CN110607298B

CN110607298B - 887l rna抑制物及其在抑制肿瘤中的应用

Info

Publication number: CN110607298B
Application number: CN201810612927.9A
Authority: CN
Inventors: 汪香婷; 孔庆鹏; 申涛; 夏王晓; 程乐华; 邵方红
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2018-06-14
Filing date: 2018-06-14
Publication date: 2022-04-05
Anticipated expiration: 2038-06-14
Also published as: CN110607298A

Abstract

本发明公开了887L RNA抑制物及其在抑制肿瘤中的应用。本发明提供了一种RNA分子，获自人(Homo sapiens)，命名为887L RNA，为序列表的序列1所示的RNA分子.本发明还保护序列表的序列2所示的DNA分子。本发明还保护所述RNA分子或所述DNA分子在制备产品中的应用；产品功能：促进癌细胞增殖；促进癌细胞迁移；促进肿瘤生长；促进肿瘤转移；制备肿瘤动物模型。本发明还保护用于降低所述RNA分子水平的物质或用于沉默所述DNA分子的物质在制备产品中的应用；产品功能：抑制癌细胞增殖；抑制癌细胞迁移；抑制肿瘤生长；抑制肿瘤转移；治疗癌症。本发明对于舌癌动物模型的构建以及舌癌的治疗，具有重大的应用推广价值。

Description

887L RNA抑制物及其在抑制肿瘤中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及887L RNA抑制物及其在抑制肿瘤中的应用。

背景技术

舌癌是口腔颌面部常见的恶性肿瘤，男性多于女性，多数为鳞状细胞癌，特别是在舌前2/3部位，腺癌比较少见，多位于舌根部；舌根部有时亦可发生淋巴上皮癌及未分化癌。

舌癌的发病部位具有丰富的局部血管淋巴，易发生早期转移，病人预后极差。例如，目前TCGA共收录舌癌病人数据125例，其中死亡病例85例，存活40例。整体五年存活率为3.2％，死亡病人中仅有1例确诊后生存时间超过5年。此外，在这125例样本中，仅有11例病人在诊断时TNM分期为T1期，说明大多数舌癌在确诊时已处于疾病发展的中后期阶段，另一方面也揭示了舌癌病人五年存活率低的原因。

目前对于舌癌的治疗方面，主要还是施行以手术为主的综合治疗，一般进行原发病切除及颈部淋巴结清扫术，手术前或手术后配合放疗或化疗。

发明内容

本发明的目的是提供887L RNA抑制物及其在抑制肿瘤中的应用。

本发明提供了一种RNA分子，获自人(Homo sapiens)，命名为887L RNA，为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的RNA分子；

(a2)来自于人的与序列表的序列1所示的RNA具有98％以上同一性的RNA分子。

本发明还保护一种DNA分子，为如下(b1)或(b2)：

(b1)序列表的序列2所示的DNA分子；

(b2)来自于人的与序列表的序列2所示的DNA具有98％以上同一性的DNA分子。

本发明还保护具有所述DNA分子的重组表达载体。

本发明还保护用于提高所述RNA分子水平的物质或用于促进所述DNA分子表达的物质在制备产品中的应用；

所述产品的功能为如下(c1)和/或(c2)和/或(c3)和/或(c4)和/或(c5)：

(c1)促进癌细胞增殖；

(c2)促进癌细胞迁移；

(c3)促进肿瘤生长；

(c4)促进肿瘤转移；

(c5)制备肿瘤动物模型。

所述用于提高所述RNA分子水平的物质具体可为所述RNA分子或所述DNA分子或所述重组表达载体。

本发明还保护用于降低所述RNA分子水平的物质或用于沉默所述DNA分子的物质在制备产品中的应用；

所述产品的功能为如下(d1)和/或(d2)和/或(d3)和/或(d4)和/或(d5)：

(d1)抑制癌细胞增殖；

(d2)抑制癌细胞迁移；

(d3)抑制肿瘤生长；

(d4)抑制肿瘤转移；

(d5)治疗癌症。

本发明还保护一种产品，其活性成分为用于提高所述RNA分子水平的物质或用于促进所述DNA分子表达的物质；

(c1)促进癌细胞增殖；

(c2)促进癌细胞迁移；

(c3)促进肿瘤生长；

(c4)促进肿瘤转移；

(c5)制备肿瘤动物模型。

本发明还保护一种产品，其活性成分为用于降低所述RNA分子水平的物质或用于沉默所述DNA分子的物质；

(d1)抑制癌细胞增殖；

(d2)抑制癌细胞迁移；

(d3)抑制肿瘤生长；

(d4)抑制肿瘤转移；

(d5)治疗癌症。

本发明还保护用于提高所述RNA分子水平的物质或用于促进所述DNA分子表达的物质的应用，为如下(c1)和/或(c2)和/或(c3)和/或(c4)和/或(c5)：

(c1)促进癌细胞增殖；

(c2)促进癌细胞迁移；

(c3)促进肿瘤生长；

(c4)促进肿瘤转移；

(c5)制备肿瘤动物模型。

本发明还保护用于降低所述RNA分子水平的物质或用于沉默所述DNA分子的物质的应用，为如下(d1)和/或(d2)和/或(d3)和/或(d4)和/或(d5)：

(d1)抑制癌细胞增殖；

(d2)抑制癌细胞迁移；

(d3)抑制肿瘤生长；

(d4)抑制肿瘤转移；

(d5)治疗癌症。

本发明还保护所述RNA分子的应用，即所述RNA分子作为舌癌标志物的应用。

本发明还保护用于检测所述RNA分子的物质的应用，即用于检测所述RNA分子的物质在制备诊断或辅助诊断舌癌的试剂盒中的应用。所述用于检测所述RNA分子的物质具体可为如下引物对：F1：5’-CCTGCTTGGCAGGTAACAGA-3’；R1：5’-GATGCCTCAGTCGAAGGGAG-3’。

本发明还保护LINC00887 RNA作为舌癌患者的预后靶标的应用。LINC00887 RNA低表达的舌癌患者存活率高于LINC00887 RNA高表达的舌癌患者。

本发明还保护用于检测LINC00887 RNA的物质在制备对舌癌患者进行预后的试剂盒中的应用。LINC00887 RNA低表达的舌癌患者存活率高于LINC00887 RNA高表达的舌癌患者。

以上任一所述癌细胞可为具有CA9基因的癌细胞。以上任一所述癌细胞可为与正常细胞相比CA9基因表达水平具有差异的癌细胞。以上任一所述癌细胞可为以CA9蛋白为标志物的癌细胞。

以上任一所述肿瘤可为由与正常细胞相比CA9基因表达水平升高的癌细胞引起的肿瘤。以上任一所述肿瘤可为由与正常细胞相比CA9蛋白水平升高的癌细胞引起的肿瘤。以上任一所述肿瘤可为由以CA9蛋白为标志物的癌细胞引起的肿瘤。以上任一所述肿瘤可为由以CA9蛋白高表达为标志物的癌细胞引起的肿瘤。

以上任一所述癌症可为由与正常细胞相比CA9基因表达水平升高的癌细胞引起的癌症。以上任一所述癌症可为由与正常细胞相比CA9蛋白水平升高的癌细胞引起的癌症。以上任一所述癌症可为由以CA9蛋白为标志物的癌细胞引起的癌症。以上任一所述癌症可为由以CA9蛋白高表达为标志物的癌细胞引起的癌症。

以上任一所述CA9蛋白如GenBank:CAA47315.1所示。

以上任一所述CA9基因如GenBank:X66839.1所示。

以上任一所述癌细胞具体可为舌癌细胞。

以上任一所述癌细胞具体可为SCC-15细胞。

以上任一所述肿瘤可为舌癌肿瘤。

以上任一所述癌症可为舌癌。

以上任一所述重组表达载体可为在pcDNA3.1(+)载体的多克隆位点(例如KpnⅠ酶切位点和EcoRⅠ酶切位点之间)插入序列表的序列2所示的DNA分子得到的重组质粒。

以上任一所述降低所述RNA分子水平的物质可为通过特异shRNA降低所述RNA分子水平的物质。以上任一所述降低所述RNA分子水平的物质可为表达特异shRNA的重组慢病毒。特异shRNA具体如序列表的序列4或序列表的序列6所示。以上任一所述降低所述RNA分子水平的物质可为重组质粒、pREV质粒、pGag/pol质粒和pVSVG质粒。以上任一所述降低所述RNA分子水平的物质可为重组病毒。所述重组病毒为将重组质粒、pREV质粒、pGag/pol质粒和pVSVG质粒共转染293T细胞，培养后得到的重组病毒。重组质粒具体可为在pLKO.1载体的多克隆位点(例如EcoRⅠ和AgeⅠ酶切位点之间)插入了序列表的序列3或序列表的序列5所示DNA分子。

以上任一所述用于沉默所述DNA分子的物质可为通过特异shRNA降低沉默所述DNA分子的物质。以上任一所述沉默所述DNA分子的物质可为表达特异shRNA的重组慢病毒。特异shRNA具体如序列表的序列4或序列表的序列6所示。以上任一所述沉默所述DNA分子的物质可为重组质粒、pREV质粒、pGag/pol质粒和pVSVG质粒。以上任一所述沉默所述DNA分子的物质可为重组病毒。所述重组病毒为将重组质粒、pREV质粒、pGag/pol质粒和pVSVG质粒共转染293T细胞，培养后得到的重组病毒。重组质粒具体可为在pLKO.1载体的多克隆位点(例如EcoRⅠ和AgeⅠ酶切位点之间)插入了序列表的序列3或序列表的序列5所示DNA分子。

本发明对于舌癌动物模型的构建以及舌癌的治疗，具有重大的应用推广价值。

附图说明

图1为实施例1中887L RNA的相对表达量的结果。

图2为实施例2的步骤四中887L RNA的相对表达量的结果。

图3为实施例2的步骤五中增殖能力检测的结果(两周)。

图4为实施例2的步骤五中增殖能力检测的结果(一周)。

图5为实施例2的步骤五中Transwell试验检测的结果。

图6为实施例2的步骤五中Transwell试验检测的结果。

图7为实施例2的步骤五中划痕试验检测的结果。

图8为实施例3中CA9基因的相对表达量的结果。

图9为实施例3中CA2基因/CA5基因/CA12基因的相对表达量的结果。

图10为实施例5的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

ATCC全称为美国美国模式培养物保藏所细胞库(网址：https://www.atcc.org/)。293T细胞：

CRL-3216^TM。MCF10A细胞：

CRL-10317^TM。MCF7细胞：

HTB-22^TM。SK-BR-3细胞：

HTB-30^TM。MDA-MB-435S细胞：

HTB-129^TM。SH-SY5Y细胞：

CRL-2266^TM。HCT116细胞：

CCL-247^TM。SCC-15细胞：

CRL-1623^TM。786-O细胞：

CRL-1932^TM。

pcDNA3.1(+)载体：美国addgene公司。

pLKO.1载体、pREV质粒、pGag/pol质粒、pVSVG质粒均记载于如下文献：Wang J,Qiao M,He Q,et al.Pluripotency Activity of Nanog Requires Bioch emicalStabilization by Variant Histone Protein H2A.Z[J].Stem Cells,2015,33(7):2126-2134.。pLKO.1载体为慢病毒shRNA表达载体，以上三个质粒为包装质粒。pLKO.1载体和三个包装质粒共同转染细胞，得到表达目标shRNA的慢病毒。

887L RNA如序列表的序列1所示。基因组DNA中，与887L RNA对应的DNA如序列表的序列2所示。

实施例1、舌癌细胞株中887L RNA的表达量

供试细胞：293T细胞(人胚肾细胞)、MCF10A细胞(人乳腺上皮细胞)、MCF7细胞(人乳腺癌细胞)、SK-BR-3细胞(人乳腺癌细胞)、MDA-MB-435S细胞(人乳腺癌细胞)、SH-SY5Y细胞(人神经母细胞瘤)、HCT116细胞(人结直肠癌细胞)、SCC-15细胞(人舌鳞状细胞癌细胞)、786-O细胞(人肾透明癌细胞)。

1、提取供试细胞的总RNA。

2、以步骤1提取的总RNA为模板，进行逆转录，得到cDNA。

反应体系(20μl)：10μl 2×RT Mix、1μl Random Primers、1μl Oligo dT₂₃VN、2μlHiScript^RⅡEnzyme Mix，1μg RNA模板，以无RNase水补至20μl。反应体系中，除了RNA模板和无RNase水以外，均为HiScript II One Step RT-PCR反转录试剂盒(中国Vazyme公司)中的组件。

反应程序：25℃5min，50℃15min，85℃10min。

3、以步骤2得到得到cDNA为模板，采用18s rRNA为内参基因，通过荧光定量PCR检测887L RNA的表达量。

反应体系(10μl)：2.5μl无RNase水、5μl 2×qPCR SYBR Green、0.25μl正向引物、0.25μl反向引物、2μL步骤2的反应产物(约含1μg cDNA)。反应体系中，F1的浓度为0.25μM，R1的浓度为0.25μM。

反应程序：95℃10min，1个循环；95℃15s、60℃60s，40个循环。

用于检测887L RNA的引物对由F1和R1组成。

用于检测内参基因的引物对由F2和R2组成。

F1(正向引物)：5’-CCTGCTTGGCAGGTAACAGA-3’；

R1(反向引物)：5’-GATGCCTCAGTCGAAGGGAG-3’。

F2(正向引物)：5’-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3’；

R2(反向引物)：5’-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3’。

887L RNA的相对表达量＝供试细胞中887L RNA的表达量/293T细胞中887L RNA的表达量。

结果见图1。SCC-15细胞、786-O细胞中887L RNA的表达量显著高于其它细胞。

实施例2、887L RNA表达量对舌癌细胞株增殖及迁移能力的影响

一、抑制887L RNA表达的重组细胞及其对照重组细胞的制备

1、重组质粒的构建

构建重组质粒甲：将单链DNA分子甲-1和单链DNA分子甲-2退火，得到具有粘末端的双链DNA分子；将具有粘末端的双链DNA分子插入至pLKO.1载体的EcoRⅠ和AgeⅠ酶切位点之间，得到重组质粒甲。经测序验证，对重组质粒甲进行结构描述如下：在pLKO.1载体的EcoRⅠ和AgeⅠ酶切位点之间插入了序列表的序列3所示的DNA分子。单链DNA分子甲-1：ccggCTCACGTTGTCACCTTAGT ggatcc ACTAAGGTGACAACGTGAG tttttg；单链DNA分子甲-2：aattcaaaaa CTCACGTTGTCACCTTAGT ggatcc ACTAAGGTGACAACGTGAG。

构建重组质粒乙：将单链DNA分子乙-1和单链DNA分子乙-2退火，得到具有粘末端的双链DNA分子；将具有粘末端的双链DNA分子插入至pLKO.1载体的EcoRⅠ和AgeⅠ酶切位点之间，得到重组质粒乙。经测序验证，对重组质粒乙进行结构描述如下：在pLKO.1载体的EcoRⅠ和AgeⅠ酶切位点之间插入了序列表的序列5所示的DNA分子。单链DNA分子乙-1：ccggCACTTCTCGTCACCACTAT ggatcc ATAGTGGTGACGAGAAGTG tttttg；单链DNA分子乙-2：aattcaaaaa CACTTCTCGTCACCACTAT ggatcc ATAGTGGTGACGAGAAGTG。

2、稳定敲低887L RNA的舌癌细胞株构建

①借助lipofectamine 2000，将pLKO.1载体、pREV质粒、pGag/pol质粒和pVSVG质粒共转染293T细胞，采用DMEM培养基培养6h，然后采用含20％胎牛血清的DMEM培养基培养48h，收集上清液，即为病毒液。

②采用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基培养SCC-15细胞至70％-80％汇合度，然后以MOI＝100的剂量感染步骤①制备的病毒液，然后加入polybrene并使其在培养体系中的浓度为8μg/ml，继续培养24h，然后采用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基培养24h，收集细胞。

③取步骤②收集的细胞，进行胰酶消化，然后采用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基稀释，然后接种至96孔板(每孔1-2个细胞)，采用含2μg/ml嘌呤霉素和10％胎牛血清的DMEM/F12培养基培养，取生长快的单克隆，扩大培养后检测887L RNA的表达量(方法同实施例1)。与SCC-15细胞相比887L RNA的表达量差异在10％以内且无明显形态学差异的细胞，即为重组细胞Ⅰ。

用重组质粒甲代替pLKO.1载体进行上述步骤。与重组细胞Ⅰ相比887L RNA的表达量降低幅度为50％以上，即为重组细胞Ⅱ。

用重组质粒乙代替pLKO.1载体进行上述步骤。与重组细胞Ⅰ细胞相比887L RNA的表达量降低幅度为50％以上，即为重组细胞Ⅲ。

二、过表达887L RNA的重组细胞及其对照重组细胞的制备

借助lipofectamine 3000，将pcDNA3.1(+)载体导入SCC-15细胞，得到重组细胞，命名为重组细胞Ⅳ。

在pcDNA3.1(+)载体的KpnⅠ酶切位点和EcoRⅠ酶切位点之间插入序列表的序列2所示的DNA分子，得到重组质粒pcDNA3.1-887L。

借助lipofectamine 3000，将重组质粒pcDNA3.1-887L导入SCC-15细胞，得到重组细胞，命名为重组细胞Ⅴ。

三、回补细胞的制备

借助lipofectamine 3000，将重组质粒pcDNA3.1-887L导入重组细胞Ⅱ，得到重组细胞，命名为重组细胞Ⅵ。

借助lipofectamine 3000，将重组质粒pcDNA3.1-887L导入重组细胞Ⅲ，得到重组细胞，命名为重组细胞Ⅶ。

四、检测887L RNA的表达量

供试细胞为步骤一和步骤二得到的各个重组细胞。

方法同实施例1。

887L RNA的相对表达量＝供试细胞中887L RNA的表达量/重组细胞Ⅰ中887L RNA的表达量。

结果见图2。

五、检测细胞的增殖能力和迁移能力

以下各个步骤的细胞培养条件：37℃、5％CO₂、静置培养。

1、增殖能力

在6孔板中接种200个供试细胞(供试细胞为重组细胞Ⅰ、重组细胞Ⅱ或重组细胞Ⅲ)，采用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基培养两周(隔3天换一次液)，然后用4％多聚甲醛溶液固定30min，然后用PBS缓冲液漂洗，然后用2.5％结晶紫溶液染色30min，然后拍照并统计克隆形成率。结果见图3。图3A为照片，图3B为克隆形成率。

在6孔板中接种200个供试细胞(供试细胞为重组细胞Ⅳ或重组细胞Ⅴ)，采用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基培养一周(隔3天换一次液)，然后用4％多聚甲醛溶液固定30min，然后用PBS缓冲液漂洗，然后用2.5％结晶紫溶液染色30min，然后拍照并统计克隆形成率。结果见图4。图4A为照片，图4B为克隆形成率。

2、转移能力(Transwell试验)

在transwell小室的上室中接种1×10⁵个供试细胞(供试细胞为重组细胞Ⅳ或重组细胞Ⅴ)，上室加入DMEM/F12培养基，下室加入含20％胎牛血清的DMEM/F12培养基，培养24h，然后取中间膜，对中间膜的下表面进行检测。检测方法：用4％多聚甲醛溶液固定30min，然后用PBS缓冲液漂洗，然后用2.5％结晶紫溶液染色30min，漂洗晾干后后拍照并统计细胞迁移率。结果见图5。图5A为照片，图5B为细胞迁移率。

在transwell小室的上室中接种1×10⁵个供试细胞(供试细胞为重组细胞Ⅰ、重组细胞Ⅵ或重组细胞Ⅶ)，上室加入DMEM/F12培养基，下室加入含20％胎牛血清的DMEM/F12培养基，培养48h，然后取中间膜，对中间膜的下表面进行检测。检测方法：用4％多聚甲醛溶液固定30min，然后用PBS缓冲液漂洗，然后用2.5％结晶紫溶液染色30min，漂洗晾干后后拍照并统计细胞迁移率。结果见图6。图6A为照片，图6B为细胞迁移率。

3、转移能力(划痕实验)

预先用marker笔在6孔细胞培养板背后，沿直尺边线均匀地划横线，每隔1cm一道，横穿过孔，然后在每个孔中加入5×10⁵个供试细胞(供试细胞为重组细胞Ⅰ、重组细胞Ⅱ、重组细胞Ⅲ)，采用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基培养至细胞铺满；然后用200μl的枪头沿着直尺边线，垂直于孔背后的横线划痕；然后吸弃培养上清，用PBS缓冲液洗3次，每孔加入200ml含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，培养24h；然后拍照并统计细胞迁移覆盖面积百分比。

结果见图7。图7A为照片，图7B为细胞迁移覆盖面积百分比。

步骤五的结果表明：与重组细胞Ⅰ相比，重组细胞Ⅱ和重组细胞Ⅲ的增殖能力和迁移能力显著降低。与重组细胞Ⅳ相比，重组细胞Ⅴ的增殖能力和迁移能力显著增强。结果表明，过表达887L RNA可以促进SCC-15细胞的增殖和迁移，抑制887L RNA表达可以抑制SCC-15细胞的增殖和迁移。

实施例3、抑制或过表达887L RNA对CA9的影响

一、CA9基因的表达量

供试细胞为实施例2的步骤一和步骤二得到的各个重组细胞。

1、提取供试细胞的总RNA。

2、以步骤1提取的总RNA为模板，进行逆转录，得到cDNA。

3、以步骤2得到得到cDNA为模板，采用18s rRNA为内参基因，通过荧光定量PCR检测CA9基因的表达量。

用于检测CA9基因(GenBank:X66839.1,linear PRI 07-OCT-2008)的引物对如下：

上游引物：AGAAATCGCTGAGGAAGGCT；

下游引物：TCAGCTGTAGCCGAGAGTCA。

CA9基因的相对表达量＝供试细胞中CA9基因的表达量/重组细胞Ⅰ中CA9基因的表达量。

结果见图8。过表达887L RNA可以促进CA9基因表达，抑制887L RNA表达可以抑制CA9基因表达。

二、其他基因的表达量

供试细胞为实施例2的步骤一得到的各个重组细胞。

1、提取供试细胞的总RNA。

2、以步骤1提取的总RNA为模板，进行逆转录，得到cDNA。

3、以步骤2得到得到cDNA为模板，采用18s rRNA为内参基因，通过荧光定量PCR检测CA2基因/CA5基因/CA12基因的表达量。

用于检测CA2基因(GenBank:J03037.1,linear PRI 31-OCT-1994)的引物对如下：

上游引物：ACTGGGGTTCACTTGATGGAC；

下游引物：GTTTAGCGCTGCCAACCTTC。

用于检测CA5基因(GenBank:L19297.1，linear PRI 01-OCT-1993)的引物对如下：

上游引物：GGATTACTGGACCTACGCGG；

下游引物：GGGTTGAAGTGGGCGATAGT。

用于检测CA12基因(GenBank:AF051882.1,linear PRI 25-JUN-1998)的引物对如下：

上游引物：CCAAGTGCAAGTCTGTACTGC；

下游引物：TGGGCCTCAGTCTCCATCTT。

某一基因的相对表达量＝供试细胞中该基因的表达量/重组细胞Ⅰ中该基因的表达量。

结果见图9。过表达887L RNA或抑制887L RNA表达，对于CA2基因/CA5基因/CA12基因的表达没有影响。

实施例4、裸鼠成瘤能力检测

两只4-6周龄BALB/c(nu/nu)雌性裸鼠，每只分别进行如下操作：在第一只小鼠腹腔左侧皮下注射重组细胞Ⅳ(体积为100μL，含1×10⁷个重组细胞Ⅳ)，在第二只小鼠腹腔左侧皮下注射重组细胞Ⅴ(体积为100μL，含1×10⁷个重组细胞Ⅴ)。

注射重组细胞8周后，观察裸鼠成瘤情况，称量瘤重。

第一只小鼠的瘤重为0.74g，第二只小鼠的瘤重为8.26g。促进887L RNA表达对于舌癌细胞成瘤具有促进作用。

实施例5、TCGA数据库中LINC00887 RNA表达量与头颈部癌病人存活率的关系

TCGA(The Cancer genome atlas，肿瘤基因组图谱)是由美国National CancerInsititute(NCI)和National Human Genome Research Institute(NHGRI)于2006年联合启动的项目。TCGA创建了一个基因组数据分析流程，可以有效地收集，选择和分析人体组织的基因组改变。目前，TCGA以及产生了33种癌症类型的多尺度，综合性基因组变化图谱。描述了肿瘤组织2.5M字节的数据，与11000多名患者的正常组织相匹配。

利用头颈部癌以及其主要的几种亚型(舌根癌、口腔底癌、喉癌、口腔癌、舌癌)的数据。对LINC00887 RNA表达量及头颈部癌病人存活率相互关系进行分析。

具体实施步骤如下：通过对TCGA数据库中的528例头颈部癌病人的临床数据进行分析，获得了头颈部癌病人的诊断后生活状况，联合LINC00887 RNA在头颈部癌中的表达情况，以overall survival(整体存活率)的标准，做Kaplan-Meier生存分析。

结果见图10。LINC00887 RNA表达量和头颈部癌的存活率有着显著的关系，具体表现为LINC00887低表达的病人整体存活率高于LINC00887高表达的病人。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学技术大学

<120> 887L RNA抑制物及其在抑制肿瘤中的应用

<130> GNCYX181163

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4202

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

gggacuuacu ccaagagccc cggggaagcg ggcugggcug uuuggggagg aaugcucacc 60

cggcagugug caggccuggc agggcugccu cuaaacccaa auugcagucc ccaagcacgu 120

gcgcuugcuc ugccugagau cuccaaugau gcugcuuugg cgggaguacu gauucuagcc 180

agugauuuau caucuguuua cucagagaaa cugcuuguuc auuucugcug gugggaaggg 240

aaggagggag ggagggaggu gaacgugugu ccugugagcu gcagagguag ccggcaggga 300

ugacuuauac acuccccucg augggugacc uccauucacu cuuccucccc gccucuccgc 360

cugaugagaa acagaaugug cucccucccc ccugggaggc uucagauuca uuuucugcuc 420

agacaccguu gcuugcaaaa uuccacccag aagauaaggg agggaguauc gcugcagcgu 480

ccugcucugu gccugguuau auuacuggau ccuuguguug cagcccuaag auagaaggau 540

ugucuccauu ucacagauga gagagaacug augcgcagga ggcugaaauu gucugaaguc 600

acacagcagc cuccucuuaa acaugacaaa gaauccaagg acuugugcug gggcugucag 660

cugcuauucu ggugcccugg ggacgaagaa gggaucugga gggaagacug ucacccucuu 720

gcgaauguuu ccaagaagca gcucagcaug ggagagaaaa ggggagaucc caguuccagg 780

aacaccuggc caguguuuca ccuguuuauc ggaguugaca ggaccagcca gcccuuuccc 840

accucucccc aucaugaugg augggagccu ggccuuugag acccuagcac ugugcucaca 900

cagcggggcg auggcgaaca agagacaagg uuccuguccu cauggagcuu acagucccgc 960

uugccuuaca cggacucgcu gagccuucuu cucgggugau gccucagcuu ccuacuucac 1020

gaagaagaua aaagcaauca gaagagaugc ucacgagcau cuguccccac cucacccgcu 1080

gccucaccgc augcccgcgu uuugugucug ucccucuccu guucugugga ugaacuuuuc 1140

acgccauggc ucaggccagc cccucccccu gcaacauuca ucccaugccc uccuggcugc 1200

ucaaggacau cgcuccagug ucucccuucu gucccuugca ccaucaaucu uucccucucu 1260

auggggucuc uccuagcagc augcuaccau guugccaucu cucccaugua aagauaccuu 1320

gucuugaccc cacuuccucc cccaggagaa uggccccagu ucuuaccacu uccaaaauga 1380

uugucuggac ucaucaucuc caaauucucu ccucccauuc ucccuugaau ccaccccaau 1440

cacacuguca ucccugacac uguucuuguc aaggucacca auguccucau uuugcuaaau 1500

gcaguggaca uuucuugguc cucaucuugc cuggcuguca gcaucauuug acauggcugg 1560

uuccucccuc cacguugaac acuuucuuca cauccaccug cuuuccuucu ccuucuggcc 1620

acugccucuc agacucuuuu gccaucuucu cuucagauuc cugcgaagga augacaaaga 1680

acaucaaggc ucaauccuug gaacucucca ucacucaucu uuaaauuaga cuucucugcu 1740

gacucucaga guuguguaug cugagaaucc acugccucua agacauccug cuuggcaggu 1800

aacagacauu ucauccugag cugagcuccu gcccaccccg cccacacaca gaccccuucu 1860

ugcccacaga uuucccaucu cagccaaugg cgaguccaaa aauccuuugu guccccuuug 1920

auucuuaggu uccuaucucc cuucgacuga ggcaucguuu ccaaaucaga cacuucucgu 1980

caccacuauu gcccuccccu uguccaaccc accuuuggcu cuuggcugga guccggugag 2040

ucuccuagcu ggcucucccu guucucguca uuucccagua aguuccaacc cugccuucag 2100

acucuucugc acacagcuuc cagaguaauc cuuucaaaaa guaagucaga ucccaucuuu 2160

ucccucccgu cucacucugu cagccacauu cauuccaaag gaccaugugg uccauguccc 2220

uguucucucu gguucucuca cugcucuccu cugugcuuac ucucuccugc cucacaaugu 2280

uugcacuuac uguuucuucu gcuuggaacu cuuucccucc aagaccuuuu uuuuuugaga 2340

cggagucucg cucugucgcc caggcuggag cgcaguggug caaucucugc ucacugcaag 2400

cucugccucc cagguucacg ucauucuccu gccucagccu cccgaguagc ugggacuaca 2460

cgcaccagcc accauaccca gcucauuuuu uuuguauuuu caguagagac gggguuucac 2520

cauguuggcc aggauggucu ugaucuccug accucgugau ccgcccgccu cggccucccu 2580

aagcgcuggg auuacaggug ugaaccaccg cgcccggccu cccuccaaga ucuuuacuca 2640

cguugucacc uuagugacgg cucccucccu aaccauccua uuuaaaauug cagcccguuc 2700

aacacccauu ccuccuucuc cauccuugcu cugcuuccuc ccuuugaccu gucacucuuu 2760

aauccagugg cauucugauu caauggugac ugggagcagg accuaaggag gugcgucauc 2820

uguagagaau uugaaaauaa ucgugaaaua aacucaaagu ggguuugcuc uuuaugagcc 2880

ccgcacacca gcaauucuaa auucuguuau caauauacuu uccugccagg gugggccgcc 2940

cccaccgauu cuccucuauc uuaauacacu auguguuucc cuuguuuauu uugcuuauug 3000

uucauuucca ugcacuagaa uauaagcucc gcgagggcag uauauuuugu cuguuuuguu 3060

caccacugug ucccucgugu cugccacaug gugugugcuc aguaagcuuu agcugaauga 3120

augaagugga ggaugucgac guucccuuag uuggggguua ucaggagggc uuccuggaug 3180

aauugguguc uauauugccu guccuuaaag aggaggaagg ugcucuaggc agaaggaaca 3240

gcagguacaa aagcaacuug acugucaggg ucauuagcua agaguaggag ucagagggau 3300

gagugggugu cguucaccag aauuuacccu ucaaaauguc agugcuuagu aaaugaaugu 3360

guuccuuuau uacuaguugu uggagggucc uuguugacau cuugcagagg ucuggcuguc 3420

acuuuuaauc agaauggcua uuccccacuc cugcugaaga gcuccaggcc uggcgggggu 3480

gggcuggcgg gcuguggugg ugguaagggc ugucccccag cacacuguua gaacuuuacu 3540

uauccucuug cuugaagugu gggagcugga gaccauucag gaagcugugg uuacaguccc 3600

agacaggguc ccuaaaagca aggagccauu cccaaugcuu ccuccuuagg gaagccuucc 3660

cuacuuucuc uucccucuuc ugggcagagu uuguaccuuc cuccuuuuug cucucuguuu 3720

auuucuuuaa uuuaacacuu aacaacauaa uaccaucuuu auuuguucca uguuuguauc 3780

uucuacugaa uguggcuuca agaacagaaa gcacagaacg uggcacguug gaggaaauca 3840

guaaguguuu gcuaaagguc caacaaugaa acagaacaga uauauccagu gcuaugccgc 3900

gucaaaagag uaugagaggu auugugguga ugcuuuugaa ugcuaaucag aauaaggagg 3960

gugacuaguc cauaguuaua uagaauauag gauauacaga auauaccuuu uucuguaacg 4020

ggauguguca cuuaacuuug uuccuuaaag cuccagaagc ccaaggucac ccacaaugau 4080

ucaaguauua ucaauguuga gagccuguaa aagcaucaag uauauuauag uuuccaaaaa 4140

auugugaauu agacugaaaa ccagcauuua aaaaauaaag ugauguugac uuaaaaaaaa 4200

aa 4202

<210> 2

<211> 4202

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

gggacttact ccaagagccc cggggaagcg ggctgggctg tttggggagg aatgctcacc 60

cggcagtgtg caggcctggc agggctgcct ctaaacccaa attgcagtcc ccaagcacgt 120

gcgcttgctc tgcctgagat ctccaatgat gctgctttgg cgggagtact gattctagcc 180

agtgatttat catctgttta ctcagagaaa ctgcttgttc atttctgctg gtgggaaggg 240

aaggagggag ggagggaggt gaacgtgtgt cctgtgagct gcagaggtag ccggcaggga 300

tgacttatac actcccctcg atgggtgacc tccattcact cttcctcccc gcctctccgc 360

ctgatgagaa acagaatgtg ctccctcccc cctgggaggc ttcagattca ttttctgctc 420

agacaccgtt gcttgcaaaa ttccacccag aagataaggg agggagtatc gctgcagcgt 480

cctgctctgt gcctggttat attactggat ccttgtgttg cagccctaag atagaaggat 540

tgtctccatt tcacagatga gagagaactg atgcgcagga ggctgaaatt gtctgaagtc 600

acacagcagc ctcctcttaa acatgacaaa gaatccaagg acttgtgctg gggctgtcag 660

ctgctattct ggtgccctgg ggacgaagaa gggatctgga gggaagactg tcaccctctt 720

gcgaatgttt ccaagaagca gctcagcatg ggagagaaaa ggggagatcc cagttccagg 780

aacacctggc cagtgtttca cctgtttatc ggagttgaca ggaccagcca gccctttccc 840

acctctcccc atcatgatgg atgggagcct ggcctttgag accctagcac tgtgctcaca 900

cagcggggcg atggcgaaca agagacaagg ttcctgtcct catggagctt acagtcccgc 960

ttgccttaca cggactcgct gagccttctt ctcgggtgat gcctcagctt cctacttcac 1020

gaagaagata aaagcaatca gaagagatgc tcacgagcat ctgtccccac ctcacccgct 1080

gcctcaccgc atgcccgcgt tttgtgtctg tccctctcct gttctgtgga tgaacttttc 1140

acgccatggc tcaggccagc ccctccccct gcaacattca tcccatgccc tcctggctgc 1200

tcaaggacat cgctccagtg tctcccttct gtcccttgca ccatcaatct ttccctctct 1260

atggggtctc tcctagcagc atgctaccat gttgccatct ctcccatgta aagatacctt 1320

gtcttgaccc cacttcctcc cccaggagaa tggccccagt tcttaccact tccaaaatga 1380

ttgtctggac tcatcatctc caaattctct cctcccattc tcccttgaat ccaccccaat 1440

cacactgtca tccctgacac tgttcttgtc aaggtcacca atgtcctcat tttgctaaat 1500

gcagtggaca tttcttggtc ctcatcttgc ctggctgtca gcatcatttg acatggctgg 1560

ttcctccctc cacgttgaac actttcttca catccacctg ctttccttct ccttctggcc 1620

actgcctctc agactctttt gccatcttct cttcagattc ctgcgaagga atgacaaaga 1680

acatcaaggc tcaatccttg gaactctcca tcactcatct ttaaattaga cttctctgct 1740

gactctcaga gttgtgtatg ctgagaatcc actgcctcta agacatcctg cttggcaggt 1800

aacagacatt tcatcctgag ctgagctcct gcccaccccg cccacacaca gaccccttct 1860

tgcccacaga tttcccatct cagccaatgg cgagtccaaa aatcctttgt gtcccctttg 1920

attcttaggt tcctatctcc cttcgactga ggcatcgttt ccaaatcaga cacttctcgt 1980

caccactatt gccctcccct tgtccaaccc acctttggct cttggctgga gtccggtgag 2040

tctcctagct ggctctccct gttctcgtca tttcccagta agttccaacc ctgccttcag 2100

actcttctgc acacagcttc cagagtaatc ctttcaaaaa gtaagtcaga tcccatcttt 2160

tccctcccgt ctcactctgt cagccacatt cattccaaag gaccatgtgg tccatgtccc 2220

tgttctctct ggttctctca ctgctctcct ctgtgcttac tctctcctgc ctcacaatgt 2280

ttgcacttac tgtttcttct gcttggaact ctttccctcc aagacctttt ttttttgaga 2340

cggagtctcg ctctgtcgcc caggctggag cgcagtggtg caatctctgc tcactgcaag 2400

ctctgcctcc caggttcacg tcattctcct gcctcagcct cccgagtagc tgggactaca 2460

cgcaccagcc accataccca gctcattttt tttgtatttt cagtagagac ggggtttcac 2520

catgttggcc aggatggtct tgatctcctg acctcgtgat ccgcccgcct cggcctccct 2580

aagcgctggg attacaggtg tgaaccaccg cgcccggcct ccctccaaga tctttactca 2640

cgttgtcacc ttagtgacgg ctccctccct aaccatccta tttaaaattg cagcccgttc 2700

aacacccatt cctccttctc catccttgct ctgcttcctc cctttgacct gtcactcttt 2760

aatccagtgg cattctgatt caatggtgac tgggagcagg acctaaggag gtgcgtcatc 2820

tgtagagaat ttgaaaataa tcgtgaaata aactcaaagt gggtttgctc tttatgagcc 2880

ccgcacacca gcaattctaa attctgttat caatatactt tcctgccagg gtgggccgcc 2940

cccaccgatt ctcctctatc ttaatacact atgtgtttcc cttgtttatt ttgcttattg 3000

ttcatttcca tgcactagaa tataagctcc gcgagggcag tatattttgt ctgttttgtt 3060

caccactgtg tccctcgtgt ctgccacatg gtgtgtgctc agtaagcttt agctgaatga 3120

atgaagtgga ggatgtcgac gttcccttag ttgggggtta tcaggagggc ttcctggatg 3180

aattggtgtc tatattgcct gtccttaaag aggaggaagg tgctctaggc agaaggaaca 3240

gcaggtacaa aagcaacttg actgtcaggg tcattagcta agagtaggag tcagagggat 3300

gagtgggtgt cgttcaccag aatttaccct tcaaaatgtc agtgcttagt aaatgaatgt 3360

gttcctttat tactagttgt tggagggtcc ttgttgacat cttgcagagg tctggctgtc 3420

acttttaatc agaatggcta ttccccactc ctgctgaaga gctccaggcc tggcgggggt 3480

gggctggcgg gctgtggtgg tggtaagggc tgtcccccag cacactgtta gaactttact 3540

tatcctcttg cttgaagtgt gggagctgga gaccattcag gaagctgtgg ttacagtccc 3600

agacagggtc cctaaaagca aggagccatt cccaatgctt cctccttagg gaagccttcc 3660

ctactttctc ttccctcttc tgggcagagt ttgtaccttc ctcctttttg ctctctgttt 3720

atttctttaa tttaacactt aacaacataa taccatcttt atttgttcca tgtttgtatc 3780

ttctactgaa tgtggcttca agaacagaaa gcacagaacg tggcacgttg gaggaaatca 3840

gtaagtgttt gctaaaggtc caacaatgaa acagaacaga tatatccagt gctatgccgc 3900

gtcaaaagag tatgagaggt attgtggtga tgcttttgaa tgctaatcag aataaggagg 3960

gtgactagtc catagttata tagaatatag gatatacaga atataccttt ttctgtaacg 4020

ggatgtgtca cttaactttg ttccttaaag ctccagaagc ccaaggtcac ccacaatgat 4080

tcaagtatta tcaatgttga gagcctgtaa aagcatcaag tatattatag tttccaaaaa 4140

attgtgaatt agactgaaaa ccagcattta aaaaataaag tgatgttgac ttaaaaaaaa 4200

aa 4202

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

ctcacgttgt caccttagtg gatccactaa ggtgacaacg tgag 44

<210> 4

<211> 44

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

cucacguugu caccuuagug gauccacuaa ggugacaacg ugag 44

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

cacttctcgt caccactatg gatccatagt ggtgacgaga agtg 44

<210> 6

<211> 44

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

cacuucucgu caccacuaug gauccauagu ggugacgaga agug 44

Claims

1.一种RNA分子，其如序列表的序列1所示。

2.特异DNA分子，其如序列表的序列2所示。

3.具有权利要求2所述特异DNA分子的重组表达载体。

4.用于提高权利要求1所述RNA分子水平的物质或用于促进权利要求2所述DNA分子表达的物质在制备产品中的应用；

所述产品的功能为如下（c1）和/或（c2）和/或（c3）和/或（c4）和/或（c5）：

（c1）促进癌细胞增殖；

（c2）促进癌细胞迁移；

（c3）促进肿瘤生长；

（c4）促进肿瘤转移；

（c5）制备肿瘤动物模型。

5.用于降低权利要求1所述RNA分子水平的物质或用于沉默权利要求2所述DNA分子的物质在制备产品中的应用；

所述产品的功能为如下（d1）和/或（d2）和/或（d3）和/或（d4）和/或（d5）：

（d1）抑制癌细胞增殖；

（d2）抑制癌细胞迁移；

（d3）抑制肿瘤生长；

（d4）抑制肿瘤转移；

（d5）治疗癌症。

6.一种产品，其活性成分为用于提高权利要求1所述RNA分子水平的物质或用于促进权利要求2所述DNA分子表达的物质；

（c1）促进癌细胞增殖；

（c2）促进癌细胞迁移；

（c3）促进肿瘤生长；

（c4）促进肿瘤转移；

（c5）制备肿瘤动物模型。

7.一种产品，其活性成分为用于降低权利要求1所述RNA分子水平的物质或用于沉默权利要求2所述DNA分子的物质；

（d1）抑制癌细胞增殖；

（d2）抑制癌细胞迁移；

（d3）抑制肿瘤生长；

（d4）抑制肿瘤转移；

（d5）治疗癌症。

8.用于检测权利要求1所述RNA分子的物质在制备诊断或辅助诊断舌癌的试剂盒中的应用。