DE69734832T2

DE69734832T2 - Zusammensetzungen und verfahren zum stimulieren von knochenwachstum

Info

Publication number: DE69734832T2
Application number: DE69734832T
Authority: DE
Inventors: R. Shirley GASPER; R. Robert WEST; Theresa Martinez; Nand Baindur; G. Kirk ROBBINS; M. Virender LABROO; A. Patricia MCKERNAN
Original assignee: Zymogenetics Inc
Current assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 1996-12-13
Filing date: 1997-12-12
Publication date: 2006-08-31
Anticipated expiration: 2017-12-13
Also published as: EP0944312A1; JP2001506635A; CA2274789A1; EP0944312B9; AU5798198A; JP2008044956A; WO1998025460A1; EP0944312B1; EP0944312A4; DE69734832D1; JP4269015B2; ATE311872T1; US6022887A; AU729793B2

Description

Die vorliegende Anmeldung beansprucht gemäss 35 USC 119 die Priorität der am 13. Dezember 1996 eingereichten Provisional Application SN 60/032,893, deren Inhalt durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht wird.
Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft Zusammensetzungen und die Verwendung von bestimmten Verbindungen bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verstärkung der Knochenbildung. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung spezieller Klassen von Verbindungen, die durch einen Screening-Test mit hohem Durchsatz identifiziert und in zusätzlichen biologischen Tests charakterisiert werden.
Technischer Hintergrund
Knochen stellen kein statisches Gewebe dar. Sie unterliegen ständig einem Abbau und einer Neusynthese, und zwar in einem komplizierten Verfahren, das durch Osteoblasten, die neuen Knochen erzeugen, und Osteoklasten, die Knochen zerstören, vermittelt wird. Die Aktivitäten dieser Zellen werden durch eine große Anzahl von Cytokinen und Wachstumsfaktoren reguliert, von denen zahlreiche identifiziert und kloniert worden sind. Mundy beschreibt die derzeitigen Erkenntnisse bezüglich dieser Faktoren (G. R. Mundy, Clin. Orthop., Bd. 324 (1996), S. 24–28; G. R. Mundy, J. Bone Miner. Res., Bd. 8 (1993), S. 505–510).
Obgleich zahlreiche Informationen über die Faktoren, die den Abbau und die Resorption von Knochen beeinflussen, zur Verfügung stehen, sind Informationen über Wachstumsfaktoren, die die Bildung von neuen Knochen stimulieren, begrenzter. Forscher haben nach Quellen für derartige Aktivitäten gesucht und dabei festgestellt, dass Knochengewebe selbst eine Fundgrube für Faktoren, die die Fähigkeit zur Stimulation von Knochenzellen haben, darstellt. So enthalten Extrakte von Rinderknochengewebe, das von Schlachthöfen bezogen wurde, nicht nur strukturelle Proteine, die für die Aufrechterhaltung des strukturellen Bestands von Knochen verantwortlich sind, sondern auch biologisch aktive Knochenwachstumsfaktoren, die die Knochenzellen zur Proliferation anregen können. Unter diesen letztgenannten Faktoren finden sich der transformierende Wachstumsfaktor β, die Heparin-bindenden Wachstumsfaktoren (z.B. saurer und basischer Fibroblasten- Wachstumsfaktor), die insulinartigen Wachstumsfaktoren (z.B. insulinartiger Wachstumsfaktor I und insulinartiger Wachstumsfaktor II) und eine vor kurzem beschriebene Familie von Proteinen mit der Bezeichnung Knochen-morphogenetische Proteine (BMPs). Alle diese Wachstumsfaktoren haben Einflüsse auf andere Typen von Zellen sowie auch auf Knochenzellen.
Die BMPs stellen neuartige Faktoren in der ausgedehnten Superfamilie der transformierenden Wachstumsfaktoren β dar. Sie wurden erstmals von J. Wozney et al., Science, Bd. 242 (1988), S. 1528–1534, unter Anwendung von Genklonierungstechniken identifiziert, und zwar im Anschluss an frühere Beschreibungen, die die biologische Aktivität in Extrakten von entmineralisiertem Knochen charakterisieren (M. Urist, Science, Bd. 150 (1965), S. 893–899). Rekombinantes BMP2 und BMP4 können eine Knochenneubildung induzieren, wenn sie lokal in das subkutane Gewebe von Ratten injiziert werden (J. Wozney, Molec. Reprod. Dev., Bd. 32 (1992), S. 160–167). Diese Faktoren werden durch normale Osteoblasten bei deren Differenzierung exprimiert. Es wurde gezeigt, dass sie die Osteoblasten-Differenzierung und die Knochen-Nodulus-Bildung in vitro sowie die Knochenbildung in vivo stimulieren (S. Harris et al., J. Bone Miner. Res., Bd. 9 (1994), S. 855–863). Diese letztgenannte Eigenschaft lässt auf eine mögliche Eignung als therapeutische Mittel bei Krankheiten, die zu Knochenverlust führen, schließen.
Bei den Zellen, die für die Knochenbildung verantwortlich sind, handelt es sich um Osteoblasten. Während Osteoblasten aus Vorstufen zu reifen, knochenbildenden Zellen differenzieren, bewirken sie eine Expression und Sekretion einer Anzahl von Enzymen und Strukturproteinen der Knochenmatrix, einschließlich Typ I-Kollagen, Osteocalcin, Osteopontin und alkalische Phosphatase (G. Stein et al., Curr. Opin. Cell Biol., Bd. 2 (1990), S. 1018–1027; S. Harris et al., (1994), a.a.O.). Sie synthetisieren auch eine Anzahl von wachstumsregulatorischen Peptiden, die in der Knochenmatrix gelagert werden und vermutlich für die normale Knochenbildung verantwortlich sind. Diese wachstumsregulierenden Peptide umfassen die BMPs (S. Harris et al., (1994), a.a.O.). Bei Studien primärer Kulturen von fötalen Rattenschädel-Osteoblasten werden die BMPs 1, 2, 3, 4 und 6 durch gezüchtete Zellen vor der Bildung von mineralisierten Knochen-Noduli exprimiert (S. Harris et al., (1994), a.a.O.). Wie alkalische Phosphatase, Osteocalcin und Osteopontin werden die BMPs durch gezüchtete Osteoblasten während ihrer Proliferation und Differenzierung exprimiert.
Obgleich die BMPs in vitro und in vivo starke Stimulatoren der Knochenbildung darstellen, bestehen bezüglich ihrer Verwendung als therapeutische Mittel zur Verstärkung der Knochenheilung Nachteile. In zahlreichen Geweben wurden Rezeptoren für knochenmorphogenetische Proteine identifiziert und die BMPs selbst werden in einer Vielzahl von Geweben in speziellen temporären und räumlichen Mustern exprimiert. Dies lässt darauf schließen, dass BMPs neben ihren Einflüssen auf Knochen auch auf zahlreiche Gewebe einwirken, was möglicherweise ihre Eignung als therapeutische Mittel bei systemischer Verabreichung einschränkt. Da es sich ferner um Peptide handelt, müssten sie durch Injektion verabreicht werden. Diese Nachteile legen der Entwicklung von BMPs als therapeutische Mittel schwere Beschränkungen auf.
Es gibt eine Überfülle von Zuständen, die durch die Notwendigkeit der Verstärkung der Knochenbildung charakterisiert sind. Am offensichtlichsten ist dies vielleicht im Fall von Knochenfrakturen, wo es wünschenswert ist, das Knochenwachstum zu stimulieren und zu beschleunigen und die Knochenreparatur zu vervollständigen. Mittel, die die Knochenbildung verstärken, wären auch bei Verfahren zur Gesichtsrekonstruktion wertvoll. Zu weiteren Knochenmangelzuständen gehören Knochensegmentdefekte, periodontale Krankheiten, metastatische Knochenkrankheiten, osteolytische Knochenkrankheiten und Zustände, bei denen eine Bindegewebereparatur von Vorteil wäre, z.B. eine Heilung oder Regeneration von Knorpeldefekten oder -verletzungen. Von großer Bedeutung ist auch der chronische Zustand der Osteoporose, einschließlich altersbedingte Osteoporose und Osteoporose in Verbindung mit dem postmenopausalen Hormonstatus. Zu weiteren Zuständen, die durch die Notwendigkeit von Knochenwachstum gekennzeichnet sind, gehören primärer und sekundärer Hyperparathyroidismus, Bewegungsmangel-Osteoporose, durch Diabetes bedingte Osteoporose und Glucocorticoid-bedingte Osteoporose.
Es gibt derzeit keine zufriedenstellenden pharmazeutischen Möglichkeiten, irgendeinen dieser Zustände zu beherrschen. Knochenfrakturen werden immer noch ausschließlich unter Verwendung von Gips, Schienen, Verankerungsvorrichtungen und anderer ausschließlich mechanischer Mittel behandelt. Ferner wird die mit postmenopausaler Osteoporose verbundene Knochenbeeinträchtigung durch Östrogene oder Bisphosphonate behandelt, deren Nebenwirkungen bekannt sind.
Das US-Patent 5 280 040 beschreibt Verbindungen, die sich zur Behandlung von Osteoporose eignen sollen. Diese Verbindungen erzielen dieses Ergebnis vermutlich durch eine Verhinderung der Knochenresorption.
G.-J. Wang et al., J. Formos. Med. Assoc., Bd. 94 (1995), S. 589–592, berichten, dass bestimmte Lipid-Clearingmittel, wie Lovastatin und Bezafibrat, dazu befähigt waren, die Knochenresorption, die sich bei einer Steroid-Verabreichung an Kaninchen ergibt, zu hemmen. In Abwesenheit einer Steroid-Behandlung ergab sich durch diese beiden Verbindungen kein Einfluss auf die Knochenbildung. Der Mechanismus der Hemmung der Knochenresorption, die in Gegenwart von Steroiden beobachtet wurden, (unter Mechanismus des Einflusses von Steroiden auf Knochen an sich), gilt als unbekannt. Die Autoren geben an, dass ein durch Steroide induzierter Knochenverlust mit einer Verringerung der Knochenbildung verbunden ist, die einer Hemmwirkung von Corticosteroiden auf die Osteoblasten-Aktivität und auf eine Steigerung der Knochenresorption aufgrund einer direkten Osteoclasten-Stimulation unter einer indirekten Hemmung der intestinalen Calciumresorption bei sekundärem Anstieg der Bildung von Parathyroid-Hormon zugeschrieben wird. Zu weiteren erwähnten Mechanismen gehören Mechanismen, die Lipid-Abnormalitäten und Hyperlipidämie zuzuschreiben sind, die zu Kreislaufbeeinträchtigungen, Verstopfungen von subchondralen Gefäßen, Osteozytennekrose und Osteoporose führen können. Im Hinblick auf die bekannten Wirkungen von Lovastatin und Bezafibrat schreiben die Autoren den Einfluss dem. Knochenverlust ihrer Fähigkeit zur Senkung der Lipidspiegel und zur Überwindung der Beeinträchtigung des Kreislaufs innerhalb des Oberschenkelkopfes zu. Bei Wang et al. finden sich keine Hinweise, dass Lovastatin direkt die Knochenbildung verstärkt.
Ein Abstract mit dem Titel "Lovastatin Prevents Steroid-Induced Adipogenesis and Osteoporosis" von Q. Cui et al. erschien in Reports of the ASBMR, 18th Annual Meeting (September 1996), J. Bone Mineral Res., Bd. 11 (1996), (S1), S. 510. Der Abstract berichtet, dass Lovastatin die Triglycerid-Vesikel verringerte, die sich anreicherten, wenn Osteoprogenitor-Zellen, die aus Knochenmarkstroma von Hühnern kloniert wurden, in Kultur mit Dexamethason behandelt wurden. Von Lovastatin wurde berichtet, dass es die Expression bestimmter mRNAs vermindert und es den Zellen erlaubt, den osteogenen Phänotyp nach Dexamethason-Behandlung aufrechtzuerhalten. Ferner trat bei Hühnern, die an einem Knochenverlust im Oberschenkelkopf als Folge einer Dexamethason-Behandlung litten, bei Behandlung mit Lovastatin eine Besserung ein. Auch hier findet sich kein Hinweis, dass Lovastatin direkt die Knochenbildung in Abwesenheit einer Steroidbehandlung verstärkt.
Jedenfalls stehen diese Daten in Gegensatz zu Berichten, dass Dexamethason und andere induzierende Mittel, wie BMPs, die Osteoblasten-Differenzierung induzieren und Osteocalcin-mRNA stimulieren (C. G. Bellows et al., Develop. Biol., Bd. 140 (1990), S. 132–138; D. J. Rickard et al., Develop. Biol., Bd. 161 (1994), S. 218–228). Ferner haben P. Ducy et al., Nature, Bd. 382 (1996), S. 448–452, kürzlich berichtet, dass Mäuse mit Osteocalcin-Mangel einen Phänotyp aufweisen, der durch erhöhte Knochenbildung und Knochen mit verbesserter funktioneller Qualität gekennzeichnet ist, ohne dass eine Beeinträchtigung durch Knochenresorption eintritt. Ducy et al. geben an, dass ihre Daten darauf schließen lassen, dass Osteocalcin-Antagonisten von therapeutischem Wert in Verbindung mit einer Östrogen-Ersatztherapie (zur Verhinderung oder Behandlung von Osteoporose) sein könnten.
Die vorliegende Erfindung beschreibt Verbindungen, die sich zur Stimulierung der Knochenbildung eignen, ohne dass damit die mit derzeit bekannten Behandlungen bei Knochenmangelzuständen verbundenen Nachteile auftreten. Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen zur positiven Stimulation des Knochenwachstums im Gegensatz zur bloßen Hemmung der Resorption oder der Stabilisierung der Knochenmasse stellt einen wichtigen Vorteil dar.
Offenbarung der Erfindung
Die Erfindung stellt Verbindungen bereit, die als übliche Pharmazeutika verabreicht werden können und die metabolische Wirkung einer direkten Verstärkung des Knochenwachstums ausüben. Die erfindungsgemäßen Verbindungen lassen sich unter Anwendung eines Tests auf ihre Fähigkeit zur Aktivierung von Kontrollelementen, die mit endogenen Faktoren, die das Knochenwachstums stimulieren, verbunden sind, identifizieren. Somit ist die Erfindung auf die Verwendung bestimmter Verbindungen bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei der Verstärkung der Knochenbildung sowie auf Zusammensetzungen zur Stimulation des Wachstums von Skelettgewebe (Knochengewebe) abgestellt, wobei es sich bei mindestens einem der Wirkstoffe um eine Verbindung der folgenden Formeln handelt
wobei X in jeder der Formeln (1) und (2) einen substituierten oder unsubstituierten Alkylen-, Alkenylen- oder Alkinylen-Linker mit 2 bis 6 C bedeutet;
Y einen oder mehrere carbocyclische oder heterocyclische Ringe bedeutet, wobei, wenn in Y zwei oder mehrere Ringe vorliegen, diese kondensiert sein können; und
R¹ ein Kation, H oder eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe mit 1 bis 6 C bedeutet; und
die gestrichelten Linien gegebenenfalls vorhandene π-Bindungen bedeuten.
Somit ist die Erfindung auf die Verwendung derartiger Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Knochenstörungen durch direkte Stimulation der Knochenbildung und auf pharmazeutische Zusammensetzungen mit einem Gehalt an derartigen Verbindungen abgestellt.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 zeigt die Struktur und die Aktivität (beim ABA-Screeningtest von Beispiel 1) von mehreren Verbindungen der Erfindung.
Ausführungsformen zur Durchführung der Erfindung
Ein Screeningtest mit raschem Durchsatz für Verbindungen, die die Knochenbildung stimulieren, und zwar aufgrund des Nachweises ihrer Fähigkeit zur Stimulierung der Expression eines Reportergens, das mit einem BMP-Promotor verknüpft ist (ein Surrogat für die Erzeugung von knochenmorphogenetischen Faktoren, die endogen erzeugt werden), ist in der US-Patentanmeldung SN 08/458,434 (Anmeldetag 2. Juni 1995), deren gesamter Inhalt durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht wird, beschrieben. Dieser Test wird auch als Teil einer Studie über immortalisierte Mäuse-Osteoblasten (abgeleitet von einer Maus, die ein Transgen exprimiert, das aus einem BMP2-Promotor, der die Expression von T-Antigen steuert, zusammengesetzt ist) bei N. Gosh Choudhery et al., Endocrinology, Bd. 137 (1996), S. 331–339, beschrieben. Bei dieser Studie wurden die immortalisierten Zellen mit einem Plasmid transfiziert, das ein Luciferase-Reportergen enthielt, das durch einen Mäuse-BMP2-Promotor (-2736/114 bp) gesteuert wird. Dabei reagierten die Zellen in dosisabhängiger Weise auf rekombinantes humanes BMP2.
Kurz zusammengefasst, der Test verwendet Zellen, die permanent oder vorübergehend mit Konstrukten transformiert sind, bei dem der Promotor eines knochenmorphogenetischen Proteins, speziell BMP2 oder BMP4, an ein Reportergen, typischerweise Luciferase, gekuppelt wird. Diese transformierten Zellen werden sodann in Bezug auf die Erzeugung des Reportergen-Produkts bewertet; Verbindungen, die den BMP-Promotor aktivieren, veranlassen die Erzeugung des Reporterproteins, das leicht getestet werden kann. Viele tausend Verbindungen wurden dieser raschen Screeningtechnik unterworfen und nur ein sehr geringer prozentualer Anteil davon ist befähigt, ein Expressionsniveau des Reportergens hervorzurufen, das 5-fach größer als das durch den Träger erzeugte Niveau ist. Verbindungen, die den BMP-Promotor aktivieren, fallen in Gruppen, wobei die Mitglieder jeder Gruppe bestimmte strukturelle Eigenschaften, die in inaktiven Verbindungen nicht vorhanden sind, gemeinsam haben. Die aktiven Verbindungen ("BMP-Promotor-aktive Verbindungen" oder "-aktive Verbindungen") eignen sich zur Förderung des Knochen- oder Knorpelwachstums und somit zur Behandlung von Wirbeltieren, die eines Knochen- oder Knorpelwachstums bedürfen.
BMP-Promotor-aktive Verbindungen können in einer Vielzahl von anderen Tests, die die Spezifität und Toxizität testen, geprüft werden. Beispielsweise können die Nicht-BMP-Promotoren oder -Reaktionselemente mit einem Reportergen verknüpft und in eine geeignete Wirtszelle inseriert werden. Die Zytotoxizität lässt sich beispielsweise durch visuelle oder mikroskopische Prüfung von BMP-Promotor und/oder Nicht-BMP-Promotor-Reportergen enthaltenden Zellen bestimmen. Alternativ können die Nucleinsäure- und/oder Proteinsynthese durch die Zellen überwacht werden. Für in vivo-Tests können Gewebe entfernt und visuell oder mikroskopisch geprüft werden oder gegebenenfalls in Verbindung mit Farbstoffen oder mit Färbemitteln, die die histologische Prüfung erleichtern, geprüft werden. Bei der Ermittlung von in vivo-Testergebnissen kann es wertvoll sein, die biologische Verteilung der Testverbindung unter Anwendung herkömmlicher medizinisch chemischer Techniken/Tiermodelltechniken zu prüfen.
Bei den hier verwendeten Ausdrücken "begrenzen" oder " begrenzend" oder "behandeln" oder "Behandlung" handelt es sich um austauschbare Ausdrücke. Die Ausdrücke umfassen eine Verschiebung der Entwicklung von Knochendefizit-Symptomen und/oder eine Verringerung der Schwere derartiger Symptome, deren Entwicklung erwartet wird. Die Ausdrücke umfassen ferner die Besserung von existierenden Knochen- oder Knorpeldefizit-Symptomen, die Verhinderung zusätzlicher Symptome, die Besserung oder Verhinderung der zugrundeliegenden Stoffwechselursachen der Symptome, die Verhinderung oder die Umkehr der Knochenresorption und/oder die Förderung des Knochenwachstums. Somit bezeichnen die Ausdrücke ein günstiges Ergebnis, das bei einem Wirbeltier mit einem Knorpel-, Knochen- oder Skelettdefizit oder bei einem Tier, bei dem sich potentiell ein derartiges Defizit entwickelt, herbeigeführt wird.
Unter "Knochendefizit" ist ein Ungleichgewicht im Verhältnis der Knochenbildung zur Knochenresorption in der Weise zu verstehen, dass das Subjekt bei unterbleibender Modifikation weniger Knochenmasse als erwünscht aufweist oder die Knochen des Subjekts weniger intakt und kohärent sind, als dies erwünscht ist. Ein Knochendefizit kann auch das Ergebnis einer Fraktur, eines chirurgischen Eingriffs oder einer dentalen oder periodontalen Krankheit sein. Unter "Knorpeldefekt" ist ein beschädigter Knorpel, eine Knorpelmenge, die geringer als erwünscht ist, oder ein Knorpel, der weniger intakt und kohärent ist, als dies erstrebenswert ist, zu verstehen.
Repräsentative Anwendungsmöglichkeiten für die erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen folgendes: Reparatur von Knochendefekten und -mangelzuständen, wie sie bei geschlossenen und offenen Brüchen und bei unvollständig geheilten Brüchen auftreten; die prophylaktische Verwendung bei der Verringerung von geschlossenen und offenen Frakturen; die Förderung der Knochenheilung bei plastischer Chirurgie; die Stimulation des Einwachsens von Knochen in nicht-zementierte, prothetische Gelenke und Dentalimplantate; die Erhöhung der Peak-Knochenmasse bei prämenopausalen Frauen; die Behandlung von Wachstumsmängeln; die Behandlung von periodontalen Krankheiten und Defekten und andere Zahnreparaturvorgänge; die Erhöhung der Knochenbildung während einer Distraktionsosteogenese; und die Behandlung von anderen Skelettstörungen, z.B. altersbedingter Osteoporose, postmenopausaler Osteoporose, Glucocorticoid-induzierter Osteoporose oder Osteoporose und Arthritis aufgrund von Bewegungsmangel, oder von beliebigen Zuständen, bei denen eine Stimulation der Knochenbildung von Vorteil ist. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch zur Reparatur von angeborenen, traumatisch induzierten oder chirurgischen Resektionen von Knochen (beispielsweise bei einer Krebsbehandlung) oder bei schönheitschirurgischen Eingriffen wertvoll sein. Ferner können die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Begrenzung oder Behandlung von Knorpeldefekten oder -störungen verwendet werden und sie können sich bei der Wundheilung oder Gewebereparatur als geeignet erweisen.
Knochen- oder Knorpelmängel oder -defekte können bei Wirbeltiersubjekten behandelt werden, indem man erfindungsgemäße Verbindungen verabreicht, die bestimmte strukturelle und funktionelle Eigenschaften aufweisen. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können systemisch oder lokal verabreicht werden. Für die systemische Anwendung werden die Verbindungen für eine parenterale (z.B. intravenöse, subkutane, intramuskuläre, intraperitoneale, intranasale oder transdermale) oder eine enterale (z.B. orale oder rektale) Abgabe gemäß herkömmlichen Verfahren zubereitet. Bei einer intravenösen Verabreichung kann es sich um eine Reihe von Injektionen oder um eine kontinuierliche Infusion über eine längere Zeitspanne handeln. Eine Verabreichung durch Injektion oder auf anderen Wegen von deutlich auseinanderliegenden Verabreichungen kann in Abständen von wöchentlich bis einmal bis dreimal täglich vorgenommen werden. Alternativ können die hier beschriebenen Verbindungen in zyklischer Weise verabreicht werden (Verabreichung der beschriebenen Verbindung; anschließend keine Verabreichung; anschließend Verabreichung der beschriebenen Verbindung und dergl.). Die Behandlung wird fortgesetzt, bis das gewünschte Ergebnis erzielt ist. Im allgemeinen umfassen pharmazeutische Zubereitungen eine erfindungsgemäße Verbindung in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, z.B. Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, 5% Dextrose in Wasser, boratgepufferte Kochsalzlösung mit einem Gehalt an Spurenmetallen oder dergl. Zubereitungen können ferner ein oder mehr Exzipientien, Konservierungsmittel, Lösungsvermittler, Pufferungsmittel, Albumin zur Verhinderung des Proteinverlustes an Ampullenoberflächen, Gleitmittel, Füllstoffe, Stabilisatoren und dergl. enthalten. Zubereitungsverfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt und beispielsweise bei Remington's Pharmaceutical Sciences, Herausgeber Gennaro, Mack Publishing Co., Easton PA, 1990, beschrieben (diese Literaturstelle wird durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht). Pharmazeutische Zusammensetzungen zur erfindungsgemäßen Verwendung können in Form von sterilen, nicht- pyrogenen, flüssigen Lösungen oder Suspensionen, beschichteten Kapseln, Suppositorien, lyophilisierten Pulvern, transdermalen Clustern oder anderen aus dem Stand der Technik bekannten Formen vorliegen. Eine lokale Verabreichung kann durch Injektion an der Stelle der Verletzung oder des Defekts durch Einführen oder Anbringen eines festen Trägers an der Stelle oder durch direktes, topisches Aufbringen einer viskosen Flüssigkeit oder dergl. erfolgen. Für die lokale Verabreichung stellt das Abgabevehikel vorzugsweise eine Matrix für das Wachstum von Knochen oder Knorpel bereit. Insbesondere handelt es sich um ein Vehikel, das vom Subjekt ohne nachteilige Wirkungen resorbiert werden kann.
Die Abgabe der hier beschriebenen Verbindungen an Wundstellen kann durch die Verwendung von Zusammensetzungen mit kontrollierter Freisetzung verstärkt werden, wie sie beispielsweise in der anhängigen US-Patentanmeldung 07/871,246 (entsprechend der WIPO-Veröffentlichung WO-93/20859, die in ihrer Gesamtheit zum Gegenstand der Beschreibung gemacht wird) beschrieben sind. Filme dieses Typs eignen sich insbesondere als Überzüge für prothetische Vorrichtungen und chirurgische Implantate. Die Filme können beispielsweise um die äußeren Oberflächen von chirurgischen Schrauben, Stangen, Stiften, Platten und dergl. gewickelt werden. Implantierbare Vorrichtungen dieses Typs werden routinemäßig in der orthopädischen Chirurgie eingesetzt. Die Filme können auch zur Beschichtung von Knochenfüllmaterialien, wie Hydroxyapatit-Blöcken, demineralisierten Knochenmatrix-Stöpseln, Collagenmatrices und dergl., verwendet werden. Im allgemeinen werden ein Film oder eine Vorrichtung gemäß den hier gemachten Angaben auf den Knochen an der Frakturstelle aufgebracht. Das Aufbringen erfolgt im allgemeinen durch Implantation in den Knochen oder durch Anbringen an der Oberfläche, wobei man sich üblicher chirurgischer Maßnahmen bedient.
Zusätzlich zu den vorerwähnten Copolymeren und Trägern können die biologisch abbaubaren Filme und Matrices andere aktive oder inerte Komponenten umfassen. Von besonderem Interesse sind Mittel, die das Gewebewachstum oder -infiltration fördern, z.B. Wachstumsfaktoren. Zu Beispielen für Wachstumsfaktoren für diesen Zweck gehören der epidermale Wachstumsfaktor (EGF), der Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), der von Blutplättchen abgeleitete Wachstumsfaktor (PDGF), transformierende Wachstumsfaktoren (TGFs), Parathyroidhormon (PTH), der Leukämie-Hemmfaktor (LIF), insulinartige Wachstumsfaktoren (IGFs) und dergl. Mittel, die das Knochenwachstums fördern, wie knochenmorphogenetische Proteine (US-Patent 4 761 471; PCT-Veröffentlichung WO-90/11366), Osteogenin (Sampath et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 84 (1987), S. 7109–7113) und NaF (Tencer et al., J. Biomed. Mat. Res., Bd. 23 (1989), S. 571–589) werden ebenfalls bevorzugt. Biologisch abbaubare Filme oder Matrices umfassen Calciumsulfat, Tricalciumphosphat, Hydroxylapatit, Polymilchsäure, Polyanhydride, Knochen- oder Hautkollagen, reine Proteine, extrazelluläre Matrixkomponenten und dergl. und Kombinationen davon. Derartige biologisch abbaubare Materialien können in Kombination mit nicht-biologisch abbaubaren Materialien eingesetzt werden, um die angestrebten mechanischen, kosmetischen oder Gewebe- oder Matrix-Grenzflächeneigenschaften zu erzielen.
Alternative Verfahren zur Abgabe der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen die Verwendung von osmotischen ALZET-Minipumpen (Alza Corp., Palo Alto, CA); Matrixmaterialien mit verzögerter Freisetzung, wie sie beispielsweise von Wang et al. beschrieben wurden (PCT-Veröffentlichung WO-90/11366); elektrisch geladenen Dextrankügelchen, wie sie beispielsweise von Bao et al. beschrieben wurden (PCT-Veröffentlichung WO-92/03125); Abgabesystemen auf Kollagenbasis, wie sie beispielsweise von Ksander et al., Ann. Surg., Bd. 211 (3) (1990), S. 288–294, beschrieben wurden; Methylcellulose-Gelsystemen, wie sie beispielsweise von Beck et al., J. Bone Min. Res., Bd. 6 (11) (1991), S. 1257–1265, beschrieben wurden; Systemen auf Alginatbasis, wie sie beispielsweise von Edelmann et al., Biomaterials, Bd. 12 (1991), S. 619–626, beschrieben wurden, und dergl. Weitere, aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren zur verzögerten lokalen Abgabe an Knochen umfassen poröse, beschichtete Metallprothesen, die imprägniert werden können und feste Kunststoffstäbe, denen therapeutische Zusammensetzungen einverleibt sind.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch zusammen mit Mitteln, die die Knochenresorption hemmen, verwendet werden. Antiresorptive Mittel, wie Östrogen, Bisphosphonate und Calcitonin, werden für diesen Zweck bevorzugt. Speziell können die hier beschriebenen Verbindungen für eine Zeitspanne (z.B. Monate bis Jahre) verabreicht werden, die ausreicht, um eine Korrektur eines Knochendefizit-Zustands zu erreichen. Nachdem der Knochendefizit-Zustand korrigiert worden ist, kann dem Wirbeltier eine antiresorptive Verbindung verabreicht werden, um den korrigierten Knochenzustand aufrechtzuerhalten. Alternativ können die hier beschriebenen Verbindungen zusammen mit einer antiresorptiven Verbindung in zyklischer Weise verabreicht werden (Verabreichung der beschriebenen Verbindung, anschließend Verabreichung eines Antiresorptivums, anschließend Verabreichung der beschriebenen Verbindung und dergl.).
Bei zusätzlichen Zubereitungen können herkömmliche Präparate, wie sie beispielsweise nachstehend beschrieben werden, eingesetzt werden.
Wässrige Suspensionen können den Wirkstoff im Gemisch mit pharmakologisch verträglichen Exzipientien, die Suspendiermittel, wie Methylcellulose; und Netzmittel, wie Lecithin, Lysolecithin oder langkettige Fettalkohole, umfassen, enthalten. Diese wässrigen Suspensionen können Konservierungsmittel, farbgebende Mittel, Aromastoffe, Süßungsmittel und dergl. gemäß der üblichen industriellen Praxis enthalten.
Präparate für die topische und lokale Verabreichung umfassen Aerosol-Sprühmittel, Lotionen, Gele und Salben in pharmazeutisch geeigneten Vehikeln, die niedere aliphatische Alkohole, Polyglykole, wie Glycerin, Polyethylenglykol, Fettsäureester, Öle und Fette und Silicone umfassen können. Die Präparate können ferner Antioxidationsmittel, wie Ascorbinsäure oder Tocopherol, und Konservierungsmittel, wie p-Hydroxybenzoesäureester, umfassen.
Parenterale Präparate umfassen insbesondere sterile oder sterilisierte Produkte. Injizierbare Zusammensetzungen können bereitgestellt werden, die den Wirkstoff und beliebige bekannte injizierbare Träger enthalten. Diese können Salze zur Regulierung des osmotischen Drucks enthalten.
Gegebenenfalls können die osteogenen Mittel Liposomen einverleibt werden, wobei man sich beliebiger bekannter Verfahren zur Herstellung von Liposomen bedient, um verschiedene pathogene Zustände zu behandeln. Die vorliegenden Zusammensetzungen können sich der vorerwähnten Verbindungen, die in Liposomen einverleibt sind, bedienen, um diese Verbindungen in Richtung auf Makrophagen, Monozyten sowie andere Zellen und Gewebe und Organe zu dirigieren, die die liposomale Zusammensetzung aufnehmen. Die in Liposomen einverleibten Verbindungen der Erfindung können durch parenterale Verabreichung eingesetzt werden, was die wirksame Verwendung geringerer Dosen der Verbindungen ermöglicht. Ferner können Liganden einverleibt werden, um eine weitere Fokussierung der Spezifität der Liposomen zu erreichen.
Zu geeigneten herkömmlichen Verfahren der Liposomenherstellung gehören (ohne Beschränkung hierauf) die in folgenden Literaturstellen beschriebenen Verfahren: A. D. Bangham et al., J. Mol. Biol., Bd. 23 (1965), S. 238–252; F. Olson et al., Biochim. Biophys. Acta, Bd. 557 (1979), S. 9–23; F. Szoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 75 (1978), S. 4194–4198; E. Mayhew et al., Bd. 775 (1984), S. 169–175; S. Kim et al., Biochim. Biophys. Acta, Bd. 728 (1983), S. 339–348; und Mayer et al., Biochim. Biophys. Acta, Bd. 858 (1986), S. 161–168.
Die Liposomen können aus den vorliegenden Verbindungen in Kombination mit beliebigen herkömmlichen synthetischen oder natürlichen Phospholipid-Liposomenmaterialien hergestellt werden, einschließlich Phospholipiden aus natürlichen Quellen, wie Eiern, Pflanzen oder tierischen Quellen, z.B. Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylglycerin, Sphingomyelin, Phosphatidylserin oder Phosphatidylinosit und dergl. Zu synthetischen Phospholipiden, die ebenfalls verwendet werden können, gehören (ohne Beschränkung hierauf) Dimyristoylphosphatidylcholin, Dioleoylphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin und Distearoylphosphatidylcholin, und die entsprechenden synthetischen Phosphatidylethanolamine und Phosphatidylglycerine.
Cholesterin oder andere Sterine, Cholesterinhemisuccinat, Glycolipide, Cerebroside, Fettsäuren, Ganglioside, Sphingolipide, 1,2-Bis-(oleoyloxy)-3-(trimethylammonio)-propan (DOTAP), N-[1-(2,3-Dioleoyl)propyl-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA) und andere kationische Lipide können den Liposomen einverleibt werden, wie es aus dem Stand der Technik bekannt ist. Die relativen Mengen an verwendetem Phospholipid und Additiven in den Liposomen können je nach Bedarf variiert werden. Die bevorzugten Bereiche betragen etwa 60–90 Mol-% Phospholipid; Cholesterin, Cholesterinhemisuccinat, Fettsäuren oder kationische Lipide können in Mengen von 0 bis 50 Mol-% verwendet werden. Die Mengen der erfindungsgemäßen Verbindungen, die der Lipidschicht der Liposomen einverleibt werden, kann mit der Konzentration der Lipide im Bereich von etwa 0,01 bis etwa 50 Mol-% variieren.
Die Liposomen mit den vorerwähnten Zubereitungen können noch spezifischer in Bezug auf die vorgesehenen Ziele gemacht werden, indem man monoklonale Antikörper oder andere Liganden, die für ein Ziel spezifisch sind, einverleibt. Beispielsweise können monoklonale Antikörper für den BMP-Rezeptor in die Liposomen durch Verknüpfung an Phosphatidylethanolamin (PE), das den Liposomen einverleibt ist, gemäß dem Verfahren von L. Leserman et al., Nature, Bd. 288 (1980), S. 602–604, einverleibt werden.
Veterinärmedizinische Anwendungen der beschriebenen Verbindungen kommen ebenfalls in Betracht. Zu derartigen Anwendungen gehören eine Behandlung von Knochen- oder Knorpeldefiziten oder -defekten bei Haustieren, Viehbeständen und reinrassigen Pferden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können zur Stimulation des Wachstums von knochenbildenden Zellen oder deren Vorläufern oder zur Induktion der Differenzierung von knochenbildenden Zellenvorläufern entweder in vitro oder ex vivo verwendet werden. Die hier beschriebenen Verbindungen können auch zur Modifikation eines Zielgewebes oder einer Organumgebung herangezogen werden, um knochenbildende Zellen in einer Umgebung, die derartiger Zellen bedarf, anzuziehen. Der hier verwendete Ausdruck "Vorläuferzelle" bezieht sich auf eine Zelle, die einem Differenzierungsweg unterliegt, die aber im allgemeinen keinen Marker exprimiert oder nicht als reife, vollständig differenzierte Zelle wirkt. Der hier verwendete Ausdruck "mesenchymale Zellen" oder "mesenchymale Stammzellen" bezieht sich auf pluripotente Progenitorzellen, die zu zahlreichen Teilungen befähigt sind und deren Nachkommen zu Skelettgeweben, einschließlich Knorpel, Knochen, Sehnen, Bänder, Knochenmarkstroma und Bindegewebe, führen (vergl. A. Caplan, J. Orthop. Res., Bd. 9 (1991), S. 641–650). Der hier verwendete Ausdruck "osteogene Zellen" umfasst Osteoblasten und Osteoblasten-Vorläuferzellen. Insbesondere eignen sich die beschriebenen Verbindungen zur Stimulation einer Zellpopulation, die mesenchymale Knochenmarkzellen enthält, wodurch die Anzahl an osteogenen Zellen in dieser Zellpopulation erhöht wird. Bei einem bevorzugten Verfahren werden hämatopoetische Zellen aus der Zellpopulation entfernt, entweder vor oder nach Stimulation mit den beschriebenen Verbindungen. Durch Ausübung derartiger Verfahren können osteogene Zellen expandiert werden. Die expandierten osteogenen Zellen können einem Wirbeltiersubjekt, das einer derartigen Behandlung bedarf, infundiert (oder reinfundiert) werden. Beispielsweise können die eigenen mesenchymalen Stammzellen eines Subjekts ex vivo den erfindungsgemäßen Verbindungen ausgesetzt werden. Die erhaltenen osteogenen Zellen können dem Subjekt infundiert oder an eine gewünschte Stelle im Subjekt dirigiert werden, wo eine weitere Proliferation und/oder Differenzierung der osteogenen Zellen ohne Immunoabstoßung erfolgen kann. Alternativ kann es sich bei der Zellpopulation, die den beschriebenen Verbindungen ausgesetzt worden ist, um immortalisierte, humane, fötale, osteoblastische oder osteogene Zellen handeln. Wenn derartige Zellen einem Wirbeltiersubjekt infundiert oder implantiert werden, kann es vorteilhaft sein, diese nicht aus dem eigenen Körper stammenden Zellen "immunologisch zu schützen" oder den Empfänger einer Immunosuppression (vorzugsweise lokal) zu unterziehen, um die Transplantation und die Knochen- oder Knorpelreparatur zu fördern.
Erfindungsgemäß handelt es sich bei einer "wirksamen Menge" einer Zusammensetzung um eine Menge, die eine statistisch signifikante Wirkung hervorruft. Beispielsweise handelt es sich bei einer "wirksamen Menge" für therapeutische Anwendungen um die Menge der Zusammensetzung, die einen hier beschriebenen Wirkstoff enthält, die erforderlich ist, um einen klinisch signifikanten Anstieg der Heilungsraten bei der Reparatur von Frakturen; eine Umkehr des Knochenverlustes bei Osteoporose; eine Umkehr von Knorpeldefekten oder -störungen; eine Verhinderung oder eine Verzögerung des Einsetzens von Osteoporose; eine Stimulation und/oder Vermehrung der Knochenbildung bei mangelhaft verheilten Brüchen und bei Distraktionsosteogenese; eine Erhöhung und/oder Beschleunigung des Knochenwachstums bei prothetischen Vorrichtungen; und eine Reparatur von dentalen Defekten ergeben. Derartige wirksame Mengen werden unter Einsatz routinemäßiger Optimierungstechniken festgelegt und hängen von dem speziellen zu behandelnden Zustand, dem Zustand des Patienten, dem Verabreichungsweg, der Formulierung und der Beurteilung durch den Arzt sowie von anderen Faktoren, die für den Fachmann offensichtlich sind, ab. Die erforderliche Dosierung für die erfindungsgemäßen Verbindungen (beispielsweise bei Osteoporose, wo eine Zunahme der Knochenbildung angestrebt wird) manifestiert sich als statistisch signifikanter Unterschied in der Knochenmasse zwischen Behandlungsgruppen und Kontrollgruppen. Dieser Unterschied in der Knochenmasse ist beispielsweise als ein 5 bis 20%-iger oder höherer Anstieg der Knochenmasse in der Behandlungsgruppe erkennbar. Weitere Messungen eines klinisch signifikanten Anstiegs der Heilung umfassen beispielsweise Tests auf Bruchfestigkeit und Dehnung, Bruchfestigkeit und Torsion, 4-Punkt-Biegung, verstärkte Konnektivität in Knochenbiopsien und andere biomechanische Tests, die dem Fachmann geläufig sind. Allgemeine Leitlinien für Behandlungsschemata ergeben sich aus Experimenten an Tiermodellen der in Frage stehenden Krankheit.
Die Dosierung der erfindungsgemäßen Verbindungen variiert je nach dem Ausmaß und der Dringlichkeit der Behandlung, der Aktivität der verabreichten Verbindung, dem allgemeinen Gesundheitszustand des Subjekts und anderen Gesichtspunkten, die dem Fachmann geläufig sind. Im allgemeinen können sie einem Menschen typischerweise auf Tagesbasis in einer oralen Dosis von etwa 0,1 mg/kg bis 1000 mg/kg und insbesondere von etwa 1 mg/kg bis etwa 200 mg/kg verabreicht werden. Die parenterale Dosis beträgt in geeigneter Weise 20–100% der oralen Dosis. Obgleich eine orale Verabreichung in den meisten Fällen bevorzugt sein kann (aus Gründen der Einfachheit, der Akzeptanz durch den Patienten und dergl.), können alternative Verabreichungsverfahren für ausgewählte Verbindungen und ausgewählte Defekte oder Krankheiten angemessen sein. Bei Vergleichstests können positive Kontrollverbindungen oder andere knochenaktive Testverbindungen subkutan verabreicht werden, während Testverbindungen vom Statin-Typ oral verabreicht werden können.
Screening-Tests
Die osteogene Aktivität der bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Verbindungen lässt sich unter Anwendung von in vitro-Screening-Techniken bestätigen, beispielsweise durch die vorstehend beschriebene Bestimmung der Transkription eines Reportergens, das mit einem Promotor, der mit einem morphogenetischen Knochenprotein assoziiert ist, gekuppelt ist, oder durch alternative Tests, z.B. gemäß den nachstehenden Angaben.
Techniken für den Test an Schädeldecken von neonatalen Mäusen (in vitro)
Ein Test auf die Knochenresorption oder Knochenbildung verläuft ähnlich den Angaben von M. Gowen & G. Mundy, J. Immunol., Bd. 136 (1986), S. 2478–2482. Kurz zusammengefasst, werden von neugeborenen weißen ICR Swiss-Mäusen 4 Tage nach der Geburt die frontalen und parietalen Knochen durch Mikrodissektion entfernt und entlang der Teilnaht gespalten. Beim Resorptionstest werden die Knochen in BGJb-Medium (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) plus 0,02% (oder eine niedrigere Konzentration) β-Methylcyclodextrin inkubiert, wobei das Medium ferner die Test- oder Kontrollsubstanzen enthält. Beim Medium, das bei der Durchführung des Tests zur Bestimmung der Knochenbildung verwendet wird, handelt es sich um gemäß Fitton und Jackson modifiziertes BGJ-Medium (Sigma), das mit 6 μg/ml Insulin, 6 μg/ml Transferrin, 6 ng/ml seleniger Säure, Calcium und Phosphat in Konzentrationen von 1,25 bzw. 3,0 mM ergänzt ist, wobei jeden zweiten Tag Ascorbinsäure bis zu einer Konzentration von 100 μg/ml zugesetzt wird. Die Inkubation wird 96 Stunden in einer befeuchteten Atmosphäre aus 5% CO₂ und 95% Luft durchgeführt.
Anschließend werden die Knochen aus den Inkubationsmedien entnommen und 24–48 Stunden in 10% gepuffertem Formalin fixiert, 1 Woche in 14 % EDTA decalcifiziert, durch abgestufte Alkohole verarbeitet und in Paraffinwachs eingebettet. 3 μm-Schnitte der Schädeldecke werden präpariert. Repräsentative Schnitte werden für die histomorphometrische Bestimmung der Knochenbildung oder Knochenresorption ausgewählt. Knochenänderungen werden an Schnitten, die im Abstand von 200 μm vorgenommen werden, gemessen. Osteoblasten und Osteoklasten werden durch unterscheidende Morphologie identifiziert.
Weitere Hilfstests können als Kontrollen herangezogen werden, um Nicht-BMP-Promotor-vermittelte Effekte von Testverbindungen zu bestimmen. Beispielsweise kann die mitogene Aktivität unter Anwendung von Screening-Tests mit einem Serum-reaktiven Element (SRE) als Promotor und einem Luciferase-Reportergen gemessen werden. Insbesondere können diese Screening-Tests eine Signalgebung über SRE-vermittelte Wege nachweisen, z.B. den Protein-kinase C-Weg. Beispielsweise eignen sich ein Osteoblasten-Aktivator-SRE-Luciferase-Screening und ein Insulinmimetisches SRE-Luciferase-Screening für diesen Zweck. Gleichermaßen kann auch die Testverbindungsstimulation von durch ein cAMP-reaktives Element (CRE) vermittelten Wegen bestimmt werden. Beispielsweise können Zellen, die mit Rezeptoren für PTH und Calcitonin (zwei knochenaktive Mittel) transfiziert worden sind, bei CRE-Luciferase-Screenings zum Nachweis erhöhter cAMP-Konzentrationen verwendet werden. Somit kann die BMP-Promotorspezifität einer Testverbindung durch Anwendung dieser Typen von Hilfstests geprüft werden.
In vivo-Test der Einflüsse von Verbindungen auf das Wachstum von Schädeldeckenknochen bei Mäusen
Es werden männliche, weiße ICR-Swiss-Mäuse im Alter von 4–6 Wochen mit einem Gewicht von 13–26 g in einer Anzahl von 4–5 Mäusen pro Gruppe herangezogen. Der Wachstumstest des Schädeldeckenknochens wird gemäß den Angaben in der PCT-Anmeldung WO-95/24211 (durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht) durchgeführt. Kurz zusammengefasst, die Testverbindung oder ein geeigneter Kontrollträger werden in das subkutane Gewebe über der rechten Schädeldecke einer normalen Maus injiziert. Typischerweise handelt es sich beim Kontrollträger um den Träger, in dem die Verbindung solubilisiert wurde. Es handelt sich um PBS mit einem Gehalt an 5% DMSO oder um PBS mit einem Gehalt an Tween (2 μl/1O ml). Die Tiere werden am Tag 14 getötet. Das Knochenwachstum wird durch Histomorphometrie gemessen. Knochenproben für die quantitative Bestimmung werden von benachbartem Gewebe gesäubert und 24–48 Stunden in 10 % gepuffertem Formalin fixiert, 1–3 Wochen in 14% EDTA decalcifiziert, durch abgestufte Alkohole bearbeitet und in Paraffinwachs eingebettet. Schnitte von 3–5 μm der Schädeldecke werden präpariert. Repräsentative Schnitte werden für die histomorphometrische Bestimmung der Einflüsse auf die Knochenbildung und Knochenresorption ausgewählt. Die Schnitte werden unter Verwendung einer Camera lucida-Zusatzvorrichtung gemessen, um direkt das mikroskopische Bild auf einer Digitalisierungsplatte abzutasten. Knochenveränderungen werden an Schnitten im Abstand von 200 μm über 4 angrenzende 1 × 1 mm-Felder sowohl auf der Injektionsseite als auch auf der Nicht-Injektionsseite der Schädeldecke gemessen. Neuer Knochen wird durch seine charakteristische Webstruktur identifiziert. Osteoklasten und Osteoblasten werden aufgrund ihrer unterschiedlichen Morphologie identifiziert. Eine Histomorphometrie-Software (Osteomeasure, Osteometrix, Inc., Atlanta) wird zur Bearbeitung der Digitalisierungseingabe verwendet, um die Zellzahlen und die Messflächen oder Umfänge zu bestimmen.
Zusätzliche in vivo-Tests
Leitverbindungen ("lead compounds") können ferner unter Anwendung eines in vivo-Dosierungstests an intakten Tieren getestet werden. Eine prototypische Dosierung kann durch subkutane, intraperitoneale oder orale Verabreichung erreicht werden und kann durch Injektion, verzögerte Wirkstoffabgabe oder andere Abgabetechniken durchgeführt werden. Die Zeitspanne für die Verabreichung der Testverbindung kann variieren (beispielsweise 28 Tage sowie 35 Tage können geeignet sein). Beispielsweise kann ein oraler oder subkutaner in vivo-Dosierungstest folgendermaßen durchgeführt werden.
Bei einer typischen Studie werden 70 weibliche Sprague-Dawley-Ratten im Alter von 3 Monaten unter Berücksichtigung ihres Gewichts in 7 Gruppen mit jeweils 10 Tieren pro Gruppe eingeteilt. Dazu gehört eine Basislinien-Kontrollgruppe von Tieren, die zu Beginn der Studie getötet werden; eine Kontrollgruppe, die nur den Träger allein erhält; eine mit PBS behandelte Kontrollgruppe; und eine positive Kontrollgruppe, die eine Verbindung (Nicht-Protein oder Proteinverbindung), deren Knochenwachstum fördernde Wirkung bekannt ist, erhält. Den übrigen drei Gruppen werden drei Dosierungshöhen der zu testenden Verbindungen verabreicht.
Kurz zusammengefasst, werden die Testverbindung, die positive Kontrollverbindung, PBS oder der Träger allein subkutan einmal täglich 35 Tage lang verabreicht. Sämtliche Tiere erhalten 9 Tage und 2 Tage, bevor sie getötet werden, eine Injektion von Calcein (zwei Calcein-Injektionen jeweils an dem angegebenen Tag). Das Körpergewicht wird wöchentlich ermittelt. Am Ende des 35-tägigen Zyklus werden die Tiere gewogen und durch orbitale oder Herzpunktur entblutet. Calcium, Phosphat, Osteocalcin und CBCs im Serum werden bestimmt. Beide Beinknochen (Oberschenkel und Schienbein) und die lumbalen Wirbel werden entnommen, von anhaftendem weichem Gewebe gereinigt und für die Bewertung in 70% Ethanol aufbewahrt. Die Bewertung erfolgt durch periphere quantitative Computertomographie (pQCT; J. Ferretti, Bone, Bd. 17 (1995), S. 353S–364S), Doppelenergie-Röntgen-Absorptiometrie (DEXA; A. Laval-Jeantet et al., Calcif. Tissue Intl., Bd. 56 (1995), S. 14–18; J. Casez et al., Bone and Mineral, Bd. 26 (1994), S. 61–68) und/oder Histomorphometrie durchgeführt. Der Einfluss der Testverbindungen auf die Knochenremodellierung kann auf diese Weise bewertet werden.
Leitverbindungen können auch an Tieren mit akuter Ovariektomie (Prophylaxemodell) unter Anwendung eines in vivo-Dosierungstests getestet werden. Bei derartigen Tests kann auch eine mit Östrogen behandelte Gruppe als Kontrolle mitgeführt werden. Ein beispielhafter subkutaner Dosierungstest kann folgendermaßen vorgenommen werden:
Bei einer typischen Studie werden 80 weibliche Sprague-Dawley-Ratten im Alter von 3 Monaten unter Berücksichtigung ihres Gewichts in 8 Gruppen mit jeweils 10 Tieren pro Gruppe eingeteilt. Hierzu gehören eine Basislinie-Kontrollgruppe von Tieren, die zu Beginn der Studie getötet werden; 3 Kontrollgruppen (Schein Ovariektomie (sham OVX) + Träger allein; Ovariektomie (OVX) + Träger allein, mit PBS behandelte OVX-Gruppe); und eine OVX-Kontrollgruppe, der eine Verbindung, deren knochenwachstumsfördernde Wirkung bekannt ist, verabreicht wird. Drei Dosierungshöhen der zu testenden Verbindung werden den restlichen drei Gruppen von OVX-Tieren verabreicht.
Da Ovariektomie (OVX) eine übermäßige Futteraufnahme verursacht, werden sämtliche OVX-Tiere während der gesamten 35-tägigen Studie paarweise mit Schein-OVX-Tieren gefüttert. Kurz zusammengefasst, die Testverbindung, die positive Kontrollverbindung, PBS oder der Träger allein werden einmal täglich 35 Tage lang oral oder subkutan verabreicht. Alternativ kann die Testverbindung zu implantierbaren Pellets zubereitet werden, die für 35 Tage implantiert werden, oder die Verabreichung kann oral, z.B. durch eine Magensonde, erfolgen. Sämtliche Tiere, einschließlich die Schein-OVX/Träger- und OVX-Träger-Gruppen, erhalten 9 Tage und 2 Tage, bevor sie getötet werden, eine intraperitoneale Injektion von Calcein (2 Injektionen von Calcein jeweils am angegebenen Tag, um eine einwandfreie Markierung von neu gebildetem Knochen zu gewährleisten). Das Körpergewicht wird wöchtentlich ermittelt. Am Ende des 35-tägigen Zyklus werden Blut und Gewebe der Tiere auf die vorstehend angegebene Weise verarbeitet.
Leitverbindungen können auch an chronischen OVX-Tieren (Behandlungsmodell) getestet werden. Ein beispielhaftes Verfahren zur Behandlung von festgestelltem Knochenverlust bei Tieren mit Ovariektomie, das zur Feststellung der Wirksamkeit von anabolen Mitteln herangezogen werden kann, kann folgendermaßen durchgeführt werden. Kurz zusammengefasst, 80–100 weibliche Sprague-Dawley-Ratten im Alter von 6 Monaten werden einem chirurgischen Scheineingriff (sham-OVX) oder einer Ovariektomie (OVX) zum Zeitpunkt Null unterworfen. 10 Ratten werden als Basislinien-Kontrollen getötet. Das Körpergewicht wird während der Versuchsdauer wöchentlich aufgezeichnet. Nach etwa 6 Wochen (42 Tagen) oder mehr der Knochenverarmung werden 10 sham-OVX- und 10 OVX-Ratten willkürlich ausgewählt und als Kontrollen der Verarmungsperiode eingesetzt. Von den restlichen Tieren werden 10 Schein-OVX- und 10 OVX-Ratten als mit Placebo behandelte Kontrollen eingesetzt. Die restlichen OVX-Tiere werden für einen Zeitraum von 5 Wochen (35 Tage) mit 3–5 Dosen der Testverbindung behandelt. Als positive Kontrolle kann eine Gruppe von OVX-Ratten mit einem Mittel, wie PTH, einem in diesem Modell bekannten anabolen Mittel (Kimmel et al., Endocrinology, Bd. 132 (1993), S. 1577–1584), behandelt werden. Um den Einfluß auf die Knochenbildung zu bestimmen, kann folgendes Verfahren herangezogen werden. Oberschenkelknochen, Schienbeinknochen und die lumbalen Wirbel 1-4 werden herausgeschnitten und gewonnen. Die proximalen linken und rechten Schienbeine werden für pQCT-Messungen, Bestimmung der Schwammknochen-Mineraldichte (BMD) (gravimetrische Bestimmung) und für histologische Untersuchungen verwendet, während das Mittelstück der Schienbeine einer kortikalen BMD-Untersuchung oder Histologie unterworfen wird. Die Oberschenkelknochen werden für pQCT-Scanning des Mittelstücks vor einem biomechanischen Test vorbereitet. Die lumbalen Wirbel (LV) LV2 werden für die BMD-Bestimmung (auch pQCT kann durchgeführt werden) bearbeitet; die Wirbel LV3 werden für eine nicht-decalcifizierte Knochenhistologie vorbereitet; und LV4 werden für einen mechanischen Test bearbeitet.
Natur der erfindungsgemäß geeigneten Verbindungen
Die für die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen geeigneten Verbindungen weisen die folgenden Formeln auf:
wobei X in jeder der Formeln (1) und (2) einen substituierten oder unsubstituierte Alkylen-, Alkenylen- oder Alkinylen-Linker mit 2 bis 6 C bedeutet;
Y einen oder mehrere carbocyclische oder heterocyclische Ringe bedeutet, wobei, wenn Y zwei oder mehr Ringe umfasst, diese Ringe kondensiert sein können; und
R' ein Kation, H oder eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe mit 1 bis 6 C bedeutet; und
die gestrichelten Linien gegebenenfalls vorhandene π-Bindungen bedeuten. Es ist darauf hinzuweisen, dass dann, wenn R' ein Kation mit mehreren positiven Ladungen bedeutet, die entsprechende Anzahl von Anionen damit gekuppelt ist. Bevorzugte Substituenten an X oder an R', wenn R' Alkyl bedeutet, sind Hydroxy, Alkoxy, Phenyl, Amino und Alkyl- oder Dialkylamino.
Die erfindungsgemäß geeigneten Verbindungen enthalten mindestens ein und im allgemeinen mehrere chirale Zentren. Erfindungsgemäß geeignete Verbindungen umfassen Gemische der verschiedenen Stereoisomeren sowie die stereoisomeren Formen der Verbindungen im einzelnen. Bevorzugte Stereoisomere der Verbindung der Formel (1) in Formen, die keine π-Bindungen enthalten, sind Verbindungen der Formel
sowie die entsprechende Stereochemie in der offenkettigen Form (Nichtlacton-Form) der Formel (2).
Formen der Formeln (1) und (2), die keine π-Bindungen enthalten (abgesehen von in X und Y), werden bevorzugt.
In einem Satz von bevorzugten Ausführungsformen ist X unsubstituiert. Insbesondere ist X aus der folgenden Gruppe ausgewählt: -CH₂CH₂-, -CH=CH-, und -C≡C- und ganz besonders -CH₂CH₂-.
Bevorzugte Ausführungsformen von Y umfassen Ringsysteme, wie Naphthyl, Polyhydronaphthyl, Monohydro- oder Dihydrophenylchinolyl, Pyridyl, Chinazolyl, Pteridyl, Pyrolyl, Oxazoyl und dergl. sowie die reduzierten oder partiell reduzierten Formen davon.
Bevorzugte Ausführungsformen des Substituenten Y umfassen solche der Formel
wobei R¹ substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl bedeutet;
die Reste R² jeweils unabhängig voneinander einen nicht-störenden Substituenten bedeuten;
R³ H, Hydroxy oder Alkoxy (1–6C) bedeutet;
m jeweils unabhängig voneinander eine ganze Zahl mit einem Wert von 0 bis 6 bedeutet, wobei R2 sich jeweils in einer der Positionen 2 bis 7 befinden kann; und
p den Wert 0 oder 1 hat, abhängig von der Position etwaiger π-Bindungen, die durch die gestrichelten Linien angegeben sind.
Zu besonders bevorzugten Ausführungsformen gehören solche der Formeln (4a)–(4f), wobei
die Obergrenze von n entsprechend den Wertigkeitserfordernissen für das spezielle Ringsystem angepasst ist.
Obgleich R¹ substituiertes Alkyl bedeuten kann, wobei die Substituenten Hydroxy, Alkoxy, Alkylthiol, Phenyl, Phenylalkyl und Halogen umfassen können, wird unsubstituiertes Alkyl bevorzugt. Besonders bevorzugte Ausführungsformen von R1 sind C_1-6-Alkyl, einschließlich Propyl, sec.-Butyl, Butyl, Isobutyl, Pentyl, Isopentyl, 1-Methylbutyl und 2-Methylbutyl. Besonders bevorzugt sind Propyl und sec.-Butyl.
Zu bevorzugten Ausführungsformen für R² gehören Hydroxy, =O und Niederalkyl (1–4C), und ganz besonders Methyl und Hydroxymethyl. Bei den bevorzugten Ausführungsformen hat n jeweils unabhängig voneinander einen Wert von 1 oder 2 und bevorzugte Positionen für die Substitution sind die Positionen 2 und 6 (vergl. die Formel (4)).
Wie vorstehend ausgeführt, können die erfindungsgemäßen Verbindungen als individuelle Stereoisomere oder als Gemische von Stereoisomeren bereitgestellt werden. Bevorzugte Stereoisomere sind solche der Formeln (4g) und (4h) als typische und geeignete Vertreter der Verbindungen der Formeln (4a) bis (4f).
Besonders bevorzugt sind Verbindungen mit der Stereochemie der Formeln (4g) und (4h), wobei die angegebenen Substituenten die einzigen Substituenten am Polyhydronaphthyl-System darstellen, wobei gegebenenfalls zusätzliche Substituenten an Position 5 vorliegen. Zu bevorzugten Ausführungsformen gehören solche, bei denen R² jeweils unabhängig OH, CH₂OH, Methyl oder =O bedeutet. Bevorzugte Ausführungsformen von R¹ in diesen bevorzugten Formen sind Propyl und sec.-Butyl.
Zu weiteren bevorzugten Ausführungsformen von Y gehören
wobei Z die Bedeutung CH oder N hat, wenn n im Zusammenhang mit dem zusätzlichen Ringsubstituenten den Wert 1 hat, und die Bedeutung S oder O hat, wenn n den Wert 0 hat. Die einzelnen Reste K umfassen ein substituiertes oder unsubstituiertes, aromatisches oder nichtaromatisches, carbocyclisches oder heterocyclisches Ringsystem, das gegebenenfalls durch einen Linker mit 1 bis 2 C im Abstand von der in den Formel (5) bis (9) dargestellten Verknüpfungsposition gehalten wird, einschließlich beispielsweise -CHOH-, -CO- und -CHNH²-. Aromatische Ringsysteme werden bevorzugt. Besonders bevorzugt sind Verbindungen der Formel (7), insbesondere wenn die beiden Indices n den Wert 1 haben.
Jeder der Reste R⁴ und R⁵ bedeutet unabhängig voneinander H oder lineares oder verzweigtes, substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl, wobei es sich bei den Substituenten vorzugsweise um Hydroxy, Alkoxy, Phenyl, Amino und Alkyl- oder Dialkylamino handelt. Jeder der Indices n bedeutet unabhängig voneinander 0 oder 1, wobei jedoch mindestens ein n in der Formel (5) und in der Formel (9) den Wert 1 haben muss.
Bei den Substituenten an den aromatischen Ringsystemen oder nicht- aromatischen Ringsystemen der Erfindung kann es sich um beliebige nichtstörende Substituenten handeln. Im allgemeinen kommt für die nicht- störenden Substituenten eine große Vielzahl von Substituenten in Frage. Zu Substituenten, die die vorteilhaften Wirkungen der erfindungsgemäßen Verbindungen bei der Knochenbildung von behandelten Subjekten nicht stören, gehören Alkyl (1–6C, vorzugsweise Niederalkyl mit 1–4C), einschließlich geradkettige oder verzweigte Formen davon, Alkenyl (2–6C, vorzugsweise 2–4C), Alkinyl (2–6C, vorzugsweise 2–4C), die alle geradkettig oder verzweigt sein können und weitere Substituenten enthalten können; Halogene, einschließlich F, Cl, Br und I; Silyloxy, OR, SR, NR2, OOCR, COOR, NCOR, NCOOR und Benzoyl, CF₃, OCF₃, SCF₃, N(CF₃)₂, CN, SO, SO₂R und SO₃R, wobei R Alkyl (1–6C) oder H bedeutet. Wenn zwei Substituenten in benachbarten Positionen im aromatischen oder nicht- aromatischen System vorliegen, können sie einen Ring bilden. Ferner können Ringe, die nicht an das aromatische oder nicht-aromatische System kondensiert sind, unter Substituenten, die eine ausreichende Anzahl an Kohlenstoffatomen und Heteroatomen aufweisen, um diese Möglichkeit zu bieten, fallen.
Bevorzugte, nicht-störende Substituenten umfassen Hydrocarbylgruppen mit 1–6C, einschließlich gesättigte und ungesättigte, lineare oder verzweigte Hydrocarbylgruppen, sowie Hydrocarbylgruppen mit einem Gehalt an Ringsystemen; Halogengruppen, Alkoxy, Hydroxy, CN, CF3 und COOR, Amino, Monoalkyl- und Dialkylamino, wobei die Alkylgruppen 1–6C aufweisen.
Obgleich die Anzahl an Substituenten an einem durch K dargestellten Ring typischerweise 0–4 oder 0–5 betragen kann (abhängig von den verfügbaren Positionen) umfassen bevorzugte Ausführungsformen die Fälle, bei denen die Anzahl an einem einzelnen Ring 0, 1 oder 2 und vorzugsweise 0 oder 1 beträgt.
Die für die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung geeigneten Verbindungen können nach aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren synthetisiert werden, da sie eine Ähnlichkeit mit einer Klasse von Verbindungen aufweisen, von denen aus dem Stand der Technik bekannt ist, dass sie sich als antihypercholesterinämische Mittel verhalten. Ein typisches Beispiel hierfür ist Lovastatin, das von der Fa. Merck als Mevacor^R vertrieben wird. Die Synthese von Lovastatin und verschiedenen Analogen davon ist im US-Patent 4 063 538 (durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht) dargelegt. Ferner sind Verfahren zur Synthese von Lovastatin und analogen Verbindungen, wie Compactin (Mevastatin), Simvastatin und Pravastatin, in den US-Patenten 5 059 696, 4 873 345, 4 866 186, 4 894 466, 4 894 465, 4 855 456 und 5 393 893) die alle durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht werden) dargelegt. Darunter werden bestimmte Verbindungen auch durch Mikroorganismen erzeugt, wie in den US-Patenten 5 362 638, 5 409 820, 4 965 200 und 5 409 820 (alle durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht) dargelegt ist. Die in diesen Druckschriften als Endprodukte beschriebenen Verbindungen eignen sich für die erfindungsgemäßen Verfahren.
Zusätzliche Analoge, einschließlich solche mit einem Gehalt an aromatischen Ausführungsformen im Rahmen von Y, sind im US-Patent 5 316 765 (durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht) beschrieben. Beispielsweise wird die Herstellung von Fluvastatin in der PCT-Anmeldung WO-84/02131 beschrieben. Weitere Verbindungen werden beispielsweise von B. D. Roth et al., J. Med. Chem., Bd. 34 (1991), S. 357–366; R. Krause et al., J. Drug Dev., Bd. 3 (Suppl. 1) (1990), S. 255–257; G. S. Karanewsky et al., J. Med. Chem., Bd. 33 (1990), S. 2952–2956, beschrieben.
Besonders bevorzugt werden Lovastatin (59–0326), Mevastatin (59–0327), Simvastatin (59-0328) und Fluvastatin (59–0342), die in 1 dargestellt sind.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung, ohne diese zu beschränken.
Beispiel 1
Screening mit hohem Durchsatz
Tausende von Verbindungen wurden im Testsystem gemäß US-SN 08/458 434 (Anmeldetag 2. Juni 1995) (durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht) getestet. Repräsentative Verbindungen der Erfindung ergaben positive Reaktionen, während der Großteil von (damit nicht verwandten) Verbindungen inaktiv ist. Bei diesem Screening handelt es sich bei der standardmäßigen positiven Kontrolle um die Verbindung 59-0008 (auch bezeichnet als "OS8"), die folgende Formel aufweist:
Im einzelnen wurden 2T3-BMP-2-LUC-Zellen verwendet, eine in stabiler Weise transformierte Osteoblasten-Zelllinie, die in der vorerwähnten Druckschrift Ghosh-Choudhury et al. Endocrinology, Bd. 137 (1996), S. 331-339, beschrieben ist. Die Zellen wurden unter Verwendung von α-MEM, 10% FCS mit 1% Penicillin/Streptomycin und 1% Glutamin ("Ausstreichmedium") gezüchtet und 1-mal pro Woche im Verhältnis von 1:5 aufgeteilt. Für den Test wurden die Zellen in Ausstreichmedium mit einem Gehalt an 4% FCS resuspendiert, auf Mikrotiterplatten in einer Konzentration von 5 × 10³ Zellen (in 50 μl)/Vertiefung ausgestrichen und 24 Stunden bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert. Zur Einleitung des Tests wurden 50 μl der Testverbindung oder die Kontrolle in DMSO in einer Konzentration von 2X in jede Vertiefung gegeben, so dass das Endvolumen 100 μl betrug. Die endgültige Serumkonzentration betrug 2% FCS. Die endgültige DMSO-Konzentration betrug 1%. Die Verbindung 59-0008 (10 μM) wurde als positive Kontrolle verwendet.
Die behandelten Zellen wurden 24 Stunden bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. Anschließend wurde das Medium entfernt. Die Zellen wurden 3-mal mit PBS gespült. Nach Entfernung von überschüssigem PBS wurde jede Vertiefung mit 25 μl 1X Zellkultur-Lysierreagenz (Promega #E153A) versetzt und mindestens 10 Minuten inkubiert. Gegebenenfalls konnten die Platten/Proben zu diesem Zeitpunkt eingefroren werden. Jede Vertiefung wurde mit 50 μl Luciferase-Substrat (Promega #E152A; 10 ml Promega-Luciferase-Testpuffer pro 7 mg Promega-Luciferase-Testsubstrat) versetzt.
Die Lumineszenz wurde an einem automatisierten Luminometer für 96 Vertiefungen gemessen und wurde entweder als Picogramm-Luciferase-Aktivität pro Vertiefung oder als Picogramm-Luciferase-Aktivität pro Mikrogramm Protein angegeben.
Bei diesem Test weist die Verbindung 59–0008 (3-Phenylazo-lH-4,1,2-benzothiadiazin) ein Reaktivitätsmuster auf, das bei einer Konzentration von etwa 3–10 μM maximal ist. Demzufolge lassen sich weitere Testverbindungen bei verschiedenen Konzentrationen bewerten und die Ergebnisse lassen sich mit den für 59–0008 bei einer Konzentration von 10 μM erhaltenen Ergebnissen (dieser Wert würde auf 100 normiert) vergleichen. Alternativ kann die Reaktivität einer Testverbindung direkt mit einer negativen Kontrolle, die keine Verbindung enthält, verglichen werden.
Eine Vielzahl von Statin-Verbindungen (Simvastatin mit der Bezeichnung OS114 oder 59–0328, hydrolysiertes Simvastatin, Mevastatin mit der Bezeichnung 59–0327, Lovastatin mit der Bezeichnung 59–0326, Fluvastatin mit der Bezeichnung 59–0342 und Pravastatin mit der Bezeichnung 59–0329) wurden in dem in vitro-Test auf BMP-Promotor-Basis (als "ABA" bezeichnet) (vergl. die vorstehenden Angaben) getestet. In einigen Experimenten wurden auch in einem Osteoblasten/Serum-Reaktionselement (OBSRE)-Kontrolltest auf Zellbasis und/oder in einem Kontroll-Glucagontest getestet. Beim negativen Kontroll-OBSRE-Test wurde eine murine Osteoblasten-Zelllinie, wie CCC-4, die ein Serum-Reaktionselement (SRE)-Luciferase-Reportergen exprimiert, verwendet (vergl. WO-96/07733). Beim negativen Kontroll-Glucagontest wird eine Glucagon-Rezeptor-positive BHK-Ze11e, die ein CRE-Luciferase-Reportergen exprimiert, verwendet (vergl. US-Patent 5 698 672).
Die Ergebnisse von drei getrennten Bestimmungen beim ABA-Test sind nachstehend aufgeführt. Die meisten Statine (d. h. Simvastatin, hydrolysiertes Simvastatin, Mevastatin, Lovastatin und Fluvastatin) wiesen eine dosisabhängige Stimulationswirkung beim ABA-Test, jedoch nicht bei den Kontrolltests auf. Bei einem Experiment zeigte Simvastatin eine mehr als 20-fache Induktion beim ABA-Test, verglichen mit der ABA-stimulatorischen Nichtstatin-Verbindung 59–0008.
Experiment 2
Experiment 3
Das Pravastatin, das getestet wurde, zeigte keine dosisabhängige Stimulationsreaktion, da aber diese Verbindung aus einer Pravastatin-Zubereitung extrahiert worden war, ist es möglich, dass die getestete Verbindung unzureichend und/oder inaktiv war.
Beispiel 2
In vivo-Daten über das Wachstum des Schädeldeckenknochens
Lovastatin und Simvastatin wurden in vivo gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren (vergl. "In vivo-Test der Einflüsse von Verbindungen auf das Wachstum des Schädeldeckenknochens bei Mäusen") getestet. Simvastatin ergab eine 1,5-fache Zunahme der Anzahl an Osteoblasten.
Bei einem Experiment wurden der Kontrollträger, bFGF und verschiedene Dosen an Simvastatin (59–0328) und Lovastatin (mit der Bezeichnung 59–0326) beim in vivo-Test des Wachstums des Schädeldeckenknochens getestet. Die Ergebnisse sind als Messung der Gesamtknochenfläche (und prozentualer Anstieg der Fläche gegenüber der Trägerkontrolle) nachstehend wiedergegeben.
Sowohl Simvastatin als auch Lovastatin stimulierten eine dosisabhängige Zunahme der Gesamtknochenfläche. Bei 10 mg/kg/Tag waren die knochenstimulatorischen Einflüsse dieser Statine vergleichbar mit der Knochenwachstumswirkung, die beobachtet wurde, wenn 12,5 μg/kg/Tag bFGF beim gleichen Test getestet wurden.
Beispiel 3
In vitro-Knochenbildung
Ausgewählte Verbindungen und geeignete Kontrollen wurden in vitro (ex vivo) auf ihre Knochenbildungsaktivität getestet (vorstehend beschrieben bei "Techniken für den Schädeldeckentest bei neugeborenen Mäusen (in vitro)"). Histomorphometrische Bestimmungen von ex vivo-Schädeldecken wurden unter Verwendung eines OsteoMetrics-Knochen-Morphometrie-Messprogramms gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Messungen wurden mit einem 10-fach- oder 20-fach-Objektiv mit einem üblichen Punktzählungs-Mikrometerokular vorgenommen.
Die Bildung von neuem Knochen wurde bestimmt (unter Verwendung eines 10X-Objektivs), indem die Fläche von neu gebildetem Knochen in einem Feld in drei repräsentativen Schnitten eines jeden Knochens (4 Knochen pro Gruppe) gemessen wurde. Jede Messung wurde in einem Halbfeldabstand vom Ende der Naht durchgeführt. Sowohl die Gesamtknochenfläche als auch die alte Knochenfläche wurden gemessen. Die Daten wurden als neue Knochenfläche in mm² angegeben.
Die Osteoblastenzahlen wurden durch Punktzählung bestimmt. Die Anzahl an Osteoblastenzellen, die die Oberfläche an beiden Seiten des Knochens bekleiden, wurde in einem Feld unter Verwendung eines 20X- Objektivs bestimmt. Die Daten wurden als Osteoblastenzahlen/mm der Knochenoberfläche angegeben.
Lovastatin und Simvastatin, die Kontrollverbindungen/Faktoren bFGF und BMP-2 und eine Trägerkontrolle wurden beim in vitro-Knochenbildungstest getestet. Die Schädeldecken wurden gemäß den vorstehenden Angaben histomorphometrisch analysiert. Nachstehend sind mehrere Sätze von experimentellen Daten aufgeführt, wobei die prozentuale Zunahme gegenüber den Trägerkontrollwerten in Klammern angegeben ist.
Diese Daten zeigen, dass Lovastatin und Simvastatin gleich gut oder besser als BMP-2 und bFGF (zwei "Goldstandard"-Mittel für das Knochenwachstum; vergl. J. Wozney, Molec. Reprod. Dev., Bd. 32 (1992), S.
160–167; WO-95/24211) bezüglich der Induktion der Knochenbildung sind. Wie in Beispiel 2 gezeigt, führten in vivo-Schädeldeckenstudien unter Verwendung von Lovastatin und Simvastatin zu Daten für das Knochenwachstum, die mit denen von in vitro-Beobachtungen übereinstimmten.
Beispiel 4
Einfluss auf die Resorption
Die Statine und Kontrollen wurden in einem Antiresorptionstest getestet. Kurz zusammengefasst, seit 15 Tagen trächtige weibliche CD-1-Mäuse erhielten eine Injektion von ⁴⁵Ca (25 μCi/Maus). Die Schädeldecken der 4 Tage alten Jungtiere wurden herausgeschnitten und halbiert. Die herausgeschnittenen Schädeldeckenhälften wurden auf Metallgitter (an der Oberfläche) in 1 ml BGJ-Medium (Sigma) mit einem Gehalt an 0,1% BSA, das mit Glutamin und Pen/Strep versetzt war, gelegt. Die Knochen wurden 24 Stunden bei 37 °C in einem zu 5 % befeuchteten Inkubator inkubiert. Anschließend wurden sie auf Vertiefungen mit einem Gehalt an 1 ml Medium, das mit Faktoren versetzt war (IL-1, PTH, und/oder Testverbindungen) übertragen. Die behandelten Knochen wurden unter den vorstehenden Bedingungen weitere 72 Stunden inkubiert. Nach dieser Inkubationsdauer wurden die Knochen entnommen und 1,5 Stunden in ein Szintillationsfläschchen mit 20% Trichloressigsäure gelegt. Sodann wurden sie mit Szintillationsflüssigkeit ausgezählt. Eine Aliquotmenge des Mediums (0,4 ml) wurde ebenfalls gezählt. Die Ergebnisse sind als prozentuale ⁴⁵Ca-Freisetzung angegeben.
Dieser Test kann modifiziert werden, indem man Testverbindungen/Faktoren oder Kontrollverbindungen /Faktoren dem Vorinkubationsmedium (d. h. während der ersten 24 Stunden) zusetzt. Da der Großteil der Osteoklasten in den Schädeldecken nach der Vorinkubationsperiode gebildet wird, können Verbindungen oder Faktoren, die die Osteoklastenbildung beeinflussen, während der Vorinkubationsperiode einen größeren Einfluss ausüben.
Bei diesem Test wurde die Verbindungstoxizität als offensichtlicher Zelltod in der periostealen Region und innerhalb der Markhöhle der Knochenorgankulturen angegeben. Diese Zellen waren durch pyknotische Kerne und vakuolisiertes Zytoplasma, die für Zellnekrose charakteristisch sind und einen Unterschied zur Apoptose darstellen, charakterisiert.
Unter Anwendung dieses Tests wurde Simvastatin auf seine Fähigkeit zur Hemmung der IL-1-induzierten Knochenresorption getestet. Kurz zusammengefasst, IL-1 (10^–10 M) wurde während einer 72-stündigen Inkubationsperiode gleichzeitig mit Simvastatin (mit 0,1, 1 oder 10 μM) zugesetzt. Die Knochenresorption wurde durch Messung der ⁴⁵Ca-Freisetzung bestimmt. IL-1 erhöhte in Abwesenheit von Simvastatin die ⁴⁵Ca-Freisetzung auf etwa das 2-fache gegenüber Kontrollschädeldecken, die in Abwesenheit von IL-1 oder Simvastatin inkubiert wurden. Simvastatin veränderte in der Konzentration von 0,1 oder 1 μM die IL-1-induzierte ⁴5Ca-Freisetzung nicht. Jedoch verringerte Simvastatin in einer Konzentration von 10 μM die IL-1-induzierte ⁴⁵Ca-Freisetzung.
Eine histologische Bewertung wies auf die Toxizität von Simvastatin in der Konzentration von 10 μM hin. Frühere Studien zeigten die Korrelation der Toxizität mit der verringerten ⁴⁵Ca-Freisetzung.
Diese Daten lassen darauf schließen, dass Simvastatin die Knochenresorption in Dosen, die beim primären Screeningtest von Beispiel 1 wirksam sind, nicht hemmt. Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu den Berichten von R. G. G. Russell et al., wonach Mevastatin in vitro die Knochenresorption in murinen Schädeldecken hemmt.
Beispiel 5
Systemische Verabreichung von Statinen in OVX-Modellen
Lovastatin und Simvastatin wurden in vivo unter Anwendung eines akuten OVX-Modells (Prophylaxemodell) und/oder eines chronischen OVX-Modellsystems (Therapiemodell) gemäß den Angaben unter "Weitere in vivo-Tests" analysiert.
Lovastatin wurde in einer akuten OVX-Studie geprüft. Kurz zusammengefasst, 59–0326 wurde oral unmittelbar im Anschluss an eine Ovariektomie verabreicht (35, 7 oder 1,4 mg/kg/Tag, 1-mal täglich für 35 Tage). Am Ende der Studie wurden Blut- und Gewebeproben der Tiere bearbeitet. Die folgenden Daten wurden erhalten.
Die pQCT-Analyse von den Tieren entnommenen Proben, die eine Dosis von 7 mg/kg/Tag erhalten hatten, zeigte eine 20%ige Zunahme der trabekulären Dichte und eine 14%ige Zunahme der kortikalen Dicke. Eine histomorphometrische Analyse durch zwei Personen ergab eine Zunahme des trabekulären Knochenvolumens von 110% (p<0,001) oder von 25% (p=0,0503) im proximalen Schienbein sowie eine Zunahme von 23% (nicht-signifikant) im distalen Oberschenkelknochen. Die Knochenbildungsrate im distalen Oberschenkel stieg bei den Tieren mit 7 mg/kg/Tag um 40% (p=0,052).
Gleichermaßen wurde Lovastatin oral unmittelbar nach einer Ovariektomie verabreicht (0,1, 1, 5, 10, 20 oder 40 mg/kg/Tag; 1-mal täglich für 35 Tage). Zwei Personen führten eine histomorphometrische Analyse von Proben durch, die den Tieren, die die Dosis von 10 mg/kg/Tag erhalten hatten, entnommen worden waren. Diese Analysen ergaben eine Zunahme des trabekulären Knochenvolumens von 38% (nicht-signifikant) oder 90% (p<0,02) im proximalen Schienbein. Für die Knochenbildungsrate im proximalen Schienbein wurde eine Zunahme von 74% (p= 0,004) bei Tieren, die eine Dosis von 10 mg/kg/Tag erhalten hatten, oder von 37% (p<0,008) bei Tieren, die eine Dosis von 1 mg/kg/Tag erhalten hatten, festgestellt. Bei Proben von Tieren, die eine Dosis von 1 mg/kg/Tag erhalten hatten, ergab sich eine Mineral-Ablagerungsate im proximalen Schienbein von 22%.
Ferner wurde Simvastatin in einer chronischen OVX-Studie geprüft. Kurz zusammengefasst, Simvastatin wurde Ratten auf oralem Wege 6 Wochen nach einer Ovariektomie verabreicht (0,1, 1, 10 oder 50 mg/kg/Tag; 1-mal täglich für 10 Wochen. Bei der Dosis von 10 mg/kg/Tag wurde eine 114%ige (nicht signifikant) Zunahme der Knochenbildungsrate im proximalen Schienbein gemessen. Bei der Dosis von 50 mg/kg/Tag wurde eine 86%ige (nicht signifikant) Zunahme der Knochenbildungsrate im proximalen Schienbein gemessen.
Beispiel 6
Durch Statin vermittelte Fraktur-Reparaturwirkungen von Testverbindungen
Simvastatin wurde in Bezug auf seine Auswirkungen auf chirurgische Defekte im Kaninchen-Radius geprüft. Eine Heilung dieser Defekte kann durch Röntgenuntersuchung, histologische Untersuchung und aufgrund der biomechanischen Festigkeit festgestellt werden.
Die Testverbindung wurde in ein Mikrozentrifugenröhrchen eingewogen. 50 μl einer 1,5-%igen Natriumalginatlösung wurden als Träger zugegeben. Die Testprobe wurde aufgewirbelt, um das gesamte Pulver zu benetzen. Sodann wurde die Probe 20 bis 30 Minuten einer Ultraschallbehandlung unterzogen und sodann erneut aufgewirbelt. Scheiben wurden oben auf dem Mikrozentrifugenröhrchen erzeugt (indem das Röhrchen mit der Deckel- oder Stopfenseite nach unten gelegt wurde). Die Vertiefung auf der Oberseite des Stopfens (d. h. des Deckels) wurde zur Bildung der Scheibe (Durchmesser 7,5 mm) verwendet. Eine CaCl₂-Lösung (100 μl mit 100 mM) wurde zu der Natriumalginat/Arzneistoff-Lösung gegeben. Man ließ die Proben 5 bis 10 Minuten absitzen und entfernte dann sorgfältig die Calciumalginat-Scheiben. Die Scheiben wurden in einem Becherglas, das mit Wasser gefüllt war, gespült, um überschüssige Calciumlösung abzuspülen. Sodann wurden die Scheiben in Röhrchen unter Verwendung von Wasser als Träger aufbewahrt. Sämtliche Lösungen und Behälter waren steril und sämtliche Maßnahmen zur Herstellung der Scheiben wurden unter sterilen Bedingungen unter einem Abzug mit laminarer Strömung durchgeführt.
Die Knochenheilung wurde folgendermaßen geprüft. Kurz zusammengefasst, männliche Kaninchen im Alter von 6 Monaten wurden in vier Behandlungsgruppen eingeteilt (n=3 Tiere/Gruppe). Die Behandlungsgruppen erhielten: 1) Placebo; 2) die Testverbindung (5 mg/Scheibe); 3) Testverbindung (10 mg/Scheibe); oder 4) ein autologes Knochentransplantat. Die Tiere wurden mit einem Kaninchen-Cocktail (1 ml/1,5 kg intramuskulär) betäubt. Die rechte vordere Gliedmaße wurde geklammert, vorbereitet und für einen aseptischen chirurgischen Eingriff abgedeckt. Die Anästhesie wurde unter Verwendung von Isofluoran, das mit einer Gesichtsmaske abgegeben wurde, aufrechterhalten. Um einen Spaltendefekt von 20 mm im rechten mittleren Radius zu erzeugen, wurde ein Einschnitt über der seitlichen Partie der vorderen Gliedmaße vorgenommen und eine Osteotomie wurde mit einer oszillierenden Knochensäge durchgeführt. Das Simvastatin oder der Träger wurden auf den Defekt aufgetragen und der Defekt wurde in Schichten verschlossen. Es brauchte keine Schiene von außen angelegt zu werden, da der Radius mit der Ulna gepaart ist, die dem Kaninchen eine normale Fortbewegung ermöglicht. Scheiben wurden zu Streifen geschnitten und so in die Fraktur eingeführt, dass der gesamte Defekt bedeckt war. Eine radiologische Bewertung wurde zum Zeitpunkt Null und nach 4 Wochen durchgeführt.
Da der Träger (Placebo-Behandlungsgruppe) eine vollständige Heilung in der Kontrollgruppe verhinderte, wurden nur Röntgenergebnisse gewonnen und analysiert. Demzufolge ergab die Röntgenanalyse 4 Wochen nach Behandlungsbeginn eine Bildung von Callus an der Knochenbehandlungsstelle in den Behandlungsgruppen (beiden Dosen), jedoch nicht in den Placebogruppen (Träger oder autologes Knochentransplantat).

Claims

Verwendung einer Verbindung der Formel
wobei X in jeder der Formeln (1) und (2) einen substituierten oder unsubstituierte Alkylen-, Alkenylen- oder Alkinylen-Linker mit 2 bis 6 C bedeutet; Y einen oder mehrere carbocyclische oder heterocyclische Ringe bedeutet, wobei, wenn Y zwei oder mehr Ringe umfasst, diese Ringe kondensiert sein können; und R' ein Kation, H oder eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe mit 1 bis 6 C bedeutet; und die gestrichelten Linien gegebenenfalls vorhandene π-Bindungen bedeuten; bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei einem Verfahren zur Verstärkung der Knochenbildung bei einem Wirbeltier.
Verwendung nach Anspruch 1, a) wobei X unsubstituiert ist und/oder b) Y die folgende Bedeutung hat
wobei R1 substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl bedeutet; R2 jeweils unabhängig voneinander einen nicht-störenden Substituenten bedeutet; R3 die Bedeutung H, Hydroxy oder Alkoxy (1–6C) hat; m jeweils unabhängig voneinander eine ganze Zahl mit einem Wert von 0 bis 6 bedeutet, wobei R2 sich jeweils in einer der Positionen 2 bis 7 befinden kann; und p den Wert 0 oder 1 hat, abhängig von der Position etwaiger π-Bindungen, die durch die gestrichelten Linien angegeben sind; und/oder c) wobei Y folgendes bedeutet
wobei n jeweils den Wert 0 oder 1 hat, wobei aber mindestens ein n in der Formel (5) und in der Formel (9) den Wert 1 haben muss; Z die Bedeutung CH oder N hat, wenn n im Zusammenhang mit dem zusätzlichen Ringsubstituenten den Wert 1 hat, und die Bedeutung S oder O hat, wenn n den Wert 0 hat; jedes K ein substituiertes oder unsubstituiertes, aromatisches oder nicht-aromatisches, carbocyclisches oder heterocyclisches Ringsystem bedeutet, das gegebenenfalls durch einen Linker mit 1 bis 2 C im Abstand von der in den Formeln (5) bis (9) dargestellten Verknüpfungsposition gehalten wird; und die Reste R4 und R5 jeweils unabhängig voneinander H oder lineares oder verzweigtkettiges Alkyl bedeuten.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Verbindung die folgende Formel aufweist,
wobei X und Y die in Anspruch 1 definierten Bedeutungen aufweisen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei X aus der aus -CH₂-CH₂-, -CH=CH- und -C≡C- bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 oder 4, wobei in der Formel (4) m jeweils unabhängig voneinander den Wert 1 oder 2 hat und wobei R2 sich jeweils in den Positionen 2, 5 oder 6 befindet.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei Y die Formel aufweist
Verwendung nach Anspruch 6, wobei Y die folgende Formel aufweist
Verwendung nach Anspruch 1 bis 4, wobei Y folgendes bedeutet
wobei n jeweils den Wert 0 oder 1 hat, wobei aber mindestens ein n in der Formel (5) und in der Formel (9) den Wert 1 haben muss; Z die Bedeutung CH oder N hat, wenn n im Zusammenhang mit dem zusätzlichen Ringsubstituenten den Wert 1 hat, und die Bedeutung S oder O hat, wenn n den Wert 0 hat; jedes K ein substituiertes oder unsubstituiertes, aromatisches oder nicht-aromatisches, carbocyclisches oder heterocyclisches Ringsystem bedeutet, das gegebenenfalls durch einen Linker mit 1 bis 2 C im Abstand von der in den Formeln (5) bis (9) dargestellten Verknüpfungsposition gehalten wird; und die Reste R⁴ und R⁵ jeweils unabhängig voneinander H oder lineares oder verzweigtkettiges Alkyl bedeuten.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Verbindung um Lovastatin, Mevastatin, Simvastatin oder Fluvastatin oder eine hydrolysierte Form davon oder um Pravastatin handelt.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Wirbeltier durch einen Zustand gekennzeichnet ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Osteoporose, Knochenfraktur oder -mangel, primärer oder sekundärer Hyperparathyroidismus, periodontale Krankheit oder Defekt, metastatische Knochenkrankheit, osteolytische Knochenkrankheit, Zustand nach plastisch-chirurgischen Eingriffen, Zustand nach prothetisch-chirugischen Eingriffen an Gelenken und Zustand nach Zahnimplantationen besteht.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Verfahren ferner die Verabreichung von einem oder mehreren Mitteln, die das Knochenwachstum fördern oder die Knochenresorption hemmen, an das Wirbeltier umfasst.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Mittel aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus knochenmorphogenetischen Faktoren, antiresorptiven Mitteln, osteogenen Faktoren, von Knorpeln abgeleitete morphogene Proteine, Wachstumshormone und differenzierende Faktoren besteht.