CN101801418A

CN101801418A - 包括人类EGFR-siRNA的组合物及使用方法

Info

Publication number: CN101801418A
Application number: CN200880100909A
Authority: CN
Inventors: X·杨; F·Y·谢; 刘伊佳; 刘颖
Original assignee: Intradigm Corp
Current assignee: Silence Therapeutics PLC
Priority date: 2007-06-22
Filing date: 2008-06-20
Publication date: 2010-08-11
Also published as: EP2170404A4; CA2692155A1; WO2009002440A3; WO2009002440A2; EP2170404A2; US20110046067A1; JP2010530754A

Abstract

本发明提供抑制EGFR表达的核酸分子。还提供使用所述核酸分子的方法。

Description

包括人类EGFR-siRNA的组合物及使用方法

相关申请的交叉引用

本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求来自2007年6月22日提交的美国临时申请60/945,842、2007年10月10日提交的美国临时申请60/998,284、2008年4月14日提交的美国临时申请61/124,223和2008年6月11日提交的美国临时申请61/060,721的优先权。

技术领域

本发明为分子生物学和医学领域，并且涉及用于调节表皮生长因子(EGF)受体的表达的短干扰RNA(siRNA)分子。

背景技术

EGFR为170kDa跨膜糖蛋白，其已经显示在控制细胞增殖和分化中起重要作用。EGFR为受体ErbB家族的成员，其包括EGFR(ErbB-1)，HER2/c-neu(ErbB-2)，Her 3(ErbB-3)和Her 4(ErbB-4)。EGFR由细胞外、跨膜和细胞质结构域组成。配体与EGFR的细胞外结构域结合导致二聚化和酪氨酸激酶活性的激活，启动酶和生物事件的复杂级联反应(cascade)，引起细胞增殖和分化。

EGFR的过度表达已经与许多恶性肿瘤相关，包括肺、肾、胰腺、乳腺、头和颈、胃和结肠的恶性肿瘤。各种细胞已经显示产生各种形式的EGFR。A431人类表皮样癌细胞，例如，已经显示产生截短的EGFR。

EGFR在癌症中的作用已经通过最近FDA批准几种EGFR抑制剂来验证，所述几种EGFR抑制剂包括用于治疗转移性结肠、肺、胰腺、以及头和颈癌的中和抗体例如维克替比(Vectibix)和爱必妥(Erbitux)以及小分子TKi(small moleculeTKi)例如Tarceva^TM。

RNA干扰(RNAi)技术作为用于降低特定基因产物的表达的有效手段出现，并且可以因此被证明在调节EGFR表达的许多治疗性、诊断性和研究性应用中独特地有用。本发明提供使用RNAi技术调节这些蛋白质的表达的组合物和方法。

这样，在本领域存在对以下的需要：将用于调节EGFR的表达的组合物和方法用作用于治疗癌症和其它疾病的治疗方法。本发明提供该优点和其它优点。

发明内容

本发明的一个方面提供下调表皮生长因子(EGF)受体基因的表达的核酸分子，其中所述核酸分子包括靶向EGFR mRNA的核苷酸序列，其中所述核酸分子包括靶向SEQ ID NOs：1-10或21-121中所示的任何一种多核苷酸序列的核苷酸序列。在特定实施方式中，所述核酸为siRNA分子。在更特定的实施方式中，siRNA包括SEQ ID NOs：11-20和122-323中提供的任何一种单链RNA序列，或其双链RNA。在某些实施方式中，所述核酸分子经由RNA干扰(RNAi)下调EGFR基因的表达。

在另一实施方式中，本发明提供包括任何一种或多种所述siRNA分子的组合物，其中所述siRNA包括SEQ ID NOs：11-20和122-323中提供的任何一种单链RNA序列，或其双链RNA。在这点上，该组合物可以包括本发明的siRNA分子的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100种或更多。在特定实施方式中，所述siRNA包括靶向部分。

在各种实施方式中，本发明提供用于治疗或预防受试者中的癌症的方法，所述受试者患有EGFR表达性癌症和有或怀疑有患有所述癌症的风险，该方法包括向受试者施用组合物，所述组合物包括SEQ ID NOs：11-20和122-323中提供的任何一种单链RNA序列，或其双链RNA，由此治疗或预防癌症。在某些实施方式中，癌症选自以下：乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结直肠癌、脑癌、食管癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、子宫颈癌、头和颈癌、肾癌、子宫内膜癌、卵巢癌、脑膜瘤、黑素瘤、淋巴瘤和胶质母细胞瘤。

在另一实施方式中，本发明提供用于抑制EGFR的合成或表达的方法，包括使表达EGFR的细胞与一种或多种siRNA接触，其中所述siRNA包括SEQ ID NOs：11-20或122-323中所示的序列。

当参考以下具体描述时，本发明的这些和其它方面将变得明显。

附图说明

图1为描述hEGFR受某些siRNA分子体外抑制的图。

将人类EGFR-siRNA的沉默人类EGFR基因的活性在HT-29细胞中测试。将HT-29细胞使用电穿孔介导的转染方法用EGFR-siRNA转染，其中使用4或8ug siRNA每2×106细胞/200ul。在转染的HT-29细胞中的EGFR蛋白的浓度在转染后72小时使用hEGFR ELISA试剂盒(R&D Systems，Inc.)测定。hEGFR蛋白的浓度针对总细胞蛋白标准化(normalized)，并且hEGFR抑制百分比针对用不使用siRNA的模拟过程处理的细胞标准化(normalized)。所有5种hEGFR siRNA证明hEGFR产生的抑制。hEGFR-25-1和hEGFR-25-2为最有效的siRNA，在siRNA转染后72小时时hEGFR蛋白抑制超过70％。

图2为证明hEGFR以剂量依赖性方式受两种siRNA分子抑制的图。

将选择的hEGFR-siRNA、hEGFR-25-1和hEGFR-25-2以剂量依赖性方式就其抑制hEGFR表达的能力进行测试。HT-29细胞用范围在0.01-10ug siRNA每2×10⁶cells/200μl的EGFR-siRNA使用电穿孔介导的转染方法转染。在转染的HT-29细胞中的EGFR蛋白的浓度在转染后48小时时使用hEGFR ELISA试剂盒(R&D Systems，Inc.)测定。hEGFR蛋白的浓度针对总细胞蛋白标准化(normalized)，并且hEGFR抑制百分比针对用不使用siRNA的模拟过程处理的细胞标准化。两种hEGFR-25-1和hEGFR-25-2都证明hEGFR产生的剂量依赖性抑制。

图3为证明hEGFR-siRNA-PolyTran^TM NPX对A431肿瘤异种移植物(xenograft)的肿瘤抑制效应的折线图。

携带hEGFR-siRNA的PolyTran^TM(PT-NPX)的抗肿瘤功效在A431(表皮样癌)异种移植物模型中确定。在肿瘤细胞移植后第4天开始将承载所建立的A431肿瘤的小鼠每隔一天用静脉内给药携带hEGFR-siRNA的PolyTran NPX治疗6次。治疗对照包括不治疗(未治疗)和Erlotinib(Tarceva^TM)，将其100mg/kg每天口服给药6天。与未治疗对照相比，使用携带人类EGFR siRNA的PT-NPX的治疗显著地抑制A431肿瘤生长；并且抑制效应比Tarceva^TM治疗对照更显著。

图4为证明A431肿瘤生长受PT-EGFR-siRNA NPX抑制是hEGFR-siRNA特异性的，并且需要PT-siRNA NPX的配制的折线图。

携带hEGFR-siRNA或阴性对照-siRNA的PolyTran^TM纳米颗粒(PT-NPX)，以及PolyTran肽单独或hEGFR-siRNA单独，在A431(表皮样癌)异种移植物模型中测试。在肿瘤细胞移植后第5天开始将承载所建立的A431肿瘤的小鼠每隔一天用静脉内给药携带hEGFR-siRNA或阴性对照-siRNA的PolyTran NPX(2mg/kg)，或hEGFR-siRNA单独，或PolyTran肽单独治疗4次。治疗对照包括不治疗(未治疗)。与未治疗对照相比，仅使用携带人类EGFR siRNA的PT-NPX的治疗显著地抑制A431肿瘤生长。所有其它治疗组包括携带对照-siRNA的PT-NPX，hEGFR-siRNA单独，或PolyTran肽，不抑制A431肿瘤生长。

图5为证明hEGFR-siRNA-PolyTran^TM NPX对A549肿瘤异种移植物的肿瘤抑制效应的折线图。

携带hEGFR-siRNA的PolyTran^TM(PT-NPX)的抗肿瘤功效在A549(NSCLC)异种移植物模型中确定。在肿瘤细胞移植后第9天开始将承载所建立的A549肿瘤的小鼠每隔一天用静脉内给药携带hEGFR-siRNA的PolyTran NPX治疗6次。治疗对照包括不治疗(未治疗)和Erlotinib(Tarceva^TM)，将其100mg/kg每天口服给药6天。与未治疗对照相比，使用携带人类EGFR siRNA的PT-NPX的治疗显著地抑制A549肿瘤生长；并且抑制效应比Tarceva^TM治疗对照更显著。携带对照-siRNA的PT-NPX对A549肿瘤生长不具有抑制效应。

图6为显示PolyTran^TM的结构和组成的示意图。PolyTran^TM为合成的生物可降解的阳离子支链多肽。带正电的PolyTran^TM多肽用作带负电的siRNA的载体和浓缩器(condenser)。

图7为显示组氨酸-赖氨酸H3K4b多肽结构的图。组氨酸-赖氨酸H3K4b多肽用于配制PT-NPX。

图8为PolyTran-siRNA NPX的电子图像。当将PolyTran多肽与siRNA(针对hVEGF)混合时，具有约100nm直径的球形纳米颗粒(PT-siRNA NPX)在溶液中形成。

图9显示证明细胞吸收PT-siRNA NPX的荧光显微镜图像。小鼠内皮EA.hy926细胞用以5ug/mL的等效siRNA浓度包含Alexa488-标记的hVEGF siRNA(QIAGEN)的PT-NPX转染6小时。细胞内观察的荧光表明PT-siRNA NPX的内化。

图10显示证明PT-siRNA NPX在肿瘤中的组织分布的荧光显微镜图像。静脉内注射后PT-NPX的生物分布使用携带荧光标记的siRNA(Alexa-555标记的hVEGF siRNA，来自QIAGEN)的PT NPX调查。承载A431异种移植物的裸小鼠用PT-NPX静脉内注射。注射1小时后，除去肿瘤组织，并且制备冷冻组织切片。荧光标记的siRNA在肿瘤组织中发现，表示实现PT-NPX在肿瘤组织中的分布。在未治疗的肿瘤组织中未看到自发荧光背景。

图11A-C为证明hVEGF基因被VEGF siRNA沉默的折线图。人类VEGF-siRNA的靶基因沉默活性在人类前列腺癌PC-3细胞中测试。将该细胞使用LipoFectamine RNAiMax(Invitrogen)用siRNA转染。在培养基中VEGF的浓度在转染后24(Fig.11A)，48(Fig.11B)和72(Fig.11C)小时使用ELISA试剂盒(R&D Systems，Inc.)测定。所有测试的3种人类VEGF siRNA以剂量依赖性方式抑制VEGF的产生并且具有纳-和亚纳摩尔的潜力。

图12为证明hVEGF基因被PT-siRNA NPX沉默的图。人类前列腺癌细胞系PC-3(其表达VEGF)用携带hVEGF-siRNA或Control siRNA的PT-NPX在无血清培养基中处理4小时，然后补充血清(10％)。处理后72小时，收集细胞裂解物以使用ELISA试剂盒(R&D Systems，Inc.)测定VEGF。包含hVEGF siRNA的PT-NPX体外抑制hVEGF产生。

图13为显示PT-siRNA NPX对人类表皮样癌A431肿瘤体积的效应的折线图。将人类表皮样癌A431细胞在雌性裸小鼠中皮下地植入。当肿瘤体积达到80-100mm³时，静脉内注射具有等效的2mg/kg siRNA的PT-NPX。注射方案通过横轴下的箭头指示。与未治疗或GFP-siRNANPX治疗的对照相比，使用包含人类VEGF-siRNA或小鼠VEGFR2-siRNA的PT-NPX的治疗(正义链5′-ggaaggcccauugaguccaacuaca-3′(SEQID NO：327)和反义链：5′-uguaguuggacucaaugggccuucc-3′(SEQ IDNO：328))显著地抑制肿瘤生长。抗肿瘤功效与经由i.p.注射(i.p.injection)的5mg/kg阿瓦斯丁(Avastin)相当。在任何hVEGF-siRNA或mVEGFR2PT-NPX治疗的动物中无明显的体重损失或临床异常被观察到。

图14为显示通过使用PT-mVEGFR2-siRNA NPX的全身治疗，小鼠VEGFR2mRNA在A549肿瘤中的体内敲弱(knockdown)的柱状图。通过PT-siRNA NPX的体内靶基因敲弱在A549异种移植物模型中检查。当异种移植物肿瘤建立时，小鼠(n＝6)用携带mVEGFR2-siRNA(正义链：5′-ggaaggcccauugaguccaacuaca-3′(SEQ ID NO：327)和反义链：5′-uguaguuggacucaaugggccuucc-3′(SEQ ID NO：328))或对照-siRNA的PT-NPX以2mg/kg每天静脉内治疗3天。在最后注射后24小时，将肿瘤除去，分离来自肿瘤组织的总RNA，并将其进行相对定量实时PCR检验(relative quantitative real-time PCR assay)。使用PT-mVEGFR2-siRNA NPX的治疗导致mVEGFR2mRNA在A549异种移植物中的显著敲弱(在重复试验中30-90％之间)。

具体实施方式

本发明涉及用于调节EGFR的表达的核酸分子。在某些实施方式中，所述核酸为核糖核酸(RNA)。在某些实施方式中，所述RNA分子为单链或双链的。在这点上，本发明的核酸类分子，例如siRNA，抑制或下调EGFR的表达。

本发明涉及用于研究、诊断和治疗应答于对EGFR基因表达和/或活性的调节的性状、疾病和状况的化合物、组合物和方法。本发明还涉及与应答于基因的表达和/或活性的调节有关的性状、疾病和状况的化合物、组合物和方法，所述基因涉及EGFR基因表达途径或介导此类性状、疾病和状况的维持或发展的其它细胞过程。具体地，本发明涉及双链核酸分子，其包括能够针对EGFR基因表达介导RNA干扰(RNAi)的小核酸分子，例如短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微-RNA(miRNA)、和短发夹RNA(shRNA)分子，包括此类小核酸分子的鸡尾酒和此类小核酸分子的纳米颗粒制剂。本发明还涉及小核酸分子，例如siNA，siRNA和能够抑制内源性RNA分子的功能的其它分子，所述内源性RNA分子例如内源性微-RNA(miRNA)(例如，miRNA抑制剂)或内源性短干扰RNA(siRNA)，(例如，siRNA抑制剂)或其能够抑制RISC(例如，RISC抑制剂)的功能，以通过干扰此类内源性RNA或与此类内源性RNAs(例如，RISC)有关的蛋白质的调控功能调节EGFR基因表达，包括此类小核酸分子的鸡尾酒和此类小核酸分子的纳米颗粒制剂。此类小核酸分子例如用于在受试者或有机体中提供预防、抑制或降低以下的组合物：乳腺、肺、前列腺、结直肠、脑、食管、膀胱、胰腺、子宫颈、头和颈、和卵巢癌、黑素瘤、淋巴瘤和神经胶质瘤、多药抗性癌(multidrug resistantcancers)、和与EGFR基因表达或活性相关的任何其它癌症疾病和/或其它疾病状态、状况或性状。

提到″抑制″或″下调″是指EGFR基因的表达、或编码EGFR蛋白的mRNA水平、EGFR蛋白的水平或EGFR的活性降低到在不存在本发明的核酸分子时观察到的之下。在一种实施方式中，使用本发明核酸分子的抑制或下调低于在存在失活对照或截短分子(attenuatedmolecule)时观察到的水平，所述失活对照或减毒分子能够与相同的靶RNA结合，但不能够裂解或否则沉默该RNA。在另一实施方式中，使用本发明核酸分子的抑制或下调优选低于在例如具有错义序列(scrambled sequence)或错配的核酸的存在下观察到的水平。在另一实施方式中，使用本发明的核酸分子的EGFR的抑制或下调在所述核酸分子的存在下比其不存在强烈。

提到″调节″意味着EGFR基因的表达、或编码EGFR蛋白的mRNA水平、EGFR蛋白的水平或EGFR的活性上调或下调，以使所述表达、水平或活性比在不存在本发明的核酸分子时观察到的高或低。

提到″双链RNA″或″dsRNA″是指与预定的基因序列匹配的双链RNA，其能够激活降解所述基因的相应信使RNA转录物的细胞酶。这些dsRNA被称为短干扰RNA(siRNA)，并且可以用于抑制基因表达(参见例如Elbashir等，2001，Nature，411，494-498；and Bass，2001，Nature，411，428-429)。本文所用的术语″双链RNA″或″dsRNA″还指能够RNA干扰″RNAi″的双链RNA分子，包括短干扰RNA″siRNA″(参见例如Bass，2001，Nature，411，428-429；Elbashir等，2001，Nature，411，494-498；and Kreutzer等，国际PCT公开号WO00/44895；Zernicka-Goetz等，国际PCT公开号WO 01/36646；Fire，国际PCT公开号WO 99/32619；Plaetinck等，国际PCT公开号WO00/01846；Mello and Fire，国际PCT公开号WO 01/29058；Deschamps-Depaillette，国际PCT公开号WO 99/07409；and Li等，国际PCT公开号WO 00/44914)。dsRNA可以为25核苷酸的。dsRNA可以为平末端或包括单链悬突(overhangs)。

提到″基因″是指编码mRNA的核酸，例如核酸序列包括但不限于编码多肽的结构基因。

提到″靶向...的核酸″是指本文所述的核酸，其与包括靶基因的基因相匹配、互补或结合或特异性杂交，并且由此调节所述包括靶基因的基因的表达，或编码EGFR蛋白的mRNA水平、EGFR蛋白的水平或EGFR的活性。

″互补性″是指核酸与另一RNA序列通过传统的Watson-Crick或其它非传统型形成氢键的能力。关于本发明的核酸分子，核酸分子与其靶或互补序列的结合自由能对于允许所述核酸进行例如酶促核酸裂解、反义或三螺旋抑制的相关功能是充分的。确定核酸分子的结合自由能在本领域是已知的(参见，例如，Turner等.，1987，CSH Symp.Quant.Biol.LII pp.123-133；Frier等，1986，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 83：9373-9377；Turner等，1987，J.Am.Chem.Soc.109：3783-3785)。互补百分比表示在与第二核酸序列可以形成氢键(例如Watson-Crick碱基配对)的核酸分子中的相邻残基的百分比(例如，10个中的5，6，7，8，9，10个，即50％，60％，70％，80％，90％，和100％互补)。″完全互补″意味着核酸序列的所有相邻残基将与第二核酸序列中的相同数目的相邻残基氢键键合。

提到″RNA″是指包括至少一种核糖核苷酸残基的分子。提到″核糖核苷酸″或″2′-OH″是指在β-D-呋喃核糖(β-D-ribo-furanose)部分的2′位置处具有羟基的核苷酸。

提到″RNA干扰″或″RNAi″是指在细胞中抑制或下调基因表达的生物过程，其在本领域是已知的，并且其受短干扰核酸分子介导(参见例如Zamore and Haley，2005，Science，309，1519-1524；Vaughnand Martienssen，2005，Science，309，1525-1526；Zamore等，2000，Cell，101，25-33；Bass，2001，Nature，411，428-429；Elbashir等，2001，Nature，411，494-498；and Kreutzer等，国际PCT公开号WO 00/44895；Zemicka-Goetz等，国际PCT公开号WO01/36646；Fire，国际PCT公开号WO 99/32619；Plaetinck等，国际PCT公开号WO 00/01846；Mello and Fire，国际PCT公开号WO01/29058；Deschamps-Depaillette，国际PCT公开号WO 99/07409；and Li等，国际PCT公开号WO 00/44914；Allshire，2002，Science，297，1818-1819；Volpe等，2002，Science，297，1833-1837；Jenuwein，2002，Science，297，2215-2218；and Hall等，2002，Science，297，2232-2237；Hutvagner and Zamore，2002，Science，297，2056-60；McManus等，2002，RNA，8，842-850；Reinhart等，2002，Gene & Dev.，16，1616-1626；and Reinhart & Bartel，2002，Science，297，1831)。此外，如本文所用，术语RNAi是指与用于描述序列特异性RNA干扰的其它术语，例如转录后基因沉默，翻译抑制、转录抑制或表观遗传学(epigenetics)同义。例如，本发明的siRNA分子可用于在转录后水平或转录开始之前都表观遗传学上沉默基因。在非限制性实例中，通过本发明的siRNA分子表观遗传学上调节基因表达可以由siRNA介导的染色质结构的修饰或甲基化模式引起以改变基因表达(参见，例如，Verdel等，2004，Science，303，672-676；Pal-Bhadra等，2004，Science，303，669-672；Allshire，2002，Science，297，1818-1819；Volpe等，2002，Science，297，1833-1837；Jenuwein，2002，Science，297，2215-2218；and Hall等，2002，Science，297，2232-2237)。在另一非限制性实例中，通过本发明的siRNA分子调节基因表达可以由siRNA介导的RNA(编码性或非编码性RNA)的裂解经由RISC引起，或作为选择，由本领域已知的翻译抑制引起。在另一实施方式中，通过本发明的siRNA分子调节基因表达可以由转录抑制引起(参见例如Janowski等，2005，NatureChemical Biology，1，216-222)

在某些实施方式中，所述核酸抑制子包括与任何已知的EGFR序列互补的序列，包括已经改变表达和/或活性的其变体，特别是与疾病有关的变体。EGFR的变体包括与野生型EGFR序列具有70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高序列同一性的序列，其中此类EGFR变体可以证明改变的(增加的或降低的)酪氨酸激酶活性。本领域技术人员应该理解，EGFR序列可以在任何各种公共序列数据库中获得，包括GENBANK或SWISSPROT。在一种实施方式中，本发明的核酸抑制子(例如，siRNA)包括与SEQ ID NOs：1-10和21-121中提供的特异性EGFR靶序列互补的序列(参见表1和3)。此类siRNA分子的实例还在实施例中显示并且在SEQ ID NOs：11-20和122-323中提供(参见表2和4)。

提到″载体″是指用于递送所期望核酸的任何基于核酸-和/或病毒的技术。

提到″受试者″是指接受本发明核酸分子的有机体。″受试者″还指本发明的核酸分子可以给予其的有机体。在某些实施方式中，受试者为哺乳动物或哺乳动物细胞。在进一步的实施方式中，受试者为人类或人类细胞。

核酸可以使用如以下所述的本领域已知的策略合成：Caruthers等，1992，Methods in Enzymology 211，3 19，Thompson等，国际PCT公开号WO 99/54459，Wincott等，1995，nucleic acids Res.23，2677-2684，Wincott等，1997，Methods Mol.Bio.，74，59，Brennan等，1998，Biotechnol Bioeng.，61，33-45，and Brennan，美国专利号6,001,311。核酸的合成利用通常的核酸保护和偶联基团，例如5′-末端的二甲氧基三苯甲基，和3′-末端的亚磷酰胺。在非限制性实例中，小规模合成在394 Applied Biosystems，Inc.合成仪上于0.2μM规模策略上进行，其中对于2′-O-甲基化核苷酸偶联步骤2.5min，对于2′-脱氧核苷酸偶联步骤45秒。作为选择，在0.2μM规模的合成可以在96-板合成仪，例如由Protogene(Palo Alto，Calif.)生产的仪器上进行，其中使用对循环的最小改变。33-倍过量的(60μL的0.11M＝6.6μM)2′-O-甲基和亚磷酰胺与105-倍过量的S-乙基四唑(60μL的0.25M＝15μM)可以在相对于聚合物-结合的5′-羟基的2′-O-甲基残基的各偶联循环中使用。22-倍过量的(40μL的0.11M＝4.4μM)脱氧亚磷酰胺与70-倍过量的S-乙基四唑(40μL的0.25M＝10μM)可以在相对于聚合物-结合的5′-羟基的脱氧残基的各偶联循环中使用。通过三苯甲基级分的量热定量确定的在394 AppliedBiosystems，Inc.合成仪上的平均偶联产率，典型地为97.599％。用于394 Applied Biosystems，Inc.合成仪的其它寡核苷酸合成试剂包括；脱三苯甲基化溶液为在二氯甲烷中的3％TCA(ABI)；加帽使用在THF中的16％N-甲基咪唑(ABI)和在THF中的10％乙酸酐/10％2，6-二甲基吡啶(ABI)；和氧化溶液为在THF中的16.9mM I₂，49mM吡啶，9％水。Burdick & Jackson合成级乙腈直接从试剂瓶使用。S-乙基四唑(0.25M在乙腈中)从获自American International Chemical，Inc.的固体制备。作为选择，对于硫代磷酸酯键的引入，使用Beaucage试剂(3H-1，2-苯并二硫醇-3-酮1，1-二氧化物，0.05M，在乙腈中)。

提到″核苷酸″是指与磷酸化的糖N-糖苷键连接的杂环含氮碱基。本领域认为核苷酸包括天然碱基(标准的)，和本领域已知的修饰的碱基。此类碱基通常位于核苷酸糖部分的1’位置。核苷酸通常包括碱基、糖和磷酸酯基团。核苷酸可以未修饰或在糖、磷酸酯和/或碱基部分修饰，(还可以相互替换地称为核苷酸类似物、修饰的核苷酸、非天然核苷酸、非标准核苷酸以及其它，参见例如，Usman andMcSwiggen，上文；Eckstein等.，国际PCT公开号WO 92/07065；Usman等，国际PCT公开号WO 93/15187；Uhlman & Peyman，上文)。如由Limbach等.，1994，Nucleic Acids Res.22，2183总结本领域存在几种修饰的核酸碱基。可以引入核酸的示例性的化学修饰和其它天然核酸碱基包括，例如，次黄嘌呤核苷、嘌呤、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2，4，6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶核苷、萘基、苯胺基(aminophenyl)、5-烷基胞嘧啶核苷(例如，5-甲基胞嘧啶核苷)、5-烷基尿嘧啶核苷(例如，胸腺嘧啶核糖核苷)、5-卤代尿嘧啶核苷(例如，5-溴代尿嘧啶核苷)或6-氮杂嘧啶(azapyrimidine)或6-烷基嘧啶(例如6-甲基尿嘧啶核苷)、丙炔、Q核苷酸(quesosine)、2-硫代尿嘧啶核苷、4-硫代尿嘧啶核苷、怀丁苷(wybutosine)、wybutoxosine、4-acetyltidine、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶核苷、5′-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶核苷、5-羧基甲基氨基甲基硫代尿嘧啶核苷、β-D-半乳糖基Q核苷酸、1-甲基腺苷、1-甲基次黄嘌呤核苷、2，2-二甲基鸟苷、3-甲基胞嘧啶核苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶核苷、5-甲基氨基甲基尿嘧啶核苷、5-甲基羰基甲基尿嘧啶核苷、5-甲基氧代尿嘧啶核苷、5-甲基-2-硫代尿嘧啶核苷、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺苷、β-D-甘露糖基Q核苷酸、尿嘧啶核苷-5-氧乙酸、2-硫代胞嘧啶核苷、苏氨酸衍生物以及其它(Burgin等.，1996，Biochemistry，35，14090；Uhlman & Peyman，上文)。在这方面提到″修饰的碱基″是指在1′位置不同于腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶的核苷酸碱基，或其等价物；此类碱基可以在任何位置使用，例如在酶促核酸分子的催化中心内和/或在核酸分子的底物-结合区域中。

提到″核苷″是指与糖N-糖苷键连接的杂环含氮碱基。本领域认为核苷包括天然碱基(标准的)，和本领域已知的修饰的碱基。此类碱基通常位于核苷酸糖部分的1’位置。核苷通常包括碱基和糖基团。核苷可以未修饰或在糖、和/或碱基部分修饰，(还可以相互替换地称为核苷类似物、修饰的核苷、非天然核苷、非标准核苷以及其它，参见例如，Usman and McSwiggen，上文；Eckstein等.，国际PCT公开号WO 92/07065；Usman等，国际PCT公开号WO 93/15187；Uhlman& Peyman，上文)。如由Limbach等.，1994，Nucleic Acids Res.22，2183总结本领域存在几种修饰的核酸碱基。可以引入核酸的示例性的化学修饰和其它天然核酸碱基包括，例如，次黄嘌呤核苷、嘌呤、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2，4，6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶核苷、萘基、苯胺基(aminophenyl)、5-烷基胞嘧啶核苷(例如，5-甲基胞嘧啶核苷)、5-烷基尿嘧啶核苷(例如，胸腺嘧啶核糖核苷)、5-卤代尿嘧啶核苷(例如，5-溴代尿嘧啶核苷)或6-氮杂嘧啶(azapyrimidine)或6-烷基嘧啶(例如6-甲基尿嘧啶核苷)、丙炔、Q核苷酸(quesosine)、2-硫代尿嘧啶核苷、4-硫代尿嘧啶核苷、怀丁苷(wybutosine)、wybutoxosine、4-acetylcytidine、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶核苷、5′-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶核苷、5-羧基甲基氨基甲基硫代尿嘧啶核苷、β-D-半乳糖基Q核苷酸、1-甲基腺苷、1-甲基次黄嘌呤核苷、2，2-二甲基鸟苷、3-甲基胞嘧啶核苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶核苷、5-甲基氨基甲基尿嘧啶核苷、5-甲基羰基甲基尿嘧啶核苷、5-甲基氧代尿嘧啶核苷、5-甲基-2-硫代尿嘧啶核苷、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺苷、β-D-甘露糖基Q核苷酸、尿嘧啶核苷-5-氧乙酸、2-硫代胞嘧啶核苷、苏氨酸衍生物以及其它(Burgin等.，1996，Biochemistry，35，14090；Uhlman & Peyman，上文)。在这方面提到″修饰的碱基″是指在1′位置不同于腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶的核苷碱基，或其等价物；此类碱基可以在任何位置使用，例如在酶促核酸分子的催化中心内和/或在核酸分子的底物-结合区域中。

在某些实施方式中，本发明的核酸分子可以从真核启动子在细胞内表达(例如，Izant and Weintraub，1985，Science，229，345；McGarry and Lindquist，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 83，399；Scanlon等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，10591-5；Kashani-Sabet等，1992，Antisense Res.Dev.，2，3-15；Dropulic等，1992，J.Virol.，66，1432-41；Weerasinghe等，1991，J.Virol.，65，5531-4；Ojwang等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，10802-6；Chen等，1992，Nucleic Acids Res.，20，4581-9；Sarver等，1990 Science，247，1222-1225；Thompson等，1995，Nucleic Acids Res.，23，2259；Good等.，1997，Gene Therapy，4，45)。本领域技术人员将承认任何核酸可以在真核细胞中从合适DNA/RNA载体表达。此类核酸的活性可以通过它们从通过酶促核酸的初级转录物的释放增加(Draper等，PCT WO 93/23569，and Sullivan等，PCT WO 94/02595；Ohkawa等，1992，Nucleic Acids Symp.Ser.，27，15-16；Taira等，1991，Nucleic Acids Res.，19，5125-30；Ventura等，1993，Nucleic Acids Res.，21，3249-55；Chowrira等，1994，J.Biol.Chem.，269，25856)。

在本发明另一方面，本发明的核酸分子，例如RNA分子，从插入DNA或RNA载体的转录单元表达(参见例如Couture等，1996，TIG.，12，510)。重组载体优选为DNA质粒或病毒载体。RNA表达病毒载体可以基于，但不限于以下构建：腺病毒相关病毒、逆转录病毒、腺病毒或α病毒。优选地，能够表达核酸分子的重组载体如上所述递送，并且在靶细胞中持续。作为选择，可以使用病毒载体，其提供核酸分子的瞬时表达。此类载体可以按需要重复地给药。一旦表达，所述核酸分子与靶mRNA结合。表达核酸分子的载体的递送可以是全身性的，例如静脉内或肌肉内给药，通过给药给从患者或受试者移出的靶细胞，然后再引入患者或受试者，或通过允许引入所期望靶细胞的任何其它手段(对于综述参见Couture等，1996，TIG.，12，510)。

在一方面本发明特征在于公开了包括编码本发明至少一种核酸分子的核酸序列的表达载体。所述编码本发明核酸分子的核酸序列以允许该核酸分子表达的方式可操作地连接。

在另一方面本发明特征在于表达载体，其包括：a)转录起始区域(例如，真核pol I，II或III起始区域)；b)转录终止区域(例如，真核pol I，II或III终止区域)；c)编码本发明至少一种核酸催化剂的核酸序列，并且其中所述序列与所述起始区域和所述终止区域以允许所述核酸分子表达和/或递送的方式可操作地连接。所述载体在编码本发明的核酸催化剂的序列的5′端和3′端可以任选地包括可操作地连接的蛋白质的开放阅读框(ORF)，和/或内含子(间插序列)。

所述核酸分子序列的转录从真核RNA聚合酶I(pol I)，RNA聚合酶II(pol II)，或RNA聚合酶III(pol III)驱动。来自pol II或pol III启动子的转录物以高水平在所有细胞中表达，在给定细胞类型的给定pol II启动子的水平依赖于相邻存在的基因调控序列(增强子、沉默子等)的性质。也可以使用原核RNA聚合酶启动子，条件是原核RNA聚合酶酶在合适的细胞中表达(Elroy-Stein and Moss，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，6743-7；Gao and Huang 1993，Nucleic Acids Res.，21，2867-72；Lieber等，1993，MethodsEnzymol.，217，47-66；Zhou等，1990，Mol.Cell.Biol.，10，4529-37)。几个研究者已经证明核酸分子，例如从此类启动子表达的核酶可以在哺乳动物细胞中起作用(例如，Kashani-Sabet等，1992，Antisense Res.Dev.，2，3-15；Ojwang等.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，10802-6；Chen等，1992，nucleic acids Res.，20，4581-9；Yu等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，6340-4；L′Huillier等，1992，EMBO J.，11，4411-8；Lisziewicz等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，90，8000-4；Thompson等，1995，Nucleic Acids Res.，23，2259；Sullenger & Cech，1993，Science，262，1566)。更具体地，转录单元例如衍生自编码U6小核酸(snRNA)、转移RNA(tRNA)和腺病毒VA RNA的基因的那些可用于产生高浓度的所期望的RNA分子例如在细胞中的核酶(Thompson等，上文；Couture and Stinchcomb，1996，上文；Noonberg等，1994 nucleicacid Res.，22，2830；Noonberg等，美国专利号5,624,803；Good等，1997，Gene Ther.，4，45；Beigelman等，国际PCT公开号WO96/18736。上述核酶转录单元可以引入各种载体以用于导入哺乳动物细胞，包括但不限于，质粒DNA载体、病毒DNA载体(例如腺病毒或腺相关病毒载体)、或病毒RNA载体(例如逆转录或α病毒载体)(对于综述参见上述的Couture and Stinchcomb，1996)。

在另一方面，本发明特征在于表达载体，其包括以允许该核酸分子的表达的方式编码本发明至少一种核酸分子的核酸序列。在一种实施方式中所述表达载体包括：a)转录起始区域；b)转录终止区域；c)编码至少一种所述核酸分子的核酸序列，并且其中所述序列与所述起始区域和所述终止区域以允许所述核酸分子表达和/或递送的方式可操作地连接。

在另一实施方式中，所述表达载体包括：a)转录起始区域；b)转录终止区域；c)开放阅读框；d)编码至少一种所述核酸分子的核酸序列，其中所述序列与所述开放阅读框的3′-末端可操作地连接，并且其中所述序列与所述起始区域、所述开放阅读框和所述终止区域以允许所述核酸分子表达和/或递送的方式可操作地连接。在另一实施方式中，所述表达载体包括：a)转录起始区域；b)转录终止区域；c)内含子；d)编码至少一种所述核酸分子的核酸序列，并且其中所述序列与所述起始区域、所述内含子和所述终止区域以允许所述核酸分子表达和/或递送的方式可操作地连接。

在另一实施方式中，所述表达载体包括：a)转录起始区域；b)转录终止区域；c)内含子；d)开放阅读框；e)编码至少一种所述核酸分子的核酸序列，其中所述序列与所述开放阅读框的3′-末端可操作地连接，并且其中所述序列与所述起始区域、所述内含子、所述开放阅读框和所述终止区域以允许所述核酸分子表达和/或递送的方式可操作地连接。

核酸分子的使用和给药方法

用于递送核酸分子的方法描述于Akhtar等，1992，Trends CellBio.，2，139；并且Delivery Strategies for AntisenseOligonucleotide Therapeutics，ed.Akhtar；Sullivan等，PCT WO94/02595，进一步描述了用于递送酶促RNA分子的一般方法。这些策略可以有利地用于递送基本上任何核酸分子。核酸分子可以通过各种本领域技术人员已知的方法给药给细胞，包括但不限于，在脂质体中的包封、通过离子电渗疗法、或通过引入合适的其它载体，例如水凝胶、环糊精、生物可降解纳米胶囊和生物粘附性微球。作为选择，所述核酸/载体组合通过直接注射或通过使用输注泵局部地递送。例如本发明的核酸和组合物可以直接给药至肿瘤。递送的其它途径包括但不限于口服(片剂或丸剂形式)和/或鞘内递送(Gold，1997，Neuroscience，76，1153-1158)。其它方法包括使用各种输送和载体系统，例如通过使用缀合物和生物可降解的聚合物。药物递送策略上的综述包括CNS delivery，see Ho等，1999，Curr.Opin.Mol.Ther，1，336-343 and Jain，Drug Delivery Systems：Technologies andCommercial Opportunities，Decision Resources，1998 andGroothuis等，1997，J.NeuroVirol.，3，387-400。核酸递送和给药的更具体描述在Sullivan等，上文，Draper等，PCT WO93/23569，Beigelman等，PCT WO99/05094，和Klimuk等，PCTWO99/04819中提供。

本发明的分子可用作药物试剂。药物试剂预防、抑制受试者中的疾病的出现或治疗(某种程度上减轻症状，优选所有症状)受试者中的疾病。

本发明带负电的多核苷酸可以通过任何标准手段，使用或不使用稳定剂、缓冲剂等给药和引入受试者，以形成药物组合物。当需要使用脂质体递送机制时，可以遵循用于形成脂质体的标准策略。本发明的组合物还可以配制成和用作用于口服给药的片剂、胶囊或酏剂；用于直肠给药的栓剂；无菌溶液；用于注射给药的悬浮液；和本领域已知的其它组合物。

本发明还包括所述化合物的药学上可接受的制剂。这些制剂包括上述化合物的盐，例如酸加成盐，例如盐酸、溴酸、乙酸和苯磺酸的盐。

药物组合物或制剂是指以适合给药至细胞或受试者，优选人类的形式(例如全身给药)的组合物或制剂。合适的形式，部分依赖于使用或进入的途径，例如口服，透皮或通过注射。此类形式不应该防止组合物或制剂到达靶细胞。例如，注射入血流的药物组合物应该是可溶的。其它因素是本领域已知的，并且包括例如毒性和防止组合物或制剂发挥其作用的形式上的考虑。

提到″全身性给药″是指药物在血流中的体内全身性吸收或累积，然后分布遍及全身。导致全身性吸收的给药途径不限制地包括：静脉内、皮下、腹膜内、吸入、口服、肺内和肌肉内。这些给药途径的每一将所期望的带负电的核酸暴露至可及的有病组织。药物进入循环的比例已经显示为分子量或大小的函数。包括本发明的化合物的脂质体或其它药物载体的使用可以潜在地将药物定位例如在特定组织类型，例如网状内皮系统(RES)的组织。可以促进药物与细胞(例如淋巴细胞和巨噬细胞)表面的结合的脂质体制剂也是有用的。该途径可以通过利用巨噬细胞和淋巴细胞免疫识别异常细胞(例如癌细胞)的特异性来提供药物至靶细胞的增强递送。

提到药学上可接受的制剂是指，允许本发明的核酸分子在最适合其所期望活性的身体位置中的有效分布的组合物或制剂。适合与本发明的核酸分子一起配制的试剂的非限制性实例包括：PEG缀合的核酸、磷脂缀合的核酸、包含亲脂性部分的核酸、硫代磷酸酯、P-糖蛋白抑制剂(例如普流尼克(Pluronic)P85)，其可以增强药物进入各种组织；生物可降解聚合物，例如用于植入后缓释递送的聚(DL-丙交酯-共乙交酯(DL-lactide-coglycolide))(Emerich，DF等，1999，CellTransplant，8，47-58)Alkermes，Inc.Cambridge，Mass.；载药纳米微粒(loaded nanoparticles)，例如由聚丁基氰基丙烯酸酯组成的那些，其可以递送药物穿过血脑屏障并且可以改变神经吸收机制(Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，23，941-949，1999)。

本发明的特征还在于包括表面-修饰的脂质体的组合物的用途，所述脂质体包含聚(乙二醇)脂质(PEG-修饰，支链化和未支链化或其组合，或长-循环脂质体或隐形(stealth)脂质体)。本发明的核酸分子还包括各种分子量的共价连接的PEG分子。这些制剂提供用于增加药物在靶组织中的累积的方法。这类药物载体抵抗通过单核吞噬细胞系统(MPS或RES)的调理作用和消除，由此对于包封的药物允许更长的血液循环次数和增强的暴露(Lasic等.Chem.Rev.1995，95，2601-2627；Ishiwata等，Chem.Pharm.Bull.1995，43，1005-1011)。此类脂质体已经显示可能通过在血管化的靶组织中的外渗和捕获而在肿瘤中的选择性累积(Lasic等，Science 1995，267，1275-1276；Oku等，1995，Biochim.Biophys.Acta，1238，86-90)。与已知在MPS组织中累积的常规阳离子脂质体相比，长-循环脂质体增强DNA和RNA的药代动力学和药效学(Liu等，J.Biol.Chem.1995，42，24864-24870；Choi等，国际PCT公开号WO96/10391；Ansell等，国际PCT公开号WO 96/10390；Holland等，国际PCT公开号WO 96/10392)。与阳离子脂质体相比，基于它们避免在代谢性侵袭MPS组织例如肝和脾中的累积的能力，长-循环脂质体还可能在更大的程度上保护药物免受核酸酶降解。

在进一步的实施方式中，本发明包括按照在US 2003/0166601中所述制备的核酸组合物，例如siRNA组合物。在这点上，在一种实施方式中，本发明提供本文所述的siRNA的组合物，其包括1)核心复合物，包括核酸(例如，siRNA)和聚乙烯亚胺；以及2)外壳部分，包括NHS-PEG-VS和靶向部分。

在本发明的某些实施方式中，利用如上所述的靶向部分以将所期望的siRNA靶向目的细胞。

这样，在某些实施方式中，包括本发明的siRNA分子的组合物包括至少一种靶向部分，例如细胞表面受体或其它细胞表面标记的配体，所述细胞表面受体或其它细胞表面标记允许使包括siRNA分子的组合物(″载体″)与靶目的组织高度特异性的相互作用。更具体地，在一种实施方式中，所述载体优选将包括未屏蔽的配体或屏蔽的配体。依赖于要靶向的细胞类型，所述载体可以包括两种或更多靶向部分。多种(两种或更多)靶向部分的使用可以提供在细胞靶向中另外的选择性，并且还可以有助于载体与靶细胞的结合的高度亲和性和/或亲和力。当超过一种靶向部分存在于载体时，靶向部分的相对摩尔比可以变化以提供优化的靶向效率。用于以此方式优化细胞结合和选择性的方法在本领域是已知的。本领域技术人员将承认用于测定细胞选择性和亲和性以及结合效率的检验在本领域是已知的，并且可以用于优化靶向配体的性质和数量。

合适的配体包括，但不限于：RGD和针对肿瘤细胞或内皮细胞表面上的受体的单克隆抗体。

靶向部分的另一实例为唾液酸化-Lewis^x，其中所述组合物旨在治疗炎症区域。其它肽配体可以使用例如以下方法鉴定：噬菌体展示(F.Bartoli等.，Isolation of peptide ligands fortissue-specific cell surface receptors，in Vector TargetingStrategies for Therapeutic Gene Delivery(Abstracts form ColdSpring Harbor Laboratory 1999 meeting)，1999，p4)和微生物展示(Georgiou等.，Ultra-High Affinity Antibodies from LibrariesDisplayed on the Surface of Microorganisms and Screened by FACS，in Vector Targeting Strategies for Therapeutic Gene Delivery(Abstracts form Cold Spring Harbor Laboratory 1999 meeting)，1999，p3.)。以此方式鉴定的配体适合用于本发明。

已经开发方法以形式新的肽序列，其引起对靶组织和细胞的强烈和选择性结合，例如″DNA改组″(W.P.C.Stremmer，DirectedEvolution of Enzymes and Pathways by DNA Shuffling，in VectorTargeting Strategies for Therapeutic Gene Delivery(Abstractsform Cold Spring Harbor Laboratory 1999 meeting)，1999，p.5.)，并且这些新序列肽对于本发明为合适的配体。配体的其它化学形式适合于本发明，例如以许多形式存在并且为细胞常用的配体(Kraling等，Am.J.Path.，1997，150，1307)的天然碳水化合物，和其中一些可以为天然配体的类似物(例如D-氨基酸和拟肽)的新化学物质，以及通过药物化学技术例如组合化学鉴定出的其它物质(P.D.Kassner等.，Ligand Identification via Expression(LIVEθ)：Directselectionof Targeting Ligands from Combinatorial Libraries，in VectorTargeting Strategies for Therapeutic Gene Delivery(Abstractsform Cold Spring Harbor Laboratory 1999 meeting)，1999，P8.)。

在进一步的实施方式中，本发明包括按照美国专利7,163,695，美国专利号7,070,807和美国专利6,692,911制备的用于递送的核酸组合物。在这点上，在一种实施方式中，本发明在组合物中提供本发明的核酸，所述组合物包括如美国专利7,163,695，7,070,807和6,692,911所述的组氨酸-赖氨酸共聚物(也称为PolyTran^TM)，其要么单独要么与PEG(例如，支链化或未支链化的PEG或其混合物)组合或与PEG和靶向部分组合。

本发明还包括用于贮存或给药而制备的组合物，其在药学上可接受的载体或稀释剂中包括药学上有效量的所期望的化合物。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂在药学领域是已知的，并且例如描述于Remington：The Science and Practice of Pharmacy，20th Edition.Baltimore，MD：Lippincott Williams & Wilkins，2000。例如，可以提供防腐剂、稳定剂、染料和调味剂。这些包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸的酯。此外，可以使用抗氧化剂和悬浮剂。

药学上有效剂量为需要预防抑制疾病状态的出现，或治疗疾病状态(某种程度上减轻症状，优选所有症状)的剂量。药学上有效剂量依赖于疾病的类型，所用的组合物，给药途径，被治疗的哺乳动物种类、所考虑的特定哺乳动物的身体特性、并行医疗(concurrentmedication)、和本领域技术人员将承认的其它因素。通常，依赖于带负电的聚合物的效力，给药0.1mg/kg至100mg/kg体重/天的量的活性成分。

本发明的核酸分子及其制剂可以以包含传统的非毒性药学上可接受的载体(carrier)、佐剂和媒介物(vehicle)的剂量单位剂型形式口服地、局部地、胃肠外地、通过吸入或喷射或直肠地给药。本文所用的术语胃肠外包括经皮、皮下、血管内(例如静脉内)、肌肉内或鞘内注射或灌输技术等。此外，提供药物制剂，其包括本发明的核酸分子和药学上可接受的载体。一种或多种本发明的核酸分子可以与一种或多种非毒性药学上可接受的载体和/或稀释剂和/或佐剂，以及如果需要其它的活性成分一起存在。包含本发明的核酸分子的药物组合物可以为适合于口服使用的形式，例如，片剂、糖锭(troches)、锭剂(lozenges)、水性或油性悬浮液、分散性粉末或颗粒剂、乳剂、硬或软胶囊、或糖浆或酏剂。

本发明的核酸组合物可以与其它核酸组合物组合使用，所述其它核酸组合物靶向靶基因(例如，EGFR)的相同或不同区域，或其靶向其它目的基因。本发明的核酸组合物还可以与任何各种治疗方法组合使用，例如化疗、放疗或小分子方案。

旨在口服使用的组合物可以根据用于制造药物组合物领域已知的任何方法制备，并且此类组合物可以包含一种或多种此类甜味剂、调味剂、着色剂或防腐剂以提供药学上优美可口的制剂。片剂包含与适合于片剂制造的非毒性药学上可接受的赋形剂混合的活性成分。这些赋形剂可以例如为惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂或崩解剂，例如玉米淀粉、或海藻酸；结合剂，例如淀粉、凝胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是无包衣的，或者它们可以通过已知技术包衣。在某些情况下此类包衣可以通过已知技术制备来延迟在胃肠道中的崩解和吸收，并且由此提供长时间的缓释作用。例如，可以使用时间延迟材料例如甘油硬脂酸单脂或甘油硬脂酸二脂。

用于口服使用的制剂还可以为硬凝胶胶囊形式，其中所述活性成分与惰性固体稀释剂，例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土，或作为软凝胶胶囊存在，其中所述活性成分与水或油介质，例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。

水性悬浮液包含与适合制造水性悬浮液的赋形剂混合的活性材料。此类赋形剂为悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基-甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯基吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶；分散剂或湿润剂可以为天然发生的磷脂，例如卵磷脂、或环氧烷烃与脂肪酸的缩聚产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯、或环氧乙烷与长链脂族醇的缩聚产物，例如heptadecaethyleneoxycetanol，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩聚产物例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐(hexitol anhydride)的偏酯的缩聚产物，例如聚乙烯失水山梨醇单油酸酯。水性悬浮液还可以包含一种或多种防腐剂，例如乙基，或正丙基对羟基苯甲酸酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂，和一种或多种甜味剂，例如蔗糖或糖精。

油性悬浮液可以通过将活性成分悬浮在植物油，例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油中，或悬浮在矿物油例如液体石蜡中来配制。油性悬浮液可以包含增稠剂，例如蜂蜡、固体石蜡或鲸蜡醇。可以添加甜味剂和调味剂来提供可口的口服制剂。这些组合物可以通过添加抗氧化剂例如抗坏血酸来保存。

适合于通过添加水来制备水性悬浮液的分散剂粉末和颗粒剂提供与分散剂或湿润剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂一起混合的活性成分。合适的分散剂或湿润剂或悬浮剂通过上述已经例举。另外的赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂，也可以存在。

本发明的药物组合物还可以为水包油乳剂的形式。油相可以为植物油或矿物油或这些的混合物。合适的乳化剂可以为天然发生的胶，例如阿拉伯树胶或黄蓍胶、天然发生的磷脂，例如大豆、卵磷脂和衍生自脂肪酸和己糖醇、酸酐的酯或偏酯，例如失水山梨醇单油酸酯，以及所述偏酯与环氧乙烷的缩聚产物，例如聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯。乳剂还可以包含甜味剂和调味剂。

糖浆和酏剂可以与甜味剂，例如甘油、丙二醇、山梨醇、葡萄糖或蔗糖一起配制。此类制剂还可以包含缓和剂、防腐剂和调味剂和着色剂。药物组合物可以为无菌注射水性或油性悬浮液的形式。该悬浮液可以根据已知领域使用上述已经提到的那些合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂来配制。无菌注射制剂还可以为在非毒性肠胃处可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如作为在1，3-丁二醇中的溶液。在可以使用的可接受的媒介物和溶剂中之一为水，林格氏溶液(Ringer′s solution)和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发性油传统地用作溶剂或悬浮介质。为此目的，任何温和的不挥发性油可以使用，包括合成的单甘油酯或二甘油酯。此外，脂肪酸例如油酸在注射制剂中发挥作用。

本发明的核酸分子可以以栓剂的形式给药，例如以用于药物的直肠给药的栓剂形式。这些组合物可以通过将药物与合适的非刺激性赋形剂混合来制备，其在常温下是固态的，但是在直肠稳定下是液态，并且因此溶解在直肠中以释放药物。此类材料包括可可油和聚乙二醇。

本发明的核酸分子可以以无菌介质的形式胃肠外给药。依赖于所用的媒介物和浓度，所述药物可以悬浮或溶解于媒介物中。有利的是，佐剂例如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂可以溶解于媒介物中。

约0.01mg至约140mg每千克体重每天量级的剂量水平可用于治疗本文所述的疾病状况(约0.5mg至约7g每患者或受试者每天)。可以与载体材料组合以产生单剂型的活性成分的量依赖于要治疗的宿主或特定的给药模式而变化。剂量单位形式通常包含约1mg至约500mg的活性成分。

应该理解对于特定患者或受试者特定剂量水平依赖于各种因素，包括所用具体化合物的活性、年龄、体重、整体健康、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄率、药物组合和经受治疗的特定疾病的严重性。

为了施用给非人类动物，所述组合物还可以添加至动物饲料或饮用水。可以方便地配制动物饲料和饮用水组合物，以使动物随着其饮食摄入治疗上合适量的组合物。还可以方便地将所述组合物呈现为预混合料以用于添加至饲料或饮用水。

本发明的核酸分子还可以与其它治疗化合物组合施用给受试者来增加总体治疗效果。治疗适应症的多种化合物的使用可以增加有益效果同时降低副作用的存在。

将本发明的基于核酸的抑制剂直接添加，或可以与其它阳离子脂类复合，在脂质体内包封，或否则递送至靶细胞或组织。核酸或核酸复合物可以局部地离体(ex vivo)或体内通过注射或输液泵，使其引入或不引入生物聚合物地施用给相关组织。

本发明的核酸分子可用于组合物，所述组合物包括靶向在EGFR基因内的不同靶序列或其它基因内的靶序列的多种核酸分子(siRNAs)。

本发明的核酸分子，单独地，或与其它药物组合或协同，可用于治疗与EGFR的改变的表达和/或活性相关的疾病或状况。这样，本文所述的小核酸分子可用于例如提供组合物以预防、抑制或降低乳腺、肺、前列腺、结直肠、脑、食管、膀胱、胰腺、子宫颈、头和颈以及卵巢癌、黑素瘤、淋巴瘤、神经胶质瘤和多药抗性癌、和在受试者或有机体中的与EGFR基因表达或活性相关的任何其它癌症疾病和/或其它疾病状态、状况或性状。

本发明的核酸分子，单独地，或与其它药物组合或协同，可用于在怀疑有风险发展此类疾病或状况的个体中预防与EGFR的改变的表达和/或活性相关的疾病或状况。例如，为了治疗或预防与EGFR的表达水平相关的疾病或状况，单独地或与一种或多种药物组合在适合治疗的条件下，患有所述疾病或状况，或怀疑有风险发展此类疾病或状况的受试者或其它合适的细胞，可以被治疗，这对本领域技术人员是已知的。这样，本发明提供用于治疗或预防对EGFR表达的调节应答的疾病或状况的方法，包括施用至需要其的受试者有效量的包括一种或多种本发明核酸分子(例如SEQ ID NOs：11-20和122-323所示的那些)的组合物。在一种实施方式中，本发明提供用于治疗或预防与EGFR的表达相关的疾病的方法，包括施用给需要其的受试者有效量的一种或多种本发明核酸分子(例如SEQ ID NOs：11-20和122-323所示的那些)，以使在受试者中EGFR的表达下调，由此治疗或预防与EGFR的表达相关的疾病。在这点上，本发明的组合物可用于治疗或预防以下疾病的方法：乳腺、肺、前列腺、结直肠、脑、食管、膀胱、胰腺、子宫颈、头和颈、脑膜瘤、肾、子宫内膜以及卵巢癌、黑素瘤、淋巴瘤、胶质母细胞瘤和多药抗性癌、以及应答于EGFR表达的调节的任何其它癌症疾病或其它状态。

在进一步的实施方式中，本发明的核酸分子，例如siRNA、反义或核酶，可以与其它已知的治疗组合使用以治疗本文所述的状况或疾病，例如所述分子可以与一种或多种已知的治疗或诊断试剂组合使用以治疗乳腺、肺、前列腺、结直肠、脑、食管、膀胱、胰腺、子宫颈、头和颈、脑膜瘤、肾、子宫内膜、以及卵巢癌、黑素瘤、淋巴瘤、胶质母细胞瘤和多药抗性癌、以及应答于EGFR表达的调节的任何其它癌症疾病或其它状态。在另一实施方式中，本发明的核酸分子可用于治疗肺癌、肾癌、胰腺癌、乳腺癌、头和颈癌、胃癌或结肠癌。

在某些实施方式中，可以与本发明的siRNA分子协同使用以治疗本文所述癌症的治疗试剂可以包括因子例如，化疗、放疗；免疫抑制试剂，例如环孢菌素、咪唑硫嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯(mycophenolate)和FK506，抗体，或其它免疫清除试剂例如CAMPATH、抗-CD3抗体或其它抗体治疗剂、细胞毒素(cytoxin)、氟达拉宾、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、细胞因子和放射。这些药物抑制钙依赖性钙调神经磷酸酶(phosphatase calcineurin)(环孢霉素和FK506)或抑制p70S6激酶，其对于生长因子诱导的信号传导是重要的(雷帕霉素)(Liu等，Cell 66：807-815，1991；Henderson等，Immun.73：316-321，1991；Bierer等.，Curr.Opin.Immun.5：763-773，1993)。在进一步的实施方式中，将本发明的RNA分子使用化疗剂例如氟达拉宾、体外反射治疗(external-beam radiation therapy)(XRT)、环磷酰胺或抗体例如OKT3或CAMPATH与骨髓移植、T细胞清除试剂协同(例如，之前、同时或之后)施用给患者。在另一实施方式中，本发明的细胞组合物在B-细胞清除治疗例如与CD20反应的试剂，例如Rituxan之后给药。

在进一步的实施方式中，本发明的RNA分子可以根据美国专利公开2005/0186586，2005/0181382和/或2006/0134787通过将一个或多个错配引入siRNA双链体(通过修饰siRNA的正义链的序列)来修饰，以例如降低所述分子的5′反义末端的稳定性，以优选引导合适的链进入RISC复合物或降低脱靶效应。另外，本发明的RNA分子可以根据US2005/0037988(通过在siRNA的反义链和其互补靶mRNA之间引入不稳定碱基对(wobble base pair)(G/U))来修饰，以例如别增加RISC周转(RISC turnover)

用于鉴定患有，或怀疑有风险患有与本文所述的EGFR的表达有关的疾病或障碍的受试者的组合物和方法在本领域是已知的。

实施例

实施例1：在A431肿瘤异种移植物模型中全身递送与PolyTran^TM一起配制的hEGFR-siRNA的抗肿瘤功效

图3.hEGFR-siRNA-PolyTran^TMNPX对A431肿瘤异种移植物的肿瘤抑制效应

携带hEGFR-siRNA的PolyTran^TM(PT-NPX)(图6)的抗肿瘤功效在A431异种移植物模型中确定。人类表皮样癌A431细胞(5×10⁶细胞每小鼠)皮下地植入雌性裸小鼠。当肿瘤大小为约80-100mm³时，将承载所建立的肿瘤的小鼠从肿瘤细胞植入后第4天开始每隔一天使用静脉内给药携带hEGFR-siRNA(2mg/kg，hEGFR-25-1和hEGFR-25-2的1∶1混合物)的PolyTran NPX 6次来治疗。通过将PolyTran肽与siRNA以3∶1的比(w/w)混合来制备PolyTran-siRNA NPX，并且NPX的颗粒大小为约100nm。治疗对照包括未治疗(不治疗)和Erlotinib(Tarceva^TM，FDA批准的EGFR抑制剂)，其每天100mg/kg口服地给药6天。肿瘤大小在给药PT-siRNA NPX前每隔一天测定。

与未治疗的对照相比，使用携带人类EGFR siRNA的PT-NPX以2mg/kg治疗显著地抑制A431肿瘤生长；并且抑制功效比Tarceva^TM治疗的对照相比更显著。

实施例2：全身递送的PT-siRNA NPX的抗肿瘤功效为hEGFR-siRNA特异性的并且需要PT-NPX的配制

图4.A431肿瘤生长的受PT-EGFR-siRNA NPX的抑制为hEGFR-siRNA特异性的并且需要PT-siRNA NPX的配制

为了确认在样品1中的抗肿瘤功效为hEGFR-siRNA特异性的并且需要siRNA与PT-NPX一起配制，携带hEGFR-siRNA或阴性对照-siRNA的PolyTran^TM(PT-NPX)，以及PolyTran肽单独或hEGFR-siRNA单独，在A431异种移植物模型中测试。人类表皮样癌A431细胞(5×10⁶细胞每小鼠)皮下地植入雌性裸小鼠。当肿瘤大小为约80-100mm³时，将承载所建立的肿瘤的小鼠从肿瘤细胞植入后第5天开始每隔一天使用静脉内给药携带hEGFR-siRNA(2mg/kg，hEGFR-25-1和hEGFR-25-2的1∶1混合物)或阴性对照-siRNA(2mg/kg)的PolyTranNPX，或hEGFR-siRNA单独(2mg/kg，hEGFR-25-1和hEGFR-25-2的1∶1混合物)，或PolyTran肽单独(6mg/kg肽)4次来治疗。通过将PolyTran肽与siRNA以3∶1的比(w/w)混合来制备PolyTran-siRNA NPX，并且NPX的颗粒大小为约100nm。治疗对照包括未治疗(不治疗)。肿瘤大小在给药测试物品前每隔一天测定。

与未治疗的对照相比，仅使用的携带人类EGFR siRNA的PT-NPX以2mg/kg治疗显著地抑制A431肿瘤生长。所有其它治疗组包括携带对照-siRNA的PT-NPX、hEGFR-siRNA单独、或PolyTran肽，不抑制A431肿瘤生长。

实施例3：在A549肿瘤异种移植物模型中全身递送与PolyTran^TM一起配制的hEGFR-siRNA的抗肿瘤功效

图5.hEGFR-siRNA-PolyTran^TM NPX对A 549肿瘤异种移植物的肿瘤抑制效应

除了A431模型之外，携带hEGFR-siRNA的PolyTran^TM(PT-NPX)的抗肿瘤功效在A 549异种移植物模型中确定。将人类非-小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞(5×10⁶细胞每小鼠)皮下地植入雌性裸小鼠。当肿瘤大小为约80-100mm³时，将承载所建立的肿瘤的小鼠从肿瘤细胞植入后第9天开始每隔一天使用静脉内给药携带hEGFR-siRNA(2mg/kg，hEGFR-25-1和hEGFR-25-2的1∶1混合物)的PolyTran NPX或阴性对照-siRNA(2mg/kg)6次来治疗。通过将PolyTran肽与siRNA以3∶1的比(w/w)混合来制备PolyTran-siRNA NPX，并且NPX的颗粒大小为约100nm。治疗对照包括未治疗(不治疗)和Erlotinib(Tarceva^TM，FDA批准的EGFR抑制剂)，其每天以100mg/kg口服地给药6天。肿瘤大小在给药PT-siRNA NPX前每隔一天测定。

与未治疗的对照相比，使用携带人类EGFR siRNA的PT-NPX以2mg/kg治疗显著地抑制A549肿瘤生长；并且抑制功效比Tarceva^TM治疗的对照更显著。携带对照-siRNA的PT-NPX不具有对A549肿瘤生长的抑制效应。

实施例4：siRNA分子抑制人类EGFR表达

人类EGFR 25-核苷酸siRNA分子使用公共可获得的人类EGFR基因(NM_005228)序列设计。表1显示hEGFR-siRNA候选物的靶序列。

表1：hEGFR-siRNA候选物的靶DNA序列

候选物siRNA分子使用标准技术合成。siRNA候选物示于表2.

表2：hEGFR siRNA分子

ID NO：	名称	siRNA序列(正义链/反义链)	SEQIDNO：
ID NO：	名称	siRNA序列(正义链/反义链)	SEQIDNO：	07-25-001	hEGFR-25-1	5’-r(CACAGUGGAGCGAAUUCCUUUGGAA)-3’3’--(GUGUCACCUCGCUUAAGGAAACCUU)r-5’	1112
07-25-002	hEGFR-25-2	5’-r(CGCAAAGUGUGUAACGGAAUAGGUA)-3’3’--(GCGUUUCACACAUUGCCUUAUCCAU)r-5’	1314	07-25-001	hEGFR-25-1		1112
07-25-002	hEGFR-25-2		1314	07-25-003	hEGFR-25-3	5’-r(GGAUCCCAGAAGGUGAGAAAGUUAA)-3’3’--(CCUAGGGUCUUCCACUCUUUCAAUU)r-5’	1516

07-25-004	hEGFR-25-4	5’-r(CGCAGCAUGUCAAGAUCACAGAUUU)-3’3’--(GCGUCGUACAGUUCUAGUGUCUAAA)r-5’	1718
07-25-004	hEGFR-25-4		1718	07-25-00	hEGFR-25-5	5’-r(CCAAGUCCUACAGACUCCAACUUCU)-3’3’--(GGUUCAGGAUGUCUGAGGUUGAAGA)r-5’	1920

将上述候选物就hEGFR基因的敲弱活性在体外筛选。HT-29细胞使用电穿孔使用siRNA候选物(表2)转染，并且hEGFR蛋白表达在转染后72小时使用商业上可获得的ELISA试剂盒检验(参见图1)。

两种siRNA候选物，hEGFR-25-1和hEGFR-25-2，进一步在剂量滴度试验中就活性测试。如图2所示，这两种hEGFR siRNA候选物以剂量依赖性方式抑制hEGFR表达。

总之，该试验通过许多siRNA候选物显示EGFR表达的成功抑制。这些siRNA候选物可用于治疗疾病。

实施例5：用于抑制人类EGFR表达的siRNA候选物分子

人类EGFR 25-聚siRNA分子使用测试算法和使用公共可获得的人类EGFR基因(NM_005228)序列设计。表3显示hEGFR-siRNA候选物的靶序列。

表3：hEGFR-siRNA候选物的靶DNA序列

hEGFR候选物siRNA分子示于以下表4，并且在SEQ ID NOs：122-323中所示。

表4：hEGFR候选物siRNA分子

在该实施例中所述的候选物siRNA分子可用于抑制hEGFR的表达和用于各种治疗设置，例如用于治疗受试者或有机体中的心血管障碍例如主动脉瓣疾病以及癌症，包括但不限于，乳腺、肺、前列腺、结直肠、脑、食管、膀胱、胰腺、子宫颈、头和颈、脑膜瘤、肾、子宫内膜、以及卵巢癌、黑素瘤、淋巴瘤、胶质母细胞瘤和多药抗性癌(multidrug resistant cancers)、以及任何其它癌症疾病、和/或与hEGFR基因表达或活性相关的其它疾病状态、状况或性状。

在本说明书引用的和/或申请数据页中列出的所有上述美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物将其全文引入以作参考。

从上述将意识到，尽管本发明的具体实施方式本文已经描述以旨在举例说明，可以进行各种改进而不背离本发明的精神和范围。因此，本发明除了所附权利要求之外不受限制。

序列表

<110>Yang，Xiaodong

Xie，Frank Y.

Liu，Yijia

Liu，Ying

<120>包括人类EGFR-siRNA的组合物及使用方法

<130>INTM/043 PCT

<141>2008-06-20

<150>US 61/060,721

<151>2008-06-11

<150>US 61/124,223

<151>2008-04-14

<150>US 60/998,284

<151>2007-10-10

<150>US 60/945,842

<151>2007-06-22

<160>326

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

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<212>DNA

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<212>DNA

<213>智人

<400>35

cccgtaatta tgtggtgaca gatca 25

<210>36

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>36

ccgtaattat gtggtgacag atcac 25

<210>37

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>37

cgtccgcaag tgtaagaagt gcgaa 25

<210>38

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>38

caagtgtaag aagtgcgaag ggcct 25

<210>39

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>39

ccttgccgca aagtgtgtaa cggaa 25

<210>40

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>40

ccgcaaagtg tgtaacggaa taggt 25

<210>41

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>41

cgcaaagtgt gtaacggaat aggta 25

<21042

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>42

gcaaagtgtg taacggaata ggtat 25

<210>43

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>43

caaagtgtgt aacggaatag gtatt 25

<210>44

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>44

cactctccat aaatgctacg aatat 25

<210>45

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>45

cctctggatc cacaggaact ggata 25

<210>46

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>46

tggatccaca ggaactggat attct 25

<210>47

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>47

tccatgcctt tgagaaccta gaaat 25

<210>48

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>48

caggaccaag caacatggtc agttt 25

<210>49

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>49

tctcttgcag tcgtcagcct gaaca 25

<210>50

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>50

catccttggg attacgctcc ctcaa 25

<210>51

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>51

ccctcaagga gataagtgat ggaga 25

<210>52

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>52

cctcaaggag ataagtgatg gagat 25

<210>53

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>53

tcaaggagat aagtgatgga gatgt 25

<210>54

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>54

aggagataag tgatggagat gtgat 25

<210>55

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>55

ggagataagt gatggagatg tgata 25

<210>56

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>56

gagataagtg atggagatgt gataa 25

<210>57

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>57

ccaagggagt ttgtggagaa ctctg 25

<210>58

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>58

gagtttgtgg agaactctga gtgca 25

<210>59

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>59

cagacaactg tatccagtgt gccca 25

<210>60

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>60

tgtatccagt gtgcccacta cattg 25

<210>61

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>61

catccaaact gcacctacgg atgca 25

<210>62

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>62

gcacggtgta taagggactc tggat 25

<210>63

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>63

ccgtcgctat caaggaatta agaga 25

<210>64

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>64

cgtcgctatc aaggaattaa gagaa 25

<210>65

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>65

cgctatcaag gaattaagag aagca 25

<210>66

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>66

caaggaatta agagaagcaa catct 25

<210>67

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>67

gaaatcctcg atgaagccta cgtga 25

<210>68

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>68

ccgcagcatg tcaagatcac agatt 25

<210>69

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>69

cgcagcatgt caagatcaca gattt 25

<210>70

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>70

catgcagaag gaggcaaagt gccta 25

<210>71

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>71

cagaaggagg caaagtgcct atcaa 25

<210>72

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>72

aagtgcctat caagtggatg gcatt 25

<210>73

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>73

gcctatcaag tggatggcat tggaa 25

<210>74

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>74

cctatcaagt ggatggcatt ggaat 25

<210>75

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>75

caagtggatg gcattggaat caatt 25

<210>76

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>76

cagccaccca tatgtaccat cgatg 25

<210>77

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>77

cacccatatg taccatcgat gtcta 25

<210>78

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>78

tgtaccatcg atgtctacat gatca 25

<210>79

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>79

tagacgcaga tagtcgccca aagtt 25

<210>80

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>80

ccaagtccta cagactccaa cttct 25

<210>81

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>81

caagtcctac agactccaac ttcta 25

<210>82

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>82

actccaactt ctaccgtgcc ctgat 25

<210>83

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>83

tctctgagtg caaccagcaa caatt 25

<210>84

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>84

caattccacc gtggcttgcattgat 25

<210>85

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>85

ccaccgtggc ttgcattgat agaaa 25

<210>86

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>86

caccgtggct tgcattgata gaaat 25

<210>87

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>87

tgcattgata gaaatgggct gcaaa 25

<210>88

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>88

gcattgatag aaatgggctg caaag 25

<210>89

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>89

cagcttcttg cagcgataca gctca 25

<210>90

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>90

ccagtgcctg aatacataaa ccagt 25

<210>91

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>91

ccacctgtgt caacagcaca ttcga 25

<210>92

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>92

gcccagaaag gcagccacca aatta 25

<210>93

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>93

cccagaaagg cagccaccaa attag 25

<210>94

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>94

ggaagccaag ccaaatggca tcttt 25

<210>95

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>95

gaagccaagc caaatggcat cttta 25

<210>96

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>96

aagccaagcc aaatggcatc tttaa 25

<210>97

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>97

tggcatcttt aagggctcca cagct 25

<210>98

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>98

catctttaag ggctccacag ctgaa 25

<210>99

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>99

ccacggagga tagtatgagc cctaa 25

<210>100

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>100

cacggaggat agtatgagcc ctaaa 25

<210>101

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>101

tacagaaacg catccagcaa gaata 25

<210>102

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>102

tgatggacca gtggtttcca gtcat 25

<210>103

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>103

cagtggtttc cagtcatgag cgtta 25

<210>104

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>104

cagcaagaga ggatgacaca tcaaa 25

<210>105

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>105

ccagcccaca ttggattcat cagca 25

<210>106

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>106

cagcccacat tggattcatc agcat 25

<210>107

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>107

gcccacattg gattcatcag cattt 25

<210>108

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>108

ccacagctga gaatgtggaa tacct 25

<210>109

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>109

cacagctgag aatgtggaat accta 25

<210>110

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>110

tctcctaatt tgaggctcag atgaa 25

<210>111

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>111

gaggctcaga tgaaatgcat caggt 25

<210>112

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>112

caggtgcgaa tgacagtagc attat 25

<210>113

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>113

gcgaatgaca gtagcattat gagta 25

<210>114

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>114

cagtagcatt atgagtagtg tggaa 25

<210>115

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>115

gcattatgag tagtgtggaa ttcag 25

<210>116

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>116

agtagtgtgg aattcaggta gtaaa 25

<210>117

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>117

tgtgccctgt aacctgactg gttaa 25

<210>118

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>118

cctgactggt taacagcagt ccttt 25

<210>119

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>119

gactggttaa cagcagtcct ttgta 25

<210>120

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>120

cagcagtcct ttgtaaacag tgttt 25

<210>121

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>121

cagcctacag ttatgttcag tcaca 25

<210>122

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>122

ugccaaggca cgaguaacaa gcuca 25

<210>123

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>123

ugagcuuguu acucgugccu uggca 25

<210>124

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>124

gcacgaguaa caagcucacg caguu 25

<210>125

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>125

aacugcguga gcuuguuacu cgugc 25

<210>126

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>126

uggaaauuac cuaugugcag aggaa 25

<210>127

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>127

uuccucugca cauagguaau uucca 25

<210>128

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>128

ggaaauuacc uaugugcaga ggaau 25

<210>129

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>129

auuccucugc acauagguaa uuucc 25

<210>130

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>130

gaaauuaccu augugcagag gaauu 25

<210>131

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>131

aauuccucug cacauaggua auuuc 25

<210>132

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>132

uaccuaugug cagaggaauu augau 25

<210>133

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>133

aucauaauuc cucugcacau aggua 25

<210>134

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>134

ccuaugugca gaggaauuau gaucu 25

<210>135

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>135

agaucauaau uccucugcac auagg 25

<210>136

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>136

ugcagaggaa uuaugaucuu uccuu 25

<210>137

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>137

aaggaaagau cauaauuccu cugca 25

<210>138

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>138

cagaggaauu augaucuuuc cuucu 25

<210>139

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>139

agaaggaaag aucauaauuc cucug 25

<210>140

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>140

uccuaugccu uagcagucuu aucua 25

<210>141

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>141

uagauaagac ugcuaaggca uagga 25

<210>142

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>142

ccuaugccuu agcagucuua ucuaa 25

<210>143

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>143

uuagauaaga cugcuaaggc auagg 25

<210>144

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>144

ccuuagcagu cuuaucuaac uauga 25

<210>145

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>145

ucauaguuag auaagacugc uaagg 25

<210>146

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>146

gggacauagu cagcagugac uuucu 25

<210>147

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>147

agaaagucac ugcugacuau guccc 25

<210>148

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>148

uagucagcag ugacuuucuc agcaa 25

<210>149

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>149

uugcugagaa agucacugcu gacua 25

<210>150

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>150

cccguaauua uguggugaca gauca 25

<210>151

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>151

ugaucuguca ccacauaauu acggg 25

<210>152

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>152

ccguaauuau guggugacag aucac 25

<210>153

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>153

gugaucuguc accacauaau uacgg 25

<210>154

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>154

cguccgcaag uguaagaagu gcgaa 25

<210>155

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>155

uucgcacuuc uuacacuugc ggacg 25

<210>156

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>156

caaguguaag aagugcgaag ggccu 25

<210>157

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>157

aggcccuucg cacuucuuac acuug 25

<210>158

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>158

ccuugccgca aaguguguaa cggaa 25

<210>159

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>159

uuccguuaca cacuuugcgg caagg 25

<210>160

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>160

ccgcaaagug uguaacggaa uaggu 25

<210>161

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>161

accuauuccg uuacacacuu ugcgg 25

<210>162

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>162

cgcaaagugu guaacggaau aggua 25

<210>163

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>163

uaccuauucc guuacacacu uugcg 25

<210>164

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>164

gcaaagugug uaacggaaua gguau 25

<210>165

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>165

auaccuauuc cguuacacac uuugc 25

<210>166

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>166

caaagugugu aacggaauag guauu 25

<210>167

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>167

aauaccuauu ccguuacaca cuuug 25

<210>168

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>168

cacucuccau aaaugcuacg aauau 25

<210>169

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>169

auauucguag cauuuaugga gagug 25

<210>170

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>170

ccucuggauc cacaggaacu ggaua 25

<210>171

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>171

uauccaguuc cuguggaucc agagg 25

<210>172

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>172

uggauccaca ggaacuggau auucu 25

<210>173

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>173

agaauaucca guuccugugg aucca 25

<210>174

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>174

uccaugccuu ugagaaccua gaaau 25

<210>175

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>175

auuucuaggu ucucaaaggc augga 25

<210>176

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>176

caggaccaag caacaugguc aguuu 25

<210>177

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>177

aaacugacca uguugcuugg uccug 25

<210>178

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>178

ucucuugcag ucgucagccu gaaca 25

<210>179

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>179

uguucaggcu gacgacugca agaga 25

<210>180

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>180

cauccuuggg auuacgcucc cucaa 25

<210>181

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>181

uugagggagc guaaucccaa ggaug 25

<210>182

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>182

cccucaagga gauaagugau ggaga 25

<210>183

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>183

ucuccaucac uuaucuccuu gaggg 25

<210>184

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>184

ccucaaggag auaagugaug gagau 25

<210>185

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>185

aucuccauca cuuaucuccu ugagg 25

<210>186

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>186

ucaaggagau aagugaugga gaugu 25

<210>187

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>187

acaucuccau cacuuaucuc cuuga 25

<210>188

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>188

aggagauaag ugauggagau gugau 25

<210>189

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>189

aucacaucuc caucacuuau cuccu 25

<210>190

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>190

ggagauaagu gauggagaug ugaua 25

<210>191

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>191

uaucacaucu ccaucacuua ucucc 25

<210>192

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>192

gagauaagug auggagaugu gauaa 25

<210>193

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>193

uuaucacauc uccaucacuu aucuc 25

<210>194

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>194

ccaagggagu uuguggagaa cucug 25

<210>195

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>195

cagaguucuc cacaaacucc cuugg 25

<210>196

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>196

gaguuugugg agaacucuga gugca 25

<210>197

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>197

ugcacucaga guucuccaca aacuc 25

<210>198

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>198

cagacaacug uauccagugu gccca 25

<210>199

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>199

ugggcacacu ggauacaguu gucug 25

<210>200

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>200

uguauccagu gugcccacua cauug 25

<210>201

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>201

caauguagug ggcacacugg auaca 25

<210>202

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>202

cauccaaacu gcaccuacgg augca 25

<210>203

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>203

ugcauccgua ggugcaguuu ggaug 25

<210>204

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列 Sequence

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>204

gcacggugua uaagggacuc uggau 25

<210>205

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>205

auccagaguc ccuuauacac cgugc 25

<210>206

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>206

ccgucgcuau caaggaauua agaga 25

<210>207

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>207

ucucuuaauu ccuugauagc gacgg 25

<210>208

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>208

cgucgcuauc aaggaauuaa gagaa 25

<210>209

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>209

uucucuuaau uccuugauag cgacg 25

<210>210

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>210

cgcuaucaag gaauuaagag aagca 25

<210>211

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>211

ugcuucucuu aauuccuuga uagcg 25

<210>212

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>212

caaggaauua agagaagcaa caucu 25

<210>213

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>213

agauguugcu ucucuuaauu ccuug 25

<210>214

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>214

gaaauccucg augaagccua cguga 25

<210>215

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>215

ucacguaggc uucaucgagg auuuc 25

<210>216

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>216

ccgcagcaug ucaagaucac agauu 25

<210>217

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>217

aaucugugau cuugacaugc ugcgg 25

<210>218

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>218

cgcagcaugu caagaucaca gauuu 25

<210>219

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>219

aaaucuguga ucuugacaug cugcg 25

<210>220

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>220

caugcagaag gaggcaaagu gccua 25

<210>221

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>221

uaggcacuuu gccuccuucu gcaug 25

<210>222

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>222

cagaaggagg caaagugccu aucaa 25

<210>223

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>223

uugauaggca cuuugccucc uucug 25

<210>224

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>224

aagugccuau caaguggaug gcauu 25

<210>225

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>225

aaugccaucc acuugauagg cacuu 25

<210>226

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>226

gccuaucaag uggauggcau uggaa 25

<210>227

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>227

uuccaaugcc auccacuuga uaggc 25

<210>228

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>228

ccuaucaagu ggauggcauu ggaau 25

<210>229

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>229

auuccaaugc cauccacuug auagg 25

<210>230

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>230

caaguggaug gcauuggaau caauu 25

<210>231

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>231

aauugauucc aaugccaucc acuug 25

<210>232

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>232

cagccaccca uauguaccau cgaug 25

<210>233

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>233

caucgauggu acauaugggu ggcug 25

<210>234

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>234

cacccauaug uaccaucgau gucua 25

<210>235

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>235

uagacaucga ugguacauau gggug 25

<210>236

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>236

uguaccaucg augucuacau gauca 25

<210>237

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>237

ugaucaugua gacaucgaug guaca 25

<210>238

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>238

uagacgcaga uagucgccca aaguu 25

<210>239

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>239

aacuuugggc gacuaucugc gucua 25

<210>240

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>240

ccaaguccua cagacuccaa cuucu 25

<210>241

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>241

agaaguugga gucuguagga cuugg 25

<210>242

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>242

caaguccuac agacuccaac uucua 25

<210>243

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>243

uagaaguugg agucuguagg acuug 25

<210>244

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>244

acuccaacuu cuaccgugcc cugau 25

<210>245

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>245

aucagggcac gguagaaguu ggagu 25

<210>246

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>246

ucucugagug caaccagcaa caauu 25

<210>247

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>247

aauuguugcu gguugcacuc agaga 25

<210>248

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>248

caauuccacc guggcuugca uugau 25

<210>249

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>249

aucaaugcaa gccacggugg aauug 25

<210>250

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>250

ccaccguggc uugcauugau agaaa 25

<210>251

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>251

uuucuaucaa ugcaagccac ggugg 25

<210>252

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>252

caccguggcu ugcauugaua gaaau 25

<210>253

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>253

auuucuauca augcaagcca cggug 25

<210>254

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>254

ugcauugaua gaaaugggcu gcaaa 25

<210>255

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>255

uuugcagccc auuucuauca augca 25

<210>256

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>256

gcauugauag aaaugggcug caaag 25

<210>257

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>257

cuuugcagcc cauuucuauc aaugc 25

<210>258

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>258

cagcuucuug cagcgauaca gcuca 25

<210>259

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>259

ugagcuguau cgcugcaaga agcug 25

<210>260

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>260

ccagugccug aauacauaaa ccagu 25

<210>261

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>261

acugguuuau guauucaggc acugg 25

<210>262

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>262

ccaccugugu caacagcaca uucga 25

<210>263

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>263

ucgaaugugc uguugacaca ggugg 25

<210>264

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>264

gcccagaaag gcagccacca aauua 25

<210>265

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>265

uaauuuggug gcugccuuuc ugggc 25

<210>266

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>266

cccagaaagg cagccaccaa auuag 25

<210>267

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>267

cuaauuuggu ggcugccuuu cuggg 25

<210>268

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>268

ggaagccaag ccaaauggca ucuuu 25

<210>269

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>269

aaagaugcca uuuggcuugg cuucc 25

<210>270

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>270

gaagccaagc caaauggcau cuuua 25

<210>271

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>271

uaaagaugcc auuuggcuug gcuuc 25

<210>272

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>272

aagccaagcc aaauggcauc uuuaa 25

<210>273

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>273

uuaaagaugc cauuuggcuu ggcuu 25

<210>274

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>274

uggcaucuuu aagggcucca cagcu 25

<210>275

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>275

agcuguggag cccuuaaaga ugcca 25

<210>276

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>276

caucuuuaag ggcuccacag cugaa 25

<210>277

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>277

uucagcugug gagcccuuaa agaug 25

<210>278

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>278

ccacggagga uaguaugagc ccuaa 25

<210>279

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>279

uuagggcuca uacuauccuc cgugg 25

<210>280

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>280

cacggaggau aguaugagcc cuaaa 25

<210>281

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>281

uuuagggcuc auacuauccu ccgug 25

<210>282

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>282

uacagaaacg cauccagcaa gaaua 25

<210>283

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>283

uauucuugcu ggaugcguuu cugua 25

<210>284

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>284

ugauggacca gugguuucca gucau 25

<210>285

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>285

augacuggaa accacugguc cauca 25

<210>286

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>286

cagugguuuc cagucaugag cguua 25

<210>287

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>287

uaacgcucau gacuggaaac cacug 25

<210>288

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>288

cagcaagaga ggaugacaca ucaaa 25

<210>289

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>289

uuugaugugu cauccucucu ugcug 25

<210>290

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>290

ccagcccaca uuggauucau cagca 25

<210>291

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>291

ugcugaugaa uccaaugugg gcugg 25

<210>292

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>292

cagcccacau uggauucauc agcau 25

<210>293

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>293

augcugauga auccaaugug ggcug 25

<210>294

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>294

gcccacauug gauucaucag cauuu 25

<210>295

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>295

aaaugcugau gaauccaaug ugggc 25

<210>296

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>296

ccacagcuga gaauguggaa uaccu 25

<210>297

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>297

agguauucca cauucucagc ugugg 25

<210>298

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>298

cacagcugag aauguggaau accua 25

<210>299

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>299

uagguauucc acauucucag cugug 25

<210>300

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>300

ucuccuaauu ugaggcucag augaa 25

<210>301

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>301

uucaucugag ccucaaauua ggaga 25

<210>302

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>302

gaggcucaga ugaaaugcau caggu 25

<210>303

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>303

accugaugca uuucaucuga gccuc 25

<210>304

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>304

caggugcgaa ugacaguagc auuau 25

<210>305

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>305

auaaugcuac ugucauucgc accug 25

<210>306

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>306

gcgaaugaca guagcauuau gagua 25

<210>307

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>307

uacucauaau gcuacuguca uucgc 25

<210>308

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>308

caguagcauu augaguagug uggaa 25

<210>309

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>309

uuccacacua cucauaaugc uacug 25

<210>310

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>310

gcauuaugag uaguguggaa uucag 25

<210>311

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>311

cugaauucca cacuacucau aaugc 25

<210>312

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>312

aguagugugg aauucaggua guaaa 25

<210>313

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>313

uuuacuaccu gaauuccaca cuacu 25

<210>314

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>314

ugugcccugu aaccugacug guuaa 25

<210>315

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>315

uuaaccaguc agguuacagg gcaca 25

<210>316

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>316

ccugacuggu uaacagcagu ccuuu 25

<210>317

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>317

aaaggacugc uguuaaccag ucagg 25

<210>318

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>318

gacugguuaa cagcaguccu uugua 25

<210>319

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>319

uacaaaggac ugcuguuaac caguc 25

<210>320

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>320

cagcaguccu uuguaaacag uguuu 25

<210>321

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>321

aaacacuguu uacaaaggac ugcug 25

<210>322

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>322

cagccuacag uuauguucag ucaca 25

<210>323

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于抑制EGFR表达的siRNA候选分子

<400>323

ugugacugaa cauaacugua ggcug 25

<210>324

<211>5616

<212>DNA

<213>智人

<400>324

ccccggcgca gcgcggccgc agcagcctcc gccccccgca cggtgtgagc gcccgacgcg

60

gccgaggcgg ccggagtccc gagctagccc cggcggccgc cgccgcccag accggacgac

120

aggccacctc gtcggcgtcc gcccgagtcc ccgcctcgcc gccaacgcca caaccaccgc

180

gcacggcccc ctgactccgt ccagtattga tcgggagagc cggagcgagc tcttcgggga

240

gcagcgatgc gaccctccgg gacggccggg gcagcgctcc tggcgctgct ggctgcgctc

300

tgcccggcga gtcgggctct ggaggaaaag aaagtttgcc aaggcacgag taacaagctc

360

acgcagttgg gcacttttga agatcatttt ctcagcctcc agaggatgtt caataactgt

420

gaggtggtcc ttgggaattt ggaaattacc tatgtgcaga ggaattatga tctttccttc

480

ttaaagacca tccaggaggt ggctggttat gtcctcattg ccctcaacac agtggagcga

540

attcctttgg aaaacctgca gatcatcaga ggaaatatgt actacgaaaa ttcctatgcc

600

ttagcagtct tatctaacta tgatgcaaat aaaaccggac tgaaggagct gcccatgaga

660

aatttacagg aaatcctgca tggcgccgtg cggttcagca acaaccctgc cctgtgcaac

720

gtggagagca tccagtggcg ggacatagtc agcagtgact ttctcagcaa catgtcgatg

780

gacttccaga accacctggg cagctgccaa aagtgtgatc caagctgtcc caatgggagc

840

tgctggggtg caggagagga gaactgccag aaactgacca aaatcatctg tgcccagcag

900

tgctccgggc gctgccgtgg caagtccccc agtgactgct gccacaacca gtgtgctgca

960

ggctgcacag gcccccggga gagcgactgc ctggtctgcc gcaaattccg agacgaagcc

1020

acgtgcaagg acacctgccc cccactcatg ctctacaacc ccaccacgta ccagatggat

1080

gtgaaccccg agggcaaata cagctttggt gccacctgcg tgaagaagtg tccccgtaat

1140

tatgtggtga cagatcacgg ctcgtgcgtc cgagcctgtg gggccgacag ctatgagatg

1200

gaggaagacg gcgtccgcaa gtgtaagaag tgcgaagggc cttgccgcaa agtgtgtaac

1260

ggaataggta ttggtgaatt taaagactca ctctccataa atgctacgaa tattaaacac

1320

ttcaaaaact gcacctccat cagtggcgat ctccacatcc tgccggtggc atttaggggt

1380

gactccttca cacatactcc tcctctggat ccacaggaac tggatattct gaaaaccgta

1440

aaggaaatca cagggttttt gctgattcag gcttggcctg aaaacaggac ggacctccat

1500

gcctttgaga acctagaaat catacgcggc aggaccaagc aacatggtca gttttctctt

1560

gcagtcgtca gcctgaacat aacatccttg ggattacgct ccctcaagga gataagtgat

1620

ggagatgtga taatttcagg aaacaaaaat ttgtgctatg caaatacaat aaactggaaa

1680

aaactgtttg ggacctccgg tcagaaaacc aaaattataa gcaacagagg tgaaaacagc

1740

tgcaaggcca caggccaggt ctgccatgcc ttgtgctccc ccgagggctg ctggggcccg

1800

gagcccaggg actgcgtctc ttgccggaat gtcagccgag gcagggaatg cgtggacaag

1860

tgcaaccttc tggagggtga gccaagggag tttgtggaga actctgagtg catacagtgc

1920

cacccagagt gcctgcctca ggccatgaac atcacctgca caggacgggg accagacaac

1980

tgtatccagt gtgcccacta cattgacggc ccccactgcg tcaagacctg cccggcagga

2040

gtcatgggag aaaacaacac cctggtctgg aagtacgcag acgccggcca tgtgtgccac

2100

ctgtgccatc caaactgcac ctacggatgc actgggccag gtcttgaagg ctgtccaacg

2160

aatgggccta agatcccgtc catcgccact gggatggtgg gggccctcct cttgctgctg

2220

gtggtggccc tggggatcgg cctcttcatg cgaaggcgcc acatcgttcg gaagcgcacg

2280

ctgcggaggc tgctgcagga gagggagctt gtggagcctc ttacacccag tggagaagct

2340

cccaaccaag ctctcttgag gatcttgaag gaaactgaat tcaaaaagat caaagtgctg

2400

ggctccggtg cgttcggcac ggtgtataag ggactctgga tcccagaagg tgagaaagtt

2460

aaaattcccg tcgctatcaa ggaattaaga gaagcaacat ctccgaaagc caacaaggaa

2520

atcctcgatg aagcctacgt gatggccagc gtggacaacc cccacgtgtg ccgcctgctg

2580

ggcatctgcc tcacctccac cgtgcagctc atcacgcagc tcatgccctt cggctgcctc

2640

ctggactatg tccgggaaca caaagacaat attggctccc agtacctgct caactggtgt

2700

gtgcagatcg caaagggcat gaactacttg gaggaccgtc gcttggtgca ccgcgacctg

2760

gcagccagga acgtactggt gaaaacaccg cagcatgtca agatcacaga ttttgggctg

2820

gccaaactgc tgggtgcgga agagaaagaa taccatgcag aaggaggcaa agtgcctatc

2880

aagtggatgg cattggaatc aattttacac agaatctata cccaccagag tgatgtctgg

2940

agctacgggg tgaccgtttg ggagttgatg acctttggat ccaagccata tgacggaatc

3000

cctgccagcg agatctcctc catcctggag aaaggagaac gcctccctca gccacccata

3060

tgtaccatcg atgtctacat gatcatggtc aagtgctgga tgatagacgc agatagtcgc

3120

ccaaagttcc gtgagttgat catcgaattc tccaaaatgg cccgagaccc ccagcgctac

3180

cttgtcattc agggggatga aagaatgcat ttgccaagtc ctacagactc caacttctac

3240

cgtgccctga tggatgaaga agacatggac gacgtggtgg atgccgacga gtacctcatc

3300

ccacagcagg gcttcttcag cagcccctcc acgtcacgga ctcccctcct gagctctctg

3360

agtgcaacca gcaacaattc caccgtggct tgcattgata gaaatgggct gcaaagctgt

3420

cccatcaagg aagacagctt cttgcagcga tacagctcag accccacagg cgccttgact

3480

gaggacagca tagacgacac cttcctccca gtgcctgaat acataaacca gtccgttccc

3540

aaaaggcccg ctggctctgt gcagaatcct gtctatcaca atcagcctct gaaccccgcg

3600

cccagcagag acccacacta ccaggacccc cacagcactg cagtgggcaa ccccgagtat

3660

ctcaacactg tccagcccac ctgtgtcaac agcacattcg acagccctgc ccactgggcc

3720

cagaaaggca gccaccaaat tagcctggac aaccctgact accagcagga cttctttccc

3780

aaggaagcca agccaaatgg catctttaag ggctccacag ctgaaaatgc agaataccta

3840

agggtcgcgc cacaaagcag tgaatttatt ggagcatgac cacggaggat agtatgagcc

3900

ctaaaaatcc agactctttc gatacccagg accaagccac agcaggtcct ccatcccaac

3960

agccatgccc gcattagctc ttagacccac agactggttt tgcaacgtttacaccgacta

4020

gccaggaagt acttccacct cgggcacatt ttgggaagtt gcattccttt gtcttcaaac

4080

tgtgaagcat ttacagaaac gcatccagca agaatattgt ccctttgagc agaaatttat

4140

ctttcaaaga ggtatatttg aaaaaaaaaa aaagtatatg tgaggatttt tattgattgg

4200

ggatcttgga gtttttcatt gtcgctattg atttttactt caatgggctc ttccaacaag

4260

gaagaagctt gctggtagca cttgctaccc tgagttcatc caggcccaac tgtgagcaag

4320

gagcacaagc cacaagtctt ccagaggatg cttgattcca gtggttctgc ttcaaggctt

4380

ccactgcaaa acactaaaga tccaagaagg ccttcatggc cccagcaggc cggatcggta

4440

ctgtatcaag tcatggcagg tacagtagga taagccactc tgtcccttcc tgggcaaaga

4500

agaaacggag gggatggaat tcttccttag acttactttt gtaaaaatgt ccccacggta

4560

cttactcccc actgatggac cagtggtttc cagtcatgag cgttagactg acttgtttgt

4620

cttccattcc attgttttga aactcagtat gctgcccctg tcttgctgtc atgaaatcag

4680

caagagagga tgacacatca aataataact cggattccag cccacattgg attcatcagc

4740

atttggacca atagcccaca gctgagaatg tggaatacct aaggatagca ccgcttttgt

4800

tctcgcaaaa acgtatctcc taatttgagg ctcagatgaa atgcatcagg tcctttgggg

4860

catagatcag aagactacaa aaatgaagct gctctgaaat ctcctttagc catcacccca

4920

accccccaaa attagtttgt gttacttatg gaagatagtt ttctcctttt acttcacttc

4980

aaaagctttt tactcaaaga gtatatgttc cctccaggtc agctgccccc aaaccccctc

5040

cttacgcttt gtcacacaaa aagtgtctct gccttgagtc atctattcaa gcacttacag

5100

ctctggccac aacagggcat tttacaggtg cgaatgacag tagcattatg agtagtgtgg

5160

aattcaggta gtaaatatga aactagggtt tgaaattgat aatgctttca caacatttgc

5220

agatgtttta gaaggaaaaa agttccttcc taaaataatt tctctacaat tggaagattg

5280

gaagattcag ctagttagga gcccaccttt tttcctaatc tgtgtgtgcc ctgtaacctg

5340

actggttaac agcagtcctt tgtaaacagt gttttaaact ctcctagtca atatccaccc

5400

catccaattt atcaaggaag aaatggttca gaaaatattt tcagcctaca gttatgttca

5460

gtcacacaca catacaaaat gttccttttg cttttaaagt aatttttgac tcccagatca

5520

gtcagagccc ctacagcatt gttaagaaag tatttgattt ttgtctcaat gaaaataaaa

5580

ctatattcat ttccactcta aaaaaaaaaa aaaaaa

5616

<210>325

<211>3633

<212>DNA

<213>智人

<400>325

atgcgaccct ccgggacggc cggggcagcg ctcctggcgc tgctggctgc gctctgcccg

60

gcgagtcggg ctctggagga aaagaaagtt tgccaaggca cgagtaacaa gctcacgcag

120

ttgggcactt ttgaagatca ttttctcagc ctccagagga tgttcaataa ctgtgaggtg

180

gtccttggga atttggaaat tacctatgtg cagaggaatt atgatctttc cttcttaaag

240

accatccagg aggtggctgg ttatgtcctc attgccctca acacagtgga gcgaattcct

300

ttggaaaacc tgcagatcat cagaggaaat atgtactacg aaaattccta tgccttagca

360

gtcttatcta actatgatgc aaataaaacc ggactgaagg agctgcccat gagaaattta

420

caggaaatcc tgcatggcgc cgtgcggttc agcaacaacc ctgccctgtg caacgtggag

480

agcatccagt ggcgggacat agtcagcagt gactttctca gcaacatgtc gatggacttc

540

cagaaccacc tgggcagctg ccaaaagtgt gatccaagct gtcccaatgg gagctgctgg

600

ggtgcaggag aggagaactg ccagaaactg accaaaatca tctgtgccca gcagtgctcc

660

gggcgctgcc gtggcaagtc ccccagtgac tgctgccaca accagtgtgc tgcaggctgc

720

acaggccccc gggagagcga ctgcctggtc tgccgcaaat tccgagacga agccacgtgc

780

aaggacacct gccccccact catgctctac aaccccacca cgtaccagat ggatgtgaac

840

cccgagggca aatacagctt tggtgccacc tgcgtgaaga agtgtccccg taattatgtg

900

gtgacagatc acggctcgtg cgtccgagcc tgtggggccg acagctatga gatggaggaa

960

gacggcgtcc gcaagtgtaa gaagtgcgaa gggccttgcc gcaaagtgtg taacggaata

1020

ggtattggtg aatttaaaga ctcactctcc ataaatgcta cgaatattaa acacttcaaa

1080

aactgcacct ccatcagtgg cgatctccac atcctgccgg tggcatttag gggtgactcc

1140

ttcacacata ctcctcctct ggatccacag gaactggata ttctgaaaac cgtaaaggaa

1200

atcacagggt ttttgctgat tcaggcttgg cctgaaaaca ggacggacct ccatgccttt

1260

gagaacctag aaatcatacg cggcaggacc aagcaacatg gtcagttttc tcttgcagtc

1320

gtcagcctga acataacatc cttgggatta cgctccctca aggagataag tgatggagat

1380

gtgataattt caggaaacaa aaatttgtgc tatgcaaata caataaactg gaaaaaactg

1440

tttgggacct ccggtcagaa aaccaaaatt ataagcaaca gaggtgaaaa cagctgcaag

1500

gccacaggcc aggtctgcca tgccttgtgc tcccccgagg gctgctgggg cccggagccc

1560

agggactgcg tctcttgccg gaatgtcagc cgaggcaggg aatgcgtgga caagtgcaac

1620

cttctggagg gtgagccaag ggagtttgtg gagaactctg agtgcataca gtgccaccca

1680

gagtgcctgc ctcaggccat gaacatcacc tgcacaggac ggggaccaga caactgtatc

1740

cagtgtgccc actacattga cggcccccac tgcgtcaaga cctgcccggc aggagtcatg

1800

ggagaaaaca acaccctggt ctggaagtac gcagacgccg gccatgtgtg ccacctgtgc

1860

catccaaact gcacctacgg atgcactggg ccaggtcttg aaggctgtcc aacgaatggg

1920

cctaagatcc cgtccatcgc cactgggatg gtgggggccc tcctcttgct gctggtggtg

1980

gccctgggga tcggcctctt catgcgaagg cgccacatcg ttcggaagcg cacgctgcgg

2040

aggctgctgc aggagaggga gcttgtggag cctcttacac ccagtggaga agctcccaac

2100

caagctctct tgaggatctt gaaggaaact gaattcaaaa agatcaaagt gctgggctcc

2160

ggtgcgttcg gcacggtgta taagggactc tggatcccag aaggtgagaa agttaaaatt

2220

cccgtcgcta tcaaggaatt aagagaagca acatctccga aagccaacaa ggaaatcctc

2280

gatgaagcct acgtgatggc cagcgtggac aacccccacg tgtgccgcct gctgggcatc

2340

tgcctcacct ccaccgtgca gctcatcacg cagctcatgc ccttcggctg cctcctggac

2400

tatgtccggg aacacaaaga caatattggc tcccagtacc tgctcaactg gtgtgtgcag

2460

atcgcaaagg gcatgaacta cttggaggac cgtcgcttgg tgcaccgcga cctggcagcc

2520

aggaacgtac tggtgaaaac accgcagcat gtcaagatca cagattttgg gctggccaaa

2580

ctgctgggtg cggaagagaa agaataccat gcagaaggag gcaaagtgcc tatcaagtgg

2640

atggcattgg aatcaatttt acacagaatc tatacccacc agagtgatgt ctggagctac

2700

ggggtgaccg tttgggagtt gatgaccttt ggatccaagc catatgacgg aatccctgcc

2760

agcgagatct cctccatcct ggagaaagga gaacgcctcc ctcagccacc catatgtacc

2820

atcgatgtct acatgatcat ggtcaagtgc tggatgatag acgcagatag tcgcccaaag

2880

ttccgtgagt tgatcatcga attctccaaa atggcccgag acccccagcg ctaccttgtc

2940

attcaggggg atgaaagaat gcatttgcca agtcctacag actccaactt ctaccgtgcc

3000

ctgatggatg aagaagacat ggacgacgtg gtggatgccg acgagtacct catcccacag

3060

cagggcttct tcagcagccc ctccacgtca cggactcccc tcctgagctc tctgagtgca

3120

accagcaaca attccaccgt ggcttgcatt gatagaaatg ggctgcaaag ctgtcccatc

3180

aaggaagaca gcttcttgca gcgatacagc tcagacccca caggcgcctt gactgaggac

3240

agcatagacg acaccttcct cccagtgcct gaatacataa accagtccgt tcccaaaagg

3300

cccgctggct ctgtgcagaa tcctgtctat cacaatcagc ctctgaaccc cgcgcccagc

3360

agagacccac actaccagga cccccacagc actgcagtgg gcaaccccga gtatctcaac

3420

actgtccagc ccacctgtgt caacagcaca ttcgacagcc ctgcccactg ggcccagaaa

3480

ggcagccacc aaattagcct ggacaaccct gactaccagc aggacttctt tcccaaggaa

3540

gccaagccaa atggcatctt taagggctcc acagctgaaa atgcagaata cctaagggtc

3600

gcgccacaaa gcagtgaatt tattggagca tga

3633

<210>326

<211>1210

<212>PRT

<213>智人

<400>326

Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln

20 25 30

Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe

35 40 45

Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn

50 55 60

Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys

65 70 75 80

Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val

85 90 95

Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr

100 105 110

Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn

115 120 125

Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu

130 135 140

His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu

145 150 155 160

Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met

165 170 175

Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro

180 185 190

Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln

195 200 205

Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg

210 215 220

Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys

225 230 235 240

Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp

245 250 255

Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro

260 265 270

Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly

275 280 285

Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His

290 295 300

Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu

305 310 315 320

Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val

325 330 335

Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn

340 345 350

Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp

355 360 365

Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr

370 375 380

Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu

385 390 395 400

Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp

405 410 415

Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln

420 425 430

His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu

435 440 445

Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser

450 455 460

Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu

465 470 475 480

Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu

485 490 495

Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro

500 505 510

Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn

515 520 525

Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly

530 535 540

Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro

545 550 555 560

Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro

565 570 575

Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val

580 585 590

Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp

595 600 605

Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys

610 615 620

Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly

625 630 635 640

Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu

645 650 655

Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His

660 665 670

Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu

675 680 685

Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu

690 695 700

Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser

705 710 715 720

Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu

725 730 735

Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser

740 745 750

Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser

755 760 765

Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser

770 775 780

Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp

785 790 795 800

Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn

805 810 815

Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg

820 825 830

Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro

835 840 845

Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala

850 855 860

Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp

865 870 875 880

Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp

885 890 895

Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser

900 905 910

Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu

915 920 925

Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr

930 935 940

Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys

945 950 955 960

Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln

965 970 975

Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro

980 985 990

Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp

995 1000 1005

Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe Phe

1010 1015 1020

Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu Ser Ala

1025 1030 1035 1040

Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn Gly Leu Gln

1045 1050 1055

Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg Tyr Ser Ser Asp

1060 1065 1070

Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp Asp Thr Phe Leu Pro

1075 1080 1085

Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro Lys Arg Pro Ala Gly Ser

1090 1095 1100

Val Gln Asn Pro Val Tyr His Asn Gln Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser

1105 1110 1115 1120

Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro

1125 1130 1135

Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp

1140 1145 1150

Ser Pro Ala His Trp Ala Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp

1155 1160 1165

Asn Pro Asp Tyr Gln Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn

1170 1175 1180

Gly Ile Phe Lys Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val

1185 1190 1195 1200

Ala Pro Gln Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala

1205 1210

Claims

1.下调表皮生长因子受体(EGFR)基因表达的核酸分子，其中所述核酸分子包括靶向SEQ ID NOs：1-10或21-121中所示的任何一种多核苷酸序列的核酸。

2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述核酸为短干扰RNA(siRNA)分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其中所述siRNA包括SEQ IDNOs：11-20和122-323中提供的任何一种单链RNA序列，或其双链RNA。

4.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述核酸分子经由RNA干扰(RNAi)下调EGFR基因的表达。

5.组合物，包括权利要求3所述的任何一种或多种siRNA分子。

6.根据权利要求5所述的组合物，进一步包括靶向部分。

7.根据权利要求5所述的组合物，进一步包括组氨酸-赖氨酸共聚物。

8.用于治疗或预防在受试者中的癌症的方法，所述受试者患有EGFR表达性癌症和有或怀疑有患有所述癌症的风险，该方法包括向受试者施用权利要求5所述的组合物，由此治疗或预防所述癌症。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述癌症选自以下：乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结直肠癌、脑癌、食管癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、子宫颈癌、头和颈癌、肾癌、子宫内膜癌、卵巢癌、脑膜瘤、黑素瘤、淋巴瘤和胶质母细胞瘤。

10.用于在细胞中降低EGFR的合成或表达的方法，包括将一种或多种siRNA引入细胞，其中所述一种或多种siRNA具有在SEQ ID NOs：11-20或122-323中所示的序列。