DE3906923A1

DE3906923A1 - Knochenresorption

Info

Publication number: DE3906923A1
Application number: DE3906923A
Authority: DE
Inventors: Jean Honore M Dr Feyen; Ulrich Prof Dr Trechsel
Original assignee: Sandoz AG; Sandoz Patent GmbH
Current assignee: Sandoz AG; Sandoz Patent GmbH
Priority date: 1988-03-04
Filing date: 1989-03-03
Publication date: 1989-09-14
Also published as: FR2628323B1; IT8947695A0; DK102389A; DK102389D0; EP0331640A3; AU621592B2; GB2216412B; EP0331640A2; PT89893A; GB8904646D0; CA1332223C; BE1003662A4; JPH01308234A; HUT52962A; KR890014124A; GB2216412A; SE8900722D0; PH26238A; SE8900722L; NL8900524A

Description

Es wurde gezeigt, daß das Interleukin 6 ein Zytokin ist, das von Fibroblasten und mehreren anderen Zelltypen hergestellt wird. Die Produktion von Interleukin 6 und seine Aktivität auf beispielsweise das Knochenmark ist in der PCT Patentanmeldung PCT/US 87/01611 (WO 88/00206) beschrieben. Interleukin 6 scheint mit verschiedenen Zielzellen zu interreagieren. Es hat sich erwiesen, daß Interleukin 6 identisch mit Interferon β-2, BSF-2 (B-cell stimulatory factor 2), Interleukin HP-1 und Faktor 26K ist. Es ist nun fraglich, ob überhaupt Interleukin 6 als ein Interferon im Hinblick auf seine niedrige anti-virale Aktivität betrachtet werden kann. Es wurde berichtet, daß die Produktion von Interleukin 6 durch Interleukin 1 (IL-1) und Tumor Nekrose Faktor (TNF-α) in gewissen Zellen stimuliert werden kann. Es ist auch bekannt, daß die Prostaglandin-E₂-Bildung, die zur Markierung der Knochenresorption dient, durch IL-1 und TNF-α stimuliert werden kann.

Trotz intensiver Forschung mit Interleukin 6, besonders im immunologischen und hematologischen Gebiet, wurde noch nichts über seine Wirkung auf Knochenresorption oder -bildung berichtet.

Es wurde nun gefunden, daß IL-6-Verbindungen (wie nachfolgend definiert) zur Hemmung der Knochenresorption und zur Erhöhung der Knochenbildung verwendet werden können. Sie können deshalb zur Behandlung von Osteoporose, beispielsweise die akuten und/oder chronischen Phasen der postmenopausalen Osteoporose, einschließlich primäre und/oder sekundäre Osteoporose und localisierte Osteoporose, posttraumatische Osteoporose, Morbus Paget (osteitis deformans), von durch maligne Knochentumoren bedingter Osteolyse, beispielsweise Osteosarkom, Osteodystrophie, beispielsweise renale Osteodystrophie, Osteomalazie, multipler Knochenmyelom, Osteogenesis imperfecta, Hyperkalzämie, Osteomyelitis, beispielsweise zusammen mit Antibiotika, und ektopischer Verkalkung eingesetzt werden.

Die unten angegebenen Ergebnisse zeigen, daß IL-6-Verbindungen

i) die PGE₂-Ausscheidung von Knochenzellenzüchtungen (Versuch 1) hemmen,
ii) die PGE₂-Ausscheidung in Knochenkulturen hemmen, deren Stimulierung durch beispielsweise zwei Lymphokinen, IL-1 und TNF, induziert wird (Versuch 2),
iii) die Knochenbildung verstärken (Versuch 3) und
iv) die Knochenresorption unterdrücken (Versuche 4 und 5).

Das Verstärken der Knochenbildung ist besonders von Interesse.

Weiterhin wurde gezeigt, daß die Osteoblasten, die auch Osteoklasten steuern, eine IL-6-Wirkung erzeugen (Versuche 6 und 7).

Wie nachfolgend verwendet, entspricht 1 Einheit (U) Il-6- Aktivität einer Menge von IL-6-Verbindungen, die die Hälfte der maximalen Stimulierung in dem B-Zellenproliferationstest verursachen, beispielsweise unter Verwendung von B13.29 Klonen (frei von dem Central Laboratory Netherlands Red Cross, Blood Transfusion Service, P. O. Box 9406, 1006 AK Amsterdam erhältlich) wie in dem spezifischen Versuch von Landsdorp et al. in Curr. Top. Microbiol. Immunol. (1986) 132, 105 und Aarden et al. in Eur. J. Immunol. (1987) 17, 1411 beschrieben. 1×10⁸ Einheiten entsprechen etwa 1 mg Polypeptid.

Zusammengefaßt, werden die Zellen in ein Kulturmedium suspendiert (Iscove abgewandelter Dulbecco-Medium, das mit 5% (V/V) fetalem Kalbserum, Penicillin und Streptomycin ergänzt ist), und auf Mikrotiterplatten (5.10³ Zellen/200 µl medium) angelegt. Die Zellen werden während 48 Stunden in einer feuchten 5% CO₂- haltigen Luftatmosphäre bei 37°C gezüchtet, wobei während der letzten 6 Stunden die Züchtung in Gegenwart von 1 µCi [³H]Thymidin stattfindet. Die in den Nuklei inkorporierte Radioaktivität wird gemessen. Das zu prüfende konditionierte Medium wird in B13.29 Zellenmedium serienverdünnt.

Die nachfolgend angegebenen Versuchsergebnisse werden mit einer IL-6-Verbindung bestimmt, die ein glykosiliertes, durch CHO- Zellen hergestelltes, gegebenenfalls zur Entfernung von LPS (Lipopolysacchariden) gereinigtes IL-6 ist.

In dieser Beschreibung steht IL-1 für Interleukin 1 α.

Versuch 1

Die Grundbildung von Prostaglandin E₂ in der Rattenosteosarcomenzellinie ROS 17/2.8 wird durch IL-6-Verbindungen bei einer Konzentration von ca. 0,01 bis ca. 100 U/ml gehemmmt. In diesem Versuch werden Zellen von der Rattenosteosarcomenzellinie ROS 17/2.8 in DMEM (Dulbecco's minimal essential medium) und Medium F12 (1 : 1), das 10% fetales Kalbserum und 2 mM L-Glutamin enthält, in einer feuchten 5% CO₂-haltigen Luftatmosphäre bei 37°C gezüchtet. Im konfluenten Stadium werden dann die Zellen mit der oben angegebenen IL-6-Verbindungenkonzentration behandelt. Nach 24stündiger Zucht wird ein Aliquot des Mediums für Prostaglandin E₂ unter Verwendung eines Standardradioimmunversuchs geprüft.

Die Ergebnisse sind wie folgt:

Versuch 2

Die PGE₂-Produktion, die durch Stimulierung von Calvarienzellen der Maus mit IL-1 und TNF-α erhalten ist, wird durch eine Konzentration von ca. 10 bis ca. 100 U/ml IL-6-Verbindungen unterdrückt.

Die Calvarienzellen der Maus werden wie folgt vorbereitet:
Frontale und parietale Knochen werden von 4 bis 5 Tage alten Mäusen (CD-1-Stamm) seziert, der Pfeilnaht entlang gespaltet und in 2 ml BGJ-Medium, enthaltend 1 mg/ml Rindserumeiweiß, Penicillin und Streptomycin, auf 35-mm-Kunststoffschalen für Gewebekulturen gezüchtet.

Nach 24 Stunden Vorzüchtung, wird das Medium durch ein BGJ-Medium ersetzt, das mit IL-1 in einer Konzentration von 10 U oder TNF-α in einer Konzentration von 10 ng/ml zusammen mit IL-6-Verbindungen in einer Konzentration wie oben angegeben, ergänzt ist. Das so erhaltene Medium wird während 48 Stunden weitergezüchtet. Während der ganzen Züchtung werden die Schalen auf einer Schüttelplattform (15 Schwingungen/Min.) in einer feuchten 5% CO₂-haltigen Luftatmosphäre bei 37°C geschüttelt. Das konditionierte Calvarienmedium wird dann geerntet und bei 4°C aufbewahrt.

Ein Aliquot des Mediums wird entnommen, und der PGE₂-Gehalt wird durch einen Radioimmunversuch bestimmt. Folgende Ergebnisse werden erhalten:

Stimulierung durch 10 U/ml IL-1

Stimulierung durch 10 ng/ml TNF-α

Falls die Stimulierung der PGE₂-Ausscheidung durch das nichtlymphokine Parathyroidhormon (10^-8 molar) induziert ist, wird jedoch eine kleine Hemmung der Prostaglandinsynthese beobachtet.

In dem oben aufgeführten Versuch hat IL-6 keine Wirkung auf die Prostaglandinsynthese von unstimulierten Knochengewebekulturen.

Versuch 3

IL-6-Verbindungen verstärken die Knochenbildung wie es beispielsweise durch erhöhte Inkorporierung von [3H]Prolin in kollagenen und nicht-kollagenen Proteine von fetalen Rattencalvarien gezeigt werden kann.

Frontale und parietale Knochen werden von 21 Tage alten fetalen Ratten seziert und der Pfeilnaht entlang gespaltet und nach der Methode von Kream et al. (Endocrinology 116, 296 [1985]) gezüchtet. Die IL-6-Verbindung wird in Dosis von 1 bis 100 U zu jeweils 2 ml den Kulturen zugegeben. Die Züchtung wird während 24 bis 48 Stunden durchgeführt.

Um die Inkorporierung von [3H]Prolin in durch Kollagenase verdaulichem Protein und in nicht-kollagenem Protein zu bestimmen, werden Knochenhomogenate mit bakterieller Kollagenase gemäß der Methode von Diegelmann R. und Peterkofsky (Dev. Biol. [1972] 28, 443), modifiziert gemäß Kream et al. (Endocrinology [1985] 116, 296) verdaut.

Versuch 4

IL-6-Verbindungen unterdrücken die Knochenresorption, wie es durch eine erniedrigte ⁴⁵Ca-Freisetzung von den Knochen gezeigt werden kann. Der Versuch wird nach der Methode von Raisz (J. Clin. Invest. [1965] 44, 103) durchgeführt.

Am 18. Tag Schwangerschaft werden schwangeren Ratten ⁴⁵Ca und Placebo oder eine IL-6-Verbindung (1 bis 100 U/Tier) s. c. verabreicht. Am nächsten Tag werden die Tiere geopfert und die Föten entnommen. Die mineralisierten Stämme der Radii und Ellen werden seziert und gezüchtet. Die Resorption wird durch die ⁴⁵Ca-Freisetzung in den Knochengewebekulturen bestimmt.

Versuch 5

IL-6-Verbindungen unterdrücken die Knochenresorption, wie es durch die reduzierte Osteoklastenanzahl und erhöhte Knochenmenge im folgenden Versuch gezeigt werden kann.

Mäuse im Wachstumstadium (6 bis 8 Wochen alt; Gewicht ca. 20 g) werden für den Versuch verwendet. IL-6-Verbindungen in Dosis von ca. 0,1 bis ca. 10 µg, beispielsweise 1 µg, werden s. c. über die Knochen der Schädeldecke, beispielsweise über die Stirn-und Schläfenknochen des Schädels injekziert. Die Injektionen werden täglich während 3 bis 10 Tagen durchgeführt. 3 Tage, 7 Tage oder 2 Wochen nach Behandlungsschluß werden die Tiere geopfert. Die Calvarienknochen werden histologisch untersucht. Beispielsweise werden die frontalen und temporalen Knochen fixiert, eingebettet und geschnitten. Die reduzierte Knochenresorption wird im Vergleich zu den Kontrolltieren morphologisch festgestellt, beispielsweise wird mehr Knochenmatrix und eine reduzierte Anzahl von Osteoklasten durch das Anfärben z. B. mit Tartrat-beständiger saurer Phosphatase beobachtet.

Dazu wird auch noch morphologisch eine Erhöhung der Knochenbildung in den Calvarienknochen, z. B. frontale und temporale Knochen, im Vergleich zu den Kontrolltieren festgestellt; beispielsweise wird ein verstärkter Knochenwachstum und zusätzlich auch eine erhöhte Osteoblastenanzahl beobachtet.

Versuch 6

Die Freisetzung einer IL-6 ähnlichen Aktivität wird in menschlichen osteoblasten-ähnlichen Saos-2-Zellen durch Phorbol- 12-Myristat-12-acetat (PMA) bei einer Konzentration von 2 bis 200 mg/ml, das ein bekannter Stimulator von IL-6 in nicht Knochenzellen ist, durch IL-1 (1 bis 20 U/ml) und Parathyroidhormon (PTH) (10^-7 bis 10^-10 M) stimuliert.

In diesem Versuch wird die osteoblastische menschliche Osteosarkomzellenlinie Saos-2 in McCoy 5A Medium, das mit 15% (V/V) fetalem Kalbserum (FCS), Penicillin, Streptomycin und 2 mM L-Glutamin ergänzt ist, in einer 5% CO₂-haltigen Luftatmosphäre bebrütet. Wenn die Zellen konfluieren, werden sie nochmals mit einem Medium ernährt, das 2 oder 10% fetalem Kalbserum enthält und mit den zu prüfenden Mitteln ergänzt ist. Das Medium der Saos-2-Zellen wird dann nach einer Stimulierung von 48 Stunden oder 72 Stunden geerntet und bei 4°C aufbewahrt.

IL-6 ähnliche Aktivität wird in dem konditionierten Medium von Saos-2-Zellen unter Verwendung eines konventionellen Inkorporierungsversuchs von Tritium-Thymidin festgestellt, beispielsweise der B-Zellen (B13.29 Klonen)-Proliferationsversuch wie oben beschrieben. Bedeutende IL-6-Spiegel werden innerhalb von 48 Stunden bestimmt.

Die Ergebnisse lauten wie folgt:

FCS = 2%

1/10 Verdünnung des konditionierten Mediums

Es wird keine nachweisbare IL-6 ähnliche Aktivität unter kontrollierten nicht stimulierten Bedingungen beobachtet.

Versuch 7

Die Züchtung der Calvarienzellen der Maus wie oben im Versuch 2 beschrieben, führt zu erheblicher IL-6-Aktivität nach 48stündiger Kultur unter kontrollierten Bedingungen (20 000 cpm). Diese Aktivität wird in Gegenwart von Phorbol-12-myristat- 13-acetat (PMA) (1 bis 100 ng/ml) und von Parathyroidhormon, hPTH_1-34, (PTH) (10^-7 bis 10^-10 M) stimuliert.

Folgende Ergebnisse (³H Thymidin Inkorporierung in cpm) werden erhalten:

Die vorliegende Erfindung betrifft

i) ein Verfahren zur Hemmung der Knochenresorption oder zur Verstärkung der Knochenbildung oder zur Behandlung von Osteoporose, Osteoarthritis oder einem der oben angegebenen Zustände bei einem Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf, dadurch gekennzeichnet, daß einem solchen Patienten eine wirksame Menge einer IL-6-Verbindung verabreicht wird,
ii) die Verwendung einer IL-6-Verbindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die zur Hemmung der Knochenresorption, zur Verstärkung der Knochenbildung oder zur Behandlung von Osteoporose, Osteoarthritis oder einem der oben angegebenen Zustände eingesetzt wird,
iii) die Verwendung einer IL-6-Verbindung zur Hemmung der Knochenresorption oder zur Verstärkung der Knochenbildung oder zur Behandlung der Osteoporose, Osteoarthritis oder einem der oben angegebenen Zustände,
iv) eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Hemmung der Knochenresorption oder zur Verstärkung der Knochenbildung oder zur Behandlung von Osteoporose, Osteoarthritis oder einem der oben angegebenen Zustände, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine IL-6-Verbindung als Wirkstoff enthält.

Unter IL-6-Verbindungen werden Verbindungen verstanden, die hauptsächlich die gleiche Struktur oder das gleiche Aktivitätsspektrum besitzen, wie das bekannte IL-6 (siehe die o. e. PCT Patentanmeldung oder die o. e. Publikationen von Landsdorp und Aarden in Zusammenhang mit dem spezifischen Proliferationsversuch) oder Faktoren davon, beispielsweise Interferon β-2 wie in beispielsweise EP 220,574 A (Yeda), WO 88/00206 (Genetics Institute) und EP 257,406 A (Ajinomoto) beschrieben. Der Inhalt dieser Veröffentlichungen ist hier durch Referenz einbezogen.

Die IL-6-Verbindungen können glykosiliert sein, beispielsweise auf den Argininstellen. Sie können beispielsweise durch E. Coli oder CHO-Zellen hergestellt werden.

Die IL-6-Verbindung wie beschrieben ist ein Polypeptid mit 212 Aminosäuren. Gewünschtenfalls kann die erste oder die letzte Methioninaminosäure oder sogar der ganze nicht-kodierende Bereich fehlen, beispielsweise die ersten 28 Aminosäuren, von Met-Asn bis und mit Phe-Pro-Ala.

Die IL-6-Verbindung kann auch eine oder mehrere fehlende Aminosäuren haben; sie kann auch eine oder mehrere Aminosäuren zusätzlich besitzen oder eine oder mehrere Aminosäuren durch andere ersetzt haben und trotzdem ihre IL-6 ähnliche Aktivität aufweisen und gemäß der Erfindung wirksam sein.

Der Ausdruck IL-6-Verbindung umfaßt solche Analogen wie auch Verbindungen, die selektiv die IL-6-Aktivität in Knochenkulturen stimulieren, besonders solche Verbindungen, die selektiv sind, indem sie unwesentlich auf anderen Faktoren oder Knochenresorption auf andere Wege wirken.

Der Ausdruck umfaßt eine Verbindung der Formel I

Es umfaßt auch eine Verbindung der Formel I, die weitere Aminosäuren enthält, z. B. an die N-terminale Gruppe gebunden, beispielsweise Ala oder Met-Ala, oder der Formel II

worin X die Formel I bedeutet.

Der Ausdruck umfaßt weiter auch Verbindungen, worin eine oder mehrere Aminosäuren ersetzt sind oder fehlen, z. B. Verbindungen, die folgende Sequenz enthalten

beispielsweise als N-terminale Sequenz, und/oder hauptsächlich die gleiche Struktur der übrigen Verbindung bewahren.

Für diese therapeutischen Wirkungen ist die geeignete Dosis unterschiedlich und hängt beispielsweise von der genauen verwendeten IL-6-Verbindung, dem Wirt, der Art der Verabreichung und der Art und der Schwere der zu behandelnden Zustände ab. Im allgemeinen sind jedoch bei Tieren zufriedenstellende Resultate zu erwarten bei täglichen Dosen von ca. 0,5 µ/kg bis ca. 20 µ/kg Tierkörper-Gewicht. Bei größeren Säugetieren, beispielsweise Menschen, beträgt eine empfohlene tägliche Dosis im Bereich von ca. 25 µ bis ca. 1000 µ einer IL-6-Verbindung, die zweckmäßiger beispielsweise in Teildosen bis 4mal täglich verabreicht wird.

Die IL-6-Verbindungen können auf jedem üblichen Weg verabreicht werden, insbesondere enteral, beispielsweise in Form von Tabletten oder Kapseln, oder vorzugsweise parenteral, beispielsweise in Form von Injektionslösungen oder Suspensionen.

Beispiele von Verabreichungsmethoden und pharmazeutischen Zusammensetzungen für IL-6-Verbindungen sind bekannt und beispielsweise in den o. e. Veröffentlichungen beschrieben.

IL-6 ist die bevorzugte Verbindung. Es ist angezeigt, daß diese Verbindung in täglichen Dosen von 25 µbis 125 µ subkutan an größere Säugetiere, beispielsweise Menschen, verabreicht werden kann.

Pharmazeutische Präparate der Erfindung können IL-6-Verbindungen zusammen mit zumindest einem pharmazeutischen Träger oder Verdünner enthalten. Solche Zusammensetzungen können auf an sich bekannte Weise hergestellt werden. Einheitsdosisformen enthalten beispielsweise von ca. 4 µbis ca. 500 µ IL-6-Verbindung.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls eine Packung, die eine pharmazetische Zusammensetzung enthaltend eine IL-6- Verbindung zusammen mit Vorschriften für eine erfindungsgemäße Anwendung aufweist.

Claims

1. Verwendung einer IL-6-Verbindung zur Hemmung der Knochenresorption.

2. Verwendung einer IL-6-Verbindung zur Verstärkung der Knochenbildung.

3. Verwendung einer IL-6-Verbindung zur Behandlung von Osteoporose, Osteroarthritis, Paget Morbus, Knochentumor bedingter Osteolyse, Osteomalazie, Osteogenesis imperfecta, Osteomyelitis und Hyperkalzämie.

4. Verwendung einer IL-6-Verbindung zur Behandlung von multiplem Knochenmyelom.

5. Anwendung einer IL-6-Verbindung bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung gemäß einem der Patentansprüche 1 bis 4.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Anwendung bei einer der Behandlungen gemäß einem der Patentansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine IL-6-Verbindung als Wirkstoff enthält.

7. Zusammensetzung oder Verwendung nach irgendeinem der vorhergehenden Patentansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die IL-6-Verbindung eine Verbindung der Formel I ist:

8. Zusammensetzung oder Verwendung nach dem Patentanspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die IL-6-Verbindung Ala-X oder Met-Ala-X ist, worin X die Sequenz der Formel I ist.

9. Zusammensetzung oder Verwendung nach dem Patentanspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die IL-6-Verbindung die Sequenz enthält.

10. Eine Packung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Patentansprüche 6 bis 9 zusammen mit Vorschriften für eine Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält.