KR19990067010A

KR19990067010A - 골결핍 상태의 치료용 조성물 및 그 치료방법

Info

Publication number: KR19990067010A
Application number: KR1019980702947A
Authority: KR
Inventors: 샤르레스 페트리에; 마크 더블유. 오메; 난드 바인더; 커크 지. 로빈스; 스코트 엠. 해리스; 마리아 콘토유아니; 로렌스 에이치. 허레이; 신 엠. 케윈; 그레고리 알. 먼디
Original assignee: 오스테오스크린, 인코포레이티드; 유니버시티 오브 텍사스 엣 오스틴; 지모제넥틱스, 인코포레이티드
Priority date: 1995-10-23
Filing date: 1996-10-23
Publication date: 1999-08-16
Also published as: CZ115398A3; AU706262B2; WO1997015308A1; HUP9802319A2; CA2235481A1; BR9611210A; AU7471096A; CN1201393A; NO981810D0; NO981810L; JP2000513324A; EP0866710A4; EA199800393A1; HUP9802319A3; PL327617A1; EP0866710A1

Abstract

하나 이상의 원자를 포함하는 링커, 또는 두 방향족계를 공유결합에 의해 1.5-15Å거리에 위치하도록 공유결합을 포함하는 것으로 정의되는 링커를 통해 공유결함으로 연결된 두 방향족 체계를 함유하는 화합물은 골결핍과 관련된 상태를 치료하는데 효과적이다. 골성장을 촉진하거나 골흡수를 저해하는 부가적인 작용제과 배합하여 또는 단독으로 상기의 화합물을 척추동물에게 투여할 수 있다. 상기 화합물을 투여하기전에, 상기 화합물이 골형태형성 단백질과 관련된 프로모터에 연결된 리포터 유전자의 전사에 미치는영향 및/또는 모델 동물체계에서 두개관의 성장을 자극하는 능력을 측정함으로써 활성에 대해 화합물을 선별할 수 있다.

Description

골결핍 상태의 치료용 조성물 및 그 치료방법

골은 정적인 조직이 아니다. 새로운 골은 생성하는 조골세포(osteoblast) 및 골을 파괴하는 골파괴세포(osteoclast)가 조절하는 복잡한 과정에서 골은 끊임없이 분해 및 재합성된다. 다수의 사이토킨(cytokine) 및 성장인자가 이들 세포의 활성을 조절하며, 현재 확인되고 클론되었다. Muddy는 이들 인자에 관련된 유포된 지식을 설명하고 있다(Muddy, G. R. Clin Orthop 324:24-28, 1996; Muddy, G. R. J Bone Miner Res 8:S505-10, 1993).

골분해와 골흡수에 영향을 미치는 인자에 관해 이용가능한 많은 정보가 있지만, 새로운 골의 생성을 자극하는 성장인자에 관한 정보는 더 제한적이다. 연구자들은 그러한 활성을 지닌 근원을 찾아왔으며, 골조직 자체가 골수세포를 자극하는 능력을 가진 인자의 창고임을 알았다. 따라서 도살장에서 얻은 소의 골조직의 추출물은 골의 구조적인 완전함을 유지하는 구조단백질뿐만 아니라, 골수세포를 자극하여 증식하게 할 수 있는 활성적인 골성장인자도 포함한다. 형질전환 성장인자β, 헤파린-결합 성장인자(산성 및 염기성 섬유아세포 성장인자), 인슐린-유사 성장인자(인슐린-유사 성장인자Ⅰ 및 인슐린-유사 성장인자Ⅱ), 및 골형태발생인자(bone morphgenetic proteins(BMPs))라 불리는 최근에 기재된 단백질군이 후자중에 있다. 이들 모든 성장인자들은 골수세포뿐만아니라 다른 형태의 세포에도 영향을 미친다. BMPs는 새로운 인자로서 확장된 형질전환 성장인자β의 수퍼패밀리(superfamily)에 속한다. Wozney등의 Science (1988) 242:1528-34에서 유전자 클로닝 기술에 의해 그것을 처음으로 확인했으며, 그 다음으로, 상기문헌보다 더 일찍 발행된 기재에 따라 탈염된 골의 추출물에서 생물학적인 활성을 특징화했다(Urist M. Science (1995) 150: 893-99). 재조합 BMP2 및 BMP4 을 쥐의 피하조직에 국부적으로 주사할 때, 그것이 새로운 골의 생성을 유도할 수 있다(Wozney J. Molec Reprod Dev (1992) 32:160-167). 정상적인 조골세포가 분화할 때 정상적인 조골세포에 의해 그 인자들이 발현어 조골세포의 분화를 자극하며, 세포내에서 골의 생성뿐만아니라 세포외에서의 골누들(nudle)생성도 자극한다(Harris S등. J. Bone Miner Res (1994) 9:855-863). 후자의 성질에 의해 골손실 결과를 초래하는 질병에 대한 치료제로서 유용성을 암시한다.

골을 생성하는 세포는 조골세포이다. 조골세포가 전구체에서 성숙한 골-생성 세포로 분화됨에 따라 다수의 효소 및 골기질의 구조단백질을 발현하여 분비하며, 이에는 유형-1 콜라겐, 오스테오칼신, 오스테오폰틴 및 알칼라인 포스포타제가 포함된다(Stein G등. Curr Opin Cell Biol (1990) 2:1018-1027; Harris S등. (1994), supra). 그들은 또한 골기질에 저장되는 다수의 성장조절 펩타이드를 합성하며, 정상적인 골생성의 원인으로 추정될 수 있을 것이다. 상기 성장조절 펩타이드에는 BMPs가 포함된다(Harris S등. (1994), supra). 태아 쥐의 두개관의(頭蓋冠, calvarial) 조골세포의 1차배양의 연구에서, 배양세포가 무기질화된(mineralized) 골누들을 생성하기 전에 BMPs 1, 2, 3, 4, 및 6을 발현한다((Harris S등. (1994), supra). 알칼라인 포스포타제, 오스테오칼신 및 오스테오폰틴과 유사하게, 배양된 조골세포가 증식하고 분화됨에 따라 BMPs를 발현한다.

BMPs가 생체내 및 생체외에서 골생성의 잠재적인 자극제이지만, 이들을 골치료를 향상시키기 위한 치료제용으로는 단점이 있다.

단백질의 수용체를 여러 조직에서 확인했으며, 매우 다양한 조직에서 특이한 시간적, 공간적 패턴으로 BMPs자체를 발현한다. 이것에 의해 BMPs가 골이외에도 여러 조직에 영향을 줄수 있음을 나타내며, 전신에 투여되었을 때, 치료제로서의 유용성을 잠재적으로 제한할 수 있음을 나타낸다. 게다가, BMPs는 펩타이드이기 때문에 주사로 투여해야 할 것이다. BMPs를 치료제로 개발하는데 이러한 단점이 심각한 제한이 된다.

과다상태는 골생성을 향상시킬 필요성을 특징으로 한다. 아마도 가장 명백한 경우는 골절이며, 골성장을 자극하여 골의 회복의 완성을 서두르는 것이 바람직할 것이다. 골생성을 향상시키는 약은 얼굴 재생과정(facial reconstruction procedure)에도 유용할 것이다. 다른 골결핍상태로는 골단편의 결함, 치근막 질병(periodontal disease), 전이성 골질병, 연골화 골질병, 및 예를 들면 상처나 연골결핍의 재생 또는 고침(healing)등과 같이 결합조직 회복이 유익한 상태가 포함된다. 또한 노년과 연관된 골다공증, 폐경기이후의 호르몬상태와 관련된 골다공증을 포함하는 골다공증의 만성적 상태는 매우 중요하다. 골성장의 필요성을 특징으로 하는 다른 상태에는 1차 및 2차 부갑상선 기능항진증, d폐용(disuse)골다공증, 당뇨병과 관련된 골다공증 및 글루코코티코이드-관련 골다공증이 포함된다. 게다가, 또는 혹은 본 발명의 화합물은 정상적인 및/또는 비정상적인 세포 또는 조직의 대사, 증식 및/또는 분화를 조절할 수도 있다.

최근에 이런 상태를 다루는 만족할만한 약학적인 접근이 없다. 깁스, 부목, 고정장치 및 다른 딱딱한 기계적인 수단만으로 여전히 골절을 치료하고 있다. 에스트로겐 또는 비스포스포네이트로 폐경기이후의 골다공증과 관련된 골악화를 감소시키거나 예방하고 있다.

미국 특허 5,280,040은 3, 4-디아릴 크로만 화합물 부류를 기재하고 있다. 이들 화합물은 2, 3, 4트리페닐 부탄올의 유도체라고 여겨질 수 있으며, 1위치에 히드록시는 부탄올의 4위치가 치환된 페닐 그룹의 오르토위치를 지닌 에테르를 형성한다. 모3, 4-디아릴 크로만은 그들의 링커 또는 방향족 성분에 질소원자를 포함하지 않는다. 바람직한 화합물, 센트크로만은 페닐 성분에 치환기중의 하나에만 질소 치환기를 가진다. 골다공증의 치료에 있어 유용한 화합물이 상기 '040특허에 기재되어 있다.

본 발명은 골결핍 상태를 제한하거나 치료 및 본 명세서에서 나타내는 분야의 전문가에게 명백한 다른 용도에 유용한 화합물을 개시하고 있다.

본 발명은 척추동물에서 골손실의 위험이 있을 때에 바람직하지 않은 골손실을 제한하고, 바람직하지 않은 골손실 또는 골성장의 필요를 특징으로 하는 상태, 골절 및 연골의 질병 치료용 조성물 및 방법에 관한 것이다. 더욱 자세하게는, 본 발명은 고완료 선별분석법(high throughput screening assay)으로 확인하고 특징화하는 특수한 부류의 조성물의 용도에 관한 것이다.

도 1 은 59-0008인 화합물에 대한 용량 반응 곡선을 나타낸다.

도 2 및 3 은 본 발명의 예시적인 화합물 및 그에 의한 생체외 실험에서 얻은 결과를 나타낸다.

본 발명을 실시하는 방법

BMP프로모터에 연결된 리포터 유전자의 발현을 자극할 수 있는 화합물에 대한 신속한 고완료선별법이 1995. 6. 2일자 미국 출원번호 08/458,434(본 명세서의 참고문헌으로 전 내용이 병합됨)에 기재되어 있다. 또한 이 분석법은 Ghosh-Choudhery, N 등의 Endocrinology (1996) 137:331-339에 무한히 생존하는(immortalized)쥐의 조골세포(T항원의 발현을 유도하는 BMPs 프로모터를 포함하는트랜스유전자(transgene)을 발현하는 쥐로부터 유래)에 대한 연구의 일부분으로서 기재되어 있다. 이 연구에서, 무한히 생존하는 세포는 쥐의 BMPs프로모터(-2736/114bp)에 의해 유도되는 루시퍼라제(luciferase)를 함유하는 플라스미드로 안정하게 세포감염되었으며, 용량-의존적인 방식으로 사람의 재조합BMPs에 반응했다.

요컨대, 골형태발생 단백질(특히 BMP2 또는 BMP4)의 프로모터가 리포터 유전자(구체적으로는 루시퍼라제)에 커플링되어 있는 구조로서 영구적 또는 일시적으로 형질전환시킨 세포를 이용하여 상기 분석법을 행한다. 그 다음 이들 형질전환된 세포에 대해 리포터 유전자의 산물의 생성을 측정한다; BMP프로모터를 활성화하는 화합물은 리포터 단백질의 생성을 유도할 것이며, 이는 쉽게 측정할 수 있다. 40,000이상의 화합물에 대해 이런 신속한 선별기술을 행했으나 불과 매우 작은 퍼센트만이 부형제(vehicle)에 의해 생성되는 양보다 5배를 초과하여 루시퍼라제를 생성할 수 있었다. BMP프로모터를 활성화하는 화합물은 불활성인 화합물에는 없는 어떤 구조적인 특징을 공유하고 있다. 활성 화합물은 골이나 연골의 성장을 촉진하는데 유용하므로 골이나 연골의 성장을 필요로 하는 척추동물의 치료에 유용하다.

특이성 및 독성을 시험하는 다양한 다른 분석법으로 BMP프로모터-활성 화합물을 조사할 수 있다. 예를 들면, 비-BMP프로모터 또는 리스판스 엘리먼트를 리포터 유전자에 연결하여 적절한 숙주세포에 삽입할 수 있다. 예를 들면, BMP프로모터-및/또는 비-BMP프로모터-리포터 유전자-함유 세포을 육안으로나 현미경으로 조사하여 세포독성을 결정할 수 있다. 혹은 세포에 의한 핵산 및/또는 단백질 합성을 조사할 수도 있다. 생체내 분석에서는, 조직을 제거하고 육안으로나 현미경으로 조사할 수 있으며, 조직학적 조사를 용이하게 하기 위하여 선택적으로 염료나 착색제를 사용하여 조사할 수도 있다. 생체내 분석법에서 결과를 측정하는데 있어서, 종래의 의약, 화학/동물모델 기술을 사용하여 시험 화합물의 생체분포를 조사하는 것도 유용하다.

본 명세서에서 사용된 것과 같이, "한정하다" 또는 "한정" 및 "치료하다" 또는 "치료"는 서로 바꿔 사용할 수 있다. 이 용어에는 골결핍 증후를 연기 및/또는 진전될 것으로 예상되거나 진전될 그러한 증후의 심각성을 감소하는 것도 포함된다. 더 나아가 상기 용어는 현존하는 골이나 연골결핍증후를 개선시키거나, 부가적인 증후를 방지하거나, 그 증후의 잠재적인 대사적 원인을 개선 또는 방지하거나, 골흡수 및/또는 골성장을 방지하거나 역전하는 것도 포함한다. 따라서 그 용어는 연골, 골 또는 골격의 결핍, 또는 이러한 결핍으로 진전될 가능성을 지닌 척추동물 환자에게 유익한 결과를 부여한다. "골결핍"이란 골흡수에 대해 골생성의 비율의 불균형을 의미하며, 이런 경우 치료하지 않으면 환자는 바람직한 것보다 더 적은 골를 가지거나, 환자의 골이 바람직한 것보다 덜 견고하고 응집성이 적을 것이다. " 연골 결함"이란 손상된 연골, 바람직한 것보다 연골이 적은 것, 연골이 바람직한 것보다 덜 견고하고 응집성이 적은 것을 의미한다.

본 발명의 화합물의 대표적인 용도는 다음과 같다: 폐쇄(closed), 개방(open) 및 위관절(僞關節, non-union)골절에서 일어나는 것과 같은 골결함 및 부족 둘 다를 회복함; 폐쇄, 개방골절로 인한 감소에서 예방제(prophylatic)용도; 성형외과에서 골고침을 촉진; 촉진하여 비접합 보철접합안으로 골의 성장 및 치과이식을 촉진; 성장결함의 치료; 치근막질병 및 결함의 치료 및 다른 치아의 회복 과정; 신연(伸延,distraction)골형성동안 골생성의 증가; 다른 골격 질환, 예를 들면 나이와 관련된 골다공증, 폐경기이후의 골다공증, 글로코코티코이드-유도 골다공증 또는 폐용골다공증 및 관절염 등의 치료. 본 발명의 화합물은 또한 선천적인, 외상으로 유도된 골 또는 외과절제수술된 골(예, 암의 치료)의 회복, 및 미용(cosmetic)수술에 유용하다. 더나아가 본 발명의 화합물을 연골결함이나 질환을 제한 또는 치료에 사용할 수 있으며, 상처치료(healing)나 조직회복에 유용할 수도 있다.

골 또는 연골 결함이나 결핍을 척추동물환자에서 어떤 구조적인, 기능적인 특성을 지닌 본 발명의 화합물을 투여함으로써 치료할 수 있다. 본 발명의 화합물을 전신으로 또는 국부적으로 투여할 수도 있다. 전신용으로는, 본 발명의 화합물을 종래의 방법에 따라 비경구용(정맥으로, 피하의, 근육내의, 복강내(intraperitoneal), 비강내 또는 경피성의(약이 혈관으로의 흡수를위한 경로로서 피부에 적용되는)) 또는 경구용(예, 입으로, 직장으로) 전달로 제제할 수 있다. 연장된 기간동안 일련의 주사 또는 연속적인 주입으로 정맥투여를 할 수 있다. 매주 매일 3번의 간격으로 주사에 의한 투여 또는 불연속적인 간격을 둔 다른 경로의 투여를 할 수 있다. 혹은 본 명세서에 기재된 화합물을 순환하는 방식으로(본 명세서에 개시된 화합물을 투여하고 그 다음 투여가 없고 본 명세서에 개시된 화합물을 투여와 같은 방식) 투여할 수 있다. 바람직한 결과가 산출될 때까지 치료를 계속할 것이다. 일반적으로, 약학 제제에는 약리적으로 허용될 수 있는 부형제, 예를 들면 염, 완충염, 5%덱스트로스 수용액, 미량금속을 함유한 붕산염 완충-함염물등이 포함된다. 더 나아가 하나이상의 부형제, 방부제, 용해제, 완충제, 유리병 표면에서의 단백질 손실을 방지하기 위한 알부민, 윤활제, 충전재, 안정제 등을 포함할 수도 있다. 제제화 방법은 본 기술분야에서 공지 및 개시되어 있다. 예를 들면 Remington의 약학, Gennaro. ed. Mack Publishing Co., Easton PA , 1990이 있으며 이들은 본 발명의 명세서에 참고문헌으로 병합되어 있다. 본 발명용의 약학 조성물은 무균이고, 발열성이 없는 액체용액이나 현탁물, 코팅된 캡슐, 좌약, 동결건조된 분말, 경피성 반창고 또는 본 분야에서 알려진 다른 형태일 수 있다. 상처나 결함위치에 주사하거나, 그 위에 고체 운반체를 부착하거나 삽입함으로써 국소 투여를 행할 수 있다. 국소투여를 위해서는, 운반체로는 성장하는 골이나 연골을 위한 기질을 제공하는 것이 바람직하며, 역효과없이 환자가 흡수할 수 있는 부형제가 더욱 바람직하다.

조절된 방출 화합물, 예를들면 출원중인 미국 특허출원번호 07/871,246(WIPO공개 WO93/20859와 일치하며, 이는 그 전문이 본 명세서의 참고문헌으로 병합되어 있다.)에 기재된 것 등을 사용함으로써 본 발명의 화합물을 상처위치로 전달을 향상시킬 수 있다. 이런 유형의 필름은 보철장치나 외과이식을 위한 코팅제로서 특히 유용하다. 예를 들면 상기 필름을 외과나사, 막대, 핀, 판 등의 외부표면에 감을 수 있다. 이런 유형의 매몰식(implantable) 장치을 정형외과수술에서 일상적으로 사용한다. 또한 상기 필름을 골충진재, 예를 들면 히드록시하파티즈 블록, 탈염된 골기질 충전물, 콜라겐기질 등을 코팅하는데 사용한다. 일반적으로, 본 명세서에 기재된 필름 또는 장치는 골절위치에서 골에 적용한다. 일반적으로 골로 매몰시키거나 표준외과방법을 사용하여 표면에 부착하여 적용한다.

상기에 언급된 중합체 및 운반체에 부가하여, 생분해 필름 및 기질에는 다른 활성 또는 불활성성분이 포함될 수도 있다. 골성장 또는 침투를 촉진하는 작용제, 예를 들면 성장인자등이 특히 중요하다. 이러한 목적에 대한 대표적인 성장인자로는 상피세포의 성장인자(EGF), 섬유아세포의 성장인자(FGF), 혈소판-유도 성장인자(PDGF), 형질전환 성장인자(TGFs), 부갑상선호르몬(PTH), leukemia 저해인자(LIF), 및 인슐린-유사 성장인자(IGFs)등이 있다. 골성장을 촉진하는 작용제로는, 예를들면, 골형태발생 단백질(미국특허번호. 4,761, 471; PCT 공개번호 WO90/11366), 오스테오게닌(osteogenin)(Sampath 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987)84:7109-13), NaF(Tencer 등의 J. Biomed. Mat. Res. (1989) 23:571-89)등이 또한 바람직하다. 생분해성 필름 또는 기질에는 칼슘설페이트, 트리칼슘 포스페이트, 히드록시아파틴, 폴리락틱 산, 폴리안하이드리드, 골 또는 피부의 콜라겐, 순수한 단백질, 세포의 기질성분등과 그들의 혼합물이 포함된다. 바람직한 기계적인, 미용적 조직이나 기질의 단면 성질을 제공하기 위하여 그러한 생분해성 물질을 비생분해성물질과 혼합하여 사용할 수도 있다.

본 발명의 화합물을 전달하는 또다른 방법으로는 ALZET 삼투압미니펌프(Alza Corp., Palo Alto, CA); Wang 등(PCT공개번호 WO 92/11366)에 개시된 지속적인 방출기질물질; Bao 등(PCT 공개번호 WO 92/03125)에 개시된 전기적으로 전하를 띠는 덱스트란 구슬; 예를 들면 Ksander 등. Ann. Surg. (1990)211(3):288-94에 개시된 콜라겐-기초한 전달체계; Beck등에 J. Bone Min. Res (1991)6(11):1257-65에 개시된 메틸셀룰로스 겔 체계; Edelman등 Biomaterials(1991)12:619-26에 개시된 아르기네이트-기초한 체계등을 사용하는 것이 포함된다.

본 분야에서 잘 알려진 것으로 골에서 지속적인, 국소적 전달을 위한 다른 방법으로는 다공성 코팅 금속보철이 포함되며, 그 내부가 치료조성물로 포화된 고체 플라스틱 막대기이다.

또한 골흡수를 저해하는 작용제와 함께 본 발명의 화합물을 사용할 수 있다. 항흡수제(antiresorption), 예를 들면 비스포스포네이트, 칼시토닌등이 이러한 목적에 바람직하다. 더욱 자세하게는, 본 명세서 개시된 화합물을 골결핍상태를 고치기에 충분한 기간동안(예, 몇 달 내지 몇 년) 투여할 수도 있다. 일단 골결핍상태가 고쳐지면, 그 상태를 유지하기 위해서 척추동물에게 항흡수 화합물을 투여할 수 있다. 혹은, 본 명세서에 개시된 화합물을 항흡수 화합물과 순환방식으로 투여할 수 있다(본 발명의 화합물, 그 다음 항흡수제, 그 다음에 본 발명의 화합물은)

부가적인 제제에서, 종래의 배합물(preparation), 예를 들면 아래에 기재된 것을 사용할 수도 있다.

수용성 현탁물은 약리적으로 허용되는 부형제와의 혼합물로서 활성성분을 포함할 수도 있으며, 메틸셀룰로스와 같은 현탁제; 및 레시틴, 리소레시틴 또는 긴사슬지방알콜등과 같은 습기제(wet agent)를 포함한다. 상기 수용성 현탁액은 또한 산업적 표준에 맞는 방부제, 색소, 향료, 및 감미료를 포함할 수도 있다.

국부적인 적용을 위한 배합물은 약리적으로 적합한 부형제에 에어졸 분사기, 로션, 겔 및 연고 등을 포함하며, 부형제에는 저급 지방족 알콜, 글리세롤과 같은 폴리글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 지방산의 에스테르, 기름 및 지방 및 실리콘을 포함할 수도 있다. 더나아가 배합물은 아스코르브산이나 토코페롤 등의 항산화제 및 파라-히드록시벤조산에스테르 등의 방부제를 포함할 수도 있다.

비경구용 배합물은 특히 무균 또는 살균된 산물을 포함한다. 활성 화함물 및 공지된 주입가능한 운반체중 어느것를 함유함으로써 주입가능한 화합물을 제공할 수 있다. 이들은 또한 삼투압 조절을 위한 염을 함유할 수도 있다.

바람직하다면, 여러 병리 상태를 치료하는데 사용되는 리포좀을 준비하는 보고된 방법중 어느것에 의해 골형성제를 리포좀에 병합할 수 있다. 본 조성물은 리포좀에 병합된 상기의 화합물을 이용하여 마크로파지, 모노사이트, 다른세포 및 리포좀을 흡수할 수 있는 조직 및 기관으로 이들 화합물을 보낸다. 리포좀에 병합된 본 발명의 화합물을 비경구적으로 투여함으로써 더 적은 양의 화합물의 효과적으로 사용할 수 있게 되었다. 또한 리간드도 병합하여 리포좀의 특이성에 더욱 초점을 마출 수 있다.

리포좀 배합물을 제조하는 적절한 종래의 방법이 이에 제한되는 것은 아니며, 다음에 기재된 것들이 포함된다 Bamgham, A. D. 등 J Mol Biol(1965) 23:238-252, Olson, F등 Biochim Biophys Acta(1979)557:9-23, Szoka, F등 Proc Natl Acad Sci USA(1978)75:4194-4198, Mayhew, E등(1984)775:169175, Kim, S등 Biochim Biophys Acta(1983)728:339:348, 및 Mayer등 Biochim Biophys Acta(1986)858:161-1688.

달걀, 식물이나 동물 출처 등의 천연 인지질, 예를 들면 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 스핑고미엘린, 포스파딜세린 또는 포스파티딜이노시톨 등을 포함하는 종래의 합성 또는 천연 인지질 리포좀물질을 섞어서 본 발명의 화합물로부터 리포좀을 만들 수 있다. 합성 인지질도 사용될 수 있으며, 디미리스토일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린 및 디스테아로일포스파티딜콜린 및 이에 상응하는 합성 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜글리세이 포함되며 이에 한정하는 것은 아니다. 콜레스테롤 또는 다른 스테롤, 콜레스테롤 헤미서시네이트, 글리코리피드, 세레브로시드, 지방산, 강글리오시드, 스핀고리피드, 1,2-비스(올레오일옥시)-3-(트리메틸 암모니오)프로판(DOTAP), N-[-(2,3-디올레로일)프로필-N,N,N-트리메틸암모니움 클로라이드(DOTMA), 및 다른 양이온 지질이 리포좀에 병합될 수 있으며, 이는 본 기술분야의 전문가에게 공지되어 있다. 리포좀에서 사용되는 인지질 및 첨가제의 상대적인 양을 바람직하도록 다양하게 할 수 있다. 바람직한 범위는 인지질의 약 60내지 90몰%이다: 콜레스테롤, 콜레스테롤헤미서시네이트, 지방산 또는 양이온 지질을 0내지 50몰%범위의 양으로 사용할 수 있다. 리포좀의 지질층에 병합된 본 발명의 화합물의 양을 지질의 농도에 따라 약 0.01 내지 약 50몰%범위로 다양하게 할 수 있다.

종래의 방법을 사용할 때, 용액상에서 본 화합물의 약 20내지 30%를 리포좀에 포획할 수 있다; 따라서 활성화합물의 약70내지 80%가 버려진다. 대조적으로, 리포좀으로 병합되는 본 발명의 화합물에 있어서는 실질적으로 모든 화합물이 리포좀으로 병합되어 필수적으로 어떤 활성 화합물도 낭비되지 않는다.

표적에 특이적인 다른 리간드나 단클론 항체을 병합함으로써 화합물의 목적표적에 더욱 특이적인 상기 배합물을 가진 리포좀을 만들 수 있다. 예를 들면, Leserman, L등 Nature(1980)288:602-604의 방법으로 리포좀에 병합된 포스파티딜에탄올아민(PE)에 연결함으로써BMP 수용체에 대한 단클론항체를 리포좀에 병합할 수 있다.

본 발명에 개시된 화합물의 수의학적 용도도 또한 예상할 수 있다. 이러한 용도에는 집에서 기르는 동물, 가축, 및 우수한 말에 있어서 골이나 연골의 결핍 또는 결함을 제한하거나 치료하는 것을 포함한다. 본 발명에서 기재된 화합물은 또한 표적 조직이나 기관환경을 변화시킴으로써 골생성세포를 필요로 하는 환경에 골생성세포를 모을수 있다.

본 발명의 화합물은 또한 생체외 또는 생체외의 실험실(ex vivo)에서 골생성세포 또는 그들의 전구체의 성장을 자극하기 위해 또는 골생성세포 전구체의 분화를 유도하기 위해 사용되기도 한다. 본 명세서에서 사용되는 것과 같이, "전구체 세포"라는 용어는 분화경로로 가는 세포를 말하는 것이나, 일반적으로는 성숙한, 완전히 분화된 세포에서와 같은 표지나 기능을 나타내지 않는 세포를 말한다. 명세서에서 사용되는 것과 같이, "간엽세포" 또는 "간엽 스템세포(mesenchymal stem cell)"이란 여러번 분열될 수 있고 그의 자손이 골격조직을 만들 수 있는 다능성(pluripotent) 선조(progenitor)세포를 말하며, 연골, 골, 건(tendon), 인대, 골수기질, 및 결합조직을 포함한다(A. Caplan J. Orthop. Res. (1991)9:641-50보기). 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "골형성세포"는 조골세포, 조골세포의 전구체세포를 포함한다. 더욱 자세하게는 개시된 화합물은 골수간엽세포를 포함하는 세포집단을 자극하여 그 세포집단에서 골형성세포수를 증가시키는데 유용하다. 바람직한 방법에서, 개시된 화합물로 자극하기 전 또는 후의 어느 하나의 경우에 혈액생성세포를 세포집단에서 제거한다. 그러한 방법으로 골형성세포가 확장된다. 확장된 골형성세포를 필요로하는 척추동물환자에게 골형성세포를 주입(또는 재주입)할 수 있다. 예를 들면, 환자자신의 간엽스템세포를 생체외에서 본발명의 화합물에 노출하여 그 결과로서 생기는 골형성세포를 환자의 내부에 원하는 위치에 주입하거나 보내며, 여기서 골형성세포가 면역거부없이 더욱 증식 및/또는 분화가 일어날 수 있다. 혹은 본 화합물에 노출된 세포집단을 사람 태아 조골세포 또는 골형성세포로서 면역할 수도 있다. 만약 그러한 세포가 척추동물환자에게 주입 또는 이식된다면, 이들 비자기(non-selssf) 세포을 "면역보호" 또는 수용자의 면역을 억제하여 이식 및 골이나 연골회복을 개선하는데 유리할 수 있다.

본 발명내에서, 조성물의 "유효량"이란 만족할 만큼 상당한 효과를 나타내는 양을 말한다. 예를 들면, 치료용으로 효과적인 양은 골절회복에서 회복속도가 임상적으로 의미있는 증가를 제공하는데 필요한 본 명세서의 활성화합물을 포함하는 조성물의 양이다; 골다공증에서 골손실의 반전; 연골의 결함 또는 질병을 반전; 골다공증의 발병의 지연 또는 방지; 골절 비결합 및 연전법(延展法) 골형성에서 골생성의 증가 및/또는 자극; 보철 장치안으로 골의 성장이 증가 및/ 또는 가속화; 및 치아 결함이 회복. 일반적인 최적화(routine optimization)기술을 사용하여 이러한 유효량을 결정할 것이며 유효량은 치료될 특수한 상태, 환자의 상태, 투여경로, 제제, 의사의 판단 및 본 기술분야의 전문가에게 명백한 다른 인자에 의존적이다. 치료와 대조그룹사이에 골량이 통계적으로 상당한 차이가 있음으로 보아 본 발명의 화합물의 필요량(예를 들면, 골다공증에서 골생성의 증가가 바람직한 경우)은 명백하다. 이러한 골량의 차이는 예를 들면 처리그룹에서 골량이 5-20%이상 증가한 것으로 알 수 있다. 치료(healing)에 있어 임상적으로 골량의 상당한 증가를 측정하는 다른 방법으로는, 예를 들면 강도 및 장력을 깨는 시험, 강도와 비틀림을 깨는 시험, 4-점 휨, 골생체검사에서 연결성의 증가 및 본 기술분야의 전문가에게 공지된 다른 생물 기계적인 시험 등이 있다. 흥미있는 질병의 동물 모델에서 수행된 실험으로부터 치료방법에 대한 일반적인 안내를 얻는다.

치료의 필요성의 심각성 및 정도, 투여화합물의 활성, 환자의 일반적인 건강 및 전문가에게 잘 알려진 다른 고려사항들에 따라 본 발명의 화합물의 용량은 다양하다. 일반적으로, 경구용 용량에 근거하여 약 0.1 mg/kg-1000mg/kg, 및 더 바람직하게는 약 1mg/kg내지 약 200mg/kg에 일반적인 사람에게 상기 화합물을 매일 투여할 수 있다. 경구용 용량의 약 20-100%가 비경구용 용량이 될 것이다.

선별법

전술한 골형태발생 단백질 관련 프로모터에 커플링된 리포터 유전자의 전사를 측정하는 방법, 또는 다음에 기재되는 다른 방법 등의 생체외 선별기술을 사용하여 본 발명의 방법에서 사용되는 화합물의 골형성 활성을 입중할 수 있다.

새로 태어난 쥐의 두개관에 대한 분석법(생체외)

이 방법은 Gowen M. & Mundy G. J Immunol(1986) 136:2478-82에 기재된 것과 유사하다. 요컨대, 출생후 4일에, ICR스위스 흰쥐새끼의 앞 및 두정부(頭頂部, parietal)의 골를 현미(顯微)해부하여 제거하고 시상봉합중에서 분리한다. 이 골을 37℃, 5% CO₂와 95%공기의 습한 분위기에서 BGJb배지(Irvine Scientific, Santa Ana, CA)에서 96시간동안 배양하며, 배지는 BGJb배지에 0.02%(또는 더 낮은 농도)β-메틸사이크로덱스트린가 첨가되어 있으며, 시험 또는 대조물질도 포함된다.

그 다음, 배양배지에서 골을 옮겨 10%완충 포르말린에 24-48시간동안 고정시키고, 1주일동안 1% EDTA에서 석회질을 제거하고, 단계가 있는(graded)알콜로 처리한 후 파라핀왁스에 매몰한다. 두개관의 3 μm 부분을 준비한다. 골생성과 골흡수를 조직형태학적으로 분석하기 위해 대표적인 부분을 선택한다. 절단되어 분리된 200μm부분에서 골의 변화를 측정한다. 그의 특징적인 형태로서 조골세포와 골파괴세포를 확인한다.

BMP가 아닌 프로모터에 의해 조절되는 시험 화합물의 효과를 결정하기 위해 다른 보조적인 분석법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 프로모터 및 루시퍼라제 리포터 유전자로서 혈청-리스판스 엘리먼트(SRE)를 특징화하는 선별법을 사용하여 미토겐의 활성을 측정할 수 있다. 더욱 자세하게는, 이들 선별법에 의해 씨-키나제 단백질 경로와 같은 SRE조절경로를 통한 신호전달은 탐지할 수 있다. 예를 들면, 조골세포 활성자(activator) SRE-루시퍼라제 선별 및 인슐린 유사SRE-루시퍼라제 선별은 상기 목적에 유용하다. 비슷하게, cAMP 리스판스 엘리먼트(CRE)-조절 경로를 자극하는 시험 화합물도 또한 분석할 수 있다. 예를 들면, cAMP증가수준을 탐지하기 위해서 CRE-루시퍼라제 screen 에 PTH 및 칼시토닌(2 골-활성제)에 대한 수용체로 세포감염된 세포를 사용할 수 있다. 따라서 이런 유형의 보조적인 분석법을 이용하여 시험 화합물에 BMP 프로모터의 특이성을 조사할 수 있다.

쥐의 두개관의 골성장에 대한 화합물의 효과를 생체내에서 분석

4-6주된, 몸무게 13-26gm, 수컷 ICR스위스 흰쥐를 한 그룹당 4-5마리로 하여 사용한다. 참조문헌으로 병합된 PCT출원번호**두개관의 골성장 분석법을 수행한다. 요컨대, 시험화합물 및 적절한 대조운반체를 정상적인 쥐의 오른쪽 두개관에 걸쳐있는 피하조직에 주입한다. 일반적으로 대조운반체는 구 운반체에서 화합물이 안정화될 수 있는 것이며, 5% DMSO를 함유하는 PBS 또는 Tween(2μl/10ml)을 함유한 PBS이다. 시험동물을 14일째 해부하여 조직형태측정법에 의해 골성장을 측정한다. 정량화를 위한 골샘플을 부가적인 조직으로부터 씻어 24-48시간동안 10%완충 포르말린에 고정시키고, 14% EDTA에 1-3주동안 탈염하고, 단계가 있는 알콜로 처리하며; 파라핀 왁스에 매몰한다. 두개관의 3내지 5μm부분을 준비하고, 골생성 및 흡수에 미치는 영향을 조직형태적 측정을 위하여 대표적인 부분을 선택한다. 디지티즈(digitized) 판위에 현미경위상을 직접 추적하는 카메라 루시다 부착(lucida attachment)를 사용하여 성분을 측정한다. 두개관에 주입된 부분 및 주입되지 않은 부분 모두에서 4 옆의 1x1mm 범위에 걸쳐서, 절단되어 분리된 200μm부분에서 골의 변화를 측정한다. 그것의 특징적인 짜여진(woven)구조로서 새로운 골을 확인하며, 특징적인 형태로 조골세포와 골파괴세포를 확인했다. 조직형태측정법의 소프트웨어(Osteomeasure, Psteometrix, Inc., Atlanta)를 사용하여 디지티지터 주입하여 둘레 또는 면적을 측정하고 세포수를 결정한다.

부가적인 생체내 분석법

완전한 동물에서 생체내 투여 분석을 이용하여 유도 화합물의 시험을 더 할 수가 있다. 기본적투여를 피하로, 복강내로 또는 입으로 투여함으로써 수행할 수도 있고, 주입, 지속적인 방출 또는 다른 전달기술을 이용하여 수행할 수도 있다. 시험화합물을 투여하는 기간을 다양하게 할 수도 있다(예를 들면, 35일 뿐만 아니라 28일도 적절할 수 있다). 전형적인 생체내 피하 투여분석법을 다음과 같이 행할 수 있다:

일반적인 연구에서, 70마리 암컷, 3달된 Sprague-Dawley쥐를 무게를 측정하고 각 그룹에 10마리씩 7그룹으로 나뉜다. 실험을 시작할 때 희생시키는 기준 대조그룹; 운반체만을 투여한 대조그룹; PBS-처리한 대조그룹; 및 골성장을 촉진하는 것으로 알려진 화합물(단백질 또는 비단백질)을 투여한 양성대조그룹이 이 이것에 포함된다. 시험될 3가지 용량수준의 화합물을 나머지 3그룹에 투여한다.

요컨대, 시험화합물, 양성대조화합물, PBS, 또는 운반체만을 35일동안 하루에 한 번씩 피하로 투여한다. 9일 동안 모든 동물에게 칼세인(calcein)을 주입하고 2일후에 희생한다(각각 지정된 날에 투여될 칼세인을 2번 주입함). 매주 몸무게를 결정한다. 35회 주기의 끝에 동물의 무게를 측정하고 안와 심장(orbital cardiac) 천자로 출혈시킨다. 혈청칼슘, 포스페이트, 오스테오칼신, 및 CBCs를 결정한다. 다리골(대퇴골과 경골) 및 요추 둘 다를 제거하여 부착된 부드러운 조직을 세척하고 측정을 위해 70%에탄올에 저장하고, 말초신경의 정량적 계산(peripheral quantative computed)단층 촬영법(pQCT; Ferretti, J. Bone(1995) 17:353S-64S), duel x-ray absorptiometry(DEXA, Laval-Jeamtet A등의 Calcif Tissue Intl(1995)56:14-18; J. Casez Bone and Mineral(1994)26:61-68) 및/또는 조직형태측정법으로 수행한다. 따라서 시험화합물이 골의 개편(remodeling)에 미치는 효과를 측정할 수 있다.

급성 난소척제된 동물에서 생체내 투여 분석법을 사용하여 유도 화합물을 또한 시험할 수 있다. 그런 방법에는 또한 대조그룹으로서 에스트로겐-처리된 그룹도 포함될 수 있다. 전형적인 피하의 투여분석법을 다음과 같이 수행할 수 있다:

일반적인 연구에서, 3달된, 암컷 Sprague-Dawley쥐 80마리를 비슷한 무게로 하여 8그룹으로 가 그룹에 10마리씩 나눈다. 시험을 시작할 때 희생시키는 기준대조그룹; 3 대조그룹(거짓으로 난소척제된(거짓 OVX)+운반체만; 난소척제된(OVX)+운반체만; PBS-처리 OVX); 및 골를 성정를 촉진하는 것으로 알려진 화합물을 투여하는 대조OVX그룹이 이에 포함된다. 시험 화합물의 3가지 용량수준을 나머지 3그룹의 OVX동물에 투여한다.

난소척제술(OVX)는 식욕항진증을 유도하기 때문에 35일 연구기간동안 내내 모든 OVX동물을 거짓OVX동물과 짝을 이루어 먹인다. 요컨대 시험화합물, 양성대조화합물, PBS 또는 운반체만을 35일 동안 하루에 한 번씩 피하로 투여한다. 혹은 시험화합물을 35일 동안 매몰식 환약으로 제제하거나, 위관영양과 같이 입으로 투여할 수도 있다. 거짓 OVX/운반체 및 OVX/운반체 그룹을 포함하는 모든 동물에 9일 동안 칼세인을 복막으로 주입하고, 2일후에 희생한다(새로 형성된 골의 적당한 표지화를 확실히 하기 위해 각 지정된 날에 투여될 칼세인을 2회 주입). 매주 몸무게를 결정한다. 35일주기의 끝에 동물의 혈액 및 조직을 전술한 대로 처리한다.

또한 만성 OVX동물(처리동물)에서 유도 화합물을 시험할 수도 있다. 동화작용제의 효능을 측정하기 위해 사용될 수 있는 난소척제된 동물에서 수립된 골손실의 처리에 대한 전형적인 방법은 다음과 같이 수행될 수 있다. 요컨대, 80-100마리 6개월된 암컷 Sprague-Dawley 쥐를 시간 0에서 거짓 수술 또는 난소척제술(OVX)의 대상으로 하고, 10마리를 기준 대조그룹으로 희생시킨다. 실험동안 몸무게를 매주 기록한다. 골소모의 약 6주후에(42일), 10 거짓OVX 및 10 OVX쥐를 임의적으로 선택하여 소모기간의 대조그룹으로 희생한다. 나머지 동물중에서, 10 거짓OVX 및 10 OVX쥐를 위약-처리 대조그룹으로 사용한다. 나머지 OVX동물을 시험약의 3내지 5용량으로 5주동안(35일) 처리한다. 양성대조그룹으로서 1 OVX그룹의 쥐를 이 모델에서 알려진 동화작용제, PTH를 작용제 처리할 수 있다(Kimmel 등의 Endocrinology(1993) 132:1577-84). 골생성에 미치는 영향을 결정하기 위해, 다음의 절차가 진행된다.

대퇴골, 결골 및 요추1 내지 4를 잘라내서 모은다. pQCT측정, 망상조직 골 미네랄밀도(BMD)(중량측정의 결정) 및 조직학을 위해 중앙 가까운 쪽의 왼쪽 및 오른쪽 경골을 사용한다. 반면에 각 경골의 중박구(midshaft)를 중추성 BMD 또는 조직학을 위한 대상으로 한다. 요추(LV)에 대해 생물 기계적인 시험을 하기에 앞서 중박구의 pQCT스캔닝 대퇴골을 준비하며, BMD(pQCT도 또한 수행할 수 있다.)를 위해 LV2를 처리하고; 탈염하지 않은 골의 조직학을 위해 LV3를 준비하고; 기계적인 시험을 위해 LV4를 처리한다.

본 발명에 유용한 화합물의 성질

본 발명의 모든 화합물은 1.5-15Å거리에 링커로서 분리된 Ar¹및 Ar²이 포함된 2 방향족체계이며, 적어도 하나의 질소원자를 포함할 수도 있다. Ar¹및 Ar²로 대표되는 두 체계에는 비-간섭 치환기를 포함할 수도 있다. Ar¹으로 대표되는 방향족 체계에서 비-간섭 치환분 및 Ar²로 대표되는 방향족 체계에서 비-간섭 치환기는 본 명세 일반식에서 R^a및 R^b로 각각 대표된다; 그러나 1Ar를 Ar¹로서, 다른 것은 Ar²로서 임의적으로 지정한다는 것을 알 수 있다. 용이한 설명을 위해, 각각을 분리하여 지정한다; 그러나 후술하는 링커는 팔린드롬(palindromic)하지 않다면 원자의 "역순"으로 화합물이 존재할 수도 있음은 분명하다. 일반적으로 비-간섭 치환기는 광범위의 것일 수 있다. 치료대상에 유익한 영향을 미치는 본 발명의 화합물을 간섭하지 않는 치환기중에는 알킬(1-6C), 바람직하게는 저급알킬(1-4C)를 포함하며, 그것의 곧은 사슬 또는 가지난 사슬을 포함하며, 알케닐(1-6C), 바람직하게는 (1-4C), 알키닐(1-6C), 바람직하게는(1-4C), 이들 모두는 곧은 사슬 또는 가지난 사슬일 수 있으며, 치환기를 더 포함할 수도 있다; F, Cl, Br, I를 포함하는 할로겐; 실옥시, OR, SR, NR₂, OOCR, COOR, NCOR, NCOOR, 및 벤조일, CF₃, OCF₃, SCF₃, N(CF₃)₂, CN, SO, SO₂R 및 SO₃R 여기서 R은 알킬(1-6C) 또는 H이다. 2 R^a또는 2 R^b치환기는 방향족 체계에서 인접한 위치에 있으며, 고리를 형성할 수도 있다. 더욱이, 이러한 가능성을 제공하기에 충분한 탄소원자 및 헤테로원자를 포함하는 치환기가 고리에 포함될 수도 있다.

바람직한 비-간섭 치환기에는 (1-6C)히드로카보닐 그룹, 포화 및 불포화, 고리 함유 히드로카보닐 그룹뿐만아니라 곧은 사슬 또는 가지 있는 히드로카보닐도 포함된다; 할로 그룹, 알콕시, 히드록시, 아미노, 모노알킬- 및 디알킬아미노, 여기서 알킬그룹은 (1-6C), CN, CF₃, COOR이다.

치환기의 R^a및 R^b수가 일반적으로 방향족 체계에서 허용가능한 위치에 의존하는 0-4 또는 0-5이고, 바람직한 실시예에서 R^a의 수가 0, 1, 2 및 R^b의 수가 0, 1, 2인 것을 포함한다.

링커그룹 L은 공유결합 또는 적어도 원자가가 2이상이며 약 1.5-15Å곧은 사슬거리에 이르는 어떠한 그룹일 수 있으며, 고리성분을 함유하거나 이러한 공간적 필요를 충족할 수 있는 것을 포함할 수 있다. 본 명세서의 정의에 의해 유용한 링커를 3개의 일반적인 범주로 나눌 수 있다: (1) 유연한(flexible) 컨주게이트되지 않은(non-conjugating) 링커, (2) 유연한, 컨주게이트 링커, (3) 유연하지 않은(유연하지 않은) 링커. 링커의 바람직한 선택은 Ar¹및 Ar²의 선택에 의존적이다. 모든 Ar¹및 Ar²의 조합에 대해 아래에 정의된 모든 링커가 적절한 것은 아니다.

본 명세서에서 정의된 것과 같이, 유연한 비-컨주게이트 링커는 Ar²의 하나의 위치에 대해 Ar¹오직 하나의 위치에 대한 것이며, Ar¹및 Ar²사이에 오직 하나의 공유결합 또는 하나의 사슬을 제공한다. 그 사슬은 가지를 포함하나, π-결합(가지에서는 제외) 또는 사이클릭 부분은 포함하지 않을 수 있다. 사슬에서 링커원자 그 자체는 단일 공유결합 주위로 자유로이 회전할 수 있으므로 링커는 자유도 2를 초과한다. 공유결합이외에도 특히 유용한 유연한 비-컨주게이트 링커는 다음 식을 갖는 것들이다: -NRCO-, -CONR-, -CR₂S-, -SCR₂-, -OCR₂-, -NRNR-, -CR₂CR₂-, -NRSO₂-, -SO₂NR-, -CR₂CO-, COCR₂-, 및 -NR-NR-CO-CR₂- 및 그의 보완물 -CR₂-CO-NR-NR-, 그들의 등배전자체. 또한 다음의 일반식도 바람직하다: -NR(CR₂)₂NR-, -O(CR₂)₂O-, -S(CR₂)₂S- 및 그들의 등배전자체를 포함한다. 이들 그룹내에서 링커의 최적선택은 Ar¹및 Ar²의 성질에 의존한다.

유연한 컨주게이트링커는 Ar²의 1위치에 대해 Ar¹의 오직 1위치를 연결하는 것이나, 적어도 하나의 이중 또는 삼중결합 및/또는 하나이상의 사이클릭 체계를 포함하므로 오직 자유도 2를 가진다. 유연한 컨주게이트 링커는 Ar¹및 Ar²사이에 완전한 컨주게이트 π-결합 연결체계를 형성하므로 Ar¹및 Ar²의 동일 평면성을 제공한다. 유용한 유연한 컨주게이트 링커의 예로는 다음이 포함된다: -RC=CR-; -N=N-; -C=C-; -RC=N-; -N=CR-; -NR-NR-CO-CR=CR-; 등, 여기서 R은 H 또는 알킬(1-6C); 바람직하게는 H 또는 저급 알킬(1-4C); 및 더욱 바람직하게는 H이다.

유연하지 않은 링커는 Ar¹및 Ar²둘다 또는 어느 하나에 대해 부착된 하나를 초과하는 위치를 가지는 것이므로 일반적으로 자유도가 오직 1만을 허용한다. 유연하지 않은 링커는 Ar¹및 Ar²를 가진 5-6원소로 이루어진 접합 사이클릭 성분을 가장 빈번하게 형성하며, 여기서 둘중 어느 하나는 링커와 두 번째 공유결합을 형성할 수 있도록 적절하게 위치한 적어도 하나의 치환기를 가지며, 예를 들면 Ar²는 반응성 오르토 위치에 치환기를 가진 페닐그룹이거나, 오르토 위치에서 링커가 직접 유도된다(비록 이런 경우에 방향족 부분이 페닐렌 또는 나프틸렌으로 적합하게 언급해야 하지만, 일반적으로 이들 부분의 1가 및 2가 형태모두를 포함하기 위해서 용어"페닐" 또는 "나프틸"을 본 명세서에서 사용한다). 특히 유용한 유연하지 않은 링커의 예는 하기의 것을 포함하고, 여기서 X는 O, N, S 또는 CR이고, Y는 CR₂또는 C=O이다.

본 발명에서 유용한 다수의 화합물이 상업적으로 허용될 수 있으며, 기술분야에서 공지된 방법으로 합성될 수 있다. 이와 비슷하게, 새로운 화합물인 본 발명의 유용한 화합물을 기술분야에서 공지된 방법으로 얻을 수 있다. 한 세트의 본 발명의 화합물에서, Ar¹은 치환되거나 치환되지 않은6개 원소로 이루어진 헤테로사이클을 포함하는 방향족 체계이며, 본 발명에서 유용한 화합물은 다음의 일반식을 가진다.

여기서 R^a는 비-간섭 치환기이고;

m은 0-4의 정수이고;

각 점선은 선택적인 π-결합을 나타내고;

각 Z는 독립적으로 N, NR, O, S, CR₂이고, 여기서 각 R은 독립적 H 또는 알킬(1-6C)이고;

X는 O, S, SO 또는 SO₂

L은 유연한 링커; 및

Ar²는 치환되거나 치환되지 않은6개 원소로 이루어진 방향족 고리이다.

실시예의 특히 바람직한 세트는 다음의 일반식을 가진다.

여기서

Ar¹은 N=NAr, MR₆COAr, COMR₆Ar, CH₂OAr, CH₂NR₆Ar로 구성된 그룹으로 부터 취한것이며, 여기서 Ar는 6개 원소로 이루어진 (비)치환된 방향족 고리이다. 이 방향족 고리에서 허용가능한 치환기는 다음을 포함한다:

할로겐, 곧은 사슬 또는 가지가 있는 사슬 저급 알킬, 알케닐 또는 알킬닐, 6개 원소로 이루어진 방향족에 의해 선택적으로 치환된, 사이클릭 알킬, 또는 사이클릭 알케닐 고리, 히드록시, 실록시, 아실록시, 곧은 사슬 또는 가지난 사슬 저급 알콕실, 벤조일, 카르보알콕시, 질소에서 저급 사슬알킬 또는 페닐로 임의로 치환된 카바모일 또는 카르복시이고;

R⁶는 수소, 또는 곧은 사슬 또는 가지난 저급 알킬 사슬로 이루어진 그룹으로 부터 선택되고;

R²및 R⁵은 H, 히드록시, 실록시, 아실록시, 할로, 시아노, 곧은 사슬 또는 가지난 사슬 저급 알킬, 또는 곧은 사슬이나 가지난 사슬 저급 알콕실로 이루어진 그룹으로부터 각각 선택된 것이고;

R³및 R⁴는 H, 할로겐, 곧은 사슬이나 가지난 사슬 저급 알킬, 알케닐, 6개 원소로 이루어진 방향족에 의해 선택적으로 치환된 알키닐, 사이클릭 알킬 또는 사이클릭 알케닐 고리, 히드록시, 시록시, 아실록시, 곧은 사슬 또는 가지 사슬 저급 알콕시, 벤조일, 카르보알콕시, 질소에서 저급사슬 알킬이나 페닐에 의해 선택적으로 치환된 카바모일 및 카르복시로 이루어진 그룹으로부터 각각 선택되고;

X 및 Y는 각각 NR₈및 N이고, 이런 경우에 X 및 Y는 단일 결합이며, 또는 각각 CR₉및 CR₁₀이며, 이 경우 X 및 Y는 이중결합이고, 여기서 R⁸은 H 또는 저급알킬중 어느 하나이고;

R⁹및 R¹⁰은 H, 할로, 및 저급 알킬로 이루어진 그룹으로부터 개별적으로 선택되고;

Z는 O, S, SO 및 SO₂또는 그들의 염화물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

상기의 일반식Ⅰ의 화합물을 다양한 방법으로 준비할 수 있다. 예를 들면,

a) 일반식Ⅱ에 티오하이드라지드 또는 유사한 티오하이드라존을 공기중에서 뜨거운 아세트산하에서 처리하며,

; 또는

b) 일반식Ⅲ의 화합물과 브롬을 반응하며,

; 또는

c) 일반식 Ⅳ인 화합물을 프로틱 용매하에서 가열하며,

; 또는

d) 일반식Ⅴ 또는 Ⅵ인 화합물을 소디움하이드라이드와 반응하며,

; 또는

e) 일반식Ⅶ의 화합물과 염기와 반응하며,

; 또는

f)일반식Ⅷ인 피리륨화합물과 적절한 뉴클레오파일과 반응한다.

여기서 R², R³, R⁴, R⁵는 위에서 정의한 것과 같으며 R은 Ar, NHAr, NHNHAr, COAr, 카보알콕시, 알콕시, NR₆COAr, CH₂OAr 및 CH₂NR₆Ar로 이루어진 그룹으로 부터 선택되고, 여기서 Ar 및 R⁶는 상기에서 설명한 것과 같고, 그 다음으로 탈보호, 커플링, 첨가, 치환 또는 제거에 의해 R, R², R³, R⁴, R⁵그룹중 어느 하나이상을 새로운 그룹 R, R², R³, R⁴, R⁵으로 선택적으로 변환시키거나; 또는 황을 산화황, 설폰으로 산화하거나; 일반식Ⅰ의 화합물을 그의 염화물로 변환시키거나 그 염화물로부터 염을 제거한다.

예:

디페닐 티오하이드라존을 재순환하는 아세트산에서 30-90분간 가열하여 벤조티오시아디아젠Ⅰ 을 제공한다.

일반식 Ⅰ인 화합물의 구체적인 예는 다음을 포함한다:

3-페닐아조-1H-4, 1, 2-벤조티아디진

2-페닐아조-2H-벤조파이란

본 발명의 방법의 용도에 적합한 다른그룹의 화합물은 다음의 일반식을 가진다:

여기서 R^a는 비-간섭 치환기이고;

n은 0 및 5인 정수이고;

L은 질소를 함유하지 않은 유연한 링커이고; 및

Ar²는 치환되거나 치환되지 않은 페닐 또는 치환되거나 치환되지 않은 나프틸이다.

이런 화합물의 그룹의 특히 바람직한 실시예는 다음의 일반식을 가진다:

여기서

R³⁵는 H, 히드록시, 알콕시, 아실록시, 및 시릴옥시로 이루어진 그룹으로 선택되고;

R³⁶은 Ar 또는 COAr중 어느 하나이고 여기서 Ar은 (비)치환된 페닐이고, 허용된 치환기는 H, 히드록시기, (비)치환된 알콕시, 아실록시, 실록시, (비)치환된 알킬, (비)치환된 알케닐, 도는 (비)치환된 알킬, 카를복시, 카보알콕시, 질소에서 저급 사슬 알킬로 선택적으로 치환된 카바모일 및 아릴로 이루어진 그룹으로 부터 선택되고;

R³⁷는 H, 히드록시, 알콕시, 할로, 아실옥시, 및 실록시로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;

R³⁸는 H, 히드록시, 알콕시, 할로, 아실옥시, 실록시, (비)치환된 알콕시, 아실옥시, 실옥시, (비)치환된 알킬, (비)치환된 알케닐, 및 (비)치환된 알키닐 또는 그들의 염화믈로 이루어진 그룹으로 부터 선택된다.

일반식 ⅩⅩⅩⅤ인 화합물은 염기 또는 산성 조건하에서 일반식 ⅩⅩⅩⅦ인 적절한 알데히드와 함께 일반식 ⅩⅩⅩⅥ의 아세토페논을 처리함으로써,

또는 알루미늄 트리클로라이드와 같은 적절한 촉매의 존재하에 일반식ⅩⅩⅩⅨ인 산할리드와 함께 일반식ⅩⅩⅩⅧ인 적절한 알킨을 처리함으로써, 준비할 수 있다.

또는 예를 들면 팔라디움 촉매와 같은 적절한 촉재의 존재하에 (E)-1,2-비스(트리-n-부틸스타닐)에틸렌 또는 일반식ⅩL인 빌닐스타난과 함께 일반식ⅩⅩⅩⅨ 인 산 할리드를 처리함으로써,

또는 강염기와 함께 일반식 ⅩLⅠ인 아세토페논을처리 함으로써 준비할 수 있다.

여기서, R³⁵, R³⁶, R³⁷, 및 R³⁸은 위에서 정의한 것과 같고, 그 다음으로 탈보호, 커플링, 첨가, 치환 또는 제거에 의해 R³⁵, R³⁶, R³⁷, 및 R³⁸그룹중 어느 하나이상을 새로운 그룹 R³⁵, R³⁶, R³⁷, 및 R³⁸로 선택적으로 변환시키고, 바람직하다면 일반식ⅩⅩⅩⅤ를 그의 염화물로 변환시키거나 그 염화물로부터 염을 제거한다.

일반식 ⅩⅩⅩⅤ인 화합물의 구체적인 예는 다음을 포함한다:

2,4-디메톡시-2′-히드록시찰콘(hydroxychalcone)

1-(2-히드록시페닐)-3-(4-메톡시페닐)프로판-

1,3-디온

1,4-디옥소-1,4-디페닐부트-2-엔

본발명에서 유용한 다른 그룹의 화함물은 다음의 식을 가지는 것이다:

여기서 R^a는 비-간섭 치환기;

n는 0 및 5의 정수이고;

L는 유연하지 않은 링커이고; 및

이러한 그룹에서 특히 바람직한 화합물은 다음의 식 Ⅸ, ⅩⅣ, 및 ⅩⅩ인 것들이다:

여기서

R¹¹및 R¹²는 H, 히드록시, C1-6알콕시, 아세틸록시, 및 C1-12(비)치환된 알킬이고;

R¹³, R¹⁴및 R¹⁷는 H, 히드록시, C1-6 곧은 사슬 또는 가지난 사슬 알콕시, 및 아세틸록시;

R¹⁵는 히드록시, (비)치환된 C1-12알콕시, C1-12알킬, (비)치환된 알킬, (비)치환된 알케닐, 및 아세틸록시로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;

R¹⁶는 H, 히드록시, (비)치환된 저급 알콕시, 아세톡시, (비)치환된 알케닐로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;

여기서 R¹¹및 R¹²는 5-7개 원소로 이루어진 (비)치환된 카보사이클 또는 헤테로사이클을 형성하고;

여기서 R¹⁵및 R¹⁶는 5-7개 원소로 이루어진 (비)치환된 카보사이클 또는 헤테로사이클 고리를 형성하고;

X¹는 카보닐 또는 CH₂중 어느 하나이고;

및 점선은 이중결합일 수 있고,

여기서, 전술한 치환그룹에서 허용가능한 치환기는 다음의 전제조건을 가지는 저급알킬, 저급 알콕시, 히드록시, 실록시, 할로, 카르복시, 및 아릴을 포함한다:

만약 X1이 카르보닐이고

만약 R¹⁵가 히드록시이고 R¹¹, R¹²또는 R¹³중 오직 하나가 히드록시이라면, 적어도 R¹⁴, R¹⁶, R¹⁷중 하나가 H이외의 것이어야 한다.;

또는 만약 R¹⁵가 알콕시이고 R¹¹, R¹², R¹³이 모두 H이라면, R¹⁷는 H나 히드록시가 아닐 수 있다;

또는 만약 R¹⁵가 (비)치환된 알콕시이고 만약 R¹¹, R¹², 및 R¹³이 모두 H만으로, 또는 H이나 1또는 2의 알콕시로 이루어지고, R¹⁷이 H이라면, R¹⁴는 H, Me, 또는 히드록시메틸이외의 것이어야 하고;

또는 만약 R¹⁵가 히드록시 도는 알콕시이고 R¹¹, R¹², R¹³모두가 H만으로 또는 H 및 1 또 2의 알콕시, 또는 H 및 단지 1 또는

또는 만약 R¹⁵가 히드록시이고 R¹¹, R¹²2 알킬, 및 R¹⁷는 C1-4알킬이라면, R¹⁴및 R¹⁶은 H이외의 것이어야 하며;, R¹³, R¹⁴및 R¹⁶모두가 H이라면, R¹⁷는 H 또는 히드록시가 아니어야 하며;

또는 만약 R¹⁵가 히드록시이고, R¹¹, R¹²및 R¹³이 모두 H만으로 되거나 H 및 1또는 2 히드록시로 이루어진다면, R¹⁴, R¹⁶, R^17은H이외의 것이어야 하며;

또는 만약 R¹⁵가 1,5디(저급)알킬C_5-10이라면, R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵, R¹⁶및 R¹⁷중 적어도 하나는 H이외의 것이어야 하며;

또는 그들의 염화물이다.

상기에 나타낸 일반식의 화합물을 다음의 방법으로 제조할 수 있으며, 여기서 아래에 나타낸 화학식 (Ⅹ)의 케톤을:

염기의 존재하에서 알킬오르토포메니트와 반응하여, 또는

피리딘의 존재하에서 에틸옥살릴 클로라이드로 반응하고, 그 다음 가수분해 및 디카르복실레일션하여, 또는

포스포러스 옥시클로라이드의 존재하에 N,N-디알킬 포름아미드와 반응하여, 또는

하이드로겐 할라이드의 존재하에 시아니드와 반응하여,

또는 일반식ⅩⅠ의 2-히드록시이소플라바노이드를 탈수함으로서 ,

또는 일반식ⅩⅡ 화합물을 촉매적 수소화를 받게 함으로써,

또는 일반식ⅩⅢ의 화합물을 처리함으로써,

적절한 벤질할라이드와 함께 유사한 페닐아세테이트의 알킬화로 부터 이용될 수 있는, 그 다음에 (PF₆)Rh(EtC₅Me₄)(C₆H₆)와 함께 환원함으로써,

여기서 그룹 R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵, R¹⁶및 R¹⁷이 위에서 정의된 것과 같고, 그 다음에 그룹R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵, R¹⁶및 R^17그룹중 어느 하나이상을 탈보호, 탈수소, 첨가, 치환, 또는 제거에 의해 새로운 그룹 R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵, R¹⁶및 R¹⁷으로 임의로 변환하고, 바람직하다면, 일반식 Ⅸ의 화합물을 그의 염화물로 변환하거나 그것의 염화물에서 염을 제거함으로써

실시예

1,3,5-트리히드록시벤젠을 이소-펜티닐 클로라이드와 반응한후, 촉매적인 수소화를 하여 산물2를 생성한다. 화합물2를 상 클로라이드3과 반응하여 케톤4를 제공한다. 0℃, 피린딘하에서 케톤4를 에틸옥실 클로라이드로 처리하여 에스테르를 제공하며, 에스테르는 소디움 카보네이트를 함유하는 수용성 아세톤에서 가수분해하여 화합물5를 생성한다. 재순환하는 톨루엔에서 가열할 때에 산5는 탈탄산되어 화합물6를 생성하며, 2,3-디클로로-5,6-디시아노-1,4-벤조퀴논으로 처리시에 이소플라카노이드7을 생성한다.

일반식 Ⅸ의 화합물의 구체적인 예는 다음을 포함한다:

텍토리게닌(tectorigenin)

로부스톤(robuston)

로부스톤 메틸 에테르

7, 2′, 4′-트리히드록시이소플라본

6, 2′,3-트리히드록시-7, 4′-디메톡시이소플라반

8, 4-디메톡시-7-히드록시이소플라본

일반식ⅩⅣ의 화합물은 다음의 구조이다:

여기서:

R¹⁸및 R¹⁹는 H, 히드록시, (비)치환된 알킬, (비)치환된 알콕시, COR²¹카르복시, 카르보알콕시, OR²², 저급 사슬 알킬 도는 페닐에 의해 질소에서 선택적으로 치환된 카르바모일, 아실옥시, 할로, 시아노 및 아자이드로 이루어진 그룹으로 부터 각각 선택되며;

R²⁰는 H, 히드록시, 할로, 저급 사슬알킬, 아실옥시 및 실옥시로 이루어진 그룹으로 부터 선택되며;

R²¹는 알킬, 알케닐, 알키닐, 아랄킬, (비)치환된 페닐, (비)치환된 나프틸, 티에닐, 퓨라닐 및 피리딜로 이루어진 그룹으로부터 선택되며;

및 R²²는 C3-6카보하이드레이트 부분으로 구성되며;

또는 그들의 염화물이다.

일반식ⅩⅥ의 산클로라이드 또는 일반식ⅩⅦ의 산 안하이드리드중 어느 하나와 함께 일반식ⅩⅤ의 일리드(ylides)를 반응함으로써,

또는 폴리포서포릭 산, 트리플로오르아세틱 안하이드리드, 또는 유사한 시약과 함께 일반식ⅩⅧ 의 산을 처리함으로써,

또는 염기 또는 산과 함께 일반식 ⅩⅨ의 칼콘을 처리한후, 2,3-디클로로-5,6-디시아노-1,4-벤조퀴논으로 처리함으로써,

여기서 그룹R¹⁸, R¹⁹, R²⁰는 상기에서와 같고, 탈보호, 커플링, 첨가, 치환, 또는 제거반응에 의해 그룹R¹⁸, R¹⁹, R²⁰중 어느 하나이상을 새로운 그룹R¹⁸, R¹⁹, R²⁰으로 임의으로 변환하고, 바람직하다면, 일반식 ⅩⅣ 의 화합물을 그의 염화합물로 변환하거나 그의 염화합물로 부터 염을 제거함으로써 일반식ⅩⅣ의 화합물을 준비할 수 있다.

일반식ⅩⅣ의 화합물의 구체적인 예는 다음이다:

5,4′-디메틸-7-아세틸플라본

7-벤조일옥시플라본

아핀 아세테이트

일반식ⅩⅩ의 화합물은 다음의 식을 가진다:

여기서

R²³, R²⁴, R²⁵, R²⁶는 H, 히드록시, (비)치환된 알콕시, 할로, 카그복실, 및 아실옥시이고 여기서 R²⁵, R²⁶과 같이, R²³및 R²⁴모두 5-7원소로 이루어진, 치환되지 않은 카르보사이클릭 또는 헤테로사이클릭 고리이고, 여기서 전술한 임의으로 치환된 그룹에서 치환기에는 저급사슬알킬, 저급사슬 알콕시, 히드록시, 실옥시, 아실옥시, 할로, 벤조일, 카르복시, 카르보알콕시, 및 저급사슬 알킬, 페닐, 티에닐, 퓨릴, 또는 피리딜로 질소에서 임의로 치환된 카르바모일을 포함한다;

Y¹는 O, -OCH₂CH₂O-, -OCH₂CH₂S-, -OCH₂CH₂CH₂S- 및 -SCH₂CH₂S-로 이루어지는 그룹으로부터 선택되며;

X²는 CH₂, O 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되며;

다음의 전제조건으로:

만약 X 및 Y가 O이고, R²⁴또는 R²⁵가 둘다 알콕시이거나, 순서대로 각각 알콕시 및 알킬이라면, R²³및 R²⁶중 적어도 하나는 H이외의 것이어야 하며,

또는 그것의 염화물이다.

THF하에서 세크-부틸 리티웁 및 테트라메틸에틸렌디아민과 함께 일반식ⅩⅩⅠ의 아미드를 반응한후, 일반식ⅩⅩⅡ의 벤잘데히드의 첨가 및 산을 첨가함으로써 일반식ⅩⅩ의 화합물을 준비할 수 있다. 촉매적인 수소화 또는 산에서 활성화된 아연으로 처리한후, 트리풀루오아세틱 안하이드리드로 탈수소함으로써, 일반식ⅩⅩⅢ의 결과로서 생기는 락톤을 환원할 수 있다.

또는 설퓨릭산, 알루미윰 트리클로라이드, 트리프루오아세틱 안하이드리드, 또는 유사한 시약과 함께 일반식ⅩⅩⅣ의 디아릴 에스테를를 처리함으로써,

여기서, R²³, R²⁴, R²⁵, R²⁶은 위에서 정의한것과 같고, 그다음으로 여기서 그룹R²³, R²⁴, R²⁵, R²⁶는상기에서와 같고, 탈보호, 커플링, 첨가, 치환, 또는 제거반응에 의해 그룹R²³, R²⁴, R²⁵, R²⁶중 어느 하나이상을 새로운 그룹R¹⁸, R¹⁹, R²⁰으로 임의로 변환하고, 바람직하다면, 일반식 ⅩⅩ의 화합물을 그의 염화합물로 변환하거나 그의 염화합물로 부터 염를 제거함으로써 일반식ⅩⅣ의 화합물을 준비할 수 있다.

일반식ⅩⅩ의 화합물의 구체적인 예는 다음을 포함한다:

3-이소프로폭시안쓰론

본 발명에서 유용한 또다른 그룹은 다음 화학식을 가진다:

여기서

R²⁷, R²⁸및 R²⁹는 각각 곧은 사슬 또는 가지난 사슬 저급 알킬이고;

R³⁰및 R³¹는 수소, 곧은 사슬이나 가지난 사슬(비)치환된 알킬, (비)치환된 방향족으로 구성된 그룹으로부터 각각 선택되며, 여기서 치환기는 할로겐, 곧은 사슬이나 가지난 사슬 저급알킬, 알케닐, 6원소로 이루어지는 방향족, 사이클릭 알킬, 또는 사이클릭 알케닐 고리에 의해 임의로 치환된 알키닐, 히드록실, 곧은 사슬 또는 가지난 사슬 알콕실, 벤조일, 카르보알콕시, 저급사슬 아킬 또는 페닐에 의해 절소에서 임의로 치환된 카바모일, 또는 카르복시이다;

R³²는 Ar, COAr, COR³³으로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 여기서 Ar는 6원소로 이루어진 방향족 고리이고, 이 고리에서 치환기는 할로겐, 곧은 사슬이나 가지난 사슬 저급 알킬, 알케닐, 6원소롤 이루어진 방향족, 사이클릭 알킬, 또는 사이클릭 알케닐 고리에 의해 임의로 치환된 알키닐, 히드록실, 곧은 사슬 또는 가지난 사슬 알콕실, 벤조일, 카르보알콕시, 저급사슬 아킬 또는 페닐에 의해 질소에서 임의로 치환된 카바모일, 또는 카르복시이다;

R³³는 수소 및 곧은 사슬이나 가지난 사슬 알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택되며;

Z²및 Z³는 CN 및 CO₂R³⁴로 이루어진 그룹으로 부터 선택되며;

R³⁴는 수소, 곧은 사슬 또는 가지난 사슬 알킬 및 (비)치환된 방향족;

또는 그것의 염화물이다.

여기서 X⁸는 NR³⁰또는 S이고, X⁹는 CR³⁰또는 N리고, X¹⁰는 NR³⁰또는 S이고, Z⁴는 CO₂H, CO₂R³⁰또는 CN이며, 산클로라이드 또는 안하이드리드와 함께 일반식ⅩⅩⅥ의 화합물을 처리함으로써 상기의 일반식ⅩⅩⅤ의 화합물을 준비할 수 있다.

또는 여기서 X¹¹는 NR³⁰또는 S이고, X¹²는 N 또는 CR³⁰이고, X¹³는 할로겐, SMe 또는 OEt이며, 아민, 설파이트 또는 에놀레이트와 함께 일반식ⅩⅩⅦ의 화합물을 반응하여,

또는 여기서 X¹⁵는 O 또는 S이며, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트 또는 카본 디설파드와 함께 일반식ⅩⅩⅧ의 화합물을 반응하여,

또는 소디움히드록시드와 함께 일반식ⅩⅩⅨ의 화합물과 반응하여,

또는 알킬토실레이트, 아릴토실레이트 또는 알킬할라이드와 함께 일반식ⅩⅩⅩ의 화합물을 반응하여,

또는 아릴이소시아니드, 디클롤이드, 포스겐, 티오페스겐 또는 3,3-비스(메틸티오)아크릴로니트릴과 함께 일반식ⅩⅩⅩⅠ의 화합물을 반응하여,

또는 여기서 X¹⁶는 O, S 또는 NH이며, 소디움 에톡시드 또는 산 클로라이드의 존재하에서 HCl 또는 산 안하이드리드의 존재하에서 HCl과 함께 일반식ⅩⅩⅩⅡ의 화합물을 반응하여,

또는 여기서 X¹⁷는 NH 또는 S이며, 산 클로라이드, 산안하이드리드 또는 HONO와 함께 일반식ⅩⅩⅩⅢ의 화합물을 반응하여,

또는 Cu(acac)₂와 함께 일반식ⅩⅩⅩⅣ의 화합물을 반응하며,

여기서 R²², R²⁸, R²⁹, R³⁰, R³¹, R³², R³³또는 R³⁴는 상기에서 정의된 것과 같고, 그다음으로 탈보호, 커플링, 첨가, 치환, 또는 제거반응에 의해 그룹R²², R²⁸, R²⁹, R³⁰, R³¹, R³², R³³또는 R³⁴중 어느 하나이상을 새로운 그룹R²², R²⁸, R²⁹, R³⁰, R³¹, R³², R³³또는 R³⁴로 임의로 변환하고, 바람직하다면, 일반식 ⅩⅩⅤ의 화합물을 그의 염화합물로 변환하거나 그의 염화합물로 부터 염를 제거함으로써 일반식ⅩⅩⅤ의 화합물을 준비할 수 있다.

일반식ⅩⅩⅤ의 화합물의 구체적인 예에는 다음이 포함된다:

3-(4-클로로페닐)-1,2,3,4-옥사트리아졸륨-5-(4-크로로페닐)아미니드:

1,3-디(4-메틸페닐)-1, 2, 3,4-테트라졸륨-5-옥시드.

다음의 실시예는 본발명을 한정하는 것이 아니라 예시하기 위한 것이다.

실시예 1

화함물 59-0008의 합성은 MacDonald, W. S등, Chem comm (1969( 392-393; Irving, H. N. N. H.등, Anal Chim Acta (1970) 49:261-266의 절차에 따라 행한다. 요컨대, 100ml 에탄올 및 50ml에 10.0g 디티존을 넣은후 18시간동안 재순환하여 가열한다. 냉각한후에 먼저 100ml물에 희석하고나서 50ml 1N NaOH에서 희석한다. 이것은6N NaOH를 첨가하여 더 중화하여 pH를 5.0으로 한다. 이 진한 보라색 혼합물을 로카베이퍼(rotavapor)에서 농축하여 어두운 침전물을 모은다. 섬광크로마토그래피(4.5x25.7 cm; EtAc/Hep(1:4); Rf0.22)로 정제한후 에탄올로 부터 재결정하여 2.15g의 mp=184-185℃인 어두운 보라색 결정을 얻는다. 1H NMR(CDCl₃)7,90(d of d,J₁=7.7, J₂=2.2, 2H),7.64(육봉, 1H), 7.49(m, 1H), 6,91(m, 2H),6.55(d, J=8.1, 1H). MS(E1) 254(47, M+), 105(26), 77[100], 51(27). HRMS(E1, M+)254.0626(calcd 254.0626182). Anal. Calcd for C₁₃H₁₀N₄S: C, 61.40; H. 3.96; N,22.03. Found: C, 61.40; H, 4.20; N, 22.06

실시예2

고완료선별법(high throughput screening)

1995. 6. 2일자 출원된 U.S 시리즈 번호. 08/458,434(본 명세서에 참고문헌으로 병합됨)에 개시된 분석체계에서 수천가지 화합물을 시험했다. 표준 양성대조구는 다음 화학식을 갖는 본 발명의 화합물인 59-0008(또한 "OS8"라고 표시한다)이다.

더욱 자세하게는, 위에서 참조한 Ghosh-Choudhury 등 Endocrinlolgy (1996) 137:331-39에 기재되어 있는 안정하게 형질전환된 골모세포 세포주인 2T3-BMP-2-LUC 세포를 사용했다. 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 1%글루타민이 포함된 10%FCS("평판 배지")인 α-MEM를 사용하여 상기 세포를 배양하여, 1주일에 한 번 1:5로 분리했다. 분석을 위해, 4% FCS를 함유하는 평판배지에서 그 세포를 재현탁하고 5X 103 세포(50μl)/세포의 농도로 마이크로티터 판에 깔아서, 24시간 동안 37℃엣서 5% CO₂하에서 배양했다. 분석을 시작하기 위해서, DMSO에서 시험화합물 또는 대조물50μl를 각웰에 2X농도로 첨가하여, 그 결과 최종부피가 100μl가 되었다. 최종 혈장농도는 2%FCS이고 최종 DMSO농도는 1%이었다. 화합물 59-0008(10μM)은 를 양성대조구로 사용했다.

처리한 세포를 24시간동안 37℃에서 5% CO2하에서 배양했다. 그런후 배지를제거하고 세포를 PBS로 세 번 세척했다. 과량의 PBS를 제거한 후에, 1X세포배양 분해시약(Promega#E153A) 의 25μl를 각웰에 첨가하여 적어도 10분간 배양하였다. 선택적으로, 이 시점에서 플레이트/샘플을 동결할 수도 있다. 루시퍼라제의 기질(Promega#E153A; Promega 루시퍼라제 분석 기질 7mg당 프로메가(Promega) 루시퍼라제 분석 완충액 10ml) 50μl를 각웰에 첨가했다. 자동식 96-웰 루미노미터로 발광도를 측정하여, 웰당 피코그햄 루시퍼라제 활성 또는 단백질 마이크로그램당 피코그램 루시퍼라제 활성으로서 나타냈다.

이러한 분석법에서, 화합물59-0008(3-페닐아조-1H-4,1,2-벤조티아디아진)은 도1에서 나타낸 것과 같이 반응도 패턴을 나타냈다. 화합물 59-0008은 약 3-10μM의 농도에서, 더욱 자세하게는 약 3μM에서 최대이므로, 약 175광방출단위(light emission unit)의 반응을 제공한다. 따라서, 다른 시험화합물을 다양한 농도에서 측정햇으며, 이들 결과를 10μM에서 59-0008에 대해 얻은 값(이값은 100으로 표준화되었다)과 비교했다. 예를 들면, 도2 및 도3에서 59-0008의 10μM보다 더 큰 활성을 나타낸 어느 시험 화합물은 결과적으로 100초과의 값을 나타낼 것이었다.

도2 및 도3에서 나타낸대로, 몇몇 화합물은 특별한 효과가 있음을 알게 되었다.

실시예 3

생체내 두개관의 골성장 데이타

재조합 사람 BMP-2의 작용에 비교하여 연골세포의 분화에 관한 영향에 대해화합물59-0008, 59-0102 및 50-0197을 분석했다. 요컨대, SV40의 큰 티-항원을 이끄는 BMP-2유전자 조절 영역을 함유하는 형질전환(transgenic)쥐의 늑골(costal)의 연골으로부터 쥐의 연골형성(chondrogenic) 세포주 클론인 TMC-23을분리하고 클로닝하였으며, 이는 Ghowh-Choudhury등 Endocrinology 137:331-39, 1996에 기재된대로 만들었다. 이들 세포는 DMEM/10%FCS에서 배양되었으며, 집합(confluence)후에 7일쯤에 T-항원을 발현했으며, 또한 아그리칸(aggrecan) (톨류딘불루 스테이닝 pH10에서) 및 유형-Ⅱ 콜라겐(면역염색법)을 생산했다.

알칼라인 포스파타제(ALP)의 활성을 측정하기 위해서, LF Bonewald등 J Biol Chem(1992) 267:8943-49의 기술을 사용했다. 요컨대, 10%FCS를 함유하는 DMEM이 있는 96-웰 마이크로티터 플이트에 TMC-23세로를 4X103세포/웰 농도로 깔았다. 2일 후에, 세포는 집합되며 10%FCS 및 다른 농도의 화합물 또는 재조합 BMP-2를 함유하는 새로운 배지로 배지를 대체했다. 2 또는 5일 추가적으로 더 배양한 후에, PBS로 플레이트를 두 번 세척하고나서 분해용액(0.05%트리톤 X-100)을 첨가했다(100μl/웰). 이런 세포를 -70℃(30분)후 37℃(30분, 흔들면서)으로 3회의 동결-해동 주기로 용해한다. 1.5 M 2-아미노-2-메틸-프로판올 완충액에서, pH 10.3에서 37℃에서, 10분간 5 mM 파라-니트로페닐 포스페이트 80μl로 세포용해물의 20개 마이크로티터를 측정했다(Sigma ALP kit, Sigma Chemical Co., St. Louis, MP). 0.5M NaOH 100μl을 첨가하여 반응을 종료했다. 샘플에서 ALP를 추정하기 위해서 405nm에서 스펙트로포토메타의 흡광도를 표준 파라-니트로페놀의 것과 비교했다. 바이오-라드 단백질 분석 키트(Bio-Rad, Hercules, CA)로 세포용해물의 단백질 함량을 결정햇다. 이를 두가지 파라미터를 사용하여 특정 활성도를 계산했다.

2일째, 운반체 대조구에 비해, 화합물59-0008(10-9M), 59-0102(10-7M) 및 59-0197(10-9M)은 각각 약 3-, 2- 및 2.5배 ALP수준이 증가했다. 운반체 대조구에 비하여, 100, 50 또는 10ng/ml에서 재조합 BMP-2는 각각 약 10-, 4-, 1.5-배 ALP수준을 유도했다.

상기로부터, 예시를 위해 본 발명의 구체적인 실시예를 명세서에서 기재했지만, 본발명의 범위 및 의도로부터 벗어나지 않고 다양한 변화가 가능하다고 여겨진다. 따라서, 본 발명을 다음에 부착된 청구범위로서 한정되는 것은아니다.

본 발명은 통상의 약으로 투여될 수 있으며, 골의 성장을 향상시키는 대사효과를 가지는 화합물을 제공한다. 이들 인자와 관련된 구성요소를 조절하는 활성을 분석함으로써 본 발명의 화합물을 확인할 수 있다. 따라서, 골조직의 성장을 자극하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이며, 이 방법이나 조성물은 활성성분으로서 그 화합물을 사용하며, 이 화합물은 두 방향족체계가 짝을 이루어 서로에 대해 약 1.5내지 15Å떨어져 위치한다. 이 연결된 체계(그들을 커플링시키는 링커를 포함하는)에는 고리 치환기이외에 적어도 하나의 질소 원자를 포함할 수도 있다.

따라서, 본 발명에서 유용한 화합물을 일반식 Ar1-링커-Ar2로 기재할 수 있으며, 여기서 Ar¹및 Ar²는 각각 독립적인 방향족 체계이고 일반식의 링커부분은 약 1.5내지 15Å떨어져 Ar¹및 Ar²에 위치한다. Ar¹, Ar²및 링커는 선택적으로 간섭하지 않는 치환기로 치환할 수 있다. 유용한 화합물에서, Ar¹, Ar²및/또는 링커중 어느 하나에서 적어도 하나의 질소원자가 존재할 수도 있으며, 어느 치환기도 독립적이다. 바람직하게는, 또한 본 발명의 화합물은 N, S, O로 이루어지는 그룹으로 부터 선택된 하나의 부가적인 헤테로원자를 포함하며, 어느 치환기도 독립적이다.

본 발명의 다른 화합물은 전하가 분리된 5개의 원소로 이루어진 고리화합물(5-membered ring, 5원환)을 특별히 포함한다.

따라서, 본 발명은 바람직한 화합물을 사용하여 골질병을 치료하는 방법 및 이러한 용도의 약학 조성물에 관한 것이다.

Claims

골성장 보충이 필요하거나 결핍된 및/또는 골흡수가 부진한 것을 특징으로 하는 상태의 척추동물을 치료하는 방법으로서 다음의 일반식 화합물의 유효량을 치료가 필요한 척추동물에 투여하는 것으로 이루어지는 치료방법.

여기서 R^a는 비-간섭(interfering) 치환기이며;

m는 0-4의 정수이며;

각각의 점선은 임의의 π결합을 나타내며;

각각 Z는 독립적으로 N, NR, O, S, CR 및 CR₂이며, 여기서 각 R는 독립적으로 H 또는 알킬(1-6C)이며;

X는 O, S, SO 또는 SO₂이며;

L는 유연한(flexible) 링커이고;

Ar²는 치환되거나 치환되지 않은 6원환 방향족 고리이다.
제 1 항에 있어서, L이 유연한 컨주게이트 링커인 방법.
제 1 항에 있어서, L이 공유결합, -N=N-, -RC=CR-, -RC=N-, -N=CR-, -NRCO-, CONR-, -CR₂O- 및 -CR₂NR-로 이루어진 그룹으로 부터 선택되며, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H 또는 알킬(1-6C)인 방법.
제 1 항에 있어서, Ar²는 다음이고

여기서 R^b가 비-간섭 치환기이고 n은 0 내지 5의 정수인 방법.
제 4 항에 있어서, Ar²가 치환되지 않은 페닐기인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 화합물이 59-0008인 방법.
약학적으로 허용될 수 있는 부형제 및 하기의 화합물을 유효량으로 포함하는 것으로 구성된, 골성장 보충이 필요하거나 결핍된 및/또는 골흡수가 부진한 것을 특징으로 하는 상태의 척추동물을 치료하는 방법에 사용되는 약학 조성물.

여기서 R^a는 비-간섭(interfering) 치환기이며;

m는 0-4의 정수이며;

각각의 점선은 임의의 π결합을 나타내며;

각각 Z는 독립적으로 N, NR, O, S, CR 및 CR₂이며, 여기서 각 R는 독립적으로 H 또는 알킬(1-6C)이며;

X는 O, S, SO 또는 SO₂이며;

L는 유연한(flexible) 링커이고;

Ar²는 치환되거나 치환되지 않은 6원환 방향족 고리이다.
제 7 항에 있어서, L은 유연한 컨주게이트 링커인 조성물.
제 7 항에 있어서, L이 공유결합, -N=N-, -RC=CR-, -RC=N-, -N=CR-, -NRCO-, CONR-,CR₂O- 및 -CR₂NR-로 이루어진 그룹으로 부터 선택되며, 여기서 R은 독립적으로 H 또는 알킬(1-6C)인 조성물.
제 7 항에 있어서, Ar²는 다음이고

여기서 Rb가 비-간섭 치환기이고 n은 0 내지 5의 정수인 조성물.
제 7 항에 있어서, Ar²가 치환되지 않은 페닐인 조성물.
제 7 항에 있어서, 상기 화합물이 59-0008인 조성물.
골성장 보충이 필요하거나 결핍된 및/또는 골흡수가 부진한 것을 특징으로 하는 상태의 척추동물을 치료하는 방법으로서 다음의 일반식 화합물의 유효량을 치료가 필요한 척추동물에 투여하는 것으로 구성되는 치료방법.

여기서 R^a는 비-간섭 치환기이며;

m는 0 및 5의 정수이며;

L는 질소가 함유되지 않은 유연한 링커이고;

Ar²는 치환되거나 치환되지 않은 페닐 또는 치환되거나 치환되지 않은 나프틸이다.
제 13 항에 있어서, R^a가 -NR₂또는 -COOR이고, 여기서 R은 H 또는 알킬(1-6C)인 방법.
제 13 항에 있어서, Ar²는 치환되거나 치환되지 않은 페닐인 방법.
제 13 항에 있어서, Ar¹및Ar²가 상이한 방법.
약학적으로 허용될 수 있는 부형제 및 하기의 화합물을 유효량으로 포함하는 것으로 구성된, 골성장 보충이 필요하거나 결핍된 및/또는 골흡수가 부진한 것을 특징으로 하는 상태의 척추동물을 치료하는 방법에 사용되는 약학 조성물.

여기서 R^a는 비-간섭 치환기이며;

m는 0 및 5인 정수이며;

L는 질소가 함유되지 않은 유연한 링커이고;

Ar²는 치환되거나 치환되지 않은 페닐 또는 치환되거나 치환되지 않은 나프틸이다
제 17 항에 있어서, R^a가 -NR₂또는 -COOR이고, 여기서 R은 H 또는 알킬(1-6C)인 조성물.
제 17 항에 있어서, Ar²는 치환되거나 치환되지 않은 페닐인 조성물.
제 17 항에 있어서, Ar¹및Ar²가 상이한 조성물.
골성장 보충이 필요하거나 결핍된 및/또는 골흡수가 부진한 것을 특징으로 하는 상태의 척추동물을 치료하는 방법으로서 다음의 일반식 화합물의 유효량을 치료가 필요한 척추동물에 투여하는 것으로 구성되는 치료방법.

여기서 R^a는 비-간섭 치환기이며;

m는 0 및 5의 정수이며;

L는 유연하지 않은(constrained) 링커이고;

Ar²는 치환되거나 치환되지 않은 페닐 또는 치환되거나 치환되지 않은 나프틸이다.
제 21 항에 있어서, R¹이 -NR₂또는 -COOR이고, 여기서 R은 H 또는 알킬(1-6C)인 방법.
제 21 항에 있어서, Ar²는 치환되거나 치환되지 않은 페닐인 방법.
약학적으로 허용될 수 있는 부형제 및 하기의 화합물을 유효량으로 포함하는 것으로 구성된, 골성장 보충이 필요하거나 결핍된 및/또는 골흡수가 부진한 것을 특징으로 하는 상태의 척추동물을 치료하는 방법에 사용되는 약학 조성물.

여기서 R^a는 비-간섭 치환기이며;

m는 0 및 5의 정수이며;

L는 유연하지 않은 링커이고;

Ar²는 치환되거나 치환되지 않은 페닐 또는 치환되거나 치환되지 않은 나프틸이다.
제 24 항에 있어서, R¹이 -NR₂또는 -COOR이고, 여기서 R은 H 또는 알킬(1-6C)인 조성물.
제 24 항에 있어서, Ar²는 치환되거나 치환되지 않은 페닐인 조성물.
제 1 항, 13 항 또는 21 항중 어느 한항에 있어서, 상기의 상태가 골다공증, 골절 또는 골결핍, 1차 또는 2차 부갑상선 기능항진증, 치근막 질병 또는 결함, 전이성 골질병, 골연화 골질병, 성형수술후의, 보철접합수술의, 또는 치아 이식후의 상태인 방법.
제 1 항, 13 항 또는 21 항중 어느 한항에 있어서, 골성장을 촉진하거나 골흡수를 저해하는 하나이상의 작용제를 상기 환자에게 투여하는 것으로 이루어진 방법.
제 28 항에 있어서, 상기 작용제가 골형태발생인자, 항골흡수제, 골형성인자, 연골-유래의 형태발생인자, 성장호르몬 및 분화인자로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 작용제인 방법.