CN105985961A - 抑制EGFR基因表达的siRNA及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抑制EGFR基因表达的siRNA及其应用。所述siRNA的核苷酸序列为以下双链RNA分子中的任意一种：正义链：5’‑GCAGAUCAUCAGAGGAAAU‑3’，反义链：5’‑AUUUCCUCUGAUGAUCUGC‑3’；正义链：5’‑CCAAGGAAGCCAAGCCAAA‑3’，反义链：5’‑UUUGGCUUGGCUUCCUUGG‑3’；正义链：5’‑GGAGAUAAGUGAUGGAGAU‑3’，反义链：5’‑AUCUCCAUCACUUAUCUCC‑3’。这些siRNA可以特异高效地抑制EGFR基因表达，降低细胞生长增殖速率。

Description

抑制EGFR基因表达的siRNA及其应用
技术领域
本发明涉及一种抑制EGFR基因表达的siRNA及其应用，属于分子生物与生物医药技术领域。
背景技术
RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，是细胞出现靶基因缺失的表型。小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)为21-25个核苷酸的小分子干扰核糖核酸,可有效地定位目标mRNA，siRNA具有特殊的结构特征，即5’端磷酸基团和3’端的羟基，其两条链的3’端各有两个碱基突出于末端。由siRNA中的反义链指导合成一种被称为RNA诱导的沉默复合体(RISC)的核糖体，再由RISC介导切割目的mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域，从而实现干扰靶基因表达的功能。同时，siRNA可以作为特殊的引物，在依赖于RNA的RNA聚合酶的作用下，以目的mRNA为模版合成dsRNA，后者又可被降解为新的siRNA，重新进入上述循环。因此，即使外源siRNA的注入量较低，该信号也可能迅速被放大，导致全面的基因沉默。
表皮生长因子受体(epidermal growth factory receptor，EGFR)是一个由单一肽链组成的跨膜糖蛋白，由氨基端细胞外配体结合结构域、疏水性单一跨膜α-螺旋和胞浆酪氨酸激酶结构域组成，C-端含有数个重要的酪氨酸残基和受体调节基序，属于HER家族，主要分布于细胞膜的表面。EGFR在许多肿瘤中过表达或发生突变，其主要作用机制是通过与细胞外的配体结合后进行同源或异源二聚化，引起胞内酪氨酸残基自身磷酸化，活化的受体募集信号合体并活化下游信号转导蛋白，从而调节肿瘤细胞的生长、侵袭、转化、血管生成及转移。
人类恶性肿瘤普遍表达EGFR，上消化道、结肠、胰腺、乳腺、卵巢、膀胱、肾等组织恶性肿瘤和神经胶质瘤中EGFR mRNA或蛋白表达过量，或伴有EGFR基因的扩增。研究显示，与不表达EGFR配体的肿瘤相比，共表达EGFR及其配体的肿瘤生长迅速，恶性度高，患者生存期短。EGFR除了能刺激肿瘤细胞增殖外，还与肿瘤细胞血管形成有关。
许多肿瘤组织同时表达EGFR及其配体，能够通过自分泌和旁分泌途径活化EGFR。已有的体内外研究表明，用EGFR抑制剂阻断肿瘤细胞内EGFR活化的信号通路能够抑制肿瘤细胞的增殖和生存。另外，研究发现成人EGFR缺乏明显的生理作用，而EGFR过表达与肿瘤患者预后较差相关，这些研究结果表明EGFR及其配体网络可作为肿瘤分子治疗策略的合理靶位。采用RNAi技术研究EGFR在肿瘤发病过程中行使的功能是对肿瘤发病机制研究的重要补充。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供能够特异高效地抑制EGFR基因表达的siRNA及其应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
抑制EGFR基因表达的siRNA，其核苷酸序列为以下双链RNA分子中的任意一种：
正义链：5’-GCAGAUCAUCAGAGGAAAU-3’，反义链：5’-AUUUCCUCUGAUGAUCUGC-3’；
正义链：5’-CCAAGGAAGCCAAGCCAAA-3’，反义链：5’-UUUGGCUUGGCUUCCUUGG-3’；
正义链：5’-GGAGAUAAGUGAUGGAGAU-3’，反义链：5’-AUCUCCAUCACUUAUCUCC-3’。
本发明还包括上述抑制EGFR基因表达的siRNA在制备预防或治疗人类表皮生长因子受体相关的疾病的药物中的应用。具体的，所述的疾病为肺癌。
进一步地，本发明还提供一种降低人非小细胞肺癌NCI-H460细胞生长增殖率的方法，具体为：将上述siRNA导入目的细胞，使目的细胞的生长增殖速率下降。
与现有技术相比，本发明提供一系列新的抑制EGFR基因表达的siRNA及其在制药中的应用，体外试验结果表明，这些siRNA可以特异高效地抑制EGFR基因表达，降低细胞生长增殖速率。
附图说明
图1为实施例2中各实验组和对照组分别作用于NCI-H460细胞后Western blotting检测各处理组细胞中EGFR的表达水平的实时拍照图；
图2为实施例2中各实验组和对照组分别作用于NCI-H460细胞后Western blotting检测各处理组细胞中EGFR的表达水平定量图；
图3为实施例3中各实验组和对照组分别作用于NCI-H460细胞后各处理组细胞被AO/EB染色的形态图，其中(a)为空白对照组，(b)为阴性对照组，(c)为EGFR siRNA正常实验组；
图4为实施例4中各实验组和对照组分别作用于NCI-H460细胞后Western blotting检测各处理组细胞中EGFR的表达水平的实时拍照图；
图5为实施例4中各实验组和对照组分别作用于NCI-H460细胞后Western blotting检测各处理组细胞中EGFR的表达水平定量图；
图6为实施例5中各实验组和对照组分别作用于NCI-H460细胞后各处理组细胞胞被AO/EB染色的形态图，其中(a)为空白对照组，(b)为阴性对照组，(c)为EGFR siRNA正常实验组；
图7为实施例6中各实验组和对照组分别作用于NCI-H460细胞后Western blotting检测各处理组细胞中EGFR的表达水平的实时拍照图；
图8为实施例6中各实验组和对照组分别作用于NCI-H460细胞后Western blotting检测各处理组细胞中EGFR的表达水平定量图。
图9为实施例7中各实验组和对照组分别作用于NCI-H460细胞后各处理组细胞被AO/EB染色的形态图，其中(a)为空白对照组，(b)为阴性对照组，(c)为EGFR siRNA正常实验组。
具体实施方式
本发明提供了三种抑制EGFR基因表达的siRNA，分别如下：
第一种：正义链：5’-GCAGAUCAUCAGAGGAAAU-3’(SEQ ID NO.1)，反义链：5’-AUUUCCUCUGAUGAUCUGC-3’(SEQ ID NO.2)；
第二种：正义链：5’-CCAAGGAAGCCAAGCCAAA-3’(SEQ ID NO.3)，反义链：5’-UUUGGCUUGGCUUCCUUGG-3’(SEQ ID NO.4)；
第三种：正义链：5’-GGAGAUAAGUGAUGGAGAU-3’(SEQ ID NO.5)，反义链：5’-AUCUCCAUCACUUAUCUCC-3’(SEQ ID NO.6)。
本发明还提供上述抑制EGFR基因表达的siRNA在制备预防或治疗人类表皮生长因子受体相关的疾病的药物中的应用，具体是在制备预防或治疗人类肺癌的药物中的应用。
本发明进一步还提供一种降低人非小细胞肺癌NCI-H460细胞生长增殖率的方法，具体为：将上述siRNA导入目的细胞，使目的细胞的生长增殖速率下降。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述,以更好地理解本发明的内容,但本发明并不限于以下实施例。
下述各实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述各实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为来自常规生化试剂商店购买得到的。
人非小细胞肺癌NCI-H460，购于中国科学院细胞库。
GibcoTM DMEM basic(1X)培养液、GibcoTM FBS Qualifieg Australia Origin胎牛血清购自Lifetechnologies公司。兔抗人EGFR一抗、鼠抗人β-actin购自Abcam公司。抗兔IgG二抗、抗鼠IgG二抗购自北京中杉金桥公司。PBS、RIPA裂解液、BCA法蛋白测定试剂盒购自北京碧云天公司。LipofectamineTM 2000购自Invitrogen。化学发光剂Supersignal West Pico购自Thermo。AO-EB双染试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。
实施例1：EGFR siRNA的设计合成
一、EGFR siRNA的合成
通过Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)数据库中获取人EGFR碱基序列全长(T01001)，如下：
ATGCGACCCTCCGGGACGGCCGGGGCAGCGCTCCTGGCGCTGCTGGCTGCGCTCTGCCCGGCGAGTCGGGCTCTGGAGGAAAAGAAAGTTTGCCAAGGCACGAGTAACAAGCTCACGCAGTTGGGCACTTTTGAAGATCATTTTCTCAGCCTCCAGAGGATGTTCAATAACTGTGAGGTGGTCCTTGGGAATTTGGAAATTACCTATGTGCAGAGGAATTATGATCTTTCCTTCTTAAAGACCATCCAGGAGGTGGCTGGTTATGTCCTCATTGCCCTCAACACAGTGGAGCGAATTCCTTTGGAAAACCTGCAGATCATCAGAGGAAATATGTACTACGAAAATTCCTATGCCTTAGCAGTCTTATCTAACTATGATGCAAATAAAACCGGACTGAAGGAGCTGCCCATGAGAAATTTACAGGAAATCCTGCATGGCGCCGTGCGGTTCAGCAACAACCCTGCCCTGTGCAACGTGGAGAGCATCCAGTGGCGGGACATAGTCAGCAGTGACTTTCTCAGCAACATGTCGATGGACTTCCAGAACCACCTGGGCAGCTGCCAAAAGTGTGATCCAAGCTGTCCCAATGGGAGCTGCTGGGGTGCAGGAGAGGAGAACTGCCAGAAACTGACCAAAATCATCTGTGCCCAGCAGTGCTCCGGGCGCTGCCGTGGCAAGTCCCCCAGTGACTGCTGCCACAACCAGTGTGCTGCAGGCTGCACAGGCCCCCGGGAGAGCGACTGCCTGGTCTGCCGCAAATTCCGAGACGAAGCCACGTGCAAGGACACCTGCCCCCCACTCATGCTCTACAACCCCACCACGTACCAGATGGATGTGAACCCCGAGGGCAAATACAGCTTTGGTGCCACCTGCGTGAAGAAGTGTCCCCGTAATTATGTGGTGACAGATCACGGCTCGTGCGTCCGAGCCTGTGGGGCCGACAGCTATGAGATGGAGGAAGACGGCGTCCGCAAGTGTAAGAAGTGCGAAGGGCCTTGCCGCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTATTGGTGAATTTAAAGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAATATTAAACACTTCAAAAACTGCACCTCCATCAGTGGCGATCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGACTCCTTCACACATACTCCTCCTCTGGATCCACAGGAACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAGGGTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAAACAGGACGGACCTCCATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATACGCGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTGCAGTCGTCAGCCTGAACATAACATCCTTGGGATTACGCTCCCTCAAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTGTGCTATGCAAATACAATAAACTGGAAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACAGCTGCAAGGCCACAGGCCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTCCCCCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAGCCCAGGGACTGCGTCTCTTGCCGGAATGTCAGCCGAGGCAGGGAATGCGTGGACAAGTGCAACCTTCTGGAGGGTGAGCCAAGGGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGCCACCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGCACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGCCCACTACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACCTGCCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGTCTGGAAGTACGCAGACGCCGGCCATGTGTGCCACCTGTGCCATCCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCCAGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAATGGGCCTAAGATCCCGTCCATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTCCTCTTGCTGCTGGTGGTGGCCCTGGGGATCGGCCTCTTCATGCGAAGGCGCCACATCGTTCGGAAGCGCACGCTGCGGAGGCTGCTGCAGGAGAGGGAGCTTGTGGAGCCTCTTACACCCAGTGGAGAAGCTCCCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGGGCTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATAAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCGCAAAGGGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTGCCTATCAAGTGGATGGCATTGGAATCAATTTTACACAGAATCTATACCCACCAGAGTGATGTCTGGAGCTACGGGGTGACCGTTTGGGAGTTGATGACCTTTGGATCCAAGCCATATGACGGAATCCCTGCCAGCGAGATCTCCTCCATCCTGGAGAAAGGAGAACGCCTCCCTCAGCCACCCATATGTACCATCGATGTCTACATGATCATGGTCAAGTGCTGGATGATAGACGCAGATAGTCGCCCAAAGTTCCGTGAGTTGATCATCGAATTCTCCAAAATGGCCCGAGACCCCCAGCGCTACCTTGTCATTCAGGGGGATGAAAGAATGCATTTGCCAAGTCCTACAGACTCCAACTTCTACCGTGCCCTGATGGATGAAGAAGACATGGACGACGTGGTGGATGCCGACGAGTACCTCATCCCACAGCAGGGCTTCTTCAGCAGCCCCTCCACGTCACGGACTCCCCTCCTGAGCTCTCTGAGTGCAACCAGCAACAATTCCACCGTGGCTTGCATTGATAGAAATGGGCTGCAAAGCTGTCCCATCAAGGAAGACAGCTTCTTGCAGCGATACAGCTCAGACCCCACAGGCGCCTTGACTGAGGACAGCATAGACGACACCTTCCTCCCAGTGCCTGAATACATAAACCAGTCCGTTCCCAAAAGGCCCGCTGGCTCTGTGCAGAATCCTGTCTATCACAATCAGCCTCTGAACCCCGCGCCCAGCAGAGACCCACACTACCAGGACCCCCACAGCACTGCAGTGGGCAACCCCGAGTATCTCAACACTGTCCAGCCCACCTGTGTCAACAGCACATTCGACAGCCCTGCCCACTGGGCCCAGAAAGGCAGCCACCAAATTAGCCTGGACAACCCTGACTACCAGCAGGACTTCTTTCCCAAGGAAGCCAAGCCAAATGGCATCTTTAAGGGCTCCACAGCTGAAAATGCAGAATACCTAAGGGTCGCGCCACAAAGCAGTGAATTTATTGGAGCATGA(SEQ IDNO.9)。
根据RNAi原理，结合设计软件，在实验的基础上，设计合成三条EGFRsiRNA和一条阴性对照siRNA。进行BLAST比对检查一保证和其他基因没有同源性。
第一条：正义链：5’-GCAGAUCAUCAGAGGAAAU-3’(SEQ ID NO.1)，反义链：5’-AUUUCCUCUGAUGAUCUGC-3’(SEQ ID NO.2)；
第二条：正义链：5’-CCAAGGAAGCCAAGCCAAA-3’(SEQ ID NO.3)，反义链：5’-UUUGGCUUGGCUUCCUUGG-3’(SEQ ID NO.4)；
第三条：正义链：5’-GGAGAUAAGUGAUGGAGAU-3’(SEQ ID NO.5)，反义链：5’-AUCUCCAUCACUUAUCUCC-3’(SEQ ID NO.6)。
上述各EGFR siRNA序列均由英潍捷基(上海)贸易有限公司(厂址：北京东三环北路2号南银大厦1711，邮编：100027)进行化学合成：以NTP为原料，利用ABI3900核酸合成仪分别化学合成单链RNA，最后在退火缓冲液的条件下各单链RNA退火形成双链RNA。为提高siRNA在体内的稳定性，在各链化学合成前，利用化学反应将各链合成原料中的嘧啶核苷酸的核糖进行2’羟基的甲氧基替代修饰。
二、阴性对照siRNA的合成
正义链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO.7)，反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID NO.8)。
由英潍捷基(上海)贸易有限公司(厂址：北京东三环北路2号南银大厦1711，邮编：100027)进行化学合成：以NTP为原料，利用ABI3900核酸合成仪分别化学合成单链RNA，最后在退火缓冲液的条件下各单链RNA退火形成双链RNA。为提高siRNA在体内的稳定性，在各链化学合成前，利用化学反应将各链合成原料中的嘧啶核苷酸的核糖进行2’羟基的甲氧基替代修饰。
实施例2：实施例1中第一条EGFR siRNA在体外对NCI-H460细胞EGFR基因表达的影响
一、分组转染
将NCI-H460细胞均匀铺在6孔板种，分为3组：
空白对照组：含有10％(体积分数含量)灭活的胎牛血清的DMEM basic(1X)培养液。
EGFR siRNA正常实验组：含有10％(体积分数含量)灭活的胎牛血清的DMEM basic(1X)培养液；转染100pmol实施例1中第一条EGFR siRNA。
阴性对照组(Negative Control)：含有10％(体积分数含量)灭活的胎牛血清DMEM basic(1X)培养液；转染100pmol实施例1中的阴性对照siRNA。
三组细胞先常规培养24h，然后根据组别进行转染(按LipofectamineTM2000试剂说明书操作)，转染后继续培养6h后，根据组别更换相应的培养液，继续培养48h后进行实验；培养条件：置于37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养。
二、Western blotting检测EGFR蛋白的表达
移除干净6孔板中的培养液，用冷PBS洗涤2次，收集细胞后充分裂解，4℃、12000转离心15min，收集上部澄清裂解液后使用BCA蛋白测定试剂盒测定3组裂解液的蛋白浓度，按裂解液比Loading Buffer为4：1混匀，与100℃加热变性5min，按每个泳道30μg总蛋白量换算上样体积上样，行10％SDS-PAGE电泳，待蛋白充分分离后，转移至PVDF膜上，置于含5％脱脂奶粉TBST的封闭液中，室温封闭1h，取出膜用1X TBST溶液洗膜5次，每次5min，将裁剪好的膜分别置于EGFR一抗(1：5000稀释)和内参β-actin一抗(1：800稀释)4℃孵育过夜，然后用1X TBST洗膜5次，每次5min，分别与抗兔IgG二抗(1：3000稀释)、抗鼠IgG二抗(1：3000稀释)室温孵育2h，将膜与化学发光液孵育后进行显色，扫描图片。检测各组EGFR蛋白和内参β-actin蛋白所对应的条带A值，然后将AEGFR/Aβ-actin的比值进行统计学分析(Quantity One软件)。
结果如图1、图2。与阴性对照组比较，EGFR siRNA转染后细胞中EGFR基因表达显著下调(P<0.01)。
实施例3：实施例1中第一条EGFR siRNA在体外对NCI-H460细胞凋亡的影响
一、分组转染
将NCI-H460细胞均匀铺在6孔板中，分为3组。具体分组同实施例2的步骤一。
二、EGFR siRNA在体外对NCI-H460细胞凋亡的影响
消化各组细胞并收集，用冷PBS清洗2次后，在用新鲜冷PBS悬浮细胞，按1ml细胞悬浮液加入20μl AO-EB混合液(AO-EB试剂使用方法见说明书)，避光染色3-5分钟后，制片于荧光显微镜下观察拍照。
吖啶橙(AO)能透过胞膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，与双链DNA结合后发出绿色荧光，溴化乙锭(EB)仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入核DNA，发橘红色荧光。凋亡的细胞呈现为染色增强，荧光更为明亮，均匀一致的圆状或固缩状、团块状结构。非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征。二者很容易判别。在荧光显微镜下观察，可见四种细胞形态：活细胞(VN)，核染色质着绿色并呈正常结构；早期凋亡细胞(VA)，核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状；晚期凋亡细胞(NVA)，核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状；非凋亡的死亡细胞(NVN)，核染色质着橘红色并呈正常结构。结果如图3所示，空白对照组和阴性对照组细胞形态与正常实验组有明显差别，有显著性差异(P<0.05)。
上述实验结果说明在体外NCI-H460细胞中，EGFR siRNA可以促进细胞发生凋亡。
实施例4：实施例1中第二条EGFR siRNA在体外对NCI-H460细胞EGFR基因表达的影响
一、分组转染
将NCI-H460细胞均匀铺在6孔板种，分为3组：
空白对照组：含有10％(体积分数含量)灭活的胎牛血清的DMEM basic(1X)培养液。
EGFR siRNA正常实验组：含有10％(体积分数含量)灭活的胎牛血清的DMEM basic(1X)培养液；转染100pmol实施例1中第二条EGFR siRNA。
阴性对照组：含有10％(体积分数含量)灭活的胎牛血清DMEM basic(1X)培养液；转染100pmol实施例1中的阴性对照siRNA。
三组细胞先常规培养24h，然后根据组别进行转染(按LipofectamineTM2000试剂说明书操作)，转染后继续培养6h后，根据组别更换相应的培养液，继续培养48h后进行实验；培养条件：置于37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养。
二、Western blotting检测EGFR蛋白的表达
移除干净6孔板中的培养液，用冷PBS洗涤2次，收集细胞后充分裂解，4℃、12000转离心15min，收集上部澄清裂解液后使用BCA蛋白测定试剂盒测定3组裂解液的蛋白浓度，按裂解液比Loading Buffer为4：1混匀，与100℃加热变性5min，按每个泳道30μg总蛋白量换算上样体积上样，行10％SDS-PAGE电泳，待蛋白充分分离后，转移至PVDF膜上，置于含5％脱脂奶粉TBST的封闭液中，室温封闭1h，取出膜用1X TBST溶液洗膜5次，每次5min，将裁剪好的膜分别置于EGFR一抗(1：5000稀释)和内参β-actin一抗(1：800稀释)4℃孵育过夜，然后用1X TBST洗膜5次，每次5min，分别与抗兔IgG二抗(1：3000稀释)、抗鼠IgG二抗(1：3000稀释)室温孵育2h，将膜与化学发光液孵育后进行显色，使用红外成像系统进行拍照。检测各组EGFR蛋白和内参β-actin蛋白所对应的条带A值，然后将AEGFR/Aβ-actin的比值进行统计学分析(Quantity One软件)。
结果如图4、图5。与阴性对照组比较，EGFR siRNA转染后细胞中EGFR基因表达下调。
实施例5：实施例1中第二条EGFR siRNA在体外对NCI-H460细胞凋亡的影响
一、分组转染
将NCI-H460细胞均匀铺在6孔板中，分为3组。具体分组同实施例4的步骤一。
二、EGFR siRNA在体外对NCI-H460细胞凋亡的影响
消化各组细胞并收集，用冷PBS清洗2次后，在用新鲜冷PBS悬浮细胞，按1ml细胞悬浮液加入20μl AO-EB混合液(AO-EB试剂使用方法见说明书)，避光染色3～5分钟后，制片于荧光显微镜下观察拍照。
吖啶橙(AO)能透过胞膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，与双链DNA结合后发出绿色荧光，溴化乙锭(EB)仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入核DNA，发橘红色荧光。凋亡的细胞呈现为染色增强，荧光更为明亮，均匀一致的圆状或固缩状、团块状结构。非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征。二者很容易判别。在荧光显微镜下观察，可见四种细胞形态：活细胞(VN)，核染色质着绿色并呈正常结构；早期凋亡细胞(VA)，核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状；晚期凋亡细胞(NVA)，核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状；非凋亡的死亡细胞(NVN)，核染色质着橘红色并呈正常结构。结果如图6所示，空白对照组和阴性对照组细胞形态与正常实验组有明显差别。
上述实验结果说明在体外NCI-H460细胞中，EGFR siRNA可以促进细胞发生凋亡。
实施例6：实施例1中第三条EGFR siRNA在体外对NCI-H460细胞EGFR基因表达的影响
一、分组转染
将NCI-H460细胞均匀铺在6孔板种，分为3组：
空白对照组：含有10％(体积分数含量)灭活的胎牛血清的DMEM basic(1X)培养液。
EGFR siRNA正常实验组：含有10％(体积分数含量)灭活的胎牛血清的DMEM basic(1X)培养液；转染100pmol实施例1中第三条EGFR siRNA。
阴性对照组：含有10％(体积分数含量)灭活的胎牛血清DMEM basic(1X)培养液；转染100pmol实施例1中的阴性对照siRNA。
三组细胞先常规培养24h，然后根据组别进行转染(按LipofectamineTM2000试剂说明书操作)，转染后继续培养6h后，根据组别更换相应的培养液，继续培养48h后进行实验；培养条件：置于37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养。
二、Western blotting检测EGFR蛋白的表达
移除干净6孔板中的培养液，用冷PBS洗涤2次，收集细胞后充分裂解，4℃、12000转离心15min，收集上部澄清裂解液后使用BCA蛋白测定试剂盒测定3组裂解液的蛋白浓度，按裂解液比Loading Buffer为4：1混匀，与100℃加热变性5min，按每个泳道30μg总蛋白量换算上样体积上样，行10％SDS-PAGE电泳，待蛋白充分分离后，转移至PVDF膜上，置于含5％脱脂奶粉TBST的封闭液中，室温封闭1h，取出膜用1X TBST溶液洗膜5次，每次5min，将裁剪好的膜分别置于EGFR一抗(1：5000稀释)和内参β-actin一抗(1：800稀释)4℃孵育过夜，然后用1X TBST洗膜5次，每次5min，分别与抗兔IgG二抗(1：3000稀释)、抗鼠IgG二抗(1：3000稀释)室温孵育2h，将膜与化学发光液孵育后进行显色，使用红外成像系统进行拍照。检测各组EGFR蛋白和内参β-actin蛋白所对应的条带A值，然后将AEGFR/Aβ-actin的比值进行统计学分析(Quantity One软件)。
结果如图7、图8。与阴性对照组比较，EGFR siRNA转染后细胞中EGFR基因表达下调。
实施例7：实施例1中第三条EGFR siRNA在体外对NCI-H460细胞凋亡的影响
一、分组转染
将NCI-H460细胞均匀铺在6孔板中，分为3组。具体分组同实施例6的步骤一。
二、EGFR siRNA在体外对NCI-H460细胞凋亡的影响
消化各组细胞并收集，用冷PBS清洗2次后，在用新鲜冷PBS悬浮细胞，按1ml细胞悬浮液加入20μl AO-EB混合液(AO-EB试剂使用方法见说明书)，避光染色3～5分钟后，制片于荧光显微镜下观察拍照。
吖啶橙(AO)能透过胞膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，与双链DNA结合后发出绿色荧光，溴化乙锭(EB)仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入核DNA，发橘红色荧光。凋亡的细胞呈现为染色增强，荧光更为明亮，均匀一致的圆状或固缩状、团块状结构。非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征。二者很容易判别。在荧光显微镜下观察，可见四种细胞形态：活细胞(VN)，核染色质着绿色并呈正常结构；早期凋亡细胞(VA)，核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状；晚期凋亡细胞(NVA)，核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状；非凋亡的死亡细胞(NVN)，核染色质着橘红色并呈正常结构。结果如图9所示，空白对照组和阴性对照组细胞形态与正常实验组有明显差别。
上述实验结果说明在体外NCI-H460细胞中，EGFR siRNA可以促进细胞发生凋亡。

Claims (4)

1.抑制EGFR基因表达的siRNA，其特征在于：其核苷酸序列为以下双链RNA分子中的任意一种：
正义链：5’-GCAGAUCAUCAGAGGAAAU-3’，反义链：5’-AUUUCCUCUGAUGAUCUGC-3’；
正义链：5’-CCAAGGAAGCCAAGCCAAA-3’，反义链：5’-UUUGGCUUGGCUUCCUUGG-3’；
正义链：5’-GGAGAUAAGUGAUGGAGAU-3’，反义链：5’-AUCUCCAUCACUUAUCUCC-3’ 。
2.权利要求1所述抑制EGFR基因表达的siRNA在制备预防或治疗人类表皮生长因子受体相关的疾病的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的疾病为肺癌。
4.降低人非小细胞肺癌NCI-H460细胞生长增殖率的方法，其特征在于：将权利要求1所述siRNA导入目的细胞，使目的细胞的生长增殖速率下降。
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