JPH10508756A

JPH10508756A - 造血タンパク質を用いて赤血球形成を刺激する方法

Info

Publication number: JPH10508756A
Application number: JP8516916A
Authority: JP
Inventors: コーシャンスキー，ケネス
Original assignee: University of Washington
Current assignee: University of Washington
Priority date: 1994-11-07
Filing date: 1995-11-07
Publication date: 1998-09-02
Also published as: WO1996015758A2; AU4462296A; WO1996015758A3; KR970706838A; US6316254B1; CN1173136A

Abstract

(57)【要約】造血タンパク質のトロンボポイエチンを用い、任意にエリトロポイエチンを組み合わせて、赤血球形成を刺激する方法を提供する。提供される本発明の諸方法は、生体外および生体内で骨髄細胞および末梢血細胞における赤血球形成を刺激するのに用いることができる。さらに患者の血小板減少症と貧血症の治療方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】造血タンパク質を用いて赤血球形成を刺激する方法発明の背景造血は、血液細胞が骨髄中の多分化能性幹細胞から成長して分化するプロセスである。このプロセスは、膜結合受容体を介して標的細胞に作用するポリペプチド成長因子類（サイトカイン類）の複雑な相互作用からなっている。特定のサイトカインに対する応答は系統特異的および／または発生段階特異的である場合が多く、サイトカインの作用によって細胞が増殖し分化する。幹細胞由来の例えば血小板または赤血球のような単細胞型が発育するには、複数のサイトカイン類が適切な順序で作用する協働作用が必要である。公知のサイトカイン類としては、インターロイキン類たとえばIL−１，IL−２，IL−３，IL−６，IL−８など；およびコロニー刺激因子類たとえばG-CSF，M-C SF，GM-CSF、エリトロポイエチン(EPO)などがある。一般にインターロイキン類は、免疫応答および炎症応答の伝達物質として作用する。コロニー刺激因子類は、骨髄由来細胞の増殖を刺激し、成熟白血球を活性化し；その他、炎症、感染および免疫のチャレンジに対する宿主の応答の一体部分を形成している。各種のサイトカイン類が治療剤として開発されている。いくつものコロニー刺激因子が患者の免疫系の回復を速めるため、癌の化学療法とともに使用されている。インターロイキン−２、α−インターフェロンおよびγ−インターフェロンはある種の癌の治療に使用されている。EPO は、赤血球の発育を刺激するが、腎不全が原因で起こる貧血の治療に使われている。巨核球形成および血小板形成の刺激に対して応答可能な因子は、一つには、最近に至るまで、優れた起源、優れた検定方法および産生部位に関する知識が欠如していることが原因で、これら因子を単離し特性を解析するため30年にわたって研究されているにもかかわらず、決定的な特性解析が妨げられている。文献では“トロンボポイエチン”と呼ばれている巨核球形成因子（McDonald，Exp．Hematol.，16巻，201〜205頁、1988年；および McDonald，Am．J．Ped．Hematol．Oncol.，14巻、８〜21頁、1992年に最近、総説が記載された）は現在、同定・単離されている（同時係属中の米国特許願第08／252,491号；Lokら、Nature，369巻、565〜568頁、1994年；およびKau shanskyら、Nature，369巻、568〜571頁、1994年参照。なおこれら文献はすべて本明細書に援用するものである）。血小板機能不全症類に関連する軽症の出血障害（MBDS）は比較的共通の障害であるが（Backmann，Seminars in Hematology，17巻、292〜305頁、1980年）、これらの障害としてはいくつかの血小板機能の先天性障害があり、例えば、ベルナール−スリエ症候群（血小板GPＩｂ欠乏症）、グランツマン血小板無力症（GPII ｂとGPIIIａの欠乏症）、先天性フィブリノーゲン欠乏血症（血漿中のフィブリノーゲンおよび血小板の濃度の減少および欠損）およびグレイ血小板症候群（α −顆粒の欠損）が挙げられる。さらに、血小板の分泌に関連する以下のようないくつかの障害がある。すなわち貯蔵プールの欠陥、血小板のアラキドン酸経路の異常、血小板シクロオキシゲナーゼおよびトロンボキサンシンテターゼの欠乏ならびに血小板活性化の欠陥である（RaoとHolmsen，Seminars in Hematology，23 巻、102〜118頁、1986年に総説が記載されている）。現在、これら欠陥に関する分子レベルの原理は十分に理解されていない。貧血症は、赤血球細胞（赤血球）の産生の欠乏症であり、血液が身体の組織に輸送する酸素のレベルが減少する。出血による大量の血液の損失；自己抗体、放射線もしくは化学薬品に対する暴露が原因の赤血球の破壊；または高い標高もしくは長期間の意識消失が原因の酸素摂取量の減少によって低酸素症が起こることがある。組織中の酸素が減少すると、EPO の産生が刺激されて赤血球の産生量が増大する。EPO は、骨髄中の原始前駆細胞が前赤血球に変換するのを促進し、次にその前赤血球が、成熟し、ヘモグロビンを合成し次いで赤血球として循環系中に放出される。循環系中の赤血球の数が、正常組織の酸素要求量に対して必要以上に大きくなると循環系中のEPO の濃度は減少する。巨核球と赤血球の濃度が、化学療法おび放射線による各種癌の治療ならびにエイズ、再生不良性貧血および脊髄形成異常症などの疾患に関連して著しく低下することがある。巨核球および／または赤血球の濃度が低くなりすぎて例えば血小板数が25,000〜50,000より低くかつヘマトクリットが25より小さくなると、かなりの病状になる可能性が高く、場合によってはこの濃度は生命にかかわることがある。内在疾患の治療に加えて、特別の治療法としては、血小板減少症（低い血小板数）に対する血小板輸注および貧血に対して、EPO を使用して行う赤血球形成の刺激または赤血球の輸注がある。分子生物学の最近の進歩によって、造血についての我々の理解が非常に高まったが、同時にそのプロセスが極めて複雑であることが分かってきた。多くのサイトカイン類の特性解析がすでに行われ、いくつかは臨床用途が明らかになっているが、骨髄およびリンパ球の前駆体の増殖と分化ならびに成熟血液細胞の産生を刺激する追加の因子が当該技術分野で要望されている。血小板および赤血球を含めて巨核球と赤血球の系統の細胞の発育と増殖を刺激する因子が特に要望されている。さらに、当該技術分野では、化学療法および放射線で癌を治療する場合のように骨髄の造血細胞の破壊で起こるような血球減少症と貧血、ならびに脊髄形成異常症、エイズ、再生不良性貧血、自己免疫疾患または炎症症状のような病状を同時に治療するのに使用できる因子に対する要望がある。本発明はこれらの要望を満たしかつ他の関連する利点を提供するものである。発明の要約本発明の目的は、TPO なしで培養する場合に比べて赤血球または赤血球前駆体の生成数を増大させるのに十分な量のTPO およびEPO の存在下、骨髄細胞または末梢血細胞を培養することによって赤血球形成を刺激する方法であって；TPO が、配列番号；２に示す28位〜172位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号；２に示す28位〜185位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号；２に示す28位〜193位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号；２に示す28位〜198位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号；２に示す28位〜207位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号；２に示す28位〜235位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号；２に示す28位〜266位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号；２に示す22位〜185位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号；２に示す22位〜1 93位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号；２に示す22位〜198位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号；２に示す22位〜207位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号；２に示す22位〜235位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；および配列番号；２に示す22位〜266位のアミノ酸残基のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる方法を提供することである。本発明の他の目的は、TPO なしで培養する場合に比べて赤血球または赤血球前駆体の生成数を増大させるのに十分な量でTPO を含有してなる組成物の存在下、骨髄細胞または末梢血細胞を培養することによって赤血球形成を刺激する方法であって；TPO が、配列番号：２に示す28位〜172位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜185位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜193位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜198位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜207位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28 位〜235位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜266位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜185位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜193位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜198位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜207位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜235位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；および配列番号：２に示す22位〜266位のアミノ酸残基のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる方法を提供することである。本発明の他の目的は、赤血球細胞の増殖または分化を高めるため、医薬として許容される賦形剤中にTPO を含んでなる組成物を投与することによって、哺乳類の赤血球形成を刺激する方法であって；TPO が、配列番号：２に示す28位〜172 位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜185位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜193位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜198位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜207位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜235位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜266位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜185位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜193位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜198位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜207位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜235位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；および配列番号：２に示す22位〜266位のアミノ酸残基のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる方法を提供することである。本発明の他の目的は、赤血球細胞の増殖または分化を高めるため、医薬として許容される賦形剤にEPO とTPO を含んでなる組成物を投与することによって、哺乳類の赤血球形成を刺激する方法であって；TPO が、配列番号：２に示す28位〜 172位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜185位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜193位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜198位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜207位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜235位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜266 位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜185位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜193位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜198位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜207位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜235位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；および配列番号：２に示す22位〜266位のアミノ酸残基のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる方法を提供することである。本発明の他の目的は、トロンボポイエチンなしで培養するのと比ベて赤血球または赤血球前駆体の生成数を増大させるのに十分な量のトロンボポイエチンおよびエリトロポイエチンを含んでなる組成物とともに骨髄細胞または末梢血細胞を培養することからなる、赤血球形成を生体外で刺激する方法であって；トロンボポイエチンの量が100pg／ml〜10ng／mlであり、かつエリトロポイエチンの量が0.5単位／ml〜５単位／mlである方法を提供することである。本発明の他の目的は、トロンボポイエチンなしで培養するのと比べて赤血球または赤血球前駆体の生成数を増大させるのに十分な量のトロンボポイエチンを含んでなる組成物とともに骨髄細胞または末梢血細胞を培養することからなる、赤血球形成を生体外で刺激する方法であって；トロンボポイエチンの量が100pg／m l〜10ng／mlである方法を提供することである。図面の簡単な説明図１は、培養される骨髄細胞にTPO とEPO を添加すると、EPO だけを添加した場合に比べて赤血球コロニーの形成が増大することを示す。図２は、予め放射線を参照しかつ化学療法を行って汎血球減少症にされた実験動物にTPO を投与すると、赤血球カウント数の低下は、TPO を投与された動物の場合、重大なほどではなくすぐ正常に戻ることを示す。発明の詳細な説明本発明を詳細に説明する前に、本明細書で用いるある種の用語を定義しておくと役に立つであろう。対立遺伝子変異体：突然変異によって生じる別の形態の遺伝子または突然変異を起こした遺伝子がコードする変化したポリペプチド。遺伝子の突然変異はサイレントの場合（コードされるポリプチドに全く変化がない）があるか、または変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることがある。 cDNA：メッセンヂャーRNA の鋳型を逆転写することによって製造される相補的 DNA またはこのような分子のクローンまたは増幅されたコピー。相補的DNA は一本鎖または二本鎖の場合がある。発現ベクター：注目のポリペプチドをコードするセグメントを含んでなり、そのセグメントがその転写を行うための追加のセグメントに作用可能に連結されている直鎖状もしくは円形のDNA 分子。このような追加のセグメントはプロモーターとターミネーターの配列を含んでおり、また１個以上の複製開始点、１個以上の選択可能マーカー、一つのエンハンサー、一つのポリアデニル化シグナルなども含有していてもよい。発現ベクターは一般にプラスミドまたはウイルスDNA から取り出されるかまたは両者の要素を含有していてもよい。用語“作用可能に連結されている”は、これらのセグメントが、それらの予定された目的、例えば転写をプロモーターで開始させ次いでそのコーディングセグメントを通じてターミネーターへ進ませる目的を達成するため協働して機能するよう配置されていることを示す。遺伝子：ポリペプチド鎖をコードする染色体DNA のセグメント。遺伝子はアミノ酸をコードする一つ以上の領域を有し、これらの領域には、場合によって、非コード配列の“介在配列” （イントロン）が、該コード領域の転写を行うための隣接する非コード領域とともに散在している。相補的分子：基準配列（reference sequence）に対して相補的な塩基配列と逆の配向を有するポリヌクレオチド分子。例えば配列5′ATGCACGGG3′は5′CCCGTG CAT3′に対して相補的である。プロモーター：RNA ポリメラーゼが結合してmRNAの合成が開始される遺伝子の部分。上記のように、本発明は、造血活性を有するタンパク質を用いて血小板形成および赤血球形成を刺激する方法を提供するものである。用語“造血の”は、本明細書で用いる場合、骨髄またはリンパ球の前駆体の増殖および／または分化を刺激する性能を意味し、これらの性能は標準の検定法で確認される（例えば、Metc alf，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，77巻、5329〜5330頁、1980年；Metcalfら、 J．Cell．Physiol．116巻、198〜206頁、1983年；およびMetcalfら、Exp．Hemat ol.，15巻、288〜295巻、1987年参照）。一般に、骨髄細胞は、試験試料と対照試料の存在下でインキュベートされる。次いでその培養物と目視検査および／または染色によって細胞の増殖と分化について採点する。特に好ましい検定法はMo smanのMTT 比色検定法である（J．Immunol．Meth.，65巻、55〜63頁、1983年；この文献は本明細書に援用するものである）。 “赤血球形成”（erythropoiesis）という用語は、本明細書で使用する場合、赤血球前駆細胞の増殖および／または分化を意味する。赤血球細胞の増殖と分化の標準の尺度としてはヘマトクリットと網状赤血球のカウントがある。ヘマトクリットは赤血球の測定値であり、通常、赤血球からなる全血容積の百分率として表される。網状赤血球のカウントは、mRNA（成熟赤血球には存在しない）およびリボソームの凝集体を含有する１〜２日齢の細胞の測定値を示す（このカウントは染色によって確認される。Erslev，A．著“Hematology”、米国ニューヨークM cGraw-Hill社1990年発行の“Reticulocyte Enumeration”の項参照）。網状赤血球のカウントは、計数される500または1000細胞当りのこの細胞の百分率である。網状赤血球のカウントの平均値の範囲は0.8〜1.2％である。EPO は市販されており（米国ミネソタ州ミネアポリス所在のR&D Systems社および米国カリフォルニア州サウザンドオークス所在のAmgen社）、活性は、エクスハイポキシック（exhypoxic）血球増加性マウスの赤血球への⁵⁶Feの取込みを測定する生体内検定法(Cotesら、Nature，191巻、1065頁、1961年）を用いてエリトロポイエチンの第二国際基準製剤（second international reference preparation）に対して校正することによって、または因子依存性ヒト赤血球病細胞系；TF−１を用いる生体外細胞増殖検定法（Kitamuraら、J．Cell．Physiol.，140巻、323頁、1989 年）によって測定される。本発明は、一部分、トロンボポイエチン(TPO)が赤血球細胞の増殖を刺激するという発見に基づいている。本発明の発明者らが、血小板減少症の哺乳類にTPO を投与したところ、驚くべきことには、TPO は、血小板を増大させることに加えて、赤血球の回復を高めてヘマトクリットのレベルを迅速に増大することが見出された。ヒトおよびマウスの代表的なTPO タンパク質をコードするcDNAクローンの配列はそれぞれ配列番号：１と配列番号：３で表され、そして対応するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：２と配列番号：４に示す。当該技術分野の当業者は、配列番号：１，２，３および４に示す配列と配列番号：５および６に示すヒトゲノム配列がヒト遺伝子の単一対立遺伝子(single allele)に相当しかつ対立遺伝子の変異が存在すると予想されることが分かるであろう。また当該技術分野の当業者は、別のコドンを用いてヌクレオチド配列の操作を容易にする部位を作ることができることも明らかである。本発明は、配列番号：２のタンパク質と実質的に相同のタンパク質とその種の同族体を用いて赤血球形成を刺激する方法を提供するものである。“単離された ”タンパク質とは、その元の環境とは異なる条件下、例えば血液および動物組織とは異なる条件下で見られるタンパク質を意味する。好ましい形態の単離されたタンパク質は、他のタンパク質、特に動物起源の他のタンパク質を実質的に含有していない。高純度の形態すなわち95％より高い純度のタンパク質を提供することが好ましく、さらに好ましいのは99％より高い純度のタンパク質を提供することである。“実質的に相同の”という用語は、本明細書で用いる場合、配列番号：２に示す配列またはその種の同族体に対する配列同一度(sequence identity)が50％、好ましくは60％、さらに好ましくは少なくとも80％であるタンパク質を意味する。かようなタンパク質は、配列番号：２またはその種の同族体に対し、さらに好ましくは少なくとも90％同一であり、最も好ましくは95％以上同一である。配列同一度の百分率は通常の方法で測定される（例えば、Altschulら、Bull．Math．Bio.，48巻、603 〜616頁、1986年およびHeniKoffとHeniKoff，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89 巻、10915〜10919頁、1992年参照）。簡単に述べると、二つのアミノ酸配列が、表１に示すように、ギャップ・オプニング・ペナルティー（gap opening penalt y）10、ギャップ・エクステンション・ペナルティー（gap extension penalty）１およびHeniKoffとHeniKoff（前掲文献）の“ブロサム（blosum）62”スコアリングマトリックス（scoring matrix）を用いて配列スコアが最適になるよう一列に配列されている（アミノ酸は標準の一文字コードで示してある）。同一度のパーセントは下記式で計算される。実質的に相同のタンパク質には、１個以上のアミノ酸の置換、欠失または付加があることが特徴的である。これらの変化は、重大でない性質の変化の方が好ましく、すなわちタンパク質の折りたたみまたは活性に大きく影響しない同類アミノ酸の置換（表２参照）；一般に１〜約30個のアミノ酸の小さな欠失；およびアミノ末端もしくはカルボキシル末端の小さなエクステンション(extension)、例えばアミノ末端のメチオニン残基、約20〜25までの残基からなる小リンカ−ペプチドまたは精製が容易になる小エクステンション例えばポリヒスチジン領域、抗原エピトープもしくは結合ドメインがある（一般に、Fordら、Protein Expressi on and Purification，２巻、95〜107頁、1991年参照。なおこの文献は本願に援用するものである）。 TPO およびEPO 中の必須アミノ酸は当該技術分野で公知の方法で確認することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法またはアラニン走査突然変異誘発法（CunninghamとWells，Science，244巻、1081〜1085頁、1989年）がある。上記方法の後者の場合、単一アラニン突然変異がその分子のあらゆる残基に導入され、次いで得られた突然変異分子を生物活性について試験した（例えば受容体結合活性、生体外もしくは生体内の増殖活性など）、分子の活性にとって決定的に重要なアミノ酸残基が確認される。またリガンド−受容体相互作用の部位は、核磁気共鳴法、結晶学または光親和性標識法のような方法で測定されるような結晶構造を分析することによって決定することができる（例えば、de-Vosら、Science ，255巻、306〜312頁、1992年；Smithら、J．Mol．Biol．224巻、899〜904頁、1 992年；Wlodaverら、FEBS Lett.，309巻、59〜64頁、1992年参照）。構造−機能の関係の解明に基づいてEPO の生物活性突然変異タンパク質が最近確認されている（Boisselら、J．of Biol，Chem.，268巻、15983〜15993頁、199 3年およびHiguchiら、J．Biol．Chem.，267巻、7703〜7709頁、1992年）。異なるシアル酸組成を有するEPO のイン型はStricklandらのヨーロッパ特許第 04282 67号に開示されている。一般にサイトカイン類は４個のαヘリックス構造を有していると考えられ、その第一と第四のヘリックスがリガンド−受容体の相互作用で最も重要であり、そのファミリーのメンバーの中で最も高度に保存される。配列番号：２に示すヒト TPO のアミノ酸配列によれば、サイトカインの配列は一直線に配列されているので、これらのヘリックスがそれぞれ29位と53位、80位と99位、108位と130位および144と168のアミノ酸残基で結合されていること（境界は±４残基）を示唆している。マウスおよび他の非ヒトTPO のヘリックス境界はヒトの配列と一列に並べることによって決定することができる。TPO のその外の重要な構造態様としては、配列番号：２の28位、50位、106位および172位のシステイン残基がある。上記の造血タンパク質に加えて、本発明の方法には、これらのタンパク質のフラグメントおよびこれらフラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチド分子を利用する方法が含まれる。特に重要なのは、MPL 受容体に結合する、少なくとも10個のアミノ酸の長さのフラグメント、およびかようなポリペプチドをコードする、少なくとも30個のヌクレオチドの長さのポリヌクレオチド分子である。この種のポリペプチドは、公知の選別法、例えば任意に上記構造分析法と組み合わせて、無傷のタンパク質を消化するかまたはオーバーラップしている小さいポリペプチドまたはポリヌクレオチドを合成する（次いでポリヌクレオチドを発現させる）ことによって確認される。得られたポリペプチドを、MPL受容体に特異的に結合してMPL受容体を介して細胞の増殖を刺激する性能について試験する。結合は従来の方法、例えば、Klotz，Science，217巻、1247頁、1982年に開示されている方法（“スキャッチャード分析法”）のような方法で測定される。簡単に述べると、放射能標識をつけた試験ポリペプチドを、濃度を増大中の未標識のTPO の存在下、MPL 受容体を保有する細胞とともに培養する。細胞に結合した標識化ポリペプチドを、フタレートオイル（phthalate oil）を通じて遠心分離によって遊離の標識化ポリペプチドから分離する。試験ポリペプチドの結合アフィニティーは、縦軸に結合標識／遊離標識の比を取り、横軸に結合標識をとってプロットすることによって決定される。結合特異性は、TPO 以外のサイトカイン類と競合させることによって測定される。また受容体結合性は、試験化合物を、固定化MPL 受容体（またはそのリガンド結合性細胞外ドメイン）によって沈澱させることによって決定することができる。簡単に述べると、該受容体またはその一部が不溶性支持体に固定化される。試験化合物は、例えば、組換え試験化合物の場合、宿主細胞を代謝によって標識化することによって、または従来の生体外標識化法（例えば、放射性ヨウ素化法）によって標識化することができる。次に標識化化合物を上記固定化受容体と結合させ、未結合物質を除去し、次いで結合した標識化化合物を検出する。各種の標識の検出方法は当該技術分野で公知である。増殖の刺激は、通常、MPL 受容体保有細胞によるMTT 比色検出法または³Ｈ−チミジン取込み検定法を用いて測定される。ポリペプチドは、各種の濃度で、一般に１nm〜１ mMの範囲にわたって活性を検定される。また50個以上の残基、好ましくは100個以上の残基、さらに好ましくは約140個以上の残基を有し、全成熟タンパク質の大きさまでの大きなポリペプチドも提供される。例えば配列番号：２に示す28位〜172位のアミノ酸残基のアミノ酸配列の分析とモデル化を行うと、上記分子のこの部分が、自己集合を行うことができるサイトカイン様領域であることを示唆している。また重要なのは、このコアサイトカイン様ドメイン＋一次翻訳産物の１個以上の追加のセグメントまたはドメインを含有する分子である。したがって、重要な他のポリペプチドとしては表３に示すものがある。当該技術分野の当業者は、中間形態の分子（例えば、配列番号：４の196位と2 06位の残基の間、配列番号：２の185位と193位の間の残基のＣ末端を有する分子、または配列番号：２の22位と28位の残基の間のＮ末端を有する分子）も、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入またはＮ末端もしくはＣ末端のエクステンションを一つ以上有するポリペプチドであるから重要であることが分かるであろう。したがって本発明は、少なくとも10個のアミノ酸残基、好ましくは少なくとも50個のアミノ酸残基、一層好ましくは少なくとも100個のアミノ酸残基そして最も好ましくは少なくとも約140個のアミノ酸残基の長さを有する造血ポリペプチドであって、配列番号：２の類似の大きさのポリペプチドに実質的に相同の造血ポリペプチドを提供するものである。赤血球生成を刺激するため本発明に用いられるタンパク質は、宿主細胞を、従来の方法にしたがって遺伝子工学で処理して製造することができる。適切な細胞は、外因性DNA で形質転換またはトランスフェクションを行い次いで培養で増殖させることができる宿主細胞型であり、細菌、真菌細胞および培養された高等真核細胞がある。クローン化DNA 分子を操作し、外因性DNA を各種宿主細胞中に導入する方法は、Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第二版、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1989年発行およびAusubelらの前掲論文に開示されている。なおこれらの文献は本明細書に援用するものである。組換えEPO の製造法は、Lin らのヨーロッパ特許第014805号；Fritschらのヨーロッパ特許第 0411678号、Fri tschらのヨーロッパ 0205564号；Hegwickらのヨーロッパ特許第 0209539号；Lin らの国際特許願公開第WO85／02610 号；米国特許第 4,677,195号および同第 4,7 03,008号に記載されている。組換えTPO の製造法は、Lokら、Nature，369巻、565〜568頁、1994年；Bartleyら、C ell，77巻、1117〜1124頁、1994年およびSauvageら、Nature，369巻、533〜538 頁、1994年に記載されている。一般に、サイトカインをコードするDNA 配列は、発現ベクター内の転写プロモーターとターミネーターに作動可能に連結されている。そのベクターは、通常、一つ以上の選択可能マーカーと一つ以上の複製開始点をもっているが、当該技術分野の当業者は、特定の系では、選択可能マーカーは別個のベクターに設けることができ、かつ外因性DNA の複製は宿主細胞のゲノムに組み込むことによって行うことができる。プロモーター、ターミネーター、選択可能マーカー、ベクターおよび他の要素の選択は、当該技術分野の当業者のレベル内のルーチン設計の問題である。多数のこれら要素は文献に記載されかつ製造業者から入手できる。タンパク質を、宿主細胞の分泌経路に導くため、分泌シグナル配列〔リーダー配列、プレプロ（prepro）配列、またはプレ(pre)配列としても知られている〕を発現ベクター中へ入れる。その分泌シグナル配列は、正しい読取り枠内の、重要なタンパク質をコードするDNA 配列に接続される。分泌シグナル配列は、通常、対象のタンパク質をコードするDNA 配列に対し５′側に配置されるが、特定のシグナル配列は、対象の DNA配列内の別の位置に配置してもよい（例えば、Welc hらの米国特許第 5,037,743号；Hollandらの米国特許第 5,143,830号参照）。分泌シグナル配列は、対象のタンパク質と正常に関連しているのかまたは他の分泌されるタンパク質をコードする遺伝子由来のものでもよい。酵母細胞、特にサッカロミセス(Saccharomyces)属の細胞は、本発明で用いてサイトカイン類を産生させるのに好ましい宿主である。酵母細胞を外因性DNA で形質転換し次いで形質転換細胞から組換えタンパク質を産生させる方法は、例えばKawasakiの米国特許第 4,599,311号； Kawasakiらの米国特許第 4,931,373号；Brakeの米国特許第 4,870,008号；Welch らの米国特許第 5,037,743号；およびMurrayらの米国特許第 4,845,075号に開示されている。なおこれらの文献は本明細書に援用するものである。形質転換された細胞は、選択可能マーカーによって、通常、薬剤耐性または特定の栄養（例えばロイシン）がなくても増殖する性能が決定される表現型によって選択される。酵母に用いるのに好ましいベクター系はKawasakiらが開示したPOT1ベクター系（米国特許第4,931,373号）であり、このベクター系によって、形質転換細胞を、グルコース含有培地で増殖させて選択することができる。酵母に用いるのに好ましい分泌シグナル配列は、エス・セレビシアエ(S．cerevisiae)のMFα １遺伝子の配列である（Brakeの前掲文献；Kurjanらの米国特許第 4,546,082号）。酵母に用いるのに適切なプロモーターとターミネーターとしては、解糖酵素遺伝子類由来のもの（例えばKawasakiの米国特許第 4,599,311号；Kingsmanらの米国特許第 4,615,974号；およびBitterの米国特許第 4,977,092号参照。これらの文献は本明細書に援用するものである）およびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子がある（また米国特許第 4,990,446号；同第 5,063,154号；同第 5,139,936号および同第 4,661,454号参照。なおこれら文献は本明細に援用する）。他の酵母類〔ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロミセス・ラクティス（Kluyverom yces lactis）、クルイベロミセス・フラギリス（Kluyveromyces fragilis）、ウスチラゴ・マイディス（Ustilago maydis）、ビキヤ・パストリス（Pichia pa storis）、ピキア・ギレルモンディー（Pichia guillermondii）およびカンジダ・マルトーサ(Candida maltosa)を含む〕に用いる形質転換は当該技術分野で公知である（例えば、Gleesonら、J．Gen．Mic robiol.，132巻、3459〜3465頁、1986年およびCreggの米国特許第 4,882,279号参照）。他の真菌細胞も宿主細胞として適している。例えば、アスペルギルス(Aspergi llus)属の細胞は、McKnightらの米国特許第 4,935,349号の方法にしたがって利用することができる。なおこの特許は本明細書に援用するものである。アクレモニウム・クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）を形質転換する方法は、Sumi noらの米国特許第 5,162,228号に開示されている。この文献は本明細書に援用するものである。ノイロスポラ（Neurospora）属の真菌を形質転換する方法は、La mbowitzの米国特許第 4,486,533号に開示されている。なおこの文献は本明細書に援用するものである。培養される哺乳類の細胞も好ましい宿主である。外因性DNAを哺乳類の宿主細胞中に導入する方法としては、リン酸カルシウムによるトランスフェクション法（Wiglerら、Cell，14巻、725頁、1978年；CorsaroとPearson，Somatic Cell Ge netics，７巻、603頁、1981年；GrahamとVan der Eb，Virology，52巻、456頁、 1973年）、エレクトロポレーション(Neumannら、EMBO J.，１巻、841〜845号、1 982年）、およびDEAE−デキストランによるトランスフェクション法(Ausubelら編集、Current Protocols in Molecular Biology、米国ニューヨーク州、John W iley and Sons，Inc．社 1987年発行）がある。なおこれらの文献は本明細書に援用するものである。培養される哺乳類の細胞中に組換えタンパク質を産生させる方法は、例えばLevinsonらの米国特許第 4,713,339号；Hagenらの米国特許第 4,784,950号；Palmiterらの米国特許第 4,579,821号；およびRingoldの米国特許第 4,656,134号に開示されており、これら文献は本明細書に援用するものである。好ましい培養される哺乳類の細胞としては、COS-1（ATCC No．CRL 1650），COS-7（ATCC No．CRL 1651），BH K（ATCC No．CRL 1632），BHK570（ATCC No．CRL 10314），293（ATCC No．CRL 1573；Grahamら、J．Gen．Virol.，36巻、59〜72頁、1977年）およびチャイニーズハムスター卵巣（例えばCHO-K1；ATCC No．CCL 61）の細胞系がある。その外の適切な細胞系は、当該技術分野で公知であり、American Type Culture Collec tion（米国メリーランド州ロックビル）などの公の受託機関から入手できる。一般に、強力な転写プロモーター、例えばSV−40またはサイトメガロウイルス由来のプロモーターが好ましい（例えば米国特許第 4,956,288号参照）。他の適切なプロモーターとしては、メタロチオネイン遺伝子由来のもの（米国特許第 4,579 ,821号および同第 4,601,978号。これら文献は本明細書に援用する）およびアデノウイルスの主要後期プロモーター（major late promoter）がある。薬剤による選択は、一般に、外来DNA が挿入されている培養哺乳類細胞を選択するのに使用される。このような細胞は通常“トランスフェクタント(transfect ant)”と呼ばれる。選択剤の存在下で培養されて対象の対象の遺伝子をその子孫に伝達することができる細胞は“安定なトランスフェクタント”と呼称される。好ましい選択可能マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子である。選択は、ネオマイシンタイプの薬剤、例えばＧ−418などの存在下で実施される。また選択システムは、対象の遺伝子の発現レベルを増大するため、“増幅”と呼ばれる方法にも用いることができる。増幅は、低レベルの選択剤の存在下でトランスフェクタントを培養し次に選択剤の量を増やして、導入遺伝子の産物を高レベルで産生する細胞を選択することによって実施される。好ましい増幅可能な選択可能マーカーはジヒドロ葉酸レダクターゼであり、これはナトトレキセートに対する耐性を付与する。他の薬剤耐性遺伝子（例えばハイグロマイシン耐性、多重薬剤耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼの遺伝子）も使用できる。また、昆虫細胞、植物細胞および鳥細胞を含む他の高級真核細胞も宿主として使用できる。昆虫細胞を形質転換して外来タンパク質を産生させることは、Guarinoらの米国特許第 5,162,222 号；Bangoらの米国特許第 4,775,624号および国際特許願公開第WO94／06463号に開示されている。これら文献は本明細書に援用する。植物細胞中に遺伝子を発現させるためのベクターとしてアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を使用することは、Sinkarら、J．Biosci．（Bangalore），11巻、 47−58頁、1987年に総説が記載されている。好ましい真核細胞の宿主は細菌のエシャリシア・コリ（Escherichia coli）であるが、バシラス（Bacillus）属などの他の属の細菌も有用である。これらの宿主を形質転換しその中にクローン化された外来DNA配列を発現する方法は当該技術分野で公知である（例えばSambrookらの前掲文献参照）。Ｅ・コリのような細菌中にタンパク質を発現させると、そのタンパク質は、細胞質中に、一般に、不溶性顆粒として保持されるか、または細菌の分泌配列によって細胞周辺腔に導かれる。前者の場合、その細胞を溶解させ、顆粒を回収し次に例えばグアジニンイソチオシアネートを用いて変性させる。次いでその変性されたタンパク質を、変性剤を希釈することによって復元する。後者の場合、細胞を（例えば、音波処理または浸透ショックによって）破裂させて、細胞周辺腔の内容物を放出させてタンパク質を回収することによって、タンパク質を可溶性でかつ機能性の形態で細胞周辺腔から回収することができる。形質転換されたかまたはトランスフェクトされた宿主細胞は、選択された宿主細胞を増殖させるのに必要な栄養および他の成分を含有する培地で、通常の方法にしたがって培養される。規定培地および複合培地を含む各種の適切な培地は当該技術分野で公知であり、一般に炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミンおよび無機質を含有している。また培地は、必要に応じて、成長因子または血清のような成分を含有していてもよい。一般に増殖培地は、例えば発現ベクターに保持されているかまたは宿主細胞中にコトランスフェクトされた（CO-transfected）選択可能マーカーによって補完される、薬剤による選択または必須栄養の欠失によって外因的に付加されたDNAを含有する細胞を選択する。本発明に用いるTPO およびEPO を製造するのに遺伝子導入動物法（transgenic animal technology）を利用することができる。宿主の雌の哺乳類の乳腺にタンパク質を産生させることが好ましい。対象のタンパク質を乳腺に発現させ続いてそのタンパク質を乳汁中に分泌させると、他の起源からタンパク質を単離する際に遭遇する多くの困難を克服することができる。乳汁は、容易に収集され、大量に入手することができ、かつ生化学的に十分、特性解析がなされている。さらに、主な乳タンパク質が乳汁中に高濃度（約１〜15ｇ／ｌ）で存在している。商業的な観点から、乳汁の収量が大きい種を宿主として使用する方が明らかに好ましい。マウスおよびラットのような小動物が使用可能である〔かつ、プルーフ・オブ・コンセプトの段階（proof-of-concept stage）で好ましい〕とはいえ、制限はないがブタ、ヤギ、ヒツジおよびウシを含む家畜哺乳類を使用することが好ましい。ヒツジは、この種の今までの遺伝子導入（transgenesis）歴、乳汁の収量、経費およびヒツジ乳収集設備をすぐに利用できることなどの要員から時に好ましい（宿主の種を選択に影響する因子を比較するため国際特許願公開第WO 88/00239号参照）。酪農用に飼育されている宿主動物の品種、例えばイースト・フリースランドのヒツジ（East Friesla nd Sheep）を選択するか、または、後日、遺伝子導入系(transgenic line)を飼育することによって酪農家畜を導入することが望ましい。いずれにしろ、公知の健康状態が良好な動物を使用しなければならない。乳腺中に発現させるため、乳タンパク質遺伝子由来の転写プロモーターを使用する。乳タンパク質遺伝子としては、カゼイン類（米国特許第 5,304,489号参照。この文献は本明細書に援用する）、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミンおよび乳清酸性タンパク質をコードする遺伝子類がある。β−ラクトグロブリン(BLG)プロモーターが好ましい。ヒツジのβ−ラクトグロブリン遺伝子の場合、その遺伝子の５′隣接配列の少なくとも近位406bpの領域を一般に使用するが、約５Kbpまでの５′隣接配列の大きな部分、例えば、β−ラクトグロブリン遺伝子の５′隣接プロモーターと非コーディング部分を含む約4.25KbpのDNA セグメントが好ましい（Whitelawら、Biochem，J.，286巻、31〜39頁、1992年参照）。他の種由来のプロモーターDNA の類似のフラグメントも適している。 β−ラクトグロブリン遺伝子の他の領域も、発現される遺伝子のゲノム領域であれば構造体に組み込むことができる。イントロンを欠いている構造体は、例えば、このようなDNA 配列を含有している構造体と比べて発現が劣っていることは当該技術分野では一般に認められている（Brinsterら、Proc．Natl．Acad．Sci ．USA，85巻、836〜840頁、1988年；Palmiterら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA ，88巻、478〜482頁、1991年；Whitelawら、Transgenic Res.，１巻、３〜13頁、1991年；国際特許願公開第WO89/01343号；同第WO91/02318号参照）。この点について、可能ならば、対象のタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子の固有のイントロンの全部またはいくらかを含有するゲノム配列を使用することが一般に好ましいので、例えばβ−ラクトグロブリン遺伝子由来の少なくともいくらかのイントロンをさらに含有させることが好ましい。このような一つの領域は、ヒツジのβ−ラクトグロブリン遺伝子の３′非コーディング領域由来のイントロンスプライシングとRN A ポリアデニル化を規定するDNA セグメントである。遺伝子の天然の３′非コーディング配列を置換すると、このヒツジβ−ラクトグロブリンセグメントは、対象のタンパク質またはポリペプチドの発現レベルを高めかつ安定化することができる。他の実施態様において、サイトカイン配列の開始ATGを囲む領域が乳汁特異的タンパク質遺伝子由来の対応する配列で置換される。このような置換によって、発現を高める推定上の組織特異的開始環境が提供される。全サイトカインのプレプロ配列（pre-pro sequence）と５′非コーディング配列を、例えばBLG 遺伝子の配列（小領域は置換できるが）で置換することが便利である。サイトカイン類を、遺伝子導入動物内で発現させるため、サイトカインをコードするDNA セグメントを、サイトカインの発現に必要な追加のDNA セグメントに作動可能に連結され発現ユニットが生成する。かような追加のセグメントとしては、mRNAの転写とポリアデニル化の終了を規定する配列のみならず上記プロモーターが含まれている。上記発現ユニットは、さらに、サイトカインをコードするセグメントに作動可能に連結された分泌シグナル配列をコードするDNA セグメントを含有している。その分泌シグナル配列は固有のサイトカイン分泌シグナル配列でもよく、または乳タンパク質のような他のタンパク質の分泌シグナル配列でもよい（例えば、Von Heinje，Nuc．Acid．Res.，14巻、4683〜4690頁、1986年；およびMeadeらの米国特許第 4,873,316号参照。なお、これらの文献は本明細書に採用するものである）。遺伝子導入動物に使用する発現ユニットの構築は、追加のDNA セグメントを含有するプラスミドまたはファージベクター中にサイトカインのコーディング配列を挿入することによって実施するのが便利であるが、発現ユニットは、連結のほとんどすべての配列によって構築することができる。乳タンパク質をコードする DNA セグメントを含有するベクターを準備し、その乳タンパク質のコーディング配列と対象のサイトカインのコーディング配列で置換して、乳タンパク質遺伝子の発現制御配列を含む遺伝子融合を起こさせることが特に便利である。いずれにしろ、プラスミドまたは他のベクター中に発現ユニットをクローン化すると、サイトカイン配列の増幅が容易になる。増幅は、細菌の（例えばイー．コリの）宿主細胞で実施することが便利であるので、ベクターは一般に、細菌宿主細胞内で機能する複製開始点と選択可能マーカーを含有している。次のその発現ユニットを、選択された宿主の種の受精卵（初期段階の胚を含む）内に導入する。非相同DNA の導入は、微量注入（例えば米国特許第 4,873,191 号）、レトロウイルスのインフェクション（Jaenisch，Science，240巻、1468〜 1474頁、1988年）、または胚幹（ES）細胞を用いる部位特異的組込み(Bradleyらの総説：Bio/Technology，10巻、534〜539頁、1992年）を含むいくつかのルートのうち一つで達成することができる。次にそれらの卵を、偽妊娠の雌の卵管または子宮に移植して出産予定日まで成長させる。それら生殖細胞系に導入されたDN A を保有する子孫は、そのDNA を、通常のメンデルの方式でその子孫に伝達して、遺伝子導入集団を成長させる。遺伝子導入動物の一般的な製造法は当該技術分野で公知である（例えば、Hoga nら、“Manipulating the Mouse Lmbryo：A Laborato ry Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory，1986年；Simonsら、Bio/Techno logy，６巻、179〜183頁、1988年；Wallら、Biol．Reprod.，32巻、645〜651頁、1985年；Buhlerら、Bio/Technology，８巻、140〜143頁、1990年；Ebertら、B io/Technology，９巻、835〜838頁、1991年；Krimpexfortら、Bio/Technology，９巻、844〜847頁、1991年；Wallら、J．Cell．Biochem.，49巻、113〜120頁、1 992年；米国特許第 4,873,191号および同第 4,873,316号；国際特許願公開第WO8 8/00239号、同第WO90/05188号および同第WO92/11757号；ならびに英国特許第87/ 00458号参照。これらの文献は本明細書に援用するものである）。外来DNA 配列を哺乳類および哺乳類の生殖細胞に導入する方法は最初マウスで開発された（例えば、Gordonら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，77巻、7380〜7384頁、1980年； GordonとRuddle，Science，214巻、1244〜1246頁、1981年；PalmiterとBrinster ，Cell，41巻、343〜345頁、1985年；Brinsterら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA ，82巻、4438〜4442頁、1985年；およびHogenらの前掲文献参照）。その後、これらの方法は、家畜の種を含む大きな動物に使用するよう適応された（例えば国際特許願公開第WO88/00239号、同第WO90/05188号および同第WO92/11757号；ならびにSimonsら、Bio/Technology，6巻、179〜183頁、1988年参照）。要約すると、遺伝子を導入されたマウスまたは家畜を産出するのに現在まで使用された最も効率的なルートでは、対象DNA の直鎖状分子を数百個、当該技術分野で標準になっている方法にしたがって、受精卵の前核の一つに注入する。DNA を接合子の細胞質中に注入する方法も利用できる。遺伝子導入植物で産生させる方法も利用できる。発現は特定の器官、例えば塊茎に一般化するかまたは実施される（Hiatt，Nature，344巻、469〜479頁、1990 年；Edelbaumら、J．Interferon Res. ，12巻、449〜453頁、1992年；Sijmonsら、Bio/Technology，８巻、217〜221頁、1990年；およびヨーロッパ特許願公開第 255,378号参照）。 TPO およびEPO は、当該技術分野で公知の方法、例えばアフィニティー精製法ならびに該タンパク質の大きさ、電荷、溶解性および他の特性に基づいた単離法を用いて精製される。該タンパク質を培養哺乳類細胞中に産生させる場合、汚染タンパク質の量を制限するため、血清を含有しない培地で細胞を培養することが好ましい。その培地を採取して分画する。好ましい分画法としては、コンカナバリンＡまたは他のレクチンを用いるアフィニティークロマトグラフィーがあり、この方法はタンパク質に存在するカーボハイドレートを利用する方法である。またTPO は、固定化されたMPL 受容体タンパク質もしくはそのリガンド結合部分またはアフィニティタグを用いて精製することができる（例えば抗体もしくは他の特異的結合因子を利用できるポリヒスチジン、サブスタンスＰまたは他のポリペプチドもしくはタンパク質）。特異的開裂部位を、対象のタンパク質とアフィニティータグとの間に設けることができる。EPO レベルが高い尿毒症患者由来のEP O が精製されている（米国特許第 4,397,840号、同第 4,303,650号および同第 3 ,865,801号；ならびにMiyakeら、J．Biol．Chem.，252巻、5558頁、1977年参照）。尿毒症患者および組換え法の両者から得たEPO が逆相HPLCを用いて精製されている（Hewickらの米国特許第 4,677,195号）。 TPO タンパク質は、例えば再生不良性貧血、脊髄形成異常症候群、自己免疫疾患、エイズ、化学療法または放射線などで誘発される血球減少症および貧血を治療する場合のように、骨髄中の造血細胞の増殖を高めることが望ましいときはいつでも治療に使用できる。 TPO を含有する組成物は、赤血球の産生が低いことが特徴の疾患（貧血）を、特に血小板の産生が低い症状（血小板減少症）が併発している場合、治療するのに有用である。癌および病状を各種の化学療法で治療すると、患者の血小板と赤血球のレベルがともに低下することが知られている。 TPO の組成物が、循環系の赤血球および赤血球前駆細胞のレベルを高くするのに有効であることが見出されたのである。これらの細胞の循環レベルが減少することは貧血症として知られている。血液中の赤血球のレベルは、血液100ml当りのヘモグロビンの量としてまたは血液100ml当り充填赤血球容積として測定される。患者は、そのヘモグロビンレベルが、（患者の年齢と性別によって）血液10 0ml当り11〜13ｇより低くなった場合貧血と診断される。本発明の方法は、骨髄の不全に関連する貧血（この場合、赤血球形成の低下は例えば化学療法の毒作用が関連している）を治療するのに有用である。 TPO タンパク質は、血小板の産生量を増大し同時に赤血球細胞のレベルを高くすることによって血小板減少症と貧血症を同時に治療するのに有用であることが見出されたのである。貧血症と血小板減少症は、単独または組み合わさって作用して症状を生じる患者と臨床状態の多様な群に関連している。血小板の計数値が低下するのは、例えば、大量輸液が原因の希釈損失(dilutional loss)または骨髄の異常な破壊による貧血症が関連していることがある。例えば、癌の治療に用いられる化学療法薬剤は、骨髄における血小板と赤血球プロジェニター細胞の発育を抑制することがあり、起こった血小板減少症と貧血症によって化学治療が制限され、輸液が必要になることがある。その上、ある種の悪性腫瘍は血小板と赤血球の産生と分配を損なうことがある。悪性細胞を殺すために使用される放射線治療法も血小板と赤血球プロジェニター細胞を殺す。血小板および赤血球の異常な破壊は、白血病とリンパ腫のような血液疾患または骨髄を冒す転移癌から起こることがある。併発している貧血症と血小板減少症を治療するためにTPO と使用する一つの指標としては、再生不良性貧血、および例えばHIV 感染症のAZT による化学療法すなわち治療から起こる薬剤誘発骨髄抑圧がある。血小板減少症は、創傷、潰瘍または注射部位からの滲出性出血のみならず鼻腔 −口腔領域または胃腸管からの粘膜出血のような出血の増大として現われる。貧血の症候群としては、身体運動による呼吸困難、めまい感、疲労、および皮膚と粘膜の蒼白がある。血小板減少症と関連して網膜出血が起こっていることがある。赤血球の産生を刺激するためEPO を使用した。EPO は分子量が約34,000ダルトンの酸性糖タンパク質であり、３種の形態：α型、β型およびアシアロ型で存在している。α型とβ型はカーボハイドレートの成分がわずかに異なっているが、効力、生物活性および分子量は同じである。アシアロ型は、末端のカーボハイドレート（シアル酸）を除いたα型もしくはβ型である。エリトロポイエチンは、身体が健康な状態にあり、かつ組織が現存する数の赤血球から十分に酸素を供給されているとき、血漿中濃度が非常に低い（例えば、Linらの米国特許第 4,703, 008号：Linらの国際特許願公開第WO85/02610号；Fritschらのヨーロッパ特許第 0411678号；Hewickらのヨーロッパ特許第 0209539号およびHewickらの米国特許第 4,677,195号参照。これらの文献は本明細書に援用する）。正常な固体の場合、赤血球の産生は、赤血球を過剰に産生したり循環を妨げたりすることなく組織に酸素を十分供給するよう正確に制御されている。赤血球の産生が減少すると、組織の低酸素症を起こして、EPO の発現が刺激され、かつ血漿中に見られる内因性EPO が増大する。EPO は、骨髄中の原始前駆細胞の前赤芽球への変換を刺激し、次にその前赤芽球が成熟し、ヘモグロビンを合成し次いで赤血球として循環系に放出されることによって、赤血球の産生量が増大する。赤血球形成に対するTPOとEPO の刺激作用を規定するために、本発明は外因性E PO を投与することは必らずしも必要ではない。先に述べたように、赤血球のレベルが低下すると、場合によっては、EPO の内因性レベルが上昇し（血漿１ml当り500mUを超える）、TPO だけ投与すれば十分である。エリトロポイエチンの発現が上昇しない場合、エリトロポイエチンをTPO の組成物とともに投与することが有利である。 EPO は、ヘモグロビンの濃度が血液100ml当り10ｇより低い尿毒症の患者に治療薬として投与される。投与経路は、静脈内（IV）または皮下（SC）の経路でもよく、患者の身体の状態によって毎日から毎週まで投与が変わることが多い(De Marchiら，Clin．and Experim．Rheumatol.，11巻，429〜444頁，1993年; Mille rら，N．Eng．J．of Med.，322巻，1689〜1692頁，1990年；Nissensonら，Annal s of Int．Med.，114巻，402〜416頁，1991年；Erslev，Sem．Oncol．19（8）Su ppl.，8巻，14〜18頁，1992年およびPROCIT Epotin-α package insert,米国カリフォルニア州サウザンドオークス所在のAmgen社）。医薬として用いるため、TPO とEPO は従来の方法によって、非経口の特に静脈内または皮下による送達用に調合される。静脈内投与は、一般的に１時間〜数時間の期間にわたってボーラス注射または注入によって行われる。一般に医薬製剤は、医薬として許容される賦形剤、例えば食塩水、緩衝食塩水または５％デキストリン水溶液などと混合して造血タンパク質類を含有している。その製剤はさらに、一種以上の、賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、バイアルびん表面でのタンパク質損失を防止するためのアルブミンなどを含有していてもよい。その上、TPO とEPO は、他のサイトカイン類、特に早期に作用するサイトカイン類、例えば幹細胞因子、IL−３，IL−６，IL−11またはGM-CSFと組み合わせてもよい。このような組合わせ療法を利用する場合、これらサイトカイン類は単一製剤中に混合してもよく、または別個の製剤で投与してもよい。調合方法は当該技術分野で公知であり、例えば、Gennaro編集“Remington's Pharmaceutical Sciences”，米国ペンシルベニア州イーストン所在のMack Publishing Co．社， 1990年発行に開示されており、この文献は本明細書に援用するものである。TPO の治療投与量は一般に、生体外有糸分裂促進検定法で95％を超える純度のタンパク質に基づいて、１日間に患者の体重１kg当り1.0×10⁵〜100×10⁵単位、好ましくは1.0×10⁵〜25×10⁵単位の範囲内である（当該技術分野の当業者は、培養細胞を用いる生体外検定法の試験結果は±20％の範囲で日常的に変化することは分かっているであろう）。これらの投与量は、約1.2μｇ／kg／日〜114μｇ／kg／日、好ましくは1.2μｇ／kg／日〜50μｇ／kg／日に相当する。場合によっては、例えば患者の感受性が高くなったりまたは治療期間を延長する必要がある場合、投与量は低い量の範囲が適当である。このような場合、0.1×10⁵〜50×10⁵単位のTPO／kg／日、好ましくは0.5×10⁵〜25×10⁵単位のTPO／kg／日が有利である。EPO の治療投与量は一般に、10〜150Ｕ／患者の体重１kg／日好ましくは50 〜150Ｕ／kg／日の範囲内にある。TPO とEPO はともに、的確な投与量は、治療される症状の性質と重篤度、患者の形質などを考慮して、容認されている基準にしたがって医師が決定する。投与量を決定することは、当該技術分野の通常の技能のレベル内に入っている。これらのタンパク質は、通常、化学療法、放射線療法または骨髄移植に続いて28日間までの期間または＞20,000／mm³、好ましくは＞50,000／mm³の血小板計数値、30〜33％のヘマトクリット値および少なくともベースラインの２倍の網状赤血球計数値が達成されるまで投与される。さらに一般的に、これらタンパク質は、１週間以上にわたって投与され、７〜14日の期間にわたって投与されることが多い。一般に、TPO またはEPO の治療上有効な量は、リンパ球または骨髄のプロジェニター細胞の増殖および／または分化を臨床上有意に高めるのに十分な量である。なおその増殖および／または分化は、成熟細胞（例えば血小板または赤血球）の循環レベルの増大として示される。したがって血小板障害の治療は、血小板計数値が少なくとも20,000／mm³、好ましくは50,000／mm³に到達するまで続行される。貧血症の治療は、30〜33％のヘマトクリットレベル、ベースラインを超えて少なくとも２倍の網状赤血球計数値すなわちヘマトクリットに対して有意のインパクトを与えるのに適当なレベルに到達するまで続けられる。すでに述べたように、網状赤血球計数値の正常な範囲は0.8％〜1.2％である。またTPO とEP O は、他のサイトカイン類、例えばIL−３，IL−６およびIL−11；幹細胞因子； G-CSFとGM-CSFと組み合わせて投与してもよい。組合わせ療法の処方において、他のサイトカイン類の１日当りの投与量は、一般に、GM-CSFは５〜15μｇ／kg； IL−３は１〜５μｇ／kg；そしてG-CSFは１〜25μｇ／kgである。GM-CSFを用いる組合わせ療法は、例えば、好中球のレベルが低い患者に指示される。またTPO とEPO は、例えば自己骨髄培養のように生体外でも使用できる。簡単に述べると、化学療法を行う前に骨髄を患者から取り出し、次に、任意にEPO と組み合わせ、および任意に１種以上の追加のサイトカイン類を組み合わせてTPO で処置する。処理した骨髄を、患者に、化学療法を行った後に戻して骨髄の回復を速める。さらに、TPO は、単独およびEPO と組合わせて、骨髄細胞または末梢血プロジェニター（PBPC）細胞を生体外で拡張させるのに使用することができる。化学療法による治療を行う前に、骨髄を幹細胞因子(SCF)またはG-CSFで刺激して早期プロジェニター細胞を末梢循環系に放出させてもよい。これらのプロジェニターを末梢血から集めて濃縮し、次いで、制限はないがSCF，G-CSF,IL−３，GM-CSF，IL− ６またはIL−11を含む１種以上の他のサイトカイン類を任意に組み合わせて、TP O およびEPO を用いて培養で処理して分化・増殖させて高密度の巨核球培養物とすることができ、次にその培養物を、高投与量の化学療法を行った後、患者に戻すことができる。骨髄を生体外で処理するのに用いるTPO の投与量は、100pg／m l〜10ng／ml、好ましくは500pg／ml〜３ng／mlの範囲内である。EPO の投与量は、0.5単位／ml〜５単位／ml、好ましくは0.5単位／ml〜２単位／mlである。本発明をさらに下記の実施例で説明するが本発明を限定するものではない。実施例Ｉ．赤血球コロニー形成の誘発 EPO が生理的レベルにある場合、TPO を添加すると、赤血球コロニーの産生が刺激されて、EPO 単独の場合に見られる産生レベルより高い赤血球コロニー形成単位(CFU-E)が見られる。骨髄細胞は、人腿骨フラッシング（femoral flushing）によって、BDF₁マウス（米国メイン州バーハーバー所在のJackson Labs社）から単離した。得られた細胞（２×10⁴／100μｌクロット）を、30％仔ウシ血清（米国ユタ州ローガン所在のHyclone社）、１％ウシ血清アルブミン、５×10^-5Ｍβ−メルカプトエタノールおよび２×10^-5Ｍ CaCl₂で補充したα培地（米国バージニア州マックリーン所在のFlow Laboratories社）を含有する培地に再懸濁させた。120Ｖ／ml組換えマウスTPO を、1.5％PWM(pokeweed mitogen)で調製した脾細胞および２単位／ml のヒトEPO に添加して早期赤血球プロジェニター(BFU-E)の成長を促進させた。２単位／mlのヒトEPO は後期赤血球プロジェニター(CFU-E)のコロニーに添加した。 TPO 活性の単位は、TPO 依存性細胞系に対するマイトジェン活性を検定することによって測定した。マウスTPO 発現ベクター（pZGmpl−1081；ブダペスト条約の規定に基づいて、米国メリーランド州ロックビル12301パークローンドライブ所在のAmerican Type Culture Collectionに、1994年２月14日付けでイー・コリ DH５α形質転換体として指定受託番号69566 で寄託した）でトランスフェクトしたBHK 細胞を、同時係属中の1994年６月１日付け出願の米国特許願第08／252,49 1 号に記載されているようにして血清なし培地で培養した。ならし培地を集め、この標準溶液を用いて分裂促進活性の漸近曲線を作成した。標的細胞はBaF3／MP LR1.1であった（安定にトランスフェクトされたＩ型マウスMPL 受容体を発現するIL−３−依存性細胞；ブダペスト条約の規定に基づいて、米国メリーランド州ロックビル12301パークローンドライブ所在のAmerican Type Culture Collectio nに、1994年９月28日付けで指定受託番号CRL11723で寄託した）。最大活性の１／２の点（16個の曲線の平均）の値を500Ｕ／mlと定めた。計算した結果、元の標準溶液は26,600Ｕ／mlのマウスTPO を含有していた。試験試料として、培養上澄み液または精製タンパク質製剤を、57μＭ２−メルカプトエタノール、２mMのＬ−グルタミン、１mMのピルビン酸ナトリウム、PSN 抗生物質混合物、10mMのHEPESおよび10％の加熱不活性化仔ウシ血清で補充したR PMI1640培地を用いて、一般に８〜24倍の希釈率で希釈した。簡単に述べると、1 00μｌの希釈試験試料または標準試料と100μｌのBaF3細胞（添加した最終細胞数は約10,00 0細胞）とを96ウェルプレートのウェル中で混合した。内部標準は、マウスTPO 検定用の８個の、100Ｕ／mlマウスTPO の２倍希釈液、またはヒトTPO 検定用の８個の、150Ｕ／mlマウスTPO の２倍希釈液である。各ウェルに２μｌづつ³Ｈ− チミジン（１μCi／μｌ；Amersham社）を加え、そのプレートを37℃で一夜インキュベートした。各プレートの各ウェルの内容物をPackard装置を使ってフィルター／プレートに移した。そのフィルターを水で８回洗浄し、乾燥し次いで計数を行った。各試料ウェルのTPO 活性の単位を前記標準曲線と比べて測定した。ヒトEPO（米国カリフォニルア州サウザンドオークス所在のAmgen lnc.社）を、０〜300ｍ単位／mlの範囲で濃度を変えて、120単位のTPO とともにまたはTPO なしで添加した。10％シトレーテッドウシ血漿（citrated bovine plasma）を添加することによって凝固を開始させた。上記骨髄培養物を、５％のCO₂を含有する十分に湿潤させた大気内で37℃にて２日間インキュベートした。赤血球のコロニーは40個を超える細胞を含有していた。インキュベーションを行った後、上記凝固物を収穫し、乾燥し、ベンジジンで染色し、次いで赤血球のコロニーを計数した（Broudyら，Arch．of Biochem． and Biophys.，265巻，329〜336頁，1988年）。試験結果は、最大コロニー成長の結果にスライドさせ、２〜３個の反復プレートの少なくとも三つの別個の繰返し試験の平均値を示す。図１は、０〜100ｍ単位／mlの範囲内のEPO の生理的濃度において、120Ｕ／ml のTPO を添加すると赤血球プロジェニター細胞のコロニーの数が有意に増加することを示している。実施例II．TPO で誘発される、網状赤血球の計数値の増大 TPO で処置された動物は、未処置の動物と比べて網状赤血球の計数値が高い。 10頭の雄のBALB/Cマウス（米国カリフォルニア州ギルロイ所在のSimonsen Lab s社，約８週齢）を、TPO で処置した５頭の群と、５頭のシャム群（sham group ）とに分割した。20mMトリス（pH8.1），0.9％のNaClおよび0.25％のウサギ血清アルブミン(RSA)中に、12.5KUの投与量のマウス組換えTPO を調製した。シャム実験動物は緩衝液だけで処置した。各実験動物に、12.5KUのTPO または緩衝液を、６日間連続で１日に１回0.2mlづつ腹腔内注射で投与した。ゼロ日に各実験動物から採血し、次いで網状赤血球計数値を含めて、全血球計数値(CBC)を各実験動物について測定した。６日目に実験動物は採血し殺して、CBC と網状血球計数値を測定した。シャム処置動物については、網状血球計数値は、ゼロ日における 4.5％のベースラインから６日目の8.7％まで移行し、TPO 処置動物の場合、ゼロ日における5.3％のベースラインから６日目の12.0％まで移行した。実施例III．TPO で処置した実験動物の赤血球形成の増大放射線と化学療法薬剤で予め処置した実験動物にTPO を投与したところ、未処置の動物と比べて赤血球形成の回復が高まった。４〜６週齢の雌のC57BL／6Jのマウス（米国メイン州バーハーバー所在のJacks on Labs社）に対して、ゼロ日に、Gammacell 40 irraditor（カナダオンタリオ州カナダ所在のNordion International Inc．社）を用いて照射し¹³⁷Csに暴露させ、次に1.2mgのカルボプラチン（米国ニュージャージー州プリンストン所在のB ristol Laboratories社）を腹腔内に注射して処置した。そのマウスをTPO またはTPO 緩衝液だけで処置した。TPO またはTPO 緩衝液のみを１日目〜14日目にわたって投与した。これらマウスを以下の３群に分割した。第一群：500cGy照射＋1.2mg カルボプラチン＋14日間のTPO 緩衝液で処置した８頭のマウス。第二群：500cGy照射＋1.2mg カルボプラチン＋14日間の25KU TPO／日で処置した８頭のマウス。第三群：500cGy照射＋1.2mg カルボプラチン＋14日間の75KU TPO／日で処置した８頭のマウス。 TPO は20mMトリス（pH8.1），0.9％NaClおよび0.25％RSA を含有する緩衝液中に調製した。これらマウスから以下のように採血してCBC を測定した。すなわちゼロ日（ベースラインを確認するため）、４，６，８，10，11日（CBC と網状赤血球計数値）、13日（CBC と網状赤血球計数値）、15，18，20，22，25および27 日（CBC と網状赤血球計数値）に採血して測定し次いで殺した。図２は、TPO で処置した動物の第二群と第三群の動物は貧血の期間が統計的に短かったことを示している（これらの群のマウスの赤血球のレベルは緩衝液だけで処置した動物より有意に速くベースラインまで回復した）。表４は、TPO で処置した動物の第二群と第三群の動物は、13日目までに、緩衝液だけで処置した動物に比べて網状赤血球の計数値が増大したことを示している。これらのデータは、赤血球のレベルが改善されたのは、赤血球の破壊の減少（または損失の減少すなわち出血の低下）ではなくて赤血球の産生が増大したためであることを示している。さらに、対照群または処置群には病的出血がみとめられる証拠は全くなかった。平均値は、網状赤血球である赤血球の百分率から計算した。上記のことから、本発明の具体的な実施態様が本明細書に例示を目的として記載されているけれども、本発明の思想と範囲を逸脱することなく各種の変形を行うことができることが分かるであろう。したがって本発明は後記特許請求の範囲で限定されることを除いて限定されることはない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号０８／４６１，８１９ (32)優先日 1995年６月５日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．TPO なしで培養する場合に比べて赤血球または赤血球前駆体の生成数を増大させるのに十分な量のトロンボポイエチン(TPO)およびエリトロポイエチン(EP O)を含んでなる組成物とともに骨髄細胞または末梢血細胞を培養することからなる、赤血球形成を生体外で刺激する方法であって；TPO が、配列番号：２に示す28位〜172位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜185位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜193位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜198位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜207位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜235位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜266位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜185位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜193位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜198位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜207位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜235位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；および配列番号：２に示す22位〜266位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる方法。２．TPO なしで培養する場合に比べて赤血球または赤血球前駆体の生成数を増大させるのに十分な量のTPO とともに骨髄細胞または末梢血細胞を培養することからなる、赤血球形成を生体外で刺激する方法であって；TPO が、配列番号：２に示す28位〜172位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜185位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜193位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜198位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜207位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜235位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜266位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜185位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜193位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜198位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜207位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜235位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；および配列番号：２に示す22位〜266位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる方法。３．赤血球細胞の増殖または分化を高めるのに十分な量で、医薬として許容される賦形剤と組み合わせて、TPO を含んでなる組成物を、赤血球形成の刺激を必要とする哺乳類に投与することからなる赤血球形成を刺激する方法であって；TP O が配列番号：２に示す28位〜172位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜185位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜193位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜198位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜207位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜235位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜266位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜185位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜193位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜198位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜207位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜235位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；および配列番号：２に示す22位〜266位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる方法。４．赤血球細胞の増殖または分化を高めるのに十分な量で、医薬として許容される賦形剤と組み合わせて、TPO およびEPO を含んでなる組成物を、赤血球形成の刺激を必要とする哺乳類に投与することからなる赤血球形成を刺激する方法であって；TPO が、配列番号：２に示す28位〜172位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜185位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜193位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜198位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜207位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号；２に示す28位〜235位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す28位〜266位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜185位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜193位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜198位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜207位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；配列番号：２に示す22位〜235位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；および配列番号：２に示す22位〜266位のアミノ酸残基のアミノ酸配列；からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる方法。５．TPO なしで培養する場合に比べて赤血球または赤血球前駆体の生成数を増大させるのに十分な量のトロンボポイエチン(TPO)およびエリトロポイエチン(EP O)を含んでなる組成物とともに骨髄細胞または末梢血細胞を培養することからなる、赤血球形成を生体外で刺激する方法であって；TPO の量が100pg／ml〜10ng ／mlでありかつEPO の量が0.5単位／ml〜５単位／mlである方法。６．TPO なしで培養する場合に比べて赤血球または赤血球前駆体の生成数を増大させるのに十分な量のトロンボポイエチン(TPO)を含んでなる組成物とともに骨髄細胞または末梢血細胞を培養することからなる、赤血球形成を生体外で刺激する方法であって；TPO の量が100pg／ml〜10ng／ml である方法。