CN103320440A - 一种特异性抑制乳腺癌MDA-MB-468细胞增殖的siRNA及其应用 - Google Patents
一种特异性抑制乳腺癌MDA-MB-468细胞增殖的siRNA及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种特异性抑制乳腺癌MDA-MB-468细胞增殖的siRNA及其应用。所述siRNA是针对EGFR-cmRNA变异体序列的第1295～1313个碱基区域设计的。目前针对肿瘤细胞增殖的siRNA往往都是针对个别基因，但是一般基因在肿瘤和正常细胞中都有表达，但基因的不同转录变异体（mRNA变异体）在肿瘤和正常细胞中表达程度可能不同，本方法设计的siRNA能特异性抑制肿瘤细胞中的EGFR-cmRNA变异体，实现特异性抑制肿瘤细胞的生长。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学与生物医药技术领域，具体涉及一种特异性抑制乳腺癌MDA-MB-468细胞增殖的siRNA及其应用。
背景技术
RNAi （RNA干扰）是由双链RNA 所引起的序列特异性基因沉默。一般设计与目标基因有同源性的21-23nt的双链小RNA（siRNA），然后转染到目标细胞，此siRNA能对目标基因的RNA进行降解，从而起到基因沉默的效果。RNAi 首先由Fire 等发现于秀丽隐杆线虫(C. elegans) 中，他们发现将dsRNA 注入线虫体内后可抑制序列同源基因的表达，并证实这种抑制主要作用于转录之后，所以又称RNAi 为转录后基因沉默( postt ranscriptional gene silencing，PTGS) 。
随着RNAi技术的不断研究的深入，发现目标基因一般存在非常多的转录变异体RNA，一般设计的siRNA对一个基因的多个变异体都有干扰效果，不同的转录变异体RNA在不同细胞中有所不同，在一种细胞中会存在特定的转录变异体，比如乳腺癌MDA-MB-468细胞和正常乳腺MCF-10A细胞中，EGFR-c（表皮生长因子受体基因-C亚型）的转录变异体只在乳腺癌MDA-MB-468细胞表达，在正常乳腺MCF-10A细胞中不表达EGFR-c亚型。EGFR基因目前发现存在4中转录变异体，即：EGFR-a，b，c，d，EGFR基因是研究较多的一种癌基因，参与肿瘤细胞的恶性增殖等生命活动。针对此情况，设计干扰EGFR-c基因的siRNA来特异性抑制乳腺癌MDA-MB-468肿瘤细胞的增殖，此siRNA对正常细胞没有作用，这样更有利于开发特异性的用于人体试验的抗癌药物研发。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种针对EGFR-c mRNA变异体序列（SEQ ID NO:1）的siRNA。
本发明的另一个目的是提供一种特异性抑制乳腺癌MDA-MB-468细胞增殖的siRNA。
本发明的另一个目的是公开上述siRNA在乳腺癌治疗药物中的应用。
本发明的另一个目的是公开EGFR-c mRNA变异体序列（SEQ ID NO:1）作为乳腺癌治疗靶点的用途。
本发明所采取的技术方案是：
一种针对EGFR-c mRNA变异体序列（SEQ ID NO:1）的siRNA，其靶序列位于EGFR-c mRNA变异体序列的第1295～1313个碱基之间。
优选的，所述siRNA的序列如下所示：
正义链为：5'-CCAUAAAUGCUACGAAUAUTT-3'（SEQ ID NO:2）；
反义链为：5'-AUAUUCGUAGCAUUUAUGGTT-3'（SEQ ID NO:3）。
上述siRNA在制备乳腺癌治疗药物中的应用。
一种特异性抑制乳腺癌MDA-MB-468细胞增殖的siRNA，其为针对EGFR-c mRNA变异体序列（SEQ ID NO:1）的siRNA。
优选的，所述siRNA的靶序列位于EGFR-c mRNA变异体序列（SEQ ID NO:1）的第1295～1313个碱基之间。
优选的，所述siRNA的序列如下所示：
正义链为：5'-CCAUAAAUGCUACGAAUAUTT-3'（SEQ ID NO:2）；
反义链为：5'-AUAUUCGUAGCAUUUAUGGTT-3'（SEQ ID NO:3）。
上述siRNA在制备乳腺癌治疗药物中的应用。
一种特异性抑制乳腺癌MDA-MB-468细胞增殖的siRNA的设计方法，包括以EGFR-c mRNA变异体序列（SEQ ID NO:1）的第1295～1313个碱基区域为靶序列，设计只针对EGFR-c mRNA变异体的siRNA。
EGFR-c mRNA变异体序列（SEQ ID NO:1）作为乳腺癌治疗靶点的用途。包括以EGFR-c mRNA变异体序列为靶点，设计相关药物降低EGFR-c mRNA变异体序列的表达，从而抑制乳腺癌MDA-MB-468细胞增殖。
本发明的有益效果是：
目前针对肿瘤细胞增殖的siRNA往往都是针对个别基因，但是一般基因在肿瘤和正常细胞中都有表达，但基因的不同转录变异体（mRNA变异体）在肿瘤和正常细胞中表达程度可能不同，本发明通过基因检测乳腺癌MDA-MB-468细胞和正常乳腺MCF-10A细胞中EGFR基因各个变异体的mRNA表达情况，发现EGFR-c变异体的mRNA只在乳腺癌MDA-MB-468细胞中表达，在正常乳腺MCF-10A细胞中没有表达；以此为基础针对EGFR-c变异体设计小核酸RNA（siRNA），MTT法检测细胞增殖情况，筛选到一个特异性抑制乳腺癌MDA-MB-468细胞增殖的siRNA，此siRNA由21nt核苷酸组成的双链小RNA，对正常乳腺MCF-10A细胞没有明显抑制作用，对乳腺癌MDA-MB-468细胞增殖有明显抑制作用。因而可用于制备乳腺癌MDA-MB-468细胞增殖的药物，或进一步用于制备乳腺癌治疗的药物。
附图说明
图1为MTT法检测细胞增殖。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
一、特异性siRNA的设计
根据EGFR-c mRNA变异体（GenBank登录号：NM_201283）序列(SEQ ID NO:1)的第1295～1313个碱基序列之间的区域设计只针对EGFR-c mRNA变异体的siRNA（命名为SiEGFR-C），得到siRNA的序列为：
SiEGFR-C-Sense：5'-CCAUAAAUGCUACGAAUAUTT-3'（SEQ ID NO:2）；
SiEGFR-C-Anti-Sense：5'-AUAUUCGUAGCAUUUAUGGTT-3'（SEQ ID NO:3）。
阴性对照由21nt核苷酸组成的对EGFR-c mRNA变异体序列没有靶向结合作用的双链小RNA，序列如下所示：
SiEGFR-NC-Sense：5'- UCACCGAGAUGAAGAUAUCTT-3'（SEQ ID NO:4）；
SiEGFR-NC-Anti-Sense：5'-GAUAUCUUCAUCUCGGUGATT-3'（SEQ ID NO:5）。
二、特异性siRNA对乳腺癌MDA-MB-468细胞的抑制作用
将乳腺癌MDA-MB-468细胞和正常乳腺MCF-10A细胞以细胞数5×10 4 /mL接种于96 孔板，24 h 后使用TurboFect Transfection Reagent（Thermo公司，货号R0534）试剂盒分别将上述SiEGFR-C siRNA和SiEGFR-NC siRNA转染两种细胞，siRNA转染终浓度为50nM，做3个复孔。转染培养24 h 、48h、72h后用于MTT 测定。MTT法检测细胞增殖情况，检测前加入5 mg/mL MTT 溶液, 4 h 后以DMSO溶解MTT，并于492 nm 处测定吸收度 (A) 值。
MTT检测细胞增殖情况（参见图1），结果显示SiEGFR-C siRNA对乳腺癌MDA-MB-468细胞增殖有明显抑制，对正常乳腺MCF-10A细胞增殖没有明显抑制，而SiEGFR-NC对乳腺癌MDA-MB-468细胞增殖和正常乳腺MCF-10A细胞增殖都没有明显的抑制作用。结果证明成功设计了特异性抑制乳腺癌MDA-MB-468细胞增殖的siRNA。
<110> 广州赛哲生物科技有限公司
<120> 一种特异性抑制乳腺癌MDA-MB-468细胞增殖的siRNA及其应用
<130>
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1595
<212> DNA
<213> human
<400> 1
ccccggcgca gcgcggccgc agcagcctcc gccccccgca cggtgtgagc gcccgacgcg 60
gccgaggcgg ccggagtccc gagctagccc cggcggccgc cgccgcccag accggacgac 120
aggccacctc gtcggcgtcc gcccgagtcc ccgcctcgcc gccaacgcca caaccaccgc 180
gcacggcccc ctgactccgt ccagtattga tcgggagagc cggagcgagc tcttcgggga 240
gcagcgatgc gaccctccgg gacggccggg gcagcgctcc tggcgctgct ggctgcgctc 300
tgcccggcga gtcgggctct ggaggaaaag aaagtttgcc aaggcacgag taacaagctc 360
acgcagttgg gcacttttga agatcatttt ctcagcctcc agaggatgtt caataactgt 420
gaggtggtcc ttgggaattt ggaaattacc tatgtgcaga ggaattatga tctttccttc 480
ttaaagacca tccaggaggt ggctggttat gtcctcattg ccctcaacac agtggagcga 540
attcctttgg aaaacctgca gatcatcaga ggaaatatgt actacgaaaa ttcctatgcc 600
ttagcagtct tatctaacta tgatgcaaat aaaaccggac tgaaggagct gcccatgaga 660
aatttacagg aaatcctgca tggcgccgtg cggttcagca acaaccctgc cctgtgcaac 720
gtggagagca tccagtggcg ggacatagtc agcagtgact ttctcagcaa catgtcgatg 780
gacttccaga accacctggg cagctgccaa aagtgtgatc caagctgtcc caatgggagc 840
tgctggggtg caggagagga gaactgccag aaactgacca aaatcatctg tgcccagcag 900
tgctccgggc gctgccgtgg caagtccccc agtgactgct gccacaacca gtgtgctgca 960
ggctgcacag gcccccggga gagcgactgc ctggtctgcc gcaaattccg agacgaagcc 1020
acgtgcaagg acacctgccc cccactcatg ctctacaacc ccaccacgta ccagatggat 1080
gtgaaccccg agggcaaata cagctttggt gccacctgcg tgaagaagtg tccccgtaat 1140
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ggaataggta ttggtgaatt taaagactca ctctccataa atgctacgaa tattaaacac 1320
ttcaaaaact gcacctccat cagtggcgat ctccacatcc tgccggtggc atttaggggt 1380
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ttttaccgtt aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1595
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
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<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
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auauucguag cauuuauggt t 21
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<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<400> 4
ucaccgagau gaagauauct t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<400> 5
gauaucuuca ucucggugat t 21
Claims (10)
1.一种针对EGFR-c mRNA变异体序列（SEQ ID NO:1）的siRNA，其靶序列位于EGFR-c mRNA变异体序列的第1295～1313个碱基之间。
2.根据权利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述siRNA的序列如下所示：
正义链为：5'-CCAUAAAUGCUACGAAUAUTT-3'（SEQ ID NO:2）；
反义链为：5'-AUAUUCGUAGCAUUUAUGGTT-3'（SEQ ID NO:3）。
3.权利要求1～2所述的siRNA在制备乳腺癌治疗药物中的应用。
4.一种特异性抑制乳腺癌MDA-MB-468细胞增殖的siRNA，其为针对EGFR-c mRNA变异体序列（SEQ ID NO:1）的siRNA。
5.根据权利要求4所述的siRNA，其特征在于，所述siRNA的靶序列位于EGFR-c mRNA变异体序列（SEQ ID NO:1）的第1295～1313个碱基之间。
6.根据权利要求4或5所述的siRNA，其特征在于，所述siRNA的序列如下所示：
正义链为：5'-CCAUAAAUGCUACGAAUAUTT-3'（SEQ ID NO:2）；
反义链为：5'-AUAUUCGUAGCAUUUAUGGTT-3'（SEQ ID NO:3）。
7.权利要求4～6任一项所述的siRNA在制备乳腺癌治疗药物中的应用。
8.一种特异性抑制乳腺癌MDA-MB-468细胞增殖的siRNA的设计方法，包括以EGFR-c mRNA变异体序列（SEQ ID NO:1）的第1295～1313个碱基区域为靶序列，设计只针对EGFR-c mRNA变异体的siRNA。
9.EGFR-c mRNA变异体序列（SEQ ID NO:1）作为乳腺癌治疗靶点的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，以EGFR-c mRNA变异体序列为靶点，设计相关药物降低EGFR-c mRNA变异体序列的表达，从而抑制乳腺癌MDA-MB-468细胞增殖。
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