WO2023104909A1 - Biokompatible strukturen zur verbindung und kultivierung von biologischem material - Google Patents

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WO2023104909A1
WO2023104909A1 PCT/EP2022/084841 EP2022084841W WO2023104909A1 WO 2023104909 A1 WO2023104909 A1 WO 2023104909A1 EP 2022084841 W EP2022084841 W EP 2022084841W WO 2023104909 A1 WO2023104909 A1 WO 2023104909A1
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linker
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linkerspheres
biological material
spheres
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PCT/EP2022/084841
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French (fr)
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Kevin ACHBERGER
Stefan LIEBAU
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Eberhard Karls Universitaet Tuebingen Medizinische Fakultaet
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    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing biocompatible structures for connecting and culturing biological material, a method for culturing aggregates of biological material, and the use of biocompatible structures for connecting and culturing biological material.
  • spheroids suspension cultures of cell aggregates, so-called spheroids or organoids
  • spheroids can be produced via self-assembly.
  • adherent individual or mixed cultures are brought together in a vessel and then form spheres independently or differentiate into organ-like, complex organoids.
  • retinal organoids They form a light-sensitive, structured retina.
  • Gut organoids may represent gut transport functions and contribute to villi in vivo.
  • Other examples are brain organoids, kidney organoids, etc.
  • organoids or spheroids remain individual organ/tissue systems and do not form complex organ systems with one another. In most cases, they also do not form any vascular or conduction pathways or structures that grow or migrate into the organ from other areas of the body during normal development.
  • assembloids represent the fusion of several organoids into a morphological and functional unit.
  • An example of this are cortico-spinal-muscle assembloids, which consist of brain areas (cortex), spinal cord spheroids (spinal) and muscle cells; see Anderson et al., Generation of Functional Human 3D Cortico-Motor Assembloids. Cell, Vol. 183, 2020, pp. 1913-1929, e1-10.
  • the assembloids like the organoids, can only be poorly oriented to one another and fuse with one another largely at random.
  • the organoids and assembloids are often of different sizes, making it difficult to bring them together in the correct spatial orientation. Frequently, one organoid or assemblage "absorbs" and overgrows another. Further, the possibilities are organoids and assembloids to give a structure, very limited. Organoids and assembloids can only be connected "in series", but not in a different orientation. After all, there is no easy way to add missing individual cells or substances or functional structures, such as immune cells, to the fused organoids or assemblages.
  • the object of the invention is to provide a method with which the disadvantages of the cultivation methods known in the prior art are avoided or at least reduced.
  • linkerspheres biocompatible structures for connecting and cultivating biological material
  • biocompatible stands for the property of being non-toxic to biological material.
  • linker spheres according to the invention and the matrix material this means in particular that the latter are suitable as a substrate for the cultivation and growth of biological material.
  • biological material includes biological cells, aggregates of biological cells, organs and parts thereof.
  • the non-polar, water-immiscible biocompatible liquid provided in step (1) is one that behaves like mineral oil, is 100% water-immiscible to form an emulsion according to the invention, and not for biological Material has toxic properties.
  • the liquid provided in step (1) is "mineral oil” (CAS number: 8042-47-5; EC number: 232-455-8), i.e. a highly viscous bioreagent having a grade and has a degree of purity that allows it to be used in molecular biology, e.g. for layering aqueous solutions and centrifugation gradients (quality level 200).
  • mineral oil from Sigma-Aldrich (M5904), Carl Roth GmbH & Co. KG (#8904), Merck (#107160; #113898) is suitable according to the invention.
  • Synonyms for the mineral oil according to the invention are "paraffin oil” and "vaseline oil”.
  • the mineral oil is preferably provided in a container, more preferably in a microreaction vessel of a suitable size, for example with a volume of 2 ml, 1.5 ml, 0.5 ml, 0.2 ml etc. (e.g. "Eppendorf '-Vessel).
  • a “matrix material” is understood to mean a mixture of molecules which is present in liquid form in step 2 and can be converted into a solid, tissue-like form by the action of physical or chemical phenomena.
  • a biocompatible, preferably network-like structure is provided by the matrix material in the solid form, which allows the cultivation of biological material.
  • matrix material suitable according to the invention include hydrogels, basement membrane-like matrices (e.g. Matrigel; contains a high, beneficial amount of laminin), and other biocompatible, gel-like substances.
  • the solution of the biocompatible matrix material is introduced into the mineral oil in step (2) using a suitable dosing device, such as a pipette. Due to the fluidity of the aqueous matrix material, it is preferably introduced into the mineral oil in the form of a liquid droplet in order to form an emulsion.
  • a suitable dosing device such as a pipette. Due to the fluidity of the aqueous matrix material, it is preferably introduced into the mineral oil in the form of a liquid droplet in order to form an emulsion.
  • the size of the linker spheres according to the invention can be easily controlled via the volume of the matrix material. A larger volume results in larger linkerspheres, a smaller volume in smaller linkerspheres.
  • step (3) an incubation takes place for a period of time which allows the formation of the linker spheres, preferably from at least 10 seconds up to 60 minutes.
  • step (4) of the method according to the invention due to the interfacial effects between the aqueous biocompatible matrix material and the surrounding mineral oil, the aqueous biocompatible matrix material in the emulsion assumes a spherical shape, which gives the linkerspheres their name.
  • biocompatible structures can be created in the form of linker spheres, which represent a valuable tool for tissue construction (engl. "Tissue Engineering”), with which the disadvantages of the prior art at least can be partially or completely remedied.
  • the linkerspheres provide a physiological environment for biological material, which also allows the formation of vascular and vascular pathways, which grow into an organ or migrate from different areas of the body during the development of an organism.
  • the linker spheres obtained according to the invention enable the reproduction of complex cell, tissue and organ interactions. They are therefore particularly suitable for examining complex biological structures such as organs, organ systems, etc.
  • the matrix material is a basement membrane-like matrix.
  • a "basal membrane-like matrix” is understood to mean a complex mixture of biomolecules that is used in 3D cell culture and in tissue construction as a basis for growth, ie as a matrix or cell substrate.
  • a basement membrane-like matrix is the purified secretion of the murine sarcoma cell line Engel-breth-Holm-Swarm (EHS cells) and is compositionally similar to the extracellular matrix of the basement membranes of animal cells. It contains laminin, entactin, collagen and heparan sulfate proteoglycans, among others. This measure has the advantage that a biocompatible matrix material that is particularly suitable according to the invention is used. At approx.
  • the basement membrane-like matrix forms a crosslinked, gel-like structure or a hydrogel through polymerization of the proteins it contains, while it is liquid at lower temperatures, for example at 4°C.
  • basal membrane-like matrices lead to the preservation of a complex, physiological, three-dimensional cell structure.
  • An overview of basement membrane-like matrices can be found, for example, in Hughes et al: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. In: Proteomics. Volume 10, Number 9, 2010, ISSN 1615-9861, pp. 1886-1890.
  • Trade names for basement membrane-like matrices suitable according to the invention are e.g. B. Matrigel (Corning Life Sciences), BME, EHS matrix etc.
  • step (2) of the method a solution of a growth factor reduced (GFR) basement membrane-like matrix is introduced.
  • GFR growth factor reduced
  • GFR basement membrane matrix useful in the present invention is sold under the trade name Corning® Matrigel® Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free, product number 354230, Corning Life Sciences.
  • step (3) of the method the emulsion is treated to solidify the matrix material, preferably by subjecting the emulsion to heat, preferably at about 37° C., more preferably for about 15 to 30 minutes.
  • This measure has the advantage that the linker spheres are brought into a solid form that is manageable and suitable for cultivation purposes by the cross-linking of the matrix material or the proteins contained therein. Solidification or cross-linking results in the formation of a solid hydrogel or gel-like structure, which allows biological material to be cultivated and grown through.
  • the heat treatment can conveniently be carried out by placing the reaction vessel containing the emulsion in a water bath.
  • the solution of the biocompatible matrix material contains cell culture medium.
  • This measure creates the physiological prerequisites for the linker spheres to be used immediately after their production for the cultivation of biological material.
  • Any type of cultivation medium is suitable according to the invention, with the specific choice by the person skilled in the art being based on which biological material is to be cultivated or connected to the linkerspheres.
  • a cell culture medium suitable for cultivating astrocytes is, for example, N2 medium and “B27-based retinal differentiation medium” (BRDM medium).
  • the solution of the matrix material contains biological material, preferably biological cells.
  • linker spheres containing biological material can be used as a separate cultivation unit or used to connect units or aggregates of biological material.
  • the solution of the biocompatible matrix material has a dye.
  • step (2) of the method the solution of the matrix material is introduced into the mineral oil as drops of fluid, preferably via a pipette tip.
  • the tip of the pipette which contains the solution of the biocompatible matrix material, is held directly over the surface of the oily liquid. If a micropipette is used, preferably up to the first pressure point pressed. In this way a drop forms at the front of the pipette. By immersing the pipette tip in the oily liquid, the drop detaches from the tip and sinks into the oily liquid to the bottom of the vessel.
  • step (4) is carried out after step (4):
  • the linker spheres are advantageously removed from the emulsion and made available for further use.
  • step (5) the following step is carried out after step (5):
  • the remaining mineral oil is removed from the linker spheres in an advantageous manner.
  • This washing step can be repeated to remove any excess oil from the linkerspheres. This prevents any excess oil from having a damaging effect in subsequent cultivation applications.
  • step (4) is carried out after step (4) and before step (5):
  • the isolated and optionally washed linker spheres are transferred to a culture vessel, preferably a culture dish.
  • the linker spheres are placed in an environment that allows them to be used directly for the cultivation and connection of biological material.
  • Commercially available culture dishes, such as Petri dishes, are suitable and their selection depends on the specific use of the linkerspheres.
  • the isolated and optionally washed and optionally transferred linkerspheres are cultivated, preferably at approx. 37° C., more preferably at approx. 20% by volume O2, more preferably at approx. 5 vol % CO2, more preferably for at least about 12 hours.
  • This measure has the advantage that particularly suitable parameters for cultivating the linker spheres are used.
  • Another subject of the present invention relates to a method for cultivating and/or connecting aggregates of biological material, which has the following steps:
  • linkerspheres biocompatible structures for connecting and culturing biological material
  • the complexes of the aggregates and the linker spheres are “cultivated” under the usual cell culture conditions, for example in an incubator in a nutrient medium at about 37° C. and optionally 5% by volume CO2.
  • the aggregates of biological material can be connected or fused to one another at a defined distance which is determined by the linker spheres.
  • more than one linker sphere or any number of them can also be interposed. Due to the distance created by the linkerspheres, there is a spatial separation of the aggregates to be fused; this means that they cannot easily grow into one another and one aggregate is prevented from overgrowing another.
  • the linkerspheres also allow a large number of aggregates to be linked to the same aggregate in order to obtain a cloverleaf-like structure, for example.
  • the linker spheres can be used to create pathway systems that link the aggregates of biological material to one another, for example conductive blood pathways, nerve pathways, or structures of the extracellular matrix (ECM). These can also be combined with each other.
  • the track systems can either be provided as further spheroid structures (e.g. by means of vascular organoids) or during the production of the linker spheres in the latter are embedded. The fusion of several linker spheres with different cell types is also possible without any problems.
  • the linkerspheres can contain any desired ECM structures and thus simulate the body/web structures.
  • linker spheres With the linker spheres according to the invention, the fusion of aggregates of different sizes is possible without any problems, since these only have to be coupled to the linker spheres and then track systems can be connected in between.
  • the aggregates of biological material are cut before being brought into contact with the linkerspheres, preferably with microscissors, wherein, more preferably, the aggregates of biological material are brought into contact with the cut surface with linkerspheres become.
  • the aggregates are brought into a shape and size which is based on the size of the linker sphere and/or the desired connection.
  • the cut surface creates a particularly good contact surface and ensures a good connection with the aggregates made of biological material.
  • the cultivation takes place at about 37° C., preferably at about 20% by volume of O 2 , more preferably at about 5% by volume of CO 2 .
  • the aggregates of biological material are organoids and/or spheroids and/or assemblages.
  • This measure has the advantage that the disadvantages described in the prior art for organoids and assemblages are reduced or even avoided.
  • the interposition of linker spheres means that there is no direct fusion of possibly different types of tissue, which is also generally not the case in the organism.
  • the interposition of the linkerspheres also allows the correct and arbitrary spatial orientation of the aggregates, which usually occurs randomly and undirectedly in the case of direct fusion, especially in the case of aggregates of different sizes.
  • the method according to the invention also allows the aggregates to be oriented “in series” for the first time.
  • the aggregates of biological material are selected from the group consisting of: retinal organoid, vascular organoid, brain organoid, neurospheroid.
  • a “retinal organoid” is a three-dimensional structure of cells of the retina differentiated from pluripotent stem cells that contains layering, cell-cell interaction, and cell-type specific diversity that mimics the human embryonic retina. Furthermore, photoreceptors can form in the retinal organoids, which are light-sensitive and have the special structure (inner and outer segment) of this type of cell.
  • a “vascular organoid” is understood to mean a three-dimensional structure which can be formed from pluripotent stem cells and contains cells of the vascular system. These include endothelial cells and pericytes.
  • a "brain ganoid” is an organoid formed from pluripotent stem cells, which can reflect the organization and cell diversity of certain areas of the brain.
  • a thalamic organoid contains neurons that occur in the thalamus.
  • a "neurospheroid” is a spheroidal arrangement of neural cells ( Neurons, glial cells and their progenitors) that can be generated from pluripotent stem cells can include organized (eg neurorosettes or cortical areas) and disorganized areas.
  • the aggregates of biological material have astrocytes, preferably those derived from induced or embryonic pluripotent stem cells (iPSC).
  • the stem cells are preferably of human or animal origin.
  • steps (2) and (3) can be repeated at least once, twice, three times, four times, ... ten times, twenty times, a hundred times, etc.
  • Another object of the present invention relates to the use of linker spheres obtained according to the production method according to the invention for the connection and cultivation of biological material.
  • Fig. 2 Astrolinker in schematic (a) and microscopic representation (b) -
  • Fig. 4 Microscopic representation of the process of connecting retinal
  • organoid and linkersphere (a), a suspension culture of the junction product (b), outgrowth of axons from the retinal organoid into a linkersphere (c), the junction product at single junction (d) and at double junction (e);
  • Fig. 7 Microscopic representation of a double connection of an astrolinker with a neuosphere and a retinal organoid
  • Fig. 8 Schematic representation of a complex optic nerve model under
  • linker spheres according to the invention Use of linker spheres according to the invention.
  • 9 Schematic representation of the support of vessel vascularization by linker spheres according to the invention.
  • Fig. 10 Schematic representation of multi-linking concepts.
  • FIG. 1 shows a schematic overview of the production of the linker spheres.
  • mineral oil is provided in a test vessel.
  • the liquid, biocompatible matrix material is drawn up in a pipette, possibly mixed with biological material, such as biological cells, and/or culture medium.
  • a drop of the solution of the biocompatible matrix material is introduced into the mineral oil.
  • the biocompatible matrix material on the underside of the pipette is brought into contact with the surface of the mineral oil.
  • the volume of the drop is then ejected from the pipette and the drop is allowed to sink to the bottom of the test tube filled with mineral oil.
  • the reaction vessel with the emulsion formed therein is subjected to a heat treatment, for example, by placing it in a water bath and incubating it at 37°C for 30 minutes.
  • the proteins of the biocompatible matrix material are cross-linked and the matrix material is solidified so that a gel-like structure or a hydrogel is formed, the "linker sphere".
  • the linker sphere is washed and transferred to culture medium. details
  • linkerspheres with cells The technical details for the production of linkerspheres with cells are described below. This is done using the example of linkerspheres that contain astrocytes, so-called "astrolinkers”.
  • DMEM/F12 with Glutamax 2% Hormone Mix, 1% Non-Essential Amino Acids (NEAA), 1% Antibiotics-Antimycotics (Anti-Anti), all Thermo Fisher Scientific)
  • the preparation of the astrocyte-containing linkerspheres is as follows:
  • AC Human iPSC-derived astrocytes
  • N2 medium at twice the amount containing TrypLE medium is added to stop the reaction.
  • the cells are transferred to a 15 ml conical tube and centrifuged at 1500 g for 2 minutes. The supernatant is discarded and the cells are resuspended in an appropriate volume of N2 medium. to count the cells (about 500 ⁇ l-1 OOOpl) in a Neubauer counting chamber diluted 1:1 with trypan blue to visualize dead cells Number of cells is transferred to a 1.5 ml Eppendorf container. 10,000 cells are required to produce 1 Astrolinker with a size of 2.5 ⁇ l per linker.
  • the collected cells are then pelleted again at 800 g for 2 minutes. The supernatant is discarded carefully and as completely as possible.
  • the cell pellet is then resuspended in cold BRDM medium to achieve 1.25 ⁇ l per astrolinker (e.g. for 10 linkers/100,000 cells, 10 ⁇ l of medium is used). It is then stored on ice. Growth factor-reduced Matrigel (thawed overnight in the refrigerator) is added to the chilled cell suspension in a 1:1 ratio and the solution is gently and thoroughly mixed, avoiding the formation of bubbles. Ink or other dyes can be added to the Matrigel to make the linkers more visible later. Here 5% of a 1:1000 dilution of ink in PBS was used.
  • reaction tubes 1.5 mL reaction tubes (1 tube per astrolinker) are filled with ⁇ 50 ⁇ L mineral oil and stored at room temperature until use.
  • 2.5 ⁇ l of the astrocyte-Matrigel mixture are then transferred into the reaction vessel filled with mineral oil using a thin 10 ⁇ l pipette tip (if possible pre-cooled).
  • the tip of the pipette which contains 2.5 ⁇ l of astrocyte-Matrigel mix, is held directly over the surface of the oily liquid and then pressed to the first pressure point. In this way a drop forms at the front of the pipette.
  • the tube containing the linker is placed on a heating block (37°C) as quickly as possible to allow rapid solidification. This is necessary to avoid the cells being distributed unevenly in the drop.
  • the tubes are then incubated for 15-30 minutes at 37°C.
  • the washed astrolinkers are transferred to a non-tissue treated 48-well plate containing 250 ⁇ l of ASC ++ prewarmed to 37 °C. Again, clipped tips are used.
  • the astrolinkers are stored at 37 °C, 20% O2 and 5% CO2 at least overnight and the medium is changed every 2-3 days until further use or fixation (half medium change).
  • the astrolinker is shown schematically in FIG. 2a.
  • 2b shows an astrolinker (linkersphere loaded with astrocytes) after one day in culture.
  • 2c shows an astrolinker with astrocytes which were previously transfected with a lentiviral construct (Lenti-GFAP-GFP) which expresses a green fluorescent protein (GFP) under a 'glial fibrillary acidic protein (GFAP) promoter.
  • Figures 2d and 2e show a three-dimensional reconstruction of part of an astrolinker in which the astrocytes, as in 2c, express GFP under a GFAP promoter.
  • FIG. 2d) shows an image of the fluorescence colored in magenta, FIG. 2e a height-coded false color image.
  • astrocytes instead of astrocytes, only medium (e.g. BRDM) is added to the GFR-Matrigel. All subsequent steps remain the same.
  • Cell-free linkerspheres can be cultured in any 37°C prewarmed medium or buffer. 2. Establishing double connections
  • RO Human iPSZ-derived retinoid organoids
  • the RO are cut in two with microscissors and transferred to a non-tissue treated 96-well V-shape plate. Half an organoid is placed in each well. An astrolinker or cell-free linkersphere with a 10OQ-1 tip is then placed in the wells containing the RO. Using a small needle or pipette tip, the RO and linker are positioned under a microscope. The RO is positioned so that the cut side touches the Astrolinker/Linkersphere directly. The plate is then placed extremely gently (without disturbing the positioning) in an incubator (37 °C, 20% O2, 5% CO2).
  • thalamic organoids differentiated according to a previously published protocol (Xiang 2019) are selected after 40-80 days of differentiation.
  • Each TO is placed in the 96-well V-shape plate containing the double link (Astrolinker/Linkersphere + RO).
  • the triple junction is made with a small needle or point, placing the thalamic organoid directly on the opposite side of the retinal organoid attached to the Astrolinker/Linkersphere. This is critical so that the cell junction must form through the astrolinker and not directly. Without moving, the plate is stored overnight in the incubator at 37 °C, 20% O2 and 5% CO2.
  • the triple compound is optionally cultivated on the following day.
  • the connection process is shown schematically in FIG.
  • the scale bar in the two micrographs shown in the figure below corresponds to a distance of 1000 pm.
  • a non-tissue-treated 48-well plate is prepared with 250 ⁇ l of BRDM medium prewarmed to 37°C.
  • the triple compounds are transferred to this 48-well plate (with 1000 ⁇ l tips cut off) and incubated again at 37°C, 20% O2, 5% CO2.
  • the linkers are checked under the microscope.
  • the RO can e.g. be stably transduced with GFP (e.g. with lentiviral vectors).
  • GFP e.g. with lentiviral vectors.
  • Medium changes for double or triple connections are performed every second to third day with warm BRDM medium (250 ⁇ l per well, half medium change).
  • FIG. 4b shows the result of the connection process between a linker sphere and a retinal organoid in a microscopic image.
  • Fig. 4b the complex is shown in a suspension culture.
  • the outgrowth of neurites from the organoid into the linker sphere can be seen in FIG. 4c.
  • FIG. 4d shows the result of a single linking of retinal organoid and linkersphere
  • FIG. 4e shows the result of a double link.
  • the astrocytes are labeled with GFP and stained accordingly.
  • FIG. 5 shows a double linkage of a linkersphere with a neuosphere on one side and a retinal organoid on the other side.
  • the neuosphere is connected to the retinal organoid by neural pathways that pass through the linkersphere.
  • Fig. 6 it is shown that GFP-labeled cells of the retinal organoid project inside the neurosphere and are positive for the ganglion cell marker NEFM.
  • FIG 7 a double linkage of an astrolinker with a neuosphere on one side and a retinal organoid on the other side is shown.
  • the Neuosphere is connected to the retinal organoid by neural pathways that pass through the linkersphere.
  • the complex optic nerve model e.g. B. to model glaucoma, consists of a retinal organoid containing retinal ganglion cells, two linkers filled with oligodendrocytes (myelinated part of the optic nerve) + astrocytes (intra-retinal part of the optic nerve)) + brain organoids (patterned e.g. for diencephalon or metathalamus).
  • FIG. 9 shows schematically how the vascularization can be supported by means of the linker body, e.g. by connecting tissue organoids to blood vessel organoids.
  • Multi-linking concepts are shown in FIGS. 10a and 10b.
  • Linkerspheres allow to combine multiple organoids and different connective concepts (e.g. neuronal connections, vascularization). Linkerspheres could potentially facilitate growth/assembly of complex multiorganoid and multicellular tissues including nerve outgrowth and vascularization.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von biokompatiblen Strukturen zur Verbindung und Kultivierung von biologischem Material, ein Verfahren zur Kultivierung von Aggregaten aus biologischem Material, und die Verwendung von biokompatiblen Strukturen zur Verbindung und Kultivierung von biologischem Material.

Description

Biokompatible Strukturen zur Verbindung und Kultivierung von biologischem Material
[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von biokompatiblen Strukturen zur Verbindung und Kultivierung von biologischem Material, ein Verfahren zur Kultivierung von Aggregaten aus biologischem Material, und die Verwendung von biokompatiblen Strukturen zur Verbindung und Kultivierung von biologischem Material.
[0002] Traditionell werden biologische Zellen in vitro, also in der Kulturschale, im Wesentlichen auf drei verschiedenen Arten und Weisen kultiviert: 1. Auf beschichteten oder unbeschichteten Plastik- oder Glasoberflächen; die Beschichtung erfolgt meist durch Gele oder Proteine sowie Peptide der extrazellulären Matrix; bei einer Kultivierung auf unbeschichteten Plastikoberflächen spricht man von einer adhärenten Zellkultur; 2. auf semipermeablen Membranen ("Transwell"); und 3. als dreidimensionale Kulturen, wie Suspensionskulturen. [0003] Mit den ersten beiden Verfahren lassen sich die Zellen oder Zellmixturen aus (Primär-) Geweben oder aus Stammzellen abgeleitet kultivieren, welche eine gewisse Zellreife und Funktionalität erreichen können. Trotzdem sind diese Zellen wenig physiologisch und können selten komplexe Zell- und Gewebeinteraktionen reproduzieren.
[0004] Suspensionskulturen von Zellaggregaten, sog. Sphäroide oder Organoide, bieten dagegen den Vorteil, dass die Zellen, meist selbstorganisierend, komplexe Strukturen und Interaktionen bilden können. Sphäroide können bspw. über Selbstaggregation hergestellt werden. Hierbei werden adhärente Einzel- oder Mixkulturen in einem Gefäß zusammengebracht und formen dann eigenständig Sphären oder differenzieren sich zu organähnlichen, komplexen Organoiden. Beispiele sind hier Retina-Organoide. Sie bilden eine lichtsensitive, strukturierte Netzhaut. Darmorganoide können Darmtransportfunktionen darstellen und in vivo zu Darmzotten beitragen. Weitere Beispiele sind Hirnorganoide, Nierenorganoide usw.
[0005] Zumeist bleiben diese Organoide oder Sphäroide aber einzelne Organ-/Gewebesysteme und bilden miteinander keine komplexen Organsysteme. Sie bilden meistens auch keine Gefäß- und Leitungsbahnen bzw. keine Strukturen, die in der normalen Entwicklung aus anderen Körperbereichen in das Organ einwachsen oder einwandern.
[0006] Eine Möglichkeit, dies bis zu einem gewissen Grad zu erreichen, bieten die sogenannten Assembloide (engl. Assembloids). Diese stellen die Fusionierung mehrere Organoide zu einer morphologischen und funktionellen Einheit dar. Ein Beispiel dafür sind Cortico-Spi- nale-Muskel Assembloide, welche aus Hirnbereichen (Cortex), Rückenmarksphäroiden (Spinal) und Muskelzellen bestehen; vgl. Anderson et al., Generation of Functional Human 3D Cortico-Motor-Assembloids. Cell, Band 183, 2020, Seiten 1913-1929, e1-10.
[0007] Die Assembloide, ebenso wie die Organoide, lassen sich jedoch nur schlecht zueinander orientieren und fusionieren weitgehend zufällig miteinander. Die Organoide und Assembloide sind oft unterschiedlich groß, was es erschwert, sie räumlich richtig ausgerichtet zusammenzubringen. Häufig "absorbiert" und überwuchert ein Organoid bzw. As- sembloid einen anderen. Ferner sind die Möglichkeiten, Organoiden und Assembloiden eine Struktur zu geben, sehr begrenzt. Organoide und Assembloide können nur "in Reihe" miteinander verbunden werden, nicht aber in anderer Orientierung. Es gibt schließlich keine einfache Möglichkeit, zusätzlich noch fehlende Einzelzellen oder Substanzen oder funktionelle Strukturen, wie z.B. Immunzellen, zu den fusionierten Organoiden oder As- sembloiden hinzugeben.
[0008] Vor diesem Hintergrund liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem die Nachteile der im Stand der Technik bekannten Kultivierungsverfahren vermieden oder zumindest reduziert werden.
[0009] Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Herstellung von biokompatiblen Strukturen zur Verbindung und Kultivierung von biologischem Material ("Linkerspheres") gelöst, das folgende Schritte aufweist:
1) Bereitstellen einer unpolaren, mit Wasser nicht mischbaren biokompatibe- len Flüssigkeit, vorzugsweise von Mineralöl;
2) Einbringen einer Lösung eines biokompatiblen Matrixmaterials in Flüssigkeit zum Erhalt einer Emulsion;
3) Inkubation der Emulsion;
4) Ausbildung einer dreidimensionalen Struktur aus dem Matrixmaterial in der Emulsion durch die Inkubation zum Erhalt der Linkerspheres.
[0010] Erfindungsgemäß steht "biokompatibel" für die Eigenschaft, nicht-toxisch gegenüber biologischem Material zu sein. In Bezug auf die erfindungsgemäßen Linkerspheres und das Matrixmaterial bedeutet dies insbesondere, dass letztere als Substrat für die Kultivierung und das Wachstum von biologischem Material geeignet sind.
[0011] Erfindungsgemäß umfasst "biologisches Material" biologische Zellen, Aggregate von biologischen Zellen, Organe und Teile hiervon. [0012] Erfindungsgemäß ist die in Schritt (1) bereitgestellte unpolare, mit Wasser nicht mischbaren biokompatible Flüssigkeit eine solche, die sich wie Mineralöl verhält, zu 100% nicht mit Wasser mischbar ist, um eine erfindungsgemäße Emulsion bilden zu können, und keine für biologisches Material toxische Eigenschaften aufweist.
[0013] Vorzugsweise handelt es sich bei der in Schritt (1) bereitgestellten Flüssigkeit um "Mineralöl" (CAS-Nummer: 8042-47-5; EC-Nummer: 232-455-8), d.h. ein hochviskoses Bioreagenz, das eine Qualität und ein Reinheitsgrad aufweist, die eine Verwendung in der Molekularbiologie erlauben, bspw. zur Überschichtung von wässrigen Lösungen und Zentrifugationsgradienten (Qualitätsniveau 200). Erfindungsgemäß geeignet ist bspw. das Mineralöl von Sigma-Aldrich (M5904), Carl Roth GmbH & Co. KG (#8904), Merck (#107160; #113898). Synonyme für das erfindungsgemäße Mineralöl sind "Paraffinöl" und "Vaselinöl". Die Bereitstellung des Mineralöls erfolgt vorzugsweise vorgelegt in einem Behältnis, weiter vorzugsweise in einem Mikroreaktionsgefäß mit geeigneter Größe, wie bspw. mit einem Volumen von 2 ml, 1 ,5 ml, 0,5 ml, 0,2 ml etc. (z.B. "Eppendorf'-Gefäß).
[0014] Erfindungsgemäß wird unter einem "Matrixmaterial" ein Gemisch von Molekülen verstanden, das in Schritt 2 in liquider Form vorliegt und durch Einwirkung von physikalischen oder chemischen Phänomenen in eine feste, gewebeähnliche Form überführt werden kann. Dabei wird durch das Matrixmaterial in der festen Form eine biokompatible, vorzugsweise netzwerkartige Struktur bereitgestellt, die die Kultivierung von biologischem Material erlaubt. Beispiele für erfindungsgemäß geeignetes Matrixmaterial umfassen Hydrogele, basalmembranartige Matrices (z.B. Matrigel; enthält einen hohen, günstigen Anteil an Laminin), und andere biokompatible, gelartige Substanzen.
[0015] Das Einbringen der Lösung des biokompatiblen Matrixmaterials in das Mineralöl in Schritt (2), erfolgt durch eine geeignete Dosiervorrichtung, wie eine Pipette. Durch die Fluidität des wässrigen Matrixmaterials wird diese vorzugsweise in Form eines Flüssigkeitstropfens in das Mineralöl eingebracht, um eine Emulsion zu bilden. [0016] Die Größe der erfindungsgemäßen Linkerspheres lässt sich einfach über das Volumen des Matrixmaterials steuern. Ein größeres Volumen resultiert in größeren Linkerspheres, ein kleineres Volumen in kleineren Linkerspheres.
[0017] Erfindungsgemäß erfolgt in Schritt (3) eine Inkubation für eine Zeitspanne, die die Ausbildung der Linkersphäres erlaubt, vorzugsweise von zumindest 10 Sekunden bis zu 60 Minuten.
[0018] Die genaue Zeitspanne wird durch den Fachmann ermittelt und richtet isch nach der Art des Geliervorganges. Matrigele bspw. gelieren bei höheren Temperaturen. Andere Hydrogele benötigen "Crosslinker" oder ähnliche Bindungschemikalien. Somit kann die Inkubation wenige Sekunden bis Minuten (bis zu 1 Stunde) dauern.
[0019] In Schritt (4) des erfindungsgemäßen Verfahrens nimmt, aufgrund der Grenzflächeneffekte zwischen dem wässrigen biokompatiblen Matrixmaterial und dem umgebenden Mineralöl, das wässrige biokompatible Matrixmaterial in der Emulsion eine kugelförmige Gestalt an, die den Linkerspheres ihren Namen gibt.
[0020] Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird damit vollkommen gelöst.
[0021] Die Erfinder haben erkannt, dass mithilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens biokompatible Strukturen in Form der Linkerspheres geschaffen werden können, die ein wertvolles Werkzeug für die Gewebekonstruktion (engl. "Tissue Engineering") darstellen, mit denen die Nachteile aus dem Stand der Technik zumindest teilweise oder gar vollständig behoben werden können.
[0022] Gemäß der Erfindung sind die nach dem Verfahren erhaltenen Linkerspheres geeignet und ausgebildet, um in ihnen und/oder darauf biologisches Material zu kultivieren. Sie sind ferner geeignet und ausgebildet, um biologisches Material miteinander zu verbinden, also als eine Brücke oder Bindeglied zwischen verschiedenen biologischen Materialien oder Aggregaten hiervon zu fungieren (engl.: "linker" = Verbindung, "spheres" = Kugeln). Da die Linkerspheres biologisches Material kultivieren können, wird es ermöglicht, dass das biologische Material oder Teile hiervon durch die Linkerspheres hindurch oder auf diesen wachsen können. Somit lässt sich über die Linkerspheres eine Verbindung zwischen einem ersten biologischen Material oder Aggregat hiervon und einem zweiten biologischen Material oder Aggregat hiervon oder weiteren biologischen Materialien oder Aggregaten hiervon schaffen.
[0023] Die Linkerspheres stellen eine physiologische Umgebung für biologisches Material bereit, das auch die Ausbildung von Gefäß- und Leitungsbahnen erlaubt, welche bei der Entwicklung eines Organismus aus verschiedenen Körperbereichen kommend in ein Organ einwachsen oder einwandern. Die erfindungsgemäß erhaltenen Linkerspheres ermöglichen die Reproduktion von komplexen Zell-, Gewebe- und Organinteraktionen. Sie eignen sich somit insbesondere zur Untersuchung von komplexen biologischen Strukturen, wie Organen, Organsystemen etc.
[0024] In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Matrixmaterial eine basalmembranartige Matrix (engl.: "basement membrane-like matrix").
[0025] Erfindungsgemäß wird unter einer "basalmembranartigen Matrix" eine komplexe Mischung von Biomolekülen verstanden, die in der 3D-Zellkultur und bei der Gewebekonstruktion als Wachstumsgrundlage, also als Matrix oder Zellsubstrat, verwendet wird. Eine basalmembranartige Matrix ist das gereinigte Sekret der murinen Sarkom-Zelllinie Engel- breth-Holm-Swarm (EHS-Zellen) und ähnelt in seiner Zusammensetzung der extrazellulären Matrix der Basalmembranen von tierischen Zellen. Sie enthält unter anderem Laminin, Entactin, Kollagen und Heparansulfat-Proteoglykane. Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass ein erfindungsgemäß besonders geeignetes biokompatibles Matrixmaterial zum Einsatz kommt. Die basalmembranartige Matrix bildet bei ca. 37°C durch Polymerisierung der enthaltenen Proteine eine vernetzte, gelartige Struktur bzw. ein Hydrogel aus, während sie bei niedrigeren Temperaturen, bspw. bei 4°C, flüssig ist. Basalmembranartige Matrices führen im Vergleich zu polylysinbeschichteten Zellkulturmatrices zum Erhalt einer komplexen, physiologischen, dreidimensionalen Zellverbandstruktur. Eine Übersicht über basalmembranartige Matrices findet sich bspw. in Hughes et al: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. In: Proteomics. Band 10, Nummer 9, 2010, ISSN 1615-9861 , S. 1886-1890. [0026] Handelsnamen für erfindungsgemäß geeignete basalmembranartige Matrices sind z. B. Matrigel (Corning Life Sciences), BME, EHS matrix etc.
[0027] In einer Ausführungsform der Erfindung wird in Schritt (2) des Verfahrens eine Lösung einer wachstumsfaktorreduzierten (growth factor reduced GFR) basalmembranartigen Matrix eingebracht.
[0028] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass eine solche Matrix zum Einsatz kommt, in der Wachstumsfaktoren vermindert vorliegen, die eine Wirkung auf die Zellen im Aggregat haben können (z.B. EGF). Neuronen bspw. werden vorzugsweise auf einer solchen Matrix kultiviert, um diesen Einfluss zu verringern. Eine erfindungsgemäß geeignete GFR basalmembranartige Matrix wird unter dem Handelsnamen Corning® Matrigel® Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free, Produktnummer 354230, Corning Life Sciences, vertrieben.
[0029] In einer Ausführungsform der Erfindung wird in Schritt (3) des Verfahrens eine Behandlung der Emulsion zur Verfestigung des Matrixmaterials durchgeführt, vorzugsweise durch Wärmebeaufschlagung der Emulsion, vorzugsweise bei ca. 37°C, weiter vorzugsweise für ca. 15 bis 30 Minuten.
[0030] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die Linkerspheres durch die Quervernetzung des Matrixmaterials bzw. der enthaltenen Proteine in eine handhabbare und für Kultivierungszwecke geeignete, feste Form gebracht werden. Durch die Verfestigung bzw. Quervernetzung bildet sich ein(e) feste(s) Hydrogel bzw. gelartige Struktur aus, die eine Kultivierung von und ein Durchwachsen mit biologischem Material ermöglicht. Die Wärmebehandlung kann zweckmäßigerweise durch Einbringung des die Emulsion enthaltenen Reaktionsgefäßes in ein Wasserbad erfolgen.
[0031] In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weist die Lösung des biokompatiblen Matrixmaterials Zellkulturmedium auf. [0032] Durch diese Maßnahme werden die physiologischen Voraussetzungen dafür geschaffen, dass die Linkerspheres unmittelbar nach ihrer Herstellung zur Kultivierung von biologischem Material einsetzbar sind. Erfindungsgemäß geeignet ist jede Art von Kultivierungsmedium, wobei sich die konkrete Wahl durch den Fachmann danach richtet, welches biologisches Material mit den Linkerspheres kultiviert bzw. verbunden werden soll. Ein zur Kultivierung von Astrozyten geeignetes Zellkulturmedium ist bspw. N2-Medium und "B27- based retinal differentiation medium" (BRDM-Medium).
[0033] Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung weist die Lösung des Matrixmaterials biologisches Material, vorzugsweise biologische Zellen auf.
[0034] Durch diese Maßnahme werden bereits bei der Herstellung biologisches Material bzw. Zellen von Interesse in die Linkerspheres integriert. Derartige, biologisches Material enthaltende Linkerspheres können als eigene Kultivierungseinheit zum Einsatz kommen oder aber zur Verbindung von Einheiten bzw. Aggregaten von biologischem Material verwendet werden.
[0035] In einer Ausführungsform der Erfindung weist die Lösung des biokompatiblen Matrixmaterials einen Farbstoff auf.
[0036] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die Sichtbarkeit der Linkerspheres verbessert wird und deren Handhabung und Einsatz in den späteren Anwendungen erleichtert. Geeignet sind biokompatible Farbstoffe, bspw. gelöst in Puffer.
[0037] In einer Ausführungsform der Erfindung wird in Schritt (2) des Verfahrens die Lösung des Matrixmaterials als Fluidtropfen in das Mineralöl eingebracht, vorzugsweise über eine Pipettenspitze.
[0038] Diese Maßnahme erlaubt eine besonders gute Herstellung der erfindungsgemäßen Linkerspheres. Dabei wird die Pipette mit ihrer Spitze, die die Lösung des biokompatiblen Matrixmaterials enthält, direkt über die Oberfläche der Ölflüssigkeit gehalten. Bei Verwendung einer Mikropipette wird anschließend vorzugsweise bis zum ersten Druckpunkt gedrückt. Auf diese Weise bildet sich ein Tropfen an der Vorderseite der Pipette. Durch Eintauchen der Pipettenspitze in die Ölflüssigkeit löst sich der Tropfen von der Spitze und sinkt in die Ölflüssigkeit bis zum Boden des Gefäßes.
[0039] In einer Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nach Schritt (4) folgender Schritt durchgeführt:
5) Isolieren der Linkerspheres aus der Emulsion.
[0040] Mit dieser Maßnahme werden die Linkerspheres auf vorteilhafte Art und Weise aus der Emulsion herausgelöst und zur weiteren Verwendung bereitgestellt.
[0041] In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nach Schritt (5) folgender Schritt durchgeführt:
6) Waschen der isolierten Linkerspheres, vorzugsweise mit einer wässrigen Lösung, weiter vorzugsweise mit Zellkulturmedium.
[0042] Mit dieser Maßnahme wird auf vorteilhafte Art und Weise das restliche Mineralöl von den Linkerspheres entfernt. Dieser Waschschritt kann wiederholt werden, um sämtliches überschüssige Öl von den Linkerspheres zu entfernen. Dadurch wird verhindert, dass sich etwaiges überschüssiges Öl in den späteren Kultivierungsanwendungen schädigend auswirken kann.
[0043] In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird nach Schritt (4) und vor Schritt (5) folgender weiterer Schritt durchgeführt:
4') Einbringen einer wässrigen Lösung, vorzugsweise einer wässrigen Pufferlösung, in die Emulsion zur Ausbildung einer wässrigen Phase und Überführung der Linkerspheres in die wässrige Phase. [0044] Durch diese Maßnahme wird ein Zwei-Phasen-System geschaffen, mit einer öligen und wässrigen Phase. Die gebildeten wässrigen Linkerspheres gehen von der Öl- in die wässrige Phase über, aus der sie sich leicht isolieren und aufreinigen lassen. Jeder handelsübliche biokompatible Puffer ist grundsätzlich geeignet, wie bspw. ein PBS-Puffer. Die konkrete Wahl des Puffers durch den Fachmann richtet sich danach, welches spezifische biologische Material kultiviert bzw. verbunden werden soll.
[0045] In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die isolierten und ggf. gewaschenen Linkerspheres in ein Kulturgefäß, vorzugsweise eine Kulturschale überführt.
[0046] Mit dieser Maßnahme werden die Linkerspheres in eine Umgebung gebracht, die ihre direkte Verwendung zur Kultivierung und Verbindung von biologischem Material erlaubt. Handelsübliche Kulturschalen, bspw. Petrischalen, sind geeignet und deren Auswahl richtet sich nach der konkreten Verwendung der Linkerspheres.
[0047] In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die isolierten und ggf. gewaschenen und ggf. überführten Linkerspheres kultiviert, vorzugsweise bei ca. 37 °C, weiter vorzugsweise bei ca. 20 Vol.-% O2, weiter vorzugsweise bei ca. 5 Vol.-% CO2, weiter vorzugsweise für zumindest ca. 12 Stunden.
[0048] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass besonders geeignete Parameter zur Kultivierung der Linkerspheres zum Einsatz kommen.
[0049] Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung und/oder Verbindung von Aggregaten aus biologischem Material, das folgende Schritte aufweist:
1) ln-kontakt-bringen der Aggregate mit biokompatiblen Strukturen zur Verbindung und Kultivierung von biologischem Material ("Linkerspheres") in einem geeigneten Medium zum Erhalt eines Komplexes aus den Aggregaten und den Linkerspheres, 2) Kultivierung der Komplexe aus den Aggregaten und den Linkerspheres, wobei die Linkerspheres gemäß dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren erhalten wurden.
[0050] Die Merkmale, Eigenschaften, Weiterbildungen und Vorteile des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens gelten für das erfindungsgemäße Kultivierungsverfahren gleichermaßen.
[0051] Erfindungsgemäß erfolgt die "Kultivierung" der Komplexe aus den Aggregaten und den Linkerspheres unter üblichen Zellkulturbedingungen, bspw. in einem Inkubator in einem Nährmedium bei ca. 37 °C und ggf. 5 Vol.-% CO2.
[0052] Mittels der erfindungsgemäßen Linkerspheres können die Aggregate aus biologischem Material in definiertem Abstand, der durch die Linkerspheres bestimmt wird, miteinander verbunden bzw. fusioniert werden. In einer Ausführungsform der Erfindung können auch mehr als eine Linkersphere bzw. eine beliebige Vielzahl davon dazwischen geschaltet werden. Durch den durch die Linkerspheres geschaffenen Abstand besteht eine räumliche Trennung der zu fusionierenden Aggregate; somit können diese nicht ohne weiteres ineinander wachsen und es wird verhindert, dass ein Aggregat ein anderes überwuchert. Die Linkerspheres erlauben auch die Verknüpfung einer Vielzahl von Aggregaten an demselben Aggregat, um eine z.B. kleeblattartige Struktur zu erhalten.
[0053] Durch die Verbindung bzw. Fusionierung der Aggregaten über eine Vielzahl von Linkerspheres lassen sich theoretisch unendlich große und komplexe Anordnungen herstellen, i.S.e. Bausteinsystems ("Lego-System").
[0054] Über die Linkerspheres lassen sich Bahnsysteme erstellen, die die Aggregate aus biologischem Material miteinander verknüpfen, bspw. leitende Blutbahnen, Nervenbahnen, oder Strukturen der extrazellulären Matrix (EZM). Diese können auch miteinander kombiniert werden. Die Bahnsysteme können entweder als weitere Sphäroid-Strukturen (mittels bspw. vaskulärer Organoide) bereitgestellt oder bei der Herstellung der Linkerspheren in letztere eingebettet werden. Auch die Fusionierung mehrerer Linkerspheren mit verschiedenen Zelltypen ist problemlos möglich.
[0055] Die Linkerspheres können beliebigen EZM-Strukturen enthalten und so die Körper-/Bahn- strukturen nachstellen.
[0056] Mit den erfindungsgemäßen Linkerspheres ist die Fusionierung unterschiedlich großer Aggregate unproblematisch möglich, da diese nur an die Linkerspheres gekoppelt werden müssen und dann Bahnsysteme dazwischen geschaltet werden können.
[0057] In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kultivierungsverfahrens werden die Aggregate aus biologischem Material vor dem ln-kontakt-bringen mit den Linkerspheres geschnitten, vorzugsweise mit einer Mikroschere, wobei, weiter vorzugsweise, die Aggregate aus biologischem Material mit der Schnittfläche mit Linkerspheres in Kontakt gebracht werden.
[0058] Durch diese Maßnahme werden die Aggregate in eine Form und Größe gebracht, die sich an der Größe der Linkersphere und/oder der gewünschten Verbindung orientiert. Die Schnittfläche schafft dabei eine besonders gut Kontaktfläche und sichert eine gute Verbindung mit den Aggregaten aus biologischem Material.
[0059] In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kultivierungsverfahrens erfolgt die Kultivierung bei ca. 37 °C, vorzugsweise bei ca. 20 Vol.-% O2, weiter vorzugsweise bei ca. 5 Vol.-% CO2.
[0060] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass dem Fachmann Kultivierungsbedingungen an die Hand gegeben werden, die sich nach Erkenntnissen des Fachmanns besonders bewährt haben.
[0061] In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kultivierungsverfahrens sind die Aggregate aus biologischem Material Organoide oder/und Sphäroide und/oder As- sembloide. [0062] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die im Stand der Technik für Organoide und As- sembloide beschriebenen Nachteile vermindert oder sogar vermieden werden. So erfolgt durch die Zwischenschaltung von Linkerspheren keine direkte Fusionierung von ggf. verschiedenen Gewebearten, was auch im Organismus i.d.R. nicht der Fall ist. Die Zwischenschaltung der Linkerspheres erlaubt außerdem die korrekte und beliebige räumliche Orientierung der Aggregate, was bei direkter Fusionierung, insbesondere bei unterschiedlich großen Aggregaten, meist zufällig und ungerichtet erfolgt. Auch erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren erstmals eine Orientierung der Aggregate "in Reihe".
[0063] In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kultivierungsverfahrens sind die Aggregate aus biologischem Material ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: retinalem Organoid, vaskulärem Organoid, Hirnorganoid, Neurosphäroid.
[0064] Mit dieser Maßnahme kommt das erfindungsgemäße Kultivierungsverfahren bei solchen biologischen Aggregaten zum Einsatz, deren natürliche Pendants eine komplexe Umgebung aufweisen, die nun erstmals durch die Erfindung nachgebildet werden kann. Ein "retinales Organoid" ist eine dreidimensionale Struktur aus Zellen der Retina, differenziert aus pluripotenten Stammzellen, die eine Schichtung, Zell-Zell-Interaktion und zelltypenspezifische Diversität enthält, welche die humanen embryonalen Retina nachbildet. Ferner können sich in den retinalen Organoiden Fotorezeptoren bilden, welche lichtsensitiv sind und über den besonderen Aufbau (Innen und Außensegment) dieser Zellart verfügen. Unter einem "vaskulären Organoid" versteht man eine dreidimensionale Struktur, welche aus pluripotenten Stammzellen gebildet werden kann und Zellen des vaskulären Systems enthält. Dies sind unter anderem Endothelzellen und Perizyten. Vaskuläre Organoide organisieren sich selbständig zu einem 3D Kapillarnetzwerk, das von einer Basalmembran umgeben ist. Ein "Hirnoganoid ist ein aus pluripotenten Stammzellen gebildeter Organoid, welcher die Organisation und die Zelldiversität von bestimmten Hirnbereichen wiederspiegeln kann. So beinhaltet beispielweise ein thalamischer Organoid Neurone, welche im Thalamus vorkommen. Erfindungsgemäß wird unter einem "Neurosphäroid" eine sphäroidale Anordnung von neuralen Zellen (Neuronen, Gliazellen und deren Vorläufer) verstanden, die aus pluripotenten Stammzellen generiert werden können. Diese kann organisierte (e.g. Neurorosetten oder rindenartige Areale) und unorganisierte Bereiche beinhalten. [0065] In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kultivierungsverfahrens weisen die Aggregate aus biologischem Material Astrozyten auf, vorzugsweise solche, die sich von induzierten, oder embryonalen, pluripotenten Stammzellen (iPSC) ableiten.
[0066] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass für die Gewebekonstruktion besonders wichtige Zellen zum Einsatz kommen, die insbesondere für neurowissenschaftliche Untersuchungen und die Testung von Wirkstoffen von besonderem Interesse sind. Die Stammzellen sind vorzugsweise menschlichen oder tierischen Ursprungs.
[0067] In einer Ausführungsform der Erfindung wird in dem Kultivierungsverfahren nach Schritt (2) folgender Schritt durchgeführt:
(3) Wiederholen der Schritte (1) und (2).
[0068] Durch diese Maßnahme lassen sich Gewebekonstruktionen von unbegrenzter Länge und Verbindungen zwischen Linkerspheres und Aggregaten von biologischem Material in beliebiger Anzahl herstellen. Erfindungsgemäß können deshalb die Schritte (2) und (3) zumindest einmal, zweimal, dreimal, viermal, ... zehnmal, zwanzigmal, hundertmal usw. wiederholt werden.
[0069] Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von Linkerspheres, die gemäß dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren erhalten wurden, zur Verbindung und Kultivierung von biologischem Material.
[0070] Die Merkmale, Eigenschaften, Weiterbildungen und Vorteile des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens und des erfindungsgemäßen Kultivierungsverfahrens gelten für die erfindungsgemäße Verwendung gleichermaßen.
[0071] Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den jeweils angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen. [0072] Die Erfindung wird nun anhand von Beispielen näher erläutert. Die dort erwähnten Merkmale gelten nicht nur in Bezug auf das konkrete Beispiel, sondern auch in isolierter Form als zur Erfindung gehörend.
[0073] Dabei wird Bezug genommen auf die beiliegenden Figuren, in denen Folgendes dargestellt ist:
Fig. 1 : Schematische Darstellung der Herstellung der erfindungsgemäßen Linkerspheres;
Fig. 2: Astrolinker in schematischer (a) und mikroskopischer Darstellung (b) -
(e);
Fig. 3: Schematische Darstellung des Verbindungsvorgangs von ganzen und halben, geschnitten Organoiden mit den Linkerspheres (oben), und mikroskopische Darstellung des Verlinkungsproduktes (unten);
Fig. 4: Mikroskopische Darstellung des Vorgang der Verbindungs von retinalem
Organoid und Linkersphere (a), einer Suspensionskultur des Verbindungsproduktes (b), des Auswachsens von Axonen aus dem retinalen Organoid in eine Linkersphere (c), des Verbindungsproduktes bei einfacher Verbindung (d) und bei Doppel-Verbindung (e);
Fig. 5/6: Mikroskopische Darstellung einer Doppel-Verbindung einer Linkersphere mit einer Neuosphere und einem retinalen Organoid;
Fig. 7: Mikroskopische Darstellung einer Doppel-Verbindung eines Astrolinkers mit einer Neuosphere und einem retinalen Organoid;
Fig. 8: Schematische Darstellung eines komplexen Sehnervenmodells unter
Verwendung von erfindungsgemäßen Linkerspheres; Fig. 9: Schematische Darstellung der Unterstützung der Gefäßvaskularisierung durch erfindungsgemäße Linkerspheres;
Fig. 10: Schematische Darstellung von Multi-Verlinkungskonzepten.
Beispiele
1. Herstellung der Linkerspheres
Überblick
[0074] In der Fig. 1 ist die Herstellung der Linkerspheres in einer Übersicht schematisch dargestellt. In einem ersten, ganz links dargestellten Schritt wird in einem Reagenzgefäß Mineralöl bereitgestellt. In einer Pipette aufgezogen befindet sich das flüssige, biokompatible Matrixmaterial, ggf. mit biologischem Material, wie z.B. biologischen Zellen, und/oder Kulturmedium versetzt.
[0075] Im nächsten Schritt wird ein Tropfen der Lösung des biokompatiblen Matrixmaterials in das Mineralöl eingebracht. Dazu wird das sich an der Unterseite der Pipette befindliche biokompatible Matrixmaterial mit der Oberfläche des Mineralöls in Kontakt gebracht. Anschließend wird das Tropfenvolumen aus der Pipette ausgestoßen und der Tropfen kann auf den Boden des mit Mineralöl gefüllten Reagenzgefäßes sinken.
[0076] Im folgenden Schritt wird das Reagenzgefäß mit der darin gebildeten Emulsion einer Wärmebehandlung unterzogen, zum Beispiel durch Einsetzen in ein Wasserbad und Inkubation für 30 Minuten bei 37°C. Die Proteine des biokompatiblen Matrixmaterials werden quervernetzt und das Matrixmaterial wird verfestigt, so dass sich eine gelartige Struktur bzw. ein Hydrogel ausbildet, die "Linkersphere".
[0077] In der in Fig. 1 als letzten Schritt dargestellten Operation wird das Linkersphere gewaschen und in Kulturmedium überführt. Details
Linkerspheres mit Zellen
[0078] Nachfolgend werden die technischen Details für die Herstellung von Linkerspheres mit Zellen beschrieben. Dies erfolgt am Beispiel von Linkerspheres, die Astrozyten enthalten, sog. "Astrolinkers".
[0079] Folgende Materialien werden benötigt:
- Wachstumsfaktor-reduziertes Matrigel (Corning Life Sciences)
- Mineralöl (Sigma Aldrich)
- N2 Medium (DMEM/F12 mit Glutamax, 2% Hormonmix, 1% nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA), 1% Antibiotics-Antimycotics (Anti-Anti), alle Thermo Fisher Scientific)
- BRDM-Medium (DMEM/F12 (3:1) mit Glutamax, 2% B27 ohne Vitamin A, 1 % AA, 1% NEAA, alle Thermo Fischer Scientific)
- ASC++ Medium (N2 Medium + 10 ng/ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) + 10 ng/ml Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2))
- BRDM FBST (DMEM/F12 (3:1) mit Glutamax, 10%FBS, 2%B27, 1% AA, 1 % NEAA, alle Thermo Fisher Scientific, 100 pM Taurin)
- PBS ohne Magnesium/Calcium (PBS“, Thermo Fisher Scientific)
- TrypLE (Thermo Fisher Scientific)
- 1 ,5 ml Reaktionsgefäße - 15 ml konisches Röhrchen
- Heizblock für Röhrchen
- Nicht-adhärente 24- oder 48-Well-Platten
- 1000 pl Pipettenspitzen mit abgeschnittenen Spitzen (mit einer Schere)
- Wasserbad bei 37°C
- Eimer mit Eis
- Mikroschere (FST)
- Nicht-gewebebehandelte v-förmige 96-Well-Platte (Sarstedt)
[0080] Die Herstellung der astrozytenenthaltenden Linkerspheres ist wie folgt:
[0081] Humane iPSC-abgeleitete Astrozyten (AC) wurden gemäß Krencik et al. 2011 (Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells, Nat. Protoc. 6(11): 1710-7, doi:10.1038/nprot.2011.405) differenziert. Für jedes Experiment werden die Astrozyten aufgetaut und auf 24- oder 48-Well-Platten in ASC++ Medium kultiviert. 6-7 Tage vor Beginn des Experiments werden die AC mit 1 ng/ml CNTF in ASC++ Medium behandelt, wobei das Medium jeden zweiten Tag gewechselt wird. Mindestens eine volle Vertiefung wird sehr sorgfältig mit PBS" gewaschen und 2 Minuten lang in TrypLE bei 37°C inkubiert, um die AC abzulösen. Nachdem sichergestellt wurde, dass die Zellen vereinzelt sind, wird N2-Medium in der doppelten Menge des TrypLE-haltigen Mediums zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Die Zellen werden in ein konisches 15- ml-Röhrchen überführt und 2 Minuten lang bei 1500 g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und die Zellen werden in einem angemessenen Volumen von N2-Medium re- suspendiert, um die Zellen (etwa 500pl-1 OOOpI) in einer Neubauer-Zählkammer zu zählen, das 1 :1 mit Trypanblau verdünnt ist, um tote Zellen sichtbar zu machen. Die erforderliche Anzahl von Zellen wird in einen 1 ,5 ml Eppendorf-Behälter überführt. Zur Herstellung von 1 Astrolinker mit einer Größe von 2,5 pl pro Linker werden 10 000 Zellen benötigt.
[0082] Die gesammelten Zellen werden dann erneut 2 Minuten lang bei 800 g pelletiert. Der Überstand wird sorgfältig und so vollständig wie möglich verworfen. Das Zellpellet wird dann in kaltem BRDM-Medium resuspendiert, um 1 ,25 pl pro Astrolinker zu erreichen (z.B. für 10 Linker/100.000 Zellen werden 10 pl Medium verwendet). Anschließend wird auf Eis gelagert. Wachstumsfaktor-reduziertes Matrigel (das über Nacht im Kühlschrank aufgetaut wurde), wird im Verhältnis 1:1 zur gekühlten Zellsuspension gegeben und die Lösung vorsichtig und gründlich gemischt, wobei Blasenbildung vermieden wird. Um die Linker später besser sichtbar zu machen, kann das Matrigel mit Tinte oder anderen Farbstoffen versetzt werden. Hier wurden 5 % einer 1 :1000-Verdünnung von Tinte in PBS" verwendet.
[0083] Vor Beginn des Verfahrens werden 1,5-ml-Reaktionsröhrchen (1 Röhrchen pro Astrolinker) mit ~50 pl Mineralöl gefüllt und bis zur Verwendung bei Raumtemperatur aufbewahrt.
[0084] 2,5 pl der Astrozyten-Matrigel-Mischung werden dann mit einer dünnen 10 pl Pipettenspitze (möglichst vorgekühlt) in das mit Mineralöl gefüllte Reaktionsgefäß überführt. Zur Herstellung der Linker wird die Pipette mit ihrer Spitze, die 2,5 pl Astrozyten-Matrigel-Mix enthält, direkt über die Oberfläche der Ölflüssigkeit gehalten und dann bis zum ersten Druckpunkt gedrückt. Auf diese Weise bildet sich ein Tropfen an der Vorderseite der Pipette. Durch Eintauchen der Pipettenspitze und des Tropfens in die Ölflüssigkeit löst sich der Tropfen von der Spitze und sinkt in die Flüssigkeit. Die restliche Flüssigkeit in der Pipette wird verworfen. Das Röhrchen, das den Linker enthält, wird so schnell wie möglich in einen Heizblock (37 °C) gebracht, um eine schnelle Verfestigung zu ermöglichen. Dies ist notwendig, um zu vermeiden, dass die Zellen ungleichmäßig im Tropfen verteilt werden. Die Röhrchen werden dann für 15-30 Minuten bei 37 °C inkubiert.
[0085] Nach der Inkubation werden ca. 200 pl vorgewärmtes PBS" (37 °C) zugegeben. Dies wird so durchgeführt, dass die gebildete Linkersphere von der Öl- in die wässrige Phase übergeht. Die Linkersphere plus das PBS" (und so wenig Öl wie möglich) werden in eine Petrischale (z.B. 6 cm) mit auf 37 °C vorgewärmtem PBS" überführt. Hierfür wird eine abgeschnittene 1000 pl Spitze verwendet, um die Beschädigung der Linkerspheres zu vermeiden. Auf diese Weise werden die Linkerspheres gewaschen, und das Öl wird entfernt. Die Waschschritte können wiederholt werden, um die Ölreste zu entfernen. Die gewaschenen Astrolinker werden in eine nicht-gewebebehandelte 48-Well-Platte transferiert, die 250 pl auf 37 °C vorgewärmtes ASC++ enthält. Auch hier werden abgeschnittene Spitzen verwendet. Die Astrolinker werden bei 37 °C, 20 % O2 und 5 % CO2 mindestens über Nacht kultiviert und das Medium wird bis zur weiteren Verwendung oder Fixierung alle 2-3 Tage gewechselt (halber Mediumwechsel).
[0086] In der Fig. 2a ist der Astrolinker schematisch dargestellt. Fig. 2b zeigt einen Astrolinker (Linkersphere mit Astrozyten beladen) nach einem Tag in Kultur. Fig. 2c zeigt einen Astrolinker mit Astrozyten, die zuvor mit einem lentiviralen Konstrukt (Lenti-GFAP-GFP) trans- fiziert wurden, die ein grünfluoreszierendes Protein (GFP) unter einem 'glial fibrillary acidic protein (GFAP) Promotor exprimiert. Die Fig. 2d und Fig. 2e zeigen einer dreidimensionale Rekonstruktion des Teils eines Astrolinkers, in welchem die Astrozyten, wie in 2c, GFP unter einem GFAP-Promoter exprimieren. Die Fig. 2d) zeigt ein in Magenta eingefärbtes Bild der Fluoreszenz, Fig. 2e ein höhenkodiertes Falschfarbenbild.
Linkerspheres ohne Zellen
[0087] Für die Herstellung von zellfreien Linkerspheres wird das gleiche Protokoll wie oben verwendet.
[0088] Anstelle von Astrozyten wird dem GFR-Matrigel nur Medium (z. B. BRDM) zugesetzt. Alle nachfolgenden Schritte bleiben gleich. Zellfreie Linkerspheres können in jedem 37 °C vorgewärmten Medium oder Puffer kultiviert werden. 2. Herstellung von Doppel-Verbindungen
[0089] Humane iPSZ-abgeleitete Retinoid-Organoide (RO), die gemäß einem zuvor veröffentlichten Protokoll (Zhong et al. 2014, Achberger et al. 2019) differenziert wurden, werden nach 40-80 Tagen der Differenzierung ausgewählt.
[0090] Am Tag 1 (Tag nach der Linker-Produktion), vor der Verbindung, werden die RO mit einer Mikroschere in zwei Teile geschnitten und in eine nicht-gewebebehandelte 96-Well-V- Form-Platte übertragen. In jede Vertiefung wird ein halbes Organoid gegeben. Dann wird eine Astrolinker- oder zellfreie Linkersphere mit einer 10OQ- l-Spitze in die Vertiefungen mit den RO gegeben. Mit einer kleinen Nadel oder Pipettenspitze werden die RO und der Linker unter einem Mikroskop positioniert. Das RO wird so positioniert, dass die aufgeschnittene Seite die Astrolinker/Linkersphere direkt berührt. Die Platte wird dann äußerst vorsichtig (ohne die Positionierung zu stören) in einen Inkubator (37 °C, 20% O2, 5% CO2) platziert.
[0091] Die Herstellung von Triple-Verbindungen, erfolgt optional am darauffolgenden Tag oder zu einem beliebigen späteren Zeitpunkt.
3. Herstellung von Triple-Verbindungen
[0092] Einen Tag später werden Thalamus-Organoide (TO), die nach einem zuvor veröffentlichten Protokoll (Xiang 2019) differenziert wurden, nach 40-80 Tagen der Differenzierung ausgewählt. Die einzelnen TO werden in die 96-Well-V-Form-Platte gegeben, die die Doppel-Verbindung (Astrolinker/Linkersphere + RO) enthält. Die Triple-Verbindung erfolgt wiederum mit einer kleinen Nadel oder Spitze, wobei das Thalamus-Organoid direkt auf der gegenüberliegenden Seite des am Astrolinker/Linkersphere befestigten Retina-Organoids platziert wird. Dies ist von entscheidender Bedeutung, damit sich die Zellverbindung durch den Astrolinker und nicht direkt bilden muss. Ohne sich zu bewegen, wird die Platte über Nacht im Inkubator bei 37 °C, 20% O2 und 5% CO2 gelagert.
[0093] Die Kultivierung der Triple-Verbindung erfolgt optional am darauffolgenden Tag. [0094] Der Verbindungsvorgang ist schematisch in der Fig. 3 dargestellt. Der Maßstabsbalken in den beiden in der Figur unten dargestellten mikroskopischen Aufnahmen entspricht einer Strecke 1000 pm.
4. Kultivierung der Triple-Verbindungen
[0095] Am nächsten Tag wird eine nicht-gewebebehandelte 48- Well-Platte mit 250 pl auf 37 °C vorgewärmtem BRDM-Medium vorbereitet. Die Triple-Verbindungen werden in diese 48- Well-Platte übertragen (mit abgeschnittenen 1000-pl-Spitzen) und erneut bei 37 °C, 20% O2, 5% CO2 inkubiert. Um die Projektionen zwischen RO und TO zu sehen, werden die Linker unter dem Mikroskop überprüft. Dazu kann die RO z.B. stabil mit GFP transduziert werden (z.B. mit lentiviralen Vektoren). Der Mediumwechsel bei Doppel- oder Triple-Verbindungen erfolgt jeden zweiten bis dritten Tag mit warmem BRDM-Medium (250 pl pro Well, halber Mediumwechsel).
[0096] In der Fig. 4b ist in einer mikroskopischen Aufnahme das Ergebnis des Verbindungsvorgangs zwischen einer Linkersphere und einem retinalen Organoid dargestellt. In der Fig. 4b ist der Komplex in einer Suspensionskultur gezeigt. In der Fig. 4c ist das Auswachsen von Neuriten aus dem Organoid in die Linkersphere erkennbar. Fig. 4d zeigt das Ergebnis einer einfachen Verlinkung von retinalem Organoid und Linkersphere, die Fig. 4e zeigt das Ergebnis einer Doppel-Verbindung. Die Astrozyten sind mit GFP markiert und dementsprechend eingefärbt.
[0097] In der Fig. 5 ist eine Doppel-Verlinkung einer Linkersphere mit einer Neuosphere auf der einen Seite und einem retinalen Organoid auf der anderen Seite dargestellt. Die Neuosphere ist mit dem retinalen Organoid über Nervenbahnen verbunden, die sich durch die Linkersphere ziehen. In der Fig. 6 ist gezeigt, dass GFP-markierte Zellen des retinalen Organoids im Inneren der Neurosphere projizieren und positiv für den Ganglienzell-Marker NEFM sind.
[0098] In der Fig. 7 ist eine Doppel-Verlinkung eines Astrolinkers mit einer Neuosphere auf der einen Seite und einem retinalen Organoid auf der anderen Seite dargestellt. Die Neuosphere ist mit dem retinalen Organoid über Nervenbahnen verbunden, die sich durch die Linkersphere ziehen.
[0099] In der Fig. 8 ist ein komplexes Sehnervenmodell schematisch dargestellt. Das komplexe Sehnervenmodell, z. B. zur Modellierung eines Glaukoms, besteht aus einem retinalem Organoid, das retinale Ganglienzellen enthält, zwei Linkern, gefüllt mit Oligodendrozyten (myelinisierter Teil des Sehnervs) + Astrozyten (intra-retinalen Teil des Sehnervs)) + Hirnorganoide (gemustert z. B. für Diencephalon oder Metathalamus).
[00100] In der Fig. 9 ist schematisch gezeigt, wie mittels der Linkershperes die Gefäßvaskularisie- rung unterstützt werden kann, z.B. durch Verbindung von Gewebeorganoiden mit Blutgefäßorganoiden.
[00101] In den Fig. 10a und 10b sind Multi-Verlinkungskonzepte gezeigt. Linkerspheres erlauben es, mehrere Organoide und verschiedene konnektive Konzepte (z.B. neuronale Verbindungen, Vaskularisierung) zu kombinieren. Linkerspheres könnten möglicherweise das Wachstum/den Zusammenbau von komplexen multiorganoiden und multizellularen Geweben einschließlich Nervenwachstum und Vaskularisierung erleichtern.

Claims

24
Patentansprüche Verfahren zur Herstellung von biokompatiblen Strukturen zur Verbindung und Kultivierung von biologischem Material ("Linkerspheres"), das folgende Schritte aufweist:
1) Bereitstellen einer unpolaren, mit Wasser nicht mischbaren, biokompatiblen Flüssigkeit;
2) Einbringen einer Lösung eines biokompatiblen Matrixmaterials in die Flüssigkeit zum Erhalt einer Emulsion;
3) Inkubation der Emulsion;
4) Ausbildung einer dreidimensionalen Struktur aus dem Matrixmaterial in der Emulsion durch die Inkubation zum Erhalt der Linkerspheres. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der unpolaren, mit Wasser nicht mischbaren, biokompatiblen Flüssigkeit um Mineralöl handelt. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Matrixmaterial um eine basalmembranartige Matrix handelt. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (2) eine Lösung einer wachstumsfaktorreduzierten basalmembranartigen Matrix eingebracht wird. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (3) eine Behandlung der Emulsion zur Verfestigung des Matrixmaterials erfolgt. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung eine Beaufschlagung mit Wärme, vorzugsweise bei ca. 37 °C, weiter vorzugsweise für ca. 15 bis 30 Minuten, aufweist. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung des Matrixmaterials Zellkulturmedium aufweist. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung des Matrixmaterials biologische Zellen aufweist. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung des Matrixmaterials einen Farbstoff aufweist. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (2) die Lösung des Matrixmaterials als Fluidtropfen in das Mineralöl eingebracht wird. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Einbringen der Lösung in das Mineralöl als Fluidtropfen über eine Pipettenspitze erfolgt. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt (4) folgender Schritt durchgeführt wird:
5) Isolieren der Linkerspheres aus der Emulsion. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt (5) folgender Schritt durchgeführt wird:
6) Waschen der isolierten Linkerspheres, vorzugsweise mit einer wässrigen Lösung, weiter vorzugsweise mit Zellkulturmedium. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt (4) und vor Schritt (5) folgender Schritt durchgeführt wird:
4') Einbringen einer wässrigen Lösung, vorzugsweise einer wässrigen Pufferlösung, in die Emulsion zur Ausbildung einer wässrigen Phase und Überführung der Linkerspheres in die wässrige Phase. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die isolierten und ggf. gewaschenen Linkerspheres in ein Kulturgefäß, vorzugsweise eine Kulturschale überführt werden. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die isolierten und ggf. gewaschenen und ggf. überführten Linkerspheres kultiviert werden, vorzugsweise bei ca. 37 °C, weiter vorzugsweise bei ca. 20 Vol.-% O2, weiter vorzugsweise bei ca. 5 Vol.-% CO2, weiter vorzugsweise für zumindest ca. 12 Stunden. Verfahren zur Kultivierung von Aggregaten aus biologischem Material, das folgende Schritte aufweist:
1) ln-kontakt-bringen der Aggregate mit biokompatiblen Strukturen zur Verbindung und Kultivierung von biologischem Material ("Linkerspheres") in einem geeigneten Medium zum Erhalt eines Komplexes aus den Aggregaten und den Linkerspheres,
2) Kultivierung der Komplexe aus den Aggregaten und den Linkerspheres, dadurch gekennzeichnet, dass die Linkerspheres gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16 erhalten wurden. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Aggregate aus biologischem Material vor dem ln-kontakt-bringen mit den Linkerspheres geschnitten werden, vorzugsweise mit einer Mikroschere. 27 Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das die Aggregate mit der Schnittfläche mit den Linkerspheres in Kontakt gebracht werden. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung bei ca. 37 °C, vorzugsweise bei ca. 20 Vol.-% O2, weiter vorzugsweise bei ca. 5 Vol.-% CO2 erfolgt. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Aggregate aus biologischem Material Organoide oder/und Sphäroide und/oder As- sembloide sind. Verfahren nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, dass die Aggregate aus biologischem Material ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: retinales Organoid, vaskuläres Organoid, Hirnorganoid, Neurosphäroid, Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass die Aggregate aus biologischem Material Astrozyten aufweisen, vorzugsweise solche, die sich von induzierten, pluripotenten Stammzellen (iPSC) ableiten. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt (2) folgender Schritt durchgeführt wird:
(3) Wiederholen der Schritte (1) und (2). Verwendung von Linkerspheres, die gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16 erhalten wurden, zur Verbindung und Kultivierung von biologischem Material.
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