-
Hintergrund
der Erfindung
-
Sachgebiet
der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Fibroblasten-Wachstumsfaktoren
als therapeutische Mittel zur Förderung
der periostalen Knochenbildung.
-
Hintergrund der Erfindung
-
Lebendes
Knochengewebe wird mit Hilfe der Abbau- und Ablagerungsprozesse
der Knochenmatrix und der Knochenmineralien ständig wieder aufgefrischt. Diese
sowohl zeitlich als auch räumlich
gekoppelten Prozesse, auch Knochenumbau ("bone remodeling") genannt, werden in der Hauptsache
von zwei Zellpopulationen geleistet, den Osteoklasten und den Osteoblasten.
Der Prozess des Knochenumbaus wird ausgelöst, wenn Osteoklasten aus dem
Knochenmark oder aus dem Blutkreislauf an die Knochenoberfläche rekrutiert werden
und dort scheibenförmige
Knochenpakete abtragen. Die Knochenmatrix und die Knochenmineralien werden
anschließend
durch ein Team von Osteoblasten aufgefüllt, die aus dem Knochenmark
an die durch Resorption veränderte
Knochenoberfläche
rekrutiert werden. Zu den pathologischen Zuständen, die mit einer abnormen
Funktion der Knochenzellen verbunden sind, gehört die Osteroporose, eine Erkrankung,
die sich durch eine Abnahme des Knochengewebes (Osteopenie) und
eine Erhöhung
der Knochenbrüchigkeit
auszeichnet. Diese Veränderungen
können
die Folge einer verstärkten
Rekrutierung und Aktivität
der Osteoklasten sein, häufig
in Kombination mit einer verringerten Rekrutierung oder Aktivität der Osteoblasten.
Man nimmt an, dass die Entwicklung übermäßiger oder zu geringer Populationen
von Osteoklasten oder von Osteoblasten auf einem entsprechenden
Mangel beziehungsweise Überschuss
an spezifischen Proteinfaktoren, der so genannten Zytokine, beruhen
kann.
-
Die
Zytokine sind durch ihre biologischen Eigenschaften und ihre einzigartigen
Aminosäuresequenzen identifiziert
worden. Jedes Zytokin weist ein eindeutiges Spektrum von Eigenschaften
auf die es von anderen Zytokinen unterscheiden. Im Allgemeinen stimulieren
die Zytokine das Wachstum und/oder die Differenzierung spezifischer Zelltypen.
Bestimmte Zytokine können
auch Krebszellen zu deren Zerstörung
angreifen. Als Beispiele für
Zytokine sind der Granulozyten-Kolonie-stimulierende Faktor (G-CSF),
der Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF),
der Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF), Interleukin-1-beta,
Interleukin-3, Interleukin-6, Interferon-gamma, der Tumor-Nekrose-Faktor,
Lymphotoxin, der Leukämie-inhibierende
Faktor, die Fibroblasten-Wachstumsfaktoren und der Transformierende
Wachstumsfaktor-alpha sowie der Transformierende Wachstumsfaktor-beta zu nennen.
-
Viele
der bekannten Zytokine stimulieren oder inhibieren Blutzellen. Einige
wachstumsregulierende Zytokine, wie M-CSF, der Transformierende
Wachstumsfaktor-alpha,
Interleukin-1 und der Tumor-Nekrose-Faktor, haben sich als Stimulantien
der Zellproliferation einkerniger Zellen des Knochenmarks erwiesen. Obwohl
Zytokine wie Interleukin-1 (IL-1), der Tumor-Nekrose-Faktor (TNF)
und Interleukin-6 (IL-6) die Bildung und Differenzierung von Osteoklasten
beeinflussen können
(Mundy, Trends Endo. Metab. 1, 307–311, 1990), sind diese Faktoren
aber dennoch keine spezifischen Osteoklasten-wachstumsregulierenden
Faktoren.
-
Wenngleich über die
Faktoren, die den Zusammenbruch und Abbau von Knochengewebe beeinflussen,
umfangreiche Informationen verfügbar
sind, beschränken
sich diese Informationen doch mehrheitlich auf Faktoren, die genau
genommen die Bildung von neuem Knochenmaterial stimulieren können. Der
Knochen selbst enthält
Faktoren, die die Fähigkeit
zur Stimulation des Wachstums und/oder der Differenzierung von Knochenzellen
aufweisen. So enthalten Extrakte von Knochengewebe nicht nur strukturelle
Proteine, die verantwortlich sind für den Erhalt der strukturellen
Vollständigkeit
des Knochens, sonderen auch biologisch aktive Knochenwachstumsfaktoren,
die die Proliferation von Knochenzellen stimulieren. Zu den Wachstumsfaktoren, die
in Knochen gefunden werden und von denen bekannt ist, dass sie die
Proliferation von Knochenzellen stimulieren, gehören der Transforming Growth
Factor-β,
die Insulinähnlichen
Wachstumsfaktoren (der Insulin-ähnliche
Wachstumsfaktor I und der Insulinähnliche Wachstumsfaktor II),
der basische Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) und die Knochen-morphogenetischen
Proteine (BMP). Diese Faktoren können die
Proliferation von Knochenzellen wie auch von anderen Zelltypen auslösen.
-
Die
Familie der Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGF) besteht aus mindestens
9 strukturverwandten Proteinen (FGF 1 bis FGF 9), deren am besten
bekannte Vertreter der saure Fibroblasten-Wachstumsfaktor (aFGF
oder FGF-1) und der basische Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF oder FGF-2) sind.
Die Vertreter dieser Familie stimulieren die Mitogenese der meisten
vom Mesoderm oder vom Neuroektoderm abgeleiteten Zellen und beeinflussen
weitere biologische Prozesse, einschließlich der Angiogenese, der
Neuriten-Extension,
des neuronalen Überlebens
und der Myoblasten-Differenzierung. Im Allgemeinen weisen die Fibroblasten-Wachstumsfaktoren
eine hohe Affinität
zu Heparin auf (bevor die Nomenklatur dieser Faktoren auf FGF festgelegt
wurde, wurden einige der Fibroblasten-Wachstumsfaktoren als Heparin-bindende
Wachstumsfaktoren-1, -2 usw. bezeichnet), und viele, jedoch nicht
alle Fibroblasten-Wachstumsfaktoren stellen Mitogene für Fibroblasten
dar. Die Mitglieder der Familie der Fibroblasten-Wachstumsfaktoren
weisen innerhalb einer Kernsequenz eine zu etwa 25 bis 55% identische
Aminosäuresequenz
auf und einige der Fibroblasten-Wachstumsfaktoren weisen außerhalb
dieser Kernsequenz signifikante Extensionen auf, hierbei kann es
sich um C-terminale und/oder N-terminale Extensionen handeln. Diese
strukturelle Homologie ist ein Hinweis darauf dass die 9 verschiedenen
Gene, die die bekannten Fibroblasten-Wachstumsfaktoren kodieren,
sich möglicherweise
alle von ein und demselben Stammgen ableiten.
-
Über die
9 bekannten Mitglieder der Familie der Fibroblasten-Wachstumsfaktoren
hinaus entsteht zusätzliche
Komplexität
aus der Bildung verschiedener molekularer Formen von Fibroblasten-Wachstumsfaktoren
aus einem einzigen Gen. So besteht beispielsweise das primäre Translationsprodukt
des sauren Fibroblasten-Wachstumsfaktors (FGF-1) aus 155 Resten.
Die längste
in natürlichem
Material (z. B. in Rinderhirn) gefundene Form von FGF-1 besteht
allerdings nur aus 154 Resten. Dieser aus 154 Resten bestehenden
Form von FGF-1 fehlt das NH2-terminale Methionin
der aus 155 Resten bestehenden Form und sie weist stattdessen eine
acetylierte terminale Aminogruppe auf. Prateolytische Behandlung
in vivo oder im Rahmen einer Reinigung führt zu kürzeren aktiven Formen von FGF-1,
bei denen entweder die aminoterminalen 15 (des 1–15) oder 21 (des 1–21) Aminosäuren fehlen.
Wie im vorliegenden Text definiert, bezieht sich FGF-1 auf die 154-Reste-Form
von FGF-1 sowie auf kürzere,
biologisch aktive Formen des Fibroblasten-Wachstumsfaktors FGF-1,
wie die oben beschriebenen Formen, bei denen die aminoterminalen
15 (des 1–15)
oder 21 (des 1–21) Aminosäuren fehlen.
Historisch wurde die 154-Reste-Form von FGF-1 als β-endothelialer
Zellwachstums-Faktor (β-ECGF)
bezeichnet, die des 1–15-Form
wurde als aFGF bezeichnet und die des 1–21-Form wurde als, α-ECGF bezeichnet.
Vor der Vereinheitlichung der Terminologie für diese Gruppe von Wachstumsfaktoren wurde
dieses Protein auch mit verschiedenen anderen Bezeichnungen belegt,
darunter Augen-abgeleiteter Wachstumsfaktor und Heparin-bindender
Wachstumsfaktor-1. Es wurden auch ähnliche Formen von bFGF (FGF-2)
beschrieben. Neben den gespaltenen Formen wurden auch verlängerte Formen
von bFGF beschrieben, die dadurch entstehen, dass eine Translation
an mehreren verschiedenen GTG-Kodons, die oberhalb des ATG-Translations-Startkodons
liegen, initiiert wird, wodurch die 155-Reste- Form von bFGF entsteht. All diese verschiedenen
Formen der Fibroblasten-Wachstumsfaktoren
enthalten die Kernregion in ihrer strukturellen Homologie, die die
FGF-Familie charakterisiert.
-
Veröffentlichte
Entwicklungen
-
Dem
basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) wurde auf Grund von
in vitro-Studien
(Hauschka et al., J. Biol. Chem. 261, 12665–12674, 1986; Globus et al.,
Endocrinology 123, 98–105,
1988; Canalis et al., J. Clin. Invest. 81, 1572–1577, 1988; McCarthy et al.,
Endocrinology 125, 2118–2126,
1989; Noff et al., FEBS Lett. 250, 619–621 Y, 1989) eine osteogene
Rolle zugeschrieben. Es wurde allerdings nur von einem Fall einer
in vivo-Verabreichung von bFGF (Mayahara et al., Growth Factors
9, 73–80,
1993) berichtet. Die intravenöse
Verabreichung von humanem bFGF an Ratten zeigte nur endostale neue
Knochenbildung. Es wurde keine Erhöhung der periostealen Knochenbildung
nachgewiesen. Ein ähnliches
systemisches osteogenes Potential wurde nach intravenöser Verabreichung
von menschlichem aFGF beobachtet.
-
Zusammenfassung
der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Fibroblasten
Wachstumsfaktoren (FGF) zur Herstellung eines Arzneimittels zur
Behandlung von Patienten, die an pathologischen Zuständen leiden,
bei denen eins unzureichende Knochenmasse vorliegt, oder zur Behebung
von Defekten des Knochen- oder des Zahngewebes. Die pharmazeutischen
Zusammensetzungen enthalten bestimmte Fibroblasten-Wachstumsfaktoren
in Mengen, die die Proliferation und/oder die Differenzierung von
Osteoblasten und/oder deren Vorläufern
stimulieren und so den Knochen-Anabolismus fördern. Die Fibrobflasten Wachstumsfaktoren
sind zur Stimulation der periostalen Knochenbildung vorzugsweise
lokal zu anzuwenden. Die bei der praktischen Ausführung der
vorliegenden Erfindung bevorzugten Fibroblasten-Wachstumsfaktoren sind FGF-1 und FGF-2
sowie, am meisten bevorzugt, FGF-1 in der Voll-Längen-Form (ECGF-β) sowie FGF-des 1–21(ECGF-α).
-
Andere
und weitere Ziele, Merkmale und Vorteile gehen aus der folgenden
Beschreibung der bevorzugten Ausgestaltungen der Erfindung hervor,
die – im
Zusammenhang mit den folgenden Abbildungen betrachtet – dem Zeck
der Offenlegung dient.
-
Kurze Beschreibung
der Abbildungen
-
1 ist
ein Mikrophoto, das das Wachstum von neuem Knochen in der Calvaria
der Nacktmaus angrenzend an WISH-Tumorzellen zeigt.
-
2 ist
ein Mikrophoto, das das Wachstum von neuem periostalen Knochen in
der Calvaria der Maus nach Verabreichung von saurem FGF (Feld A)
und von basischem FGF (Feld B) zeigt.
-
3 zeigt
die Wirkung von saurem und basischem FGF auf das Knochenwachstum
in der Calvaria.
-
4 zeigt
die Zeitabhängigkeit
der Wirkung von aFGF auf das Knochenwachstum.
-
5 zeigt
die Zeitabhängigkeit
der Wirkung von aFGF auf die Periostum-Proliferation beziehungsweise die Osteoblasten
Differenzierung.
-
6 zeigt
die Dosisabhängigkeit
der Wirkung von aFGF beziehungsweise bFGF auf die Knochenbildung
in der Calvaria.
-
7 zeigt
die Wirkung der täglichen
Verabreichung von aFGF auf den Knochenschwund in der Tibia von ovarektomierten
Ratten.
-
8 zeigt
die Wirkung der täglichen
Verabreichung von aFGF auf die Knochendichte der Wirbel von ovarektomierten
Ratten.
-
9 zeigt
die Serum-Fluoridgehalte nach der Verabreichung von Methoxyfluran.
-
10 zeigt
die Wirkung der zyklischen Verabreichung von aFGF auf die Knochendichte
von Ratten.
-
11 zeigt
die Wirkung von aFGF auf die Knochenmasse von ovarektomierten Ratten.
-
Beschreibung
der bevorzugten Ausgestaltungen
-
Ein
bevorzugter Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung stellt eine
Verwendung von FGF zur Stimulation der periostalen Knochenbildung
zur Verfügung,
die von Nutzen ist bei der Behandlung von pathologischen Zuständen, bei
denen eine unzureichende Knochenmasse vorliegt, oder zur Behebung
von Defekten des Knochen- oder des Zahngewebes. Die vorliegende
Erfindung dient der Verbesserung der periostalen Knochenbildung
durch lokale Anwendung zur Förderung
der Netto-Erhöhung
des kortikalen Knochens.
-
Die
Erfindung schließt
sowohl die Verwendung von natürlich
vorkommenden Fibroblasten-Wachstumsfaktoren in teilweise gereinigter
und im wesentlichen homogener Form als auch von synthetisch oder
rekombinatorisch hergestellen Fibroblasten-Wachstumsfaktoren, von biologisch aktiven
Fragmenten dieser Fibroblasten-Wachstumsfaktoren
und von pharmazeutisch akzeptablen Salzen und Derivaten dieser Fibroblasten-Wachstumsfaktoren
ein.
-
Definitionen
-
"Im wesentlichen gereinigt" wird hier wie "im wesentlichen homogen" verwendet, dieser
Begriff definiert Protein-Materialien, die im wesentlichen frei
von Verbindungen sind, mit denen sie im natürlichen Zustand assoziiert
sind (z. B. andere Proteine oder Peptide, Kohlenwasserstoffe, Lipide).
In den am meisten bevorzugten Fällen
bezieht sich dieser Begriff auf ein Polypeptid, das glykosyliert
oder nicht glykosyliert sein kann und das sich durch ein bestimmtes
Molekulargewicht und/oder eine multiple Reihe von Molekulargewichten,
sein chromatographisches Retentionsverhalten und Elutionsprofil,
seine Aminosäurenzusammensetzung
und -sequenz und seine biologische Aktivität auszeichnet. "Im wesentlichen gereinigt" ist nicht als ein
Begriff zu verstehen, der künstliche
beziehungsweise synthetische Gemische mit anderen Verbindungen ausschließt. Durch diesen
Begriff soll auch nicht die Gegenwart von Verunreinigungen ausgeschlossen
werden, die die biologische Aktivität nicht beeinträchtigen
und die beispielsweise auf Grund von unvollständiger Reinigung oder Mischen
mit einer pharmazeutisch akzeptablen Zubereitung vorhanden sind.
-
Der
Begriff "Tier" umfasst Säugetiere,
wie Hunde, Katzen, Pferde, Kühe,
Schweine, Ratten, Mäuse und
Affen, sowie Menschen.
-
Unter
dem Begriff "biologisch
aktives Polypeptid" ist
ein natürlich
vorkommendes Polypeptid als solches ebenso wie dessen biologisch
aktive Analoga, einschließlich
synthetisch hergestellter Polypeptide und derer Analoga, sowie natürliche und
pharmazeutisch akzeptable Salze und pharmazeutisch akzeptable Derivate
eines solchen Polypeptids zu verstehen.
-
Der
Begriff "biologisch
aktives Polypeptid" schließt auch
die biologisch aktiven Fragmente sowie die biologisch aktiven Sequenzanaloga
von biologisch aktiven Polypeptiden ein. In der Natur können verschiedene Formen
vorkommen. Diese Varietäten
können
sich durch Unterschiede in der Nukleotidsequenz des Strukturgens,
das die Proteine gleicher biologischer Funktion kodiert, auszeichnen.
-
Der
Begriff "biologisch
aktives Sequenzanalogon" schließt sowohl
natürlich
als auch nicht natürlich vorkommende
Analoga ein, die einzelne oder mehrfache Aminosäure- Substitutionen, -Fehlstellen, -Ergänzungen
oder -Ersetzungen aufweisen. Der Schutzbereich der vorliegenden
Erfindung erstreckt sich auf all diese allelen Varietäten, Modifikationen
und Analoga, aus welchen Derivate resultieren, in denen eine oder
mehrere der ursprünglichen
biologischen Aktivitäts-Eigenschaften
erhalten sind.
-
Der
Begriff "FGF-1" umfasst die 154-Reste-Form
der sauren Wachstumsfaktoren FGF-1 (auch bekannt als ECGF-β), die des
1–15-Form
und die des 1–21-Form
(auch bekannt als ECGF-α).
FGF-1 kann nach den auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt
werden. Der im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendete Fibroblasten-Wachstumsfaktor FGF-1
wird vorzugsweise durch Rekombinationstechnologie wie im US-Patent
Nr. 4 868 113 veröffentlicht
hergestellt.
-
Zur
Reinigung der für
die Ausführung
der vorliegenden Erfindung nützlichen
Polypeptide, die entweder aus natürlichen Quellen stammen oder
rekombinatorisch hergestellt wurden, können chromatographische Verfahren
angewendet werden, beispielsweise eine chromatographische Aufbereitung
in einer Säule
mit geringem Durchmesser, die ein Harz geringer Korngröße enthält, unter
erhöhtem
Druck zur Erhöhung
der Effizienz der Trennung, d. h. eine Hochdruckflüssigkeitschromatographie.
-
Aufkonzentration
und Entfernung von Salzen sind häufig
angwendete Schritte bei bestimmten, im Rahmen der Erfindung durchgeführten chromatographischen
oder anderen Trennverfahren.
-
Die
Entfernung von Salzen ist im Allgemeinen notwendig, wenn Ionenaustauscher- oder andere Verfahren
angewendet werden, bei denen die Ionenstärke eine Rolle spielt. Die
Entfernung von Salzen kann beispielsweise durch Dialyse oder Gelfiltration
oder mittels Controlled-Pore-Glass-(CPG)-Chromatographie erfolgen.
-
Es
werden auch verschiedene Gelfiltrations- und Konzentrationsverfahren
angewendet. Bestimmte kommerziell erhältliche Materialien sind besonders
nützlich.
Sephacryl, Sephadex und Bio-Gel sind Beispiele für Gelfiltrationsmedien, die
zur Isolierung und Reinigung von Proteinen und zur Bestimmung ihrer
physikalischen Eigenschaften häufig
eingesetzt werden.
-
Die
Erfindung schließt
die Verwendung von Fibroblasten-Wachstumsfaktoren, vorzugsweise
von FGF-1, bFGF und neuen, aus WISH-Zellen isolierten Formen von
basischem FGF, zur Behandlung von Knochenerkrankungen, die mit einer
verringerten Skelettmasse oder einer gestörten oder unzureichenden Knochbildung
verbunden sind, ein.
-
Saure
und basische Fibroblasten-Wachstumsfaktoren stimulieren das Wachstum
menschlicher Zellen des Osteoblasten-Phänotyps sowie derer Vorläufer. Im
Rahmen einer Ausgestaltung stellt die vorliegende Erfindung eine
Verwendung der Fibroblasten-Wachstumsfaktoren
zur Behandlung von beim Menschen oder bei Tieren auftretenden Störungen zur
Verfügung,
die sich durch ein abnormal verringertes Maß der Osteoblasten-Zellproliferation
auszeichnen.
-
Die
Verabreichung der Fibroblasten-Wachstumsfaktoren zur Erreichung
der therapeutischen Ziele der vorliegenden Erfindung kann lokal,
parenteral, intravenös,
intramuskulär,
subkutan, rektal oder auf jedem anderen geeigneten Weg erfolgen.
Die Dosierung, in der die Fibroblasten-Wachstumsfaktoren verabreicht
werden, kann vom Alter und Gewicht, von der Art der gegebenenfalls
gleichzeitig durchgeführten
weiteren Behandlung und der Art des Knochenleidens, das behandelt
wird, abhängen.
-
Die
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können angewendet werden, indem
Fibroblasten-Wachstumsfaktoren beispielsweise in Form von flüssigen Lösungen,
Suspensionen, Elixieren oder sterilen flüssigen Formen verabreicht werden.
Zu den geeigneten Trägerstoffen
gehören
Verdünnungsmittel
und Füllstoffe,
sterile wässerige
Medien und verschiedene ungiftige organische Lösungsmittel. Die Zusammensetzungen
können
in Form von Pulvern, wässerigen
Suspensionen oder Lösungen,
injektablen Lösungen,
Elixieren, Sirupen und ähnlichem
formuliert werden und können
zum Erhalt einer pharmazeutisch akzeptablen Zubereitung ein oder
mehrere Stabilisierungsmittel, wie menschliches Serum-Albumin, Zucker
(einschließlich
der Glykosoaminoglykane, wie Heparin, oder Heparinfragmente, jedoch
auch andere Zucker) oder Aminosäuren,
antibakterielle Substanzen und Konservierungsmittel enthalten. Es
wird vorzugsweise ein beliebiger inerter Trägerstoff wie Kochsalzlösung oder
phosphatgepufferte Kochsalzlösung,
oder ein beliebiger Trägerstoff,
in dem die bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten
Faktoren geeignete Lösungseigenschaften aufweisen,
verwendet. Träger
wie devitalisiertes Knochenpulver, Hydroxyapatit und Fibrin-Sealant
können
zur Ausführung
der vorliegenden Erfindung ebenfalls verwendet werden.
-
Der
jeweilige Trägerstoff
und das Verhältnis
aktive Verbindung/Trägerstoff
werden bestimmt von der Löslichkeit
und den chemischen Eigenschaften der Protein-Faktoren, der jeweiligen
Art der Verabreichung und den pharmazeutischen Standardverfahren.
Zur parenteralen Verabreichung können
Lösungen
oder Suspensionen dieser Faktoren in wässerigen alkoholischen Medien
oder in Sesam- oder Erdnussöl
oder wässerige Lösungen der
löslichen,
pharmazeutisch akzeptablen Salze verwendet werden.
-
Der
bei der Ausführung
der Erfindung angewendete Dosierungsplan wird so gewählt, dass
bis zum Eintritt einer Besserung Dosen verabreicht werden, die eine
maximale therapeutische Wirkung erzielen, und anschließend Dosen
gegeben werden, die die minimale wirksame Dosierung darstellen,
welche Erleichterung bringen. Die Dosen können in Abhängigkeit von Alter, Konstitution,
Körpergewicht
und anderen Merkmalen des Patienten variieren, im Falle von injektablen
Formen liegen sie jedoch im Allgemeinen im Bereich von 0,1 bis 500
mg/kg, vorzugsweise van 1 bis 250 mg/kg und am meisten bevorzugt
von 5 bis 100 mg/kg Körpergewicht;
diese Dosen können
selbstverständlich
in Teildosen verabreicht werden. Im Falle von anderen Darreichungsformen
werden in Abhängigkeit
vom jeweiligen Verabreichungsweg gleichwertige beziehungsweise entsprechend
angepasste Dosen verabreicht.
-
Die
folgenden Beispiele beschreiben die Isolierung und Reinigung der
Fibroblasten-Wachstumsfaktoren sowie die Bestimmung ihrer biologischen
Aktivität
und ihre Verwendung als therapeutische Mittel zur Vorbeugung und
Behandlung von pathologischen Zuständen im Zusammenhang mit Knochendefekten
und Verletzungen.
-
BIEISPIEL 1
-
Untersuchung
der proliferativen Wirkung van Fibroblasten-Wachstumsfaktoren auf
Osteosarkomzellen und Osteoblasten-Knochenzellen
-
Die
proliferative Wirkung von Fibroblasten-Wachstumsfaktoren auf menschliche
MG-63-Osteosarkomzellen und MC3T3-Knochenzellen wird durch Messung
des Einbaus von Tritium-markiertem Thymidin in die DNA der Zellen
bestimmt.
-
Menschliche
MG-63-Osteosarkomzellen, bezogen von der American Type Culture Collection
(Rockville, MD), werden gezüchtet
in Eagle's Minimum
Essential Medium (EMEM), dem 10% Fetales Kälberserum (FBS) zugesetzt werden.
MC-3T3EI-Osteoblasten der Maus, zur Verfügung gestellt von Dr. T. Suda
(Showa-Universität
Tokio) werden gezüchtet
in α-modifiziertem
Eagle's-Medium (αMEM), dem
10% Fetales Kälberserum
(FBS) zugesetzt werden. Alle Kulturen werden bei 37°C in einer
befeuchteten Atmosphäre
von 5% CO2 in Luft bebrütet.
-
Die
MG-63- und die MC3T3-Zellen werden in 96-Well-Platten in einer Menge
von 5 × 103 Zellen/100 μl/Well in mit 10% FBS versetztem
EMEM beziehungsweise αMEM
gesät.
Nach etwa 18–24-stündiger Inkubation
werden die Zellen mit 200 μl/Well
phosphatgepufferter Kochsalzlösung
(PBS) gewaschen, wiederum mit 50 μl/Well serumfreiem
0,1%-igem BSA in EMEM oder αMEM
genährt
und es werden 50 μl/Well
einer Wachstumsfaktoren enthaltenden Probe, verdünnt in 0,1% BSA in DMEM/F12,
zugegeben. Basislinien-Kontrollproben (50 μl/Well 0,1% BSA in DMEM/F12
50/50) sowie positive Kontrollproben (50 μl/Well 20% FBS in DMEM/F12 50/50)
werden in jeder Platte parallel zu der untersuchten Probe gefahren.
Etwa 44 Stunden nach Zugabe der Probe sowie der Kontrollproben werden
die Zellen 4 Stunden mit 1 μCi/Well
[3H-Methyl]-Thymidin gepulst. Nach 4 Stunden werden
die Zellen geerntet und mit Hilfe eines PHD-Zellernte-Geräts (Cambridge Technology, Watertown,
MA) abgeerntet und über
Filterpapierblättern
gespült.
Die auf den Filtern zurückbleibende
Radioaktivität
wird unter Verwendung eines Szintillationszählers (Beckman, Fullerton,
CA) in cpm gemessen.
-
Die
proliferative Aktivität
jeder Probe (zweifache Versuchsdurchführung) wird entsprechend der
folgenden Formel ausgedrückt
als die auf den entsprechenden Wert der positiven Kontrollprobe
bezogene, prozentuale Stimulation des Einbaus von 3H-Thymidin:
-
-
BEIPIEL 2
-
Reinigung der biologischen
Aktivität
von verlängertem
bFGF aus WISH-Zellen
-
A: In Vivo-Tumorwachstum
-
Menschliche
Amnion-Tumorzellen (2 × 107) wurden vierzehn 4 Wochen alten, männlichen
Nacktmäusen
im an den Schaft des Oberschenkelknochens angrenzenden Bereich in
die rechte Hinterhand injiziert. Nach 3–5 Wochen wurden den Tieren
solide Tumoren entfernt. Zu diesem Zeitpunkt wurde sowohl radiologisch als
auch histologisch neues Knochenwachstum nachgewiesen. Bei 10 Mäusen haftete
der Tumor dicht an der Knochenoberfläche an und in all diesen Fällen wurde
neues Knochenwachstum nachgewiesen. Das Wachstum von neuem Knochen
war leicht zu erkennen an seiner mehr geflechtartigen als lamellären Struktur
und war stark ausgeprägt
an den periostalen Knochenoberflächen,
an denen die Tumormasse anhaftete. Der solide Tumor wurde vom Knochen
entfernt und zur anschließenden
Proteinaufbereitung sofort in flüssigem
Stickstoff tiefgefroren. Für
eine quantitative Histomorphometrie wurden die Zellen (1 × 107 Zellen/0,2 ml PBS) oberhalb der Calvaria
von Nacktmäusen
(n = 8) subkutan injiziert. Nach zwei Wochen wurden die Mäuse getötet. Bei
sechs Mäusen
haftete der Tumor dicht an der Knochenoberfläche an. Die histologischen
Verfahren zur Präparation der
Knochenproben entsprachen den im folgenden Beispiel 3 beschriebenen
Verfahren. Oberhalb der Calvaria dieser Mäuse war stark ausgeprägte neue
Knochenbildung zu verzeichnen (1) und die
Querschnittsfläche
des Calvariaknochens war erhöht:
96 ± 37
(Standardabweichung) %.
-
B: Isolierung und Reinigung
von verlängertem
bFGF
-
Fünfundzwanzig
Gramm festes Tumorgewebe, das aus dem Oberschenkel von tumorbefallenen
Mäusen
isoliert wurde, wurden in flüssigem
Stickstoff pulverisiert, durch 72-stündiges Rühren bei 4°C in 125 ml Extraktionspuffer,
der 10 mM EDTA, 50 mM Tris HCl, pH 7,0, 1,5 M NaCl, 25 mM Benzamidin,
jeweils 1 μg/ml Leugeptin
und Aprotinin und 1 mM PMSF (gelöst
in 100% Isopropanol) enthielt, extrahiert und schließlich auf einen
pH-Wert von 7,0 eingestellt. Nach 72 Stunden wurde der Extrakt 20
min bei 4°C
bei 6 000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und
bei –70°C tiefgefroren.
-
Es
wurde eine zweite Extraktion des unlöslichen Präzipitats aus der ersten Extraktion
mit demselben Puffer durchgeführt,
wobei das Pellet mit 250 ml frischem Extraktionspuffer versetzt
und das Gemisch weitere 24 Stunden bei 4°C gerührt wurde. Anschließend wurde
der Extrakt 20 min bei 4°C
bei 6 000 U/min zentrifugiert. Die Überstände aus der ersten und der
zweiten Extraktion wurden vereinigt und bei 4°C einer 1-stündigen Hochgeschwindigkeitszentrifugation
bei 15 000 g unterzogen. Der Überstand
wurde abgenommen und gegen 10 mM Tris-HCl, 0,1 M NaCl, pH 7,0, dialysiert.
Die Proteinkonzentration wurde mit Hilfe der Absorption bei 280
und 260 nm bestimmt.
-
Eine
4,8 × 30
cm-Säule
wurde mit Heparin-Sepharose CL-6B gepackt und mit Puffer (0,1 M
NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7) äquilibriert.
Der zuvor erhaltene letzte Extrakt (ungefähr 200 ml) wurde auf die Säule aufgegeben.
Die Säule
wurde mit demselben Puffer gespült
und mit einem linearen Gradienten (0,4–3,0 M NaCl) eluiert. Es wurden
12 ml-Fraktionen
abgenommen. Aliquote Mengen aller Fraktionen wurden mit Hilfe der
in Beispiel 1 beschriebenen MG-63- und MC3T3-Zellproliferationstests
untersucht. Die Fraktionen, die eine MG-63-proliferative Aktivität aufwiesen,
wurden bei 1,5 M NaCl eluiert und über Heparin-Sepharose unter
denselben Bedingungen wie zuvor erneut chromatographiert. Die Fraktionen,
die eine MG-63-proliferative Aktivität aufwiesen, wurden bei 1,8
M NaCl eluiert. Diese Fraktionen (34–44) wurden vereinigt, auf
0,05% CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propan-sulfonat;
ein mildes zwitterionisches Detergens) eingestellt und gegen 50
mM Natriumphosphat, pH 6,0, 0,05% CHAPS, dialysiert. Das Dialysat
wurde über
einer MonoS-FPLC-Säule
mit einem Gradienten von 0 bis 1,0 M NaCl in 50 mM Natriumphosphat,
pH 6,0, 0,05% CHAPS, chromatographiert. Es wurden Fraktionen zu
je 0,8 ml abgenommen. Die MG-63-positiven Fraktionen (26–32) wurden
vereinigt, auf eine C4- oder C18-HPLC-Säule aufgegeben und mit einem
Gradienten von 7 bis 63% Acetonitril in 0,1% TFA chromatographiert.
Zur Bestimmung der biologischen Aktivität wurden 10% des Materials
auf einer C18-RP-HPLC-Säule chromatographiert
und die Fraktionen in einer neutralisierenden Lösung (24 mM Ammoniumhydrogencarbonat
pH 8, 0,1% BSA, 2 μg/ml
Heparin und 0,01% CHAPS) aufgefangen. Das bei 37% Acetonitril eluierte
Protein wurde einer SDS-PA-Gelelektrophorese
(15% Gel) unterzogen und auf eine Nitrocellulosemembran (0,45 μm, Schleicher & Schuell, Keene,
NH) übertragen.
Die Aminosäuresequenz
wurde durch automatisierten Edman-Abbau unter Verwendung eines mit
einem online-Analyzer Modell 120A PTH ausgestatteten Applied Biosystems
Proteinsequenzanalysators Modell 477A ermittelt. Die Aminosäuresequenz
des gereinigten, aus den WISH-Zellen isolierten Polypeptids ist ähnlich,
jedoch nicht identisch mit der Aminosäuresequenz von bFGF. Die neue
Sequenz scheint eine bislang unbekannte verlängerte Form von basischem FGF
zu definieren, die die zusätzliche
Aminosäuresequenz
GSRPGAGT (Seq.-Id.-Nr.: 1) als Verlängerung des N-terminalen Endes
MAAGSIT (Seq.-Id.-Nr.: 2) der bekannten 18 kD-Form von bFGF aufweist.
-
BEISPIEL 3
-
In vivo-Untersuchung
der Wirkung der Polypeptide auf das Knochenwachstum
-
Der
Einfluss der Polypeptid-Faktoren auf das Knochenwachstum wurde an
männlichen
weißen ICR/SWISS-Mäusen untersucht,
die 4–6
Wochen alt waren und 13–26
g wogen, wobei mit Gruppen zu je 4–5 Mäusen gearbeitet wurde. Das
Polypeptid oder eine Kontroll-Trägersubstanz
wurde in das subkutane Gewebe oberhalb der rechten Hälfte der
Calvaria normaler Mäuse
injiziert. Unter den getesteten Polypeptiden waren der Rohextrakt
aus WISH-Tumoren, der die verlängerte
Form von bFGF enthält
und der wie in Beispiel 2 beschrieben isoliert wurde, sowie bFGF
und FGF-1, das aFGF enthält.
Diese Testproteine wurden entweder allein oder zusammen mit Heparin
injiziert.
-
Sofern
nichts anderes vermerkt ist, wurde als Kontroll-Trägersubstanz
PBS mit 1% BSA verwendet. Heparin wurde in einer Dosis von 50 Einheiten/ml
verabreicht. Die Tiere wurden am 14. Tag getötet und das Knochenwachstum
durch Histomorphometrie bestimmt.
-
Knochenproben
zur Quantifizierung wurden von anhaftendem Gewebe gesäubert, für 24–48 Stunden in
10%-igem, gepuffertem Formalin fixiert, 1–3 Wochen in 14%-igem EDTA
dekalzifiziert, mit Hilfe einer aufsteigenden alkoholischen Reihe
dehydratisiert und in Paraffin-Wachs eingebettet. Es wurden 3 μm-Schnitte der
Calvaria und des Oberschenkelknochens präpariert. Zur histomorphometrischen
Bestimmung der Wirkung der aFGF oder bFGF enthaltenden Tumoren,
Tumorextrakte und Fibroblasten-Wachstumsfaktoren auf die Knochenbildung
und den Knochenabbau wurden repräsentative
Schnitte ausgewählt.
Die Schnitte wurden unter Verwendung einer Camera-Lucida-Anordnung
ausgemessen, mit der das mikroskopische Bild direkt auf eine digitale
Platte übertragen
wurde. Veränderungen
des Knochens wurden an Hand von Schnitten gemessen, die über 4 aneinander
angrenzende 1 × 1
mm-Felder beider Seiten der Calvaria – der Seite, in die injiziert wurde,
und der Seite, in die nicht injiziert wurde – in Abständen von 200 μm gewonnen
wurden. Neues Knochengewebe wurde auf Grund seiner mehr geflechtartigen
als lamellären
Struktur identifiziert und Osteoklasten sowie Osteoblasten wurden
auf Grund ihrer charakteristischen Morphologie identifiziert. Die
Histomorphometrie-Software (Osteomeasure, Osteometrix Inc., Atlanta)
wurde zur Prozessierung des Digitizer-Inputs zur Bestimmung von
Zellzahlen sowie zur Darstellung von bestimmten Bereichen oder Umrissen
eingesetzt.
-
Um
festzustellen, ob eine normale Mineralisation des neu gebildeten
Knochens stattgefunden hat, wurden auch Knochenproben aus der Calvaria
genommen, nachdem den Tieren zwei Dosen Tetrazyklin (25 mg/kg i.
p.) verabreicht wurde. Das Tetrazyklin wird an den Stellen abgelagert,
an denen aktive Knochenbildung stattfindet, es fungiert daher als
ein zeitabhängiger
Gewebsmarker zur Berechnung von Knochenbildungsraten und zur Beurteilung
der Mineralisation. Diese Knochenproben wurden wie oben beschrieben
fixiert, mit Hilfe einer aufsteigenden alkoholischen Reihe dehydratisiert
und – um
die Tetrazyklin-Marker zu erhalten – ohne Dekalzifizierung in
einen Kunststoff auf Methacrylat-Basis eingebettet. Es wurden in
5 μm-Abständen Schnitte
gewonnen und auf Mineralisationsgrad und Tetrazyklin-Aufnahme untersucht.
Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Beispiel 4 beschrieben.
-
BEISPIEL 4
-
In vivo-Untersuchung der
Wirkung der Fibroblasten-Wachstumsfaktoren auf das Knochenwachstum
-
Die
Wirkung der Polypeptid-Faktoren auf das Knochenwachstum wurde an
männlichen
weißen ICR/SWISS-Mäusen gemessen,
die 4–6
Wochen alt waren und 13–26
g wogen, wobei mit Gruppen zu je 4–5 Mäusen gearbeitet wurde. Das
Polypeptid oder eine Kontroll-Trägersubstanz
wurde in das subkutane Gewebe oberhalb der Calvaria normaler Mäuse injiziert.
Unter den getesteten Polypeptiden waren verlängertes bFGF, das wie in Beispiel
2 beschrieben aus WISH-Zellen isoliert wurde, die Full-Length-Form
(mit 155 Resten) des Fibroblasten-Wachstumsfaktors-1 und der basische
FGF. Diese Testproteine wurden entweder allein oder zusammen mit
Heparin injiziert.
-
In
einem der Experimente diente PBS mit 1% BSA Zusatz als Kontroll-Trägersubstanz.
Heparin wurde in einer Dosis von 50 Einheiten/ml verabreicht. In
Tabelle 1 sind die Ergebnisse der Tests zusammengestellt, bei denen
an drei aufeinanderfolgenden Tagen jeweils vier (sofern aufgenommen)
Injektionen der Trägersubstanz
allein, der Trägersubstanz
unter Heparinzusatz, von 5 μg
FGF-1 oder IGF-2, von 1 μg
aFGF zusammen
mit Heparin oder eines Rohextrakts aus der ersten ("WISH roh") oder zweiten ("WISH teilweise gereinigt
(pp)") Extraktion
aus WISH Zellen verabreicht wurden. Die Tiere wurden am 14. Tag
getötet
und das Knochenwachstum histomorphometrisch bestimmt.
-
-
Wie
aus Tabelle 1 hervorgeht, war FGF-1, das zusammen mit Heparin oberhalb
der Calvaria von Mäusen
injiziert wurde, fähig,
neue periostale Knochenbildung zu induzieren. In diesem Experiment
führte
keine andere Behandlung zu einer im Vergleich zur Kontrollprobe
signifikanten Erhöhung
der Bildung von neuem Knochen. Die proliferative Aktivität der ohne
gleichzeitige Verabreichung von Heparin injizierten WISH-Extrakte
entsprach vermutlich nur der Aktivität von 10–100 ng FGF. In keiner der
behandelten Gruppen wurde ein verstärkter Knochenabbau nachgewiesen.
-
Zur
weiteren Untersuchung der Wirkung von Fibroblasten-Wachstumsfaktoren
auf das Knochenwachstum und des Einflusses von Heparin auf die Stimulation
des Knochenwachstums wurde männlichen
weißen
ICR/SWISS-Mäusen,
die 4–6
Wochen alt waren (wobei jede Behandlung an einer Gruppe von 5 Mäusen durchgeführt wurde),
durch Injektion oberhalb der Calvaria an drei aufeinanderfolgenden
Tagen 4 Mal täglich 1 μg FGF-1 beziehungsweise
bFGF in einem Volumen von 10 μl
in Gegenwart oder in Abwesenheit von Heparin verabreicht. Als Kontroll-Trägersubstanz
wurde 0,1% BSA in PBS verwendet. Heparin wurde in einer Dosis von
50 Einheiten/ml verabreicht. Demeclozyklin (25 mg/kg) wurde zur
Berechnung der Knochenbildungsraten und zur Beurteilung der Mineralisation
an den Tagen 4, 8 und 12 IP verabreicht.
-
Die
Mäuse wurden
am 14. Tag getötet
und die hintere Hälfte
der Calvaria wurde dekalzifiziert und in Paraffin eingebettet. Die
vordere Hälfte
der Calvaria, die Metaphyse der Tibia und die Metaphyse des Oberschenkelknochens
sowie die Lendenwirbel wurden ohne Dekalzifizierung in Kunststoff
eingebettet. Die Mäuse, die
aFGF und bFGF erhalten hatten, zeigten eine stark ausgeprägte Bildung
von neuem Knochen auf der oberen Oberfläche der Calvaria (2).
Keine Wirkung war zu verzeichnen in der Metaphyse des Oberschenkelknochens
und den Wirbeln. Der neue Knochen wurde in den zuletzt entstandenen,
oberflächlichen
Schichten gebildet. Er verfügte über eine
gute Mineralisation und zeigte die für geflechtartiges Knochengewebe
typische diffuse Aufnahme der Demeclozyklin-Marker.
-
-
Tabelle
2 und 3 zeigen, dass sowohl aFGF als auch bFGF die Bildung
von neuem Knochen stimulieren und die Osteoblasten-Oberfläche, die
Fläche
des periostalen Knochens und die Gesamt-Knochenfläche erhöhen, und
zwar jeweils in Gegenwart wie auch in Abwesenheit von Heparin. Die
durch bFGF bewirkte erhöhte
Bildung von neuem Knochen unterhalb der Calvaria (% neuer endostaler
Knochen) wird allerdings durch Heparin inhibiert (3).
-
Es
wurde der zeitliche Verlauf der Knochen-Veränderungen im Anschluss an die
Stimulation durch Injektion von 1 μg/Injektion aFGF, das zusammen
mit Heparin verabreicht wurde, untersucht. Die Verfahrensweise war
dieselbe wie oben beschrieben, jedoch wurden für jeden Zeit-Punkt acht Tiere
injiziert. Jeweils vier Tieren wurde nur die Trägersubstanz injiziert, den übrigen vier
FGF-1 und Heparin. Die Mäuse
wurden am 3., 7., 14., 21. und 36. Tag getötet und die Veränderungen
des Knochens wurden an Hand von zwei Ebenen, die einen Abstand von
mindestens 200 μm
aufwiesen, bestimmt.
-
-
Wie
aus Tabelle 3 ersichtlich ist, führt
FGF-1 zu einer anhaltenden Stimulation der Knochenbildung: nach
dreitägiger
Behandlungsdauer hält
die stimulierende Wirkung 21 Tage lang an (4). Die
anfängliche Wirkung
ist eine Zellproliferations-Wirkung,
die einhergeht mit einer Differenzierung der Osteoblasten und einer
Matrixbildung nach nur 3-tägiger
Behandlungsdauer (5). Es liegt kein Hinweis auf
eine verstärkte
Bildung von Osteoklasten in irgendeinem der untersuchten Zeiträume vor.
-
Es
wurde auch die Dosis-Abhängigkeit
der Knochenveränderungen
im Anschluss an die Stimulation durch 4 Mal tägliche Injektion von 0,5 ng,
5,0 ng, 50 ng oder 500 ng FGF-1 oder bFGF, jeweils mit und ohne gleichzeitige
Gabe von Heparin (50 Einh./ml), untersucht. Jede Behandlungsgruppe
bestand aus 4 männlichen weißen ICR/SWISS- Mäusen eines Alters von 4–6 Wochen.
14 Mäuse
bildeten die Kontrollgruppe, sieben erhielten nur die Trägersubstanz
(PBS + 0,1% BSA), die übrigen
sieben erhielten die Trägersubstanz
und Heparin.
-
Die
Mäuse wurden
am 14. Tag getötet
und die Calvaria wie oben beschrieben präpariert. 6 zeigt, dass
sowohl aFGF als auch bFGF in vivo im Nanogramm-Maßstab
wirksam sind. Während
im Falle von alleiniger Heparin-Verabreichung keine Wirkung auf
das Knochenwachstum zu verzeichnen war, verstärkte Heparin die Wirkung sowohl
von aFGF als auch von bFGF insbesondere auf der Seite der Calvaria,
in die nicht injiziert wurde.
-
2 zeigt,
dass sowohl FGF-1 als auch bFGF zu einer stark ausgeprägten Bildung
von neuem, geflechtartigem Knochengewebe auf der oberen periostalen
Oberfläche
führte,
wobei dieses Knochengewebe schnell mineralisiert wurde. Basischer
FGF führte
zu einer maximalen Erhöhung
der Stärke
der Calvaria von mehr als 100% auf der Seite, in die injiziert wurde,
und induzierte auch auf der Unterseite der Calvaria die Bildung
von neuem Knochen. Heparin verstärkte
die Wirkung von aFGF. Weder aFGF noch bFGF verstärkten den Knochenabbau oder
erhöhten
die Zahl der Osteoklasten. In einer Studie zu zeitlichem Verlauf
und Dosisabhängigkeit
zeigten aFGF und Heparin eine zunächst kräftige, aber nur kurz andauernde
Wirkung auf die Fibroblasten. Osteoblasten-Proliferation war klar erkennbar vom
3. bis zum 21. Tag. Bis zum 36. Tag war die Osteoblasten-begrenzte
obere periostale Oberfläche
wieder zum Normalzustand zurückgekehrt
und das zuletzt gebildete Knochengewebe wies eindeutig lamellären Charakter
auf. Die Wirkungen zeigten auch eine Abhängigkeit von der Dosis, wobei
eine maximale Wirkung bei 50 ng/Injektion zu verzeichnen war.
-
BEISPIEL 5
-
In Vivo-Wirkung der Systemischen
Verabreichung von FGF-1 bei ovarektomierten Ratten
-
Die
ovarektomierte Ratte stellt ein anerkanntes Tiermodell für die postmenopausale
Osteoporose beim Menschen dar. Zur Bestimmung der Wirkung der Systemischen
Verabreichung von aFGF auf Skelettgewebe an einem Tiermodell mit
akutem Knochenschwund, der mit einem Östrogenmangel verbunden ist, ähnlich wie er
bei post-menopausalen Frauen zu beobachten ist, wurden weibliche
Sprague-Dawley-Ratten (250 g) entweder scheinoperiert oder chirurgisch
ovarektomiert. Sieben Tagen nach der Operation wurde damit begonnen,
den Ratten über
einen Zeitraum von 28 Tagen die Trägersubstanz (PBS), aFGF (0,2
mg/kg i. v. über
die Schwanzvene) oder Östrogen (160 μg/kg s. c.)
zu verabreichen. Sämtliche
Injektionen wurden unter Methoxyfluran-Betäubung
durchgeführt.
Vor der Tötung
wurden allen Ratten zur Messung der Knochenbildung und der Mineralisation
Einzeldosen an Tetrazyklin und Demeclozyklin verabreicht. Die Tibiae
und die Lendenwirbel wurden entnommen, fixiert und zur histomorphometrischen
Auswertung sowohl in dekalzifizierter als auch in nicht dekalzifizierter
Form weiterverarbeitet.
-
Die
Fläche
des porösen
Knochens (ausgedrückt
in %, bezogen auf die Fläche
des Gewebes) wurde an Hand von dekalzifizierten Schnitten der Tibia-Metaphyse
und der Lendenwirbel quantifiziert. Im Vergleich zu den mit der
Trägersubstanz
behandelten ovarektomierten Ratten war die Knochenfläche im Bereich
der sekundären
Spongiosa der Tibia sowohl im Falle der scheinoperierten Ratten,
denen die Trägersubstanz
oder aFGF verabreicht worden war, als auch im Falle der ovarektomierten
Ratten, denen FGF-1 oder Östrogen
verabreicht worden war, deutlich erhöht (7). Ähnliche,
jedoch nicht signifikante Veränderungen
der porösen Knochenfläche wurden
im Falle der Lendenwirbel beobachtet (8). Diese
Daten zeigen, dass FGF-1 den mit einem Östrogenmangel verbundenen porösen Knochenschwund
in der sekundären
Spongiosa stoppte. Darüber
hinaus wurde die periostale Knochenbildung bei scheinoperierten
Ratten durch Behandlung mit FGF-1 erhöht.
-
Die
qualitative Beurteilung von Schnitten aus der Tibia und den Wirbeln
ergab, dass die tägliche
Injektion von aFGF in den Wirbeln sowie der Diaphyse und der Epiphyse
der Tibia die Bildung von neuem, geflechtartigem Knochengewebe induzierte.
Die Auswertung von nicht dekalzifizierten Schnitten ergab, dass
aFGF zur Bildung von neuem Knochengewebe führte, das schwach mineralisiert
war. Dieser Mineralisationsdefekt schien eine Folge der Fluoridakkumulation
auf Grund der täglichen
Verabreichung des fluoridhaltigen, gasförmigen Betäubungsmittels zu sein. Diese
Vermutung wird gestützt
durch die Tatsache, dass bei diesen Ratten eine gleichzeitige Erhöhung des
Serum-Fiuoridspiegels beobachtet wurde (9).
-
Zur
Bestimmung der Wirkung der zyklischen Verabreichung von systemischem
FGF-1 auf das Skelett wurden 250 g-Sprague-Dawley-Ratten entweder
scheinoperiert oder chirurgisch ovarektomiert und 2 Monate nach
der Operation wurde damit begannen, den Ratten entweder die Trägersubstanz
oder FGF-1 zu verabreichen. Der Behandlungsbeginn erfolgte 2 Monate
nach der Operation, weil zu diesem Zeitpunkt in Folge des Östrogenmangels
eine ungefähr
50%-ige Verringerung des porösen
Knochengewebes in der Metaphyse der Tibia stattgefunden hat. Den
Ratten wurde an drei aufeinanderfolgenden Tagen jeweils eine Injektion
verabreicht, die entweder die Trägersubstanz
oder FGF-1 (0,5 mg/kg/Tag i. v.) enthielt, anschließend folgten
6 behandlungsfreie Tage. Dieser Verabreichungsplan wurde drei Mal
wiederholt. Die Ratten wurden am 28. Tag getötet. Vor der Tötung wurden
allen Ratten Einzeldosen an Tetrazyklin und Demeclozyklin verabreicht.
Tibiae, Oberschenkelknochen und Lendenwirbel wurden für histomorphometrische
und Zwei-Energie-Röntgen-absorptiometrische
Analysen entnommen.
-
Die
Knochenmineraldichte (BMD Bone Mineral Density), ein Wert zur Beurteilung
der Knochenmasse, wurde mit Hilfe eines LUNAR-Dexa-Geräts gemessen.
Die Knochenmineraldichte in der Metaphyse der Tibia, den Lendenwirbeln
und dem Oberschenkelknochen der mit aFGF behandelten Ratten war
im Vergleich zu der mit der Trägersubstanz
behandelten Gruppe erhöht
(10), Diese Daten wurden bestätigt durch Erhöhungen der
porösen
Knochenfläche,
die mittels histomorphometrischer Analyse der Tibia- und der Oberschenkelknochen-Metaphysen
der mit FGF-1 behandelten Ratten bestimmt wurden (11).
Die qualitative Beurteilung ergab, dass die zyklische systemische
Verabreichung von FGF-1 eine gewisse Bildung von geflechtartigem
Knochengewebe in den Schäften
der Röhrenknochen,
jedoch nicht in den Wirbeln oder der Epiphyse der Tibia induzierte.
Die Auswertung der Versuche mit den Tetrazyklin-Markern ergab, dass
der in Folge der Behandlung mit aFGF gebildete neue Knochen normal
mineralisiert war. Der Serum-Fluoridspiegel wurde bei diesen Tieren
nicht gemessen Diese Daten zeigen, dass aFGF die Knochenmasse im
Falle eines Modells mit bestehender und fortschreitender Osteopenie
erhalten und erhöhen
kann.
-
BEISPIEL 6
-
Wirkung der Systemischen
Verabreichung von FGF-1 bei gealterten ovarektomierten Ratten
-
Die
bestehende post-menopausale Osteoporose ist eine Krankheit, die
sich durch eine Verringerung der porösen und der kortikalen Knochenmasse,
geringe Knochenumbau-Raten
und einen verringerten Vernetzungsgrad der porösen Wirbelknochen auszeichnet.
Zur Beurteilung der möglichen
Wirkungen von FGF-1 auf diese Veränderungen wurde FGF-1 über einen
Zeitraum von 28 Tagen systemisch an gealterte ovarektomierte Ratten
verabreicht, ein Tiermodell für
bestehende kortikale und poröse
Osteopenie, geringe Knochenumbau-Raten und verringerten Vernetzungsgrad
der porösen
Wirbelknochen. Acht 10 Monate alte Sprague-Dawley-Ratten, die zuvor
Junge aufgezogen hatten, wurden entweder scheinoperiert oder chirurgisch
ovarektomiert. Sechs Monate nach der Operation wurde den ovarektomierten
Ratten entweder die Trägersubstanz
oder FGF-1 (0,2 mg/kg/Tag i. v.) verabreicht. Die scheinoperierten
Ratten erhielten nur die Trägersubstanz.
Sämtliche
Injektionen erfolgten unter Isofluoran-Betäubung. Die Hälfte der
Ratten jeder Behandlungsgruppe wurde nach 28-tägiger Behandlungsdauer getötet. Die
verbleibende Hälfte
wurde weitere 28 Tage ahne Behandlung gehalten, um die Langzeitfolgen
der Behandlung mit FGF-1 zu untersuchen. Vor der Tötung erhielten
alle Ratten 2 Injektionen von Calcein-Grün, das als zeitkodierter Knochengewebs-Marker
zur Berechnung der Knochenbildungsraten dient. Oberschenkelknochen,
Tibiae und Lendenwirbel wurden zur DEXA- und histomorphometrischen
Untersuchung wie im obigen Beispiel 5 beschrieben entnommen. Zur
Durchführung
von biomechanischen Analysen wurden die isolierten Lendenwirbel
in einem Materialuntersuchungsgerät bei konstanter Kompressionsrate
bis zum Brechen komprimiert. Das Brechen wird als der Punkt festgelegt,
an dem die Kraft-Verformungs-Kurve nach Erreichen einer maximalen
Druckfestigkeit wieder abfällt.
-
Die
DEXA-Analyse zeigte, dass die Behandlung mit FGF-1 eine geringe,
jedoch nicht signifikante Erhöhung
der Knochenmineraldichte in Oberschenkelknochen, Tibia und Wirbeln
am 28. Tag bewirkte. In den Röhrenknochen
ist diese Erhöhung
in der Diaphyse wie auch der Metaphyse offensichtlich, sie zeigt
eine Erhöhung
sowohl des kortikalen als auch des porösen Knochengewebes an. Es ist
zu vermuten, dass der Vernetzungsgrad der porösen Wirbelknochen bei den FGF-1-behandelten
Ratten am 28. und am 56. Tag erhöht ist.
Diese Veränderungen
kommen in der Folge zum Ausdruck in einer Erhöhung der Kompressionsfestigkeit der
Wirbel bei den mit FGF-1 behandelten Ratten. Diese Daten zeigen,
dass die systemische Verabreichung von FGF-1 sowohl die kortikale
als auch die poröse
Knochenmasse und auch den Vernetzungsgrad und die Festigkeit der
porösen
Wirbelknochen an einem Tiermodell für bestehende post-menopausale
Osteoporose erhöht.
-
Der
kundige Fachmann wird leicht erkennen, dass die vorliegende Erfindung
gut dazu geeignet ist, die oben genannten Zwecke zu erfüllen und
die genannten Ziele und Vorteile, einschließlich weiterer aus diesen hervorgehender
Ziele und Vorteile, zu erreichen. Die hier beschriebenen Peptide,
Antikörper,
Methoden, Verfahren und Techniken werden als repräsentative
Beispiele für
die bevorzugten Ausgestaltungen vorgestellt.
-
-
-
-
