NL8900524A - Beenresorptie. - Google Patents

Description

* i, - Beenresorptie -

Deze uitvinding heeft betrekking op beenresorptie.

Interleukine 6 is een cytokine, die door fibroblasten en vele andere celtypen blijkt te worden gevormd. De vorming van interleukine 6 en de werking ervan op bijvoorbeeld beenmerg is beschreven 5 in de PCT aanvrage PCT/US 87/01611 ingediend van de Amerikaanse aanvrage 06/885905 ingediend op 15 juli 1986 (WO 88/00206).

Interleukine 6 schijnt veelvuldige doelwitcellen te hebben. Interleukine 6 bleek identiek te zijn met interferon β-2, B-cellen stimulerende factor 2 (BSF-2), interleukine HP-1 en 26K factor.Het is nu twijfel-10 achtig of interleukine-6 gezien de lage anti-virale werking ervan nogwel als interferon kan worden beschouwd. Vermeld is, dat de produktie van interleukine 6 kan worden gestimuleerd door interleukine 1 (IL-1) en tumornecrose factor (TNFalfa) in bepaalde cellen. Het is eveneens bekend dat de prostaglandine produktie^ een merker van 15 beenresorptie, wordt gestimuleerd door IL-1 en TNFalfa.

In weerwil van intensief onderzoek met interleukine-6, in het bijzonder op immunologisch en hematologisch gebied, bestaat er geen verslag van de effecten van interleukine 6 op de beenresorptie of -vorming.

20 Gevonden werd nu dat IL-6 moleculen ( zoals hierna gede finieerd) bruikbaar zijn bij de remming van beenresorptie en de toename van beenvorming. Ze zijn dus bruikbaar bij de behandeling van osteoporose , bijvoorbeeld acute en/of chronische stadia van postmenopauzale osteoporose, waaronder primaire en/of secundaire 25 osteoporose en gelokaliseerde osteoporose, posttraumatische osteoporose, de ziekte van Paget van beenderen (osteitis deformans), osteolyse ten gevolge van kwaadaardige beenziekten, bijvoorbeeld osteogeen sarcoom, osteodystrofie, bijv. renale osteodystrofie,, osteomalacie, multiple myeloma van de beenderen, osteogenesis imperfecta, hyper-30 calcemie, osteomyelitis, bijvoorbeeld tezamen met antibiotica en ectopische calcificatie.

Uit de hierna volgende resultaten blijkt dat IL-6 moleculen ( zoals hierna gedefinieerd): i) de secretie uit beencelcultures remmen (proef 35 1) , ii) PGE2 secretie stimulatie geïnduceerd door bijvoorbeeld 8900524 * « - 2 - twee lymfokinen, interleukine-1 en tumornecrose factor, in beeneultures, remmen (proef 2), iii) beenvorming doen toenemen (proef 3) , en iv) beenresorptie verminderen (proef 4 en 5).

5 Bovendien is aangetoond dat osteoblasten , die eveneens * ί osteoclasten medieren, een interleukine-6 activiteit geven ( de proeven 6 en 7).

Zoals hierna wordt toegepast duidt één eenheid (U) inter- leukine-6 werking op de hoeveelheid IL-6 molecuul die de helft van 10 de maximale stimulering bij het B-cellen vermeerderingsonderzoek veroorzaakt, bijvoorbeeld onder toepassing van kloon B13.29 (dat vrij verkrijgbaar is bij het centrale laboratorium van het Nederlandse

Rode Kruis, bloedtransfusiedienst, Postbus 9406, 1006 AK Amsterdam) zoals beschreven is in het specifieke onderzoek van Landsdorp en 15 med. Curr. Top. Microbiol. Immunol. (1986) 132 , 105 en Aarden 8 en med. Eur. J. Immunol. (1987) Γ7, 1411.1 x 10 eenheden is ongeveer 1 mg polypeptide .

In het kort gezegd worden cellen gesuspendeerd in cultuur- medium (Iscove's gemodificeerd Dulbecco's medium aangevuld met 5% 20 (v/v) foetaal kalfsserum, penicilline en streptomycine) en op platen 3 gebracht (5jl0 cellen /200 uL medium) in microtiter platen. De cellen worden 48 uren in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO in lucht bij 37°C gekweekt, de laatste 6 uren in aanwezigheid van 1 microCi [3H] thymidine en de radioactiviteit die opgenomen is 25 in de kernen werd geanalyseerd. Het te onderzoeken , geconditioneerde medium werd volgens een reeks verdund in B13.29 celmedium.

Het interleukine-6 waarvoor de onderzoekresultaten zijn gegeven heeft betrekking op geglycosyleerd IL-6 geproduceerd door CHO cellen ,desgewenst gezuiverd ter verwijdering van LPS (lipo-30 polysaccharide).

Zoals hierna toegepast is interleukine-1 alfa= IL-1.

Onderzoek 1

De basale produktie van prostaglandine bij de osteosarcoom cellijn ROS 17/2.8 van ratten werd geremd in een concentratie van 35 ongeveer 0,01 tot ongeveer 100 U/ml IL-6 molecuul. Volgens deze proef werden cellen van de osteosarcoom cellijn ROS 17/2.8 van ratten gekweekt in Dulbecco's minimaal essentieel medium en medium P12 (1:1), bevattende 10% feotaal kalfsserum en 2 mM L-glutamine, in 89 0 0 524 .

*

V

- 3 - een bevochtigde atmosfeer van 5% CO^ in lucht bij een temperatuur van 37°C. Bij samenvloeiing werden de cellen behandeld met de hiervoor genoemde concentratie van IL-6 molecuul. Na 24 uren kweken werd 5 een portie van het medium onderzocht op prostaglandine E^, onder toepassing van een standaard radioimmunoassay.

De resultaten verkregen met interleukine-6 zijn :

Concentratie van PGE^ interleukine-6 in ü/ml _ . . , , .

Pg (picogrammen)/ml 10 0 (controle) 184 0,1 151 1,0 128 10 118 15

Onderzoek 2

De vorming van prostaglandine door stimulering van calvariale cellen van muizen door interleukine-1 en tumornecrose factor wordt verminderd bij een concentratie van ongeveer 10 tot 20 ongeveer 100 eenheden ml IL-6 molecuul.

Volgens dit onderzoek werden eerst orgaancultures van muis calvaria bereid:

Frontale en parietale beenderen werden gesneden uit neonatale (5 tot 6 dagen oude) muizen (stam CD-I), gespleten langs 25 de sagittatenaad en gekweekt in 2 ml BGJ-medium bevattende 1 mg/ml runderserumalbumine, penicilline en streptomycine in weefselcultuurholten van kunststof van 35 mm.

Na de voorcultuurperiode (24 uren ) werd het medium vervangen door BGJ-cultuurmedium aangevuld met interleukine-1 in 30 een concentratie van 10 eenheden of TNFalfa in een concentratie van 10 nanogram per ml en het IL-6 molecuul in de hiervoor vermelde concentratie en gekweekt voor nog eens 48 uren. Gedurende deze gehele kweekperiode, werden de -platen met vele holten geschud op een schudplateau (15 oscillaties per minuut) in een bevochtigde atmosfeer 35 van 5 % CO^ in lucht van 37°C . Het calvaria-geconditioneerde medium werd gewonnen en gebracht op 4°C.

Een fractie van het medium werd daarna onderzocht op prostaglandine E^ onder toepassing van radioimmunoassay.

89 00524 » - 4 -

De resultaten verkregen met interleukine-6 zijn:

Stimulatie door 10 U/ml interleukine-1

Concentratie van inter- Prostaglandine leukine-6 (eenheden/ml) pg/ml 5 0 4800 10 4400 100 500* (* equivalent aan de controle-waarde zonder stimulering door Interleukine-10 6)‘

Stimulatie door 10 ng/ml TNFa

Concentratie van inter- Prostaglandine E^ leukine-6 (eenheden/ml) pg/ml 15 0 3300 10 1200 100 800* (* Controle-waarde zonder stimulatie = 500 pg/ml) 20 indien de prostaglandine E secretie stimulering wordt 2 -8 geïnduceerd door het niet-lymfokine parathyroide hormoon (10 molair) , wordt nog een geringe remming van de prostaglandine synthese waargenomen.

25

Concentratie van mterleu- Prostaglandine E^ kine-6 (eenheden/ml) pg/ml 0 3700 10 3450 30 100 3300

Interleukine-6 heeft geen effect op de prostaglandine E^ synthese van niet- gestimuleerde beencultures bij de hiervoor beschreven proef.

35

Onderzoek 3 IL-6 moleculen vergroten de beenvorming , zoals blijkt uit een toegenomen opname van [3H]proline in collageen en niet-collageen eiwitten in foetale rattencalvaria.

89 00 52 4 /

A

- 5 -

Orgaancultures van rattencalvaria werden bereid door frontale en parietale beenderen van 21 dagen oude foetale ratten uit te snijden, ze langs de sagittale naad te splitsen en te kweken volgens de methode van Kream en med. (Endocrinology (1985) 5 116 , 296).

De IL-6 moleculen werden in doses van 1-100 eenheden toegevoegd aan 2 ml van de cultures. Het kweken geschiedde gedurende 24 tot 48 uren.

Ter bepaling van de hoeveelheid [3H]proline die in 10 collagenase-verteerbaar eiwit en niet-collageen eiwit is opgenomen, werden beenhomogenisaten gedigereerd met bacteriele collagenase volgens de methode van Diegelmann R. en Peterkofsky (Dev. Biol.

(1972) 28:443 en gemodificeerd door Kream en med. (Endocrinology (1985) 116:296).

15

Onderzoek 4 IL-6 moleculen verlagen de beenresorptie, zoals blijkt uit een daling in de vrijmaking van [45]Ca uit gebeente.

De proef werd uitgevoerd volgens de principes van Raisz 20 (j. Clin.-Invest. (1965) 44, 103).

Zwangere ratten werden s.c. geïnjecteerd met [45]Ca op de 18e dag van de zwangerschap. Placebo of IL-6 moleculen (1-100 eenheden per dier) werden subcutaan geïnjecteerd. Op de 19e dag werden de dieren opgeofferd en de foetussen werden verwijderd.

De gemineraliseerde scheden van de radii en ulnae werden weggesneden 25 en in een cultuur gebracht. De resorptie werd kwantitatief bepaald op basis van de vrijmaking van [45]Ca uit de beenexplantatio's.

Onderzoek 5 IL-6 moleculen verminderen de beenresorptie, zoals blijkt 30 uit een verlaagd aantal osteoclasten en een toegenomen dichtheid van beenderen}zoals blijkt uit de volgende proef:

Er werd gebruik gemaakt van groeiende muizen (6 tot 8 wéken oud, gewicht ongeveer 20 g) . IL-6 moleculen in doses van ongeveer 0,1 tot ongeveer 10 pg , bijvoorbeeld 1 pg, werden sub-35 cutaan geïnjecteerd over de calvariale beenderen^ bijvoorbeeld over de frontale en temporale beenderen van de schedel. Dagelijks werden 89 00524 * - 6 - gedurende 3 tot 10 dagen injecties toegediend. Vijf dagen, 7 dagen of 2 weken na het beëindigen van de behandeling werden de dieren opgeofferd. De calvariale beenderen werden histologisch onderzocht.

Zo werden bijvoorbeeld de frontale en temporale beenderen gefixeerd, 5 in schijfjes gesneden en ingebed.De vermindering van de beenvorming ten opzichte van controledieren werd waargenomen op morfologische basis , bijvoorbeeld door een dichter been en door een verminderd aantal osteoclasten zoals blijkt door verkleuring, bijvoorbeeld met tegen tartraat bestandzijnde zuurfosfatase.

10 Bovendien werd een toename van de beenvorming in de calvariale beenderen, bijvoorbeeld frontale en temporale beenderen, ten opzichte van controledieren waargenomen op morfologische basis, bijvoorbeeld door een toegenomen beendergroei en werd eveneens waargenomen door een verhoging van het aantal osteoblasten.

15

Onderzoek 6

De ontwikkeling van interleukine-6 achtige werking wordt gestimuleerd in humane osteoblast-achtige Saos-2 cellen door forbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) (een bekende stimulator van 20 interleukine-6 uit niet-beendercelcultures)( bij een concentratie van 2-200 nanogram/ml) , interleukine-1 (1-20 eenheden per ml) en -7 -10 parathyroid hormoon (PTH) (10 tot 10 M).

Bij dit onderzoek werd de osteoblastische humane osteo-sarcoomcellijn Saos-2 gekweekt in McCoy's 5A medium aangevuld met 25 15% (v/v) foetaal kalfsserum (PCS), penicilline, streptomycine en 2 mM L-glutamine in een vochtig gemaakte atmosfeer van 5% CO^ in lucht bij 37°C. Bij samenvloeien werden de cellen weer voorzien van medium bevattende 2 of 10% foetaal kalfsserum en aangevuld met de verschillende, te onderzoeken, middelen. Het medium van de Saos-30 2 cellen werd na een stimulatieperiode van 48 uren of 42 uren gewonnen en bij 4°C opgeslagen.

De interleukine-6 achtige werking werd aangetoond onder toepassing van een gebruikelijke tritium-thymidine opnameonderzoek en wel op de volgende wijze: 35 Geconditioneerd medium van Soas-2 cellen werd onderzocht op de aanwezigheid van interleukine-6 werking onder toepassing van het hiervoor genoemde B-cel (kloon B13.29) vermeerderingsonderzoek.

Significante spiegels van interleukine-6 werden na 48 8300 524 - 7 - uren gevonden.

De representatieve resultaten waren: FCS = 2%

Verdunning van conditioneel medium 1/10 5

Stimulator 3H-thymidine opname (cpm)*

Geen 874 PMA (20 mg/ml) 61015 10 IL-1 (10 ü/ml) 23189 PTH (10~8 M) 1287 * (basis = 400 cpm? maximale opname 66000 cpm)

Er werden geen aantoonbare hoeveelheden van een interleukine-15 6 achtige werking onder controle van niet-stimulerende omstandigheden waargenomen.

Onderzoek 7

Het kweken van calvariale cellen van muizen beschreven 20 hiervoor onder onderzoek 2 gaf een significante interleukme-6 werking onder controle omstandigheden ( 20.000 cpm) na 48 uren kweken. Dit werd gestimuleerd in de aanwezigheid van forbol 12-myristaat 13- acetaat (PMA) (1 tot 100 ng/ml) en parathyroidhormoon, hPTH^_^, (PTH) (10~7 tot 10~10 M).

25

De verkregen resultaten ( H thymidine opname m cpm) zijn:

Verdunning Controle PMA PMA PMA

100 ng/ml 10 ng/ml 1 ng/ml 30 1 10 39919 47510 37679 48150 2 100 9075 48239 36162 18145 3 1000 680 27694 17687 1370 4 10.000 346 5885 2545 580 5 100.000 305 595 572 411 35

PTH 7 PTH 8 PTH 9 PTH

10-7 M 10-8 M 10-9 M 10-10 M

8900524.

t * - 8 - (vervolg tabel) 1 12326 14638 16252 35897 2 23222 26885 30172 13073 5 3 22816 18503 9059 827 4 1935 1279 1095 531 5 336 452 682 678 10

De onderhavige uitvinding verschaft dientengevolge: i) een methode voor het remmen van beenresorptie of het toenemen van beenvorming of behandeling van osteoporose of osteoarthritis of elke andere hiervoor vermelde indicatie bij een patient, welke omvat het toedienen van een therapeutisch doeltreffende hoeveelheid van een IL-6 molecuul aan een patient die een dergelijke behandeling behoeft, ii) het gebruik van een iL-6 molecuul bij de bereiding of vervaardiging van een geneesmiddel dat geschikt is voor de remming 2Q van beenresorptie of toename van beenvorming of voor de behandeling van osteoporose of osteoarthritis of een andere hiervoor genoemde indicatie, iii) het gebruik van een IL-6 molecuul ter remming van beenresorptie of toename van beenvorming of behandeling van osteoporosis of osteoarthritis of elke andere hiervoor genoemde 25 indicatie, of iv) een geneesmiddel ter remming van beenresorptie of verbetering van de beenvorming of ter behandeling van osteoporose of osteoarthritis of elke andere hiervoor genoemde indicatie dat een IL-6 molecuul bevat.

Met IL-6 molecuul wordt elke verbinding genoemd die overeenkomt met, vrijwel dezelfde structuur heeft als, of hetzelfde werkingsspectrum heeft als het bekende interleukine-6 (zie de hiervoor genoemde PCT aanvrage of bij de specifieke vermeerderingsproef waarnaar hiervoor is verwezen met betrekking tot de Landsdorp en Aarden 35

publicaties) of hiervoor genoemde factoren, bijvoorbeeld interferon beta-2 zoals bijvoorbeeld beschreven in EP 220574A (Yeda), PCT

8900524· ,3 0 - 9 - aanvrage WO 88/00206 (Genetics Institute) en EP 257406 (Ajinomoto).

De inhoud van al deze publicaties (hierna interleukine-6 publicaties genoemd) zijn hierin als referentie opgenomen.

Het IL-6 molecuul kan geglycosyleerd zijn, bijvoorbeeld 5 aan de arginineplaatsen, of kan zijn bereid , bijvoorbeeld uit E.coli of CHO cellen.

Het beschreven IL-6 molecuul is een polypeptide bestaande uit 212 aminozuren. Desgewenst kunnen het eerste of laatste methionine-aminozuur of zelfs het geheel niet-coderende gedeelte worden weggelaten, 10 dat wil zeggen de eerste 28 aminozuren , vanaf Met.Asn tot en met Phe Pro Ala.

In het interleukine-6 kunnen 1, 2 of meer aminozuren afwezig zijn, worden toegevoegd of vervangen zijn door anderen en toch nog kan dit zijn interleukine-6 achtige activiteit 15 hebben behouden en actief zijn bij de werkwijze volgens de uitvinding.

De aanduiding IL-6 molecuul omvat dergelijke analoga , evenals elke verbinding die selectief de IL-6 werking in beencultures stimuleert, in het bijzonder indien de verbinding selectief is omdat ze een immateriële werking op andere factoren of beenresorptie via 20 andere wegen heeft.

De aanduiding omvat dus een verbinding met formule I :

PRO VAL PRO PRO GLY GLU ASP SER LYS ASP VAL ALA ALA PRO HIS ARG GLN PRO LEU THR SER SER

GLU ARG ILE ASP LYS GLN ILE ARG TYR ILE LEU

25

ASP.GLY ILE SER ALA LEU ARG LYS GLU THR CYS ASN LYS SER ASN MET CYS GLU SER SER LYS GLU ALA LEU ALA GLU ASN ASN LEU ASN LEU PRO LYS MET ALA GLU LYS ASP GLY CYS PHE GLN SER GLY PHE ASN GLU GLU THR CYS LEU VAL LYS ILE ILE 30 THR GLY LEU LEU GLU PHE GLU VAL TYR LEU GLU I

TYR LEU GLN ASN ARG PHE GLU SER SER GLU GLU GLN ALA ARG ALA VAL GLN MET SER THR LYS VAL LEU ILE GLN PHE LEU GLN LYS LYS ALA LYS ASN LEU ASP ALA ILE THR THR PRO ASP PRO THR THR 35 ASN ALA SER LEU LEU THR LYS LEU GLN ALA GLN ASN GLN TRP LEU GLN ASP MET THR THR HIS LEU ILE LEU ARG SER PHE LYS GLU PHE LEU GLN SER SER LEU ARG ALA LEU ARG GLN MET.

8900524.

n - 10 -

De aanduiding omvat eveneens een verbinding met formule I met extra aminozuren, bijvoorbeeld gehecht aan de N-terminale groep, bijvoorbeeld Ala of Met Ala of met formuel II

5 ALA PRO THR SER SER SER THR LYS LYS THR GLN

LEU GLN LEU GLU HIS LEU LEU LEU ASP LEU PHE (II) ARG ALA - X, waarin X een in formule I gedefinieerde betekenis heeft.

De aanduiding omvat eveneens moleculen waarin één of 10 een aantal aminozuren zijn vervangen of weggelaten, bijvoorbeeld de volgende volgorde is opgenomen PRO VAL PRO PRO GLY GLU ASP SER LYS ASP VAL ALA ALA, bijvoorbeeld als de N-terminale volgorde, en/of onder vrijwel lo behoud van dezelfde volgorde van de rest.

Voor deze indicaties zal de geschikte dosering natuurlijk variëren , afhankelijk van bijvoorbeeld het toegepaste exacte IL- 6 molecuul, de gastheer, de wijze van toediening en de aard en de 2Q ernst van de te behandelen aandoening. In het algemeen worden echter bevredigende resultaten bij dieren verkregen bij toepassing van dagelijkse doses van ongeveer 0,5 ug per kg tot ongeveer 20 ug per kg lichaamsgewicht. Bij grotere zoogdieren, bijvoorbeeld mensen , ligt een geïndiceerde dagelijkse dosis in het traject van ongeveer n_ 25 U9T tot ongeveer 1000 ug van een IL-6 molecuul, geschikt bijzo voorbeeld in gescheiden doses maximaal 4 maal daags toegediend.

De IL-6 moleculen kunnen via elke geschikte wijze worden toegediend, in het bijzonder enteraal, bijvoorbeeld in de vorm van 230 tabletten of capsules, of bij voorkeur parenteraal, bijvoorbeeld in de vorm van injecteerbare oplossingen of suspensies.

Zo zijn bijvoorbeeld toedieningsmethoden en galenische preparaten voor toepassing van interleukine-6 bekend, bijvoorbeeld uit de hiervoor genoemde interleukine-6 publicaties.

22 Interleukine-6 is de aanbevolen verbinding. De onderzoek resultaten zijn hiervoor vermeld. Het is geïndiceerd, dat de verbinding in dagelijkse doses van 25 ug tot 125 ug door subcutane injectie 89 00524.' -liaan grotere zoogdieren, bijvoorbeeld mensen, kan worden toegediend.

Farmaceutische preparaten kunnen een IL-6 molecuul desgewenst tezamen met tenminste één farmaceutische drager of verdunnings-middel bevatten. Dergelijke preparaten kunnen op een gebruikelijke 5 wijze worden bereid of vervaardigd. Eenheidsdoseringsvormen bevatten bijvoorbeeld ongeveer 4 pg tot ongeveer 500 yg van het IL-6 molecuul.

De onderhavige uitvinding verschaft eveneens een pak dat een farmaceutisch preparaat met een IL-6 molecuul tezamen met 10 instructies voor toepassing bij een hiervoor beschreven methode bevat.

89 00524

Claims (16)

1. Werkwijze voor het bereiden of vervaardigen van een geneesmiddel dat geschikt is voor remming van beenresorptie, met het kenmerk, dat men een IL-6 molecuul in een voor een dergelijke toepassing geschikte toedieningsvorm brengt.

2. Werkwijze voor het bereiden of vervaardigen van een geneesmiddel dat geschikt is ter verbetering van beenvorming, met het kenmerk, dat men een IL-6 molecuul in een voor een dergelijke toepassing geschikte toedieningsvorm brengt.

3. Werkwijze voor het bereiden of vervaardigen van 20 geneesmiddel dat geschikt is ter behandeling van osteoporose, met het kenmerk, dat men een ILQ-6 molecuul in een voor een dergelijke toepassing geschikte toedieningsvorm brengt.

4. Werkwijze voor het bereiden of vervaardigen van een geneesmiddel dat geschikt is ter behandeling van osteoarthritis , 25 met het kenmerk, dat men een IL-6 molecuul in een voor een dergelijke toepassing geschikte toedieningsvorm brengt.

5 ASN LYS SER ASN MET CYS GLU SER SER LYS GLU ALA LEU ALA GLU ASN ASN LEU ASN LEU PRO LYS MET ALA GLU LYS ASP GLY CYS PHE GLN SER GLY PHE ASN GLU GLU THR CYS LEU VAL LYS ILE ILE THR GLY LEU LEU GLU PHE GLU VAL TYR LEU GLU I 1Q TYR LEU GLN ASN ARG PHE GLU SER SER GLU GLU GLN ALA ARG ALA VAL GLN MET SER THR LYS VAL LEU ILE GLN PHE LEU GLN LYS LYS ALA LYS ASN LEU ASP ALA ILE THR THR PRO ASP PRO THR THR ASN ALA SER LEU LEU THR LYS LEU GLN ALA GLN ASN GLN TRP LEU GLN ASP MET THR THR HIS LEU

5. Werkwijze voor het bereiden of vervaardigen van een geneesmiddel dat geschikt is voor het behandelen van tenminste één van de volgende ziekten: de ziekte van Paget van de beenderen, 20 osteolyse ten gevolge van kwaadaardige beenziekten, osteomalacia, multiple myeloma van de beenderen , osteogenese imperfecta of osteomyelitis, met het kenmerk, dat men een IL-6 molecuul in een voor een dergelijke toepassing geschikte toedieningsvorm brengt.

6. Werkwijze voor het bereiden of vervaardigen van een 25 geneesmiddel dat geschikt is ter behandeling van multiple myeloma van de beenderen , met het kenmerk, dat men een IL-6 molecuul in een voor een dergelijke toepassing geschikte toedieningsvorm brengt.

7. Werkwijze ter bereiding of vervaardiging van een geneesmiddel dat geschikt is ter behandeling van hypercalcemie, 30 net het kenmerk, dat men een IL-6 molecuul in een voor een dergelijke toepassing geschikte toedieningsdvorm brengt.

8. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het IL-6 molecuul interleukine-6 is.

9. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, 35 met het kenmerk, dat het IL-6 molecuul formule I : 8300524 . - 13 - PRO VAL PRO PRO GLY GLU ASP SER LYS ASP VAL ALA ALA PRO HIS ARG GLN PRO LEU THR SER SER GLU ARG ILE ASP LYS GLN ILE ARG TYR ILE LEU ASP GLY ILE SER ALA LEU ARG LYS GLU THR CYS

10. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat de verbinding Ala-X is ,- waarin X de volgorde van formule I 20 is.

11. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat de verbinding Met-Ala-X is , waarin X de volgorde met formule I is.

12. Werkwijze volgens conclusie 9, met het kenmerk, 25 dat het IL-6 molecuul de volgorde PRO VAL PRO PRO GLY GLÜ ASP SER LYS ASP VAL ALA ALA bevat.

13. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, zoals beschreven in één van de voorbeelden. 30

14. Werkwijze ter behandeling van eén van de in de voorgaande conclusies genoemde ziekten, met het kenmerk, dat men aan een patient die een dergelijke behandeling behoeft één of een aantal verbindingen zoals gedefinieerd in één der voorgaande conclusies toedient. 35

15. Een pak dat een farmaceutisch preparaat bevat, omvattende een IL-6 molecuul tezamen met instructies voor toepassing 8900524. - 14 - * ervan volgens een methode als gedefinieerd in conclusie 14.

15 ILE LEU ARG SER PHE LYS GLU PHE LEU GLN SER SER LEU ARG ALA LEU ARG GLN MET. ..

16. Preparaten en werkwijzen als beschreven in de beschrijving en/of voorbeelden. -o-o-o-o- C i- .^9 0 0 52 4