KR20190026819A - 외인성 rna를 발현하는 치료용 세포 시스템과 관련된 조성물 및 방법 - Google Patents

외인성 rna를 발현하는 치료용 세포 시스템과 관련된 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20190026819A
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아바크 카베지안
조디 마타-핀크
로버트 제이. 딘스
오미드 하란디
어지이트 칸왈카
스네하 하리하란
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루비우스 테라퓨틱스, 아이엔씨.
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Abstract

본 발명은 단백질을 인코딩하는 외인성 RNA를 포함하는 적혈구 세포와 관련된 조성물 및 방법을 포함한다. 외인성 RNA는 조절 요소를 포함하는 이종성 비번역 영역을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 조합하여, 외인성 RNA는 화학적 변형을 포함할 수 있다.

Description

외인성 RNA를 발현하는 치료용 세포 시스템과 관련된 조성물 및 방법
관련 출원
본 출원은 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 2016년 7월 7일에 출원된 미국 출원 일련 번호 62/359416호를 우선권으로 주장한다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이의 전체내용은 참조로서 본원에 포함된다. 2017년 7월 7일에 생성된 상기 ASCII 카피는 R2081-7015WO_SL.txt로 명명되며, 921 바이트 크기이다.
적혈구 세포는, 예를 들어, 독성 대사물을 분해하거나, 생체이물질(xenobiotics)을 비활성화시키기 위한 약물 전달 시스템으로서, 그리고 기타 생체의학 분야에서 사용하기 위해 고려되어 왔다. 개선된 적혈구 세포 기반 약물 전달 시스템이 당 분야에 필요하다.
본 발명은 외인성 RNA(예를 들어, 단백질을 인코딩하는 외인성 RNA)를 포함하는 적혈구 세포와 관련된 조성물 및 방법을 포함한다. 외인성 RNA는 코딩 영역 및 이종성 비번역 영역(UTR), 예를 들어, 조절 요소를 포함하는 UTR을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 조합하여, 외인성 RNA는 화학적 변형을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 조합하여, 외인성 RNA는 조절 RNA, 예를 들어, miRNA일 수 있다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 일부 구현예에서, 외인성 RNA는 대조군에 비해 개선된 파라미터, 예를 들어, 안정성 또는 증가된 번역을 갖는다.
특정 양태에서, 본 발명의 개시는 이종성 비번역 영역(UTR)에 작동 가능하게 연결된 코딩 영역을 포함하는 외인성 mRNA를 포함하는 제핵 적혈구 세포를 제공한다.
특정 양태에서, 본 발명의 개시는 이종성 비번역 영역(UTR)에 작동 가능하게 연결된 코딩 영역을 포함하는 외인성 mRNA를 포함하는 제핵 적혈구 세포를 제공하며, 이종성 UTR은 조절 요소를 포함한다.
특정 양태에서, 본 발명의 개시는 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 표 1의 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 표 2의 하나 이상의 화학적 백본 변형, 표 3의 하나 이상의 화학적으로 변형된 캡, 또는 이들의 임의의 조합)를 포함하는 외인성 mRNA를 포함하는 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포를 제공한다.
본 발명의 개시는 또한 하기 단계를 포함하는 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포를 생성하는 방법을 제공한다:
a) 적혈구 세포, 예를 들어, 유핵 적혈구 세포와 조절 요소를 포함하는 이종성 UTR에 작동 가능하게 연결된 코딩 영역을 포함하는 외인성 mRNA(예를 들어, 분리된 RNA 또는 시험관 내 전사된 RNA)를 접촉시키는 단계, 및
b) 외인성 mRNA의 흡수에 적합한 조건하에서 접촉된 적혈구 세포를 유지시킴으로써 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포를 생성하는 단계.
본 발명의 개시는 또한 하기 단계를 포함하는 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포를 생성하는 방법을 제공한다:
a) 적혈구 세포, 예를 들어, 유핵 적혈구 세포와 표 1의 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 표 2의 하나 이상의 화학적 백본 변형, 표 3의 하나 이상의 화학적으로 변형된 캡, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 외인성 mRNA를 접촉시키는 단계; 및
b) 외인성 mRNA의 흡수에 적합한 조건하에서 접촉된 적혈구 세포를 유지시킴으로써 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포를 생성하는 단계.
본 발명의 개시는 하기 단계를 포함하는 제핵 적혈구 세포에서 외인성 단백질을 생성하는 방법을 추가로 제공한다:
a) 조절 요소를 포함하는 이종성 UTR에 작동 가능하게 연결된 코딩 영역을 포함하는 외인성 mRNA(예를 들어, 분리된 RNA 또는 시험관 내 전사된 RNA)를 포함하는 적혈구 세포, 예를 들어, 유핵 적혈구 세포를 제공하는 단계, 및
b) 외인성 단백질의 생성에 적합한 조건하에서 적혈구 세포를 배양함으로써 외인성 단백질을 생성하는 단계.
본 발명의 개시는 하기 단계를 포함하는 제핵 적혈구 세포에서 외인성 단백질을 생성하는 방법을 추가로 제공한다:
a) 표 1의 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 표 2의 하나 이상의 화학적 백본 변형, 표 3의 하나 이상의 화학적으로 변형된 캡, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 적혈구 세포, 예를 들어, 유핵 적혈구 세포를 제공하는 단계, 및
b) 외인성 단백질의 생성에 적합한 조건하에서 적혈구 세포를 배양함으로써 외인성 단백질을 생성하는 단계.
특정 양태에서, 본 발명의 개시는 조절 요소를 포함하는 이종성 UTR에 작동 가능하게 연결된 코딩 영역을 포함하는 외인성 mRNA(예를 들어, 분리된 RNA 또는 시험관 내 전사된 RNA)를 포함하는 적혈구 세포, 예를 들어, 유핵 적혈구 세포를 대상체에 투여함으로써 대상체에 외인성 단백질을 제공하거나, 대상체에 외인성 단백질을 생성할 수 있는 제핵 적혈구 세포를 제공하거나, 대상체를 치료하는 단계를 포함하는, 대상체에 외인성 단백질을 제공하거나, 대상체에 외인성 단백질을 생성할 수 있는 제핵 적혈구 세포를 제공하거나, 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
특정 양태에서, 본 발명의 개시는 표 1의 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 표 2의 하나 이상의 화학적 백본 변형, 표 3의 하나 이상의 화학적으로 변형된 캡, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 외인성 mRNA를 포함하는 적혈구 세포, 예를 들어, 유핵 적혈구 세포를 대상체에 투여함으로써 대상체에 외인성 단백질을 제공하거나, 대상체에 외인성 단백질을 생성할 수 있는 제핵 적혈구 세포를 제공하거나, 대상체를 치료하는 단계를 포함하는, 대상체에 외인성 단백질을 제공하거나, 대상체에 외인성 단백질을 생성할 수 있는 제핵 적혈구 세포를 제공하거나, 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명의 개시는 하기 단계를 포함하는 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포(또는 상기 세포의 배치(batch))를 평가하는 방법을 제공한다:
a) 조절 요소를 포함하는 이종성 UTR에 작동 가능하게 연결된 코딩 영역을 포함하는 외인성 mRNA를 포함하는 적혈구 세포, 예를 들어, 유핵 적혈구 세포(또는 상기 세포의 배치)를 제공하는 단계, 및
b) 미리 선택된 파라미터에 대해 적혈구 세포, 예를 들어, 유핵 적혈구 세포(또는 상기 세포의 배치)를 평가함으로써 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포(또는 상기 세포의 배치)를 평가하는 단계.
일부 양태에서, 본 발명의 개시는 하기 단계를 포함하는 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포(또는 상기 세포의 배치)를 평가하는 방법을 제공한다:
a) 표 1의 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 표 2의 하나 이상의 화학적 백본 변형, 표 3의 하나 이상의 화학적으로 변형된 캡, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 적혈구 세포, 예를 들어, 유핵 적혈구 세포를 제공하는 단계, 및
b) 미리 선택된 파라미터에 대해 적혈구 세포, 예를 들어, 유핵 적혈구 세포(또는 상기 세포의 배치)를 평가함으로써 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포(또는 상기 세포의 배치)를 평가하는 단계.
특정 양태에서, 본 발명의 개시는 a) 코딩 영역 및 이종성 UTR을 포함하는 외인성 mRNA(예를 들어, 분리된 RNA 또는 시험관 내 전사된 RNA)와 적혈구 세포를 접촉시키는 단계, 및 b) 외인성 단백질의 생성에 적합한 조건하에서 적혈구 세포를 배양함으로써 외인성 단백질을 포함하는 제핵 적혈구 세포를 생성하는 단계를 포함하는, 외인성 단백질을 포함하는 복수의 제핵 적혈구 세포를 생성하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명의 개시는 표 1의 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 표 2의 하나 이상의 화학적 백본 변형, 또는 표 3의 하나 이상의 화학적으로 변형된 캡, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 외인성 mRNA를 포함하는 제핵 적혈구 세포를 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명의 개시는 하기 단계를 포함하는 외인성 단백질을 포함하는 복수의 제핵 적혈구 세포를 생성하는 방법을 제공한다:
a) 적혈구 세포와 외인성 단백질을 인코딩하는 본원에 기재된 외인성 mRNA(예를 들어, 분리된 RNA 또는 시험관 내 전사된 RNA)를 접촉시키는 단계로서, 외인성 mRNA가 표 1의 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 표 2의 하나 이상의 화학적 백본 변형, 또는 표 3의 하나 이상의 화학적으로 변형된 캡, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 단계, 및
b) 외인성 단백질의 생성에 적합한 조건하에서 적혈구 세포를 배양함으로써 외인성 단백질을 포함하는 제핵 적혈구 세포를 생성하는 단계.
특정 양태에서, 본 발명의 개시는 a) 적혈구 세포 막횡단 단백질, 예를 들어, GPA 또는 Kell을 인코딩하는 코딩 영역, 및 b) 이종성 UTR, 예를 들어, 하나 이상의 조절 요소를 포함하는 UTR 또는 헤모글로빈 3' UTR을 포함하는 RNA 분자를 제공한다.
특정 양태에서, 본 발명의 개시는 a) 적혈구 세포 막횡단 단백질, 예를 들어, GPA 또는 Kell을 인코딩하는 코딩 영역, 및 b) 본원에 기재된 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어, 표 1, 2, 또는 3의 뉴클레오티드를 포함하는 RNA 분자를 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명의 개시는 적혈구 세포, 예를 들어, 적혈구 세포 전구체와 본원에 기재된 하나 이상의 핵산을 접촉시키는 단계 및 핵산의 발현을 가능하게 하는 조건하에 세포를 배치하는 단계를 제공하는 본원에 기재된 적혈구 세포를 생성하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명의 개시는 본원에 기재된 복수의 적혈구 세포, 예를 들어, 적어도 108, 109, 1010, 1011, 또는 1012개의 세포를 포함하는 제조물, 예를 들어, 약학적 제조물을 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명의 개시는 성숙 단계 동안, 예를 들어, 성숙 단계 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일 동안 외인성 mRNA와 적혈구 세포를 접촉시키는 방법을 제공한다.
본원의 양태 중 임의의 양태, 예를 들어, 상기 양태는 본원의 구현예 중 하나 이상, 예를 들어, 하기 구현예를 특징으로 할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원의 방법은 하기 단계를 포함한다:
c) 외인성 RNA의 흡수 후 적혈구 세포를 배양하는 단계.
구현예들에서, UTR은 대상 코딩 영역이 아닌 코딩 영역에 자연적으로 작동 가능하게 연결되어 발생하거나, 상기 자연 발생 UTR과 적어도 70, 80, 90, 95, 99, 또는 100%의 상동성을 갖는다. 구현예들에서, UTR은 대상 코딩 영역과 함께 자연 발생하지 않고, 예를 들어, 대상 코딩 영역과 자연적으로 작동 가능하게 연결되어 발생하는 UTR과 적어도 1개의 뉴클레오티드, 예를 들어, 이의 뉴클레오티드의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50%만큼 상이하다. 구현예들에서, UTR은 사실상 존재하지 않는다.
구현예들에서, UTR은 3' UTR을 포함한다. 구현예들에서, UTR은 5' UTR을 포함한다. 구현예들에서, 이종성 UTR은 5' UTR이고, 외인성 mRNA는 이종성 3' UTR을 추가로 포함한다. 구현예들에서, UTR은 인트론에 해당하는 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA는 대안적 스플라이싱을 겪을 수 있으며, 예를 들어, 복수의 스플라이스 아이소형을 인코딩할 수 있다. 구현예들에서, 대안적 스플라이싱은 엑손 스킵핑(exon skipping), 대안적인 5' 공여체 부위 사용, 대안적 3' 수용체 부위 사용, 또는 인트론 보유를 포함한다. 일 구현예에서, UTR은 코딩 영역 내에 인트론을 포함한다. 일 구현예에서, 코딩 영역 내의 인트론은 UTR을 포함한다. 일 구현예에서, UTR은 인트론을 포함하는 5' UTR이다.
구현예들에서, 제핵 적혈구 세포는 제2의 UTR을 추가로 포함한다. 구현예들에서, 제핵 적혈구는 3' UTR 및 5' UTR을 포함한다.
구현예들에서, UTR은 야생형 인간 세포에서 자연 발생한다. 구현예들에서, UTR은 야생형 인간 세포에서 자연 발생하지 않는다.
구현예들에서, 코딩 영역은 야생형 인간 세포에서 자연 발생하고/하거나, 야생형 인간 세포에서 자연 발생하는 단백질을 인코딩한다. 구현예들에서, 코딩 영역은 야생형 인간 세포에서 자연 발생하지 않고/않거나, 야생형 인간 세포에서 자연 발생하지 않는 단백질을 인코딩한다. 구현예들에서, UTR은 야생형 적혈구 세포에서 발현되는 코딩 영역, 예를 들어, 헤모글로빈 코딩 영역과 자연적으로 작동 가능하게 연결되어 발생한다.
구현예들에서, UTR은, 예를 들어, SEQ ID NO:1의 서열 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 갖는 글로빈 UTR, 예를 들어, 헤모글로빈 UTR이다.
구현예들에서, 코딩 영역은 표 4에 나열된 효소, 항체 분자, 보체 조절 단백질, 킬레이트제, 또는 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드는 페닐알라닌 암모니아 분해효소(PAL) 또는 이의 페닐알라닌-대사 단편 또는 변이체를 포함한다.
구현예들에서, 세포는 외인성 mRNA에 의해 인코딩되는 단백질을 추가로 포함한다. 구현예들에서, 세포는 외인성 mRNA를 인코딩하는 DNA를 포함하지 않는다.
일부 구체예에서, 세포는 저장성으로 로딩되지 않았거나, 저장성으로 로딩되지 않는다.
구현예들에서, 외인성 mRNA는 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 화학적 백본 변형, 또는 변형된 캡, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 구현예들에서, 복수의 세포 중 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 85%가 외인성 단백질을 생성한다. 구현예들에서, 세포 집단은 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 세포 생활력을 갖는다.
구현예들에서, 상기 방법은 형질감염, 전기천공, 저장성 로딩, 세포 압력에서의 변화, 세포 변형(예를 들어, CellSqueeze), 또는 외인성 RNA가 세포로 진입하도록 하기 위해 세포막을 파괴하기 위한 다른 방법을 포함한다.
구현예들에서, 외인성 mRNA는 유사한 적혈구 세포에서 화학적 변형이 결여된 상응하는 mRNA의 반감기보다 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 더 크거나, 2배, 5배, 10배, 20배, 또는 100배 더 큰 반감기를 갖는다. 구현예들에서, 외인성 mRNA는 mRNA의 도입 후 유사한 시점에서 측정시 달리 유사한 적혈구 세포에서 화학적 변형이 결여된 동일한 서열의 mRNA의 수준보다 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 더 크거나, 2배, 5배, 10배, 20배, 또는 100배 더 큰 수준으로 적혈구 세포에 존재한다.
구현예들에서, 외인성 단백질은 mRNA의 도입 후 유사한 시점에서 측정시 달리 유사한 적혈구 세포에서 화학적 변형이 결여된 동일한 서열의 mRNA에 의해 생성된 단백질의 수준보다 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 더 크거나, 2배, 5배, 10배, 20배, 또는 100배 더 큰 수준으로 적혈구 세포에 존재한다. 구현예들에서, 시점은 세포가 mRNA와 접촉된 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21, 또는 28일이다. 구현예들에서, 화학적 변형은 슈도우리딘을 포함한다. 구현예들에서, mRNA는 캡을 추가로 포함한다. 구현예들에서, mRNA는 polyA 꼬리를 추가로 포함한다.
구현예들에서, 외인성 단백질은 mRNA의 도입 후 유사한 시점에서 측정시 달리 유사한 적혈구 세포에서 polyA 꼬리가 결여된 동일한 서열의 mRNA에 의해 생성된 단백질의 수준보다 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 더 크거나, 2배, 5배, 10배, 20배, 또는 100배 더 큰 수준으로 적혈구 세포에 존재한다. 구현예들에서, 시점은 세포가 mRNA와 접촉된 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21, 또는 28일이다.
구현예들에서, 본원에 기재된 세포는 이종성 UTR, 예를 들어, 조절 요소를 포함하는 이종성 UTR을 포함하며, 화학적 변형을 추가로 포함하고, 예를 들어, 표 1의 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 표 2의 하나 이상의 화학적 백본 변형, 표 3의 하나 이상의 화학적으로 변형된 캡, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 접촉 단계(예를 들어, 적혈구 세포와 mRNA를 접촉시킴)는 세포의 제핵 전에 발생하고, 다른 구현예에서, 접촉 단계는 세포의 제핵 후에 발생한다. 구현예들에서, 접촉 단계는 복수의 제핵 세포 및 복수의 유핵 세포를 포함하는 세포의 집단에 대해 수행된다. 세포의 집단은, 예를 들어, 주로 유핵 세포 집단이거나 주로 제핵 세포 집단일 수 있다. 구현예들에서, 상기 방법은 제핵에 적합한 조건하에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본원의 방법 중 임의의 방법의 일부 구현예에서, 제공 단계는 적혈구 세포, 예를 들어, 유핵 적혈구 세포와 조절 요소를 포함하는 이종성 UTR에 작동 가능하게 연결된 코딩 영역을 포함하는 외인성 mRNA(예를 들어, 분리된 RNA 또는 시험관 내 전사된 RNA)를 접촉시키는 것을 포함한다. 구현예들에서, 제공 단계는 또 다른 존재물로부터의 적혈구 세포를 수용하는 것을 포함한다.
구현예들에서, 본원에 기재된 파라미터는 외인성 단백질을 발현하는 능력; 외인성 단백질의 구조 또는 기능; 내인성 mRNA를 포함하는 세포의 비율; 내인성 단백질을 포함하는 세포의 비율; 세포에서의 외인성 mRNA의 수준; 세포에서의 외인성 단백질의 수준; 세포 증식률; 또는 세포 분화 상태로부터 선택된다. 구현예들에서, 상기 방법은 미리 선택된 파라미터에 대한 값을 참조와 비교하는 단계를 포함한다. 구현예들에서, 상기 방법은 파라미터에 대한 값에 대한 반응, 또는 상기 값과 참조의 비교, 세포 또는 세포 배치의 분류, 승인, 또는 거부를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 세포는 세포의 집단에 배치된다. 구현예들에서, 세포의 집단은 본원에 기재된 바와 같은 복수의 세포를 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 다른 세포, 예를 들어, 외인성 mRNA가 결여된 야생형 적혈구 세포, 유핵 적혈구 세포, 또는 비-적혈구 세포를 추가로 포함한다. 구현예들에서, 세포의 집단은 적어도 제1 외인성 RNA를 포함하는 제1 세포 및 제2 외인성 RNA를 포함하는 제2 세포를 포함한다. 구현예들에서, 세포의 집단은 적어도 제1 외인성 RNA 및 제2 외인성 RNA를 포함하는 제1 세포를 포함한다.
구현예들에서, RNA는 시험관 내 전사 또는 고상 화학 합성에 의해 생성된다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 성숙 단계 동안 적혈구 세포와 외인성 mRNA를 접촉시키는 것을 포함하는 구현예에서, 접촉은 전기천공을 포함한다. 일부 구현예에서, 접촉은 성숙의 6 내지 8일, 5 내지 9일, 4 내지 10일, 3 내지 11일, 2 내지 12일, 또는 1 내지 13일 사이에 수행된다. 일부 구현예에서, 접촉은 성숙의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일에 또는 그 후에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 접촉 후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20일 동안 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 접촉 후, 예를 들어, 세포와 mRNA를 접촉시킨 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일에 트랜스제닉 mRNA의 발현을 시험하는 단계, 예를 들어, 트랜스제닉 mRNA에 의해 인코딩된 단백질의 수준을 검출하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 개시는 하기 단계를 포함하는 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하는 적혈구 세포를 제조하는 방법을 제공한다:
a) 성숙 단계의 적혈구 세포를 제공하는 단계, 및
b) 적혈구 세포에 의한 mRNA의 흡수를 가능하게 하는 조건하에서 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA와 적혈구 세포를 접촉(예를 들어, 전기천공)시킴으로써 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하는 적혈구 세포를 제조하는 단계.
구현예들에서, 상기 방법은 성숙 단계의 적혈구 세포의 집단을 제공하는 단계 및 상기 집단과 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 접촉시키는 단계를 포함한다. 구현예들에서, 집단의 복수의 적혈구 세포는 각각 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 흡수한다. 구현예들에서, 세포는 외인성 단백질을 발현한다. 구현예들에서, 세포는 외인성 단백질을 포함한다. 구현예들에서, 집단 내의 복수의 세포는 외인성 단백질을 발현한다. 구현예들에서, 성숙 단계의 세포의 집단은 3 내지 7일, 예를 들어, 4 내지 5일 또는 4 내지 6일 동안 성숙 배지에서 확장된 세포의 집단이다. 구현예들에서, 성숙 단계의 세포의 집단은, 예를 들어, 특정 백분율의 제핵, 번역 활성, 또는 세포 표면 마커 발현을 갖는 본원에 기재된 집단이다.
구현예들에서, 집단 내의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%는, 예를 들어, mRNA와의 접촉 5일 후에 외인성 단백질을 포함한다. 구현예들에서, 집단 내의 세포는, 예를 들어, mRNA와의 접촉 5일 후에 적어도 1,000, 2,000, 5,000, 10,000, 20,000, 50,000, 또는 100,000 카피의 외인성 단백질을 포함한다. 구현예들에서, 세포는 mRNA와의 접촉 후 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15일 동안 적어도 1,000, 2,000, 5,000, 10,000, 20,000, 50,000, 또는 100,000 카피의 외인성 단백질을 포함한다. 구현예들에서, 세포는 mRNA와의 접촉 후 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15일 동안 적어도 1,000 카피의 외인성 단백질을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 개시는 하기 단계를 포함하는 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하는 적혈구 세포를 제조하는 방법을 제공한다:
a) 성숙 단계의 적혈구 세포를 제공하는 단계, 및
b) 적혈구 세포에 의한 mRNA의 흡수를 가능하게 하는 조건하에서 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA와 적혈구 세포를 접촉시킴으로써 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하는 적혈구 세포를 제조하는 단계.
구현예들에서, 상기 방법은 성숙 단계의 적혈구 세포의 집단을 제공하는 단계 및 적혈구 세포 집단의 복수의 세포와 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 접촉시키는 단계를 포함한다. 구현예들에서, 성숙 단계의 적혈구 세포의 집단은 3 내지 7일, 예를 들어, 4 내지 5일 또는 4 내지 6일 동안 성숙 배지에서 확장된 세포의 집단이다. 구현예들에서, 적혈구 세포의 집단은 하기 특성 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17개 이상)을 포함하는 적혈구 세포의 집단이다:
i.a) 집단 내의 세포의 2 내지 40%, 3 내지 33%, 5 내지 30%, 10 내지 25%, 또는 15 내지 20%가 제핵되거나;
i.b) 집단 내의 세포의 0%, 0.1%, 0.2%, 또는 0.5% 초과이나, 2%, 3%, 4%, 또는 5% 미만이 제핵되거나;
i.c) 집단 내의 세포의 0%, 0.1%, 0.2%, 또는 0.5% 초과이나, 6%, 10%, 15%, 20%, 또는 25% 미만이 제핵되거나;
i.d) 집단 내의 세포의 0%, 0.1%, 0.2%, 또는 0.5% 초과이나, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 미만이 제핵되거나;
i.e) 집단 내의 세포의 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 15%, 또는 20% 이하가 제핵되거나;
i.f) 집단 내의 세포의 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 이하가 제핵되거나;
i.g) 세포의 집단이 최대 제핵의 6 내지 70%, 10 내지 60%, 20 내지 50%, 또는 30 내지 40%에 도달하거나;
i.h) 세포의 집단이 최대 제핵의 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 15%, 또는 20% 이하에 도달하거나;
i.i) 세포의 집단이 최대 제핵의 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 또는 60% 이하에 도달하거나;
ii.a) 세포의 집단이 세포 분열에서 플래토(plateau)로부터 3, 2, 또는 1회 미만으로 집단 배가하거나;
ii.b) 세포의 집단이 3, 2, 또는 1회 미만으로 집단 배가할 수 있거나;
ii.c) 집단이 집단 내의 세포의 적어도 70%의 제핵 수준에 도달하기 전에 집단이 1.5, 2, 또는 3배 이하만큼 증가하거나;
iii.a) 집단 내의 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)이거나;
iii.b) 집단 내의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 또는 79%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)이거나;
iii.c) 집단 내의 세포의 30 내지 90%, 40 내지 90%, 50 내지 90%, 60 내지 90%, 또는 70 내지 90%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)이거나;
iii.d) 집단 내의 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)의 형태를 나타내거나;
iii.e) 집단 내의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 또는 79%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)의 형태를 나타내거나;
iii.f) 집단 내의 세포의 30 내지 90%, 40 내지 90%, 50 내지 90%, 60 내지 90%, 또는 70 내지 90%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)의 형태를 나타낸다.
구현예들에서, 복수의 세포와 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 접촉시키기 전 또는 후에, 복수의 세포는 적혈구 세포의 집단으로부터 분리되고, 예를 들어, 복수의 세포는 제핵 상태를 기초로 하여 집단으로부터 분리된다(예를 들어, 복수의 세포는 유핵 세포이고, 집단의 나머지는 제핵 세포이다).
구현예들에서, 복수의 세포와 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 접촉시키기 전 또는 후에, 상기 방법은, 예를 들어, 집단과 제핵의 억제제(예를 들어, 히스톤 데아세틸라제(HDAC)의 억제제, 미토겐-활성화 단백질 키나제(MAPK)의 억제제, 사이클린-의존성 키나제(CDK)의 억제제, 또는 프로테아솜 억제제)를 인큐베이션함으로써, 예를 들어, 집단의 성장, 발달, 헤모글로빈 합성, 또는 제핵 과정을 정지시킴으로써 적혈구 세포의 집단의 분화 단계를 동기화시키는 단계를 추가로 포함한다. 구현예들에서, 정지는 집단 내의 세포의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10% 초과의 제핵 전에 발생한다.
일부 양태에서, 본 발명의 개시는 하기 단계를 포함하는 외인성 단백질을 발현하는 망상적혈구의 집단을 제조하는 방법을 제공한다:
(a) 적혈구 전구 세포(예를 들어, CD34+ 세포)의 집단을 제공하는 단계;
(b) 분화하는 적혈구 세포의 집단을 제공하는 분화 조건하에서 적혈구 전구 세포의 집단을 배양하는 단계;
(c) 분화하는 적혈구 세포에 의한 mRNA의 흡수를 가능하게 하는 조건하에서 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA와 분화하는 적혈구 세포를 접촉시키는 단계로서, 분화하는 적혈구 세포의 집단이 0.1 내지 25%가 제핵(예를 들어, 0.1 내지 20%가 제핵되거나, 0.1 내지 15%가 제핵되거나, 0.1 내지 12%가 제핵되거나, 0.1 내지 10%가 제핵됨)되는 경우에 접촉이 수행되는, 단계; 및
(d) 분화하는 적혈구 세포를 추가로 배양하여 망상적혈구 집단을 제공함으로써, 외인성 단백질을 발현하는 망상적혈구 집단을 제조하는 단계.
구현예들에서, 추가 배양은 3, 2, 또는 1회 미만의 집단 배가를 포함한다. 구현예들에서, 분화하는 적혈구 세포의 적어도 50%(적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 또는 95%)가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)의 형태를 나타나는 경우에 접촉이 수행된다.
일부 양태에서, 본 발명의 개시는 (a) 적혈구 전구 세포의 집단을 제공하는 단계, (b) 분화하는 적혈구 세포의 집단을 제공하는 분화 조건하에서 적혈구 전구 세포의 집단을 배양하는 단계, (c) 분화하는 적혈구 세포와 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 접촉시키는 단계로서, 분화하는 적혈구 세포의 집단이 0.1 내지 25%가 제핵(예를 들어, 0.1 내지 20%가 제핵되거나, 0.1 내지 15%가 제핵되거나, 0.1 내지 12%가 제핵되거나, 0.1 내지 10%가 제핵됨)되는 경우에 접촉이 수행되는, 단계를 포함하는, 외인성 단백질을 발현하는 망상적혈구의 집단을 제조하는 방법을 제공한다.
구현예들에서, 분화하는 적혈구 세포의 집단이 세포 분열에서 플래토 전에 3, 2, 또는 1회 미만의 집단 배가를 갖는 경우에 접촉이 수행된다. 구현예들에서, 분화하는 적혈구 세포의 적어도 50%(적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 또는 95%)가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)의 형태를 나타나는 경우에 접촉이 수행된다.
일부 양태에서, 본 발명의 개시는 하기 단계를 포함하는 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하는 적혈구 세포를 제조하는 방법을 제공한다:
mRNA의 분해를 억제하는 조건, 예를 들어, 반응 혼합물 중에 리보뉴클레아제 억제제의 포함에 의한 조건하에서 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA 및 적혈구 세포를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계, 및
적혈구 세포에 의한 mRNA의 흡수를 가능하게 하는 조건하에서 반응 혼합물을 유지시킴으로써 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하는 적혈구 세포를 제조하는 단계.
구현예들에서, 상기 방법은 적혈구 세포의 집단을 제공하는 단계 및 상기 집단과 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 접촉시키는 단계를 포함한다. 구현예들에서, 집단의 복수의 적혈구 세포는 각각 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 흡수한다. 구현예들에서, 세포 또는 복수의 세포는 외인성 단백질을 발현한다. 구현예들에서, 세포 또는 복수의 세포는 외인성 단백질을 포함한다. 구현예들에서, 상기 방법은 세포 또는 세포의 집단을 전기천공하는 단계를 추가로 포함한다. 구현예들에서, 상기 방법은 적혈구 세포의 집단과 리보뉴클레아제 억제제를 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 구현예들에서, 상기 방법은 세포와 mRNA를 접촉시키기 전, 접촉시키는 동안, 또는 접촉시킨 후에 세포 집단과 리보뉴클레아제 억제제를 접촉시키는 단계를 포함한다. 구현예들에서, 상기 방법은 성숙 단계의 4, 5, 또는 6일에서 세포와 리보뉴클레아제 억제제를 접촉시키는 단계를 포함한다. 구현예들에서, 세포는 성숙 단계의 세포이다. 구현예들에서, 성숙 단계의 세포의 집단은, 예를 들어, 특정 백분율의 제핵, 번역 활성, 또는 세포 표면 마커 발현을 갖는 본원에 기재된 집단이다.
구현예들에서, mRNA는 시험관 내 전사된 mRNA이다.
구현예들에서, 집단의 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 95%(및 선택적으로 95% 이하)는 세포가 mRNA와 접촉된 지 5일 후에 생존 가능(예를 들어, Annexin V 염색에 의해 결정됨)하다. 구현예들에서, 집단의 세포의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%는 세포가 mRNA와 접촉된 지 5일 후에 제핵된다. 구현예들에서, 세포가 mRNA와 접촉된 지 5일 후에 제핵되는 세포의 비율은 리보뉴클레아제 억제제로 처리되지 않은 달리 유사한 세포 집단에서 제핵되는 세포의 비율의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%이다. 구현예들에서, 세포의 집단은 세포가 mRNA와 접촉시에 적어도 1×106, 2×106, 5×106, 1×107, 2×107, 5×107, 또는 1×108개의 세포를 포함한다. 구현예들에서, 세포의 집단은 세포가 mRNA와 접촉된 후 5일 이내에 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%만큼 확장된다. 구현예들에서, 집단의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%는, 예를 들어, 세포가 mRNA와 접촉된 지 5일 후에 외인성 단백질을 발현한다. 구현예들에서, 집단의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%는, 예를 들어, 세포가 mRNA와 접촉된 지 5일 후에 외인성 단백질의 적어도 1,000, 2,000, 5,000, 10,000, 20,000, 50,000, 또는 100,000개의 카피를 포함한다. 구현예들에서, 집단의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%는, 예를 들어, 세포가 mRNA와 접촉된 지 5일 후에 외인성 단백질의 적어도 1,000개의 카피를 포함한다. 구현예들에서, 집단의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%는, 예를 들어, 세포가 mRNA와 접촉된 지 5일 후에 외인성 단백질의 적어도 10,000개의 카피를 포함한다. 구현예들에서, 세포의 집단은 리보뉴클레아제 억제제로 처리되지 않은 달리 유사한 세포 집단보다 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이상, 또는 적어도 2배, 3배, 4배, 또는 5배 더 많은 외인성 단백질을 포함한다.
본 발명의 개시는 또한, 일부 양태에서, i) 적혈구 세포, ii) 외인성 단백질을 포함하는 mRNA 및 iii) 리보뉴클레아제 억제제를 포함하는 반응 혼합물을 제공한다.
구현예들에서, mRNA는 적혈구 세포 내에 있다. 구현예들에서, 반응 혼합물은 복수의 적혈구 세포를 포함한다.
본 발명의 개시는 또한, 일부 양태에서, 하기 단계를 포함하는 리보뉴클레아제 억제제에 대한 외인성 단백질을 포함하는 제핵 적혈구 세포를 포함하는 반응 혼합물을 검정하는 방법을 제공한다:
외인성 단백질을 포함하는 제핵 적혈구 세포를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계, 및
예를 들어, 반응 혼합물의 분취액에서, 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 질량분광법에 의해 리보뉴클레아제 억제제의 존재 또는 수준을 검정하는 단계.
구현예들에서, 상기 방법은 리보뉴클레아제 억제제의 수준을 참조 값과 비교하는 단계를 추가로 포함한다.
구현예들에서, 상기 방법은 비교에 반응하여 하기 단계 중 하나 이상을 수행하는 것을 추가로 포함한다:
집단을, 예를 들어, 필요조건을 충족하거나 필요조건을 충족하지 않는 것으로 분류하는 단계로서, 예를 들어, 리보뉴클레아제 억제제의 수준이 참조 값 아래인 경우에 필요조건이 충족되는 단계,
예를 들어, 리보뉴클레아제 억제제의 수준이 참조 값보다 위인 경우에 집단이 이후 정제 단계에 적합한 경우와 같이 집단을 이후의 처리 단계에 적합하거나 적합하지 않은 것으로 분류하는 단계,
집단을 치료제로 사용하기에 적합하거나 적합하지 않은 것으로 분류하는 단계, 또는
예를 들어, 리보뉴클레아제 억제제의 수준이 참조 값 아래인 경우에 집단 또는 이의 분취액을 치료제로 사용하기 위해 제형화하거나 패키징하는 단계.
구현예들에서, 리보뉴클레아제 억제제는 RNAsin Plus(예를 들어, Promega 제품), Protector RNAse Inhibitor(예를 들어, Sigma 제품), 또는 Ribonuclease Inhibitor Huma(예를 들어, Sigma 제품)이다.
본 발명의 개시는 또한, 일부 양태에서, 하기 단계를 포함하는 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하는 적혈구 세포를 제조하는 방법을 제공한다:
단백질 분해를 억제하는 조건, 예를 들어, 반응 혼합물 중에 프로테아제 억제제, 예를 들어, 프로테아솜 억제제의 포함에 의한 조건하에서 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA 및 적혈구 세포를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계, 및
적혈구 세포에 의한 mRNA의 흡수를 가능하게 하는 조건하에서 반응 혼합물을 유지시킴으로써 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하는 적혈구 세포를 제조하는 단계.
구현예들에서, 상기 방법은 적혈구 세포의 집단을 제공하는 단계 및 상기 집단과 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 접촉시키는 단계를 포함한다. 구현예들에서, 집단의 복수의 적혈구 세포는 각각 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 흡수한다. 구현예들에서, 세포 또는 복수의 세포는 외인성 단백질을 발현한다. 구현예들에서, 세포 또는 복수의 세포는 외인성 단백질을 포함한다. 구현예들에서, 상기 방법은 세포 또는 세포의 집단을 전기천공하는 단계를 추가로 포함한다. 구현예들에서, 상기 방법은 적혈구 세포의 집단과 프로테아솜 억제제를 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 구현예들에서, 상기 방법은 세포와 mRNA를 접촉시키기 전, 접촉시키는 동안, 또는 접촉시킨 후, 예를 들어, 세포와 mRNA를 접촉시키기 0.5 내지 2일 전 또는 0.5 내지 2일 후에 세포 집단과 프로테아솜 억제제를 접촉시키는 단계를 포함한다. 구현예들에서, 상기 방법은 세포와 mRNA를 접촉시키기 0.5 내지 2일 전에 세포 집단과 프로테아솜 억제제를 접촉시키는 단계를 포함한다. 구현예들에서, 상기 방법은 전기천공 전에 프로테아솜 억제제를 제거(예를 들어, 세포 세척에 의함)하는 단계를 포함한다.
구현예들에서, 상기 방법은 성숙 3 내지 7일, 예를 들어, 성숙 단계 4, 5, 또는 6일에서 세포와 프로테아솜 억제제를 접촉시키는 단계를 포함한다. 구현예들에서, 세포는 성숙 단계의 세포이다. 구현예들에서, 성숙 단계의 세포의 집단은, 예를 들어, 특정 백분율의 제핵, 번역 활성, 또는 세포 표면 마커 발현을 갖는 본원에 기재된 집단이다.
구현예들에서, mRNA는 시험관 내 전사된 mRNA이다. 구현예들에서, 집단의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%는 세포가 mRNA와 접촉된 지 5일 후에 생존 가능하다. 구현예들에서, 집단의 세포의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%는 세포가 mRNA와 접촉된 지 5일 후에 제핵된다. 구현예들에서, 세포가 mRNA와 접촉된 지 5일 후에 제핵되는 세포의 비율은 프로테아솜 억제제로 처리되지 않은 달리 유사한 세포 집단에서 제핵되는 세포의 비율의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%이다. 구현예들에서, 세포의 집단은 세포가 mRNA와 접촉시에 적어도 1×106, 2×106, 5×106, 1×107, 2×107, 5×107, 또는 1×108개의 세포를 포함한다.
구현예들에서, 세포의 집단은 세포가 mRNA와 접촉된 후 5일 이내에 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%만큼 확장된다. 구현예들에서, 집단의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%는, 예를 들어, 세포가 mRNA와 접촉된 지 5일 후에 외인성 단백질을 발현한다. 구현예들에서, 집단의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%는, 예를 들어, 세포가 mRNA와 접촉된 지 5일 후에 외인성 단백질의 적어도 1,000, 2,000, 5,000, 10,000, 20,000, 50,000, 또는 100,000개의 카피를 포함한다. 구현예들에서, 집단의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%는, 예를 들어, 세포가 mRNA와 접촉된 지 5일 후에 외인성 단백질의 적어도 1,000개의 카피를 포함한다. 구현예들에서, 집단의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%는, 예를 들어, 세포가 mRNA와 접촉된 지 5일 후에 외인성 단백질의 적어도 10,000개의 카피를 포함한다. 구현예들에서, 세포의 집단은 프로테아솜 억제제로 처리되지 않은 달리 유사한 세포 집단보다 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이상, 또는 적어도 2배, 3배, 4배, 또는 5배 더 많은 외인성 단백질을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 개시는 i) 적혈구 세포, ii) 외인성 단백질을 포함하는 mRNA 및 iii) 프로테아솜 억제제를 포함하는 반응 혼합물을 제공한다.
구현예들에서, mRNA는 적혈구 세포 내에 있다. 구현예들에서, 반응 혼합물은 복수의 적혈구 세포를 포함한다.
본 발명의 개시는 또한, 일부 양태에서, 하기 단계를 포함하는 프로테아솜 억제제에 대한 외인성 단백질을 포함하는 제핵 적혈구 세포를 포함하는 반응 혼합물을 검정하는 방법을 제공한다:
외인성 단백질을 포함하는 제핵 적혈구 세포를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계, 및
예를 들어, 반응 혼합물의 분취액에서, 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 질량분광법에 의해 프로테아솜 억제제의 존재 또는 수준을 검정하는 단계.
구현예들에서, 상기 방법은 또한 프로테아솜 억제제의 수준을 참조 값과 비교하는 단계를 추가로 포함한다.
구현예들에서, 상기 방법은 비교에 반응하여 하기 단계 중 하나 이상을 수행하는 것을 추가로 포함한다:
집단을, 예를 들어, 필요조건을 충족하거나 필요조건을 충족하지 않는 것으로 분류하는 단계로서, 예를 들어, 프로테아솜 억제제의 수준이 참조 값 아래인 경우에 필요조건이 충족되는 단계,
예를 들어, 프로테아솜 억제제의 수준이 참조 값보다 위인 경우에 집단이 이후 정제 단계에 적합한 경우와 같이 집단을 이후의 처리 단계에 적합하거나 적합하지 않은 것으로 분류하는 단계,
집단을 치료제로 사용하기에 적합하거나 적합하지 않은 것으로 분류하는 단계, 또는
예를 들어, 프로테아솜 억제제의 수준이 참조 값 아래인 경우에 집단 또는 이의 분취액을 치료제로 사용하기 위해 제형화하거나 패키징하는 단계.
구현예들에서, 프로테아솜 억제제는 20S 프로테아솜 억제제, 예를 들어, MG-132 또는 카르필조밉(carfilzomib), 또는 26S 프로테아솜 억제제, 예를 들어, 보르테조밉(bortezomib)이다.
구현예들에서, 제1 외인성 단백질 및 제2 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하는 적혈구 세포를 제조하는 방법은,
a) 적혈구 세포, 예를 들어, 성숙 단계의 적혈구 세포를 제공하는 단계, 및
b) 적혈구 세포에 의한 제1 mRNA 및 제2 mRNA의 흡수를 가능하게 하는 조건하에서 제1 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA 및 제2 외인성 단백질을 인코딩하는 제2 mRNA와 적혈구 세포를 접촉시킴으로써 제1 mRNA 및 제2 mRNA를 포함하는 적혈구 세포를 제조하는 단계를 포함한다.
구현예들에서, 적혈구 세포는, 예를 들어, mRNA와의 접촉 5일 후에 제1 외인성 단백질 및 제2 외인성 단백질의 적어도 1,000, 2,000, 5,000, 10,000, 20,000, 50,000, 또는 100,000개의 카피를 포함한다.
본 발명의 개시는 또한, 일부 양태에서, 제1 외인성 단백질 및 제2 외인성 단백질을 발현하는 적혈구 세포의 집단을 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
a) 적혈구 세포, 예를 들어, 성숙 단계의 적혈구 세포의 집단을 제공하는 단계, 및
b) 제1 단백질을 인코딩하는 제1 mRNA 및 제2 단백질을 인코딩하는 제2 mRNA와 적혈구 세포의 집단을 접촉시킴으로써 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하는 적혈구 세포를 제조하는 단계를 포함하고,
집단 내의 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%는 제1 mRNA 및 제2 mRNA 둘 모두를 포함한다.
구현예들에서, 적혈구 세포의 집단은, 예를 들어, mRNA와의 접촉 5일 후에 세포 당 제1 외인성 단백질 및 제2 외인성 단백질의 평균 적어도 1,000, 2,000, 5,000, 10,000, 20,000, 50,000, 또는 100,000개의 카피를 포함한다.
구현예들에서, 접촉 단계는 전기천공을 수행하는 것을 포함한다.
구현예들에서, 세포의 집단은, 세포가 제1 및 제2 mRNA와 접촉한 후 적어도 5일 동안 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%에서 제1 외인성 단백질 및 제2 외인성 단백질을 포함한다. 구현예들에서, 세포의 집단은, 세포가 제1 및 제2 mRNA와 접촉한 후 적어도 2, 4, 6, 8, 10, 12, 또는 14일 동안 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%에서 제1 외인성 단백질 및 제2 외인성 단백질을 포함한다. 구현예들에서, 세포의 집단은, 세포가 제1 및 제2 mRNA와 접촉한 후 적어도 2, 4, 6, 8, 10, 12, 또는 14일 동안 세포의 적어도 80%에서 제1 외인성 단백질 및 제2 외인성 단백질을 포함한다.
구현예들에서, 제1 외인성 단백질은 제2 외인성 단백질의 아미노산 길이보다 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 이하로 더 긴 아미노산 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 외인성 단백질의 평균 수준은 적혈구 세포 집단에서 제1 외인성 단백질의 수준의 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 이하이다.
구현예들에서, 제1 외인성 단백질은 제2 외인성 단백질의 아미노산 길이보다 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 2배, 또는 3배 더 긴 아미노산 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 외인성 단백질의 평균 수준은 적혈구 세포 집단에서 제1 외인성 단백질의 수준보다 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 2배, 또는 3배 더 높다.
본 발명의 개시는 또한, 특정 양태에서, 집단 내의 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 제1 외인성 단백질 및 제2 외인성 단백질을 발현하는 적혈구 세포의 집단을 제공하며, 상기 집단은 세포와 제1 또는 제2 외인성 단백질을 인코딩하는 DNA를 접촉시킴으로써 제조되지 않았다.
본 발명의 개시는 또한, 특정 양태에서, 집단과 소정량의 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 접촉시킴으로써 소정량의 외인성 단백질을 포함하는 적혈구 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 세포 당 소정의 수의 외인성 단백질의 카피를 포함하는 복수의 적혈구 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 구현예들에서, 상기 방법은 복수의 적혈구 세포(예를 들어, 제핵 적혈구 세포) 중 하나 이상을 평가하여 외인성 단백질의 양을 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 개시는 하기 단계를 포함하는 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포의 샘플에서 외인성 단백질의 양을 평가하는 방법을 제공한다:
집단과 소정량의 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 접촉시킴으로써 제조된 세포 당 소정의 수의 외인성 단백질의 카피를 포함하는 복수의 적혈구 세포를 제공하는 단계, 및
복수의 적혈구 세포에서 외인성 단백질의 양을 결정하는 단계.
일부 구현예에서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
세포 집단과 집단 내의 5E6 세포 당 0.6±50%, ±20% 또는 ±10% ㎍의 mRNA를 접촉시켜 세포 당 1,000,000±50%, ±20% 또는 ±10% 카피의 외인성 단백질을 발현하는 세포의 집단을 발생시키는 단계,
세포 집단과 집단 내의 5E6 세포 당 0.4±50%, ±20% 또는 ±10% ㎍의 mRNA를 접촉시켜 세포 당 870,000±50%, ±20% 카피의 외인성 단백질을 발현하는 세포의 집단을 발생시키는 단계,
세포 집단과 집단 내의 5E6 세포 당 0.2±50%, ±20% 또는 ±10% ㎍의 mRNA를 접촉시켜 세포 당 610,000±50%, ±20%, 또는 ±10% 카피의 외인성 단백질을 발현하는 세포의 집단을 발생시키는 단계,
세포 집단과 집단 내의 5E6 세포 당 0.1±50%, ±20% 또는 ±10% ㎍의 mRNA를 접촉시켜 세포 당 270,000±50%, ±20%, 또는 ±10% 카피의 외인성 단백질을 발현하는 세포의 집단을 발생시키는 단계,
세포 집단과 집단 내의 5E6 세포 당 0.05±50%, ±20% 또는 ±10% ㎍의 mRNA를 접촉시켜 세포 당 100,000±50%, ±20%, 또는 ±10% 카피의 외인성 단백질을 발현하는 세포의 집단을 발생시키는 단계, 또는
세포 집단과 집단 내의 5E6 세포 당 0.025±50%, ±20% 또는 ±10% ㎍의 mRNA를 접촉시켜 세포 당 43,000±50%, ±20%, 또는 ±10% 카피의 외인성 단백질을 발현하는 세포의 집단을 발생시키는 단계.
구현예들에서, 집단의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%는 세포가 외인성 단백질과 접촉된 지 1일 후에 외인성 단백질을 발현한다.
본원의 양태 중 임의의 양태의 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 적혈구 세포의 집단(예를 들어, mRNA와 접촉되는 세포의 집단)은 하기 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 이상)에 해당하는 적혈구 세포의 집단이다:
집단 내의 세포의 2 내지 40%, 3 내지 33%, 5 내지 30%, 10 내지 25%, 또는 15 내지 20%가 제핵되거나;
집단 내의 세포의 3%, 5%, 10%, 20%, 또는 30% 미만이 제핵되거나;
집단 내의 세포의 0% 초과(예를 들어, 0.1%, 0.2%, 0,5%) 및 50% 이하(40%, 30%, 20%, 18%, 15%, 12%, 10%)가 제핵되거나;
세포의 집단이 최대 제핵의 6 내지 70%, 10 내지 60%, 20 내지 50%, 또는 30 내지 40%에 도달하거나;
세포의 집단이 최대 제핵의 6%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 미만에 도달하거나;
세포의 집단이 BONCAT 검정, 예를 들어, 실시예 10의 번역 검정에 의해 측정시 적어도 600,000, 800,000, 1,000,000, 1,200,000, 1,400,000, 1,600,000, 1,800,000, 2,000,000, 2,200,000, 또는 2,400,000의 번역 활성을 갖거나;
세포의 집단이 BONCAT 검정, 예를 들어, 실시예 10의 번역 검정에 의해 측정시 600,000 내지 2,400,000, 800,000 내지 2,200,000, 1,000,000 내지 2,000,000, 1,200,000 내지 1,800,000, 또는 1,400,000 내지 1,600,000의 번역 활성을 갖거나;
성숙 단계의 세포의 집단이 최대 번역 활성의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%를 갖고, 최대 번역 활성이 유사한 수의 성숙 단계의 세포의 전구체 또는 전구 세포, 예를 들어, CD34+ 세포의 최대 번역 활성을 나타내거나;
집단 내의 세포의 0.1 내지 25%가 제핵되고, 세포의 집단이 세포 분열에서 플래토로부터 1, 2, 또는 3회 미만으로 집단 배가하거나;
세포의 집단이 세포 분열에서 플래토로부터 3, 2, 또는 1회 미만으로 집단 배가하거나;
세포의 집단이 3, 2, 또는 1회 미만으로 집단 배가할 수 있거나;
집단이 집단 내의 세포의 적어도 70%의 제핵 수준에 도달하기 전에 집단이 1.5, 2, 또는 3배 이하만큼 증가하거나;
집단 내의 세포의 84 내지 99%, 85 내지 95%, 또는 약 90%가 GPA-양성(예를 들어, 유세포분석 검정, 예를 들어, 실시예 10의 유세포분석 검정에 의해 측정됨)이거나;
집단 내의 세포의 84%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%가 GPA-양성(예를 들어, 유세포분석 검정, 예를 들어, 실시예 10의 유세포분석 검정에 의해 측정됨)이거나;
집단 내의 세포의 54 내지 99%, 55 내지 98%, 60 내지 95%, 65 내지 90%, 70 내지 85%, 또는 75 내지 80%가 band3-양성(예를 들어, 유세포분석 검정, 예를 들어, 실시예 10의 유세포분석 검정에 의해 측정됨)이거나;
집단 내의 세포의 적어도 54%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%가 band3-양성(예를 들어, 유세포분석 검정, 예를 들어, 실시예 10의 유세포분석 검정에 의해 측정됨)이거나;
집단 내의 세포의 96 내지 100%, 97 내지 99%, 또는 약 98%가 alpha4 인테그린-양성(예를 들어, 유세포분석 검정, 예를 들어, 실시예 10의 유세포분석 검정에 의해 측정됨)이거나;
집단 내의 세포의 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 alpha4 인테그린-양성(예를 들어, 유세포분석 검정, 예를 들어, 실시예 10의 유세포분석 검정에 의해 측정됨)이거나;
집단 내의 세포의 적어도 50%(예를 들어, 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%)가 alpha4 인테그린-양성 및 band3-양성이거나;
집단 내의 세포의 적어도 50%가 band3-양성이고, 적어도 90% 내지 95%가 alpha4 인테그린-양성이다.
본 발명의 개시는 상기 양태 및/또는 구현예 중 어느 하나 이상의 모든 조합뿐만 아니라 상세한 설명 및 실시예에 기재된 구현예 중 어느 하나 이상과의 조합을 고려한다.
본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 이용될 수 있으나, 적합한 방법 및 물질이 하기에 기재된다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌(예를 들어, 서열 데이터베이스 참조 번호)은 이들의 전체내용이 참조로서 포함된다. 예를 들어, 본원의 임의의 표에서 본원에 참조된 모든 GenBank, Unigene, 및 Entrez 서열은 참조로서 포함된다. 달리 명시하지 않는 한, 본원의 임의의 표를 포함하는 본원에 명시된 서열 등록 번호는 2016년 7월 7일 현재의 데이터베이스 항목을 참조한다. 하나의 유전자 또는 단백질이 복수의 서열 등록 번호를 언급하는 경우, 서열 변이체 모두가 포함된다.
도 1은 렌티바이러스 형질도입 후의 K562 적백혈병 세포에 대한 상이한 크기의 다양한 작제물의 발현을 제시하는 플롯이다. 각각의 데이터 포인트는 고유한 작제물을 나타낸다. 각각의 작제물이 적절한 에피토프 태그를 함유하므로 발현은 항-HA 항체를 이용한 유세포분석에 의해 측정된다. 작제물은 표적 세포 유전체로 통합될 바이러스 유전체(트랜스진 자체를 포함함) 내의 핵산의 길이인 프로바이러스 길이에 의해 배열된다.
도 2는 프로바이러스가 약 3.5 kb 내지 약 8.5 kb 범위가 되도록 하는 다양한 길이의 트랜스진을 함유하는 렌티바이러스 입자의 특성규명을 제시하는 플롯이다. y-축은 p24의 ㎍ 당 RNA 카피를 제시한다. 바이러스 상층액 ㎖ 당 RNA 카피의 수는 qPCR에 의해 측정된다. 바이러스 상층액 ㎖ 당 p24의 양(㎍)은 p24에 대해 ELISA에 의해 측정된다. 2개의 측정된 값의 비율은 p24 질량 당 RNA 카피의 수를 제공한다.
도 3은 K562 세포에 대해 최적화된 조건을 이용하여 GFP mRNA를 이용한 세포의 전기천공 24시간 후에 유세포분석에 의해 측정된 바와 같은 일차 전구세포로부터 배양된 적혈구 세포 및 K562 세포에서의 GFP의 발현을 제시하는 유세포분석 히스토그램을 제시한다.
도 4a, 도 4b, 및 도 4c는 GFP mRNA를 이용한 세포의 전기천공 24시간 후에 유세포분석에 의해 측정된 바와 같은 일차 전구세포로부터 배양된 적혈구 세포에서의 GFP의 발현을 제시하는 유세포분석 히스토그램을 제시한다. 12개의 상이한 조건(번호 1 내지 12)이 제시된다. 첫 번째 열에서, GFP 형광이 검출된다. 두 번째 열에서, Life Technologies LIVE/DEAD 염색으로 세포 생활력이 측정되며, 여기서 사멸된 세포는 염료에 의해 염색되므로, 살아 있는 세포의 백분율은 100% - %형광 세포이다.
도 5는 GFP mRNA를 이용한 세포의 전기천공 24시간 후에 유세포분석에 의해 측정된 바와 같은 분화의 다양한 단계의 일차 전구세포로부터 배양된 적혈구 세포에서의 GFP의 발현을 제시하는 유세포분석 히스토그램을 제시한다. 형질감염되지 않은 세포가 GFP mRNA 형질감염된 세포와 비교된다. 열은 형질감염 전 적혈구 분화 일 수를 나타낸다. 생활력 백분율은 Life Technologies LIVE/DEAD 염색으로 측정되며, 살아 있는 세포, 즉, 염색에 대해 음성으로 염색된 세포의 %로 보고된다.
도 6은 GFP mRNA를 이용한 세포의 전기천공 24시간 후에 유세포분석에 의해 측정된 바와 같은 일차 전구세포로부터 배양된 적혈구 세포에서의 GFP의 발현을 제시하는 유세포분석 히스토그램을 제시한다. 세포는 배양 9일째에 형질감염된 후, 분화 배지로 복귀되고, 13일에서 재분석되었다. 13일에, 세포는 GFP mRNA로 재-전기천공되었고, 24시간 후에 발현에 대해 분석되었다.
도 7a, 7b, 및 7c는 시험관 내 분화의 시작 후 상이한 시점에서 전기천공된 GFP 양성 적혈구 세포의 백분율을 제시한다. 도 7a는 확장, 분화, 및 성숙 단계를 예시한다. 도 7b는 성숙 9일을 통해 검정시 분화 9일째의 전기천공 후의 GFP 양성 세포의 백분율을 제시한다. 도 7c는 성숙 16일을 통해 검정시 성숙 7일째의 전기천공 후의 GFP 양성 세포의 백분율을 제시한다. "EP 없음"은 전기천공이 없는 대조군을 나타낸다. "P1-P4"는 4개의 전기천공 조건을 나타낸다.
도 8a 및 8b는 적혈구 세포가 성숙의 M4 내지 M7 일에 GFP를 인코딩하는 mRNA로 전기천공된 경우에 지정된 시점에서 GFP를 발현하는 적혈구 세포에서의 GFP 발현을 제시하는 그래프이다. 도 8a는 GFP를 발현하는 세포의 백분율을 제시하고, 도 8b는 세포의 평균 형광 강도를 제시한다.
도 9는 적혈구 세포 성숙의 시간 경과를 제시하는 그래프이다. 원은 AHA 강도/혼입으로 측정된 번역의 수준을 나타낸다. 사각형은 제핵 수준을 나타낸다.
도 10은 적혈구 세포 성숙의 시간 경과를 제시하는 그래프이며, mCherry를 발현하는 세포의 백분율이 y-축에 제시된다. EP, 전기천공된 대조군(RNasin이 없음). UT EP 없음, 형질감염되지 않은 대조군, 전기천공 없음. EP + RNasin 0.5, 0.5 U/㎕ RNasin으로 처리된 전기천공된 샘플. EP + RNasin 1, 1 U/㎕ RNasin으로 처리된 전기천공된 샘플. EP + RNasin 2, 2 U/㎕ RNasin으로 처리된 전기천공된 샘플.
도 11은 상이한 시점에서 프로테아솜 억제제로 처리된 세포의 시간에 비한 유효 발현(평균 형광 강도×형광 세포의 수)/1×106)을 제시하는 그래프이다.
도 12는 M4일에 GFP-PAL 네이키드 mRNA, GFP-PAL polyA Cap mRNA, GFP-PAL 네이키드 변형 mRNA, 또는 GFP-PAL polyA Cap 변형 mRNA로 전기천공된 세포에 대한 GFP-양성 세포의 백분율을 제시하는 그래프이다. GFP 발현은 M5(24시간 후), M6, M7, 및 M10일에 유세포분석에 의해 측정되었다.
정의
본원에서 사용되는 용어 "항체 분자"는 적어도 하나의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하는 단백질, 예를 들어, 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편을 나타낸다. 용어 "항체 분자"는 항체 및 항체 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 항체 분자는 다중특이적 항체 분자, 예를 들어, 이특이적 항체 분자이다. 항체 분자의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, scFv 항체 단편, 이황화물-결합 Fvs(sdFv), VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편, 선형 항체, 단일 도메인 항체, 예를 들어, sdAb(VL 또는 VH), 카멜리드(camelid) VHH 도메인, 항체 단편, 예를 들어, 힌지 영역에서 이황화물 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체, 항체의 분리된 에피토프 결합 단편, 맥시바디(maxibodies), 미니바디(minibodies), 나노바디(nanobodies), 인트라바디(intrabodies), 디아바디(diabodies), 트리아바디(triabodies), 테트라바디(tetrabodies), v-NAR 및 비스-scFv를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용되는 "분화 조건"은 통상적으로 에리트로포이에틴 및 다른 성장 인자가 첨가되는 생체 외 배양에서 적혈구 전구 세포, 예를 들어, HSC, 또는 CD34+ 세포가 증폭되고 제핵 적혈구 세포(예를 들어, 제핵 망상적혈구 또는 적혈구)로 분화되는 조건이다. 이 과정은 통상적으로 증식/확장 단계, 분화 단계, 및 성숙 단계(그 동안, 세포는 이의 핵을 상실함)를 포함한다. 분화 조건은 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Olivier et al., Novel, High-Yield Red Blood Cell Production Methods from CD34-Positive Cells Derived from Human Embryonic Stem, Yolk Sac, Fetal Liver, Cord Blood, and Peripheral Blood. Stem Cells Transl Med. 2012 Aug; 1(8): 604-614], 및 그 안에 인용된 참고문헌을 참고한다. 본원에서 사용되는 "적혈구 세포"는 적혈구 전구 세포, 예를 들어, 조혈 줄기 세포(HSC) 및 유핵 적혈구 전구 세포, 예를 들어, CD34+ 세포, 유핵 적혈구 세포 전구체, 제핵 적혈구 세포(예를 들어, 망상적혈구 또는 적혈구), 및 적혈구 전구 세포와 제핵 적혈구 사이의 임의의 중간물을 포함하는 적혈구 계열의 세포이다. 일 구현예에서, 적혈구 세포는 전적혈모구, 호염기 적혈모구, 다염 적혈모구, 정염 적혈모구, 망상적혈구, 또는 적혈구이다. 일 구현예에서, 적혈구는 제대혈 줄기 세포, CD34+ 세포, 조혈 줄기 세포(HSC), 비장 콜로니 형성(CFU-S) 세포, 일반 골수성 전구세포(CMP), 배반포 콜로니-형성 세포, 대집락 형성 단위-적혈구(BFU-E), 거핵세포-적혈구 전구세포(MEP) 세포, 적혈구 콜로니-형성 단위(CFU-E), 망상적혈구, 적혈구, 유도 다능성 줄기 세포(iPSC), 중간엽 줄기 세포(MSC), 다염 적혈모구, 정염 적혈모구, 또는 이들의 조합물이다.
구현예들에서, 적혈구 세포는 무한증식 또는 무한증식화 세포이거나, 이들로부터 유래된다. 예를 들어, 무한증식화 적혈모구 세포는 Oct4, Sox2, Klf4, cMyc를 발현하고, TP53를 억제하도록 CD34+ 조혈 전구 세포의 레트로바이러스 형질도입에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Huang et al. (2013) Mol Ther, epub ahead of print September 3]에 기재된 바와 같음). 또한, 세포는 자가 사용을 위해 의도될 수 있거나, 동종이형 수혈을 위한 공급원을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포는 배양된다.
본원에서 사용되는 "제핵"은 핵이 결여된 세포, 즉, 성숙 적혈구 세포로의 분화를 통해 핵을 상실한 세포를 나타낸다.
"외인성 폴리펩티드"는 상기 유형의 야생형 세포에 의해 생성되지 않거나, 외인성 폴리펩티드를 함유하는 세포에서보다 야생형 세포에서 낮은 수준으로 존재하는 폴리펩티드를 나타낸다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드는 세포로 도입된 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드이며, 상기 핵산은 선택적으로 세포에 의해 보유되지 않는다.
용어 mRNA를 변형시키는데 사용되는 경우의 "외인성"은 mRNA와 선택된 대상 세포, 예를 들어, 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포 사이의 관계를 나타낸다. 외인성 mRNA는 대상 세포에 자연적으로 존재하지 않는다. 일 구현예에서, 외인성 mRNA는 선택된 대상 세포에서 자연 발생하지 않는 폴리펩티드(외인성 폴리펩티드)를 발현한다. 구현예들에서, 외인성 mRNA는 선택된 대상 세포에서 자연 발생하지 않는 제1 부분 및 선택된 대상 세포에서 자연 발생하는 제2 부분을 포함한다.
용어 비번역 영역(UTR)을 변형시키기 위해 사용되는 경우의 "이종성"은 UTR과 UTR이 작동 가능하게 연결되는 코딩 영역(대상 코딩 영역) 사이의 관계를 나타낸다. UTR은 i) 자연적으로 존재하지 않거나; ii) 대상 코딩 영역과 함께 자연적으로 발생하지 않고, 예를 들어, 대상 코딩 영역과 자연적으로 작동 가능하게 연결되어 발생하는 UTR과 적어도 1개의 뉴클레오티드, 예를 들어, 이의 뉴클레오티드의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50%만큼 상이하거나; iii) UTR이 대상 코딩 영역과 자연적으로 작동 가능하게 연결되어 발생하지 않지만, 대상 코딩 영역이 아닌 코딩 영역과 자연적으로 작동 가능하게 연결되어 발생하거나, 상기 자연 발생 UTR과 적어도 70, 80, 90, 95, 99, 또는 100% 상동성을 갖는 특성 중 하나 이상을 갖는 경우에 이종성 UTR이다.
핵산과 관련하여 본원에서 사용되는 "변형된"은 표준 핵산과 상이한 핵산의 구조적 특징을 나타낸다. 이는 핵산 또는 뉴클레오티드를 제조하는 임의의 특정 과정을 의미하지는 않는다.
RNA 서열과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "조절 요소"는 분자, 예를 들어, 소분자, RNA 결합 단백질, 또는 조절 RNA, 예를 들어, miRNA의 존재 또는 수준에 반응하여 RNA의 특성(예를 들어, 안정성 또는 번역가능성, 예를 들어, 조절 요소가 작동 가능하게 연결되는 코딩 영역의 번역 수준)을 조절(예를 들어, 상향조절 또는 하향조절)할 수 있는 서열을 나타낸다.
화학적으로 변형된 핵산
외인성 RNA는 변형되지 않거나 변형된 핵염기를 포함할 수 있다. 자연 발생 RNA는 4개의 기본 리보뉴클레오티드인 ATP, CTP, UTP 및 GTP로부터 합성되나, 전사후 변형된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 또한, 약 100개의 상이한 뉴클레오시드 변형이 RNA에서 확인되었다(Rozenski, J, Crain, P, and McCloskey, J. (1999). The RNA Modification Database: 1999 update. Nucl Acids Res 27: 196-197). RNA는 또한 자연에서 발생하지 않는 전체 합성 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 화학적 변형은 PCT/US2016/032454호, 미국 특허 공개 번호 20090286852호, 국제 출원 번호 WO/2012/019168호, WO/2012/045075호, WO/2012/135805호, WO/2012/158736호, WO/2013/039857호, WO/2013/039861호, WO/2013/052523호, WO/2013/090648호, WO/2013/096709호, WO/2013/101690호, WO/2013/106496호, WO/2013/130161호, WO/2013/151669호, WO/2013/151736호, WO/2013/151672호, WO/2013/151664호, WO/2013/151665호, WO/2013/151668호, WO/2013/151671호, WO/2013/151667호, WO/2013/151670호, WO/2013/151666호, WO/2013/151663호, WO/2014/028429호, WO/2014/081507호, WO/2014/093924호, WO/2014/093574호, WO/2014/113089호, WO/2014/144711호, WO/2014/144767호, WO/2014/144039호, WO/2014/152540호, WO/2014/152030호, WO/2014/152031호, WO/2014/152027호, WO/2014/152211호, WO/2014/158795호, WO/2014/159813호, WO/2014/164253호, WO/2015/006747호, WO/2015/034928호, WO/2015/034925호, WO/2015/038892호, WO/2015/048744호, WO/2015/051214호, WO/2015/051173호, WO/2015/051169호, WO/2015/058069호, WO/2015/085318호, WO/2015/089511호, WO/2015/105926호, WO/2015/164674호, WO/2015/196130호, WO/2015/196128호, WO/2015/196118호, WO/2016/011226호, WO/2016/011222호, WO/2016/011306호, WO/2016/014846호, WO/2016/022914호, WO/2016/036902호, WO/2016/077125호, WO/2016/077123호에 제공되는 것이며, 상기 특허 출원 각각은 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다. 폴리뉴클레오티드로의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드의 혼입은 뉴클레오티드 내 변형의 위치에 따라 핵염기, 백본, 또는 핵염기 및 백본 둘 모두에 혼입되는 변형을 발생시킬 수 있음이 이해된다. 일부 구현예에서, 백본 변형은 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 EP 2813570호에 제공된 것이다. 일부 구현예에서, 변형된 캡은 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 공개 번호 20050287539호에 제공된 것이다.
일부 구현예에서, 변형된 mRNA는 ARCA: 항-역방향 캡 유사체(m27.3'-OGP3G), GP3G(비메틸화 캡 유사체), m7GP3G(일메틸화 캡 유사체), m32.2.7GP3G(삼메틸화 캡 유사체), m5CTP(5'-메틸-시티딘 트리포스페이트), m6ATP(N6-메틸-아데노신-5'-트리포스페이트), s2UTP(2-티오-우리딘 트리포스페이트), 및 Ψ(슈도우리딘 트리포스페이트) 중 하나 이상을 포함한다. 구현예들에서, 변형된 mRNA는 N6-메틸아데노신을 포함한다. 구현예들에서, 변형된 mRNA는 슈도우리딘을 포함한다.
일부 구현예에서, 외인성 RNA는 백본 변형, 예를 들어, 백본 내의 당 또는 포스페이트 기에 대한 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 RNA는 핵염기 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 외인성 mRNA는 표 1의 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 표 2의 하나 이상의 화학적 백본 변형, 표 3의 하나 이상의 화학적으로 변형된 캡을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 외인성 mRNA는 2개 이상(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상)의 상이한 유형의 화학적 변형을 포함한다. 예로서, 외인성 mRNA는, 예를 들어, 본원, 예를 들어, 표 1에 기재된 바와 같은 2개 이상(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상)의 상이한 유형의 변형된 핵염기를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 조합하여, 외인성 mRNA는, 예를 들어, 본원, 예를 들어, 표 2에 기재된 바와 같은 2개 이상(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상)의 상이한 유형의 백본 변형을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 조합하여, 외인성 mRNA는, 예를 들어, 본원, 예를 들어, 표 3에 기재된 바와 같은 2개 이상(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상)의 상이한 유형의 변형된 캡을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 외인성 mRNA는 하나 이상의 유형의 변형된 핵염기 및 하나 이상의 유형의 백본 변형; 하나 이상의 유형의 변형된 핵염기 및 하나 이상의 변형된 캡; 하나 이상의 유형의 변형된 캡 및 하나 이상의 유형의 백본 변형; 또는 하나 이상의 유형의 변형된 핵염기, 하나 이상의 유형의 백본 변형, 및 하나 이상의 유형의 변형된 캡을 포함한다.
일부 구현예에서, 외인성 mRNA는 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000개 이상)의 변형된 핵염기를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA의 모든 핵염기는 변형된다. 일부 구현예에서, 외인성 mRNA는 백본 내의 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000개 이상)의 위치에서 변형된다. 일부 구현예에서, mRNA의 모든 백본 위치는 변형된다.
이종성 비번역 영역
본원에 기재된 외인성 mRNA는 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4개 이상)의 이종성 UTR을 포함할 수 있다. UTR은, 예를 들어, 3' UTR 또는 5' UTR일 수 있다. 구현예들에서, 이종성 UTR은 진핵생물, 예를 들어, 동물, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간 UTR 서열, 또는 이 중 임의의 것의 일부 또는 변이체를 포함한다. 구현예들에서, 이종성 UTR은 합성 서열을 포함한다. 구현예들에서, 이종성 UTR은 바이러스 UTR, 예를 들어, 간염 바이러스 UTR, 예를 들어, 우드척(Woodchuck) 간염 바이러스 UTR 이외의 것이다.
이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 일부 구현예에서, 5' UTR은 번역 동안 리보솜의 스캐닝 시간을 감소시키기 위해 짧다. 구현예들에서, 비번역 영역은 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 40, 30, 20, 10, 또는 5개 미만의 뉴클레오티드 길이이다. 구현예들에서, 5' UTR은 자연 발생 5' UTR로부터의 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 40, 30, 20, 10, 또는 5개 이하의 연속적인 뉴클레오티드를 갖는 서열을 포함한다. 구현예들에서, UTR은 5' UTR이 결여되어 있다.
일부 구현예에서, 5' UTR은 시작 코돈의 AUG 업스트림(uAUG)을 포함하지 않는다. 본원의 비제한적인 이론에 따르면, 일부 자연 발생 5' UTR은 인코딩되는 유전자의 번역을 조절, 예를 들어, 감소시킬 수 있는 하나 이상의 uAUG를 함유한다. 때때로, uAUG는 정지 코돈과 쌍을 이루어 uORF를 형성한다. 따라서, 일부 구현예에서, 5' UTR은 자연 발생 5' UTR과 서열 유사성을 가지나, 자연 발생 5' UTR에 비해 하나 이상의 uAUG 또는 uORF가 결여되어 있다. 하나 이상의 uAUG는, 예를 들어, 결실 또는 치환 돌연변이에 의해 제거될 수 있다.
본원에 제공된 이종성 UTR이, 예를 들어, 이종성 UTR을 포함하는 mRNA와 적혈구 세포를 접촉시킴으로써 정제된 RNA의 일부로서 제공될 수 있음이 이해된다. 본원의 이종성 UTR은 또한, 예를 들어, 세포가 DNA를 이종성 UTR을 포함하는 RNA로 전사하는 것을 가능하게 하는 조건하에서 DNA와 적혈구 세포를 접촉시킴으로써 DNA를 통해 제공될 수 있다.
구현예들에서, 3' UTR은 polyA 꼬리, 예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000개의 아데노신을 포함한다.
구현예들에서, 외인성 RNA는 직접적 또는 간접적인 업스트림 요소의 다운스트림 요소로의 결합을 통해 RNA의 고리화를 가능하게 하는 5' UTR 및 3' UTR을 포함한다. 구현예들에서, 외인성 RNA는 고리화에 관여하는 5' 캡을 포함한다.
조절 요소를 포함하는 UTR
구현예들에서, UTR은 조절 요소를 포함한다. 조절 요소는 작동 가능하게 연결된 코딩 영역의 특성(예를 들어, 안정성 또는 번역 수준)을 조절(예를 들어, 상향조절 또는 하향조절)할 수 있다. 일부 구현예에서, 조절 요소는 RNA의 번역 시기를 제어한다. 예를 들어, RNA는 세포 주기의 단계, 병원체(예를 들어, 세포로 진입하는 바이러스)의 존재 또는 수준, 적혈구 세포 분화의 단계, 세포 내부의 분자(예를 들어, 대사물, 신호전달 분자, 또는 RNA, 예를 들어, miRNA)의 존재 또는 수준, 또는 세포 외부의 분자(예를 들어, 적혈구 세포의 표면 상의 수용체에 의해 결합되는 단백질)의 존재 또는 수준에 반응하여 번역될 수 있다.
구현예들에서, 조절 요소는, 예를 들어, 문헌[Callura et al., "Tracking, tuning, and terminating microbial physiology using synthetic riboregulators" PNAS 107:36, p.15898-15903]에 기재된 바와 같이 리보조절인자(riboregulator)를 포함한다. 구현예들에서, 리보조절인자는 리보솜 결합 부위를 은폐하여 mRNA의 번역을 억제하는 헤어핀을 포함한다. 구현예들에서, 전이-활성화 RNA(trans-activating RNA)는 헤어핀에 결합하고 이를 개방시켜, 리보솜 결합 부위를 노출시키고, mRNA가 번역되도록 한다. 구현예들에서, 리보솜 결합 부위는 IRES, 예를 들어, 문헌[Pedersen, SK, et al., Biochem J. 2002 Apr 1; 363(Pt 1): 37-44]에 기재된 인간 IGF-II 5' UTR-유래 IRES이다:
Figure pct00001
구현예들에서, 조절 요소는, 예를 들어, 국제 출원 WO2012058488호에 기재된 바와 같은 토홀드 스위치(toehold switch)를 포함한다. 구현예들에서, 토홀드는 리보조절인자와 유사하게 기능하며, 전이-조절 RNA와 상동성을 갖는 토홀드로 언급되는 짧은 단일 가닥 서열을 추가로 포함한다. 구현예들에서, 토홀드는 상이한 결합 파트너를 샘플링할 수 있으며, 이에 의해 전이-조절 RNA가 존재하는지의 여부를 더욱 신속히 검출할 수 있다.
구현예들에서, 조절 요소는 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Araujo et al., "Before It Gets Started: Regulating Translation at the 5' UTR" Comparative and Functional Genomics, Volume 2012 (2012), Article ID 475731, 8 pages]에 기재된 것이다.
구현예들에서, 조절 요소는 업스트림 오픈 리딩 프레임(uORF)을 포함한다. uORF는 uAUG 및 uAUG와 인-프레임(in-frame)의 정지 코돈을 포함한다. uORF는 리보솜이 uORF를 번역한 후, 다운스트림 코딩 영역에 도달하지 않고 정지 코돈에서 정지하는 경우에 종종 번역의 음성 조절인자로 작용한다. 예시적인 uORF는 아르기닌 농도에 의해 조절되는 진균 아르기닌 감쇠자 펩티드(AAP)에서 발견되는 것이다. 또 다른 예시적 uORF는 효모 GCN4에서 발견되며, 여기서 번역은 아미노산 고갈 조건하에서 활성화된다. 또 다른 uORF는 카르니틴 팔미토일트랜스페라제 1C(CPT1C) mRNA에서 발견되며, 여기서 억제는 글루코스 결핍에 반응하여 완화된다. 일부 구현예에서, uORF는 합성 uORF이다. 일부 구현예에서, uORF는 사이클린-의존성-키나제 억제제 단백질(CDKN2A), 트롬보포이에틴, 헤어리스(hairless) 동족체, TGF-beta3, SRY, IRF6, PRKAR1A, SPINK1, 또는 HBB에 대한 mRNA의 5' UTR에서 발견되는 것이다.
구현예들에서, 조절 요소는 이차 구조, 예를 들어, 헤어핀을 포함한다. 구현예들에서, 헤어핀은 약 -30, -40, -50, -60, -70, -80, -90, 또는 -100 kcal/㏖ 또는 더 강한 자유 에너지를 가지며, 이는 헤어핀이 결여된 mRNA에 비해 mRNA의 번역을 감소시키기에 충분하다. 구현예들에서, 이차 구조는 YB-1에 결합하는 TGF-beta1 mRNA, 또는 이의 단편 또는 변이체에서 발견되는 것이다.
구현예들에서, 조절 요소는 RPB(RNA-결합 단백질) 결합 모티프를 포함한다. 구현예들에서, RNA 결합 단백질은 HuR, Musashi, IRP(예를 들어, IRP1 또는 IRP2), SXL, 또는 lin-14를 포함한다. 구현예들에서, 조절 요소는 IRE, SXL 결합 모티프, p21 5' UTR GC-풍부 스템 루프, 또는 lin-4 모티프를 포함한다. IRP1 및 IRP2는 철-반응 요소(IRE)로 언급되는 스템-루프 서열에 결합하며; 결합은 번역에 대한 입체적 블록을 생성시킨다. SXL 단백질은 SXL 결합 모티프, 예를 들어, 5' UTR 내의 인트론 내의 poly-U 스트레치에 결합하여 인트론 유지를 야기시킨다. SXL 단백질은 또한 3' UTR 내의 poly-U 영역에 결합하여 예비-개시 복합체의 모집을 차단하고, 번역을 억제한다. SXL은 또한 uORF의 번역을 촉진하여, 주요 코딩 영역의 번역을 억제한다. p21 5' UTR GC-풍부 스템 루프는 CUGBP1(번역 활성인자) 또는 칼레티쿨린(CRT, 번역 억제인자)에 의해 결합된다.
일부 구현예에서, 조절 요소는 전이-작용 RNA에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 전이-작용 RNA는 miRNA이다. 구현예들에서, 비번역 영역은 RNA-결합 서열, 예를 들어, lin-4 RNA에 의해 결합되는 보존 서열을 포함하는 lin-14 3' UTR을 포함하여 lin-14 RNA의 번역을 하향 조절한다(Wightman et al., Cell, Vol. 75, 855-862, December 3, 1993).
구현예들에서, 조절 요소는 리보솜 RNA에 결합하고, 예를 들어, 5' UTR의 세그먼트를 우회하여 시작 코돈에 도달하도록 하는 리보솜의 션팅(shunting)을 촉진하는 서열을 포함한다. 구현예들에서, 션팅을 촉진하는 조절 서열은 꽃양배추 모자이크 바이러스 또는 아데노바이러스에서 발견되는 서열이다.
적혈구 세포 단백질의 UTR
일부 구현예에서, 비번역 영역은 야생형 적혈구 세포, 예를 들어, 성숙 적혈구 세포에서 발현되는 RNA의 UTR이다. 구현예들에서, UTR은 타입 I 적혈구 세포 막횡단 단백질(예를 들어, 글리코포린 A), 타입 II 적혈구 세포 막횡단 단백질(예를 들어, Kell 또는 CD71), 또는 타입 III 적혈구 세포 막횡단 단백질, 예를 들어, GLUT1에 대한 유전자의 UTR이다. 구현예들에서, UTR은 적혈구 세포 단백질, 예를 들어, CD235a, c-Kit, GPA, IL3R, CD34, CD36, CD71, Band 3, 헤모글로빈, 및 Alpha 4 인테그린의 UTR이다. 구현예들에서, UTR은 스펙트린, 앙키린, 4.1R, 4.2, p55, 트로포모듈린(tropomodulin), 또는 4.9에 대한 유전자의 UTR이다.
일부 구현예에서, 비번역 영역은 헤모글로빈 UTR, 예를 들어, SEQ ID NO:1의 3' 헤모글로빈 UTR을 포함한다:
Figure pct00002
구현예들에서, 비번역 영역은 SEQ ID NO:1의 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 또는 130개의 뉴클레오티드의 스트레치를 포함한다. 구현예들에서, 비번역 영역은 SEQ ID NO:1의 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 외인성 mRNA는 이종성 3' UTR을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 mRNA는 이종성 5' UTR을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 mRNA는 이종성 3' UTR 및 이종성 5' UTR을 포함한다.
조절 RNA
본 발명은, 일부 양태에서, 조절 RNA를 포함하는 적혈구 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 외인성 mRNA를 추가로 포함한다.
관련 양태에서, 본 발명은 적혈구 세포와 조절 RNA를 접촉시키는 방법을 포함한다. 구현예들에서, 상기 방법은 세포와 외인성 mRNA를 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 구현예들에서, 세포는 조절 RNA와의 접촉 전, 접촉 동안, 또는 접촉 후에 외인성 mRNA와 접촉된다.
관련 양태에서, 본 발명은 (i) 조절 RNA(예를 들어, miRNA 또는 항-miR), 및 (ii) 본원에 기재된 외인성 mRNA, 예를 들어, 인간 세포(예를 들어, 인간 적혈구 세포)에서의 발현에 대해 코돈-최적화된 mRNA, 적혈구 세포 막횡단 세그먼트를 포함하는 mRNA, 또는 본원에 기재된 이종성 UTR(예를 들어, 헤모글로빈 UTR 또는 또 다른 적혈구 세포 단백질로부터의 UTR)을 포함하는 mRNA를 포함하는 조성물(예를 들어, 정제되거나 분리된 조성물)을 포함한다.
구현예들에서, 조절 RNA는 외인성 mRNA의 특성(예를 들어, 안정성 또는 번역)을 조절한다. 일부 구현예에서, 조절 RNA는 적혈구 세포에 영향을 미치고, 예를 들어, 이의 증식 또는 분화에 영향을 미친다. 일부 구현예에서, 증식에 영향을 미치는 것은 시작 세포(예를 들어, 배양 중)가 이루는 분열의 수를 증가시키고/시키거나, 시작 세포 또는 집단으로부터 생성되는 세포의 전체 수를 증가시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 분화를 조절하는 것은 성숙 및/또는 제핵을 촉진하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 조절 RNA는 EPO를 인코딩하며, 예를 들어, 적혈구 세포의 확장을 자극한다.
구현예들에서, 조절 RNA는 miRNA이다. 일부 구현예에서, miRNA는 인간 miRNA, 예를 들어, 본원의 표 12에 열거된 miRNA, 예를 들어, "MIR"로 시작하는 표기가 있는 표 12의 요소 중 하나, 또는 이에 대한 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 변경(예를 들어, 치환, 삽입, 또는 결실)을 갖는 서열이다.
일부 구현예에서, 조절 RNA는 항-miR이다. 일부 구현예에서, 항-miR은 miRNA와 하이브리드화되고, miRNA가 이의 표적 mRNA와 결합하는 것을 방지함으로써 miRNA(예를 들어, 내인성 miRNA)를 억제한다. 일부 구현예에서, 항-miR은 인간 miRNA, 예를 들어, 본원의 표 12에 열거된 miRNA, 예를 들어, "MIR"로 시작하는 표기가 있는 표 12의 요소 중 하나, 또는 이에 대한 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 변경(예를 들어, 치환, 삽입, 또는 결실)을 갖는 서열에 결합하고/하거나 이에 대한 상보성을 갖는다.
일부 구현예에서, 조절 RNA는 siRNA, shRNA, 또는 안티센스 분자이다. 구현예들에서, siRNA는 서로 하이브리드화될 수 있는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 안티센스 가닥은 표적 mRNA에 추가로 하이브리드화될 수 있고; 1개 또는 2개의 블런트 말단을 가질 수 있고; 1개 또는 2개의 오버행, 예를 들어, 3' dTdT 오버행을 가질 수 있고; 화학적 변형을 포함할 수 있고; 캡을 포함할 수 있고; 컨쥬게이트를 포함할 수 있다. 구현예들에서, shRNA는 센스 영역, 안티센스 영역, 및 루프 영역을 갖는 헤어핀 구조를 포함하며, 여기서 센스 영역 및 안티센스 영역은 서로 하이브리드화될 수 있고, 안티센스 영역은 표적 mRNA에 추가로 하이브리드화될 수 있고; 블런트 말단을 가질 수 있고; 오버행을 가질 수 있고; 화학적 변형을 포함할 수 있고; 캡을 포함할 수 있고; 컨쥬게이트를 포함할 수 있다. 구현예들에서, 안티센스 분자는 표적 mRNA에 하이브리드화될 수 있는 단일 가닥을 포함하고; 화학적 변형을 포함할 수 있고; 캡을 포함할 수 있고; 컨쥬게이트를 포함할 수 있다.
지질 나노입자 방법
일부 구현예에서, 본원에 기재된 RNA(예를 들어, mRNA)는 지질 나노입자(LNP)를 이용하여, 예를 들어, 형질감염에 의해 적혈구 세포로 도입된다. 따라서, 일부 양태에서, 본 발명의 개시는 적혈구 세포와 mRNA 및 LNP, 예를 들어, 본원에 기재된 LNP를 접촉시키는 단계를 포함하는 적혈구 세포로 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 도입하는 방법을 제공한다. 본 발명의 개시는 또한 적혈구 세포, mRNA, 및 LNP를 포함하는 반응 혼합물을 제공한다. 일부 구현예에서, mRNA는 LNP와 복합체화된다. 구현예들에서, LNP와 접촉되는 세포의 집단은 적어도 1×107, 2×107, 5×107, 1×108, 2×108, 5×108, 1×109, 2×109, 또는 5×109, 1×1010, 2×1010, 또는 5×1010개의 세포를 포함한다.
예시적 LNP는 양이온성 트리알킬 지질, 비-양이온성 지질(예를 들어, PEG-지질 컨쥬게이트 및 인지질), 및 지질 입자 내에서 캡슐화된 mRNA 분자를 포함한다. 구현예들에서, 인지질은 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 구현예들에서, PEG-지질 컨쥬게이트는 PEG-디아실글리세롤(PEG-DAG) 컨쥬게이트, PEG-디알킬옥시프로필(PEG-DAA) 컨쥬게이트, PEG-인지질 컨쥬게이트, PEG-세라미드(PEG-Cer) 컨쥬게이트, 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 구현예들에서, PEG-DAA 컨쥬게이트는 PEG-디데실옥시프로필(C10) 컨쥬게이트, PEG-디라우릴옥시프로필(C12) 컨쥬게이트, PEG-디미리스틸옥시프로필(C14) 컨쥬게이트, PEG-디팔미틸옥시프로필(C16) 컨쥬게이트, PEG-디스테아릴옥시프로필(C18) 컨쥬게이트, 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 구현예들에서, LNP는 콜레스테롤을 추가로 포함한다. 추가의 LNP는, 예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 공개 번호 20160256567호에 기재되어 있다.
또 다른 예시적 LNP는 하기 구조 화학식 (I)를 갖는 지질 또는 이의 염을 포함할 수 있다:
[구조 화학식 I]
Figure pct00003
상기 식에서,
R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, 및 R8은 수소, 선택적으로 치환되는 C7-C30 알킬, 선택적으로 치환되는 C7-C30 알케닐 및 선택적으로 치환되는 C7-C30 알키닐로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고;
단, (a) R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, 및 R8 중 적어도 2개는 수소가 아니고, (b) 수소가 아닌 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, 및 R8 중 적어도 2개 중 2개는 서로에 대해 1,3 배열, 1,4 배열 또는 1,5 배열로 존재하고;
X는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐 및 C2-C6 알키닐로 구성된 군으로부터 선택되고;
R9, R10, 및 R11은 독립적으로 수소, 선택적으로 치환되는 C1-C7 알킬, 선택적으로 치환되는 C2-C7 알케닐 및 선택적으로 치환되는 C2-C7 알키닐로 구성된 군으로부터 선택되나, 단, R9, R10, 및 R11 중 하나는 부재할 수 있고;
n 및 m은 각각 독립적으로 0 또는 1이다.
예를 들어, 지질은 하기 구조 중 하나를 포함할 수 있다:
Figure pct00004
,
Figure pct00005
, 또는
Figure pct00006
.
구현예들에서, LNP는 비-양이온성 지질, 예를 들어, 인지질, 콜레스테롤, 또는 인지질 및 콜레스테롤의 혼합물을 추가로 포함한다. 구현예들에서, 인지질은 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 추가의 LNP는, 예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 공개 번호 20130064894호에 기재되어 있다.
또 다른 예시적 LNP는 (a) 핵산, 예를 들어, mRNA; (b) 입자 내에 존재하는 전체 지질의 50 ㏖% 내지 65 ㏖%(예를 들어, 52 ㏖% 내지 62 ㏖%)를 구성하는 양이온성 지질; (c) 인지질 및 콜레스테롤 또는 이의 유도체의 혼합물을 포함하는 비-양이온성 지질로서, 인지질이 입자에 존재하는 전체 지질의 4 ㏖% 내지 10 ㏖%를 구성하고, 콜레스테롤 또는 이의 유도체가 입자에 존재하는 전체 지질의 30 ㏖% 내지 40 ㏖%를 구성하는, 비-양이온성 지질; 및 (d) 입자에 존재하는 전체 지질의 0.5 ㏖% 내지 2 ㏖%를 구성하는 입자의 응집을 억제하는 컨쥬게이션된 지질을 포함한다. 구현예들에서, 인지질은 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 구현예들에서, 입자의 응집을 억제하는 컨쥬게이션된 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 컨쥬게이트를 포함한다. 구현예들에서, PEG-지질 컨쥬게이트는 PEG-디아실글리세롤(PEG-DAG) 컨쥬게이트, PEG-디알킬옥시프로필(PEG-DAA) 컨쥬게이트, 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 구현예들에서, PEG-DAA 컨쥬게이트는 PEG-디미리스틸옥시프로필(PEG-DMA) 컨쥬게이트, PEG-디스테아릴옥시프로필(PEG-DSA) 컨쥬게이트, 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 추가의 LNP는, 예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 8,058,069호에 기재되어 있다.
적혈구 세포를 제조하는 방법
적혈구 전구 세포를 성숙 적혈구 세포로 분화시키는 방법은 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Douay & Andreu. Transfus Med Rev. 2007 Apr;21(2):91-100; Giarratana et al. Nat Biotechnol. 2005 Jan;23(1):69-74; Olivier et al. Stem Cells Transl Med. 2012 Aug; 1(8): 604-614] 및 이에 인용된 참고문헌을 참조한다.
외인성 RNA 및/또는 단백질을 포함(예를 들어, 발현)하는 적혈구 세포를 제조하는 방법은, 예를 들어, WO2015/073587호 및 WO2015/153102호에 기재되어 있으며, 이들 각각의 전체내용은 참조로서 포함된다.
일부 구현예에서, 조혈 전구 세포, 예를 들어, CD34+ 조혈 전구 세포는 하나 이상의 외인성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 또는 핵산들과 접촉되며, 세포는 배양시 확장되고 분화된다.
구현예들에서, 상기 방법은, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 세포를 전기천공하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 적혈구 세포는 적어도 1000, 2000, 5000, 10,000, 20,000, 50,000, 또는 100,000배(선택적으로, 100,000, 200,000, 또는 500,000배 이하) 확장된다. 세포의 수는, 일부 구현예에서, 자동화 세포 계수기를 이용하여 측정된다.
일부 구현예에서, 적혈구 세포의 집단은 적어도 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 98%(선택적으로, 약 80, 90, 또는 100% 이하)의 제핵 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포의 집단은 1% 미만의 살아 있는 제핵 세포를 함유하고, 예를 들어, 검출 가능하지 않은 살아 있는 제핵 세포를 함유한다. 제핵은, 일부 구현예에서, 핵 염색을 이용한 FACS에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 집단 내의 적혈구 세포의 적어도 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 또는 80%(선택적으로, 약 70, 80, 90, 또는 100% 이하)는 외인성 RNA 및/또는 폴리펩티드를 포함한다. 외인성 폴리펩티드의 발현은, 일부 구현예에서, 폴리펩티드에 대한 표지된 항체를 이용한 FACS에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 제핵 세포의 집단은 약 1×109 내지 2×109, 2×109 내지 5×109, 5×109 내지 1×1010, 1×1010 내지 2×1010, 2×1010 내지 5×1010, 5×1010 내지 1×1011, 1×1011 내지 2×1011, 2×1011 내지 5×1011, 5×1011 내지 1×1012, 1×1012 내지 2×1012, 2×1012 내지 5×1012, 또는 5×1012 내지 1×1013개의 세포를 포함한다.
예시적인 외인성 폴리펩티드 및 이의 용도
외인성 단백질 중 하나 이상은 진핵생물 세포, 예를 들어, 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포에서 특징적인 번역후 변형을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 외인성 단백질 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5개 이상)은 당화되거나, 인산화되거나, 당화 및 인산화된다. 당단백질의 시험관 내 검출은 과요오드산-쉬프(Periodic acid-Schiff)(PAS) 방법의 변형을 이용하여 SDS-PAGE 젤 및 웨스턴 블롯에서 일상적으로 달성된다. 당단백질의 세포 국소화는 당 분야에 공지된 렉틴 형광 컨쥬게이트를 이용하여 달성될 수 있다. 인산화는 포스포-특이적 항체를 이용하여 웨스턴 블롯에 의해 평가될 수 있다.
번역 후 변형은 또한 소수성 기에 대한 컨쥬게이션(예를 들어, 미리스토일화, 팔미토일화, 이소프레닐화, 프레닐화, 또는 글리피화), 보조인자에 대한 컨쥬게이션(예를 들어, 리포일화(lipoylation), 플라빈 모이어티(예를 들어, FMN 또는 FAD), 헴 C 부착, 포스포판테테이닐화(phosphopantetheinylation), 또는 레티닐리덴 쉬프 염기 형성), 디프타미드 형성, 에탄올아민 포스포글리세롤 부착, 하이푸신(hypusine) 형성, 아실화(예를 들어, O-아실화, N-아실화, 또는 S-아실화), 포르밀화, 아세틸화, 알킬화(예를 들어, 메틸화 또는 에틸화), 아미드화, 부티릴화, 감마-카르복실화, 말로닐화, 하이드록실화, 요오드화, 뉴클레오티드 첨가, 예를 들어, ADP-리보실화, 산화, 포스페이트 에스테르(O-결합) 또는 포스포르아미데이트(N-결합) 형성(예를 들어, 인산화 또는 아데닐릴화), 프로피오닐화, 피로글루타메이트 형성, S-글루타티오닐화, S-니트로실화, 숙시닐화, 황산화, ISG화(ISGylation), 수모화(SUMOylation), 유비퀴틴화, 네딜화(Neddylation), 또는 아미노산의 화학적 변형(예를 들어, 시트룰린화, 탈아미드화, 엘리미닐화(eliminylation), 또는 카르바밀화), 이황화 브릿지의 형성, 라세미화(예를 들어, 프롤린, 세린, 알라닌, 또는 메티오닌의 라세미화)를 포함한다. 구현예들에서, 당화는 당화를 발생시키는 아르기닌, 아스파라긴, 시스테인, 하이드록시리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 또는 트립토판으로의 글리코실기의 첨가를 포함한다. 구현예들에서, 당화는, 예를 들어, O-결합 당화 또는 N-결합 당화를 포함한다.
일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드 중 하나 이상은 융합 단백질, 예를 들어, 내인성 적혈구 세포 단백질 또는 이의 단편, 예를 들어, 막횡단 단백질, 예를 들어, 이의 GPA 또는 막횡단 단편과의 융합체이다.
일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드에 대한 코딩 영역은 발현되는 세포, 예를 들어, 포유동물 적혈구 세포, 예를 들어, 인간 적혈 구 세포에 대해 코돈-최적화된다.
일부 구현예에서, 적혈구 세포는 세포 당 적어도 1,000, 2,000, 5,000, 10,000, 20,000, 50,000, 또는 100,000개 카피의 외인성 단백질을 포함한다. 구현예들에서, 외인성 단백질의 카피수는, 예를 들어, 정량적 웨스턴 블롯에 의하거나, 유세포분석 검정에서 표준화된 형광 미세구(예를 들어, Bangs Laboratories로부터의 것)를 이용하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 외인성 단백질이 형광 단백질인 경우, 평균 형광 강도(MFI)는, 예를 들어, 샘플의 MFI를 결정하고, 유사한 샘플에서 형광 단백질의 카피수를 정량하고(예를 들어, 정량적 웨스턴 블롯에 의함), MFI와 단백질 카피수 사이의 전환 인자를 계산함으로써 단백질 카피수를 추정하기 위해 사용될 수 있다.
제핵 적혈구 세포의 물리적 특징
일부 구현예에서, 본원에 기재된 적혈구 세포는 본원에 기재된 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4개 이상)의 물리적 특징, 예를 들어, 삼투 취약성, 세포 크기, 헤모글로빈 농도, 또는 포스파티딜세린 함량을 갖는다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 일부 구현예에서, 외인성 단백질을 발현하는 제핵 적혈구 세포는 야생형의 미처리 적혈구 세포(예를 들어, 저장성 투석에 적용되지 않은 적혈구 세포)와 유사한 물리적 특징을 갖는다. 대조적으로, 저장성으로 로딩된 RBC는 때때로 변경된 물리적 특징, 예를 들어, 증가된 삼투 취약성, 변경된 세포 크기, 감소된 헤모글로빈 농도, 또는 세포막의 외엽 상에서의 증가된 포스파티딜세린 수준을 나타낸다.
삼투 취약성
일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포는 외인성 폴리펩티드를 포함하지 않는 분리된 배양되지 않은 적혈구 세포와 실질적으로 동일한 삼투막 취약성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포의 집단은 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 또는 0.5% NaCl에서 50% 미만의 세포 용해의 삼투 취약성을 갖는다. 일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포의 집단은 물 중 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 또는 0.5% NaCl로 구성된 용액에서 50% 미만의 세포 용해의 삼투 취약성을 갖는다. 삼투 취약성은, 일부 구현예에서, WO2015/073587호의 실시예 59의 방법을 이용하여 결정된다.
세포 크기
일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포는 야생형의 미처리 망상적혈구와 대략적인 직경 또는 용적을 갖는다. 일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포는 약 150 fℓ, 예를 들어, 약 140 내지 160, 130 내지 170, 또는 120 내지 180 fℓ의 용적을 갖는다. 일부 구현예에서, 집단은 약 150 fℓ, 약 140 내지 160, 130 내지 170, 120 내지 180, 110 내지 190, 또는 100 내지 200 fℓ의 평균 세포 용적을 갖는다. 일부 구현예에서, 집단 내의 세포의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%는 약 140 내지 160, 130 내지 170, 120 내지 180, 110 내지 190, 또는 100 내지 200 fℓ의 용적을 갖는다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포의 평균 적혈구 용적의 용적은 10 fℓ, 20 fℓ, 30 fℓ, 40 fℓ, 50 fℓ, 60 fℓ, 70 fℓ, 80 fℓ, 90 fℓ, 100 fℓ, 110 fℓ, 120 fℓ, 130 fℓ, 140 fℓ, 150 fℓ 초과, 또는 150 fℓ 초과이다. 일 구현예에서, 적혈구 세포의 평균 적혈구 용적은 30 fℓ, 40 fℓ, 50 fℓ, 60 fℓ, 70 fℓ, 80 fℓ, 90 fℓ, 100 fℓ, 110 fℓ, 120 fℓ, 130 fℓ, 140 fℓ, 150 fℓ, 160 fℓ, 170 fℓ, 180 fℓ, 190 fℓ, 200 fℓ 미만, 또는 200 fℓ 미만이다. 일 구현예에서, 적혈구 세포의 평균 적혈구 용적은 80 내지 100, 100 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 또는 400 내지 500 펨토리터(fℓ)이다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포의 집단은 본 단락에 기재된 평균 적혈구 용적을 가지며, 집단의 표준 편차는 50, 40, 30, 20, 10, 5, 또는 2 fℓ 미만이다. 용적은, 일부 구현예에서, 혈액학적 분석 장치, 예를 들어, 쿨터 계수기(Coulter Counter)를 이용하여 측정된다.
헤모글로빈 농도
일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포는 야생형의 미처리 적혈구 세포, 예를 들어, 성숙 RBC와 유사한 헤모글로빈 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 초과 또는 10% 초과의 태아 헤모글로빈을 포함한다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포는 적어도 약 20, 22, 24, 26, 28, 또는 30 pg, 선택적으로 약 30 pg 이하의 전체 헤모글로빈을 포함한다. 헤모글로빈 수준은, 일부 구현예에서, WO2015/073587호의 실시예 33의 드랍킨 시약(Drabkin's reagent) 방법을 이용하여 결정된다.
포스파티딜세린 함량
일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포는 야생형의 미처리 RBC와 대략적으로 동일한 세포막의 외엽 상의 포스파티딜세린 함량을 갖는다. 포스파티딜세린은 주로 야생형의 미처리 RBC의 세포막의 내엽에 존재하며, 저장성 로딩은 포스파티딜세린이 외엽에 분포하도록 할 수 있으며, 여기서 이는 면역 반응을 촉발시킬 수 있다. 일부 구현예에서, RBC의 집단은 Annexin V 염색에 대해 양성인 약 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1% 미만의 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 집단 내의 제핵 세포의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%는 외인성 단백질을 발현하지 않는 달리 유사하게 배양된 적혈구 세포와 동일한 수준의 포스파티딜세린 노출을 갖는다. 포스파티딜세린 노출은, 일부 구현예에서, 예를 들어, WO2015/073587호의 실시예 54의 방법을 이용하여 PS에 우선적으로 결합하는 Annexin-V-FITC에 대한 염색 및 유세포분석에 의한 FITC 형광 측정에 의해 평가된다.
다른 특징
일부 구현예에서, 적혈구 세포의 집단은 GPA에 대해 양성인 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%(선택적으로, 90 또는 100% 이하)의 세포를 포함한다. GPA의 존재는, 일부 구현예에서, FACS를 이용하여 검출된다.
일부 구현예에서, 적혈구 세포는 대상체에서 적어도 30, 45, 또는 90일의 반감기를 갖는다.
적혈구 세포 분화 및 성숙의 단계
구현예들에서, 제핵 적혈구 세포는 CD34+ 줄기 세포를 첫 번째 확장, 이후 분화, 및 최종적으로 성숙 조건의 3개의 조건에 노출시킴으로써 생성된다. 예시적인 확장, 분화, 및 성숙 조건은, 예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 WO2015/073587호의 단락 [1221]의 실시예 3의 단계 1, 2, 및 3으로 기재되어 있다. 구현예들에서, 확장 단계는 확장 배지(예를 들어, 상기 단계 1의 배지)에서 세포를 배양하는 것을 포함하고, 분화 단계는 분화 배지(예를 들어, 상기 단계 2의 배지)에서 세포를 배양하는 것을 포함하고, 성숙 단계는 성숙 배지(예를 들어, 상기 단계 3의 배지)에서 세포를 배양하는 것을 포함한다.
구현예들에서, 성숙 단계는, 예를 들어, 유세포분석 검정에 의해 측정시 집단 내의 세포의 약 84%가 GPA에 대해 양성인 경우에 시작된다. 구현예들에서, 성숙 단계의 시작시, 세포의 집단은, 예를 들어, 유세포분석 검정에 의해 측정시 약 54% band3-양성이다. 구현예들에서, 성숙 단계의 시작시, 세포의 집단은, 예를 들어, 유세포분석 검정에 의해 측정시 약 98% alpha4 인테그린-양성이다. 일 구현예에서, 성숙 단계는 적혈구 세포 집단 내의 세포의 약 53%가 band3 및 alpha4 인테그린 둘 모두에 대해 양성인 경우에 시작된다. 구현예들에서, 성숙 단계는 세포 집단이 주로 전-적혈모구 및 호염기성 적혈모구인 경우에 시작된다.
구현예들에서, 본원에 기재된 적혈구 세포 집단 내의 세포의 약 99%는 GPA에 대해 양성이다. 일 구현예에서, 적혈구 세포 집단 내의 세포의 약 98%는 band3에 대해 양성이다. 일 구현예에서, 적혈구 세포 집단 내의 세포의 약 91%는 alpha4 인테그린에 대해 양성이다. 일 구현예에서, 적혈구 세포 집단 내의 세포의 약 90%는 band3 및 alpha4 인테그린 둘 모두에 대해 양성이다. 구현예들에서, 세포 집단은 주로 다염 적혈모구 및 정염 적혈모구이다. 구현예들에서, 세포 집단은 약 3% 제핵된다. 구현예들에서, 세포 집단은 최대 제핵의 약 6%로 존재하고, 최대 제핵은 배양 종료시에 세포 집단이 도달하는 제핵의 백분율이다. 구현예들에서, 세포 집단은, 예를 들어, 실시예 10에 기재된 바와 같은 BONCAT 검정에서 약 2,410,000의 AHA 강도/혼입 값을 갖는다. 구현예들에서, 이러한 단계는 세포가 3일 동안 성숙 조건에 노출(M3일)된 경우에 도달된다.
구현예들에서, 본원에 기재된 적혈구 세포 집단 내의 세포의 약 99.5%는 GPA에 대해 양성이다. 일 구현예에서, 적혈구 세포 집단 내의 세포의 약 100%는 band3에 대해 양성이다. 일 구현예에서, 적혈구 세포 집단 내의 세포의 약 84.2%는 alpha4 인테그린에 대해 양성이다. 일 구현예에서, 적혈구 세포 집단 내의 세포의 약 84.2%는 band3 및 alpha4 인테그린 둘 모두에 대해 양성이다. 구현예들에서, 세포 집단은 주로 정염 적혈모구 및 망상적혈구이다. 구현예들에서, 세포 집단은 약 11% 제핵된다. 구현예들에서, 세포 집단은 최대 제핵의 약 22%로 존재한다. 구현예들에서, 세포 집단은 BONCAT 검정에서 약 1,870,000의 AHA 강도/혼입 값을 갖는다. 구현예들에서, 이러한 단계는 세포가 5일 동안 성숙 조건에 노출(M5일)된 경우에 도달된다.
구현예들에서, 세포 집단은 약 34% 제핵된다. 구현예들에서, 세포 집단은 최대 제핵의 약 68%로 존재한다. 구현예들에서, 세포 집단은 BONCAT 검정에서 약 615,000의 AHA 강도/혼입 값을 갖는다. 구현예들에서, 이러한 단계는 세포가 7일 동안 성숙 조건에 노출(M7일)된 경우에 도달된다.
구현예들에서, 세포 집단은 약 43% 제핵된다. 구현예들에서, 세포 집단은 최대 제핵의 약 86%로 존재한다. 구현예들에서, 세포 집단은 BONCAT 검정에서 약 189,000의 AHA 강도/혼입 값을 갖는다. 구현예들에서, 이러한 단계는 세포가 9일 동안 성숙 조건에 노출(M9일)된 경우에 도달된다.
구현예들에서, 적혈구 세포는 전-적혈모구, 조기 호염기성 적혈모구, 후기 호염기성 적혈모구, 다염 적혈모구, 정염 적혈모구, 망상적혈구, 또는 적혈구로부터 선택된다.
본원의 조성물, 예를 들어 적혈구 세포를 이용한 처리 방법
외인성 RNA 및/또는 단백질을 포함(예를 들어, 발현)하는 적혈구 세포를 투여하는 방법은, 예를 들어, WO2015/073587호 및 WO2015/153102호에 기재되어 있으며, 이들 각각의 전체내용은 참조로서 포함된다.
구현예들에서, 본원에 기재된 적혈구 세포는 대상체, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간에게 투여된다. 치료될 수 있는 예시적 포유동물은 인간, 가축(예를 들어, 개, 고양이 등), 농장 동물(예를 들어, 소, 양, 돼지, 말 등) 및 실험용 동물(예를 들어, 원숭이, 래트, 마우스, 토끼, 기니아 피그 등)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 기재된 방법은 인간 요법 및 수의 적용 둘 모두에 적용 가능하다.
일부 구현예에서, 적혈구 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개월마다 환자에게 투여된다.
일부 구현예에서, 적혈구 세포의 용량은 약 1×109 내지 2×109, 2×109 내지 5×109, 5×109 내지 1×1010, 1×1010 내지 2×1010, 2×1010 내지 5×1010, 5×1010 내지 1×1011, 1×1011 내지 2×1011, 2×1011 내지 5×1011, 5×1011 내지 1×1012, 1×1012 내지 2×1012, 2×1012 내지 5×1012, 또는 5×1012 내지 1×1013개의 세포를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 개시는 본원에 기재된 조성물, 예를 들어, 본원에 기재된 제핵 적혈구 세포를 본원에 기재된 질병 또는 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 본원에 기재된 질병 또는 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 질병 또는 질환은 암, 감염(예를 들어, 바이러스 또는 박테리아 감염), 염증성 질병, 자가면역 질병, 또는 대사 결핍이다. 일부 양태에서, 본 발명의 개시는 본원에 기재된 질병 또는 질환을 치료하기 위한 본원에 기재된 적혈구 세포의 용도를 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명의 개시는 본원에 기재된 질병 또는 질환을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 본원에 기재된 적혈구 세포의 용도를 제공한다.
암의 유형은 급성 림프모구 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 항문암, 담관암, 방광암, 골암, 장암, 뇌종양, 유방암, 공지되지 않은 원발성 암, 뼈로 전이된 암, 뇌로 전이된 암, 간으로 전이된 암, 폐로 전이된 암, 유암종, 자궁경부암, 융모막암종, 만성 림프성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 결장암, 결장직장암, 자궁내막암, 안구암, 담낭암, 위암, 임신 융모 종양(GTT), 털세포 백혈병, 두경부암, 호지킨 림프종, 신장암, 후두암, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종 피부암, 중피종, 남성암, 기태 임신, 구강암 및 입인두암, 골수종, 비강암 및 부비동암, 코인두암, 비-호지킨 림프종(NHL), 식도암, 난소암, 췌장암, 음경암, 전립선암, 희귀암, 직장암, 타액선암, 속발성 암, 피부암(비-흑색종), 연조직 육종, 위암, 고환암, 갑상선암, 공지되지 않은 원발성 암, 자궁암, 질암, 및 외음부암을 포함한다.
바이러스 감염은 아데노바이러스, 콕사키바이러스, A형 간염 바이러스, 폴리오바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 단순 헤르페스 타입 1, 단순 헤르페스 타입 2, 인간 사이토메갈로바이러스, 인간 헤르페스바이러스 타입 8, 수두-대상포진 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 유두종바이러스, 광견병 바이러스, 및 풍진 바이러스를 포함한다. 다른 바이러스 표적은 파라믹소바이러스과(예를 들어, 폐렴바이러스, 홍역바이러스, 메타뉴모바이러스, 레스피로바이러스 또는 루불라바이러스), 아데노바이러스과(예를 들어, 아데노바이러스), 아레나바이러스과(예를 들어, 아레나바이러스, 예를 들어, 림프구 맥락수막염 바이러스), 아르테리바이러스과(예를 들어, 돼지 호흡기 및 생식기 증후군 바이러스 또는 말 동맥염 바이러스), 분야바이러스과(예를 들어, 플레보바이러스 또는 한타바이러스), 칼리시바이러스과(예를 들어, 노로 바이러스), 코로나바이러스과(예를 들어, 코로나바이러스 또는 토로바이러스), 필로바이러스과(예를 들어, 에볼라-유사 바이러스), 플라비바이러스과(예를 들어, 헤파시바이러스 또는 플라비바이러스), 헤르페스바이러스과(예를 들어, 심플렉스바이러스, 바리셀로바이러스, 사이토메갈로바이러스, 로세올로바이러스, 또는 림포크립토바이러스), 오르토믹소바이러스과(예를 들어, 인플루엔자 바이러스 또는 토고토바이러스), 파르보바이러스과(예를 들어, 파르보바이러스), 피코마바이러스과(예를 들어, 엔테로바이러스 또는 헤파토바이러스), 폭스바이러스과(예를 들어, 오르토폭스바이러스, 아비폭스바이러스, 또는 레포리폭스바이러스), 레트로바이러스과(예를 들어, 렌티바이러스 또는 스푸마바이러스), 레오바이러스과(예를 들어, 로타바이러스), 랍도바이러스과(예를 들어, 리사바이러스, 노비랍도바이러스, 또는 베시큘로바이러스), 및 토가바이러스과(예를 들어, 알파바이러스 또는 루비바이러스)를 포함한다. 이들 바이러스의 특정 예는 인간 호흡기 코로나바이러스, 인플루엔자 바이러스 A 내지 C, 간염 바이러스 A 내지 G, 및 단순 헤르페스 바이러스 1 내지 9를 포함한다.
박테리아 감염은 미코박테리아(Mycobacteria), 리케챠(Rickettsia), 미코플라스마(Mycoplasma), 나이세리아 메닌기티데스(Neisseria meningitides), 나이세리아 고노레오에아에(Neisseria gonorrheoeae), 레지오넬라(Legionella), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 스트렙토콕키(Streptococci), 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스태필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 코리노박테리아 디프테리아에(Corynobacteria diphtheriae), 클로스트리듐 종(Clostridium spp.), 장독소생성 에스케리키아 콜리(Eschericia coli), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 리케챠(Rickettsia), 바르토넬라 헨셀라에(Bartonella henselae), 바르토넬라 퀸타나(Bartonella quintana), 콕시엘라 부르네티이(Coxiella burnetii), 클라미디아(chlamydia), 미코박테리움 레프라에(Mycobacterium leprae), 살모넬라(Salmonella); 시겔라(shigella); 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica); 예르시니아 슈도튜베로쿨로시스(Yersinia pseudotuberculosis); 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila); 미코박테리움 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis); 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes); 미코플라스마 종(Mycoplasma spp.); 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens); 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae); 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae); 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis); 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum); 렙토스피라(Leptospira); 보렐리아(Borrelia); 코리네박테리움 디프테리아에(Corynebacterium diphtheriae); 프란시셀라(Francisella); 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis); 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni); 엔테로박터(Enterobacter); 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis); 프로테우스(Proteus); 및 클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
염증성 질병은 박테리아 패혈증, 류마티스 관절염, 연령 관련 황반 변성(AMD), 전신 홍반 루푸스(결합 조직의 염증성 장애), 사구체신염(신장의 모세혈관의 염증), 크론병, 궤양성 대장염, 복강병, 또는 다른 특발성 염증성 장질병, 및 알레르기 천식을 포함한다.
자가면역 질병은 전신 홍반 루푸스, 사구체신염, 류마티스 관절염, 다발경화증, 및 타입 1 당뇨병을 포함한다.
대사 결핍은 페닐케톤뇨증(PKU), 아데노신 데아미나제 결핍-중증 복합 면역결핍(ADA-SCID), 미토콘드리아 신경위장 뇌병증(MNGIE), 원발성 과옥살산뇨증, 알캅톤뇨증, 및 혈전 저혈소판혈증 자색반병(TTP)을 포함한다.
예시적인 추가 특징 및 구현예가 하기에 제공된다:
1. 외인성 단백질을 인코딩하는 핵산, 예를 들어, mRNA를 포함하는 적혈구 세포를 제조하는 방법으로서,
a) 성숙 단계의 적혈구 세포를 제공하는 단계, 및
b) 적혈구 세포에 의한 핵산, 예를 들어, mRNA의 흡수를 가능하게 하는 조건하에서 외인성 단백질을 인코딩하는 핵산, 예를 들어, mRNA와 적혈구 세포를 접촉시킴으로써, 외인성 단백질을 인코딩하는 핵산, 예를 들어, mRNA를 포함하는 적혈구 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
2. 구현예 1에 있어서, 적혈구 세포가 외인성 단백질을 인코딩하는 핵산, 예를 들어, mRNA를 흡수하는 방법.
3. 구현예 1에 있어서, 성숙 단계의 적혈구 세포의 집단을 제공하는 단계 및 적혈구 세포 집단의 복수의 세포와 외인성 단백질을 인코딩하는 핵산, 예를 들어, mRNA를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
4. 구현예 3에 있어서, 적혈구 세포 집단의 복수의 세포가 각각 외인성 단백질을 인코딩하는 핵산, 예를 들어, mRNA를 흡수하는 방법.
5. 구현예 1 내지 구현예 4 중 임의의 구현예에서, 외인성 단백질을 인코딩하는 핵산, 예를 들어, mRNA의 흡수 후, 세포 또는 복수의 세포가 외인성 단백질을 발현하는 방법.
6. 구현예 5에 있어서, 세포 또는 복수의 세포가 외인성 단백질을 포함하는 방법.
7. 구현예 3 내지 구현예 6 중 임의의 구현예에서, 성숙 단계의 적혈구 세포의 집단이 3 내지 7일, 예를 들어, 4 내지 5일 또는 4 내지 6일 동안 성숙 배지에서 확장된 세포의 집단인 방법.
8. 외인성 단백질을 발현하는 망상적혈구의 집단을 제조하는 방법으로서,
(a) 적혈구 전구 세포(예를 들어, CD34+ 세포)의 집단을 제공하는 단계;
(b) 분화하는 적혈구 세포의 집단을 제공하는 분화 조건하에서 적혈구 전구 세포의 집단을 배양하는 단계;
(c) 분화하는 적혈구 세포 집단의 복수의 세포에 의한 핵산, 예를 들어, mRNA의 흡수를 가능하게 하는 조건하에서 외인성 단백질을 인코딩하는 핵산, 예를 들어, mRNA와 분화하는 적혈구 세포 집단의 복수의 세포를 접촉시키는 단계; 및
(d) 분화하는 적혈구 세포 집단의 복수의 세포를 추가로 배양하여 망상적혈구 집단을 제공함으로써, 외인성 단백질을 발현하는 망상적혈구 집단을 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
9. 구현예 8에 있어서, 추가 배양이 3, 2, 또는 1회 미만의 집단 배가를 포함하는 방법.
10. 구현예 3 내지 구현예 9 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 하기 특성 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21개 이상)을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법:
i.a) 집단 내의 세포의 2 내지 40%, 3 내지 33%, 5 내지 30%, 10 내지 25%, 또는 15 내지 20%가 제핵되거나;
i.b) 집단 내의 세포의 0%, 0.1%, 0.2%, 또는 0.5% 초과이나, 2%, 3%, 4%, 또는 5% 미만이 제핵되거나;
i.c) 집단 내의 세포의 0%, 0.1%, 0.2%, 또는 0.5% 초과이나, 6%, 10%, 15%, 20%, 또는 25% 미만이 제핵되거나;
i.d) 집단 내의 세포의 0%, 0.1%, 0.2%, 또는 0.5% 초과이나, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 미만이 제핵되거나;
i.e) 집단 내의 세포의 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 15%, 또는 20% 이하가 제핵되거나;
i.f) 집단 내의 세포의 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 이하가 제핵되거나;
i.g) 세포의 집단이 최대 제핵의 6 내지 70%, 10 내지 60%, 20 내지 50%, 또는 30 내지 40%에 도달하거나;
i.h) 세포의 집단이 최대 제핵의 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 15%, 또는 20% 이하에 도달하거나;
i.i) 세포의 집단이 최대 제핵의 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 또는 60% 이하에 도달하거나;
ii.a) 세포의 집단이 세포 분열에서 플래토로부터 3, 2, 또는 1회 미만으로 집단 배가하거나;
ii.b) 세포의 집단이 3, 2, 또는 1회 미만으로 집단 배가할 수 있거나;
ii.c) 집단이 집단 내의 세포의 적어도 70%의 제핵 수준에 도달하기 전에 집단이 1.5, 2, 또는 3배 이하만큼 증가하거나;
iii.a) 집단 내의 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)이거나;
iii.b) 집단 내의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 또는 79%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)이거나;
iii.c) 집단 내의 세포의 30 내지 90%, 40 내지 90%, 50 내지 90%, 60 내지 90%, 또는 70 내지 90%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)이거나;
iii.d) 집단 내의 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)의 형태를 나타내거나;
iii.e) 집단 내의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 또는 79%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)의 형태를 나타내거나;
iii.f) 집단 내의 세포의 30 내지 90%, 40 내지 90%, 50 내지 90%, 60 내지 90%, 또는 70 내지 90%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)의 형태를 나타내거나;
iv.a) 세포의 집단이 최대 번역 활성의 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90%를 갖거나;
iv.b) 세포의 집단이 최대 번역 활성의 적어도 20%, 30%, 40%, 또는 50%를 갖거나;
iv.c) 세포의 집단이 BONCAT 검정, 예를 들어, 실시예 10의 번역 검정에 의해 측정시 적어도 600,000, 800,000, 1,000,000, 1,200,000, 1,400,000, 1,600,000, 1,800,000, 2,000,000, 2,200,000, 또는 2,400,000의 번역 활성을 갖거나;
iv. d) 세포의 집단이 BONCAT 검정, 예를 들어, 실시예 10의 번역 검정에 의해 측정시 600,000 내지 2,400,000, 800,000 내지 2,200,000, 1,000,000 내지 2,000,000, 1,200,000 내지 1,800,000, 또는 1,400,000 내지 1,600,000의 번역 활성을 갖는다.
11. 구현예 10에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i로부터의 특성 및 ii로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
12. 구현예 10에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i로부터의 특성 및 iii로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
13. 구현예 10에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i로부터의 특성 및 iv로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
14. 구현예 10에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 ii로부터의 특성 및 iii로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
15. 구현예 10에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 ii로부터의 특성 및 iv로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
16. 구현예 10에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii로부터의 특성 및 iv로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
17. 구현예 10에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i로부터의 특성, ii로부터의 특성, 및 iii로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
18. 구현예 10에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i로부터의 특성, ii로부터의 특성, 및 iv로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
19. 구현예 10에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i로부터의 특성, iii로부터의 특성, 및 iv로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
20. 구현예 10에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 ii로부터의 특성, iii로부터의 특성, 및 iv로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
21. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.a 및 ii.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
22. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.b 및 ii.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
23. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.c 및 ii.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
24. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.d 및 ii.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
25. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.e 및 ii.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
26. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.f 및 ii.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
27. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.g 및 ii.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
28. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.h 및 ii.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
29. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.i 및 ii.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
30. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.a 및 ii.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
31. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.b 및 ii.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
32. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.c 및 ii.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
33. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.d 및 ii.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
34. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.e 및 ii.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
35. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.f 및 ii.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
36. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.g 및 ii.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
37. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.h 및 ii.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
38. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.i 및 ii.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
39. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.a 및 ii.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
40. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.b 및 ii.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
41. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.c 및 ii.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
42. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.d 및 ii.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
43. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.e 및 ii.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
44. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.f 및 ii.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
45. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.g 및 ii.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
46. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.h 및 ii.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
47. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.i 및 ii.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
48. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.a 및 iii.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
49. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.b 및 iii.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
50. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.c 및 iii.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
51. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.d 및 iii.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
52. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.e 및 iii.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
53. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.f 및 iii.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
54. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.g 및 iii.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
55. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.h 및 iii.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
56. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.i 및 iii.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
57. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.a 및 iii.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
58. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.b 및 iii.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
59. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.c 및 iii.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
60. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.d 및 iii.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
61. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.e 및 iii.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
62. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.f 및 iii.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
63. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.g 및 iii.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
64. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.h 및 iii.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
65. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.i 및 iii.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
66. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.a 및 iii.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
67. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.b 및 iii.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
68. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.c 및 iii.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
69. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.d 및 iii.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
70. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.e 및 iii.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
71. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.f 및 iii.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
72. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.g 및 iii.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
73. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.h 및 iii.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
74. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.i 및 iii.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
75. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.a 및 iii.d의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
76. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.b 및 iii.d의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
77. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.c 및 iii.d의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
78. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.d 및 iii.d의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
79. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.e 및 iii.d의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
80. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.f 및 iii.d의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
81. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.g 및 iii.d의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
82. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.h 및 iii.d의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
83. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.i 및 iii.d의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
84. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.a 및 iii.e의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
85. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.b 및 iii.e의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
86. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.c 및 iii.e의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
87. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.d 및 iii.e의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
88. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.e 및 iii.e의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
89. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.f 및 iii.e의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
90. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.g 및 iii.e의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
91. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.h 및 iii.e의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
92. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.i 및 iii.e의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
93. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.a 및 iii.f의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
94. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.b 및 iii.f의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
95. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.c 및 iii.f의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
96. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.d 및 iii.f의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
97. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.e 및 iii.f의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
98. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.f 및 iii.f의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
99. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.g 및 iii.f의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
100. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.h 및 iii.f의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
101. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.i 및 iii.f의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
102. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.a 및 iv.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
103. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.b 및 iv.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
104. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.c 및 iv.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
105. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.d 및 iv.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
106. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.e 및 iv.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
107. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.f 및 iv.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
108. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.g 및 iv.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
109. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.h 및 iv.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
110. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.i 및 iv.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
111. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.a 및 iv.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
112. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.b 및 iv.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
113. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.c 및 iv.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
114. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.d 및 iv.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
115. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.e 및 iv.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
116. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.f 및 iv.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
117. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.g 및 iv.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
118. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.h 및 iv.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
119. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.i 및 iv.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
120. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.a 및 iv.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
121. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.b 및 iv.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
122. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.c 및 iv.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
123. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.d 및 iv.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
124. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.e 및 iv.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
125. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.f 및 iv.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
126. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.g 및 iv.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
127. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.h 및 iv.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
128. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.i 및 iv.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
129. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.a 및 iv.d의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
130. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.b 및 iv.d의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
131. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.c 및 iv.d의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
132. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.d 및 iv.d의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
133. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.e 및 iv.d의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
134. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.f 및 iv.d의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
135. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.g 및 iv.d의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
136. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.h 및 iv.d의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
137. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i.i 및 iv.d의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
138. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.a 및 ii.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
139. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.b 및 ii.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
140. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.c 및 ii.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
141. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.d 및 ii.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
142. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.e 및 ii.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
143. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.f 및 ii.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
144. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.a 및 ii.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
145. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.b 및 ii.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
146. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.c 및 ii.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
147. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.d 및 ii.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
148. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.e 및 ii.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
149. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.f 및 ii.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
150. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.a 및 ii.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
151. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.b 및 ii.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
152. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.c 및 ii.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
153. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.d 및 ii.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
154. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.e 및 ii.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
155. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.f 및 ii.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
156. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.a 및 iv.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
157. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.b 및 iv.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
158. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.c 및 iv.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
159. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.d 및 iv.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
160. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.e 및 iv.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
161. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.f 및 iv.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
162. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.a 및 iv.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
163. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.b 및 iv.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
164. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.c 및 iv.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
165. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.d 및 iv.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
166. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.e 및 iv.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
167. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.f 및 iv.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
168. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.a 및 iv.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
169. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.b 및 iv.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
170. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.c 및 iv.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
171. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.d 및 iv.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
172. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.e 및 iv.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
173. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.f 및 iv.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
174. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.a 및 iv.d의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
175. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.b 및 iv.d의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
176. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.c 및 iv.d의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
177. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.d 및 iv.d의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
178. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.e 및 iv.d의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
179. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii.f 및 iv.d의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
180. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 ii.a 및 iv.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
181. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 ii.b 및 iv.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
182. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 ii.c 및 iv.a의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
183. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 ii.a 및 iv.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
184. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 ii.b 및 iv.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
185. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 ii.c 및 iv.b의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
186. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 ii.a 및 iv.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
187. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 ii.b 및 iv.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
188. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 ii.c 및 iv.c의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
189. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 ii.a 및 iv.d의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
190. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 ii.b 및 iv.d의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
191. 구현예 10 내지 구현예 20 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 ii.c 및 iv.d의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
192. 구현예 3 내지 구현예 191 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이, 예를 들어, 유세포분석 검정, 예를 들어, 실시예 10의 유세포분석 검정에 의해 측정시 집단 내의 세포의 84 내지 99%, 85 내지 95%, 또는 약 90%가 GPA-양성인 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
193. 구현예 3 내지 구현예 191 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이, 예를 들어, 유세포분석 검정, 예를 들어, 실시예 10의 유세포분석 검정에 의해 측정시 집단 내의 세포의 적어도 84%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%가 GPA-양성인 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
194. 구현예 3 내지 구현예 191 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이, 예를 들어, 유세포분석 검정, 예를 들어, 실시예 10의 유세포분석 검정에 의해 측정시 집단 내의 세포의 54 내지 99%, 55 내지 98%, 60 내지 95%, 65 내지 90%, 70 내지 85%, 또는 75 내지 80%가 band3-양성인 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
195. 구현예 3 내지 구현예 191 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이, 예를 들어, 유세포분석 검정, 예를 들어, 실시예 10의 유세포분석 검정에 의해 측정시 집단 내의 세포의 적어도 54%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%가 band3-양성인 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
196. 구현예 3 내지 구현예 191 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이, 예를 들어, 유세포분석 검정, 예를 들어, 실시예 10의 유세포분석 검정에 의해 측정시 집단 내의 세포의 96 내지 100%, 97 내지 99%, 또는 약 98%가 alpha4 인테그린-양성인 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
197. 구현예 3 내지 구현예 191 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이, 예를 들어, 유세포분석 검정, 예를 들어, 실시예 10의 유세포분석 검정에 의해 측정시 집단 내의 세포의 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 alpha4 인테그린-양성인 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
198. 구현예 3 내지 구현예 197 중 임의의 구현예에서, 복수의 세포와 외인성 단백질을 인코딩하는 핵산, 예를 들어, mRNA를 접촉시키기 전 또는 후에, 복수의 세포가 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단으로부터 분리되고, 예를 들어, 복수의 세포가 제핵 상태를 기초로 하여 집단으로부터 분리(예를 들어, 복수의 세포는 유핵 세포이고, 집단의 나머지는 제핵 세포임)되는 방법.
199. 구현예 3 내지 구현예 197 중 임의의 구현예에서, 복수의 세포와 외인성 단백질을 인코딩하는 핵산, 예를 들어, mRNA를 접촉시키기 전 또는 후에, 예를 들어, 집단과 제핵의 억제제(예를 들어, 히스톤 데아세틸라제(HDAC)의 억제제, 미토겐-활성화 단백질 키나제(MAPK)의 억제제, 사이클린-의존성 키나제(CDK)의 억제제, 또는 프로테아솜 억제제)를 인큐베이션함으로써, 예를 들어, 집단의 성장, 발달, 헤모글로빈 합성, 또는 제핵 과정을 정지시킴으로써 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단을 동기화시키는 단계를 포함하는 방법.
200. 구현예 199에 있어서, 정지가 집단 내의 세포의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10% 초과의 제핵 전에 발생하는 방법.
201. 외인성 단백질을 발현하는 망상적혈구의 집단을 제조하는 방법으로서,
(e) 적혈구 전구 세포(예를 들어, CD34+ 세포)의 집단을 제공하는 단계;
(f) 분화하는 적혈구 세포의 집단을 제공하는 분화 조건하에서 적혈구 전구 세포의 집단을 배양하는 단계;
(g) 분화하는 적혈구 세포에 의한 mRNA의 흡수를 가능하게 하는 조건하에서 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA와 분화하는 적혈구 세포를 접촉시키는 단계로서, 분화하는 적혈구 세포의 집단이 0.1 내지 25%가 제핵(예를 들어, 0.1 내지 20%가 제핵되거나, 0.1 내지 15%가 제핵되거나, 0.1 내지 12%가 제핵되거나, 0.1 내지 10%가 제핵됨)되는 경우에 접촉이 수행되는, 단계; 및
(h) 분화하는 적혈구 세포를 추가로 배양하여 망상적혈구 집단을 제공함으로써, 외인성 단백질을 발현하는 망상적혈구 집단을 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
202. 구현예 201에 있어서, 추가 배양이 3, 2, 또는 1회 미만의 집단 배가를 포함하는 방법.
203. 구현예 201 또는 구현예 202에 있어서, 분화하는 적혈구 세포의 적어도 50%(적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 또는 95%)가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)의 형태를 나타나는 경우에 접촉이 수행되는 방법.
204. 외인성 단백질을 발현하는 망상적혈구의 집단을 제조하는 방법으로서, (a) 적혈구 전구 세포의 집단을 제공하는 단계, (b) 분화하는 적혈구 세포의 집단을 제공하는 분화 조건하에서 적혈구 전구 세포의 집단을 배양하는 단계, (c) 분화하는 적혈구 세포와 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 접촉시키는 단계로서, 분화하는 적혈구 세포의 집단이 0.1 내지 25%가 제핵(예를 들어, 0.1 내지 20%가 제핵되거나, 0.1 내지 15%가 제핵되거나, 0.1 내지 12%가 제핵되거나, 0.1 내지 10%가 제핵됨)되는 경우에 접촉이 수행되는, 단계를 포함하는, 방법.
205. 구현예 204에 있어서, 분화하는 적혈구 세포의 집단이 세포 분열에서 플래토 전에 3, 2, 또는 1회 미만의 집단 배가를 갖는 경우에 접촉이 수행되는 방법.
206. 구현예 204 또는 구현예 205에 있어서, 분화하는 적혈구 세포의 적어도 50%(적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 또는 95%)가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)의 형태를 나타나는 경우에 접촉이 수행되는 방법.
207. 이종성 비번역 영역(UTR)에 작동 가능하게 연결된 코딩 영역을 포함하는 외인성 mRNA를 포함하는 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포로서, 이종성 UTR이 조절 요소를 포함하는, 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포.
208. 표 1의 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 표 2의 하나 이상의 화학적 백본 변형, 표 3의 하나 이상의 화학적으로 변형된 캡, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 외인성 mRNA를 포함하는 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포.
209. 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포를 생성하는 방법으로서,
a) 적혈구 세포, 예를 들어, 유핵 적혈구 세포와 조절 요소를 포함하는 이종성 UTR에 작동 가능하게 연결된 코딩 영역을 포함하는 외인성 mRNA(예를 들어, 분리된 RNA 또는 시험관 내 전사된 RNA)를 접촉시키는 단계, 및
b) 외인성 mRNA의 흡수에 적합한 조건하에서 접촉된 적혈구 세포를 유지시킴으로써 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
210. 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포를 생성하는 방법으로서,
a) 적혈구 세포, 예를 들어, 유핵 적혈구 세포와 표 1의 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 표 2의 하나 이상의 화학적 백본 변형, 표 3의 하나 이상의 화학적으로 변형된 캡, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 외인성 mRNA를 접촉시키는 단계; 및
b) 외인성 mRNA의 흡수에 적합한 조건하에서 접촉된 적혈구 세포를 유지시킴으로써 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
211. 제핵 적혈구 세포에서 외인성 단백질을 생성하는 방법으로서,
a) 조절 요소를 포함하는 이종성 UTR에 작동 가능하게 연결된 코딩 영역을 포함하는 외인성 mRNA(예를 들어, 분리된 RNA 또는 시험관 내 전사된 RNA)를 포함하는 적혈구 세포, 예를 들어, 유핵 적혈구 세포를 제공하는 단계, 및
b) 외인성 단백질의 생성에 적합한 조건하에서 적혈구 세포를 배양함으로써 외인성 단백질을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
212. 제핵 적혈구 세포에서 외인성 단백질을 생성하는 방법으로서,
a) 표 1의 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 표 2의 하나 이상의 화학적 백본 변형, 표 3의 하나 이상의 화학적으로 변형된 캡, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 적혈구 세포, 예를 들어, 유핵 적혈구 세포를 제공하는 단계, 및
b) 외인성 단백질의 생성에 적합한 조건하에서 적혈구 세포를 배양함으로써 외인성 단백질을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
213. 조절 요소를 포함하는 이종성 UTR에 작동 가능하게 연결된 코딩 영역을 포함하는 외인성 mRNA(예를 들어, 분리된 RNA 또는 시험관 내 전사된 RNA)를 포함하는 적혈구 세포, 예를 들어, 유핵 적혈구 세포를 대상체에 투여함으로써 대상체에 외인성 단백질을 제공하거나, 대상체에 외인성 단백질을 생성할 수 있는 제핵 적혈구 세포를 제공하거나, 대상체를 치료하는 단계를 포함하는,
대상체에 외인성 단백질을 제공하거나, 대상체에 외인성 단백질을 생성할 수 있는 제핵 적혈구 세포를 제공하거나, 대상체를 치료하는 방법.
214. 표 1의 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 표 2의 하나 이상의 화학적 백본 변형, 표 3의 하나 이상의 화학적으로 변형된 캡, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 외인성 mRNA를 포함하는 적혈구 세포, 예를 들어, 유핵 적혈구 세포를 대상체에 투여함으로써 대상체에 외인성 단백질을 제공하거나, 대상체에 외인성 단백질을 생성할 수 있는 제핵 적혈구 세포를 제공하거나, 대상체를 치료하는 단계를 포함하는,
대상체에 외인성 단백질을 제공하거나, 대상체에 외인성 단백질을 생성할 수 있는 제핵 적혈구 세포를 제공하거나, 대상체를 치료하는 방법.
215. 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포(또는 상기 세포의 배치(batch))를 평가하는 방법으로서,
a) 조절 요소를 포함하는 이종성 UTR에 작동 가능하게 연결된 코딩 영역을 포함하는 외인성 mRNA를 포함하는 적혈구 세포, 예를 들어, 유핵 적혈구 세포(또는 상기 세포의 배치)를 제공하는 단계, 및
b) 미리 선택된 파라미터에 대해 적혈구 세포, 예를 들어, 유핵 적혈구 세포(또는 상기 세포의 배치)를 평가함으로써 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포(또는 상기 세포의 배치)를 평가하는 단계를 포함하는, 방법.
216. 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포(또는 상기 세포의 배치)를 평가하는 방법으로서,
a) 표 1의 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 표 2의 하나 이상의 화학적 백본 변형, 표 3의 하나 이상의 화학적으로 변형된 캡, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 적혈구 세포, 예를 들어, 유핵 적혈구 세포를 제공하는 단계, 및
b) 미리 선택된 파라미터에 대해 적혈구 세포, 예를 들어, 유핵 적혈구 세포(또는 상기 세포의 배치)를 평가함으로써 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포(또는 상기 세포의 배치)를 평가하는 단계를 포함하는, 방법.
217. 구현예 207에 있어서, 집단 내의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%가, 예를 들어, mRNA와의 접촉 5일 후에 외인성 단백질을 포함하는 방법.
218. 구현예 207에 있어서, 집단 내의 세포가, 예를 들어, mRNA와의 접촉 5일 후에 외인성 단백질의 적어도 1,000, 2,000, 5,000, 10,000, 20,000, 50,000, 또는 100,000개의 카피를 포함하는 방법.
219. 구현예 207에 있어서, 세포가 mRNA와의 접촉 후 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15일 동안 외인성 단백질의 적어도 1,000, 2,000, 5,000, 10,000, 20,000, 50,000, 또는 100,000개의 카피를 포함하는 방법.
220. 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하는 적혈구 세포를 제조하는 방법으로서,
mRNA의 분해를 억제하는 조건, 예를 들어, 반응 혼합물 중에 리보뉴클레아제 억제제의 포함에 의한 조건하에서 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA 및 적혈구 세포를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계, 및
적혈구 세포에 의한 mRNA의 흡수를 가능하게 하는 조건하에서 반응 혼합물을 유지시킴으로써 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하는 적혈구 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
221. 구현예 220에서, 적혈구 세포의 집단을 제공하는 단계 및 상기 집단과 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
222. 구현예 220 또는 구현예 221에 있어서, 집단의 복수의 적혈구 세포가 각각 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 흡수하는 방법.
223. 구현예 220 내지 구현예 222 중 임의의 구현예에서, 세포 또는 복수의 세포가 외인성 단백질을 발현하는 방법.
224. 구현예 220 내지 구현예 223 중 임의의 구현예에서, 세포 또는 복수의 세포가 외인성 단백질을 포함하는 방법.
225. 구현예 220 내지 구현예 224 중 임의의 구현예에서, 세포 또는 세포 집단을 전기천공하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
226. 구현예 220 내지 구현예 225 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단과 리보뉴클레아제 억제제를 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
227. 구현예 220 내지 구현예 226 중 임의의 구현예에서, 세포와 mRNA를 접촉시키기 전, 접촉시키는 동안, 또는 접촉시킨 후에 세포 집단과 리보뉴클레아제 억제제를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
228. 구현예 220 내지 구현예 227 중 임의의 구현예에서, 성숙 단계 4, 5, 또는 6일에서 세포와 리보뉴클레아제 억제제를 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
229. 구현예 220 내지 구현예 228 중 임의의 구현예에서, 세포가 성숙 단계의 세포인 방법.
230. 구현예 220 내지 구현예 229 중 임의의 구현예에서, 세포가 하기 특성 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21개 이상)을 포함하는 경우에 세포와 리보뉴클레아제 억제제를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법:
i.a) 집단 내의 세포의 2 내지 40%, 3 내지 33%, 5 내지 30%, 10 내지 25%, 또는 15 내지 20%가 제핵되거나;
i.b) 집단 내의 세포의 0%, 0.1%, 0.2%, 또는 0.5% 초과이나, 2%, 3%, 4%, 또는 5% 미만이 제핵되거나;
i.c) 집단 내의 세포의 0%, 0.1%, 0.2%, 또는 0.5% 초과이나, 6%, 10%, 15%, 20%, 또는 25% 미만이 제핵되거나;
i.d) 집단 내의 세포의 0%, 0.1%, 0.2%, 또는 0.5% 초과이나, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 미만이 제핵되거나;
i.e) 집단 내의 세포의 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 15%, 또는 20% 이하가 제핵되거나;
i.f) 집단 내의 세포의 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 이하가 제핵되거나;
i.g) 세포의 집단이 최대 제핵의 6 내지 70%, 10 내지 60%, 20 내지 50%, 또는 30 내지 40%에 도달하거나;
i.h) 세포의 집단이 최대 제핵의 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 15%, 또는 20% 이하에 도달하거나;
i.i) 세포의 집단이 최대 제핵의 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 또는 60% 이하에 도달하거나;
ii.a) 세포의 집단이 세포 분열에서 플래토로부터 3, 2, 또는 1회 미만으로 집단 배가하거나;
ii.b) 세포의 집단이 3, 2, 또는 1회 미만으로 집단 배가할 수 있거나;
ii.c) 집단이 집단 내의 세포의 적어도 70%의 제핵 수준에 도달하기 전에 집단이 1.5, 2, 또는 3배 이하만큼 증가하거나;
iii.a) 집단 내의 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)이거나;
iii.b) 집단 내의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 또는 79%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)이거나;
iii.c) 집단 내의 세포의 30 내지 90%, 40 내지 90%, 50 내지 90%, 60 내지 90%, 또는 70 내지 90%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)이거나;
iii.d) 집단 내의 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)의 형태를 나타내거나;
iii.e) 집단 내의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 또는 79%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)의 형태를 나타내거나;
iii.f) 집단 내의 세포의 30 내지 90%, 40 내지 90%, 50 내지 90%, 60 내지 90%, 또는 70 내지 90%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)의 형태를 나타내거나;
iv.a) 세포의 집단이 최대 번역 활성의 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90%를 갖거나;
iv.b) 세포의 집단이 최대 번역 활성의 적어도 20%, 30%, 40%, 또는 50%를 갖거나;
iv.c) 세포의 집단이 BONCAT 검정, 예를 들어, 실시예 10의 번역 검정에 의해 측정시 적어도 600,000, 800,000, 1,000,000, 1,200,000, 1,400,000, 1,600,000, 1,800,000, 2,000,000, 2,200,000, 또는 2,400,000의 번역 활성을 갖거나;
iv. d) 세포의 집단이 BONCAT 검정, 예를 들어, 실시예 10의 번역 검정에 의해 측정시 600,000 내지 2,400,000, 800,000 내지 2,200,000, 1,000,000 내지 2,000,000, 1,200,000 내지 1,800,000, 또는 1,400,000 내지 1,600,000의 번역 활성을 갖는다.
231. 구현예 230에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i로부터의 특성 및 ii로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
232. 구현예 230에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i로부터의 특성 및 iii로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
233. 구현예 230에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i로부터의 특성 및 iv로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
234. 구현예 230에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 ii로부터의 특성 및 iii로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
235. 구현예 230에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 ii로부터의 특성 및 iv로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
236. 구현예 230에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii로부터의 특성 및 iv로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
237. 구현예 230에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i로부터의 특성, ii로부터의 특성, 및 iii로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
238. 구현예 230에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i로부터의 특성, ii로부터의 특성, 및 iv로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
239. 구현예 230에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i로부터의 특성, iii로부터의 특성, 및 iv로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
240. 구현예 230에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 ii로부터의 특성, iii로부터의 특성, 및 iv로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
241. 구현예 220 내지 구현예 240 중 임의의 구현예에서, 세포가 하기 특성 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5개 이상)을 포함하는 경우(예를 들어, 유세포분석 검정, 예를 들어, 실시예 10의 유세포분석 검정에 의함)에 세포와 리보뉴클레아제 억제제를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법:
집단 내의 세포의 84 내지 99%, 85 내지 95%, 또는 약 90%가 GPA-양성이거나;
집단 내의 세포의 적어도 84%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%가 GPA-양성이거나;
집단 내의 세포의 54 내지 99%, 55 내지 98%, 60 내지 95%, 65 내지 90%, 70 내지 85%, 또는 75 내지 80%가 band3-양성이거나;
집단 내의 세포의 적어도 54%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%가 band3-양성이거나;
집단 내의 세포의 96 내지 100%, 97 내지 99%, 또는 약 98%가 alpha4 인테그린-양성이거나;
집단 내의 세포의 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 alpha4 인테그린-양성이다.
242. 구현예 220 내지 구현예 241 중 임의의 구현예에서, mRNA가 시험관 내 전사된 mRNA인 방법.
243. 구현예 220 내지 구현예 242 중 임의의 구현예에서, 집단의 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 95%가, 세포가 mRNA와 접촉된 지 5일 후에 생존 가능한 방법.
244. 구현예 220 내지 구현예 243 중 임의의 구현예에서, 집단의 세포의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%가, 세포가 mRNA와 접촉된 지 5일 후에 제핵되는 방법.
245. 구현예 220 내지 구현예 244 중 임의의 구현예에서, 세포가 mRNA와 접촉된 지 5일 후에 제핵되는 세포의 비율이 리보뉴클레아제 억제제로 처리되지 않은 달리 유사한 세포 집단에서 제핵되는 세포의 비율의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%인 방법.
246. 구현예 220 내지 구현예 245 중 임의의 구현예에서, 세포의 집단이, 세포가 mRNA와 접촉시에 적어도 1×106, 2×106, 5×106, 1×107, 2×107, 5×107, 또는 1×108개의 세포를 포함하는 방법.
247. 구현예 220 내지 구현예 246 중 임의의 구현예에서, 세포의 집단이, 세포가 mRNA와 접촉된 후 5일 이내에 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%만큼 확장되는 방법.
248. 구현예 220 내지 구현예 247 중 임의의 구현예에서, 집단의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%가, 예를 들어, 세포가 mRNA와 접촉된 지 5일 후에 외인성 단백질을 발현하는 방법.
249. 구현예 220 내지 구현예 248 중 임의의 구현예에서, 집단의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%가, 예를 들어, 세포가 mRNA와 접촉된 지 5일 후에 외인성 단백질의 적어도 1,000, 2,000, 5,000, 10,000, 20,000, 50,000, 또는 100,000개의 카피를 포함하는 방법.
250. 구현예 220 내지 구현예 249 중 임의의 구현예에서, 세포의 집단이 리보뉴클레아제 억제제로 처리되지 않은 달리 유사한 세포 집단보다 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이상, 또는 적어도 2배, 3배, 4배, 또는 5배 더 많은 외인성 단백질을 포함하는 방법.
251. i) 적혈구 세포, ii) 외인성 단백질을 포함하는 mRNA 및 iii) 리보뉴클레아제 억제제를 포함하는 반응 혼합물.
252. 구현예 251에 있어서, mRNA가 적혈구 세포 내에 있는 반응 혼합물.
253. 구현예 251 또는 구현예 252에 있어서, 복수의 적혈구 세포를 포함하는 반응 혼합물.
254. 리보뉴클레아제 억제제에 대한 외인성 단백질을 포함하는 제핵 적혈구 세포를 포함하는 반응 혼합물을 검정하는 방법으로서,
외인성 단백질을 포함하는 제핵 적혈구 세포를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계, 및
예를 들어, 반응 혼합물의 분취액에서, 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 질량분광법에 의해 리보뉴클레아제 억제제의 존재 또는 수준을 검정하는 단계를 포함하는, 방법.
255. 구현예 254에 있어서, 리보뉴클레아제 억제제의 수준을 참조 값과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
256. 구현예 255에 있어서, 상기 비교에 반응하여,
집단을, 예를 들어, 필요조건을 충족하거나 필요조건을 충족하지 않는 것으로 분류하는 단계로서, 예를 들어, 리보뉴클레아제 억제제의 수준이 참조 값 아래인 경우에 필요조건이 충족되는 단계,
예를 들어, 리보뉴클레아제 억제제의 수준이 참조 값보다 위인 경우에 집단이 이후 정제 단계에 적합한 경우와 같이 집단을 이후의 처리 단계에 적합하거나 적합하지 않은 것으로 분류하는 단계,
집단을 치료제로 사용하기에 적합하거나 적합하지 않은 것으로 분류하는 단계, 또는
예를 들어, 리보뉴클레아제 억제제의 수준이 참조 값 아래인 경우에 집단 또는 이의 분취액을 치료제로 사용하기 위해 제형화하거나 패키징하는 단계 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 방법.
257. 구현예 220 내지 구현예 256 중 임의의 구현예에서, 리보뉴클레아제 억제제가 RNAsin Plus, Protector RNAse Inhibitor, 또는 Ribonuclease Inhibitor Huma인 반응 혼합물 또는 방법.
258. 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하는 적혈구 세포를 제조하는 방법으로서,
단백질 분해를 억제하는 조건, 예를 들어, 반응 혼합물 중에 프로테아솜 억제제의 포함에 의한 조건하에서 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA 및 적혈구 세포를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계, 및
적혈구 세포에 의한 mRNA의 흡수를 가능하게 하는 조건하에서 반응 혼합물을 유지시킴으로써 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하는 적혈구 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
259. 구현예 258에 있어서, 적혈구 세포의 집단을 제공하는 단계 및 상기 집단과 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
260. 구현예 258 또는 구현예 259에 있어서, 집단의 복수의 적혈구 세포가 각각 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 흡수하는 방법.
261. 구현예 258 내지 구현예 260 중 임의의 구현예에서, 세포 또는 복수의 세포가 외인성 단백질을 발현하는 방법.
262. 구현예 258 내지 구현예 261 중 임의의 구현예에서, 세포 또는 복수의 세포가 외인성 단백질을 포함하는 방법.
263. 구현예 258 내지 구현예 262 중 임의의 구현예에서, 세포 또는 세포 집단을 전기천공하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
264. 구현예 258 내지 구현예 263 중 임의의 구현예에서, 적혈구 세포의 집단과 프로테아솜 억제제를 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
265. 구현예 258 내지 구현예 264 중 임의의 구현예에서, 세포와 mRNA를 접촉시키기 전, 접촉시키는 동안, 또는 접촉시킨 후, 예를 들어, 세포와 mRNA를 접촉시키기 0.5 내지 2일 전 또는 0.5 내지 2일 후에 세포 집단과 프로테아솜 억제제를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
266. 구현예 258 내지 구현예 265 중 임의의 구현예에서, 성숙 단계 4, 5, 또는 6일에서 세포와 프로테아솜 억제제를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
267. 구현예 258 내지 구현예 266 중 임의의 구현예에서, 세포가 성숙 단계의 세포인 방법.
268. 구현예 258 내지 구현예 267 중 임의의 구현예에서, 세포가 하기 특성 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21개 이상)을 포함하는 경우에 세포와 프로테아솜 억제제를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법:
i.a) 집단 내의 세포의 2 내지 40%, 3 내지 33%, 5 내지 30%, 10 내지 25%, 또는 15 내지 20%가 제핵되거나;
i.b) 집단 내의 세포의 0%, 0.1%, 0.2%, 또는 0.5% 초과이나, 2%, 3%, 4%, 또는 5% 미만이 제핵되거나;
i.c) 집단 내의 세포의 0%, 0.1%, 0.2%, 또는 0.5% 초과이나, 6%, 10%, 15%, 20%, 또는 25% 미만이 제핵되거나;
i.d) 집단 내의 세포의 0%, 0.1%, 0.2%, 또는 0.5% 초과이나, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 미만이 제핵되거나;
i.e) 집단 내의 세포의 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 15%, 또는 20% 이하가 제핵되거나;
i.f) 집단 내의 세포의 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 이하가 제핵되거나;
i.g) 세포의 집단이 최대 제핵의 6 내지 70%, 10 내지 60%, 20 내지 50%, 또는 30 내지 40%에 도달하거나;
i.h) 세포의 집단이 최대 제핵의 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 15%, 또는 20% 이하에 도달하거나;
i.i) 세포의 집단이 최대 제핵의 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 또는 60% 이하에 도달하거나;
ii.a) 세포의 집단이 세포 분열에서 플래토로부터 3, 2, 또는 1회 미만으로 집단 배가하거나;
ii.b) 세포의 집단이 3, 2, 또는 1회 미만으로 집단 배가할 수 있거나;
ii.c) 집단이 집단 내의 세포의 적어도 70%의 제핵 수준에 도달하기 전에 집단이 1.5, 2, 또는 3배 이하만큼 증가하거나;
iii.a) 집단 내의 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)이거나;
iii.b) 집단 내의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 또는 79%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)이거나;
iii.c) 집단 내의 세포의 30 내지 90%, 40 내지 90%, 50 내지 90%, 60 내지 90%, 또는 70 내지 90%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)이거나;
iii.d) 집단 내의 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)의 형태를 나타내거나;
iii.e) 집단 내의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 또는 79%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)의 형태를 나타내거나;
iii.f) 집단 내의 세포의 30 내지 90%, 40 내지 90%, 50 내지 90%, 60 내지 90%, 또는 70 내지 90%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)의 형태를 나타내거나;
iv.a) 세포의 집단이 최대 번역 활성의 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90%를 갖거나;
iv.b) 세포의 집단이 최대 번역 활성의 적어도 20%, 30%, 40%, 또는 50%를 갖거나;
iv.c) 세포의 집단이 BONCAT 검정, 예를 들어, 실시예 10의 번역 검정에 의해 측정시 적어도 600,000, 800,000, 1,000,000, 1,200,000, 1,400,000, 1,600,000, 1,800,000, 2,000,000, 2,200,000, 또는 2,400,000의 번역 활성을 갖거나;
iv. d) 세포의 집단이 BONCAT 검정, 예를 들어, 실시예 10의 번역 검정에 의해 측정시 600,000 내지 2,400,000, 800,000 내지 2,200,000, 1,000,000 내지 2,000,000, 1,200,000 내지 1,800,000, 또는 1,400,000 내지 1,600,000의 번역 활성을 갖는다.
269. 구현예 268에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i로부터의 특성 및 ii로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
270. 구현예 268에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i로부터의 특성 및 iii로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
271. 구현예 268에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i로부터의 특성 및 iv로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
272. 구현예 268에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 ii로부터의 특성 및 iii로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
273. 구현예 268에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 ii로부터의 특성 및 iv로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
274. 구현예 268에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 iii로부터의 특성 및 iv로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
275. 구현예 268에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i로부터의 특성, ii로부터의 특성, 및 iii로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
276. 구현예 268에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i로부터의 특성, ii로부터의 특성, 및 iv로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
277. 구현예 268에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i로부터의 특성, iii로부터의 특성, 및 iv로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
278. 구현예 268에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 ii로부터의 특성, iii로부터의 특성, 및 iv로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
279. 구현예 258 내지 구현예 278 중 임의의 구현예에서, 세포가 하기 특성 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5개 이상)을 포함하는 경우(예를 들어, 유세포분석 검정, 예를 들어, 실시예 10의 유세포분석 검정에 의함)에 세포와 프로테아솜 억제제를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법:
집단 내의 세포의 84 내지 99%, 85 내지 95%, 또는 약 90%가 GPA-양성이거나;
집단 내의 세포의 적어도 84%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%가 GPA-양성이거나;
집단 내의 세포의 54 내지 99%, 55 내지 98%, 60 내지 95%, 65 내지 90%, 70 내지 85%, 또는 75 내지 80%가 band3-양성이거나;
집단 내의 세포의 적어도 54%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%가 band3-양성이거나;
집단 내의 세포의 96 내지 100%, 97 내지 99%, 또는 약 98%가 alpha4 인테그린-양성이거나;
집단 내의 세포의 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 alpha4 인테그린-양성이다.
280. 구현예 258 내지 구현예 279 중 임의의 구현예에서, mRNA가 시험관 내 전사된 mRNA인 방법.
281. 구현예 258 내지 구현예 280 중 임의의 구현예에서, 집단의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%가, 세포가 mRNA와 접촉된 지 5일 후에 생존 가능한 방법.
282. 구현예 258 내지 구현예 281 중 임의의 구현예에서, 집단의 세포의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%가, 세포가 mRNA와 접촉된 지 5일 후에 제핵되는 방법.
283. 구현예 258 내지 구현예 282 중 임의의 구현예에서, 세포가 mRNA와 접촉된 지 5일 후에 제핵되는 세포의 비율이 프로테아솜 억제제로 처리되지 않은 달리 유사한 세포 집단에서 제핵되는 세포의 비율의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%인 방법.
284. 구현예 258 내지 구현예 283 중 임의의 구현예에서, 세포의 집단이, 세포가 mRNA와 접촉시에 적어도 1×106, 2×106, 5×106, 1×107, 2×107, 5×107, 또는 1×108개의 세포를 포함하는 방법.
285. 구현예 258 내지 구현예 284 중 임의의 구현예에서, 세포의 집단이, 세포가 mRNA와 접촉된 후 5일 이내에 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%만큼 확장되는 방법.
286. 구현예 258 내지 구현예 285 중 임의의 구현예에서, 집단의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%가, 예를 들어, 세포가 mRNA와 접촉된 지 5일 후에 외인성 단백질을 발현하는 방법.
287. 구현예 258 내지 구현예 286 중 임의의 구현예에서, 집단의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%가, 예를 들어, 세포가 mRNA와 접촉된 지 5일 후에 외인성 단백질의 적어도 1,000, 2,000, 5,000, 10,000, 20,000, 50,000, 또는 100,000개의 카피를 포함하는 방법.
288. 구현예 258 내지 구현예 287 중 임의의 구현예에서, 세포의 집단이 프로테아솜 억제제로 처리되지 않은 달리 유사한 세포 집단보다 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이상, 또는 적어도 2배, 3배, 4배, 또는 5배 더 많은 외인성 단백질을 포함하는 방법.
289. i) 적혈구 세포, ii) 외인성 단백질을 포함하는 mRNA 및 iii) 프로테아솜 억제제를 포함하는 반응 혼합물.
290. 구현예 289에 있어서, mRNA가 적혈구 세포 내에 있는 반응 혼합물.
291. 구현예 289 또는 구현예 290에 있어서, 복수의 적혈구 세포를 포함하는 반응 혼합물.
292. 프로테아솜 억제제에 대한 외인성 단백질을 포함하는 제핵 적혈구 세포를 포함하는 반응 혼합물을 검정하는 방법으로서,
외인성 단백질을 포함하는 제핵 적혈구 세포를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계, 및
예를 들어, 반응 혼합물의 분취액에서, 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 질량분광법에 의해 프로테아솜 억제제의 존재 또는 수준을 검정하는 단계를 포함하는, 방법.
293. 구현예 292에 있어서, 프로테아솜 억제제의 수준을 참조 값과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
294. 구현예 293에 있어서, 상기 비교에 반응하여,
집단을, 예를 들어, 필요조건을 충족하거나 필요조건을 충족하지 않는 것으로 분류하는 단계로서, 예를 들어, 프로테아솜 억제제의 수준이 참조 값 아래인 경우에 필요조건이 충족되는 단계,
예를 들어, 프로테아솜 억제제의 수준이 참조 값보다 위인 경우에 집단이 이후 정제 단계에 적합한 경우와 같이 집단을 이후의 처리 단계에 적합하거나 적합하지 않은 것으로 분류하는 단계,
집단을 치료제로 사용하기에 적합하거나 적합하지 않은 것으로 분류하는 단계, 또는
예를 들어, 프로테아솜 억제제의 수준이 참조 값 아래인 경우에 집단 또는 이의 분취액을 치료제로 사용하기 위해 제형화하거나 패키징하는 단계 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 방법.
295. 구현예 258 내지 구현예 294 중 임의의 구현예에서, 프로테아솜 억제제가 20S 프로테아솜 억제제, 예를 들어, MG-132 또는 카르필조밉(carfilzomib), 또는 26S 프로테아솜 억제제, 예를 들어, 보르테조밉(bortezomib)인 반응 혼합물 또는 방법.
296. 제1 외인성 단백질 및 제2 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하는 적혈구 세포를 제조하는 방법으로서,
a) 적혈구 세포, 예를 들어, 성숙 단계의 적혈구 세포를 제공하는 단계, 및
b) 적혈구 세포에 의한 제1 mRNA 및 제2 mRNA의 흡수를 가능하게 하는 조건하에서 제1 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA 및 제2 외인성 단백질을 인코딩하는 제2 mRNA와 적혈구 세포를 접촉시킴으로써 제1 mRNA 및 제2 mRNA를 포함하는 적혈구 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
297. 구현예 296에 있어서, 적혈구 세포가, 예를 들어, mRNA와의 접촉 5일 후에 제1 외인성 단백질 및 제2 외인성 단백질의 적어도 1,000, 2,000, 5,000, 10,000, 20,000, 50,000, 또는 100,000개의 카피를 포함하는 방법.
298. 제1 외인성 단백질 및 제2 외인성 단백질을 발현하는 적혈구 세포의 집단을 생성하는 방법으로서,
a) 적혈구 세포, 예를 들어, 성숙 단계의 적혈구 세포의 집단을 제공하는 단계, 및
b) 제1 단백질을 인코딩하는 제1 mRNA 및 제2 단백질을 인코딩하는 제2 mRNA와 적혈구 세포의 집단을 접촉시킴으로써 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하는 적혈구 세포를 제조하는 단계를 포함하고,
집단 내의 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 제1 mRNA 및 제2 mRNA 둘 모두를 포함하는, 방법.
299. 구현예 298에 있어서, 적혈구 세포의 집단이, 예를 들어, mRNA와의 접촉 5일 후에 세포 당 제1 외인성 단백질 및 제2 외인성 단백질의 평균 적어도 1,000, 2,000, 5,000, 10,000, 20,000, 50,000, 또는 100,000개의 카피를 포함하는 방법.
300. 구현예 296 내지 구현예 299 중 임의의 구현예에서, 접촉 단계가 전기천공을 수행하는 것을 포함하는 방법.
301. 구현예 298 내지 구현예 300 중 임의의 구현예에서, 세포의 집단이, 세포가 제1 및 제2 mRNA와 접촉한 후 적어도 5일 동안 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%에서 제1 외인성 단백질 및 제2 외인성 단백질을 포함하는 방법.
302. 집단 내의 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 제1 외인성 단백질 및 제2 외인성 단백질을 발현하는 적혈구 세포의 집단으로서, 집단이 세포와 제1 또는 제2 외인성 단백질을 인코딩하는 DNA와 접촉시킴으로써 제조되지 않은, 적혈구 세포의 집단.
303. 세포 당 소정의 수의 외인성 단백질의 카피를 포함하는 복수의 적혈구 세포를 생성하는 방법으로서, 집단과 소정량의 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 접촉시킴으로써 소정량의 외인성 단백질을 포함하는 적혈구 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
304. 구현예 303에 있어서, 복수의 적혈구 세포(예를 들어, 제핵 적혈구 세포) 중 하나 이상을 평가하여 외인성 단백질의 양을 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
305. 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포의 샘플에서 외인성 단백질의 양을 평가하는 방법으로서,
집단과 소정량의 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 접촉시킴으로써 제조된 세포 당 소정의 수의 외인성 단백질의 카피를 포함하는 복수의 적혈구 세포를 제공하는 단계, 및
복수의 적혈구 세포에서 외인성 단백질의 양을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
306. 구현예 303 내지 구현예 305 중 임의의 구현예에서,
세포 집단과 집단 내의 5E6 세포 당 0.6±20% ㎍의 mRNA를 접촉시켜 세포 당 1,000,000±20% 카피의 외인성 단백질을 발현하는 세포의 집단을 발생시키거나,
세포 집단과 집단 내의 5E6 세포 당 0.4±20% ㎍의 mRNA를 접촉시켜 세포 당 870,000±20% 카피의 외인성 단백질을 발현하는 세포의 집단을 발생시키거나,
세포 집단과 집단 내의 5E6 세포 당 0.2±20% ㎍의 mRNA를 접촉시켜 세포 당 610,000±20% 카피의 외인성 단백질을 발현하는 세포의 집단을 발생시키거나,
세포 집단과 집단 내의 5E6 세포 당 0.1±20% ㎍의 mRNA를 접촉시켜 세포 당 270,000±20% 카피의 외인성 단백질을 발현하는 세포의 집단을 발생시키거나,
세포 집단과 집단 내의 5E6 세포 당 0.05±20% ㎍의 mRNA를 접촉시켜 세포 당 100,000±20% 카피의 외인성 단백질을 발현하는 세포의 집단을 발생시키거나,
세포 집단과 집단 내의 5E6 세포 당 0.025±20% ㎍의 mRNA를 접촉시켜 세포 당 43,000±20% 카피의 외인성 단백질을 발현하는 세포의 집단을 발생시키는, 방법.
307. 구현예 303 내지 구현예 306 중 임의의 구현예에서, 집단의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%가, 세포가 외인성 단백질과 접촉된 지 1일 후에 외인성 단백질을 발현하는 방법.
실시예
실시예 1: 외인성의 변형되거나 변형되지 않은 RNA를 전달하는 방법
렌티바이러스로 형질도입된 K562 세포의 경우, 트랜스진에 함유된 에피토프 태그(HA 태그)의 발현은 프로바이러스 길이와 역비례 관계에 있으며, 약 6 kb보다 큰 프로바이러스 작제물에 대해 HA 태그를 발현하는 세포의 백분율이 약 1-log 감소한다(도 1 참조). 임의의 특정 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 형질도입 효율에서의 감소에 대한 이유는 렌티바이러스 내에서 더 긴 프로바이러스 서열의 감소된 패키징 효율과 관련이 있는 것으로 생각된다. 3.6 kb 내지 8.2 kb 범위의 프로바이러스 길이의 렌티바이러스 작제물 세트를 시험하였다(도 2 참조). 생성된 렌티바이러스 입자의 수는 ELISA에 의해 측정된 p24 캡시드 단백질의 수를 이용하여 정량하였다. 프로바이러스 RNA 카피의 수는 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)로 측정하였다. 표준화는 프로바이러스 길이의 함수로서 p24 캡시드 단백질 마이크로그램 당 RNA 카피의 정량화를 제공한다. 실험에서, 5kb 미만의 프로바이러스 길이에 대해, p24 마이크로그램 당 약 3×109개의 RNA 카피가 관찰될 수 있었다. 6 kb 초과의 작제물에 대해, 바이러스 제조물은 p24 캡시드 마이크로그램 당 약 8×108개 초과의 RNA 카피를 나타내지 않았다. 형질도입 효율에서의 감소를 초래하는 RNA-함유 바이러스 제조물과 RNA-결핍 바이러스 제조물 사이의 크기-의존적 차이가 관찰될 수 있다.
260V의 단일 펄스/녹색 형광 단백질(GFP)을 인코딩하는 mRNA를 갖는 150 μF의 K562 세포 및 배양된 적혈구 세포(일차 세포로부터의 적혈구 세포)에 의한 전기천공을 수행하였다(도 3 참조). GFP로부터의 형광을 판독함으로써 성공적인 유전자 전달을 측정하였으며, 이는 mRNA가 세포로 진입한 후, 단백질로 번역되는 것을 필요로 한다. K562 세포의 성공적인 전기천공을 발생시키는 문헌으로부터의 조건(Van Tendeloo et al., Blood 2001 98(1):49-56)은 배양된 적혈구 세포(일차 전구세포로부터 유래됨)로의 외인성 핵산의 효과적인 전달에 불충분하다. 일차 전구세포로부터의 배양된 적혈구 세포의 전기천공을 위한 50개를 초과하는 상이한 조건을 시험하였다. 형질감염 효율은 일반적으로 0.1%의 형질감염 세포 내지 85% 초과의 형질감염 세포의 범위였다(도 4a 내지 4c 참조). 도 4a 내지 도 4c는 12개의 상이한 조건에 대한 분화 8일에서 일차 전구세포로부터의 배양된 적혈구 세포의 전기천공 후의 mRNA로부터의 GFP의 번역을 제시한다. 생활력을 Life Technologies로부터의 LIVE/DEAD 염색을 이용하여 측정하였으며, 염색에 대해 음성인 세포를 생존 가능한 것으로 간주하였다. 조건 1은 형질감염되지 않은 대조군(0.21% GFP, 97.39% 생활력)에 해당한다. 이용된 전기천공 조건에 따라, 세포는 조건 2에서와 같이 mRNA의 매우 우수한 흡수(86.9%) 및 높은 생활력(92.6%)을 가졌으나, 조건 9에서와 같이 mRNA의 불량한 흡수(30.9%) 및 불량한 생활력(42.7%)을 가졌다.
세포가 계속 분화함에 따라, 높은 생활력을 유지하면서 우수한 트랜스진 흡수 및 발현을 달성하기 위해 상이한 전기천공 조건이 요구된다. 우수한 형질감염 및 우수한 생활력에 도움이 되는 조건을 확인하기 위해 약 20일의 분화 배양 과정에 걸쳐 50개 초과의 조건을 세포에 대해 시험하였다. 도 5는 3개의 상이한 시점인 8일, 13일, 및 15일에서의 전기천공에 의한 GFP mRNA를 이용한 세포의 성공적인 형질감염을 제시한다. 적합한 조건은 표 5 내지 7에 요약되어 있다. 배양된 적혈구 세포를 또한 분화 10일 및 12일에서 전기천공에 의해 GFP mRNA를 이용하여 형질감염시켜 GFP 발현을 발생시켰다(데이터는 제시하지 않음).
일차 전구세포로부터 배양된 적혈구 세포의 본원에 개시된 조건하에서의 전기천공은 말단 분화하는 세포의 능력을 손상시키는 것을 나타내지 않은 것으로 또한 관찰되었다. 1회 전기천공된 세포를 재-전기천공하였고, 다시 트랜스진을 성공적으로 흡수하였고, 이를 번역하였다. 도 6은 9일째에 전기천공된 후(이는 4일 동안 분열하는 것을 가능하게 하며, 그 동안 GFP 형광의 양은 감소하였고, 이는 세포 분열을 통한 mRNA 및 단백질의 희석으로 인한 것일 수 있음), 13일째에 재-전기천공된 일차 전구세포로부터 배양된 전혈구 세포의 집단을 제시한다.
배양된 적혈구 세포를 세포가 비교적 미분화되는 확장 단계 동안인 분화 4일째에 GFP mRNA로 전기천공하였다. 분화 8일째에, 세포는 표 8에 제시된 바와 같이 7AAD 염색에 의한 GFP 형광 및 높은 생활력을 나타내었다. 표 8에서, P1은 세포를 구성하는 주요 집단의 백분율을 나타내고(예를 들어, 높은 P1 값은 조직파편의 낮은 수준을 의미함); % GFP는 GFP 형광을 나타내는 P1의 세포의 백분율을 나타내고, MFI는 GFP+ 세포의 평균 형광 강도이고, %AAD-는 AAD 음성인 세포의 백분율을 나타내고, 여기서 생존 가능한 세포는 AAD 음성이다.
실시예 2: ELISA
P24 단백질을 제조업체의 프로토콜에 따라 상업적 키트(Clontech)를 이용하여 정량하였다. 간단히, 바이러스 상층액을 20 ㎕ 용해 완충액을 갖는 튜브에 분배하고, 60분 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 미세역가 플레이트로 옮겼다. 미세역가 플레이트를 세척하고, 60분 동안 37℃에서 100 ㎕의 항-p24(비오틴 컨쥬게이트) 검출기 항체와 함께 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 30분 동안 실온에서 100 ㎕의 스트렙타비딘-HRP 컨쥬게이트와 함께 인큐베이션한 후, 다시 세척하였다. 기질 용액을 플레이트에 첨가하고, 20(±2)분 동안 실온(18 내지 25℃)에서 인큐베이션하였다. 반응을 정지 용액으로 정지시키고, 비색 판독을 450 nm에서의 흡광도로 검출하였다.
실시예 3: qPCR
바이러스 RNA 카피를 제조업체의 프로토콜에 따라 상업적 렌티벡터 qRT-PCR 키트(Clontech)를 이용하여 정량하였다. 간단히, 렌티바이러스 상층액으로부터 RNA를 추출하기 위해 RNA 바이러스 정제 키트를 사용하였다. 바이러스 유전체 상의 보존 서열을 인지하고, 벡터에 의해 인코딩된 특정 트랜스진에 의존하지 않는 표준 렌티바이러스 프라이머(정방향 및 역방향)로 PCR 반응을 수행하였다. 42℃에서 5분 인큐베이션 후, 95℃에서 10초 인큐베이션 후, 40주기의 95℃에서 5초 및 60℃에서 30초로 RT 반응을 수행하였다. 사용된 기계는 Life Technologies QuantStudio였다.
실시예 4: 시험관 내 전사에 의한 mRNA의 생성
mRNA의 시험관 내 생성을 위한 키트는, 예를 들어, Life Technologies MAxiscript T7 키트로부터 상업적으로 이용 가능하다. 간단히, 관심 유전자를 표준 분자생물학 기술에 의해 적절한 T7 프로모터-함유 플라스미드 DNA로 클로닝한다. 전사 반응은 20 ㎕의 전체 부피로 1 ㎍의 DNA 주형, 2 ㎕의 10x 전사 완충액, 1 ㎕의 각각의 10 mM ATP, CTP, GTP, 및 UTP, 2 ㎕의 T7 중합효소 효소 믹스로 설정한다. 반응물을 충분히 혼합하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 오염된 잔여 플라스미드 DNA를 제거하기 위해, 1 ㎕의 turbo DNAse를 첨가하고, 반응물을 37℃에서 15분 동안 인큐베이션한다. 1 ㎕의 0.5 M EDTA의 첨가에 의해 반응을 중지시킨다. 전사물을 젤 전기영동 또는 회전 컬럼 정제로 정제한다.
실시예 5: 전기천공
세포를 RPMI 완충액으로 세척하고, 10 ㎕의 전체 부피로 1×10^7 세포/㎖의 밀도로 Life Technologies Neon 전기천공 기계에 로딩하고, 1000 V의 1 펄스, 50 ms 펄스 폭의 조건으로 전기천공하였다.
실시예 6: 화학적으로 변형된 mRNA를 이용한 전기천공
GFP를 인코딩하는 화학적으로 변형된 mRNA를 TriLink로부터 구입하였다. RNA는 슈도-우리딘 및 5-메틸 시토신을 함유한다. 분화하는 적혈구 세포를 분화 4, 8, 10, 또는 12일째에 전기천공하였다. 시험된 모든 분화일, 및 시험된 상이한 전기천공 조건하에서, GFP 형광이 관찰되었다. 표 9는 세포가 4일째에 전기천공되고, 8일째에 관찰되는 경우에 관찰된 GFP 형광 수준을 나타낸다. 표 10은 세포가 12일째에 전기천공되고, 15일째에 관찰되는 경우에 관찰된 GFP 형광 수준을 나타낸다. GFP 형광이 또한 분화 8일 또는 10일째에 전기천공된 세포에서 관찰되었다(데이터는 제시하지 않음).
세포 생활력 및 증식 능력을 트리판 블루 염색을 이용하여 전기천공된 세포에서 측정하였다. 세포를 변형되지 않은 GFP mRNA 또는 슈도-우리딘 및 5-메틸 시토신을 포함하는 TriLink 화학 변형 RNA를 이용하여 분화 8일째에 전기천공하였다. 9일째에, 변형되지 않은 RNA 및 변형된 RNA를 수용한 세포에서 GFP 형광이 관찰되었다(데이터는 제시하지 않음). 9일에서 또한, 세포의 전체 수, 살아 있는 세포의 수, 및 세포 생활력을 측정하였다. 변형되지 않은 mRNA로 전기천공된 샘플에서, 살아 있는 세포의 수는 외인성 핵산을 첨가하지 않고 전기천공된 대조군 세포에서 살아 있는 세포의 수보다 낮았다(표 11 참조). 이러한 감소는 변형된 RNA가 사용된 경우에 부분적으로 역전되었다(표 11). 이는 변형되지 않은 RNA를 이용한 전기천공이 세포 성장 또는 생활력을 감소시킬 수 있고, 변형된 RNA의 사용이 성장 또는 생활력을 적어도 부분적으로 구제할 수 있음을 나타낸다.
실시예 7: 이종성 비번역 영역
적혈구 세포를 헤모글로빈 3' UTR 서열이 첨부된 시험관내 전사된 GFP mRNA("Hemo-GFP")로 전기천공하였다. mRNA는 화학적으로 변형되지 않았다. 이후, 세포를 전기천공 2일 후에 유세포분석으로 GFP 형광에 대해 검정하였다. 세포의 59.7%가 GFP-양성이었다. GFP-양성 세포의 평균 형광 강도는 35069 단위였다.
실시예 8: 성숙 단계 동안의 mRNA 전기천공
도 7a에 예시된 바와 같이, 적혈구 세포 분화는 확장(전체적으로 0 내지 5일에 해당하는 0 내지 5일의 확장), 분화(전체적으로 6 내지 14일에 해당하는 1 내지 9일의 분화), 및 성숙(전체적으로 15 내지 28일에 해당하는 1 내지 14일의 성숙)의 3개의 단계로 나뉘어질 수 있다. 확장은 초기 단계 배양물을 증폭시켜 임상 용량 요구사항을 충족하기 위한 비-분화 환경에서의 조혈 전구 세포 분리 및 확장의 단계를 기재한다. 분화는 적혈구형성을 유도하고, 적혈구 세포 기능으로 분화시키기 위한 성장 인자 및 배지 첨가물의 사용을 기재한다. 성숙은 적혈구 세포가 이의 핵을 먼저 상실하고, 이어서 이의 미토콘드리아 및 리보솜 함유물을 상실하는 최종 단계를 나타낸다. 성숙 적혈구 세포는 새로운 mRNA 합성 또는 단백질 번역을 위한 능력을 갖지 않는다.
적혈구 세포 분화를 시험관 내에서 수행하고, 세포를 상이한 시점에서 GFP mRNA로 전기천공하였다. 세포를 분화 9일(전체적으로 14일)에서 전기천공한 경우, GFP 발현이 초기에 관찰되었으나, 9일 실험의 과정에 걸쳐 감소하였다(도 7b). 세포를 성숙 7일(전체적으로 21일)에서 전기천공한 경우, GFP 발현이 9일 실험 과정 전체에 걸쳐 연장되었다(도 7c). 4개의 상이한 전기천공 프로토콜(P1 내지 P4) 하에서, 결과는 유사하였고, 이는 상기 효과가 전기천공 조건과 비교적 독립적이라는 것을 나타낸다.
상기 후기 단계에서의 전기천공은 그래 왔던 것처럼 또한 잘 작동한 것이 놀라웠다. 스타인버그(Steinberg)의 문헌[Steinberg, M., Disorders of Hemoglobin: Genetics, Pathophysiology, and Clinical Management, Cambridge University Press, 2001]에 인용된 바와 같이, 성인 적혈구 세포는 이의 가스 운반에서의 역할을 위해 합성 헤모글로빈을 갖도록 구성되며; 핵, 단백질 합성 능력, 및 이의 기능을 다양화하는 능력은 생물학적으로 경제적인 수단을 통한 헤모글로빈 운반의 궁극적 목적을 위해 버려졌다. 당 분야는 일반적으로 성숙을 적혈구 세포가 제핵되고, 리보솜 및 미토콘드리아를 제거하는 단계로 간주하였다. 리보솜 제거는 성숙 단계의 적혈구 세포가 불량하게 전사되어, 이에 따라 새로운 단백질 합성을 할 수 없을 것이라는 예상을 하게 한다.
따라서, 적어도 성숙 단계의 적혈구 세포 뿐만 아니라 분화 단계의 적혈구 세포가 트랜스제닉 mRNA를 번역할 수 있는 것이 놀라웠고, 성숙 단계의 적혈구 세포가 분화 단계의 적혈구 세포보다 더 지속된 수준의 트랜스제닉 단백질을 생성한 것이 더욱 더 놀라웠다. 이는 외부적으로 제공된 RNA로부터의 새로운 단백질 합성이 제핵 적혈구 세포에서 달성될 수 있는 전통적인 모델과 달리 적혈구 발달의 독특한 단계를 확인한다. 이는 후기 단계 적혈구 세포 생성물에서 안정적인 단백질 생성을 달성하기 위한 지금까지 공지되지 않은 경로를 확인한다.
실시예 9: 전기천공의 시기
성숙 조건하에서 적혈구 세포의 집단으로 리포터 단백질(GFP)을 인코딩하는 mRNA를 전기천공하기 위한 여러 상이한 시점을 시험하였다. 특히, 성숙 4, 5, 6, 및 7일째에 전기천공을 시험하였다. 세포를 전기천공 후 적어도 6일 동안 24시간마다 유세포분석에 의해 GFP 발현에 대해 검정하였다. 적합한 전기천공 조건은, 예를 들어, 본원의 실시예 1 및 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 국제 출원 WO2016/183482호에 기재되어 있다.
도 8a에 제시된 바와 같이, 모든 시점에서 전기천공된 세포가 연장된 GFP 발현을 발생시켰다. 그러나, M4 및 M5일에 전기천공된 세포는 M6 또는 M7에서 전기천공된 세포보다 GFP를 발현하는 세포의 더 높은 백분율을 발생시켰다. 이러한 실험은 트랜스진을 특히 발현시킬 수 있는 적혈구 세포 성숙의 기간(window)을 나타낸다. 도 8b는 시간 경과에 걸쳐 M4 또는 M5에서 형질감염된 세포에서 집단 내의 GFP 수준이 다소 감소하나; 이들 세포에서의 GFP 발현은 대조군 세포 및 이후 시점에서 전기천공된 세포에서의 GFP 발현보다 여전히 높은 것을 제시한다.
이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 상기 범위는 세포의 번역 기구가 아직 상실되지 않은 성숙에서 충분히 초기이나, 동시에 외인성 mRNA 및 인코딩된 단백질이 후속하는 세포 분열에 의해 과도하게 희석되지 않은 성숙에서 충분히 후기인 시점을 나타낼 수 있다. 이러한 범위는 실시예 10에 기재된 바와 같이 추가로 특성규명되었다.
실시예 10: 성숙 적혈구 세포의 특성규명
다음으로, 성숙 적혈구 세포를 이의 번역 활성 및 제핵 수준에 대해 여러 시점에서 특성규명하였다. 번역 활성을 쌍직교 비표준 아미노산 태깅, 또는 BONCAT으로 측정하였다. 적합한 BONCAT 검정은, 예를 들어, 문헌[Hatzenpichler et al., "In situ visualization of newly synthesized proteins in environmental microbes using amino acid tagging and click chemistry" Environmental Microbiology (2014) 16(8), 2568-2590]에 기재되어 있다. 이러한 검정은 L-메티오닌에 대한 대용물인 비-표준 아미노산 L-아지도호모알라닌(AHA)의 생체 내 혼입 후, 클릭 화학에 의한 혼입된 AHA 세포 단백질의 형광 표지화를 기초로 한다. 이러한 프로토콜은 AHA 농도를 1mM에서 2mM로 증가시키고, 인큐베이션 시간을 3시간으로 최적화시킴으로써 포유동물 일차 세포, 특히 인간 적혈구 전구세포에 대해 변형되고 최적화되었으며, 젤 전기영동 및 적외선 영상화에 의해 분석되는 구리-비함유 클릭 화학을 가능하게 하는 디벤조사이클로옥틴 기(DBCO)가 사용되었다. 적혈구 세포의 집단을 확장, 분화, 및 성숙 조건에 노출시켰고, 3×106개의 세포의 샘플을 M3, M5, M7, M9, M11, M15, 및 M16일에 수거하였다. 도 9에 제시된 바와 같이, 세포의 번역 활성은 시간 경과에 걸쳐 급격하게 감소하였고, 이는 적혈구 세포가 번역 기구를 상실한 것을 나타낸다. 동일 시간 경과에 걸쳐, 집단 내의 제핵 세포의 비율은 급격히 상승하였다.
세포 표면 마커를 또한 유세포분석에 의해 성숙의 상이한 단계에서 적혈구 세포에서 검정하였다. 표 13에 제시된 바와 같이, GPA-양성 세포 및 Band3-양성 세포의 백분율은 성숙 동안 상승하였고, Alpha4 인테그린-양성의 백분율은 시간 경과 전체에 걸쳐 높게 유지되었다.
실시예 11: 전기천공된 적혈구 세포에서 단백질 발현을 증가시키는 리보뉴클레아제 억제제
본 실험은 리보뉴클레아제 억제제에 적혈구 세포를 노출시키는 것이 트랜스진의 발현을 증가시키는 것을 입증한다.
적혈구 세포를 분화시키고, 성숙 조건에 노출시키고, 리포터 유전자(mCherry)를 인코딩하는 mRNA로 M4일에 전기천공하였다. 2×106개의 세포를 RNasin으로 처리한 후, mRNA를 0.5 U/㎕, 1 U/㎕, 또는 2 U/㎕의 수준으로 세포에 첨가하거나, 대조군으로서 RNasin을 처리하지 않았다. 전기천공되지 않은 대조군을 또한 포함하였다. 세포를 M5, M7, M9, 및 M11일에 검정하였다. 도 10에 제시된 바와 같이, mCherry를 발현하는 세포의 백분율은 특히 M11 시점에서 RNasin이 처리되지 않은 세포보다 RNasin이 처리된 세포에서 더 높았다. RNasin 처리는 세포 생활력 또는 제핵에 부정적인 영향을 미치지 않았다(데이터는 제시하지 않음).
실시예 12: 전기천공된 적혈구 세포에서 단백질 발현을 증가시키는 프로테아솜 억제제
본 실험은 프로테아제 억제제에 적혈구 세포를 노출시키는 것이 트랜스진의 발현을 증가시키는 것을 입증한다.
적혈구 세포를 분화시키고, 성숙 조건에 노출시키고, 리포터 유전자(GFP)를 인코딩하는 mRNA로 M5일에 전기천공하였다. 세포를 M4, M5, 또는 M6일에 MG-132, 보르테조밉, 및 카르필조밉으로부터 선택된 프로테아솜 억제제로 처리하였다. 모든 세포 샘플은 M7, M9, 및 M11일에 검정시 75%가 넘는 GFP-양성 세포의 높은 백분율을 발생시켰다(데이터는 제시하지 않음). 도 11에 제시된 바와 같이, 전기천공 전, 20S 프로테아솜 억제제, MG-132 또는 보르테조밉을 이용한 처리는 하나 이상의 시점에서 GFP의 증가된 효가적인 발현을 발생시켰다. 보르테조밉 처리는 프로테아솜 억제제로 처리되지 않은 세포에 비해 GFP의 효과적인 발현에서 4배의 증가를 발생시켰다. 전기천공 전 20S 프로테아솜 억제제를 이용한 처리는 또한 정상 제핵을 발생시켰다(데이터는 제시하지 않음).
실시예 13: 2개 이상의 RNA의 공동-발현
본 실시예는 적혈구 세포에서의 2개 이상의 mRNA의 공동-발현을 입증한다.
첫째로, 적혈구 세포를 EGFP mRNA 단독(표 14, 첫 번째 데이터 열), mCherry mRNA 단독(표 14, 두 번째 데이터 열), 또는 둘 모두의 mRNA(표 14, 세 번째 데이터 열)로 M5일에 전기천공하였다. EGFP 및 mCherry 형광을 M6, M11, M13, 및 M18일에 유세포분석으로 검정하였다. EGFP 및 mCherry 둘 모두를 발현하는 세포의 백분율은 시점 전체에 걸쳐 시종일관 높았으며(66.05% 내지 86.55%), mRNA 중 단지 하나를 이용한 전기천공 후에 형광을 발하는 세포의 백분율과 동등하였다. 본 실험은 2개의 mRNA의 균일한 발현을 동시에 달성하는 것이 가능함을 나타낸다.
발현 수준을 또한 검정하였다. M13일에, mCherry mRNA 단독으로 전기천공된 세포에서의 mCherry의 효과적인 발현은 117이었고, mCherry mRNA 및 EGFP mRNA 둘 모두로 전기천공된 세포에서의 mCherry의 효과적인 발현은 85였다. EGFP mRNA 단독으로 전기천공된 세포에서의 EGFP의 효과적인 발현은 219였고, mCherry mRNA 및 EGFP mRNA 둘 모두로 전기천공된 세포에서의 EGFP의 효과적인 발현은 201이었다. 따라서, 발현 수준은 1개 또는 2개의 mRNA로 전기천공된 세포에서 유사하였다.
생활력은 mRNA 단독으로 전기천공된 세포에서보다 2개의 mRNA로 공동-전기천공된 세포에서 더 낮지 않았다(데이터는 제시하지 않음).
HA-태깅된 m4-1BBL 및 FLAG-태깅된 아벨루맙(Avelumab)을 인코딩하는 mRNA의 또 다른 쌍을 적혈구 세포에서 공동-발현시켰다. RNA를 0.6 또는 0.8 ㎎/㎖ mRNA의 농도로 분화 6일(D6) 또는 분화 7일(D7)에 25×106개의 적혈구 세포에 첨가하였다. 외인성 단백질을 항-HA 항체 및 항-FLAG 항체를 이용하여 유세포분석에 의해 검출하였다. 표 15에 제시된 바와 같이, 단백질의 공동-발현은 58.5%의 세포에서 달성되었고, 이는 mRNA 중 하나만으로 전기천공된 샘플에서 단백질 단독을 발현한 세포의 수와 동등하다.
실시예 14: 용량-발현 연구
본 실험은 소정량의 외인성 단백질이 적혈구 세포의 집단과 소정량의 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 접촉시킴으로써 생성될 수 있음을 입증한다.
성숙 4일에서 5×106개의 세포를 상이한 양의 mRNA(샘플 당 0.0025 내지 0.6 ㎍의 RNA)와 접촉시키고, 전기천공하였다. 단백질 발현을 전기천공 24시간 후에 검정하였다. 외인성 단백질을 항-HA 항체를 이용하여 유세포분석으로 정량하였다. 세포 당 단백질의 평균 수를 계산하였고, 이는 표 16에 제시된다. 외인성 단백질을 발현하는 세포의 백분율이 또한 표 16에 제시된다. 특히, 시험된 모든 mRNA 수준에서, 외인성 단백질을 발현하는 세포의 백분율은 높다. 그러나, 세포 당 카피의 수는 사용되는 mRNA의 양에 따라 대략 선형으로 증가한다. 따라서, 세포 집단 전체에 걸쳐 균일한 발현을 유지하면서 적절한 mRNA를 선택함으로써 원하는 단백질 발현의 양이 획득될 수 있다.
실시예 15: 변형된 RNA로부터의 발현
5' 캡(ARCA), polyA 꼬리, 및 슈도우리딘 중 하나 이상을 포함하는 변형된 mRNA를 생성하였다. mRNA는 번역을 촉진하기 위한 IRES, 검출을 촉진하기 위한 HA-인코딩 영역, 및 GFP 및 PAL(페닐알라닌 암모니아 분해효소)의 융합체를 인코딩하는 영역을 포함한다. mRNA를 M4일에 전기천공에 의해 적혈구 세포로 도입하고, M5(24시간 후), M6, M7, 및 M10일에 분석하였다. GFP 발현을 유세포분석으로 측정하였다. 도 12에 제시된 바와 같이, 슈도우리딘 mRNA를 발현하는 세포는 완전히 변형되지 않은 RNA를 발현하는 세포보다 GFP-양성 세포의 더 높은 백분율을 가졌다. polyA 꼬리 및 캡의 첨가는 GFP-양성 세포의 백분율을 추가로 증가시켰다. 최종적으로, GFP 리포터의 발현을 나타내는 세포의 백분율은 캡, poly-A 꼬리, 및 슈도우리딘 혼입을 갖는 mRNA와 접촉된 세포에서 가장 높았다.
표
[표 1]
변형된 뉴클레오티드
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
[표 2]
백본 변형
Figure pct00010
[표 3]
변형된 캡
Figure pct00011
[표 4]
선택된 질병, 수용자 및 표적
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
[표 5]
전기천공 조건 (8 내지 9일)
Figure pct00022
[표 6]
전기천공 조건 (12 내지 13일)
Figure pct00023
[표 7]
전기천공 조건 (14 내지 16일)
Figure pct00024
[표 8]
전기천공된 4일 세포의 GFP 형광.
Figure pct00025
[표 9]
화학적으로 변형된 RNA로 전기천공된 4일 세포의 GFP 형광
Figure pct00026
[표 10]
화학적으로 변형된 RNA로 전기천공된 12일 세포의 GFP 형광
Figure pct00027
[표 11]
전기천공 후 트리판 블루 염색에 의한 세포 생활력 및 증식 능력의 평가
Figure pct00028
[표 12]
인간 비코딩 RNA
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
[표 13]
성숙 적혈구 세포에서의 세포 표면 마커
Figure pct00041
[표 14]
EGFP 및 mCherry의 공동-발현
Figure pct00042
[표 15]
4 - 1BBL 및 아벨루맙의 공동-발현
Figure pct00043
[표 16]
용량 발현 결과
Figure pct00044
전술한 본 발명은 이해의 명확함의 목적상 예시 및 예로 다소 상세히 기재되었으나, 첨부된 청구항의 사상 또는 범위로부터 벗어남이 없이 이에 대해 특정한 변화 및 변형이 이루어질 수 있음이 본 발명의 교시내용에 비추어 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.
<110> RUBIUS THERAPEUTICS, INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS RELATED TO THERAPEUTIC CELL SYSTEMS EXPRESSING EXOGENOUS RNA <130> 2018FPI-12-005/US <150> US 62/359,416 <151> 2016-07-07 <150> PCT/US 2017/041155 <151> 2017-07-07 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 132 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> /note="Description of Unknown: hemoglobin UTR sequence" <400> 1 gctcgctttc ttgctgtcca atttctatta aaggttcctt tgttccctaa gtccaactac 60 taaactgggg gatattatga agggccttga gcatctggat tctgcctaat aaaaaacatt 120 tattttcatt gc 132 <210> 2 <211> 119 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gaccgggcat tgcccccagt ctcccccaaa tttgggcatt gtccccgggt cttccaacgg 60 actgggcgtt gctcccggac actgaggact ggccccgggg tctcgctcac cttcagcag 119

Claims (118)

  1. 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하는 적혈구 세포를 제조하는 방법으로서,
    a) 성숙 단계의 적혈구 세포를 제공하는 단계, 및
    b) 적혈구 세포에 의한 mRNA의 흡수를 가능하게 하는 조건하에서 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA와 적혈구 세포를 접촉시킴으로써 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하는 적혈구 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 적혈구 세포가 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 흡수하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 성숙 단계의 적혈구 세포의 집단을 제공하는 단계 및 적혈구 세포 집단의 복수의 세포와 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 적혈구 세포의 집단의 복수의 세포가 각각 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 흡수하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA의 흡수 후, 세포 또는 복수의 세포가 외인성 단백질을 발현하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 세포 또는 복수의 세포가 외인성 단백질을 포함하는 방법.
  7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 성숙 단계의 적혈구 세포의 집단이 3 내지 7일, 예를 들어, 4 내지 5일 또는 4 내지 6일 동안 성숙 배지에서 확장된 세포의 집단인 방법.
  8. 외인성 단백질을 발현하는 망상적혈구의 집단을 제조하는 방법으로서,
    (e) 적혈구 전구 세포(예를 들어, CD34+ 세포)의 집단을 제공하는 단계;
    (f) 분화하는 적혈구 세포의 집단을 제공하는 분화 조건하에서 적혈구 전구 세포의 집단을 배양하는 단계;
    (g) 분화하는 적혈구 세포의 집단의 복수의 세포에 의한 mRNA의 흡수를 가능하게 하는 조건하에서 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA와 분화하는 적혈구 세포의 집단의 복수의 세포를 접촉시키는 단계; 및
    (h) 분화하는 적혈구 세포의 집단의 복수의 세포를 추가로 배양하여 망상적혈구 집단을 제공함으로써, 외인성 단백질을 발현하는 망상적혈구 집단을 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 추가 배양이 3, 2, 또는 1회 미만의 집단 배가를 포함하는 방법.
  10. 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 하기 특성 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17개 이상)을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법:
    i.a) 집단 내의 세포의 2 내지 40%, 3 내지 33%, 5 내지 30%, 10 내지 25%, 또는 15 내지 20%가 제핵되거나;
    i.b) 집단 내의 세포의 0%, 0.1%, 0.2%, 또는 0.5% 초과이나, 2%, 3%, 4%, 또는 5% 미만이 제핵되거나;
    i.c) 집단 내의 세포의 0%, 0.1%, 0.2%, 또는 0.5% 초과이나, 6%, 10%, 15%, 20%, 또는 25% 미만이 제핵되거나;
    i.d) 집단 내의 세포의 0%, 0.1%, 0.2%, 또는 0.5% 초과이나, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 미만이 제핵되거나;
    i.e) 집단 내의 세포의 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 15%, 또는 20% 이하가 제핵되거나;
    i.f) 집단 내의 세포의 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 이하가 제핵되거나;
    i.g) 세포의 집단이 최대 제핵의 6 내지 70%, 10 내지 60%, 20 내지 50%, 또는 30 내지 40%에 도달하거나;
    i.h) 세포의 집단이 최대 제핵의 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 15%, 또는 20% 이하에 도달하거나;
    i.i) 세포의 집단이 최대 제핵의 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 또는 60% 이하에 도달하거나;
    ii.a) 세포의 집단이 세포 분열에서 플래토(plateau)로부터 3, 2, 또는 1회 미만으로 집단 배가하거나;
    ii.b) 세포의 집단이 3, 2, 또는 1회 미만으로 집단 배가할 수 있거나;
    ii.c) 집단이 집단 내의 세포의 적어도 70%의 제핵 수준에 도달하기 전에 집단이 1.5, 2, 또는 3배 이하만큼 증가하거나;
    iii.a) 집단 내의 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)이거나;
    iii.b) 집단 내의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 또는 79%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)이거나;
    iii.c) 집단 내의 세포의 30 내지 90%, 40 내지 90%, 50 내지 90%, 60 내지 90%, 또는 70 내지 90%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)이거나;
    iii.d) 집단 내의 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)의 형태를 나타내거나;
    iii.e) 집단 내의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 또는 79%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)의 형태를 나타내거나;
    iii.f) 집단 내의 세포의 30 내지 90%, 40 내지 90%, 50 내지 90%, 60 내지 90%, 또는 70 내지 90%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)의 형태를 나타낸다.
  11. 제10항에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i로부터의 특성 및 ii로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i로부터의 특성 및 iii로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
  13. 제10항에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 ii로부터의 특성 및 iii로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
  14. 제10항에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i로부터의 특성, ii로부터의 특성, 및 iii로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
  15. 제3항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이, 예를 들어, 유세포분석 검정, 예를 들어, 실시예 10의 유세포분석 검정에 의해 측정시 집단 내의 세포의 84 내지 99%, 85 내지 95%, 또는 약 90%가 GPA-양성인 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
  16. 제3항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이, 예를 들어, 유세포분석 검정, 예를 들어, 실시예 10의 유세포분석 검정에 의해 측정시 집단 내의 세포의 적어도 84%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%가 GPA-양성인 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
  17. 제3항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이, 예를 들어, 유세포분석 검정, 예를 들어, 실시예 10의 유세포분석 검정에 의해 측정시 집단 내의 세포의 54 내지 99%, 55 내지 98%, 60 내지 95%, 65 내지 90%, 70 내지 85%, 또는 75 내지 80%가 band3-양성인 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
  18. 제3항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이, 예를 들어, 유세포분석 검정, 예를 들어, 실시예 10의 유세포분석 검정에 의해 측정시 집단 내의 세포의 적어도 54%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%가 band3-양성인 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
  19. 제3항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이, 예를 들어, 유세포분석 검정, 예를 들어, 실시예 10의 유세포분석 검정에 의해 측정시 집단 내의 세포의 96 내지 100%, 97 내지 99%, 또는 약 98%가 alpha4 인테그린-양성인 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
  20. 제3항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이, 예를 들어, 유세포분석 검정, 예를 들어, 실시예 10의 유세포분석 검정에 의해 측정시 집단 내의 세포의 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 alpha4 인테그린-양성인 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
  21. 제3항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 세포와 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 접촉시키기 전 또는 후에, 복수의 세포가 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단으로부터 분리되고, 예를 들어, 복수의 세포가 제핵 상태를 기초로 하여 집단으로부터 분리되는(예를 들어, 복수의 세포는 유핵 세포이고, 집단의 나머지는 제핵 세포임) 방법.
  22. 제3항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 세포와 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 접촉시키기 전 또는 후에, 예를 들어, 집단과 제핵의 억제제(예를 들어, 히스톤 데아세틸라제(HDAC)의 억제제, 미토겐-활성화 단백질 키나제(MAPK)의 억제제, 사이클린-의존성 키나제(CDK)의 억제제, 또는 프로테아솜 억제제)를 인큐베이션함으로써, 예를 들어, 집단의 성장, 발달, 헤모글로빈 합성, 또는 제핵 과정을 정지시킴으로써 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단을 동기화시키는 단계를 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 정지가 집단 내의 세포의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10% 초과의 제핵 전에 발생하는 방법.
  24. 외인성 단백질을 발현하는 망상적혈구의 집단을 제조하는 방법으로서,
    (i) 적혈구 전구 세포(예를 들어, CD34+ 세포)의 집단을 제공하는 단계;
    (j) 분화하는 적혈구 세포의 집단을 제공하는 분화 조건하에서 적혈구 전구 세포의 집단을 배양하는 단계;
    (k) 분화하는 적혈구 세포에 의한 mRNA의 흡수를 가능하게 하는 조건하에서 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA와 분화하는 적혈구 세포를 접촉시키는 단계로서, 분화하는 적혈구 세포의 집단이 0.1 내지 25%가 제핵(예를 들어, 0.1 내지 20%가 제핵되거나, 0.1 내지 15%가 제핵되거나, 0.1 내지 12%가 제핵되거나, 0.1 내지 10%가 제핵)되는 경우에 접촉이 수행되는, 단계; 및
    (l) 분화하는 적혈구 세포를 추가로 배양하여 망상적혈구 집단을 제공함으로써, 외인성 단백질을 발현하는 망상적혈구 집단을 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 추가 배양이 3, 2, 또는 1회 미만의 집단 배가를 포함하는 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 분화하는 적혈구 세포의 적어도 50%(적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 또는 95%)가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)의 형태를 나타나는 경우에 접촉이 수행되는 방법.
  27. (a) 적혈구 전구 세포의 집단을 제공하는 단계, (b) 분화하는 적혈구 세포의 집단을 제공하는 분화 조건하에서 적혈구 전구 세포의 집단을 배양하는 단계, (c) 분화하는 적혈구 세포와 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 접촉시키는 단계로서, 분화하는 적혈구 세포의 집단이 0.1 내지 25%가 제핵(예를 들어, 0.1 내지 20%가 제핵되거나, 0.1 내지 15%가 제핵되거나, 0.1 내지 12%가 제핵되거나, 0.1 내지 10%가 제핵)되는 경우에 접촉이 수행되는, 단계를 포함하는, 외인성 단백질을 발현하는 망상적혈구의 집단을 제조하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 분화하는 적혈구 세포의 집단이 세포 분열에서 플래토 전에 3, 2, 또는 1회 미만의 집단 배가를 갖는 경우에 접촉이 수행되는 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 분화하는 적혈구 세포의 적어도 50%(적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 또는 95%)가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)의 형태를 나타나는 경우에 접촉이 수행되는 방법.
  30. 이종성 비번역 영역(UTR)에 작동 가능하게 연결된 코딩 영역을 포함하는 외인성 mRNA를 포함하는 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포로서, 이종성 UTR이 조절 요소를 포함하는, 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포.
  31. 표 1의 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 표 2의 하나 이상의 화학적 백본 변형, 표 3의 하나 이상의 화학적으로 변형된 캡, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 외인성 mRNA를 포함하는 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포.
  32. 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포를 생성하는 방법으로서,
    a) 적혈구 세포, 예를 들어, 유핵 적혈구 세포와 조절 요소를 포함하는 이종성 UTR에 작동 가능하게 연결된 코딩 영역을 포함하는 외인성 mRNA(예를 들어, 분리된 RNA 또는 시험관 내 전사된 RNA)를 접촉시키는 단계, 및
    b) 외인성 mRNA의 흡수에 적합한 조건하에서 접촉된 적혈구 세포를 유지시킴으로써 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  33. 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포를 생성하는 방법으로서,
    a) 적혈구 세포, 예를 들어, 유핵 적혈구 세포와 표 1의 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 표 2의 하나 이상의 화학적 백본 변형, 표 3의 하나 이상의 화학적으로 변형된 캡, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 외인성 mRNA를 접촉시키는 단계; 및
    b) 외인성 mRNA의 흡수에 적합한 조건하에서 접촉된 적혈구 세포를 유지시킴으로써 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  34. 제핵 적혈구 세포에서 외인성 단백질을 생성하는 방법으로서,
    a) 조절 요소를 포함하는 이종성 UTR에 작동 가능하게 연결된 코딩 영역을 포함하는 외인성 mRNA(예를 들어, 분리된 RNA 또는 시험관 내 전사된 RNA)를 포함하는 적혈구 세포, 예를 들어, 유핵 적혈구 세포를 제공하는 단계, 및
    b) 외인성 단백질의 생성에 적합한 조건하에서 적혈구 세포를 배양함으로써 외인성 단백질을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  35. 제핵 적혈구 세포에서 외인성 단백질을 생성하는 방법으로서,
    a) 표 1의 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 표 2의 하나 이상의 화학적 백본 변형, 표 3의 하나 이상의 화학적으로 변형된 캡, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 적혈구 세포, 예를 들어, 유핵 적혈구 세포를 제공하는 단계, 및
    b) 외인성 단백질의 생성에 적합한 조건하에서 적혈구 세포를 배양함으로써 외인성 단백질을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  36. 조절 요소를 포함하는 이종성 UTR에 작동 가능하게 연결된 코딩 영역을 포함하는 외인성 mRNA(예를 들어, 분리된 RNA 또는 시험관 내 전사된 RNA)를 포함하는 적혈구 세포, 예를 들어, 유핵 적혈구 세포를 대상체에 투여함으로써 대상체에 외인성 단백질을 제공하거나, 대상체에 외인성 단백질을 생성할 수 있는 제핵 적혈구 세포를 제공하거나, 대상체를 치료하는 단계를 포함하는,
    대상체에 외인성 단백질을 제공하거나, 대상체에 외인성 단백질을 생성할 수 있는 제핵 적혈구 세포를 제공하거나, 대상체를 치료하는 방법.
  37. 표 1의 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 표 2의 하나 이상의 화학적 백본 변형, 표 3의 하나 이상의 화학적으로 변형된 캡, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 외인성 mRNA를 포함하는 적혈구 세포, 예를 들어, 유핵 적혈구 세포를 대상체에 투여함으로써 대상체에 외인성 단백질을 제공하거나, 대상체에 외인성 단백질을 생성할 수 있는 제핵 적혈구 세포를 제공하거나, 대상체를 치료하는 단계를 포함하는,
    대상체에 외인성 단백질을 제공하거나, 대상체에 외인성 단백질을 생성할 수 있는 제핵 적혈구 세포를 제공하거나, 대상체를 치료하는 방법.
  38. 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포(또는 상기 세포의 배치(batch))를 평가하는 방법으로서,
    a) 조절 요소를 포함하는 이종성 UTR에 작동 가능하게 연결된 코딩 영역을 포함하는 외인성 mRNA를 포함하는 적혈구 세포, 예를 들어, 유핵 적혈구 세포(또는 상기 세포의 배치)를 제공하는 단계, 및
    b) 미리 선택된 파라미터에 대해 적혈구 세포, 예를 들어, 유핵 적혈구 세포(또는 상기 세포의 배치)를 평가함으로써 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포(또는 상기 세포의 배치)를 평가하는 단계를 포함하는, 방법.
  39. 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포(또는 상기 세포의 배치)를 평가하는 방법으로서,
    a) 표 1의 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 표 2의 하나 이상의 화학적 백본 변형, 표 3의 하나 이상의 화학적으로 변형된 캡, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 적혈구 세포, 예를 들어, 유핵 적혈구 세포를 제공하는 단계, 및
    b) 미리 선택된 파라미터에 대해 적혈구 세포, 예를 들어, 유핵 적혈구 세포(또는 상기 세포의 배치)를 평가함으로써 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포(또는 상기 세포의 배치)를 평가하는 단계를 포함하는, 방법.
  40. 제30항에 있어서, 집단 내의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%가, 예를 들어, mRNA와의 접촉 5일 후에 외인성 단백질을 포함하는 방법.
  41. 제30항에 있어서, 집단 내의 세포가, 예를 들어, mRNA와의 접촉 5일 후에 적어도 1,000, 2,000, 5,000, 10,000, 20,000, 50,000, 또는 100,000 카피의 외인성 단백질을 포함하는 방법.
  42. 제30항에 있어서, 세포가 mRNA와의 접촉 후 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15일 동안 적어도 1,000, 2,000, 5,000, 10,000, 20,000, 50,000, 또는 100,000 카피의 외인성 단백질을 포함하는 방법.
  43. 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하는 적혈구 세포를 제조하는 방법으로서,
    mRNA의 분해를 억제하는 조건, 예를 들어, 반응 혼합물 중에 리보뉴클레아제 억제제의 포함에 의한 조건하에서 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA 및 적혈구 세포를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계, 및
    적혈구 세포에 의한 mRNA의 흡수를 가능하게 하는 조건하에서 반응 혼합물을 유지시킴으로써 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하는 적혈구 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 적혈구 세포의 집단을 제공하는 단계 및 상기 집단과 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 집단의 복수의 적혈구 세포가 각각 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 흡수하는 방법.
  46. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 또는 복수의 세포가 외인성 단백질을 발현하는 방법.
  47. 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 또는 복수의 세포가 외인성 단백질을 포함하는 방법.
  48. 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 또는 세포의 집단을 전기천공하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  49. 제43항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 적혈구 세포의 집단과 리보뉴클레아제 억제제를 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  50. 제43항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 세포와 mRNA를 접촉시키기 전, 접촉시키는 동안, 또는 접촉시킨 후에 세포 집단과 리보뉴클레아제 억제제를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  51. 제43항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 성숙 단계 4, 5, 또는 6일에서 세포와 리보뉴클레아제 억제제를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  52. 제43항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 성숙 단계의 세포인 방법.
  53. 제43항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 하기 특성 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17개 이상)을 포함하는 경우에 세포와 리보뉴클레아제 억제제를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법:
    i.a) 집단 내의 세포의 2 내지 40%, 3 내지 33%, 5 내지 30%, 10 내지 25%, 또는 15 내지 20%가 제핵되거나;
    i.b) 집단 내의 세포의 0%, 0.1%, 0.2%, 또는 0.5% 초과이나, 2%, 3%, 4%, 또는 5% 미만이 제핵되거나;
    i.c) 집단 내의 세포의 0%, 0.1%, 0.2%, 또는 0.5% 초과이나, 6%, 10%, 15%, 20%, 또는 25% 미만이 제핵되거나;
    i.d) 집단 내의 세포의 0%, 0.1%, 0.2%, 또는 0.5% 초과이나, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 미만이 제핵되거나;
    i.e) 집단 내의 세포의 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 15%, 또는 20% 이하가 제핵되거나;
    i.f) 집단 내의 세포의 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 이하가 제핵되거나;
    i.g) 세포의 집단이 최대 제핵의 6 내지 70%, 10 내지 60%, 20 내지 50%, 또는 30 내지 40%에 도달하거나;
    i.h) 세포의 집단이 최대 제핵의 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 15%, 또는 20% 이하에 도달하거나;
    i.i) 세포의 집단이 최대 제핵의 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 또는 60% 이하에 도달하거나;
    ii.a) 세포의 집단이 세포 분열에서 플래토로부터 3, 2, 또는 1회 미만으로 집단 배가하거나;
    ii.b) 세포의 집단이 3, 2, 또는 1회 미만으로 집단 배가할 수 있거나;
    ii.c) 집단이 집단 내의 세포의 적어도 70%의 제핵 수준에 도달하기 전에 집단이 1.5, 2, 또는 3배 이하만큼 증가하거나;
    iii.a) 집단 내의 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)이거나;
    iii.b) 집단 내의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 또는 79%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)이거나;
    iii.c) 집단 내의 세포의 30 내지 90%, 40 내지 90%, 50 내지 90%, 60 내지 90%, 또는 70 내지 90%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)이거나;
    iii.d) 집단 내의 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)의 형태를 나타내거나;
    iii.e) 집단 내의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 또는 79%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)의 형태를 나타내거나;
    iii.f) 집단 내의 세포의 30 내지 90%, 40 내지 90%, 50 내지 90%, 60 내지 90%, 또는 70 내지 90%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)의 형태를 나타낸다.
  54. 제53항에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i로부터의 특성 및 ii로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
  55. 제53항에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i로부터의 특성 및 iii로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
  56. 제53항에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 ii로부터의 특성 및 iii로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
  57. 제53항에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i로부터의 특성, ii로부터의 특성, 및 iii로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
  58. 제43항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 하기 특성 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5개 이상)을 포함하는 경우(예를 들어, 유세포분석 검정, 예를 들어, 실시예 10의 유세포분석 검정에 의함)에 세포와 리보뉴클레아제 억제제를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법:
    집단 내의 세포의 84 내지 99%, 85 내지 95%, 또는 약 90%가 GPA-양성이거나;
    집단 내의 세포의 적어도 84%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%가 GPA-양성이거나;
    집단 내의 세포의 54 내지 99%, 55 내지 98%, 60 내지 95%, 65 내지 90%, 70 내지 85%, 또는 75 내지 80%가 band3-양성이거나;
    집단 내의 세포의 적어도 54%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%가 band3-양성이거나;
    집단 내의 세포의 96 내지 100%, 97 내지 99%, 또는 약 98%가 alpha4 인테그린-양성이거나;
    집단 내의 세포의 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 alpha4 인테그린-양성이다.
  59. 제43항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA가 시험관 내 전사된 mRNA인 방법.
  60. 제43항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 집단의 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 95%가 세포가 mRNA와 접촉된 지 5일 후에 생존 가능한 방법.
  61. 제43항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 집단의 세포의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%가 세포가 mRNA와 접촉된 지 5일 후에 제핵되는 방법.
  62. 제43항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 mRNA와 접촉된 지 5일 후에 제핵되는 세포의 비율이 리보뉴클레아제 억제제로 처리되지 않은 달리 유사한 세포 집단에서 제핵되는 세포의 비율의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%인 방법.
  63. 제43항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 집단이 세포가 mRNA와 접촉시에 적어도 1×106, 2×106, 5×106, 1×107, 2×107, 5×107, 또는 1×108개의 세포를 포함하는 방법.
  64. 제43항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 집단이 세포가 mRNA와 접촉된 후 5일 이내에 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%만큼 확장되는 방법.
  65. 제43항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 집단의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%가, 예를 들어, 세포가 mRNA와 접촉된 지 5일 후에 외인성 단백질을 발현하는 방법.
  66. 제43항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 집단의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%가, 예를 들어, 세포가 mRNA와 접촉된 지 5일 후에 외인성 단백질의 적어도 1,000, 2,000, 5,000, 10,000, 20,000, 50,000, 또는 100,000개의 카피를 포함하는 방법.
  67. 제43항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 집단이 리보뉴클레아제 억제제로 처리되지 않은 달리 유사한 세포 집단보다 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이상, 또는 적어도 2배, 3배, 4배, 또는 5배 더 많은 외인성 단백질을 포함하는 방법.
  68. i) 적혈구 세포, ii) 외인성 단백질을 포함하는 mRNA 및 iii) 리보뉴클레아제 억제제를 포함하는 반응 혼합물.
  69. 제68항에 있어서, mRNA가 적혈구 세포 내에 있는 반응 혼합물.
  70. 제68항 또는 제69항에 있어서, 복수의 적혈구 세포를 포함하는 반응 혼합물.
  71. 리보뉴클레아제 억제제에 대한 외인성 단백질을 포함하는 제핵 적혈구 세포를 포함하는 반응 혼합물을 검정하는 방법으로서,
    외인성 단백질을 포함하는 제핵 적혈구 세포를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계, 및
    예를 들어, 반응 혼합물의 분취액에서, 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 질량분광법에 의해 리보뉴클레아제 억제제의 존재 또는 수준을 검정하는 단계를 포함하는, 방법.
  72. 제71항에 있어서, 리보뉴클레아제 억제제의 수준을 참조 값과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  73. 제72항에 있어서, 비교에 반응하여,
    집단을, 예를 들어, 필요조건을 충족하거나 필요조건을 충족하지 않는 것으로 분류하는 단계로서, 예를 들어, 리보뉴클레아제 억제제의 수준이 참조 값 아래인 경우에 필요조건이 충족되는 단계,
    예를 들어, 리보뉴클레아제 억제제의 수준이 참조 값보다 위인 경우에 집단이 이후 정제 단계에 적합한 경우와 같이 집단을 이후의 처리 단계에 적합하거나 적합하지 않은 것으로 분류하는 단계,
    집단을 치료제로 사용하기에 적합하거나 적합하지 않은 것으로 분류하는 단계, 또는
    예를 들어, 리보뉴클레아제 억제제의 수준이 참조 값 아래인 경우에 집단 또는 이의 분취액을 치료제로 사용하기 위해 제형화하거나 패키징하는 단계 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 방법.
  74. 제43항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 리보뉴클레아제 억제제가 RNAsin Plus, Protector RNAse Inhibitor, 또는 Ribonuclease Inhibitor Huma인 반응 혼합물 또는 방법.
  75. 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하는 적혈구 세포를 제조하는 방법으로서,
    단백질 분해를 억제하는 조건, 예를 들어, 반응 혼합물 중에 프로테아솜 억제제의 포함에 의한 조건하에서 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA 및 적혈구 세포를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계, 및
    적혈구 세포에 의한 mRNA의 흡수를 가능하게 하는 조건하에서 반응 혼합물을 유지시킴으로써 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하는 적혈구 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
  76. 제75항에 있어서, 적혈구 세포의 집단을 제공하는 단계 및 상기 집단과 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  77. 제75항 또는 제76항에 있어서, 집단의 복수의 적혈구 세포가 각각 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 흡수하는 방법.
  78. 제75항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 또는 복수의 세포가 외인성 단백질을 발현하는 방법.
  79. 제75항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 또는 복수의 세포가 외인성 단백질을 포함하는 방법.
  80. 제75항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 또는 세포의 집단을 전기천공하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  81. 제75항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 적혈구 세포의 집단과 프로테아솜 억제제를 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  82. 제75항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 세포와 mRNA를 접촉시키기 전, 접촉시키는 동안, 또는 접촉시킨 후, 예를 들어, 세포와 mRNA를 접촉시키기 0.5 내지 2일 전 또는 0.5 내지 2일 후에 세포 집단과 프로테아솜 억제제를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  83. 제75항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 성숙 단계 4, 5, 또는 6일에서 세포와 프로테아솜 억제제를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  84. 제75항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 성숙 단계의 세포인 방법.
  85. 제75항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 하기 특성 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17개 이상)을 포함하는 경우에 세포와 프로테아솜 억제제를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법:
    i.a) 집단 내의 세포의 2 내지 40%, 3 내지 33%, 5 내지 30%, 10 내지 25%, 또는 15 내지 20%가 제핵되거나;
    i.b) 집단 내의 세포의 0%, 0.1%, 0.2%, 또는 0.5% 초과이나, 2%, 3%, 4%, 또는 5% 미만이 제핵되거나;
    i.c) 집단 내의 세포의 0%, 0.1%, 0.2%, 또는 0.5% 초과이나, 6%, 10%, 15%, 20%, 또는 25% 미만이 제핵되거나;
    i.d) 집단 내의 세포의 0%, 0.1%, 0.2%, 또는 0.5% 초과이나, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 미만이 제핵되거나;
    i.e) 집단 내의 세포의 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 15%, 또는 20% 이하가 제핵되거나;
    i.f) 집단 내의 세포의 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 이하가 제핵되거나;
    i.g) 세포의 집단이 최대 제핵의 6 내지 70%, 10 내지 60%, 20 내지 50%, 또는 30 내지 40%에 도달하거나;
    i.h) 세포의 집단이 최대 제핵의 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 15%, 또는 20% 이하에 도달하거나;
    i.i) 세포의 집단이 최대 제핵의 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 또는 60% 이하에 도달하거나;
    ii.a) 세포의 집단이 세포 분열에서 플래토로부터 3, 2, 또는 1회 미만으로 집단 배가하거나;
    ii.b) 세포의 집단이 3, 2, 또는 1회 미만으로 집단 배가할 수 있거나;
    ii.c) 집단이 집단 내의 세포의 적어도 70%의 제핵 수준에 도달하기 전에 집단이 1.5, 2, 또는 3배 이하만큼 증가하거나;
    iii.a) 집단 내의 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)이거나;
    iii.b) 집단 내의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 또는 79%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)이거나;
    iii.c) 집단 내의 세포의 30 내지 90%, 40 내지 90%, 50 내지 90%, 60 내지 90%, 또는 70 내지 90%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)이거나;
    iii.d) 집단 내의 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)의 형태를 나타내거나;
    iii.e) 집단 내의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 또는 79%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)의 형태를 나타내거나;
    iii.f) 집단 내의 세포의 30 내지 90%, 40 내지 90%, 50 내지 90%, 60 내지 90%, 또는 70 내지 90%가 적혈모구(예를 들어, 다염 또는 정염 적혈모구)의 형태를 나타낸다.
  86. 제85항에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i로부터의 특성 및 ii로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
  87. 제85항에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i로부터의 특성 및 iii로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
  88. 제85항에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 ii로부터의 특성 및 iii로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
  89. 제85항에 있어서, 적혈구 세포의 집단 또는 분화하는 적혈구 세포의 집단이 i로부터의 특성, ii로부터의 특성, 및 iii로부터의 특성을 포함하는 적혈구 세포의 집단인 방법.
  90. 제75항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 하기 특성 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5개 이상)을 포함하는 경우(예를 들어, 유세포분석 검정, 예를 들어, 실시예 10의 유세포분석 검정에 의함)에 세포와 프로테아솜 억제제를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법:
    집단 내의 세포의 84 내지 99%, 85 내지 95%, 또는 약 90%가 GPA-양성이거나;
    집단 내의 세포의 적어도 84%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%가 GPA-양성이거나;
    집단 내의 세포의 54 내지 99%, 55 내지 98%, 60 내지 95%, 65 내지 90%, 70 내지 85%, 또는 75 내지 80%가 band3-양성이거나;
    집단 내의 세포의 적어도 54%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%가 band3-양성이거나;
    집단 내의 세포의 96 내지 100%, 97 내지 99%, 또는 약 98%가 alpha4 인테그린-양성이거나;
    집단 내의 세포의 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 alpha4 인테그린-양성이다.
  91. 제75항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA가 시험관 내 전사된 mRNA인 방법.
  92. 제75항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 집단의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%가 세포가 mRNA와 접촉된 지 5일 후에 생존 가능한 방법.
  93. 제75항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 집단의 세포의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%가 세포가 mRNA와 접촉된 지 5일 후에 제핵되는 방법.
  94. 제75항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 mRNA와 접촉된 지 5일 후에 제핵되는 세포의 비율이 프로테아솜 억제제로 처리되지 않은 달리 유사한 세포 집단에서 제핵되는 세포의 비율의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%인 방법.
  95. 제75항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 집단이 세포가 mRNA와 접촉시에 적어도 1×106, 2×106, 5×106, 1×107, 2×107, 5×107, 또는 1×108개의 세포를 포함하는 방법.
  96. 제75항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 집단이 세포가 mRNA와 접촉된 후 5일 이내에 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%만큼 확장되는 방법.
  97. 제75항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 집단의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%가, 예를 들어, 세포가 mRNA와 접촉된 지 5일 후에 외인성 단백질을 발현하는 방법.
  98. 제75항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 집단의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%가, 예를 들어, 세포가 mRNA와 접촉된 지 5일 후에 외인성 단백질의 적어도 1,000, 2,000, 5,000, 10,000, 20,000, 50,000, 또는 100,000개의 카피를 포함하는 방법.
  99. 제75항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 집단이 프로테아솜 억제제로 처리되지 않은 달리 유사한 세포 집단보다 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이상, 또는 적어도 2배, 3배, 4배, 또는 5배 더 많은 외인성 단백질을 포함하는 방법.
  100. i) 적혈구 세포, ii) 외인성 단백질을 포함하는 mRNA 및 iii) 프로테아솜 억제제를 포함하는 반응 혼합물.
  101. 제100항에 있어서, mRNA가 적혈구 세포 내에 있는 반응 혼합물.
  102. 제100항 또는 제101항에 있어서, 복수의 적혈구 세포를 포함하는 반응 혼합물.
  103. 프로테아솜 억제제에 대한 외인성 단백질을 포함하는 제핵 적혈구 세포를 포함하는 반응 혼합물을 검정하는 방법으로서,
    외인성 단백질을 포함하는 제핵 적혈구 세포를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계, 및
    예를 들어, 반응 혼합물의 분취액에서, 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 질량분광법에 의해 프로테아솜 억제제의 존재 또는 수준을 검정하는 단계를 포함하는, 방법.
  104. 제103항에 있어서, 프로테아솜 억제제의 수준을 참조 값과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  105. 제104항에 있어서, 비교에 반응하여,
    집단을, 예를 들어, 필요조건을 충족하거나 필요조건을 충족하지 않는 것으로 분류하는 단계로서, 예를 들어, 프로테아솜 억제제의 수준이 참조 값 아래인 경우에 필요조건이 충족되는 단계,
    예를 들어, 프로테아솜 억제제의 수준이 참조 값보다 위인 경우에 집단이 이후 정제 단계에 적합한 경우와 같이 집단을 이후의 처리 단계에 적합하거나 적합하지 않은 것으로 분류하는 단계,
    집단을 치료제로 사용하기에 적합하거나 적합하지 않은 것으로 분류하는 단계, 또는
    예를 들어, 프로테아솜 억제제의 수준이 참조 값 아래인 경우에 집단 또는 이의 분취액을 치료제로 사용하기 위해 제형화하거나 패키징하는 단계 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 방법.
  106. 제75항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아솜 억제제가 20S 프로테아솜 억제제, 예를 들어, MG-132 또는 카르필조밉(carfilzomib), 또는 26S 프로테아솜 억제제, 예를 들어, 보르테조밉(bortezomib)인 반응 혼합물 또는 방법.
  107. 제1 외인성 단백질 및 제2 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하는 적혈구 세포를 제조하는 방법으로서,
    a) 적혈구 세포, 예를 들어, 성숙 단계의 적혈구 세포를 제공하는 단계, 및
    b) 적혈구 세포에 의한 제1 mRNA 및 제2 mRNA의 흡수를 가능하게 하는 조건하에서 제1 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA 및 제2 외인성 단백질을 인코딩하는 제2 mRNA와 적혈구 세포를 접촉시킴으로써 제1 mRNA 및 제2 mRNA를 포함하는 적혈구 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
  108. 제107항에 있어서, 적혈구 세포가, 예를 들어, mRNA와의 접촉 5일 후에 제1 외인성 단백질 및 제2 외인성 단백질의 적어도 1,000, 2,000, 5,000, 10,000, 20,000, 50,000, 또는 100,000개의 카피를 포함하는 방법.
  109. 제1 외인성 단백질 및 제2 외인성 단백질을 발현하는 적혈구 세포의 집단을 생성하는 방법으로서,
    a) 적혈구 세포, 예를 들어, 성숙 단계의 적혈구 세포의 집단을 제공하는 단계, 및
    b) 제1 단백질을 인코딩하는 제1 mRNA 및 제2 단백질을 인코딩하는 제2 mRNA와 적혈구 세포의 집단을 접촉시킴으로써 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하는 적혈구 세포를 제조하는 단계를 포함하고,
    집단 내의 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 제1 mRNA 및 제2 mRNA 둘 모두를 포함하는, 방법.
  110. 제109항에 있어서, 적혈구 세포의 집단이, 예를 들어, mRNA와의 접촉 5일 후에 세포 당 제1 외인성 단백질 및 제2 외인성 단백질의 평균 적어도 1,000, 2,000, 5,000, 10,000, 20,000, 50,000, 또는 100,000개의 카피를 포함하는 방법.
  111. 제107항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉 단계가 전기천공을 수행하는 것을 포함하는 방법.
  112. 제109항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 집단이, 세포가 제1 및 제2 mRNA와 접촉한 후 적어도 5일 동안 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%에서 제1 외인성 단백질 및 제2 외인성 단백질을 포함하는 방법.
  113. 집단 내의 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 제1 외인성 단백질 및 제2 외인성 단백질을 발현하는 적혈구 세포의 집단으로서, 상기 집단이 세포와 제1 또는 제2 외인성 단백질을 인코딩하는 DNA를 접촉시킴으로써 제조되지 않은, 적혈구 세포의 집단.
  114. 집단과 소정량의 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 접촉시킴으로써 소정량의 외인성 단백질을 포함하는 적혈구 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 세포 당 소정의 수의 카피의 외인성 단백질을 포함하는 복수의 적혈구 세포를 생성하는 방법.
  115. 제114항에 있어서, 복수의 적혈구 세포(예를 들어, 제핵 적혈구 세포) 중 하나 이상을 평가하여 외인성 단백질의 양을 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  116. 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포의 샘플에서 외인성 단백질의 양을 평가하는 방법으로서,
    집단과 소정량의 외인성 단백질을 인코딩하는 mRNA를 접촉시킴으로써 제조된 세포 당 소정의 수의 외인성 단백질의 카피를 포함하는 복수의 적혈구 세포를 제공하는 단계, 및
    복수의 적혈구 세포에서 외인성 단백질의 양을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  117. 제114항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포 집단과 집단 내의 5E6 세포 당 0.6±20% ㎍의 mRNA를 접촉시켜 세포 당 1,000,000±20% 카피의 외인성 단백질을 발현하는 세포의 집단을 발생시키거나,
    세포 집단과 집단 내의 5E6 세포 당 0.4±20% ㎍의 mRNA를 접촉시켜 세포 당 870,000±20% 카피의 외인성 단백질을 발현하는 세포의 집단을 발생시키거나,
    세포 집단과 집단 내의 5E6 세포 당 0.2±20% ㎍의 mRNA를 접촉시켜 세포 당 610,000±20% 카피의 외인성 단백질을 발현하는 세포의 집단을 발생시키거나,
    세포 집단과 집단 내의 5E6 세포 당 0.1±20% ㎍의 mRNA를 접촉시켜 세포 당 270,000±20% 카피의 외인성 단백질을 발현하는 세포의 집단을 발생시키거나,
    세포 집단과 집단 내의 5E6 세포 당 0.05±20% ㎍의 mRNA를 접촉시켜 세포 당 100,000±20% 카피의 외인성 단백질을 발현하는 세포의 집단을 발생시키거나,
    세포 집단과 집단 내의 5E6 세포 당 0.025±20% ㎍의 mRNA를 접촉시켜 세포 당 43,000±20% 카피의 외인성 단백질을 발현하는 세포의 집단을 발생시키는, 방법.
  118. 제114항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 집단의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%가 세포가 외인성 단백질과 접촉된 지 1일 후에 외인성 단백질을 발현하는 방법.
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