DE102016224702B4 - Verfahren zur Verbesserung der Kulturbedingungen von Kulturen von primären Schweißdrüsenzellen und/oder dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten - Google Patents

Verfahren zur Verbesserung der Kulturbedingungen von Kulturen von primären Schweißdrüsenzellen und/oder dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten Download PDF

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Abstract

Verfahren zur Verbesserung der Kulturbedingungen von Kulturen von primären Schweißdrüsenzellen und/oder dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten, umfassend die folgenden Verfahrensschritte:a) Bereitstellen mindestens einer Kultur von primären Schweißdrüsenzellen und/oder mindestens eines dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents mit 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen sowie einem Durchmesser von 100 bis 6.000 µm,b) Kultivieren der unter Schritt a) bereitgestellten mindestens einen Zellkultur von primären Schweißdrüsenzellen und/oder dem mindestens einen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalent in einem Kulturmedium, welchesb1) mindestens einen Neurotransmitter in einer Gesamtkonzentration von 2,0 µM bis 30 mM und/oderb2) 11 bis 100 ng/ml mindestens eines Wachstumsfaktors in einer Gesamtkonzentration von 11 ng/ml bis 80 ng/ml enthält.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein zur Verbesserung der Kulturbedingungen von Kulturen von primären Schweißdrüsenzellen und/oder dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten, bei welchem zunächst eine Kultur von primären Schweißdrüsenzellen und/oder dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten mit 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen sowie einem Durchmesser von 100 bis 6.000 µm bereitgestellt und diese anschließend in einem Kulturmedium, enthaltend mindestens einen Neurotransmitter und/oder mindestens 11 ng/ml Wachstumsfaktor, kultiviert werden. Die Kultivierung dieser Zellen und Modelle in einem Kulturmedium, welches mindestens einen Neurotransmitter und/oder mindestens 11 ng/ml Wachstumsfaktor enthält, führt zu einer Erhöhung von Schweißdrüsen-spezifischen Markerproteinen im Vergleich zur Kultivierung ohne Zusatz von Neurotransmitter(n) und/oder mindestens 11 ng/ml Wachstumsfaktor(en). Hierdurch kann ein Funktionsverlust der kultivierten Zellen, welcher bei Abwesenheit bzw. nur geringer Expression dieser Marker auftritt, vermieden werden.
  • Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung mindestens eines Neurotransmitters und/oder mindestens eines Wachstumsfaktors zur Verbesserung der Kulturbedingungen von Kulturen von primären Schweißdrüsenzellen und/oder dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten. Durch Zusatz dieser Verbindungen wird eine Erhöhung von Schweißdrüsen-spezifischen Markerproteinen erhalten und auf diese Weise ein Funktionsverlust der kultivierten Zellen vermieden.
  • Das Waschen, Reinigen und Pflegen des eigenen Körpers stellt ein menschliches Grundbedürfnis dar und die moderne Industrie versucht fortlaufend, diesen Bedürfnissen des Menschen in vielfältiger Weise gerecht zu werden. Besonders wichtig für die tägliche Hygiene ist die anhaltende Beseitigung oder zumindest Reduzierung des Körpergeruchs und der Achselnässe. Achselnässe und Körpergeruch entstehen durch die Sekretion aus ekkrinen und apokrinen Schweißdrüsen in der humanen Achselhöhle. Während die ekkrinen Drüsen der Thermoregulation des Körpers dienen und für die Entstehung der Achselnässe verantwortlich sind, scheiden die apokrinen Drüsen ein viskoses Sekret in Reaktion auf Stress ab, aus welchem durch bakterielle Zersetzung unangenehmer Körpergeruch entsteht.
  • Erste Forschungsarbeiten an nativen ekkrinen und apokrinen Schweißdrüsen wurden bereits Anfang des 20. Jahrhunderts durchgeführt, um diese zur Gruppe der exokrinen Drüsen gehörenden Hautanhangsgebilde zu klassifizieren. Schweißdrüsen lassen sich hiernach in apokrine und ekkrine Schweißdrüsen sowie eine Mischform aus apokrinen und ekkrinen Schweißdrüsen (auch als apoekkrine Schweißdrüse bezeichnet) einteilen. Die zuvor genannten Formen können anhand morphologischer und charakteristischer Merkmale unterschieden werden.
  • Die ekkrine Schweißdrüse, insbesondere die humane ekkrine Schweißdrüse, gehört zu den unverzweigten gewunden tubulären Drüsen und lässt sich in das sekretorische Endstück (auch als Coil bezeichnet), den dermalen Ausführgang (auch als Dukt bezeichnet) sowie den epidermalen Ausführgang (auch als Acrosyringium bezeichnet) unterteilen. Die in diesen Drüsenabschnitten vorhanden Zellen weisen unterschiedliche Aufgaben und Funktionen auf, wie beispielsweise die Sekretion im Coil, Rückresorption von Ionen im Dukt sowie Abgabe des Sekrets, insbesondere des Schweißes, an die umliegende Haut durch das Acrosyringium. Die ekkrinen Schweißdrüsen werden hauptsächlich durch den Neurotransmitter Acetylcholin (ACh) stimuliert, jedoch ist auch eine purinerge (beispielsweise durch ATP/UTP) sowie eine aß-adrenerge (beispielsweise durch Noradrenalin) Stimulation möglich.
  • Im Hinblick auf die Vermeidung von Achselnässe und/oder Körpergeruch ist es daher wünschenswert, die Sekretion aus ekkrinen und/oder apokrinen Schweißdrüsen zu vermindern und/oder zu vermeiden. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass die Ausführungsgänge der ekkrinen Schweißdrüsen mittels sogenannter Plugs verstopft. Hierzu werden im Stand der Technik schweißhemmende Aluminium- und/oder Aluminium-Zirkoniumsalze eingesetzt, welche jedoch vom Verbraucher als kritisch empfunden werden. Weiterhin werden im Stand der Technik antibakterielle Mittel eingesetzt, welche den bakteriellen Abbau des Schweißes verhindern. Derartige Mittel können jedoch die natürliche Mikroflora der Haut unter der Achselhöhle negativ beeinflussen. Es ist daher wünschenswert, kosmetische Mittel bereitzustellen, welche in der Lage sind, die Achselnässe und/oder den Körpergeruch zuverlässig zu verhindern und welche frei von Aluminium- und/oder Aluminium-Zirkoniumsalzen sowie antibakteriell wirkenden Verbindungen sind. Eine Möglichkeit zur Bereitstellung derartiger Mittel besteht in dem Einsatz von Substanzen, welche die Stimulierung und/oder die biologischen Prozesse der Schweißdrüsen effektiv hemmen und somit die Schweißsekretion vermindern bzw. vermeiden. Um derartige Substanzen zu identifizieren, können in-vivo Tests mit Versuchsteilnehmern durchgeführt werden. Solche Tests sind jedoch aufwändig und erlauben keine Screeningverfahren mit hohen Durchsatzraten. Weiterhin können in-vitro Tests unter Einsatz von Zellkulturen und/oder Zellmodellen von Schweißdrüsen eingesetzt werden, an welchen der Einfluss von Testsubstanzen auf die Stimulation der Schweißdrüsen untersucht werden kann.
  • Damit die in-vitro erhaltenen Testergebnisse gut auf die in-vivo Situation übertragbar sind, müssen die eingesetzten Zellen bzw. Zellmodelle der Schweißdrüse die in-vivo-Situation möglichst genau nachbilden. Hierzu ist es wünschenswert, dass in den Zellkulturen und/oder Zellmodellen von Schweißdrüsen eine möglichst hohe Menge an schweißdrüsenspezifischen Markerproteinen exprimiert wird. Die im Stand der Technik bislang bekannten Bedingungen zur Kultivierung von Schweißdrüsenzellen und deren Zellmodellen resultieren jedoch in einer nur geringen Expression der zuvor genannten Markerproteine.
  • Aus der DE 10 2016 217 182 A1 ist eine Kultur von dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten bekannt, die das Bereitstellen von dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten mit 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen mit einem Durchmesser von 200 bis 1.500 µm und Kultivieren mit 10 ng/ml EGF oder Neurotransmitter umfasst.
  • Es besteht daher ein Bedarf an Verfahren zur Optimierung der Kulturbedingungen von Zellkulturen und/oder Zellmodellen von Schweißdrüsenzellen, um eine Erhöhung der Exprimierung von Schweißdrüsenspezifischen Markerproteinen zu erreichen.
  • Der vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Optimierung der Kulturbedingungen von Zellkulturen und/oder Zellmodellen von Schweißdrüsenzellen bereitzustellen.
  • Es wurde nun überraschend gefunden, dass der Zusatz von mindestens einem Neurotransmitter und/oder mindestens 11 ng/ml Wachstumsfaktor zu dem Kulturmedium während der Kultivierung der Zellkulturen und/oder Zellmodelle von Schweißdrüsenzellen zu einer Erhöhung der Expression von Schweißdrüsenspezifischen Markerproteinen führt. Auf diese Weise kann ein Funktionsverlust dieser Markerproteine in der Kultur vermieden und die in-vivo-Situation verbessert abgebildet werden.
  • Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Verbesserung der Kulturbedingungen von Kulturen von primären Schweißdrüsenzellen und/oder dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten, umfassend die folgenden Verfahrensschritte:
    1. a) Bereitstellen mindestens einer Kultur von primären Schweißdrüsenzellen und/oder mindestens eines dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents mit 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen sowie einem Durchmesser von 100 bis 6.000 µm,
    2. b) Kultivieren der unter Schritt a) bereitgestellten mindestens einen Zellkultur von primären Schweißdrüsenzellen und/oder dem mindestens einen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalent in einem Kulturmedium, welches
      • b1) mindestens einen Neurotransmitter in einer Gesamtkonzentration von 2,0 µM bis 30 mM und/oder
      • b2) 11 ng/ml bis 100 ng/ml mindestens eines Wachstumsfaktors in einer Gesamtkonzentration von 11 ng/ml bis 80 ng/ml enthält.
  • Der Zusatz von mindestens einem Neurotransmitter und/oder 11 bis 100 ng/ml mindestens eines Wachstumsfaktors während der Kultivierung der Schweißdrüsenzellen und/oder Schweißdrüsenäquivalente führt zu einer erhöhten Expression von Schweißdrüsenspezifischen Markerproteinen, wie beispielsweise Aquaporin-5. Bei Aquaporin 5 (AQP5) handelt es sich um ein Wasserkanal-Protein, welches bei der Bildung von Schweiß eine Rolle spielt. Durch die erhöhte Expression derartiger Proteine wird ein Funktionsverlust innerhalb der Zellkulturen vermieden und auf diese Weise die in-vivo-Situation besser abgebildet. Somit lassen sich die mit diesen Kulturen erhaltenen Ergebnisse in Bezug auf die Wirksamkeit von schweißhemmenden Verbindungen besser auf die in-vivo-Situation übertragen.
  • Unter dem Begriff „Verbesserung der Kulturbedingungen“ wird erfindungsgemäß die Erhöhung der Expression von Schweißdrüsenspezifischen Markerproteinen, wie beispielsweise Aquaporin 5, durch Einsatz von Neurotransmittern in einer Gesamtkonzentration von 2,0 µM bis 30 mM und/oder 11 bis 100 ng/ml mindestens eines Wachstumsfaktors in einer Gesamtkonzentration von 11 ng/ml bis 80 ng/ml verstanden. Hierzu werden bevorzugt Kulturen, welche während der Kultivierung mit den zuvor gennannten Verbindungen behandelt wurden mit Kulturen, welche ohne Zusatz dieser Verbindungen kultiviert wurden, verglichen.
  • Weiterhin wird unter einem dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalent erfindungsgemäß ein Zellmodell aus Schweißdrüsenzellen verstanden, welches eine Ausdehnung in alle drei Raumrichtungen aufweist und in welchem die Zellen eine ähnliche Funktion, insbesondere eine identische Funktion, wie die Zellen einer nativen Schweißdrüse zeigen.
  • Zudem wird unter einem Kulturmedium, welches auch als Nährmedium bezeichnet wird, ein vorzugsweise flüssiges Medium zur Kultivierung der primären Schweißdrüsenzellen und/oder dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente verstanden.
  • Unter einem Neurotransmitter wird erfindungsgemäß eine Verbindung verstanden, welche in der Lage ist, einen Neurorezeptor (auch als Membranrezeptorprotein bezeichnet) zu stimulieren bzw. zu inhibieren. Aufgrund der Struktur und Ladungsverteilung der Neurotransmitter erfolgt eine spezifische Bindung an die entsprechenden Membranproteine. Durch die Bindung des Neurotransmitters wird eine Umformung des Rezeptorproteins ausgelöst. Diese Umformung führt entweder direkt (auch als ionotrop bezeichnet) oder mittelbar (auch als metabotrop bezeichnet) zur Öffnung bestimmter lonenkanäle der Zelle in dieser Region. Die Stärke der Ionenströme ist hierbei abhängig von der Zahl an gebunden Neurotransmittern. In der Regel ist die Bindung der Neurotransmitter an die Membranrezeptormoleküle reversibel, so dass nur eine vorübergehende Öffnung der lonenkanäle erfolgt.
  • Schließlich werden unter Wachstumsfaktoren erfindungsgemäß Proteine verstanden, welche zur Signalübertragung zwischen Zellen dienen. Die Signalübertragung erfolgt hierbei durch Bindung des Wachstumsfaktors an einen spezifischen Rezeptor an der Oberfläche der Zellmembran. Die Wachstumsfaktoren können entweder von der Zelle in die Umgebung abgegeben werden oder membranständig sein. Bei Bindung des Wachstumsfaktors an den entsprechenden Rezeptor erfolgt eine Konformationsänderung dieses Rezeptors. Diese Konformationsänderung löst im Inneren der Zelle Signale aus, welche beispielsweise über weitere Signalübertragungen zur Aktivierung oder Abschaltung von Genen führen.
  • In Verfahrensschritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Kultur von primären Schweißdrüsenzellen und/oder ein dreidimensionales Schweißdrüsenäquivalent bereitgestellt.
  • Dieses dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent weist eine bestimmten Zellzahl sowie einen bestimmten Durchmesser auf.
  • Hierbei ist es erfindungsgemäß vorteilhaft, wenn es sich bei der Kultur von primären Schweißdrüsenzellen um bestimmte Kulturen handelt. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind daher dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der in Verfahrensschritt a) bereitgestellten mindestens einen Kultur von primären Schweißdrüsenzellen um eine Monolayer-Kultur dieser Schweißdrüsenzellen handelt. Der Einsatz derartiger Monolayer-Kulturen führt bei Zugabe von Neurotransmittern in einer Gesamtkonzentration von 2,0 µM bis 30 mM und/oder 11 bis 100 ng/ml mindestens eines Wachstumsfaktors in einer Gesamtkonzentration von 11 ng/ml bis 80 ng/ml zu einer besonders hohen Expression von Schweißdrüsenspezifischen Markerproteinen.
  • Um eine gute Vergleichbarkeit mit der in-vivo Situation zu gewährleisten werden in Verfahrensschritt a) bevorzugt Monolayer-Kulturen eingesetzt, welche aus ekkrinen und/oder apokrinen humanen Schweißdrüsen hergestellt wurden. Es ist daher erfindungsgemäß vorteilhaft, wenn es sich bei der in Verfahrensschritt a) bereitgestellten mindestens einen Kultur von primären Schweißdrüsenzellen um eine ekkrine und/oder apokrine humane primäre Monolayer-Kultur dieser Schweißdrüsenzellen handelt. Derartige Kulturen können beispielsweise durch Isolierung von nativen ekkrinen und/oder apokrinen Schweißdrüsen aus menschlichen Hautbiopsien mittels enzymatischem Verdau sowie Herstellung einer Zellpräparation aus diesen isolierten Schweißdrüsen erhalten werden. Diese Zellpräparation wird anschließend zur Herstellung der in Verfahrensschritt a) eingesetzten Monolayer-Kulturen verwendet.
  • In Verfahrensschritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann es zudem vorgesehen sein, anstelle oder neben der Kultur an primären Schweißdrüsenzellen mindestens ein dreidimensionales Schweißdrüsenäquivalent bereitzustellen. Diese Schweißdrüsenäquivalente weisen Durchmesser von 100 bis 6.000 µm auf. Es hat sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung jedoch als vorteilhaft erwiesen, wenn die bereitgestellten dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente geringere Durchmesser aufweisen. Es ist daher erfindungsgemäß bevorzugt, wenn das in Verfahrensschritt a) bereitgestellte mindestens eine dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent einen Durchmesser von 100 bis 4.000 µm, vorzugsweise von 100 bis 2.000 µm, insbesondere von 200 bis 1.500 µm, aufweist. Der Durchmesser der bevorzugt kugelförmigen Schweißdrüsenäquivalente kann beispielsweise mittels mikroskopischer Vermessung unter Verwendung der Software „CellSens“ bestimmt werden, wobei sich obige Werte auf den Durchmesser an der breitesten bzw. längsten Stelle eines einzelnen Schweißdrüsenäquivalents beziehen.
    Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, wenn die in Verfahrensschritt a) bereitgestellten Schweißdrüsenäquivalente frei sind von Matrixverbindungen und/oder Trägern. Unter Matrixverbindungen sind hierbei Verbindungen zu verstehen, welche zur Ausbildung räumlicher Netzwerke in der Lage sind. Hierunter fallen jedoch nicht die von den Zellen der Äquivalente selbst produzierten und ausgeschiedenen Substanzen, welche zur Ausbildung räumlicher Netzwerke in der Lage sind. Weiterhin werden unter Trägern im Sinne der vorliegenden Erfindung selbsttragende Stoffe verstanden, welche als Unterlage bzw. Gerüst für die Schweißdrüsenzellen dienen können. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist daher das in Verfahrensschritt a) bereitgestellte mindestens eine dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent frei von Matrixverbindungen und/oder Trägern, insbesondere frei von Matrixverbindungen und Trägern.
  • Unter dem Begriff „frei von“ wird erfindungsgemäß verstanden, dass die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente weniger als 1 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents, an Matrixverbindungen und/oder Träger enthalten. Es ist daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorteilhaft, wenn die in Verfahrensschritt a) bereitgestellten dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente 0 bis 1 Gew.-%, vorzugsweise 0 bis 0,5 Gew.-%, bevorzugt 0 bis 0,2 Gew.-%, insbesondere 0 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents, an Matrixverbindungen und Trägern enthalten.
  • In diesem Zusammenhang ist es besonders vorteilhaft, wenn die in Verfahrensschritt a) bereitgestellten dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente frei sind von bestimmten Matrixverbindungen und Trägern. Es ist daher bevorzugt, wenn das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent keine Matrixverbindungen und/oder Träger enthält, welche ausgewählt sind aus der Gruppe von Collagenen, insbesondere Collagen Typ I und/oder Typ III und/oder Typ IV, Scleroproteinen, Gelatinen, Chitosanen, Glucosaminen, Glucosaminoglucanen (GAG), Heparinsulfatproteoglucanen, sulfatierten Glycoproteinen, Wachstumsfaktoren, vernetzten Polysacchariden, vernetzten Polypeptiden sowie deren Mischungen.
  • Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem in Verfahrensschritt a) bereitgestellten dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalent um ein Äquivalent der ekkrinen und/oder apokrinen humanen Schweißdrüse. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind daher dadurch gekennzeichnet, dass das in Verfahrensschritt a) bereitgestellte mindestens eine dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent ein dreidimensionales Schweißdrüsenäquivalent der ekkrinen und/oder apokrinen humanen Schweißdrüse ist. Mit derartigen Schweißdrüsenäquivalenten kann die in-vivo Situation in der humanen Schweißdrüse besonders gut nachgestellt werden.
  • Darüber hinaus ist es erfindungsgemäß besonders bevorzugt, wenn das in Verfahrensschritt a) bereitgestellte dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent aus humanen ekkrinen und/oder apokrinen Schweißdrüsen hergestellt wurde. Es ist daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorteilhaft, wenn das in Verfahrensschritt a) bereitgestellte mindestens eine dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent ein aus ekkrinen und/oder apokrinen nativen humanen Schweißdrüsenzellen gewonnenes dreidimensionales Schweißdrüsenäquivalent ist.
  • Darüber hinaus hat es sich erfindungsgemäß als vorteilhaft erwiesen, wenn die in Verfahrensschritt a) bereitgestellten dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente mindestens eine bestimme Zellart aufweisen. Der Einsatz derartiger Äquivalente führt zu einer besonders guten Simulation der in-vivo Situation. Bevorzugt Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind daher dadurch gekennzeichnet, dass das in Verfahrensschritt a) bereitgestellte mindestens eine dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent mindestens eine Zellart, ausgewählt aus der Gruppe von (i) Coilzellen, insbesondere clear cells, dark cells, sowie Myoepitheliumzellen, (ii) Duktzellen sowie (iii) deren Mischungen enthält. Unter dem Begriff „clear cells“ werden erfindungsgemäß Zellen verstanden, welche ein klares bzw. ungefärbtes Cytoplasma bei Anfärbung mit Farbstoffen, insbesondere mit Hematoxylin und Eosin, aufweisen. Derartige „clear cells“ sind bevorzugt sekretorische Zellen des Epitheliums, welche sich bevorzugt in Kontakt mit dem Lumen befinden. Die Plasmamembran dieser Zellen ist an der apikalen und lateralen Oberfläche stark gefaltet. Das Cytoplasma dieser „clear cells“ enthält hohe Mengen an Glycogen sowie viele Mitochondrien. Die wässrige Komponente des Schweißes, welche Elektrolyte und anorganische Substanzen enthält, wird bevorzugt von dieser Zellart ausgeschieden. Hingegen sind die zuvor angeführten „dark cells“ Zellen, deren Vakuolen eine positive Anfärbung auf Mucopolysaccharidsäure aufweisen, deren Cytoplasma sich also durch Farbstoffe anfärben lässt. Diese „dark cells“ stehen in Kontakt mit der Basalmembran und weisen im Vergleich zu den „clear cells“ nur wenige Mitochondrien auf. Bevorzugt werden Makromoleküle, wie beispielsweise Glycoproteine, von diesen „dark cells“ abgeschieden. Unter den zuvor angeführten „Myoepithelzellen“ sind kontraktile Epithelzellen zu verstehen, welche ein Zytosklett mit sogenannten Gap junctions aufweisen und sich daher zusammenziehen können. Auf diese Weise wird die Sekretabgabe aus den Drüsenendstücken unterstützt. Derartige Zellen befinden sich bevorzugt zwischen der Basalmembran und den zuvor angeführten „clear cells“ und „dark cells“. Schließlich werden unter dem Begriff „Duktzellen“ erfindungsgemäß Zellen verstanden, welche die Wand des Duktes bilden und ein stratifiziertes kubisches Epithel aufweisen. Die zuvor angeführten Zellarten können neben der Anfärbung unter Verwendung von Hematoxylin und Eosin auch mittels immunzytochemischen Färbungen unter Einsatz von für diese Zellen spezifische Marker bestimmt werden. Ein für Myoepithelzellen einsetzbarer spezifischer Marker ist beispielsweise das alphasmooth muscle actin (auch als α-SMA bezeichnet). Als spezifische Marker für „clear cells“ eignet sich beispielsweise Substance P sowie S100. Weiterhin kann für „dark cells“ der unter der Bezeichnung CGRP (calcitonin-gene related peptide) bekannte Marker sowie für Duktzellen die spezifischen Marker Cytokeratin 10 (auch als CK10 bezeichnet) und CD200 verwendet werden.
  • Im Folgenden sind besonders bevorzugte in Verfahrensschritt a) bereitgestellte dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente beschrieben.
  • Eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Verfahrensschritts ist demnach die Bereitstellung eines dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents der ekkrinen und/oder apokrinen humanen Schweißdrüse, umfassend 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen, wobei das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent einen Durchmesser von 200 bis 1.500 µm aufweist.
  • Weiterhin ist eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Verfahrensschritts die Bereitstellung eines aus ekkrinen und/oder apokrinen nativen humanen Schweißdrüsenzellen gewonnenes dreidimensionales Schweißdrüsenäquivalent, umfassend 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen, wobei das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent einen Durchmesser von 200 bis 1.500 µm aufweist.
  • Darüber hinaus ist eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Verfahrensschritts die Bereitstellung eines dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents, umfassend 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen, wobei das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent einen Durchmesser von 200 bis 1.500 µm aufweist und mindestens eine Zellart, ausgewählt aus der Gruppe von clear cells, dark cells, Myoepitheliumzellen, Duktzellen sowie deren Mischungen enthält.
  • Zudem ist eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Verfahrensschritts die Bereitstellung eines aus ekkrinen und/oder apokrinen nativen humanen Schweißdrüsenzellen gewonnenes dreidimensionales Schweißdrüsenäquivalent, umfassend 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen, wobei das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent einen Durchmesser von 200 bis 1.500 µm aufweist und mindestens eine Zellart, ausgewählt aus der Gruppe von clear cells, dark cells, Myoepitheliumzellen, Duktzellen sowie deren Mischungen enthält.
  • Weiterhin ist eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Verfahrensschritts die Bereitstellung eines dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents der ekkrinen und/oder apokrinen humanen Schweißdrüse, umfassend 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen, wobei das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent einen Durchmesser von 200 bis 1.500 µm aufweist und 0 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents, an Matrixverbindungen und Trägern enthält.
  • Zudem ist eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Verfahrensschritts die Bereitstellung eines dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents der ekkrinen und/oder apokrinen humanen Schweißdrüse, umfassend 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen, wobei das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent einen Durchmesser von 200 bis 1.500 µm aufweist und 0 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents, an Matrixverbindungen und Trägern enthält, wobei die Matrixverbindungen und/oder Träger ausgewählt sind aus der Gruppe von Collagenen, insbesondere Collagen Typ I und/oder Typ III und/oder Typ IV, Scleroproteinen, Gelatinen, Chitosanen, Glucosaminen, Glucosaminoglucanen (GAG), Heparinsulfatproteoglucanen, sulfatierten Glycoproteinen, Wachstumsfaktoren, vernetzten Polysacchariden, vernetzten Polypeptiden sowie deren Mischungen.
  • Die in Verfahrensschritt a) bereitgestellten Monolayer-Kulturen von Schweißdrüsenzellen sowie die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente lassen sich beispielsweise durch die nachfolgend beschriebenen Verfahrensschritte herstellen.
  • In einem ersten Schritt werden zunächst isolierte Schweißdrüsen bereitgestellt, welche aus Hautbiopsien oder dergleichen erhalten werden können und welche aus ihrer natürlichen Umgebung entfernt wurden. Bevorzugt werden diese Schweißdrüsen durch Isolierung nativer Schweißdrüsen, insbesondere nativer ekkriner und/oder apokriner Schweißdrüsen, aus der menschlichen Haut erhalten, wobei die Isolierung der nativen Schweißdrüsen bevorzugt durch enzymatischen Verdau der menschlichen Haut unter Verwendung einer Mischung aus 2 bis 3 mg/ml Collagenase II und 0,1 bis 0,2 mg/ml Thermolysin für 3 bis 6 Stunden bei 35 bis 40 °C, insbesondere bei 37°C, erfolgt.
  • Aus diesen isolierten Schweißdrüsen wird durch Kultivierung eine Zellkultur hergestellt. Eine besonders gute Kultivierung der isolierten Schweißdrüsen wird erreicht, wenn eine Mischung aus DMEM und Ham's F12 im Gewichtsverhältnis 3:1, welche zusätzlich 10 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Mischung, fetales Kälber Serum (FCS), enthält, als Nährmedium verwendet wird. Die Kultivierung dieser Schweißdrüsen in dem zuvor beschriebenen Nährmedium erfolgt vorzugsweise für 7 bis 28 Tage, insbesondere für 14 Tage, bei einer Temperatur von 36 bis 38 °C und einem CO2-Gehalt von 5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der zur Kultivierung eingesetzten Atmosphäre.
  • Um die in Verfahrensschritt a) bereitgestellten Kulturen von primären Schweißdrüsenzellen zu erhalten werden die aus den isolierten Schweißdrüsen herauswachsenden Schweißdrüsenzellen abgelöst und erneut kultiviert.
  • Zur Herstellung der dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente wird eine Zellpräparation eingesetzt, welche durch Ablösung der aus den isolierten Schweißdrüsen herauswachsenden Schweißdrüsenzellen, Kultivierung dieser Zellen in Monolayer-Kulturen sowie Ablösung und Suspendierung in Nährmedium erhalten wird. Bevorzugt enthält die Zellpräparation eine Zellzahl der primären Schweißdrüsenzellen von 50 bis 250.00 Zellen pro µL Nährmedium, insbesondere 400 bis 600 Zellen pro µL Nährmedium. Um das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent zu erhalten werden 10 bis 100 µL, insbesondere von 40 bis 60 µL, dieser Zellpräparation in hängendem Zustand, also in Form eines von einer Oberfläche frei schwebend herabhängenden Tropfens, kultiviert. In diesem Zusammenhang hat sich die Verwendung sogenannter Hanging-Drop-Wells, wie beispielsweise kommerziell von der Firma Insphero als GravityPLUS®-Einsaatplatte mit SureDrop® Inlet-Einführsystem sowie GravityTRAP®-Ernteplatte erhältlich, als vorteilhaft erwiesen. Hierbei ist es bevorzugt, wenn während der Kultivierungsdauer, insbesondere nach 1 bis 3 Tagen, 40 Volumenprozent, bezogen auf das Gesamtvolumen der zuvor angeführten Zellpräparation, des Nährmediums der Zellpräparation durch frisches Nährmedium ersetzt werden. Die erhaltenen Äquivalente werden durch Zugabe von 50 bis 200 µL Nährmedium isoliert und können gemäß Verfahrensschritt b) kultiviert werden. Es kann jedoch auch vorgesehen sein, dass die isolierten Äquivalente zunächst erneut kultiviert werden, bevor Verfahrensschritt b) durchgeführt wird.
  • Die in Verfahrensschritt a) bereitgestellten dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente werden bevorzugt ausschließlich unter Verwendung von in-vitro Methoden hergestellt. Somit können diese Äquivalente auch zur Testung von Substanzen verwendet werden, welche zur kosmetischen Anwendung vorgesehen sind. Weiterhin erlaubt dieses Herstellungsverfahren eine kostengünstige Herstellung von standardisierten Äquivalenten, welche in Screeningverfahren mit hohen Durchsatzraten eingesetzt werden können. Zudem resultiert dieses Herstellverfahren in dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten, welche geordnete Strukturen ausbilden und unterschiedlich differenzierte Zellen aufweisen. Hierdurch wird die in-vivo Situation gut abbildet.
  • Ein Herstellverfahren für die in Verfahrensschritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens bereitgestellten dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente ist beispielsweise in der deutschen Anmeldung DE 10 2015 222 279 offenbart, auf deren Inhalt hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird.
  • In dem zweiten Verfahrensschritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Kultivierung der in Verfahrensschritt a) bereitgestellten Zellkultur von primären Schweißdrüsenzellen und/oder der dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente, wobei das zu dieser Kultivierung verwendete Kulturmedium mindestens einen Neurotransmitter in einer Gesamtkonzentration von 2,0 µM bis 30 mM und/oder 11 bis 100 ng/ml mindestens eines Wachstumsfaktors in einer Gesamtkonzentration von 11 ng/ml bis 80 ng/ml enthält. Die Menge an 11 bis 100 ng/ml bezieht sich hierbei auf die Gesamtkonzentration an Wachstumsfaktor(en) in dem Nährmedium.
  • Es hat sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung als besonders vorteilhaft erwiesen, wenn dem in Verfahrensschritt b) eingesetzten Kulturmedium ausschließlich ein Neurotransmitter in einer Gesamtkonzentration von 2,0 µM bis 30 mM oder 11 bis 100 ng/ml mindestens eines Wachstumsfaktors in einer Gesamtkonzentration von 11 ng/ml bis 80 ng/ml zugesetzt werden. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind daher dadurch gekennzeichnet, dass das in Verfahrensschritt b) eingesetzte Kulturmedium genau einen Neurotransmitter in einer Gesamtkonzentration von 2,0 µM bis 30 mM oder 11 bis 100 ng/ml genau eines Wachstumsfaktors in einer Gesamtkonzentration von 11 ng/ml bis 80 ng/ml enthält. Der Einsatz eines Kulturmediums, welches ausschließlich einen Neurotransmitter oder 11 bis 100 ng/ml genau eines Wachstumsfaktors in einer Gesamtkonzentration von 11 ng/ml bis 80 ng/ml enthält, hat sich als besonders vorteilhaft in Bezug auf die Expression Schweißdrüsenspezifischer Markerproteine der kultivierten Zellen bzw. Äquivalente erwiesen.
  • Als Kulturmedium wird bevorzugt eine Mischung aus DMEM (auch als Dulbecco's Modified Eagle Medium bezeichnet) und Ham's F12 im Volumenverhältnis von 3:1, welche zusätzlich 10 Gew.-% fätales Kälber Serum (FCS) enthält, eingesetzt. Dieses Kulturmedium kann zusätzlich weitere Bestandteile, ausgewählt aus der Gruppe von Hydrocortison, Insulin, Choleratoxin, Adenin, Gentamicin, Penicillin G, Triiodothyronin und Ascorbyl-2-phosphat sowie deren Mischungen enthalten. Der Zusatz dieser zusätzlichen Bestandteile hat sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung als vorteilhat in Bezug auf das Wachstum der primären Schweißdrüsenzellen sowie der dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente erwiesen.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, wenn das in Verfahrensschritt b) eingesetzte Kulturmedium bestimmte Neurotransmitter enthält. Es ist daher erfindungsgemäß bevorzugt, wenn der mindestens eine Neurotransmitter, insbesondere der genau eine Neurotransmitter, ausgewählt ist aus der Gruppe von Verbindungen, welche an metabotrope und/oder ionotrope Rezeptoren binden, insbesondere aus der Gruppe von muskarinen Transmittern, aß-adrenergen Transmittern, purinergen Transmittern sowie deren Mischungen. Der Einsatz der zuvor genannten Neurotransmitter hat sich als besonders vorteilhaft in Bezug auf die Erhöhung der Expression Schweißdrüsenspezifischer Markerproteine erwiesen. Unter metabotropen Rezeptoren sind hierbei Rezeptoren auf der Oberfläche der Zellmembran zu verstehen, welche bei Bindung des Neurotransmitters mittelbar zur Öffnung von lonenkanälen führen. Dahingegen führt die Bindung dieser Neurotransmitter an ionotrope Rezeptoren zu einer unmittelbaren Öffnung der lonenkanäle aufgrund der Neurotransmitterbindung.
  • In diesem Zusammenhang ist es besonders vorteilhaft, wenn der muskarine Neurotransmitter ausgewählt ist aus Acetylcholin und seinen Analoga. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind daher dadurch gekennzeichnet, dass der muskarine Transmitter ausgewählt ist aus der Gruppe von Acetylcholin, Acetylcholin-Analoga sowie deren Mischungen, insbesondere Acetylcholin. Unter dem Begriff Acetylcholin-Analoga sind erfindungsgemäß chemische Verbindungen zu verstehen, welche eine strukturelle oder funktionelle Ähnlichkeit mit Acetylcholin aufweisen und daher bei Bindung an die zuvor genannten Rezeptoren ebenfalls eine Öffnung von lonenkanälen auslösen. Beispiele für erfindungsgemäß einsetzbare Acetylcholin-Analoga sind Pilocarpin und Carbachol. Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist es jedoch, wenn das in Verfahrensschritt b) eingesetzte Kulturmedium mindestens einen, insbesondere genau einen, Neurotransmitter aus der Gruppe der muskarinen Transmitter, insbesondere Acetylcholin, enthält. Der alleinige Einsatz von Acetylcholin in Verfahrensschritt b) hat sich als besonders vorteilhaft in Bezug auf die Erhöhung der Expression von Schweißdrüsenspezifischen Markerproteinen erwiesen und führt damit zu einer besonders hohen Verbesserung der Kulturbedingungen von primären Schweißdrüsenzellen und dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten.
  • Weiterhin kann es in diesem Zusammenhang auch vorgesehen sein, dass das in Verfahrensschritt b) eingesetzte Kulturmedium einen speziellen aß-adrenergen Transmitter enthält. Es kann daher erfindungsgemäß bevorzugt sein, wenn der aß-adrenerge Transmitter ausgewählt ist aus der Gruppe von Katecholaminen, Katecholamin-Analoga sowie deren Mischungen, insbesondere Noradrenalin. Unter dem Begriff Katecholamin-Analoga sind erfindungsgemäß chemische Verbindungen zu verstehen, welche eine strukturelle oder funktionelle Ähnlichkeit mit Katecholaminen aufweisen. Besonders gute Ergebnisse in Bezug auf die Verbesserung der Kultivierungsbedingungen werden im Rahmen der Erfindung erhalten, wenn das in Verfahrensschritt b) eingesetzte Kulturmedium mindestens einen, insbesondere genau einen, Neurotransmitter aus der Gruppe der aß-adrenergen Transmitter, insbesondere Noradrenalin, enthält.
  • Darüber hinaus kann es in diesem Zusammenhang auch vorgesehen sein, dass der purinerge Transmitter aus bestimmten Nukleosiden und phosphorylierten Nukleotiden ausgewählt ist. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind daher dadurch gekennzeichnet, dass der purinerge Transmitter ausgewählt ist aus der Gruppe von Nukleosiden und phosphorylierten Nukleotiden, insbesondere aus Adenosin, Adenosindiphosphat (ADP), Adenosintriphosphat (ATP), Urinosindiphosphat (UDP), Urinosintriphosphat (UTP) sowie Urinosindiphosphat-Glukose (UDP-Glukose) sowie deren Mischungen. Unter Nukleosiden werden erfindungsgemäß chemische Verbindungen verstanden, welche aus einer Nukleobase sowie einer Pentose bestehen und im Gegensatz zu den Nukleotiden keine Phosphatreste enthalten. Ein Beispiel hierfür ist Adenosin, welches aus der Nukleobase Adenin und der Pentose β-D-Ribose besteht. Hingegen handelt es sich bei Nukleotiden erfindungsgemäß um Verbindungen, welche neben einer Nukleobase sowie einer Pentose weiterhin mindestens einen Phosphatrest enthalten. Beispiele hierfür sind Adenosindiphosphat (ADP), Adenosintriphosphat (ATP), Urinosindiphosphat (UDP), Urinosintriphosphat (UTP) sowie Urinosindiphosphat-Glukose (UDP-Glukose). Im Rahmen der vorliegenden Erfindung hat es sich im Hinblick auf die Erhöhung der Expression Schweißdrüsenspezifischer Markerproteine und somit im Hinblick auf die Verbesserung der Kultivierungsbedingungen als vorteilhaft erwiesen, wenn das Nährmedium Adenosintriphosphat (ATP) als einzigen purinergen Transmitter enthält.
    Es hat sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung weiterhin als vorteilhaft erwiesen, wenn das in Verfahrensschritt b) eingesetzte Kulturmedium den mindestens einen Neurotransmitter in einer bestimmten Gesamtkonzentration enthält. Es ist daher im erfindungsgemäß bevorzugt, wenn das in Verfahrensschritt b) eingesetzte Kulturmedium den mindestens einen Neurotransmitter in einer Gesamtkonzentration von 2,0 µM bis 28 mM, bevorzugt von 2,0 µM bis 25 mM, insbesondere von 2,0 µM bis 20 mM, enthält. Die zuvor angegebenen Konzentrationen beziehen sich hierbei auf die Gesamtheit an eingesetzten Neurotransmittern, d. h bei Einsatz einer Mischung aus verschiedenen Neurotransmittern beziehen sich obige Konzentrationsangaben auf die Gesamtkonzentration der eingesetzten Mischung. Bei Einsatz der zuvor angeführten Gesamtkonzentrationen an Neurotransmitter(n) in dem Kulturmedium des Verfahrensschritts b) wird eine besonders hohe Steigerung der Genexpression von Schweißdrüsenspezifischen Markerproteinen im Vergleich zu Kulturen, welche ohne Zugabe von Neurotransmitter(n) kultiviert wurden, erzielt. Auf diese Weise kann der Funktionsverlust der Zellen, welcher bei geringer Expression dieser Markerproteine auftreten kann, vermieden werden.
  • Wird als Neurotransmitter ein muskariner Transmitter, insbesondere Acetylcholin, und/oder ein purinerger Transmitter, insbesondere Adenosintriphosphat (ATP), eingesetzt, so hat es sich in diesem Zusammenhang als vorteilhaft erwiesen, wenn diese Transmitter in den nachfolgend genannten Konzentrationsbereichen in dem Nährmedium des Verfahrensschritts b) enthalten sind. Es ist daher erfindungsgemäß bevorzugt, wenn der genau eine muskarine Neurotransmitter, insbesondere Acetylcholin, in einer Gesamtkonzentration von 2,0 µM bis 50 µM enthalten ist. Weiterhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn der genau eine purinerge Neurotransmitter, insbesondere Adenosintriphosphat (ATP), in einer Gesamtkonzentration von 0,3 bis 20 mM enthalten ist.
  • In Verfahrensschritt b) eingesetzte bevorzugte Kulturmedien sind daher durch die nachfolgenden Ausführungsformen AF1 bis AF10 beschrieben:
    • - AF1: Kulturmedium enthält mindestens einen Neurotransmitter, ausgewählt aus der Gruppe von muskarinen Transmittern, aß-adrenergen Transmittern, purinergen Transmittern sowie deren Mischungen,
    • - AF2: Kulturmedium enthält mindestens einen Neurotransmitter, ausgewählt aus der Gruppe von muskarinen Transmittern, aß-adrenergen Transmittern, purinergen Transmittern sowie deren Mischungen in einer Gesamtkonzentration von 2,0 µM bis 30 mM, vorzugsweise von 2,0 µM bis 28 mM, bevorzugt von 2,0 µM bis 25 mM, insbesondere von 2,0 µM bis 20 mM,
    • - AF3: Kulturmedium enthält genau einen Neurotransmitter, ausgewählt aus muskarinen Transmittern,
    • - AF4: Kulturmedium enthält genau einen Neurotransmitter, ausgewählt aus muskarinen Transmittern in einer Gesamtkonzentration von 2,0 µM bis 50 µM,
    • - AF5: Kulturmedium enthält genau einen Neurotransmitter, ausgewählt aus muskarinen Transmittern in einer Gesamtkonzentration von 2,0 µM bis 50 µM, wobei der muskarine Transmitter Acetylcholin ist,
    • - AF6: Kulturmedium enthält genau einen Neurotransmitter, ausgewählt aus aß-adrenergen Neurotransmittern,
    • - AF7: Kulturmedium enthält genau einen Neurotransmitter, ausgewählt aus aß-adrenergen Neurotransmittern, wobei der aß-adrenergen Transmitter Noradrenalin ist,
    • - AF8: Kulturmedium enthält genau einen Neurotransmitter, ausgewählt aus purinergen Transmittern,
    • - AF9: Kulturmedium enthält genau einen Neurotransmitter, ausgewählt aus purinergen Transmittern in einer Gesamtkonzentration von 0,3 bis 20 mM,
    • - AF10: Kulturmedium enthält genau einen Neurotransmitter, ausgewählt aus purinergen Transmittern in einer Gesamtkonzentration von 0,3 bis 20 mM, wobei der purinerge Transmitter Adenosintriphosphat (ATP) ist.
  • Neben oder anstelle des mindestens einen Neurotransmitters in einer Gesamtkonzentration von 2,0 µM bis 30 mM enthält das in Verfahrensschritt b) eingesetzte Kulturmedium 11 bis 100 ng/ml mindestens eines Wachstumsfaktors in einer Gesamtkonzentration von 11 ng/ml bis 80 ng/ml. Als bevorzugt hat sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung der Einsatz bestimmter Wachstumsfaktoren herausgestellt. Vorteilhafte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind daher dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Wachstumsfaktor, insbesondere der genau eine Wachstumsfaktor, ausgewählt ist aus epidermal growth factor (EGF). Der Einsatz von EGF, insbesondere der ausschließliche Einsatz von EGF, in einer Gesamtkonzentration von 11 bis 100 ng/ml in dem Kulturmedium des Verfahrensschritts b) hat sich als besonders vorteilhaft in Bezug auf die Erhöhung der Expression von Schweißdrüsenspezifischen Markerproteinen und somit in Bezug auf die Verbesserung der Kulturbedingungen von primären Schweißdrüsenzellen und dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten erwiesen.
  • Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung weiterhin bevorzugt, wenn das in Verfahrensschritt b) eingesetzte Kulturmedium den mindestens einen Wachstumsfaktor geringeren Gesamtkonzentrationen enthält. Es ist daher im erfindungsgemäß bevorzugt, wenn das in Verfahrensschritt b) eingesetzte Kulturmedium den mindestens einen Wachstumsfaktor, insbesondere epidermal growth factor (EGF), in einer Gesamtkonzentration von 11 ng/ml bis 60 ng/ml, bevorzugt von 11 ng/ml bis 40 ng/ml, insbesondere von 15 ng/ml bis 25 ng/ml, enthält. Die zuvor angegebenen Konzentrationen beziehen sich hierbei auf die Gesamtheit an eingesetzten Wachstumsfaktoren bzw. auf den Einsatz von EGF als Wachstumsfaktor. Bei Einsatz der zuvor angeführten Gesamtkonzentrationen an Wachstumsfaktor(en) in dem Kulturmedium des Verfahrensschritts b) wird eine besonders hohe Steigerung der Genexpression von Schweißdrüsenspezifischen Markerproteinen im Vergleich zu Kulturen, welche ohne Zugabe von Wachstumsfaktor(en) kultiviert wurden, erzielt. Auf diese Weise kann der Funktionsverlust der Zellen, welcher bei geringer Expression dieser Markerproteine auftreten kann, vermieden werden.
  • Bevorzugt erfolgt die Kultivierung in Verfahrensschritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens über einen bestimmten Zeitraum. Es hat sich erfindungsgemäß als vorteilhaft herausgestellt, wenn die Kultivierung in Verfahrensschritt b) für einen Zeitraum von 4 h bis 25 Tagen, insbesondere von 4 h bis 72 h, erfolgt.
    Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann es weiterhin vorgesehen sein, dass während der Kultivierung in Verfahrensschritt b) ein bestimmter Volumenanteil des Kulturmediums nach einer bestimmten Zeit durch frisches Kulturmedium ersetzt wird. Unter frischem Kulturmedium ist hierbei ein Medium zu verstehen, welches keinerlei Zellen, jedoch mindestens einen Neurotransmitter und/oder 11 bis 100 ng/ml mindestens eines Wachstumsfaktors in einer Gesamtkonzentration von 11 ng/ml bis 80 ng/ml enthält. Der Volumenanteil bezieht sich hierbei auf das Gesamtvolumen des in Verfahrensschritt b) eingesetzten Kulturmediums. Es ist daher erfindungsgemäß vorteilhaft, wenn während der Kultivierung in Verfahrensschritt b) 20 bis 60 Vol.-%, insbesondere 40 bis 50 Vol.-%, des Kulturmediums nach 24 h bis 48 h, insbesondere nach 24 h, durch frisches Kulturmedium, enthaltend mindestens einen Neurotransmitter und/oder 11 bis 100 ng/ml mindestens eines Wachstumsfaktors, ersetzt wird. Bevorzugt eingesetzte Neurotransmitter und Wachstumsfaktoren sowie bevorzugte Gesamtmengen bzw. Gesamtkonzentrationen sind die zuvor angeführten Transmitter, Wachstumsfaktoren, Gesamtmengen bzw. Gesamtkonzentrationen.
  • Ein zweiter Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung mindestens eines Neurotransmitters und/oder mindestens eines Wachstumsfaktors zur Verbesserung der Kulturbedingungen von Kulturen von primären Schweißdrüsenzellen und/oder dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten mit 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen sowie einem Durchmesser von 100 bis 6.000 µm. Die erfindungsgemäße Verwendung führt zu einer Erhöhung der Expression von Schweißdrüsen-spezifischen Markerproteinen in diesen Kulturen. Auf diese Weise kann ein Funktionsverlust, welcher bei Abwesenheit bzw. bei lediglich geringen Konzentrationen dieser Proteine auftritt, während der Kultivierung vermieden werden.
  • Besonders bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstands sind dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Neurotransmitter oder mindestens ein Wachstumsfaktor, insbesondere genau ein Neurotransmitter oder genau ein Wachstumsfaktor, verwendet wird.
  • In Bezug auf die erfindungsgemäß verwendeten Neurotransmitter und Wachstumsfaktoren sowie in Bezug auf die Gesamtmenge an verwendeten Neurotransmittern gilt das für das erfindungsgemäße Verfahren Gesagte mutatis mutandis.
  • Bezüglich weiterer bevorzugter Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verwendung gilt mutatis mutandis das zu dem erfindungsgemäßen Verfahren Gesagte.
  • Beispiele:
  • Bereitstellung der Kultur von primären Schweißdrüsenzellen sowie der dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente (Verfahrensschritt a))
  • Isolation der Schweißdrüsen
  • Die nativen Schweißdrüsen wurden aus humanen Gewebeproben, sogenannten Biopsien gewonnen, welche aus plastischen Operationen von Patienten stammen, die der Verwendung des Materials zu Forschungszwecken zugestimmt haben. Das verwendete Gewebe wurde bei Oberarmstraffungen und Gesichtsstraffungen entnommen. Hieraus wurden die ekkrinen und apokrinen Schweißdrüsen aus dem Achselbereich isoliert.
  • Hierzu wurde die jeweilige Biopsie in kleine Stücke zerteilt und danach in Stücke von maximal ca. 1 cm x 1 cm geschnitten wurde. Anschließend erfolgte der Verdau der Haut mit einem Gemisch aus gleichen Teilen Collagenase II (5 mg/ml) und Thermolysin (0,25 mg/ml) bei 37 °C im Brutschrank für ca. 3,5 bis 5 Stunden, bis das Bindegewebe fast vollständig verdaut war. Diese Mischung wurde anschließend bei 1200 rpm für 5 Minuten zentrifugiert und der Überstand verworfen, um die Enzymlösung sowie das überschüssige Fett zu entfernen. Das entstandene Pellet wurde in DMEM-Lösung aufgenommen und die Lösung in eine Petrischale überführt. Anhand einer Mikrokapillare wurden intakte Schweißdrüsen unter einem Binokular isoliert und in frisches DMEM-Medium überführt.
  • Kultivieren der isolierten nativen Schweißdrüsen und Herstellung der Kultur von primären Schweißdrüsenzellen
  • Die in Schritt 1.1 isolierten Schweißdrüsen wurden in Collagen-I beschichtete Kulturflaschen gegeben und anschließend 25 ml Nährmedium hinzugefügt. Nach Kultivierung für 7 bis 21 Tage im Brutschrank bei 37 °C und 5 % CO2 wurden die auswachsenden Schweißdrüsenzellen abgelöst und auf Collagen-I beschichteten Kulturflaschen erneut bis zur Konfluenz kultiviert (Monolayer-Kultur der primären Schweißdrüsenzellen).
  • Die Zusammensetzung des eingesetzten Nährmediums ist wie folgt:
    Bestandteile des Mediums
    DMEM/ Ham's F12 Nutrient Mix 3 : 1
    Fätales Kälber Serum (FCS) 10 %
    EGF 10 ng/ml
    Hydrocortison 0,4 µg/ml
    Insulin 0,12 UI/ml
    Choleratoxin 10-10 M
    Adenin 2,43 g/ml
    Gentamicin 25 µg/ml
    Penicillin G 100 UI/ml
    Triiodothyronin 2*10-9 M
    Ascorbyl-2-phosphat 1 mM
  • Herstellung der dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente
  • Nach Bestimmung der genauen Zellzahlen der obigen Monolayer-Kulturen der primären Schweißdrüsenzellen wurden diese unter Verwendung des obigen Nährmediums auf eine Zellzahl von 10 bis 5.000 Zellen pro µl eingestellt und anschließend je 50 µl dieser Zellsuspension mittels des „SureDrop® Inlet“-Einführsystems in Wells einer „GravityPLUS®“-Einsaatplatte (jeweils Firma Inshpero AG, Schweiz) überführt. Die Kultivierung erfolgt bei 36 bis 38 °C und einem CO2-Gehalt von 5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der zur Kultivierung eingesetzten Atmosphäre. Nach 1 bis 3 Tagen werden jeweils 40 Vol.-% des Mediums in den Wells der „GravityPLUS®“-Einsaatplatte durch frisches Nährmedium ersetzt. Nach 2 bis 7 Tagen Kultivierung werden die 3D-Schweißdrüsenäquivalente durch Zugabe von 50 bis 200 µL Nährmedium geerntet und in eine „GravityTRAP®“-Platte (Firma Insphero AG, Schweiz) überführt. Vor der Ernte wird die „GravityTRAP®“-Platte mit 60 bis 100 µL Keratinozyten-Medium mithilfe einer Multikanalpipette angefeuchtet, um die Bildung von Luftblasen zu minimieren und den Verlust der dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente zu vermeiden. Nach der Ernte wird die Platte für 1 bis 5 Minuten bei 100 bis 300 xg zentrifugiert, um Luftblasen zu entfernen. Ein Teil der dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente wurde analysiert, wohingegen ein weiterer Teil für weitere 1 bis 6 Tage in den Vertiefungen der Ernteplatte bei 37 °C und 5 Gew.-% CO2, bezogen auf das Gesamtgewicht der zur Kultivierung eingesetzten Atmosphäre, kultiviert wurde.
  • Kultivierung der primären Schweißdrüsenzellen und/oder der dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente (Verfahrensschritt b))
  • Die in den obigen Schritten 1.2 und 1.3 herstellte Zellkultur von primären Schweißdrüsenzellen bzw. die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente wurden jeweils nach Zugabe der Kulturmedien K1 und K2 für 48 h bei 37 °C und 5 Gew.-% CO2, bezogen auf das Gesamtgewicht der zur Kultivierung eingesetzten Atmosphäre, kultiviert. Nach 24 h werden 40 Vol.-% des jeweiligen Kulturmediums K1 bzw. K2 durch frisches Kulturmedium K1 bzw. K2 ersetzt und die Kultivierung fortgesetzt.
  • Kulturmedium K1: entspricht dem unter Punkt 1.2 eingesetzten Kulturmedium, enthält jedoch zusätzlich 2,0 bis 50 µM Acetylcholin als muskarinen Neurotransmitter Kulturmedium K2: entspricht dem unter Punkt 1.2 eingesetzten Kulturmedium, enthält jedoch zusätzlich 0,3 bis 20 mM Adenosintriphosphat (ATP) als purinergen Neurotransmitter
  • Identifizierung und Analyse der Genexpression von Schweißdrüsenspezifischen Markerproteinen
  • Der Nachweis der nachstehend genannten Schweißdrüsenspezifischen Markerproteine kann beispielsweise mittels molekularbiologischer Methoden bestimmt werden. Hierbei wird zunächst die mRNA mithilfe des „RNeasy Micro Kits“ (Qiagen) nach Herstellerangaben isoliert und anschließend mittels quantitativer Real-Time-PCR analysiert (Bellas et. al.: „In Vitro 3D Full-Thickness Skin-Equivalent Tissue Model Using Silk and Collagen Biomaterials“; Macromolecular Bioscience, 2012, 12, Seiten 1627-1636). Es ist jedoch auch möglich, die nachstehend genannten Schweißdrüsenspezifischen Markerproteine mithilfe proteinbiochemischen Methoden, beispielsweise Western Blot-Analysen oder ELISA (enzyme-linked immonosorbent assay) zu analysieren.
  • In den unter Punkt 2. Hergestellten Kulturen konnten mit den zuvor genannten Methoden sigifikant höhere Mengen an den Schweißdrüsenspezifischen Markerproteinen Aquaporin 5 (AQP5), Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), Ca2+-activated chloride channel (ANO1), Natrium-Kalium-Chlorid Cotransporter 1 (NKCC1), carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 (CEACAM5), muscarinic acetylcholine receptor M3 (Chrm3) im Vergleich zu Kulturen, welche lediglich mit dem unter Punkt 1.2 beschriebenen Kulturmedium behandelt wurden, nachgewiesen werden.

Claims (7)

  1. Verfahren zur Verbesserung der Kulturbedingungen von Kulturen von primären Schweißdrüsenzellen und/oder dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten, umfassend die folgenden Verfahrensschritte: a) Bereitstellen mindestens einer Kultur von primären Schweißdrüsenzellen und/oder mindestens eines dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents mit 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen sowie einem Durchmesser von 100 bis 6.000 µm, b) Kultivieren der unter Schritt a) bereitgestellten mindestens einen Zellkultur von primären Schweißdrüsenzellen und/oder dem mindestens einen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalent in einem Kulturmedium, welches b1) mindestens einen Neurotransmitter in einer Gesamtkonzentration von 2,0 µM bis 30 mM und/oder b2) 11 bis 100 ng/ml mindestens eines Wachstumsfaktors in einer Gesamtkonzentration von 11 ng/ml bis 80 ng/ml enthält.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der in Verfahrensschritt a) bereitgestellten mindestens einen Kultur von primären Schweißdrüsenzellen um eine Monolayer-Kultur dieser Schweißdrüsenzellen handelt.
  3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das in Verfahrensschritt a) bereitgestellte mindestens eine dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent ein dreidimensionales Schweißdrüsenäquivalent der ekkrinen und/oder apokrinen humanen Schweißdrüse ist.
  4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das in Verfahrensschritt a) bereitgestellte mindestens eine dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent mindestens eine Zellart, ausgewählt aus der Gruppe von clear cells, dark cells, Myoepitheliumzellen, Duktzellen sowie deren Mischungen enthält.
  5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Neurotransmitter, insbesondere der genau eine Neurotransmitter, ausgewählt ist aus der Gruppe von Verbindungen, welche an metabotrope und/oder ionotrope Rezeptoren binden, insbesondere aus der Gruppe von muskarinen Transmittern, aß-adrenergen Transmittern, purinergen Transmittern sowie deren Mischungen.
  6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Wachstumsfaktor, insbesondere der genau eine Wachstumsfaktor, ausgewählt ist aus epidermal growth factor (EGF).
  7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung in Verfahrensschritt b) für einen Zeitraum von 4 h bis 25 Tagen, insbesondere von 4 h bis 72 h erfolgt.
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