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Die
Proliferation glatter Muskelzellen (SMCs) in der Gefäßwand ist
ein bedeutendes Ereignis bei der Bildung von Gefäßläsionen bei Atherosklerose,
nach Gefäßrekonstruktion
oder als Antwort auf eine andere Gefäßverletzung. Zum Beispiel beinhaltet
die Behandlung der Arteriosklerose häufig das Freiräumen verstopfter
Gefäße durch
Angioplastie, Endarterektomie oder Reduktionsatherektomie oder durch
Bypassversorgung, operative Verfahren, bei denen atherosklerotische
Plaques durch Katheterisierung (Angioplastie) zusammengepresst oder
beseitigt werden, von der Arterienwand über eine Inzision (Endarterektomie)
abgezogen werden oder mit natürlichen
oder synthetischen Transplantaten überbrückt werden. Diese Verfahren
entfernen das Gefäßendothel,
unterbrechen die darunter liegende Intimaschicht und führen zum
Absterben von SMCs in der Media. Dieser Verletzung folgen eine Proliferation
von SMCs in der Media und deren Migration in die Intima, begleitet
von einer exzessiven Ablagerung extrazellulärer Matrix. Diese Entwicklung
der Läsion
erfolgt typischerweise innerhalb der ersten paar Wochen und bis
zu sechs Monaten nach der Verletzung und endet, wenn die darüber liegende
Endothelschicht wiederhergestellt ist. Bei Menschen bestehen diese
Läsionen
aus etwa 20% Zellen und 80% extrazellulärer Matrix.
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Bei
etwa 30% oder mehr der Patienten, die mit Angioplastie, Endarterektomie
oder Bypass-Transplantaten behandelt wurden, verursachen Thrombose
und/oder Proliferation von SMCs in der Intima einen erneuten Gefäßverschluss
und einen folgenden Misserfolg der rekonstruktiven Operation. Dieser
Verschluss eines Gefäßes nach
einer Operation ist als Restenose bekannt.
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Ein ähnlicher
Prozess der Proliferation von SMCs wurde auch bei transplantierten
Organen beobachtet und trägt
möglicherweise
zu Arteriosklerose und Organversagen der Transplantate bei. Die
Verdickung der Intima bei diesem Prozess bezieht nur das verpflanzte
Organ ein.
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Es
wurde postuliert, dass Plättchen-Mitogene
wie der Plättchen-Wachstumsfaktor
(PDGF) eine Rolle bei der Entwicklung atherosklerotischer Plaques
spielen (siehe Ross et al., Cell 46: 155–169, 1986; Harker, Am. J.
Cardiol. 60: 20B–28B,
1987). Ein vorgeschlagener Mechanismus für die Bildung von Plaques ist
die Freisetzung von Wachstumsfaktoren, die das Wachstum vom SMCs
stimulieren, durch Plättchen
an Stellen mit endothelialer Denudierung (Ross und Glomset, N. Eng.
J. Med. 295: 369–377,
420–425,
1976; Ross, Arteriosclerosis 1: 293–311, 1981). Moore et al. (Thrombos.
Haemostas. (Stuttg.) 35: 70, 1976) und Friedman et al. (J. Clin.
Invest. 60: 1191–1201,
1977) berichteten über
eine Hemmung einer unter Verwendung eines Verletzungsmodells mit
einem Verweilkatheter experimentell induzierten Läsionsbildung
der Intima in Arterien von Kaninchen durch prolongierte Thrombocytopenie,
die durch Verabreichung von Antiplättchen-Serum induziert wurde.
Es wurde auch postuliert, dass SMCs selbst PDGF produzieren können, der
die Entwicklung von Läsionen
durch einen autokrinen Mechanismus stimuliert (Ross et al., ibid;
Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7311–7315, 1986).
Fingerle et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8412–8416 untersuchten
die Bildung von Läsionen
der Intima bei Ratten mit Thrombocytopenie und schlossen, dass die
Plättchen
keine Rolle bei der initialen Proliferation der SMCs nach Verletzung
mit einem Ballon spielen, aber die Migration der SMCs in die Intima
regulieren können.
Von Plättchen
ist jetzt bekannt, dass sie eine Anzahl Wachstumsfaktoren freisetzen, einschließlich des
PDGF, des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF), der transformierenden
Wachstumsfaktoren alpha und beta (TGFα und TGFβ), des insulinartigen Wachstumsfaktors
I (IGF-I) und des Plättchen-Endothelzell-Wachstumsfaktors,
sowie verschiedener Chemokine. Obwohl bestimmte Studien PDGF in
Vorgänge, die
mit der Entwicklung von Läsionen
verknüpft
sind, einbeziehen, bleibt die Ätiologie
der Intimahyperplasie bei Säugern
nicht erklärt.
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Die
Beseitigung atherosklerotischer Plaques durch Angioplastie oder
Endarterektomie ist von beschränkter
Wirksamkeit, und es wurde keine effektive Behandlung für die Restenosierung
von behandelten Gefäßen oder
für die
Stenose von Bypass-Transplantaten entwickelt. Folglich gibt es im
Fachgebiet einen Bedarf nach Verfahren zur Reduktion oder Vermeidung
der Entwicklung von SMC-reichen Läsionen in Gefäßwänden, einschließlich der
Stenosierung von Blutgefäßen nach
einer Gefäßverletzung
wie einer Verletzung aufgrund einer Ballon-Katheterisierung, einer
Endarterektomie, der Implantation eines endovaskulären Stents oder
einer Reduktionsatherektomie, wie auch in Gefäßtransplantaten, Organtransplantaten
und bei der Plazierung von Kathetern. Die vorliegende Erfindung
stellt solche Verfahren zur Verfügung
und erfüllt
weitere, ähnliche
Bedürfnisse.
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EP 0 604 853 (Hoechst Japan
Limited) behandelt eine pharmazeutische Verbindung, die 1-[4-[2-(3-Ethyl-4-methyl-2-oxo-3-pyrrolin-1-carboxyamido)ethyl]-phenylsulfonyl]-3-(trans-4-methylcyclohexyl)-harnstoff
enthält.
Die Verbindung wird zur Prophylaxe oder Behandlung der Arteriosklerose
eingesetzt.
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Die
vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines Plättchen-Wachstumsfaktor-Antagonisten der Formel
I bei der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Intimahyperplasie
in dem Gefäßsystem
eines Säugers
zur Verfügung:
worin R
1,
R
4 und R
5 unabhängig voneinander
H, F, Cl, Br, -CF
3 oder ein lineares oder
verzweigtes Alkyl oder Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen sind;
R
2 und R
3 unabhängig voneinander
H oder ein lineares oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen sind; R
6 H, ein lineares oder verzweigtes Alkyl
oder Alkoxy mit 1 bis 18 Kohlenstoff-Atomen, Benzyloxy oder
ist,
n 1 oder 2 ist;
jedes X unabhängig
voneinander C, N, NH, O und S ist, mit der Maßgabe, dass zumindest 1–2 X C sind,
wobei wahlweise jedes X C sein kann; R
9,
R
10 und R
11, unabhängig voneinander
H, F, Br, Cl, -CF
3 oder ein lineares oder
verzweigtes Alkyl oder Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen sind;
R
7 und R
8 unabhängig voneinander
H, ein lineares oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 18 Kohlenstoff-Atomen,
-CONH-R
12,
sind,
oder R
7 und R
8 zusammen
mit dem sie verbindenden N einen substituierten oder unsubstituierten
heterocyclischen Ring mit 3 bis 8 Ringatomen bilden, z. B. einen
unsubstituierten heterocyclischen Ring mit nicht mehr als 6 Ringatomen;
R
12 H,
ist;
Y Stickstoff ist,
R
13 und R
14 unabhängig voneinander
H oder ein lineares oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen
sind oder R
13 und R
14 zusammen
mit dem sie verbindenden N einen substituierten oder unsubstituierten
heterocyclischen Ring mit 3 bis 8 Ringatomen bilden; Z Kohlenstoff
ist und R
15, R
16 und
R
17 unabhängig voneinander H, ein lineares
oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen sind, R
15 und R
16, R
16 und R
17 oder R
15 und R
17 zusammen
mit Z ein substituiertes oder unsubstituiertes Monocycloalkyl mit
3 bis 8 Kohlenstoff-Atomen bilden, oder R
15,
R
16 und R
17 zusammen
mit Z ein substituiertes oder unsubstituiertes Mono- oder Polycycloalkyl
mit 7 bis 14 Kohlenstoff-Atomen oder ein substituiertes oder ein
unsubstituiertes überbrücktes Mono-
oder Polycycloalkyl mit 6 bis 14 Kohlenstoff-Atomen bilden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung sind R
1, R
4 und
R
5 unabhängig
voneinander H, Methyl oder Methoxy; R
2 und
R
3 sind unabhängig voneinander H oder Methyl;
R
6 ist ein lineares oder verzweigtes Alkoxy
mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen oder
n ist 1 oder 2, jedes X ist
unabhängig
voneinander aus der Gruppe, die C, S und N umfasst, ausgewählt, mit der
Maßgabe,
dass 1–2
X C sind; R
9, R
10 und
R
11 sind unabhängig voneinander H, Methyl
oder Methoxy; R
7 und R
8 sind
unabhängig
voneinander H, ein lineares oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen oder
CONH-R
12; R
12 ist
H,
Y ist Stickstoff; Z ist Kohlenstoff;
R
13 und R
14 bilden
zusammen mit Y einen heterocyclischen Ring mit 5 bis 6 Ringatomen
und R
15 und R
16,
R
16 und R
17 oder
R
15 und R
17 bilden
zusammen mit Z ein substituiertes oder unsubstituiertes Monocycloalkyl
mit 5 bis 6 Kohlenstoff-Atomen oder R
15,
R
16 und R
17 bilden
zusammen mit Z ein substituiertes oder unsubstituiertes Mono- oder
Polycycloalkyl mit 9 bis 10 Kohlenstoff-Atomen oder ein substituiertes
oder unsubstituiertes überbrücktes Mono-
oder Polycycloalkyl mit 8 bis 10 Kohlenstoff-Atomen.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
bilden R
13 und R
14 zusammen
mit Y die Komponente
worin
Y Stickstoff ist,
n 1 oder 2 ist und R
18 und R
19 unabhängig voneinander
H, F, Br, Cl, -CF
3 oder ein lineares oder verzweigtes
Alkyl oder Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen sind, vorzugsweise
worin R
18 und R
19 unabhängig voneinander
H, Methyl, Ethyl, Methoxy oder Ethoxy sind.
-
In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
bilden R
15 und R
16,
R
16 und R
17 oder
R
15 und R
17 zusammen
mit Z die Komponente
worin Z Kohlenstoff ist,
n 1 oder 2 ist und R
20, R
21 und
R
22 unabhängig voneinander H, F, Br,
Cl, -CF
3 oder ein lineares oder verzweigtes
Alkyl oder Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoff-Atomen sind, vorzugsweise
worin R
20, R
21 und
R
22 unabhängig voneinander H, Methyl,
Ethyl, Methoxy oder Ethoxy sind.
-
In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist der Nicht-Peptid-PDGF-Antagonist NNC92-0270:
-
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist besagter Säuger
ein Primat.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist besagtes Medikament zur Anwendung des besagten
Nicht-Peptid-PDGF-Antagonisten zeitgleich mit oder innerhalb einer
antihyperplastisch effektiven Zeitperiode vor einer akuten Gefäßverletzung
bei besagtem Säuger
bestimmt; oder
besagter Nicht-Peptid-PDGF-Antagonist ist zur
Anwendung innerhalb einer antihyperplastisch effektiven Zeitperiode,
die auf eine akute Gefäßverletzung
bei besagtem Säuger
folgt, bestimmt;
und worin in beiden Fällen besagte Verletzung optional
auf eine Gefäßrekonstruktion
zurückzuführen ist,
z. B. worin besagte Gefäßrekonstruktion
Angioplastie, Endarterektomie, Reduktionsatherektomie, endovaskuläre Laserablation
oder Anastomosierung mit einem Gefäßtransplantat umfasst.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung umfasst besagtes Medikament weiterhin Heparin.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist das besagte Medikament zur Anwendung des besagten
Nicht-Peptid-PDGF-Antagonisten und Heparin bei besagtem Säuger durch
eine Applikationsform bestimmt, die aus der Gruppe, die orale, intravaskuläre, perivaskuläre, transdermale
und rectale Applikationsformen umfasst, ausgewählt ist.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch eine Verbindung der Formel I zur
Verwendung als ein Medikament bereit.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung, die zur
Hemmung von Intimahyperplasie geeignet ist und einen Nicht-Peptid-PDGF-Antagonisten
der Formel I und Heparin umfasst, bereit.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch ein Produkt, welches einen Nicht-Peptid-PDGF-Antagonisten der Formel
I und Heparin enthält,
als ein Kombinationspräparat
zur zeitgleichen, separaten oder sequentiellen Verwendung zur Hemmung
von Intimahyperplasie bereit.
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Intimahyperplasie
ist auf eine Gefäßverletzung
zurückzuführen, einschließlich einer
Gefäßverletzung infolge
einer Gefäßrekonstruktion
wie Angioplastie, Endarterektomie, Reduktionsatherektomie, endovaskuläre Laserablation
oder Anastomosierung eines Gefäßtransplantats.
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Eine
Verbindung der Formel I wird vorzugsweise einem Säuger innerhalb
einer antihyperplastisch effektiven Zeitperiode vor, zeitgleich
mit oder nach einer akuten Gefäßverletzung
bei dem Säuger
verabreicht.
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Eine
Verbindung der Formel I wird vorzugsweise zeitgleich mit einer antihyperplastisch
effektiven Menge Heparin verabreicht.
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Die
Erfindung lässt
auch Verfahren zur Verwendung von Verbindungen der Formel I als
Nicht-Peptid-PDGF-Antagonisten zu, wie zur Hemmung von PDGF-Aktivität in einem
Säuger.
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Die
vorliegende Erfindung lässt
Verfahren zur Hemmung von Intimahyperplasie im Gefäßsystem
eines Säugers
und Verfahren zur Hemmung von Plättchen-Wachstumsfaktor-(PDGF)-Aktivität zu.
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Wie
in der vorliegenden Erfindung verwendet:
bezieht sich Alkyl
auf einen gesättigten,
acyclischen Kohlenwasserstoff-Rest;
bezieht sich Alkoxy auf
einen gesättigten
acyclischen Kohlenwasserstoff-Rest, welcher mindestens ein Sauerstoff-Atom
enthält;
bezieht
sich Mono- oder Polycycloalkyl auf einen Rest eines gesättigten
Kohlenwasserstoffes, welcher einen (mono) oder mehr als einen (poly)
Ring hat;
bezieht sich überbrücktes Mono-
oder Polycycloalkyl auf ein Mono- oder Polycycloalkyl mit einer
oder mehreren Brücken,
die aus einer chemischen Bindung, einem einzelnen Atom oder einer
Kette von Atomen bestehen, welche zwei verschiedene Teile des Moleküls verbinden.
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Diese
und andere Aspekte der Erfindung werden unter Bezugnahme auf die
folgende ausführliche
Beschreibung der Erfindung klar werden.
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Wie
oben erwähnt
ist die Restenose von Blutgefäßen ein
verbreitetes Problem bei Patienten, die sich einer Angioplastie,
einer Endarterektomie oder einer Bypassversorgung unterzogen haben.
Restenose ist ein Beispiel für
Intimahyperplasie, von der angenommen wird, dass sie über einen
Prozess abläuft,
der sowohl Proliferation (Mitose) und Wanderung von glatten Gefäßmuskelzellen
in die vom chirurgischen Verfahren beschädigte Region als auch die Produktion
(Ablagerung) extrazellulärer
Matrix umfasst. Siehe im Allgemeinen Harker, Am. J. Cardiol. 60:
20B–28B,
1987 und DeFeudis, Drug News and Perspectives 5: 49–51, 1992.
Dieser proliferative Prozess manifestiert sich auch im Verschluss
von Gefäßtransplantaten
(sowohl von natürlichen, einschließlich autologer
und allogener, als auch von synthetischen) und in transplantierten
Organen. Dieser proliferative Prozess führt zur Entwicklung von Läsionen,
die reich an glatten Muskelzellen sind, und wird hier als Intimahyperplasie
bezeichnet.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Hemmung der Entwicklung
SMC-reicher Läsionen
(teilweiser oder kompletter Verschluss eines Blutgefäßes durch
Verdickung der Intima (Hyperplasie)) durch die Verwendung einer
antihyperplastisch effektiven Menge eines Nicht-Peptid-PDGF-Antagonisten,
entweder unabhängig
oder in Kombination mit einer antihyperplastisch effektiven Menge
von Heparin, zur Verfügung.
Von besonderem Interesse für
die Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind 4-(2-(N-(2-Carboxamidoindol))aminoethyl)-benzolsulfonamide
mit Formel I. Nicht-Peptid-PDGF-Antagonisten
der vorliegenden Erfindung können
im therapeutischen Regime gegen Sklerodermie, Lungenhyperplasie,
Nierenfibrose, rheumatoide Arthritis, zur Behandlung von soliden
malignen Tumoren einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf Osteosarkom, Fibrosarkom, Gliom oder anderer proliferativer
Zellerkrankungen von Nutzen sein.
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Verbindungen
zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung von im
Fachgebiet bekannten Verfahren synthetisiert werden (siehe Francia
et al., Boll. Chim. Farm 114: 379–393, 1975; Vicentini et al.,
II Farmaco. Ed. Sc. 38: 672–678,
1983; Biere et al., J. of Med. Chem. 17: 716–721, 1973 und Höhn et al.,
J. of Med. Chem. 16: 1340–1346,
1973). Zum Beispiel sind repräsentative
Schemata für
die Synthesen der Verbindungen der Formel I unten gezeigt. Das entsprechende
2-(Aminoethyl)benzol wird zunächst durch
Reaktion mit Acetanhydrid acetyliert und dann durch Behandlung mit
Chlorsulfonsäure
in das Benzolsulfonylchlorid II umgewandelt. II kann dann durch
Behandlung mit einem Amin in das gewünschte Sulfonamid umgewandelt
werden. III stellt direkt den korrekten Baustein für Verbindungen
der Formel I zur Verfügung,
worin R7 und R8 Sulfonamide
bilden.
-
-
Für die Synthese
von Verbindungen mit Formel I, worin R7 und
R8 Sulfonylharnstoffe bilden, stellt IV, worin
R7 und R8 H sind,
das Ausgangsmaterial für
weitere Manipulationen wie unten gezeigt zur Verfügung. IV wird
zunächst
durch Behandlung mit Ethylchloroformiat in das Ethyl-sulfonylcarbamat
V umgewandelt. V kann dann entweder durch Reaktion mit dem entsprechenden
Amin zu VI (oder der Verbindung der Formel I, worin R7 oder
R8 -CONH2 ist) umgewandelt
werden, oder durch Reaktion mit einem Hydrazin zu VII.
-
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Das
Acetylamid wird entweder in wässriger
Base oder Säure
hydrolysiert, um das freie Amin VIII zu ergeben. VIII kann dann
mit dem entsprechenden Indol-2-carbonsäurechlorid acetyliert werden,
um X zu ergeben, die Verbindungen der Formel I. IX wird durch die
Reaktion der entsprechenden Indol-2-carbonsäure mit Oxalylchlorid zubereitet.
Die Indol-2-carbonsäuren
werden mit einem der vielen den Fachleuten bekannten Verfahren hergestellt.
-
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Die
Herstellung von Verbindungen, die typisch für ausgefallenere 3-Alkoxyindole
(worin R6 Alkoxy oder eine der beschriebenen
Methoxy-Ringverbindungen ist) sind, ist unten gezeigt. Das Ethyl-2-aminobenzoat
wird mit Ethyl-α-bromacetat
N-alkyliert, um XI zu ergeben. Behandlung von XI mit Natriumethoxid
bringt das 3-Oxoindol XII hervor. Alkylierung mit dem entsprechenden
Alkylhalogenid ergibt das 3-Alkoxyindol XIII. Esterspaltung gefolgt
von einer Reaktion mit Oxalylchlorid ergibt das Säurechlorid
XV.
-
-
Der
Begriff „Nicht-Peptid-PDGF-Antagonist" bezieht sich wie
hier verwendet auf eine Verbindung, die keine Peptid-Verbindung
ist und eine PDGF-induzierte Stimulation eines Reaktionswegs hemmt.
Ein „Reaktionsweg" ist ein biochemischer
Weg, der als Antwort auf externe Stimuli aktiviert wird und im Allgemeinen,
aber nicht immer, direkt an einen membrangebundenen Rezeptor gekoppelt
ist. Reaktionswege induzieren im Allgemeinen zelluläre Antworten
wie Sekretion extrazellulärer
Matrix aus reagierenden Zellen, Hormonsekretion, Chemotaxis, Differenzierung
oder Stimulation der Zellteilung reagierender Zellen.
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PDGF-Rezeptoren
sind integrale, transmembranöse
Glykoproteine, deren Expression im Allgemeinen auf Zellen mesodermalen
Ursprungs beschränkt
ist. Zwei PDGF-Rezeptor-Polypeptide wurden beschrieben. Sie werden
als „alpha-Rezeptor" (Kelly et al., WO
90/14425; Kelly et al., U.S. Patent Nr. 5,371,205; Claesson-Welsh
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4917–4921, 1989) und „beta-Rezeptor" (Claesson-Welsh
et al., Mol. Cell. Biol. 8: 3476–3486, 1988; Gronwald et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3435–3439, 1988) bezeichnet. In
Gegenwart des PDGF-Liganden dimerisieren die Rezeptor-Polypeptide. Somit
sind drei Rezeptor-Subtypen möglich: αα, αβ und ββ. Der β-Rezeptor
ist für
die B-Kette des PDGF spezifisch, während der α-Rezeptor die A-Kette und die
B-Kette bindet.
Folglich hängt
die wachstumsregelnde Empfindlichkeit von Zellen auf PDGF nicht
nur von der Verfügbarkeit
von Isoformen der PDGF-Liganden AA, AB und BB ab, sondern auch von
der Expression und Verfügbarkeit
der verschiedenen Subtypen von PDGF-Rezeptoren (Heldin et al., Cell
Regul. 1: 555–566,
1990). Glatte Muskelzellen vom Menschen exprimieren sowohl alpha-
als auch beta-Rezeptor-Subtypen (Heldin et al., Cell Regul. 1: 555–566, 1990),
aber es sind andere Zelltypen bekannt, die nur einen einzigen Rezeptor-Subtyp
exprimieren (Gronwald et al., J. Biol. Chem. 264: 8129–8125, 1989).
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Hemmung der
Intimahyperplasie durch koordinierte Anwendung einer antihyperplastisch
effektiven Menge eines Nicht-Peptid-PDGF-Antagonisten und einer
antihyperplastisch effektiven Menge von Heparin zur Verfügung. Der
Begriff „Heparin" bezieht sich wie
hier verwendet auf jedes Mitglied einer Familie strukturell komplexer,
sulfatierter Glykosaminoglykane, welche im Allgemeinen durch eine
Struktur sich wiederholender Glucosamine und Glucuronsäure-Zuckerreste
charakterisiert sind (Casu, Adv. Carbohyd. Chem. and Biochem. 47:
578–583,
1985). Das weitgehendst bekannte Heparin ist „unfraktioniertes" oder „kommerzielles" Heparin, das aus
Rinderlunge oder Schweinedarm hergestellt wird und eine heterogene
Mischung von Heparinmolekülen
mit einem Molekulargewicht von etwa 8.000 bis 20.000 Dalton umfasst
(Wolinsky et al., J. Am. Coll. Cardiol. 15: 475–481, 1990). Jedoch beinhaltet
der Begriff Heparin auch ein umfassendes Sortiment homogenerer Heparinzubereitungen
und auch heparinähnlicher
Moleküle einschließlich der
Heparansulfate. Unter diesen speziellen Beispielen von Heparinen
sind auch spezifischere Heparin-Subtypen bekannt. Zum Beispiel wurden
von Endothelzellen (Castellot et al., J. Cell. Biol. 90: 372–379, 1981)
und von glatten Muskelzellen (Fritze et al., J. Cell. Biol. 100:
1041–1049,
1985) produzierte Heparansulfat-Komponenten isoliert, die den Berichten
zufolge bei der Hemmung der Proliferation glatter Muskelzellen bis
zu 40 mal aktiver sind als unfraktioniertes Heparin. Ferner wurden
aus den natürlich
vorkommenden Größenvarianten
des Heparins fraktionierte Heparinarten isoliert, die vorherrschend
entweder antikoagulatorische oder antiproliferative Aktivität zeigen
(Wolinsky et al., J. Am. Coll. Cardiol. 15: 475–481, 1990). Die letztere Aktivität tendiert
dazu, bei den Heparinarten mit niedrigem Molekulargewicht vorzuliegen,
wie bei Heparinen im Bereich von Penta- bis Dekasacchariden, von
denen berichtet wurde, dass sie auch eine größere Bioverfügbarkeit
und eine längere
Halbwertszeit bieten (Id., Bacher et al., Thrombosis Res. 70: 295–306, 1993),
und die daher im Rahmen besonderer Ausführungsformen der Erfindung
besonders nützlich
sein können.
In die Definition von Heparin für
die Zwecke der Beschreibung der Erfindung sind auch synthetische
Heparine und Heparinderivate eingeschlossen, von denen eine Auswahl
unter Verwendung konventioneller chemischer synthetischer, modifizierender
und degradativer Verfahren hergestellt wurde (siehe, zum Beispiel,
Roden, L., The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans (Lennarz,
W. J. ed.) pp 267–371,
Plenum Publishing Corp., New York, 1980).
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Eine „antihyperplastisch
effektive Menge" einer
Verbindung ist als eine Menge einer Verbindung definiert, die ausreicht,
um Intimahyperplasie in einem Blutgefäß, einem Gefäßtransplantat
oder einer Gefäßkomponente
eines transplantierten Organs messbar zu verringern oder zu verhindern.
Spezieller schließt „Hemmung
von Intimahyperplasie" hier
definitionsgemäß jede messbare
Hemmung von einem oder mehreren der im Fach gebiet beschriebenen
hyperplastischen Prozesse der Intima ein, wie die Wanderung von
glatten Gefäßmuskelzellen
(VSMC), die Proliferation von VSMC und die Ablagerung von extrazellulärer Matrix
in der Neointima. In diesem Zusammenhang kann die Verringerung oder
Verhinderung von Intimahyperplasie oder eines hyperplastischen Prozesses,
der an Intimahyperplasie beteiligt ist, leicht unter Verwendung
von im Fachgebiet bekannten in-vitro-, in-vivo- oder ex-vivo-Prüfsystemen,
besonders von auf Primaten basierenden Prüfsystemen, beurteilt werden
(z. B. nicht-menschliche oder menschliche Primaten-VSMC-Kulturen
oder explantierte Gefäßgewebe,
oder in-vivo-Tests
an nicht-menschlichen Primaten). Indem PDGF daran gehindert wird, seinen
Stimulationseffekt auszuüben,
kann SMC-Proliferation und nachfolgende Ablagerung von Matrix verringert
werden. Eine Reduktion der Intimahyperplasie ist klinisch als eine
signifikante Reduktion der Abnahme des luminalen Volumens nach einer
akuten Gefäßverletzung
erklärt.
Eine derartige Reduktion wird im Allgemeinen zu einem verringerten
Bedarf nach Revaskularisationsmaßnahmen (z. B. wiederholte
Angioplastie) an der Stelle der anfänglichen Verletzung führen. Die
Verfahren der vorliegenden Erfindung sind bei der Behandlung von
Intimahyperplasie infolge einer akuten Gefäßverletzung besonders nützlich.
Akute Gefäßverletzungen
treten schnell auf (d. h. über
Tage bis Monate), im Gegensatz zu chronischen Gefäßverletzungen
(z. B. Atherosklerose), die sich über eine Lebenszeit entwickeln.
Akute Gefäßverletzungen
sind oft auf chirurgische Verfahren wie Gefäßrekonstruktionen zurückzuführen, wobei
die Verfahren der Angioplastie, der Endarterektomie, der Reduktionsatherektomie,
des endovaskulären
Stentings, der endovaskulären
Laserablation, der Anastomosierung mit einem Gefäßtransplantat oder desgleichen
eingesetzt werden. Hyperplasie kann auch als verzögerte Antwort
bei der Reaktion auf z. B. die Implantation eines Gefäßtransplantats
oder auf eine Organtransplantation auftreten.
-
Menschen,
die mit einer Therapie mit einem Nicht-Peptid-PDGF-Antagonisten,
entweder allein oder in Kombination mit Heparin, behandelt werden,
kann der Antagonist unter vielfältigen
Bedingungen gegeben werden. Der Antagonist kann über Bolusinjektionen gegeben
werden, sowohl vor der Revaskularisationsmaßnahme als auch mehrfach nach
der Maßnahme.
Der Antagonist kann vor der Maßnahme
oral oder als Bolusinjektion (intravenös, intramuskulär, intraperitoneal
oder subcutan) gegeben werden (im Allgemeinen innerhalb von 24 Stunden
vor der Operation) und als Dauerinfusion nach der Maßnahme (einschließlich der
Infusion über implantierte
Pumpen. In vielen Fällen
wird es vorzuziehen sein, während
eines Krankenhausaufenthaltes tägliche
Dosen zu verabreichen (einschließlich der Verabreichung über Infusion),
gefolgt von weniger häufigen Bolusinjektionen
während
einer ambulanten Behandlung in einer Zeitspanne von ein bis zwei
oder mehr Wochen. Die Behandlung kann für eine Zeit bis zu sechs Monaten
nach der anfänglichen
Verletzung fortgeführt werden.
Der Antagonist kann über
viele Applikationswege einschließlich intravenöser, intramuskulärer und subcutaner
Injektionen gegeben werden. Zusätzlich
kann der Antagonist unter Verwendung von Ballonkathetern, Beschichtung
auf Stents oder Aufbringen auf gelbeschichtete Ballonkatheter lokal
an die Stelle der Gefäßverletzung
abgegeben werden. In letzteren Fällen
würde zu
erwarten sein, dass die Dosen des Antagonisten erheblich geringer
sind als die erforderliche Dosis bei systemischer Gabe. Der Antagonist
kann auch von Freisetzungssystemen mit langsamer Freisetzungsrate
abgegeben werden, einschließlich
solcher Systeme, die in Gefäßtransplantate
oder Stents eingearbeitet sind, oder durch Perfusion von Doppelballonkathetern. Pumpen
oder andere bekannte Freisetzungssysteme können auch zur Anwendung kommen.
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In
einer alternierenden Ausführungsform
der Erfindung wird ein Nicht-Peptid-PDGF-Antagonist einem Säuger koordiniert mit Heparin
in entsprechenden Dosierungen des Antagonisten und des Heparins,
die ausreichen, um in Kombination Intimahyperplasie im Gefäßsystem
des Säugers
zu hemmen, verabreicht. In diesem Zusammenhang soll „koordinierte
Verabreichung" zeitgleiche,
separate oder sequentielle Verabreichung des Antagonisten und des
Heparins einschließen,
wobei sowohl der Antagonist als auch das Heparin innerhalb einer
beschränkten,
kombinatorisch effektiven Zeitperiode im Verhältnis zueinander verabreicht
werden. Eine „kombinatorisch
effektive Zeitperiode" ist
definiert als die maximale Zwischenzeitspanne zwischen der Verabreichung
des Antagonisten und der Verabreichung des Heparins, in der die
beiden Agenzien bei der Hemmung der Hyperplasie als Kombination
wirksam sind. Die Bezeichnung „kombinatorisch
effektiv" ist wiederum
definiert als die Herbeiführung
einer messbaren Hemmung von Intimaverdickung, von der Bildung von
Läsionen oder
eines hyperplastischen Prozesses, welche einen Höchstgrad der Hemmung übersteigt,
der bei alleiniger Verab reichung entweder vom Antagonisten oder
vom Heparin unter sonst vergleichbaren Bedingungen und Dosierung
unabhängig
erreicht wird.
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Im
Allgemeinen wird die Dosierung des Heparins zwischen etwa 1 μg–100 mg/kg/Tag
liegen. Vorzugsweise wird die Dosierung des Heparins zwischen 29 μg–10 mg/kg/Tag
liegen, und wünschenswerter
unter etwa 1 mg/kg/Tag. Fachleuten wird klar sein, dass die tatsächlichen
Dosierungen unter Berücksichtigung
spezifischer Umstände,
einschließlich
von Patientenparametern und von Charakteristika der verabreichten
Antagonisten und des verabreichten Heparins ermittelt werden.
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Es
wird zu erwarten sein, dass die Hemmung der Hyperplasie zu einer
Abnahme klinischer Ereignisse bei Patienten führen wird. Diese Ereignisse
schließen
eine Abnahme bei einem oder mehreren Myokardinfarkten, Angina, der
Erfordernis von Revaskularisationsmaßnahmen und Todesfällen ein.
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Beispiele
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Beispiel 1
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Antagonisten-Test
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Die
anfängliche
Charakterisierung von NNC92-0270 als Nicht-Peptid-PDGF-Antagonist
wurde durch ein SRE-Luciferase-Testsystem für hohen Durchsatz ermöglicht,
welches zur Selektion von Substanzen führt, die die Expression eines
Serum-Reaktionselement (SRE)-Luciferase-Reportergens, das in SWISS3T3-Zellen exprimiert
wird, blockieren können.
Das SRE-Luciferase-Konstrukt, pKZ67, ist ein von pUC18 abgeleiteter Säugerzell-Expressionsvektor,
der eine Luciferase-Expressionseinheit umfasst, welche ein synthetisiertes Segment,
das die menschliche c-fos-Sequenz von –360 bis +30 (van Straaten
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3183–3187, 1983) (einschließlich der
TATA-, SRE- und SIE (sis-induzierbares Element)-Promotorelemente)
enthält,
eine Luciferase-Sequenz (Delegeane et al., Mol. Cell Biol. 7: 3994–4002, 1987;
deWet et al., Mol. Cell Biol. 7: 725–737, 1987) und einen Terminator
des Gens für
den menschlichen Wachstumsfaktor beinhaltet. Diese Expressionseinheit
liegt in entgegengesetzter Tran skriptionsrichtung zu einer zweiten
Expressionseinheit, die einen Neomycin-Resistenzmarker, der von
SV40-Promotor- und -Terminatorsequenzen flankiert wird, enthält. SWISS3T3-Zellen
exprimieren endogene Wachstumsfaktorrezeptoren wie PDGF-AA, -AB
und -BB; bFGF und EGF. Stimulation der Rezeptoren mit einem dieser
Wachstumsfaktoren initiiert eine Signalkaskade, die zur Induktion
von Luciferase führt.
PMA (Phorbol 12-Myristat 13-Acetat) umgeht den Rezeptor und initiiert durch
Stimulation der Proteinkinase C eine interne Signalkaskade, was
zur Induktion von Luciferase führt.
Das Ausmaß der
Spezifität
des Antagonisten kann durch den Vergleich des sich ergebenden Signals
für die
drei Wachstumsfaktoren (PDGF, bFGF und EGF) bestimmt werden. Verbindungen,
die im Vergleich zur Kontrolle zu einer 50-fachen Signalreduktion
führten,
wurden für
weitere Untersuchungen in Betracht gezogen.
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SWISS3T3-Zellen
(transfiziert mit einem SRE-Luciferase-Reportergen, SWISS3T3/KZ67-G1-6)
wurden durch fortlaufende Passagierung in Erhaltungsmedium (DMEM
(Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium, GIBCO BRL, Gaithersburg,
MD), ergänzt
mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat,
1 mg/ml G418) kultiviert. Zwei Tage vor dem Test wurden die Zellen
trypsinisiert, auf 5 × 104 Zellen/Kavität in Wachstumsmedium (DMEM
ergänzt
mit 1% FBS, 2 mM L-Glutamin,
1 mM Natriumpyruvat) eingestellt, in deckweiße 96-Loch-Mikrotiterplatten
mit 200 μl/Kavität (1 × 104 Zellen/Kavität) ausplattiert und über 48 Stunden
bei 37°C,
5% CO2 gezüchtet.
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Die
Testsubstanzen wurden in 4% DMSO zubereitet. Die Induktion wurde
durch Entfernung des verbrauchten Mediums aus den Vertiefungen und
Zugabe von 50 μl
Testmedium (F12 HAM (Gibco) ergänzt
mit 0,5% Fraktion-V-BSA (Sigma, St. Louis, Mo.), 2 mM L-Glutamin,
1 mM Natriumpyruvat, 20 mM Hepes) pro Kavität eingeleitet. Fünfundzwanzig
Mikroliter entweder von 50 ng/ml PDGF (endgültige Testkonzentration 12,5 ng/ml)
oder von 8 ng/ml bFGF (endgültige
Testkonzentration 2,0 ng/ml) in Testmedium wurden in die Vertiefungen
zugegeben. In Testmedium zubereitete Kontrollen wurden auf jeder
Platte einbezogen: unbehandelte Vertiefungen (basal), 12,5 ng/ml,
wünschenswerter
6,25 ng/ml PDGF BB (Plättchen-Wachstumsfaktor,
Stamm 10 μg/ml,
10 mM Essigsäure,
0,25% RSA (Serumalbumin vom Kaninchen) in PBS, phosphat gepufferte
Saline), 2,0 ng/ml bFGF (basaler Fibroblasten-Wachstumsfaktor (Genzyme
Diagnostics, Cambridge, MA)), 4,5 ng/ml EGF (epidermaler Wachstumsfaktor
(Sigma) oder 50 ng/ml PMA (Sigma). Die endgültige Testkonzentration von
DMSO überschreitet
1% nicht. Die Platten wurden über
5 Stunden bei 37°C,
5% CO2 inkubiert.
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Nach
der Induktion wurde die Aktivität
der Luciferase unter Verwendung eines Promega Luciferase-Testkits
(E1500; Promega Corp., Madison, WI) gemäß dem Protokoll des Testkits
gemessen. Kurz dargestellt wurde das Testmedium von der Platte entfernt,
und 25 μl/Kavität Zelllyse-Puffer,
1 : 5 mit sterilem Wasser verdünnt,
wurden der Platte zugegeben. Die Platten wurden über 15 Minuten inkubiert. Die
Platten wurden in ein LumiskanTM-Mikrotiter-Luminometer
(ICN Biomedical, Cleveland, OH) umgesetzt, das pro Kavität 40 μl Luciferase-Testsubstat
(Promega Corp.) zugab. Die Menge der Lumineszenz (relative Lichteinheiten,
RLU) wurde nach einem 1-Sekunden-Mix und einer 1-3-Integration des Signals bestimmt.
Das basale (nicht induzierte) Luciferase-Signal wurde von allen
Messungen abgezogen, und das von den getesteten Proben induzierte
Luciferase-Signal wurde als Prozentsatz des Signals in der Kontrolle
formuliert. Die in Tabelle 1 dargestellten Daten zeigen die ungefähr effektive
Dosis von NNC92-0270 zur Hemmung von 50% der Kontroll-Aktivität (IC50).
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Tabelle
1
Induktion der SRE-Luciferase
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Beispiel 2
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Hemmung der Bindung von 125I-PDGF-BB an glatte Muskelzellen (SMCs)
von der Ratte
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NNC92-0270
wurde auf die Fähigkeit,
die Bindung von 125I-PDGF-BB an einschichtige
Zelllagen von SMCs von der Ratte zu hemmen, untersucht. Zum Test
auf die Hemmung der Bindung von 125I-PDGF-BB
an SMCs von der Ratte wurden die SMCs mit etwa 20.000 Zellen/Kavität in 24-Loch-Kulturplatten
ausplattiert. Die Zellen wurden 2–7 Tage nach dem Ausplattieren
für Tests
benutzt. Die Testverbindung wurde in Bindungsmedien (500 ml Hams
F-12 (Gibco BRL), 12 ml 1 M Hepes pH 7,4, 5 ml 100 × PSN (Penicillin-Streptomycin-Neomycin,
Gibco BRL), 1 g Serumalbumin vom Kaninchen (Sigma Chemical CO.,
St. Louis, MO)) auf die in Tabelle 2 gezeigten Konzentrationen verdünnt und
dann in dreifacher Ausführung
zu den SMCs (1 ml/Kavität) gegeben.
In die Vertiefungen wurden dann 50 μl einer 125I-PDGF-BB-Stammlösung zugegeben.
Bindungsmedien allein wurden als negative Kontrolle verwendet, und
die Zugabe von 200 ng/ml PDGF-BB wurde verwendet, um die unspezifische
Bindung für 125I-PDGF-BB zu bestimmen. Die Zellen wurden über etwa
1½ Stunden bei
4°C inkubiert
und dann mit Bindungsmedien gewaschen, um ungebundenen Liganden
zu entfernen. Die Zellen wurden dann in Extraktionspuffer (20 mM
Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% Nonident P-40, 0,5%
Natriumdesoxycholat, 10 mM NaI, 1% Rinder-Serumalbumin) inkubiert,
und die Extrakte wurden gewonnen und in einem Gamma-Zähler gezählt. Die
Ergebnisse der Bindungsstudien sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Daten
sind als spezifische, für 125I-PDGF-BB bestimmte cpm (Zählungen
pro Minute) dargestellt. Die durch die Zugabe von 200 ng/ml von
unmarkiertem PDGF-BB bestimmte unspezifische Bindung betrug 853
cpm und wurde von den dargestellten Daten abgezogen.
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Tabelle
2
Hemmung der Bindung von
125I-PDGF-BB
an SMCs von der Ratte
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Diese
Ergebnisse zeigen, dass NNC92-0270 ein potenter Hemmstoff der Bindung
von PDGF-BB an PDGF-Rezeptoren auf der Zelloberfläche ist.
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NNC92-0270
wurde anschließend
auf seine Fähigkeit
untersucht, die Bindung von 125I-PDGF-BB an SMCs von
der Ratte zu hemmen, wenn der Radioligand in Gegenwart von 10% Serum
vom Menschen zu den Zellen gegeben wurde. Die SMCs von der Ratte
wurden in 24-Loch-Kulturplatten ausplattiert und wie oben beschrieben
untersucht. Die Testverbindung wurde entweder in Bindungsmedien
allein oder in Bindungsmedien mit 10% Serum vom Menschen auf die
in Tabelle 3 gezeigten Konzentrationen verdünnt, und Aliquots von 1 ml
wurden in dreifacher Ausführung
zu den Testzellen gegeben. Fünfzig μl einer 20 × 125I-PDGF-BB-Stammlösung wurden jeder Vertiefung
zugegeben. Die Zellen wurden über
2,5 Stunden bei 4°C
inkubiert, mit Bindungsmedien gewaschen, um ungebundenen Liganden
zu entfernen und mit Extraktionspuffer gewonnen. Die Extrakte wurden
dann in einem Gamma-Zähler
gezählt,
um die gebundenen CPM zu bestimmen. Die in Tabelle 3 dargestellten
Ergebnisse zeigen, dass NNC92-0270, wenn es in Bindungsmedien mit
10% Serum vom Menschen gelöst
ist, im Vergleich zu dem, das in Bindungsmedien allein gelöst ist,
etwa die gleiche Wirksamkeit bei der Hemmung der Bindung von 125I-PDGF-BB hat. Es sollte beachtet werden,
dass die Bindung von 125I-PDGF-BB in der
negativen Kontrollprobe, die Serum vom Menschen enthielt, gegenüber der
negativen Kontrollprobe mit Bindungsmedien allein geringer war.
Die Ergebnisse sind als gesamte gebundene CPM dargestellt.
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Tabelle
3
Hemmung der Bindung von
125I-PDGF-BB
an SMCs von der Ratte in Gegenwart und Abwesenheit von Serum vom
Menschen
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Beispiel 3
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Hemmung der mitogenen
Aktivität
von PDGF-BB an glatten Muskelzellen vom Pavian
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NNC92-0270
wurde auf seine Fähigkeit,
die mitogene Aktivität
von PDGF an glatten Muskelzellen vom Pavian zu hemmen, untersucht.
Alle Tests zur Mitogenese, die an glatten Gefäßmuskelzellen vom Pavian (BVSMCs)
durchgeführt
wurden, wurden an primären
Zellkulturen zwischen den Passagierungen 13 und 20 in der Kultur
vorgenommen. Die Ausgangskulturen wurden aus dem Auswuchs von explantiertem
Aortengewebe hergestellt. Glatte Muskelzellen vom Pavian in mit
10% fetalem Kälberserum
ergänztem
DMEM wurden mit etwa 20.000 Zellen pro Kavität in 24-Loch Kulturplatten
ausplattiert. Einen Tag vor der Verwendung wurden die Kulturmedien
entfernt, und 1 ml Mito Media (Tabelle 5) wurde in jede Vertiefung
zugegeben, um es den Zellen zu ermöglichen, einen Ruhezustand
zu erreichen. Zum Zeitpunkt des Experiments wurden die Zellen mit PDGF-BB
stimuliert. Es wurde eine Standardkurve für PDGF-BB mit Konzentrationen
von 1, 0,5, 0,25, 0,062 und 0,0 ng/ml erstellt. 20-×-Stammlösungen wurden
für jede
der PDGF-Konzentrationen durch Verdünnung in 10 mM Essigsäure mit 0,25%
Albumin hergestellt, und 50 μl
PDGF oder Dilutionsmittel allein wurden den Kulturvertiefungen zugegeben.
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Zur
Untersuchung der Aktivität
von NNC92-0270 zur Neutralisierung der mitogenen Aktivität von PDGF-BB
wurde 1 ng/ml PDGF zusammen mit Verdünnungen von NNC92-0270 in die
Vertiefungen zugegeben. Die Zellen wurden mit den Testproben über etwa
20 Stunden bei 37°C
inkubiert. 50 μl
einer 20-×-Stammlösung von
[3H]-Thymidin
wurde dann zu jeder Vertiefung gegeben, um eine Endkonzentration
von 1 μCi/ml
zu ergeben. Die Zellen wurden über
4 Stunden bei 37°C
inkubiert, mit PBS gewaschen, dann mit Trypsin gewonnen und auf
Aufnahme von [3H]-Thymidin in einem BetaplateTM-Flüssigkeits-Szintillationszähler von
Wallac (Turku, Finnland) ausgezählt.
Die in Tabelle 4 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die mitogene
Aktivität
von PDGF-BB dosisabhängig von
NNC92-0270 gehemmt wurde. Die ED50 für die Hemmung
lag für
NNC92-0270 etwa bei 12,5 μM.
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Tabelle
4
Hemmung der mitogenen Aktivität von PDGF-BB an glatten Muskelzellen
vom Pavian
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Als
Teil desselben Experiments wurde die inhibitorische Wirksamkeit
von NNC92-0270 in Gegenwart von Heparin untersucht. Wir haben vorher
gezeigt, dass Heparin in einer kombinatorischen Art und Weise mit neutralisierenden
monoklonalen Antikörpern
auf den PDGF-Rezeptor einwirken kann, um die mitogene Aktivität von PDGF
auf glatte Muskelzellen vom Pavian zu hemmen. Wir wollten ermitteln,
ob bei NNC92-0270 die Gegenwart von Heparin einen ähnlich potenzierenden
Effekt auf die Hemmung der mitogenen Aktivität von PDGF-BB hat.
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NNC92-0270
wurde mit 1 ng/ml PDGF-BB in Gegenwart von 0,5 U/ml unfraktionierten
Heparins inkubiert. Die Zellen wurden wie oben beschrieben mit [3H]-Thymidin puls markiert und der [3H]-Thymidin-Level wurde bestimmt. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 4 dargestellt.
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Diese
Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe von Heparin zu NNC92-0270 zu
einer weiteren Hemmung von [3H]-Thymidin führte, die über der lag, die mit NNC92-0270
allein erreicht wurde.
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Beispiel 5
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Auswaschstudie
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NNC92-0270
wurde in einem Auswaschexperiment auf einen verlängerten inhibitorischen Effekt
auf die mitogene Aktivität
von PDGF-BB auf glatte Muskelzellen vom Pavian untersucht. SMCs
vom Pavian wurden mit 20.000 Zellen pro Kavität auf eine 24-Loch-Kulturplatte
ausplattiert und über
2 Tage gezüchtet.
Die Kulturmedien wurden entfernt und mit Mito Media (Tabelle 5)
ersetzt, um es den Zellen zu ermöglichen,
einen Ruhezustand zu erreichen. Das Experiment war so aufgebaut,
dass die Zellen entweder über
24 Stunden vor der Zugabe von PDGF-BB oder sequentiell mit der Zugabe
von PDGF-BB mit NNC92-0270 oder mit Kontroll-Dilutionsmittel (0,5%
DMSO) behandelt wurden. Die Zellen, die anfänglich mit NNC92-0270 oder
Kontroll-Dilutionsmittel über
24 Stunden behandelt worden waren, wurden mit Mito Media gewaschen,
um die Testverbindung zu entfernen, und dann mit PDGF-BB (1 ng/ml) über weitere
24 Stunden inkubiert. Eine zweite Gruppe von Zellen wurde mit NNC92-0270
oder mit Kontroll-Dilutionsmittel
simultan mit PDGF-BB über
24 Stunden behandelt. Die Zellen wurden über 4 Stunden mit [3H]-Thymidin radioaktiv markiert (letztlich
1 μCi/ml),
mit Trypsin gewonnen und in einem Betaplate-Zähler von Wallac gezählt, um
die CPM für
die Aufnahme von [3H]-Thymidin zu bestimmen.
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Die
in Tabelle 6 dargestellten Ergebnisse sind als Mittelwert +/– Standardabweichung
von Dreifachbestimmungen der [3H]-Thymidin-Aufnahme angegeben. Es
wurden Essigsäure
(10 mM) als Kontroll-Dilutionsmittel von PDGF-BB und 0,5% DMSO als
Kontrolle der Testverbindung verwendet.
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Tabelle 5
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Mito Media
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Für 500 ml
Lösung:
250
ml | DMEM
(GIBCO BRL) |
250
ml | Hams
F-12 (GIBCO BRL) |
0,25
ml | 10
mg/ml Insulin-Stammlösung
(GIBCO BRL) für
eine Endkonzentration von 5 μg/ml |
1 ml | 10
mg/ml Transferrin-Stammlösung
(Collaborative Research, Bedford, MA) für eine Endkonzentration von
20 μg/ml |
2 ml | 4 μg/ml Selen-Stammlösung (Aldrich
Chemical, Milwaukee, WI) für
eine Endkonzentration von 5 nM |
5 ml | 10%
Rinderserumalbumin-Stammlösung
(GIBCO BRL) für
eine Endkonzentration von 0,1%. |
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Tabelle
6
Auswaschexperiment zur Untersuchung des verlängerten
Effekts von NNC92-0270 auf die mitogene Aktivität von PDGF-BB auf glatte Muskelzellen
vom Pavian.