JP2019520829A - 外来性rnaを発現する治療的細胞系に関連する組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる2016年7月7日出願の米国特許出願第62/359416号明細書に対する優先権を主張する。
本出願は、配列表を含み、この配列表は、ASCIIフォーマットで電子的に提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。2017年7月7日に作製された前記ASCIIコピーは、R2081−7015WO_SL.txtと命名され、921バイトのサイズを有する。
a)赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を、調節エレメントを含む異種UTRに作動可能に結合されたコード領域を含む外来性mRNA(例えば、単離RNA又はインビトロ転写RNA)と接触させることと、
b)接触された赤血球細胞を外来性mRNAの取込みに好適な条件下で維持することと
を含み、それにより、赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞を生成する。
a)赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を、表1の1つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表2の1つ以上の化学的バックボーン修飾、表3の1つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む外来性mRNAと接触させることと、
b)接触された赤血球細胞を外来性mRNAの取込みに好適な条件下で維持することと
を含み、それにより、赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞を生成する。
a)調節エレメントを含む異種UTRに作動可能に結合されたコード領域を含む外来性mRNA(例えば、単離RNA又はインビトロ転写RNA)を含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を提供し、且つ
b)赤血球細胞を外来性タンパク質の生成に好適な条件下で培養し、それにより、外来性タンパク質を生成する。
a)表1の1つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表2の1つ以上の化学的バックボーン修飾、表3の1つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を提供し、且つ
b)赤血球細胞を外来性タンパク質の生成に好適な条件下で培養し、それにより、外来性タンパク質を生成する。
調節エレメントを含む異種UTRに作動可能に結合されたコード領域を含む外来性mRNA(例えば、単離RNA又はインビトロ転写RNA)を含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を対象に投与すること
を含み、それにより、外来性タンパク質を対象に提供するか、外来性タンパク質を生成することができる脱核赤血球細胞を対象に提供するか、又は対象を処置する。
赤血球細胞、例えば表1の1つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表2の1つ以上の化学的バックボーン修飾、表3の1つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む外来性mRNAを含む有核赤血球細胞を対象に投与すること
を含み、それにより、外来性タンパク質を対象に提供するか、外来性タンパク質を生成することができる脱核赤血球細胞を対象に提供するか、又は対象を処置する。
a)調節エレメントを含む異種UTRに作動可能に結合されたコード領域を含む外来性mRNAを含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞(又はそのような細胞のバッチ)を提供することと、
b)赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞(又はそのような細胞のバッチ)を、予め選択されたパラメーターに関して評価することと
を含み、それにより、赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞(又はそのような細胞のバッチ)を評価する。
a)表1の1つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表2の1つ以上の化学的バックボーン修飾、表3の1つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を提供することと、
b)赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞(又はそのような細胞のバッチ)を、予め選択されたパラメーターに関して評価することと
を含み、それにより、赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞(又はそのような細胞のバッチ)を評価する。
a)赤血球細胞を、外来性タンパク質をコードする、本明細書に記載される外来性mRNA(例えば、単離RNA又はインビトロ転写RNA)と接触させることであって、外来性mRNAは、表1の1つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表2の1つ以上の化学的バックボーン修飾若しくは表3の1つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む、接触させることと、
b)赤血球細胞を外来性タンパク質の生成に好適な条件下で培養することと
を含み、それにより、外来性タンパク質を含む脱核赤血球細胞を生成する。
c)外来性RNAの取込み後に赤血球細胞を培養するステップ
を含む。
a)成熟段階における赤血球細胞を提供することと、
b)赤血球細胞を、外来性タンパク質をコードするmRNAと、赤血球細胞によるmRNAの取込みを可能にする条件下で接触させる(例えば、電気穿孔する)ことと
を含み、それにより、外来性タンパク質をコードするmRNAを含む赤血球細胞を製造する。
a)成熟段階における赤血球細胞を提供することと、
b)赤血球細胞によるmRNAの取込みを可能にする条件下において、赤血球細胞を、外来性タンパク質をコードするmRNAと接触させることと
を含み、それにより、外来性タンパク質をコードするmRNAを含む赤血球細胞を製造する。
i.a)集団における細胞の2〜40%、3〜33%、5〜30%、10〜25%、又は15〜20%は、脱核されていること、
i.b)集団における細胞の0%、0.1%、0.2%、又は0.5%を超えるが、2%、3%、4%、又は5%未満は、脱核されていること、
i.c)集団における細胞の0%、0.1%、0.2%、又は0.5%を超えるが、6%、10%、15%、20%、又は25%未満は、脱核されていること、
i.d)集団における細胞の0%、0.1%、0.2%、又は0.5%を超えるが、30%、35%、40%、45%、又は50%未満は、脱核されていること、
i.e)集団における細胞の1%、2%、3%、5%、10%、15%、又は20%以下は、脱核されていること、
i.f)集団における細胞の25%、30%、35%、40%、45%、又は50%以下は、脱核されていること、
i.g)細胞の集団は、最大脱核の6〜70%、10〜60%、20〜50%、又は30〜40%に到達していること、
i.h)細胞の集団は、最大脱核の1%、2%、3%、5%、10%、15%、又は20%以下に到達していること、
i.i)細胞の集団は、最大脱核の25%、30%、35%、40%、45%、50%、又は60%以下に到達していること、
ii.a)細胞の集団は、細胞分裂におけるプラトーから3、2、又は1未満だけ倍加した集団であること、
ii.b)細胞の集団は、3、2、又は1未満の集団の倍加が可能であること、
ii.c)集団は、集団が集団における細胞の少なくとも70%の脱核レベルに到達する前に1.5、2、又は3倍以下だけ増大すること、
iii.a)集団における細胞の少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)であること、
iii.b)集団における細胞の少なくとも50%、60%、70%、75%、又は79%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)であること、
iii.c)集団における細胞の30〜90%、40〜90%、50〜90%、60〜90%、又は70〜90%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)であること、
iii.d)集団における細胞の少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)の形態を示すこと、
iii.e)集団における細胞の少なくとも50%、60%、70%、75%、又は79%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)の形態を示すこと、又は
iii.f)集団における細胞の30〜90%、40〜90%、50〜90%、60〜90%、又は70〜90%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)の形態を示すこと
の1つ以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、又はそれを超える)を含む赤血球細胞の集団である。
(a)赤血球前駆体細胞(例えば、CD34+細胞)の集団を提供することと、
(b)赤血球前駆体細胞の集団を分化条件下で培養して、分化している赤血球細胞の集団を提供することと、
(c)分化している赤血球細胞を、外来性タンパク質をコードするmRNAと、分化している赤血球細胞によるmRNAの取込みを可能にする条件下で接触させることであって、分化している赤血球細胞の集団が0.1〜25%脱核されている(例えば、0.1〜20%脱核されている、0.1〜15%脱核されている、0.1〜12%脱核されている、又は0.1〜10%脱核されている)ときに行われる、接触させることと、
(d)分化している赤血球細胞を更に培養して、網状赤血球の集団を提供することと
を含み、それにより、外来性タンパク質を発現する網状赤血球の集団を製造する。
赤血球細胞及び外来性タンパク質をコードするmRNAを含む反応混合物を、例えば反応混合物中にリボヌクレアーゼ阻害剤を含めることにより、mRNAの分解を阻害する条件下で提供することと、
赤血球細胞によるmRNAの取込みを可能にする条件下で反応混合物を維持することと
を含み、それにより、外来性タンパク質をコードするmRNAを含む赤血球細胞を作製する。
外来性タンパク質を含む脱核赤血球細胞を含む反応混合物を提供することと、
例えば、反応混合物のアリコートにおける例えばELISA、ウェスタンブロット、又は質量分析により、リボヌクレアーゼ阻害剤の存在又はレベルに関してアッセイすることと
を含む。
集団を、例えば必須要件を満たすか又は必須要件を満たさないとして分類することであって、必須要件は、例えば、リボヌクレアーゼ阻害剤のレベルが基準値を下回る場合に満たされる、分類すること、
例えば、リボヌクレアーゼ阻害剤のレベルが基準値を上回る場合、集団が、続く精製ステップに好適であるとき、集団を、続く処理ステップに好適であるか又は好適でないとして分類すること、
集団を、治療としての使用に好適であるか又は好適でないとして分類すること、又は
例えば、リボヌクレアーゼ阻害剤のレベルが基準値を下回る場合、集団又はそのアリコートを治療的使用のために処方又は包装すること
の1つ以上を更に含む。
赤血球細胞及び外来性タンパク質をコードするmRNAを含む反応混合物を、例えば反応混合物中にプロテアーゼ阻害剤、例えばプロテアソーム阻害剤を含めることにより、タンパク質分解を阻害する条件下で提供することと、
赤血球細胞によるmRNAの取込みを可能にする条件下で反応混合物を維持することと
を含み、それにより、外来性タンパク質をコードするmRNAを含む赤血球細胞を作製する。
外来性タンパク質を含む脱核赤血球細胞を含む反応混合物を提供することと、
例えば、反応混合物のアリコートにおける例えばELISA、ウェスタンブロット、又は質量分析により、プロテアソーム阻害剤の存在又はレベルに関してアッセイすることと
を含む。
集団を、例えば必須要件を満たすか又は必須要件を満たさないとして分類することであって、必須要件は、例えば、プロテアソーム阻害剤のレベルが基準値を下回る場合に満たされる、分類すること、
例えば、プロテアソーム阻害剤のレベルが基準値を上回る場合、集団が、続く精製ステップに好適であるとき、集団を、続く処理ステップに好適であるか又は好適でないとして分類すること、
集団を、治療としての使用に好適であるか又は好適でないとして分類すること、
例えば、プロテアソーム阻害剤のレベルが基準値を下回る場合、集団又はそのアリコートを治療的使用のために処方又は包装すること
の1つ以上を更に含む。
a)例えば、成熟段階における赤血球細胞を提供することと、
b)赤血球細胞を、第1の外来性タンパク質をコードする第1のmRNA及び第2の外来性タンパク質をコードする第2のmRNAと、赤血球細胞による第1のmRNA及び第2のmRNAの取込みを可能にする条件下で接触させることと
を含み、それにより、第1のmRNA及び第2のmRNAを含む赤血球細胞を作製する、方法である。
a)例えば、成熟段階における赤血球細胞を提供することと、
b)赤血球細胞の集団を、第1の外来性タンパク質をコードする第1のmRNA、及び第2の外来性タンパク質をコードする第2のmRNAと接触させることと
を含み、それにより、外来性タンパク質をコードするmRNAを含む赤血球細胞を作製し、集団における細胞の少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%は、第1のmRNA及び第2のmRNAの両方を含む。
1細胞当たり外来性タンパク質の所定の数のコピーを含む複数の赤血球細胞を提供することであって、赤血球細胞は、集団を、外来性タンパク質をコードする所定の量のmRNAと接触させることによって作製されたものである、提供することと、
複数の赤血球細胞における外来性タンパク質の量を決定することと
を含む。
細胞集団を、集団における5E6細胞当たり0.6±50%、±20%又は±10%ugのmRNAと接触させることが、1細胞当たり外来性タンパク質の1,000,000±50%、±20%又は±10%のコピーを発現する細胞の集団を産出すること、
細胞集団を、集団における5E6細胞当たり0.4±50%、±20%又は±10%ugのmRNAと接触させることが、1細胞当たり外来性タンパク質の870,000±50%、±20%のコピーを発現する細胞の集団を産出すること、
細胞集団を、集団における5E6細胞当たり0.2±50%、±20%又は±10%ugのmRNAと接触させることが、1細胞当たり外来性タンパク質の610,000±50%、±20%、又は±10%のコピーを発現する細胞の集団を産出すること、
細胞集団を、集団における5E6細胞当たり0.1±50%、±20%又は±10%ugのmRNAと接触させることが、1細胞当たり外来性タンパク質の270,000±50%、±20%、又は±10%のコピーを発現する細胞の集団を産出すること、
細胞集団を、集団における5E6細胞当たり0.05±50%、±20%又は±10%ugのmRNAと接触させることが、1細胞当たり外来性タンパク質の100,000±50%、±20%、又は±10%のコピーを発現する細胞の集団を産出すること、又は
細胞集団を、集団における5E6細胞当たり0.025±50%、±20%又は±10%ugのmRNAと接触させることが、1細胞当たり外来性タンパク質の43,000±50%、±20%、又は±10%のコピーを発現する細胞の集団を産出すること
を含む。
集団における細胞の2〜40%、3〜33%、5〜30%、10〜25%、又は15〜20%は、脱核されていること、
集団における細胞の3%、5%、10%、20%、又は30%未満は、脱核されていること、
集団における細胞の0を超え(例えば、0.1%、0.2%、0,5%)且つ50%(40%、30%、20%、18%、15%、12%、10%)以下は、脱核されていること、
細胞の集団は、最大脱核の6〜70%、10〜60%、20〜50%、又は30〜40%に到達していること、
細胞の集団は、最大脱核の6%、10%、20%、30%、40%、50%、又は60%未満に到達していること、
細胞の集団は、BONCATアッセイ、例えば実施例10の翻訳アッセイによって測定されて、少なくとも600,000、800,000、1,000、000、1,200,000、1,400,000、1,600,000、1,800,000、2,000,000、2,200,000、又は2,400,000の翻訳活性を有すること、
細胞の集団は、BONCATアッセイ、例えば実施例10の翻訳アッセイによって測定されて、600,000〜2,400,000、800,000〜2,200,000、1,000、000〜2,000,000、1,200,000〜1,800,000、又は1,400,000〜1,600,000の翻訳活性を有すること、
成熟段階における細胞の集団は、最大翻訳活性の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%を有し、最大翻訳活性は、同様の数の、成熟段階における細胞の前駆体又は前駆細胞、例えばCD34+細胞の最大翻訳活性を指すこと、
集団における細胞の0.1〜25%は、脱核され、細胞の集団は、細胞分裂におけるプラトーから1、2又は3未満だけ倍加した集団であること、
細胞の集団は、細胞分裂におけるプラトーから3、2、又は1未満だけ倍加した集団であること、
細胞の集団は、3、2、又は1未満の集団の倍加が可能であること、
集団は、集団が集団における細胞の少なくとも70%の脱核レベルに到達する前に1.5、2、又は3倍以下だけ増大すること、
集団における細胞の84〜99%、85〜95%、又は約90%は、GPA陽性(例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例10のフローサイトメトリーアッセイによって測定して)であること、
集団における細胞の少なくとも84%、85%、90%、95%、又は99%は、GPA陽性(例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例10のフローサイトメトリーアッセイによって測定して)であること、
集団における細胞の54〜99%、55〜98%、60〜95%、65〜90%、70〜85%、又は75〜80%は、バンド3陽性(例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例10のフローサイトメトリーアッセイによって測定して)であること、
集団における細胞の少なくとも54%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、又は99%は、バンド3陽性(例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例10のフローサイトメトリーアッセイによって測定して)であること、
集団における細胞の96〜100%、97〜99%、又は約98%は、α4インテグリン陽性(例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例10のフローサイトメトリーアッセイによって測定して)であること、
集団における細胞の少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%は、α4インテグリン陽性(例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例10のフローサイトメトリーアッセイによって測定して)であること、
集団における細胞の少なくとも50%(例えば、少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%)は、α4インテグリン陽性及びバンド3陽性であること、又は
集団における細胞の少なくとも50%の細胞は、バンド3陽性であり、及び少なくとも90%〜95%は、α4インテグリン陽性であること
の1つ以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8又はそれを超える)である、赤血球細胞の集団である。
本明細書で使用するとき、用語「抗体分子」は、タンパク質、例えば少なくとも1つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む免疫グロブリン鎖又はその断片を指す。用語「抗体分子」は、抗体及び抗体断片を包含する。一実施形態において、抗体分子は、多特異性抗体分子、例えば二重特異性抗体分子である。抗体分子の例としては、限定されるものではないが、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv断片、scFv抗体断片、ジスルフィド結合Fvs(sdFv)、VH及びCH1ドメインからなるFd断片、線状抗体、sdAb(VL又はVHのいずれか)等の単一ドメイン抗体、ラクダ科動物VHHドメイン、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって結合された2つのFab断片を含む二価断片等の抗体断片から形成された多特異性抗体、抗体の単離されたエピトープ結合断片、マキシボディ(maxibodies)、ミニボディ(minibodies)、ナノボディ、細胞内抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、v−NAR及びビス−scFvが挙げられる。
外来性RNAは、非修飾又は修飾核酸塩基を含むことができる。天然に生じるRNAは、4つの塩基性リボヌクレオチド:ATP、CTP、UTP及びGTPから合成されるが、転写後に修飾されたヌクレオチドを含むことができる。更に、およそ100の異なるヌクレオシド修飾がRNAで特定されている(Rozenski,J,Crain,P,and McCloskey,J.(1999).The RNA Modification Database:1999 update.Nucl Acids Res 27:196−197)。RNAは、天然に生じない完全合成ヌクレオチドも含むことができる。
本明細書に記載される外来性mRNAは、1つ以上の(例えば、2つ、3つ、4つ、又はそれを超える)異種UTRを含むことができる。UTRは、例えば、3’UTR又は5’UTRであり得る。実施形態において、異種UTRは、真核生物、例えば動物、例えば哺乳動物、例えばヒトUTR配列、又は前述のいずれかの一部若しくは変異体を含む。実施形態において、異種UTRは、合成配列を含む。実施形態において、異種UTRは、ウイルスUTR以外、例えば肝炎ウイルスUTR以外、例えばWoodchuck肝炎ウイルスUTR以外である。
実施形態において、UTRは、調節エレメントを含む。調節エレメントは、それが作動可能に結合されたコード領域の特性(例えば、安定性又は翻訳レベル)を調節(例えば、上方調節又は下方調節)することができる。いくつかの実施形態において、調節エレメントは、RNAの翻訳のタイミングを制御する。例えば、RNAは、細胞周期の段階、病原体(例えば、細胞に侵入するウイルス)の存在若しくはレベル、赤血球細胞分化のステージ、細胞内の分子(例えば、代謝産物、シグナル伝達分子、又はmiRNA等のRNA)の存在若しくはレベル、又は細胞外の分子(例えば、赤血球細胞の表面上の受容体により結合されたタンパク質)の存在若しくはレベルに応答して翻訳され得る。
いくつかの実施形態において、非翻訳領域は、野生型赤血球細胞、例えば成熟赤血球細胞内で発現するRNAのUTRである。実施形態において、UTRは、I型赤血球細胞膜貫通タンパク質(例えば、グリコホリンA)、II型赤血球細胞膜貫通タンパク質(例えば、Kell又はCD71)、又はGLUT1等のIII型赤血球細胞膜貫通タンパク質に関する遺伝子のUTRである。実施形態において、UTRは、CD235a、c−Kit、GPA、IL3R、CD34、CD36、CD71、バンド3、ヘモグロビン、及びα4インテグリン等の赤血球細胞タンパク質のUTRである。実施形態において、UTRは、スペクトリン、アンキリン、4.1R、4.2、p55、トロポモジュリン、又は4.9に関する遺伝子のUTRである。
本発明は、いくつかの態様において、調節RNAを含む赤血球細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、外来性mRNAを更に含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるRNA(例えば、mRNA)は、脂質ナノ粒子(LNP)を使用して、例えば遺伝子導入により赤血球細胞内に導入される。従って、いくつかの態様において、本開示は、外来性タンパク質をコードするmRNAを赤血球細胞内に導入する方法を提供し、方法は、赤血球細胞をmRNA及びLNP、例えば本明細書に記載されるLNPと接触させることを含む。本開示は、赤血球細胞、mRNA、及びLNPを含む反応混合物も提供する。いくつかの実施形態において、mRNAは、LNPと複合体化される。実施形態において、LNPと接触する細胞の集団は、少なくとも1×107、2×107、5×107、1×108、2×108、5×108、1×109、2×109、又は5×109、1×1010、2×1010、又は5×1010細胞を含む。
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、及びR8は、独立して、水素、任意選択的に置換されたC7−C30アルキル、任意選択的に置換されたC7−C30アルケニル及び任意選択的に置換されたC7−C30アルキニルからなる群から選択され;
但し、(a)R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、及びR8の少なくとも2つは、水素ではなく、(b)水素ではないR1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、及びR8の少なくとも2つの2つは、互いに対して1、3配置、1、4配置又は1、5配置で存在することを条件とし;
Xは、C1−C6アルキル、C2−C6アルケニル及びC2−C6アルキニルからなる群から選択され;
R9、R10、及びR11は、独立して、水素、任意選択的に置換されたC1−C7アルキル、任意選択的に置換されたC2−C7アルケニル及び任意選択的に置換されたC2−C7アルキニルからなる群から選択され、但し、R9、R10、及びR11の1つは、存在しなくてもよいことを条件とし;
n及びmは、各々独立して0又は1である。
赤血球前駆体細胞の成熟赤血球細胞への分化方法は、既知である。例えば、Douay&Andreu.Transfus Med Rev.2007 Apr;21(2):91−100;Giarratana et al.Nat Biotechnol.2005 Jan;23(1):69−74;Olivier et al.Stem Cells Transl Med.2012 Aug;1(8):604−614、及びそれに引用される参考文献を参照されたい。
外来性タンパク質の1つ以上は、真核生物細胞、例えば哺乳動物細胞、例えばヒト細胞の翻訳後修飾特性を有し得る。いくつかの実施形態において、外来性タンパク質の1つ以上(例えば、2、3、4、5、又はそれを超える)は、グリコシル化され、リン酸化され、又はそれらの両方である。糖タンパク質のインビトロ検出は、過ヨウ素酸シッフ(PAS)方法を用いて、SDS−PAGEゲル及びウェスタンブロットで日常的に達成される。糖タンパク質の細胞局在化は、当技術分野で既知のレクチン蛍光コンジュゲートを利用して達成することができる。リン酸化は、リン酸化特異的抗体を使用したウェスタンブロットにより評価することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される赤血球細胞は、本明細書に記載される1つ以上の(例えば、2、3、4、又はそれを超える)物理的特性、例えば浸透圧脆弱性、細胞サイズ、ヘモグロビン濃度、又はホスファチジルセリン含有量を有する。理論に束縛されるものではないが、いくつかの実施形態において、外来性タンパク質を発現する脱核赤血球細胞は、野生型の未処理赤血球細胞(例えば、低張透析に供されていない赤球細胞)に類似した物理的特性を有する。対照的に、低張負荷されたRBCは、ときに、浸透圧脆弱性の増大、細胞サイズの変化、ヘモグロビン濃度の低下、又は細胞膜外葉のホスファチジルセリンレベルの増大等、物理的特性の変化を示す。
いくつかの実施形態において、脱核赤血球細胞は、外来性ポリペプチドを含まない、単離された未培養赤血球細胞と実質的に同じ浸透圧膜脆弱性を示す。いくつかの実施形態において、脱核赤血球細胞の集団は、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%、又は0.5% NaClでの50%未満の細胞溶解の浸透圧脆弱性を有する。いくつかの実施形態において、脱核赤血球細胞の集団は、水中0.3%、0.35%、0.4%、0.45%、又は0.5% NaClからなる溶液中で50%未満の細胞溶解の浸透圧脆弱性を有する。浸透圧脆弱性は、いくつかの実施形態では、国際公開第2015/073587号パンフレットの実施例59の方法を用いて決定される。
いくつかの実施形態において、脱核赤血球細胞は、野生型の未処理網状赤血球とほぼ同じ直径又は容積を有する。いくつかの実施形態において、脱核赤血球細胞は、約150fL、例えば約140〜160、130〜170、又は120〜180fLの容積を有する。いくつかの実施形態において、集団は、約150fL、約140〜160、130〜170、120〜180、110〜190、又は100〜200fLの平均細胞容積を有する。いくつかの実施形態において、集団における少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、又は99%の細胞は、約140〜160、130〜170、120〜180、110〜190、又は100〜200fLの容積を有する。いくつかの実施形態において、赤血球細胞の平均赤血球容積の容積は、10fL、20fL、30fL、40fL、50fL、60fL、70fL、80fL、90fL、100fL、110fL、120fL、130fL、140fL、150fLを超え、又は150fLを超える。一実施形態において、赤血球細胞の平均赤血球容積は、30fL、40fL、50fL、60fL、70fL、80fL、90fL、100fL、110fL、120fL、130fL、140fL、150fL、160fL、170fL、180fL、190fL、200fL未満、又は200fL未満である。一実施形態において、赤血球細胞の平均赤血球容積は、80〜100、100〜200、200〜300、300〜400、又は400〜500フェムトリットル(fL)である。いくつかの実施形態において、赤血球細胞の集団は、この段落に示す平均赤血球容積を有し、集団の標準偏差は、50、40、30、20、10、5、又は2fL未満である。容積は、いくつかの実施形態において、血液系分析機器、例えばコールターカウンターを使用して測定される。
いくつかの実施形態において、脱核赤血球細胞は、野生型の未処理赤血球細胞、例えば成熟RBCと同様のヘモグロビン含有量を有する。いくつかの実施形態において、赤血球細胞は、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%を超える、又は10%を超える胎児ヘモグロビンを含む。いくつかの実施形態において、赤血球細胞は、少なくとも約20、22、24、26、28、又は30pg、及び任意選択的に約30pgまでの総ヘモグロビンを含む。ヘモグロビンレベルは、いくつかの実施形態において、国際公開第2015/073587号パンフレットの実施例33のDrabkin試薬方法を用いて決定される。
いくつかの実施形態において、脱核赤血球細胞は、野生型の未処理RBCとほぼ同じホスファチジルセリン含有量をその細胞膜外葉に有する。ホスファチジルセリンは、野生型の未処理RBCsの細胞膜の内葉に優勢に存在し、低張負荷は、外葉にホスファチジルセリンを分布させ得、そこでホスファチジルセリンが免疫応答を引き起こし得る。いくつかの実施形態において、RBCの集団は、約30、25、20、15、10、9、8、6、5、4、3、2、又は1%未満の、Annexin V染色に対して陽性の細胞を含む。いくつかの実施形態において、集団における脱核細胞の少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%は、外来性タンパク質を発現しない他に同様の培養赤血球細胞と同じホスファチジルセリン暴露のレベルを有する。ホスファチジルセリン暴露は、いくつかの実施形態において、PSに選択的に結合するAnnexin−V−FITCに関する染色、及び例えば国際公開第2015/073587号パンフレットの実施例54の方法を用いてフローサイトメトリーによりFITC蛍光を測定することによって評価される。
いくつかの実施形態において、赤血球細胞の集団は、少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、又は95%(及び任意選択的に90又は100%まで)の、GPAに対して陽性の細胞を含む。GPAの存在は、いくつかの実施形態において、FACSを使用して検出される。
実施形態において、脱核赤血球細胞は、CD34+幹細胞を次の3つの条件に暴露することにより生成される:最初に増殖条件、次いで分化条件、及び最終的に成熟条件。例示的な増殖、分化、及び成熟条件は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2015/073587号パンフレットの段落[1221]の実施例3にそれぞれステップ1、2、及び3として記載されている。実施形態において、増殖段階は、増殖培地(例えば、上記のステップ1の培地)中で細胞を培養することを含み、分化段階は、分化培地(例えば、上記のステップ2の培地)中で細胞を培養することを含み、成熟段階は、成熟培地(例えば、上記のステップ3の培地)中で細胞を培養することを含む。
外来性RNA及び/又はタンパク質を含む(例えば、発現する)赤血球細胞を投与する方法は、例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2015/073587号パンフレット及び国際公開第2015/153102号パンフレットに記載されている。
1.外来性タンパク質をコードする核酸、例えばmRNAを含む赤血球細胞を作製する方法であって、
a)成熟段階における赤血球細胞を提供することと、
b)赤血球細胞を、外来性タンパク質をコードする核酸、例えばmRNAと、赤血球細胞による核酸、例えばmRNAの取込みを可能にする条件下で接触させることと
を含み、それにより、外来性タンパク質をコードする核酸、例えばmRNAを含む赤血球細胞を作製する、方法。
(a)赤血球前駆体細胞(例えば、CD34+細胞)の集団を提供することと、
(b)赤血球前駆体細胞の集団を分化条件下で培養して、分化している赤血球細胞の集団を提供することと、
(c)分化している赤血球細胞の集団の複数の細胞を、外来性タンパク質をコードする核酸、例えばmRNAと、分化している赤血球細胞の集団の複数の細胞による核酸、例えばmRNAの取込みを可能にする条件下で接触させることと、
(d)分化している赤血球細胞の集団の複数の細胞を更に培養して、網状赤血球の集団を提供することと
を含み、それにより、外来性タンパク質を発現する網状赤血球の集団を製造する、方法。
i.a)集団における細胞の2〜40%、3〜33%、5〜30%、10〜25%、又は15〜20%は、脱核されていること、
i.b)集団における細胞の0%、0.1%、0.2%、又は0.5%を超えるが、2%、3%、4%、又は5%未満は、脱核されていること、
i.c)集団における細胞の0%、0.1%、0.2%、又は0.5%を超えるが、6%、10%、15%、20%、又は25%未満は、脱核されていること、
i.d)集団における細胞の0%、0.1%、0.2%、又は0.5%を超えるが、30%、35%、40%、45%、又は50%未満は、脱核されていること、
i.e)集団における細胞の1%、2%、3%、5%、10%、15%、又は20%以下の細胞は、脱核されていること、
i.f)集団における細胞の25%、30%、35%、40%、45%、又は50%以下は、脱核されていること、
i.g)細胞の集団は、最大脱核の6〜70%、10〜60%、20〜50%、又は30〜40%に到達していること、
i.h)細胞の集団は、最大脱核の1%、2%、3%、5%、10%、15%、又は20%以下に到達していること、
i.i)細胞の集団は、最大脱核の25%、30%、35%、40%、45%、50%、又は60%以下に到達していること、
ii.a)細胞の集団は、細胞分裂におけるプラトーから3、2、又は1未満だけ倍加した集団であること、
ii.b)細胞の集団は、3、2、又は1未満の集団の倍加が可能であること、
ii.c)集団は、集団が集団における細胞の少なくとも70%の脱核レベルに到達する前に1.5、2、又は3倍以下だけ増大すること、
iii.a)集団における最大脱核の少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)であること、
iii.b)集団における最大脱核の少なくとも50%、60%、70%、75%、又は79%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)であること、
iii.c)集団における最大脱核の30〜90%、40〜90%、50〜90%、60〜90%、又は70〜90%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)であること、
iii.d)集団における最大脱核の少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)の形態を示すこと、
iii.e)集団における最大脱核の少なくとも50%、60%、70%、75%、又は79%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)の形態を示すこと、
iii.f)集団における最大脱核の30〜90%、40〜90%、50〜90%、60〜90%、又は70〜90%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)の形態を示すこと、
iv.a)細胞の集団は、最大翻訳活性の少なくとも60%、70%、80%、又は90%を有すること、
iv.b)細胞の集団は、最大翻訳活性の少なくとも20%、30%、40%、又は50%を有すること、
iv.c)細胞の集団は、BONCATアッセイ、例えば実施例10の翻訳アッセイによって測定されて、少なくとも600,000、800,000、1,000、000、1,200,000、1,400,000、1,600,000、1,800,000、2,000,000、2,200,000、又は2,400,000の翻訳活性を有すること、又は
iv.d)細胞の集団は、BONCATアッセイ、例えば実施例10の翻訳アッセイによって測定されて、600,000〜2,400,000、800,000〜2,200,000、1,000、000〜2,000,000、1,200,000〜1,800,000、又は1,400,000〜1,600,000の翻訳活性を有すること
の1つ以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、又はそれを超える)を含む赤血球細胞の集団である、実施形態3〜9のいずれかの方法。
(e)赤血球前駆体細胞(例えば、CD34+細胞)の集団を提供することと、
(f)赤血球前駆体細胞の集団を分化条件下で培養して、分化している赤血球細胞の集団を提供することと、
(g)分化している赤血球細胞を、外来性タンパク質をコードするmRNAと、分化している赤血球細胞によるmRNAの取込みを可能にする条件下で接触させることであって、分化している赤血球細胞の集団が0.1〜25%脱核されている(例えば、0.1〜20%脱核されている、0.1〜15%脱核されている、0.1〜12%脱核されている、又は0.1〜10%脱核されている)ときに行われる、接触させることと、
(h)分化している赤血球細胞を更に培養して、網状赤血球の集団を提供することと
を含み、それにより、外来性タンパク質を発現する網状赤血球の集団を製造する、方法。
a)赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を、調節エレメントを含む異種UTRに作動可能に結合されたコード領域を含む外来性mRNA(例えば、単離RNA又はインビトロ転写RNA)と接触させることと、
b)接触された赤血球細胞を外来性mRNAの取込みに好適な条件下で維持することと
を含み、それにより、赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞を生成する、方法。
a)赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を、表1の1つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表2の1つ以上の化学的バックボーン修飾、表3の1つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む外来性mRNAと接触させることと、
b)接触された赤血球細胞を外来性mRNAの取込みに好適な条件下で維持することと
を含み、それにより、赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞を生成する、方法。
a)調節エレメントを含む異種UTRに作動可能に結合されたコード領域を含む外来性mRNA(例えば、単離RNA又はインビトロ転写RNA)を含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を提供し、且つ
b)赤血球細胞を外来性タンパク質の生成に好適な条件下で培養し、それにより、外来性タンパク質を生成する、方法。
a)表1の1つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表2の1つ以上の化学的バックボーン修飾、表3の1つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を提供することと、
b)赤血球細胞を外来性タンパク質の生成に好適な条件下で培養することと
を含み、それにより、外来性タンパク質を生成する、方法。
調節エレメントを含む異種UTRに作動可能に結合されたコード領域を含む外来性mRNA(例えば、単離RNA又はインビトロ転写RNA)を含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を対象に投与すること
を含み、それにより、外来性タンパク質を対象に提供するか、外来性タンパク質を生成することができる脱核赤血球細胞を対象に提供するか、又は対象を処置する、方法。
赤血球細胞、例えば表1の1つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表2の1つ以上の化学的バックボーン修飾、表3の1つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む外来性mRNAを含む有核赤血球細胞を対象に投与すること
を含み、それにより、外来性タンパク質を対象に提供するか、外来性タンパク質を生成することができる脱核赤血球細胞を対象に提供するか、又は対象を処置する、方法。
a)調節エレメントを含む異種UTRに作動可能に結合されたコード領域を含む外来性mRNAを含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞(又はそのような細胞のバッチ)を提供することと、
b)赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞(又はそのような細胞のバッチ)を、予め選択されたパラメーターに関して評価することと
を含み、それにより、赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞(又はそのような細胞のバッチ)を評価する、方法。
a)表1の1つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表2の1つ以上の化学的バックボーン修飾、表3の1つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を提供することと、
b)赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞(又はそのような細胞のバッチ)を、予め選択されたパラメーターに関して評価することと
を含み、それにより、赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞(又はそのような細胞のバッチ)を評価する、方法。
赤血球細胞及び外来性タンパク質をコードするmRNAを含む反応混合物を、例えば反応混合物中にリボヌクレアーゼ阻害剤を含めることにより、mRNAの分解を阻害する条件下で提供することと、
赤血球細胞によるmRNAの取込みを可能にする条件下で反応混合物を維持することと
を含み、それにより、外来性タンパク質をコードするmRNAを含む赤血球細胞を作製する、方法。
i.a)集団における細胞の2〜40%、3〜33%、5〜30%、10〜25%、又は15〜20%は、脱核されていること、
i.b)集団における細胞の0%、0.1%、0.2%、又は0.5%を超えるが、2%、3%、4%、又は5%未満は、脱核されていること、
i.c)集団における細胞の0%、0.1%、0.2%、又は0.5%を超えるが、6%、10%、15%、20%、又は25%未満は、脱核されていること、
i.d)集団における細胞の0%、0.1%、0.2%、又は0.5%を超えるが、30%、35%、40%、45%、又は50%未満は、脱核されていること、
i.e)集団における細胞の1%、2%、3%、5%、10%、15%、又は20%以下は、脱核されていること、
i.f)集団における細胞の25%、30%、35%、40%、45%、又は50%以下は、脱核されていること、
i.g)細胞の集団は、最大脱核の6〜70%、10〜60%、20〜50%、又は30〜40%に到達していること、
i.h)細胞の集団は、最大脱核の1%、2%、3%、5%、10%、15%、又は20%以下に到達していること、
i.i)細胞の集団は、最大脱核の25%、30%、35%、40%、45%、50%、又は60%以下に到達していること、
ii.a)細胞の集団は、細胞分裂におけるプラトーから3、2、又は1未満だけ倍加した集団であること、
ii.b)細胞の集団は、3、2、又は1未満の集団の倍加が可能であること、
ii.c)集団は、集団が集団における細胞の少なくとも70%の脱核レベルに到達する前に1.5、2、又は3倍以下だけ増大すること、
iii.a)集団における細胞の少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)であること、
iii.b)集団における細胞の少なくとも50%、60%、70%、75%、又は79%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)であること、
iii.c)集団における細胞の30〜90%、40〜90%、50〜90%、60〜90%、又は70〜90%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)の形態を示すこと、
iii.d)集団における細胞の少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)の形態を示すこと、
iii.e)集団における細胞の少なくとも50%、60%、70%、75%、又は79%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)の形態を示すこと、
iii.f)集団における細胞の30〜90%、40〜90%、50〜90%、60〜90%、又は70〜90%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)の形態を示すこと、
iv.a)細胞の集団は、最大翻訳活性の少なくとも60%、70%、80%、又は90%を有すること、
iv.b)細胞の集団は、最大翻訳活性の少なくとも20%、30%、40%、又は50%を有すること、
iv.c)BONCATアッセイ、例えば実施例10の翻訳アッセイによって測定されて、細胞の集団は、少なくとも600,000、800,000、1,000、000、1,200,000、1,400,000、1,600,000、1,800,000、2,000,000、2,200,000、又は2,400,000の翻訳活性を有すること、又は
iv.d)BONCATアッセイ、例えば実施例10の翻訳アッセイによって測定されて、細胞の集団は、600,000〜2,400,000、800,000〜2,200,000、1,000、000〜2,000,000、1,200,000〜1,800,000、又は1,400,000〜1,600,000の翻訳活性を有すること
の1つ以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、又はそれを超える)を含む時点で細胞をリボヌクレアーゼ阻害剤と接触させることを含む、実施形態220〜229のいずれかの方法。
集団における細胞の84〜99%、85〜95%、又は約90%は、GPA陽性であること、
集団における細胞の少なくとも84%、85%、90%、95%、又は99%は、GPA陽性であること、
集団における細胞の54〜99%、55〜98%、60〜95%、65〜90%、70〜85%、又は75〜80%は、バンド3陽性であること、
集団における細胞の少なくとも54%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、又は99%は、バンド3陽性であること、
集団における細胞の96〜100%、97〜99%、又は約98%は、α4インテグリン陽性であること、又は
集団における細胞の少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%は、α4インテグリン陽性であること
の1つ以上(例えば、2、3、4、5、又はそれを超える)を含む時点で細胞をリボヌクレアーゼ阻害剤と接触させることを含む、実施形態220〜240のいずれかの方法。
外来性タンパク質を含む脱核赤血球細胞を含む反応混合物を提供することと、
例えば、反応混合物のアリコートにおける例えばELISA、ウェスタンブロット、又は質量分析により、リボヌクレアーゼ阻害剤の存在又はレベルに関してアッセイすることと
を含む方法。
集団を、例えば必須要件を満たすか又は必須要件を満たさないとして分類することであって、例えば、必須要件は、リボヌクレアーゼ阻害剤のレベルが基準値を下回る場合に満たされる、分類すること、
例えば、リボヌクレアーゼ阻害剤のレベルが基準値を上回る場合、集団が、続く精製ステップに好適であるとき、集団を、続く処理ステップに好適であるか又は好適でないとして分類すること、
集団を、治療としての使用に好適であるか又は好適でないとして分類すること、又は
例えば、リボヌクレアーゼ阻害剤のレベルが基準値を下回る場合、集団又はそのアリコートを治療的使用のために処方又は包装すること
の1つ以上を更に含む、実施形態255の方法。
赤血球細胞及び外来性タンパク質をコードするmRNAを含む反応混合物を、例えば反応混合物中にプロテアソーム阻害剤を含めることにより、タンパク質分解を阻害する条件下で提供することと、
赤血球細胞によるmRNAの取込みを可能にする条件下で反応混合物を維持することと
を含み、それにより、外来性タンパク質をコードするmRNAを含む赤血球細胞を作製する、方法。
i.a)集団における細胞の2〜40%、3〜33%、5〜30%、10〜25%、又は15〜20%は、脱核されていること、
i.b)集団における細胞の0%、0.1%、0.2%、又は0.5%を超えるが、2%、3%、4%、又は5%未満は、脱核されていること、
i.c)集団における細胞の0%、0.1%、0.2%、又は0.5%を超えるが、6%、10%、15%、20%、又は25%未満は、脱核されていること、
i.d)集団における細胞の0%、0.1%、0.2%、又は0.5%を超えるが、30%、35%、40%、45%、又は50%未満は、脱核されていること、
i.e)集団における細胞の1%、2%、3%、5%、10%、15%、又は20%以下は、脱核されていること、
i.f)集団における細胞の25%、30%、35%、40%、45%、又は50%以下は、脱核されていること、
i.g)細胞の集団は、最大脱核の6〜70%、10〜60%、20〜50%、又は30〜40%に到達していること、
i.h)細胞の集団は、最大脱核の1%、2%、3%、5%、10%、15%、又は20%以下に到達していること、
i.i)細胞の集団は、最大脱核の25%、30%、35%、40%、45%、50%、又は60%以下に到達していること、
ii.a)細胞の集団は、細胞分裂におけるプラトーから3、2、又は1未満だけ倍加した集団であること、
ii.b)細胞の集団は、3、2、又は1未満の集団の倍加が可能であること、
ii.c)集団は、集団が集団における細胞の少なくとも70%の脱核レベルに到達する前に1.5、2、又は3倍以下だけ増大すること、
iii.a)集団における細胞の少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)であること、
iii.b)集団における細胞の少なくとも50%、60%、70%、75%、又は79%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)であること、
iii.c)集団における細胞の30〜90%、40〜90%、50〜90%、60〜90%、又は70〜90%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)であること、
iii.d)集団における細胞の少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)の形態を示すこと、
iii.e)集団における細胞の少なくとも50%、60%、70%、75%、又は79%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)の形態を示すこと、
iii.f)細胞の30〜90%、40〜90%、50〜90%、60〜90%、又は70〜90%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)の形態を示すこと、
iv.a)細胞の集団は、最大翻訳活性の少なくとも60%、70%、80%、又は90%を有すること、
iv.b)細胞の集団は、最大翻訳活性の少なくとも20%、30%、40%、又は50%を有すること、
iv.c)細胞の集団は、BONCATアッセイ、例えば実施例10の翻訳アッセイによって測定されて、少なくとも600,000、800,000、1,000、000、1,200,000、1,400,000、1,600,000、1,800,000、2,000,000、2,200,000、又は2,400,000の翻訳活性を有すること、又は
iv.d)細胞の集団は、BONCATアッセイ、例えば実施例10の翻訳アッセイによって測定されて、600,000〜2,400,000、800,000〜2,200,000、1,000、000〜2,000,000、1,200,000〜1,800,000、又は1,400,000〜1,600,000の翻訳活性を有すること、
の1つ以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、又はそれを超える)を含む時点で細胞をプロテアソーム阻害剤と接触させることを含む、実施形態258〜267のいずれかの方法。
集団における細胞の84〜99%、85〜95%、又は約90%は、GPA陽性であること、
集団における細胞の少なくとも84%、85%、90%、95%、又は99%は、GPA陽性であること、
集団における細胞の54〜99%、55〜98%、60〜95%、65〜90%、70〜85%、又は75〜80%は、バンド3陽性であること、
集団における細胞の少なくとも54%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、又は99%は、バンド3陽性であること、
集団における細胞の96〜100%、97〜99%、又は約98%は、α4インテグリン陽性であること、又は
集団における細胞の少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%は、α4インテグリン陽性であること
の1つ以上(例えば、2、3、4、5、又はそれを超える)を含む時点で細胞をプロテアソーム阻害剤と接触させることを含む、実施形態258〜278のいずれかの方法。
外来性タンパク質を含む脱核赤血球細胞を含む反応混合物を提供することと、
例えば、反応混合物のアリコートにおける例えばELISA、ウェスタンブロット、又は質量分析により、プロテアソーム阻害剤の存在又はレベルに関してアッセイすることと
を含む方法。
集団を、例えば必須要件を満たすか又は必須要件を満たさないとして分類することであって、例えば、必須要件は、プロテアソーム阻害剤のレベルが基準値を下回る場合に満たされる、分類すること、
例えば、プロテアソーム阻害剤のレベルが基準値を上回る場合、集団が、続く精製ステップに好適であるとき、集団を、続く処理ステップに好適であるか又は好適でないとして分類すること、
集団を、治療としての使用に好適であるか又は好適でないとして分類すること、又は
例えば、プロテアソーム阻害剤のレベルが基準値を下回る場合、集団又はそのアリコートを治療的使用のために処方又は包装すること
の1つ以上を更に含む、実施形態293の方法。
a)例えば、成熟段階における赤血球細胞を提供することと、
b)赤血球細胞を、第1の外来性タンパク質をコードするmRNA、及び第2の外来性タンパク質をコードする第2のmRNAと、赤血球細胞による第1のmRNA及び第2のmRNAの取込みを可能にする条件下で接触させることと
を含み、それにより、第1のmRNA及び第2のmRNAを含む赤血球細胞を作製する、方法。
a)例えば、成熟段階における赤血球細胞の集団を提供することと、
b)赤血球細胞の集団を、第1の外来性タンパク質をコードする第1のmRNA、及び第2の外来性タンパク質をコードする第2のmRNAと接触させることと
を含み、それにより、外来性タンパク質をコードするmRNAを含む赤血球細胞を作製する、方法であって、集団における細胞の少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%は、第1のmRNA及び第2のmRNAの両方を含む、方法。
1細胞当たり外来性タンパク質の所定の数のコピーを含む複数の赤血球細胞を提供することであって、赤血球細胞は、集団を、外来性タンパク質をコードする所定の量のmRNAと接触させることにより作製されたものである、提供することと、
複数の赤血球細胞における外来性タンパク質の量を決定することと
を含む方法。
細胞集団を、集団における5E6細胞当たり0.4±20%ugのmRNAと接触させることは、1細胞当たり外来性タンパク質の870,000±20%のコピーを発現する細胞の集団を産出し、
細胞集団を、集団における5E6細胞当たり0.2±20%ugのmRNAと接触させることは、1細胞当たり外来性タンパク質の610,000±20%のコピーを発現する細胞の集団を産出し、
細胞集団を、集団における5E6細胞当たり0.1±20%ugのmRNAと接触させることは、1細胞当たり外来性タンパク質の270,000±20%のコピーを発現する細胞の集団を産出し、
細胞集団を、集団における5E6細胞当たり0.05±20%ugのmRNAと接触させることは、1細胞当たり外来性タンパク質の100,000±20%のコピーを発現する細胞の集団を産出し、又は
細胞集団を、集団における5E6細胞当たり0.025±20%ugのmRNAと接触させることは、1細胞当たり外来性タンパク質の43,000±20%のコピーを発現する細胞の集団を産出する、実施形態303〜305のいずれかの方法。
レンチウイルス形質導入K562細胞の場合、導入遺伝子に含まれるエピトープタグ(HAタグ)の発現は、プロウイルス長に逆相関し、およそ6kbを超えるプロウイルスコンストラクトでは、HAタグを発現する細胞のパーセントにおいておよそ1−log低下している(図1を参照されたい)。任意の特定の理論に束縛されるものではないが、形質導入効率の低下の理由は、より長いプロウイルス配列のレンチウイルス内のパッケージング効率の低下が関与すると考えられる。3.6kb〜8.2kbの範囲のプロウイルス長のレンチウイルスコンストラクトのセットを試験した(図2を参照されたい)。ELISAで測定したp24カプシドタンパク質の数を用いて、生成されたレンチウイルス粒子の数を定量化した。プロウイルスRNAのコピーの数を定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)により測定した。正規化により、プロウイルス長の関数としてのp24カプシドタンパク質の1マイクログラム当たりのRNAコピーの数量化が提供された。実験では、プロウイルス長<5kbの場合、p24の1マイクログラム当たり約3×109のRNAコピーが観察された。コンストラクト>6kbの場合、p24カプシドの1マイクログラム当たり約8×108超のRNAコピーを示すウイルス製剤は存在しなかった。形質導入効率の低下をもたらす、RNA含有ウイルス製剤とRNA欠損ウイルス製剤との間のサイズ依存性相違が認められる。
市販のキット(Clontech)を使用して、製造両者のプロトコルに従ってP24タンパク質を定量化した。手短には、ウイルス上清を、20uL溶解緩衝液を有するチューブ内に分配し、37Cで60分間インキュベートした後、マイクロタイタープレートに移動した。マイクロタイタープレートを洗浄し、100μlの抗p24(ビオチンコンジュゲート)検出器抗体と共に37Cで60分間インキュベートした。洗浄後、プレートを100μlのストレプトアビジン−HRPコンジュゲートと共に室温で30分間インキュベートした後、再び洗浄した。12。基質溶液をプレートに加え、室温(18〜25℃)で20(±2)分間インキュベートした。反応を停止溶液により停止し、450nmでの光吸収により比色分析読み取りを検出した。
市販のレンチウイルスベクターqRT−PCRキット(Clontech)を使用して、製造業者のプロトコルに従って、ウイルスRNAコピーを定量化した。手短には、RNAウイルス精製キットを使用して、レンチウイルス上清からRNAを抽出した。ウイルスゲノム上の保存配列を認識し、ベクターによりコードされる特定の導入遺伝子に依存しない、標準的なレンチウイルスプライマー(フォワード及びリバース)を用いてPCR反応を行った。42Cで5分間のインキュベーション、次いで95℃で10秒間のインキュベーション、次いで95Cで5秒間及び60Cで30秒間の40サイクルによりRT反応を行った。使用した機器は、Life Technologies QuantStudioであった。
mRNAのインビトロ生成のためのキットは、市販されている(例えば、Life TechnologiesのMAxiscript T7キット)。手短には、関心対象の遺伝子を、標準的な分子生物学的技術により、適切なT7プロモーターを含有するプラスミドDNAにクローン化する。転写反応を1ug DNA鋳型、2uL 10×転写緩衝液、各々1uLの10mM ATP、CTP、GTP、及びUTP、2uLのT7ポリメラーゼ酵素ミックスを用いて総容積20uLで設定する。反応物を徹底的に混合し、37Cで1時間インキュベートする。汚染する残留プラスミドDNAを除去するために、1uLターボDNAseを加え、反応物を37Cで15分間インキュベートする。1uL 0.5M EDTAを加えて反応を停止する。転写産物をゲル電気泳動又はスピンカラム精製により精製する。
細胞をRPMI緩衝液中で洗浄し、10uLの総容積中の密度1×107細胞/mLでLife TechnologiesのNeon電気穿孔機器に負荷し、以下の条件で電気穿孔した:1000Vの1パルス、50msのパルス幅。
GFPをコードする化学修飾mRNAをTriLinkから購入した。RNAは、シュード−ウリジン及び5−メチルシトシンを含む。分化している赤血球細胞を、分化の4、8、10、又は12日目に電気穿孔した。試験した全ての分化の日、試験した異なる電気穿孔条件下でGFP蛍光を観察した。表9は、4日目に電気穿孔され、8日目に観察した際のGFP蛍光レベルを示す。表10は、細胞が12日目に電気穿孔され、15日目に観察した際のGFP蛍光レベルを示す。分化の8日目又は10日目に電気穿孔された細胞におけるGFP蛍光も観察した(データは示さず)。
ヘモグロビン3’UTR配列が追加されたインビトロ転写GFP mRNA(「Hemo−GFP」)を用いて赤血球細胞を電気穿孔した。mRNAは、化学的に修飾されていなかった。次いで、電気穿孔から2日後に細胞をフローサイトメトリーによりGFP蛍光に関してアッセイした。59.7%の細胞は、GFP陽性であった。GFP陽性細胞の平均蛍光強度は、35069単位であった。
図7Aに示すように、赤血球細胞分化は、3つの段階に分割することができる:増殖(増殖の0〜5日目、これは全体の0〜5日目に対応する)、分化(分化の1〜9日目、これは全体の6〜14日目に対応する)、及び成熟(成熟の1〜14日目、これは全体の15〜28日目に対応する)。増殖は、初期培養物を増幅して臨床的用量の必須要件を満たすための非分化環境内での造血性前駆細胞の単離及び増殖の段階を説明する。分化は、赤血球生成を誘導し、赤血球細胞機能に特殊化させるための成長因子及び培地添加物の使用を説明する。成熟は、赤血球細胞が最初に核を、続いてそれらのミトコンドリア及びリボソーム内容物を喪失する最終ステージを指す。成熟赤血球細胞は、新たなmRNA合成又はタンパク質翻訳の能力を有さない。
成熟条件下での赤血球細胞の集団へのレポータータンパク質(GFP)をコードするmRNAの電気穿孔に関して、いくつかの異なる時点を試験した。詳細には、電気穿孔を成熟の4、5、6、及び7日目に試験した。電気穿孔後、細胞をフローサイトメトリーにより、少なくとも6日間、24時間毎にGFP発現に関してアッセイした。好適な電気穿孔条件は、例えば、本明細書の実施例1、及びその全体が参照により本明細書に組み込まれる国際出願国際公開第2016/183482号パンフレットに記載されている。
次に、成熟している赤血球細胞をそれらの翻訳活性及び脱核レベルに関していくつかの時点で特徴付けた。翻訳活性は、生体直交型非標準アミノ酸タグ化、即ちBONCATにより測定した。好適なBONCATアッセイは、例えば、Hatzenpichler et al.,“In situ visualization of newly synthesized proteins in environmental microbes using amino acid tagging and click chemistry”Environmental Microbiology(2014)16(8),2568−2590に記載されている。このアッセイは、L−メチオニンの代理、非標準アミノ酸L−アジドホモアラニン(AHA)のインビボ組み入れと、その後の組み入れられたAHA細胞タンパク質のクリックケミストリーによる蛍光標識化とに基づく。このプロトコルを修正し、AHA濃度を1mMから2mMに増大させ、インキュベーション時間を3時間に最適化し、ゲル電気泳動及び赤外線撮像による分析を可能にするジベンゾシクロオクチン基(DBCO)を使用した銅フリークリックケミストリーにより、哺乳動物初代細胞、特にヒト赤血球前駆細胞に対して最適化した。赤血球細胞の集団を拡大、分化、及び成熟条件に暴露し、3×106細胞のサンプルをM3、M5、M7、M9、M11、M15、及びM16日に収集した。図9に示すように、細胞の翻訳活性は、時間の経過と共に劇的に減少し、赤血球細胞が翻訳機構を喪失したことが示された。同じ時間の経過と共に、集団における脱核細胞の割合は、劇的に上昇した。
この実験は、赤血球細胞をリボヌクレアーゼ阻害剤に暴露すると、導入遺伝子の発現が増大することを示す。
この実験は、赤血球細胞をプロテアーゼ阻害剤に暴露すると、導入遺伝子の発現が増大することを示す。
この実施例は、赤血球細胞内での2つ以上のmRNAの共発現を示す。
この実験は、所定の量の外来性タンパク質が、赤血球細胞の集団を、外来性タンパク質をコードする所定の量のmRNAと接触させることにより生成し得ることを示す。
5’キャップ(ARCA)、ポリAテイル、及びシュードウリジンの1つ以上を含む修飾mRNAを生成した。mRNAは、翻訳を促進するためのIRES、検出を促進するためのHA−コード領域、並びにGFP及びPAL(フェニルアラニンアンモニアリアーゼ)の融合をコードする領域を含む。mRNAを電気穿孔によりM4日に赤血球細胞に導入し、M5(24時間後)、M6、M7、及びM10日に分析した。GFP発現をフローサイトメトリーにより測定した。図12に示すように、シュードウリジンmRNAを発現する細胞は、完全に非修飾のRNAを発現する細胞よりも高いGFP陽性細胞の百分率を有した。ポリAテイル及びキャップの付加は、GFP陽性細胞の百分率を更に増大させた。最終的に、GFPレポーターの発現を示す細胞の百分率は、キャップ、ポリ−Aテイル、及びシュードウリジン組み入れを有するmRNAと接触させた細胞で最大であった。
Claims (118)
- 外来性タンパク質をコードするmRNAを含む赤血球細胞を作製する方法であって、
a)成熟段階における赤血球細胞を提供することと、
b)前記赤血球細胞を、前記外来性タンパク質をコードするmRNAと、前記赤血球細胞による前記mRNAの取込みを可能にする条件下で接触させること
を含み、それにより、外来性タンパク質をコードするmRNAを含む赤血球細胞を作製する、方法。 - 前記赤血球細胞は、前記外来性タンパク質をコードする前記mRNAを取込む、請求項1に記載の方法。
- 成熟段階における赤血球細胞の集団を提供することと、前記赤血球細胞の集団の複数の細胞を、前記外来性タンパク質をコードする前記mRNAと接触させることとを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記赤血球細胞の集団の前記複数の細胞は、前記外来性タンパク質をコードする前記mRNAをそれぞれ取込む、請求項3に記載の方法。
- 前記外来性タンパク質をコードする前記mRNAの取込み後、前記細胞又は前記複数の細胞は、前記外来性タンパク質を発現する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞又は前記複数の細胞は、前記外来性タンパク質を含む、請求項5に記載の方法。
- 成熟段階における前記赤血球細胞の集団は、成熟培地中で3〜7日間、例えば4〜5又は4〜6日間にわたって拡大された細胞の集団である、請求項3〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 外来性タンパク質を発現する網状赤血球の集団を製造する方法であって、
(e)赤血球前駆体細胞(例えば、CD34+細胞)の集団を提供することと、
(f)前記赤血球前駆体細胞の集団を分化条件下で培養して、分化している赤血球細胞の集団を提供することと、
(g)前記分化している赤血球細胞の集団の複数の細胞を、前記外来性タンパク質をコードするmRNAと、前記分化している赤血球細胞の集団の前記複数の細胞による前記mRNAの取込みを可能にする条件下で接触させることと、
(h)前記分化している赤血球細胞の集団の前記複数の細胞を更に培養して、網状赤血球の集団を提供することと
を含み、それにより、前記外来性タンパク質を発現する網状赤血球の集団を製造する、方法。 - 前記更なる培養は、3、2、又は1未満の集団の倍加を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性:
i.a)前記集団における前記細胞の2〜40%、3〜33%、5〜30%、10〜25%、又は15〜20%は、脱核されていること、
i.b)前記集団における前記細胞の0%、0.1%、0.2%、又は0.5%を超えるが、2%、3%、4%、又は5%未満は、脱核されていること、
i.c)前記集団における前記細胞の0%、0.1%、0.2%、又は0.5%を超えるが、6%、10%、15%、20%、又は25%未満は、脱核されていること、
i.d)前記集団における前記細胞の0%、0.1%、0.2%、又は0.5%を超えるが、30%、35%、40%、45%、又は50%未満は、脱核されていること、
i.e)前記集団における前記細胞の1%、2%、3%、5%、10%、15%、又は20%以下は、脱核されていること、
i.f)前記集団における前記細胞の25%、30%、35%、40%、45%、又は50%以下は、脱核されていること、
i.g)前記細胞の集団は、最大脱核の6〜70%、10〜60%、20〜50%、又は30〜40%に到達していること、
i.h)前記細胞の集団は、最大脱核の1%、2%、3%、5%、10%、15%、又は20%以下に到達していること、
i.i)前記細胞の集団は、最大脱核の25%、30%、35%、40%、45%、50%、又は60%以下に到達していること、
ii.a)前記細胞の集団は、細胞分裂におけるプラトーから3、2、又は1未満だけ倍加した集団であること、
ii.b)前記細胞の集団は、3、2、又は1未満の集団の倍加が可能であること、
ii.c)前記集団は、前記集団が前記集団における細胞の少なくとも70%の脱核レベルに到達する前に1.5、2、又は3倍以下だけ増大すること、
iii.a)前記集団における前記細胞の少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)であること、
iii.b)前記集団における前記細胞の少なくとも50%、60%、70%、75%、又は79%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)であること、
iii.c)前記集団における前記細胞の30〜90%、40〜90%、50〜90%、60〜90%、又は70〜90%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)であること、
iii.d)前記集団における前記細胞の少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)の形態を示すこと、
iii.e)前記集団における前記細胞の少なくとも50%、60%、70%、75%、又は79%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)の形態を示すこと、又は
iii.f)前記集団における前記細胞の30〜90%、40〜90%、50〜90%、60〜90%、又は70〜90%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)の形態を示すこと
の1つ以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、又はそれを超える)を含む赤血球細胞の集団である、請求項3〜9のいずれか一項に記載の方法。 - 前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団は、iの特性及びiiの特性を含む赤血球細胞の集団である、請求項10に記載の方法。
- 前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団は、iの特性及びiiiの特性を含む赤血球細胞の集団である、請求項10に記載の方法。
- 前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団は、iiの特性及びiiiの特性を含む赤血球細胞の集団である、請求項10に記載の方法。
- 前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団は、iの特性、iiの特性、及びiiiの特性を含む赤血球細胞の集団である、請求項10に記載の方法。
- 前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性:例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例10のフローサイトメトリーアッセイによって測定されて、前記集団における前記細胞の84〜99%、85〜95%、又は約90%は、GPA陽性であることを含む赤血球細胞の集団である、請求項3〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性:例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例10のフローサイトメトリーアッセイによって測定されて、前記集団における前記細胞の少なくとも84%、85%、90%、95%、又は99%は、GPA陽性であることを含む赤血球細胞の集団である、請求項3〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性:例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例10のフローサイトメトリーアッセイによって測定されて、前記集団における前記細胞の54〜99%、55〜98%、60〜95%、65〜90%、70〜85%、又は75〜80%は、バンド3陽性であることを含む赤血球細胞の集団である、請求項3〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性:例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例10のフローサイトメトリーアッセイによって測定されて、前記集団における前記細胞の少なくとも54%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、又は99%は、バンド3陽性であることを含む赤血球細胞の集団である、請求項3〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性:例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例10のフローサイトメトリーアッセイによって測定されて、前記集団における前記細胞の96〜100%、97〜99%、又は約98%は、α4インテグリン陽性であることを含む赤血球細胞の集団である、請求項3〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性:例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例10のフローサイトメトリーアッセイによって測定されて、前記集団における前記細胞の少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%は、α4インテグリン陽性であることを含む赤血球細胞の集団である、請求項3〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の細胞を、前記外来性タンパク質をコードする前記mRNAと接触させる前又は接触させた後、前記複数の細胞は、前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団から分離され、例えば、前記複数の細胞は、脱核状態に基づいて前記集団から分離される(例えば、前記複数の細胞は、有核細胞であり、及び前記集団の残りのものは、脱核細胞である)、請求項3〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の細胞を、前記外来性タンパク質をコードする前記mRNAと接触させる前又は接触させた後、例えば前記集団を脱核の阻害剤(例えば、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)の阻害剤、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)の阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ(CDK)の阻害剤、又はプロテアソーム阻害剤)と共にインキュベートすることにより、例えば前記集団の成長、発達、ヘモグロビン合成、又は脱核プロセスを停止させることにより、前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団を同期させることを含む、請求項3〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 停止は、前記集団における前記細胞の1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10%超の脱核前に行われる、請求項22に記載の方法。
- 外来性タンパク質を発現する網状赤血球の集団を製造する方法であって、
(i)赤血球前駆体細胞(例えば、CD34+細胞)の集団を提供することと、
(j)前記赤血球前駆体細胞の集団を分化条件下で培養して、分化している赤血球細胞の集団を提供することと、
(k)前記分化している赤血球細胞を、前記外来性タンパク質をコードするmRNAと、前記分化している赤血球細胞による前記mRNAの取込みを可能にする条件下で接触させることであって、前記分化している赤血球細胞の集団が0.1〜25%脱核されている(例えば、0.1〜20%脱核されている、0.1〜15%脱核されている、0.1〜12%脱核されている、又は0.1〜10%脱核されている)ときに行われる、接触させることと、
(l)前記分化している赤血球細胞を更に培養して、網状赤血球の集団を提供することと
を含み、それにより、前記外来性タンパク質を発現する網状赤血球の集団を製造する、方法。 - 前記更なる培養は、3、2、又は1未満の集団の倍加を含む、請求項24に記載の方法。
- 前記接触は、前記分化している赤血球細胞の少なくとも50%(少なくとも60%、70%、75%、80%、90%、又は95%)が正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)の形態を示すときに行われる、請求項24又は25に記載の方法。
- 外来性タンパク質を発現する網状赤血球の集団を製造する方法であって、(a)赤血球前駆体細胞の集団を提供することと、(b)前記赤血球前駆体細胞の集団を分化条件下で培養して、分化している赤血球細胞の集団を提供することと、(c)前記分化している赤血球細胞を、前記外来性タンパク質をコードするmRNAと接触させることとを含み、改善は、前記接触が、前記分化している赤血球細胞の集団が0.1〜25%脱核されている(例えば、0.1〜20%脱核されている、0.1〜15%脱核されている、0.1〜12%脱核されている、又は0.1〜10%脱核されている)ときに行われることを含む、方法。
- 前記接触は、前記分化している赤血球細胞の集団が細胞分裂におけるプラトーの前に3、2、又は1未満の集団の倍加を有するときに行われる、請求項27に記載の方法。
- 前記接触は、前記分化している赤血球細胞の少なくとも50%(少なくとも60%、70%、75%、80%、90%、又は95%)が正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)の形態を示すときに行われる、請求項27又は28に記載の方法。
- 異種非翻訳領域(UTR)に作動可能に結合されたコード領域を含む外来性mRNAを含み、前記異種UTRは、調節エレメントを含む、赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞。
- 表1の1つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表2の1つ以上の化学的バックボーン修飾、表3の1つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む外来性mRNAを含む赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞。
- 赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞を生成する方法であって、
a)赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を、調節エレメントを含む異種UTRに作動可能に結合されたコード領域を含む外来性mRNA(例えば、単離RNA又はインビトロ転写RNA)と接触させることと、
b)前記接触された赤血球細胞を前記外来性mRNAの取込みに好適な条件下で維持することと
を含み、それにより、前記赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞を生成する、方法。 - 赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞を生成する方法であって、
a)赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を、表1の1つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表2の1つ以上の化学的バックボーン修飾、表3の1つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む外来性mRNAと接触させることと、
b)前記接触された赤血球細胞を前記外来性mRNAの取込みに好適な条件下で維持することと
を含み、それにより、前記赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞を生成する、方法。 - 脱核赤血球細胞における外来性タンパク質を生成する方法であって、
a)調節エレメントを含む異種UTRに作動可能に結合されたコード領域を含む外来性mRNA(例えば、単離RNA又はインビトロ転写RNA)を含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を提供し、且つ、
b)前記赤血球細胞を前記外来性タンパク質の生成に好適な条件下で培養し、それにより、前記外来性タンパク質を生成する、方法。 - 脱核赤血球細胞における外来性タンパク質を生成する方法であって、
a)表1の1つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表2の1つ以上の化学的バックボーン修飾、表3の1つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を提供し、且つ、
b)前記赤血球細胞を前記外来性タンパク質の生成に好適な条件下で培養し、それにより、前記外来性タンパク質を生成する、方法。 - 外来性タンパク質を対象に提供するか、外来性タンパク質を生成することができる脱核赤血球細胞を対象に提供するか、又は対象を処置する方法であって、
調節エレメントを含む異種UTRに作動可能に結合されたコード領域を含む外来性mRNA(例えば、単離RNA又はインビトロ転写RNA)を含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を前記対象に投与すること
を含み、それにより、外来性タンパク質を対象に提供するか、外来性タンパク質を生成することができる脱核赤血球細胞を対象に提供するか、又は対象を処置する、方法。 - 外来性タンパク質を対象に提供するか、外来性タンパク質を生成することができる脱核赤血球細胞を対象に提供するか、又は対象を処置する方法であって、
表1の1つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表2の1つ以上の化学的バックボーン修飾、表3の1つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む外来性mRNAを含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を前記対象に投与すること
を含み、それにより、外来性タンパク質を対象に提供するか、外来性タンパク質を生成することができる脱核赤血球細胞を対象に提供するか、又は対象を処置する、方法。 - 赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞(又は前記細胞のバッチ)を評価する方法であって、
a)調節エレメントを含む異種UTRに作動可能に結合されたコード領域を含む外来性mRNAを含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞(又は前記細胞のバッチ)を提供することと、
b)前記赤血球細胞、例えば前記有核赤血球細胞(又は前記細胞のバッチ)を、予め選択されたパラメーターに関して評価することと
を含み、それにより、前記赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞(又は前記細胞のバッチ)を評価する、方法。 - 赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞(又は前記細胞のバッチ)を評価する方法であって、
a)表1の1つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表2の1つ以上の化学的バックボーン修飾、表3の1つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を提供することと、
b)前記赤血球細胞、例えば前記有核赤血球細胞(又は前記細胞のバッチ)を、予め選択されたパラメーターに関して評価することと
を含み、それにより、前記赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞(又は前記細胞のバッチ)を評価する、方法。 - 前記集団における前記細胞の少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、又は95%は、例えば、前記mRNAと接触させてから5日後に前記外来性タンパク質を含む、請求項30に記載の方法。
- 前記集団における前記細胞は、例えば、前記mRNAとの前記接触から5日後に前記外来性タンパク質の少なくとも1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、又は100,000コピーを含む、請求項30に記載の方法。
- 前記細胞は、前記mRNAと接触させた後、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15日間にわたって前記外来性タンパク質の少なくとも1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、又は100,000コピーを含む、請求項30に記載の方法。
- 外来性タンパク質をコードするmRNAを含む赤血球細胞を作製する方法であって、
赤血球細胞及び前記外来性タンパク質をコードするmRNAを含む反応混合物を、例えば前記反応混合物中にリボヌクレアーゼ阻害剤を含めることにより、mRNAの分解を阻害する条件下で提供することと、
前記赤血球細胞による前記mRNAの取込みを可能にする条件下で前記反応混合物を維持することと
を含み、それにより、外来性タンパク質をコードするmRNAを含む赤血球細胞を作製する、方法。 - 赤血球細胞の集団を提供することと、前記集団を、前記外来性タンパク質をコードする前記mRNAと接触させることとを含む、請求項43に記載の方法。
- 前記集団の複数の赤血球細胞は、前記外来性タンパク質をコードするmRNAをそれぞれ取込む、請求項43又は44に記載の方法。
- 前記細胞又は複数の細胞は、前記外来性タンパク質を発現する、請求項43〜45のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞又は複数の細胞は、前記外来性タンパク質を含む、請求項43〜46のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞又は細胞の集団を電気穿孔することを更に含む、請求項43〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 赤血球細胞の集団をリボヌクレアーゼ阻害剤と接触させることを更に含む、請求項43〜48のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞を前記mRNAと接触させる前、接触させている間、又は接触させた後、前記細胞の集団を前記リボヌクレアーゼ阻害剤と接触させることを含む、請求項43〜49のいずれか一項に記載の方法。
- 成熟段階の4、5、又は6日目に前記細胞を前記リボヌクレアーゼ阻害剤と接触させることを含む、請求項43〜50のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞は、成熟段階にある、請求項43〜51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、以下の特性:
i.a)前記集団における前記細胞の2〜40%、3〜33%、5〜30%、10〜25%、又は15〜20%は、脱核されていること、
i.b)前記集団における前記細胞の0%、0.1%、0.2%、又は0.5%を超えるが、2%、3%、4%、又は5%未満は、脱核されていること、
i.c)前記集団における前記細胞の0%、0.1%、0.2%、又は0.5%を超えるが、6%、10%、15%、20%、又は25%未満は、脱核されていること、
i.d)前記集団における前記細胞の0%、0.1%、0.2%、又は0.5%を超えるが、30%、35%、40%、45%、又は50%未満は、脱核されていること、
i.e)前記集団における前記細胞の1%、2%、3%、5%、10%、15%、又は20%以下は、脱核されていること、
i.f)前記集団における前記細胞の25%、30%、35%、40%、45%、又は50%以下は、脱核されていること、
i.g)前記細胞の集団は、最大脱核の6〜70%、10〜60%、20〜50%、又は30〜40%に到達していること、
i.h)前記細胞の集団は、最大脱核の1%、2%、3%、5%、10%、15%、又は20%以下に到達していること、
i.i)前記細胞の集団は、最大脱核の25%、30%、35%、40%、45%、50%、又は60%以下に到達していること、
ii.a)前記細胞の集団は、細胞分裂におけるプラトーから3、2、又は1未満だけ倍加した集団であること、
ii.b)前記細胞の集団は、3、2、又は1未満の集団の倍加が可能であること、
ii.c)前記集団は、前記集団が前記集団における細胞の少なくとも70%の脱核レベルに到達する前に1.5、2、又は3倍以下だけ増大すること、
iii.a)前記集団における前記細胞の少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)であること、
iii.b)前記集団における前記細胞の少なくとも50%、60%、70%、75%、又は79%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)であること、
iii.c)前記集団における前記細胞の30〜90%、40〜90%、50〜90%、60〜90%、又は70〜90%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)であること、
iii.d)前記集団における前記細胞の少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)の形態を示すこと、
iii.e)前記集団における前記細胞の少なくとも50%、60%、70%、75%、又は79%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)の形態を示すこと、又は
iii.f)前記集団における前記細胞の30〜90%、40〜90%、50〜90%、60〜90%、又は70〜90%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)の形態を示すこと
の1つ以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、又はそれを超える)を含む時点で前記細胞を前記リボヌクレアーゼ阻害剤と接触させることを含む、請求項43〜52のいずれか一項に記載の方法。 - 前記赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、iの特性及びiiの特性を含む赤血球細胞の集団である、請求項53に記載の方法。
- 前記赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、iの特性及びiiiの特性を含む赤血球細胞の集団である、請求項53に記載の方法。
- 前記赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、iiの特性及びiiiの特性を含む赤血球細胞の集団である、請求項53に記載の方法。
- 前記赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、iの特性、iiの特性、及びiiiの特性を含む赤血球細胞の集団である、請求項53に記載の方法。
- (例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例10のフローサイトメトリーアッセイにより)前記細胞が、以下の特性:
前記集団における前記細胞の84〜99%、85〜95%、又は約90%は、GPA陽性であること、
前記集団における前記細胞の少なくとも84%、85%、90%、95%、又は99%は、GPA陽性であること、
前記集団における前記細胞の54〜99%、55〜98%、60〜95%、65〜90%、70〜85%、又は75〜80%は、バンド3陽性であること、
前記集団における前記細胞の少なくとも54%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、又は99%は、バンド3陽性であること、
前記集団における前記細胞の96〜100%、97〜99%、又は約98%は、α4インテグリン陽性であること、又は
前記集団における前記細胞の少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%は、α4インテグリン陽性であること
の1つ以上(例えば、2、3、4、5、又はそれを超える)を含む時点で前記細胞を前記リボヌクレアーゼ阻害剤と接触させることを含む、請求項43〜57のいずれか一項に記載の方法。 - 前記mRNAは、インビトロ転写mRNAである、請求項43〜58のいずれか一項に記載の方法。
- 前記集団の前記細胞の少なくとも80%、85%、90%、又は95%は、前記細胞が前記mRNAと接触されてから5日後に生存可能である、請求項43〜59のいずれか一項に記載の方法。
- 前記集団の前記細胞の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%は、前記細胞が前記mRNAと接触されてから5日後に脱核されている、請求項43〜60のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞が前記mRNAと接触されてから5日後に脱核されている前記細胞の割合は、前記リボヌクレアーゼ阻害剤で処理されていない他に同様の細胞の集団における脱核されている細胞の割合の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、又は95%である、請求項43〜61のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞の集団は、前記細胞が前記mRNAと接触される時点で少なくとも1×106、2×106、5×106、1×107、2×107、5×107、又は1×108細胞を含む、請求項43〜62のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞の集団は、前記細胞が前記mRNAと接触されてから5日以内に少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%だけ拡大する、請求項43〜63のいずれか一項に記載の方法。
- 前記集団の前記細胞の少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、又は95%は、例えば、前記細胞が前記mRNAと接触されてから5日後に前記外来性タンパク質を発現する、請求項43〜64のいずれか一項に記載の方法。
- 前記集団の前記細胞の少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、又は95%は、例えば、前記細胞が前記mRNAと接触されてから5日後に前記外来性タンパク質の少なくとも1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、又は100,000コピーを含む、請求項43〜65のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞の集団は、前記リボヌクレアーゼ阻害剤で処理されていない他に同様の細胞の集団よりも少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、若しくは90%だけ多い、又は少なくとも2倍、3倍、4倍、若しくは5倍だけ多い前記外来性タンパク質を含む、請求項43〜66のいずれか一項に記載の方法。
- i)赤血球細胞、ii)外来性タンパク質を含むmRNA、及びiii)リボヌクレアーゼ阻害剤を含む反応混合物。
- 前記mRNAは、前記赤血球細胞内にある、請求項68に記載の反応混合物。
- 複数の赤血球細胞を含む、請求項68又は69に記載の反応混合物。
- リボヌクレアーゼ阻害剤のための外来性タンパク質を含む脱核赤血球細胞を含む反応混合物をアッセイする方法であって、
外来性タンパク質を含む脱核赤血球細胞を含む反応混合物を提供することと、
例えば、前記反応混合物のアリコートにおける例えばELISA、ウェスタンブロット、又は質量分析により、リボヌクレアーゼ阻害剤の存在又はレベルに関してアッセイすることと
を含む方法。 - 前記リボヌクレアーゼ阻害剤のレベルを基準値と比較することを更に含む、請求項71に記載の方法。
- 前記比較に応答して、
前記集団を、例えば必須要件を満たすか又は必須要件を満たさないとして分類することであって、例えば、前記必須要件は、前記リボヌクレアーゼ阻害剤のレベルが前記基準値を下回る場合に満たされる、分類すること、
例えば、前記リボヌクレアーゼ阻害剤のレベルが前記基準値を上回る場合、前記集団が、続く精製ステップに好適であるとき、前記集団を、続く処理ステップに好適であるか又は好適でないとして分類すること、
前記集団を、治療としての使用に好適である、又は好適でないとして分類すること、又は
例えば、前記リボヌクレアーゼ阻害剤のレベルが前記基準値を下回る場合、前記集団又はそのアリコートを治療的使用のために処方又は包装すること
の1つ以上を更に含む、請求項72に記載の方法。 - 前記リボヌクレアーゼ阻害剤は、RNAsin Plus、Protector RNAse Inhibitor、又はRibonuclease Inhibitor Humaである、請求項43〜73のいずれか一項に記載の反応混合物又は方法。
- 外来性タンパク質をコードするmRNAを含む赤血球細胞を作製する方法であって、
赤血球細胞及び前記外来性タンパク質をコードするmRNAを含む反応混合物を、例えば前記反応混合物中にプロテアソーム阻害剤を含めることにより、タンパク質分解を阻害する条件下で提供することと、
前記赤血球細胞による前記mRNAの取込みを可能にする条件下で前記反応混合物を維持することと
を含み、それにより、外来性タンパク質をコードするmRNAを含む赤血球細胞を作製する、方法。 - 赤血球細胞の集団を提供することと、前記集団を、前記外来性タンパク質をコードする前記mRNAと接触させることとを含む、請求項75に記載の方法。
- 前記集団の複数の赤血球細胞は、前記外来性タンパク質をコードするmRNAをそれぞれ取込む、請求項75又は76に記載の方法。
- 前記細胞又は複数の細胞は、前記外来性タンパク質を発現する、請求項75〜77のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞又は複数の細胞は、前記外来性タンパク質を含む、請求項75〜78のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞又は細胞の集団を電気穿孔することを更に含む、請求項75〜79のいずれか一項に記載の方法。
- 赤血球細胞の集団をプロテアソーム阻害剤と接触させることを更に含む、請求項75〜80のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞を前記mRNAと接触させる前、接触させている間、又は接触させた後、例えば前記細胞を前記mRNAと接触させる0.5〜2日前又は後に前記細胞の集団を前記プロテアソーム阻害剤と接触させることを含む、請求項75〜81のいずれか一項に記載の方法。
- 成熟段階の4、5、又は6日目に前記細胞を前記プロテアソーム阻害剤と接触させることを含む、請求項75〜82のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞は、成熟段階にある、請求項75〜83のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、以下の特性:
i.a)前記集団における前記細胞の2〜40%、3〜33%、5〜30%、10〜25%、又は15〜20%は、脱核されていること、
i.b)前記集団における前記細胞の0%、0.1%、0.2%、又は0.5%を超えるが、2%、3%、4%、又は5%未満は、脱核されていること、
i.c)前記集団における前記細胞の0%、0.1%、0.2%、又は0.5%を超えるが、6%、10%、15%、20%、又は25%未満は、脱核されていること、
i.d)前記集団における前記細胞の0%、0.1%、0.2%、又は0.5%を超えるが、30%、35%、40%、45%、又は50%未満は、脱核されていること、
i.e)前記集団における前記細胞の1%、2%、3%、5%、10%、15%、又は20%以下は、脱核されていること、
i.f)前記集団における前記細胞の25%、30%、35%、40%、45%、又は50%以下は、脱核されていること、
i.g)前記細胞の集団は、最大脱核の6〜70%、10〜60%、20〜50%、又は30〜40%に到達していること、
i.h)前記細胞の集団は、最大脱核の1%、2%、3%、5%、10%、15%、又は20%以下に到達していること、
i.i)前記細胞の集団は、最大脱核の25%、30%、35%、40%、45%、50%、又は60%以下に到達していること、
ii.a)前記細胞の集団は、細胞分裂におけるプラトーから3、2、又は1未満だけ倍加した集団であること、
ii.b)前記細胞の集団は、3、2、又は1未満の集団の倍加が可能であること、
ii.c)前記集団は、前記集団が前記集団における細胞の少なくとも70%の脱核レベルに到達する前に1.5、2、又は3倍以下だけ増大すること、
iii.a)前記集団における前記細胞の少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)であること、
iii.b)前記集団における前記細胞の少なくとも50%、60%、70%、75%、又は79%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)であること、
iii.c)前記集団における前記細胞の30〜90%、40〜90%、50〜90%、60〜90%、又は70〜90%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)であること、
iii.d)前記集団における前記細胞の少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)の形態を示すこと、
iii.e)前記集団における前記細胞の少なくとも50%、60%、70%、75%、又は79%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)の形態を示すこと、又は
iii.f)前記集団における前記細胞の30〜90%、40〜90%、50〜90%、60〜90%、又は70〜90%は、正赤芽球(例えば、多染性又は正染性正赤芽球)の形態を示すこと
の1つ以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、又はそれを超える)を含む時点で前記細胞を前記プロテアソーム阻害剤と接触させることを含む、請求項75〜84のいずれか一項に記載の方法。 - 前記赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、iの特性及びiiの特性を含む赤血球細胞の集団である、請求項85に記載の方法。
- 前記赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、iの特性及びiiiの特性を含む赤血球細胞の集団である、請求項85に記載の方法。
- 前記赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、iiの特性及びiiiの特性を含む赤血球細胞の集団である、請求項85に記載の方法。
- 前記赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、iの特性、iiの特性、及びiiiの特性を含む赤血球細胞の集団である、請求項85に記載の方法。
- (例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例10のフローサイトメトリーアッセイにより)前記細胞が、以下の特性:
前記集団における前記細胞の84〜99%、85〜95%、又は約90%は、GPA陽性であること、
前記集団における前記細胞の少なくとも84%、85%、90%、95%、又は99%は、GPA陽性であること、
前記集団における前記細胞の54〜99%、55〜98%、60〜95%、65〜90%、70〜85%、又は75〜80%は、バンド3陽性であること、
前記集団における前記細胞の少なくとも54%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、又は99%は、バンド3陽性であること、
前記集団における前記細胞の96〜100%、97〜99%、又は約98%は、α4インテグリン陽性であること、又は
前記集団における前記細胞の少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%は、α4インテグリン陽性であること
の1つ以上(例えば、2、3、4、5、又はそれを超える)を含む時点で前記細胞を前記プロテアソーム阻害剤と接触させることを含む、請求項75〜89のいずれか一項に記載の方法。 - 前記mRNAは、インビトロ転写mRNAである、請求項75〜90のいずれか一項に記載の方法。
- 前記集団の前記細胞の少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、又は95%は、前記細胞が前記mRNAと接触されてから5日後に生存可能である、請求項75〜91のいずれか一項に記載の方法。
- 前記集団の前記細胞の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%は、前記細胞が前記mRNAと接触されてから5日後に脱核されている、請求項75〜92のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が前記mRNAと接触されてから5日後に脱核されている細胞の割合は、前記プロテアソーム阻害剤で処理されていない他に同様の細胞の集団における脱核されている細胞の割合の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、又は95%である、請求項75〜93のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞の集団は、前記細胞が前記mRNAと接触される時点で少なくとも1×106、2×106、5×106、1×107、2×107、5×107、又は1×108細胞を含む、請求項75〜94のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞の集団は、前記細胞が前記mRNAと接触されてから5日以内に少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%だけ拡大する、請求項75〜95のいずれか一項に記載の方法。
- 前記集団の前記細胞の少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、又は95%は、例えば、前記細胞が前記mRNAと接触されてから5日後に前記外来性タンパク質を発現する、請求項75〜96のいずれか一項に記載の方法。
- 前記集団の前記細胞の少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、又は95%は、例えば、前記細胞が前記mRNAと接触されてから5日後に前記外来性タンパク質の少なくとも1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、又は100,000コピーを含む、請求項75〜97のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞の集団は、前記プロテアソーム阻害剤で処理されていない他に同様の細胞の集団よりも少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、若しくは90%だけ多い、又は少なくとも2倍、3倍、4倍、若しくは5倍だけ多い前記外来性タンパク質を含む、請求項75〜98のいずれか一項に記載の方法。
- i)赤血球細胞、ii)外来性タンパク質を含むmRNA、及びiii)プロテアソーム阻害剤を含む反応混合物。
- 前記mRNAは、前記赤血球細胞内にある、請求項100に記載の反応混合物。
- 複数の赤血球細胞を含む、請求項100又は101に記載の反応混合物。
- プロテアソーム阻害剤のための外来性タンパク質を含む脱核赤血球細胞を含む反応混合物をアッセイする方法であって、
外来性タンパク質を含む脱核赤血球細胞を含む反応混合物を提供することと、
例えば、前記反応混合物のアリコートにおける例えばELISA、ウェスタンブロット、又は質量分析により、プロテアソーム阻害剤の存在又はレベルに関してアッセイすることと
を含む方法。 - 前記プロテアソーム阻害剤のレベルを基準値と比較することを更に含む、請求項103に記載の方法。
- 前記比較に応答して、
前記集団を、例えば必須要件を満たすか又は必須要件を満たさないとして分類することであって、例えば、前記必須要件は、前記プロテアソーム阻害剤のレベルが前記基準値を下回る場合に満たされる、分類すること、
例えば、前記プロテアソーム阻害剤のレベルが前記基準値を上回る場合、前記集団が、続く精製ステップに好適であるとき、前記集団を、続く処理ステップに好適であるか又は好適でないとして分類すること、
前記集団を、治療としての使用に好適である、又は好適でないとして分類すること、又は
例えば、前記プロテアソーム阻害剤のレベルが前記基準値を下回る場合、前記集団又はそのアリコートを治療的使用のために処方又は包装すること
の1つ以上を更に含む、請求項104に記載の方法。 - 前記プロテアソーム阻害剤は、20Sプロテアソーム阻害剤、例えばMG−132若しくはカルフィルゾミブ、又は26Sプロテアソーム阻害剤、例えばボルテゾミブである、請求項75〜105のいずれか一項に記載の反応混合物又は方法。
- 第1の外来性タンパク質及び第2の外来性タンパク質をコードするmRNAを含む赤血球細胞を作製する方法であって、
a)例えば、成熟段階における赤血球細胞を提供することと、
b)前記赤血球細胞を、前記第1の外来性タンパク質をコードするmRNA及び前記第2の外来性タンパク質をコードする第2のmRNAと、前記赤血球細胞による前記第1のmRNA及び前記第2のmRNAの取込みを可能にする条件下で接触させることと
を含み、それにより、前記第1のmRNA及び前記第2のmRNAを含む赤血球細胞を作製する、方法。 - 前記赤血球細胞は、例えば、前記mRNAとの前記接触から5日後に前記第1の外来性タンパク質及び前記第2の外来性タンパク質の少なくとも1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、又は100,000コピーを含む、請求項107に記載の方法。
- 第1の外来性タンパク質及び第2の外来性タンパク質を発現する赤血球細胞の集団を生成する方法であって、
a)例えば、成熟段階における赤血球細胞の集団を提供することと、
b)前記赤血球細胞の集団を、第1の外来性タンパク質をコードする第1のmRNA及び第2の外来性タンパク質をコードする第2のmRNAと接触させることと
を含み、それにより、外来性タンパク質をコードするmRNAを含む赤血球細胞を作製する、方法であって、前記集団における細胞の少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%は、前記第1のmRNA及び前記第2のmRNAの両方を含む、方法。 - 前記赤血球細胞の集団は、例えば、前記mRNAとの前記接触から5日後に1細胞当たり前記第1の外来性タンパク質及び前記第2の外来性タンパク質の少なくとも平均1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、又は100,000コピーを含む、請求項109に記載の方法。
- 前記接触は、電気穿孔を行うことを含む、請求項107〜110のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞の集団は、細胞が前記第1及び第2のmRNAと接触された後、少なくとも5日間にわたって前記細胞の少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%において前記第1の外来性タンパク質及び前記第2の外来性タンパク質を含む、請求項109〜111のいずれか一項に記載の方法。
- 前記集団における細胞の少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%は、第1の外来性タンパク質及び第2の外来性タンパク質を発現し、前記集団は、前記細胞を、前記第1又は第2の外来性タンパク質をコードするDNAと接触させることによって作製されたものではない、赤血球細胞の集団。
- 1細胞当たり外来性タンパク質の所定の数のコピーを含む複数の赤血球細胞を生成する方法であって、前記集団を、前記外来性タンパク質をコードする所定の量のmRNAと接触させることを含み、それにより、前記所定の量の前記外来性タンパク質を含む前記赤血球細胞を作製する、方法。
- 前記複数の赤血球細胞(例えば、脱核赤血球細胞)の1つ以上を評価して、前記外来性タンパク質の量を決定することを更に含む、請求項114に記載の方法。
- 赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞のサンプル中の外来性タンパク質の量を評価する方法であって、
1細胞当たり外来性タンパク質の所定の数のコピーを含む複数の赤血球細胞を提供することであって、前記複数の赤血球細胞は、前記集団を、前記外来性タンパク質をコードする所定の量のmRNAと接触させることによって作製されたものである、提供することと、
前記複数の赤血球細胞における前記外来性タンパク質の量を決定することと
を含む方法。 - 前記細胞集団を、前記集団における5E6細胞当たり0.6±20%ugのmRNAと接触させることは、1細胞当たり前記外来性タンパク質の1,000,000±20%のコピーを発現する細胞の集団を産出し、
前記細胞集団を、前記集団における5E6細胞当たり0.4±20%ugのmRNAと接触させることは、1細胞当たり前記外来性タンパク質の870,000±20%のコピーを発現する細胞の集団を産出し、
前記細胞集団を、前記集団における5E6細胞当たり0.2±20%ugのmRNAと接触させることは、1細胞当たり前記外来性タンパク質の610,000±20%のコピーを発現する細胞の集団を産出し、
前記細胞集団を、前記集団における5E6細胞当たり0.1±20%ugのmRNAと接触させることは、1細胞当たり前記外来性タンパク質の270,000±20%のコピーを発現する細胞の集団を産出し、
前記細胞集団を、前記集団における5E6細胞当たり0.05±20%ugのmRNAと接触させることは、1細胞当たり前記外来性タンパク質の100,000±20%のコピーを発現する細胞の集団を産出し、又は
前記細胞集団を、前記集団における5E6細胞当たり0.025±20%ugのmRNAと接触させることは、1細胞当たり前記外来性タンパク質の43,000±20%のコピーを発現する細胞の集団を産出する、請求項114〜116のいずれか一項に記載の方法。 - 前記集団の前記細胞の少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、又は95%は、前記細胞が前記外来性タンパク質と接触されてから1日後に前記外来性タンパク質を発現する、請求項114〜117のいずれか一項に記載の方法。
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CN111394351B (zh) * | 2020-03-18 | 2023-11-07 | 济南爱新卓尔医学检验有限公司 | 一种抑制DICER1-AS1表达的siRNA及其应用 |
CN111893120B (zh) * | 2020-03-20 | 2021-10-19 | 浙江生研生物科技有限公司 | 长链非编码rna linc01141在制备治疗肝癌药物组合物中的应用 |
CN111534515A (zh) * | 2020-04-15 | 2020-08-14 | 湖南省科域生物医药科技有限公司 | Mir143hg作为抑制前列腺癌细胞增殖、侵袭与转移的用途 |
JP2023526422A (ja) | 2020-05-20 | 2023-06-21 | フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス,エルエルシー | コロナウイルス抗原組成物及びそれらの使用 |
IL298363A (en) | 2020-05-20 | 2023-01-01 | Flagship Pioneering Innovations Vi Llc | Immunogenic compositions and uses thereof |
US20230203192A1 (en) | 2020-05-20 | 2023-06-29 | Flagship Pioneering, Inc. | Compositions and methods for producing human polyclonal antibodies |
US20230203510A1 (en) | 2020-05-29 | 2023-06-29 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Trem compositions and methods relating thereto |
US20230203509A1 (en) | 2020-05-29 | 2023-06-29 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Trem compositions and methods relating thereto |
EP4167984A1 (en) | 2020-06-23 | 2023-04-26 | Flagship Pioneering, Inc. | Anti-viral compounds and methods of using same |
CN111647660B (zh) * | 2020-07-09 | 2021-03-16 | 河南省人民医院 | Linc01559在胃癌诊断及治疗中的应用 |
JP2023542492A (ja) | 2020-09-03 | 2023-10-10 | フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス,エルエルシー | 免疫原性組成物及びその使用 |
WO2022140702A1 (en) | 2020-12-23 | 2022-06-30 | Flagship Pioneering, Inc. | Compositions of modified trems and uses thereof |
AU2022246895A1 (en) | 2021-03-31 | 2023-10-19 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer |
CN113278695B (zh) * | 2021-04-12 | 2022-09-02 | 山东大学第二医院 | Linc00969在肝癌诊断生物标志物及治疗靶点中的应用 |
CN113322318B (zh) * | 2021-05-13 | 2022-03-04 | 武汉大学中南医院 | Linc00485作为分子标志物在制备用于诊断和/或预后肝细胞癌的产品中的应用 |
WO2023009547A1 (en) | 2021-07-26 | 2023-02-02 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Trem compositions and uses thereof |
CN113430273B (zh) * | 2021-08-17 | 2022-05-27 | 广州齐凯生物科技有限公司 | 长链非编码rna linc01565在急性髓系白血病预后中的应用 |
TW202330916A (zh) | 2021-09-17 | 2023-08-01 | 美商旗艦先鋒創新有限責任公司 | 用於產生環狀多核糖核苷酸之組成物和方法 |
TW202322826A (zh) | 2021-10-18 | 2023-06-16 | 美商旗艦先鋒創新有限責任公司 | 用於純化多核糖核苷酸之組成物及方法 |
CN113862366A (zh) * | 2021-10-26 | 2021-12-31 | 山东师范大学 | 一种肝癌诊断的生物标志物及其诊断试剂盒 |
KR20230059641A (ko) * | 2021-10-26 | 2023-05-03 | 사회복지법인 삼성생명공익재단 | 대장암의 치료 및 전이 억제용 조성물 및 이의 용도 |
WO2023096990A1 (en) | 2021-11-24 | 2023-06-01 | Flagship Pioneering Innovation Vi, Llc | Coronavirus immunogen compositions and their uses |
WO2023096963A1 (en) | 2021-11-24 | 2023-06-01 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Varicella-zoster virus immunogen compositions and their uses |
WO2023097003A2 (en) | 2021-11-24 | 2023-06-01 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Immunogenic compositions and their uses |
WO2023122745A1 (en) | 2021-12-22 | 2023-06-29 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Compositions and methods for purifying polyribonucleotides |
WO2023122789A1 (en) | 2021-12-23 | 2023-06-29 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Circular polyribonucleotides encoding antifusogenic polypeptides |
CN115247176B (zh) * | 2022-01-17 | 2023-06-20 | 郑州大学第一附属医院 | 一种长链非编码rna及其应用 |
WO2023220083A1 (en) | 2022-05-09 | 2023-11-16 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Trem compositions and methods of use for treating proliferative disorders |
WO2023220729A2 (en) | 2022-05-13 | 2023-11-16 | Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc | Double stranded dna compositions and related methods |
WO2023230549A2 (en) | 2022-05-25 | 2023-11-30 | Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc | Compositions and methods for modulation of tumor suppressors and oncogenes |
WO2023230573A2 (en) | 2022-05-25 | 2023-11-30 | Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc | Compositions and methods for modulation of immune responses |
WO2023230578A2 (en) | 2022-05-25 | 2023-11-30 | Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc | Compositions and methods for modulating circulating factors |
WO2023230566A2 (en) | 2022-05-25 | 2023-11-30 | Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc | Compositions and methods for modulating cytokines |
WO2023230570A2 (en) | 2022-05-25 | 2023-11-30 | Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc | Compositions and methods for modulating genetic drivers |
WO2023250112A1 (en) | 2022-06-22 | 2023-12-28 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Compositions of modified trems and uses thereof |
WO2024035613A1 (en) * | 2022-08-09 | 2024-02-15 | Eligab Tx Llc | Optimized gapmers antisense oligonucleotides for increasing foxg1 expression |
WO2024077191A1 (en) | 2022-10-05 | 2024-04-11 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012531203A (ja) * | 2009-06-23 | 2012-12-10 | ニューヨーク ブラッド センター インコーポレイテッド | 赤芽球の分化の間の膜タンパク質の規則性集合 |
WO2014186508A1 (en) * | 2013-05-15 | 2014-11-20 | University Of Rechester | Human extensively self-renewing erythroblasts (esre) |
WO2015073587A2 (en) * | 2013-11-18 | 2015-05-21 | Rubius Therapeutics, Inc. | Synthetic membrane-receiver complexes |
WO2015153102A1 (en) * | 2014-04-01 | 2015-10-08 | Rubius Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for immunomodulation |
JP2016506740A (ja) * | 2013-02-08 | 2016-03-07 | アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル | 無細胞翻訳系 |
Family Cites Families (63)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6316254B1 (en) * | 1994-02-14 | 2001-11-13 | University Of Washington | Methods for stimulating erythropoiesis using hematopoietic proteins |
US20050287539A1 (en) | 2004-06-29 | 2005-12-29 | Emmanuel Labourier | Methods and compositions for preparing capped RNA |
LT2578685T (lt) | 2005-08-23 | 2019-06-10 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Rnr, apimančios modifikuotus nukleozidus ir jų panaudojimo būdai |
NZ588583A (en) | 2008-04-15 | 2012-08-31 | Protiva Biotherapeutics Inc | Novel lipid formulations for nucleic acid delivery |
EP2119783A1 (en) | 2008-05-14 | 2009-11-18 | Prosensa Technologies B.V. | Method for efficient exon (44) skipping in Duchenne Muscular Dystrophy and associated means |
WO2012019168A2 (en) | 2010-08-06 | 2012-02-09 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
US20120237975A1 (en) | 2010-10-01 | 2012-09-20 | Jason Schrum | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
ES2618127T3 (es) | 2010-10-27 | 2017-06-20 | President And Fellows Of Harvard College | Composiciones de dúplex de cebador de extremos cohesivos y métodos de uso |
AU2012236099A1 (en) | 2011-03-31 | 2013-10-03 | Moderna Therapeutics, Inc. | Delivery and formulation of engineered nucleic acids |
EP2710136A4 (en) | 2011-05-17 | 2015-01-21 | Moderna Therapeutics Inc | MANIPULATED NUCLEIC ACIDS AND USE METHOD FOR NON-HUMAN SPINE |
US9126966B2 (en) | 2011-08-31 | 2015-09-08 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Cationic lipids and methods of use thereof |
WO2013039857A1 (en) | 2011-09-12 | 2013-03-21 | modeRNA Therapeutics | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
EP3384938A1 (en) | 2011-09-12 | 2018-10-10 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
EP3682905B1 (en) | 2011-10-03 | 2021-12-01 | ModernaTX, Inc. | Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof |
EP2791364A4 (en) | 2011-12-14 | 2015-11-11 | Moderna Therapeutics Inc | METHODS OF RESPONSE TO A BIOLOGICAL THREAT |
RS63244B1 (sr) | 2011-12-16 | 2022-06-30 | Modernatx Inc | Kompozicije modifikovane mrna |
CA2859691A1 (en) | 2011-12-21 | 2013-06-27 | Moderna Therapeutics, Inc. | Methods of increasing the viability or longevity of an organ or organ explant |
WO2013101690A1 (en) | 2011-12-29 | 2013-07-04 | modeRNA Therapeutics | Modified mrnas encoding cell-penetrating polypeptides |
US20150030576A1 (en) | 2012-01-10 | 2015-01-29 | Moderna Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for targeting agents into and across the blood-brain barrier |
CN108949772A (zh) | 2012-04-02 | 2018-12-07 | 现代泰克斯公司 | 用于产生与人类疾病相关的生物制剂和蛋白质的修饰多核苷酸 |
EP2833892A4 (en) | 2012-04-02 | 2016-07-20 | Moderna Therapeutics Inc | MODIFIED POLYNUCLEOTIDES FOR THE PRODUCTION OF PROTEINS AND PEPTIDES ASSOCIATED WITH ONCOLOGY |
EP2885419A4 (en) | 2012-08-14 | 2016-05-25 | Moderna Therapeutics Inc | ENZYMES AND POLYMERASES FOR RNA SYNTHESIS |
ES2921623T3 (es) | 2012-11-26 | 2022-08-30 | Modernatx Inc | ARN modificado terminalmente |
EP2931319B1 (en) | 2012-12-13 | 2019-08-21 | ModernaTX, Inc. | Modified nucleic acid molecules and uses thereof |
US20150315541A1 (en) | 2012-12-13 | 2015-11-05 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for altering cell phenotype |
WO2014113089A2 (en) | 2013-01-17 | 2014-07-24 | Moderna Therapeutics, Inc. | Signal-sensor polynucleotides for the alteration of cellular phenotypes |
EP2964234A4 (en) | 2013-03-09 | 2016-12-07 | Moderna Therapeutics Inc | NON-TRANSLATED HETEROLOGOUS REGIONS FOR MRNA |
EP2968397A4 (en) | 2013-03-12 | 2016-12-28 | Moderna Therapeutics Inc | DIAGNOSIS AND TREATMENT OF FIBROSIS |
WO2014159813A1 (en) | 2013-03-13 | 2014-10-02 | Moderna Therapeutics, Inc. | Long-lived polynucleotide molecules |
US10258698B2 (en) | 2013-03-14 | 2019-04-16 | Modernatx, Inc. | Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions |
US8980864B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-03-17 | Moderna Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of altering cholesterol levels |
WO2014144767A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Moderna Therapeutics, Inc. | Ion exchange purification of mrna |
EP3578663A1 (en) | 2013-03-15 | 2019-12-11 | ModernaTX, Inc. | Manufacturing methods for production of rna transcripts |
WO2014144039A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Moderna Therapeutics, Inc. | Characterization of mrna molecules |
US11377470B2 (en) | 2013-03-15 | 2022-07-05 | Modernatx, Inc. | Ribonucleic acid purification |
US20160017313A1 (en) | 2013-03-15 | 2016-01-21 | Moderna Therapeutics, Inc. | Analysis of mrna heterogeneity and stability |
WO2014152030A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Moderna Therapeutics, Inc. | Removal of dna fragments in mrna production process |
HRP20211563T1 (hr) | 2013-07-11 | 2022-01-07 | Modernatx, Inc. | Pripravci koji sadrže sintetske polinukleotide koji kodiraju proteine srodne crispr-u i sintetske sgrna, te postupci njihove uporabe |
WO2015011633A1 (en) | 2013-07-23 | 2015-01-29 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for delivering messenger rna |
EP3041938A1 (en) | 2013-09-03 | 2016-07-13 | Moderna Therapeutics, Inc. | Circular polynucleotides |
CA2923029A1 (en) | 2013-09-03 | 2015-03-12 | Moderna Therapeutics, Inc. | Chimeric polynucleotides |
EP3043826A4 (en) | 2013-09-13 | 2017-05-24 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotide compositions containing amino acids |
WO2015048744A2 (en) | 2013-09-30 | 2015-04-02 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides |
EP3052479A4 (en) | 2013-10-02 | 2017-10-25 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotide molecules and uses thereof |
WO2015051169A2 (en) | 2013-10-02 | 2015-04-09 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotide molecules and uses thereof |
AU2014329452B2 (en) | 2013-10-03 | 2019-06-20 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor |
AU2014337156A1 (en) | 2013-10-18 | 2016-05-12 | Modernatx, Inc. | Compositions and methods for tolerizing cellular systems |
US20170173128A1 (en) | 2013-12-06 | 2017-06-22 | Moderna TX, Inc. | Targeted adaptive vaccines |
US20150167017A1 (en) | 2013-12-13 | 2015-06-18 | Moderna Therapeutics, Inc. | Alternative nucleic acid molecules and uses thereof |
EP3092250A4 (en) | 2014-01-08 | 2017-05-24 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotides for the in vivo production of antibodies |
SG11201608798YA (en) | 2014-04-23 | 2016-11-29 | Modernatx Inc | Nucleic acid vaccines |
WO2015196128A2 (en) | 2014-06-19 | 2015-12-23 | Moderna Therapeutics, Inc. | Alternative nucleic acid molecules and uses thereof |
US20170136132A1 (en) | 2014-06-19 | 2017-05-18 | Moderna Therapeutics, Inc. | Alternative nucleic acid molecules and uses thereof |
US20170175129A1 (en) | 2014-06-19 | 2017-06-22 | Moderna Therapeutics, Inc. | Alternative nucleic acid molecules and uses thereof |
CA2955250A1 (en) | 2014-07-16 | 2016-01-21 | Moderna Therapeutics, Inc. | Chimeric polynucleotides |
EP3169335B8 (en) | 2014-07-16 | 2019-10-09 | ModernaTX, Inc. | Circular polynucleotides |
JP2017523777A (ja) | 2014-07-17 | 2017-08-24 | モデルナティエックス インコーポレイテッドModernaTX,Inc. | ポリヌクレオチドの末端修飾 |
WO2016014846A1 (en) | 2014-07-23 | 2016-01-28 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of intrabodies |
US20180085391A1 (en) | 2014-08-08 | 2018-03-29 | Modernatx, Inc. | Compositions and methods for the treatment of ophthalmic diseases and conditions |
WO2016036902A1 (en) | 2014-09-03 | 2016-03-10 | Moderna Therapeutics, Inc. | Tolerogenic compositions and methods |
EP3041948B1 (en) | 2014-11-10 | 2019-01-09 | Modernatx, Inc. | Alternative nucleic acid molecules containing reduced uracil content and uses thereof |
EP4324473A2 (en) | 2014-11-10 | 2024-02-21 | ModernaTX, Inc. | Multiparametric nucleic acid optimization |
WO2016183482A1 (en) | 2015-05-13 | 2016-11-17 | Rubius Therapeutics, Inc. | Membrane-receiver complex therapeutics |
-
2017
- 2017-07-07 WO PCT/US2017/041155 patent/WO2018009838A1/en unknown
- 2017-07-07 US US16/315,967 patent/US20190161730A1/en not_active Abandoned
- 2017-07-07 EP EP17749550.4A patent/EP3481943A1/en active Pending
- 2017-07-07 CA CA3029906A patent/CA3029906A1/en active Pending
- 2017-07-07 AU AU2017293931A patent/AU2017293931A1/en not_active Abandoned
- 2017-07-07 MX MX2019000205A patent/MX2019000205A/es unknown
- 2017-07-07 JP JP2018569000A patent/JP2019520829A/ja not_active Withdrawn
- 2017-07-07 CN CN201780044400.4A patent/CN109526226A/zh active Pending
- 2017-07-07 BR BR112019000195-6A patent/BR112019000195A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2017-07-07 KR KR1020197003248A patent/KR20190026819A/ko not_active Application Discontinuation
-
2021
- 2021-09-22 JP JP2021154086A patent/JP2021191304A/ja active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012531203A (ja) * | 2009-06-23 | 2012-12-10 | ニューヨーク ブラッド センター インコーポレイテッド | 赤芽球の分化の間の膜タンパク質の規則性集合 |
JP2016506740A (ja) * | 2013-02-08 | 2016-03-07 | アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル | 無細胞翻訳系 |
WO2014186508A1 (en) * | 2013-05-15 | 2014-11-20 | University Of Rechester | Human extensively self-renewing erythroblasts (esre) |
WO2015073587A2 (en) * | 2013-11-18 | 2015-05-21 | Rubius Therapeutics, Inc. | Synthetic membrane-receiver complexes |
WO2015153102A1 (en) * | 2014-04-01 | 2015-10-08 | Rubius Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for immunomodulation |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20190026819A (ko) | 2019-03-13 |
EP3481943A1 (en) | 2019-05-15 |
BR112019000195A2 (pt) | 2019-04-24 |
CN109526226A (zh) | 2019-03-26 |
AU2017293931A1 (en) | 2019-01-17 |
JP2021191304A (ja) | 2021-12-16 |
WO2018009838A1 (en) | 2018-01-11 |
US20190161730A1 (en) | 2019-05-30 |
MX2019000205A (es) | 2019-09-23 |
CA3029906A1 (en) | 2018-01-11 |
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