<Desc/Clms Page number 1>
EMI1.1
1 Nouvelle utilisation thérapeutique de l'interleukine-6
EMI1.2
Cette invention concerne la résorption osseuse.
L'interleukine-6 est une cytokine pour laquelle on a montré qu'elle produisait des fibroblastes et de nombreux autres types de cellules. La production de l'interleukine-6 et son activité sur, par exemple, la moelle osseuse, est décrite dans la demande PCT/US 87/01611 déposée à partir de la demande US nO 06/885905 déposée le 15 juillet 1986 (WO 88/00206). L'interleukine-6 semble avoir des cellules-cibles multiples. L'interleukine-6 s'est révélée être identique à
EMI1.3
l'interféron ss-2, au facteur 2 stimulant les lymphocytes B (BSF-2), à l'interleukine HP-1 et au facteur 26K. On doute maintenant que l'interleukine-6 puisse être considérée comme étant un interféron du fait de sa faible activité anti-virale.
On a rapporté que la production d'interleukine-6 peut être stimulée par l'interleukine-1 (IL-1) et le facteur de nécrose tumorale (TNFa) dans certaines cellules. On sait également que la production de prostaglandine Equi est un marqueur de la résorption osseuse, est stimulée par IL-A et TNFa.
Malgré les recherches intensives sur l'interleukine-6, en particulier dans les domaines immunologique et hématologique, aucun rapport n'a été fait sur les effets de l'interleukine-6 sur la résorption ou la formation osseuse.
On a maintenant découvert que les molécules de IL-6 (telles que définies ci-après) sont utiles pour inhiber la résorption osseuse et augmenter la formation osseuse. Elles sont ainsi utiles pour traiter l'ostéoporose, par exemple les stades aigus et/ou chroniques de l'ostéoporose post-ménopausique, y compris l'ostéoporose primaire et/ou secondaire et l'ostéoporose localisée, l'ostéoporose post-traumatique, la maladie osseuse de Paget (ostéite déformante hypertrophique), l'ostéolyse due à des malignités osseuses, par exemple l'ostéosarcome, l'ostéodystrophie, par exemple l'ostéodystrophie rénale, l'ostéomalacie, le myélome mul-
<Desc/Clms Page number 2>
tiple des os, la dysplasie périostale ou l'ostéopsathrose, l'hypercalcémie, l'ostéomyélite, par exemple en conjonction avec les antibiotiques et la calcification ectopique.
Les résultats ci-dessous montrent que les molécules de IL-6 (telles que définies ci-après) : i) inhibent la sécrétion de PGE2 des cultures de cellules osseuses (essai 1) ii) inhibent la stimulation de la sécrétion de PGE2 induite, par exemple, par deux lymphokines, l'interleukine-1 et le facteur de nécrose tumorale, dans les cultures osseuses (essai 2), iii) augmentent la formation osseuse (essai 3), et iv) diminuent la résorption osseuse (essai 4 et essai 5).
De plus, il est montré que les ostéoblastes, qui servent également de médiateurs des ostéoclastes, produisent une activité d'interleukine-6 (essais 6 et 7).
Comme on l'utilise ci-après, 1 unité (U) d'activité d'interleukine-6 désigne la quantité de molécules de IL-6 qui provoquent la moitié du maximum de stimulation dans le dosage de la prolifération des lymphocytes B, par exemple au moyen du clone B13.29 (qui est disponible frais auprès du Laboratoire Central de la Croix Rouge Néerlandaise, Service de Transfusion Sanguine, Boite Eostale 9406,1006 AK Amsterdam), comme le décrivent le dosage spécifique de Landsdorp et coll., Curr. Top. Microbiol. Immunol. (1986) 132,105 et Aarden et coll. Eur. J. Immunol. (1987) 17,1411. 1 x 108 unités représente environ 1 mg de polypeptide.
En bref, les cellules sont mises en suspension dans un milieu de culture (milieu de Dulbecco modifié Iscove supplé- menté avec 5% (en volume/volume) de sérum de veau foetal (pénicilline et streptomycine) et cultivé sur des plaques de microtitrage (5 x 103 cellules/200 u. l de milieu). Les cellules sont cultivées pendant 48 heures dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO dans l'air à 37OC, les 6 dernières heures en présence de 1 microCi de [Hj-thymidine et la ra-
<Desc/Clms Page number 3>
dioactivité incorporée dans les noyaux est analysée.
Le milieu conditionné à étudier est soumis à des dilutions successives dans le milieu cellulaire B13. 29.
L'interleukine-6 pour laquelle sont indiqués les résultats de l'essai désigne la IL-6 glycosylée produite par les cellules CHO, et éventuellement purification pour éliminer le LPS (lipopolysaccharide).
Dans la suite on utilise l'abréviation interleukine-l a = IL-l.
Essai 1
La production basale de prostaglandine E2 dans la lignée cellulaire d'ostéosarcome chez le rat ROS 17/2,8 est inhibée à une concentration d'environ 0, 01 à environ 100 U/ml de molécule de IL-6. Dans cet essai, on cultive les cellules de la lignée cellulaire d'ostéosarcome chez le rat ROS 17/2,8 dans le milieu essentiel minimal de Dulbecco et le milieu F12 (1 : 1) contenant 10% de sérum de veau foetal et 2 mM de L-glutamine dans une atmosphère humidifiée de 5% de C02 dans l'air à 37 C. A la confluence, les cellules sont traitées avec la concentration ci-dessus de molécule de IL- 6. Au bout de 24 heures de culture, on dose une partie aliquote du milieu pour déterminer la teneur en prostaglandine E2 en utilisant un dosage radioimmunologique standard.
Les résultats obtenus avec l'interleukine-6 sont les suivants :
EMI3.1
<tb>
<tb> Concentration <SEP> d'interleukine-6 <SEP> PGE2
<tb> en <SEP> U/ml <SEP> pg <SEP> (picogrammes)/ml
<tb> 0 <SEP> (Témoin) <SEP> 184
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> 151
<tb> l, <SEP> 0. <SEP> 128
<tb> 10 <SEP> 118
<tb>
Essai 2
La production de prostaglandine E2 produite par stimulation des cellules de la calotte crânienne de la souris par l'interleukine-1 et le facteur de nécrose tumorale est ré-
<Desc/Clms Page number 4>
duite à une concentration d'environ 10 à environ 100 unités/ml de molécule de IL-6.
Dans cet essai, on prépare d'abord des cultures organiques de calotte crânienne de souris.
Les os frontal et pariétal sont disséqués chez des souris (souche CD-1) néonatales (âgées de 5 à 6 jours), fendus le long de la suture sagittale et cultivés dans 2 ml de milieu BGJ contenant 1 mg/ml de sérumalbumine de boeuf, de pénicilline et de streptomycine dans des puits de culture tissulaire en matière plastique de 35 mm.
Après la période de préculture (24 heures), on remplace le milieu par le milieu de culture BGJ supplémenté avec de l'interleukine-1 en concentration de 10 unités ou par TNFa en concentration de 10 nanogrammes/ml et on cultive la molécule IL-6 à la concentration ci-dessus pendant 48 heures supplémentaires. Tout au long de la période de culture, on secoue les boîtes à plusieurs puits sur une plate-forme oscillante (15 oscillations/minute) dans une atmosphère humidifiée de 5% de C02 dans l'air à 37 C. Le milieu conditionné à la. calotte crânienne est récolté et placé à 4 C.
On dose ensuite la prostaglandine E2 dans une partie aliquote du milieu en utilisant un dosage radioimmunologique.
Les résultats obtenus avec l'interleukine-6 sont les suivants : Stimulation par 10 U/ml d'interleukine-l
EMI4.1
<tb>
<tb> Concentration <SEP> d'interleu- <SEP> Prostaglandine <SEP> E2
<tb> kine-6 <SEP> (unités/ml) <SEP> pg/ml
<tb> 0 <SEP> 4800
<tb> 10 <SEP> 4400
<tb> 100 <SEP> 500*
<tb>
(*équivalent à la valeur du témoin sans stimulation par l'interleukine-6).
<Desc/Clms Page number 5>
Stimulation par 10 ng/ml de TNFa
EMI5.1
<tb>
<tb> Concentration <SEP> d'interleu-Prostaglandine <SEP> E
<tb> kine-6 <SEP> (unités/ml) <SEP> pg/ml
<tb> 0 <SEP> 3300
<tb> 10 <SEP> 1200
<tb> 100 <SEP> 800*
<tb>
(*Valeur du témoin sans stimulation = 500 pg/ml)
Si la stimulation de la sécrétion de la prostaglandine E2 est induite par l'hormone parathyroïde non-lymphokine (10-800), on peut encore alors observer une petite inhibition de la synthèse de la prostaglandine.
EMI5.2
<tb>
<tb>
Concentration <SEP> d'interleu-Prostaglandine <SEP> E
<tb> kine-6 <SEP> (unités/ml) <SEP> pg/ml
<tb> 0 <SEP> 3700
<tb> 10 <SEP> 3450
<tb> 100 <SEP> 3300
<tb>
L'interleukine-6 n'a pas d'effet sur la synthèse de la prostaglandine E2 des cultures osseuses non stimulées dans l'essai ci-dessus.
Essai 3
Les molécules de IL-6 augmentent la formation osseuse, comme l'indique une incorporation accrue de [3H]-proline dans les protéines collagènes et non collagènes dans la calotte crânienne des rats foetaux.
Les cultures organiques de calotte crânienne de rat sont préparées par dissection des os frontal et pariétal chez des rats foetaux âgés de 21 jours, fente le long de la suture sagittale et culture selon la méthode de Kream et coll. (Endocrinology (1985) 116, 296).
Les molécules de IL-6 sont ajoutées en doses de 1 à 100 unités à 2 ml de cultures. La culture est effectuée pendant 24 à 48 heures.
Pour quantifier l'incorporation de [3H]-proline dans une protéine digérable par la collagénase et une protéine non collagène, on digère des homogénéisais osseux avec une
<Desc/Clms Page number 6>
collagénase bactérienne selon la méthode de Diegelmann R. et Peterkofsky (Dev. Biol. (1972) 28 : 443), modifiée par Kream et coll. (Endocrinology (1985) 116 : 296).
Essai 4
Les molécules de IL-6 diminuent la résorption osseuse, comme l'indique une diminution de la libération de [45] Ca des os.
L'essai est effectué selon les principes de Raisz (J.
Clin. Invest. (1965) 44, 103).
Des rats gravides reçoivent une injection sous-cutanéede [45] Ca au dix-huitième jour de gestation. Du placebo ou des molécules de IL-6 (1 à 100 unités par animal) sont injectés par voie sous-cutanée. Le dix-neuvième jour, les animaux sont sacrifiés, les foetus retirés. Les corps des radius et des cubitus minéralisés sont disséqués et placés en culture.
La résorption est quantifiée sur la base de la libération de [45] Ca des explants osseux.
Essai 5
Les molécules de IL-6 diminuent la résorption osseuse, comme l'indique une diminution du nombre d'ostéoclastes et une augmentation de la densité des os, mise en évidence par l'essai suivant :
On utilise des souris en croissance (âgées de 6 à 8 semaines ; poids environ 20 g). Des molécules de IL-6, en doses d'environ 0,1 à environ 10 ug, par exemple de 1 gg, sont injectées par voie sous-cutanée sous les os de la calotte crânienne, par exemple sur les os frontal et temporal du crâne.
Les injections sont faites quotidiennement pendant 3 à 10 jours. 5 jours, 7 jours ou 2 semaines après l'arrêt du traitement, les animaux sont sacrifiés. Les os de la calotte crânienne sont examinés par histologie. Par exemple, les os frontal et temporal sont fixés, sectionnés et inclus. La diminution de la formation osseuse par rapport aux animaux témoins est observée sur une base morphologique, par exemple par un os plus dense et par une diminution du nombre d'os-
<Desc/Clms Page number 7>
téoclastes révélée par coloration, par exemple avec une phosphatase acide résistante au tartrate.
En outre, on observe une augmentation de la formation osseuse dans les os de la calotte crânienne, par exemple les os frontal et temporal, par rapport aux animaux témoins, sur une base morphologique, par exemple par l'accroissement de la croissance osseuse, et on l'observe également par l'augmentation du nombre d'ostéoblastes.
Essai 6
La libération d'une activité analogue à celle de l'interleukine-6 est stimulée, dans les cellules Saos-2 analogues à l'ostéoblaste humain, par le 12-myristate-13-acétate de phorbol (PMA) (qui est un stimulateur connu de l'interleukine-6 issu de cultures cellulaires non osseuses) (en concentration de 2 à 200 ng/ml), l'interleukine-1 (1 à 20 unités/ ml) et l'hormone parathyroïde (PTH) (10-7 à 10-10M).
Dans cet essai, la lignée cellulaire Saos-2 de l'ostéosarcome humain ostéoblastique est cultivée dans un milieu 5A de McCoy supplémenté par 15% (en volume/volume) de sérum de foetus de veau (FCS), de la pénicilline, de la streptomycine et 2 mM de L-glutamin dans une atmosphère humidifiée de 5% de C02 dans l'air à 37 C. A la confluence, les cellules sont réalimentées par du milieu contenant 2 ou 10% de sérum de foetus de veau et supplémenté par les différents agents à étudier. Le milieu des cellules Saos-2 est récolté au bout de 48 heures ou de 72 heures de stimulation et stocké à 4 C.
L'activité de type interleukine-6 est décelée à l'aide d'un dosage par incorporation de thymidine tritiée classique, de la manière suivante.
Le milieu conditionné de cellules Saos-2 est analysé et l'on dose la présence d'une activité de type interleukine-6 au moyen du dosage de prolifération des lymphocytes B (clone B13. 29) sus-mentionné.
Les niveaux significatifs d'interleukine-6 sont détectés en 48 heures.
<Desc/Clms Page number 8>
Les résultats représentatifs sont les suivants : FCS = 2% Dilution du milieu de conditionnement 1/10
EMI8.1
<tb>
<tb> Stimulateur <SEP> incorporation <SEP> de <SEP> 3H-thymidine
<tb> (cpm) <SEP> *
<tb> Néant <SEP> 874
<tb> PMA <SEP> (20 <SEP> mg/ml) <SEP> 61015
<tb> IL-1 <SEP> (10 <SEP> U/ml) <SEP> 23189
<tb> PTH <SEP> (10-8M) <SEP> 1287
<tb>
* (fond = 400 cpm ; incorporation maximale 66000 cpm)
On n'observe aucune quantité décelable d'activité de type interleukine-6 dans les conditions non stimulées témoins.
Essai 7
La culture des cellules de la calotte crânienne de la souris décrite ci-dessus dans l'essai 2 donne une activité de type interleukine-6 significative dans les conditions témoins (20000 cpm) au bout de 48 heures de culture. Celle-ci est stimulée en présence de 12-myristate-13-acétate de phor-
EMI8.2
bol (PMA) (1 à 100 ng/ml) et d'hormone parathydoïde, hPTHl-34 (PTH) (10-7 à 10-10M).
Les résultats obtenus (incorporation de 3H-thymidine en cpm) sont :
<Desc/Clms Page number 9>
EMI9.1
<tb>
<tb> Dilution <SEP> Témoin <SEP> PMA <SEP> PMA <SEP> PMA
<tb> 100 <SEP> ng/ml <SEP> 10 <SEP> ng/ml <SEP> 1 <SEP> ng/ml
<tb> 1 <SEP> 10 <SEP> 39919 <SEP> 47510 <SEP> 37679 <SEP> 48150
<tb> 2 <SEP> 100 <SEP> 9075 <SEP> 48239 <SEP> 36162 <SEP> 18145
<tb> 3 <SEP> 1000 <SEP> 680 <SEP> 27694 <SEP> 17687 <SEP> 1370
<tb> 4 <SEP> 10000 <SEP> 346 <SEP> 5885 <SEP> 2545 <SEP> 580
<tb> 5 <SEP> 100000 <SEP> 305 <SEP> 595 <SEP> 572 <SEP> 411
<tb> PTH <SEP> 7 <SEP> PTH <SEP> 8 <SEP> PTH <SEP> 9 <SEP> PTH
<tb> 10-7 <SEP> M <SEP> 10-8 <SEP> M <SEP> 10-9 <SEP> M <SEP> 10-10 <SEP> M
<tb> l <SEP> 12326 <SEP> 14638 <SEP> 16252 <SEP> 35897
<tb> 2 <SEP> 23222 <SEP> 26885 <SEP> 30172 <SEP> 13073
<tb> 3 <SEP> 22816 <SEP> 18503 <SEP> 9059 <SEP> 827
<tb> 4 <SEP> 1935 <SEP> 1279 <SEP> 1095
<SEP> 531
<tb> 5 <SEP> 336 <SEP> 452 <SEP> 682 <SEP> 678
<tb>
La présente invention fournit donc i) un procédé d'inhibition de la résorption osseuse ou d'augmentation de la formation osseuse ou de traitement de l'ostéoporose ou de l'arthrose ou de toute autre indication mentionnée ci-dessus, chez un sujet, qui comprend l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'une molécule IL-6 à un sujet nécessitant un tel traitement, ii) l'utilisation d'une molécule de IL-6 dans la fabrication d'un médicament convenant pour inhiber la résorption osseuse ou augmenter la formation osseuse ou traiter l'ostéoporose ou l'arthrose ou toute autre indication mentionnée ci-dessus, iii)
l'utilisation d'une molécule de IL-6 pour inhiber la résorption osseuse ou augmenter la formation osseuse ou traiter l'ostéoporose ou l'arthrose ou toute autre indication mentionnée ci-dessus, ou iv) un médicament pour inhiber la résorption osseuse ou augmenter la formation osseuse ou traiter l'ostéoporose ou l'arthrose ou toute autre indication mentionnée ci-dessus, contenant une molécule de IL-6.
L'expression molécule de IL-6 signifie n'importe quel
<Desc/Clms Page number 10>
composé correspondant à, ayant essentiellement la même structure ou le même spectre d'activité que, l'interleukine- 6 connue (voir la demande PCT sus-mentionnée ou le dosage de prolifération spécifique indiqué ci-dessus par référence aux publications de Lansdorp et Aarden) ou des facteurs mentionnés ci-dessus, par exemple l'interféron ss-2 tel que décrit, par exemple, dans EP-A-220 574 (Yeda), la demande PCT WO 88/00206 (Genetics Institute) et EP-257 406 (Ajinomoto). Le contenu de toutes ces publications (appelées dans la suite publications d'interleukine-6) est cité ici à titre de référence.
La molécule de IL-6 peut être glycosylée, par exemple sur les sites d'arginine, et peut être produite, par exemple, à partir de cellules de E. coli ou de CHO.
La molécule IL-6, telle qu'elle est décrite, est un polypoptide à 212 acides aminés. Si on le souhaite, on peut supprimer le premier acide aminé ou le dernier acide aminé méthionine, ou même la totalité de la région non codante, c'est-à-dire les 28 premiers acides aminés, depuis Met. Asn jusqu'à, et y compris, Phe Pro Ala.
L'interleukine-6 peut avoir un, deux ou trois, ou plus, acides aminés absents, ajoutés ou remplacés par d'autres et toujours conserver une activité. de type interleukine-6, et être active dans le procédé de l'invention.
La molécule IL-6 d'expression couvre ces analogues ainsi que tout composé qui stimule sélectivement l'activité de type IL-6 dans les cultures osseuses, en particulier si le composé est sélectif dans la mesure où il a une action immatérielle sur d'autres facteurs ou sur la résorption osseuse par d'autres voies.
Le terme inclut donc un composé de formule
PRO VAL PRO PRO GLY GLU ASP SER LYS ASP VAL
ALA ALA PRO HIS ARG GLN PRO LEU THR SER SER
GLU ARG ILE ASP LYS GLN ILE ARG TYR ILE LEU
ASP GLY ILE SER ALA LEU ARG LYS GLU THR CYS
ASN LYS SER ASN MET CYS GLU SER SER LYS GLU
<Desc/Clms Page number 11>
ALA LEU ALA GLU ASN ASN LEU ASN LEU PRO LYS
MET ALA GLU LYS ASP GLY CYS PHE GLN SER GLY
PHE ASN GLU GLU THR CYS LEU VAL LYS ILE ILE
THR GLY LEU LEU GLU PHE GLU VAL TYR LEU GLU
TYR LEU GLN ASN ARG PHE GLU SER SER GLU GLU
GLN ALA ARG ALA VAL GLN MET SER THR LYS VAL
LEU ILE GLN PHE LEU GLN LYS LYS ALA LYS ASN
LEU ASP ALA ILE THR THR PRO ASP PRO THR THR
ASN ALA SER LEU LEU THR LYS LEU GLN ALA GLN
ASN GLN TRP LEU GLN ASP MET THR THR HIS LEU
ILE LEU ARG SER PHE LYS GLU PHE LEU GLN SER
SER LEU ARG ALA LEU ARG GLN MET.
Il inclut également un composé de formule I comportant des acides aminés additionnels, par exemple fixés au groupe N-terminal, par exemple Ala ou Met Ala ou de formule II :
ALA PRO THR SER SER SER THR LYS LYS THR GLN
LEU GLN LEU GLU HIS LEU LEU LEU ASP LEU PHE (II)
ARG ALA-X dans laquelle X a la formule I.
Le terme inclut également des molécules dans lesquelles un ou plusieurs acides aminés sont remplacés ou supprimés, par exemple incorporant la séquence :
PRO VAL PRO PRO GLY GLU ASP SER LYS
ASP VAL ALA ALA par exemple comme séquence N-terminale, et/ou conservant essentiellement la même séquence du reste.
Pour ces indications, le dosage approprié variera, bien entendu, suivant, par exemple, la molécule IL-6 exacte employée, l'hôte, le mode d'administration et la nature et la gravité du trouble à traiter. Cependant, en général, il a été indiqué que l'on obtenait des résultats satisfaisants chez les animaux avec des posologies quotidiennes d'environ 0, 5 ug/kg à environ 20 lig/kg de poids corporel de l'animal.
Chez les mammifères plus grands, par exemple les hommes, une
<Desc/Clms Page number 12>
indication de la posologie quotidienne est dans l'intervalle d'environ 25 ug à environ 1000 ug d'une molécule IL-6 administrée de façon convenable, par exemple en prises séparées jusqu'à quatre fois par jour.
Les molécules IL-6 peuvent être administrées par toute voie classique, en particulier par voie entérale, par exemple sous forme de comprimés ou de capsules, ou de préférence parentérale, par exemple sous forme de solutions ou de suspensions injectables.
Par exemple, des méthodes d'administration et des formulations galéniques à utiliser pour l'interleukine-6 sont connues, par exemple d'après les publications de l'interleukine-6 sus-mentionnées.
L'interleukine-6 est le composé préféré. Les résultats des essais sont indiqués ci-dessus. Il est indiqué que le composé peut être administré à des posologies quotidiennes de 25 ug à 125 ug par injection sous-cutanée à des mammifères plus grands, par exemple les hommes.
Les compositions pharmaceutiques peuvent comprendre une molécule de IL-6 en association avec au moins un véhicule ou diluant pharmaceutique. Ces compositions peuvent être fabriquées d'une manière classique. Les formes posologiques unitaires contiennent, par exemple d'environ 4 ug à environ 500 u. g de la molécule de IL-6.
La présente composition fournit également un emballage contenant une composition pharmaceutique comprenant une molécule de IL-6 ainsi qu'un mode d'emploi dans un procédé tel que défini ci-dessus.