ES2229729T3 - Un metodo para inducir la produccion de factores de crecimiento. - Google Patents
Un metodo para inducir la produccion de factores de crecimiento.Info
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Abstract
Un procedimiento para potenciar la producción de un factor de crecimiento derivado de las plaquetas que comprende la etapa de: cocultivar células productoras de un factor de crecimiento derivado de las plaquetas en presencia de vitamina D activa.
Description
Un método para inducir la producción de factores
de crecimiento.
Esta invención se refiere a un procedimiento para
potenciar la producción del factor de crecimiento en sistemas de
cocultivo. Más específicamente, la invención se refiere a un
procedimiento para producir el factor de crecimiento, incluyendo el
factor de crecimiento derivado de las plaquetas (denominado en lo
sucesivo PDGF).
En lo que concierne a los procedimientos para
potenciar la producción del factores de crecimiento, Zang y col.,
J Dermatol 22, 305-309 (1995) describieron
que la producción de PDGF se indujo añadiendo vitamina D activa al
medio de cultivo de queratinocitos humanos en un sistema de cultivo
único. En la actualidad no se conocen procedimientos para potenciar
la producción de PDGF en sistemas de cocultivo. Y se necesita un
método más eficaz para potenciar la producción del factores de
crecimiento.
A la vista de lo anterior, se realizaron una
serie de diligentes estudios para proporcionar un método más eficaz
de potenciar la producción del factores de crecimiento en sistemas
de cocultivo.
Como ejemplo de esos estudios, Wang y col.
(Endocrinology, vol.138, n° 7, Julio 1997, páginas
2953-2962) describen los efectos de la
1,25-dihidroxivitamina D_{3} sobre un cocultivo
de osteoblastos (HOB) y células endoteliales (HUVEC); en el caso
del cocultivo de HOB y HUVEC Wang demuestra que la forma activa de
la vitamina D, es decir, la 1,25-dihidroxivitamina
D_{3} efectúa la estimulación de la expresión de un gen del
receptor del factor de crecimiento del endotelio vascular sobre las
células endoteliales seguida de un aumento de la producción del
factores de crecimiento osteotropos.
La patente de EE.UU. 5.658.450 describe un
procedimiento para convertir el factor transformador de crecimiento
beta latente (TGF-\beta), ya producido por las
células, en una forma activa por medio de ultrasonidos.
Esta invención proporciona realizaciones que
comprenden métodos para potenciar la producción del factor de
crecimiento en un sistema de cocultivo (1) añadiendo una forma
activa de vitamina D al medio de cocultivo, (2) exponiendo a
ultrasonidos las células en un medio de cocultivo y (3) añadiendo la
forma activa de vitamina D a un medio de cocultivo y exponiendo las
células del medio de cocultivo ultrasonidos. A continuación se
describe en detalle la invención.
La figura muestra las cantidades de
PDGF-AB en el medio de cocultivo en donde
a) Grupo de control
b) Grupo expuesto a ultrasonidos
c) Grupo de tratamiento con vitamina D activa
d) Grupo de exposición a ultrasonidos más
tratamiento con vitamina D activa
El asterisco (*) y el doble asterisco (**)
indican un valor de P <0,05 y <0,01 respectivamente, en
comparación con el grupo control de acuerdo con los resultados del
test de comparación múltiple de Dunnett.
Esta invención es aplicable a factores de
crecimiento como el factor básico de crecimiento fibroblástico
(bFGF), el factor transformador de crecimiento \beta
(TGF-\beta) y PDGF. De ellos se prefiere el
PDGF.
Se ha sugerido que estos factores de crecimiento
desempeñan papeles importantes en el proceso de reparación tisular,
por ejemplo, en la reparación de las fracturas [Joyce y col.,
Prog. Clin. Biol. Res. 365, 391-416, (1991)].
Se ha encontrado que uno de ellos, el PDGF, participa en fenómenos
vitales extremadamente importantes en el desarrollo corporal, la
diferenciación celular, la proliferación celular, etcétera. Además,
el PDGF posee una actividad estimulante del crecimiento que afecta
prácticamente a todas las células de estirpe mesodérmica. Debido a
que el PDGF posee este tipo de actividades, se ha esperado usarlo
como agente terapéutico, como agente promotor de la
neovascularización o para la cicatrización de heridas. De hecho, se
encontró que desempeña un papel importante en el proceso de
cicatrización de heridas [H. Hosgood, Vet Surg 22,
490-495 (1993), patente EE.UU. número 5.457.093].
Además la reparación de las fracturas se puede acelerar por
inyección local de este factor, y se puede usar como agente
terapéutico para las fracturas.
Los sistemas de cocultivo de la invención son el
cultivo en el mismo medio de dos o más clases de células que
producen factores de crecimiento. De ellas se prefiere la
combinación de osteoblastos y células endoteliales. Los osteoblastos
tal y como se describen en la presente memoria descriptiva se
refieren a células de osteosarcoma humanas
(SaOS-2), HOS, M063, etcétera. Estas células pueden
obtenerse de la American Type Culture Collection, y se usan
experimentalmente en cultivo y subcultivo, tal y como se describe a
continuación.
Células endoteliales, tal y como se describen en
el presente documento, significan células endoteliales de vena
umbilical humana (HUVEC), células endoteliales microvasculares,
células endoteliales pulmonares, etcétera. Estas células se pueden
obtener de Sanko Junyaku Co. Ltd., Takara Co. Ltd., e Iwaki Glass
Col. Ltd., de Japón, etcétera. Estas células se pueden usar en
cultivo y subcultivo en un medio para células endoteliales. El
sistema de cocultivo para osteoblastos y células endoteliales se
establece cultivando osteoblastos en medio de cultivo como se
describe más adelante, y añadiendo al día siguiente células
endoteliales a los osteoblastos, lo que da como resultado un sistema
de cocultivo.
Los medios de cultivo usados en la invención para
el sistema de cocultivo significan el medio modificado de McCoy 5A,
un MEM que contiene del 5 al 15% de suero bovino fetal, etcétera.
Entre ellos, se prefiere el medio modificado de McCoy 5A con un 10%
de suero bovino fetal.
La forma activa de vitamina D usada en la
invención se refiere a una forma de vitamina D que posee
actividades fisiológicas, como acciones de regulación del
metabolismo del calcio y del hueso, y que se diferencia de formas de
vitamina D que no poseen actividad fisiológica, e incluye formas
activas de vitamina D_{2}, formas activas de vitamina D_{3}, y
sus derivados. Ejemplos reales comprenden
1-hidroxivitamina D,
1,24-dihidroxivitamina D,
1,25-dihidroxivitamina D,
1,24,25-trihidroxivitamina D,
24,24-difluoro-1,25-dihidroxivitamina
D, y
26,26,26,27,27,27-hexafluoro-1,25-dihidroxivitamina
D. Entre ellas se prefieren la 1-hidroxivitamina
D_{3} y la 1,25-dihidroxivitamina D_{3}. Las
concentraciones que se pueden añadir al medio de cultivo son
1x10^{-10}M a 1x10^{-7}M, y es preferible el intervalo de
concentraciones de 1x10^{-5}M a 3x10^{-8}M.
En una realización preferida el ultrasonido de
baja intensidad es aquel que no se asocia a eventos térmicos. El
ultrasonido de baja intensidad consiste en una frecuencia de 1,3 a
2 MHz, un ciclo de repetición de 100 a 1000 Hz, una anchura de tren
de pulsos de 10 a 2000 \mus, y una intensidad de hasta 100
mW/cm^{2}. Se contempla además poder usar otra energía ultrasónica
con o sin efecto térmico.
Es preferible exponer la superficie inferior de
los pocillos que contienen el cocultivo a ultrasonidos usando una
fuente de ultrasonidos Exogen Co. durante 20 minutos al día a lo
largo de 4 días consecutivos.
Las características de la producción de
ultrasonido usada a continuación fueron una tren de pulsos de 200
\mus, una frecuencia de 1,5 MHz, un ciclo de repetición de 1 KHz,
y la intensidad fue de 30mW/cm^{2}.
La máquina de ultrasonidos usada en estos
experimentos se describe en la patente de EE.UU. (número 4.530.360)
como una técnica y dispositivo terapéutico básicos incruentos para
aplicar pulsos ultrasónicos por vía transcutánea desde el exterior
del cuerpo del paciente en las proximidades del lugar afectado. El
ultrasonido de baja intensidad consiste en una frecuencia de 1,3 a 2
MHz, un ciclo de repetición de 100 a 1000 Hz, y una anchura de tren
de pulsos de 10 a 2000 \mus, y una intensidad de hasta
100mW/cm^{2}. La duración preferida de exposición a ultrasonidos
es de hasta 20 minutos.
En la patente EE.UU. número 5.520.612 de Winder y
col. también se desvelan los sistemas de tratamiento ultrasónico
preferidos. En esos sistemas se usan ultrasonidos de baja
intensidad a una frecuencia de 20 kHz a 10 MHz. El ciclo de
repetición abarca un intervalo de 5 a 10 kHz. El ciclo de trabajo es
de aproximadamente 5 a 90% y la intensidad de hasta
100mW/cm^{2}.
En otra patente EE.UU. (Patente EE.UU. 5.003.965)
Talish y col. han descrito un sistema de tratamiento ultrasónico
que consiste en una unidad aplicadora corporal conectada a una
unidad de control remoto por un cable de fibra óptica revestido; el
ultrasonido de baja intensidad de este sistema consiste en una
frecuencia de 1,3 a 2 MHz y una intensidad de hasta 1 a 50
mW/cm^{2}.
El procedimiento para potenciar la producción del
factores de crecimiento en el sistema de cocultivo de esta
invención implica la combinación de añadir vitamina D activa a un
medio de cocultivo que contiene células que producen factor de
crecimiento, y también es preferible exponer las células a
ultrasonidos.
Para ilustrar la presente invención se
proporcionan los siguientes ejemplos específicos.
Ejemplos 1 a
3
Ejemplo
comparativo
Se sembró un volumen 2 mL de células
osteoblásticas humanas (SaOS-2) a una densidad de
2x10^{5} células/pocillo en una placa de 6 pocillos revestida de
colágeno humano tipo 1. La SaOS-2 es una línea
celular osteoblástica establecida en 1975 a partir de un
osteosarcoma de una mujer de raza caucásica, y se obtuvo de la
American Type Culture Collection. Como medio de cultivo de uso
medio de McCoy 5A al que se había añadido un 10% de suero bovino
fetal (SBF) (McCoy5A - SBF 10%). Al día siguiente, se añadieron a
cada pocillo 0,5 mL de células endoteliales de vena umbilical
humana (HUVEC) a una densidad de 3x10^{5} células/pocillo. Las
HUVEC se obtuvieron de Sanko Junyaku Co. Ltd.
Cada grupo se muestra a continuación.
La superficie inferior de los pocillos fue
expuesta a ultrasonidos durante 20 minutos diarios a lo largo de
cuatro días consecutivos.
Se añadieron al medio de cultivo 10^{-8}M de
1,25-dihidroxivitamina D_{3}.
Se añadieron al medio de cultivo 10^{-8}M de
1,25-dihidroxivitamina D_{3} y la superficie
inferior de los pocillos fue expuesta a ultrasonidos durante 20
minutos diarios a lo largo de cuatro días consecutivos.
En el ejemplo comparativo y en el ejemplo 1
referentes al tratamiento con vitamina D activa, el medio de
cultivo fue sustituido por McCoy's 5A -SBF10% que contenía 0,01% de
etanol (vehículo de la 1,25-dihidroxivitamina
D_{3}]. El medio se cambió 2 días más tarde.
En el Ejemplo 2 y el Ejemplo 3 el medio de
cultivo fue sustituido por McCoy 5A - SBF 10% que contenía
1x10^{-8}M de 1,25-dihidroxivitamina D_{3}. El
medio se cambió 2 días más tarde.
En lo que respecta a la exposición a
ultrasonidos, en el Ejemplo comparativo y el Ejemplo 2 no hubo
exposición a ultrasonidos. En el Ejemplo 1 y el Ejemplo 3, la
exposición a ultrasonidos de baja intensidad se hizo con una unidad
de ultrasonidos Exogen Co, durante 20 minutos diarios a lo largo de
cuatro días consecutivos. Las características de los ultrasonidos
fueron una anchura de pulso de 200 \mus, una frecuencia de 1,5
MHz a 1 kHz de ciclo de repetición, y una intensidad de 30 mW /
cm^{2}.
El medio de cultivo se recuperó al día siguiente,
y se midió la concentración de PDGF-AB en el medio
de cultivo con un kit de ELISA de Amersham Co. que determina
específicamente PDGF-AB. Los resultados obtenidos se
muestran en la figura 1.
Como se muestra claramente en la figura 1, la
cantidad de PDGF-AB producida estaba incrementada
significativamente en los Ejemplos 1, 2 y 3 en comparación con el
Ejemplo comparativo. Además, de los tres grupos de ejemplos, se
observó un mayor incremento de PDGF-AB en el
Ejemplo 3.
Claims (4)
1. Un procedimiento para potenciar la producción
de un factor de crecimiento derivado de las plaquetas que comprende
la etapa de: cocultivar células productoras de un factor de
crecimiento derivado de las plaquetas en presencia de vitamina D
activa.
2. Un procedimiento para potenciar la producción
de un factor de crecimiento derivado de las plaquetas que comprende
la etapa de cocultivar células productoras de un factor de
crecimiento derivado de las plaquetas a la vez que se exponen las
células a ultrasonidos.
3. Un procedimiento para potenciar la producción
de un factor de crecimiento derivado de las plaquetas según la
reivindicación 1, que comprende la etapa de exponer las células a
ultrasonidos.
4. Un procedimiento para la reivindicación 1, la
reivindicación 2 o la reivindicación 3 donde el cocultivo es de
osteoblastos y células endoteliales vasculares.
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