DE69418865T2

DE69418865T2 - Osteoblastswachstumfordernde zusammensetzungen die pdgf und vitamin-d enthalten

Info

Publication number: DE69418865T2
Application number: DE69418865T
Authority: DE
Inventors: Emma Moore
Original assignee: Zymogenetics Inc
Current assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 1993-03-29
Filing date: 1994-03-29
Publication date: 2000-02-17
Anticipated expiration: 2014-03-30
Also published as: ES2132399T3; DE69418865D1; US5533836A; JPH08508499A; EP0691849A1; CA2159449C; GR3030402T3; JP3699111B2; DK0691849T3; AU681879B2; CN1121693A; KR960701648A; EP0691849B1; CN1104257C; ATE180674T1; WO1994022463A1; CA2159449A1; AU6417194A; RU2140282C1

Description

Hintergrund der Erfindung

Der Knochenumbau ist ein dynamischer Prozeß, über den die Gewebemasse und die Struktur des Skeletts aufrechterhalten werden. Bei diesem Prozeß geht es um das Gleichgewicht zwischen der Knochenresorption und der Knochenbildung, wobei man annimmt, daß zwei Zelltypen dabei die Hauptrolle spielen. Diese Zellen sind die Osteoklasten und die Osteoblasten synthetisieren und lagern neuen Knochen in Hohlräumen ab, die von den Osteoklasten ausgehölt werden. Die Aktivitäten von Osteoblasten und Osteoklasten werden durch viele systemische und lokale Faktoren einschließlich der Wachstumsfaktoren gesteuert.
Einer der Wachstumsfaktoren, der vermutlich an der Knochenhomöostase beteiligt ist, ist der Plättchenwachstumsfaktor (platelet-derived growth factor = PDGF). Biologisch aktiver PDGF findet sich als Homodimer oder Heterodimer der Komponente A- und B-Ketten. In vitro-Studien haben gezeigt, daß PDGF für Osteoblasten mitogen ist (Abdennagy et al., Cell Biol. Internat. Rep. 16(3): 235-247, 1992). Eine mitogene Aktivität sowie chemotaktische Aktivitäten im Zusammenhang mit PDGF ist nachgewiesen worden, wenn der Wachstumsfaktor normalen osteoblastenartigen Zellen (Tuskamota et al., Biochem Biosphyl. Res. Co mm. 175(3): 745-747, 1991) und primären Osteoblastenkulturen zugesetzt wird (Centrella et al., Endocrinol. 125 (1): 13-19, 1989). In jüngerer Zeit durchgeführte Studien haben gezeigt, das der Osteoblast die AA-Isoform von PDGF erzeugt (Zhang et al., Am. J. Physiol. 261: c348-354, 1991). Der genaue Modus, durch den PDGF das Wachstum von Osteoblasten beeinflußt, ist noch nicht ganz klar, doch es scheint Einigkeit darüber zu bestehen, daß der Wachstumsfaktor eine Schlüsselrolle bei der Steuerung sowohl beim normalen Umbau des Skeletts als auch bei der Heilung von Frakturen spielt.
Die therapeutischen Anwendungen für PDGF umfassen beispielsweise die Behandlung von Verletzungen, bei denen zur Heilung, zum Beispiel von Frakturen, die starke Vermehrung von Osteoblasten erforderlich ist. Die Anregung der mesenchymalen Zellvermehrung und die Synthese von intermembranösem Knochen sind als Aspekte der Reparatur von Frakturen genannt worden (Joyce et al., 36t" Annual Meeting, Orthopaedic Research Society, 5.-8. Februar 1990, New Orleans, LA).
Vitamin D gilt seit jeher als wesentlich bei der Prophylaxe von Rachitis, einer Krankheit, bei der die Knochen nicht ausreichend mineralisiert werden. Dies wird der Rolle von Vitamin D, die Aufnahme von Calcium im Magen-Darm-Trakt zu erleichtern, und der Bedeutung des Calciumspiegels im Serum bei der Knochenhomöostase zugeschrieben. Seit kurzem liegen Beweise dafür vor, daß Osteoblasten Rezeptoren für den Vitamin-D-Metaboliten 1α,25-Dihydroxycholecalciferol aufweisen, was heißt, daß der Osteoblast ein wichtiges Ziel für das Hormon ist (Suda et al., J. tell. Biochem., 49: 53-58, 1992). Man nimmt an, daß das Vitamin D eine wichtige Rolle bei der Aktivierung der Osteoklasten vermittelten Resorption durch den Osteoblasten spielt (Watrous et al., Sem. in Arthritis and Rheum. 19 (1) 45-65, 1989). Vitamin D ist bei in vitro angelegten Kulturen von Osteoblasten verwendet worden (Kurihara et al., Endocrinol. 118 (3): 940-947, 1986) und wurde mit einer Zunahme der alkalischen Phosphatase, einem Marker der Zelldifferenzierung zum osteoblastischen Phänotyp in Verbindung gebracht. Jedoch wird bei menschlichen Knochenzellen die Anregung der alkalischen Phosphatase mit einer Abnahme der Zellvermehrung in Verbindung gebracht (Huffer, Lab. Investig. 59 (4): 418-442, 1988). Bei Schädeldachkulturen erhöht die Zugabe von Vitamin D die Freisetzung von Calcium in das Medium und ist der Knochenresorptionsaktivität korreliert (Beil, J. Clinical Investig. 76: 1-6, 1985). Die Expression von Osteocalcin, einem Marker für Osteoblasten, erfordert die Vitamin-D-Induktion (Yoon et al., Biochem. 27: 8521-8526, 1988). Die genaue Rolle von Vitamin D bei der Knochenhomöostase und die Art, wie es sich auf Osteoblasten und Osteoklasten auswirkt, bleibt noch zu klären.
Wegen der wichtigen Rolle von Osteoblasten bei Heilungs- und Regenerationsprozessen von Knochen, ist die Fähigkeit, die Vermehrung dieser Zellen zu steigern, nach wie vor ein erstrebenswertes Ziel. Die Erfindung macht dies möglichst und bietet außerdem weitere Vorteile, die aus der folgenden detaillierten Beschreibung und den Begleitzeichnungen hervorgehen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung betrifft eine Zubereitung, die eine synergistische Kombination von Plättchenwachstumsfaktor (PDGF) und Vitamin D zur Stimulierung des Wachstums von Osteoblastenzellen umfaßt. In einer Ausführungsform ist die Zusammensetzung im wesentlichen frei von der PDGF-A- Kette. In einer verwandten Ausführungsform umfaßt die Zusammensetzung rekombinantes PDGF-BB. In einer anderen Ausführungsform werden die Zellen in vitro gezüchtet.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung dient die Zubereitung dazu, das Knochenwachstum bei einem Patienten anzuregen. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist das Vitamin D 9,10-Secocholesta- 5,7,10[19]-trien-3-ol oder 1α,25-Dihydroxycholecalciferol.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Stimulierung des Wachstums von Osteoblastenzellen durch Kultivieren der Zellen in Gegenwart der Zubereitung, die im wesentlichen frei von der PDGF-A- Kette ist, zur Verfügung.
Die Erfindung stellt auch die Verwendung einer synergistischen Kombination aus PDGF und Vitamin D, wie nachstehend beschrieben und beansprucht zur Verfügung.
Diese und weitere Aspekte der Erfindung gehen aus der folgenden detaillierten Beschreibung und den Begleitzeichnungen hervor.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt, daß Vitamin D die PDGF-BB Stimulierung der ³H-Thymidinaufnahme in primären Schweineosteoblasten erhöht.
Fig. 2 zeigt, daß sowohl PDGF als auch Vitamin D gleichzeitig vorhanden sein müssen, damit die zweifache Zunahme der Mitogenese beobachtet werden kann.
Fig. 3 zeigt, daß sich die synergistische Wirkung von PDGF und Vitamin D mit der Vitamin-D-Konzentration ändert.
Fig. 4 zeigt, daß der synergistische Effekt nicht auftritt, wenn basischer FGF und Vitamin D verwendet werden.
Fig. 5 zeigt, daß Vitamin D die durch PDGF induzierte Mitogenese von Swiss-3T3-Fibroblasten nicht beeinflußt.
Fig. 6 zeigt, daß PDGF in Gegenwart von Vitamin D bei einer Osteoblastenzellinie einer Maus, MC3T3, für verstärktere vielfache Induktion sorgt als ohne Vitamin D.
Fig. 7 zeigt, daß PDGF und Vitamin D die Knochenresorption stimulieren, wenn sie getrennten Schädeldachkulturen zugesetzt werden, aber daß PDGF und Vitamin D zu einer Verringerung der Knochenresorption führen, wenn man sie zusammen zu einer Schädeldachkultur gibt.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung gründet sich zum Teil auf die Entdeckung der Erfinder, daß PDGF und Vitamin D eine synergistische Wirkung auf das Wachstum von Osteoblasten haben. Zusätzlich haben die Erfinder herausgefunden, daß PDGF die durch Vitamin D induzierte Knochenresorption hemmen kann. Wie bereits ausgeführt, spielen Osteoblasten eine zentrale Rolle bei der Knochenbildung und Knochenhomöostase im allgemeinen. Die erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich zur Stimulierung des Osteoblastenwachstums in in vitro Zellkulturen sowie in vivo (d. h. bei der Reparatur bzw. Heilung von Knochenbrüchen), wodurch sie die Heilung fördern.
Im Zusammenhang der Erfindung umfaßt PDGF die AA-, BB- und AB-Isoformen von PDGF, einzeln oder in Kombination sowie biologisch aktive Analoga derselben. Außerdem umfassen die BB-Isoformen von PDGF das virale Homolog (das v-sis-Genprodukt). PDGF ist entweder aus nativen oder rekombinanten Quellen erhältlich. Verfahren zur Herstellung von rekombinantem PDGF oder PDGF-Analogen sind in den US-A-4,769,322, 4,801,542 und 4,766,073 sowie in der EP 0 282 317 beschrieben. PDGF kann auch in Bakterien hergestellt werden (siehe Tackney et al., WO90/04035). Verfahren zur Aufreinigung von PDGF aus nativen Quellen werden von Raines und Ross (J. Biol. Chem. 257: 5154-5160, 1982), Hart et al. (Biochemistry 29: 166-172, 1990) und in der US-A-4,479,896 beschrieben. Wie in einigen der vorstehend aufgeführten erteilten Patenten erörtert, hat man herausgefunden, daß man biologisch aktives Material direkt erhalten kann, in dem man den sekretorischen Weg eukaryontischer Zellen dazu nutzt, rekombinantes PDGF zu exprimieren. Die Expression und Sekretion des entsprechenden Genprodukts aus eukaryontischen Zellen ermöglicht ein korrektes Processing und Anordnen (Assembly) und ergibt Moleküle mit einer nativen und biologisch aktiven Konformation. Vorausgesetzt, man verwendet geeignete Transcriptionspromotoren und sekretorische Signalsequenzen, kann im allgemeinen jede eukaryontische Zelle PDGF in biologisch aktiver Form exprimieren und ausscheiden, damit es in der Erfindung verwendet werden kann. Alternativ können PDGF-Polypeptidketten in prokaryontischen Zellen exprimiert, isoliert und in vitro zusammengefügt werden, um biologisch aktive Moleküle herzustellen.
Um PDGF in Hefe zu exprimieren, wird eine DNA-Sequenz, die ein PDGF- Polypeptid (d. h. eine PDGF-A-Kette oder PDGF-B-Kette) codiert, an einen geeignete Promoto- und eine sekretorische Signalsequenz ligiert. Promotoren, die in Hefe verwendet werden können, umfassen den Hefe-α-Faktor (MFα1) Promotor und den Hefetriosephosphatisomerase (TPI1) Promotor (US-A-4,559,311). Promotoren können auch von anderen Hefegenen abgeleitet werden, z. B. der Alkoholdehydrogenase I (ADH1) oder Alkoholdehydrogenase 2 (ADH2). Geeignete Promotoren für andere eukaryontische Spezies können ebenfalls verwendet werden und sind Fachleuten bekannt. Die Sekretion der PDGF-Genprodukte kann durch Einsatz der preprosekretorischen Signalsequenz des Hefe-Paarungs-Pheromon-α-Faktors (Kurjan und Herskowitz, Cell 30: 933, 1982; Julius et al., Cell 36: 309, 1984, und Brake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4642, 1984) oder Leadern und Sequenzen der dritten Domäne des Hefe BAR1 Gen erreicht werden (siehe US -A-5,037,743), obwohl auch andere Sekretionssignale eingesetzt werden können. Um die effiziente Transcriptionstermination und Polyadenylierung der mRNS sicherzustellen, kann eine Hefeterminationssequenz wie der Triosephosphatisomerase-Terminator angefügt werden (Alber und Kawasaki, J. Molec. Appl. Genet. 1: 419, 1982). Verfahren zur Ligierung von DNS-Fragmenten sind umfassend beschrieben worden (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) und gehören zum Allgemeinwissen bzw. Routine eines Fachmanns. Nach der Herstellung der Expressionseinheits-Konstrukte, werden diese in einen geeigneten Expressionsvektor eingebracht.
Vorzugsweise wird ein Expressionsvektor verwendet, der innerhalb der Wirtszelle stabil bleibt, um pro Einheit der Kultur mehr biologische Aktivität zu erzeugen. Geeignete Hefexpressionsvektoren sind in dieser Hinsicht die Plasmide pCPOT (ATCC 39685) und pMPOT2 (ATCC 67788), die das Schizosaccharomyces pombe Gen umfassen, das das glycolytische Enzym Triosephosphatisomerase codiert (POT1-Gen). Der Einbau des POT1-Gens stellt sicher, daß das Plasmid in einer Wirtszelle mit einer TPI- Gendeletion stabil gehalten wird, weil es die Gendeletion in der Wirtszelle ergänzen kann (siehe US-A-4,931,373).
Nach Herstellung eines DNS-Konstrukts, welches den POT1- selektierbaren Marker und eine Expressionseinheit enthält, welche beispielsweise den TPI1-Promoter, die BAR1-Leader- und dritte Domänensequenzen, eine geeignete, PDGF-codierende DNS-Sequenz und den TPI1- Terminator umfaßt, wird das Konstrukt in einen Hefewirt mit einer TDI1- Gendelition transformiert. Verfahren zur Transformation von Hefen sind wohlbekannt und sind in der Literatur beschrieben worden.
Die transformierten Hefezellen können durch Wachstum auf einem herkömmlichen komplexen Medium, enthaltend Glukose, selektiert werden, wenn das POT1-Gen als selektierbarer Marker eingesetzt wird. Ein herkömmliches Medium wie YEPD (20 g Glukose, 20 g Bacto-Pepton, 10 g Hefeextrakt pro Liter) kann eingesetzt werden. Sobald sie selektiert sind, werden die Transformanten, welche die geeigneten Expressionskonstrukte enthalten, zur stationären Phase auf herkömmlichen komplexen Medien gezogen, die Zellen durch Zentrifugation oder Filtration entfernt und das Medium konzentriert. Da PDGF ein hochkationisches und hydrophobes Protein ist (Raines und Ross, ibid.; Antoniades, Proc. Ntl. Acad. Sci. USA 78: 7314, 1981; Deuel et al. J. Biol. Chem. 256: 8896, 1981), verfügt das rekombinante PDGF gleichermaßen über Eigenschaften, die die Anwendung der Ionenaustauschchromatographie bei seiner Aufreinigung gestatten. Beispielsweise wird rekombinantes PDGF-BB in Hefefermentationsbrühe von den Zellen abgetrennt und über Kationenaustauschchromatographie fraktioniert. Das von der Säule desorbierte PDGF-BB wird angesäuert und weiter durch Umkehrphasenchromatographie unter Chargenbedingungen fraktioniert. Das PDGF enthaltende Eluat wird angesäuert und durch eine starke Kationenaustauschersäule geführt und mit einem NaCl-Stufengradienten eluiert. Das Eluat wird gesammelt und PDGF-BB unter Verwendung von (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; ausgefällt. Das erhaltene Material wird durch Gelfiltration entsalzt und nach seiner Ladung getrennt. Das Eluat wird angesäuert und auf eine starke Kationenaustauschersäule aufgetragen und mit einem linearen Gradienten von NH&sub4;HCO&sub3; bei pH 8-10 eluiert. Das Eluat wird gesammelt und das PDGF-BB durch Zugabe von (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; ausgefällt. Das erhaltene Präzipitat wird in Essigsäure gelöst und durch Gelfiltration fraktioniert. Das Eluat wird entsalzt und lyophilisiert.
Die Expression von biologisch aktiven Proteinen in anderen eukaryotischen Zellen als Hefezellen, kann vom Fachmann über den Einsatz geeigneter Expressions-/Regulationssignale erzielt werden. Transkriptionspromoteren, die die Expression von PDGF-Sequenzen dirigieren können, werden auf ihre Fähigkeit hin ausgewählt, eine effiziente und/oder gesteuerte Expression in dem speziellen eukariotischen Zelltyp zu ergeben. Signalsequenzen, die das Genprodukt in den sekretorischen Weg der Zelle dirigieren können, werden auf ihre Funktion in der Wirtszelle hin gewählt. Die Selektion anderer geeigneter Regulationssignale, wie Transkriptions-Terminationssignalen, Polyadenylierungssignalen und Transkriptions-Enhancersequenzen sind für den Fachmann selbstverständlich bzw. offensichtlich.
Es konnte gezeigt werden, daß rekombinantes PDGF im wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie natives PDGF besitzt. Die grundlegende biologische Aktivität von PDGF, insbesondere die Induktion der Chemotaxis und Mitogenese in ansprechbaren Zelltypen (einschließlich Fibroblasten, Osteoblasten und glatten Muskelzellen) unterliegt vielen der physiologischen Rollen dieses Proteins, einschließlich seiner Rolle bei der Gewebereparatur.
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist das PDGF im wesentlichen frei von der A-Kette. Da die homodimeren Isoformen von PDGF (AA und BB) homolog, jedoch nicht identisch sind, und die Monomere Molekulargewichte von 12,5-14,3 kD (A-Kette) und 13-14 kD (B- Kette) aufweisen, kann die Reinheit über den Erhalt einer einzelnen Hauptbande auf einem Polyacrylamidgel überprüft werden.
PDGF-Zusammensetzungen, die in bestimmten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind vorzugsweise im wesentlichen rein, das heißt im allgemeinen frei von Verunreinigungen oder Kontaminationen, die mit deren therapeutischer Verwendung interferieren würden. Besonders bevorzugt sind diejenigen Zubereitungen, die frei von toxischen, antigenischen, entzündlichen, pyrogenen oder anderen schädlichen Substanzen sind und zu mehr als 90%, vorzugsweise mehr als 99% rein sind.
Wie hier verwendet, bezieht sich "Vitamin D" auf sowohl biologische aktive Formen der Verbindung als auch Vorläufer derselben, die in vivo in eine biologisch aktive Form überführt werden können. Das Vitamin D ist daher so aufzufassen, daß es unter anderem Vitamin D&sub2;, Vitamin D&sub3; und deren aktive Metaboliten umfaßt. Vitamin D&sub2; (9,10-Secoergosta- 5,7,10[19], 22-tetraen-3-ol) ist eine synthetische Form des Vitamins D (Inhoffen, Angew. Chem. 72: 857, 1960) und sein biologisch aktiver Metabolit ist das 25-Hydroxyergocalciferöl (Suda et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 35: 182, 1969). Andere metabolisierbare Formen und Analoga dieser Verbindungen können ebenso eingesetzt werden, eingeschlossen 1-α-Hydroxyvitamin D&sub3;, 25-Hydroxy-Vitamin D&sub3;, 24,25-Dihydroxyvitamin D&sub3;, 1,25-Dihydroxyvitamin D&sub3;, 25-Hydroxyvitamin D&sub2;, 1,25- Dihydroxyvitamin D&sub2;, 24,25-Dihydroxyvitamin D&sub2; und andere im Stand der Technik bekannte. Eine bevorzugte Verbindung ist Vitamin D&sub3; (9,10- Secocholesta-5,7,10[19]-trien-3-ol) und am meisten bevorzugt ist die biologisch aktive Form der Verbindung, 1α,25-Dihydroxycholecalciferol, die beide im Handel erhältlich sind.
In einer Ausführungsform dient die vorliegende Erfindung dazu, das Wachstum von Osteoblasten in vitro zu stimulieren. Es ist häufig der Fall, daß Osteoblasten von einer primären Kultur, das heißt einer Kultur, die direkt aus einem Gewebe erhalten wird, welches eine heterogene Population von Zelltypen umfaßt, abgeleitet werden. Primärkulturen aus Knochengewebe können Osteoklasten, Fibroblasten, Osteoblasten- Vorläuferzellen und Endothelzellen enthalten. Primärkulturen können unter Verwendung zahlreicher, im Stand der Technik bekannter Verfahren etabliert werden. Beispielsweise kann ein fötaler Schädel, der gemahlen und in Anwesenheit von Collagenase inkubiert wird, zum Etablieren einer Primärkultur eingesetzt werden. Die durch den Collagenase-Abbau freigesetzten Zellen werden gesammelt und kultiviert (Aubin et al., J, of Cell Biol., 92: 452-461, 1982). Alternative Verfahren setzten frisch isolierte Knochenscheiben ein, die mit Collagenase behandelt und gewaschen und anschließend kultiviert werden, um eine Wanderung der Zellen aus den Knochenscheiben zu gestatten, und anschließend Verwendung eines Mediums mit niedrigem Ca&spplus;&spplus;-Gehalt, das auf das Wachstum von Osteoblasten nach der Collagenasebehandlung selektiert (Robey et al., Calif. Tiss. 37: 453-460, 1985). Die Identifizierung von Osteoblasten in einer Primärkultur erfolgt primär phenotypisch. Die Phenotypmarker für Osteoblasten schließen die Expression der alkalinen Phosphatase (Manduca et al., J. Bone Min. Res. 8: 281, 1993), die Typ-1-Collagen-Synthese (Kurihara et al., Endocrinol. 118(3): 940-947, 1986), die Produktion von Osteocalcin (Yoon et al., ibid.) und die Ansprechbarkeit durch Parathyoidhormon (Aubin et al., ibid.) ein. Osteoblastenzellen werden typischerweise bei 37ºC in 5% CO&sub2; in einem Wachstumsmedium kultiviert, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, essentialle Aminosäuren, Vitamine, Mineralien und Wachstumsfaktoren umfaßt, die im allgemeinen durch fötales Kalbsserum bereitgestellt werden. Eine Vielzahl geeigneter Medien ist im Stand der Technik bekannt.
Die vorliegende Erfindung kann außerdem eingesetzt werden, um das Wachstum von etablierten Osteoblasten-Zelllinien zu stimulieren. Beispiele solcher Zelllinien schließen ein: Saos-2, ein human-primärosteogenes Sarcom (ATCC Nr. HTB 85); U-2 OS, ein human-primär-osteogenes Sarcom (ATCC Nr. HTB 964), HOS (TE85), ein human-osteogenes Sar com (ATCC Nr. CRL 1543); MG-63, ein Human-Osteosarcom (ATCC Nr. CRL 1427) und UMR 106, ein Osteosarcom der Ratte (ATCC Nr. CRL 1661).
Bei einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine PDGF und Vitamin D enthaltende Zubereiteitung bzw. Zusammensetzung als ein Therapeutikum eingesetzt, um die von Osteoblasten vermittelte Knochenbildung zu fördern. Die Verfahren der Erfindung können angewandt werden, um die Heilung oder Reparatur von Knochendefekten und Mängeln, wie denjenigen, die in geschlossen, offenen und nicht einheitlichen Frakturen auftreten, zu fördern, die Knochenheilung in der plastischen Chirurgie zu fördern, das Einwachsen von Knochen in nicht einzementierte Prothesengelenke und Zahnimplantate zu fördern, bei der Behandlung von Peridontalerkrankungen und Defekten, zur Steigerung der Knochenbildung während der Distraktionsosteogenese und bei der Behandlung anderer Skeletterkrankungen, die über die Stimulation der Osteoblastenaktivität behandelt werden können, wie der Osteoporose und Arthritis.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können lokal oder systemisch verabreicht werden. Die lokale Verabreichung kann durch Injektion am Ort der Verletzung oder des Defekts oder durch Insertion oder Anheftung eines festen Trägers an der Stelle oder durch direkte, topische Anwendung einer viskosen Flüssigkeit erfolgen.
Die Übermittlung von biologisch aktivem PDGF und Vitamin D an Wundorte kann durch die Verwendung kontrolliert freisetzender Zusammensetzungen gefördert werden, wie denjenigen, die in der anhängigen US-Patentanmeldung der Nr. 07/871,246 (entsprechend der WIPO-Veröffentlichung WO 93/20859) beschrieben sind. Kurz gesagt, werden biologisch abbaubare Polyesterfilme wie Polymilchsäure (PLA), Polyglykolsäure, Polydioxanon oder Polymilchsäure/Polyglykolsäure-Copolymerfilme, enthaltend PDGF, hergestellt und zu Nadeln, Platten, Schrauben und dergleichen zum Anheften an oder für die Insertion in Knochen verarbeitet. Diese Zubereitungen sorgen für eine verzögerte Freisetzung des PDGF am Zielort. 50 : 50 PLA : PGA-Filme (Polymilchsäure : Polyglykolsäure) sind bevorzugt. Diese Filme können außerdem einen Träger wie Albumin, ein Polyoxyethylensorbitandetergenz oder Glutaminsäure enthalten. Wenn Albumin enthalten ist, wird das Verhältnis von PDGF zu Albumin im allgemeinen zwischen 0,125 und 2,5 ug/mg gehalten. Im Prinzip kann jede Substanz, die den Polymerabbau fördert, Poren im Film erzeugt oder die Absorption des Wachstumsfaktors bzw. der Wachstumsfaktoren an den Film verringert, als Träger eingesetzt werden. Albumin ist ein besonders bevorzugter Träger.
Als Träger geeignete Polyoxyethylensorbitandetergentien schließen Polyoxyethylensorbitanmonooleat, Polyoxyethylensorbtinamonolaureat, Polyoxyethylensorbitanmonopalmitat, Polyoxyethylensorbitanmonostearat und Polyoxyethylensorbitantrioleat ein.
Filme dieser Art sind insbesondere als Beschichtungen für Prothesenvorrichtungen und chirurgische Implantate geeignet. Die Filme können beispielsweise um die äußeren Oberflächen von chirurgischen Schrauben, Stäben, Nadeln, Platten und dergleichen gewickelt werden. Implantierbare Vorrichtungen dieser Art werden routinemäßig in der orthopädischen Chirurgie verwendet. Die Filme können außerdem dazu verwendet werden, Knochenfüllmaterialien wie Hydroxyapatit-Blöcke, entmineralisierte Knochenmatrixstopfen, Collagenmatrices und dergleichen zu beschichten. Im allgemeinen wird ein Film oder eine Vorrichtung, wie hier beschrieben, am Knochen am Ort der Fraktur angewandt. Die Anwendung erfolgt im allgemeinen durch Implantation in den Knochen oder Anheftung an die Oberfläche unter Anwendung chirurgischer Standardverfahren.
Zusätzlich zu den Copolymeren, Wachstumsfaktoren und Trägern, wie oben aufgezeigt, können die biologisch abbaubaren Filme andere aktive oder inerte Komponenten umfassen. Von besonderem Interesse sind diejenigen Mittel, die das Gewebewachstum oder die Infiltration fördern. Mittel, die Knochenwachstum fördern, wie morphogene Proteine des Knochens (US-Patent Nr. 4,761,471; die PCT-Veröffentlichung WO 90/11366), Osteogenin (Sampath et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7109-7113, 1987) und NaF (Tencer et al., J. Biomed. Mat. Res. 23: 571-589, 1989) sind besonders bevorzugt.
Um die Filme zu beladen, werden PDGF und ein Träger auf den Film als Pulver oder flüssige Lösung aufgetragen. Beispielsweise können lyophilisiertes PDGF und Albumin gleichmäßig über eine Oberfläche des Films dispergiert und der Film zusammengefaltet werden. Alternativ dazu können die Proteine in Form einer wäßrigen Lösung aufgetragen werden (beispielsweise in Phosphat-gepuffertem Salz oder 0,1 M Essigsäure), die man trocknen läßt.
PDGF enthaltende, biologisch abbaubare Materialien können ebenso zu einer Vielzahl von Implantaten gemäß im Stand der Technik bekannter Verfahren geformt werden. Nadeln, Platten, Blöcke, Schrauben und dergleichen können für die Insertion in oder die Anheftung an Knochen an der Stelle einer Fraktur oder eines andere Defekts hergestellt werden.
Biologisch abbaubare Materialien werden typischerweise so formuliert, daß sie zwischen 0,0375 und 1,25 ug PDGF pro mg des Copolymeren enthalten.
Alternative Verfahren zur lokalen Übermittlung von PDGF und/oder Vitamin D schließen die Verwendung von ALZET osmotischen Minipumpen (Alza Corp. Palo Alto, CA), verzögert freisetzenden Matrixmaterialien, wie diejenigen, die in Wang et al. (WO 90/11366) offenbart sind, elektrisch geladenen Dextrankügelchen, wie in Bao et al. (WO 92/03125) offenbart, Übermittlungssysteme auf Collagenbasis, wie beispielsweise in Ksander et al. (Ann. Surg. 211(3): 288-294, 1990)offenbart, Methylcellulosegelsysteme, wie in Beck et al. (J. Bone Min. Res. 6(11): 1257-1265, 1991) offenbart, und Systeme auf Alginatbasis, wie in Edelman et al. (Biomaterials, 12: 619-626, 1991) offenbart, ein. Andere im Stand der Technik wohlbekannte Verfahren für die verzögerte lokale Übermittlung in Knochen schließen poröse beschichtete Metallprothesen ein, die imprägniert werden können, und feste Kunststoffstäbe, in die therapeutische Zubereitungen eingearbeitet wurden.
Die Übermittlung von systemisch verabreichten Zubereitungen der vorliegenden Erfindung kann durch Konjugieren von einem oder beiden von PDGF und Vitamin D an ein zielsuchendes Molekül gesteigert werden. Ein "zielsuchendes Molekül" bezieht sich auf ein Molekül, das an das interessende Gewebe bindet. Beispielsweise schließen knochen-zielsuchende Moleküle Tetracycline, Calcein, Bisphosphonate, Polyasparaginsäure, Polyglutaminsäure, Aminophosphorzucker, Peptide, von denen bekannt ist, daß sie mit der Mineralfaser des Knochens assoziiert sind, wie Osteonectin, Kochensialoprotein und Osteopontin, knochenspezifische Antikörper, Proteine mit Knochenmineral bindenden Domänen und dergleichen ein (siehe beispielsweise die Offenbarungen von Bentz et al. (EP 0 512 844) und Murakami et al. (EP 0 341 961).
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Zubereitungen können in Form von pharmazeutisch akzeptablen Salzen, insbesondere Säureadditionssalzen, umfassend Salze von organischen Säuren und Mineralsäuren, vorliegen. Beispiele solcher Salze schließen organische Säuren wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Bernsteinsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Salicylsäure und dergleichen ein. Die Säureadditionssalze der basischen Aminsäurereste werden hergestellt, indem man das Peptid mit der geeigneten Säure oder dem Mineral gemäß dem. Fachmann wohlbekannter Verfahren behandelt oder das gewünschte Salz kann direkt durch Lyophilisieren aus der geeigneten Säure erhalten werden. Diese Salze können zusätzlich bei der Herstellung von injizierbaren topischen und wäßrigen Lösungen für die lokale oder systemische Übermittlung von Zubereitungen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Materialien und Verfahren zur Herstellung von injizierbaren und topischen Formen finden sich in Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Auflage, 1985.
In der vorliegenden Erfindung ist eine "wirksame Menge" einer Zusammensetzung diejenige Menge, die einen statisch signifikanten Effekt erzeugt. Wenn zur Stimulation des Wachstums von Osteoblastenzellen in vitro eingesetzt, ist es im allgemeinen wünschenswert, einen Wachstumsanstieg von mindestens 50% zu erzeugen, gemessen über die Inkorporation bzw. den Einbau von ³H-Thymidin im Vergleich zu Zellen, die in Anwesenheit von PDGF und in Abwesenheit von Vitamin D gezogen werden. Für therapeutische Anwendungen ist eine "wirksame Menge" diejenige Menge der PDGF und Vitamin D enthaltenden Zusammensetzung, die erforderlich ist, um an einen klinisch signifikanten Anstieg in Heilungsraten bei der Reparatur von Brüchen, der Umkehr des Knochenverlusts in der Osteoporose, der Stimulation und/oder Unterstützung der Knochenbildung in Frakturmissmatches und bei der Distraktion der Osteogenese, eines Anstieges und/oder eine Beschleunigung des Knochenwachstums in Prothesenvorrichtungen und eine Heilung von Dentaldefekten zu bewirken. Solche Mengen werden teilweise von dem spezifischen zu behandelnden Bedingungen und anderen Faktoren abhängen, die dem Fachmann offensichtlich sind. Beispiels manifestiert sich bei der Osteoporose ein Anstieg in der Knochenbildung als statistisch signifikanter Unterschied hinsichtlich der Knochenmasse zwischen behandelten und Kontrollgruppen. Dies zeigt sich beispielsweise als 10-20%iger oder darüberliegender Anstieg der Knochenmasse. Andere Messungen für klinisch signifikante Anstiege bei der Heilung können beispielsweise einschließen Tests auf Bruchfestigkeit und Spannung, Bruchfestigkeit und Verdrillung, 4-Punktbeugung und andere biomechanische Tests, die dem Fachmann wohlbekannt sind. Allgemeine Richtlinien für Behandlungsschemata wird aus Experimenten erhalten, die an Tiermodellen für die interessierende Erkrankung durchgeführt wurden.
Ein bevorzugter Dosisbereich für Vitamin D für die systemische Behandlung eines 70-kg-Patienten beträgt von etwa 1 ng bis 1 mg, vorzugsweise von etwa 10 ng bis etwa 500 ug und am meisten bevorzugt von etwa 20 ng bis 1 ug. Ein bevorzugter Dosisbereich für Vitamin D für die lokale Anwendung von Vitamin D in Kombination mit PDGF beträgt von etwa 1 ng bis 1 mg, vorzugsweise von etwa 5 ng bis etwa 500 ng und am meisten bevorzugt von etwa 10 ng bis 100 ng.
Ein bevorzugter Dosisbereich für die Verabreichung von PDGF für die systemische Behandlung eines 70 kg-Patienten beträgt von etwa 1 pg bis 10 mg, vorzugsweise von 100 pg bis 1 mg und am meisten bevorzugt von 10 ng bis 100 ug. Ein bevorzugter Dosisbereich für die lokale Anwendung von PDGF in Kombination mit Vitamin D beträgt von etwa 1 ng bis etwa 10 mg, vorzugsweise von 1 ug bis 1 mg und am meisten bevorzugt von 10 ug bis 500 ug. Im allgemeinen werden verzögert freisetzende Zusammensetzungen formuliert, um Dosierungen an einem oberen Ende der genannten Bereiche bereitzustellen. Die Dosierung wird der Freisetzungsgeschwindigkeit angepaßt. Flüssige Zubereitungen werden in typischer Weise von 1 bis 1000 ug/ml PDGF, vorzugsweise 10 bis 500 ug/ml enthalten.
In vitro beträgt der bevorzugte Bereich der PDGF-Konzentration etwa 1 ng/ml bis 100 ng/ml, vorzugsweise 5 ng/ml bis 40 ng/ml und am meisten bevorzugt 6 ng/ml bis 20 ng/ml.
Es wurde gefunden, daß man die synergistische Wirkung von PDGF und Vitamin D am besten durch Kombinieren des PDGF und des Vitamin D in einem Verhältnis von 6 : 0,1 bis 6 : 1000 (PDGF: Vitamin D), vorzugsweise 6 : 1 bis 6 : 500, stärker bevorzugt 6 : 10 bis 6 : 100, am meisten bevorzugt etwa 6 : 40 erhält.
Die oben beschriebenen Zusammensetzungen werden über eine Zeitspanne verabreicht, die von einem Tag bis 6 Monate oder darüber reicht, in Abhängigkeit von den zu behandelnden Zuständen. Im allgemeinen werden die Dosen von fünfmal täglich bis zu einmal im Monat und vorzugsweise von einmal täglich bis einmal im Monat solange verabreicht, bis die Heilung im wesentlichen vollständig ist. Das tatsächliche Behandlungsschema hängt von solchen Faktoren wie dem Alter und dem Allgemeinzustand des Patienten, dem zu behandelnden Zustand und dem Übermittlungsweg ab. Die Ermittlung des Behandlungsschemas liegt im Können des Fachmanns.
Die Erfindung wird durch die folgenden, nicht beschränkenden Beispiele veranschaulicht.

Beispiel I

Eine primäre Osteoblastenkultur aus Schweinen wurde etabliert. Die trabekulären Knochenteile wurden aus den Femuren eines nicht ausgereiften Schweins (etwa 30 Pfund) entfernt. Der Knochen wurde in Scheiben geschnitten, etwa 2 · 2 mm, und mehrfach bei Raumtemperatur in phosphatgepuffertem Kochsalz (PBS) gewaschen, um alles Blut zu entfernen. Die Knochenscheiben wurden in 1 mg/ml Clostridium histolyticum Typ II Collagenase (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) angeordnet, die in Dulbecco's Medium (DMEM) verdünnt (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA) und das vor der Anwendung filtersterilisiert worden war. Die Scheiben wurden zwei Stunden lang bei 37º unter Schütteln in dem Collagenasemedium inkubiert. Nach der Collagenaseinkubation wurde das Medium entfernt und die Knochenscheiben in PBS gebracht und solange gewaschen, bis keine Zellen im Waschmedium mehr vorhanden waren.
Die Scheiben wurden in Eagles-MEM-Medium (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD), enthaltend 10% fötales Kalbsserum (FCS) (Hyclone, Logan, UT), 1 mM Natriumpyruvat und 0,29 mg/ml L-Glutamin, in geringer Dichte angeordnet und bei 37ºC und 5% CO&sub2; inkubiert. Das Medium wurde alle 4-5 Tage ausgetauscht. Die Osteoblastenwanderung aus den Knochenscheiben war nach 7- 10 Tagen zu sehen. Die Zellen wurden sofort, wenn sie konfluent waren, für den Test verwendet und dann entsorgt.
Die Zellen wurden auf die Expression der alkalinen Phosphatase zur Bestätigung des Osteoblasten-Phänotyps getestet. Die histochemische Anfärbung erfolgte unter Verwendung des AP Histochemical Staining kit 86R (Sigma, St. Louis, MO) gemäß den Angaben des Herstellers. Die Ergebnisse zeigen an, daß 30-70% der heterogenen Primärzellpopulation positiv für die alkalische Phosphatase war und daß eine steigende Zelldichte den prozentualen Gehalt der AP&spplus;-Zellen erhöhte.

Beispiel II

Primäre Schweine-Osteoblasten (hergestellt wie oben beschrieben) wurden auf relative mitogene Aktivität in Anwesenheit von PDGF-BB, PDGF-BB und 1α,25-Dihydroxycholecalciferol und 1α,25-Dihydroxycholecalciferol alleine getestet. Die mitogene Aktivität wurde durch Messung der ³H- Thymidin-Inkorporation beruhend auf dem Verfahren von Raines und Ross (Meth. Enzymology 109: 749-773, 1985) getestet. Kurz gesagt, wurden ruhende primäre Schweine-Osteoblasten erhalten, indem man Zellen in einer Dichte von 3 · 10&sup4; Zellen/ml in Eagles-MEM-Medium (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD), enthaltend 10 fötales Kalbsserum (FCS), in Platten mit 96 Vertiefungen ausplattierte und sie für 3-4 Tage wachsen ließ. Das Medium wurde entfernt und 180 ul DFC (Tabelle 1), enthaltend 0,1% FCS, pro Vertiefung zugegeben. Zu der Hälfte der Vertiefungen wurden 10 nM lct,25-Dihydroxycholecalciferol (Biomol. Research Labs, Plymouth Meeting, PA) zugegeben. Die Zellen wurden drei Tage bei 37ºC in 5% CO&sub2; inkubiert. Da das 1α,25-Dihydroxycholecalciferol in Ethanol gelöst war, wurde ein weiterer Satz von Vertiefungen als Kontrolle hergestellt, enthaltend eine Menge an Ethanol äquivalent zu derjenigen, die durch die Zugabe des 1α,25-Dihydroxycholecalciferols zugefügt wurde. 20 ul von 10X PDGF wurden so zugefügt, daß die Endkonzentraton von 0,2-50 ng/ml reichte. Negative Kontrollen wurden ohne zugesetztes PDGF-BB und mit und ohne Vitamin-D-Zusatz angesetzt. Die Platten wurden 20 Stunden bei 37ºC inkubiert und das Medium entfernt. 100 ul DFC, enthaltend 0,1% FCS und 2 pci/ml ³H-Thymidin wurden zu jeder Vertiefung zugegeben und die Platten weitere drei Stunden bei 37ºC inkubiert. Das Medium wurde abgesaugt und 150 ul Trypsin in jede Vertiefung zugegeben. Die Platten wurden bei 37ºC inkubiert bis die Zellen abgelöst waren (mindestens 10 Minuten). Die abgelösten Zellen wurden geerntet unter Verwendung eines LKB Wallac 1295-0001 Cell Harvesters (Zell-Erntegerät, LKB Wallac, Pharmacia, Gaithersburg, MD)auf Filtern. Die Filter wurden durch Erwärmen in einen Mikrowellenofen für 10 Minuten getrocknet und in einem LKB-Betaplatten 1250 Szintillistionszählgerät, wie vom Hersteller (LKB Wallac) beschrieben, gezählt.

TABELLE 1

250 ml Dubecco's Modified Eagles Medium (DMEM)
250 ml Ham's F12-Medium
0,29 mg/ml L-Glutamin
1 mM Natriumpyruvat
25 mM Hepes (Sigma, St. Louis, MO)
10 ug/ml Fetuin (Aldrich, Milwaukee, WI)
50 ug/ml Insulin (GIBCO-BRL)
3 ng/ml Selen (Aldrich, Milwaukee, WI)
20 ug/ml Transferrin (JRH, Lenexa, KS)
Die Ergebnisse, wie in Fig. 1 dargestellt, zeigen, daß PDGF-BB die Thymidinaufnahme in den primären Schweine-Osteoblastenkulturen stimuliert. Die maximale Stimulation tritt zwischen 6 und 10 ng/ml auf. Der Einschluß von 10 nM 1α,25-Dihydroxycholecalciferol zusammen mit PDGF verdoppelt die Maximalaufnahme des Thymidins. In Anwesenheit von 1 , 25-Dihydroxycholecalciferol alleine würde keine Stimulation des Wachstums beobachtet.

Beispiel III

Um zu ermitteln, ob 1α,25-Dihydroxycholecalciferol und PDGF gleichzeitig vorhanden sein müssen, damit der synergistische Wachstumseffekt beobachtet werden kann, wurde der Mitogenitätstest, wie im Beispiel II beschrieben, durchgeführt, mit den folgenden Modifikationen: a) die Endkonzentration des 1α,25-Dihydroxycholecalciferols betrug 100 nM; b) ein weiterer Satz von Vertiefungen wurde ohne 1α,25-Dihydroxycholecalciferol in Anwesenheit von PDGF hergestellt, indem das zur Vorbehandlung der Zellen verwendete Medium mit 1α,25-Dihydroxycholecalciferol entfernt und frisches Medium zugesetzt wurde, das nur die geeigneten Verdünnungen von PDGF enthielt.
Die Ergebnisse, wie in Fig. 2 veranschaulicht, zeigen, daß sowohl PDGF als auch 1α,25-Dihydroxycholecalciferol gleichzeitig vorhanden sein müssen, damit der zweifache Anstieg der Mitogenese beobachtet wird.

Beispiel IV

Um zu ermitteln, ob die Wirkung von 1α,25-Dihydroxycholecalciferol auf die PDGF induzierte Mitogenese der primären Schweine-Osteoblasten dosisabhängig ist, wurde ein Test, wie in Beispiel II beschrieben, durchgeführt, mit den folgenden Modifikationen: a) die Konzentration von 1α,25-Dihydroxycholecalciferol reichte von 0,01 nm bis 100 nm und b) PDGF war in der einzigen Konzentration von 6,2 ng/ml vorhanden. Die Ergebnisse, wie in Fig. 3 veranschaulicht, belegen, daß die synergistische Wirkung von PDGF und 1α,25-Dihydroxycholecalciferol sich mit der Konzentration von 1α,25-Dihydroxycholecalciferol ändert.

Beispiel V

Um zu bestimmen, ob die mit Vitamin D zu sehenden Effekte spezifisch für PDGF sind, wurde Vitamin D in Kombination mit dem basischen Fibro blasten Wachstumsfaktor (Fibroblast Growth Faktor = FGF) getestet. Humaner rekombinanter basischer FGF (BRL-GIBCO) wurde bei Konzentrationen im Bereich von 0,4 ng/ml bis 100 ng/ml in dem in Beispiel II beschriebenen Mitogenitätstest untersucht. Die Ergebnisse, in Fig. 4 gezeigt, zeigen, daß keine Wirkung vorhanden ist, wenn der basische FGF und 1α,25-Dihydroxycholecalciferol verwendet werden.

Beispiel VI

Es wurde ein Test durchgeführt, um zu ermitteln, ob Fibroblasten, ein potentiell kontaminierender Zelltyp in Primärkulturen aus Knochen, für die mit PDGF und 1α,25-Dihydroxycholecalciferol gesehene synergistische Wirkung verantwortlich sind. Unter Verwendung der Mäuse-Fibroblasten- Zelllinie Swiss 3T3 (ATCC Nr. CCL92) wurde der Test, wie im Beispiel II beschrieben, durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Fibroblastenzellen in DMEM, enthaltend 10% FCS, in einer Dichte von 3 · 10&sup4; Zellen/ml ausplattiert wurden. Die in Fig. 5 gezeigten Ergebnisse belegen, daß das 1α,25-Dihydroxycholecalciferol die PDGF induzierte Mitogenese dieser Fibroblastenzellen nicht beeinflußt.

Beispiel VII

Um zu verifizieren, daß sich die synergistische Wirkung von 1α,25-Dihydroxycholecalciferol und PDGF in Osteoblasten zeigt, wurde eine etablierte Osteoblasten-Mäusezellinie, MC3T3 (Suda et al., J. Cell Biol. 96: 191-198, 1983) eingesetzt. Der Test wurde im wesentlichen, wie im Beispiel II beschrieben, durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Zellen in einer Dichte von 3 · 10&sup4; Zellen/ml in α-MEM-Medium (GIBCO-BRL) mit 10% FCS ausplattiert wurden. Im Gegensatz sowohl zu den Swiss 3T3- Fibroblasten als auch den primären Schweine-Osteoblasten inhibierte 1α,25-Dihydroxycholecalciferol das Wachstum der MC3T3-Zellen. Daher wurden die Daten als vielfachste Induktion der Thymidinaufnahme analysiert. Die Vielfachinduktion ist definiert als das Verhältnis der cpm (counts per minutes = Zählrate pro Minute) des in Anwesenheit von PDGF inkorporierten ³H-Thymidins zu der in Abwesenheit von PDGF erhaltenen. Die Ergebnisse, wie in Fig. 6 veranschaulicht, zeigen, daß PDGF eine höhere vielfache Induktion in Anwesenheit von 1α,25-Dihydroxycholecalciferol als in Abwesenheit des Vitamins ergibt.

Beispiel VIII

Um zu verifizieren, daß Osteoblasten in den primären Schweineknochenkulturen auf PDGF und 1α,25-Dihydroxycholecalciferol ansprachen, wurden Tests die Mitogenese und die Exprimierung der alkalischen Phosphatase ausgeführt. Primäre Schweineknochenzellen wurden auf die ³H-Thymidinaufnahme und die Expression des Osteoblasten-Markersalkalische Phosphatase in derselben Zelle getestet. Die primären Schweinknochenzellen wurden ausplattiert und, wie oben beschrieben, behandelt, mit den folgenden Ausnahmen: a) die Zellen wurden in auf Lab-tek, Kammerträger Nr. 177445 (All World Scientific, Seattle, WA) ausplattiert; b) eine einzige Konzentration von 100 ng/ml PDGF-BB wurde eingesetzt, und c) eine einzige Konzentration von 10 nM 1α,25-Dihydroxycholecalciferol wurde eingesetzt. Nach Inkorporation des ³H-Thymidins wurden die Träger dreimal mit PBS gewaschen und auf die alkalische Phosphotaseexpression, wie zuvor beschrieben, gefärbt. Nach dem Färben wurden die Träger luftgetrocknet und mit NTB3-Emulsion (Kodak, Rochester, NY) beschichtet. Man ließ die Emulsion lufttrocknen und die Träger wurden bei 4ºC angeordnet und eine Woche exponiert. Nach der Exposition wurden die Träger 5 Minuten in D-19-Entwickler (Schnellfixierer, Kodak) beim Raumtemperatur entwickelt, in Wasser gespült und in Rapid-Fixierer (Kodak) 5 Minuten fixiert. Die Träger wurden mit Methylenblau (Sigma) durch Verdünnen des Stamms von 1 : 100 in Wasser und Auftragen auf die Zellen für eine Minute gegengefärbt.
Die alkalische Phosphatase in expremierenden Zellen (AP+) wurden über ihre Pinkfärbung identifiziert, wogegen Zellen, die ³H-Thymidin inkorporiert hatten, über die Anhäufung von Silberkörnern über ihren Nuclei identifiziert wurden. In Abwesenheit des PDGF-BB inkorporierten nur 2- 4% der Zellen ³H-Thymidin und diese Prozentzahlen wurden durch die Zugabe von 1α,25-Dihydroxycholecalciferol nicht beeinflußt. Die Zugabe von PDGF-BB steigerte den Prozentualgehalt der Zellen, die ³H-Thymidin inkorporiert hatten, um etwa das zehnfache. Sowohl AP+- als auch AP- Zellen sprachen auf PDGF-BB an. Die Prozentzahl der AP+-Zellen, die ³H- Thymidin als Antwort auf PDGF in Anwesenheit oder Abwesenheit von 1α, 25-Dihydroxycholecalciferol inkorporiert hatten, wurde berechnet. Ähnliche Berechnungen wurden für die AP--Zellen durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Die Zugabe von 1α,25- Dihydroxycholecalciferol steigert die Anzahl von AP+-Zellen, die Thymidin inkorporiert hatten, um nahezu das zweifache, wogegen ein mäßigerer Einstieg für die AP--Zellen beobachtet wurde. Diese Ergebnisse belegen, daß die Osteoblasten in der Kultur, wie über ihre Expression der AP identifiziert, eine synergistische Antwort auf 1α,25-Dihydroxycholecalciferol und PDGF-BB zeigen. Auch bei der Identität der AP--Zellen, die eine synergistische Antwort auf 1α,25-Dihydroxycholecalciferol und PDGF-BB zeigen, kann es sich um Osteoblasten handeln oder auch nicht, da Osteoblasten nicht in allen Stadien ihrer Differenzierung AP expremieren.

Beispiel IX

Von Vitamin D ist bekannt, daß dieses ein potenter Stimulator der Knochenresporption ist, wenn es zu einem in vitro Schädeldachtest bzw. Kalotten zugesetzt wird; und für PDGF ist gezeigt worden, daß es eine mäßige knochenresorbierende Wirkung in diesem Test hat. Da die Knochenresporption eine Kontraindikation für die Stimulation der Knochenbildung darstellt, erfolgte eine Bewertung, der Wechselwirkung von PDGF und Vitamin D in einem Test auf die Knochenresporption.
Schädel, die die Parietalknochen mit der Sagitalspalte einschlossen, wurden von vier Tage alten CD-1-Mäusen (Charles River Laboratories, San Diego, CA) gesammelt. Die Knochen wurden in Petrischalen mit sechs Vertiefungen (American Science Products, McGraw Park, IL) mit 1 ml Wachstumsmedium (DMEM, 0,29 mg/ml L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat und 15% hitzeinaktiviertem Pferdeserum (HIHS)) eingebracht und bei 35ºC in 5% CO&sub2; unter leichtem Schütteln für 24 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Medium aus den Vertiefungen entfernt und durch 1,5 ml Wachstumsmedium, enthaltend entweder 200 ng/ml PDGF-BB, 108 M 1α,25-Dihydroxycholecalciferol oder sowohl PDGF als auch Vitamin D, ersetzt. Fünf Knochen befanden sich in jeder Probengruppe und die Gruppen wurden unter Schütteln bei 37ºC, 5% CO&sub2;, für 72 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Medium aus den Vertiefungen entfernt und auf Ca&spplus;&spplus;- Level unter Verwendung eines NOVA-7 Gesamtcalciumanalysators (Nova Biomedical, Waltham, MA) gemäß den Angaben des Herstellers analysiert. Zusätzlich zu den Probenmedien wurde das Medium aus der 24-Stunden- Inkubation analysiert, um sicherzustellen, daß keiner der Knochen während des Sammlungsprozesses beschädigt worden war. Beschädigte Knochen setzen hohe Mengen an Calcium in das Medium frei und wurden für die Endanalysen nicht verwendet.
Die Ergebnisse, wie in Fig. 7 gezeigt, zeigen, daß sowohl PDGF als auch 1α,25-Dihydroxycholecalciferol die Knochenresorption stimulierten, wenn sie separat zu Schädeln zugesetzt wurden. Wenn jedoch PDGF und 1α,25-Dihydroxycholecalciferol in Kombination zugesetzt wurden, waren die Maße der Ca&spplus;&spplus;-Freisetzung aufgrund der Knochenresporption, die mit Vitamin D zu sehen waren, reduziert, was eine inhibitorische Wirkung des PDGF anzeigt.

Beispiel X

Um die Fähigkeit von PDFG und Vitamin D zu testen, synergistisch das. Knocheneinwachstum in ein poröses Hydroxylapetitimplantat zu steigern, wurden zylindrische Implantate von 25 mm Länge und 4 mm Nominaldurchmesser aus Hydroxylapetitmaterial (Interpore, Irvine, CA) mit einer Porengröße von 190-230 um hergestellt. Die Zylinder wiesen einen unterschnittenen Bereich auf, 10 mm und 3 mm im Durchmesser. Die Implantate wurden durch Eintauchen des Implantats in eine Lösung aus PDGF mit PDGF beladen, was zu Dosen im Bereich von 0,5 bis 50 ng/Implantat führte. Das Vitamin D wird lokal unter Verwendung einer ALZET-Minipumpe (Alza Corporation) verabreicht und führt zu Dosen des Vitamins D von 10-100 ng/Implantat. Das Dosisverhältnis von PDGF zu Vitamin D beträgt 1 : 6. Trägerbeladene Implantate wurden als Kontrollen eingesetzt.
Vierundzwanzig bezüglich des Skeletts ausgereifte Neuseeland-Weißkaninchen mit einem mittleren Gewicht von 3,5 kg wurden in der Untersuchung eingesetzt. Die Anästhesie erfolgte durch Injektion von 5,0 mg/kg von Xylazin und 35,0 mg/kg Ketamin bei halber Dosierung in jeden Paraspinosusmuskel. Die Tiere werden anschließend intubiert und die Betäubung bzw. Anästhesie unter Verwendung von Halothangas aufrechterhalten.
Die Intramedullarimplantate werden unter Anwendung eines Distalansatzes insertiert (Anderson et al., J. Orthop. Res. 10 : 588-595, 1992). Ein 2,5 cm langer lateraler Parapatellareinschnitt wurde vorgenommen, der entlang der Lateralkante der Patellarsehne in das Knie eindringt. Die Patella wird bei ausgestrecktem Bein medial disloziert. Eine 4,0 mm Bohrung wird direkt proximal zwischen den femoralen Condylen eingeführt. Sobald diese durch das artikuläre Knorpelgewebe und den metaphysealen Knochen durchreicht, wird das Loch zur Bestätigung der intramedulären Position sondiert. Das Implantat wird eingefügt und proximal in seine Endposition geschoben. Zum Verstopfen des distalen Eintrittslochs wird Knochenwachs benutzt. Die Wunde wird in Schichten mit 4-0-absorbierbarem Verbandmaterial und Nahtmaterial aus rostfreiem Stahl geschlossen.
Die Analysen erfolgen histologisch und biomechanisch. Querschnitte werden so ausgeführt, daß 3,5 mm lange Femorknochenproben mit Implantaten so erhalten werden, daß die folgenden Bereiche untersucht werden können: in der Nachbarschaft der trabekularen Region des proximalen Femurs, in der Aussparungsstelle und in der Nachbarschaft zum endostealen Cortex des mittproximalen Teils des Femurs. Für jede Stelle wird die Probe zweigeteilt, wobei eine für die Histologie und die andere für die biomechanischen Untersuchungen verwendet wird. Jede experimentelle Stelle wird mit Vehikel beladenen Kontrollen aus dem gegenlateralen Femur verglichen.
Histologische Proben werden in phosphatgepuffertem Formalin fixiert und in ansteigenden Serien von Alkohol (EtOH) dehydriert: 95% EtOH für 24 Stunden, gefolgt von dreimaligem Wechsel in 100% Ethanol für 24 Stunden jeweils. Nach der letzten 100%-Ethanol-Behandlung werden die Proben durch zweimaliges Wechseln von Xylol für je 24 Stunden geklärt. Eine Gewebeinfiltration für das Einbetten in Kunststoff wird durchgeführt. Die Proben werden für die transversale Sektionierung in Plastikstäben orientiert und in Methacrylatkunststoff bei Raumtemperatur in einem Vakuumtrockner unter Stickstoffatmosphäre eingebettet, wie in Bain et al. offenbart (Stain Technol., 65(49): 159, 1990). Aus jeder Probenentnahmestelle werden 150 um Abschnitte unter Verwendung einer Diamantscheibensäge mit niedriger Geschwindigkeit (Struers Accutom-2, Torrance, CA) hergestellt. Dicke Abschnitte werden anschließend auf etwa 30 um zwischen zwei Glasträgern handgemahlen, die mit 1200 Grit- Emery-Tuch bedeckt waren. Gemahlene Abschnitte werden mit Immuno-Mount (Shandon, Pittsburgh, PA) auf Glasträgern befestigt.
Die Flächeneigenschaften für das Knocheneinwachsen in das Implantat und dynamische Anzeichen der Knochenbildung werden unter Verwendung des Bioquant Bone Morphemetry Program (Bioquant-Knochenmorphometrie-Programm) (Biometrics, Inc., Nashville, TN) mit Interface über eine Camera lucida mit einer Olympus BH-2 Licht/Epifluoreszenz-Mikroskop (Scientific Instruments, Inc., Redmond, WA) ermittelt. Das gesamte Knocheneinwachstum in das Implantat wird unter dem Fluoreszenzmikroskop bei 40- facher Vergrößerung gemessen. Die Parameter der Mineralablagerung und der Knochenbildung werden aus in vivo Fluorochrom-Markern bei 100- facher Vergrößerung ermittelt. Die mittleren Abstände zwischen den Marken an den Implantatflächen werden durch die Zeitspannen zwischen den Markern geteilt, um die Mineralablagerungsgeschwindigkeiten zu berechnen. Gesamtknochenbildungsgeschwindigkeiten werden durch Aufspüren der Flächen von neu geformtem Knochen (das heißt dem Knochen, an den Fluorochromlabel gebunden wird) und Teilen der insgesamt neuen Knochenfläche durch die Interlabelzeit ermittelt.
Das Knocheneinwachstum wird mechanisch unter Verwendung eines Pushout-Tests bewertet. Die zu testenden Proben werden auf einem Instron- Testgerät befestigt und eine konstante Kraft von 0,5 mm/Sekunde auf die Mitte des Implantats aufgebracht. Die Kraft, die erforderlich ist, die Implantate herauszupressen, wird unter Verwendung biomechanischer Testverfahren, die dem Fachmann wohlbekannt sind, ermittelt, wie in Knowles et al. (Biomaterials, 13(8): 491-496, 1992) offenbart.

Beispiel XI

Die Fähigkeit von PDGF-BB und Vitamin D, die periosteale Knochenbildung in neonatalen Rattenfemuren und in Calvarien bzw. Schädeln von 5 Wochen alten Mäusen zu stimulieren, wird unter Verwendung von PDGF, Vitamin D oder einer Kombination von PDGF und Vitamin D getestet. Für das Testen in Femuren war der eingesetzte Dosisbereich von PDGF 2 bis 200 ng pro Tag. Der eingesetzte Dosisbereich für Vitamin D betrug 20 ng bis 2 ug pro Tag. Die Verbindungen werden in das Periosteum am mittelvorderen Aspekt des linken Femurs in neugeborenen Ratten (2-3 Tage alt) für 10 aufeinanderfolgende Tage injiziert. Der kontralaterale Femur dient als Trägerkontrolle. Die Knochen werden für die Histomorphometrie durch eine intraperitoneale Injektion von Tetracyclin (10 mg/kg) am Tag 5 und intraperitoneale Calceininjektionen (10 mg/kg) an den Tagen 17 und 22 markiert. Acht Ratten werden für jede Behandlungsgruppe eingesetzt. Am 24. Tag werden die Tiere euthanasiert und beide Femuren entfernt und für die nicht entcalcifizierte Knochen-Histomorphometrie bearbeitet.
Die Untersuchung der Knochenbildung in Schädeln wird durch Injizieren von PDGF, Vitamin D oder einer Kombination von PDGF und Vitamin D subkutan in das Periostealgewebe über der Sagittalspalte ausgeführt. Die Injektionen werden 10 Tage lang einmal pro Tag vorgenommen. Der eingesetzte Dosisbereich für PDGF liegt bei 2 bis 200 ng pro Tag. Der eingesetzte Dosisbereich für Vitamin D liegt bei 20 ng bis 2 ug pro Tag. Die Knochenneubildung wird zu Meßzwecken durch intraperitoneale Injektion von Tetracyclin am ersten Tag und intraperitoneale Injektionen mit Calcein an den Tagen 18 und 25 markiert. Die Mäuse werden am 28. Tage getötet und die Calvarien gesammelt und für histologische Bewertungen verarbeitet.

Claims

1. Pharmazeutische Zubereitung, umfassend eine synergistische Kombination von Plättchenwachtumsfaktoren (PDGF) und Vitamin D in einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

2. Pharmazeutische Zubereitung gemäß Anspruch 1, in der das Vitamin D 9,10- Secocholesta-5,7,10[19]-trien-3-ol oder 1α,25-Dihydroxycholecalciferol ist.

3. Pharmazeutische Zubereitung gemäß Anspruch 1 oder 2, in der die Konzentration des PDGF in der Zubereitung 10 ug/ml bis 500 ug/ml ist.

4. Pharmazeutische Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, in der das Verhältnis PDGF: Vitamin D von 6 : 1 bis 6 : 500 ist.

5. Pharmazeutische Zubereitung gemäß Anspruch 4, in der das Verhältnis PDGF Vitamin von 6 : 10 bis 6 : 100 ist.

6. Pharmazeutische Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, in der die Zubereitung im wesentlichen frei von der PDGF-A-Kette ist.

7. Pharmazeutische Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Stimulierung des Knochenwachstums eines Patienten.

8. Pharmazeutische Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 zur in-vivo-Stimulierung von Osteoblastenzellen.

9. Pharmazeutische Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 zur in-vitro- Stimulierung von Osteoblastenzellen.

10. Verwendung des Plättchenwachstumsfaktors in einer synergistischen Kombination mit Vitamin D für die Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung des Wachstums von Osteoblastenzellen.

11. Verwendung gemäß Anspruch 10, wobei die Zubereitung im wesentlichen frei von der PDGF-A-Kette ist.

12. Verwendung gemäß Anspruch 10 oder 11, wobei die Zubereitung rekombinantes PDGF-BB umfaßt.

13. Verwendung nach Anspruch 10, 11 oder 12, wobei die Zubereitung zur Stimulierung des in-vitro-Wachstums von Osteoblastenzellen dient.

14. Verwendung gemäß Anspruch 13, wobei die Konzentration von PDGF in der Zubereitung 1 ng/ml bis 100 ng/ml beträgt.

15. Verwendung gemäß Anspruch 13, wobei die Konzentration von PDGF in der Zubereitung 5 ng/ml bis 40 ng/ml beträgt.

16. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 110 bis 15, wobei das Verhältnis PDGF Vitamin D in der Zubereitung 6 : 1 bis 6 : 500 beträgt.

17. Verwendung gemäß Anspruch 16, wobei das Verhältnis PDGF: Vitamin D in der Zubereitung 6 : 10 bis 6 : 100 beträgt.

18. Verwendung von PDGF in einer synergistischen Kombination mit Vitamin D zur Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung des Knochenwachstums in einem Patienten.

19. Verwendung gemäß Anspruch 18, wobei das Vitamin D 9,10-Secocholesta- 5,7,10[19]-trien-3-ol oder 1α,25-Dihydroxycholecalciferol ist.

20. Verwendung gemäß Anspruch 18 oder 19, wobei die Zubereitung zur lokalen Anwendung für eine Wunde oder Defekt eines Knochen bestimmt ist.

21. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei das Verhältnis PDGF Vitamin D in der Zubereitung 6 : 1 bis 6 : 500 beträgt.

22. Verwendung gemäß Anspruch 21, wobei das Verhältnis PDGF: Vitamin D in der Zubereitung 6 : 10 bis 6 : 100 beträgt.

23. Verfahren zur Stimulierung des Wachstums von Osteoblastenzellen, bei dem die Zellen in Gegenwart einer Zubereitung, umfassend eine synergistische Kombination von PDGF und Vitamin D, kultiviert werden und die Zubereitung im wesentlichen frei ist von der A-Kette des PDGF.