CN107236736B - 特异性抑制MSI-1基因表达的siRNA及其重组载体和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种特异性抑制MSI‑1基因表达的siRNA及其重组载体和应用，属于分子生物学与生物医药技术领域。所述siRNA，包括正义链和反义链，正义链：5’‑AAUUUCACACACUUUCUCCAC‑3’；反义链：5’‑GGAGAAAGUGUGUGAAAUUCA‑3’。本发明提供的siRNA可以特异性、高效地抑制MSI‑1基因的mRNA和蛋白表达，减少细胞增殖，增加细胞凋亡，降低细胞迁移和侵袭能力，并能有效逆转卵巢癌细胞对紫杉醇的耐药。本发明还提供了所述siRNA及其重组载体在制备治疗卵巢癌、神经胶质瘤、结直肠癌、子宫内膜癌、或逆转卵巢癌耐药的药物中的应用。

Description

特异性抑制MSI-1基因表达的siRNA及其重组载体和应用
技术领域
本发明涉及分子生物学与生物医药技术领域，具体为一种特异性抑制MSI-1基因表达的siRNA及其重组载体和应用。
背景技术
RNA干扰(RNA interference，RNAi)，又叫基因沉默，是动植物中广泛存在的序列特异性转录后基因沉默机制。2001年Tuschl和他同事发现体外培养的哺乳动物细胞转染人工合成的21-23nt的双链siRNA分子可以模拟RNAi作用，进一步研究发现短于21bp或者长于25bp的双链RNA(dsRNA)均不能有效启动RNAi，而且其中间序列只要有一个碱基的错配，基因沉默的效应就明显减退甚至消失，充分体现了其作用的特异性。
正因为RNAi作用具有很高的特异性和高效性，为基因的功能研究提供了强有力的研究工具，利用小分子干扰RNA(siRNA)作为基因沉默的方法被广泛用于恶性肿瘤机制的研究，大力推动了以该技术为基础的肿瘤特异高效治疗策略的研发进程。
卵巢癌是女性第二大常见恶性肿瘤，是女性因癌致死的主要原因，在早期很少有症状表现，60％以上的妇女在明确诊断时已是III期或IV期，已发生广泛转移，预后很差。标准的治疗手段为卵巢肿瘤细胞减灭术加后续化疗，但大多数的患者还是会因为化疗耐药、肿瘤复发最终死亡，五年生存率极低(30％左右)。如何改善卵巢癌的治疗效果、寻找卵巢癌化疗耐药的解决方案，是妇科肿瘤学家面临的最严峻挑战。
分子靶向药物和化疗联合应用是目前提高恶性肿瘤患者生存率最有前景的治疗方法。研究发现肿瘤细胞中的一类亚群，肿瘤干细胞样细胞(Cancer stem-like cells，CSCs)，能导致肿瘤形成和药物耐药，CSCs的抗药性和一些关键基因的表达有明显相关性。在卵巢癌细胞中也陆续发现了一些CSCs标记分子和耐药相关，musashi-1(MSI-1)基因就是其中一个。最近有文献报道在卵巢浆液性腺癌、粘液性腺癌和透明细胞癌中MSI-1蛋白表达明显高于正常组织，临床资料分析发现还和预后密切相关，MSI-1高表达预后就差。
MSI-1是在研究神经元前体细胞不对称分裂过程中首次被发现和报道的一种RNA结合调控基因，是一个干细胞早期调控的重要基因，在小鼠小肠和人结肠憩室干细胞中也有表达。最近发现干细胞标记分子MSI-1在实体肿瘤，如神经胶质瘤、结直肠癌和子宫内膜癌中表达均有上调，同时MSI-1可以作为疾病进展、转移和预后的判断指标。进一步研究发现MSI-1可能通过抑制Numb基因表达进而激活了Notch信号传导途径。MSI-1不仅是细胞干细胞的标记，还是肿瘤细胞化疗和放疗耐药的信号传导分子。这些途径可能是MSI-1基因参与卵巢癌发病和耐药的主要机制。
因此，采用RNAi技术进行MSI-1基因在卵巢癌中的研究将是对卵巢癌发病机制的重要补充，是对卵巢癌及其耐药治疗的重要探索和应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性抑制MSI-1基因表达的siRNA，用于卵巢癌发病机制研究。本发明的另一个目的在于提供该siRNA在制备治疗卵巢癌和紫杉醇耐药的卵巢癌药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明设计、合成3对特异性抑制MSI-1基因表达的siRNA，分别转染到卵巢癌细胞株A2780及其紫杉醇耐药株A2780/taxol中，结果发现S2抑制MSI-1基因表达的干扰效果最明显。
本发明提供了一种特异性抑制MSI-1基因表达的siRNA(S2)，包括正义链和反义链，
所述正义链：5’-AAUUUCACACACUUUCUCCAC-3’(SEQ ID NO.1)；
所述反义链：5’-GGAGAAAGUGUGUGAAAUUCA-3’(SEQ ID NO.2)。
作为优选，所述正义链和反义链的5’和3’端的3个碱基进行2’-甲氧基-4’-硫代修饰。本发明研究证明，2’-甲氧基-4’-硫代修饰后的siRNA(S2)稳定性增加，提高其在体内抵抗核糖酶的水解的能力，降低免疫刺激反应，延长siRNA干扰基因表达下调的作用时间，使其作用具有高效性、特异性。
本发明提供了一种包含编码所述siRNA的DNA序列的RNA干扰试剂盒。所述试剂盒中包含克隆了所述siRNA的DNA质粒载体，应用时，该质粒载体在真核细胞中转录表达所需的siRNA，从而达到沉默MSI-1基因的表达。
本发明提供了一种含有编码所述siRNA的DNA序列的重组载体。作为优选，采用的原始载体为慢病毒载体pLKO.1puro。
本发明还提供了重组载体的构建方法，包括：
(1)合成MSI-1-S2片段，选择Age I和EcoR I两个酶切位点，根据S2的序列，设计其shRNA序列，序列如下：
正义链：
5’-CCGGTGAATTTCACACACTTTCTCCACTTCAAGAGAGTGGAGAAAGTGTGTGAAATTCATTTTTTGGTACC-3’(SEQ ID NO.8)；
反义链：
5’-AATTGGTACCAAAAAATGAATTTCACACACTTTCTCCACTCTCTTGAAGTGGAGAAAGTGTGTGAAATTCA-3’(SEQ ID NO.9)；
(2)退火得到MSI-1-S2的DNA片段；
(3)用慢病毒载体pLKO.1puro构建pLKO.1-MSI-1-S2重组载体。
本发明提供的siRNA能够高效特异性抑制卵巢癌细胞MSI-1基因的表达，减少细胞增殖，增加细胞凋亡，降低细胞迁移和侵袭能力，因此，所述siRNA和重组载体作为MSI-1基因表达抑制剂可以应用于肿瘤疾病发病机制的研究当中。所述MSI-1基因序列如SEQ IDNO.3所示。
本发明提供了所述siRNA和重组载体在制备MSI-1基因表达抑制剂中的应用。
本发明提供了所述siRNA和重组载体在制备治疗卵巢癌、神经胶质瘤、结直肠癌或子宫内膜癌药物中的应用。
本发明研究表明，紫杉醇耐药株A2780/taxol转染所述siRNA后，该细胞株对紫杉醇的敏感性明显提高，逆转指数为9.08，说明本发明提供的siRNA对紫杉醇耐药株A2780/taxol耐药的逆转效果非常明显，因此，所述siRNA对逆转卵巢癌紫杉醇耐药的治疗具有潜在应用价值。
本发明提供了所述的siRNA和重组载体在制备逆转卵巢癌紫杉醇耐药的药物中的应用。
本发明具备的有益效果：
本发明提供的siRNA能够特异性、高效地抑制MSI-1基因的mRNA和蛋白表达，减少细胞增殖，增加细胞凋亡，降低细胞迁移和侵袭能力，并能有效逆转卵巢癌细胞对紫杉醇的耐药。将其应用于肿瘤发病机制研究、肿瘤治疗及逆转卵巢癌耐药治疗中，具有重要意义。
附图说明
图1为qRT-PCR检测S1，S2，S3转染48h后A2780细胞MSI-1mRNA表达。
图2为qRT-PCR检测S1，S2，S3转染48h后A2780/Taxol细胞MSI-1mRNA表达。
图3为Western Blotting检测S1，S2，S3转染72h后A2780细胞MSI-1蛋白表达。
图4为Western Blotting检测S1，S2，S3转染72h后A2780/Taxol细胞MSI-1蛋白表达。
图5为qRT-PCR筛选不同浓度S2转染48h后A2780细胞MSI-1mRNA表达。
图6为qRT-PCR筛选不同浓度S2转染48h后A2780/Taxol细胞MSI-1mRNA表达。
图7为Western Blotting筛选不同浓度S2转染72h后A2780细胞MSI-1蛋白表达。
图8为Western Blotting筛选不同浓度S2转染72h后A2780/Taxol细胞MSI-1蛋白表达。
图9为pLKO.1-MSI-1-S2重组质粒及插入酶切位点示意图。
图10为小发卡shRNA示意图。U6启动子指导下游小发卡shRNA的转录；包括23个S2正义链碱基，23个S2反义链碱基。
图11为Western Blotting检测pLKO.1-MSI-1-S2转染后A2780细胞MSI-1蛋白表达。
图12为Western Blotting检测pLKO.1-MSI-1-S2转染后A2780/Taxol细胞MSI-1蛋白表达。
图13为相差显微镜观察转染pLKO.1-MSI-1-S2后A2780和A2780/Taxol细胞数量和形态变化。
图14为溴标法检测转染pLKO.1-MSI-1-S2后A2780和A2780/Taxol细胞增殖。
图15为Caspase3活性检测转染pLKO.1-MSI-1-S2后A2780和A2780/Taxol细胞凋亡。
图16为细胞划痕实验检测转染pLKO.1-MSI-1-S2后A2780细胞迁移能力。
图17为细胞划痕实验检测转染pLKO.1-MSI-1-S2后A2780/Taxol细胞迁移能力。
图18为Transwell检测转染pLKO.1-MSI-1-S2后A2780和A2780/Taxol细胞迁移能力。
图19为Transwell检测转染pLKO.1-MSI-1-S2后A2780和A2780/Taxol细胞侵袭能力。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。以下的实施例中采用的方法目的是更好地理解本发明，但并不限于本发明。如无特殊说明，实施例中涉及的实验方法均为常规方法，所用的实验材料均为常规试剂公司购买。
采用SPSS 16.0统计分析软件，各样本数据以均数±标准差表示，两组之间的差异用T检验(Independent-Sample T Test)，多组之间的检验用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，P＜0.05有统计学差异。
卵巢癌细胞株A2780及卵巢癌A2780紫杉醇耐药细胞株A2780/Taxol由浙江省女性生殖健康研究重点实验室细胞库保存；
兔抗人MSI-1一抗(Cat.27185-1-AP)、鼠抗人GAPDH一抗(Cat.60004-1-Ig)、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗(Cat.SA00001-1)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)二抗(Cat.SA00001-2)均购自Proteintech公司；
Western Blotting Luminol Reagent检测试剂盒(Cat.sc-2048)购自Santa Cruz公司；
cDNA逆转录试剂盒PrimeScriptTM RT Master Mix(Cat.RR036A)、荧光定量PCR检测试剂盒SYBR Premix Ex Taq(perfect Real time,Cat.DRR041A)购自TaKaRa公司；Lipofectamine3000转染试剂盒(Cat.L3000008)购自Invitrogen公司；
限制性内切酶Age I(Cat.R0552S)、EcoR I(Cat.R0101S)、Kpn I(Cat.R0142S)购自NEB公司；T4连接酶(Cat.2011A)、DNA片段纯化试剂盒(Cat.9761)、DNA凝胶回收试剂盒(Cat.9762)、质粒DNA小量纯化试剂盒(Cat.9760)均购自TaKaRa公司；
siRNA由TaKaRa公司合成；PCR引物及克隆用DNA由上海生工生物工程公司合成；
预染蛋白Marker(Cat.26616)购自Fermentas公司；
溴标法细胞增殖检测试剂盒Cell Proliferation ELISA,BrdU(colorimetric,Cat.11647229001)购自Roche公司；
CaspACE Assay System(colorimetric，Cat.G7351)购自Promega公司；细胞迁移、侵袭模型Transwell Permeable Supports(Cat.3428)购自Corning公司；
Lab-Tek II Chamber Slide System—Lab-Tek腔室玻片系统购自Nunc公司(Cat.154526)；
BD MatrigelTM Basement Membrane Matirx基质膜(Cat.356234)购自BD公司；
siRNA阴性对照AllStars Negative Control SiRNA(Cat.1027281)购自QIAGEN公司；
SDS-PAGE凝胶配置试剂盒(Cat.CW0022M)购自康为世纪公司；
0.45um PVDF膜(Cat.IPVH00010)购自Millipore公司；
紫杉醇(Cat.P106868)购自Aladdin公司。
实施例1.MSI-1siRNA设计合成
在Genebank中查获Musashi-1基因序列(NM_002442.3)，用siDirect Ver2.0软件(http://sidirect2.rnai.jp/)在线设计获得3对siRNA序列，设计过程中选择同时满足文献报道的三种算法(Ui-Tei×Reynolds×Amarzguioui)的序列，并选择siRNA作用特异性最高的23nt长度片段，该设计可避免将来体内实验时发生干扰素样免疫反应，选择起始密码子后100nt，避开5’和3’端UTR区，GC含量控制在30-70％。共选择3对23nt长度的siRNA作为实验筛选干扰片段，结构特征表现为正义链和反义链3’端各有两个碱基外挂，结构特点如下
随后用BLASTN(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在线进行同源性搜索，排除有同源性的序列，尽可能避免非特异性片段对siRNA特异性作用效应的影响。
最后在化学合成时对正义链和反义链的5’和3’端连续3个嘌呤(嘧啶)碱基进行2’-OMe-4’-thio(2’-甲氧基-4’-硫代)修饰，增加siRNA分子在细胞内的化学稳定性，延长siRNA干扰基因表达下调的时间和效应。最终的序列和修饰如表1和式(Ⅰ)如下：
表1
实施例2.三对MSI-1siRNA在卵巢癌细胞株A2780及其紫杉醇耐药株A2780/taxol中对MSI-1基因干扰效果的检测和筛选
一、实验分组：
1.A2780正常组(不转染siRNA)。以下称作A；
2.A2780阴性对照组(转染阴性对照siRNA)，以下称作A-N；
3.A2780实验组(转染S1)，以下称作A-S1；
4.A2780实验组(转染S2)，以下称作A-S2；
5.A2780实验组(转染S3)，以下称作A-S3；
6.A2780/Taxol正常组(不转染siRNA)，以下称作AR；
7.A2780/Taxol阴性对照组(转染阴性对照siRNA)，以下称作AR-N；
8.A2780/Taxol实验组(转染S1)，以下称作AR-S1；
9.A2780/Taxol实验组(转染S2)，以下称作AR-S2；
10.A2780/Taxol实验组(转染S3)，以下称作AR-S3。
二、分组转染
为确保转染效率，降低细胞毒性，我们采用Lipofectamine3000转染试剂进行siRNA转染。转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板在六孔板中，使其在转染日密度0.5×106/ml，细胞融合至70-90％。每孔用125μl无血清OPTI-MEM培养基稀释5ulLipofectamine 3000试剂并充分混匀；制备siRNA预混液，用125μl无血清OPTI-MEM培养基稀释siRNA至终浓度为50nM，并充分混匀；在已稀释的Lipofectamine 3000试剂中加入siRNA预混液(1:1)，室温孵育5min；最后将siRNA-脂质体复合物加入细胞中，37℃，5％的CO2中继续培养。48h后检测MSI-1mRNA表达，72h后检测MSI-1蛋白表达。
三、实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测MSI-1基因mRNA表达
培养48h后吸弃6孔板中的培养基，用PBS洗涤两次后用Trizol抽提总RNA，ThermoNano Drop2000分光光度仪测定RNA浓度，并按SYBR Premix Ex Taq(perfect Real time)试剂盒说明书操作。第一步RNA变性。反应体系：RNA0.5ug，去RNA酶DEPC水补足至6.8ul；反应条件：70℃孵育10min后置于冰上。第二步逆转录。反应体系：按照PrimeScript RTMaster Mix试剂盒说明书进行逆转录；反应条件：42℃孵育60min，85℃灭活5min后，-20℃保存。取1ul逆转录产物进行荧光定量PCR反应。PCR引物序列：
5’-GTCTCGAGTCATGCCCTACG-3’；5’-AGGAATGGCTGTAAGCTCGG-3’，产物长度：202bp，反应条件：95℃10s，95℃5s，6℃30s，共40个循环。采用2-△CT法计算各组样本中MSI-1mRNA的表达量。
结果：如图1所示，A2780细胞分别转染S1、S2、S3后，MSI-1mRNA的表达均有明显下降，其中A-S2干扰效果最好，与阴性对照组比较，MSI-1mRNA下调了96.84％(P＜0.05)。同样如图2所示，在A2780/Taxol细胞中，AR-S2干扰效果最好，与阴性对照组比较，MSI-1mRNA下调了95.18％(P＜0.05)。结果表明，在A2780和紫杉醇耐药株A2780/Taxol中，S2对MSI-1的mRNA表达有最好的干扰效果。
四、Western Blotting检测MSI-1蛋白表达
培养72h后吸弃6孔板中的培养基，PBS洗涤3次，加入RIPA蛋白裂解液(100ul/孔)，吹打数次，冰上孵育5min，使之充分裂解，4℃，12000转离心5分钟，收集上清，分装-20℃贮存；每个样品95℃变性5min后取10ul上样，8％SDS-PAGE电泳，200V，10min；100V，100min；转至PVDF膜：110V，120min；用含5％脱脂奶粉的TBS封闭液封闭60min；一抗孵育：MSI-1一抗(1：2000)、GAPDH一抗(1：5000)室温下孵育2h；TBS洗膜10min×3次；二抗孵育：辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗(1：10000)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)二抗(1：10000)孵育1h；TBST洗膜10min×3次，TBS洗膜10min×1次；ECL显影后，用ImageQuant LAS4000mini(GE Healthcare)对图象扫描处理。
结果：如图3、图4所示，与阴性对照相比，S2转染后，A2780细胞和A2780/Taxol细胞中MSI-1蛋白表达显著下降(P﹤0.05)，且与S1和S3相比有显著差异(P﹤0.05)。结果表明，在A2780和紫杉醇耐药株A2780/Taxol中，S2对MSI-1的蛋白表达具有最好的干扰效果。故经过筛选，S2被选择作为后续研究的siRNA。
实施例3.筛选和优化S2干扰MSI-1基因表达的作用剂量
研究发现，越是小剂量能高效起到干扰效果的片段，特异性越高，同时对细胞的毒副作用也越小。因此在实施例2中筛选获得了干扰效果最好的siRNA片段(S2)的基础上，需要进一步优化S2的转染剂量，使之达到最佳量效比。该部分设立了50nM，10nM，2nM，400pM，80pM五个剂量梯度转染细胞。
一、实验分组：
1.A2780正常组(不转染siRNA)，以下称作A；
2.A2780阴性对照组(转染阴性对照siRNA)，以下称作A-N；
3.A2780实验组1(转染50nM S2)；
4.A2780实验组2(转染10nM S2)；
5.A2780实验组3(转染2nM S2)；
6.A2780实验组4(转染400pM S2)；
7.A2780实验组5(转染80pM S2)；
8.A2780/Taxol正常组(不转染siRNA)，以下称作AR；
9.A2780/Taxol阴性对照组(转染阴性对照siRNA)，以下称作AR-N；
10.A2780/Taxol实验组1(转染50nM S2)；
11.A2780/Taxol实验组2(转染10nM S2)；
12.A2780/Taxol实验组3(转染2nM S2)；
13.A2780/Taxol实验组4(转染400pM S2)；
14.A2780/Taxol实验组5(转染80pM S2)。
二、分组转染
转染过程同前。转染48h后检测MSI-1mRNA表达，72h后检测MSI-1蛋白表达。
三、实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测MSI-1基因mRNA表达
细胞转染后继续培养48h，抽提总RNA，经过RNA变性、逆转录后取1ul逆转录产物进行荧光定量PCR反应，具体步骤和反应体系同前。采用2-△CT法计算各组样本中MSI-1mRNA的表达量。
结果：如图5所示，A2780细胞中，当S2的剂量为50nM，10nM，2nM时，MSI-1mRNA的表达量分别下降了95.78％，94.72％和91.25％，三种剂量之间无明显差异；当S2的剂量400pM，80pM时，MSI-1mRNA的表达量分别下降了73.45％和56.71％，提示S2在低浓度(2nM)时有最高的量效比，能抑制超过90％MSI-1mRNA的表达，同时我们也发现，即使在极低的转染浓度(80pM)时，S2仍然能对MSI-1mRNA的表达达到近50％的抑制效果，是特异性和效果非常好的干扰片段。
同样如图6所示，在A2780/Taxol细胞中，当S2的剂量为50nM，10nM，2nM时，MSI-1mRNA的表达量分别下降了95.74％，94.15％和92.29％，三种剂量之间无明显差异；当S2的剂量400pM，80pM时，MSI-1mRNA分别下降了72.61％和51.20％，提示在A2780/Taxol细胞中，2nM仍然是最高量效比的浓度。
四、Western Blotting检测MSI-1蛋白表达
细胞转染后培养72后，抽提蛋白，8％SDS-PAGE电泳，转膜，一抗孵育，二抗孵育，ECL显影后分析图像，具体步骤同前。
结果：如图7所示，A2780细胞中，当S2的剂量为50nM，10nM，2nM时，MSI蛋白表达量与阴性对照相比，分别下降了93.84％，94.02％和91.23％，三种剂量之间无明显差异；当S2的剂量400pM，80pM时，MSI-1蛋白表达量分别下降了69.87％和58.91％。
同样如图8所示，在A2780/Taxol细胞中，当S2的剂量为50nM，10nM，2nM时，MSI-1蛋白表达量与阴性对照相比，分别下降了92.15％，91.87％和91.03％，三种剂量之间无明显差异；当S2的剂量400pM，80pM时，MSI蛋白分别下降了61.13％和50.66％。
以上结果显示，当S2的剂量为2nM时，无论在mRNA水平还是在蛋白水平都能特异性、高效抑制MSI-1基因的表达。
实施例4.真核载体pLKO.1-MSI-1-S2的构建及对MSI-1基因表达的干扰效果检测
一、实验分组：
1.A2780正常组(不转染任何载体)，以下称作A；
2.A2780阴性对照组(转染pLKO.1puro空载体)，以下称作A-N；
3.A2780实验组1(转染pLKO.1-MSI-1-S2)；以下称作A-S2；
4.A2780/Taxol正常组(不转染任何载体)，以下称作AR；
5.A2780/Taxol阴性对照组(转染pLKO.1puro空载体)，以下称作AR-N；
6.A2780/Taxol实验组1(转染pLKO.1-MSI-1-S2)；以下称作AR-S2；
二、合成MSI-1-S2片段
选择Age I和EcoR I两个酶切位点，根据S2的序列，设计其shRNA序列并构建到真核表达载体pLKO.1puro中。序列如下：
正义链
5’-CCGGTGAATTTCACACACTTTCTCCACTTCAAGAGAGTGGAGAAAGTGTGTGAAATTCATTTTTTGGTACC-3’
反义链
5’-AATTGGTACCAAAAAATGAATTTCACACACTTTCTCCACTCTCTTGAAGTGGAGAAAGTGTGTGAAATTCA-3’
三、真核载体pLKO.1-MSI-1-S2的构建
用真核表达载体pLKO.1puro构建pLKO.1-MSI-1-S2重组表达载体(图9和10)，具体方法参见美国冷泉港出版社《分子克隆实验指南》。
将MSI-1-S2正义链和反义链经退火程序(95℃变性2min；缓慢冷却退火至25℃)，4℃保存。Age I和EcoR I完全酶切载体pLKO.1puro，37℃过夜；酶切产物用DNA凝胶回收试剂盒回收DNA。退火产物与载体酶切回收片段进行连接反应，反应体系(10ul)：T4连接酶1ul，T4连接酶缓冲液1ul，退火产物与载体酶切回收片段混合物(摩尔比3:1)；去离子水补至10ul，16℃连接过夜；取5ul连接产物置于100ul JM109感受态细菌中，冰浴30min，42℃热休克90s，冰浴5min，加LB培养基1000ul，37℃摇床培养30min，5000rpm离心5min，弃上清，将细菌均匀涂布于LB平板上(含50ug/ml氨苄青霉素)，37℃倒置培养过夜；挑选若干独立菌落接种于含相应抗性的LB培养基中，37℃震荡过夜扩菌；收集细菌，用质粒DNA纯化试剂盒抽提获得质粒DNA，Kpn I酶切鉴定，获得pLKO.1-MSI-1-S2重组质粒。
四、pLKO.1-MSI-1-S2重组质粒转染细胞后观察干扰效果
将pLKO.1-MSI-1-S2转染入对数生长期的A2780及A2780/Taxol细胞中。转染参照Lipofectamine3000操作说明书，每孔用125μl无血清OPTI-MEM培养基稀释5ulLipofectamine 3000试剂并充分混匀；在125μl无血清OPTI-MEM培养基中加入5ug重组质粒DNA，加入P3000试剂10ul，充分混匀，制备重组质粒预混液；在已稀释的Lipofectamine3000试剂中加入重组质粒预混液(1:1)，室温孵育5mim；最后将重组质粒-脂质体复合物250ul加入细胞中，37℃，5％的CO2中继续培养。72h后检测MSI-1蛋白表达。
如图11和图12所示，转染pLKO.1-MSI-1-S2重组质粒后，与阴性对照(转染空质粒)相比，A2780细胞和A2780/Taxol细胞中MSI-1蛋白表达均显著下降(P﹤0.05)，结果表明，在A2780和紫杉醇耐药株A2780/Taxol中，转染pLKO.1-MSI-1-S2重组质粒能有效干扰MSI-1的蛋白表达。
实施例5.pLKO.1-MSI-1-S2特异性阻断MSI-1表达后对肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响
一、实验分组：
1.A2780正常组(不转染任何载体)，以下称作A；
2.A2780阴性对照组(转染pLKO.1puro空载体)，以下称作A-N；
3.A2780实验组1(转染pLKO.1-MSI-1-S2)；以下称作A-S2；
4.A2780/Taxol正常组(不转染任何载体)，以下称作AR；
5.A2780/Taxol阴性对照组(转染pLKO.1puro空载体)，以下称作AR-N；
6.A2780/Taxol实验组1(转染pLKO.1-MSI-1-S2)；以下称作AR-S2。
二、分组转染
转染步骤同前，转染后继续培养细胞，用于检测细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭。
三、细胞增殖试验
细胞在96孔板中转染pLKO.1-MSI-1-S2后继续培养72h，每孔加入10ulBrdU标记液至BrdU终浓度为10uM，37℃孵育2h；吸除BrdU标记液，每孔加入200ul FixDenat，20℃孵育30min；吸除FixDenat，每孔加入100ul anti-BrdU-POD，20℃孵育90min；每孔200ulWashing Solution洗涤3次；加入100ul/孔底物溶液，20℃孵育20min，检测波长370nm(参考波长492nm)测吸光度(A)，细胞增殖的能力用A实验组/A对照组表示。
结果如图13和图14所示，在A2780和A2780/Taxol细胞中，转染pLKO.1-MSI-1-S2后，相差显微镜下观察可见，实验组细胞数量明显减少，悬浮细胞数量增加，可见较多细胞碎片；溴标法测试细胞增殖结果也显示：与阴性对照相比，A2780和A2780/Taxol实验组细胞增殖能力分别下降了72.60％和65.02％，有显著性差异(P＜0.05)。说明特异性阻断MSI-1的表达后，能抑制肿瘤细胞增殖。
四、Caspase3活性检测细胞凋亡
转染72h后收集细胞，裂解液调整细胞密度为1×108/ml，冰上裂解15min，15000g×20min，收集上清。按照CaspACE Assay System(colorimetric)说明书同时制备阳性和阴性对照样品，测定并调整各组蛋白浓度相同。96孔板中每孔加入Caspace AssayBuffer32ul，DMSO2ul，100nM DTT 10ul，去离子水调整体积为98ul，加入2ul DEVD-pNA底物，37℃孵育4h，检测波长405nM测吸光度，用ΔA法计算每组样品Caspase3活性。
结果如图15所示，A2780和A2780/Taxol细胞转染pLKO.1-MSI-1-S2后，Caspase3活性分别增加了2.29倍和2.33倍，与阴性对照比较，均有显著性差异(P＜0.05)说明特异性阻断MSI-1的表达后，能促进肿瘤细胞凋亡。
五、细胞划痕试验检测细胞迁移能力
在六孔板背后用直尺均匀划横线，约0.5cm划一道，横穿过孔，每孔至少有6条横线。细胞转染pLKO.1-MSI-1-S2后，继续培养24h细胞融合成单层状态时，在选定区域用200ul的枪头在六孔板中垂直划痕，PBS洗3次去除划下的细胞，加入无血清培养基继续培养。0h，24h，48h时间点拍照，随机选取6条水平线，计算细胞间距离均值。
结果如图16和图17所示，pLKO.1-MSI-1-S2转染细胞24h和48h后，A2780和A2780/Taxol细胞间距离显著大于阴性对照组，细胞划痕后愈合能力显著下降，说明特异性阻断MSI-1的表达后，能抑制肿瘤细胞的迁移。
六、Transwell试验检测细胞迁移能力
细胞转染48h后，用胰酶消化收集，用无血清培养基重悬，调整细胞密度为5×105/ml，上室加2ml细胞悬液，下室加10％FBS完全培养基2ml，继续培养24h，取出小室，PBS洗3次，用棉签小心去除上室上层表面的细胞，倒置晾干，95％乙醇固定25min，苏木素染色，显微镜下观察、计数、拍照。每个小室计数10个视野，取平均值统计并分析细胞迁移能力的改变。
细胞迁移实验结果如图18所示，转染pLKO.1-MSI-1-S2后，A2780实验组与阴性对照组穿透小室的细胞数量分别是272±25与81±11，两者有统计学差异(P＜0.05)；A2780/Taxol实验组与阴性对照组穿透小室的细胞数量分别是239±21与69±12，两者有统计学差异(P＜0.05)；该结果表明，特异性阻断MSI-1的表达后，能抑制肿瘤细胞的迁移。
七、Transwell试验检测细胞侵袭能力
将-20℃保存的基质胶先在4℃复温液化，取基质胶与OPTI-MEM以1:6冰上混匀稀释，包被小室底部膜的上室面，37℃固化30min，吸除小室内析出的液体。基质胶包被后其余步骤同上，每个小室计数10个视野，取平均值统计并分析细胞侵袭能力的改变。
细胞侵袭实验结果如图19所示，A2780实验组与阴性对照组穿透小室的细胞数量分别是178±19与33±5，两者有统计学差异(P＜0.05)；A2780/Taxol实验组与阴性对照组穿透小室的细胞数量分别是162±21与37±6，两者有统计学差异(P＜0.05)；该结果表明，特异性阻断MSI-1的表达后，能抑制肿瘤细胞浸润。
实施例6.pLKO.1-MSI-1-S2特异性阻断MSI-1表达后对卵巢癌耐药的逆转作用
一、实验分组：
1.A2780正常组(不转染任何载体)；
2.A2780/Taxol正常组(不转染任何载体)；
3.A2780/Taxol阴性对照组(转染pLKO.1puro空载体)；
4.A2780/Taxol实验组(转染pLKO.1-MSI-1-S2)。
二、分组转染
转染步骤同前，转染后继续培养细胞24h。
三、转染pLKO.1-MSI-1-S2后细胞对紫杉醇敏感性的检测
各组取对数生长期细胞，胰酶消化后细胞重悬，细胞计数并调整细胞悬液的密度为1×105/ml，接种到96孔板继续培养24h。次日，各组中加入紫杉醇，浓度梯度分别设200ug/ml，100ug/ml，50ug/ml，25ug/ml，12.5ug/ml，6.25ug/ml，3.125ug/ml，0ug/ml，作用24h后，用溴标法在波长370nm(参考波长492nm)测吸光度(A)，计算紫杉醇对每组细胞的抑制率，抑制率＝A实验组/A阴性对照组。每个浓度设3个复孔，取平均值。
抑制率为50％时的药物浓度为半数抑制浓度(IC50)；
耐药株A2780/Taxol的IC50与其亲本细胞株A2780的IC50的比值为耐药倍数(Resistant Folder,RF)；
耐药株A2780/Taxol的IC50与其转染pLKO.1-MSI-1-S2(逆转剂)后的IC50的比值为耐药逆转指数(Reversal Index,RI)。
结果如表2和表3所示，A2780/Taxol对紫杉醇的IC50(38.95±3.87ug/ml)显著高于亲本A2780对紫杉醇的IC50(1.302±0.24ug/ml)，耐药倍数高达29.92，提示A2780/Taxol对紫杉醇的敏感性显著低于亲本细胞A2780，高度耐药。而当A2780/Taxol转染pLKO.1-MSI-1-S2之后，对紫杉醇的敏感性明显提高(4.32±0.96ug/ml)，pLKO.1-MSI-1-S2对A2780/Taxol紫杉醇耐药的逆转效果非常明显，逆转指数为9.08。
表2.A2780及A2780/Taxol对紫杉醇的药物敏感性
表3.转染pLKO.1-MSI-1-S2后A2780/Taxol对紫杉醇药物敏感性的逆转
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<110> 浙江大学
<120> 特异性抑制MSI-1基因表达的siRNA及其重组载体和应用
<130>
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
aauuucacac acuuucucca c 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
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ggagaaagug ugugaaauuc a 21
<210> 3
<211> 2989
<212> DNA
<213> MSI-1
<400> 3
cttcgccgcg ctcctcatct gccccgcgcc gagcgccgcc gccgccgccg ccgccgccgc 60
tccgctgccc gcgccgcccg cggctcccga tggagactga cgcgccccag cccggcctcg 120
cctccccgga ctcgccgcac gacccctgca agatgttcat cgggggactc agttggcaga 180
ctacgcagga agggctgcgc gaatacttcg gccagttcgg ggaggtgaag gagtgtctgg 240
tgatgcggga ccccctgacc aagagatcca ggggtttcgg cttcgtcact ttcatggacc 300
aggcgggggt ggataaagtg ctggcgcaat cgcggcacga gctcgactcc aaaacaattg 360
accctaaggt ggccttccct cggcgagcac agcccaagat ggtgactcga acgaagaaga 420
tctttgtggg ggggctgtcg gtgaacacca cggtggagga cgtgaagcaa tattttgagc 480
agtttgggaa ggtggacgac gccatgctga tgtttgacaa aaccaccaac cggcaccgag 540
ggttcgggtt tgtcacgttt gagagtgagg acatcgtgga gaaagtgtgt gaaattcatt 600
ttcatgaaat caacaacaaa atggtggaat gtaagaaagc tcagccaaag gaggtgatgt 660
cgccaacggg ctcagcccgg gggaggtctc gagtcatgcc ctacggaatg gacgccttca 720
tgctgggcat cggcatgctg ggttacccag gtttccaagc cacaacctac gccagccgga 780
gttatacagg cctcgcccct ggctacacct accagttccc cgaattccgt gtagagcgga 840
cccctctccc gagcgcccca gtcctccccg agcttacagc cattcctctc actgcctacg 900
gaccaatggc ggcggcagcg gcggcagcgg ctgtggttcg agggacaggc tctcacccct 960
ggacgatggc tccccctcca ggttcgactc ccagccgcac agggggcttc ctggggacca 1020
ccagccccgg ccccatggcc gagctctacg gggcggccaa ccaggactcg ggggtcagca 1080
gttacatcag cgccgccagc cctgccccca gcaccggctt cggccacagt cttgggggcc 1140
ctttgattgc cacagccttc accaatgggt accactgaag caggggacgg tggcaggagc 1200
gccccagcct gcagctgact gaggaccacg agtgagccag cgagggggcg ggagacctca 1260
gccgcagccg ccgccccctc ccctgcagcg actcggaccc gctactgcct gcccccaact 1320
ccccgggccc ggcccctgcc ctgctgcccc caacagcgtc tggctcccct actaacgtcc 1380
ccctcttcgc ccttgccccc atccccaccc gcccctctcc cggccctgct tttatttatt 1440
ttggattagc cggttgccca ccccagccct ctggtccatc cctccctccg tgccgcgccc 1500
ccctaggacc gccccctccc caaaaggctt ttggatttgt gcatagctgg agtgaaggcg 1560
gagggagcct gctacaggcc gcagcccaac ccctgttttt tattcagatt tcccctcctt 1620
taccctttcc cttttttttt tttttttttt ttttaaagaa acctttttta aactatttct 1680
aggtttgtga atgtgaagcc ccaggccgca gggggcaagg ggccaggtgc cccccaccag 1740
ctgagaacaa agtgtctatc tgggtgtggg cccctggccg cctccctcca gccctggaga 1800
ggagggcagg gctgcgggga ggccaggccg agcccctgga accatcccgt cctgtatcat 1860
atgtaaatac tgtgaggtga tgtgcccacc cctctctaag acccctcggg ggtgaggggc 1920
tcccccctcc cctgtttctg tcccctcaga caccgttact gtaagcttgc aggcctcagc 1980
tgtggccacg gcaggcccgc tctctcaggc cctcagggtc aaggccttgg ttggacctgc 2040
ccactccaaa aacccagtgt gggggcaaag ggcgtgggaa gagcagggct tgcccagcga 2100
cactgctgga caggaattaa ctctccaaag gtctcccctg ctccctacct aggttggggc 2160
ttcatggttt ctgctcagtc tgtccccctt ccccctcgac ccccgcaatg agtgggcacc 2220
aggggacgct ctggcgaggg cagaccccag gggaaagcaa agggcgtctc agggaacccc 2280
cacattctct cactgaagtt tcccaccagg atgaccccac agccagagtc ccttggcagc 2340
ccctcacccc agacccccct tctaaggaaa aagagaggtt cagagcgttg gaccttcatg 2400
aacagtggcc tggctggcgt ggcagggcca aggcccaccc actgccatcc cccttctgtg 2460
tgtccctctc ccccagttat gaggcccagg gcctgagctc tcttccccag cattgccccc 2520
acccggaaac cccacctttg gagagttaat tgtctgtgtg aggtgcttaa cctatcagcc 2580
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tttttttttt ttaatgtttc ctaataaaag agaagctgca ttttattggt ttttattttt 2700
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gacccttcca ccccactggg cccaaccatg ggctcaggac cctggaattc cgttttctga 2820
tttgctttgg gatttttttt ttttttaaga tgttacatgg tgtttcgaag ccagcaagtt 2880
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<400> 9
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tgtgaaattc a 71

Claims (10)

1.特异性抑制MSI-1基因表达的siRNA，包括正义链和反义链，其特征在于，所述正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述正义链和反义链的5’和3’端的3个碱基进行2’-甲氧基-4’-硫代修饰。
3.如权利要求1或2所述的siRNA在制备MSI-1基因表达抑制剂中的应用。
4.如权利要求1或2所述的siRNA在制备治疗卵巢癌药物中的应用。
5.如权利要求1或2所述的siRNA在制备逆转卵巢癌紫杉醇耐药的药物中的应用。
6.一种包含编码如权利要求1或2所述siRNA的DNA序列的RNA干扰试剂盒。
7.一种含有编码如权利要求1或2所述siRNA的DNA序列的重组载体。
8.如权利要求7所述的重组载体在制备MSI-1基因表达抑制剂中的应用。
9.如权利要求7所述的重组载体在制备治疗卵巢癌药物中的应用。
10.如权利要求7所述的重组载体在制备逆转卵巢癌紫杉醇耐药的药物中的应用。
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