AT9687U1 - Verwendung von lanthan bei der behandlung von knochenerkrankungen - Google Patents

Description

2 AT 009 687 U1

Kurze Beschreibung der Erfindung

Diese Erfindung betrifft die Behandlung und Vorbeugung von Knochenerkrankungen, Verfahren zum Verstärken der Knochenbildung und auch die Behandlung eines Knochenbruchs. 5

Hintergrund der Erfindung

Das ganze Leben hindurch wird alter Knochen kontinuierlich durch knochenresorbierende Osteoklasten entfernt und durch neuen Knochen, der durch Osteoblasten gebildet wird, ersetzt, io Dieser Zyklus wird als Knochenumbauzyklus (engl.: "bone remodelling cycle") bezeichnet und ist normalerweise streng reguliert, d.h. die Funktion von Osteoklasten und Osteoblasten ist so verbunden, dass in einem Gleichgewichtszustand dieselbe Knochenmenge gebildet wie resorbiert wird. 15 Der Knochenumbauzyklus findet in besonderen Bereichen auf den Oberflächen von Knochen statt. Osteoklasten, die aus geeigneten Vorläuferzellen innerhalb von Knochen gebildet werden, resorbieren Teile des Knochens; neuer Knochen wird dann durch osteoblastische Aktivität erzeugt. Osteoblasten bilden die kollagenen Vorstufen der Knochenmatrix und regulieren auch ihre Mineralisierung. Es wird angenommen, dass die dynamische Aktivität von Osteoblasten im 20 Knochenumbauzyklus durch verschiedene Faktoren, wie Hormone, Wachstumsfaktoren, körperliche Aktivität und andere Stimuli, beeinflusst wird, um den Anforderungen des Skelettwachstums und der Matrix gerecht zu werden und auch ihre Aufrechterhaltung und mechanische Funktion zu regulieren. Es wird angenommen, dass Osteoblasten Rezeptoren für das Parathormon und Östrogen aufweisen. Osteoklasten haften auf der Oberfläche von Knochen, die 25 eine Resorption erfahren, und es wird angenommen, dass sie durch eine gewisse Art von Signal aus Osteoblasten aktiviert werden.

Unregelmäßigkeiten in einer oder mehreren Stufen des Knochenumbauzyklus (z.B. wenn das Gleichgewicht zwischen Knochenbildung und Knochenresorption verloren gegangen ist) können 30 zu Störungen des Knochenumbaus oder Erkrankungen des Knochenstoffwechsels führen. Beispiele solcher Erkrankungen sind Osteoporose, Morbus Paget und Rachitis. Einige dieser Erkrankungen werden durch Überaktivität einer Hälfte des Knochenumbauzyklus verglichen mit der anderen, d.h. durch Osteoklasten oder Osteoblasten, hervorgerufen. Bei der Osteoporose besteht zum Beispiel eine relative Zunahme der osteoklastischen Aktivität, die eine Verringe-35 rung der Knochendichte und Knochenmasse verursachen kann. Osteoporose ist die häufigste der Erkrankungen des Knochenstoffwechsels und kann entweder eine primäre Erkrankung sein oder kann auf eine andere Erkrankung oder andere Erkrankungen folgen.

Osteoporose nach der Menopause ist gegenwärtig die häufigste Form von Osteoporose. Senile 40 Osteoporose befällt ältere Patienten beiderlei Geschlechts, und jüngere Individuen leiden gelegentlich an Osteoporose.

Osteoporose ist allgemein durch einen Verlust von Knochendichte gekennzeichnet. Ein Dünnerund Schwächerwerden der Knochen führt zu einer erhöhten Bruchbildung infolge eines minima-45 len Traumas. Die häufigste Bruchbildung bei Osteoporotik nach der Menopause ist die des Handgelenks und der Wirbelsäule. Senile Osteoporose ist durch eine höhere als durchschnittliche Bruchbildung des Oberschenkelknochens gekennzeichnet.

Obwohl Osteoporose als therapeutisches Ziel von sehr großem Interesse war und weiterhin ist, so macht eine enge Verknüpfung zwischen den osteoblastischen und osteoklastischen Aktivitäten des Knochenumbauzyklus den Ersatz von bereits verlorenem Knochen zu einer äußerst schwierigen Herausforderung. Folglich ergab die Erforschung der Behandlungen zur Vorbeugung oder Prophylaxe von Osteoporose (im Gegensatz zum Ersatz von bereits verlorenem Knochen) bis heute bessere Ergebnisse. 55 3 AT 009 687 U1 Östrogenmangel wurde als Hauptursache von Osteoporose nach der Menopause angesehen. Tatsächlich wurden Steroide, einschließlich Östrogen, als therapeutische Mittel verwendet (New Eng. J. Med, 303, 1195 (1980)). Aus neueren Untersuchungen wurde jedoch geschlossen, dass andere Ursachen existieren müssen (J. Clin. Invest., 77, 1487 (1986)). 5

Andere Knochenerkrankungen können durch eine Unregelmäßigkeit im Knochenumbauzyklus hervorgerufen werden, wodurch sowohl eine erhöhte Knochenresorption als auch eine erhöhte Knochenbildung stattfinden. Morbus Paget ist ein solches Beispiel. io Lanthan war auf Grund seiner Eigenschaft, mit Phosphat stabile Komplexe zu bilden, früher in der Medizin von Bedeutung. Diese Anwendung wurde bei der Behandlung von Hyperphospha-tämie durch die Verabreichung von Lanthancarbonat gezeigt. Das U.S.-Patent 5,968,976 beschreibt die Herstellung und die Verwendung in einem Arzneimittel von bestimmten Lanthancarbonathydraten für die Behandlung von Hyperphosphatämie. 15

Fernandez-Gavarron etal. (Bone and Mineral, 283-291 (1988)) berichten über Untersuchungen des Einbaus von 140Lanthan in Zahnknochen und Hydroxyapatit in vitro. Während die Tiefe der Aufnahme von geschätzten 5 bis 15 pm variierte (abhängig von den experimentellen Bedingungen), bestand der Schluss der Autoren darin, dass ein Austausch von Calcium durch Lanthan in 20 Hydroxyapatit eine erhöhte Beständigkeit gegenüber einer durch Säure ausgelösten Auflösung bereitstellen kann. Auf der Basis dieser vorgeschlagenen erhöhten Säurebeständigkeit schlagen die Autoren vor, dass die klinische Nützlichkeit von Lanthan als Zusatz beim Behandeln von Erkrankungen, wie Osteoporose, Wurzelkaries und Alveolarknochenresorption, erforscht werden könnte. 25

Vijai S. Shankar et al. (Biochemical and Biophysical Research Communications, 907-912 (1992)) berichten, dass eine extrazelluläre Anwendung von Lanthan (III) eine konzentrationsabhängige Erhöhung von cytosolischem Calcium in Osteoklasten auslöste. Die Autoren schlugen vor, dass der Calciumrezeptor von Osteoklasten auf eine Aktivierung und Inaktivierung durch 30 das dreiwertige Kation Lanthan empfindlich sein könnte.

Bernd Zimmermann et al. (European Journal of Cell Biology, 114-121 (1994)) berichten, dass Lanthan die endochondrale Mineralisierung inhibierte und die Calciumakkumulation in organoiden Kulturen mesodermaler Zellen der Extremitätenknospe verringerte. 35

Zusammenfassung der Erfindung

Wir stellten überraschenderweise fest, dass Lanthan(lll)verbindungen die Knochenbildung und Knochendichte verstärken und nützliche Wirkungen auf die Aktivität und Differenzierung von 40 Knochenzellen aufweisen.

Folglich betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Verstärken der Knochenbildung bei einem Säuger, der diese benötigt, umfassend Verabreichen einer wirksamen Menge einer Lanthanverbindung, bevorzugt Lanthan (III), an den Säuger. Gemäß einer Ausführungsform der 45 Erfindung ist der Säuger ein Mensch. Der Mensch kann Knochenverlust aufweisen oder gefährdet sein, Knochenverlust zu entwickeln. Die Erfindung zieht auch in Erwägung, dass der Mensch eine Störung des Knochenumbaus aufweist oder gefährdet ist, eine solche Störung zu entwickeln. Beispiele von Störungen des Knochenumbaus schließen Osteoporose, Morbus Paget, Osteoarthritis, rheumatoide Arthritis, Achondroplasie, Osteochodritis, Hyperparathyroi-50 dismus, Osteogenesis imperfecta, Hypophosphatasie (Rathbun), fribromatöse Läsionen, fibröse Displasie, multiples Myelom, anomalen Knochenumsatz, osteolytische Knochenerkrankung und parodontale Erkrankung ein.

In einer Ausführungsform ist die Störung des Knochenumbaus Osteoporose, einschließlich 55 primärer Osteoporose, sekundärer Osteoporose, Osteoporose nach der Menopause, Osteopo- 4 AT 009 687 U1 rose beim Mann und Steroid-induzierter Osteoporose.

Es wird auch ein Verfahren zum Verstärken der Knochenbildung bei einem Säuger, der einen Knochenverlust aufweist, der nicht aus einer Störung des Knochenumbaus resultiert, bereitge-5 stellt. Solche Knochenverluste können zum Beispiel aus einem Knochenbruch, einem Knochentrauma oder einem mit posttraumatischer Knochenchirurgie, postprothetischer Gelenkchirurgie, postplastischer Knochenchirurgie, postdentaler Chirurgie, chemotherapeutischer Knochenbehandlung oder radiotherapeutischer Knochenbehandlung in Verbindung stehenden Zustand resultieren. 10

In einer Ausführungsform der Verfahren der Erfindung ist die Lanthan(lll)verbindung aus Lanthanchlorid, Lanthancarbonat, anderen Lanthansalzen, Chelaten oder Derivaten davon, Lanthanharzen oder Lanthanabsorbenzien ausgewählt. 15 In einer weiteren Ausführungsform der Verfahren der Erfindung beträgt die wirksame Menge der Lanthan(lll)verbindung von 0,01 mg/kg/Tag bis 100 mg/kg/Tag, bevorzugt von 0,05 mg/kg/Tag bis 50 mg/kg/Tag oder von 0,1 mg/kg/Tag bis 10 mg/kg/Tag.

Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Erhöhen der Knochendichte bei einem 20 Säuger, der diese benötigt, bereit, umfassend Verabreichen einer wirksamen Menge einer Lanthan(lll)verbindung an den Säuger. Es wird auch ein Verfahren zum Stimulieren der Osteoblastendifferenzierung durch Kontaktieren der Osteoblasten mit einer wirksamen Menge einer Lanthan(lll)verbindung, wodurch die Differenzierung stimuliert wird, bereitgestellt. Noch weiter wird ein Verfahren zum Inhibieren der Osteoklastendifferenzierung durch Kontaktieren der 25 Osteoklasten mit einer wirksamen Menge einer Lanthan(lll)verbindung, wodurch die Differenzierung inhibiert wird, bereitgestellt.

In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Aktivieren der Knochenbildungsaktivität von differenzierten Osteoblasten durch Kontaktieren der Osteoblasten mit 30 einer wirksamen Menge einer Lanthan(lll)verbindung, wodurch die Knochenbildung stimuliert wird, bereit. Die Erfindung zieht auch ein Verfahren in Erwägung zum gleichzeitigen Stimulieren der Osteoblastendifferenzierung und Inhibieren der Osteoklastendifferenzierung bei einem Säuger, der eine Störung des Knochenumbaus aufweist oder gefährdet ist, eine Störung des Knochenumbaus zu entwickeln, durch Verabreichen einer wirksamen Menge einer Lan-35 than(lll)verbindung an den Säuger.

Die Erfindung zieht auch ein Verfahren zum Verstärken der Knochenbildung bei einem Säuger, der diese benötigt, durch Verabreichen einer wirksamen Menge einer Lanthan(lll)verbindung und mindestens eines knochenverstärkenden Mittels an den Säuger in Erwägung. Beispiele 40 geeigneter knochenverstärkender Mittel schließen ein synthetisches Hormon, ein natürliches Hormon, Östrogen, Calcitonin, Tamoxifen, ein Biphosphonat, ein Biphosphonat-Analogon, Vitamin D, ein Vitamin-D-Analogon, ein Mineralienergänzungsmittel, einen Statin-Arzneistoff, einen selektiven Östrogenrezeptor-Modulator und Natriumfluorid ein. 45 Die Erfindung zieht ferner die Verwendung einer Lanthanlllverbindung für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung zum Verstärken der Knochenbildung bei einem Säuger, der diese benötigt, in Erwägung. In einer Ausführungsform ist der Säuger ein Mensch, der eine Störung des Knochenumbaus aufweist oder gefährdet ist, eine solche Störung zu entwickeln. In einer weiteren Ausführungsform zieht die Erfindung ein Arzneimittel zur Behandlung oder Vor-50 beugung einer Störung des Knochenumbaus, umfassend eine Lanthan(lll)verbindung und ein knochenverstärkendes Mittel, in Erwägung.

Wir stellten auch fest, dass Lanthanverbindungen zum selektiven Inhibieren der Osteoklastendifferenzierung verwendet werden können. Bei bestimmten niedrigen Konzentrationen kann die 55 Osteoblastendifferenzierung aktiviert werden, und aus der Manifestation von einem oder beiden 5 AT 009 687 U1 dieser Phänomene kann eine erhöhte Knochenbildung resultieren.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird somit ein Verfahren zum Inhibieren der osteoklastischen Differenzierung bereitgestellt, wodurch eine Knochenerkrankung geregelt, behan-5 delt oder vorgebeugt wird, welches Verabreichen einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge einer Lanthanverbindung an einen menschlichen oder tierischen Patienten, der an einer Knochenerkrankung leidet oder dafür anfällig ist, umfasst.

Aus der Sicht einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zum Aktivieren der oste-io oblastischen Differenzierung bereitgestellt, wobei eine Knochenerkrankung geregelt, behandelt oder vorgebeugt wird, welches Verabreichen einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge einer Lanthanverbindung an einen menschlichen oder tierischen Patienten, der an einer Knochenerkrankung leidet oder dafür anfällig ist, umfasst. 15 In diesem Text soll "für eine Knochenerkrankung anfällig" eine höhere als durchschnittliche Prädisposition gegenüber der Entwicklung einer Knochenerkrankung umfassen. Beispielsweise schließen diejenigen, die für Osteoporose anfällig sind, Frauen nach der Menopause, ältere Männer (z.B. die mit einem Alter von mehr als 65) und diejenigen, die mit Arzneistoffen behandelt werden, von denen bekannt ist, dass sie Osteoporose als Nebenwirkung verursachen (z.B. 20 Steroid-induzierte Osteoporose), ein.

Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die Verwendung einer Lanthanverbindung für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem beliebigen Verfahren der Erfindung bereitgestellt. 25

Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die Verwendung einer Lanthanverbindung in einem beliebigen Verfahren der Erfindung bereitgestellt.

Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die Verwendung einer Lan-30 thanverbindung für die Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei der Diagnose einer Knochenerkrankung oder eines Knochenbruchs bereitgestellt.

Diese und andere Ausführungsformen der Erfindung werden nach der Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung und die angefügten Zeichnungen offensichtlich. Zusätzlich 35 wird hier auf verschiedene Veröffentlichungen Bezug genommen, die hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen sind.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen 40 Die Erfindung wird durch Bezugnahme auf die folgenden Zeichnungen besser verstanden, in denen:

Fig. 1 ein Balkendiagramm ist, das die kombinierten Ergebnisse der Wirkung von LA auf die Knochenresorption zeigt, wobei die Balken die relativen mittleren Mengen von CrossLaps pro 45 Osteoklast ± Std.abw. bei verschiedenen Lanthankonzentrationen wiedergeben;

Fig. 2 ein Balkendiagramm ist, das die kombinierten Ergebnisse der Wirkung von LA auf die Osteoblastendifferenzierung zeigt, wobei die Balken die relativen TRAP-5b-Aktivitäten ± Std.abw. bei verschiedenen Lanthankonzentrationen wiedergeben;

Fig. 3 ein Balkendiagramm ist, das die kombinierten Ergebnisse der Wirkung von LA auf die so Osteoblastendifferenzierung zeigt, wobei die Balken die relativen spezifischen Aktivitäten von zellulärer alkalischer Phosphatase ± Std.abw. bei verschiedenen Lanthankonzentrationen wiedergeben; und

Fig. 4 ein Balkendiagramm ist, das die kombinierten Ergebnisse der Wirkung von LA auf die Knochenbildungsaktivität reifer Osteoblasten zeigt, wobei die Balken die Calciummenge 55 (mmol/l) ± Std.abw., die nach der HCI-Extraktion aus den Knochennoduli freigesetzt wurde, bei 6 AT 009 687 U1 verschiedenen Lanthankonzentrationen wiedergeben.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung 5 Wie vorstehend erwähnt, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Verstärken der Knochenbildung bei einem Säuger, der diese benötigt, bereit, umfassend Verabreichen einer wirksamen Menge einer Lanthanverbindung, bevorzugt einer Lanthan(lll)verbindung, an den Säuger. Knochenbildung oder Osteogenese bezieht sich auf die Erzeugung von neuer Knochenmasse. Dies schließt den Prozess ein, durch den neue Knochenstruktur wächst oder die io Dichte von vorhandenem Knochen erhöht wird. Osteoblasten bilden Knochen, indem sie extrazelluläre organische Matrix oder Osteoid bilden und dann die Matrix mineralisieren, um Knochen zu bilden. Die hauptsächliche mineralische Komponente des Knochens ist kristalliner Hydroxyapetit, der viel von der Masse eines normalen ausgewachsenen Knochens stellt. Wir stellten überraschenderweise fest, dass Lanthan die Knochenbildung in vitro und in vivo signifi-15 kant verstärkt. Eine verstärkte Knochenbildung in vitro wurde beobachtet, wenn Lanthan (III) mit Konzentrationen von 100 bis 15000 ng/ml zu Kulturen reifer Osteoblasten in vitro gegeben wurde. Eine verstärkte Knochenbildung wurde durch Messen der Calciummenge, die in durch die Osteoblasten gebildeten Knochennoduli eingebaut wurde, quantitativ bestimmt. 20 Wir stellten auch fest, dass Lanthan (III) die Knochenbildung in wachsenden Hunden verstärkte. Eine Dosis von 2000 mg/kg/Tag Lanthan verstärkte die Knochenbildung und erzeugte, verglichen mit Kontrolltieren, eine signifikante Zunahme des Knochenvolumens und der Knochendichte. 25 Lanthan(lll)verbindungen können in den Verfahren der Erfindung verwendet werden, um die Knochenbildung bei einer Reihe von Säugern, einschließlich Haustiere, wie Schweine, Rinder, Pferde, Schafe und Ziegen, und auch einschließlich Heimtiere und Versuchstiere, wie Hunde, Katzen und Nager, zu verstärken. 30 In einer Ausführungsform der Erfindung ist der Säuger ein Mensch, der eine verstärkte Knochenbildung benötigt. In einer Ausführungsform weist der Mensch, der sie benötigt, einen Knochenverlust auf, was bedeutet, dass sie weniger Knochen als wünschenswert aufweist oder dass der Knochen weniger dicht oder stark als gewünscht ist. Ein Knochenverlust kann lokalisiert sein, wie der durch einen Knochenbruch hervorgerufene, oder systemisch sein, wie der 35 durch Osteoporose verursachte. Knochenverluste können aus einer Störung des Knochenumbaus resultieren, wodurch das Gleichgewicht zwischen Knochenbildung und Knochenresorption verschoben ist, was zu einem Knochenverlust führt.

Beispiele solcher Störungen des Knochenumbaus schließen Osteoporose, Morbus Paget, 40 Osteoarthritis, rheumatoide Arthritis, Achondroplasie, Osteochodritis, Hyperparathyroidismus, Osteogenesis imperfecta, Hypophosphatasie (Rathbun), fribromatöse Läsionen, fibröse Displa-sie, multiples Myelom, anomalen Knochenumsatz, osteolytische Knochenerkrankung und paro-dontale Erkrankung ein. Störungen des Knochenumbaus schließen Erkrankungen des Knochenstoffwechsels, die durch Störungen der organischen Matrix, der Knochenmineralisierung, 45 des Knochenumbaus, endokriner Faktoren, der Ernährungsfaktoren und anderer Faktoren, welche die Skelett- und Mineralhomöostase regulieren, gekennzeichnet sind, ein. Solche Erkrankungen können hereditär oder erworben sein und sind im Allgemeinen systemisch, was das gesamte Skelettsystem beeinträchtigt. so Somit kann in einer Ausführungsform der Mensch eine Störung des Knochenumbaus aufweisen. Knochenumbau, wie hier verwendet, bezieht sich auf den Prozess, wodurch durch einen kontinuierlichen Umsatz von Knochenmatrix und Mineral, der die Knochenresorption durch Osteoklasten und die Knochenbildung durch Osteoblasten umfasst, alter Knochen entfernt und neuer Knochen gebildet wird. 55 7 AT 009 687 U1

Osteoporose ist eine häufige Störung des Knochenumbaus, die durch eine Abnahme der Knochendichte von normal mineralisiertem Knochen gekennzeichnet ist, was zu einem Dünnerwerden und einer erhöhten Porosität von Knochenkortizes und Knochentrabekeln führt. Die durch Osteoporose verursachte Skelettbrüchigkeit macht die Patienten für Knochenschmerzen und 5 ein erhöhtes Vorkommen von Brüchen anfällig. Fortschreitender Knochenverlust kann bei dieser Krankheit zu einem Verlust von bis zu 50 % der ursprünglichen Skelettmasse führen.

Primäre Osteoporose schließt idiopathische Osteoporose, die bei Kindern oder jungen Erwachsenen mit normaler Gonadenfunktion vorkommt, Osteoporose Typ I, auch als Osteoporose io nach der Menopause beschrieben, und Osteoporose Typ II, senile Osteoporose, die hauptsächlich bei den Personen vorkommt, die ein Alter von mehr als 70 Jahren aufweisen, ein. Die Ursachen einer sekundären Osteoporose können endokrin sein (z.B. Glucocorticoidüberschuss, Hyperparathyreoidismus, Hypoganodismus), durch Arzneistoffe (z.B. Corticosteroid, Heparin, Tabak) ausgelöst sein und sonstige (z.B. chronisches Nierenversagen, Lebererkrankung und 15 Osteoporose durch Malabsorptionssyndrom) sein.

Der Ausdruck "gefährdet sein, Knochenverlust zu entwickeln", wie hier verwendet, soll Säuger und Menschen umfassen, die eine höhere als durchschnittliche Prädisposition für die Entwicklung eines Knochenverlusts aufweisen. Beispielsweise schließen diejenigen, die für Osteoporo-20 se anfällig sind, Frauen nach der Menopause, ältere Männer (z.B. die mit einem Alter von mehr als 65) und diejenigen, die mit Arzneistoffen behandelt werden, von denen bekannt ist, dass sie Osteoporose als Nebenwirkung verursachen (z.B. Steroid-induzierte Osteoporose), ein. Bestimmte Faktoren sind in dem Fachgebiet bekannt und können zur Identifizierung von denen, die gefährdet sind, auf Grund von Störungen des Knochenumbaus, wie Osteoporose, einen 25 Knochenverlust zu entwickeln, verwendet werden. Wichtige Faktoren schließen eine geringe Knochenmasse, die Familiengeschichte, den Lebensstil, einen Östrogen- oder Androgenmangel und ein negatives Calciumgleichgewicht ein. Frauen nach der Menopause sind besonders gefährdet Osteoporose zu entwickeln. Nachstehend sollen Bezugnahmen auf die Behandlung von Knochenerkrankungen die Regelung und/oder Prophylaxe einschließen, außer wenn der 30 Kontext etwas anderes fordert.

Die Verfahren der Erfindung können auch verwendet werden, um die Knochenbildung bei Zuständen zu verstärken, bei denen ein Knochenverlust durch andere Faktoren als Störungen des Knochenumbaus verursacht wird. Solche Knochenverluste schließen Brüche, ein Knochen-35 trauma, mit posttraumatischer Knochenchirurgie, postprothetischer Gelenkchirurgie, postplastischer Knochenchirurgie, postdentaler Chirurgie, Chemotherapie von Knochen, postdentaler Chirurgie und Radiotherapie von Knochen in Verbindung stehende Zustände ein. Brüche schließen alle Typen von mikroskopischen und makroskopischen Brüchen ein. 40 Beispiele von Brüchen schließen Abrissbruch, Trümmerbruch, Querbruch, Schrägbruch, Spiralbruch, Segmentbruch, dislozierten Bruch, Stauchungsbruch, Grünholzbruch, Wulstbruch, Ermüdungsbruch, intraartikulären Bruch (Epiphysenbruch), geschlossenen Bruch (einfachen Bruch), offenen Bruch (komplizierten Bruch) und okkulten Bruch ein. 45 Wie vorstehend erwähnt, können viele verschiedene Knochenerkrankungen, zum Beispiel alle die Knochenerkrankungen, die mit dem Knochenumbauzyklus verbunden sind, gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden. Beispiele solcher Erkrankungen schließen alle Formen von Osteoporose, Osteomalazie, Rachitis und Morbus Paget ein. Osteoporose, besonders vom Typ nach der Menopause, Typ beim Mann und Steroid-induzierten Typ, ist von besonderer so Bedeutung. Zusätzlich finden Lanthanverbindungen als Antiresorptionsmittel, im Allgemeinen als Mittel zur Knochenförderung und als Knochenanabolika, Verwendung. Solche Verwendungen bilden eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.

Wir stellten überraschenderweise fest, dass Lanthan die Osteoblastendifferenzierung stimuliert. 55 Die Osteoblastendifferenzierung wurde in Kulturen von Knochenmark in vitro gemessen, das 8 AT 009 687 U1 von Osteovorläuferzellen abgeleitet wurde, die zum Proliferieren und Differenzieren zu reifen Osteoblasten, die mineralisierte Knochennoduli bilden können, in der Lage sind. Die Differenzierung wurde durch die Bestimmung der spezifischen Aktivitäten von intrazellulärer alkalischer Phosphatase gemessen. Es wurde festgestellt, dass niedrige Dosen von Lanthan (100 ng/ml) die Osteoblastendifferenzierung stimulieren.

Wir stellten auch überraschenderweise fest, dass Lanthan die Osteoklastendifferenzierung in vitro inhibiert, was durch eine Abnahme von TRAP-(Tartrat-resistente saure Phosphatase)-positiven, mehrkernigen Zellen in einer Kultur von Mäuseknochenmark, verglichen mit Kontroll-kulturen, gemessen wurde. Bei vielen Störungen des Knochenumbaus, einschließlich Osteoporose, kann der Knochenverlust auf eine übermäßige Knochenresorption durch differenzierte Osteoklasten zurückgeführt werden. Die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung können verwendet werden, um die Osteoklastendifferenzierung zu inhibieren und somit die Knochenresorption zu inhibieren. Eine gewisse Inhibierung der Knochenresorption wurde in vitro festgestellt.

Es wurde somit festgestellt, dass niedrige Dosen von Lanthan sowohl die Knochenbildung verstärken als auch die Osteoblastendifferenzierung stimulieren und auch die Osteoklastendifferenzierung und Knochenresorption inhibieren.

Eine Reihe von Lanthanverbindungen, bevorzugt Lanthan (III) in einer Form, die bioverfügbar ist, kann in den Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung verwendet werden. Bevorzugte Lanthanverbindungen schließen zum Beispiel Lanthansalze und Derivate davon, Lanthanharze und Lanthanabsorbenzien ein. Das Lanthan kann, falls gewünscht, in Form eines Chelats vorliegen. Beispiele von geeigneten Lanthansalzen schließen Lanthancarbonat, Lanthancarbonathydrat und Lanthanchlorid ein.

Eine zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung wirksame Lanthanmenge ist die Menge einer Lanthan(lll)verbindung, die nach der Verabreichung gemäß dem vorgeschriebenen Schema den gewünschten Nutzen oder die gewünschte therapeutische Wirkung bereitstellt. Nichteinschränkende Beispiele einer wirksamen Lanthanmenge können im Bereich von etwa 0,01 mg/kg/Tag bis etwa 100 mg/kg/Tag, bevorzugt von etwa 0,05 mg/kg/Tag bis etwa 50 mg/kg/Tag und stärker bevorzugt von etwa 0,1 mg/kg/Tag bis etwa 10 mg/kg/Tag liegen.

Die Dosis kann auch so ausgewählt werden, dass eine wirksame Konzentration von Lanthan im Plasma bereitgestellt wird.

Beispiele einer wirksamen Konzentration von Lanthankonzentration im Plasma können im Bereich von etwa 0,1 ng/ml bis etwa 1000 ng/ml, bevorzugt von etwa 1 ng/ml bis etwa 500 ng/ml, stärker bevorzugt von etwa 1 ng/ml bis etwa 100 ng/ml liegen.

Die Dosis kann ferner so ausgewählt werden, dass eine wirksame Konzentration von Lanthan in und in der Nähe der Knochenoberfläche bereitgestellt wird.

Beispiele von wirksamen Mengen in und in der Nähe von wesentlichen Knochenoberflächen können im Bereich von 0,1 pg/g bis 500 pg/g, bevorzugt von 0,5 pg/g bis 100 pg/g, stärker bevorzugt von 1 pg/g bis 25 pg/g liegen.

Der Begriff "Lanthanverbindung" wird hier verwendet, um eine beliebige pharmakologisch verträgliche Lanthanverbindung, die sicherstellen kann, dass das Lanthan bioverfügbar ist, zu bezeichnen. Bevorzugte Verbindungen schließen zum Beispiel Lanthansalze und Derivate davon, Lanthanharze und Lanthanabsorbenzien ein. Das Lanthan kann, falls gewünscht, in Form eines Chelats vorliegen. Nachstehend wird die Erfindung mit spezieller Bezugnahme auf bestimmte Lanthansalze und Derivate beschrieben. 9 AT 009 687 U1

Die Lanthanverbindungen der Erfindung können in Form eines Arzneimittels, umfassend den Wirkstoff im Gemisch oder in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel, verabreicht werden. Der Wirkstoff kann in einer Zusammensetzung formuliert werden, die zur Verabreichung auf einem beliebigen günstigen Weg, z.B. oral (einschließ-5 lieh sublingual), topisch, parenteral (einschließlich intravenöser, intramuskulärer, intraperitonealer und subkutaner Verabreichung) und rektal, geeignet ist, wobei die orale Verabreichung bevorzugt ist. Es sollte jedoch selbstverständlich sein, dass die Erfindung alle Verabreichungsformen, die das Lanthan systematisch oder lokal verfügbar machen, umfasst. Oral verabreichbare Zusammensetzungen können, falls gewünscht, einen oder mehrere physiologisch kompa-io tible Träger und/oder Exzipienten enthalten und können fest oder flüssig sein. Die Zusammensetzungen können jede günstige Form, einschließlich zum Beispiel Tabletten, überzogener Tabletten, Kapseln, Pastillen, wässriger oder öliger Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirupe, Elixiere und Trockenprodukte, die zur Rekonstitution mit Wasser oder einem anderen geeigneten flüssigen Vehikel vor der Verwendung geeignet sind, annehmen. Die Zusammen-15 Setzungen können vorteilhafterweise in einer Dosierungseinheitsform hergestellt werden. Tabletten und Kapseln gemäß der Erfindung können, falls gewünscht, herkömmliche Bestandteile, wie Bindemittel, zum Beispiel Sirup, Gummi arabicum, Gelatine, Sorbit, Tragant oder Polyvinyl-pyrrolidon; Füllstoffe, zum Beispiel Lactose, Zucker, Maisstärke, Calciumphosphat, Sorbit oder Glycin; Gleitmittel, zum Beispiel Magnesiumstearat, Talk, Polyethylenglycol oder Siliciumdioxid; 20 Sprengmittel, zum Beispiel Kartoffelstärke; oder verträgliche Netzmittel, wie Natriumlaurylsulfat, enthalten. Tabletten können gemäß Verfahren, die in dem Fachgebiet bekannt sind, überzogen werden.

Flüssige Zusammensetzungen können herkömmliche Zusätze, wie Suspendiermittel, zum 25 Beispiel Sorbitsirup, Methylcellulose, Glucose/Zuckersirup, Gelatine, Hydroxymethylcellulose, Carboxymethylcellulose, Aluminiumstearatgel oder gehärtete Speisefette; Emulgiermittel, zum Beispiel Lecithin, Sorbitanmonooleat oder Gummi arabicum; nichtwässrige Vehikel, die Speiseöle einschließen können, zum Beispiel pflanzliche Öle, wie Erdnussöl, Mandelöl, fraktioniertes Kokosnussöl oder Fischleberöle; ölige Ester, wie Polysorbat 80; Propylenglycol oder Ethylalko-30 hol; und Konservierungsmittel, zum Beispiel Methyl- oder Propyl-p-hydroxybenzoate oder Sorbinsäure, enthalten. Flüssige Zusammensetzungen können geeigneterweise zum Beispiel in Gelatine verkapselt sein, wobei sich ein Produkt in einer Dosierungseinheitsform ergibt.

Formulierungen zur oralen Verabreichung können in einer Formulierung mit verzögerter Frei-35 Setzung formuliert werden, so dass das Lanthan an den Dickdarm abgegeben wird. Dies verringert die Wechselwirkung von Lanthan mit Phosphat in der Nahrung, was zur Fällung von Lanthanphosphat führt, das durch den Darm schlecht absorbiert wird. Formulierungen mit verzögerter Freisetzung sind in dem Fachgebiet bekannt und schließen zum Beispiel Kapseln mit verzögerter Freisetzung oder Zeitpillen, Kapseln mit osmotischer Abgabe etc. ein. 40

Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung können unter Verwendung eines injizierbaren, flüssigen Trägers, wie steriles, pyrogenfreies Wasser, steriles, peroxidfreies Ethyloleat, wasserfreier Alkohol oder Propylenglycol oder eines Gemisches aus wasserfreiem Alko-hol/Propylenglycol, formuliert werden und können intravenös, intraperitoneal, subkutan oder 45 intramuskulär injiziert werden.

Zusammensetzungen zur rektalen Verabreichung können unter Verwendung eines herkömmlichen Suppositoriengrundstoffs, wie Kakaobutter oder eines anderen Glycerids, formuliert werden. 50

Zusammensetzungen zur topischen Verabreichung schließen Salben, Cremes, Gele, Lotionen, Shampoos, Tinkturen, Pulver (einschließlich Spraypulver), Scheidenzäpfchen, Tampons, Sprays, Tauchbäder, Aerosole, Aufgüsse und Tropfen ein. Der Wirkstoff kann zum Beispiel in einem hydrophilen oder hydrophoben Grundstoff, wie geeignet, formuliert werden. 55 10 AT 009 687 U1

Es kann vorteilhaft sein, ein Antioxidationsmittel, zum Beispiel Ascorbinsäure, butyliertes Hydro-xyanisol oder Hydrochinon, in die Zusammensetzungen der Erfindung einzubringen, um ihre Lagerfähigkeit zu verbessern. 5 Die Verabreichung in dieser Erfindung kann aus einem oder mehreren Zyklen bestehen; während dieser Zyklen treten eine oder mehrere Perioden osteoklastischer und osteoblastischer Aktivität sowie eine oder mehrere Perioden, in denen weder osteoklastische noch osteoblasti-sche Aktivität stattfindet, auf. io In einer anderen Ausführungsform kann die Verabreichung in einem kontinuierlichen Schema durchgeführt werden; ein solches Schema kann ein Langzeitschema, z.B. ein permanentes Schema, sein.

Es ist selbstverständlich, dass die Dosierungen der Zusammensetzungen und die Dauer der 15 Verabreichung gemäß der Erfindung abhängig von den Erfordernissen des besonderen Patienten variieren. Das genaue Dosierungsschema wird von dem behandelnden Arzt oder Tierarzt bestimmt, der unter anderem Faktoren, wie Körpergewicht, Alter und Symptome (falls vorhanden), berücksichtigt. Die Zusammensetzungen können, falls gewünscht, einen oder mehrere weitere Wirkstoffe enthalten. 20 Während des Dosierungsschemas kann die Verabreichung einmal oder mehrmals pro Tag, zum Beispiel einmal, zweimal, dreimal oder viermal pro Tag, durchgeführt werden.

Falls gewünscht, kann die Lanthanverbindung gleichzeitig oder nacheinander mit anderen 25 Wirkstoffen verabreicht werden. Diese Wirkstoffe können zum Beispiel andere Medikamente oder Zusammensetzungen, die mit dem Knochenumbauzyklus wechselwirken können und/oder die bei einer Bruchheilung von Nutzen sind, einschließen. Solche Medikamente oder Zusammensetzungen können zum Beispiel die bei der Behandlung von Osteoarthritis oder Osteoporose verwendbaren sein. 30

Knochenverstärkende Mittel, von denen in dem Fachgebiet bekannt ist, dass sie die Knochenbildung, Knochendichte oder Knochenmineralisierung erhöhen oder der Knochenresorption verhindern, können in den Verfahren und Arzneimitteln der Erfindung verwendet werden. Geeignete knochenverstärkende Mittel schließen natürliche oder synthetische Hormone, wie Ös-35 trogene, Androgene, Calcitonin, Prostaglandine und Parathormon; Wachstumsfaktoren, wie aus Blutplättchen gewonnenen Wachstumsfaktor, Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor, transformierenden Wachstumsfaktor, epidermalen Wachstumsfaktor, Bindegewebswachstumsfaktor und Fibroblastenwachstumsfaktor; Vitamine, besonders Vitamin D; Mineralien, wie Calcium, Aluminium, Strontium und Fluorid; Statin-Arzneistoffe, einschließlich Pravastatin, Fluvastatin, Sim-40 vastatin, Lovastatin und Atorvastatin; Agonisten oder Antagonisten von Rezeptoren auf der Oberfläche von Osteoblasten und Osteoklasten, einschließlich Parathormonrezeptoren, Östrogenrezeptoren und Prostaglandinrezeptoren; Biphosphonate und Knochenanabolika ein.

Die Figuren 1 bis 4 zeigen die Wirkung des Lanthan(lll)-ions auf die Knochenresorption, Oste-45 oklastendifferenzierung, Osteoblastendifferenzierung beziehungsweise Knochenbildung.

Die folgenden nichteinschränkenden Beispiele, welche die Wirkung einer Lanthan(lll)-ion-enthaltenden Lösung in Knochenkulturassays in vitro und in einer in vivo Untersuchung beschreiben, veranschaulichen die vorliegende Erfindung. 50

Beispiel 1 Knochen resorptionsassay in vitro Testsubstanz 55 Die Testsubstanz war Lanthancarbonatetetrahydrat (nachstehend Lanthancarbonat). 1 mg 11 AT 009 687 U1

Lanthan entspricht 1,9077 mg Lanthancarbonat. Lanthancarbonat wurde in 2 M HCl gelöst, wobei sich eine Konzentration von 28,6 mg/ml (d.h. 15 mg/ml Lanthan) ergab. Aliquote Teile dieser Stammlösung wurden mit 2 M HCl verdünnt, was zu Lösungen mit verschiedenen Konzentrationen führte, so dass die Zugabe von 1 pl dieser Lösungen zu dem Kulturmedium die 5 Testendkonzentrationen von 100, 500, 1000, 5000 und 15000 ng/ml Lanthan in dem Kulturmedium ergab. Diese Lösungen/Konzentrationen werden nachstehend als LA 100, LA 500, LA 1000, LA 5000 und LA 15000 bezeichnet.

Kontrollsubstanzen 10

Wir verwendeten in den jeweiligen Assays Kontrollgruppen, um zu zeigen, dass die Assays die Wirkung der Inhibierung (Knochenresorptionsassay und Osteoklastendifferenzierungsassay) oder Aktivierung (Osteoblastendifferenzierung und Knochenbildung) nachweisen können. Die verwendeten Kontrollsubstanzen waren: 15

Bafilomycin A1 (in dem Knochenresorptionsassay) 17-ß-Östradiol (in dem Osteoblastendifferenzierungsassay und Knochenbildungsassay)

In dem Osteoklastendifferenzierungsassay enthielt die Kontrollgruppe kein Vitamin D. 20

Das Verfahren der Osteoklastenkultur auf Knochenscheiben wurde ursprünglich von Boyde et af. (1984) und von Chambers et al. (1984) beschrieben. Zur Zellkultur verwendeten wir ein zu den ursprünglichen Verfahren leicht modifiziertes Verfahren (Lakkakorpi et al. 1989, Lakkakorpi und Väänänen, 1991). Die Geschwindigkeit der Knochenresorption in den Kulturen wurde ur-25 sprünglich durch Zählen der Zahl von Resorptionsgruben auf jeder Knochen- oder Dentinscheibe unter Verwendung eines Mikroskops mit Phasenkontrastobjektiven bestimmt (Sundquist et al. 1990). Später wurden die Gruben unter Verwendung des Lectins Weizenkeimagglutinin, das spezifisch an den resorbierten Bereich im Knochen bindet, sichtbar gemacht (Seiender et al. 1994), was die quantitative Bestimmung des gesamten resorbierten Bereiches unter Verwen-30 düng eines Mikroskops und eines computergestützen Bildanalysensystems ermöglicht (Laitala und Väänänen 1994, Hentunen et al. 1995). Wir verwendeten ein kommerziell verfügbares Verfahren (CrossLaps für Kulturen, Osteometer Biotech, Herlev, Dänemark), um die Menge von Kollagenvernetzungen, die in das Kulturmedium freigesetzt Wurden, als einen Index der Knochenresorptionsgeschwindigkeit zu bestimmen (Bagger et al., 1999). 35

Die Untersuchungsvorschrift verwendet ein Verfahren, in dem man Osteoklasten auf Knochenscheiben züchtet und Knochen resorbieren lässt. Das System ist zur Bestimmung der Wirkung von Arzneistoffkandidaten auf die knochenresorbierende Aktivität von Osteoklasten ideal. Arzneistoffkandidaten werden am Beginn der Kulturperiode in die Zellkulturen gegeben, und man 40 lässt die Osteoklasten 3 Tage Knochen resorbieren. Die Menge von während der Kulturperiode resorbiertem Knochen wird bestimmt und mit der Menge von in Kontrollkulturen (die in Abwesenheit von Arzneistoffkandidaten gezüchteten) resorbiertem Knochen verglichen. Wenn der Arzneistoffkandidat die Funktion von Osteoklasten inhibiert, ist die Menge von in diesen Kulturen resorbiertem Knochen signifikant niedriger als in den Kontrollkulturen. 45

Verfahren:

Transversale 0,1 mm dicke Scheiben von kortikalem Knochen wurden unter Verwendung einer langsam laufenden Diamantsäge aus dem Knochenschaft frischer Oberschenkelknochen von so Rindern (Atria Slaughterhouse, Oulu, Finnland) geschnitten, durch Ultraschallbehandlung mit einem mehrfachen Wechsel des sterilen, destillierten Wassers gereinigt und vor der Verwendung bei 4°C gelagert. Aus 1 Tag alten Rattenjungen, die durch Köpfen getötet wurden, wurden die Röhrenknochen entfernt. Die Knochen wurden von anhaftenden Weichteilen befreit, und die endostealen Oberflächen wurden mit einer Skalpellklinge in das Osteoklastenkulturmedium 55 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMIEM) (Gibco BRL, Paisley, UK)), das mit 100 lU/ml 12 AT 009 687 U1

Penicillin, 100 pg/ml Streptomycin (Penicillin/Streptomycin-Lösung, Gibco BRL, Paisley, UK), 20 mM HEPES-Puffer (Gibco BRL, Paisley, UK) und 10 % hitzeinaktiviertem, fötalem Kälberserum, pH 6,9 (Gibco BRL, Paisley, UK) ergänzt war, geschabt. Die so erhaltene Suspension von dispergierten Zellen und Knochenfragmenten wurde unter Verwendung einer Kunststoffpipette 5 gerührt. Man ließ größere Fragmente einige Sekunden absetzen, und die vorher in dem Medium angefeuchteten Knochenscheiben wurden mit dem Überstand angeimpft. Nach einer Absetzdauer von 30 Minuten bei 37°C wurden die Knochenscheiben durch Eintauchen in frisches Medium gewaschen und dann in die Vertiefungen von Kulturschalen mit 24 Vertiefungen, die Osteoklastenkulturmedium enthielten, überführt. Die Knochenscheiben wurden in einer ange-io feuchteten Atmosphäre von 95 % Luft und 5 % Kohlendioxid bei 37°C 72 Stunden inkubiert.

Nach der Kulturperiode wurde die Menge der Knochenresorption durch Messen der Menge der Kollagenvernetzungen, die in das Kulturmedium freigesetzt wurde, unter Verwendung eines handelsüblichen Kits (CrossLaps für Kulturen, Osteometer Biotech) gemäß den Anleitungen 15 des Herstellers bestimmt. Die Zahl von Osteoklasten in jeder Kultur wurde durch mikroskopisches Zählen der Menge von TRAP-positiven, mehrkernigen Zellen bestimmt, und die Ergebnisse sind als Zahl von Kollagenvernetzungen, die pro Osteoklast freigesetzt wurden, angegeben. 20 In dieser Untersuchung wurde die Wirkung des Lanthan(lll)-ions auf die knochenresorbierende Aktivität von Osteoklasten untersucht.

Die folgenden Probengruppen waren eingeschlossen: 25 Grundlinie (einschließlich Vehikel)

Kontrolle (Grundlinie + 10 nM Bafilomycin A1)

Grundlinie + 100 ng/ml Lanthan Grundlinie + 500 ng/ml Lanthan Grundlinie + 1000 ng/ml Lanthan 30 Grundlinie + 5000 ng/ml Lanthan Grundlinie + 15000 ng/ml Lanthan

Sechs Wiederholungsversuche waren in jeder Gruppe enthalten, und der Test wurde zweimal durchgeführt. Bafilomycin A1, ein hochwirksamer Inhibitor der Osteoklasten-V-ATPase-35 Protonenpumpe, wurde als Kontrolle verwendet, um die Fähigkeit des Testsystems zum Nachweis der Inhibierung der Knochenresorption zu zeigen.

Tabellen der Ergebnisse: 40 In dem Knochenresorptionsassay wurde die Menge von CrossLaps (nM) im Medium, die in das Kulturmedium freigesetzt wurde, bestimmt, und die Zahl von Osteoklasten in den entsprechenden Kulturen wurde berechnet. Die Mengen von CrossLaps im Medium wurden durch die Osteoklastenzahlen in den entsprechenden Kulturen dividiert, und die Ergebnisse sind in Tabelle 1 als relative Mengen von CrossLaps im Medium pro Osteoklasten angegeben. Die relativen 45 Werte wurden durch Dividieren jedes einzelnen Werts durch den Mittelwert der Grundliniengruppe erhalten.

Tabelle 1: Relative Mengen von CrossLaps im Medium pro Osteoklast in dem ersten Knochenresorptionsassay

Gruppe 1 2 3 4 5 6 Mittelwert ± Std.abw. Grundlinie 0,98 0,82 1,01 1,65 0,74 0,81 1,00±0,34 Kontrolle 0,00 0,00 0,00 0,19 0,27 0,14 0,10±0,11 <***> LA 100 0,57 0,56 1,13 0,78 0,71 0,71 0,74±0,21 13 AT 009 687 U1

Gruppe 1 2 3 4 5 6 Mittelwert ± Std.abw. LA 500 1,04 0,58 1,38 0,75 0,88 0,63 0,88±0,30 LA 1000 1,14 1,09 0,83 1,76 1,07 1,11 1,18±0,30 LA 5000 1,39 0,78 2,70 1,18 0,76 1,21 1,34±0,71 LA 15000 0,57 0,58 0,57 0,96 2,53 1,11 1,05±0,76

Tabelle 2: Relative Mengen von CrossLaps im Medium pro Osteoklast in dem zweiten Knochen-resorptionsassay

Gruppe 1 2 3 4 5 6 Mittelwert ± Std.abw. Grundlinie 0,75 1,33 0,88 1,98 0,53 0,53 1,00±0,56 Kontrolle 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00±0,00 <***> LA 100 0,38 0,75 0,78 0,94 0,67 0,96 0,74±0,21 LA 500 0,50 2,14 0,50 1,03 0,47 0,63 0,88±0,65 LA 1000 0,70 0,59 1,69 1,40 1,68 0,73 1,13±0,51 LA 5000 0,48 1,18 0,77 0,98 1,99 1,81 1,20±0,59 LA 15000 0,29 1,08 0,62 0,87 0,47 0,45 0,63±0,29

Alle in den Tabellen 1 und 2 gezeigten Daten wurden kombiniert und analysiert. Die kombinierten Ergebnisse sind in Tabelle 3 und Figur 1 gezeigt.

Tabelle 3: Kombinierte Ergebnisse der Wirkung von LA 100 bis LA 15000 auf die Knochenresorption

Gruppe Zahl Mittelwert ± Std.abw. Grundlinie 12 1,00±0,44 Kontrolle 12 0,00±0,00 (***) LA 100 12 0,74±0,20 LA 500 12 0,88±0,48 LA 1000 12 1,15±0,40 LA 5000 12 1,27±0,63 LA 15000 12 0,84±0,59

Ergebnisse

In dem Knochenresorptionsassay gab es weder auf die Menge von CrossLaps, die in das Kulturmedium freigesetzt wurde, noch auf die Osteoklastenzahl eine signifikante Wirkung des Lanthan(lll)-ions. Die Kontrollsubstanz, Bafilomycin A1, inhibierte die Knochenresorption vollständig. Wie in Tabelle 3 und Figur 4 gezeigt, weist das Lanthan(lll)-ion keine statistisch signifikanten Wirkungen auf die knochenresorbierende Aktivität einzelner reifer Osteoklasten bei keiner der untersuchten Konzentrationen auf. Die dosisabhängige Inhibierung der Knochenresorption mit den niedrigeren Konzentrationen (LA 100 und LA 500) sollte jedoch beachtet werden. Die mit LA 15000 beobachtete leichte Abnahme kann auf die schwachen toxischen Wirkungen dieser hohen Konzentration zurückgeführt werden.

Literaturstellen:

Bagger YZ, Foged NT, Andersen L, Lou H, Qvist P (1999) CrossLaps for culture: An improved 14 AT 009 687 U1 enzyme-linked Immunosorbent assay (ELISA) for measuring bone resorption in vitro. J Bone Miner Res 14, Ergänzungsbd. 1, S370.

Boyde A, Ali NN, Jones SJ (1984) Resorption of dentine by isolated osteoclasts in vitro. Br Dcnt 5 J 156:216-220.

Chambers TJ, Revell PA, Füller K, Athanasou NA (1984) Resorption of bone by isolated rabbit osteociasts. J Cell Sei 66: 383-399. io Hentunen TA, Lakkakorpi PT, Tuukkanen J, Lehenkari PP, Sampath TK, Väänänen PK (1995) Effects of recombinant human osteogenic protein-1 on the differentiation of osteoclast-like cells and bone resorption. Biochem Biophys Res Commun 209: 433-443.

Laitala T, Väänänen HK (1994) Inhibition of bone resorption in vitro by antisense RNA and DNA 15 molecules targeted against carbonic anhydrase II or two subunits of vacuolar H+-ATPase. J Clin Invest 93: 2311-2318.

Lakkakorpi F, Tuukkanan I, Hentunen T, Järvelin K, Väänänen HK (1989) Organization of os-teoclast microfilaments during the attachment to bone surface in vitro. I Bone Miner Res 4: 817-20 825.

Lakkakorpi PT, Väänänen HK (1991) Kinetics of the osteoclast cytoskeleton during the resorption cycle in vitro. J Bone Miner Res 6: 817.826. 25 Seiender K, Lehenkari P, Väänänen HK (1994) The effects of bisphosphonates on the resorption cycle of isolated osteoclasts. Calcif Tissue Int 55: 368-375.

Sundquist K, Lakkakorpi P, Wallmark B, Väänänen HK (1990) Inhibition of osteoclast proton transport by bafilomycin A, abolishes bone resorption. Biochem Biophys Res Commun 168: 30 309-313.

Beispiel 2 Osteoklastendifferenzierungsassay in vitro

Ein Verfahren, das als Kultursystem mit Mäuseknochenmark bekannt ist, ist das zur Untersu-35 chung der Osteoklastendifferenzierung am häufigsten verwendete System. Ursprünglich wurde dieses Verfahren von Takahashi et al. (1988a) entwickelt. Osteoklastenvorläufer im Mäuseknochenmark können induziert werden, um in Gegenwart von entweder einem aktiven Stoffwechselprodukt von Vitamin D3 (1,25(OH)2D3) oder Parathormon (PTH) mehrkernige Osteoklastenähnliche Zellen (MNC) zu bilden. Von in Knochenmarkkulturen von Mäusen gebildeten MNC 40 wurde gezeigt, dass sie mehrere für Osteoklasten charakteristische Merkmale besitzen. Sie bilden auf Knochen- oder Dentinscheiben Gruben (Takahashi et al. 1988a, Hattersley und Chambers 1989, Shinar et al. 1990); sie exprimieren hohe Konzentrationen von Tartrat-resistenter saurer Phosphatase (TRAP) und Calcitoninrezeptoren (Takahashi et al. 1988b, Shinar et al. 1990); und sie sprechen auf Calcitonin (Takahashi et al. 1988a) und Prostaglandin 45 E2 (Collins und Chambers 1992) an. Somit ist das Verfahren ein ideales Verfahren, um mit ihm sowohl Stimulatoren als auch Inhibitoren der Osteoklastendifferenzierung zu untersuchen.

In dem ursprünglichen Kultursystem wurde die Osteoklastenbildung nach einer 8-tägigen Kultur bestimmt. Im Knochenmark sind sowohl nichthaftende Osteoklastenvorläufer als auch Stroma-50 zellen vorhanden, wobei die letztgenannten zur Unterstützung der Osteoklastenbildung benötigt werden. Die Zahl der gebildeten Osteoklasten wird im Allgemeinen durch Zählen der Zahl von TRAP-positiven MNC, die mindestens drei Kerne enthalten, bestimmt (Takahashi et al. 1988a). In der negativen Kontrolle, in der 1,25(OH)2D3 nicht zugegeben wird, werden keine TRAP-positiven MNC gebildet. 55 15 AT 009 687 U1

Wir modifizierten den ursprünglichen Assay so, dass wir 6 Tage 1 x 106 Mäusemarkzellen/ml züchteten. Mit dieser Modifikation wurde gezeigt, dass die Zahl von TRAP-positiven MNC/Kultur ungefähr 150 beträgt (Choi et al. 1998, Hentunen et al. 1998). Anstatt die Zahl der gebildeten differenzierten Osteoklasten zu zählen, wurde von uns die Menge von TRAP, die aus Osteoklasten in das Kulturmedium freigesetzt wurde, unter Verwendung eines schnellen, einfachen TRAP-Immuntests (Halleen et al. 1999; Präsentation bei dem Annual Meeting of the American Society for Bone and Mineral Research, 30. September bis 4. Oktober 1999, in St. Louis, MO, USA) gemessen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Menge von TRAP, die in das Kulturmedium freigesetzt wurde, signifikant (r = 0,94, p < 0,0001, n = 120) mit der Menge von gebildeten Osteoklasten korreliert.

Verfahren: 8 bis 10 Wochen alte Mäuse wurden mit C02 getötet. Die Schienbein- und Oberschenkelknochen wurden von anhaftenden Weichteilen befreit. Die Knochenenden wurden mit einem Skalpell abgeschnitten, und das Mark wurde mit α-Minimal Essential Medium (α-MEM, Gibco BRL, Paisley, UK), das mit 100 lU/ml Penicillin und 100 pg/ml Streptomycin ergänzt war, herausgespült. Eine Spritze mit 10 ml und einer Nadel Nr. 27 wurde zum Herausspülen verwendet. Die Zellen wurden 10 Minuten mit 600 x g zentrifugiert, und das Zellpellet wurde in α-MEM, das 10 % fötales Kälberserum enthielt, resuspendiert. Man ließ die Zellen 2 h bei 37°C in einem Inkubator mit 5 % C02 an Kunststoff binden, um die Entfernung von Monozyten und Makrophagen zu ermöglichen. Nichthaftende Zellen wurden vorschriftsmäßig entfernt, und die gebundenen Knochenmarkzellen wurden 6 Tage in Platten mit 24 Vertiefungen (1 x 106 Zel-lenA/ertiefung = 1 ml) kultiviert. Die Hälfte der Medien wurde am 3. Tag gewechselt, und die Behandlungen wurden ersetzt. Am Ende der Kultur wurden die Platten 20 Minuten mit 2 % Paraformaldehyd in PBS fixiert. Die Osteoklastenbildung wurde durch Messen der TRAP-Aktivität aus den Kulturmedien unter Verwendung des neuen TRAP-Immunassays (siehe unten) bestimmt, wobei wir ein polyklonales TRAP-Antiserum, das in Kaninchen gegen gereinigte menschliche Knochen-TRAP hergestellt wurde, verwendeten. Der TRAP-Antikörper wurde an Vertiefungen von Mikrotiterplatten, die mit anti-Kaninchen-IgG beschichtet waren (Gibco BRL, Paisley, UK), gebunden, und TRAP im Medium wurde dann an den Antikörper gebunden. Die Aktivität von gebundenem TRAP wurde in Natriumacetatpuffer unter Verwendung von pNPP als Substrat gemessen.

In dieser Untersuchung wurde die Wirkung des Lanthan(lll)-ions auf die Osteoklastendifferenzierung in Gegenwart von 1,25-Dihydroxyvitamin D3 untersucht. Die folgenden Probengruppen waren enthalten;

Grundlinie (einschließlich Vehikel)

Kontrolle (Grundlinie ohne 1,25-Dihydroxyvitamin D3)

Grundlinie + 100 ng/ml Lanthan Grundlinie + 500 ng/ml Lanthan Grundlinie + 1000 ng/ml Lanthan Grundlinie + 5000 ng/ml Lanthan Grundlinie + 15000 ng/ml Lanthan

Sechs Wiederholungsversuche waren in jeder Gruppe enthalten, und der Test wurde zweimal durchgeführt. Die Grundlinie ohne 1,25-Dihydroxyvitamin D3 wurde als Kontrolle verwendet, um zu zeigen, dass das Testsystem die Inhibierung der Osteoklastendifferenzierung nachweisen kann. Da die Ergebnisse von LA 100 statistisch nicht dasselbe Ergebnis (signifikant verschieden oder nicht mit der Grundlinie verglichen) in beiden der zwei Tests ergeben, führten wir den Test mit LA 100 noch einmal durch.

Tabellen der Ergebnisse: 16 AT 009 687 U1

In dem Osteoklastendifferenzierungsassay wurde die Menge von TRAP-5b-Aktivität, die in das Kulturmedium freigesetzt wurde, als Index der Osteoklastenzahl bestimmt. Die Ergebnisse sind als relative TRAP-Sb-Aktivitäten, die durch Dividieren jeder einzelnen TRAP-5b-Aktivität durch die mittlere TRAP-5b-Aktivität der Grundliniengruppe erhalten wurden, gezeigt.

Tabelle 4: Relative TRAP-5b-Aktivitäten in dem ersten Osteoklastendifferenzierungsassay

Gruppe 1 2 3 4 5 6 Mittelwert ± Std.abw. Grundlinie 1,32 0,72 0,43 0,45 1,89 1,18 1,00±0,57 Kontrolle 0,16 0,17 0,18 0,11 0,11 0,20 0,16±0,04 (**) LA 100 0,81 0,96 0,43 1,39 0,98 0,65 0,87±0,33 LA 500 0,73 0,55 0,48 0,87 0,58 1,05 0,71 ±0,22 LA 1000 0,58 0,82 0,35 0,40 0,98 0,45 0,60±0,25 LA 5000 0,44 0,40 0,41 0,36 0,51 0,52 0,44±0,06 (*) LA 15000 0,14 0,26 0,21 0,34 0,31 0,88 0,36±0,27 O 20 Tabelle 5: Relative TRAP-5b-Aktivitäten in dem zweiten Osteoklastendifferenzierungsassay

Gruppe 1 2 3 4 5 6 Mittelwert ± Std.abw. Grundlinie 1,27 1,37 0,98 0,92 0,74 0,71 1,00±0,27 Kontrolle 0,17 0,34 0,14 0,10 0,11 0,06 0,15±0,10O LA 100 0,64 0,66 0,62 0,36 0,33 0,62 0,54±0,15 (**) LA 500 1,16 1,30 0,85 1,33 0,76 1,01 1,07±0,24 LA 1000 0,70 0,78 0,34 0,65 0,69 1,00 0,69±0,21 LA 5000 0,94 0,46 0,21 0,72 0,68 0,33 0,56±0,27 O LA 15000 0,22 0,31 0,35 0,25 0,15 0,20 0,25±0,07 (***)

Der Assay mit LA 100 wurde noch einmal wiederholt, da die Ergebnisse von der Grundlinie in 35 dem zweiten Assay signifikant verschieden waren und in dem ersten Assay nicht signifikant verschieden waren.

Tabelle 6: Relative TRAP-5b-Aktivitäten in dem dritten Osteoklastendifferenzierungsassay mit LA 100 40

Gruppe 1 2 3 4 5 6 Mittelwert ± Std.abw. Grundlinie 1,25 1,20 0,76 0,93 1,07 0,81 1,00±0,20 Kontrolle 0,08 0,07 0,20 0,10 0,25 0,13 0,14±0,07 (***) LA 100 0,71 0,96 0,42 0,47 0,87 0,69 0,69±0,21 (*)

Alle in den Tabellen 4 bis 6 gezeigten Daten wurden kombiniert und analysiert. Die kombinierten Ergebnisse sind in Tabelle 7 und Figur 2 gezeigt.

Tabelle 7: Kombinierte Ergebnisse der Wirkung von LA 100 bis LA 15000 auf die Osteoklastendifferenzierung 55 5 17 AT 009 687 U1

Grippe Zahl Mittelwert ± Std.abw. Grundlinie 18 1,00±0,36 Kontrolle 18 0,15±0,07 (***) LA 100 18 0,70±0,27 Π LA 500 12 0,89±0,29 LA 1000 12 0,65±0,23 Γ) LA 5000 12 0,50±0,20 (***) LA 15000 12 0,30±0,19 (***) 10

Ergebnisse: 15 In dem Osteoklastendifferenzierungsassay wurde mit LA 500 bis LA 15000 eine deutliche dosisabhängige Inhibierung beobachtet, die von LA 1000 bis LA 15000 statistisch signifikant war. Eine statistisch signifikante Inhibierung wurde auch mit LA 100 beobachtet. In der Kontrollgrup-pe, in der Vitamin D weggelassen wurde, war die Osteoklastendifferenzierung signifikant niedriger als in der Grundliniengruppe. 20

Literaturstellen

Halleen N, Alatalo S, Hentunen TA, Väänänen HK (1999) A novel TRAP 5b immunoassay for osteoclast cultures. J Bone Miner Res 14, Ergänzungsbd. 1, S244. 25

Choi SJ, Devlin RD, Menaa C, Chung H, Roodman GD, Reddy SV (1998) Cloning and Identification of human Sca as a novel inhibitor of osteoclast formation and bone resorption. J Clin Invest 102: 1360-1368. 30 Collins DA, Chambers TJ (1992) Prostaglandin E2 promotes osteoclast formation in murine hematopoietic cultures through an action on hematopotetic cells. J Bone Miner Res 7: 555-561.

Hattersley G, Chambers TJ (1989) Generation of osteoclastic function in mouse bone marrow cultures: multinuclearity and tartrate-resistant acid phosphatase are unreliable markers for 35 osteoclastic differentiation. Endocrinology 124: 1689-1696.

Hentunen TA, Reddy SV, Boyce BF, Dovlin R, Park H-R, Chimg H, Seiender KS, Dallas M, Kurihara N, Galson OL, Goldring SR, Koop BA, Windle JJ, Roodman GD (1998) Immortalization of osteoclast precursors, by targeting bcl-xL and simian virus 40 large T antigen to the osteo-40 clast lineage in transgenic mice. J Clin Invest 102: 88-97.

Shinar DM, Sato M, Rodan GA (1990) The effect of hempoietic growth factors on the generation of osteoclast-like cells in mouse bone marrow cultures. Endocrinology 126:1728-1735. 45 Takahashi N, Yamana H, Yoshiki S, Roodman GD, Mundy GR, Jones SJ, Boyde A, Suda T (1988a) Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures. Endocrinology 122: 1373-1382.

Takahashi N, Akatsu T, Sasaki T, Nicholson GC, Moseley JM, Martin TJ, Suda T (1988b) Induc-50 tion of calcitonin receptors by 1,25-dihydroxyvitamin D3 in osteoclast-like multinucleated cells formed from mouse bone marrow cells. Endocrinology 123: 1504-1510.

Beispiel 3 Osteoblastendifferenzierungsassay in vitro 55 Osteoblasten sind knochenbildende Zellen, die aus mesenchymalen Stammzellen entstehen. 18 AT 009 687 U1 Während der Entwicklung von Osteoblasten wurden drei verschiedene Perioden identifiziert und definiert: 1) Zellproliferation und Sekretion extrazellulärer Matrix (ECM); 2) ECM-Reifung; und 3) ECM-Mineralisierung. Während dieser Perioden wurde eine sequenzielle Expression von Osteoblastenphänotypmarkern charakterisiert. Alkalische Phosphatase steht mit dem Knochenzell-5 phänotyp in Verbindung und wird während der Reifung der Osteoblasten aktiv exprimiert. Mit dem Beginn der Mineralisierung werden große Mengen von Calcium in die reife organische Matrix abgeschieden, wobei knochenartige Noduli gebildet werden. Indem man diesen Markern folgt, können wir alle Stufen der Osteoblastendifferenzierung in diesem Kultursystem untersuchen. 10

Mehrere Verfahren wurden zur Untersuchung von Osteoblasten entwickelt. Das erste dieser Verfahren umfasst die Isolierung von Zellen aus den Schädeldach mit dem osteoblastischen Phänotyp. Diese Zellen stellen jedoch nur die reife Stufe von Osteoblasten dar, da nur eine kleine Fraktion der Schädeldachzellen Osteoblastenvorläufer sind (Bellows und Aubin 1989, 15 Bellows et al. 1994). Osteoblastische Zelllinien sind bequem zu verwenden, aber es ist möglich, dass sie sich nicht wie primäre Osteoblasten verhalten (Mundy 1995). Es ist denkbar, dass Osteoblastenvorläufer im Knochenmark vorhanden sind (Friedenstein 1976, Owen 1988), und Stromazellen des Knochenmarks wurden lange als Quelle von Osteovorläuferzellen erkannt. 20 Wir etablierten ein Kulturmodell, in dem von Mäuseknochenmark abgeleitete Osteovorläuferzellen zuerst proliferieren und sich dann zu Osteoblasten differenzieren, die in der Lage sind, mineralisierte Knochennoduli zu bilden (Qu et al. 1998, Qu et al. 1999). Wir bestätigten dies, indem wir die Expression mehrerer Marker des osteoblastischen Phänotyps verfolgten und die Morphologie von Kulturen auf licht- und elektronenmikroskopischer Ebene untersuchten. Die 25 Synthese von fibrillärer, extrazellulärer Matrix mit später Abscheidung von Calcium bestätigte die Differenzierung und Reifung von Osteoblasten. Somit erfüllt dieses Kultursystem die Anforderungen eines Modells in vitro, das zur Untersuchung der Differenzierung von Osteovorläuferzellen in knochenbildende Osteoblasten verwendbar ist. 30 Verfahren:

Knochenmarkzellen wurden aus den Oberschenkelknochen von 10 Wochen alten, weiblichen NMRI-Mäusen erhalten. Die Tiere wurden durch Halswirbeldislokation getötet. Beide Oberschenkelknochen wurden entfernt, und die Weichteile wurden aseptisch abgelöst. Die Kno-35 chenwachstumszonen beider Enden wurden abgeschnitten, und Knochenmarkzellen wurden durch Spülen des Knochenschafts mit Kulturmedium, Phenolrot-freies α-modifiziertes Minimalmedium (a-MEM (Gibco BRL, Paisley, UK)), aufgenommen. Eine Suspension von Knochenmarkzellen wurde durch wiederholtes Ansaugen der Zellpräparation durch eine Nadel Nr. 22 erhalten, und kernhaltige Zellen wurden mit einem Hämozytometer gezählt. Die Zellen wurden 40 mit 106 Zellen/cm2 in Gewebekulturkolben T-75 in Phenolrot-freiem a-MEM, das mit 10 % FCS, 10'8 M Dexamethason, 50 pg/ml Ascorbinsäure, 10'2 M Natrium-ß-glycerophosphat, 100 lU/ml Penicillin und 100 pg/ml Streptomycin ergänzt war, ausgestrichen. Die Zellen wurden 6 Tage kultiviert, und die Hälfte der Medien wurde nach 3 Tagen ersetzt. Am 6. Tag wurden Subkulturen hergestellt. Die Zellen wurden mit warmem PBS gewaschen, und anhaftende Zellen wurden 45 unter Verwendung von Trypsin-EDTA abgelöst. Die trypsinisierten Zellen wurden durch eine Spritze mit einer Nadel Nr. 22 geleitet, um eine Einzelzellsuspension herzustellen, gezählt und in Platten mit 24 Vertiefungen mit einer Dichte von 5 x 103 Zellen/ml ausgestrichen. Diese Osteovorläuferzellen wurden zur Differenzierung zu reifen Osteoblasten stimuliert, indem sie in Gegenwart von 10'1° M Östrogen (17ß-Östradiol) 8 Tage kultiviert wurden. Die Testsubstanzen so wurden am Beginn der sekundären Kultur ohne Östrogen und jedes Mal, wenn das Medium gewechselt wurde, zugegeben.

Die Zahl der gebildeten Osteoblasten wurde durch Messen der Aktivität von zellulärer alkalischer Phosphatase (ALP) in der Kultur bestimmt. Die Zellen wurden durch zweimaliges Wa-55 sehen der Zellschichten mit PBS, Extrahieren in 200 pl Puffer mit 0,1 % Triton X-100 mit einem 19 AT 009 687 U1 pH-Wert von 7,6 (Sigma, St. Louis, MO, USA) und Einfrieren über Nacht aufgebrochen. Die ALP-Aktivität wurde unter Verwendung von p-Nitrophenylphosphat als Substrat mit einem pH-Wert von 9,7 und Bestimmung der optischen Dichte bei 405 nm kolorimetrisch bestimmt. Parallel wurde der Proteingehalt der Vertiefungen durch den Proteintestassay von BIO-RAD be-5 stimmt, und die spezifische ALP-Aktivität wird als Einheiten/mg Protein ausgedrückt.

In dieser Untersuchung wurde die Wirkung des Lanthan(lll)-ion auf die Osteoblastendifferenzierung untersucht. Die folgenden Probengruppen waren enthalten: io Grundlinie (+ Vehikel)

Kontrolle (Grundlinie + 10'10 M 17ß-Östradiol)

Grundlinie + 100 ng/ml Lanthan Grundlinie + 500 ng/ml Lanthan Grundlinie + 1000 ng/ml Lanthan 15 Grundlinie + 5000 ng/ml Lanthan Grundlinie + 15000 ng/ml Lanthan

Tabellen der Ergebnisse: 20 Die Osteoblastendifferenzierung wurde durch Messen der Aktivitäten von zellulärer alkalischer Phosphatase (ALP) und der Gesamtproteinmengen aus Zelllysaten bestimmt. Die ALP-Aktivitäten wurden durch die entsprechenden Proteinmengen dividiert, um die spezifischen Aktivitäten von ALP zu erhalten. Die Ergebnisse sind als relative spezifische Aktivitäten, die durch Dividieren jedes einzelnen Werts durch den Mittelwert der Grundliniengruppe erhalten 25 wurden, gezeigt.

Tabelle 8: Relative spezifische Aktivitäten der intrazellulären alkalischen Phosphatase in dem vorläufigen Osteoblastendifferenzierungsassay

Gruppe 1 2 3 4 Mittelwert ± Std.abw. Grundlinie 0,94 1,10 0,94 1,02 1,00±0,07 Kontrolle 1,10 1,32 1,31 1,29 1,26±0,10 (**) LA 100 0,98 1,29 1,19 1,12 1,15±0,13 LA 500 0,96 0,98 0,99 1,11 1,01 ±0,07 LA 1000 0,69 1,13 0,92 1,01 0,94±0,19 LA 5000 0,42 0,46 0,50 0,48 0,47±0,03 (***) LA 15000 0,51 0,49 0,47 0,54 0,50±0,03 (***)

Tabelle 9: Relative spezifische Aktivitäten der intrazellulären alkalischen Phosphatase in dem ersten Osteoblastendifferenzierungsassay

Gruppe 1 2 3 4 5 6 7 8 Mittelwert ± Std.abw. Grundlinie 0,97 0,94 1,12 0,98 0,97 1,06 0,99 0,96 1,00±0,06 Kontrolle 1,01 1,20 1,04 1,13 1,19 1,06 1,03 1,14 1,1010,08^ LA 100 1,25 0,98 1,31 0,77 0,95 1,04 1,13 0,98 1,05±0,17 LA 500 0,83 1,03 1,02 0,98 0,95 0,96 0,82 0,62 0,90±0,14 LA 1000 1,01 1,12 1,06 0,76 1,01 0,78 0,93 0,81 0,9410,14 LA 5000 0,54 0,48 0,47 0,63 0,54 0,59 0,44 0,55 0,5310,06 <***> LA 15000 0,40 0,42 0,53 0,36 0,39 0,35 0,30 0,43 0,4010,07 <***> AT 009 687 U1 20 .

Tabelle 10: Relative spezifische Aktivitäten der intrazellulären alkalischen Phosphatase in dem zweiten Osteoblastendifferenzierungsassay

Gruppe 1 2 3 4 5 6 Mittelwert ± Std.abw. Grundlinie 0,99 0,83 1,25 1,01 0,88 1,04 1,00±0,15 Kontrolle 1,00 1,18 1,53 1,52 1,03 1,38 1,27±0,24 O LA 100 0,91 0,94 1,34 1,20 1,00 1,43 1,14±0,22 LA 500 0,88 0,89 1,10 1,09 0,75 0,90 0,93±0,14 LA 1000 0,73 0,71 1,19 0,81 0,72 1,09 0,88±0,21 LA 5000 0,31 0,51 0,51 0,49 0,28 0,40 0,41 ±0,10 (***) LA 15000 0,27 0,13 0,33 0,32 0,29 0,31 0,28±0,07 (***) 15

Alle in den Tabellen 8 bis 10 gezeigten Daten wurden kombiniert und analysiert. Die kombinierten Ergebnisse sind in Tabelle 11 und Figur 3 gezeigt.

Tabelle 11: Kombinierte Ergebnisse der Wirkung von l_A 100 bis LA 15000 auf die Oste-20 oblastendifferenzierung

Gruppe Zahl Mittelwert ± Std.abw. Grundlinie 18 1,00±0,09 Kontrolle 18 1,19±0,17 (***) LA 100 18 1,10±0,18 (*) LA 500 18 0,94±0,13 LA 1000 18 0,92±0,17 LA 5000 18 0,48±0,09 (***) LA 15000 18 0,38±0,11 (***) 25 30

Ergebnisse: 35

Das Lanthan(lll)-ion zeigte eine deutliche dosisabhängige Antwort in dem Osteoblastendifferen-zierungsassay. Die höchsten Testkonzentrationen (LA 5000 und LA 15000) inhibierten die Osteoblastendifferenzierung signifikant, und die niedrigste Testkonzentration (LA 100) aktivierte die Osteoblastendifferenzierung signifikant. Keine signifikante Antwort wurde mit LA 500 und 40 LA 1000 beobachtet. Die Kontrollsubstanz, 17ß-Östradiol, aktivierte die Osteoblastendifferenzierung signifikant.

Literaturstellen 45 Bellows CG, Aubin JE (1989) Determination of the number of osteoprogenitors in isolated fetal rat calvarial cells in vitro. Develop Biol 113: 8-13.

Bellows CG, Wang YH, Heersche JN, Aubin JE (1994) 1,25-dihydroxyvitamin D3 stimulates adipocytic differentiation in cultures of fetal rat calvarial cells: comparison with the effects of 50 dexamethasone. Endocrinology 134: 2221.2229.

Friedenstein AJ (1976) Precursor cells of mechanocytes. Int Rev Cytol 47: 327-355.

Mundy RG (1995) Osteoblests, bone formation and mineralization. In: Bone remodelling and its 55 disorders. Martin Dunitz Ltd S. 29-30. 21 AT 009 687 U1

Owen M, Friendenstein AJ (1988) Stromal stem cells: Marrow-derived osteogenic precursors. Ciba Found Symp 136: 42-60.

Qu Q, Perälä-Heape M, Kapanen A, Dahllund J, Salo J, Väänänen HK, Härkönen P (1998) 5 Estrogen enhances differentiation of osteoblasts in mouse bone marrow culture. Bone 22: 201.209.

Qu Q, Härkönen PL, Väänänen HK (1999) Comparative effects of estrogen and antiestrogens on differentiation of osteoblasts in mouse bone marrow culture. J Cell Biochem 73: 500-507. 10

Beispiel 4 Knochenbildungsassay in vitro

Die Aktivität reifer Osteoblasten kann durch ihre Fähigkeit, mineralisierte Knochenmatrix zu bilden, quantitativ bestimmt werden. Dies erfolgt durch Entmineralisieren der gebildeten Kno-15 chenmatrix und Bestimmung der freigesetzten Calciummenge. Somit erfüllt dieses Kultursystem die Anforderungen eines Modells in vitro, das zur Untersuchung der Knochenbildungsaktivität reifer Osteoblasten verwendbar ist.

Verfahren: 20

Man ließ die reifen Osteoblasten, die während der 8-tägigen sekundären Kultur in Abwesenheit von Östrogen und beliebigen der vorstehend beschriebenen Testsubstanzen erhalten wurden, Knochennoduli bilden, indem man sie 7 zusätzliche Tage züchtete. Am Ende der Kultur wurde die während der Kultur abgeschiedene Calciummenge bestimmt, und die Menge der Knochen-25 bildung (Calciumabscheidung) wurde berechnet.

Zur quantitativen Bestimmung der abgeschiedenen Calciummenge werden die Zellkulturen dreimal mit Ca2+- und Mg2+-freiem PBS gewaschen und über Nacht bei Raumtemperatur in 0,6 M HCl inkubiert. Extrakte mit 50 pl wurden mit 1 ml bestimmtem o-Cresolphthalein-30 komplexon komplexiert. Die kolorimetrische Reaktion wurde bei 570 nm in einem Spektrophotometer bestimmt. Die absoluten Calciumkonzentrationen wurden durch den Vergleich mit einem kalibrierten Standard, der von dem Händler bereitgestellt wurde, bestimmt.

In dieser Untersuchung wurde die Wirkung von Lanthancarbonat auf die Knochenbildung unter-35 sucht. Die folgenden Probengruppen waren enthalten:

Grundlinie (einschließlich Vehikel)

Kontrolle (Grundlinie + 10'10 M 17ß-Östradiol)

Grundlinie + 100 ng/ml Lanthan 40 Grundlinie + 500 ng/ml Lanthan Grundlinie + 1000 ng/ml Lanthan Grundlinie + 5000 ng/ml Lanthan Grundlinie + 15000 ng/ml Lanthan 45 Tabellen der Ergebnisse:

Die Menge der Knochenbildung wurde durch Messen der Calciummenge, die in die durch reife Osteoblasten gebildeten Knochennoduli abgeschieden wurde, bestimmt. Die Ergebnisse sind als die Calciummenge (mmol/l), die nach der HCI-Extraktion aus den Knochennoduli freigesetzt so wurde, gezeigt. Die Grundlinienwerte sind zu niedrig, um die Ergebnisse unter Verwendung relativer Mengen, wie es in den anderen Assays durchgeführt wurde, zu zeigen.

Tabelle 12: Calciumabscheidung (mmol/l) in dem vorläufigen Knochenbildungsassay 55 22 AT 009 687 U1

Gruppe 1 2 3 4 Mittelwert ± Std.abw. Grundlinie 0 0 0 0 0,00±0,00 Kontrolle 0,04 0 0 0,04 0,02±0,02 LA 100 0 0 0 0 0,00±0,00 LA 500 0 0 0 0,09 0,02±0,05 LA 1000 0,10 0 0,12 0,05 0,07±0,05 (*) LA 5000 0,59 1,64 0,39 1,62 1,06±0,66 (***) LA 15000 1,48 0,16 0,50 1,41 0,89±0,66 (***)

Tabelle 13: Calciumabscheidung (mmol/l) in dem ersten Knochenbildungsassay

Gruppe 1 2 3 4 5 6 Mittelwert ± Std.abw. Grundlinie 0 0 0 0,02 0,02 0 0,01 ±0,01 Kontrolle 0,15 0,21 0,14 0,10 0,15 0,16 0,15±0,04 (***) LA 100 0,04 0,17 0,01 0,27 0 0,14 0,11±0,11 o LA 500 0,44 0,15 1,32 0,27 1,31 1,10 0,77±0,54 (***) LA 1000 0,95 1,66 1,47 1,41 1,00 1,25 1,29±0,28 (***) LA 5000 1,31 1,55 1,56 1,52 1,40 1,39 1,46±0,10 (***) LA 15000 1,46 1,42 1,56 1,11 1,11 1,08 1,29±0,21 (***)

Tabelle 14: Calciumabscheidung (mmol/l) in dem zweiten Knochenbildungsassay

Gruppe 1 2 3 4 5 6 7 8 Mittelwert ± Std.abw. Grundlinie 0 0,01 0 0,01 0 0 0,02 0 0,01 ±0,01 Kontrolle 0,22 0,14 0,16 0 0,16 0 0,10 0,16 0,12±0,08 (**) LA 100 0,04 0,18 0 0 0 0,28 0,14 0 0,08±0,11 LA 500 0,17 0,30 1,41 0 0,02 0,46 1,17 1,40 0,62±0,61 (***) La 1000 1,09 0,81 1,34 1,56 1,76 0,02 1,52 1,02 1,14±0,55 (***) LA 5000 1,70 1,44 1,64 1,52 1,08 1,63 1,30 1,48 1,47±0,20 (***) LA 15000 1,24 1,46 1,22 1,68 1,62 1,18 1,21 1,56 1,40±0,21 (***) 40

Die in den Tabellen 13 und 14 gezeigten Daten wurden kombiniert und analysiert. Die Ergebnisse aus Tabelle 12 waren nicht eingeschlossen, da zwischen der Grundlinie und den Kontroll-gruppen kein signifikanter Unterschied bestand. Die kombinierten Ergebnisse sind in Tabelle 15 und Figur 4 gezeigt. 45

Tabelle 15: Kombinierte Ergebnisse der Wirkungen von l_A 100 bis LA 15000 auf die Knochenbildungsaktivität reifer Osteoblasten

Gruppe Zahl Mittelwert ± Std.abw. Grundlinie 14 0,01±0,01 Kontrolle 14 0,13±0,06 (***) LA 100 14 0,09±0,10Π LA 500 14 0,68±0,56 (***) 55 23 AT 009 687 U1

Gruppe Zahl Mittelwert ± Std.abw. LA 1000 14 1,20±0,45 (***) LA 5000 14 1,47±0,16 (***) LA 15000 14 1,35±0,21 (***)

Ergebnisse: io Alle Konzentrationen des untersuchten Lanthan(lll)-ions zeigten eine hochsignifikante Aktivierung der Knochenbildungsaktivität reifer Osteoblasten, wobei die Aktivierung mit den höchsten Testkonzentrationen am höchsten ist. Die Kontrollsubstanz, 17ß-Östradiol, aktivierte die Knochenbildung signifikant. 15 Literaturstellen

Bellows CG, Aubin JE (1989) Determination of the number of osteoprogenitors in isolated fetal rat calvarial cells in vitro. Dev Biol 113: 8-13. 20 Bellows CG, Wang YH, Heersche JN, Aubin JE (1994) 1,25-dihydroxyvitamin D3 stimulates adipocytic differentiation in cultures of fetal rat calvarial cells: comparison with the effects of dexamethasone. Endocrinology 134: 2221-2229.

Friedenstein AJ (1976) Preciirsor cells of mechanocytes. Int Rev Cytol 47: 327-355. 25

Mundy RG (1995) Osteoblasts, bone formation and mineralization. In: Bone remodelling and its disorders. Martin Dunitz Ltd S. 29-30.

Owen M, Friendentein AT (1988) Stromal stem cells: Marrow-derived osteogenic precursors. 30 Ciba Found Symp 136: 42-60.

Qu Q, Perälä-Heape M, Kapanen A, Dahllund J, Salo J, Väänänen HK, Harkönen P (1998) Estrogen enhances differentiation of osteoblasts in mouse bone marrow culture. Bone 22: 201-209. 35

Qa Q, Harkönen PL, Väänänen HK (1999) Comparative effects of oestrogen and antiestrogens on differentiation of osteoblasts in mouse bone marrow culture. J Cell Biochem. 73: 500-507.

Tiere für Untersuchungen in vitro 40

Spezies/Stamm/Alter/Geschlecht Lieferant Maus/NMRI, < 8 bis 12 w, männlich und weiblich Universität von Turku, The centre of experimental animals, Turku, Finnland Ratte, Sprague-Dawley, 1 Tag Universität von Turku, The centre of experimental animals, Turku, Finnland

Statistische Analysen der Ergebnisse in vitro 50

Der Mittelwert und die Standardabweichung (Std.abw.) jeder Gruppe wurden bestimmt. Eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) wurde verwendet, um zu untersuchen, ob die zwischen verschiedenen Gruppen erhaltenen Werte (Grundlinie vs. Kontrollen und Testsubstanzen) statistisch verschieden (mit p < 0,05) waren. Eine statistische Signifikanz wird in jeder Tabelle 55 und Figur mit Sternchen gezeigt, wobei ein Sternchen (*) einen p-Wert zwischen 0,05 und 0,01 24 AT 009 687 U1 anzeigt, zwei Sternchen (**) einen p-Wert zwischen 0,01 und 0,001 anzeigen, und drei Sternchen (***) einen p-Wert K 0,001 anzeigen. Keine Sternchen zeigen, dass sich die Ergebnisse der Gruppe von den Ergebnissen der entsprechenden Grundliniengruppe nicht signifikant unterscheiden. 5

Zusammenfassung der Ergebnisse in vitro

Die Wirkungen der Testkonzentrationen des Lanthan(lll)-ions auf die Aktivität und Differenzierung von Knochenzellen sind in Tabelle 17 zusammengefasst, wobei (+) eine signifikante Akti-io vierung, (-) eine signifikante Inhibierung und (0) keine Wirkung bedeuten. Ein Zeichen (+ oder -) bedeutet einen p-Wert zwischen 0,05 und 0,01, zwei Zeichen (++ oder - -) bedeuten einen p-

Wert zwischen 0,01 und 0,001, und drei Zeichen (+++ oder---) bedeuten einen p-Wert <0,001. 15 Tabelle 17: Die Wirkungen von l_A auf Knochenzellen

Dosis, ng/ml Knochen resorption Osteoklasten differenzierung Osteoblasten differenzierung Knochen bildung 100 0 -- + ++ 500 0 0 0 +++ 1000 0 0 +++ 5000 0 — — +++ 15000 0 — — +++ 20 25

Schlussfolgerungen aus den Untersuchungen in vitro 30 Das Lanthan(lll)-ion ist bei allen untersuchten Konzentrationen ein starker Stimulator der Knochenbildungsaktivität reifer Osteoblasten, wobei die besten Antworten mit den höchsten Testkonzentrationen beobachtet wurden (LA 5000 und LA 15000). Diese Konzentrationen können jedoch auch zytotoxische Wirkungen auf die Osteoblastenvorläuferzellen aufweisen, welche die Aktivierung reifer Osteoblasten in vivo kompensieren können. 35 LA 500 und LA 1000 stimulieren ebenfalls die Knochenbildung, aber diese Konzentrationen verringern nicht die Formulierung von Osteoblasten in dem Osteoblastendifferenzierungsassay, was darauf hinweist, dass sie keine zytotoxischen Wirkungen auf Osteoblastenvorläuferzellen haben. LA 1000 verringert jedoch die Bildung vom Osteoklasten im Osteoklastendifferenzie- 40 rungsassay, was darauf hinweist, dass es zytotoxischen Wirkungen auf Osteoklastenvorläuferzellen haben kann. Die einzige signifikante Wirkung von LA 500 in den vier Assays war die Aktivierung der Knochenbildung. Somit ist es möglich, dass diese Konzentration von LA zum Erhöhen der Knochenbildung ohne zytotoxische Wirkungen verwendet werden kann. 45 LA 100 aktiviert scheinbar sowohl die Knochenbildung als auch die Osteoblastendifferenzierung und inhibiert offensichtlich die Osteoklastendifferenzierung und Knochenresorption (obwohl die Inhibierung der Knochenresorption nicht statistisch signifikant ist). Alle diese Wirkungen verstärken Knochen. so Beispiel 5 Untersuchung der Knochenbildung in vivo Verfahren:

Die Proben, die aus dem Darmbeinkamm von wachsenden, unreifen Hunden entnommen wur- 55 den, wurden analysiert. Die Gruppe wurde in eine Kontroll- und Behandlungsgruppe aufgeteilt.

Claims (7)

1. 25 AT 009 687 U1 Die Behandlungsgruppe erhielt 1000 mg/kg/Tag Lanthancarbonat, das zweimal täglich oral verabreicht wurde. Die Gruppen wurden 13 Wochen behandelt, und nach dieser Zeit wurden vertikal durch den Darmbeinkamm Knochenproben entnommen, in ein Harz auf Methylmethac-rylatbasis eingebettet, Schnittpräparate davon hergestellt und mit Toluidinblau und Von-Kossa-Färbemittel angefärbt. Die gemessenen Parameter waren: trabekuläre und kortikale Knochenmasse Osteoidoberfläche und -volumen Osteoblastenoberfläche kortikales Osteoidvolumen Zahl trabekulärer und kortikaler Osteoklasten resorbierende Oberflächen im Kortexknochen und trabekulären Knochen Einbau von Lanthan in den Knochen (modifiziertes Eriochromazurinverfahren) Ergebnisse: Der Darmbeinkamm dieser Tiere wirkt als Wachstumsplatte. Das Aussehen ist das von unreifen Tieren, die aktiv wachsen. Es fand überall in den entnommenen Proben ein sehr aktiver Knochenumbau statt, und zusätzlich fand scheinbar ein Knochenumbau mit einer sehr aktiven periostalen Osteoklasie auf der kortikalen Oberfläche und andererseits im Kortex statt. Es bestand ein deutlicher Unterschied in der kortikalen Dicke zwischen den verschiedenen Tieren und eine deutliche Variation der Knochenmenge in der Biopsieprobe. Dieser Variationsgrad war nicht auf eine der zwei Gruppen von Tieren oder auf Tiere eines besonderen Geschlechts beschränkt. Es bestand ein statistisch signifikanter Unterschied hinsichtlich des trabekulären Knochenvolumens zwischen den zwei Gruppen. Das trabekuläre Knochenvolumen war in der Kontrollgruppe niedriger (ungefähr die Hälfte des in der Behandlungsgruppe) als in der mit Lanthan behandelten Gruppe. Es bestand kein statistisch signifikanter Unterschied in einem beliebigen der anderen untersuchten Knochenparameter zwischen den zwei Gruppen. Es fand, verglichen mit der Kontrollgruppe, eine Zunahme des trabekulären Knochenvolumens bei behandelten Tieren (ungefähr zweifach) statt. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass Lanthan das Knochenwachstum auf der Wachstumsplatte beeinflusst. Nach der Veranschaulichung und Beschreibung der Grundzüge der Erfindung in bevorzugten Ausführungsformen ist es für Fachleute selbstverständlich, dass die Erfindung im Aufbau und in den Einzelheiten modifiziert werden kann, ohne von diesen Grundzügen abzuweichen. Wir beanspruchen alle Modifikationen, die unter den Umfang der folgenden Ansprüche fallen. Alle Veröffentlichungen, Patente und Patentanmeldungen, auf die hier Bezug genommen wurde, sind hier durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit bis zu demselben Umfang aufgenommen, als ob von jeder einzelnen Veröffentlichung, jedem einzelnen Patent oder jeder einzelnen Patentanmeldung speziell und einzeln gezeigt wurde, dass sie durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen ist. Ansprüche: 1. Verwendung einer Lanthan(lll)verbindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Vorbeugung (a) einer mit Knochenverlust verbundenen Knochenerkrankung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Knochenfrakturen, Knochentraumata sowie Knochenerkrankungen, die durch posttraumatische Knochenchirurgie, postprothetische Gelenkchirurgie, postplasti- 26 AT 009 687 U1 sehe Knochenchirurgie, Chemotherapie von Knochen, postdentale Chirurgie oder Radiotherapie von Knochen bedingt sind, und/oder (b) einer mit dem Knochenumbauzyklus verbundenen Knochenerkrankung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Osteoporose, Morbus Paget, Achondroplasie, Osteochondritis, 5 Osteogenesis imperfecta, osteolytischen Knochenerkrankungen, Osteomalazie sowie Kno chenerkrankungen, die durch Hyperparathyroidismus, kongenitale Hypophosphatasie, fibromatöse Läsionen, fibröse Dysplasie, multiple Myelome oder parodontale Erkrankungen bedingt sind. io
2. 2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Lanthan(lll)verbindung ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Lanthansalzen und Chelaten davon.
3. 3. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Lanthan(lll)verbindung ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Lanthancarbonat und Lanthanchlorid. 15
4. 4. Arzneimittelzusammensetzung zur Behandlung oder Vorbeugung von Knochenerkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Lanthan(lll)verbindung umfaßt.
5. 5. Arzneimittelzusammensetzung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Lan- 20 than(lll)verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lanthansalzen und Che laten davon.
6. 6. Arzneimittelzusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Lan-than(lll)verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lanthancarbonat und 25 Lanthanchlorid.
7. 7. Arzneimittelzusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie weiters ein knochenstärkendes Mittel umfaßt, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Hormon, bevorzugt Östrogen und Calcitonin, Tamoxifen, ei- 30 nem Biphosphonat, einem Biphosphonat-Analogon, Vitamin D, einem Vitamin D-Analogon, einem Mineralstoff, einem Statin, einem selektiven Östrogenrezeptor-Modulator und Natriumfluorid. 35 Hiezu 4 Blatt Zeichnungen 40 45 50 55