DE60000501T2

DE60000501T2 - Verwendung von melanomhemmendem faktor zur reparatur von knorpelgewebe und knochen

Info

Publication number: DE60000501T2
Application number: DE60000501T
Authority: DE
Inventors: Carola Dony; Ulrike Leser-Reiff; Gabriele Proetzel
Original assignee: Individual
Current assignee: Bionet Pharma GmbH
Priority date: 1999-01-28
Filing date: 2000-01-27
Publication date: 2003-02-13
Anticipated expiration: 2020-01-28
Also published as: AU2799000A; PT1146897E; WO2000044401A1; US6890897B1; JP4800483B2; ATE224731T1; AU765929B2; EP1025871A1; CA2361238C; JP2011084574A; EP1146897A1; ES2180514T3; EP1146897B1; CA2361238A1; DK1146897T3; DE60000501D1; JP2002537229A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Zusammensetzung für die Induktion der chondro-/osteogenen Abstammung (lineage) von mesenchymalen Stammzellen und für die Förderung von Knorpel- und Knochenbildung unter Verwendung eines melanomhemmenden Aktivitätsfaktors (MIA), bevorzugt in Kombination mit einem osteoinduktiven Protein.
MIA wurde zuerst als ein Faktor beschrieben, der das Wachstum der malignen Melanomzelllinie HTZ-19 hemmt (Weibach et al., Cancer Res. 50 (1990) 6981-69ß6).
Klonierung und Reinigung des Faktors führte zu einem neuen 11 kD Protein mit Anti- Tumor-Aktivität (WO 95/03328). Das Rinderhomologe CD-RAP (aus Knorpel erhältliches, Retinsäure-sensitives Protein) wurde in primordialem Knorpel und Knorpel nachgewiesen (Dietz, U., und Sandell, L., J. Biol. Chem. 271 (1996) 3311- 3316). Das Maus-CD-RAP/MIA-Gen wurde in embryonalem Mausknorpel lokalisiert und die Transkripte wurden in Chondrosarkomen nachgewiesen (Bosserhoff et al., Developmental Dynamics 208 (1997) 516-525). Diese Daten weisen auf eine normale Expression von MIA in Knorpel hin. Weitere Daten werden von transgenen Mäusen erhalten, worin ein MIA Promotor die knorpelspezifische Expression von IacZ steuert (Xie et al., 44th Annual Meeting, Orthopaedic Research Society, March 16-19, 1998, New Orleans, Louisiana). MIA konnte auch als Progessionsmarker für maligne Melanome verwendet werden (Bosserhoff et al., Cancer Research 57 (1977) 3149-3153; DE 196 53 358 A1).
Osteoinduktive Proteine sind Proteine, die die ganze Entwicklungskaskade der endochondralen Knochenbildung zu Knorpelzellen und Osteozyten induzieren und sind, zum Beispiel, Hedgehog Proteine (Sonic (Shh), Indian (Ihh), Desert (Dhh); Kinto et al., Kinto et al., FEBS Letters 404 (1997) 319-323), oder Mitglieder der knochenmorphogenetischen Proteinfamilie (BMPs).
Hedgehog Proteine, speziell Sonic Hedgehog (Shh) sind für die Entwicklung von mehreren Organsystemen, einschließlich Gehirn, Rückenmark, kraniofacialen Strukturen, Extremitäten, das Auge, linke und rechte Körpersymmetrie, Somitmusterung verantwortlich (Hammerschmidt et al., Trends Genet. 13 (1997) 14- 21). Indian Hedgehog (Ihh) spielt eine Rolle in der Knorpelentwicklung (Vortkamp et al., Science 273 (1996) 613-622; Lanske et al., Science 273 (1996) 663-666). Desert Hedgehog (Dhh) ist in die Entwicklung von männlichen Keimbahnzellen involviert. Ein weiterer Beleg für die Involvierung von Hedgehog, z. B. Shh in Knochenentwicklung und -Reparatur ist durch Mutationen gegeben, die zum menschlichen Holoprosenzephalie-Syndrom führen (Roessler et al., Human Molekular Genetics 6 (1997) 1847-1853; Belloni et al., Nature Genetics 14 (1996) 353) und durch die Induktion von ektopischen Knochen nach Expression von Shh in Fibroblasten und Transplantation der Zellen in Muskeln (Nakamura et al., BBRC 237 (1997) 465-469); Kinto et al., FEBS Letters 404 (1997) 319-323).
Knochenmorphogenetische Proteine (BMPs) sind Moleküle, welche verantwortlich sind für die Bildung von Knochen-, Knorpel-, Sehnen- und anderen Geweben, was anhand ektopischer Knochenbildung gezeigt wurde (Wozney et al., Science 272 (1988) 738-741). Die einzigartigen induktiven Aktivitäten dieser Proteine, neben deren Gegenwart in Knochen, lässt vermuten, dass sie wichtige Regulatoren von Knochenreparaturprozessen sind und möglicherweise in der normalen Erhaltung von Knochengewebe involviert sind. Viele solcher Proteine sind bekannt, wobei diese in mehrere Unterfamilien eingeteilt werden können (Reddi, A. H., Cytokine & Groth Factor Rewies 8 (1997) 11-20). Solche BMPs sind z. B. BMP-2 bis BMP-14 und die Wachstums- und Entwicklungsfaktoren GDF-1 bis GDF-14.
BMPs sind wichtige Signalfaktoren und regulieren die mehrstufige sequentielle Kaskade in der Knochen- und Knorpelbildung, ebenso wie Chemotaxis, Mitose, und Differenzierung. Insbesondere leiten BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5 und BMP-7 die Chondrogenese und Osteogenese ein.
Im Fall der Förderung der Knochenheilung wurde nur begrenzter Erfolg erzielt. Gegenwärtig werden große Knochendeffekte (orthopädische Rekonstruktion) entweder mit Knochen oder Knochenpulver behandelt und Autotransplantate oder Allotransplantate eingepflanzt. Darüber hinaus zeigen etwa 5-10% aller Fälle von Knochenfrakturen Schwierigkeiten bei der Heilung, also entweder eine verzögerte Verbindung (Heilung erst nach 6 Monaten) oder keine Heilung (immer noch kein Zusammenwachsen nach 9 Monaten) (Einhorn, T. A., Journal of Bone and Joint Surgery, American Volume 77A (1995) 940-956). Allogenetische Knochen und Knochenpulver werden von menschlichen Spendern erhalten und können in Knochengewebebanken gelagert werden, sind aber begrenzt. Da es menschliches Material ist, ist ein umfangreiches Screening auf virale (z. B. HIV, HBV, HCV) und bakterielle Kontamination nötig. Ebenso können Transplantatabstoßungen auftreten. Das Material variiert in Qualität in Abhängigkeit vom Spender. Die Verwendung von autogenen Knochen ist oft mit jvlorbidität an der Transplantatstelle begleitet (Muschler et al., Clin. Orthop. Rel. Res. (1996) 250-260). Außerdem ist nur eine begrenzte Menge von solchem Material vom autogenen Spender verfügbar.
Für BMP-2 und BMP-7 alleine wurden klinische Versuche zur geförderten Knochenheilung gestartet. Die ersten Ergebnisse deuten darauf hin, dass BMP-2 oder BMP-7 gleichwertig zu sein scheinen mit Knochen- oder Knochenpulvertransplantaten (Boyne, J. Oral Maxillofac. Surg. 53 Suppl 4 (1995) 92; Kirker-Head et al., Clin. Orthop. 218 (1995) 222; Johnson et al., Clin. Orthop. 277 (1992) 229). Etwa 2,5 bis 6,8 mg pro g Matrix werden verwendet.
Es besteht ein hoher medizinischer Bedarf an verfeinerter und verbesserter Knorpelreparatur. Gegenwärtige Therapien für akute Defekte (z. B. Auto- oder Sportunfälle), entweder Defekte betreffend die partielle Dicke oder Defekte betreffend die gesamte Dicke oder Spaltdefekte, sind Exzision, Wundreinigung oder das Warten auf die sehr seltene stattfindende Selbstheilung. Es werden einige Therapien erforscht, z. B. Mosaikkunststoff, unter Verwendung von autogenen Knochen/Knorpeltransplantat in der Form eines Zylinders für große Defekte. Es gibt einige wenige Zelltherapieansätze in vorklinischen und vorkommerziellen Studien. Autologe Chondrozyten, die während einer Biopsie isoliert werden, werden in vitro als eine Monoschicht kultiviert (Brittberg et al., N. Engl. J. Med. 331 (1994) 889-895). Die entdifferenzierten Zellen werden in einem chirurgischen Eingriff am offenen Knie unter einem peristalen Gewebelappen injiziert, der über dem Defekt vernäht wird. Mesenchymale Stammzellen, die auf einem geeigneten Träger (US-P 5,486,359) in Chondrozyten differenzieren können, sind in vorklinischen Studien. Bislang existiert noch keine einfach anzuwendende Therapie unter Verwendung eines Proteins oder Kombinationen von Proteinen.
WO 98/30234 beschreibt eine Zusammensetzung von BMP und Hedgehog Proteinen. WO 97/21447 beschreibt eine Kombination von osteoinduktiven knochenmorphogenetischem Protein (z. B. BMP-7) und einem morphogenetischen Protein, das Faktor IGF-1 zur Knochenheilung stimuliert. WO 92/09697 beschreibt eine Kombination von BMP und TGF-β für solche Zwecke. Faktoren, die entweder alleine oder in Kombination Knorpel heilen, sind in WO 96/14335 (morphogenetische Proteine, erhalten aus Knorpel) und WO 97/23612 beschrieben.
Weitere Kombinationen von Faktoren für Knochenheilung sind beschrieben in US-P 5,270,300: osteogenetischer Faktor (TGF-beta, TGF-beta und EGF, Osteogenin, BMP, + Kombinationen davon) und angiogenetischer Faktor (TGF-beta, Angiogenin, Angiotropin, FGF-2, PDGF-a und Kombinationen davon) für Knochenheilung; in US- P 5,629,009: TGF-beta, EGF, oder Faktoren, die von entmineralisierter Knochenmatrix erhalten werden (zwischen etwa 10 und 90 Gewichts-% der Matrix) kombiniert mit FGF oder PDGF; in EP-B 0 429 570 von Genetics Institute, Inc.: Kombination von BMPs (Protein oder DNA) mit unterschiedlichen Typen von Trägern. Es werden auch Kombinationen von BMPs mit EGF, FGFs, PDGF, TGFalpha und TGF-beta erwähnt.
Die Erfindung stellt die Verwendung von MIA, bevorzugt in Kombination mit einem osteoinduktiven Protein, für die Herstellung von einem Medikament für verbesserte Induktion der chondro-/osteogenischen Abstammung (lineage) und Förderung der Knorpel und verbesserte Knochenbildung, zur Verfügung
Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für Induktion der chondro-/osteogenischen Abstammung (lineage) und Förderung von Knorpel und Knochenbildung, worin ein Melanom-inhibierender Aktivitätsfaktor (MIA) gemäß der Erfindung verwendet wird als eine essentielle Komponente von dieser pharmazeutischen Zusammensetzung. Es ist weiter bevorzugt, eine Kombination von MIA und einem osteoinduktiven Protein als essentiellen Komponenten zu verwenden. Das Verhältnis von osteoinduktivem Protein: MIA ist bevorzugt 1 : 1 bis 1 : 20.
Es wurde überraschenderweise gefunden, dass MIA, bevorzugt in Kombination mit einem osteoinduktiven (osteogenen) Protein, bevorzugt mit einem knochenmorphogenetischen Protein 2, 3, 4, 5 oder 7 oder einem Hedgehog Protein, zu Knorpel und/oder Knochenheilung führt.
Mit "osteoinduktiven Protein" wird bevorzugt ein osteogenes Protein verstanden, das endochondrale Knochenbildung einleitet. Chondrozyten produzieren knorpelige Matrix, gefolgt von Osteoblasten und Osteozyten, welche Knochengewebe produzieren. Frühe Gene von den chondro-/osteogenen Abstammungen (lineages), z. B. Cbfa1, werden dadurch hochreguliert und dies führt letzten Endes zur Bildung von Chondrozyten und Osteozyten. Solch eine Osteoinduktion kann beispielsweise erreicht werden, durch BMPs oder Hedgehog Proteine. BMP-2, BMP-7 oder Hedgehog Protein (Shh, Ihh oder Dhh) ist bevorzugt. Die osteoinduktiven Proteine, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen ebenso Proteine wie TGFβ, BMPs und TGF-β kombiniert mit EGF ein.
Die Fähigkeit einer Substanz, Osteogenese einzuleiten, kann auf einfache Weise getestet werden. Zu diesem Zweck werden beispielsweise pluripotente mesenchymale Zellen, z. B. C3H10T1/2 Zellen, mit und ohne potentiellem osteoinduktiven Faktor, kultiviert. Kontrollen und behandelte Zellen werden auf alkalische Phosphataseaktivität gestestet. Die Aktivität kann photometrisch unter Verwendung eines geeigneten kolorimetrischen Substrates, z. B. p- Nitrophenylphosphat (Nakamura et al., BBRC 237 (1997) 465-469), bestimmt werden. Erhöhte Aktivität von alkalischer Phosphatase wird als Osteoinduktion gezählt. Alternativ wird die. Hochregulierung von Osteocalcin und alkalischer Phosphatase durch RT-PCR unter Verwendung geeigneter Primer für Osteocalcin und alkalischer Phosphatase gemessen.
Die Fähigkeit einer Verbindung, Osteogenese einzuleiten, kann in-vitro unter Verwendung von pluripotenten mesenchymalen Zellen, z. B. C3H10T1/2 oder prächondrogenen Zellen, z. B. RCJ3.1C5.18, getestet werden. Die Zellen werden in dreidimensionalen Kulturen für zwei bis drei Wochen kultiviert, z. B. "Micromass" Kulturen mit dem Induktor oder eine Kombination von Induktoren. Typ II Kollagen als Knorpelmarker kann entweder durch lmmunozytochemie unter Verwendung vvn monoklonalen Antikörpern oder durch Northern blot nach RNA-Isolierung nachgewiesen werden. Alcianblau-Färbung beweist die Existenz von Proteoglycanen. Eine unterschiedliche Methode würde sein, auf Aggrecan mit spezifischen Primern in der RT-PCR Reaktion zu testen.
MIA, bevorzugt in Kombination mit einem osteogenen Protein, kann in Zellen via Gentherapiemethoden ex vivo oder in vivo eingeführt werden. Für diese Methode. werden die Gene, die für MIA und optional für das osteogene Protein kodieren, in einem Vektor eingeführt, bevorzugt unter Kontrolle des gleichen Promotors, oder in separate Vektoren. Für eine effiziente Expression von MIA und dem osteogenen Protein ist es notwendig, starke Promotoren in den Vektoren zu verwenden. Solche Promotoren sind z. B. PGK oder CMV Promotoren. Bevorzugt besteht der Expressionvektor aus solch einem starken Promotor, der mRNA des gewählten Gens in voller Länge, z. B. BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-7, Shh, Ihh oder Dhh, FGF, HGF, PIGF, VEGF, einem künstlichen Intron und einer Poly-A-Stelle. Für in vivo Anwendung wird DNA entweder an Kollagenspangen lyophilisiert, bevorzugt für Osteogenese, oder mit einem beliebigen anderen geeigneten Träger angewendet, bevorzugt Hyaluronsäure oder Kollagen zur Anwendung als ein Gel für Chondrogenese. Für eine ex vivo Anwendung werden Zellen von der chondrogenetischen und osteogenetischen Abstammung (lineage) mit solchen Vektoren transfiziert und anschließend implantiert.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Formulierung kann ebenso eine geeignete Matrix einschließen, beispielsweise für Transport und/oder Unterstützung der Zusammensetzung und/oder zur Verfügung stellen einer Oberfläche für Knochenbildung. Die Matrix kann eine langsame Freisetzung von MIA zur Verfügung stellen, bevorzugt in Kombination mit einem osteoinduktiven Protein. Langsame Freisetzung für MIA ist möglich durch Kombinieren von MIA mit einer Matrix, an die MIA in einer reversiblen Art und Weise durch ionische oder hydrophobe Wechselwirkung gebunden ist. Bevorzugt beinhaltet die Zusammensetzung eine Matrix, die biokompatibel und/oder biologisch abbaubar ist. Potentielle Matrices für die Zusammensetzungen enthalten zum Beispiel Hyaluronsäure, Alginat, Calziumsulfat, Tricalziumphosphat, Hydroxylapatit, Polylactic-co-glycolid, Polyanhydride, Kollagen oder Kombinationen von diesen, wobei Hyaluronsäure, Alginat, Heparin, Kollagen, und/oder Polylactic-co-glycolid oder Derivate davon bevorzugt sind.
Für lokale Knochenreparatur ist es bevorzugt, MIA oder seine Kombination mit dem osteoinduktiven Protein zu verwenden. Es ist daher bevorzugt, für Osteogenese formstabile Matrices in engem Kontakt mit den Vorläuferzellen zu verwenden. MIA oder die Kombination, die auf eine dreidimensionale Matrix wie einen Schwamm appliziert wird und eng an den Defekt angelegt wird, ermöglicht es Zellen, z. B. aus Periosteum oder Knochenmark zu proliferieren und in Knochenzellen zu differenzieren, welche bevorzugt biologisch abbaubar sind. Bevorzugte Materialien für solche Schwämme sind zum Beispiel Kollagen, Alginat, Tricalziumphosphat, Hydroxylapatit und Kombinationen davon.
Für die Induktion von Chondrogenese ist es essentiell, dass MIA oder seine Kombination mit dem chondrogenen/osteogenen Protein zum lokalen Knorpeldefekt geleitet werden sollte. Knorpelvorläuferzellen werden entweder von dem subchondralen Knochen (in Defekte, die Knochendicke voll betreffend) oder von der Synovialis (in Defekte, die Knochendicke teilweise betreffend) erhalten. Die Behandlung ermöglicht es den Zellen zu proliferieren und zu differenzieren, was zur Synthese von neuem Knorpel führt. Reife Chondrocyten aus dem umgebenden Bereich konnten ebenfalls stimuliert werden. Zu diesem Zweck ist es zweckdienlich, dass die pharmazeutische Zusammensetzung direkt auf oder innerhalb des Knorpelgewebes angewendet werden sollte, bevorzugt über lokale Implantation oder lokale Injektion. Dies wird in geeigneter Weise mittels einer Spritze getan. Auch hier ist die Verwendung einer Matrix bevorzugt. Dennoch ist es bevorzugt, dass diese Matrix eher fliesfähig wie ein Gel oder eine Paste ist als formstabil zu sein. Bevorzugterweise ist die Fliesfähigkeit hoch genug um zu erlauben, dass die pharmazeutische Zusammensetzung mit einer Spritze appliziert werden kann.
Die Dosisverordnung wird durch den behandelnden Arzt unter Einbeziehung verschiedener Faktoren, welche die Wirkung der erfindungsgemäßen Formulierung modifizieren können, festgesetzt. Faktoren, welche die Wirkung der Formulierung modifizieren, schließen die Menge an Knochen, welche wunschgemäß gebildet werden soll, die Stelle der Anwendung, der Zustand des Schadens, das Alter des Patienten, Geschlecht und Ernährung, die Heftigkeit jeglicher Infektion, Zeit der Applikation und andere klinische Faktoren, mit ein. Die Dosierung kann mit der Art der verwendeten Matrix zur Wiederherstellung des Knochens variieren.
Die Erfindung bezieht sich weiter auf ein Verfahren für die Produktion von einem pharmazeutischen Mittel dadurch gekennzeichnet, dass MIA als essentielle Komponente dieses Mittels verwendet wird. In diesem Verfahren ist es bevorzugt, dass 500 ug von MIA pro Implantat oder pro Bolusinjektion verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform beinhaltet das pharmazeutische Mittel zusätzlich ein osteoinduktives Protein. Das Gewichtsverhältnis von osteoinduktivem Protein MIA ist bevorzugt 1 : 1 bis 1 : 20. Es ist demnach bevorzugt, eine überschüssige Menge an MIA zu verwenden. In dieser Zusammensetzung ist es bevorzugt, etwa 100 ug osteoinduktives Protein und etwa 500 ug MIA zu verwenden. Die Gesamtmenge an MIA und osteoinduktivem Protein ist bevorzugt in einem Bereich zwischen 200 und 800 ug, bezogen auf Gramm Matrixprotein.
Für die Knorpelanwendungen ist eine solche pharmazeutische Formulierung bevorzugt ein Gel, basierend auf einer Hyaluronsäure- oder Kollagenmatrix. Bevorzugt ist ein solches Gel injizierbar und wird in einer Menge von 100 ug bis 2 ml pro Bolusinjektion appliziert. Im Fall einer Applikation in den Knochen, ist die Verwendung eines Kollagenschwammes bevorzugt.
Die Erfindung bezieht sich weiter auf eine pharmazeutische Zusammensetzung dieser Art. Eine pharmazeutische Zusammensetzung dieser Art kann angewendet werden für Knochenreparatur, in vivo Osteogenese, speziell für die Behandlung von Patienten, die an Knochenschäden leiden und demzufolge gleichwohl einer Knochenreparatur als auch einer Knorpelreparatur bedürfen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Expressionsvektor für MIA und optional, zusätzlich für ein osteoinduktives Protein oder eine Kombination von einem Vektor für die Expression von MIA mit einem zur Expression von einem osteoinduktiven Protein fähigen Vektor beinhaltet, ebenso wie auch eine Methode zur Herstellung solch einer pharmazeutischen Zusammensetzung.
Die folgenden Beispiele und Referenzen werden zur Verfügung gestellt, um das Verständnis der vorliegenden Erfindung zu begünstigen, deren tatsächlicher Umfang in den anhängigen Ansprüchen festgesetzt ist.

Beispiel 1

In vitro Zellassay zur Induktion von osteogener Differenzierung

Mesenchymale Zellen, z. B. C3H10T1/2 Zellen, werden in Mikrotiterplatten mit 96 Wells ausgesät. Nach 24 Stunden wird der osteoinduktive Faktor, z. B. Hedgehog oder BMP, alleine oder in Kombination mit MIA zugesetzt (siehe Tabelle 1). Als Kontrolle werden Zellen nicht behandelt. Nach 5 Tagen werden Kontrolle und behandelte Zellen auf alkalische Phosphataseaktivität und Proteingehalt untersucht. Die Aktivität der alkalischen Phosphatase (AP) wird photometrisch unter Verwendung von p-Nitrophenylphosphat als ein kolorimetrisches Substrat gemessen. Eine Aktivitätssteigerung wird als Osteoinduktion gezählt. Für Hedgehog wurden 0,05 ug/ml appliziert. MIA wurde in verschiedenen Konzentrationen von 0,05 ug/ml bis 50 ug/ml getestet.
Alleinig appliziertes MIA änderte nicht die alkalische Phosphataseaktivität. Wenn MIA in Kombination mit Hedgehog appliziert wurde, wurde ein synergistischer Effekt beobachtet, der zu einem 2,7-fachen Ansteigen der alkalischen Phosphataseaktivität führte. Tabelle 1

Beispiel 2

In vitro Assay zur Induktion von Knorpelmarkern

Chondrocyten von Schweinen wurden aus femoralen Kondylen isoliert. Primäre menschliche Chondrocyten wurden aus femoralen Kondylen von Patienten, die sich einem chirurgischen Eingriff am Knie unterzogen, isoliert. Der Knorpel wurde in kleine Teile zerhackt und in 10 ml mit 2 mg/nl Kollagenase (Roche Diagnostics GmbH, DE) und 0,1 mg/ml Hyaluronidase (Sigma) und 0,15 mg/ml DNase (Roche Diagnostics GmbH, DE) bei 37ºC für 16 Stunden inkubiert. Die Chondrocyten wurden nach Zentrifugation in Petrischalen zur Proliferation ausgesät.
Die entdifferentierten Zellen wurden für Assays benutzt. In 10 ul Medium wurden 2 · 104 Zellen pro Well in Mikrotiterplatten mit 96 Wells getüpfelt. Nach 4 Stunden wurden 200 ul Medium zugesetzt. Nach 7 Tagen wurden Induktoren zur "Micromass" Kultur zugesetzt: BMP-2, Hedgehog, MIA und Kombinationen davon. 2 bis 4 Wochen später wurden die Kulturen auf Knorpelmarker geprüft. Morphologisch sind Chondrocyten an ihrer runden Erscheinungsform zu erkennen. Die Immunocytochemie zeigt Kollagen Typ II Expression. Cytochemisch beweist Alcianblau sulfatierte Proteoglykane. Aggrecan und SOX9 konnten mit PCR gezeigt werden.

Beispiel 3

In vitro Assay zur Induktion von Proliferation

Chondrocyten wurden aus femoralen Kondylen von Schweinen isoliert. 3000 Zellen wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Wells ausgesät und für 3 Tage kultiviert. Nach 24 Stunden serumfreier Inkubation wurden MIA, BMP-2, Shh und Kombinationen davon zugesetzt. Während der letzten 16 Stunden der 48-stündigen serumfreien Induktionsperiode war BrdU Markierung zugegen. Die ELISA Detektion wurde gemäß den Instruktionen des Herstellers (Roche Diagnostics GmbH) durchgeführt: Tabelle 2
MIA allein und in Kombination stimuliert die DNA Synthese von primären Chondrocyten.

Beispiel 4

In vitro Organassay zur Untersuchung der Chondrogenese: Mausextremitätenknospenassay

Extremitätenknospen werden von E12.5 bis E15.5 Mausembryonen (NMRI) unter Verwendung einer Mikrodissektierschere und Watchmaker Forzeps unter sterilen Bedingungen isoliert. Die Extremitätenknospen wurden in PBS, welches ein Antibiotikum-Antimycotikum von Gibco-BRL (#15240-039) enthielt, gewaschen und anschließend in serumfreien BGJb Medium von Gibco-BRL (#12591-020) für 48 Stunden bis 144 Stunden in Organkulturschalen kultiviert. Nach 24 Stunden Kultivierung wurden MIA, BMP-2 alleine oder verschiedene Kombinationen von MIA und BMP zugesetzt. Die Medien wurden jeden Tag gewechselt. Am Ende der Kultivierung wurden die Extemitäten in PBS gewaschen, dann über Nacht in 4% Paraformaldehyd fixiert, und entweder zur Einbettung in Paraffin oder zur "wholemount" in situ Hybridisierung, wie von Wilkinson, D. G., "In situ hybridization: a practical approach, In: Rickwood D, Hames BD (eds.) The practical approach series", Oxford Univ. Press, Oxford, New York, Tokyo (1992) beschrieben, weiterverarbeitet. Paraffinschnitte wurden mit von Kossa angefärbt, um die Menge der kalzifizierten Bereiche sichtbar zu machen und zu quantifizieren, mit Alcianblau angefärbt, um Chondrogenese einzuschätzen. Zusätzlich wurde RNA Hybridisierung durchgeführt, um für Knorpelentwicklung charakteristische Genexpression zu analysieren, z. B. Kollagen II, MIA, Kollagen X.

Beispiel 5

Mausbioassay zur Knorpel-, Knochen-, Sehen- und Ligamentinduktion

Ähnlich zum Assay von Sampath und Reddi zu ektopischen Implantaten bei Ratten, wurde ein Assay zu ektopischen Implantaten bei Mäusen, unter Verwendung von 4 Monate alten C3H Inzuchtmäusen durchgeführt (Sampath und Reddi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983) 6591-695; WO 95/16035). (a) MIA alleinig, (b) BMP-2 alleinig, und (c) Kombinationen von MIA und BMP-2 wurden in dem geeigneten Puffer, 0,1% Trifluoressigsäure für BMP-2 und 100 mM Kaliumphosphat, 150 mM NaCl, pH 6,0 für MIA, appliziert. Als Träger wurden eine Kollagen Typ I Matrix und Hyaluronsäure verwendet. Jeder geeignete Träger kann eingesetzt werden, z. B. eine Kollagen Typ I Matrix, eine Kollagen-Heparin Mischung, Gelatinekapseln, Hyaluronsäure, Alginat, oder eine andere funktionell äquivalente Vorrichtung, basierend auf Biokompatibilität, biologischer Abbaubarkeit, Stabilität und mechanischen Eigenschaften.
Die Implantate wurden intramuskulär in den Glutäus der Maus platziert und für 14 Tage dort belassen. Nach 14 Tagen wurden die Mäuse durch zervikale Dislokation getötet. Die Implantate wurden isoliert und unter Verwendung von histologischen Standardtechniken weiterverarbeitet (siehe Theory and Practice of Histological Techniques, ed. Bancroft and Stevens, Churchville Livingstone, 1996). Es wurden Paraffinschnitte (4 um) geschnitten und mit von Kossa angefärbt, um die Menge an Knorpel und Knochengewebe, welche in jedem Implantat induziert wurde, sichtbar zu machen und zu quantifizieren. Positive (z. B. BMP-2) und negative (z. B. Attrappe) Implantatkontrollgruppen wurden mit den experimentellen Implantaten verglichen.
Um die Qualität des induzierten Knorpels und/oder Knochens zu bewerten, kann Genexpression via RNA in situ Hybridisierung für Knorpel- und Knochenmarkern wie oben beschrieben, unter Verwendung von Knorpelmarkern (z. B. Kollagen II, Kollagen X) und Knochenmarkern (z. B. Kollagen I, Osteocalzin), untersucht werden.

Beispiel 6

Mausbioassay zur Knorpel-, Knochen-, Sehnen- und Ligamentinduktion für DNA Expressionsvektoren

Ähnlich zum Assay von Sampath und Reddi zu ektopischen Implantaten bei Ratten, wurde ein Assay zu ektopischen Implantaten bei Mäusen, z. B. unter Verwendung von 2 Monate alten NMRI Auszuchtmäusen oder C3H lnzuchtmäusen durchgeführt (Sampath und Reddi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983) 6591-695; WO 95/16035). Es wurden Expressionsfaktoren für (a) osteoinduktiven Faktor alleinig, (b) Mia alleinig und (c) Kombinationen von osteoinduktiven Faktor und MIA im geeignetem Puffer, z. B. TE-Puffer, lyophilisiert (Fang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 5753-5758). Jeder geeignete Träger kann eingesetzt werden, z. B. eine Kollagen Typ I Matrix, eine Kollagen-Heparin Mischung, Gelatinekapseln, Hyaluronsäure, Alginat, oder eine andere funktionell äquivalente Vorrichtung, basierend auf Biokompatibilität, biologischer Abbaubarkeit, Stabilität und mechanischen Eigenschaften.
Die Implantate wurden intramuskulär in den Beinmuskel der Maus für sieben und 14 Tage gesetzt. Nach sieben und 14 Tagen wurden die Mäuse durch zervikale Dislokation getötet. Die Implantate wurden isoliert und unter Verwengung von histologischen Standardtechniken weiterverarbeitet (siehe Theory and Practice of Histological Techniques, ed. Bancroft and Stevens, Churchville Livingstone, 1996). Es können Paraffinschnitte (4 um) angefärbt werden mit Toluidinblau, Alcianblau, von Kossa, Movat oder Hämatoxylin I Eosin, um die Menge an Sehnen-, Ligament-, Knorpel- und Knochengewebe, welches in jedem Implantat induziert wurde, sichtbar zu machen und zu quantifizieren. Positive (z. B. BMP-2, Shh Expressionsvektor) und negative (z. B. Attrappe) Implantatkontrollgruppen wurden mit den experimentellen Implantaten verglichen.
Um die Qualität des induzierten Knorpel und/oder Knochens zu bewerten, kann Genexpression via RNA in situ Hybridisierung für Knorpel- und Knochenmarker, wie oben beschrieben, untersucht werden.

Beispiel 7

Modell zur sich nicht verbindenden (non-union) Fraktur in Kaninchen (Radiusosteotomy)

Ein sich nicht verbindender (non-union) Defekt von 1,5 cm Länge wurde am Radius von erwachsenen Kaninchen erzeugt, um die Fähigkeit, Knochenheilung zu bewirken, der Kombinationen von MIA allein und MIA in Kombination mit BMP oder Hedgehog Proteinen und geeignetem Träger zu bewerten. Die Tiere wurden durch intravenöse Injektion von Xylazin/Ketamin anästhesiert und der chirurgische Eingriff fand unter sterilen Bedingungen statt. Der Defekt wurde entweder leer gelassen, gefüllt mit dem geeigneten Träger oder gefüllt mit einem Träger, der MIA und BMP enthielt, oder jeden dieser Faktoren alleine. Den Tieren wurde erlaubt, sich frei zu bewegen und zwei und vier Wochen nach dem chirurgischen Eingriff wurden Röntgenaufnahmen durchgeführt, um die Rate der Knochendefektheilung zu bewerten. Nach dem Ende der Untersuchung wurden die Tiere unter Anästhesie getötet und die Stelle des Knochendefektes für histologische Untersuchung entfernt und unter Verwendung des von Kossa und Goldner Färbemittels die Qualität des neu gebildeten Reparaturgewebes quantifiziert und charakterisiert.

Beispiel 8

Modell zur Reparatur des Gelenkflächenknorpels in voller Dicke

Es wird ein Modell zum Defekt des Gelenkflächenknorpels in voller Dicke im femoralen Patellargelenk von erwachsenen Kaninchen verwendet, um die Fähigkeit von MIA alleine oder in Kombination mit BMP oder Hedgehog Protein und Träger zu bewerten, Knorpel- und Knochenreparatur zu bewirken. Erwachsene Kaninchen werden anästhesiert und für einen sterilen chirurgischen Eingriff vorbereitet. Ein bis zu 4 · 4 mm großer Defekt durch den Gelenkflächenknorpel und in den darrunterliegenden subchondralen Knochen wird in die Patellarfurche des Kniegelenkes gebohrt. Der Defekt wird entweder leer gelassen, gefüllt mit dem geeigneten Träger, oder gefüllt mit einem Träger, der MIA allein oder in Kombination mit BMP oder Hedgehog Protein enthält. Den Tieren wurde erlaubt, sich für vier Wochen frei zu bewegen. Nach vier Wochen werden die Tiere unter humanen Bedingungen euthanasiert und die Stelle des Gelenkflächenknorpel-/subchondralen Knochendefektes wird histologisch nach Gewebearchitektur, Quantität und Qualität der Reparatur bewertet.

Beispiel 9

Modell zur Reparatur des Gelenkflächenknorpels in partieller Dicke

Es wird ein Modell zum Defekt des Gelenkflächenknorpels in partieller Dicke im femoralen Patellargelenk von erwachsenen Kaninchen verwendet, um die Fähigkeit von MIA alleine oder in Kombination mit BMP oder Hedgehog Protein und Träger zu bewerten, Knorpel- und Knochenreparatur zu bewirken. Erwachsene Kaninchen werden anästhesiert und für einen sterilen chirurgischen Eingriff vorbereitet. Ein bis zu 4 · 4 mm großes Loch wird durch den Gelenkflächenknorpel in die Patellarfurche des Kniegelenkes gebohrt, wobei der darrunterliegende subchondrale Knochen intakt bleibt. Der Defekt wird entweder leer gelassen, gefüllt mit dem geeigneten Träger, oder gefüllt mit einem Träger, der MIA allein oder in Kombination mit BMP oder Hedgehog Protein enthält. Den Tieren wurde erlaubt, sich für vier Wochen frei zu bewegen. Nach vier Wochen werden die Tiere unter humanen Bedingungen euthanasiert und die Stelle des Gelenkflächenknorpel-/subchondraler Knochendefektes wird histologisch nach Gewebearchitektur, Quantität und Qualität der Reparatur bewertet.

Literaturverzeichnis

Belloni et al., Nature Genetics 14 (1996) 353
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Claims

1. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend einen Melanominhibierenden Aktivitätsfaktor und eine biokompatible und/oder biologisch abbaubare Matrix, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hyaluronsäure, Alginat, Calciumsulfat, Tricalciumphosphat, Hydroxylapatit, Polylactic-co-glycolid, Polyanhydriden, Collagen oder Kombinationen von diesen.

2. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend einen Melanominhibierenden Aktivitätsfaktor (MIA) in Kombination mit einem osteoinduktiven Protein.

3. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin das Verhältnis von osteoinduktivem Protein: MIA 1 : 1 bis 1 : 20 ist.

4. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 2 oder 3, worin das osteoinduktive Protein BMP-2, BMP-7 oder ein Hedgehog Protein ist.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung nach den Ansprüchen 2 bis 4, worin die Zusammensetzung eine biokompatible Matrix einschließt.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 5, worin die biokompatible Matrix Hyaluronsäure, Alginat, Collagen, Heparin, Polylactic-co-glycolid und/oder Pofylactic-co-glycolid-Derivate oder Kombinationen davon ist.

7. Verwendung eines Melanom-inhibierenden Aktivitätsfaktors (MIA) als die essentielle Komponente zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für verbesserte Induktion der chondro-losteogenen Abstammung (lineage) und Förderung von Knorpel- und/oder Knochenbildung.

8. Verwendung nach Anspruch 7, worin die Zusammensetzung zusätzlich ein osteoinduktives Protein beinhaltet.

9. Verwendung nach Anspruch 8, worin das osteoinduktive Protein BMP-2 oder BMP-7 oder ein Hedgehog Protein ist.

10. Verwendung nach Anspruch 8 oder 9, worin das Verhältnis von osteoinduktivem Protein: MIA 1 : 1 bis 1 : 20 ist.

11. Verwendung nach den Ansprüchen 8 bis 10, worin der melanomhemmende Aktivitätsfaktor (MIA) mit einer biokompatiblen Matrix kombiniert ist.

12. Verwendung nach Anspruch 11, worin die biokompatible Matrix Hyaluronsäure, Alginat, Collagen, Heparin, Polylactic-co-glycolid und/oder Polylactic-co-glycolid-Derivate oder Kombinationen davon ist.

13. Verwendung eines Expressionsvektors für einen Melanominhibierenden Aktivitätsfaktor (MIA) oder einer Kombination eines Vektors für die Expression von einem osteoinduktiven Protein mit einem zur Expression von Melanom-inhibierenden Aktivitätsfaktor fähigen Vektor zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für verbesserte Induktion der chondro-/osteogenen Abstammung (lineage) und Förderung von Knorpel- und/oder Knochenbildung.

14. Verwendung eines zur Expression eines Melanom-inhibierenden Aktivitätsfaktors (MIA) fähigen Expressionsvektors oder eines zur Expression eines osteoinduktiven Proteins fähigen Vektors und eines zur Expression eines Melanom-inhibierenden Aktivitätsfaktors (MIA) fähigen Vektors als essentielle Komponente zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für verbesserte Induktion der chondro-/osteogenen Abstammung (lineage) und Förderung von Knorpel- und/oder Knochenbildung.

15. Verwendung nach Anspruch 13, worin die Zusammensetzung eine biokompatible Matrix einschließt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hyaluronsäure, Alginat, Calciumsulfat, Tricalciumphosphat, Hydroxylapatit, Polylactic-co-glycolid, Polyanhydriden, Collagen oder Kombinationen von diesen.

16. Verwendung eines Melanom-inhibierenden Aktivitätsfaktors (MIA) zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung eines Patienten, der einer Knochen- und/oder Knorpelreparatur bedarf.

17. Verwendung nach Anspruch 18, worin eine Kombination eines Melanom-inhibierenden Aktivitätsfaktors (MIA) und eines osteoinduktiven Proteins verwendet wird.