DE69119576T2

DE69119576T2 - Verfahren zur Abtrennung, Identifizierung und Quantifizierung von Isoenzymen und Isoformen der alkalischen Phosphatase

Info

Publication number: DE69119576T2
Application number: DE69119576T
Authority: DE
Inventors: Roland Chevigne
Original assignee: Analis SA
Current assignee: Analis SA
Priority date: 1991-01-15
Filing date: 1991-12-23
Publication date: 1997-03-27
Anticipated expiration: 2011-12-24
Also published as: DE69119576D1; EP0495346B1; EP0495346A1; BE1005220A3; JPH05103698A; US5264098A

Description

Gegenstand der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft im wesentlichen ein elektrophoretisches Verfahren, das ermöglicht, die in einer physiologischen Flüssigkeit oder einem Gewebeextrakt enthaltenen Isoenzyme und Isoforme der alkalischen Phosphatase zu trennen und zu identifizieren.
Sie betrifft außerdem ein densitometrisches Verfahren, das ermöglicht, die durch das elektrophoretische Verfahren der Erfindung sichtbar gemachten Isoenzyme und Isoforme zu quantifizieren.
Die Erfindung erstreckt sich außerdem auf die zur Verwirklichung des Verfahrens verwendeten vorbereiteten Produkte, und auf die Produkte des Verfahrens.

Technologischer Hintergrund

Der Ausdruck alkalische Phosphatase (EC3.1.3.1), abgekürzt ALP faßt eine Gesamtheit von Enzymen zusammen, die bei basischem pH die Hydrolyse von Phosphorsäureestern katalysieren.
Die ALP ist im Bereich der Zellmembranen vorhanden und wird in den meisten Geweben des Organismus angetroffen. Entsprechend der Lokalisierung wird von einem Darm-, Nieren-, Knochen-, Leber-, Plazenta- und Fetaldarm- Isoenzym gesprochen. Die ALPS zirkulieren ebenfalls in dem Blutserum.
In dem menschlichen Organismus steuern vier verschiedene Gene die Expression der ALP: ein unspezifisches Gewebe-Gen (das insbesondere für das Knochen-, Leber- und Nieren-Isoenzym kodiert), ein Darm-Gen, ein Plazenta-Gen und ein Fetaldarm-Gen, wobei jedes dieser Gene für ein entsprechendes Isoenzym kodiert.
Jedes dieser Isoenzyme kann eine oder mehrere posttranslationale Modifikationen erleiden, bei denen seine physikalisch-chemischen Eigenschaften verändert werden, aber seine biologischen Eigenschaften erhalten bleiben, und zu einem Isoform werden.
Gegenwärtig sind die folgenden Isoforme bekannt: ein Isoenzym, das an ein Immunoglobulin gebunden ist, ein tetrameres Isoenzym, ein Isoenzym, das einen anormalen Gehalt an Sialsäure hat, ein Isoenzym, das an einen Zellmembran-Überrest gebunden ist (und makromolekulares Enzym genannt wird), und ein Isoenzym, das an ein Lipoprotein, zum Beispiel das LPX, gebunden ist.
Die Anzahl und die Menge der verschiedenen Isoenzyme und Isoforme der alkalischen Phosphatase variieren sehr stark in Abhängigkeit von einerseits dem Alter, und andererseits dem Gesundheitszustand der einzelnen Menschen.
Insbesondere wurden die Knochen- und Leber-Isoenzyme untersucht, da jede primäre oder sekundäre Erkrankung, die die Knochen- und/oder Leber- Gallen-Systeme beeinflußt, je nach Fall eine Zunahme oder eine Abnahme der Knochen- und/oder Leber-Isoenzyme in dem Blutserum verursachen kann, und von dem Auftreten eines weiteren Isoenzyms oder einem oder mehreren Isoformen verbunden sein kann.
Es ist bekannt, daß der Gehalt an Serum-Knochen-Isoenzymen von der Kindheit bis zum Erwachsenenalter abnimmt und zum Zeitpunkt der Wachstumsschübe Spitzen aufweist. Ein Wachstumsstillstand bei dem Kind ist durch eine anormale Verminderung des Gehaltes an Knochen-Isoenzymen gekennzeichnet. Diese Wachstumsschübe sind von dem Vorhandensein einer zweiten Knochenfraktion in dem Blutserum begleitet, die in Form von Tetrameren auftritt.
Diese Fraktion fehlt in dem Serum des normalen Erwachsenen, aber sie wird angetroffen, wenn im Bereich der Knochen ein pathologischer Vermehrungsprozeß abläuft (Paget-Krankheit, Knochenmetastasen...).
Eine osteoklastische Aktivität ist gekennzeichnet durch das Vorhandensein von Knochen-Isoenzymen mit geringerem Gehalt an Sialsäure.
Der Gehalt an Leber-Isoenzym bleibt bei einem einzelnen Menschen mit guter Gesundheit im Lauf des Lebens normalerweise konstant.
Die degenerativen Krankheiten der Leber, wie die Fibrose, die Krankheiten, die eine Leberinfiltration verursachen und eine progressive Zerstörung der Hepatozyten zur Folge haben, führen zu einer Verminderung, und dann zum Verschwinden des Leber-Isoenzyms.
Eine intra- oder extrahepatische Cholostase (Hepatitis, Zirrhose, Lebermetastasen, Leberkompression, die beispielsweise durch einen benachbarten Tumor verursacht wird) kann dagegen eine Zunahme des Leber-Isoenzyms verursachen, begleitet von dem Auftreten des (an einen Membran-Überrest gebundenen) Isoforms, das makromolekulare, Leber-Gallen- oder Alpha 1- Fraktion genannt wird, sowie weiterer Isoforme, wie an verschiedene Lipoproteine gebundene Leberfraktionen.
Bei Fehlen einer akuten Entzündung ist das Vorhandensein eines Leber- Isoenzyms, das einen verminderten Gehalt an Sialsäure hat, ein Anzeichen für das Vorhandensein eines Tumors.
Ein Leber-Isoenzym, das einen anormalen Gehalt an Sialsäure hat, wird bei der infantilen transitorischen Hyperphosphatasämie (Virusinfektion der Atem- oder Verdauungswege bei dem Kind) angetroffen.
Die Identifizierung weiterer Arten von Isoenzymen der alkalischen Phosphatase ermöglicht außerdem, pathologische Störungen nachzuweisen.
Es ist bekannt, daß das Vorhandensein von Plazenta-Isoenzymen außerhalb der Schwangerschaft das Anzeichen für eine rasch fortschreitende Tumorerkrankung ist, daß Darm-Isoenzyme und Darm-Isoforme in hohen Mengen das Kennzeichen einer systemischen Krankheit sein können, und daß das Fetaldarm- Isoenzym im Fall eines primitiven Tumors der Leber (Hepatom) angetroffen wird.
Die Untersuchung der alkalischen Phosphatasen kann also eine wesentliche Hilfe bei der Diagnose bringen, aber auch bei der Überwachung der Patienten nützlich sein, um den Verlauf einer Krankheit zu verfolgen, oder die Wirkung einer Behandlung zu objektivieren.

Zusammenfassung des Standes der Technik

Die verschiedenen Isoenzyme werden gewöhnlich durch Elektrophorese auf Agarose- oder Polyacrylamid-Gel, oder auf Zelluloseacetat-Membranen getrennt.
Je nach den verwendeten Techniken werden manche Isoenzyme oder Isoforme nicht erfaßt, oder können nicht eindeutig identifiziert werden. Die Empfindlichkeit ist auch nicht immer ausreichend, was einen frühzeitigen Nachweis der Erkrankungen verhindert.
Der Einfluß der Verwendung von nicht-ionischen Detergenzien auf die Ergebnisse von verschiedenen Elektrophorese-Arten ist in der Literatur beschrieben. In dem Artikel mit dem Titel "Acrylamide disc gel electrophoresis of alkaline phosphate of human tissues, serum and ascites fluid using triton X-100 in the sample and the gel matrix", veröffentlicht in Biochemical Medicine, Band 9, Nr. 3, März 1974, Seite 309-315, hat FISHMAN L. gezeigt, daß die Verwendung des nicht-ionischen Detergens Triton X100 bei verschiedenen Proben und bei einem Acrylamid-Gel ermöglicht, in dieses Gel Isoenzyme mit hohem Molekulargewicht eindringen zu lassen, die bei Fehlen dieses Detergens an dem Aufbringungspunkt bleiben und als diffuse Zone erscheinen.
Dies wird bestätigt in dem Artikel von MOSS et al. mit dem Titel "Alkaline phosphatase isoenzymes", veröffentlicht in CLINICAL CHEMISTRY, Band 28, Nr. 10, Oktober 1982, Seite 2007-2016, Winston-Salem, Washington, US.
Außerdem wurde in dem Patent US-A-4 030 995 vorgeschlagen, verschiedene nicht-ionische Detergenzien mit einem Molekulargewicht zwischen 600 und 2000, wie beispielsweise Triton, Brij oder Tween für die Elektrophorese von alkalischen Phosphatasen auf einem Agarose-Gel oder einer Zellulosemembran zu verwenden. Die Isoenzyme dringen in den Träger ein, wobei sie die Empfindlichkeit verbessern, aber keinen Einfluß auf die Qualität der Trennung haben.
Die anionischen Detergenzien übertragen eine negative Ladung auf die verschiedenen Isoforme, was ermöglicht, sie über die ganze Länge der Migration zu verteilen. Ihre Verwendung weist jedoch Nachteile auf: Sie erhöhen den Strom (mit Gefahr des Reißens der Gele), und folglich den Joule- Effekt (mögliche Denaturierung der Enzyme); diese Detergenzien sind außerdem oft denaturierend im Bereich der Proteine (also der Enzyme); sie können sogar "Anti-Enzyme" sein, das heißt, eine Hemmung der phosphatasischen Aktivität verursachen. Schließlich können sie eine für ein bestimmtes Isoform zu große Ladung übertragen, und das Isoform bei der Elektrophorese zu rasch wandern lassen und sogar aus dem Gel herauswandern lassen.
Wenn ein kationisches Detergens allein verwendet wird, wandert die makromolekulare Fraktion, deren Ladung geändert ist, in einer Richtung, die entgegengesetzt zu der Richtung ist, in der sie bei der Elektrophorese von Serumproteinen wandert, was die Interpretation schwierig macht.
Aus allen diesen Gründen werden die anionischen oder kationischen Detergenzien bei den elektrophoretischen Techniken zur Identifizierung der alkalischen Phosphatasen gewöhnlich kaum verwendet.
Bisher konnte eine einwandfreie Trennung und eine sichere Identifizierung der Isoenzyme, insbesondere des Knochen- und Leber-Isoenzyms, nur unter Zuhilfenahme von zusätzlichen Techniken, die eine doppelte Analyse erfordern, erhalten werden.
So werden in bekannter Weise Elektrophoresen auf Zelluloseacetat- Membranen gemacht, bei denen man auf demselben Träger nicht nur die zu analysierende Probe, sondern auch eine während 10 Minuten bei 56ºC thermodenaturierte Probe wandern läßt.
Weiterhin werden in bekannter Weise Proben mit Neuraminidase behandelt, die je nach der Herkunft (Leber oder Knochen) des Isoenzyms die Sialsäurereste von alkalischen Phosphatasen mit verschiedenen Geschwindigkeiten entfernt, wodurch eine bessere Trennung der dem Leber- oder Knochen-Isoenzym entsprechenden, elektrophoretischen Streifen sichergestellt wird. Nach den bekannten Techniken ermöglicht selbst die densitometrische Analyse nicht, auf eindeutige Weise zwei getrennte Fraktionen nachzuweisen, ohne einen zusätzlichen Test zu Hilfe zu nehmen. Dabei ist anzumerken, daß die Neuraminidase nicht auf die aus Asialoglykoproteinen bestehende Darmfraktion wirkt.
Die Techniken mit doppelter Analyse sind leider langsam und teuer.
Die Dauer der Analysen nach den bekannten Verfahren, die die Verwendung eines Detergens umfassen, wird noch dadurch vergrößert, daß das Detergens im allgemeinen nach dem Gießen und Abkühlen des Gels zu dem Gel hinzugegeben wird: Vor der eigentlichen Elektrophorese ist es erforderlich, das Gel während 30 Minuten in einen sogenannten Äquilibrationspuffer zu geben. Solche Puffer haben nur eine begrenzte Haltbarkeitsdauer (60 Tage), und müssen also erneuert werden, wenn das ganze Jahr über Analysen gemacht werden.

Ziele der Erfindung

Die Erfindung hat zum Ziel, eine elektrophoretische Technik zu entwickeln, die eine einwandfreie Trennung des Knochen- und Leber-Isoenzyms der alkalischen Phosphatase, sowie eine eindeutige Identifizierung jedes anderen Isoenzyms oder Isoforms ermöglicht, wobei sie zugleich eine sehr große Empfindlichkeit hat.
Sie hat außerdem zum Ziel, eine Trennung zu ermöglichen, die verwirklicht werden kann, ohne eine doppelte Analyse von Proben zu Hilfe zu nehmen.
Sie hat weiterhin zum Ziel, ein elektrophoretisches Verfahren vorzuschlagen, das ermöglicht, das Knochen- und Leber-Isoenzym der alkalischen Phosphatase in physiologischer Flüssigkeit oder Gewebeextrakten direkt zu quantifizieren.
Ein besonders nützliches Ziel ist, gebrauchsfertige Elektrophorese- Ausrüstungen mit großer Haltbarkeitsdauer zu liefern, die ermöglichen, eine gute Färbung der Proben zu erhalten, während sie zugleich bei einer einfacheren Prozedur verwendet werden können, die im Vergleich zu den bei den bekannten Techniken anzuwendenden Prozeduren eine beträchtlich kürzere Dauer hat.
Die Anmelderin hat mit Überraschung festgestellt, daß die gemeinsame Verwendung eines nicht-ionischen Detergens und eines anionischen Detergens bei einem bei der Elektrophorese verwendeten Agarose-Gel ermöglicht, die obigen Ziele zu erreichen.

Kennzeichnende Elemente der Erfindung

Gemäß der Erfindung wird ein elektrophoretisches Verfahren zum Trennen und Identifizieren der Isoenzyme und Isoforme der alkalischen Phosphatase in einer Probe einer physiologischen Flüssigkeit oder eines Gewebeextrakts vorgeschlagen, bei dem ein Puffer, mindestens ein nicht-ionisches Detergens, und mindestens ein anionisches Detergens auf die Trägermitte aufgebracht werden. Die Detergenzien sind vorzugsweise in Lösung in dem Puffer.
Jedes Detergens ist in dem Puffer vorzugsweise in einer Menge von 0,1 bis 10 g/l enthalten.
Das Verhältnis zwischen dem nicht-ionischen Detergens und dem anionischen Detergens beträgt in vorteilhafter Weise 2:1.
Der pH des Puffers liegt vorzugsweise zwischen 8 und 11. Bei einer bevorzugten Ausführungsform beträgt der pH 9,45.
Der verwendete Puffer ist vorzugsweise Tris(hydroxymethyl)aminomethan, das Borsäure enthält.
Das anionische Detergens kann unter den Gallensäuren und den Gallensalzen gewählt werden und in diesem Fall vorzugsweise aus Natriumdesoxycholat oder Natriumtaurocholat bestehen.
In alternativer Weise kann das anionische Detergens aus einer Verbindung mit der Formel
R&sub1; - XNa
bestehen,
wobei R&sub1; eine lineare oder verzweigte Alkylkette mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen repräsentiert, und
X eine Gruppe repräsentiert, die unter den Gruppen Sulfat, Sulfonat und Carboxylat gewählt wird.
Bei dem Verfahren der Erfindung kann als anionisches Detergens ebenfalls ein Aminosäurederivat verwendet werden, dessen Amingruppe einen N- Alkyl- oder N-Alkoyl-Substituenten mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen trägt.
Das Trägermedium für die Elektrophorese kann eine Zelluloseacetat- Membran, ein Polyacrylamid-Gel oder ein Agarose-Gel sein.
In diesem letzteren Fall können die Detergenzien entweder vor dem Gießen der Gele zu der gepufferten Agaroselösung hinzugegeben werden, oder vermischt mit einem Äquilibrationspuffer zu dem bereits gegossenen Gel hinzugegeben werden.
Das nicht-ionische Detergens wird in der Gruppe gewählt, die die Derivate vom Typ Triton (Alkylphenylpolyäthylenglykol), Brij (Polyoxyäthylenäther) und Tween (Polyoxyäthylensorbitan), sowie Lubrol, Äthylphenylpolyoxyäthylenglykol und das N-Oxid von Dimethyl-N-N-dodecylamin aufweist.
Das Verfahren der Erfindung kann außerdem einen Schritt zur Quantifizierung der durch dieses Verfahren getrennten und identifizierten Isoenzyme und Isoforme der alkalischen Phosphatase aufweisen. Diese Quantifizierung kann nach Inkubation des Gels während 15 Minuten in einer Lösung, die 5-Brom- 4-chlor-3-indolylphosphat und Tetrazolnitritblau enthält, durch densitometrische Analyse bei ungefähr 600 nm erfolgen.
Die Erfindung hat außerdem Ausrüstungen für die Elektrophorese der Isoenzyme der alkalischen Phosphatase zum Gegenstand, mit einem Agarose-Gel und einem Detergens, das aus mindestens einem nicht-ionischen Detergens und mindestens einem anionischen Detergens besteht. Zur Herstellung des Agarose- Gels dieser Ausrüstungen werden vorzugsweise die in einem Puffer gelösten Detergenzien vor der Verfestigung des Agarose enthaltenden Gels zugegeben.
Die Detergenzien werden unter den obenerwähnten Detergenzien gewählt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Agarose-Gel, das diese Detergenzien enthält.
In vorteilhafter Weise wird zur Herstellung der Ausrüstungen der Erfindung vor der Verfestigung der Agarose außer den Detergenzien Chlorhexidin zugegeben. Diese Substanz ist ein gutes Konservierungsmittel; ein Gegenstand der Erfindung ist ihre Verwendung zu diesem Zweck bei Labor- Reagenzien.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der Ausrüstungen der Erfindung zur Identifizierung und Quantifizierung der Isoenzyme und Isoforme bei Proben von physiologischer Flüssigkeit und bei Gewebeextrakten.

Ausführungsbeispiele der Erfindung

Die Erfindung wird durch die nachstehend wiedergegebenen Beispiele zur Herstellung von elektrophoretischen Gelen (Beispiele 1 bis 4), und durch ein Beispiel zur Verwirklichung des Verfahrens (Beispiel 5) veranschaulicht.

Beispiele 1 bis 4 (Herstellung der Gele)

Eine Standard-Agaroselösung wird auf die folgende Weise hergestellt: Zu 1 l destilliertem Wasser werden nacheinander zugegeben: 0,38 Mol Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 0,062 Mol Borsäure, ungefähr 0,02 Mol Natriumhydroxid, um einen pH von 9,45 zu erhalten. Nach vollständiger Auflösung werden 10 g Agarose, sowie bekannte Zusatzstoffe, die ermöglichen, die gewünschten Gel-Eigenschaften (Textur, Wasserzurückhaltung,...) zu erhalten, unter starker Bewegung zugegeben. Das Gemisch wird auf 95ºC erwärmt. Nach vollständiger Auflösung wird es auf 55ºC abgekühlt.

Beispiel 1

Zu der Standardlösung werden 1 g Äthylphenylpolyoxyäthylenglykol, das 10 Äthylenreste enthält, und 0,75 g Natrium-N-lauroylsarcosinat, sowie 200 mg Chlorhexidin zugegeben. Nach vollständiger Auflösung wird die Bewegung angehalten, und dann wird das Gießen der Agarose-Gele (200 bis 250 Gele von 10 x 7,5 cm) auf einem geeigneten Träger vorgenommen.

Beispiel 2

Zu der Standardlösung werden 1 g Äthylphenylpolyoxyäthylenglykol, das 10 Äthylenreste enthält, und 0,9 g Natrium-N-lauroyl-N-methyltaurinat, sowie 200 mg Chlorhexidin zugegeben. Nach vollständiger Auflösung wird die Bewegung angehalten, und dann wird das Gießen der Agarose-Gele (200 bis 250 Gele von 10 x 7,5 cm) auf einem geeigneten Träger vorgenommen.

Beispiel 3

Zu der Standardlösung werden 1 g Polyoxyäthylenlauryläther, Polyäthylenglykol 9-10, (mittleres MG 582), das 10 Äthylenreste enthält), und 0,75 g Natrium-N-lauroylsarcosinat, sowie 200 mg Chlorhexidin zugegeben. Nach vollständiger Auflösung wird die Bewegung angehalten, und dann wird das Gießen der Agarose-Gele (200 bis 250 Gele von 10 x 7,5 cm) auf einem geeigneten Träger vorgenommen.

Beispiel 4

Zu der Standardlösung werden 1 g N-Oxid von Dimethyl-N-N-dodecylamin, das 10 Äthylenreste enthält, und 0,75 g Natrium-N-lauroylsarcosinat, sowie 200 mg Chlorhexidin zugegeben. Nach vollständiger Auflösung wird die Bewegung angehalten, und dann wird das Gießen der Agarose-Gele (200 bis 250 Gele von 10 x 7,5 cm) auf einem geeigneten Träger vorgenommen.
Dabei ist anzumerken, daß die Verwendung von Chlorhexidin (das gewöhnlich laufend zur Desinfektion der Hände während chirurgischen Operationen, oder als aktives Desinfektionsmittel bei beispielsweise Munderkrankungen verwendet wird) als Konservierungsmittel bei einem Agarose-Gel besonders vorteilhaft ist: Die erhaltenen Ergebnisse sind ebenso gut wie wenn in herkömmlicher Weise Natriumazid verwendet wird, bei dem Gefahr besteht, daß sich beim Kontakt mit metallischen Objekten, beispielsweise in den Abwasserleitungen, explosive Verbindungen bilden.
Die Anmelderin hat im übrigen zu diesem Zweck Chlorhexidin für Agarose- oder Agar-Gele, die für andere Arten von elektrophoretischen Analysen als diejenigen der Isoenzyme der alkalischen Phosphatase bestimmt sind, mit Erfolg verwendet. Die Verwendung von Chlorhexidin als Schutzmittel, das die Entwicklung von Bakterien, Schimmelpilzen, Hefepilzen und Algen in den verschiedensten Labor-Reagenzien verhindert, hat sich wiederholt als wirksam erwiesen.

Beispiel 5 (Verwirklichung des Verfahrens)

Ein Gel, das gemäß einem der bei den Beispielen 1, 2, 3 und 4 beschriebenen Herstellungsverfahren erhalten wurde, wird auf den Tisch aufgebracht und mit Löschpapier abgelöscht, um den überschüssigen Puffer zu entfernen, und dann werden Proben nach einem bei der Elektrophorese üblichen Verfahren aufgebracht. Das Gel wird dann während 25 Minuten einer Elektrophorese von 150 V (Werte für ein Gel von 10 x 7,5 cm) unterworfen, wobei als Elektrophoresepuffer vorzugsweise ein Puffer verwendet wird, der identisch mit dem Puffer ist, der zur Herstellung der Standard-Agaroselösung verwendet wird. Nach der Elektrophorese wird das Gel während 15 Minuten bei 45ºC inkubiert, und zwar mit einer Lösung aus 10 ml eines 2-Amino-2-methylpropanol-Puffers mit pH 10,6, die 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat und Tetrazolnitritblau als Substrat enthält. Das Gel wird danach mit destilliertem Wasser und/oder einer 5%igen Essigsäurelösung gespült, und dann getrocknet. Nach dem Spülen kann das Gel ebenfalls mit Löschpapier abgelöscht werden, einmal oder mehrmals komprimiert werden, und dann getrocknet werden.
Dabei ist übrigens anzumerken, daß das Tetrazolnitritblau infolge der Umwandlung des Substrats in eine violette Verbindung die erhaltene Färbung verstärkt. Eine Viertelstunde Inkubation in dem Puffer ist völlig ausreichend, um ein ausgezeichnetes Ergebnis zu erhalten.
Die Gele weisen nach der Elektrophorese eine Reihe von Streifen mit violetter Färbung auf, die den verschiedenen, in den Proben enthaltenen Isoformen oder Isoenzymen entsprechen, und in den meisten Fällen mit bloßem Auge identifiziert werden können.
Experimentelle Ergebnisse, die bei einer großen Anzahl von Proben verschiedener Herkunft erhalten wurden, haben ermöglicht, auf zuverlässige Weise, und ohne Zuhilfenahme einer zusätzlichen Analyse die folgenden Isoenzyme und Isoforme zu identifizieren: Isoenzyme, die an Lipoproteine gebunden sind, ein Isoenzym, das an das LPX gebunden ist, eine X-Fraktion, die bei der infantilen transitorischen Hyperphosphatasämie vorhanden ist, die makromolekulare Fraktion, die Fetaldarm-Fraktion, tetramerisierte Fraktionen (wie die zweite Knochenfraktion, die zweite und die dritte Plazentafraktion, die Varianten-Darmfraktion), die Leberfraktion, die Knochenfraktion, die Erwachsenen-Darmfraktion, und die Leber-, Knochen-, Darm- und Plazentafraktion, wobei jede dieser Fraktionen eine an ein Immunoglobulin gebundene Form hat.
Die densitometrische Analyse bei ungefähr 600 nm ermöglicht, die Mengen der verschiedenen, in einer bestimmten Probe enthaltenen Fraktionen genau zu bestimmen. Wenn solche Analysen bei demselben Patienten über einen gewissen Zeitraum gemacht werden, kann der Verlauf einer Krankheit verfolgt werden, oder eine genaue Diagnose gemacht werden.
Obwohl die obigen Beispiele besonders vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung veranschaulichen, begrenzen sie den Geltungsbereich der Erfindung in keiner Weise.
Bei Elektropliorese-Techniken, bei denen der Träger beispielsweise aus Zelluloseacetat besteht, kann ebenfalls ein Gemisch aus einem nicht-ionischen Detergens und einem anionischen Detergens verwendet werden.
Falls beispielsweise ein Beckman Paragon SPE-Gel verfügbar ist, das keinen solchen Puffer mit zwei Detergenzien enthält, wie oben beschrieben wurde, wird der Rahmen der Erfindung nicht verlassen, wenn man ein solches herkömmliches Gel in einem solchen Puffer inkubieren läßt: Die erhaltenen Ergebnisse sind völlig gleich; eine solche Verfahrensweise stellt eine Alternative dar, bei der der Rahmen der Erfindung nicht verlassen wird.

Claims

1. Elektrophoretisches Verfahren, um die Isoenzyme und die Isoforme der alkalischen Phosphatase in einer Probe einer physiologischen Flüssigkeit oder eines Gewebeextrakts abzutrennen und zu identifizieren, bei dem ein Puffer und mindestens ein nicht-ionisches Detergens auf ein Trägermedium aufgebracht wird, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich zu dem nicht-ionischen Detergens mindestens ein anionisches Detergens aufgebracht wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Detergenzien in dem Puffer in Lösung sind.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß jedes Detergens in dem Puffer in einer Menge von 0,1 bis 10 gil Puffer enthalten ist.

4. Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis zwischen dem nicht-ionischen Detergens und dem anionischen Detergens 2:1 ist.

5. Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der pH des Puffers zwischen 8 und 11 liegt.

6. Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Puffer Tris(hydroxymethyl)aminomethan ist, das Borsäure enthält.

7. Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das anionische Detergens unter den Gallensäuren und den Gallensalzen gewählt wird.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Detergens ein Gallensalz, vorzugsweise Natriumdesoxycholat oder Natriumtaurocholat ist.

9. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das anionische Detergens aus einer Verbindung mit der Formel

R&sub1; X Na

besteht,

wo R&sub1; eine lineare oder verzweigte Alkylkette mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen repräsentiert,

und X eine Gruppe repräsentiert, die unter den Gruppen Sulfat, Sulfonat und Carboxylat ausgewählt wird.

10. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das anionische Detergens ein Aminosäurederivat ist, dessen Amingruppe einen N-Alkyl- oder N-Alkoyl-Substituenten mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen trägt.

11. Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet&sub1; daß das Trägermedium eine zelluloseacetat-Membran ist.

12. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermedium ein Polyacrylamid-Gel ist.

13. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermedium ein Agarose-Gel ist.

14. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Detergenzien vor dem Gießen der Gele zu einer gepufferten Agaroselösung hinzugegeben werden.

15. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Detergenzien in einem Äquilibrationspuffer zu dem bereits gegossenen Agarose-Gel hinzugegeben werden.

16. Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das nicht-ionische Detergens in der Gruppe gewählt wird, die die Derivate vom Typ Alkylphenylpolyäthylenglykol, Polyoxyäthylenäther, Polyoxyäthylensorbitan, Lubrol, Äthylphenylpolyoxyäthylenglykol und N-Oxid von Dimethyl-N-N-dodecylamin aufweist.

17. Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem einen Schritt zur Quantifizierung der abgetrennten und identifizierten Isoenzyme und Isoforme der alkalischen Phosphatase umfaßt.

18. Verfahren gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Gel nach der Elektrophorese während 15 Minuten mit einem Substrat inkubiert wird, das S-Brom-4-chlor-indolylphosphat und Tetrazolnitritblau enthält, und daß bei ungefähr 600 nm eine densitometrische Analyse der erhaltenen gefärbten Streifen gemacht wird, was eine Quantifizierung ermöglicht.

19. Agarose-Gel für die Elektrophorese der Isoenzyme der alkalischen Phosphatase, dadurch gekennzeichnet, daß es als Detergens mindestens ein nicht-ionisches Detergens und mindestens ein anionisches Detergens enthält.

20. Gel gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das oder die anionischen Detergenzien unter den Detergenzien von irgendeinem der Ansprüche 7 bis 10 gewählt werden, und daß das oder die nicht-ionischen Detergenzien unter den Detergenzien des Anspruchs 16 gewählt werden.

21. Gel gemäß Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem Chlorhexidin aufweist.

22. Verfahren zur Herstellung des Gels gemäß irgendeinem der Ansprüche 19 bis 21 für die Elektrophorese der Isoenzyme der alkalischen Phosphatase, dadurch gekennzeichnet, daß eine Standard-Agaroselösung in einem Puffer angesetzt wird, die Lösung erhitzt wird, und die Lösung abgekühlt wird, und daß vor der Verfestigung mindestens ein nicht-ionisches Detergens und mindestens ein anionisches Detergens hinzugegeben wird.

23. Verfahren gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß vor der Verfestigung außerdem Chlorhexidin hinzugegeben wird.

24. Ausrüstung für die Elektrophorese der Isoenzyme der alkalischen Phosphatase, wobei diese Ausrüstung ein Agarose-Gel gemäß irgendeinem der Ansprüche 19 bis 21 aufweist.

25. Verwendung einer Ausrüstung gemäß Anspruch 24 zur Identifizierung und Quantifizierung der Isoenzyme und Isoforme der alkalischen Phosphatase bei Proben von physiologischer Flüssigkeit und bei Gewebeextrakten.