CN114107174B - 一种原代汗腺细胞体外分离方法 - Google Patents

一种原代汗腺细胞体外分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种原代汗腺细胞体外分离方法，其中，所述原代汗腺细胞体外分离方法包括：采用胶原蛋白包被细胞培养皿，获得包被细胞培养皿；向所述包被细胞培养皿内加入汗腺条件培养基，将汗腺组织加入所述包被细胞培养皿中；待汗腺组织贴壁并爬出细胞后，使用差速消化法实现原代汗腺细胞的体外高度富集。本发明利用胶原蛋白包被细胞培养皿以增加贴壁细胞的粘附性，使得90％的离体汗腺组织可以在8小时内快速贴壁，并在24小时内爬出汗腺细胞。本发明所提供的改良方法避免了传统酶消化法中涉及的二次组织消化、高强度机械吹打、及离心对细胞造成的伤害，简化了分离步骤，提高了原代汗腺的分离效率，有利于原代汗腺细胞的活性维持及其体外扩增。

Description

一种原代汗腺细胞体外分离方法
技术领域
本发明涉及汗腺细胞培养技术领域，特别是涉及一种高效实现原代汗腺细胞体外快速富集的原代汗腺细胞体外培养分离方法。
背景技术
汗腺是皮肤最为重要的附属器官之一，在物质代谢、水电解质平衡以及维持机体内环境稳态等方面具有举足轻重的作用。然而汗腺的再生能力有限，且创伤后皮肤的瘢痕性修复进一步破坏了汗腺的结构和功能，导致皮肤不能正常排汗，体温调节失衡，给患者带来巨大生理及心理伤害。
随着皮肤创伤修复研究的不断深入，以干细胞技术为核心的再生医学被誉为“继药物治疗和手术治疗之后的一个医疗革命”，为大面积深度烧创伤患者的康复治疗，恢复其排汗功能带来了新的契机。由于创面内残余汗腺细胞数量不足、机能有限，自体或同种异体汗腺移植成为一种替代性方法，开始应用于创皮肤功能性修复相关的基础与临床研究中。目前，人原代汗腺的分离手段尚不成熟。且现有技术主要采用组织块培养法，分离周期长、获取的汗腺细胞少、且种类不纯，无法满足临床治疗中对细胞“数量”及“质量”的要求。因此，改良原有技术手段，探索一种高效制备可治疗用汗腺细胞的体外分离方法势在必行。
发明内容
本发明实施例提供了一种原代汗腺细胞体外分离方法，以解决现有技术无法实现原代汗腺细胞的体外快速富集的问题。
为了解决上述问题，本申请是这样实现的：
本发明实施例提供了一种改良的原代汗腺细胞体外分离方法，其中，包括：
采用胶原蛋白包被细胞培养皿，获得包被细胞培养皿；
向所述包被细胞培养皿中加入汗腺条件培养基，将汗腺组织加入所述包被细胞培养皿中；
待汗腺组织贴壁并爬出汗腺细胞后，使用细胞消化液消化汗腺细胞，并在消化终止后，移入新的包被细胞培养皿中，完成传代培养。
可选地，所述的方法中，采用胶原蛋白包被细胞培养皿，包括：
向细胞培养皿加入胶原蛋白，然后置于CO2培养箱中进行包被处理后吸掉胶原蛋白，并用磷酸缓冲盐溶液清洗，完成细胞培养皿的包被。
可选地，所述的方法中，所述胶原蛋白为IV型胶原蛋白。
可选地，所述的方法中，在使用细胞消化液消化汗腺细胞的过程中，在加入所述细胞消化液后，当观察到汗腺细胞漂浮时加入所述汗腺条件培养基终止消化。
可选地，所述的方法中，CO2培养箱的温度为37℃、CO2的体积分数为5％。
可选地，所述的方法中，所述方法还包括步骤：
在观察到成纤维细胞生长汇合度达到80％的情况下，用细胞消化液去掉成纤维，以纯化汗腺细胞。
可选地，所述的方法中，用细胞消化液去掉成纤维的步骤，包括：
取出细胞培养皿，用PBS清洗，再加入细胞消化液；
在加入细胞消化液后，当观察到汗腺周围的成纤维细胞漂浮时加入所述汗腺条件培养基终止消化；
弃掉终止液，用PBS将细胞培养皿清洗一遍，加入上述汗腺条件培养基继续培养。
可选地，所述的方法中，传代培养的过程包括：
待汗腺组织贴壁并爬出汗腺细胞后，弃掉原有培养基，用磷酸缓冲盐溶液清洗后加入细胞消化液，置于CO2培养箱中进行消化，待汗腺细胞漂浮时加入上述汗腺条件培养基终止消化；
将终止消化后的培养液混匀，然后按1:2传代，加入包被细胞培养皿中，再置于CO2培养箱中培养，待汗腺细胞贴壁后利用所述汗腺条件培养基进行换液，且每隔2～3天换液一次。
可选地，所述的方法中，所述细胞消化液为accutase溶液或0.25％胰酶无菌消化液。
可选地，所述的方法中，所述汗腺条件培养基为细胞基础培养基DMEM/F12中添加终浓度体积百分数为5～10％的血清、体积百分数为1～2％的青霉素/链霉素。
本发明实施例包括以下优点：
本发明实施例中，先利用胶原蛋白包被细胞培养皿，然后将汗腺组织加入包被细胞培养皿中进行培养，使得离体汗腺组织可以在8小时内快速贴壁，24小时内爬出汗腺细胞，且汗腺组织贴壁率可以达到90％。不仅实现了人原代汗腺细胞的高效分离，而且避免了传统酶消化法中涉及的二次组织消化、高强度机械吹打、及离心对细胞造成的伤害，更简化了分离步骤，提高了原代汗腺的分离效率，有利于原代汗腺细胞的活性维持及其体外扩增。
附图说明
图1为本发明实施例所提供的原代汗腺细胞分离方法的流程示意图；
图2为皮肤组织经II型胶原酶过夜消化后的显微镜扫描图，bar＝200um；
图3为汗腺组织加入含汗腺条件培养基的包被细胞培养皿时的显微镜扫描图，bar＝50um；
图4为汗腺组织加入含汗腺条件培养基的包被细胞培养皿经8小时贴壁后的显微镜扫描图，bar＝50um；
图5为汗腺组织加入含汗腺条件培养基的包被细胞培养皿经24小时贴壁后的显微镜扫描图，bar＝50um；
图6为汗腺组织加入含汗腺条件培养基的包被细胞培养皿经7天贴壁后的显微镜扫描图，bar＝50um；
图7为汗腺汗腺细胞传代培养3天后的显微镜扫描图，bar＝200um；
图8为汗腺汗腺细胞传代培养7天后的显微镜扫描图，bar＝200um；
图9为将成纤维细胞纯化后的汗腺细胞显微镜扫描图，bar＝200um。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
请参阅图1，示出了本发明实施例所提供的原代汗腺细胞培养方法的流程示意图。如图1所示，本发明实施例所提供的原代汗腺细胞分离方法，包括步骤S101～步骤S103：
步骤S101、采用胶原蛋白包被细胞培养皿，获得包被细胞培养皿；
步骤S102、向所述包被细胞培养皿中加入汗腺条件培养基，将汗腺组织加入所述包被细胞培养皿中；
步骤S103、待汗腺组织贴壁并爬出汗腺细胞后，使用细胞消化液消化汗腺细胞，并在消化终止后，移入新的包被后的细胞培养皿中，完成传代培养。
本发明实施例所提供的原代汗腺细胞分离方法中，先利用胶原蛋白包被细胞培养皿，汗腺组织加入包被细胞培养皿中进行培养，使得汗腺组织可以快速贴壁并爬出汗腺细胞，贴壁率可以达到90％，可快速分离、富集汗腺细胞，进而便于快速进行原代汗腺细胞的体外扩增。上述培养方法，操作简单、技术稳定且可重复性好。
另外，本发明实施例中，因为采用直接贴壁法，不仅可以实现高效分离汗腺细胞，而且无需酶消化为单个汗腺细胞，避免了传统酶消化法中涉及的二次组织消化、高强度机械吹打、及离心对细胞造成的伤害，简化了分离步骤，提高了原代汗腺的分离效率。
可选地，在一种实施方式中，上述步骤S101具体包括：
向细胞培养皿加入胶原蛋白，然后置于CO2培养箱中进行包被处理后吸掉胶原蛋白，并用磷酸缓冲盐溶液清洗，完成细胞培养皿的包被。
该实施方式中，胶原蛋白为IV型胶原蛋白，利用IV型胶原蛋白包被细胞培养皿不仅能加速汗腺组织的贴壁，而且能提高汗腺组织的贴壁效率。离体汗腺组织的贴壁效率直接决定了后续分离汗腺细胞的活性，因此能显著促进原代汗腺细胞的爬出及生长。从根本上解决了汗腺细胞体外获取过程中原代数量少、活性差的难点问题。
其中，上述细胞培养皿可以为6cm细胞培养皿等；CO2培养箱的温度为37℃、CO2的体积分数为5％；
可选地，在上述步骤S102具体包括：
取出人体组织放入细胞培养皿中，用添加有5～10％青霉素/链霉素的PBS清洗三次，然后去掉脂肪部分，将组织剪成碎末，加入5～10mL2mg/mL的II型胶原酶，搅拌均匀后放入37℃、体积分数5％的CO2培养箱中过夜消化，获得含有汗腺组织的混合溶液；
用短枪头将汗腺组织吸取出来，然后直接打到加有上述汗腺条件培养基的包被细胞培养皿中进行贴壁培养。
可选地，在上述步骤S103中，待汗腺组织贴壁并爬出汗腺细胞后，约8个小时，补加上述汗腺条件培养基，且每隔2～3天换液一次，当观察到汗腺细胞融合度达到70％-80％时，即可使用细胞消化液进行消化处理汗腺细胞。
其中，在使用细胞消化液消化汗腺细胞的过程中，在加入所述细胞消化液后，当观察到汗腺细胞漂浮时加入所述汗腺条件培养基终止消化。本发明实施例中，直接用汗腺条件培养基终止，避免了离心、胰酶消化法对原代汗腺细胞的损伤以及细胞的丢失。
具体地，上述培养基可以在细胞基础培养基DMEM/F12中添加终浓度为体积百分数为5～10％的血清、体积百分数为1～2％的青霉素/链霉素制得；上述细胞消化液为accutase溶液或0.25％胰酶无菌消化液。
可选地，一种实施方式中，上述步骤S103中具体包括步骤S301～S302：
步骤S301、待汗腺组织贴壁并爬出汗腺细胞后，弃掉原有培养基，用磷酸缓冲盐溶液清洗后加入细胞消化液，置于CO2培养箱中进行消化，待细胞漂浮时加入所述汗腺条件培养基终止消化；
步骤S302、将终止消化后的培养液混匀，然后按1:2进行传代，加入包被细胞培养皿中，再置于CO2培养箱中培养，待汗腺组织贴壁后利用所述汗腺条件细胞培养基进行换液，且每隔2～3天换液一次。
上述步骤S301中，先弃掉汗腺培养基，然后用磷酸缓冲盐溶液清洗一遍，再加入0.5～1mL accutase等细胞消化液溶液，再置于温度为37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中进行消化，并每隔5分钟观察一次，待细胞大量漂浮时加入2mL上述培养基终止消化；
上述步骤S302中，通过轻轻吹打的方式将将终止消化后的培养液混匀，然后按1:2传代，加入包被细胞培养皿中，再置于温度为37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中进行培养，等待大约8小时后汗腺细胞贴壁，即可以用上述汗腺条件培养基进行换液，之后每隔2～3天换液一次，实现消化传代。
在上述实施方式中，因为一次消化并不能把所有的汗腺细胞消化下来，可以将消化后的细胞培养皿用磷酸缓冲盐溶液清洗一遍后，再加入上述汗腺条件细胞培养基继续培养。
可选地，在一种实施方式中，本发明实施例所提供的方法中，还包括步骤S104：
步骤S104、在观察到成纤维细胞生长汇合度达到80％的情况下，用细胞消化液去掉成纤维细胞，以纯化汗腺细胞。
由于贴壁汗腺中爬出的细胞包含汗腺细胞和成纤维细胞，且成纤维细胞的生长速度较快，会影响分离汗腺细胞的纯度。因此，为解决或避免原代汗腺细胞获取过程中成纤维细胞的污染问题，利用成纤维细胞和汗腺细胞对细胞消化液的敏感性不同的特点，采用差速消化法去除成纤维细胞的污染。
本发明实施例所提供的方法中，不仅能很好的展现原代汗腺的结构和生长情况，有利于体外研究和实验，而且在获得汗腺细胞的同时也能得到原代皮肤成纤维。
可选地，在一种具体实施方式中，上述步骤S104中用细胞消化液去掉成纤维的步骤，具体包括：
取出细胞培养皿，用PBS清洗，再加入细胞消化液；
在加入细胞消化液后，当观察到汗腺周围的成纤维细胞漂浮时加入所述汗腺条件培养基终止消化；
弃掉终止液，用PBS将细胞培养皿清洗一遍，加入所述汗腺条件培养基继续培养。
上述具体实施方式中，在观察到成纤维细胞生长汇合度达到80％的情况下，说明有大量成纤维细胞，即可以确定需要进行纯化；在确定需要进行纯化时，取出细胞培养皿并用PBS清洗，然后加入accutase溶液等细胞消化液；在观察到汗腺周围的成纤维细胞漂浮时，加入上述培养基终止消化，弃掉终止液，用PBS将细胞培养皿清洗一遍，加入上述汗腺条件培养基继续培养。
可选地，上述离心过程具体可以是在1000rpm下离心处理5分钟。
下面通过实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
(1)取出人体乳腺组织放入10cm细胞培养皿中，用添加有5％penicillin/streptomycin的PBS清洗三次，然后去掉脂肪部分，将组织剪成碎末，加入10mL 2mg/mL的II型胶原酶，搅拌均匀后放入37℃、体积分数5％的CO2培养箱中过夜消化，可以获得汗腺组织，具体如图2所示。
(2)汗腺条件培养基配置,该汗腺条件培养基为细胞基础培养基DMEM/F12中添加终浓度为10％的血清、1％的penicillin/streptomycin。
(3)取出6cm细胞培养皿，加入2mL IV胶原蛋白，放入置于37℃、体积分数5％的CO2培养箱中包被15分钟，取出细胞培养皿，吸掉IV胶原蛋白，用PBS清洗一遍，然后加入实施例1中所配置的汗腺条件培养基，保证汗腺条件培养基没过皿底即可。
(4)将用1mL枪头吸取出来的原代汗腺组织直接打到加有上述汗腺条件培养基的细胞培养皿中，此时，汗腺组织的形态如图3所示，可以看出汗腺组织还没贴壁；经8个小时后，汗腺组织的形态如图4所示，可以见汗腺组织已经贴壁生长；此时补加上述汗腺条件培养基，之后每隔2天换液一次，当观察到汗腺细胞融合度达到80％时，即可进行消化传代；其中，贴壁后的汗腺组织经24h的培养后的细胞形态如图5所示，可以看出汗腺细胞已从汗腺组织中爬出；贴壁后的汗腺组织经7天的培养后的细胞形态如图6所示，可以看出大量汗腺细胞不断的从汗腺组织中爬出，获得了大量汗腺细胞。
(5)弃掉汗腺条件培养基，用PBS清洗一遍，加入1mL accutase溶液，置于37℃、体积分数5％的CO2培养箱中进行消化，每隔5分钟观察一次，待汗腺细胞大量漂浮时加入2mL实施例1中所配置的培养基终止消化，轻轻吹打并混匀后，直接按1:2传代加入包被后的6cm细胞培养皿中，置于37℃、体积分数5％的CO2培养箱中培养，待汗腺贴壁后，及时用上述汗腺条件培养基进行换液，之后每隔2天换液一次。其中，传代后3天的的汗腺细胞和伴随生长的成纤维细胞的形态如图7所示，传代后7天的的汗腺细胞和伴随生长的成纤维细胞的形态如图8所示。
(6)将消化后的细胞培养皿用PBS清洗一遍，加入1mL上述汗腺条件培养基继续培养。
(7)当观察到有大量成纤维的时候需要进行纯化，取出细胞培养皿，用PBS清洗一遍，加入1mL accutase溶液，当观察到汗腺周围的成纤维细胞漂浮的时候加入上述培养基终止消化，约1分钟，弃掉终止液，用PBS将细胞培养皿清洗一遍，加入上述汗腺条件培养基继续培养。其中，将成纤维细胞纯化后的汗腺细胞形态如图9所示。
以上结果说明：利用本发明提供的原代汗腺细胞分离方法，能够使提取出来的原代汗腺组织迅速爬出汗腺细胞，并快速扩增，克服了原代汗腺体外获取过程中细胞数量少，纯度低的难点问题，也避免了传统酶消化法中涉及的二次组织消化、高强度机械吹打、及离心对细胞造成的伤害，简化了分离步骤，提高了原代汗腺的分离效率，进而有利于原代汗腺细胞的活性维持及其体外扩增。
以上对本发明所提供的一种原代汗腺细胞分离方法，进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (8)

1.一种原代汗腺细胞体外分离方法，其特征在于，包括：
采用胶原蛋白包被细胞培养皿，获得包被细胞培养皿；
向所述包被细胞培养皿中加入汗腺条件培养基，将汗腺组织加入所述包被细胞培养皿中；
待汗腺组织贴壁并爬出汗腺细胞后，使用细胞消化液消化所述汗腺细胞，并在消化终止后，移入新的包被细胞培养皿中，完成传代培养；
所述胶原蛋白为IV胶原蛋白；
所述汗腺条件培养基为细胞基础培养基DMEM/F12中添加终浓度体积百分数为5～10％的血清、体积百分数为1～2％的青霉素/链霉素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用胶原蛋白包被细胞培养皿，包括：
向细胞培养皿加入胶原蛋白，然后置于CO2培养箱中进行包被处理后吸掉胶原蛋白，并用磷酸缓冲盐溶液清洗，完成细胞培养皿的包被。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在使用细胞消化液消化所述汗腺细胞的过程中，在加入所述细胞消化液后，当观察到汗腺细胞漂浮时加入所述汗腺条件培养基终止消化。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，CO2培养箱的温度为37℃、CO2的体积分数为5％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：
在观察到成纤维细胞生长汇合度达到80％的情况下，用细胞消化液去掉成纤维细胞，以纯化汗腺细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，用细胞消化液去掉成纤维细胞的步骤，包括：
取出细胞培养皿，用PBS清洗，再加入细胞消化液；
在加入细胞消化液后，当观察到汗腺周围的成纤维细胞漂浮时加入所述汗腺条件培养基终止消化；
弃掉终止液，用PBS将细胞培养皿清洗一遍，加入所述汗腺条件培养基继续培养。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，传代培养的过程包括：
待汗腺组织贴壁并爬出汗腺细胞后，弃掉原有培养基，用磷酸缓冲盐溶液清洗后加入细胞消化液，置于CO2培养箱中进行消化，待汗腺细胞漂浮时加入所述汗腺条件培养基终止消化；
将终止消化后的培养液混匀，然后按1:2传代，加入包被处理后的细胞培养皿中，再置于CO2培养箱中培养，待汗腺细胞贴壁后利用所述汗腺条件培养基进行换液，且每隔2～3天换液一次。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞消化液为accutase溶液或0.25％胰酶无菌消化液。
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