DE69920015T2

DE69920015T2 - Verfahren zur induktion der herstellung von wachstumsfaktoren

Info

Publication number: DE69920015T2
Application number: DE69920015T
Authority: DE
Inventors: Masayo Hino-shi ITO; Yoshiaki Hino-shi AZUMA; Tomohiro Hino-shi OHTA
Original assignee: Exogen Inc
Current assignee: Exogen Inc
Priority date: 1998-06-23
Filing date: 1999-06-23
Publication date: 2005-09-15
Anticipated expiration: 2019-06-24
Also published as: CA2332935A1; ATE275580T1; WO1999067289A1; DE69920015D1; ES2229729T3; AU4819999A; EP1087995A1; EP1087995B1; JP2000004875A; AU754874B2

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Steigern der Produktion eines Wachstumsfaktors in Kokultursystemen. Genauer gesagt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Produktion eines Wachstumsfaktors, der Thrombozytenwachstumsfaktor (nachfolgend als PDGF bezeichnet) umfasst.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Bezüglich Verfahren zum Steigern der Produktion von Wachstumsfaktoren wurde berichtet, dass PDGF-Produktion induziert wurde, indem dem Nährmedium von menschlichen Keratinozyten von Zang et al., J Dermatol 22, 305-309, (1995) in einem Einzelkultursystem aktives Vitamin D zugegeben wurde. Verfahren zum Steigern von PDGF-Produktion in Kokultursystemen sind zur Zeit nicht bekannt. Und es wird ein effizienteres Verfahren zum Steigern der Produktion von Wachstumsfaktoren benötigt.
Im Hinblick auf Obiges wurde eine Reihe von gewissenhaften Untersuchungen durchgeführt, um ein effizienteres Verfahren zum Steigern der Produktion von Wachstumsfaktoren in Kokultursystemen bereitzustellen.
Als ein Beispiel dieser Untersuchungen beschreiben Wang et al. (Endocrinology, Band 138, Nr. 7, Juli 1997, Seiten 2953-2962) die Auswirkungen von 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ auf eine Kokultur von Osteoblast- (HOB) und Endothelzellen (HUVEC-Zellen); in dem Fall des Kokultivierens von HOB und HUVEC zeigt Wang, dass die aktive Form von Vitamin D, d. h. 1,25-Dihydroxyvitamin D₃, die Stimulation der Genexpression eines Rezeptors für einen vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor auf den Endothelzellen, gefolgt von erhöhter Produktion von Knochenwachstumsfaktoren durchführt.
Das US-Patent 5 656 450 beschreibt ein Verfahren zum Umwandeln eines latenten transformierenden Wachstumsfaktors Beta (TGFβ), der von den Zellen in einer aktiver Form mittels Ultraschall schon produziert wurde.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung stellt Ausführungsformen bereit, die Verfahren zum Steigern der Produktion eines Wachstumsfaktors in einem Kokultursystem beinhaltet, indem (1) einem Kokulturmedium eine aktive Form von Vitamin D zugegeben wird, (2) die Zellen in einem Kokulturmedium Ultraschall ausgesetzt werden und (3) einem Kokulturmedium eine aktive Form von Vitamin D zugegeben wird und die Zellen in dem Kokulturmedium Ultraschall ausgesetzt werden. Die Erfindung wird unten im Detail beschrieben.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
Die Figur zeigt die Mengen an PDGF-AB in dem Kokulturmedium, wobei:

a) Kontrollgruppe
b) Ultraschall ausgesetzte Gruppe
c) mit aktivem Vitamin D behandelte Gruppe
d) Ultraschall ausgesetzte + mit aktivem Vitamin D behandelte Gruppe.

Der Asterisk (*) und der doppelte Asterisk (**) bezeichnen einen P-Wert von < 0,05 bzw. < 0,01 im Vergleich mit der Kontrollgruppe gemäß den Ergebnissen des Dunnett-Tests für multiple Vergleiche.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung kann auf Wachstumsfaktoren, wie etwa einen basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), einen transformierenden Wachstumsfaktor-β (TGF-β) und PDGF angewendet werden. Von diesen wird PDGF bevorzugt.
Es ist nahegelegt worden, dass diese Wachstumsfaktoren wichtige Rollen bei dem Reparaturprozess von Gewebe, z. B. bei der Fraktur-Reparatur [Joyce et al. Prog. Clin. Biol. Res. 365, 391-416, (1991)], spielen. Es hat sich herausgestellt, dass einer von ihnen, PDGF, an sehr wichtigen, wesentlichen Phänomenen bei der Körperentwicklung, Zelldifferenzierung, Zellvermehrung usw. beteiligt ist. Zusätzlich dazu weist PDGF eine Wachstum stimulierende Aktivität in Bezug auf fast alle mesodermal abgeleiteten Zellen auf. Aufgrund der Tatsache, dass PDGF solche Aktivitäten aufweist, wurde von ihm erwartet, dass er als therapeutisches Mittel, wie etwa ein Mittel zur Förderung von Gefäßneubildung oder ein Mittel zur Wundheilung, verwendet wird. Es hat sich in der Tat herausgestellt, dass er eine wichtige Rolle bei dem Wundheilungsprozess spielt [H. Hosgood, Vet Surg 22, 490-495 (1993), Vereinigte Staaten Patentnr. 5,457,093]. Zusätzlich dazu kann die Fraktur-Reparatur durch lokale Einspritzen von ihm beschleunigt werden, und er kann als ein therapeutisches Mittel für eine Fraktur verwendet werden.
Erfindungsgemäße Kokultursysteme sind die Kultur von zwei oder mehreren Wachstumsfaktoren produzierenden Zellarten, in dem gleichen Medium. Von diesen wird die Kombination aus Osteoblasten und Endothelzellen bevorzugt. Mit den hier beschriebenen Osteoblasten sind menschliche Osteosarkomzellen (SaOS-2), HOS, M063 usw. gemeint. Diese Zellen können von der American Type Culture Collection (Amerikanische Kultursammlung) erhalten und wie unten beschrieben durch Kultivieren und durch Subkultivieren experimentell verwendet werden.
Unter Endothelzellen, wie hier beschrieben, versteht man Endothelzellen der menschlichen Nabelvene (RUVEC), mikrovaskuläre Endothelzellen, Lungenendothelzellen usw. Diese Zellen können von Sanko Junyaku Co. Ltd., Takara Co. Ltd. und Iwaki Glass Co. Ltd. aus Japan usw. erhalten werden. Diese Zellen können durch Kultivieren und Subkultivieren in einem Medium für Endothelzellen verwendet werden. Das Kokultursystem von Osteoblasten und Endothelzellen wird gebildet, indem wie unten beschrieben Osteoblasten in dem Nährmedium kultiviert werden und Endothelzellen am folgenden Tag auf die Osteoblasten zugegeben werden, was zu einem Kokultursystem führt.
Unter den in der Erfindung für das Kokultursystem verwendeten Nährmedien versteht man McCoy's modifiziertes 5A-Medium, das 5-15 % fötales Kälberserum enthaltende a-MEM usw. Von diesen wird das 10 % fötales Kälberserum enthaltende, modifizierte McCoy's 5A-Medium bevorzugt.
Unter der aktiven Form von Vitamin D, die in der Erfindung verwendet wurde, versteht man eine Form von Vitamin D, die physiologische Aktivitäten, wie etwa Aktivitäten zur Regulierung des Calcium- und Knochenstoffwechsels aufweist, im Unterschied zu Formen von Vitamin D, die keine physiologische Aktivität aufweisen, und sie umfasst aktive Formen von Vitamin D₂, aktive Formen von Vitamin D₃ und deren Derivate. Eigentliche Beispiele umfassen 1-Hydroxyvitamin D, 1,24-Dihydroxyvitamin D, 1,25-Dihydroxyvitamin D, 1,24,25-Trihydroxyvitamin D, 24,24-Difluor-1,25-Dihydroxyvitamin D und 26,26,26,27,27,27-Hexafluor-1,25-dihydroxyvitamin D. Von diesen werden 1-Hydroxyvitamin D₃, 1,24(R)-Dihydroxyvitamin D₃ und 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ bevorzugt. Konzentrationen, die dem Nährmedium zugegeben werden können, betragen 1×10^-10 M bis 1×10^-7 M, und der Konzentrationsbereich von 1×10^-5 M bis 3×10^-8 M wird bevorzugt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist Ultraschall mit niedriger Intensität derjenige, der nicht mit thermischen Ereignissen in Verbindung steht. Ultraschall mit niedriger Intensität besteht aus einer Frequenz von 1,3 bis 2 MHz, einem Wiederholungszyklus von 100 bis 1000 Hz, einer Signallänge von 10 bis 2000 μs und einer Intensitat von bis zu 100 mW/cm². Es wird weiterhin in Erwägung gezogen, dass andere Ultraschallenergie entweder mit thermischer Wirkung oder ohne diese verwendet werden kann.
Es wird bevorzugt, dass die Unterfläche der Löcher, die die Kokultur enthalten, unter Verwendung einer Ultraschallausgabe von Exogen Co. 20 Minuten lang pro Tag an 4 aufeinander folgenden Tagen Ultraschall ausgesetzt wird.
Die Charakteristiken der unten angewendeten Ultraschallausgabe waren ein Impulssignal von 200 μs, eine Frequenz von 1,5 MHz, ein Wiederholungszyklus von 1 kHz, und die Intensität betrug 30 mW/cm².
Die Ultraschallmaschine, die in diesen Versuchen verwendet wurde, ist in dem Vereinigten Staaten Patent (Nr. 4,530,360) als eine grundlegende, nichtinvasive Behandlungstechnik und Vorrichtung zur transkutanen Anwendung von Ultraschallimpulsen von außerhalb des Körpers des Patienten auf den betroffenen Ort beschrieben.
Ultraschall mit niedriger Intensität besteht aus einer Frequenz von 1,3 bis 2 MHz, einem Wiederholungszyklus von 100 bis 1000 Hz, einer Signallänge von 10 bis 2000 μs und einer Intensität von bis zu 100 mW/cm². Die bevorzugte Dauer des Ultraschall-Aussetzens beträgt bis zu 20 Minuten.
Im U.S. Patent Nr. 5,520,612 an Winder et al. werden auch bevorzugte Ultraschallbehandlungssysteme offenbart. In diesen Systemen wird Ultraschall mit niedriger Intensität in einem Frequenzbereich von 20 kHz bis 10 MHz angewendet. Der Wiederholungszyklus liegt im Bereich von 5 bis 10 kHz. Der Auslastungsgrad beträgt von ungefähr 5 bis 90 % und die Intensität beträgt bis zu 100 mW/cm².
In einem anderen Vereinigten Staaten Patent (USP 5,003,965) haben Talish et al. ein Ultraschallbehandlungssystem beschrieben, das aus einer Körper-Applikatoreinheit, die mit einer Fernbedienungseinheit mittels eines abgedeckten Glasfaserkabels verbunden ist, besteht, und in diesem System besteht Ultraschall mit niedriger Intensität aus einer Frequenz von 1,3 bis 2 MHz und einer Intensität von bis zu 1 bis 50 mW/cm².
Das Verfahren zum Steigern der Produktion von Wachstumsfaktoren in dem Kokultursystem in dieser Erfindung schließt die Kombination aus dem Zugeben eines aktiven Vitamins D zu einem Kokulturmedium, das Wachstumsfaktor produzierende Zellen enthält, und vorzugsweise auch das Ultraschall-Aussetzen von Zellen ein.
BEISPIELE
Die folgenden spezifischen Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden Erfindung.
Beispiele 1 bis 3 und Vergleichsbeispiel
Ein 2-mL Volumen von menschlichen osteoblastischen Zellen (SaOS-2) wurde bei einer Dichte von 2×10⁵ Zellen/Loch in eine Platte mit 6 Löchern, die mit menschlichem Kollagen I beschichtet war, angeimpft. SaOS-2 ist eine osteoblastische Zelllinie, die 1975 von einem Osteosarkom einer Frau von kaukasischer Abstammung gebildet wurde, und sie wurde von der American Type Culture Collection (Amerikanische Kultursammlung) erhalten. Das McCoy's 5A-Medium, zu dem 10 % fötales Kälberserum (FCS) zugegeben worden war (10 % FCS-McCoy's 5A), wurde als Nährmedium verwendet. Am nächsten Tag wurde jedem Loch bei einer Dichte von 3×10⁵ Zellen/Loch 0,5 ml Endothelzellen der menschlichen Nabelvene (HUVECs) zugegeben. Die HUVECs wurden von Sanko Junyaku Co. Ltd erhalten.
Jede Gruppe ist wie unten gezeigt.

Beispiel 1: Die Unterfläche der Löcher wurde 20 min lang pro Tag an 4 aufeinander folgenden Tagen Ultraschall ausgesetzt.
Beispiel 2: 10^-8 M 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ wurde dem Nährmedium zugegeben.
Beispiel 3: 10^-8 M 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ wurde dem Nährmedium zugegeben, und die Unterfläche der Löcher wurde 20 min lang pro Tag an 4 aufeinander folgenden Tagen Ultraschall ausgesetzt.

In dem Vergleichsbeispiel und Beispiel 1 wurde das Nährmedium hinsichtlich der Behandlung mit aktivem Vitamin D durch 10 % FCS-McCoy's 5A, das 0,01 % Ethanol (das Vehikel für 1,25-Dihydroxyvitamin D3) enthielt, ersetzt. Das Medium wurde 2 Tage später gewechselt.
In Beispiel 2 und Beispiel 3 wurde das Nährmedium durch 10 % FCS-McCoy's 5A, das 1×10^-8 M 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ enthielt, ersetzt. Das Medium wurde 2 Tage später gewechselt.
Hinsichtlich des Ultraschallaussetzens erfolgte in dem Vergleichsbeispiel und Beispiel 2 kein Ultraschallaussetzen. In Beispiel 1 und Beispiel 3, das Aussetzen gegenüber Ultraschall mit niedriger Intensität mit einer Ultraschallausgabeeinheit von Exogen Co. 20 Minuten lang pro Tag an 4 aufeinanderfolgenden Tagen. Die Charakteristiken der Ultraschallausgabe waren ein Impulslänge von 200 μs, eine Frequenz von 1,5 MHz, ein Wiederholungszyklus von 1 kHz, und die Intensität betrug 30 mW/cm².
Am folgenden Tag wurde das Nährmedium gesammelt, und die Konzentration von PDGF-AB in dem Nährmedium wurde mit einem ELISA-Kit von Amersham Co, der spezifisch PDGF-AB misst, gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
Wie in 1 klar ersichtlich, war die Menge an produziertem PDGF-AB in Beispiel 1, 2 und 3 im Vergleich zu dem Vergleichsbeispiel signifikant erhöht. Darüber hinaus wurde in den Beispielgruppen eine größere Erhöhung des PDGF-AB in Beispiel 3 beobachtet.

Claims

Ein Verfahren zum Steigern der Produktion eines Thrombozytenwachstumsfaktors, das den Schritt des Kokultivierens von einen Thrombozytenwachstumsfaktor produzierenden Zellen in Anwesenheit von aktivem Vitamin D beinhaltet.
Verfahren zum Steigern der Produktion eines Thrombozytenwachstumsfaktors, das den Schritt des Kokultivierens von einen Thrombozytenwachstumsfaktor produzierenden Zellen, während die Zellen Ultraschall ausgesetzt werden, beinhaltet.
Verfahren zum Steigern der Produktion eines Thrombozytenwachstumsfaktors gemäß Anspruch 1, das den Schritt beinhaltet, die Zellen Ultraschall auszusetzen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, Anspruch 2 oder Anspruch 3, wobei Osteoblasten und vaskuläre Endothelzellen kokultiviert werden.