CN112877286A - 一种干细胞体外诱导方法 - Google Patents

一种干细胞体外诱导方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112877286A
CN112877286A CN202110213863.7A CN202110213863A CN112877286A CN 112877286 A CN112877286 A CN 112877286A CN 202110213863 A CN202110213863 A CN 202110213863A CN 112877286 A CN112877286 A CN 112877286A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mol
stem cells
adipose
induction
adipogenic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110213863.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112877286B (zh
Inventor
张若冰
谢惠明
张茜玥
谢家琪
张�杰
韩飞
徐根艳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN202110213863.7A priority Critical patent/CN112877286B/zh
Publication of CN112877286A publication Critical patent/CN112877286A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112877286B publication Critical patent/CN112877286B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/36—Lipids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/40—Nucleotides, nucleosides, bases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/06—Anti-neoplasic drugs, anti-retroviral drugs, e.g. azacytidine, cyclophosphamide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/33—Insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39—Steroid hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/90—Polysaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种干细胞体外诱导方法，包括以下步骤：取脂肪组织，分离获得脂肪干细胞，将其进行传代培养，获得P3‑P5代脂肪干细胞；将P3‑P5代脂肪干细胞接种于孔板中进行孵育，当细胞达到100％融合时，将原培养基更换为成脂诱导培养基A，诱导培养2‑3天；将成脂诱导培养基A更换为成脂诱导培养基B，继续诱导培养2‑3天；将成脂诱导培养基B更换为成脂诱导培养C，继续诱导培养。该方法可有效解决现有的诱导培养方法存在的成脂分化率低，诱导时间长的问题。

Description

一种干细胞体外诱导方法
技术领域
本发明涉及干细胞诱导方法技术领域，具体涉及一种干细胞体外诱导方法。
背景技术
长期以来，对创伤和肿瘤等原因导致的软组织缺损的治疗都是整形科的常见问题。目前，主要采取的措施主要包括人工材料充填、自体脂肪移植等，但是，人工材料充填存在一定的异物反应风险，而自体脂肪移植的组织存活率低，脂肪吸收坏死率高，还容易引发并发症，限制了其在临床上的使用。
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞；根据干细胞的发育潜能分为三类:全能干细胞、多能干细胞和专能干细胞。干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。
脂肪间充质干细胞是存在于脂肪组织中的，具有多项分化潜能的干细胞，具有来源丰富、取材方便的优点，因此被认为是组织再生和修复的理想种子细胞。基于脂肪间充质干细胞的成脂分化能力构建组织工程脂肪，能有效提高脂肪移植的效果，为软组织的缺损重建提供了新的途径，在组织工程和再生医学领域中具有良好的应用前景。但是，目前脂肪间充质干细胞成脂分化的效率较低，而且成脂诱导时间长，难以满足临床上对脂肪组织的大量需求，限制了其在临床上的应用。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种干细胞体外诱导方法，该方法可有效解决现有的诱导培养方法存在的成脂分化率低，诱导时间长的问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种干细胞体外诱导方法，包括以下步骤：
(1)取脂肪组织，分离获得脂肪干细胞，将其进行传代培养，获得P3-P5代脂肪干细胞；
(2)将P3-P5代脂肪干细胞以4-6×103个/cm2的密度接种于孔板中进行孵育，当细胞达到100％融合时，更换为成脂诱导培养基A，诱导培养2-3天；
(3)将成脂诱导培养基A更换为成脂诱导培养基B，继续诱导培养2-3天；
(4)将成脂诱导培养基B更换为成脂诱导培养C，继续诱导培养。
上述方案中，将获取的脂肪干细胞依次在不同的诱导培养基中培养，利用不同培养基对不同时期的脂肪干细胞进行作用，促进脂肪干细胞的成脂分化，缩短脂肪干细胞的分化时间，提高脂肪干细胞的成脂分化率。
进一步地，步骤(1)中的脂肪干细胞获取方法为：于无菌环境下获取脂肪组织，用磷酸盐缓冲液于37℃气浴培养箱中回旋振荡漂洗干净，吸取下层组织，向其中加入质量体积比为0.05-0.3％的胶原酶进行酶解消化，消化过程中进行超声处理，脂肪与胶原酶的体积比为1:0.05-1；消化后吸取下层细胞冲洗干净后离心，继续收集下层细胞组织即为脂肪干细胞。
上述方案中，超声处理可以加速消化的效率，通过上述方法获得的脂肪干细胞数量较多，相当于传统方法增加10％，且获得的脂肪干细胞的时间缩短20min以上。
进一步地，成脂诱导培养基A包括含有6-12％胎牛血清的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：胰岛素2-4μmol/L、地塞米松2-4μmol/L、氢化可的松1-3μmol/L和反油酸5-15μmol/L。
进一步地，成脂诱导培养基A包括含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：胰岛素2μmol/L、地塞米松2μmol/L、氢化可的松1μmol/L和反油酸6μmol/L。
上述方案中，地塞米松通过促进成脂分化、抑制成骨分化，并且在成脂分化早期抑制脂肪干细胞增值的方式促进成脂分化效果；具体的，地塞米松通过上调成脂分化转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ的表达，促进脂肪干细胞成脂分化；通过抑制Runx2等成骨分化转录因子，抑制脂肪干细胞成骨分化；地塞米松可通过激活MKP-1，使细胞外信号调控激酶去磷酸化，抑制干细胞增殖；
氢化可的松在脂肪干细胞分化早期通过抑制细胞周期蛋白D3、细胞周期素依赖性激酶等实现抑制干细胞增殖的目的；氢化可的松和地塞米松协同作用，抑制脂肪干细胞增殖。
反油酸能够明显下调β-catenin蛋白的表达，促进成脂分化；
胰岛素通过丝裂原活化蛋白激酶信号通路降低核蛋白磷酸酶的活性，增强脂肪形成基因转录，进而促进脂肪前体细胞成熟，此外，胰岛素还能激活磷酸肌醇3激酶信号通路，促进脂肪干细胞成脂分化。地塞米松、胰岛素、氢化可的松和反油酸之间共同作用，促进成脂分化效率。
进一步地，成脂诱导培养基B包括含有6-12％胎牛血清和3-6％脂肪组织分泌物的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：胰岛素2-4μmol/L，地塞米松2-4μmol/L、氢化可的松1-3μmol/L、三氟醋柳酸2-4μmol/L和紫杉醇0.5-2μmol/L。
进一步地，成脂诱导培养基B包括含有8％胎牛血清和5％脂肪组织分泌物的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：胰岛素2μmol/L，地塞米松2μmol/L、氢化可的松2μmol/L、三氟醋柳酸2μmol/L和紫杉醇1μmol/L。
上述方案中，三氟醋柳酸是环氧合酶的抑制剂，也是成脂关键通路磷酸二酯酶的抑制剂，可通过提高胞内环磷酸腺苷的水平，进而激活cAMP反应原件结合蛋白，调控C/EBPs表达，促进成脂分化进行；
一定浓度的紫杉醇可减缓干细胞增殖，抑制干细胞的多向分化能力，促使其向脂肪细胞分化。
进一步地，成脂诱导培养基C包括含有6-12％胎牛血清和3-6％脂肪组织分泌物的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：胰岛素2-4μmol/L，海藻酸钠1-3μmol/L和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5-1μmol/l。
进一步地，成脂诱导培养基C包括含有6％胎牛血清和5％脂肪组织分泌物的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：胰岛素2μmol/L，海藻酸钠2μmol/L和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5μmol/l。
上述方案中，脂肪组织分泌物中含有大量的促进成脂分化的生长因子，可促进干细胞成脂分化；3-异丁基-1-甲基黄嘌呤作为可抑制细胞增殖。
进一步地，成脂诱导培养基B和C中脂肪细胞分泌物的制备方法如下：将脂肪组织切成1mm×1mm的小块，冲洗干净后放入含有100ml/l胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养3-5天后，收集培养基，即可。
进一步地，步骤(2)、(3)和(4)中均在37℃、5％体积CO2条件下进行培养。
本发明所产生的有益效果为：
本申请中利用不同的培养基对脂肪干细胞进行诱导培养，促进脂肪干细胞的成脂分化，缩短脂肪干细胞的分化时间，提高脂肪干细胞的成脂分化率；诱导初期，通过地塞米松、氢化可的松协同抑制脂肪干细胞增殖，通过地塞米松、反油酸和胰岛素促进脂肪干细胞成脂分化，诱导中期，通过脂肪分泌物、胰岛素、三氟醋柳酸和紫杉醇促进脂肪干细胞成脂分化，促进细胞内脂肪生成，诱导后期，取消地塞米松的使用，减少激素类药物对细胞的影响，通过脂肪组织分泌物、胰岛素促进成脂分化，通过3-异丁基-1-甲基黄嘌呤促进细胞增殖。利用本申请中的诱导方法可大大缩短成脂时间，一般7-10天即可完成，且利用不同的成分分阶段进行诱导，可大大提高成脂分化效率。
具体实施方式
实施例1
一种干细胞体外诱导方法，包括以下步骤：
(1)于无菌环境下获取脂肪组织，用磷酸盐缓冲液于37℃气浴培养箱中回旋振荡漂洗干净，吸取下层组织，向其中加入质量体积比为0.1％的胶原酶进行酶解消化，消化过程中进行超声处理，超声功率为30kw，脂肪与胶原酶的体积比为1:0.2；消化后吸取下层细胞冲洗干净后离心，继续收集下层细胞组织即为脂肪干细胞，将其进行传代培养，获得P3代脂肪干细胞；
(2)将P3代脂肪干细胞以4×103个/cm2的密度接种于孔板中进行孵育，当细胞达到100％融合时，更换为成脂诱导培养基A，在37℃、5％体积CO2条件下诱导培养2天，其中，成脂诱导培养基A包括含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：胰岛素2μmol/L、地塞米松2μmol/L、氢化可的松1μmol/L和反油酸5μmol/L；
(3)将成脂诱导培养基A更换为成脂诱导培养基B，在37℃、5％体积CO2条件下继续诱导培养2天，其中，成脂诱导培养基B包括含有10％胎牛血清和3％脂肪组织分泌物的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：胰岛素2μmol/L，地塞米松2μmol/L、氢化可的松1μmol/L、三氟醋柳酸2μmol/L和紫杉醇0.5μmol/L；
(4)将成脂诱导培养基B更换为成脂诱导培养C，在37℃、5％体积CO2条件下继续诱导培养，其中，成脂诱导培养基C包括含有10％胎牛血清和3％脂肪组织分泌物的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：胰岛素2μmol/L，海藻酸钠1μmol/L和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5μmol/l；
成脂诱导培养基B和C中脂肪细胞分泌物的制备方法如下：将脂肪组织切成1mm×1mm的小块，冲洗干净后放入含有100ml/l胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养5天后，收集培养基，即可。
实施例2
(1)于无菌环境下获取脂肪组织，用磷酸盐缓冲液于37℃气浴培养箱中回旋振荡漂洗干净，吸取下层组织，向其中加入质量体积比为0.3％的胶原酶进行酶解消化，消化过程中进行超声处理，超声功率为30kw，脂肪与胶原酶的体积比为1:1；消化后吸取下层细胞冲洗干净后离心，继续收集下层细胞组织即为脂肪干细胞，将其进行传代培养，获得P5代脂肪干细胞；
(2)将P5代脂肪干细胞以6×103个/cm2的密度接种于孔板中进行孵育，当细胞达到100％融合时，更换为成脂诱导培养基A，在37℃、5％体积CO2条件下诱导培养3天，其中，成脂诱导培养基A包括含有12％胎牛血清的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：胰岛素4μmol/L、地塞米松4μmol/L、氢化可的松3μmol/L和反油酸15μmol/L；
(3)将成脂诱导培养基A更换为成脂诱导培养基B，在37℃、5％体积CO2条件下继续诱导培养3天，其中，成脂诱导培养基B包括含有12％胎牛血清和6％脂肪组织分泌物的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：胰岛素4μmol/L，地塞米松4μmol/L、氢化可的松3μmol/L、三氟醋柳酸4μmol/L和紫杉醇2μmol/L；
(4)将成脂诱导培养基B更换为成脂诱导培养C，在37℃、5％体积CO2条件下继续诱导培养，其中，成脂诱导培养基C包括含有12％胎牛血清和6％脂肪组织分泌物的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：胰岛素4μmol/L，海藻酸钠3μmol/L和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤1μmol/l；
成脂诱导培养基B和C中脂肪细胞分泌物的制备方法如下：将脂肪组织切成1mm×1mm的小块，冲洗干净后放入含有100ml/l胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养5天后，收集培养基，即可。
实施例3
(1)于无菌环境下获取脂肪组织，用磷酸盐缓冲液于37℃气浴培养箱中回旋振荡漂洗干净，吸取下层组织，向其中加入质量体积比为0.2％的胶原酶进行酶解消化，消化过程中进行超声处理，超声功率为30kw，脂肪与胶原酶的体积比为1:0.5；消化后吸取下层细胞冲洗干净后离心，继续收集下层细胞组织即为脂肪干细胞，将其进行传代培养，获得P4代脂肪干细胞；
(2)将P4代脂肪干细胞以5×103个/cm2的密度接种于孔板中进行孵育，当细胞达到100％融合时，更换为成脂诱导培养基A，在37℃、5％体积CO2条件下诱导培养3天，其中，成脂诱导培养基A包括含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：胰岛素2μmol/L、地塞米松2μmol/L、氢化可的松1μmol/L和反油酸6μmol/L；
(3)将成脂诱导培养基A更换为成脂诱导培养基B，在37℃、5％体积CO2条件下继续诱导培养2-3天，其中，成脂诱导培养基B包括含有8％胎牛血清和5％脂肪组织分泌物的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：胰岛素2μmol/L，地塞米松2μmol/L、氢化可的松1μmol/L、三氟醋柳酸2μmol/L和紫杉醇1μmol/L；
(4)将成脂诱导培养基B更换为成脂诱导培养C，在37℃、5％体积CO2条件下继续诱导培养，其中，成脂诱导培养基C包括含有6％胎牛血清和5％脂肪组织分泌物的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：胰岛素2μmol/L，海藻酸钠2μmol/L和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5μmol/l；
成脂诱导培养基B和C中脂肪细胞分泌物的制备方法如下：将脂肪组织切成1mm×1mm的小块，冲洗干净后放入含有100ml/l胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养5天后，收集培养基，即可。
对比例1
(1)于无菌环境下获取脂肪组织，用磷酸盐缓冲液于37℃气浴培养箱中回旋振荡漂洗干净，吸取下层组织，向其中加入质量体积比为0.2％的胶原酶进行酶解消化，脂肪与胶原酶的体积比为1:0.5；消化后吸取下层细胞冲洗干净后离心，继续收集下层细胞组织即为脂肪干细胞，将其进行传代培养，获得P6代脂肪干细胞；
(2)将P6代脂肪干细胞以5×104个/cm2的密度接种于孔板中进行孵育，当细胞达到100％融合时，更换为成脂诱导培养基A，在37℃、5％体积CO2条件下诱导培养3天，其中，成脂诱导培养基A包括含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：胰岛素2μmol/L、地塞米松2μmol/L、氢化可的松1μmol/L和反油酸6μmol/L；
(3)将成脂诱导培养基A更换为成脂诱导培养基B，在37℃、5％体积CO2条件下继续诱导培养2-3天，其中，成脂诱导培养基B包括含有8％胎牛血清和5％脂肪组织分泌物的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：胰岛素2μmol/L，地塞米松2μmol/L、氢化可的松1μmol/L、三氟醋柳酸2μmol/L和紫杉醇1μmol/L；
(4)将成脂诱导培养基B更换为成脂诱导培养C，在37℃、5％体积CO2条件下继续诱导培养，其中，成脂诱导培养基C包括含有6％胎牛血清和5％脂肪组织分泌物的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：胰岛素2μmol/L，海藻酸钠2μmol/L和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5μmol/l；
成脂诱导培养基B和C中脂肪细胞分泌物的制备方法如下：将脂肪组织切成1mm×1mm的小块，冲洗干净后放入含有100ml/l胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养5天后，收集培养基，即可。
对比例2
(1)于无菌环境下获取脂肪组织，用磷酸盐缓冲液于37℃气浴培养箱中回旋振荡漂洗干净，吸取下层组织，向其中加入质量体积比为0.2％的胶原酶进行酶解消化，消化过程中进行超声处理，超声功率为30kw，脂肪与胶原酶的体积比为1:0.5；消化后吸取下层细胞冲洗干净后离心，继续收集下层细胞组织即为脂肪干细胞，将其进行传代培养，获得P4代脂肪干细胞；
(2)将P4代脂肪干细胞以5×103个/cm2的密度接种于孔板中进行孵育，当细胞达到100％融合时，更换为成脂诱导培养基，在37℃、5％体积CO2条件下诱导培养3天，其中，成脂诱导培养基包括含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：胰岛素2μmol/L、地塞米松2μmol/L、氢化可的松1μmol/L、三氟醋柳酸2μmol/L、紫杉醇1μmol/L、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5μmol/l和反油酸6μmol/L；
成脂诱导培养基B和C中脂肪细胞分泌物的制备方法如下：将脂肪组织切成1mm×1mm的小块，冲洗干净后放入含有100ml/l胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养5天后，收集培养基，即可。
对比例3
(1)于无菌环境下获取脂肪组织，用磷酸盐缓冲液于37℃气浴培养箱中回旋振荡漂洗干净，吸取下层组织，向其中加入质量体积比为0.2％的胶原酶进行酶解消化，消化过程中进行超声处理，超声功率为30kw，脂肪与胶原酶的体积比为1:0.5；消化后吸取下层细胞冲洗干净后离心，继续收集下层细胞组织即为脂肪干细胞，将其进行传代培养，获得P4代脂肪干细胞；
(2)将P4代脂肪干细胞以5×103个/cm2的密度接种于孔板中进行孵育，当细胞达到100％融合时，更换为成脂诱导培养基A，在37℃、5％体积CO2条件下诱导培养4天，其中，成脂诱导培养基A包括含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：胰岛素2μmol/L、地塞米松2μmol/L、氢化可的松1μmol/L和反油酸6μmol/L；
(3)将成脂诱导培养基A更换为成脂诱导培养基B，在37℃、5％体积CO2条件下继续诱导培养4天，其中，成脂诱导培养基B包括含有8％胎牛血清和5％脂肪组织分泌物的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：胰岛素2μmol/L，地塞米松2μmol/L、氢化可的松1μmol/L、三氟醋柳酸2μmol/L和紫杉醇1μmol/L；
(4)将成脂诱导培养基B更换为成脂诱导培养C，在37℃、5％体积CO2条件下继续诱导培养，其中，成脂诱导培养基C包括含有6％胎牛血清和5％脂肪组织分泌物的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：胰岛素2μmol/L，海藻酸钠2μmol/L和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5μmol/l；
成脂诱导培养基B和C中脂肪细胞分泌物的制备方法如下：将脂肪组织切成1mm×1mm的小块，冲洗干净后放入含有100ml/l胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养5天后，收集培养基，即可。
对比例4
(1)于无菌环境下获取脂肪组织，用磷酸盐缓冲液于37℃气浴培养箱中回旋振荡漂洗干净，吸取下层组织，向其中加入质量体积比为0.2％的胶原酶进行酶解消化，消化过程中进行超声处理，超声功率为30kw，脂肪与胶原酶的体积比为1:0.5；消化后吸取下层细胞冲洗干净后离心，继续收集下层细胞组织即为脂肪干细胞，将其进行传代培养，获得P4代脂肪干细胞；
(2)将P4代脂肪干细胞以5×103个/cm2的密度接种于孔板中进行孵育，当细胞达到100％融合时，更换为成脂诱导培养基A，在37℃、5％体积CO2条件下诱导培养3天，其中，成脂诱导培养基A包括含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：胰岛素1μmol/L、地塞米松6μmol/L、氢化可的松5μmol/L和反油酸6μmol/L；
(3)将成脂诱导培养基A更换为成脂诱导培养基B，在37℃、5％体积CO2条件下继续诱导培养2-3天，其中，成脂诱导培养基B包括含有8％胎牛血清和5％脂肪组织分泌物的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：胰岛素6μmol/L，地塞米松6μmol/L、氢化可的松5μmol/L、三氟醋柳酸7μmol/L和紫杉醇1μmol/L；
(4)将成脂诱导培养基B更换为成脂诱导培养C，在37℃、5％体积CO2条件下继续诱导培养，其中，成脂诱导培养基C包括含有6％胎牛血清和5％脂肪组织分泌物的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：胰岛素6μmol/L，海藻酸钠2μmol/L和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5μmol/l；
成脂诱导培养基B和C中脂肪细胞分泌物的制备方法如下：将脂肪组织切成1mm×1mm的小块，冲洗干净后放入含有100ml/l胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养5天后，收集培养基，即可。
对比例5
(1)于无菌环境下获取脂肪组织，用磷酸盐缓冲液于37℃气浴培养箱中回旋振荡漂洗干净，吸取下层组织，向其中加入质量体积比为0.2％的胶原酶进行酶解消化，消化过程中进行超声处理，超声功率为30kw，脂肪与胶原酶的体积比为1:0.5；消化后吸取下层细胞冲洗干净后离心，继续收集下层细胞组织即为脂肪干细胞，将其进行传代培养，获得P4代脂肪干细胞；
(2)将P4代脂肪干细胞以5×103个/cm2的密度接种于孔板中进行孵育，当细胞达到100％融合时，更换为成脂诱导培养基A，在37℃、5％体积CO2条件下诱导培养3天，其中，成脂诱导培养基A包括含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：胰岛素2μmol/L、地塞米松2μmol/L、氢化可的松1μmol/L和吲哚美辛6nmol/L；
(3)将成脂诱导培养基A更换为成脂诱导培养基B，在37℃、5％体积CO2条件下继续诱导培养2-3天，其中，成脂诱导培养基B包括含有8％胎牛血清和5％脂肪组织分泌物的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：胰岛素2μmol/L，地塞米松2μmol/L、氢化可的松1μmol/L、虾青素2μmol/L和二苯乙烯苷1μmol/L；
(4)将成脂诱导培养基B更换为成脂诱导培养C，在37℃、5％体积CO2条件下继续诱导培养，其中，成脂诱导培养基C包括含有6％胎牛血清和5％脂肪组织分泌物的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：地塞米松2μmol/L、胰岛素2μmol/L；
成脂诱导培养基B和C中脂肪细胞分泌物的制备方法如下：将脂肪组织切成1mm×1mm的小块，冲洗干净后放入含有100ml/l胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养5天后，收集培养基，即可。
实验例
按照实施例1-3和对比例1-5中诱导获得的细胞，然后分别在诱导培养7、8、9、10天后进行油红O染色，然后分别测定各实施例和对比例的成脂分化率，具体结果见表1-4。
测定方法：吸出培养基，用10％中性甲醛固定30min，蒸馏水冲洗，室温下用油红O染色20min，弃去多余的染料，在倒置显微镜下观察拍照，随机记录3个视野的染色阳性细胞数以及细胞总数，然后计算成脂分化率。
计算方法如下：成脂分化率＝(染色阳性细胞数/细胞总数)×100％
表1：诱导7天后的成脂分化率
Figure BDA0002953244200000131
表2：诱导8天后的成脂分化率
Figure BDA0002953244200000132
表3：诱导9天后的成脂分化率
Figure BDA0002953244200000133
表4：诱导10天后的成脂分化率
Figure BDA0002953244200000134
通过上表中数据可以得知，按照实施例1-3中的方法诱导培养7天后的成脂率均高于对比例1-4中的成脂率，尤其是按照实施例3中的方法诱导培养后的成脂率最高。证明本发明中的干细胞体外诱导方法科学合理，诱导效果更好。
实施例1-3中诱导培养7天后，成脂率基本不再增加，而对比例1-4中的诱导方法诱导7天后以后成脂率还有微小上调，可知，实施例1-3中的诱导方法的成脂诱导时间较短，成脂诱导率较高。
将对比例1与实施例3中的方法进行对比，对比例1中，取消了超声处理，改变了脂肪干细胞的代数以及增加了诱导接种的密度，通过结果可知，会对成脂率等造成一定的影响。
将对比例2与实施例3中的方法进行对比，对比例2中未进行阶段性诱导培养，通过结果可知，阶段性诱导培养对成脂率的影响较大。
将对比例3与实施例3中的方法进行对比，对比例3中改变了每一阶段的诱导时间，通过结果可知，在不同培养基中诱导时间也会对成脂率造成一定的影响。
将对比例4与实施例3中的方法进行对比，对比例4中改变了每种成脂诱导培养基成分的含量，通过结果可知，不同的成分含量会对成脂诱导产生较大的影响。
将对比例5与实施例3中的方法进行对比，对比例5中改变了不同阶段成脂诱导培养基具体成分，通过结果可知，具体成分对成脂诱导的影响也较大。

Claims (10)

1.一种干细胞体外诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取脂肪组织，分离获得脂肪干细胞，将其进行传代培养，获得P3-P5代脂肪干细胞；
(2)将P3-P5代脂肪干细胞以4-6×103个/cm2的密度接种于孔板中进行孵育，当细胞达到100％融合时，将原培养基更换为成脂诱导培养基A，诱导培养2-3天；
(3)将成脂诱导培养基A更换为成脂诱导培养基B，继续诱导培养2-3天；
(4)将成脂诱导培养基B更换为成脂诱导培养C，继续诱导培养。
2.如权利要求1所述的干细胞体外诱导方法，其特征在于，步骤(1)中的脂肪干细胞获取方法为：于无菌环境下获取脂肪组织，用磷酸盐缓冲液于37℃气浴培养箱中回旋振荡漂洗干净，吸取下层组织，向其中加入质量体积比为0.05-0.3％的胶原酶进行酶解消化，消化过程中进行超声处理，脂肪与胶原酶的体积比为1:0.05-1；消化后吸取下层细胞冲洗干净后离心，继续收集下层细胞组织即为脂肪干细胞。
3.如权利要求1所述的干细胞体外诱导方法，其特征在于，成脂诱导培养基A包括含有6-12％胎牛血清的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：胰岛素2-4μmol/L、地塞米松2-4μmol/L、氢化可的松1-3μmol/L和反油酸5-15μmol/L。
4.如权利要求3所述的干细胞体外诱导方法，其特征在于，成脂诱导培养基A包括含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：胰岛素2μmol/L、地塞米松2μmol/L、氢化可的松1μmol/L和反油酸6μmol/L。
5.如权利要求1所述的干细胞体外诱导方法，其特征在于，成脂诱导培养基B包括含有6-12％胎牛血清和3-6％脂肪组织分泌物的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：胰岛素2-4μmol/L，地塞米松2-4μmol/L、氢化可的松1-3μmol/L、三氟醋柳酸2-4μmol/L和紫杉醇0.5-2μmol/L。
6.如权利要求5所述的干细胞体外诱导方法，其特征在于，成脂诱导培养基B包括含有8％胎牛血清和5％脂肪组织分泌物的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：胰岛素2μmol/L，地塞米松2μmol/L、氢化可的松1μmol/L、三氟醋柳酸2μmol/L和紫杉醇1μmol/L。
7.如权利要求1所述的干细胞体外诱导方法，其特征在于，成脂诱导培养基C包括含有6-12％胎牛血清和3-6％脂肪组织分泌物的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：胰岛素2-4μmol/L，海藻酸钠1-3μmol/L和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5-1μmol/l。
8.如权利要求7所述的干细胞体外诱导方法，其特征在于，成脂诱导培养基C包括含有6％胎牛血清和5％脂肪组织分泌物的DMEM/F12培养基和以下终浓度的组分：胰岛素2μmol/L，海藻酸钠2μmol/L和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5μmol/l。
9.如权利要求1所述的干细胞体外诱导方法，其特征在于，成脂诱导培养基B和C中脂肪细胞分泌物的制备方法如下：将脂肪组织切成1mm×1mm的小块，冲洗干净后放入含有100ml/l胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养3-5天后，收集培养基，即为脂肪细胞分泌物。
10.如权利要求1所述的干细胞体外诱导方法，其特征在于，步骤(2)、(3)和(4)中均在37℃、5％体积CO2条件下进行培养。
CN202110213863.7A 2021-02-26 2021-02-26 一种干细胞体外诱导方法 Active CN112877286B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110213863.7A CN112877286B (zh) 2021-02-26 2021-02-26 一种干细胞体外诱导方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110213863.7A CN112877286B (zh) 2021-02-26 2021-02-26 一种干细胞体外诱导方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112877286A true CN112877286A (zh) 2021-06-01
CN112877286B CN112877286B (zh) 2022-12-27

Family

ID=76054616

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110213863.7A Active CN112877286B (zh) 2021-02-26 2021-02-26 一种干细胞体外诱导方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112877286B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115125196A (zh) * 2022-08-24 2022-09-30 蚌埠医学院第一附属医院（蚌埠医学院附属肿瘤医院） 一种脂肪干细胞成脂诱导分化方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000157260A (ja) * 1998-11-26 2000-06-13 Toyobo Co Ltd 初代前駆脂肪細胞の分化誘導方法及びその分化用培地
CN108588015A (zh) * 2018-03-06 2018-09-28 安徽瑞杰赛尔生物科技有限公司 一种人间充质干细胞成脂诱导分化培养基及制备方法
CN109679901A (zh) * 2019-02-21 2019-04-26 山东华思生物科技有限公司 一种成脂诱导分化培养液及成脂诱导分化方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000157260A (ja) * 1998-11-26 2000-06-13 Toyobo Co Ltd 初代前駆脂肪細胞の分化誘導方法及びその分化用培地
CN108588015A (zh) * 2018-03-06 2018-09-28 安徽瑞杰赛尔生物科技有限公司 一种人间充质干细胞成脂诱导分化培养基及制备方法
CN109679901A (zh) * 2019-02-21 2019-04-26 山东华思生物科技有限公司 一种成脂诱导分化培养液及成脂诱导分化方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DUO YANG等: "Spontaneous adipogenic differentiation potential of adipose‑derived stem cells decreased with increasing cell passages", 《MOL MED REP》 *
陈犹白等: "脂肪干细胞成脂分化的研究进展", 《中国美容医学》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115125196A (zh) * 2022-08-24 2022-09-30 蚌埠医学院第一附属医院（蚌埠医学院附属肿瘤医院） 一种脂肪干细胞成脂诱导分化方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN112877286B (zh) 2022-12-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106754668B (zh) 一种干细胞培养液及注射液
CN109234229B (zh) 从胎盘血管分离间充质干细胞的方法和所用消化酶组合物
CN108004207B (zh) 从脂肪中获取大量脂肪间充质干细胞的方法
CN108685948B (zh) 一种医用细胞修复剂的制备方法
CN107858329B (zh) 从脂肪中分离脂肪间充质干细胞的方法和使用的试液
CN1912109B (zh) 一种组织工程化脂肪组织的构建方法与应用
CN104726406A (zh) 一种诱导牙髓间充质干细胞分化为神经细胞的方法
US20190264179A1 (en) Serum-free medium inducing differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cell into insulin-secretion-like cell and preparation method and use thereof
CN110564682A (zh) 一种大规模生产人脂肪间充质干细胞外泌体的方法
CN106318906A (zh) 一种大规模培养人脐带间充质干细胞的方法
CN104651305A (zh) 一种利用脐带间充质干细胞获取生物活性蛋白的方法
CN114540298A (zh) 一种干细胞无血清培养基及其制备方法
CN107083359B (zh) 干细胞培养基及干细胞分离方法
CN109628388B (zh) 用消化酶组合物从胎盘血管分离间充质干细胞
CN115873789A (zh) 人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基及其应用
CN112877286B (zh) 一种干细胞体外诱导方法
CN114107187A (zh) 一种牙髓间充质干细胞培养基及应用其的方法
CN107384864B (zh) 将脐带间充质干细胞诱导成神经干细胞的细胞培养液及其使用方法
CN116474000B (zh) 脐带间充质干细胞制剂、制备方法及其在治疗膝骨关节炎中的应用
WO2019237812A1 (zh) 脂肪组织消化液和快速获得基质血管成分细胞的方法
CN114790443B (zh) 一种间充质干细胞体外培养方法及其培养基
CN111849878A (zh) 一种提高间充质干细胞成骨能力的方法
CN108034634B (zh) 一种从经血中分离宫内膜间充质干细胞的方法
CN113403272B (zh) 一种原代脐带间充质干细胞的培养基及其应用
CN104818243A (zh) 一种胎盘源胎儿干细胞的分离方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant