EP0809690A1 - In vitro kultivierung von pleomorphen trypanosomenstämmen - Google Patents

In vitro kultivierung von pleomorphen trypanosomenstämmen

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EP0809690A1
EP0809690A1 EP96904791A EP96904791A EP0809690A1 EP 0809690 A1 EP0809690 A1 EP 0809690A1 EP 96904791 A EP96904791 A EP 96904791A EP 96904791 A EP96904791 A EP 96904791A EP 0809690 A1 EP0809690 A1 EP 0809690A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
trypanosomes
cultivation
culture medium
pleomorphic
trypanosome
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP96904791A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Michael Boshart
Erik Vassella
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Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Original Assignee
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
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Filing date
Publication date
Application filed by Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV filed Critical Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Publication of EP0809690A1 publication Critical patent/EP0809690A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/10—Protozoa; Culture media therefor
    • C12N1/105—Protozoal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/90—Protozoa ; Processes using protozoa
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/44—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from protozoa

Definitions

  • the present invention relates to a method for the in vitro cultivation of trypanosome strains without a previous adaptation phase, the use of the culture medium or fractions or components thereof obtainable by cultivation for the production of a therapeutic agent and a biological in vitro test system for the determination of effector substances which are responsible for the transition induce or / and inhibit a rapidly dividing trypanosome form to an incapable trypanosome form.
  • Trypanosomes are flagellated unicellular organisms that live as parasites in the Elutbahn of mammals and in tropical Africa and South America from insects, e.g. Tsetse flies being transferred from one host to another. They are the causative agent of African sleeping sickness in humans and various livestock diseases such as, in particular, the Nagana and are therefore of great medical, veterinary and economic importance.
  • the parasites occur in two morphologically and biochemically distinguishable forms. Because of their morphology, the rapidly dividing parasites are referred to as "long slenders".
  • the "short stumpy” forms that result from differentiation have irreversibly lost the ability to divide cells. Only if the "short stumpy" trypanosomes get through the blood meal of a Tsetse fly in the fly stomach can they differentiate further and continue the life cycle as procyclical forms. In the mammalian bloodstream, the "short stumpy" trypanosomes die after a few days and therefore cannot maintain the infection in the host.
  • the "long slender” forms are differentiated into “short stumpy” forms by an Known signal that correlates with the number of parasites in the blood. This seems to be a mechanism to limit parasitemia (number of parasites per ml of blood) in a way that ensures the survival of the host and thus the spread of the parasite.
  • Naturally occurring trypanosomes are always pleomorphic (diverse), which means that they can differentiate from "long slender” into “short stumpy” forms. To date, these strains cannot be efficiently propagated as bloodstream forms in any in vitro cell culture system. Only variants, certain monomorphic forms, which have been adapted to the cultivation conditions in the laboratory through a multi-week adaptation or selection phase, have so far been able to be cultivated and propagated in vitro. Such culture forms have lost the ability to differentiate into "short stumpy" forms or are severely defective therein.
  • the method according to the invention enables the cultivation of pleomorphic trypanosomes or monomorphic trypanosomes which have never been cultivated in vitro.
  • Such strains only grow in conventional liquid media after an adaptation period of several weeks during which massive cell death and selection take place. Cultivation in a liquid or semi-solid culture medium which contains a polymeric matrix makes these adaptation and selection steps unnecessary.
  • This high molecular or polymer matrix is preferably selected from polypeptides and / or polysaccharides, in particular from polysaccharides based on agar or / and dextran.
  • the method according to the invention allows pleomorphic trypanosomes to be cultivated in vitro.
  • the "long slender” trypanosomes in this culture system differentiate into “short stumpy” forms when a certain cell density is exceeded.
  • Extensive controls show that "stumpy" forms produced in vitro correspond to "stumpy” forms from the blood of infected animals in all parameters tested so far.
  • the invention thus furthermore relates to a process for the in vitro cultivation of pleomorphic trypanosomes, which is characterized in that pleomorphic trypanosomes capable of proliferation are spread onto the surface of a semi-solid culture medium and incubated under conditions in which the trypanosomes multiply .
  • the cultivation is preferably carried out by light microscopy until it occurs. Trypanosome colonies.
  • the process according to the invention enables the cultivation of the proliferation-capable "long slender” form until it is differentiated into the proliferation-incapable "short stumpy” form.
  • the method according to the invention is based on the fact that the cultivation of pleomorphic wild-type trypanosome strains is surprisingly possible as colonies on the surface of semi-solid culture media.
  • an agar-based culture medium e.g. Agar or agarose plates.
  • An example of a suitable medium is the HMI-9 medium, but other known media suitable for cultivating trypanosomes can also be used in principle.
  • Another object of the present invention is the use of the method described above as an assay system for determining effector substances which influence the growth or / and the differentiation of trypanosome strains, i.e. induce and / or inhibit. Of particular importance are those effector substances which have a growth-inhibiting or / and differentiation-inducing effect.
  • a particularly preferred application of the assay system is the determination and characterization of the signal substance SIF, which can be obtained from a conditioned culture medium which has already been used for the cultivation of trypanosomes.
  • a method for enriching a signaling substance (SIF) which stimulates the differentiation of pleomorphic trypanosome strains which is characterized in that trypanosomes are grown in vitro in a culture medium, the culture medium is separated from the cells and the signaling substance is extracted from the Culture medium enriched by conventional biochemical methods.
  • suitable biochemical enrichment methods are chromatographic methods such as gel chromatography, affinity chromatography, ion exchange chromatography, HPLC, reverse phase HPLC or combinations thereof.
  • the enrichment is preferably carried out in an inert Atmosphere.
  • SIF is contained, for example, in a heat-resistant, low-molecular fraction of the conditioned culture medium.
  • SIF or analogues of this substance are excellently suited for blocking the multiplication of trypanosomes in the mammalian bloodstream by inducing the differentiation into "short stumpy” forms. Since "short stumpy" forms themselves only have a limited lifespan of a few days, the administration of pharmacological doses of SIF or analogues leads to the elimination of the parasites and is therefore of great therapeutic benefit.
  • the above-mentioned bio-assay can also be used to search for other effector substances, e.g. for substances that stimulate the signal transduction cascade that mediates the SIF signal.
  • the present invention therefore furthermore relates to a therapeutic composition which contains, as active substance, a conditioned culture medium which was used for the cultivation of trypanosomes, or fractions or constituents of this medium, if appropriate together with customary pharmaceutical auxiliaries.
  • the composition preferably additionally contains one or more further active substances which are suitable for controlling trypanosome infections, for example germanin, pentamidine or tryparsamide.
  • the composition is preferably administered over a period of at least one week in order to ensure that the "long slender" forms are converted as completely as possible to the "short stumpy" forms which are no longer capable of reproduction.
  • Yet another object of the present invention is the use of the conditioned culture medium or of fractions or constituents of this medium for producing an agent for combating trypanosome infection, in particular an agent for combating sleeping sickness, caused by the trypanosome species T.gambiense or T.rhodes-iense, or an agent for combating the Nagana, which is caused by the trypanosome species T.brucei brucei.
  • Fig. 1 the growth of a pleomorphic trypanosome strain
  • Fig. 2 shows the plating efficiency of pleomorphic trypanosomes after in vitro cultivation.
  • 1.6 x HMI-9 medium is modified from the published method by Hirumi and Hirumi (1989) Journal of Parasitology 75; 985-989.
  • the agarose plates are produced based on the published method by Vern B. Curruthers and George A.M. Cross (1992) Proc. Natl. Acad. Be. USA 89, 8818-8821.
  • a 1.78% agarose solution (1.3 g low melting point SeaPlaque GTG agarose, biozyme, catalog no. 50112 in 73 ml bidistilled water) is autoclaved at 120 ° C for 20 minutes and then cooled to 37 ° C .
  • 127 ml of 1.6x HMI-9 medium preheated to 37 ° C. are added to this solution.
  • 20 ml of this mixture are transferred to 100 x 15 mm petri dishes without bubbles.
  • the agarose plates solidify for 60 minutes at room temperature with the lid closed. This is followed by drying the surface of the agar plate e.g. for approx. 20 minutes with the cover removed in a laminar flow of the Heraeus Lamin Air HB 2948 type.
  • Monomorphic trypanosome strains can be cultured in simply concentrated HMI-9 medium (Vern B. Curruthers and George AM Cross (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 8818-8821).
  • the conditioned medium of such cultures (containing the SIF) is obtained by centrifuging the cells and then sterilizing them.
  • This medium or the fractions obtained therefrom with the usual biochemical processes are enriched ad 5% with Serum Plus "and ad 15% with fetal calf serum (see Section A).
  • Pleomorphic trypanosomes are either isolated directly from the blood of infected mice or rats or obtained from one of the cultures described here (by washing the plates with simply concentrated HMI-9 medium) and diluted to the appropriate cell density. 100 .mu.l of the cell suspension are distributed on the surface of the plate by means of a rotary motion using a sterile Drigalski spatula. The plates are then transferred to an incubator (eg of the Heraeus 6000 type) and incubated at 37 ° C. in 5% CO 2 and 100% atmospheric humidity. After 2 to 3 hours (optional) and after overnight incubation, the liquid collected at the edge of the petri dish is aspirated using a sterile pipette. After 2 days, clearly visible colonies are formed under light microscopy (40 x magnification).
  • an incubator eg of the Heraeus 6000 type
  • Figure 1 shows a comparison of the growth of a pleomorphic trypanosome strain (curves 1 and 2) and a monomorphic trypanosome strain (curve 3) when cultivated on a semi-solid agar medium in vitro. It can be seen that the number of cells per plate in monomorphic trypanosomes is approximately at least a factor 10 2 higher than in pleomorphic trypanosomes is. This result is to be interpreted in such a way that pleomorphic trypanosomes differentiate from a form capable of proliferation into a form incapable of proliferation from a certain cell density.
  • pleomorphic trypanosomes are also possible in liquid medium which contains a polymeric matrix such as agarose. This finding was obtained for two types of agarose with different gelling temperatures (semi-liquid agarose and liquid (ultra-low-geling) agarose).
  • the assay system described in Example 1 for determining effector substances which influence the growth or differentiation of pleomorphic trypanosome strains can be considerably simplified and improved, in particular miniaturized. For this purpose, faster testing e.g. possible in the course of the purification of the signal substance s SIF.
  • Monomorphic trypanosome strains which had never been cultivated in vitro, only grew in conventional HMI-9 liquid medium after an adaptation period of several weeks, in which massive cell death and a selection for bloodstream forms take place. This adaptation and selection can be dispensed with by culture on agarose plates according to Example 1.
  • Heat-resistant low molecular weight fraction of the conditioned medium described in Example 1 was prepared. This heat-resistant kidney molecular fraction was sufficient to inhibit the growth of pleomorphic trypanosomes and to induce differentiation.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro Kultivierung von Trypanosomenstämmen, die Verwendung des durch diese Kultivierung erhältlichen Kulturmediums oder Fraktionen oder Bestandteilen davon zur Herstellung eines therapeutischen Mittels und ein biologisches in vitro Testsystem zur Ermittlung von Effektorsubstanzen, welche den Übergang einer sich rasch teilenden Trypanosomenform zu einer teilungsunfähigen Trypanosomenform induzieren oder/und hemmen.

Description

In vitro Kultivierung von pleomorphen Trypanosomenstämmen
BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro Kultivierung von Trypanosomenstämmen ohne vorherige Adaptions¬ phase, die Verwendung des durch eine Kultivierung erhältlichen Kulturmediums oder Fraktionen oder Bestandteilen davon zur Herstellung eines therapeutischen Mittels und ein biologisches in vitro Testsystem zur Ermittlung von Effektorsubstanzen, welche den Übergang einer sich rasch teilenden Trypanosomenform zu einer teilungsunfähigen Trypanosomenform induzieren oder/und hemmen.
Trypanosomen sind begeißelte Einzeller, die als Parasiten in der Elutbahn von Säugetieren leben und im tropischen Afrika und Südamerika durch Insekten, z.B. Tsetse-Fliegen, von einem Wirt zum anderen übertragen werden. Sie sind Erreger der afrikani¬ schen Schlafkrankheit beim Menschen und verschiedener Nutztier¬ seuchen wie insbesondere der Nagana und haben damit große medizinische, veterinärmedizinische und ökonomische Bedeutung.
In der Säugerblutbahn, auf die sich die folgenden Ausführungen beschränken, kommen die Parasiten in zwei morphologisch und biochemisch unterscheidbaren Formen vor. Die sich rasch teilen¬ den Parasiten werden aufgrund ihrer Morphologie als "long slender" bezeichnet. Die durch Differenzierung aus ihnen ent¬ stehenden "short stumpy" Formen haben die Fähigkeit zur Zell¬ teilung irreversibel verloren. Nur wenn die "short stumpy" Trypanosomen durch die Blutmahlzeit einer Tsetse-Fliege in den Fliegenmagen gelangen, können sie sich weiter differenzieren und als prozyklische Formen den Lebenszyklus fortsetzen. In der Säugerblutbahn sterben die "short stumpy" Trypanosomen nach wenigen Tagen ab und können somit die Infektion im Wirt nicht aufrecht erhalten. Die Differenzierung der "long slender" Formen in "short stumpy" Formen erfolgt durch ein noch unbe- kanntes Signal, das mit der Anzahl an Parasiten im Blut korre- liert. Es scheint dies ein Mechanismus zu sein, die Parasitämie (Zahl der Parasiten pro ml Blut) in einer Weise zu begrenzen, die das Überleben des Wirts und damit die Weiterverbreitung des Parasiten sicherstellt.
Natürlicherweise vorkommende Trypanosomen sind immer pleomorph (vielgestaltig), das heißt, sie können die Differenzierung von "long slender" in "short stumpy" Formen durchlaufen. Diese Stämme können bisher in keinem in vitro Zellkultursystem als Blutbahnformen effizient vermehrt werden. Lediglich Varianten, bestimmter monomorpher Formen, die im Labor durch eine mehr¬ wöchige Adaptions- bzw. Selektionsphase an die Kultivierungs- bedingungen angepaßt wurden, konnten bisher in vitro kultiviert und vermehrt werden. Solche Kulturformen haben die Fähigkeit zur Differenzierung in "short stumpy" Formen verloren oder sind hierin stark defekt.
Wir haben eine Zellkulturmethodik entwickelt, die es erstmals erlaubt, eine Kultivierung von Trypanosomen, insbesondere von Trypanosomen der Spezies T. brucei, ohne vorherige Adaptions- phase in einem Medium durchzuführen, das eine polymere Matrix enthält. Insbesondere gelingt durch das erfindungsgemäße Ver¬ fahren die Kultivierung von pleomorphen Trypanosomen oder noch niemals in vitro kultivierten monomorphen Trypanosomen. Der¬ artige Stämme wachsen in üblichen Flüssigmedien nur nach einer mehrwöchigen Adaptionsperiode, in der massiver Zelltod und Selektion stattfinden. Durch Kultivierung in einem flüssigen oder halbfesten Kulturmedium, das eine polymere Matrix enthält, werden diese Adaptions- und Selektionsschritte entbehrlich.
Die vorliegenden Daten zeigen eindeutig, daß die Zugabe der polymeren Matrix für die Kultivierbarkeit der Trypanosomen verantwortlich ist. Diese hochmolekulare oder polymere Matrix wird vorzugsweise aus Polypeptiden oder/und Polysacchariden, insbesondere aus Polysacchariden auf Agar- oder/und Dextranba- sis ausgewählt. Insbesondere erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren pleomorphe Trypanosomen in vitro zu kultivieren. Darüber hinaus differen¬ zieren die "long slender" Trypanosomen in diesem Kultursystem bei Überschreiten einer bestimmten Zelldichte in "short stumpy" Formen. Umfangreiche Kontrollen zeigen, daß in vitro erzeugten "stumpy" Formen in allen bisher getesteten Parametern "stumpy" Formen aus dem Blut infizierter Tiere übereinstimmen. Selbst bei einer seriellen Passage pleomorpher Trypanosomen, z.B. über drei Monate, änderte sich der pleomorphe Charakter der in vitro kultivierten Trypanosomen nicht im Vergleich zu solchen, die niemals in vitro kultiviert wurden. Beide Populationen der pleomorphen Trypanosomen zeigten nämlich nach Infektion in Mäusen die Fähigkeit, innerhalb einiger Tage in "stumpy" Formen und anschließend in Fliegenmagen Formen zu differenzieren.
Hiermit haben wir erstmals gezeigt, daß das wirksame Prinzip, das das Signal zur Differenzierung vermittelt, von Faktoren des Säugerwirts unabhängig ist, da es in vitro abläuft, in gleicher Weise wie im intakten Tier, mit der Dichte der Zellpopulation korreliert und folglich von den Trypanosomen selbst abgegeben oder modifiziert werden muß. Weiterhin kann Medium, in dem Trypanosomen in höherer Dichte gewachsen sind (konditioniertes Medium) alleine eine differenzierungsinduzierende und damit proliferationshemmende Wirkung entfalten. Mit diesem in vitro Differenzierungssystem verfügen wir über einen sensitiven Bio-Assay, der eine weitere Eingrenzung und Fraktionierung der genannten Aktivität mit der üblichen biochemischen Methodik erlaubt. Die Aktivität wird als SIF (stumpy induction factor) bezeichnet.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur in vitro Kultivierung von pleomorphen Trypanosomen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man proliferationsfähige pleo¬ morphe Trypanosomen auf die Oberfläche eines halbfesten Kultur¬ mediums ausstreicht und unter Bedingungen inkubiert, bei denen eine Vermehrung der Trypanosomen erfolgt. Vorzugsweise erfolgt die Kultivierung bis zum Auftreten lichtmikroskopisch erkenn- barer Trypanosomenkolonien. Durch das erfindungsgemäße Ver¬ fahren gelingt die Kultivierung der proliferationsfähigen "long slender" Form bis zur Differenzierung in die proliferations¬ unfähige "short stumpy" Form.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht darauf, daß die Kultivie¬ rung von pleomorphen Wildtyp-Trypanosomenstämmen überraschen¬ derweise als Kolonien auf der Oberfläche von halbfesten Kultur¬ medien möglich ist. Vorzugsweise verwendet man ein Kulturmedium auf Agarbasis, z.B. Agar- oder Agaroseplatten. Ein Beispiel für ein geeignetes Medium ist das HMI-9 Medium, doch auch andere bekannte, zur Kultivierung von Trypanosomen geeignete Medien können grundsätzlich verwendet werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Anwendung des oben beschriebenen Verfahrens als Assay-System zur Bestimmung von Effektorsubstanzen, welche das Wachstum oder/und die Differenzierung von Trypanosomenstämmen beein¬ flussen, d.h. induzieren oder/und hemmen. Dabei sind insbeson¬ dere solche Effektorsubstanzen von Bedeutung, die eine wachs¬ tumshemmende oder/und differenzierungsinduzierende Wirkung besitzen. Eine besonders bevorzugte Anwendung des Assaysystems ist die Bestimmung und Charakterisierung des Signalstoffes SIF, der aus einem konditionierten Kulturmedium erhältlich ist, das schon einmal zur Kultivierung von Trypanosomen verwendet wurde.
Somit wird ein Verfahren zur Anreicherung eines die Differen¬ zierung pleomorpher Trypanosomenstämme stimulierenden Signal- Stoffes (SIF) bereitgestellt, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man Trypanosomen in vitro in einem Kulturmedium an¬ züchtet, das Kulturmedium von den Zellen abtrennt und den Signalstoff aus dem Kulturmedium nach üblichen biochemischen Methoden anreichert. Beispiele für geeignete biochemische Anreicherungsmethoden sind chromatographische Methoden wie etwa Gelchromatographie, Affinitätschromatographie, Ionenaustau¬ scherchromatographie, HPLC, reverse Phase HPLC oder Kombinatio¬ nen davon. Vorzugsweise wird die Anreicherung in einer inerten Atmosphäre durchgeführt. SIF ist beispielsweise in einer hitze- resistenten niedermolekularen Fraktion des konditionierten Kulturmediums enthalten.
SIF oder Analoge dieser Substanz sind hervorragend geeignet durch Induktion der Differenzierung in "short stumpy" Formen, die Vermehrung von Trypanosomen in der Säugerblutbahn zu blok- kieren. Da "short stumpy" Formen selbst nur eine begrenzte Lebensdauer von wenigen Tagen haben, führt die Verabreichung pharmakologischer Dosen von SIF oder Analogen zur Elimination der Parasiten und ist damit therapeutisch von großem Nutzen. Der genannte Bio-Assay kann auch eingesetzt werden, um nach anderen Effektorsubstanzen zu suchen, z.B.nach Substanzen, die in die das SIF Signal vermittelnde Signaltransduktionskaskade stimulierend eingreifen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine therapeutische Zusammensetzung, die als Wirksubstanz ein konditioniertes Kulturmedium, das zur Kultivierung von Trypan¬ osomen verwendet wurde, oder Fraktionen oder Bestandteile, dieses Mediums ggf. zusammen mit pharmazeutisch üblichen Hilfs¬ stoffen enthält. Vorzugsweise enthält die Zusammensetzung zusätzlich eine oder mehrere weitere zur Bekämpfung von Trypan- osomeninfektionen geeigneten Wirksubstanzen, z.B.Germanin, Pentamidin oder Tryparsamid. Die Verabreichung der Zusammen¬ setzung erfolgt vorzugsweise über eine Dauer von mindestens einer Woche, um eine möglichst vollständige Umwandung der "long slender" Formen zu den nicht mehr vermehrungsfähigen "short stumpy" Formen sicherzustellen.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des konditionierten Kulturmediums oder von Fraktio¬ nen oder Bestandteilen dieses Mediums zur Herstellung eines Mittels für die Bekämpfung einer Trypanosomeninfektion, ins¬ besondere eines Mittels für die Bekämpfung der Schlafkrankheit, die durch die Trypanosomenspezies T.gambiense oder T.rhodes- iense hervorgerufen wird, oder eines Mittels für die Bekämpfung der Nagana, die durch die Trypanosomenspezies T.brucei brucei hervorgerufen wird.
Weiterhin soll die vorliegende Erfindung durch die nachfolgen¬ den Beispiele und die Abbildungen 1 und 2 näher erläutert werden.
Es zeigen:
Abb. 1 das Wachstum eines pleomorphen Trypanosomenstammes
(AnTat 1.1) und eines monomorphen Trypanosomenstammes (MiTat 427-221) bei Kultivierung auf einem halbfesten Agarmedium in vitro und
Abb. 2 die Plattierungseffizienz von pleomorphen Trypano¬ somen nach einer in vitro Kultivierung.
Beispiel 1 :
In vitro Assay zum Nachweis einer wachstumshemmenden und diffe- renzierungsinduzierenden Aktivität von Trypanosoma Blutstrom- formen z.B. Trypanosoma b. brucei AnTat 1.1.
A) Herstellung des HMI-9 Mediums in 1.6 facher Konzentration (1.6 x HMI-9)
1.6 x HMI-9 Medium wird nach einer Modifikation der publizier¬ ten Methode von Hirumi und Hirumi (1989) Journal of Parasito- logy 75; 985-989 hergestellt.
Zu 365 ml des in zweifacher Konzentration hergestellten Grund¬ mediums (Iscove's modified Dulbecco's medium von Gibco BRL; Katalog-Nr. 074-02200A) werden folgende sterile wässrige Lösun¬ gen in aufgeführter Reihenfolge beigegeben:
10 ml Hypoxanthin (Sigma, Katalog-Nr. H 9636) ; 13,6 mg/ml 10 ml Bathocuproin-Bisulfonsaure (Serva, Katalog- Nr.14470); 2.82 mg/ml
10 ml S-Mercaptoethanol (-Merck, Katalog-Nr. 120060050) 20 μM/ml 10 ml Thyτnidin (Sigma, Katalog-Nr. T 1895) ; 3.9 mg/ml
10 ml Pyruvat (Gibco BRL, Katalog- Nr. 043-01360H)
10 ml Penicillin/Streptomycin (Gibco BRL, Katalog-Nr.
043-05140H)
10 ml Cystein 1] (Gibco BRL, Katalog-Nr.066-01033E) ;
18.2 mg/ml
50 ml Serum Plus *21 (JRH Biosciences, Katalog-Nr. 14-001)
150 ml Fetales Kälberserum21 (Gibco BRL, z.B. Charge
40Q2321X, Katalog-Nr. 01105290 M)
x) innerhalb 10 Minuten nach Ansetzen der Lösung dem Medium zugeben 21 hitzeinaktiviert während 30 min bei 56°C
B) Herstellung der Agaroseplatten
Die Herstellung der Agaroseplatten erfolgt in Anlehnung an die publizierte Methode von Vern B. Curruthers und George A.M. Cross (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 8818-8821.
Eine 1,78 %-ige Agaroselösung (1.3 g low melting point SeaPla- que GTG Agarose, Biozym, Katalog-Nr. 50112 in 73 ml bidestil- liertem Wasser) wird 20 Minuten bei 120°C autoklaviert und anschließend auf 37°C abgekühlt. Dieser Lösung werden 127 ml auf 37°C vorgewärmtes 1.6x HMI-9 Medium (siehe oben) zugegeben. 20 ml dieser Mischung werden blasenfrei in 100 x 15 mm Petri- schalen überführt. Die Agaroseplatten erstarren während 60 Minuten bei Raumtemperatur mit geschlossenem Deckel. Darauf folgt eine Trocknung der Oberfläche der Agarplatte z.B. für ca. 20 Minuten bei abgenommenem Deckel in einem Laminar Flow des Typs Heraeus Lamin Air HB 2948.
C) Herstellung von Platten mit konditioniertem Medium
Monomorphe Trypanosomenstämme (z.B. MiTat 427-221) können in einfach konzentriertem HMI-9 Medium kultiviert werden (Vern B. Curruthers und George A. M. Cross (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 8818-8821) . Das konditionierte Medium solcher Kulturen (das den SIF enthält) wird durch Abzentrifugieren der Zellen und anschließendem Sterilfiltrieren gewonnen. Dieses Medium oder mit den üblichen biochemischen Verfahren daraus gewonnenen Fraktionen werden ad 5 % mit Serum Plus" und ad 15 % mit feta¬ lem Kälberserum (siehe Abschnitt A) angereichert. 9 Volumen¬ anteile dieser Lösung werden mit 1 Volumenanteil einer 6.5%iger Agaroselösung (hergestellt wie unter Abschnitt B beschrieben) gemischt. Diese Lösung wird mit verschiedenen Mengen der unter Abschnitt B beschriebenen Standard-HMI-9-Agarose Lösung ver¬ mischt, um unterschiedliche Anteile an konditionierten. Medium zu erhalten. 20 ml dieser Mischung werden anschließend in Petrischalen gegossen.
D) Ausplattieren der Blutstromformen pleomorpher Trypanosomen
Pleomorphe Trypanosomen (z.B. AnTat 1.1) werden entweder direkt aus dem Blut infizierter Mäuse oder Ratten isoliert oder aus einer der hier beschriebenen Kulturen gewonnen (durch Abwaschen der Platten mit einfach konzentriertem HMI-9 Medium) und auf die geeignete Zelldichte verdünnt. 100 μl der Zellsuspension werden mittels eines sterilen Drigalski-Spatels auf der Ober¬ fläche der Platte durch Drehbewegungen derselben verteilt. Anschließend werden die Platten in einen Brutschrank (z.B des Typs Heraeus 6000) überführt und bei 37°C in 5% C02 und 100% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Nach 2 bis 3 Stunden (optional) sowie nach Inkubation über Nacht wird die am Rand der Petri- schale angesammelte Flüssigkeit mittels einer sterilen Pipette abgesaugt. Nach 2 Tagen bilden sich lichtmikroskopisch (40 x Vergrößerung) gut sichtbare Kolonien.
Abbildung 1 zeigt einen Vergleich des Wachstums eines pleomor¬ phen Trypanosomenstammes (Kurven 1 und 2) und eines monomorphen Trypanosomenstammes (Kurve 3) bei Kultivierung auf einem halb¬ festen Agarmedium in vitro. Es ist zu erkennen, daß die Zel¬ lenzahl pro Platte bei monomorphen Trypanosomen um ca. minde¬ stens den Faktor 102 höher als bei pleomorphen Trypanosomen ist. Dieses Ergebnis ist so zu interpretieren, daß pleomorphe Trypanosomen ab einer bestimmten Zelldichte von einer prolife- rationsfähigen Form in eine proliferationsunfähige Form diffe¬ renzieren.
Dieser Befund wird auch durch Abbildung 2 belegt, worin die Plattierungseffizienz von pleomorphen Trypanosomen nach einer bereits erfolgten in vitro Kultivierung dargestellt ist. Es ist zu erkennen, daß diese Plattierungseffizienz mit zunehmender Zeitdauer der Vorkultur drastisch abnimmt. Dies zeigt, daß mit zunehmender Dauer der Vorkultur eine Differenzierung der pleo¬ morphen Trypanosomen stattfindet.
E) Ablesen und Beurteilung des Assays
Zur Bestimmung der wachstumshemmenden und differenzierungs- induzierenden Wirkung der Fraktionen des konditioniertem Medi¬ ums wird folgende Auswertung nach 2 Tagen Inkubation der Try¬ panosomen vorgenommen.
1) wachstumshemmende Wirkung: a) Bestimmung der Kolonienzahl (quantitativ) sowie der Kolo¬ niengröße auf Platten, auf die 100 bis 200 Zellen aus¬ plattiert wurden (mit Lichtmikroskop) b) Bestimmung der Gesamtzellzahl pro Platte, auf die 10 000 Zellen ausplattiert wurden (Abwaschen der Platte und anschließender Bestimmung der Zellzahl mit einer Neubauer Zellkammer oder eines cell counters; z.Schärfe System, Reutlingen) .
2) differenzierungsinduzierende Wirkung:
Untersuchung der Morphologie der Trypanosomen (Phasenkontrast- Mikroskopie, Anfärben mit Giemsa) . Beispiel 2 :
Flüssigkultivierung von pleomorphen Trypanosomen
Die Kultivierung von pleomorphen Trypanosomen ist auch in Flüssigmedium möglich, das eine polymere Matrix wie etwa Aga- rose enthält. Dieser Befund wurde für zwei Agarosetypen mit unterschiedlicher Geliertemperatur (halbflüssige Agarose und flüssige (Ultra-low-geling) Agarose) erhalten.
Durch diese Flüssigkultivierung kann das in Beispiel 1 be¬ schriebene Assay-System zur Bestimmung von Effektorsubstanzen, welche das Wachstum oder die Differenzierung pleomorpher Try- panosomenstämme beeinflussen, erheblich vereinfacht und verbes¬ sert, insbesondere miniaturisiert werden. Hierzu wird ein zügigeres Testen z.B. im Zuge der Aufreinigung des Signalstof- f s SIF möglich.
Beispiel 3 :
Kultivierung von noch niemals in vitro kultivierten monomorphen Trypanosomen
Monomorphe Trypanosomenstämme, die noch niemals in vitro kulti¬ viert worden waren, wuchsen in üblichem HMI-9 Flüssigmedium nur nach einer mehrwöchigen Adaptionsperiode, in der massiver Zelltod und eine Selektion auf Blutbahnformen stattfinden. Durch Kultur auf Agaroseplatten gemäß Beispiel 1 wird diese Adaption und Selektion entbehrlich.
Beispiel 4 :
Charakterisierung von SIF
Durch 15 minütiges Kochen und Ultrafiltration durch eine Mem¬ bran mit einem Molekulargewichts cut-off von 500 wurde eine hitzeresistente niedermolekulare Fraktion des in Beispiel 1 beschriebenen konditionierten Mediums hergestellt. Diese hitze¬ resistente nierdermolekulare Fraktion war ausreichend, um das Wachstum von pleomorphen Trypanosomen zu inhibieren und die Differenzierung zu induzieren.
Weitere Untersuchungen an SIF ergaben einen Molekulargewichts- bereich von vermutlich ≤ 250 D. Schließlich ist SIF bei einem neutralen pH-Wert nicht mit Äther extrahierbar.

Claims

PATENTANSPRUCHE
1. Verfahren zur in vitro Kultivierung von Trypanosomen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung ohne vorherige Adaptionsphase in einem Medium durchführt, das eine polymere Matrix enthält.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man pleomorphe oder noch niemals in vitro kultivierte monomorphe Trypanosomen verwendet .
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die polymere Matrix aus Polypeptiden oder/und Polysacchariden auswählt.
4. Verf hren nach einem der Ansprüche 1 - 3 , dadurch gekennzeichnet, daß man ein Polysaccharid auf Agar- oder/und Dextranbasis verwendet .
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung in einem flüssigen oder halbfe¬ sten Kulturmedium durchführt .
6. Verfahren zur in vitro Kultivierung von pleomorphen Try¬ panosomen nach einem der Ansprüche 1 - 5, dadurch gekennzeichnet, daß man proliferationsfähige pleomorphe Trypanosomen auf die Oberfläche eines halbfesten Kulturmediums ausstreicht und unter Bedingungen inkubiert, bei denen eine Vermehrung der Trypansosomen erfolgt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bis zum Auftreten lichtmikroskopisch erkennbarer Kolonien erfolgt.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß man ein halbfestes Kulturmedium auf Agarbasis ver¬ wendet.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bis zur Differenzierung in eine proliferationsunfähige Form erfolgt.
10. Anwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 - 9 als Assay-System zur Bestimmung von Effektorsubstanzen, welche das Wachstum oder/und die Differenzierung von Trypanosomenstämme beeinflussen.
11. Anwendung nach Anspruch 10 zur Bestimmung und Charakteri¬ sierung eines die Differenzierung stimulierenden Signal- Stoffes (SIF) , der aus einem konditionierten Kulturmedium erhältlich ist, das zur Kultivierung von Trypanosomen verwendet wurde.
12. Verfahren zur Anreicherung eines die Differenzierung pleomorpher Trypanosomenstämme stimulierenden Signalstof¬ fes (SIF) , dadurch gekennzeichnet, daß man Trypanosomen in vitro in einem Kulturmedium an¬ züchtet, das Kulturmedium von den Zellen abtrennt und den Signalstoff aus dem Kulturmedium nach üblichen biochemi¬ schen Methoden anreichert .
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man den Anreicherungsgrad des Signalstoffes in einem Assay-System ermittelt, das auf einer Hemmung des Wachs¬ tums oder/und einer Induktion der Differenzierung von Trypanosomenstämmen beruht.
14. Therapeutische Zusammensetzung, die als Wirksubstanz ein konditioniertes Kulturmedium, das zur Kultivierung von Trypanosomen verwendet wurde, oder Fraktionen oder Be¬ standteile dieses Mediums gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch üblichen Hilfsstoffen enthält.
15. Zusammensetzung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirksubstanz in einer hitzeresistenten niedermole¬ kularen Fraktion des konditionierten Kulturmediums ent¬ halten ist.
16. Zusammensetzung nach Anspruch 14 oder 15, die zusätzlich eine oder mehrere weitere zur Bekämpfung von Trypanosome- ninfektionen geeignete Wirksubstanzen enthält.
17. Verwendung eines konditionierten Kulturmediums, das zur Kultivierung von Trypanosomen verwendet wurde, oder von Fraktionen oder Bestandteilen dieses Mediums zur Herstel¬ lung eines Mittels für die Bekämpfung einer Trypanosome- ninfektion.
18. Verwendung nach Anspruch 17 zur Herstellung eines Mittels für die Bekämpfung der Schlafkrankheit.
19. Verwendung nach Anspruch 17 zur Herstellung eines Mittels für die Bekämpfung der Nagana.
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