JPH08508499A - Ｐｄｇｆおよびビタミンｄを含有する骨芽細胞の成長を刺激する組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 骨芽細胞の成長を刺激する方法および組成物を開示する。血小板誘導成長因子およびビタミンＤを含んでなる組成物は、骨芽細胞の成長を剌激するために十分な量で骨芽細胞に適用される。本発明の方法はｉｎ ｖｉｔｒｏで骨芽細胞の成長を促進するために、あるいはｉｎ ｖｉｖｏで骨の欠陥の治癒を促進するために使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 ＰＤＧＦおよびビタミンＤを含有する骨芽細胞の成長を剌激する組成物 発明の背景 骨の改造は組織の質量および骨格の構築を維持する動力学的方法である。この 方法は骨の吸収と骨の形成との間の釣り合いであり、２つの細胞の型は主要な演 技者であると考えられる。これらの細胞は溶骨細胞および骨芽細胞である。骨芽 細胞は新しい骨を合成しそして、溶骨細胞が掘った空洞の中に新しい骨を沈積す る。骨芽細胞および溶骨細胞の活性は、成長因子を包含する、系統的および局所 的な、多数の因子により調節される。 骨の恒常性に閏係すると信じられる遣伝暗号の１つは、血小板誘導成長因子（ ＰＤＧＦ）である。生物学的に活性なＰＤＧＦは成分ＡおよびＢ鎖のホモダイマ ーおよびヘテロダイマーである。ｉｎｖｉｔｒｏの研究はＰＤＧＦが骨芽細胞の ために有糸分裂誘発因子であることを示した（Ａｄｂｅｎｎａｇｙら、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒｎａｔ．Ｒｅｐ． １６（３）：２３５−２４７、１９ ９２）。ＰＤＧＦに関連する有糸分裂誘発活性ならびに走化活性は、成長因子を 正常骨芽細胞様細胞（Ｔｕｓｋａｍｏｔｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙ ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ． 、１７５（３）：７４５−７４７、１９９１）および一 次骨芽細胞培養物（Ｃｅｎｔｒｅｌｌａら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１２５、（１） ：１３-１９、１９８９）に添加したとき、証明された。最近の研究は、 骨芽細胞がＰＤＧＦのＡＡイソ形態を生産することを証明した（Ｚｈａｎｇら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ． 、２６１：ｃ３４８−３ ５４、１９９１）。ＰＤＧＦが骨芽細胞の成長に影響を与える正確なモードはま だ明瞭に理解されていないが、成長因子が正常の骨格の改造および骨折の修復の 両方の調節において重要な役割を演ずるいうコンセンサスが存在するように思わ れる。 ＰＤＧＦのための治療的応用は、例えば、治癒するために骨芽細胞の増殖を必 要とする損傷、例えば、骨折の処理を包含する。間充織細胞の増殖の刺激および 膜内骨の合成は、骨折の修復の面として示された（Ｊｏｙｃｅら、３６ｔｈ Ａ ｎｎｔｌａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ， Ｏｒｔｈｐａｅｄｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｆｅｂｒｕａｒｙ ５−８、１９９０。ルイジアナ州ニューオ ルレアンス）。 ビタミンＤは伝統的にくる病、すなわち、不適切な骨の無機質化の病気、の予 防のために必須であると考えられてきている。この重要性は、、カルシウムの胃 腸の吸収の促進におけるビタミンＤの役割および骨の恒常性のための血清カルシ ウムのレベルの重要性に間連する。最近の証拠は骨芽細胞がビタミンＤ代謝物１ α，２５−ジヒドロキシコレカリフェロールのためのレセプターであることを示 唆し、骨芽細胞がホルモンのための主要な標的であることを示す（Ｓｕｄａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． 、４９：５３−５８、１９９２）。ビタミンＤ は骨芽細胞仲介吸収の骨芽細胞による活性化において重要な部分を演ずると信じ られる（Ｗａｔｒｏｕｓら、Ｓｅｍ． ｉｎ Ａｒｔｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈ ｅｕｍ． 、１９（１）：４５−６５、１９８９）。ビタミンＤは骨芽細胞のｉｎ vｉｔｒｏ培養において使用されてきており（Ｋｕｒｉｈａｒａら、Ｅｎｄｏ ｃｒｉｎｏｌ． 、１１８（３）：９４０−９４７、１９８６）そしてアルカリ性 ホスファターゼ、すなわち、骨芽細胞の表現型への細胞の分化のマーカー、の増 加に関連づけられた。しかしな がら、ヒトの骨の細胞において、アルカリ性ホスファターゼの剌激は細胞の分化 の滅少に関連づけられた（Ｈｕｆｆｅｒ、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．、５９（ ４） ：４１８−４４２、１９８８）。頭蓋冠の培養において、ビタミンＤの添加 は培地の中へのカルシウムの放出を増加し、そして骨の吸収活性に相関関係づけ られた（Ｂｅｌｌ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、７６：１−６、１９８５） 。オステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）、すなわち、骨芽細胞のマーカ ー、の発現はビタミンＤの誘発を必要とする（Ｙｏｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７ ：８５２１−８５２６、１９８８）。骨の恒常性におけるビタミンＤの正確 な役割およびそれが骨芽細胞および溶骨細胞に作用する方法は明らかにすべきま まである。 骨の治癒および再生のプロセスにおいて骨芽細胞は重要な役割を有するので、 これらの細胞の増殖を増強する能力は望ましい目的に止まる。本発明は、次の詳 細な説明および添付図面から明らかなように、この能力および他の有利を提供す る。 発明の要約 本発明は、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）を含んでなる組成物の適用により 、骨芽細胞の成長を剌激する方法に関する。１つの態様内で、組成物はＰＤＧＦ のＡ鎖を本質的に含まない。関係する態様内で、組成物は組換えＰＤＧＦ−ＢＢ を含む。他の態様内で、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで成長させる。 本発明の他の面は、ＰＤＧＦおよびビタミンＤを含んでなる組成物の有効量を 患者に投与することからなる、患者における骨の成長を剌激する方法を提供する 。ある種の好ましい態様内で、ビタミンＤは９，１０−セココレスタ−５，７， １０［１９］−トリエン−３−オールまたは１α，２５−ジヒドロキシコレカル シフェロール である。 他の面内で、本発明は、ＰＤＧＦおよびビタミンＤを含んでなる組成物の有効 量の存在下に特に骨芽細胞を培養することからなり、前記組成物はＰＤＧＦのＡ 鎖を本質的に含まない、骨芽細胞の成長を剌激する方法を提供する。 本発明のこれらおよび他の面は、次の詳細な説明および添付図面を参照すると 明らかとなるであろう。 図面の簡単な説明 第１図は、ビタミンＤが骨芽細胞における³Ｈ−チミジンの吸収のＰＤＧＦ− ＢＢの剌激を増加することを図解する。 第２図は、有糸分裂誘発の２倍の増加を観察するためには、ＰＤＧＦおよびビ タミンＤの両方が同時に存在しなくてはならないことを図解する。 第３図は、ＰＤＧＦおよびビタミンＤの相乗効果がビタミンＤの濃度とともに 変化することを図解する。 第４図は、塩基性ＦＧＦおよびビタミンＤを使用するとき、、相乗効果が存在 しないことを図解する。 第５図は、ビタミンＤがスイス（Ｓｗｉｓｓ）３Ｔ３線維芽のＰＤＧＦ誘発の 有糸分裂誘発に影響を与えることを図解する。 第６図は、マウス骨芽細胞系、ＭＣ３Ｔ３のためのビタミンＤの不存在下にお けるよりビタミンＤの存在において、ＰＤＧＦがより大きい倍数で誘発すること を図解する。 第７図は、別々の頭蓋冠の培養物に添加するとき、ＰＤＧＦおよびビタミンＤ は骨の吸収を剌激するが、一緒に頭蓋冠の培養物に添加したＰＤＧＦおよびビタ ミンＤは骨の吸収の減少を示すことを図解する。 発明の詳細な説明 本発明は、ＰＤＧＦおよびビタミンＤが骨芽細胞の成長に対して相乗効果を示 すという本発明者らによる発見に一部分基づく。さらに、本発明者らはＰＤＧＦ がビタミンＤ誘発の骨の吸収を抑制できることを発見した。前述したように、骨 芽細胞は一般に骨の形成および骨の恒常性において主要な役割を演ずる。本発明 の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養およびｉｎ ｖｉｖｏで（例えば、骨折 の修復において）骨芽細胞の成長を刺激し、これにより治癒を促進するために有 用である。 本発明の関係内で、ＰＤＧＦはＰＤＧＦのＡＡ、ＢＢ、およびＡＢイソ型を、 個々にまたは組み合わせで、ならびにそれらの生物学的に活性な類似体を包含す ることが理解されるであろう。さらに、ＰＤＧＦのＢＢイソ型はそのウイルスの 相同体（ｖ−ｓｉｓ遣伝子産生物）を包含することが理解される。ＰＤＧＦは天 然源または組み換え源から得ることができる。組み換えＰＤＧＦおよびＰＤＧＦ の類似体を製造する方法は、米国特許第４，７６９，３２２号：米国特許第４， ８０１，５４２号；および米国特許第４，７６６，０７３号および欧州特許（Ｅ Ｐ）第２８２，３１７号（これらの全体をここに引用によって加える）に記載さ れている。ＰＤＧＦは、また、細菌の中で生成することができる（参照、Ｔａｃ ｋｎｅｙら、ＷＯ第９０／０４０３５号）。天然源からＰＤＧＦを精製する方法 は、ＲａｉｎｅｓおよびＲｏｓｓ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５７：５１５ ４−５１６０、１９８２）、Ｈａｒｔら（Ｂｊｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９：１ ６６−１７２、１９９０）、および米国特許第４，４７９，８９６号に記載され ている。 前述の発行された特許のあるものに論じられているように、組み換えＰＤＧＦ を発現する真核細胞の分泌経路を利用することによっ て、生物学的に活性な物質を直接得ることができる。真核細胞からの適当な遣伝 子産生物の発現および分泌は適切なプロセシングおよびアセンブリーを可能とし 、天然の生物学的に活性なコンフォメーションをもつ分子を生ずる。適当な転写 プロモーターおよび分泌シグナルの配列を利用するかぎり、一般に真核細胞は本 発明の範囲内の使用のために生物学的に活性な形態でＰＤＧＦを発現しかつ分泌 することができる。別法において、ＰＤＧＦのポリペプチド鎮を原核細胞中で発 現させ、単離し、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏで組立てて生物学的に活性な分子を生 成する。 酵母中のＰＤＧＦの発現のために、ＤＮＡ配列（例えば、ＰＤＧＦのＡ鎖およ びＰＤＧＦのＢ鎖）をエンコードするＤＮＡ配列を適当なプロモーターおよび分 泌シグナルの配列に結合する。酵母において利用できるプロモーターは、酵母の アルファ−因子（ＭＦα１）プロモーターおよび酵母トリオースホスフェート・ イソメラーゼ（ＴＰＩ１）プロモーター（米国特許第４，５５９，３１１号）を 包含する。プロモーターは、また、他の酵母遣伝子、例えば、アルコールデヒド ロゲナーゼＩ（ＡＤＨ１）またはアルコールデビドロゲナーゼ２（ＡＤＨ２）か ら得ることができる。また、他の真核生物種のための適当なプロモーターは使用 可能であり、そして当業者において明らかである。ＰＤＧＦ遣伝子産生物の分泌 は、酵母交配フェロモンのアルファ−因子のｐｒｅｐｒｏ分泌シグナル配列（Ｋ ｕｒｉｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、Ｃｅｌｌ、３０：９３３、１９８２ ；Ｊｌｉｕｓら、Ｃｅｌｌ、３６：３０９、１９８４；およびＢｒａｋｅら、Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 、８１：４６４２、１９８４）、 または酵母ＢＡＲ１遣伝子リーダーおよび第３ドメイン配列（参照、米国特許第 ５，０３７，７４３号）の使用により達成できるが、他の配列シグナル使用でき る。 ｍＲＮＡの効率よい転写停止およびポリアデニル化を保証するために、酵母ター ミネーター配列、例えば、トリオースホスフェートイソメラーゼターミネーター を添加することができる（ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａ ｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ． 、１：４１９、１９８２）。ＤＮＡ断片の結合方法は詳細 に記載されており（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）そして当業者の 水準の範囲内に十分に入る。発現単位構成体の調製後、それらを適当な発現ベク ターの中に挿入する。 培養単位につきいっそう多い生物学的活性を生成するために、宿主細胞内で安 定に維持される発現ベクターを使用することが好ましい。これに関して適当な酵 母の発現ベクターはプラスミドｐＣＰＯＴ（ＡＴＣＣ ３９６８５）およびｐＭ ＰＯＴ２（ＡＴＣＣ ６７７８８）であり、これらは解糖酵素のトリオースホス フェートイソメラーゼをエンコードするシゾサッカラロミセス・ポンベ（Ｓｃｈ ｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ） の遣伝子（ＰＯＴ１遣伝子） を包含する。遣伝子の含有は、米国特許第４，９３１，３７３号（これをここに 引用によって加える）に開示されているように、宿主細胞中の遺伝子の欠失を相 補するその能力のために、ＴＰＩ遣伝子の欠失を有する宿主細胞の中のプラスミ ドの安定な維持を保証する。 ＰＯＴ１選択可能なマーカーおよび、例えば、ＴＰＩ１プロモーター、ＢＡＲ １ リーダーおよび第３ドメインの配列、ＰＤＧＦをエンコードする適当なＤＮＡ 配列、およびＴＰＩ１ターミネーターからなる発現単位を取り込んだＤＮＡ構成 体の調製後、構成体はＴＰＩ１遣伝子の欠失をもつ酵母宿主の中に形質転換する 。酵母を形質 転換する手順はよく知られており、そして文献に記載されてきている。 形質転換された酵母細胞は、ＰＯＴ１遣伝子を選択可能なマーカーとして利用 するとき、グルコースを含有する普通の複合培地上で成長させることによって選 択することができる。普通の培地、例えば、ＹＥＰＤ（２０ｇのグルコース、２ ０ｇのバクト−ペプトン、１０ｇの酵母エキス／ｌ）を使用することができる。 いったん選択されると、適当な発現構成体を含有する形質転換体を普通の複合培 地上で定常期に成長させ、細胞を遠心または濾過により除去し、そして培地を濃 縮する。ＰＤＧＦは高度にカチオン性および疎水性のタンパク質である（Ｒａｉ ｎｅｓおよびＲｏｓｓ、前掲；Ａｎｔｏｎｉａｄｅｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 、７８：７３１４、１９８１；Ｄｅｕｅｌら、Ｊ．Ｂｉ ｏｌ．Ｃｈｅｍ． 、２５６：８８９６、１９８１）ので、組み換えＰＤＧＦは同 様にその精製においてイオン交換クロマトグラフィーの使用を可能とする特性を 有する。例えば、酵母発酵ブロス中の組み換えＰＤＧＦ−ＢＢを細胞から分離し 、そしてカチオン交換クロマトグラフィーにより分画する。カラムから脱着され たＰＤＧＦ−ＢＢを酸性化し、そしてバッチの条件下に逆相クロマトグラフィー によりさらに分画する。ＰＤＧＦを含有する流出液を酸性化し、そして強いカチ オン交換カラムに通過させ、そしてＮａＣｌ段階の勾配で溶離する。流出液を集 め、そしてＰＤＧＦ−ＢＢを（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄で沈澱させる。生ずる物質をゲル 濾過により脱塩し、そして電荷に従い分離する。流出液を酸性化し、そして強い カチオン交換カラムに適用し、そしてｐＨ８〜１０においてＮＨ₄ＨＣＯ₃の線状 勾配で溶離する。流出液を集め、そしてＰＤＧＦ−ＢＢを（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄の添 加により沈澱させる。生ずる沈澱を酢酸中に溶解し、そしてゲ ル濾過により分画する。流出液を脱塩しそして凍結乾燥する。 酵母細胞以外の真核細胞中の生物学的に活性なタンパク質の発現は、適当な発 現／調節シグナルの使用して当業者により達成されることができる。ＰＤＧＦ配 列の発現を指令することができる転写プロモーターは、特定の真核細胞の型にお ける効率よいおよび／または調節された発現を与えるそれらの能力について選択 する。遺伝子産生物を細胞の分泌経路の中に向けることができるシグナル配列を 、宿主細胞におけるそれらの機能について選択する。他の有用な調節シグナル、 例えば、転写停止シグナル、ポリアデニル化シグナルおよび転写エンハンサー配 列の選択は、個々の当業者にとって明らかである。 組み換えＰＤＧＦは天然のＰＤＧＦと実質的に同一の生物学的活性を有するこ とが示された。ＰＤＧＦの基本的生物学的活性、特に応答性細胞の型（線維芽細 胞、骨芽細胞および平滑筋細胞を包含する）における化学走性および有糸分裂誘 発の誘発は、組織の修復におけるその役割を包含する、このタンパク質の生理学 的役割の多数の下に横たわる。 本発明の好ましい態様の範囲内で、ＰＤＧＦはＡ鎖を本質的に含まない。ＰＤ ＧＦのホモジマーのイソ形態（ＡＡおよびＢＢ）は相同性であるが、同一ではな く、そしてモノマーは１２．５〜１４．３ｋＤ（Ａ鎖）および１３〜１４ｋＤ（ Ｂ鎖）の分子量を有するが、純度はポリアクリルアミドゲル上の単一の、主要な バンドの収量により確認することができる。 本発明のある種の態様の範囲内で利用されるＰＤＧＦ組成物は好ましくは実質 的に純粋である、すなわち、それらの治療的使用を妨害する不純物または汚染物 質を一般にに含まない。毒性、抗原性、炎症性、パイロジェン性物質または他の 有害な物質を含まず、そし て９０％より大きい、好ましくは９９％より大きい純度を有する調製物は特に好 ましい。 ここにおいて使用するとき、ビタミンＤは化合物の生物学的に活性な形態およ びｉｎ ｖｉｖｏで生物学的に活性な形態に変換されうるその前駆体の両方を呼 ぶ。したがって、ビタミンＤは、なかでも、ビタミンＤ₂、ビタミンＤ₃およびそ れらの活性な代謝物を包含すると理解されるであろう。ビタミンＤ₂（９，１０ −セコエルゴスタ−５，７，１０［１９］，２２−テトラ−３−オール）はビタ ミンＤの合成形態（Ｉｎｈｏｆｆｅｎ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．、７２：８７５ 、１９６０）であり、そしてその生物学的に活性な形態は２５−ヒドロキシエル ゴカルシフェロール（Ｓｕｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． 、３５：１８２、１９６９）である。また、これらの化合物の他の代 謝可能な形態および類似体を使用することができ、これらは１−α−ヒドロキシ ビタミンＤ₃、２５−ヒドロキシビタミンＤ₃、２４，２５−ジヒドロキシビタミ ンＤ₃、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃、２５−ヒドロキシビタミンＤ₂、 １，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₂、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₂お よびこの分野において知られている他のものを包含する。好ましい化合物はビタ ミンＤ₃（９，１０−セココレスタ−５，７，１０［１９］−トリエン−３−オ ール）であり、そしてこの化合物の生物学的に活性な形態、すなわち、１α，２ ５−ジヒドロキシコレカルシフェロールは最も好ましく、それらの両方は商業的 に入手可能である。 １つの態様内で、本発明はｉｎ ｖｉｖｏで骨芽細胞の成長を剌激する働きを する。骨芽細胞が一次培養物、すなわち、細胞の型の異質集団を含有する組織か ら直接得られた培養物、から誘導されることがしばしばある。骨組織からの一次 培養物は溶骨細胞、線維芽 細胞、骨芽細胞の子孫細胞および内皮細胞を含有することができる。一次培養物 はいくつかのこの分野においてよく知られている方法により確立することができ る。例えば、粉砕しそしてコラゲナーゼの存在下にインキュベーションした胎児 頭蓋冠を使用して一次培養物を確立することができる。コラゲナーゼ消化により 解放される細胞を集めそして培養する（Ａｕｂｉｎら、Ｊ．ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂ ｉｏｌ． 、９２：４５２−４６１、１９８２）。別法は新しく分離した骨のチッ プを使用し、これらをコラゲナーゼ処理しそして洗浄し、次いで培養して骨にチ ップからの細胞の移動およびコラゲナーゼ処理後に骨芽細胞の成長について選択 する低いＣａ++の培地の使用を可能とする（Ｒｏｂｅｙら、Ｃａｌｉｆ．Ｔｉｓ ｓ． 、３７：４５３−４６０、１９８５）。一次培養物内の骨芽細胞の同定は主 として表現型である。骨芽細胞の表現型のマーカーは、アルカリ性ホスファター ゼの発現（Ｍａｎｄｕｃａら、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．、８：２８１、 １９９３）、１型コラーゲンの合成（Ｋｕｒｉｈａｒａら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ ｌ． 、１１８（３）：９４０−９４７、１９８６）、オステオカルシンの産生（ Ｙｏｏｎら、前掲）および副甲状腺ホルモンに対する応答（Ａｕｂｉｎら、前掲 ）を包含する。骨芽細胞は典型的には３７℃において５％ＣＯ₂中で増殖培地の 中で培養し、ここで増殖培地は炭酸源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、ミネ ラルおよび一般に胎児仔ウシ血清により供給される成長因子を含む。種々の適当 な培地はこの分野において知られている。 本発明は、また、確立された骨芽細胞系の成長を剌激するために使用できる。 このような細胞系の例は次のものを包含ずる：Ｓａｏｓ−２、ヒト一次骨原性肉 腫（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＴＢ ８５）；Ｕ−２ ＯＳ、ヒト一次骨原性肉腫（Ａ ＴＣＣ Ｎｏ．ＨＴＢ ９ ６４）；ＨＯＳ（ＴＥ８５）、ヒト骨肉腫（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ １４２７ ）およびＵＭＲ １０６、ラット骨肉腫（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ １６６１）。 本発明の他の態様において、ＰＤＧＦおよびビタミンＤを含んでなる組成物を 治療薬として使用して骨芽細胞仲介の骨の形成を増強する。本発明の方法は骨の 欠陥および欠損、例えば、閉鎖骨折、解放骨折および非結合骨折において起こる もの、の修復を促進するために；形成外科における骨の治癒を促進するために； 非セメント人工関節および歯の移植片の中への骨の内部成長を刺激するために； 歯周の病気および欠陥の処置において；伸延骨形成の間の骨の形成を増加するた めに；および骨芽細胞の活性の剌激により処置できる他の骨格の疾患、例えば、 オステオポローシスおよび関節炎の処置において；適用することができる。 本発明の組成物は局所的または全身的に投与できる。局所的投与は、障害また は欠陥の部位における注射によるか、あるいはその部位における固体担体の挿入 または取り付けによるか、あるいは粘性液体の直接の、局所的適用によることが できる。 生物学的に活性なＰＤＧＦおよびビタミンＤの創傷部位への送り出しは、調節 して解放される組成物、例えば、係属中の米国特許出願第０７／８７１，２４６ 号（ＷＩＰＯ公開ＷＯ第９３／２０８５９号）（この全体をここに引用によって 加える）に記載されている組成物の使用により増強することができる。簡単に述 べると、ＰＤＧＦを含有する生物分解性フィルム、例えば、ポリ酢酸、ポリグリ コール酸、ポリジオキサノンまたはポリ酢酸／ポリグリコール酸のコポリマーの フィルムを製造しそして取り付けのためにピン、プレート、ネジなどに製作する か、あるいは骨の中に挿入する。これらの組成物は標的部位においてＰＤＧＦを 持続的に放出する。５０： ５０のＰＬＡ：ＰＧＡフィルムが好ましい。これらのフィルムはさらに担体、例 えば、アルブミン、ポリオキシエチレンソルビタンの洗浄剤またはグルタミン酸 を含むことができる。アルブミンを含有させるとき、ＰＤＧＦ／アルブミンの比 は、一般に、０．１２５〜２．５μｇ／ｍｌの間に維持されるであろう。原理的 には、ポリマーの分解を増強する物質はフィルムの中に孔をつくるか、あるいは フィルムへの１または２以上の成長因子の吸収を減少する物質を担体として使用 できる。アルブミンは特に好ましい担体である。担体として有用であるポリオキ シエチレンソルビタンの洗浄剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエー ト、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビ タンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレートおよび ポリオキシエチレンソルビタントリオレエートを包含する。 この型のフィルムは人工装置および外科用移植片のためのコーティングとして 特に有用である。フィルムは、例えば、外科用ネジ、ロッド、ピン、プレートな どの外表面の回りに巻き付けることができる。この型の移植可能な装置を整形外 科において日常的に使用される。フィルムは、また、骨充填物質、例えば、ヒド ロキシアパタイトのブロック、脱ミネラル化骨マトリックスのプラグ、コラーゲ ンマトリックスなどをコーティングするために使用できる。一般に、ここに記載 するフィルムまたは装置は骨に骨折部位において骨に適用される。適用は、一般 に、標準の外科的手順を使用する骨の中への移植または表面への取り付けによる 。 コポリマー、前述の成長因子および担体に加えて、フィルムは他の活性または 不活性の成分を含むことができる。組織の成長または浸潤を促進する因子は特に 重要である。骨の成長を促進する因子、例えば、骨の形態発生タンパク質（米国 特許第４，７６１，４７１ 号；ＰＣＴ公開ＷＯ第９０／１１３６６号）、オステオゲニン（Ｓａｍｐａｔｈ ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７１０９−７１１ ３、１９８７）およびＮａＦ（Ｔｅｎｃｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔ．Ｒ ｅｓ． 、２３：５７１−５８９、１９８９）は特に好ましい。 フィルムを負荷するために、ＰＤＧＦおよび担体を粉剤または液体溶液として フィルムに適用する。例えば、液化ＰＤＧＦおよびアルブミンをフィルムの１つ の表面の上に均一に分散させ、そしてフィルムを上に折り畳むことができる。別 法において、タンパク質を水溶液（例えば、リン酸塩緩衝液または０．１Ｍの酢 酸中の）として適用することができ、これらの溶液を乾燥する。 ＰＤＧＦを含有する生物分解性物質を、また、この分野において知られている 手順に従い種々の移植片に成形することができる。ピン、プレート、ブロック、 ネジなどを、骨折または他の欠陥の部位において骨の中に挿入するか、あるいは 骨に取り付けるために製作することができる。 生物分解性物質は、典型的には、０．０３７５〜１．２５μｇのＰＤＧＦ／ｍ ｇのコポリマーを含有するように配合する。 ＰＤＧＦおよび／またはビタミンＤの局所的送り出しの別法は、ＡＬＺＥＴ浸 透圧ミニポンプ（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州パロアルト）；持続 放出性マトリックス物質、例えば、Ｗａｎｇら（ＷＯ第９０／１１３６６号）に 開示されているもの；Ｂａｏら（ＷＯ第９２／０３１２５号）に開示されている ような帯電デキストランのビーズ；例えば、Ｋｓａｎｄｅｒら（Ａｎｎ．Ｓｕｒ ｇ 、．２１１（３）：２８８−２９４、１９９０）に開示されているようなコラ ーゲンに基づく送り出し系；Ｂｅｃｋら（Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．、６ （１１） ：１２５７−１２６５、１９９ １）に開示されているようなメチルセルロースゲル系およびＥｄｅｌｍａｎら（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ 、１２：６１９−６２６、１９９１）に開示されてい るようなアルギン酸塩に基づく系の使用を包含する。骨における持続局所的送り 出しのためのこの分野においてよく知られている他の方法は、含浸できる多孔質 被覆金属プロテーゼおよび治療組成物を内部に混入した固体のプラスチックロッ ドを含む。 本発明の全身的に投与される組成物の送り出しは、ＰＤＧＦおよびビタミンＤ の一方または両方をターゲッティング分子に結合することによって増強すること ができる。「ターゲッティング分子」は問題の組織に結合する分子を意味する。 例えば、骨ターゲッティング分子は、テトラサイクリン；カルセイン；ビスホス ホネート；ポリアスパラギン酸；ポリグルタミン酸；アミノホスホ糖類；骨のミ ネラル相に関連することが知られているペプチド、例えば、オステオネクチン、 骨シアロタンパク質およびオステオポンチン；骨特異的抗体；ミネラル結合ドメ インをもつタンパク質などを包含する。参照、例えば、Ｂｅｎｔｚらの開示（欧 州特許（ＥＰ）第０５１２８４４号）およびＭｕｒａｋａｍｉら（欧州特許（Ｅ Ｐ）第０３４１９６１号）。 本発明の範囲内で使用する組成物は、製剤学的に許容されうる塩類、殊に有機 酸および鉱酸の塩類を包含する酸付加塩の形態であることができる。このような 塩類の例は、有機酸、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸 、ピルビン酸、シュウ酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、 サリチル酸などを包含する。塩基性アミノ酸残基のアミノ酸配列はペプチドを当 業者によく知られている手順に従い適当な酸またはミネラルで処理することによ って調製するか、あるいは所望の塩は適当な酸を凍結 乾燥することによって直接得ることができる。これらの塩類はさらに注射可能な 調製物、局所薬および本発明の組成物の局所的または全身的デリバリーのための 水溶液において使用することができる。注射可能な調製物および局所薬の製造の ための材料および方法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 、第１７版、１９８５（この全体をここに引用によって 加える）の中に見出すことができる。 本発明の範囲内で、組成物の「有効量」は満足に有意な作用を生成する量であ る。ｉｎ ｖｉｔｒｏで骨芽細胞の成長を刺激するために使用するとき、³Ｈ− チミジンの取り込みにより測定して、ＰＤＧＦの存在およびビタミンＤの不存在 下に成長した細胞に比較して、少なくとも５０％の成長の増加を生成することが 一般に望ましい。治療的使用のために、「有効量」は骨折の修復において治癒速 度の臨床的に有意な増加、オステオポローシスにおける骨の損失の逆転、非結合 骨折における骨の形成および伸延骨形成の剌激および／または増大、人工装置の 中への骨の成長および歯の欠陥の修復の増加および／または加速を提供するため に要求されるＰＤＧＦおよびビタミンＤを含んでなる組成物の量である。このよ うな量は、一部分、処置すべき特定の状態および当業者にとって明らかな他の因 子に依存するであろう。例えば、オステオポローシスにおいて、骨の形成の増加 は処置群と対照群との間の骨の質量における統計学的に有意な差として発現され る。これは、例えば、骨の質量の１０〜２０％またはそれ以上の増加として見る ことができる。治癒における臨床的に有意な増加の他の測定は、例えば、破壊の 強さおよび張力、破壊の強さおよびねじれ、４点の曲げについての試験、および この分野においてよく知られている生物機械的試験を包含することができる。処 置の養生法のための一般的指針は、問題の疾患の動物 モデルにおいて実施する実験から得られる。 ７０ｋｇの患者の全身的処置のためにビタミンＤの好ましい投与量の範囲は、 約１ｎｇ〜１ｍｇ、好ましくは約１０ｎｇ〜約５００μｇ、そして最も好ましく は約２０ｎｇ〜１μｇである。ＰＤＧＦと組み合わせたビタミンＤの局所的適用 のためのビタミンＤについて好ましい投与量の範囲は、約１ｎｇ〜１ｍｇ、好ま しくは約５ｎｇ〜約５００μｇ、そして最も好ましくは約１０ｎｇ〜１００ｎｇ である。 ７０ｋｇの患者の全身的処置のためにＰＤＧＦの好ましい投与量の範囲は、約 １ｐｇ〜１０ｍｇ、好ましくは約１００ｐｇ〜約１ｍｇ、最も好ましくは約１０ ｎｇ〜１００μｇである。ビタミンＤと組み合わせたＰＤＧＦの局所的適用のた めの好ましい投与量の範囲は、約１ｎｇ〜１０ｍｇ、好ましくは約１μｇ〜約１ ｍｇ、そして最も好ましくは約１０μｇ〜５００ｎｇである。一般に、持続放出 性組成物は述べた範囲の上限における投与量を提供するように配合されるであろ う。投与量は放出速度に調節されるであろう。液体組成物は典型的には１〜１０ ０μｇ／ｍｌのＰＤＧＦ、好ましくは１０〜５００μｇ／ｍｌを含有するであろ う。 ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＰＤＧＦ濃度について好ましい範囲は約１ｎｇ／ｍｌ〜 １００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌそして最も好まし くは６ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌである。 ＰＤＧＦおよびビタミンＤの相乗効果は６：０．１〜６：１０００（ＰＤＧＦ ：ビタミンＤ）、好ましくは６：１〜６：５００、より好ましくは６：１０〜６ ：１００、最も好ましくは約６：４０の比でＰＤＧＦおよびビタミンＤを組み合 わせることによって最もく得られることが発見された。 前述の組成物は、処置すべき状態に依存して、１日から６カ月またはそれ以上 にわたって投与される。一般に、投与量は５回／日〜１回／月そして好ましくは １回／日〜１回／月で、治癒が実質的に完結するまで、投与されるであろう。実 際の処置の養生法は、因子、例えば、患者の年令および一般的状態、処置すべき 状態、および送り出しのルートに依存するであろう。処置の養生法の決定は当業 者のレベルの範囲内である。 本発明を次の非限定的実施例により例示する。実施例Ｉ ブタの一次骨芽細胞培養物を確立した。未成熟ブタ（ほぼ３０ポンド）の大腿 骨から小柱の骨の部分を取り出した。骨を小さいチップ、ほぼ２×２ｍｍに切断 し、そしてリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）中で室温において多数回洗浄してすべての 血液を除去した。骨をチップを、ダルベッコ培地（ＤＭＥＭ）（Ｆｒｅｄ Ｈｕ ｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、ワシント ン州シアトル）中で希釈しそして使用前に滅菌濾過した１ｍｇ／ｍｌのクロスト リジウム・ヒストリチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕ ｍ ）ＩＩ型コラゲナーゼ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、ミゾリー州セ ントルイス）の中にいれた。チップをコラゲナーゼ培地の中で３７℃において震 盪しながら２時間インキュベーションした。コラゲナーゼのインキュベーション 後、培地を除去し、そして骨のチップをＰＢＳの中に入れ、そして洗浄培地の中 に細胞がそれ以上存在しなくなるまで洗浄した。 チップを１０％の胎児仔ウシ血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ロウガ ン）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび０．２９ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミ ンを含有する低濃度のイーグル−ＭＥＭ 培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、マリイランド州ガイサーバーグ）の中に入れ、そし て３７℃および５％ＣＯ₂においてインキュベーションした。培地を４〜５日毎 に交換した。骨のチップからの骨芽細胞の移動は７〜１０日に見られた。細胞は いったんコンフルエントになったときアッセイのために直ちに使用し、次いで廃 棄した。 細胞をアルカリ性ホスファターゼの発現について試験して、骨芽細胞の表現型 を確証した。ＡＰ組織化学的染色キット（Ｓｉｇｍａ、ミゾリー州セントルイス ）を製造業者の使用説明書に従い使用して、組織化学的染色を実施した。結果は 異質一次細胞集団の３０〜７０％がアルカリ性ホスファターゼ陽性であり、そし て細胞密度の増加がＡＰ＋細胞の百分率を増加することを示した。実施例ＩＩ ブタ一次骨芽細胞（前述したように調製した）を、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ −ＢＢおよび１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロール、および１α，２ ５−ジヒドロキシコレカルシフェロール単独の存在下に相対的有糸分裂誘発活性 について試験した。有糸分裂誘発活性をＲａｉｎｅｓおよびＲｏｓｓ（Ｍｅｔｈ ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 、１０９：７４９−７７３、１９８５）の方法に基づく³ Ｈ−チミジンの取り込みの測定によりアッセイした。簡単に述べると、細胞を ３×１０⁴細胞／ｍｌの密度で９６ウェルのプレート中の１０％胎児仔ウシ血清 （ＦＣＳ）を含有するイーグルＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、マリイランド 州ガイサーバーグ）の中にプレートし、そして３〜４日間それらを成長させるこ とによって、休止一次ブタ骨芽細胞を得た。培地を除去し、そして０．１％のＦ ＣＳを含有するＤＦＣ（表１）の１８０μｌ／ウェルを添加した。ウェルの半分 はそれらに添加された１０ｎＭの１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロー ル（Ｂｉｏｍｏｌ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ、ペンシルベニア州プライモスミーティング）を有した。細胞を３７℃ において５％ＣＯ₂中で３日間インキュベーションした。１α，２５−ジヒドロ キシコレカルシフェロールをエタノール中に溶解させたので、他の組のウェルを １α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールの添加により導入したのと等し い量のエタノールを含有する対照として調製した。２０μｌの１０×ＰＤＧＦを 最終濃度が０．２〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲であるように添加した。添加したＰＤ ＧＦ−ＢＢを含まずかつ＋／−ビタミンＤ添加の陰性の対照を構成した。プレー トを３７℃において２０時間インキュベーションしそして培地を除去した。０． １％のＦＣＳおよび２μＣｉ／ｍｌの³Ｈ−チミジンを含有するＤＦＣの１００ μｌを各ウェルに添加し、そしてプレートを３７℃においてさらに３時間インキ ュベーションした。培地を吸引除去し、そして１５０μｌのトリプシンを各ウェ ルに添加した。細胞が分離するまで（少なくとも１０分）プレートを３７℃にお いてインキュベーションした。分離した細胞をＬＫＢワラック（Ｗａｌｌａｃ） １２９５−００１細胞収獲器（ＬＫＢ Ｗａｌｌａｃ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、マ リイランド州ガイサーバーグ）を使用してフィルターの中に収獲した。フィルタ ーを高周波炉中の加熱により１０分間乾燥し、そしてＬＫＢベータプレート（Ｂ ｅｔａｐｌａｔｅ）１２５０シンチレーションカウター（ＬＫＢ Ｗａｌｌａｃ ）中で供給会社が記載するように計数した。 第１図に図解する結果が示すように、ＰＤＧＦ−ＢＢは一次ブタ骨芽細胞培養 物におけるチミジンの吸収を剌激する。最大の剌激は６〜１０ｎｇ／ｍｌにおい て起こる。１０ｎＭの１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールをＰＤＧ Ｆとともに含有させると、チミジンの最大吸収は２倍となる。１α，２５−ジヒ ドロキシコレカルシフェロール単独の存在下に、成長の剌激は観察されなかった 。実施例ＩＩＩ 相乗成長効果を観察するためには１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロ ールおよびＰＤＧＦが同時に存在しなくてはならないかどうかを決定するために 、次の変更を加えて有糸分裂誘発アッセイを実施例１１に記載するように実施し た：ａ）１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールの最終濃度は１００ｎ Ｍであった；ｂ）１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールで細胞を前処 理するために使用した培地を除去しそしてＰＤＧＦの適当な希釈物 のみを含有する新鮮な培地を添加することによって、ＰＤＧＦの存在下に１α， ２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールを含まない追加の組のウェルを調製し た。 第２図に図解する結果が証明するように、有糸分裂誘発の２倍の増加を観察す るためには、ＰＤＧＦおよび１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールの 両方が存在しなくてはならない。実施例ＩＶ 一次ブタ骨芽細胞上のＰＤＧＦ誘発有糸分裂誘発への１α，２５−ジヒドロキ シコレカルシフェロールの効果が投与量依存性であるかどうかを決定するために 、次の変更を加えてアッセイを実施例ＩＩに記載するように実施した：ａ）１α ，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールの濃度は０．０１ｎＭ〜１００ｎＭ の範囲でありそしてｂ）ＰＤＧＦは６．２ｎｇ／ｍｌの単一濃度で存在した。第 ３図に図解する結果が証明するように、ＰＤＧＦおよび１α，２５−ジヒドロキ シコレカルシフェロールの相乗効果は１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェ ロールの濃度とともに変化する。実施例Ｖ ビタミンＤを使用して見られる効果がＰＤＧＦについて特異的であるかどうか 決定するために、ビタミンＤを塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）と組み合わ せて試験した。ヒト組み換え塩基性ＦＧＦ（ＢＲ−ＧＩＢＣＯ）を、実施例１１ に記載する有糸分裂誘発アッセイにおいて、０．４ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍ ｌの濃度範囲で試験した。第４図に図解する結果が示すように、塩基性ＦＧＦお よび１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールを使用するとき、効果は存 在しない。実施例ＶＩ 線維芽細胞、すなわち、骨からの一次培養物中の潜在的汚染細胞 型が、ＰＤＧＦおよび１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールを使用し て見られた相乗効果の原因となるかどうかを決定するために、アッセイを実施し た。マウス線維芽細胞の細胞系スイス３Ｔ３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ９２）を 使用して、線維芽細胞を１０％のＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で３×１０⁴細胞 ／ｍｌの密度でプレートした以外、実施例１１に記載するようにアッセイを実施 した。第５図に図解する結果が証明するように、１α，２５−ジヒドロキシコレ カルシフェロールはこれらの線維芽細胞のＰＤＧＦ誘発有糸分裂誘発に影響を与 えない。実施例ＶＩＩ １α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールおよびＰＤＧＦの相乗効果が 骨芽細胞において見られることを評価するために、確立された骨芽細胞のマウス 細胞系、ＭＣ３Ｔ３（Ｓｕｄａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、９６：１９１− １９８、１９８３）を使用した。細胞を１０％のＦＣＳを含むα−ＭＥＭ培地（ ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）中で３×１０⁴細胞／ｍｌの密度でプレートする以外、本 質的に実施例ＩＩに記載するようにアッセイを実施した。スイス３Ｔ３線維芽細 胞および一次ブタ骨芽細胞の両方と対照的に、１α，２５−ジヒドロキシコレカ ルシフェロールはＭＣ３Ｔ３細胞の成長を阻害した。したがって、データをチミ ジンの吸収の誘発倍数で分析した。誘発倍数はＰＤＧＦの存在下に取り込まれた³ Ｈ−チミジンのｃｐｍ／ＰＤＧＦの不存在下に得られたものの比として定義さ れる。第６図に図解する結果が示すように、ＰＤＧＦはビタミンの不存在下より １α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールの存在下により大きい誘発倍数 で誘発する。実施例ＶＩＩＩ ブタ一次骨培養物中の骨芽細胞がＰＤＧＦおよび１α，２５−ジ ヒドロキシコレカルシフェロールに対して応答することを評価するために、アッ セイを有糸分裂誘発およびアルカリ性ホスファターゼの発現について実施した。 ブタ一次骨細胞を同一細胞内の³Ｈ−チミジンの吸収および骨芽細胞マーカーの アルカリ性ホスファターゼの発現についてアッセイした。次の例外を使用して前 述したようにブタ一次骨細胞をプレートしそして処理した：ａ）細胞をラブ−テ ク（Ｌａｂ−ｔｅｋ）チャンバースライドＮｏ．１７７４４５（Ａｌｌ Ｗｏｒ ｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ワシントン州シアトル）中でプレートした；ｂ） １００ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢの単一濃度を使用した；そしてｃ）１０ｎＭ の１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールの単一濃度を使用した。³Ｈ −チミジンの取り込み後、スライドをＰＢＳで３回洗浄し、そして前述したよう にアルカリ性ホスファターゼの発現について染色した。染色後、スライドを空気 乾燥しそしてＮＴＢ３エマルジョン（Ｋｏｄａｋ、ニューヨーク州ロチェスター ）で被覆した。エマルジョンを空気乾燥し、そしてスライドを４℃において配置 し、そして１週間露出した。露出後、スライドを室温においてＤ−１９現像液（ Ｋｏｄａｋ）中で５分間現像し、水中ですすぎ、そして急速定着液中で５分間定 着した。原液を水中で１：１００に希釈しそして細胞に１分間適用することによ って、スライドをメチレンブルー（Ｓｉｇｍａ）で対比染色した。 アルカリ性ホスファターゼを発現する細胞（ＡＰ＋）はそれらのピンク色で同 定されたが、取り込んだ³Ｈ−チミジンを有する細胞はそれらの核の上の銀粒子 の蓄積により同定された。ＰＤＧＦ−ＢＢの不存在下に、細胞の２〜４％のみが³ Ｈ−チミジンを取り込み、そしてこの百分率は１α，２５−ジヒドロキシコレ カルシフェロールの添加により影響を受けなかった。ＰＤＧＦ−ＢＢの添加は、 取 り込まれた³Ｈ−チミジンを有する細胞の百分率をほぼ３倍増加した。ＡＰ＋お よびＡＰ−の両方の細胞はＰＤＧＦ−ＢＢに対して応答性であった。１α，２５ −ジヒドロキシコレカルシフェロールの存在または不存在下にＰＤＧＦに応答す る取り込んだ³Ｈ−チミジンを有するＡＰ＋細胞の百分率を計算した。同様な計 算をＡＰ−細胞について行った。１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロー ルの添加は取り込まれたチミジンを有するＡＰ＋細胞の数をほとんど２倍に増加 したが、より適度な増加はＡＰ−細胞について観察された。これらの結果が証明 するように、ＡＰのそれらの発現により同定される、培養物中の骨芽細胞は１α ，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールおよびＰＤＧＦ−ＢＢに対して相乗 的応答を示す。１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールおよびＰＤＧＦ −ＢＢに対する相乗的応答を示すＡＰ−細胞の同一性は、骨芽細胞がそれらの分 化のすべての段階においてＡＰを発現しないので、骨芽細胞であるか、あるいは 骨芽細胞でないことがある。 実施例ＩＸ ビタミンＤは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの頭蓋冠アッセイに添加したとき、骨の吸収 の効力のある剌激因子であることが知られており、そしてＰＤＧＦはこのアッセ イにおいて適度な骨吸収作用を有するこ とが示された。骨の吸収は骨の形成の剌激と矛盾するので、骨の吸収アッセイに おけるＰＤＧＦとビタミンＤとの相互作用の評価を行った。 矢状縫合とともに頭頂骨を含む頭蓋冠を、４日齢のＣＤ−１マウス（Ｃｈａｒ ｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州サンディエ ゴ）から集めた。１ｍｌの成長培地（ＤＭＥＭ、０．２９ｍｇ／ｍｌのＬ−グル タミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、および１５％の熱不活性化ウマ血清（ ＨＩＨＳ））を有する６ウェルのペトリ皿（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、イリノイ州マクグローパーク）の中に骨を入れ、そして３ ７℃において５％ＣＯ2中でおだやかに振とうしながら２４時間インキュベーシ ョンした。インキュベーション後、培地をウェルから除去し、そして２００ｎｇ ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢ、１０-８Ｍの１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフ ェロール、あるいはＰＤＧＦおよびビタミンＤの両方を含有する１．５ｍｌの成 長培地と置換した。５つの骨が各試料群に存在し、そして群を揺動しながら３７ ℃、５％ＣＯ₂において７２時間インキュベーションした。インキュベーション 後、培地をウェルから取り出し、そして製造業者の使用説明書に従いＮＯＶＡ− ７合計のカルシウム分析器（ＮＯＶＡ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、マサチュセッ ツ州ウォルサム）を使用してＣａ++レベルについて分析した。試料培地に加えて 、２４時間のインキュベーションからの培地を分析して、骨のいずれもが収集プ ロセスの間に損傷されなかったがことを保証した。損傷した骨は高いレベルのカ ルシウムを培地の中に放出し、そして最終の分析において使用しなかった。 第７図に示す結果が示すように、ＰＤＧＦおよび１α，２５−ジヒドロキシコ レカルシフェロールの両方は、頭蓋冠に別々に添加し たとき、骨の吸収を刺激した。しかしながら、ＰＤＧＦおよび１α，２５−ジヒ ドロキシコレカルシフェロールを組み合わせで添加したとき、ビタミンＤで見ら れた骨の吸収によるＣａ++の解放のレベルは減少し、ＰＤＧＦの阻害作用を示し た。実施例Ｘ 多孔質ヒドロキシアパタイトの移植片の中への骨の内部成長を相乗的に増加す るＰＤＧＦおよびビタミンＤの能力を試験するために、長さ２５ｍｍおよび４ｍ ｍの公称直径の円筒形移植片を１９０〜２３０μｍの孔大きさの（Ｉｎｔｅｒｐ ｏｒｅ、カリフォルニア州アービン）ヒドロキシアパタイトから機械加工した。 円筒は直径１０ｍｍおよび３ｍｍのアンダーカット領域を含有する。移植片をＰ ＤＧＦの溶液に浸漬することによって、移植片にＰＤＧＦを付加させ、これは０ ．５〜５０ｎｇ／移植片の投与量を生ずる。ビタミンＤをＡＬＺＥＴミニポンプ （Ａｌｚａ Ｃｏｒｐ．）により局所的に投与しそして１０〜１００ｎｇ／移植 片のビタミンＤの投与量を生成する。ＰＤＧＦ／ビタミンＤの投与量の比は１： ６である。賦形剤を負荷した移植片を対照として使用する。 ２４匹の平均体重３．５ｋｇの骨格的に成熟したニュージーランド白ウサギを 研究において使用する。５．０ｍｇ／ｋｇのキシラジンおよび３５．０ｍｇ／ｋ ｇのケタミンを各棘近傍筋の中に半分の投与量で注射することによって、麻酔を 実施する。次いで動物に挿管し、そしてハロタンガスを使用して麻酔を維持する 。 遠位アプローチ（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．、１０： ５８８−５９５、１９９２）を使用して、髄内移植片を挿入する。２．５ｃｍの 横方向の膝蓋骨近傍の切開を行って、膝が膝蓋骨の腱の横方向に沿って入るよう にする。膝蓋骨を脚と中間に延長して変位させる。４．０ｍｍのきり先を大腿骨 の顆の間に、 直接に近位させて導入する。関節軟骨および骨幹端骨をいったん通過したとき、 孔を空けて髄内の位置決めを確証する。移植片を挿入し、そしてその最終位置に 近位的に押す。骨ろうを使用して遠位入口孔をふさぐ。創傷を４−０吸収性縫合 糸およびステンレス鋼の縫合糸で層状に閉じた。 分析は組織学的および生物機械的である。断面の切片を作って移植片を有する ３．５ｍｍの長さの大腿骨の標本を生成し、こうして次の領域を研究できるよう にする：基部の大腿骨の小柱領域に隣接する、ギャップ部位におけるおよび大腿 骨の中央基部の骨内膜の皮質に隣接する。各部位について、標本を２つに切断し 、一方を組織学のために使用し、そして他方を生物機械的研究に使用する。各実 験部位を対側の大腿骨からの賦形剤負荷対照と比較する。 組織学的標本をリン酸塩緩衝化ホルマリン中で固定し、そしてアルコール（Ｅ ｔＯＨ）の上昇する系列中で脱水する：２４時間の間９５％のＥｔＯＨ、次いで 各２４時間の間１００％のＥｔＯＨ中で３回の交換。最後の１００％のＥｔＯＨ の処理後、標本を２回の交換のキシレン中で各２４時間の間清浄にする。プラス チックの埋め込みのための組織の浸潤を実施する。標本をプラスチックロッドに おいて横方向に切断するために配向し、そして室温においてメタクリレートプラ スチックの中に真空デシケーターの中で窒素雰囲気下にＢａｉｎら（Ｓｔａｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌ 、６５（４）：１５９、１９９０）に開示されているように埋 め込んだ。各サンプリング部位から、１５０μｍの切片を低速ダイヤモンド車の ノコギリ（Ｓｔｒｕｅｒｓ Ａｃｃｕｔｏｍ−２、カリフォルニア州トランス） を使用して調製する。次いで、１２００グリットのエメリークロスで被覆した２ 枚のガラス板の間で、厚い切片をほぼ３０μｍに手で磨いた。磨いた切片をイム ノ−マウント（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｍｏｕｎｔ ）（Ｓｈａｎｄｏｎ、ペンシルベニア州ピッツパーグ）でガラススライド上にマ ウントする。 オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ）ＢＨ−２光／エピフルオレセント顕微鏡（Ｓｃ ｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．、ワシントン州レドモンド ）を有するカメラルシダーを経てインターフェースされたバイオクアント（Ｂｉ ｏｑｕａｎｔ）骨形態測定プログラム（Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｉｎｃ．、テネ シー州ナッシュビレ）を使用して、移植片の中への骨の内部成長についての区域 の性質および骨の形成の動的指数を決定する。蛍光顕微鏡検査により４０×の倍 率で合計の骨の内部成長を測定する。ミネラルの付着および骨の形成のパラメー ターをｉｎ ｖｉｖｏの蛍光色素の標識から１００×の倍率で決定する。移植片 の界面における平均の標識間の幅を標識間の時間で割って、ミネラルの付着速度 を計算する。新しく形成した骨（すなわち、蛍光色素が結合した骨）の面積を追 跡しそして合計の新しい骨の面積を標識間の時間で割ることによって、合計の骨 の形成速度を決定する。 骨髄の内部成長をプッシュアウト試験を使用して機械的に評価する。試験すべ き標本をインストロン試験装置にマウントし、そして一定の力を０．５ｍｍ／秒 で移植片の中央に加える。Ｋｎｏｗｌｅｓｓら（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、１ ３（８） ：４９１−４９６、１９９２）に開示されているように、当業者によく 知られている生物機械的試験法を使用して、移植片をプッシュアウトするために 要求される力を決定する。実施例ＸＩ ＰＤＧＦ、ビタミンＤまたはＰＤＧＦおよびビタミンＤの組み合わせを使用し て、新生児のラットの大腿骨および５週齢のマウスの頭蓋冠における骨膜の骨の 形成を剌激するＰＤＧＦ−ＢＢおよびビ タミンＤの能力を試験する。大腿骨における試験のために、使用したＰＤＧＦの 投与量の範囲は２〜２００ｎｇ／日である。使用したビタミンＤの投与量の範囲 は２０ｎｇ〜２μｇ／日である。新生児のラットの子（２〜３日齢）において骨 膜の中に左大腿骨の中央後面に化合物を連続１０日間注射する。対側の大腿骨は 賦形剤の対照として働く。テトラサイクリン（１０ｍｇ／ｋｇ）を第５日に腹腔 内注射しそしてカルセイン（１０ｍｇ／ｋｇ）を第１７および２２日に腹腔内注 射することによって、骨を組織形態測定のために標識化する。８匹のラットの子 を各処置群のために使用する。第２４日に、動物を安楽死させ、そして両方の大 腿骨を取り出し、そして脱カルシウムしない骨の組織形態測定のために処置する 。 ＰＤＧＦ、ビタミンＤまたはＰＤＧＦとビタミンＤとの組み合わせを矢状縫合 の上に横たわる骨膜組織の中に皮下注射することによって、頭蓋冠における骨の 形成の検査を行う。注射を１０日間１日１回実施する。使用するＰＤＧＦの投与 量範囲は２〜２００ｎｇ／日である。使用するビタミンＤの投与量範囲は２０ｎ ｇ〜２μｇ／日である。第１日にテトラサイクリンを腹腔内注射しそしてカルセ インを第１８および２５日に腹腔内注射することによって、新しい骨の形成を測 定のために標識化する。マウスを第２８日に殺し、そして頭蓋冠を収獲し、そし て組織学的評価のために処理する。 上の発明は理解を明瞭とするために例証および実施例により多少詳細に記載し たが、本発明の範囲内である種の変化および変更を実施できることは明らかであ ろう。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．骨芽細胞の成長を刺激するために十分な量のビタミンＤと組み合わせて血 小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）を含んでなる組成物を骨芽細胞に適用する、 ことからなる骨芽細胞の成長を剌激する方法。 ２．組成物がＰＤＧＦのＡ鎖を本質的に含まない、請求の範囲１の方法。 ３．組成物が組換えＰＤＧＦ−ＢＢを含む、請求の範囲１の方法。 ４．骨芽細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで成長させる、請求の範囲１の方法。 ５．前記組成物中のＰＤＧＦの濃度が１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌである 、請求の範囲４の方法。 ６．前記組成物中のＰＤＧＦの濃度が５ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌである、 請求の範囲４の方法。 ７．前記組成物中のＰＤＧＦ：ビタミンＤの比が６：１〜６：５００である、 請求の範囲１の方法。 ８．前記組成物中のＰＤＧＦ：ビタミンＤの比が６：１０〜６：１００である 、請求の範囲１の方法。 ９．ＰＤＧＦおよびビタミンＤを含んでなる組成物の有効量を患者に投与する ことからなる、患者における骨の成長を剌激する方法。 １０．ビタミンＤが９，１０−セココレスタ−５，７，１０［１９］−トリエ ン−３−オールまたは１α，２５−ジヒドロキシコレカリフェロールである、請 求の範囲９の方法。 １１．組成物を骨の外傷または欠陥に局所的にデリバリーする、請求の範囲９ の方法。 １２．前記組成物中のＰＤＧＦ：ビタミンＤの比が６：１〜６： ５００である、請求の範囲９の方法。 １３．前記組成物中のＰＤＧＦ：ビタミンＤの比が６：１０〜６：１００であ る、請求の範囲９の方法。 １４．ＰＤＧＦおよびビタミンＤを含んでなる組成物の有効量の存在下に特に 骨芽細胞を培養することからなり、前記組成物はＰＤＧＦのＡ鎖を本質的に含ま ない、骨芽細胞の成長を剌激する方法。 １５．製剤学的に許容されうる担体の中に血小板誘導成長因子およびビタミン Ｄを含んでなる製剤組成物。 １６．ビタミンＤが９，１０−セココレスタ−５，７，１０［１９］−トリエ ン−３−オールまたは１α，２５−ジヒドロキシコレカリフェロールである、請 求の範囲１５の製剤組成物。 １７．前記組成物中のＰＤＧＦの濃度が１０ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌで ある、請求の範囲１６の製剤組成物。 １８．ＰＤＧＦ：ビタミンＤの比が６：１〜６：５００である、請求の範囲１ ６の製剤組成物。 １９．ＰＤＧＦ：ビタミンＤの比が６：１０〜６：１００である、請求の範囲 １６の製剤組成物。 ２０．前記組成物がＰＤＧＦのＡ鎮を本質的に含まない、請求の範囲１５の製 剤組成物。 ２１．骨の成長の刺激のための薬物の製造における血小板誘導成長因子および ビタミンＤの使用。