CN106282385B - 长链非编码rna xloc_000090在肺癌中的鉴定和用途 - Google Patents

长链非编码rna xloc_000090在肺癌中的鉴定和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及长链非编码RNA XLOC_000090在肺癌中的鉴定和用途。长链非编码RNA XLOC_000090表达基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1。本发明探讨了XLOC_000090表达与NSCLC侵袭转移和预后的相互关系。通过基因芯片技术筛选出10对肺癌组织及其对应的正常肺组织中差异表达的lncRNA，其中发现XLOC_000090在肺癌中的表达明显高于正常肺组织中的表达。因此，本发明公开的长链非编码RNA XLOC_000090表达基因可以用于检测肺癌细胞是否转移方面。

Description

长链非编码RNA XLOC_000090在肺癌中的鉴定和用途
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，涉及XLOC_000090表达与NSCLC侵袭转移和预后的相互关系，更具体的说是一种长链非编码RNA XLOC_000090在肿瘤中的鉴定和用途。
背景技术
肺癌目前是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。非小细胞肺癌（non-smallcell lung cancer，NSCLC）在肺癌中约占了80%-85%，其5年生存率仅为15%左右，NSCLC之所以有如此高的死亡率，是因为早起缺乏特异性诊断方法而难以发现，确诊时70%-80%的患者已出现远处转移，失去手术机会。如何有效地预防和治疗手术后非小细胞肺癌的复发和转移，已成为亟待解决地重要问题。大量的研究发现，在人类基因组中，仅不到2%的转录产物具有蛋白质编码功能，其余大部分均为非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA），根据核苷酸序列的长度，一般将长度>200个核苷酸的ncRNA定义为长链非编码RNA（long non-codingRNA，lncRNA）。随着近年来研究的深入，人们发现lncRNA参与了表观遗传、转录及转录后调控等多种途径的基因调控，尤其是肿瘤的发生、发展过程与肿瘤的增殖、侵袭、转移等生物学行为密切相关，成为近些年来研究的热点。
我们通过基因芯片技术筛选出10对肺癌组织及其对应的正常肺组织中差异表达的lncRNA，其中发现XLOC_000090在肺癌中的表达明显高于正常肺组织中的表达，检索Pubmed及相关数据库发现，XLOC_000090在肿瘤中的功能未见报道。
发明内容
本发明探讨了XLOC_000090表达与NSCLC侵袭转移和预后的相互关系。为此
本发明公开了一种长链非编码RNA XLOC_000090表达基因，其特征在于RNA XLOC_000090基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1。
本发明进一步公开了长链非编码RNA XLOC_000090表达基因在用于检测肺癌细胞是否转移方面的应用。特别是治疗非小细胞肺癌治疗靶点药物中的应用。
本发明公开的长链非编码RNA XLOC_000090表达基因序列如下：
ATTTGACCCTCTGCAGGAGGTGTGCTGAATGTCCCATTCCCCGGTGCTGCCAGCTCCTCAGAGCTCTGTAGGTTACCCCGTGAGACCTTCTCCCTGCACGCCTTTTTTTCTCTAATAGAAATACCTGCTACCTGTTGCCTTCTTCCCTGCAGGATCACAAGCGCTTGCCCAGTGCCTGGCATAGAGGCGGCCATAGCTGGACTCCTACCCTGTTCCAGATGAGGAAACTGCCGCTCAGAGACGGCAGCCGACCCAGCCAAGGCCGCACAGCCAGGATTCAAAGCCATACCGCTCAGCTCCTGCCTCCAGGCTCTGCCTTTGCATGTGGCTTCTCCTGGCTCCTGGACCCTTCCCCGGCCCTCCCAGCTGGCTGTGCTGTGACAGTGGGCGGGGGAGTGCCAAGGCTCTGCCCTGCCCCCCGCCCTTGGCATCTCCGGTCAATATGGCACTCACAGCTCCCTGGGCATGGACCCCCTCCTGCCATCCCCACTTAAAGTGAT
附图说明：
图1为XLOC_000090在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义；其中a为 XLOC_000090在癌和正常组织中的表达； b为 XLOC_000090在不同肿瘤大小中的表达； c为XLOC_000090在阳性和阴性淋巴结中的表达； d 为XLOC_000090在不同分期中的表达；
图2为XLOC_000090对细胞增殖能力的影响；其中a 为抑制XLOC_000090后对A549细胞增殖能力的影响； b 过表达XLOC_000090后对A549细胞增殖能力的影响；
图3 为上调或下调XLOC_000090对A549细胞克隆形成能力的影响；
图4 为XLOC_000090对细胞迁移能力的影响，其中（A）为过表达XLOC_000090后对A549细胞迁移的影响；（B）抑制XLOC_000090后对A549细胞迁移的影响；（C）过表达XLOC_000090后对H1299细胞迁移的影响；（D）抑制XLOC_000090后对Calu3细胞迁移的影响；
图5为XLOC_000090对细胞迁移和侵袭能力的影响，其中为（A）抑制XLOC_000090后对A549细胞迁移和侵袭的影响；（B）抑制XLOC_000090后对Calu3细胞迁移和侵袭的影响；（C）过表达XLOC_000090后对A549细胞迁移和侵袭的影响；（D）过表达XLOC_000090后对H1299细胞迁移和侵袭的影响；
图6为裸鼠尾静脉注射过表达XLOC_000090的A549细胞后，肺表面的转移结节和对照组之间的比较。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。
实施例1
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2008年2月至2010年12月天津医科大学肿瘤医院118例非小细胞肺癌患者癌组织及其对应的正常肺组织（外科手术切除病理证实为非小细胞肺癌，全体患者均签署了知情同意书，随访资料完整并建立患者临床病历资料数据库）。
纳入标准：
（1）经完全性手术切除（肺叶切除术或全肺切除术加肺门/纵膈淋巴结清扫术）；
（2）且病理证实为非小细胞肺癌。
排除标准：
（1）术前化疗或放疗；（2）手术切缘阳性；（3）术后1个月内死亡的非小细胞肺癌患者。基于纳入和排除标准，共有118例非小细胞肺癌患者纳入了本研究。所有患者均为中国人。其中男76例，女42例；年龄31～79岁，平均(58.0±9.4)岁。肿瘤分期根据第七版的TNM分期如下：I 期45例，II期29例，III期40例，IV期4例。末次随访日期为2010年12月，中位随访时间达46.0个月。
1.2 细胞系和主要试剂
人肺癌细胞株A549、Calu3和H1299购于中国典型培养物保藏中心；胎牛血清购于美国Gibco公司；RPMI-1640和MEM培养基购于美国Hyclone公司，SYBRGreen PCR试剂盒购于美国Thermo公司；Transwell小室购于康宁生命科学有限公司；XLOC_000090的shRNA购于OriGene公司。
1.3 细胞培养
人肺癌细胞株A549、Calu3和H1299的培养条件为含有10%胎牛血清的RPMI-1640或MEM培养基，37℃下在含有5%CO2的培养箱中培养。
1.4 细胞转染
用表达XLOC_000090的慢病毒分别转染A549和H1299细胞，用表达特异性抑制XLOC_000090基因shRNA(short hairpin RNA)的慢病毒转染病毒转染A549和Calu3细胞。
1.5 RT-PCR 应用
实时定量RT-PCR检测转染细胞和组织中XLOC_000090的表达，转染后48h收集各组细胞，利用TriZol法提取细胞和组织中总RNA,用分光光度计定量检测。RNA样品用逆转录反应合成cDNA后，用SYBRGreen PCR试剂盒检测样本中XLOC_000090含量。反应条件为95℃预变性10min，95℃、15s，60℃、45s，40个循环，反应结束后得到各个标本和内参GAPDH的基本循环数（Ct值）。根据公式计算目的基因相对含量（RQ值），即为XLOC_000090相对含量，实验重复三次。
1.6 细胞增殖实验
每块板设置对照组和实验组。将处于对数生长期的对照组和实验组的细胞株，胰蛋白酶消化，稀释细胞使其浓度为1×104～5×104个细胞/ml培养液，分别取100ul至96孔培养板，每种细胞每块板接种3个同样的孔作为复孔，1×103～5×103个细胞/孔，以100ul培养液做空白对照，37℃培养过夜。每个孔加入20ulMTT，37℃，5%CO2孵育4h后，倒掉每个孔中的培养基，加入150ulDMSO,采用微板分光光度计测定450nm波长吸光度。记录每块板的数值，制作细胞生长曲线。
1.7 Transwell侵袭实验
实验前24 h将不同分组的细胞换成无血清DMEM培养基，继续培养；接种前将24孔板和Transwell小室用1×PBS浸泡5min湿润小室；消化细胞，用无血清DMEM培养液洗涤细胞，用含有1％胎牛血清的DMEM重悬细胞，计数，稀释到1×105个细胞/ml，接种到Transwell小室内，每个小室加0.5ml细胞悬液，下层的24孔板中加入0.75ml含10%胎牛血清的DMEM培养基，每组3个复孔，置于37℃培养箱中培养48h；每孔加入1ml4%甲醛溶液，室温固定10min；吸去固定液，用1×PBS洗涤1次，每孔加1ml0.5%结晶紫溶液，染色30min后用1×PBS洗涤3次，晾干；用棉签小心擦去Transwell小室内没有迁移的细胞，置于显微镜下观察，计数每个视野中的细胞数。
1.8 细胞划痕实验
对照组和实验组细胞消化计数后取8×105个分入35 mm2培养皿中培养。在盘底用记号笔画线作为标记，吸去培养液，用200ul枪头垂直于记号笔标记划去盘中细胞。用PBS冲洗去除划下的细胞，加入无血清培养液继续培养。在0h、48h分别拍照，拍照时选取记号笔画的线和细胞划痕的交点作为观察点，以定点观察。
1.9 裸鼠尾静脉注射体内转移实验
10只雄性裸鼠（5周龄）购自中国科学院（上海，中国），SPF级饲养。将10只裸鼠分为两组，一组尾静脉注射转染空载体（PCDH）的A549细胞，一组尾静脉注射转染XLOC_000090的A549细胞，胰酶消化细胞，PBS洗涤，重悬细胞浓度为2×107/ml。100ul重悬A549细胞注入裸鼠尾静脉。注射后6周处死裸鼠并对其进行解剖，将肺取出拍照，计数肺表面转移结节。本研究严格按照美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南。该研究经天津医科大学肿瘤医院动物实验伦理委员会批准。所有实验过程均在戊巴比妥钠麻醉下进行以尽量减少痛苦。
2.0 统计学处理
采用SPSS 17.0统计学软件进行分析，论文中的实验结果均为3次重复实验的平均值，t检验评估统计学差异，P<0.05为差异有统计学意义。
结果
2.1 临床样本中XLOC_000090的表达情况
运用RT-PCR方法检测发现，XLOC_000090在肺癌癌组织中的表达高于正常肺组织（图
1a），而XLOC_000090的表达高于在不同大小肿瘤中的表达没有差异（图1b），有淋巴结转移患者中XLOC_000090的表达高于没有淋巴结转移患者（图1c），III/IV期肺癌患者中XLOC_000090的表达高于I/II期患者（图1d）。表1显示XLOC_000090在肺癌组织中的表达与性别、淋巴结转移和病理分期相关（表1）：
表 1. XLOC_000090表达与临床病理特征的相关性
2 XLOC_000090在肺癌中的预后意义
单因素分析显示性别、病理分期和XLOC_000090和预后相关（表2）：
表 2 无病生存期和总生存期的单因素分析.
将性别、病理分期和XLOC_000090纳入多因素分析，可以看出病理分期和XLOC_000090是独立预后因子（DFS:危险比：1.921，95%置信区间：1.205-3.060，P=0.006；OS：危险比：2.154，95%置信区间：1.343-3.453，P=0.001和DFS:危险比：1.452，95%置信区间：1.189-1.923，P=0.018；OS：危险比：1.468，95%置信区间：1.203-1.898，P=0.023）（表3 ）：
表 3无病生存期和总生存期的多因素分析：
2.3 上调XLOC_000090或干扰下调XLOC_000090对细胞增殖的影响
A549细胞shRNA质粒3d后铺96孔板，连续培养5天，MTT法连续监测细胞增殖能力。结果显示，与shRNA对照组相比，XLOC_000090干扰组与空载体对照组的肺癌细胞增殖能力无显著变化（图2a），相似的，上调XLOC_000090表达后，与对照组相比，转染表达XLOC_000090组的细胞增殖能力并无差异（图2b）。与MTT结果一致，克隆形成实验的结果显示XLOC_000090并不能影响细胞的增值（图3）。
2.4 上调XLOC_000090或干扰下调XLOC_000090对细胞迁移的影响
通过细胞划痕修复实验，观察质粒肺癌细胞迁移能力受转染XLOC_000090的干扰程度。在划痕刚开始及开始后48h这两个时间点拍照，比较细胞迁移能力，如图4所示，与空白组相比，如上调XLOC_000090表达后，A549和H1299迁移能力增强；与空白组相比，若下调XLOC_000090表达后，A549和Calu3细胞迁移能力下降。
2.5 上调XLOC_000090或干扰下调XLOC_000090对细胞侵袭的影响
采用Matrigel侵袭实验检测XLOC_000090对细胞侵袭能力的影响，结果如图5。与空白组相比，如上调XLOC_000090表达后，A549和H1299侵袭能力增强；与空白组相比，若下调XLOC_000090表达后，A549和Calu3细胞侵袭能力下降，差异均有统计学差异（P<0.05）。
结果提示XLOC_000090能在肺癌细胞的侵袭中发挥促进作用。
2.6 XLOC_000090在裸鼠体内对肺癌细胞转移的影响
如图6所示，与空白对照组相比，转染XLOC_000090的A549细胞在裸鼠体内形成更多的转移结节，差异具有统计学差异（P<0.05）。
3 讨论
lncRNA的转录本长度大于200 nt，一般不编码蛋白或编码蛋白能力有限，近年来的研究发现长链非编码RNA与微小RNA 一样也具有重要的生物学功能与人类基因调节、细胞生长分化以及肿瘤疾病的发生发展有着密切的联系。lncRNA的异常表达与肺癌的发病机制、治疗及预后等关系密切。
lncRNA对肿瘤侵袭转移的影响即表现在对转移起促进作用的基因的激活，又表现在对转移起抑制作用的基因的失活。文献还报道了一些与NSCLS迁移侵袭相关lncRNA，如肿瘤组织中表达上调的结肠癌相关的转录物2、ghrelin受体基因反义链及表达下调的GAS6反义RNA1［1-3］，这些lncRNA的表达紊乱均与NSCLC的淋巴结转移及预后不良密切相关，其中研究较多的当属肺腺癌转移相关转录子（metastasis-associated lung adenocarcinomatranscript 1, MALAT1），MALAT1是一个长度超过8000nt的lncRNA，基因组中定位于11q13.1[4]，在NSCLC中表达上调[5]。NSCLC中 MALAT1的表达具有病程和组织特异性，在有远处转移的患者肿瘤标本中MALAT1表达水平显著上调，并与患者的TNM分期、转移等密切相关，可作为NSCLC早期诊断及预后的分子标记物[6]。MALAT1发挥作用可能是与未甲基化的Pc2(CBX4)作用调节Pc2绑定的转移相关靶基因的转录。在核斑中，MALAT1能与多种SR蛋白绑定，调节其表达和磷酸化水平或调控某些前体mRNA的剪切活性[7]。NSCLC中MALAT1具有癌基因的特点，能促进细胞侵袭转移，从而在肺癌发病机制及治疗方案研究中具有重要意义[8]。
本发明通过基因芯片技术筛选出一系列癌和对应的正常肺组织中表达差异的lncRNA，其中差异表达明显的一个就是XLOC_000090。首先我们应用RT-PCR技术分析XLOC_000090在118经手术切除的非小细胞肺癌中的意义，发现XLOC_000090与性别、淋巴结转移和病理分期相关，XLOC_000090在淋巴结转移和晚期肺癌中的表达高于没有淋巴结转移和早期肺癌患者。并且单因素和多因素分析显示XLOC_000090能够独立预测非小细胞肺癌患者预后。接下来我们构建了上调和下调XLOC_000090的肺癌细胞系，发现XLOC_000090并不能影响肺癌细胞的增殖，但是我们发现XLOC_000090能够促进肺癌细胞的迁移和侵袭，裸鼠体内实验同样证明XLOC_000090能够促进肺癌的转移。
总之，我们的研究发现XLOC_000090能够促进肺癌的转移，XLOC_000090可成为具潜能的非小细胞肺癌治疗靶点。沉默XLOC_000090基因的表达例如设计针对XLOC_000090的单克隆抗体，患者服用针对XLOC_000090的单克隆抗体后，能够阻止或延迟肿瘤进展，从而达到改善患者预后的目的。
4 展望与小结
疾病的发生是极其复杂的过程。人们对于哺乳动物细胞内lncRNA调控机制的认识仍存在许多不明之处，关于lncRNA及其功能、调控机制的研究仅是冰山一角。随着高通量技术大量的涌现及大规模数据管理和分析方法的逐步完善，也许会发现更多的与肿瘤相关的lncRNA， lncRNA介导的基因表达调控网络及信号通路网络的构建，将深入揭示lncRNA在NSCLC发生发展中的分子机制，为lncRNA能否成为NSCLC早期诊断的分子标志、肿瘤预后指标、肿瘤分子靶向治疗的有效靶标及肿瘤个体化治疗提供新的理论基础和研究方向。鉴于lncRNA自身的特殊性其在肺癌中的研究面临很大的困难：在研究方法上，高质量数据库的缺乏、功能性lncRNA的筛查数据量大、研究手段相对较少等问题极大限制了相关的研究进展；在研究内容上，各种lncRNA在肺癌中是通过何种机制来发挥作用的，是否存在特异的信号通路和相关调节蛋白或分子，又如何解释多种lncRNA之间的交叉的基因调控网络机制？因此，在今后的研究中，我们不仅要完善lncRNA文库和动物模型的构建，提高现有检测技术的灵敏度，建立更为有效的新技术以及加强多层次多水平的研究，而且要加强对各类与肺癌相关的肿瘤标记分子的研究，同时关注多个分子间是否存在相关性，以此补充完善lncRNA在肺癌中的调控机制。相信随着lncRNA与肺癌发生发展的关系的阐明，lncRNA将可能作为一类肺癌分子标记物或治疗靶点，为肺癌的诊断和治疗提供新契机。
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SEQUENCE LISTING
<110> 天津医科大学肿瘤医院
<120> 长链非编码RNA XLOC_000090在肺癌中的鉴定和用途
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atttgaccct ctgcaggagg tgtgctgaat gtcccattcc ccggtgctgc cagctcctca 60
gagctctgta ggttaccccg tgagaccttc tccctgcacg cctttttttc tctaatagaa 120
atacctgcta cctgttgcct tcttccctgc aggatcacaa gcgcttgccc agtgcctggc 180
atagaggcgg ccatagctgg actcctaccc tgttccagat gaggaaactg ccgctcagag 240
acggcagccg acccagccaa ggccgcacag ccaggattca aagccatacc gctcagctcc 300
tgcctccagg ctctgccttt gcatgtggct tctcctggct cctggaccct tccccggccc 360
tcccagctgg ctgtgctgtg acagtgggcg ggggagtgcc aaggctctgc cctgcccccc 420
gcccttggca tctccggtca atatggcact cacagctccc tgggcatgga ccccctcctg 480
ccatccccac ttaaagtgat 500

Claims (2)

1.长链非编码RNA XLOC_000090基因在制备非小细胞肺癌治疗靶点药物中的应用；其RNA XLOC_000090基因转录的cDNA序列为SEQ ID No.1。
2.长链非编码RNA XLOC_000090基因在制备用于检测肺癌细胞是否转移的分子标记物方面的应用；其RNA XLOC_000090基因转录的cDNA序列为SEQ ID No.1。
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