JP2574962B2 - 血小板減少症の処置方法及びそれに対し有用な医薬組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、一般に、有効量の白血病阻害因子（LIF）
及び／又はその誘導体及び所望により１又はそれ以上の
他のサイトカインとの組合せの投与による哺乳動物にお
ける血小板減少症の処置の方法及び、それに有効な医薬
組成物に関する。

白血病阻害因子（LIF）は精製され（1,2）そして、分
化を誘導するその能力の基にクローン化され（３）、そ
して、MIマウス骨髄性白血病細胞系のクローン原性（cl
onogenecity）を抑制する（国際特許出願番号PCT/AU88/
00093参照）。LIFは、特にコロニー刺激因子と協同して
作用したときヒトHL60及びU937細胞に類似の効果を有す
る（４）。慣用の半流動培養においてLIFは、連続造血
細胞系DAI.1a（６）及びmyC−形質転換マウス胎児肝臓
細胞からの赤色細胞系の増殖を刺激するけれども正常な
ネズミの造血細胞に体するコロニー刺激活性はない。

LIFについてのレセプターは単核球マクロファージ
（７）、並びに骨芽細胞、胎盤及び肝臓細胞（８）を含
む幾つかの非造血細胞に存在する。LIFは作用の顕著な
変化を有することが示される。それは骨組織からカルシ
ウムを放出し（９）、正常胎児性幹細胞における自然の
分化を防ぐ因子であり（10,11）、DAI.1a（６）細胞増
殖を刺激する分子であり、肝臓細胞を刺激して急性期蛋
白を生成し（12,13）、そして、リポ蛋白リパーゼイン
ヒビターである（14）。

最初の研究で、高LIFレベルの結果が、LIF生成Fbc−P
I細胞が植えつけられたマウスに測定された（国際特許
出願番号PCT/U90/00092;15,16）。かかるマウスは、体
重損失の致死症候群、補償の脾及び肝臓髄外造血を伴う
骨硬化、好中球白血球増加、膵炎、骨格筋肉、心臓及び
肝臓での石灰化、肝臓壊死及び線維症、胸線萎縮、副腎
皮質変化並びに精子形成及び黄体形成の不全を発達させ
た。

植えつけられたモデルは、もしかすると植えつけられ
たFDC−PI細胞の存在によるコンプレックスである。本
発明は、精製された組換えネズミLIFをマウスに注入す
ることによりこの複雑度に打ち勝つことを試みる実験か
ら生れ、注入されたLIFからどんな変化が誘導されたか
を測定する。とりわけ血液成分、骨髄、脾及び腹腔細胞
成分、骨髄及び脾における巨核球及び前駆細胞成分での
変化が分析され、LIFが巨核球及び／又はそれらの前駆
細胞の形成のレベルで促進、刺激及び／又は増加を起こ
し血小板の増加に至ることが驚くべきことに発見され
た。従って、本発明は、幾つかの急性感染症、アナフィ
ラキシーショック、ある種の出血性疾患、（化学又は放
射線療法の結果としての）貧血、血小板−作用欠損病、
慢性肝臓障害及び腎障害に起きる血小板減少症の処置に
有益であろう。

従って本発明の一局面は哺乳動物における血小板減少
の処置法に係り、方法は、該哺乳動物に有効量の白血病
阻害因子（LIF）を、巨核球及び／又はそれらの前駆体
の形成のレベルを促進し、刺激し及び／又は増加し、及
び／又は血小板のレベルを増加するに十分な時間及び条
件下に投与することを含む。

他の実施態様では、LIFは、１又はそれ以上の他のサ
イトカインと同時に又は連続的に投与される。

本発明の他の局面は、哺乳動物における血小板減少症
を処置するための医薬組成物に向けられ、該組成物は、
１又はそれ以上の他のサイトカイン及び１又はそれ以上
の製薬上許容しうる担体及び／又は希釈剤との組合せで
LIFを含む。

本発明のさらに他の局面は、LIFのみの、又は１又は
それ以上のサイトカイン及び／又はそれらの誘導体との
組合せでの、巨核球及び／又はその前駆体及び／又は哺
乳動物における血小板の形成のレベルを促進し、刺激し
及び／又は増加することによる血小板減少症を処置する
ための医薬の製造のための、使用に関する。

好ましい実施態様では、哺乳動物はヒト又は家畜類動
物であり、ヒト、ネズミ及び／又は家畜動物LIFが用い
られる。さらに好ましい他のサイトカインはインターロ
イキン３（IL−３）、トロンボポイエチン及び／又はイ
ンターロイキン６（IL−６）を含む。最も好ましい他の
サイトカインはIL−３である。いかなる例でも、好まし
い他のサイトカインは、ヒト、ネズミ及び／又は家畜動
物起源である。

本発明はマウス又はサルにおけるLIFの効果に関して
記載される。これは、しかしながら、本発明が全ての哺
乳動物における、そして特にヒト及び家畜動物における
LIFの効果に拡がることの理解と共になされる。従っ
て、マウス又はサルでのLIFの効果を本明細書中で引用
することにより、哺乳動物、特にヒト及び家畜動物での
LIFの効果にも適用しうることを意味する。

１実施態様において、ヒト、ネズミ又は、家畜動物LI
Fが用いられるが本発明は本明細書中に記載された望ま
しい活性を有する全ての哺乳動物LIFに及ぶ。

用語「血小板減少症」は本明細書においては、巨核球
及び／又はそれらの前駆体及び／又は血小板のレベルに
影響する哺乳動物で条件を示すのに用いられる。従っ
て、血小板減少症の処置は、巨核球及び／又はそれらの
前駆体及び／又は血小板の増加に影響するに十分な時間
及び条件下に、有効量のLIFの投与により、巨核球及び
／又はそれらの前駆細胞の形成のレベルを促進し、刺激
し、及び／又は増加することに、及び／又は、哺乳動物
における血小板のレベルを増加することに、行なわれ
る。血小板減少症は、疾病条件に続いて起きるか外傷又
は治療から生じ、本発明は血小板減少症の１又はそれ以
上の原因に限定されない。典型的には、血小板減少症
は、幾つかの急性感染症、アナフィラキシーショック、
ある種の出血性疾患、化学又は放射線療法の結果とし
て、貧血、血小板−作用欠損疾病、慢性肝臓障害及び腎
障害に起きる。

本発明は、又、予防治療に及び、それによってLIF及
び所望により１又はそれ以上のサイトカインが投与さ
れ、血小板減少症発展の可能性を予防又は減少する。

静脈内に注射されたLIFが非常に短い血清半減期であ
ることにより、腹腔内ルートがマウス内で高められた血
清LIFレベルの維持期間を確実にするのに、より実行可
能であることを示した。しかしながら、投与の他のルー
トも本発明の範囲からはずれることなく可能であり
（例、静脈内、筋肉内、及び皮下）、全てのかかるルー
トが含まれる。LIF−生成細胞が植えつけられた、放射
線照射されたマウスは10³単位/mlまでの血清レベルに達
し、あるものは器管が14日内に変化した（15,16）。注
射されたLIFのインビボ効果を実証する試みに選ばれた
最初の計画は、２μg 1日３回14日で、これは各注射後
数時間LIFレベル10³単位/ml以上に達する。遭遇した極
端な副作用は、これらが有毒であったことを示唆する。
本発明に導く作業にみられる予期しない、且つ予期でき
ない変化、例えば血小板レベルでのそれらは、初めに認
識されず、全てのマウスがこれらの変化を分析されたわ
けではない。

本発明に従ってLIFの、単独又は１又はそれ以上の他
のサイトカインとの組合せでの注射により、前駆細胞の
明らかな上昇が脾中に誘導され、これは巨核球前駆体で
の上昇を含むことが見出された。前駆細胞変化は、天然
好中球、単核球又は好酸球で観察しうるほど増加しない
が、その変化は巨核球メンバーでの上昇、続く血液血小
板レベルでの上昇と関連している。巨核球及びLIFによ
り誘導された血小板増加の大きさは、単独又は１又はそ
れ以上の他のサイトカインとの組合せで、巨核急及び／
又はそれらの前駆細胞及び／又は血小板のレベルを増加
することにより血小板減少症を処置するためのLIFの潜
在性臨床使用を示すIL−３（18）、トロンボポイエチン
（19）又はIL−６のみ（20,21）により誘導されたそれ
らと等しいかそれらより大である。それゆえに、LIFの
減少した用量が、依然として、行動の変化又は体又は胸
線重量損害により評価されたように毒性効果なしに巨核
球及血小板レベルで変化を誘導しうることは興味があ
る。特に有効な組合せはLIFとIL−３である。

LIFが、末分別マウス骨髄細胞又は精製前駆細胞の慣
用半流動培養においてコロニー刺激活性を有しないよう
である（ヒルトン・ディジェイ，ニコラ・エヌエイ及び
メトコーフ・ディ、末発表データ）一方、本発明は巨核
球がLIF受容体を表現することを証明する。本発明を活
性のモードの後の１理論に限定することを意図するもの
ではないが、巨核球及び血小板形成でのLIFの刺激効果
は幾つかの他の因子との関連した直接効果を表わす。LI
Fは血小板レベルでの上昇前に巨核球前駆細胞及び巨核
球での上昇を誘導し、血小板で観察された上昇は巨核球
の増加した形成に基づくものであり、単に存在する巨核
球から血小板が遊離されたことによるのではないことを
示唆する。さらに明細書に記載された前駆細胞レベル、
巨核球形成及び血小板レベルでの注射されたLIFの効果
は、正常造血細胞インビボでのLIFの明らかな不活性と
対照適である。他の可能性は、LIFが幾つかの他の巨核
球刺激因子の生成に相互に作用するかそれを誘導しうる
ことでありうる。

従って、本発明は哺乳動物における血小板減少症を処
置する方法を意図し、その方法は、該哺乳動物に有効量
のLIFを単独又は１又はそれ以上の他のサイトカインと
の組合せで巨核球及び／又はそれらの前駆体及び／又は
血小板の数を増加するに十分な時間及び条件下に投与す
ることを含む。

好ましい哺乳動物はヒト又は家畜動物であるが本発明
はそれに限定されない。さらに投与のルートは好ましく
は腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下投与（例、注射）に
よるが、他のルートも、ここで意図された方法にごくわ
ずかの修飾で同様に適用しうる。LIFの有効量は、哺乳
動物及び処置される条件による。例えばマウスでは、巨
核球の度数は、脾中、３〜14日、１日２μg LIFで１−
３回腹腔内注射後２−５倍に増加した。しかしながら、
哺乳動物に投与するよう要求される量は無毒であること
が必要である。従って、マウスにおいて、例えば、14日
間１日１ないし３回与えられた200mg又はより低い用量
は、近接の毒性用量に比べて巨核球及び血小板をごく少
し増加させるが、決して少しの有効ではなく、重要なこ
とは無毒である。一般にLIF及び用いられるサイトカイ
ンの有効量は0.01ないし10.000μg/kgで好ましくは１な
いし1000μg/kg体重である。

用語「家畜動物」のここでの使用はヒツジ、ブタ、ヤ
ギ、ウマ、ロバ及びウシのような動物を含むことを意図
し、さらにネコ及びイヌに及ぶ。

本発明の方法は、さらにLIFの、１又はそれ以上の他
のサイトカインとの同時又は連続的投与を意図する。こ
のようなサイトカインは、IL−３、トロンボポイエチン
及び／又はIL−６を含むがこれらに限定されない。最も
好ましい実施態様では、LIFはIL−３と与えられる。か
かる投与のモードは、LIF及びサイトカインの両方を含
む単一組成物の投与（同時投与）又は、二つの別の組成
物、一つはLIFを含み他は１又はそれ以上のサイトカイ
ンを含む、の投与（連続的投与）を含む。本発明は１つ
より多くのサイトカインの、別の組成物での又は単一組
成物での使用に及ぶ。さらに本発明は全ての順序でのLI
F及びサイトカインの使用を意図する。他の実施態様で
は、一つのサイトカイン（LIFを含む）が直接注射によ
り与えられ、一方他のサイトカインは例えば点滴により
投与される。連続的投与においては、本発明は二つの組
成物の投与の間のいかなる時間の期間も限定されない。
しかしながら好ましくは時間差は72時間よりも少ない。

上の場合の全てにおいて、本発明はLIF及び他のサイ
トカインの誘導体、同族体及び／又は類似体の使用に及
ぶ。「誘導体」及び「類似体」は、誘導体が巨核球、巨
核球前駆体及び／又は血小板刺激活性を有する限り、LI
F又は他のサイトカインの組換え体、化学又は他の合成
形及び／又は全ての変更、例えばLIF又は他のサイトカ
インの分子のアミノ酸配列成分への、又は、炭化水素又
は他の結合した分子残基（もし存在するなら）への、付
加、置換及び／又は削除を意味する。好ましくは、LIF
はヒト、ネズミ又は家畜動物起源であるが本発明はこれ
らに限られる必要はない。従って、明細書において用語
「LIF」及び「サイトカイン」の使用は、天然に生じて
いる（天然）又は組換え又は合成形を含む全ての１又は
それ以上のそれらの誘導体、同族体又は類似体を含むこ
とを意図する。

本発明により、LIF及び１又はそれ以上の他のサイト
カイン（例えばIL−３）は同一又は異なる哺乳動物種か
らでありうる。

さらに本発明は、LIFを、１又はそれ以上の他のサイ
トカイン及び／又はそれらの誘導体及び１又はそれ以上
の製薬上許容しうる担体及び／又は希釈剤との組合せで
含む医薬組成物に及ぶ。かかる医薬組成物は、巨核球及
び／又はその前駆細胞及び／又は血小板細胞の形成のレ
ベルを促進し、刺激し及び／又は増加するのに有用であ
る。

本発明に従って記載された方法及び医薬組成物は、幾
つかの急性感染症、アナフィラキーショック、ある種の
出血性疾患、化学又は放射線療法の結果として白血病貧
血、血小板−作用欠損疾病、慢性肝臓障害及び腎障害に
起きる血小板減少症の処置にとりわけ有用である。さら
に本発明は、哺乳動物、特にヒト及び家畜動物におけ
る、例えば血小板減少症の処置での巨核球及び／又はそ
の前駆体及び／又は血小板のレベルを促進し、刺激し及
び／又は増加するための医薬の製造のためのLIF及び／
又はその誘導体のみの、又は１又はそれ以上の他のサイ
トカイン及び／又はそれらの誘導体との組合せの使用に
及ぶ。

腹腔内注射による投与後LIFの存在は以下に概説され
るように他の影響を有する。

LIF−注射マウスに見られる造血変化（実施例２参
照）は、LIFがある種の造血群（population）に影響を
及ぼす直接又は間接作用を有することを示すパターンを
有した。２μg LIFのマウスへの注射は植えついだモデ
ル（16）に見られる特徴的な好中球白血球増加を再生成
するのに失敗したが、骨髄リンパ球の選択的欠損を伴う
減少骨髄細胞性、増加した脾性赤血球生成を伴う脾リン
パ球母集団の抑制及び皮質リンパ球の欠損による著しい
胸線萎縮を含むマウスに見られる他の変化を再生した。

さらにLIFの高用量の早い影響は過剰活性状態と体重
欠損で、後者は、皮下及び腹部脂肪組織の減少に基づ
く。過剰活性状態はLIFの、アドレナリン作動性からコ
リン作動性モードに合図する自律神経を切り換える能力
に関連するか、又は高カルシウム血に関連しうる（2
2）。体脂肪の選択的欠損はリピドの脂肪細胞への移転
を阻止しうるLIF（14）のリポ蛋白リパーゼ阻止活性に
基づきうる。LIF−注射マウスに気づく増加した赤血球
沈降速度は、単一注射の６時間以内に現れ、赤血球沈降
に影響するように急性期蛋白（12,13）の肝臓細胞によ
る生成を誘導するLIFの能力による。

心筋層での最小石灰化以外にLIF−注射マウスの他の
器管において異常は見られず、これはLIFの最高用量注
射したマウスにのみ見られた。

LIF−種植えつけマウスでの最も顕著な変化は過剰な
骨芽細胞活性及び特に胸骨及び長骨の端に起きる新しい
骨形成であった（15,16）。この性質の著しい変化はLIF
−注射マウスには見られないが、LIF注射は、胸骨の骨
切片の皮質を幾らか厚くすることを誘導した。¹²⁵I−標
識LIFの静脈注射後、骨髄骨芽細胞の標識が見られ、注
射されたLIFはこれらの細胞に接近し、それゆえLIFは骨
芽細胞及び新骨形成に直接作用を有する。それゆえに、
予め放射線照射されたが正常でないマウスへの３日間LI
F注射の最初の実験例は、骨髄中、細胞に明確な増加を
生じ、LIF−生成細胞を植えついだマウスの骨髄中劇的
な形で変化が見られた。低用量でも血清カルシウムレベ
ルを高めるLIFの能力は、新しい骨形成でのLIFの作用と
して重要である。

本発明は以下の非限定図面及び実施例によりさらに記
載される。

図１は、２μg LIFの腹腔内注射後のDBA/2マウスでの
血清LIFレベルを示すグラフ表現である。各点は異なる
マウスからの血清レベルを示す。

図２は、１日３回２μg LIFを注射したDBA/2及びC3H/
HeJマウスでの体重の欠損を示すグラフ表現である。体
重欠損は最初の週に限定されることに注意。

図３は１日３回14日２μg LIFを注射したC3H/HeJマウ
スにおける血清カルシウム／アルブミン比の上昇を示す
グラフ表現である。

図４は、１日３回14日２μｇを注射したDBA/2マウス
の脾（Ａ）FCS/生理食塩水を注射した対照マウスからの
脾（Ｂ）における巨核球での増加を示す絵の表現であ
る。ヘマトキシリン及びエオシン（×250）。

図５は１日３回14日２μｇを注射したマウスの骨髄及
び脾の前駆細胞の度数（ｏ）対FCS/生理食塩水を注射し
た対照マウスにおける度数（ｏ）での増加を示すグラフ
表現である。各点は個々の動物からのデータを示す。

図６は、LIFのml当り1000単位の封入によるC3H/HeJ骨
髄細胞の50,000のIL−３促進培養での巨核球コロニー形
成の増加を示すグラフ表現である。各点は重複培養から
の平均値を示す。

図７はml IL−３当り500単位プラス0.1ml生理食塩水
又はml IL−３当り500単位プラスml LIF当り1000単位に
より促進された50,000C3H/HeJ骨髄細胞の培養での巨核
球コロニー形成の18の別個の実験例から集められたデー
タを示すグラフ表現である。各点は単一培養皿でのコロ
ニーの数を示す。

図８は、全体的又は部分的に巨核球からなるコロニーの
巨核球の絶対数の度数分布分析、ml IL−３当り500単位
プラス0.1ml生理食塩水により促進された444コロニー及
びIL−３当り500単位プラスmlLIF当り1000単位により促
進された565コロニーの逐次分析を示すグラフ表現であ
る。

図９は、過剰の未標識LIFを伴い又は伴うことなく、
¹²⁵I−LIFを結合する骨髄巨核球のオートラジオグラフ
でのグレンカウントの度数分布を示すグラフ表現であ
る。

図10は、アカゲザルでのLIFに対する血小板反応を示
すグラフ表現である。

図11は、アカゲザルでのLIFに対する血小板反応を示
すグラフ表現である。

実施例１ 材料及び方法 マウス 用いたマウスは系DBA/2（国際特許出願番号PCT/AU90/
00092に記載されるようにLIF−生成FDC−P1細胞のレピ
シエントとして既に用いた系）及びエンドトキシン低反
応系C3H/Hejの特異的病原体−フリーの２ないし３月令
雌であり、後者は全ての観察される変化がエンドトキシ
ンに起因する可能性を最小にする。

組換えLIF 組換えネズミLIFはGEX細菌発現系を用いて生成し、既
に記載されるように（PCT/AU88/00093）均質に精製し
た。LIFの特異的活性はMI白血病細胞上でのアッセーと
して約10⁸単位/mg蛋白であった（50単位/mlは300MI細胞
の寒天培養での50％のMIコロニーの分化を含むLIFの濃
度である−PCT/AU88/00093参照）。

組換えLIFを５％（v/v）ウシ胎児血清（FCS/生理食塩
水）に溶解し、注射した各用量は0.2mlの容量であっ
た。対照マウスは0.2mlの同じ５％（v/v）FCS/生理食塩
水希釈液バッチを注射した。２つに分けたLIF調製品を
用い、２つの異なるバッチのFCS/生理食塩水を希釈剤と
して用いた。全ての調製品をカブトガニアメーバ様細胞
溶解物アッセーによりアッセーし、FCS/生理食塩水塩水
中0.2mlのLIF又は0.3mlFCS/生理食塩水の注射容量は0.1
−0.2mgエンドトキシンを含むことが判り、材料のエン
ドトキシ含量は用いたFCSから多分生じたことを示し
た。

注射 マウスは１日１〜３回14日間まで0.2mlのLIF又はFCS/
生理食塩水を注射し、時々重量測定し、次いで注射最後
の日の完了後の朝に詳細に分析した。

培養 全ての培養は、0.3％（w/v）寒天中、20％（v/v）ウ
シ胎児血清の最後濃度を含む1mlの寒天培地中、２ケ月
令C3H/HeJマウスから50,000骨髄細胞を含む35mmペトリ
皿を用いて実施した。

培養物は空気中10％（v/v）CO₂の十分に湿った大気
中、37℃でインキュベートした。１週間のインキュベー
ション後、コロニー計算を×35拡大で実施し、次いで全
培養物を0.9％（w/v）生理食塩水中、2.5％（w/v）グル
タルアルデヒドの1mlを用いて固定した。ガラススライ
ド上に無処理の培養物を浮遊したのち、培養物を空気乾
燥し、アセチルコリンエステラーゼ用に、次いで、ルク
ソール−ファストーブル及びヘマトキシリンで染色し
た。コード化スライドを用い、巨核球コロニー（１又は
それ以上のアセチルコリンエステラーゼ−陽極細胞を含
むクローンとして定義される）を数えあげ、全細胞数は
各コロニー中アセチルコリンエステラーゼ−陽極細胞と
した。

試験した全ての刺激は、細菌又は酵母発現系を用いこ
の研究室で生成された精製ネズミ組換え因子であった、
LIF,IL−3,GM−CSF,G−OSF及びＭ−CSFについての特異
的活性は全て10⁸単位/mgであった。

オートラジオグラフィ 精製組換えネズミLIFは既に記載した方法（３）を用
い¹²⁵Iで標識した。成熟マウスを10⁸カウント／分¹²⁵I
−LIFで静脈内に注射し、１時間後殺した。組織を10正
式生理食塩水中に固定し５μ部分を調製し、コダックN2
エマルジョンに浸漬した。３ケ月暴露後、スライドを発
展させ、ヘマトキシリン及びエオシンで染めた。インビ
トロ研究のため、脾及び骨髄懸濁液を¹²⁵−LIT（100,00
0カウント／分）と、20倍過剰の未標識LITと共に又はな
しに37℃で１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、
細胞遠心機（cytocentrifuge）調製品を2.5％（w/v）グ
ルタルアルデヒドを用いて固定した。浸漬及び暴露後、
調製品はマイ・グリーンワルド・ギムザで染色した。

観察 マウスを麻酔して眼窩叢血液を白血球、ヘマトクリッ
ト値及び血生板評価に用いた。マウスを液窩管から瀉血
して血清をさらに分析するため1:4を希釈した。膓腔細
胞を2mlの５％（v/v）FCS/生理食塩水を用いて集め、器
管の重さを測り、全大腿細胞係数を実施した。細胞遠心
機調製品を膓腔、脾及び骨髄細胞から作り、マイ・グリ
ーンワルド・ギムザで染色した。全ての調製品をコード
化スライドを用いて採点した。器管を10％（v/v）正式
生理食塩水の固定し、分割し、次いでヘマトキシリン及
び細網用にエオシンで染色した。脾及び細胞懸濁液を培
養して、400単位GM−CSF及び400単位IL−３（17）の混
合物により刺激された25,000細胞の1ml寒天−培地培養
を用い前駆動細胞の頻度を測定した。７日でコロニー計
数を実施し、培養物を1mlの2.5％（w/v）グルタルアル
デヒドと混合し、次にアセチルコリンエステラーゼ次い
でルクソールファストブルー及びヘマトキシリン用に染
色し、示差（differential）コロニー計数をコード化調
製品について、×200倍率で実施した。

赤血球沈降をヘパリンを加えた毛細ヘマトクリットチ
ューブ中、50mmカラムの血液を用い測定した。赤血球の
促進沈降は、LAF−注射マウスからの血液で10分以内に
見られた測定は普通に２時間で行なった。簡単にするた
め、図を算数的に100mmカラム当りmm沈降に変換した。

血清カルシウム及びアルブミン評価を１−４希釈血清
を用い実施した。

巨核球細胞計算を脾及び胸骨骨髄切片のセクションか
ら×400倍率で実施した。調査された区域は、カメラル
シダ製図から測定し、像は脾について巨核球×区域^-1×
器管重量又は個々の胸骨骨髄切片について巨核球×区域
^-1×100として表わした。

統計分析 全てのデータは、スチューデントのＴ検定を用いて分
析し、観察した差の統計的有意差を確立した。

実施例２ LIFの効果 LIF−精製FDC−P1細胞を植えつけたマウスにおける平
均血清LIF濃度は1000単位/mlであった（15,16）。類似
の濃度をLISの注射により達せられるかどうかを測定す
るため、静脈内又は膓腔内に注射されたLIFの血清半減
期について研究を実施した。２μｇのLIFの注射は８−
９分の第二期を伴う非常に短い血清半減期となった。し
かしながら２μｇのLIFの膓腔内注射は、約３時間1000
単位/mlを超過する血清LIFレベルのより維持された上昇
となった（図１）。これを基に最初の注射を、膓腔内に
注射された２μg LIFを用い8.00am,2.00pm及び5.00pmで
日に３回実施した。続く実施例で、低容量のLIFを用い
１日当りの注射の数を１−３で変えた。

一般的観察 ３日で16DBA/2マウスの最小の、５及び９日の間の８
つの多分異常なC3H/HeJマウスの４の、並びに５日での8
C3H/HeJマウスの他のグループの最小の、死が起きたの
で、１日３回２μg LIFの用量が毒性限界に近いようい
思われた。

この用量レベルで、５つの別個の実験例での両系のマ
ウスでの注射されたLIFの均一効果は、２日まで最初の
明らか重量損失があり、注射の第一週の間の進行した
が、第２週の間、重量損失はなかった（図２）。重量損
失に伴って、背中の特に首の後の毛が直立したマウスウ
の過剰運動性及び被刺激性の奇妙な状態があった。戦い
は示さなかった。LIF−注射マウスは又、用いた麻酔薬
−メトキシフルオランからの回復に困難を示した。

１日１−３回14日与えられた、LIFの200ng又はより低
い用量で注射したマウスには死亡又は重量損失を起ら
ず、又機能の被刺激性もこれらの用量レベルでは見られ
なかった。

血液変化 １日３回２μg LIFを注射したマウスの15日に見られ
た変化を表１にまとめた。有意な変化は全白血球に起き
なかったがヘマトクリットにおける小低下（fall）がLI
F注射マウスに見られた。LIF注射マウスにおいてほとん
ど100％の血小板レベルで増加が顕著に見られた。血小
板レベルは、１日３回与えた２μg LIFの単一注射後６
及び24時間又は２μg LISの注射の３日後で上昇しなか
った（表1,2）。

２μg LIFを注射したマウスからの血液試料の他の特
徴は、赤血球沈降の促進であった。他の実施例では、促
進された赤血球沈降は２μg LIFの単一注射に続く６及
び24時間で、及び１日１回200ngというLIFの低用量で14
日に見られた（表２）。

図３における典型的実施例に示されるように、血清カ
ルシウムレベルは14日間２μg LIFを注射したマウスで
上昇し、上昇は対照−注射マウスで平均30％以上の値で
あった。上昇した血清カルシウムレベルは14日間１日１
回与えた20ngのように低い用量でも見られた（表２）。
１日３回２μｇを注射したマウスで、上昇したカルシウ
ムレベルは注射の６時間後現れなかったが３日後現れ
た。

骨髄、脾及び腹腔細胞変化 表３は14日間１日３回２μg LIFを注射したDBA/2マウ
スからのデータをまとめる。簡潔にするため、C3H/heJ
マウスからの同様のデータは詳しく述べない。

両系のマウスにおいて均一に見られることは、リンパ
様細胞の百分率での有意な低下と成熟顆粒球の百分率で
の小さい有意な上昇を伴う全骨髄細胞数での約40％の低
下であった。

少しの重量増加がLIF注射マウスの脾に見られ、表３
に示すようにLIF注射マウスにおいて、リンバ球の百分
率での有意な低下及び有核赤血球細胞及び成熟顆粒球の
百分率での有意な上昇があった。

一貫しない傾向が明らかなLIF−注射マウスにおける
腹腔細胞の全数で実験例間に、ある変異性が見られた。
FCS/生理食塩水の注射は有意な数の好酸球の出現、恐ら
く異種蛋白の反復注射に対する免疫応答で注射の第２週
の間だけ明白となる、を誘発した。この好酸球応答はLI
F−注射マウスにおいて有異に低いかなかった。反対にL
IF−注射マウスは腹腔個体群におけるリンパ球のパーセ
ントでの有意な上昇を示した。

上記パラメーターの全てにおいて、LIF−注射C3H/HeJ
マウスに見られる変化は、方向で同一であり、統計的に
有意であるが通常大きさで少し小さかった。

200ngLIFを注射したDBA/2マウスでは、骨髄細胞性に
日に１ないし３回類似すが少し著しい変化が見られ、興
味深いことに脾拡大は高LIF用量でより明らかであっ
た。

巨核球変化 巨核球は細胞遠心機調製品で十分に表れなかったの
で、巨核球数の計数は、脾及び胸骨骨髄切片の部分から
なした。日に３回２μg LIFで14日間注射された両系
で、巨核球の度数は脾において有意に増加し（２−５
倍）（表4,図４）より少しの大きさの有意な上昇が胸骨
骨髄に観察された。

脾巨核球数の有意な上昇は１日１回14日間の注射で20
ng LIFという少量でも検出可能であり（３倍）、巨核球
数は日に３回２μg LIF注射の３日以内に脾において上
昇した（表２）。

骨髄及び脾における前駆動細胞変化 前駆細胞（巨核球前駆体を除く）の度数は、１日３回
14日間２μg LIFを注射したDBA/2及びC3H/HeJマウスの
骨髄において、対照注射マウスの骨髄におけるよりも、
有意に高かった（図５）。しかしながら、これらの値は
全骨髄細胞性における低下を訂正するとで、全前駆細胞
数はLIF注射により本質的に変らなかった。

対照的に、前駆細胞の度数における著しい上昇は、LI
Fを注射した両系の脾に見られた。脾の全体の大きさは
少し増加したので、これは前駆細胞の絶対数での上昇を
示す。示差コロニー計数は、LIF−注射及び対照マウス
間に、前駆細胞：顆粒球の、顆粒球−マクロファージ、
好酸球、赤血球及び混合−赤血球前駆体の種々サブセッ
トの比較的度数において差のないことを明らかにした。

巨核数コロニーの度数は図５でデータに示されず、そ
れらの度数を測定するため、計数はアセチルコリンエス
テラーゼ−染色培養上独立に実施した。巨核球前駆体の
度数はLIF−注射マウスの骨髄において対照マウスにお
けるよりも有意に高く、LIF−注射マウスの脾において
対照マウスにおけるよりも10倍高かった（表４）。絶対
細胞数に訂正すると骨髄において巨核球前駆体で少しの
絶対上昇があったが脾では少くとも10倍であった。

LIF−注射マウスにおける他の変化 １日３回14日間２μg LIFを注射したマウスにおい
て、試験は体重の損失が皮下及び腹部死亡の完全な損失
に帰因することを示し、変化は又は、注射の３日後にの
み明らかであった。肝臓及び腎臓重量は変化せず、重量
損失は真のカヘキシーではないことを示す。

これらの用量のLIFを受けているマウスは皮質リンパ
球の完全な損失による著しい胸腺萎縮（表２）を示し
た。胸腺重量の損失はより低い用量のLIFを注射したマ
ウスには見られなかった。

肝臓は、造血細胞による侵入の証拠、非活性クッパー
細胞での増加及び石灰化を示さなかった。しかしなが
ら、１日３回14日間２μg LIFを受けているマウスで
は、核−フリー細胞質の領域における対応増加を伴う単
位面積当りの実質細胞質核の数における奇妙な減少があ
った（例えばDBA/2マウスにおいて、対照マウスにおけ
る20±２からLIF−注射マウスにおける16±３、0.01
（Ｐ＜0.02））。肝臓細胞核のピクノーゼは見られなか
った。

カルシウム沈澱の小フォーカスは２μg LIF注射した1
1DBA/2マウスの８の心筋層に、対12対照マウスの４に見
られた。少しで有意差なし。

組織学的異常は、LIF−生成細胞に植えついだマウス
に存在するものに似て膵臓、卵巣、副腎皮質又は骨髄筋
に認められなかった。

LIF−生成FDC−P1細胞（15,16）を植えついだマウス
における著しい過剰の新しい骨形成を考慮して、分析は
大腿骨、脛骨及び胸骨で行なった。明らかな新骨形成は
異常な柱形成により評価され、大腿骨又は脛骨において
見られなかった。しかしながら、胸骨切片の分析でLIF
−注射DBA/2マウスにおいて、骨皮質を有意に厚くなる
ことを示した。１日３回14日間２μｇを注射したマウス
で骨皮質により占められた区域は、胸骨切片の全区域の
30.4±4.2％対、対照マウスにおける23.1.±5.6％であ
った（Ｐ＜0.01）。しかながら同一LIF容量が与えられ
たC3H/HeJマウスでは、像は23.1±5.3％対21.4±4.4で
有意差はなかった。

実施例３ LIF及びIL−３の効果 100単位/mlのLIFを含む骨髄細胞の７日培養では巨核
球又は他のコロニー形成及び単一巨核球の延命を示さな
かった。LIF（1000単位/ml）と1000単位/mlのGM−CSF,G
−CSF又はＭ−CSFとの組合せを含む培養において、巨核
球を含むコロニーは見られず、巨核球単一延命もなかっ
た。

125から1000単位/mlのIL−３を含む骨髄培養におい
て、巨核球コロニー形成が見られた。これらのコロニー
は通常２つの型−少数の大きさ分散した巨核球を含めた
もの又は種々の大きさのアセチルコリン−陽性細胞を含
む大きなコロニーであった。少ない頻度で、巨核球を他
の系統の細胞と共に含む混合コロニーが見られ、典型型
にこれらのコロニーではアセチルコリンエステラーゼ−
陽性細胞の数は比較的小であった。このような培養での
1000単位のLIFの含有により、IL−３の全濃度と共に示
す巨核球コロニーの数が増加した（図６）。500単位のI
L−３を用いる18の別個の実施例からの巨核球コロニー
数についてのデータは、各培養で、巨核球コロニーの数
が広く変ることを示した。同じ18の実施例で、500単位
のIL−３プラス1000単位/mlのLIFを含む培養では、各培
養間の多様性にもかかわらず、巨核球コロニー数での有
意な全体増加が見られた（図７）（ｔ−4.43,P＜0.0
1）。

LIFとIL−３の組合せは、IL−３のみを含む培養と比
較してこれらの培養において発達する顆粒球−マクロフ
ァージコロニーの数又は大きさに影響しなかった。この
促進されたコロニー形成がより多くの巨核球の生成とな
ることを実証するため、全巨核球を、500単位IL−３の
み又は1000単位のIL−３との組合せを用いる14実施例
中、全培養皿におけるコロニー巨核球を数れることによ
り測定した。各型の50の未選択培養での計数において、
LIFの添加は培養当り発達する巨核球の全数を183±122
から300±185（±50）（ｔ＝3.79,p＜0.01）に有意に増
加した。

個々のコロニーにおける巨核球数の度数分布を分析し
てLIFが成熟細胞の小コロニーの大きさに、又は成熟の
変化段階で巨核球を含んでいるより大きなコロニーに選
択的影響を及ぼすかを測定した。図８のヒストグラムは
少数の又は多数の巨核球を含んでいるコロニーの度数分
布を示す。LIFの添加は巨核球含有コロニーの特異的サ
ブセットの度数において唯一の増加となるようには見え
なかった。

実施例４ 巨核球でのLIFについてのレセプター 巨核球について濃縮された骨髄懸濁液をインビトロで
¹²⁵I−標識ILFと、20倍過剰の未標識LIFと共に又はなし
にインキュベートした。図９に示すように、標識化は、
約85％の巨核球により示された。過剰の未標識LIFの存
在で、標識化は、有意に減少し、排除しない。これは、
観察された標識化の部分が非特異的で、それゆえに、傷
ついた巨核球が未標識LIFによりブロックされない顕著
な標識化を示すことが明らかであることを示唆する。成
熟巨核球が好塩基細胞膜を伴う少し成熟していない細胞
より高いグレンカウント（grain count）を示すことも
明らかであった（成熟細胞についての平均グレンカウン
ト＝80±50対、未成熟細胞11±14細胞当りグレン）。

実施例５ サルにおける血液血小板数でLIFの効果 材料及び方法 両性、約６ないし10年令、６ないし11kgの８成熟アカ
ゲザル、マカカ・ムラッタを個々に収容した。サルは60
％±10の比較湿度で23±２℃に新鮮な空気条件の１時間
当り10変化を与えた。それらは12時間明／暗サイクル保
持し生水、不断のそして商業上の霊長類食物及び果物を
与えた。

LIFの投与 ココス・ニコラ博士（ザ・ワルダー・アンド・エリザ
・ホール・インスチチュート・オブ・メディカル・リサ
ーチ、メルボルン、オーストリア）により提供されたLI
Fの凍結保存溶液を１日量に分け再び−70℃で保存し
た。１日量を解凍し、0.5％サル血清を補充した4ml生理
食塩水で希釈した。サイトカインの一日用量を２投与に
分けて、午前８と９時及び午後４と５時の間に皮下注射
（s.c.）した。生物活性を測定するための試料は、処理
期間の始めと終りに維持した。対照サルは、0.5％サル
血清を補充した非パリロージェン生理食塩水のs.c.注射
を受けた。

血液学的実験 末梢血を、EDTA−被覆管中血液学的実験用に、処理開
始前、処理期間中１日又は２日間隔で、及び処理期間後
の１週３回、集めた。

測定したパラメータは、赤血球（RBC）、白血球（WB
C）、血小板の総計算並びにヘモグロビン及びヘマトク
リット値の測定を含んだ（シスメックス2000、ティーオ
ウエイ：東京、日本）。特異の血液細胞計数は２人の独
立した観察者によりギムザ染色血液塗抹標本の200細胞
の試験でアザゲザル（23）に対し正常として確立した。

結果 血液血小板計数の上昇 図10に示すように、２μg LIF/kgの１日用量を受けて
いる動物の１つは２週処理期間の終わりに血液血小板計
数での上昇を示した。上記正常レベルを1.4倍上昇した
最大血小板計数は、LIF投与の終了後５日に測定した。
２μｇ用量グループにおける他の動物は、血小板計数で
少しの上昇を示した。２週間10μg LIF/kgの１日用量を
受けている２匹のサルは、約1.5倍基礎レベルの血小板
計数で最高上昇を応答した。図11に示すように、50μg
LIF/kgの１日用量で処理した動物は、処理の開始後２−
３日に始める血小板計数において早い上昇で、投与期間
の終りで正常レベルの上２−３倍の範囲において最大レ
ベルで応答した。

この分野の当業者は、本明細書に記載される発明が特
に記載さたもの以外に変更や修飾しやすいことを識別す
るであろう。本発明がそのような変更や修飾を全て含む
ことが理解されるべきである。本発明は、又は、本明細
書で引用され又は示される全ての段階、特徴、組成物及
び化合物を個々に又は集合的にそして全て２又はそれ以
上の該段階又は特徴の全ての組合せで含む。

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フロントページの続き (56)参考文献 特開 平３−109330（ＪＰ，Ａ) 特表 平１−502985（ＪＰ，Ａ) 特表 平４−503958（ＪＰ，Ａ) 特表 平４−502224（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 264，Ｎｏ．15（1989），Ｐ．8941− 8945

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】白血病阻害因子（LIF）を有効成分とす
   る、哺乳動物の血小板減少症処置剤。
2. 【請求項２】１又はそれ以上の他のサイトカインと同時
   に又は逐次組合せて使用する、請求項１記載の処置剤。
3. 【請求項３】他のサイトカインが１又はそれ以上のイン
   ターロイキン−３（IL−３）、トロンボポイエチン及び
   インターロイキン−６（IL−６）から選ばれたものであ
   る、請求項２記載の処置剤。
4. 【請求項４】他のサイトカインがIL−３である請求項３
   記載の処置剤。
5. 【請求項５】LIF及び／又は他のサイトカインがヒト、
   ネズミ又は家畜類起源のものである、請求項１〜４のい
   ずれか１項に記載の処置剤。
6. 【請求項６】LIF及び／又は他のサイトカインが組換え
   又合成手段により調製されたものである、請求項１〜５
   のいずれか１項に記載の処置剤。
7. 【請求項７】哺乳動物がヒト又は家畜類動物である、請
   求項１〜６のいずれか１項に記載の処置剤。
8. 【請求項８】静脈内、腹腔内、筋肉内又は皮下経路に投
   与される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の処置
   剤。
9. 【請求項９】LIFの及び使用される他のサイトカインの
   有効量が0.01ないし10,000μg/体重のkgである、請求項
   １〜８のいずれか１項に記載の処置剤。
10. 【請求項１０】LIF及びサイトカインの有効量が１ない
    し1,000μg/体重のkgである、請求項９記載の処置剤。