DE69632402T2 - 4-(2-(n-(-2-carboxamidoindole)aminiethyl)-benzensulfonamide oder sulfonylharnstoffe als pdgf antagoniste - Google Patents

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Description

  • Die Proliferation glatter Muskelzellen (SMCs) in der Gefäßwand ist ein bedeutendes Ereignis bei der Bildung von Gefäßläsionen bei Atherosklerose, nach Gefäßrekonstruktion oder als Antwort auf eine andere Gefäßverletzung. Zum Beispiel beinhaltet die Behandlung der Arteriosklerose häufig das Freiräumen verstopfter Gefäße durch Angioplastie, Endarterektomie oder Reduktionsatherektomie oder durch Bypassversorgung, operative Verfahren, bei denen atherosklerotische Plaques durch Katheterisierung (Angioplastie) zusammengepresst oder beseitigt werden, von der Arterienwand über eine Inzision (Endarterektomie) abgezogen werden oder mit natürlichen oder synthetischen Transplantaten überbrückt werden. Diese Verfahren entfernen das Gefäßendothel, unterbrechen die darunter liegende Intimaschicht und führen zum Absterben von SMCs in der Media. Dieser Verletzung folgen eine Proliferation von SMCs in der Media und deren Migration in die Intima, begleitet von einer exzessiven Ablagerung extrazellulärer Matrix. Diese Entwicklung der Läsion erfolgt typischerweise innerhalb der ersten paar Wochen und bis zu sechs Monaten nach der Verletzung und endet, wenn die darüber liegende Endothelschicht wiederhergestellt ist. Bei Menschen bestehen diese Läsionen aus etwa 20% Zellen und 80% extrazellulärer Matrix.
  • Bei etwa 30% oder mehr der Patienten, die mit Angioplastie, Endarterektomie oder Bypass-Transplantaten behandelt wurden, verursachen Thrombose und/oder Proliferation von SMCs in der Intima einen erneuten Gefäßverschluss und einen folgenden Misserfolg der rekonstruktiven Operation. Dieser Verschluss eines Gefäßes nach einer Operation ist als Restenose bekannt.
  • Ein ähnlicher Prozess der Proliferation von SMCs wurde auch bei transplantierten Organen beobachtet und trägt möglicherweise zu Arteriosklerose und Organversagen der Transplantate bei. Die Verdickung der Intima bei diesem Prozess bezieht nur das verpflanzte Organ ein.
  • Es wurde postuliert, dass Plättchen-Mitogene wie der Plättchen-Wachstumsfaktor (PDGF) eine Rolle bei der Entwicklung atherosklerotischer Plaques spielen (siehe Ross et al., Cell 46: 155–169, 1986; Harker, Am. J. Cardiol. 60: 20B–28B, 1987). Ein vorgeschlagener Mechanismus für die Bildung von Plaques ist die Freisetzung von Wachstumsfaktoren, die das Wachstum vom SMCs stimulieren, durch Plättchen an Stellen mit endothelialer Denudierung (Ross und Glomset, N. Eng. J. Med. 295: 369–377, 420–425, 1976; Ross, Arteriosclerosis 1: 293–311, 1981). Moore et al. (Thrombos. Haemostas. (Stuttg.) 35: 70, 1976) und Friedman et al. (J. Clin. Invest. 60: 1191–1201, 1977) berichteten über eine Hemmung einer unter Verwendung eines Verletzungsmodells mit einem Verweilkatheter experimentell induzierten Läsionsbildung der Intima in Arterien von Kaninchen durch prolongierte Thrombocytopenie, die durch Verabreichung von Antiplättchen-Serum induziert wurde. Es wurde auch postuliert, dass SMCs selbst PDGF produzieren können, der die Entwicklung von Läsionen durch einen autokrinen Mechanismus stimuliert (Ross et al., ibid; Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7311–7315, 1986). Fingerle et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8412–8416 untersuchten die Bildung von Läsionen der Intima bei Ratten mit Thrombocytopenie und schlossen, dass die Plättchen keine Rolle bei der initialen Proliferation der SMCs nach Verletzung mit einem Ballon spielen, aber die Migration der SMCs in die Intima regulieren können. Von Plättchen ist jetzt bekannt, dass sie eine Anzahl Wachstumsfaktoren freisetzen, einschließlich des PDGF, des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF), der transformierenden Wachstumsfaktoren alpha und beta (TGFα und TGFβ), des insulinartigen Wachstumsfaktors I (IGF-I) und des Plättchen-Endothelzell-Wachstumsfaktors, sowie verschiedener Chemokine. Obwohl bestimmte Studien PDGF in Vorgänge, die mit der Entwicklung von Läsionen verknüpft sind, einbeziehen, bleibt die Ätiologie der Intimahyperplasie bei Säugern nicht erklärt.
  • Die Beseitigung atherosklerotischer Plaques durch Angioplastie oder Endarterektomie ist von beschränkter Wirksamkeit, und es wurde keine effektive Behandlung für die Restenosierung von behandelten Gefäßen oder für die Stenose von Bypass-Transplantaten entwickelt. Folglich gibt es im Fachgebiet einen Bedarf nach Verfahren zur Reduktion oder Vermeidung der Entwicklung von SMC-reichen Läsionen in Gefäßwänden, einschließlich der Stenosierung von Blutgefäßen nach einer Gefäßverletzung wie einer Verletzung aufgrund einer Ballon-Katheterisierung, einer Endarterektomie, der Implantation eines endovaskulären Stents oder einer Reduktionsatherektomie, wie auch in Gefäßtransplantaten, Organtransplantaten und bei der Plazierung von Kathetern. Die vorliegende Erfindung stellt solche Verfahren zur Verfügung und erfüllt weitere, ähnliche Bedürfnisse.
  • EP 0 604 853 (Hoechst Japan Limited) behandelt eine pharmazeutische Verbindung, die 1-[4-[2-(3-Ethyl-4-methyl-2-oxo-3-pyrrolin-1-carboxyamido)ethyl]-phenylsulfonyl]-3-(trans-4-methylcyclohexyl)-harnstoff enthält. Die Verbindung wird zur Prophylaxe oder Behandlung der Arteriosklerose eingesetzt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines Plättchen-Wachstumsfaktor-Antagonisten der Formel I bei der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Intimahyperplasie in dem Gefäßsystem eines Säugers zur Verfügung:
    Figure 00030001
    worin R1, R4 und R5 unabhängig voneinander H, F, Cl, Br, -CF3 oder ein lineares oder verzweigtes Alkyl oder Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen sind; R2 und R3 unabhängig voneinander H oder ein lineares oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen sind; R6 H, ein lineares oder verzweigtes Alkyl oder Alkoxy mit 1 bis 18 Kohlenstoff-Atomen, Benzyloxy oder
    Figure 00030002
    ist,
    n 1 oder 2 ist; jedes X unabhängig voneinander C, N, NH, O und S ist, mit der Maßgabe, dass zumindest 1–2 X C sind, wobei wahlweise jedes X C sein kann; R9, R10 und R11, unabhängig voneinander H, F, Br, Cl, -CF3 oder ein lineares oder verzweigtes Alkyl oder Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen sind; R7 und R8 unabhängig voneinander H, ein lineares oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 18 Kohlenstoff-Atomen, -CONH-R12,
    Figure 00040001
    sind,
    oder R7 und R8 zusammen mit dem sie verbindenden N einen substituierten oder unsubstituierten heterocyclischen Ring mit 3 bis 8 Ringatomen bilden, z. B. einen unsubstituierten heterocyclischen Ring mit nicht mehr als 6 Ringatomen; R12 H,
    Figure 00040002
    ist;
    Y Stickstoff ist, R13 und R14 unabhängig voneinander H oder ein lineares oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen sind oder R13 und R14 zusammen mit dem sie verbindenden N einen substituierten oder unsubstituierten heterocyclischen Ring mit 3 bis 8 Ringatomen bilden; Z Kohlenstoff ist und R15, R16 und R17 unabhängig voneinander H, ein lineares oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen sind, R15 und R16, R16 und R17 oder R15 und R17 zusammen mit Z ein substituiertes oder unsubstituiertes Monocycloalkyl mit 3 bis 8 Kohlenstoff-Atomen bilden, oder R15, R16 und R17 zusammen mit Z ein substituiertes oder unsubstituiertes Mono- oder Polycycloalkyl mit 7 bis 14 Kohlenstoff-Atomen oder ein substituiertes oder ein unsubstituiertes überbrücktes Mono- oder Polycycloalkyl mit 6 bis 14 Kohlenstoff-Atomen bilden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind R1, R4 und R5 unabhängig voneinander H, Methyl oder Methoxy; R2 und R3 sind unabhängig voneinander H oder Methyl; R6 ist ein lineares oder verzweigtes Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen oder
    Figure 00050001
    n ist 1 oder 2, jedes X ist unabhängig voneinander aus der Gruppe, die C, S und N umfasst, ausgewählt, mit der Maßgabe, dass 1–2 X C sind; R9, R10 und R11 sind unabhängig voneinander H, Methyl oder Methoxy; R7 und R8 sind unabhängig voneinander H, ein lineares oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen oder CONH-R12; R12 ist H,
    Figure 00050002
    Y ist Stickstoff; Z ist Kohlenstoff; R13 und R14 bilden zusammen mit Y einen heterocyclischen Ring mit 5 bis 6 Ringatomen und R15 und R16, R16 und R17 oder R15 und R17 bilden zusammen mit Z ein substituiertes oder unsubstituiertes Monocycloalkyl mit 5 bis 6 Kohlenstoff-Atomen oder R15, R16 und R17 bilden zusammen mit Z ein substituiertes oder unsubstituiertes Mono- oder Polycycloalkyl mit 9 bis 10 Kohlenstoff-Atomen oder ein substituiertes oder unsubstituiertes überbrücktes Mono- oder Polycycloalkyl mit 8 bis 10 Kohlenstoff-Atomen.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bilden R13 und R14 zusammen mit Y die Komponente
    Figure 00060001
    worin
    Y Stickstoff ist, n 1 oder 2 ist und R18 und R19 unabhängig voneinander H, F, Br, Cl, -CF3 oder ein lineares oder verzweigtes Alkyl oder Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen sind, vorzugsweise worin R18 und R19 unabhängig voneinander H, Methyl, Ethyl, Methoxy oder Ethoxy sind.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform bilden R15 und R16, R16 und R17 oder R15 und R17 zusammen mit Z die Komponente
    Figure 00060002
    worin Z Kohlenstoff ist, n 1 oder 2 ist und R20, R21 und R22 unabhängig voneinander H, F, Br, Cl, -CF3 oder ein lineares oder verzweigtes Alkyl oder Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen sind, vorzugsweise worin R20, R21 und R22 unabhängig voneinander H, Methyl, Ethyl, Methoxy oder Ethoxy sind.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Nicht-Peptid-PDGF-Antagonist NNC92-0270:
  • Figure 00070001
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist besagter Säuger ein Primat.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist besagtes Medikament zur Anwendung des besagten Nicht-Peptid-PDGF-Antagonisten zeitgleich mit oder innerhalb einer antihyperplastisch effektiven Zeitperiode vor einer akuten Gefäßverletzung bei besagtem Säuger bestimmt; oder
    besagter Nicht-Peptid-PDGF-Antagonist ist zur Anwendung innerhalb einer antihyperplastisch effektiven Zeitperiode, die auf eine akute Gefäßverletzung bei besagtem Säuger folgt, bestimmt;
    und worin in beiden Fällen besagte Verletzung optional auf eine Gefäßrekonstruktion zurückzuführen ist, z. B. worin besagte Gefäßrekonstruktion Angioplastie, Endarterektomie, Reduktionsatherektomie, endovaskuläre Laserablation oder Anastomosierung mit einem Gefäßtransplantat umfasst.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst besagtes Medikament weiterhin Heparin.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das besagte Medikament zur Anwendung des besagten Nicht-Peptid-PDGF-Antagonisten und Heparin bei besagtem Säuger durch eine Applikationsform bestimmt, die aus der Gruppe, die orale, intravaskuläre, perivaskuläre, transdermale und rectale Applikationsformen umfasst, ausgewählt ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Verbindung der Formel I zur Verwendung als ein Medikament bereit.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung, die zur Hemmung von Intimahyperplasie geeignet ist und einen Nicht-Peptid-PDGF-Antagonisten der Formel I und Heparin umfasst, bereit.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Produkt, welches einen Nicht-Peptid-PDGF-Antagonisten der Formel I und Heparin enthält, als ein Kombinationspräparat zur zeitgleichen, separaten oder sequentiellen Verwendung zur Hemmung von Intimahyperplasie bereit.
  • Intimahyperplasie ist auf eine Gefäßverletzung zurückzuführen, einschließlich einer Gefäßverletzung infolge einer Gefäßrekonstruktion wie Angioplastie, Endarterektomie, Reduktionsatherektomie, endovaskuläre Laserablation oder Anastomosierung eines Gefäßtransplantats.
  • Eine Verbindung der Formel I wird vorzugsweise einem Säuger innerhalb einer antihyperplastisch effektiven Zeitperiode vor, zeitgleich mit oder nach einer akuten Gefäßverletzung bei dem Säuger verabreicht.
  • Eine Verbindung der Formel I wird vorzugsweise zeitgleich mit einer antihyperplastisch effektiven Menge Heparin verabreicht.
  • Die Erfindung lässt auch Verfahren zur Verwendung von Verbindungen der Formel I als Nicht-Peptid-PDGF-Antagonisten zu, wie zur Hemmung von PDGF-Aktivität in einem Säuger.
  • Die vorliegende Erfindung lässt Verfahren zur Hemmung von Intimahyperplasie im Gefäßsystem eines Säugers und Verfahren zur Hemmung von Plättchen-Wachstumsfaktor-(PDGF)-Aktivität zu.
  • Wie in der vorliegenden Erfindung verwendet:
    bezieht sich Alkyl auf einen gesättigten, acyclischen Kohlenwasserstoff-Rest;
    bezieht sich Alkoxy auf einen gesättigten acyclischen Kohlenwasserstoff-Rest, welcher mindestens ein Sauerstoff-Atom enthält;
    bezieht sich Mono- oder Polycycloalkyl auf einen Rest eines gesättigten Kohlenwasserstoffes, welcher einen (mono) oder mehr als einen (poly) Ring hat;
    bezieht sich überbrücktes Mono- oder Polycycloalkyl auf ein Mono- oder Polycycloalkyl mit einer oder mehreren Brücken, die aus einer chemischen Bindung, einem einzelnen Atom oder einer Kette von Atomen bestehen, welche zwei verschiedene Teile des Moleküls verbinden.
  • Diese und andere Aspekte der Erfindung werden unter Bezugnahme auf die folgende ausführliche Beschreibung der Erfindung klar werden.
  • Wie oben erwähnt ist die Restenose von Blutgefäßen ein verbreitetes Problem bei Patienten, die sich einer Angioplastie, einer Endarterektomie oder einer Bypassversorgung unterzogen haben. Restenose ist ein Beispiel für Intimahyperplasie, von der angenommen wird, dass sie über einen Prozess abläuft, der sowohl Proliferation (Mitose) und Wanderung von glatten Gefäßmuskelzellen in die vom chirurgischen Verfahren beschädigte Region als auch die Produktion (Ablagerung) extrazellulärer Matrix umfasst. Siehe im Allgemeinen Harker, Am. J. Cardiol. 60: 20B–28B, 1987 und DeFeudis, Drug News and Perspectives 5: 49–51, 1992. Dieser proliferative Prozess manifestiert sich auch im Verschluss von Gefäßtransplantaten (sowohl von natürlichen, einschließlich autologer und allogener, als auch von synthetischen) und in transplantierten Organen. Dieser proliferative Prozess führt zur Entwicklung von Läsionen, die reich an glatten Muskelzellen sind, und wird hier als Intimahyperplasie bezeichnet.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Hemmung der Entwicklung SMC-reicher Läsionen (teilweiser oder kompletter Verschluss eines Blutgefäßes durch Verdickung der Intima (Hyperplasie)) durch die Verwendung einer antihyperplastisch effektiven Menge eines Nicht-Peptid-PDGF-Antagonisten, entweder unabhängig oder in Kombination mit einer antihyperplastisch effektiven Menge von Heparin, zur Verfügung. Von besonderem Interesse für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind 4-(2-(N-(2-Carboxamidoindol))aminoethyl)-benzolsulfonamide mit Formel I. Nicht-Peptid-PDGF-Antagonisten der vorliegenden Erfindung können im therapeutischen Regime gegen Sklerodermie, Lungenhyperplasie, Nierenfibrose, rheumatoide Arthritis, zur Behandlung von soliden malignen Tumoren einschließlich, aber nicht beschränkt auf Osteosarkom, Fibrosarkom, Gliom oder anderer proliferativer Zellerkrankungen von Nutzen sein.
  • Verbindungen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Verfahren synthetisiert werden (siehe Francia et al., Boll. Chim. Farm 114: 379–393, 1975; Vicentini et al., II Farmaco. Ed. Sc. 38: 672–678, 1983; Biere et al., J. of Med. Chem. 17: 716–721, 1973 und Höhn et al., J. of Med. Chem. 16: 1340–1346, 1973). Zum Beispiel sind repräsentative Schemata für die Synthesen der Verbindungen der Formel I unten gezeigt. Das entsprechende 2-(Aminoethyl)benzol wird zunächst durch Reaktion mit Acetanhydrid acetyliert und dann durch Behandlung mit Chlorsulfonsäure in das Benzolsulfonylchlorid II umgewandelt. II kann dann durch Behandlung mit einem Amin in das gewünschte Sulfonamid umgewandelt werden. III stellt direkt den korrekten Baustein für Verbindungen der Formel I zur Verfügung, worin R7 und R8 Sulfonamide bilden.
  • Figure 00110001
  • Für die Synthese von Verbindungen mit Formel I, worin R7 und R8 Sulfonylharnstoffe bilden, stellt IV, worin R7 und R8 H sind, das Ausgangsmaterial für weitere Manipulationen wie unten gezeigt zur Verfügung. IV wird zunächst durch Behandlung mit Ethylchloroformiat in das Ethyl-sulfonylcarbamat V umgewandelt. V kann dann entweder durch Reaktion mit dem entsprechenden Amin zu VI (oder der Verbindung der Formel I, worin R7 oder R8 -CONH2 ist) umgewandelt werden, oder durch Reaktion mit einem Hydrazin zu VII.
  • Figure 00120001
  • Das Acetylamid wird entweder in wässriger Base oder Säure hydrolysiert, um das freie Amin VIII zu ergeben. VIII kann dann mit dem entsprechenden Indol-2-carbonsäurechlorid acetyliert werden, um X zu ergeben, die Verbindungen der Formel I. IX wird durch die Reaktion der entsprechenden Indol-2-carbonsäure mit Oxalylchlorid zubereitet. Die Indol-2-carbonsäuren werden mit einem der vielen den Fachleuten bekannten Verfahren hergestellt.
  • Figure 00130001
  • Die Herstellung von Verbindungen, die typisch für ausgefallenere 3-Alkoxyindole (worin R6 Alkoxy oder eine der beschriebenen Methoxy-Ringverbindungen ist) sind, ist unten gezeigt. Das Ethyl-2-aminobenzoat wird mit Ethyl-α-bromacetat N-alkyliert, um XI zu ergeben. Behandlung von XI mit Natriumethoxid bringt das 3-Oxoindol XII hervor. Alkylierung mit dem entsprechenden Alkylhalogenid ergibt das 3-Alkoxyindol XIII. Esterspaltung gefolgt von einer Reaktion mit Oxalylchlorid ergibt das Säurechlorid XV.
  • Figure 00130002
  • Der Begriff „Nicht-Peptid-PDGF-Antagonist" bezieht sich wie hier verwendet auf eine Verbindung, die keine Peptid-Verbindung ist und eine PDGF-induzierte Stimulation eines Reaktionswegs hemmt. Ein „Reaktionsweg" ist ein biochemischer Weg, der als Antwort auf externe Stimuli aktiviert wird und im Allgemeinen, aber nicht immer, direkt an einen membrangebundenen Rezeptor gekoppelt ist. Reaktionswege induzieren im Allgemeinen zelluläre Antworten wie Sekretion extrazellulärer Matrix aus reagierenden Zellen, Hormonsekretion, Chemotaxis, Differenzierung oder Stimulation der Zellteilung reagierender Zellen.
  • PDGF-Rezeptoren sind integrale, transmembranöse Glykoproteine, deren Expression im Allgemeinen auf Zellen mesodermalen Ursprungs beschränkt ist. Zwei PDGF-Rezeptor-Polypeptide wurden beschrieben. Sie werden als „alpha-Rezeptor" (Kelly et al., WO 90/14425; Kelly et al., U.S. Patent Nr. 5,371,205; Claesson-Welsh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4917–4921, 1989) und „beta-Rezeptor" (Claesson-Welsh et al., Mol. Cell. Biol. 8: 3476–3486, 1988; Gronwald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3435–3439, 1988) bezeichnet. In Gegenwart des PDGF-Liganden dimerisieren die Rezeptor-Polypeptide. Somit sind drei Rezeptor-Subtypen möglich: αα, αβ und ββ. Der β-Rezeptor ist für die B-Kette des PDGF spezifisch, während der α-Rezeptor die A-Kette und die B-Kette bindet. Folglich hängt die wachstumsregelnde Empfindlichkeit von Zellen auf PDGF nicht nur von der Verfügbarkeit von Isoformen der PDGF-Liganden AA, AB und BB ab, sondern auch von der Expression und Verfügbarkeit der verschiedenen Subtypen von PDGF-Rezeptoren (Heldin et al., Cell Regul. 1: 555–566, 1990). Glatte Muskelzellen vom Menschen exprimieren sowohl alpha- als auch beta-Rezeptor-Subtypen (Heldin et al., Cell Regul. 1: 555–566, 1990), aber es sind andere Zelltypen bekannt, die nur einen einzigen Rezeptor-Subtyp exprimieren (Gronwald et al., J. Biol. Chem. 264: 8129–8125, 1989). Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Hemmung der Intimahyperplasie durch koordinierte Anwendung einer antihyperplastisch effektiven Menge eines Nicht-Peptid-PDGF-Antagonisten und einer antihyperplastisch effektiven Menge von Heparin zur Verfügung. Der Begriff „Heparin" bezieht sich wie hier verwendet auf jedes Mitglied einer Familie strukturell komplexer, sulfatierter Glykosaminoglykane, welche im Allgemeinen durch eine Struktur sich wiederholender Glucosamine und Glucuronsäure-Zuckerreste charakterisiert sind (Casu, Adv. Carbohyd. Chem. and Biochem. 47: 578–583, 1985). Das weitgehendst bekannte Heparin ist „unfraktioniertes" oder „kommerzielles" Heparin, das aus Rinderlunge oder Schweinedarm hergestellt wird und eine heterogene Mischung von Heparinmolekülen mit einem Molekulargewicht von etwa 8.000 bis 20.000 Dalton umfasst (Wolinsky et al., J. Am. Coll. Cardiol. 15: 475–481, 1990). Jedoch beinhaltet der Begriff Heparin auch ein umfassendes Sortiment homogenerer Heparinzubereitungen und auch heparinähnlicher Moleküle einschließlich der Heparansulfate. Unter diesen speziellen Beispielen von Heparinen sind auch spezifischere Heparin-Subtypen bekannt. Zum Beispiel wurden von Endothelzellen (Castellot et al., J. Cell. Biol. 90: 372–379, 1981) und von glatten Muskelzellen (Fritze et al., J. Cell. Biol. 100: 1041–1049, 1985) produzierte Heparansulfat-Komponenten isoliert, die den Berichten zufolge bei der Hemmung der Proliferation glatter Muskelzellen bis zu 40 mal aktiver sind als unfraktioniertes Heparin. Ferner wurden aus den natürlich vorkommenden Größenvarianten des Heparins fraktionierte Heparinarten isoliert, die vorherrschend entweder antikoagulatorische oder antiproliferative Aktivität zeigen (Wolinsky et al., J. Am. Coll. Cardiol. 15: 475–481, 1990). Die letztere Aktivität tendiert dazu, bei den Heparinarten mit niedrigem Molekulargewicht vorzuliegen, wie bei Heparinen im Bereich von Penta- bis Dekasacchariden, von denen berichtet wurde, dass sie auch eine größere Bioverfügbarkeit und eine längere Halbwertszeit bieten (Id., Bacher et al., Thrombosis Res. 70: 295–306, 1993), und die daher im Rahmen besonderer Ausführungsformen der Erfindung besonders nützlich sein können. In die Definition von Heparin für die Zwecke der Beschreibung der Erfindung sind auch synthetische Heparine und Heparinderivate eingeschlossen, von denen eine Auswahl unter Verwendung konventioneller chemischer synthetischer, modifizierender und degradativer Verfahren hergestellt wurde (siehe, zum Beispiel, Roden, L., The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans (Lennarz, W. J. ed.) pp 267–371, Plenum Publishing Corp., New York, 1980).
  • Eine „antihyperplastisch effektive Menge" einer Verbindung ist als eine Menge einer Verbindung definiert, die ausreicht, um Intimahyperplasie in einem Blutgefäß, einem Gefäßtransplantat oder einer Gefäßkomponente eines transplantierten Organs messbar zu verringern oder zu verhindern. Spezieller schließt „Hemmung von Intimahyperplasie" hier definitionsgemäß jede messbare Hemmung von einem oder mehreren der im Fach gebiet beschriebenen hyperplastischen Prozesse der Intima ein, wie die Wanderung von glatten Gefäßmuskelzellen (VSMC), die Proliferation von VSMC und die Ablagerung von extrazellulärer Matrix in der Neointima. In diesem Zusammenhang kann die Verringerung oder Verhinderung von Intimahyperplasie oder eines hyperplastischen Prozesses, der an Intimahyperplasie beteiligt ist, leicht unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten in-vitro-, in-vivo- oder ex-vivo-Prüfsystemen, besonders von auf Primaten basierenden Prüfsystemen, beurteilt werden (z. B. nicht-menschliche oder menschliche Primaten-VSMC-Kulturen oder explantierte Gefäßgewebe, oder in-vivo-Tests an nicht-menschlichen Primaten). Indem PDGF daran gehindert wird, seinen Stimulationseffekt auszuüben, kann SMC-Proliferation und nachfolgende Ablagerung von Matrix verringert werden. Eine Reduktion der Intimahyperplasie ist klinisch als eine signifikante Reduktion der Abnahme des luminalen Volumens nach einer akuten Gefäßverletzung erklärt. Eine derartige Reduktion wird im Allgemeinen zu einem verringerten Bedarf nach Revaskularisationsmaßnahmen (z. B. wiederholte Angioplastie) an der Stelle der anfänglichen Verletzung führen. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind bei der Behandlung von Intimahyperplasie infolge einer akuten Gefäßverletzung besonders nützlich. Akute Gefäßverletzungen treten schnell auf (d. h. über Tage bis Monate), im Gegensatz zu chronischen Gefäßverletzungen (z. B. Atherosklerose), die sich über eine Lebenszeit entwickeln. Akute Gefäßverletzungen sind oft auf chirurgische Verfahren wie Gefäßrekonstruktionen zurückzuführen, wobei die Verfahren der Angioplastie, der Endarterektomie, der Reduktionsatherektomie, des endovaskulären Stentings, der endovaskulären Laserablation, der Anastomosierung mit einem Gefäßtransplantat oder desgleichen eingesetzt werden. Hyperplasie kann auch als verzögerte Antwort bei der Reaktion auf z. B. die Implantation eines Gefäßtransplantats oder auf eine Organtransplantation auftreten.
  • Menschen, die mit einer Therapie mit einem Nicht-Peptid-PDGF-Antagonisten, entweder allein oder in Kombination mit Heparin, behandelt werden, kann der Antagonist unter vielfältigen Bedingungen gegeben werden. Der Antagonist kann über Bolusinjektionen gegeben werden, sowohl vor der Revaskularisationsmaßnahme als auch mehrfach nach der Maßnahme. Der Antagonist kann vor der Maßnahme oral oder als Bolusinjektion (intravenös, intramuskulär, intraperitoneal oder subcutan) gegeben werden (im Allgemeinen innerhalb von 24 Stunden vor der Operation) und als Dauerinfusion nach der Maßnahme (einschließlich der Infusion über implantierte Pumpen. In vielen Fällen wird es vorzuziehen sein, während eines Krankenhausaufenthaltes tägliche Dosen zu verabreichen (einschließlich der Verabreichung über Infusion), gefolgt von weniger häufigen Bolusinjektionen während einer ambulanten Behandlung in einer Zeitspanne von ein bis zwei oder mehr Wochen. Die Behandlung kann für eine Zeit bis zu sechs Monaten nach der anfänglichen Verletzung fortgeführt werden. Der Antagonist kann über viele Applikationswege einschließlich intravenöser, intramuskulärer und subcutaner Injektionen gegeben werden. Zusätzlich kann der Antagonist unter Verwendung von Ballonkathetern, Beschichtung auf Stents oder Aufbringen auf gelbeschichtete Ballonkatheter lokal an die Stelle der Gefäßverletzung abgegeben werden. In letzteren Fällen würde zu erwarten sein, dass die Dosen des Antagonisten erheblich geringer sind als die erforderliche Dosis bei systemischer Gabe. Der Antagonist kann auch von Freisetzungssystemen mit langsamer Freisetzungsrate abgegeben werden, einschließlich solcher Systeme, die in Gefäßtransplantate oder Stents eingearbeitet sind, oder durch Perfusion von Doppelballonkathetern. Pumpen oder andere bekannte Freisetzungssysteme können auch zur Anwendung kommen.
  • In einer alternierenden Ausführungsform der Erfindung wird ein Nicht-Peptid-PDGF-Antagonist einem Säuger koordiniert mit Heparin in entsprechenden Dosierungen des Antagonisten und des Heparins, die ausreichen, um in Kombination Intimahyperplasie im Gefäßsystem des Säugers zu hemmen, verabreicht. In diesem Zusammenhang soll „koordinierte Verabreichung" zeitgleiche, separate oder sequentielle Verabreichung des Antagonisten und des Heparins einschließen, wobei sowohl der Antagonist als auch das Heparin innerhalb einer beschränkten, kombinatorisch effektiven Zeitperiode im Verhältnis zueinander verabreicht werden. Eine „kombinatorisch effektive Zeitperiode" ist definiert als die maximale Zwischenzeitspanne zwischen der Verabreichung des Antagonisten und der Verabreichung des Heparins, in der die beiden Agenzien bei der Hemmung der Hyperplasie als Kombination wirksam sind. Die Bezeichnung „kombinatorisch effektiv" ist wiederum definiert als die Herbeiführung einer messbaren Hemmung von Intimaverdickung, von der Bildung von Läsionen oder eines hyperplastischen Prozesses, welche einen Höchstgrad der Hemmung übersteigt, der bei alleiniger Verab reichung entweder vom Antagonisten oder vom Heparin unter sonst vergleichbaren Bedingungen und Dosierung unabhängig erreicht wird.
  • Im Allgemeinen wird die Dosierung des Heparins zwischen etwa 1 μg–100 mg/kg/Tag liegen. Vorzugsweise wird die Dosierung des Heparins zwischen 29 μg–10 mg/kg/Tag liegen, und wünschenswerter unter etwa 1 mg/kg/Tag. Fachleuten wird klar sein, dass die tatsächlichen Dosierungen unter Berücksichtigung spezifischer Umstände, einschließlich von Patientenparametern und von Charakteristika der verabreichten Antagonisten und des verabreichten Heparins ermittelt werden.
  • Es wird zu erwarten sein, dass die Hemmung der Hyperplasie zu einer Abnahme klinischer Ereignisse bei Patienten führen wird. Diese Ereignisse schließen eine Abnahme bei einem oder mehreren Myokardinfarkten, Angina, der Erfordernis von Revaskularisationsmaßnahmen und Todesfällen ein.
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • Antagonisten-Test
  • Die anfängliche Charakterisierung von NNC92-0270 als Nicht-Peptid-PDGF-Antagonist wurde durch ein SRE-Luciferase-Testsystem für hohen Durchsatz ermöglicht, welches zur Selektion von Substanzen führt, die die Expression eines Serum-Reaktionselement (SRE)-Luciferase-Reportergens, das in SWISS3T3-Zellen exprimiert wird, blockieren können. Das SRE-Luciferase-Konstrukt, pKZ67, ist ein von pUC18 abgeleiteter Säugerzell-Expressionsvektor, der eine Luciferase-Expressionseinheit umfasst, welche ein synthetisiertes Segment, das die menschliche c-fos-Sequenz von –360 bis +30 (van Straaten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3183–3187, 1983) (einschließlich der TATA-, SRE- und SIE (sis-induzierbares Element)-Promotorelemente) enthält, eine Luciferase-Sequenz (Delegeane et al., Mol. Cell Biol. 7: 3994–4002, 1987; deWet et al., Mol. Cell Biol. 7: 725–737, 1987) und einen Terminator des Gens für den menschlichen Wachstumsfaktor beinhaltet. Diese Expressionseinheit liegt in entgegengesetzter Tran skriptionsrichtung zu einer zweiten Expressionseinheit, die einen Neomycin-Resistenzmarker, der von SV40-Promotor- und -Terminatorsequenzen flankiert wird, enthält. SWISS3T3-Zellen exprimieren endogene Wachstumsfaktorrezeptoren wie PDGF-AA, -AB und -BB; bFGF und EGF. Stimulation der Rezeptoren mit einem dieser Wachstumsfaktoren initiiert eine Signalkaskade, die zur Induktion von Luciferase führt. PMA (Phorbol 12-Myristat 13-Acetat) umgeht den Rezeptor und initiiert durch Stimulation der Proteinkinase C eine interne Signalkaskade, was zur Induktion von Luciferase führt. Das Ausmaß der Spezifität des Antagonisten kann durch den Vergleich des sich ergebenden Signals für die drei Wachstumsfaktoren (PDGF, bFGF und EGF) bestimmt werden. Verbindungen, die im Vergleich zur Kontrolle zu einer 50-fachen Signalreduktion führten, wurden für weitere Untersuchungen in Betracht gezogen.
  • SWISS3T3-Zellen (transfiziert mit einem SRE-Luciferase-Reportergen, SWISS3T3/KZ67-G1-6) wurden durch fortlaufende Passagierung in Erhaltungsmedium (DMEM (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium, GIBCO BRL, Gaithersburg, MD), ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 1 mg/ml G418) kultiviert. Zwei Tage vor dem Test wurden die Zellen trypsinisiert, auf 5 × 104 Zellen/Kavität in Wachstumsmedium (DMEM ergänzt mit 1% FBS, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat) eingestellt, in deckweiße 96-Loch-Mikrotiterplatten mit 200 μl/Kavität (1 × 104 Zellen/Kavität) ausplattiert und über 48 Stunden bei 37°C, 5% CO2 gezüchtet.
  • Die Testsubstanzen wurden in 4% DMSO zubereitet. Die Induktion wurde durch Entfernung des verbrauchten Mediums aus den Vertiefungen und Zugabe von 50 μl Testmedium (F12 HAM (Gibco) ergänzt mit 0,5% Fraktion-V-BSA (Sigma, St. Louis, Mo.), 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 20 mM Hepes) pro Kavität eingeleitet. Fünfundzwanzig Mikroliter entweder von 50 ng/ml PDGF (endgültige Testkonzentration 12,5 ng/ml) oder von 8 ng/ml bFGF (endgültige Testkonzentration 2,0 ng/ml) in Testmedium wurden in die Vertiefungen zugegeben. In Testmedium zubereitete Kontrollen wurden auf jeder Platte einbezogen: unbehandelte Vertiefungen (basal), 12,5 ng/ml, wünschenswerter 6,25 ng/ml PDGF BB (Plättchen-Wachstumsfaktor, Stamm 10 μg/ml, 10 mM Essigsäure, 0,25% RSA (Serumalbumin vom Kaninchen) in PBS, phosphat gepufferte Saline), 2,0 ng/ml bFGF (basaler Fibroblasten-Wachstumsfaktor (Genzyme Diagnostics, Cambridge, MA)), 4,5 ng/ml EGF (epidermaler Wachstumsfaktor (Sigma) oder 50 ng/ml PMA (Sigma). Die endgültige Testkonzentration von DMSO überschreitet 1% nicht. Die Platten wurden über 5 Stunden bei 37°C, 5% CO2 inkubiert.
  • Nach der Induktion wurde die Aktivität der Luciferase unter Verwendung eines Promega Luciferase-Testkits (E1500; Promega Corp., Madison, WI) gemäß dem Protokoll des Testkits gemessen. Kurz dargestellt wurde das Testmedium von der Platte entfernt, und 25 μl/Kavität Zelllyse-Puffer, 1 : 5 mit sterilem Wasser verdünnt, wurden der Platte zugegeben. Die Platten wurden über 15 Minuten inkubiert. Die Platten wurden in ein LumiskanTM-Mikrotiter-Luminometer (ICN Biomedical, Cleveland, OH) umgesetzt, das pro Kavität 40 μl Luciferase-Testsubstat (Promega Corp.) zugab. Die Menge der Lumineszenz (relative Lichteinheiten, RLU) wurde nach einem 1-Sekunden-Mix und einer 1-3-Integration des Signals bestimmt. Das basale (nicht induzierte) Luciferase-Signal wurde von allen Messungen abgezogen, und das von den getesteten Proben induzierte Luciferase-Signal wurde als Prozentsatz des Signals in der Kontrolle formuliert. Die in Tabelle 1 dargestellten Daten zeigen die ungefähr effektive Dosis von NNC92-0270 zur Hemmung von 50% der Kontroll-Aktivität (IC50).
  • Tabelle 1 Induktion der SRE-Luciferase
    Figure 00200001
  • Beispiel 2
  • Hemmung der Bindung von 125I-PDGF-BB an glatte Muskelzellen (SMCs) von der Ratte
  • NNC92-0270 wurde auf die Fähigkeit, die Bindung von 125I-PDGF-BB an einschichtige Zelllagen von SMCs von der Ratte zu hemmen, untersucht. Zum Test auf die Hemmung der Bindung von 125I-PDGF-BB an SMCs von der Ratte wurden die SMCs mit etwa 20.000 Zellen/Kavität in 24-Loch-Kulturplatten ausplattiert. Die Zellen wurden 2–7 Tage nach dem Ausplattieren für Tests benutzt. Die Testverbindung wurde in Bindungsmedien (500 ml Hams F-12 (Gibco BRL), 12 ml 1 M Hepes pH 7,4, 5 ml 100 × PSN (Penicillin-Streptomycin-Neomycin, Gibco BRL), 1 g Serumalbumin vom Kaninchen (Sigma Chemical CO., St. Louis, MO)) auf die in Tabelle 2 gezeigten Konzentrationen verdünnt und dann in dreifacher Ausführung zu den SMCs (1 ml/Kavität) gegeben. In die Vertiefungen wurden dann 50 μl einer 125I-PDGF-BB-Stammlösung zugegeben. Bindungsmedien allein wurden als negative Kontrolle verwendet, und die Zugabe von 200 ng/ml PDGF-BB wurde verwendet, um die unspezifische Bindung für 125I-PDGF-BB zu bestimmen. Die Zellen wurden über etwa 1½ Stunden bei 4°C inkubiert und dann mit Bindungsmedien gewaschen, um ungebundenen Liganden zu entfernen. Die Zellen wurden dann in Extraktionspuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% Nonident P-40, 0,5% Natriumdesoxycholat, 10 mM NaI, 1% Rinder-Serumalbumin) inkubiert, und die Extrakte wurden gewonnen und in einem Gamma-Zähler gezählt. Die Ergebnisse der Bindungsstudien sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Daten sind als spezifische, für 125I-PDGF-BB bestimmte cpm (Zählungen pro Minute) dargestellt. Die durch die Zugabe von 200 ng/ml von unmarkiertem PDGF-BB bestimmte unspezifische Bindung betrug 853 cpm und wurde von den dargestellten Daten abgezogen.
  • Tabelle 2 Hemmung der Bindung von 125I-PDGF-BB an SMCs von der Ratte
    Figure 00210001
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass NNC92-0270 ein potenter Hemmstoff der Bindung von PDGF-BB an PDGF-Rezeptoren auf der Zelloberfläche ist.
  • NNC92-0270 wurde anschließend auf seine Fähigkeit untersucht, die Bindung von 125I-PDGF-BB an SMCs von der Ratte zu hemmen, wenn der Radioligand in Gegenwart von 10% Serum vom Menschen zu den Zellen gegeben wurde. Die SMCs von der Ratte wurden in 24-Loch-Kulturplatten ausplattiert und wie oben beschrieben untersucht. Die Testverbindung wurde entweder in Bindungsmedien allein oder in Bindungsmedien mit 10% Serum vom Menschen auf die in Tabelle 3 gezeigten Konzentrationen verdünnt, und Aliquots von 1 ml wurden in dreifacher Ausführung zu den Testzellen gegeben. Fünfzig μl einer 20 × 125I-PDGF-BB-Stammlösung wurden jeder Vertiefung zugegeben. Die Zellen wurden über 2,5 Stunden bei 4°C inkubiert, mit Bindungsmedien gewaschen, um ungebundenen Liganden zu entfernen und mit Extraktionspuffer gewonnen. Die Extrakte wurden dann in einem Gamma-Zähler gezählt, um die gebundenen CPM zu bestimmen. Die in Tabelle 3 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass NNC92-0270, wenn es in Bindungsmedien mit 10% Serum vom Menschen gelöst ist, im Vergleich zu dem, das in Bindungsmedien allein gelöst ist, etwa die gleiche Wirksamkeit bei der Hemmung der Bindung von 125I-PDGF-BB hat. Es sollte beachtet werden, dass die Bindung von 125I-PDGF-BB in der negativen Kontrollprobe, die Serum vom Menschen enthielt, gegenüber der negativen Kontrollprobe mit Bindungsmedien allein geringer war. Die Ergebnisse sind als gesamte gebundene CPM dargestellt.
  • Tabelle 3 Hemmung der Bindung von 125I-PDGF-BB an SMCs von der Ratte in Gegenwart und Abwesenheit von Serum vom Menschen
    Figure 00230001
  • Beispiel 3
  • Hemmung der mitogenen Aktivität von PDGF-BB an glatten Muskelzellen vom Pavian
  • NNC92-0270 wurde auf seine Fähigkeit, die mitogene Aktivität von PDGF an glatten Muskelzellen vom Pavian zu hemmen, untersucht. Alle Tests zur Mitogenese, die an glatten Gefäßmuskelzellen vom Pavian (BVSMCs) durchgeführt wurden, wurden an primären Zellkulturen zwischen den Passagierungen 13 und 20 in der Kultur vorgenommen. Die Ausgangskulturen wurden aus dem Auswuchs von explantiertem Aortengewebe hergestellt. Glatte Muskelzellen vom Pavian in mit 10% fetalem Kälberserum ergänztem DMEM wurden mit etwa 20.000 Zellen pro Kavität in 24-Loch Kulturplatten ausplattiert. Einen Tag vor der Verwendung wurden die Kulturmedien entfernt, und 1 ml Mito Media (Tabelle 5) wurde in jede Vertiefung zugegeben, um es den Zellen zu ermöglichen, einen Ruhezustand zu erreichen. Zum Zeitpunkt des Experiments wurden die Zellen mit PDGF-BB stimuliert. Es wurde eine Standardkurve für PDGF-BB mit Konzentrationen von 1, 0,5, 0,25, 0,062 und 0,0 ng/ml erstellt. 20-×-Stammlösungen wurden für jede der PDGF-Konzentrationen durch Verdünnung in 10 mM Essigsäure mit 0,25% Albumin hergestellt, und 50 μl PDGF oder Dilutionsmittel allein wurden den Kulturvertiefungen zugegeben.
  • Zur Untersuchung der Aktivität von NNC92-0270 zur Neutralisierung der mitogenen Aktivität von PDGF-BB wurde 1 ng/ml PDGF zusammen mit Verdünnungen von NNC92-0270 in die Vertiefungen zugegeben. Die Zellen wurden mit den Testproben über etwa 20 Stunden bei 37°C inkubiert. 50 μl einer 20-×-Stammlösung von [3H]-Thymidin wurde dann zu jeder Vertiefung gegeben, um eine Endkonzentration von 1 μCi/ml zu ergeben. Die Zellen wurden über 4 Stunden bei 37°C inkubiert, mit PBS gewaschen, dann mit Trypsin gewonnen und auf Aufnahme von [3H]-Thymidin in einem BetaplateTM-Flüssigkeits-Szintillationszähler von Wallac (Turku, Finnland) ausgezählt. Die in Tabelle 4 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die mitogene Aktivität von PDGF-BB dosisabhängig von NNC92-0270 gehemmt wurde. Die ED50 für die Hemmung lag für NNC92-0270 etwa bei 12,5 μM.
  • Tabelle 4 Hemmung der mitogenen Aktivität von PDGF-BB an glatten Muskelzellen vom Pavian
    Figure 00250001
  • Als Teil desselben Experiments wurde die inhibitorische Wirksamkeit von NNC92-0270 in Gegenwart von Heparin untersucht. Wir haben vorher gezeigt, dass Heparin in einer kombinatorischen Art und Weise mit neutralisierenden monoklonalen Antikörpern auf den PDGF-Rezeptor einwirken kann, um die mitogene Aktivität von PDGF auf glatte Muskelzellen vom Pavian zu hemmen. Wir wollten ermitteln, ob bei NNC92-0270 die Gegenwart von Heparin einen ähnlich potenzierenden Effekt auf die Hemmung der mitogenen Aktivität von PDGF-BB hat.
  • NNC92-0270 wurde mit 1 ng/ml PDGF-BB in Gegenwart von 0,5 U/ml unfraktionierten Heparins inkubiert. Die Zellen wurden wie oben beschrieben mit [3H]-Thymidin puls markiert und der [3H]-Thymidin-Level wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe von Heparin zu NNC92-0270 zu einer weiteren Hemmung von [3H]-Thymidin führte, die über der lag, die mit NNC92-0270 allein erreicht wurde.
  • Beispiel 5
  • Auswaschstudie
  • NNC92-0270 wurde in einem Auswaschexperiment auf einen verlängerten inhibitorischen Effekt auf die mitogene Aktivität von PDGF-BB auf glatte Muskelzellen vom Pavian untersucht. SMCs vom Pavian wurden mit 20.000 Zellen pro Kavität auf eine 24-Loch-Kulturplatte ausplattiert und über 2 Tage gezüchtet. Die Kulturmedien wurden entfernt und mit Mito Media (Tabelle 5) ersetzt, um es den Zellen zu ermöglichen, einen Ruhezustand zu erreichen. Das Experiment war so aufgebaut, dass die Zellen entweder über 24 Stunden vor der Zugabe von PDGF-BB oder sequentiell mit der Zugabe von PDGF-BB mit NNC92-0270 oder mit Kontroll-Dilutionsmittel (0,5% DMSO) behandelt wurden. Die Zellen, die anfänglich mit NNC92-0270 oder Kontroll-Dilutionsmittel über 24 Stunden behandelt worden waren, wurden mit Mito Media gewaschen, um die Testverbindung zu entfernen, und dann mit PDGF-BB (1 ng/ml) über weitere 24 Stunden inkubiert. Eine zweite Gruppe von Zellen wurde mit NNC92-0270 oder mit Kontroll-Dilutionsmittel simultan mit PDGF-BB über 24 Stunden behandelt. Die Zellen wurden über 4 Stunden mit [3H]-Thymidin radioaktiv markiert (letztlich 1 μCi/ml), mit Trypsin gewonnen und in einem Betaplate-Zähler von Wallac gezählt, um die CPM für die Aufnahme von [3H]-Thymidin zu bestimmen.
  • Die in Tabelle 6 dargestellten Ergebnisse sind als Mittelwert +/– Standardabweichung von Dreifachbestimmungen der [3H]-Thymidin-Aufnahme angegeben. Es wurden Essigsäure (10 mM) als Kontroll-Dilutionsmittel von PDGF-BB und 0,5% DMSO als Kontrolle der Testverbindung verwendet.
  • Tabelle 5
  • Mito Media
  • Für 500 ml Lösung:
    250 ml DMEM (GIBCO BRL)
    250 ml Hams F-12 (GIBCO BRL)
    0,25 ml 10 mg/ml Insulin-Stammlösung (GIBCO BRL) für eine Endkonzentration von 5 μg/ml
    1 ml 10 mg/ml Transferrin-Stammlösung (Collaborative Research, Bedford, MA) für eine Endkonzentration von 20 μg/ml
    2 ml 4 μg/ml Selen-Stammlösung (Aldrich Chemical, Milwaukee, WI) für eine Endkonzentration von 5 nM
    5 ml 10% Rinderserumalbumin-Stammlösung (GIBCO BRL) für eine Endkonzentration von 0,1%.
  • Tabelle 6 Auswaschexperiment zur Untersuchung des verlängerten Effekts von NNC92-0270 auf die mitogene Aktivität von PDGF-BB auf glatte Muskelzellen vom Pavian.
    Figure 00280001

Claims (12)

  1. Verwendung eines Plättchen-Wachstumsfaktor-(PDGF)-Antagonisten der Formel I bei der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Intimahyperplasie in dem Gefäßsystem eines Säugers:
    Figure 00290001
    Formel I worin R1, R4 und R5 unabhängig voneinander H, F, Cl, Br, -CF3 oder ein lineares oder verzweigtes Alkyl oder Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen sind; R2 und R3 unabhängig voneinander H oder ein lineares oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen sind; R6 H, ein lineares oder verzweigtes Alkyl oder Alkoxy mit 1 bis 18 Kohlenstoff-Atomen, Benzyloxy oder
    Figure 00290002
    ist, n 1 oder 2 ist; jedes X unabhängig voneinander C, N, NH, O und S ist, mit der Maßgabe, dass zumindest 1–2 X C sind, wobei wahlweise jedes X C sein kann; R9, R10 und R11 unabhängig voneinander H, F, Br, Cl, -CF3 oder ein lineares oder verzweigtes Alkyl oder Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen sind; R7 und R8 unabhängig voneinander H, ein lineares oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 18 Kohlenstoff-Atomen, -CONH-R12,
    Figure 00300001
    sind, oder R7 und R8 zusammen mit dem sie verbindenden N einen substituierten oder unsubstituierten heterocyclischen Ring mit 3 bis 8 Ringatomen bilden, z. B. einen unsubstituierten heterocyclischen Ring mit nicht mehr als 6 Ringatomen; R12 H,
    Figure 00300002
    ist; Y Stickstoff ist, R13 und R14 unabhängig voneinander H, ein lineares oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen sind oder R13 und R14 zusammen mit dem sie verbindenden N einen substituierten oder unsubstituierten heterocyclischen Ring mit 3 bis 8 Ringatomen bilden; Z Kohlenstoff ist und R15, R16 und R17 unabhängig voneinander H, ein lineares oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen sind, R15 und R16, R16 und R17 oder R15 und R17 zusammen mit Z ein substituiertes oder unsubstituiertes Monocycloalkyl mit 3 bis 8 Kohlenstoff-Atomen bilden, oder R15, R16 und R17 zusammen mit Z ein substituiertes oder unsubstituiertes Mono- oder Polycycloalkyl mit 7 bis 14 Kohlenstoff-Atomen oder ein substituiertes oder ein unsubstituiertes überbrücktes Mono- oder Polycycloalkyl mit 6 bis 14 Kohlenstoff-Atomen bilden.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, worin R1, R4 und R5 unabhängig voneinander H, Methyl oder Methoxy sind; R2 und R3 unabhängig voneinander H oder Methyl sind; R6 ein lineares oder verzweigtes Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen oder
    Figure 00310001
    ist, n 1 oder 2 ist; jedes X unabhängig voneinander aus der Gruppe, die C, S und N umfasst, ausgewählt ist, mit der Maßgabe, dass 1–2 X C sind; R9, R10 und R11 unabhängig voneinander H, Methyl oder Methoxy sind; R7 und R8 unabhängig voneinander H, ein lineares oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen oder CONH-R12 sind; R12 H,
    Figure 00310002
    ist, Y Stickstoff ist; Z Kohlenstoff ist; R13 und R14 zusammen mit Y einen heterocyclischen Ring mit 5 bis 6 Ringatomen bilden und R15 und R16, R16 und R17 oder R15 und R17 zusammen mit Z ein substituiertes oder unsubstituiertes Monocycloalkyl mit 5 bis 6 Kohlenstoff-Atomen bilden oder R15, R16 und R17 zusammen mit Z ein substituiertes oder unsubstituiertes Mono- oder Polycycloalkyl mit 9 bis 10 Kohlenstoff-Atomen oder ein substituiertes oder ein unsubstituiertes überbrücktes Mono- oder Polycycloalkyl mit 8 bis 10 Kohlenstoff-Atomen bilden.
  3. Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin R13 und R14 zusammen mit Y die Komponente
    Figure 00320001
    bilden, worin Y Stickstoff ist, n 1 oder 2 ist und R18 und R19 unabhängig voneinander H, F, Br, Cl, -CF3 oder ein lineares oder verzweigtes Alkyl oder Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen sind, vorzugsweise worin R18 und R19 unabhängig voneinander H, Methyl, Ethyl, Methoxy oder Ethoxy sind.
  4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin R15 und R16, R16 und R17 oder R15 und R17 zusammen mit Z die Komponente
    Figure 00320002
    bilden, worin Z Kohlenstoff ist, n 1 oder 2 ist und R20, R21 und R22 unabhängig voneinander H, F, Br, Cl, -CF3 oder ein lineares oder verzweigtes Alkyl oder Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen sind, vorzugsweise worin R20, R21 und R22 unabhängig voneinander H, Methyl, Ethyl, Methoxy oder Ethoxy sind.
  5. Verwendung nach Anspruch 1, worin besagter Nicht-Peptid-PDGF-Antagonist NNC92-0270 ist:
    Figure 00330001
  6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin besagter Säuger ein Primat ist.
  7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin entweder: (a) besagtes Medikament zur Anwendung des besagten Nicht-Peptid-PDGF-Antagonisten zeitgleich mit oder innerhalb einer antihyperplastisch effektiven Zeitperiode vor einer akuten Gefäßverletzung bei besagtem Säuger bestimmt ist; oder (b) besagter Nicht-Peptid-PDGF-Antagonist zur Anwendung innerhalb einer antihyperplastisch effektiven Zeitperiode, die auf eine akute Gefäßverletzung bei besagtem Säuger folgt, bestimmt ist; und worin in beiden Fällen besagte Verletzung optional auf eine Gefäßrekonstruktion zurückzuführen ist, z. B. worin besagte Gefäßrekonstruktion Angioplastie, Endarterektomie, Reduktionsatherektomie, endovaskuläre Laserablation oder Anastomosierung mit einem Gefäßtransplantat umfasst.
  8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin besagtes Medikament weiterhin Heparin umfasst.
  9. Verwendung nach Anspruch 8, worin besagtes Medikament zur Anwendung des besagten Nicht-Peptid-PDGF-Antagonisten und Heparin bei besagtem Säuger durch eine Applikationsform bestimmt ist, die aus der Gruppe, die orale, intravaskuläre, perivaskuläre, transdermale und rectale Applikationsformen umfasst, ausgewählt ist.
  10. Verbindung der Formel I wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert zur Verwendung als ein Medikament.
  11. Zusammensetzung, die zur Hemmung von Intimahyperplasie geeignet ist, umfassend einen Nicht-Peptid-PDGF-Antagonisten wie in den Ansprüchen 1 bis 5 definiert und Heparin.
  12. Produkt, welches einen Nicht-Peptid-PDGF-Antagonisten wie in den Ansprüchen 1 bis 5 definiert und Heparin enthält, als ein Kombinationspräparat zur zeitgleichen, separaten oder sequentiellen Verwendung zur Hemmung von Intimahyperplasie.
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