CN105886507A - 长链非编码rna fam83h-as1在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，特别涉及长链非编码RNA在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。本发明通过特异性的锁核酸（LNA）改变FAM83H‑AS1的表达，降低FAM83H‑AS1表达从而抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移侵袭，促进其凋亡、阻滞细胞周期。本发明所公开的方法具有较高的抑制效率，同时水溶性好，可以自由穿入细胞膜，易被机体吸收；体内无毒性作用，具有较好的临床前景。

Description

长链非编码RNA FAM83H-AS1在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及长链非编码RNA FAM83H-AS1在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用，属于基因工程领域。

背景技术

癌症是世界范围内最常见的公共卫生问题之一，而其中肺癌是癌症相关死亡的主要原因,占所有癌症死亡的19.4%。2012年，全球大约有182万新发病例肺癌的发生。国家癌症登记中心最新数据显示：我国肺癌发病率及死亡率多年来一直位居恶性肿瘤之首，死亡率目前已攀升至37.00/10 万人，严重威胁我国人民健康。据估计，到2045年，我国因肺癌致死的人数将高达1800万。肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，非小细胞肺癌占所有肺癌的85%，可分为鳞癌、腺癌、大细胞肺癌等。

目前针对非小细胞肺癌的治疗包括化疗、放疗和手术切除。但许多患者在诊断时已发生转移，往往失去手术机会，而针对肺癌的化疗方案效果亦欠佳，五年生存率低于15%，亟需寻找新的、有效的治疗肺癌的方法，提高病人的生存率和生活质量。

肺癌的发病机制研究在基因组水平已获得了很大进展：目前发现了EGFR、ALK、ROS1、KRAS、MET等十余种肺癌驱动基因，并针对部分突变基因成功开发了多种靶向治疗药物。尽管在临床上靶向药物的广泛应用已获得了较好疗效，但仍有近半数人群突变谱未知，且5年总体生存率仍徘徊于20-30%。在后基因组时代，RNA组学逐渐成为研究热点。

大量的高通量基因组平台数据表明超过98%的基因组转录产物为不编码蛋白的非编码RNA，其中长非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类长度大于200nt的非编码RNA。越来越多的证据表明lncRNAs在多种生物进程和疾病进展中发挥重要作用，例如免疫反应、细胞分化、代谢、肿瘤发生及发展。lncRNAs 因其在致癌与肿瘤抑制途径中显露出的潜在作用而成为肿瘤研究的新热点。

LncRNAs在肺癌中广泛表达。通过在表观遗传学、转录及转录后等多个水平调控一系列生物功能或者干扰正常功能，包括转录沉默、可变剪接等方式，lncRNAs 在肺癌的发生发展中起着重要作用。因此，lncRNAs也可能成为良好的治疗靶点候选。

随着基因工程研究的深入，科学家对运用基因工程研制肿瘤药表现出浓厚的兴趣。

在过去的20年中，RNA药物研发已投入了巨额的资本及大量的努力，然而极具吸引力的RNA靶向性疗法转化成临床益处的进展却比较缓慢。当前，仍有许多极具挑战性的疾病靶标，这些靶标用小分子或抗体难以治疗甚至无法触及。而LNA技术的出现及发展，为RNA靶向疗法前景的实现提供了关键技术。

锁核酸（locked nucleic acid，LNA）作为一种新颖的核苷酸衍生物在药学研究领域引起了人们的广泛关注，有希望成为分子水平治疗各种疾病的新突破口。它是一种特殊的双环状核苷酸衍生物，与DNA/RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架，对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力。

其具备以下优点：和DNA、RNA互补的双链有很强的热稳定性；抗3′脱氧核苷酸酶降解的稳定性；通过RHase H酶激活的ASO能有效的靶向降解核内RNA，更适合研究核内lncRNA的功能；水溶性好，自由穿入细胞膜，易被机体吸收；体内无毒性作用，生物性稳定高，在穿透细胞膜屏障与细胞内靶向位点成功相互作用方面具有高潜力，特殊的修饰方式使得LNA具有极好的药物代谢动力学和药效动力学特性；高效的自动寡聚化作用，合成方法相对简单，同时具有高灵活性，可在体内体外靶向抑制mRNA及核内lncRNA。

正因为上述优点，LNA显示出很好的应用前景。LNA在基因诊断和基因治疗的策略中具有很大的潜力。LNA技术极大地增强了寡核苷酸的亲和力，意味着以LNA为基础的药物，可以做的比基于其他化学的典型反义RNA药物短的多，同时呈现出对RNA靶标前所未有的亲和力。反过来，小尺寸与高度亲和力的独特组合，允许这一类新的反义药物能强有力地、特异性地抑制多个不同组织中的RNA靶标，而无需复杂的运载工具，这些特性只有基于LNA的药物才能实现。这意味着更强劲的药效、更好的耐受性及潜在的口服给药。LNA平台提供了高效发现和开发一类重要新药的方法，可能解决横跨数个治疗领域显著未获满足的医疗需求。

发明内容

lncRNA FAM83H-AS1位于人类染色体 8q24.3 区正链，转录本全长 2743bp，是由发明人通过综合分析正常肺组织及非小细胞肺癌组织的lncRNA 表达谱芯片数据和癌症基因图谱（TCGA）数据发现的一个显著差异高表达于肺癌组织的lncRNA。

因而长链非编码RNA FAM83H-AS1具有良好的在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用前景。

其中所述的长链非编码RNA FAM83H-AS1的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

为了实现前述应用，我们通过锁核酸序列调控FAM83H-AS1表达。具体地，这一FAM83H-AS1的特异锁核酸序列（5’ to 3’）：CTTACTGTCCATTCT，见SEQ ID NO.2。

同时，我们还请求保护SEQ ID NO.2所示特异性锁核酸在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。

以及经SEQ ID NO.2所示特异性锁核酸修饰的长链非编码RNA FAM83H-AS1（LAN-FAM83H-AS1）在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。

本发明的目的是通过下列步骤来实现的：

设计特异性的针对FAM83H-AS1的锁核酸序列，以非特异性序列NC的序列作为阴性对照，转染非小细胞肺癌细胞株 A549 细胞，起到下调FAM83H-AS1表达的作用。所述NC的序列（5’ to 3’）：AACACGTCTATACGC，见SEQ ID NO.3。

一、FAM83H-AS1在非小细胞肺癌的表达谱构建

（一）：FAM83H-AS1在正常肺组织与肺癌组织中的表达情况

1. 芯片制备及分析: 按照博奥生物有限公司的要求准备正常肺组织与肺癌组织标本，交由博奥生物有限公司进行芯片制备，人类长链非编码RNA芯片V2.0版本完成芯片分析。

2. 芯片结果 : 实验数据来自博奥公司，结果如图 1 所示。

3. 结果分析:FAM83H-AS1在肺癌中的表达量较正常肺组织中上调了 36.79 倍；提示FAM83H-AS1在肺癌中可能作为一个癌基因发挥作用。

（二）：qRT-PCR 分析FAM83H-AS1在正常肺上皮细胞株16-HBE与非小细胞肺癌细胞株中的表达量

1. 方法：Trizol 试剂提取细胞总 RNA，qRT-PCR 运用 SYBR Green PCR Master Mix(TAKARA，大连，中国 )，人 GAPDH 作为内参。

2．qRT-PCR 结果：如图 2 所示。

3. 结果分析：FAM83H-AS1在16-HBE中低表达，在常见非小细胞肺癌细胞质中高表达，与基因芯片结果一致。

二、FAM83H-AS1对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡、迁移侵袭的影响

实验分组：LNA转染A549细胞株 (A549/LNA-FAM83H-AS1)设为实验组，阴性对照（NC）转染 A549 细胞株（A549/ NC）设为对照组。

结果：实验组FAM83H-AS1表达较对照组低（图3），表明LNA-FAM83H-AS1有着较好的抑制效率。

实验一：细胞增殖相关实验

1.CCK8实验：转染前一天，2×10⁵细胞接种在6孔板上，24h后转染相应LNA。24h后悬浮细胞2×10³在细胞种在96孔板上，分别在0h，24h，48h，72h和96h测定450nm吸光度（加入CCK8试剂），完成5次CCK8检测。

2. 结果测定：如图4所示。

3. 结果分析：与对照组相比，转染LNA下调FAM83H-AS1表达后，A549细胞增殖减缓，提示下调FAM83H-AS1 表达可抑制非小细胞肺癌细胞的增殖。

实验二：细胞凋亡实验

1.流式细胞仪检测细胞凋亡：转染前一天，2×10⁵细胞接种在6孔板上，24h后转染相应LNA。24h后流式细胞术测细胞凋亡水平。

2. 结果测定：如图 5所示。

3. 结果分析：与对照组相比，转染LNA下调FAM83H-AS1表达后，A549细胞凋亡增多，提示下调FAM83H-AS1 表达可促进非小细胞肺癌细胞的凋亡。

实验三：细胞周期检测

1.流式细胞仪检测细胞周期：转染前一天，2×10⁵细胞接种在6孔板上，24h后转染相应LNA。24h 后流式细胞术测细胞周期。

2. 结果测定：如图6所示。

3.结果分析：与对照组相比，转染LNA下调FAM83H-AS1表达后，A549细胞出现G1 期阻滞增加伴S期分布减少，提示下调FAM83H-AS1 表达可影响细胞周期，抑制非小细胞肺癌细胞的增殖。

实验四：细胞划痕实验

1.划痕细胞实验：转染前一天，2×10⁵细胞接种在6孔板上，24h后转染相应LNA。24h 后划痕细胞实验检测细胞迁移能力。

2. 结果测定：如图 7 所示。

3.结果分析：与对照组相比，转染LNA下调FAM83H-AS1表达后，A549细胞划痕愈合较慢，提示下调FAM83H-AS1 表达可抑制非小细胞肺癌细胞的迁移。

实验五：Matrigel细胞侵袭实验

1.Matrigel实验：转染前一天，2×10⁵细胞接种在6孔板上，24h后转染相应LNA。24h 后Matrigel实验检测细胞侵袭能力。

2. 结果测定：如图 8 所示。

3.结果分析：与对照组相比，转染LNA下调FAM83H-AS1表达后，A549细胞穿膜数较少，提示下调FAM83H-AS1 表达可抑制非小细胞肺癌细胞的侵袭。

实验五：A549细胞异种移植小鼠实验

1.A549细胞异种移植小鼠实验：尾静脉注射对数生长期A549细胞株建立异种移植小鼠模型。2周后分组，持续皮下注射LNA-FAM83H-AS1或LNA-NC5周。第7周至第12周分析结果。

2.结果测定：如图9所示。

3.结果分析：A549细胞异种移植小鼠模型中，与对照组相比，注射LNA-FAM83H-AS1组，小鼠皮下成瘤大小及肺部结节数目均较小，提示LNA-FAM83H-AS1能抑制肺癌的增殖侵袭，对治疗非小细胞肺癌有潜在的作用。

本发明的有益效果如下：

通过FAM83H-AS1对非小细胞肺癌细胞凋亡、增殖、迁移侵袭的影响，说明降低FAM83H-AS1表达可促进非小细胞肺癌细胞凋亡；将细胞周期阻滞在G1期从而抑制细胞增殖；抑制非小细胞肺癌的迁移侵袭。

通过给A549细胞异种移植小鼠模型注射LNA-FAM83H-AS1 对小鼠模型成瘤部位和转移数目的影响，说明靶向敲减FAM83H-AS1表达能够抑制非小细胞肺癌的恶性进展，显示了FAM83H-AS1作为治疗非小细胞肺癌分子靶标的价值。

本发明所公开的方法具有较高的抑制效率，同时水溶性好，可以自由穿入细胞膜，易被机体吸收；体内无毒性作用，具有较好的临床前景。

附图说明

图1为基因芯片分析正常肺组织与肺癌组织中长链非编码 RNA 表达谱的情况示意图；

图2为qRT-PCR 测正常肺上皮细胞株16-HBE与常见非小细胞肺癌细胞株中FAM83H-AS1的表达水平示意图，其中GAPDH 设为内参；

图3为LNA-FAM83H-AS1的转染效率示意图；

图4为CCK8实验检测敲减LNA-FAM83H-AS1后A549细胞的增殖能力变化示意图；

图5为流式细胞术检测敲减LNA-FAM83H-AS1后A549细胞的凋亡能力变化示意图；

图6为流式细胞术检测敲减LNA-FAM83H-AS1后A549细胞细胞周期的变化示意图；

图7为划痕实验检测敲减LNA-FAM83H-AS1后A549细胞的迁移能力变化示意图；

图8为Matrigel小室实验检测敲减LNA-FAM83H-AS1后A549细胞的侵袭能力变化示意图；

图9为A549细胞异种移植小鼠模型中注射LNA-FAM83H-AS1检测其对非小细胞肺癌恶性进展的抑制作用示意图。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面我们结合具体的实施例对本发明进行进一步的阐述。

实施例中末注明具体条件的的实验方法，基本上都按照 Sambrook，J 等人编著的《分子克隆实验指南（第 3 版）》（Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed. 黄培堂等译，科学出版社 .2002.8）中所述的条件及方法或按照材料提供商所建议的条件及方法进行，其它没有详细描述的技术相应于本领域人员来说是熟知的标准方法。

本申请中提及的细胞株以及培养基均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作举例，对本发明不是唯一的，可分别用其它适合的工具和生物材料来代替。

实施例 1

发明人提供正常肺组织与肺癌组织标本，交由博奥公司进行芯片制备，人类长链非编码 RNA 芯片 V2.0 版本完成芯片分析，该芯片包含众多 LncRNAs 数据库最新版本，目前涵盖约数万条 LncRNAs 检测的探针。该芯片检测原理是根据 lncRNA 序列长度和结构特征，采用随机引物和 Oligo(dT) 相结合的逆转录方式引入 T7 启动子，再通过进行体外转录介导的线性扩增方法对 RNA 进行扩增，RNA 线性扩增方法用于微阵列芯片分析中样品标记。将线性扩增产物 cRNA 反转录得到 DNA，再用 KlenowFragent 酶对 DNA 进行荧光标记，最终实现荧光标记的DNA产物与芯片上的Oligo探针杂交，进行基于芯片的基因表达分析。通过lncRNA芯片检测，研究人员能够快速高通量的获得与特定生物学过程或者疾病相关的 lncRNA 的表达变化。博奥生物 LncRNA 芯片检测样品标记过程，主要包括如下步骤：

1.从Total RNA的样品开始，用含有T7启动子序列的T7 Oligo(dT)Primer和T7 RandomPrimer 为引物，使用 CbcScript 酶合成 1st-strand cDNA。

2.Second strand DNA 合成：用 RNaseH、DNA Polymerase 将 DNA-RNA 杂合体中的 RNA 链转化为 SecondStrand cDNA，合成双链 DNA 并进行 DNA 过柱纯化。

3. 体外转录合成 cRNA ：以双链 DNA 为模板，利用 T7 Enzyme Mix 合成 cRNA，这一步对 RNA 进行扩增。

4.cRNA纯化：使用RNA纯化柱纯化cRNA，除去反应中的盐、酶等试剂，并对cRNA进行定量。

5.cRNA 反转录：以 cRNA 为模板，Random Primer 为引物，CbcScript Ⅱ酶进行反转录。过柱纯化并回收 cRNA 反转录得到的 cDNA。

6.cDNA荧光标记：以反转录的cDNA产物为模板，Random Primer为引物，用Klenow Fragment 酶合成 cDNA 互补链并掺入带有荧光基团的 Cy3-dCTP 或 Cy5-dCTP。纯化并定量标记产物。这些带有荧光基团 DNA 即可用于芯片杂交。

芯片筛选出在肺癌组织中特异性高表达的 lncRNAs 后，研究员通过 qRT-PCR 方法扩增 DNA 来鉴定得到的即为目的 DNA（FAM83H-AS1，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1）。FAM83H-AS1的引物如下：Forword Primer 5′-CCTGGGTTCAAGCGATTCT-3′ ,Reverse Primer 5′-GGTGGCACACACCTGCTAT -3′。

实施例 2 检测FAM83H-AS1在组织和细胞中的表达情况

（一）：FAM83H-AS1在正常肺组织与肺癌组织中的表达情况：

芯片制备及分析 : 按照中国的博奥公司的要求准备正常肺组织与肺癌组织标本，交由博奥公司进行芯片制备，人类长链非编码 RNA 芯片 V2.0 版本完成芯片分析。

芯片结果 : 实验数据来自博奥公司，结果如图 1 所示。

结果分析 :FAM83H-AS1在肺癌组织在肺癌组织中高表达，在正常肺组织中低表达，二者差异达 18.79倍，提示FAM83H-AS1在肺癌中可能作为一个癌基因发挥作用。

（二）qRT-PCR 分析FAM83H-AS1在正常肺组织细胞株16-HBE及非小细胞肺癌细胞株中的表达谱

方法：Trizol 试剂提取细胞总 RNA，qRT-PCR 运用 SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa，大连，中国 )，人 GAPDH 作为内参。

qRT-PCR 结果：如图 2 所示。

结果分析：FAM83H-AS1在正常肺组织细胞株16-HBE中低表达，在7种非小细胞肺癌细胞株高表达，其中A549细胞中表达最高，大约上调32倍。

实施例 2、设计构建FAM83H-AS1特异性LNA转染细胞：

设计特异性的针对FAM83H-AS1的干扰序列，其序列为（5’ to 3’）见 Seq NO.2，非特异性序列（NC）作为对照，转染非小细胞肺癌细胞株 A549 细胞，起到下调FAM83H-AS1表达的作用，48h后检测转染效率。

结果测定 : 如图 3 所示。

结果分析: LNA-FAM83H-AS1组较对照组细胞增殖能力明显受抑制。观察到此现象，提示干扰FAM83H-AS1表达可以抑制非小细胞肺癌细胞增殖。

实施例 3、CCK8法检测细胞增殖：

1）接种细胞：用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的1640培养液配成单个LNA-FAM83H-AS1（对照为NC）细胞悬液，以每孔2000 个细胞接种于 96 孔培养板中，每孔体积 100ul。

2）培养细胞：将培养板移入 CO2 孵箱中，在 37℃、5％ CO2 及相对湿度条件下培养，培养4天。

3）呈色：培养第6h、24h、48h、72h、96h后，每孔加入CCK8试剂10ul，37℃，继续孵育2h，终止培养。

4）比色：450nm 波长处测定光密度值 (OD)，每组 3个复孔，重复三次实验。读取OD值。

5）结果测定 : 如图 4 所示。

结果分析:LNA-FAM83H-AS1组较对照组细胞增殖能力明显受抑制。观察到此现象，提示干扰FAM83H-AS1表达可以抑制非小细胞肺癌细胞增殖。

实施例 4、流式细胞术 Annexin V/PI 双染色法测细胞凋亡：

1）细胞转染后24h，取对数生长期细胞，收集培养液，胰酶适度消化细胞，用培养液吹打，800 rpm，离心 15 min去上清；

2）PBS洗2次，加1 mL PBS吹匀，务必吹散（期间可以用滤器过滤）；

3）配置标记液：将FITC- Annexin V和PI加入到孵育缓冲液中，终浓度均为1 ug/ml；

4）用100 ul的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10~15 min。

5）使用FACSCalibu流式细胞仪检测凋亡率。

如上述方法，将LNA-FAM83H-AS1（对照为NC）细胞种在 6 孔板上，3×10⁵个细胞/孔。流式细胞术测细胞凋亡水平。

结果测定：如图 5 所示。

结果分析：与对照组相比，LNA-FAM83H-AS1组细胞凋亡增加，提示下调FAM83H-AS1 表达可促进非小细胞肺癌细胞的凋亡。

实施例 5、流式细胞术检测细胞生长周期（PI 染色）：

1）各组细胞使用基础培养基培养12h，使周期同步化，细胞转染24h后，取对数生长期细胞，收集培养液，胰酶适度消化细胞，用培养液吹打，800 rpm，离心 15 min去上清；

2）PBS洗2次（期间可以用滤器过滤），加75%冰乙醇吹匀，务必吹散，-20℃过夜（至少一天）；

3）0.5mlPBS 重悬细胞，加入PI 和RNaseA 至终浓度50μg/ml，37℃温浴30min；

4）使用FACSCalibu流式细胞仪检测细胞周期分布。

如上述方法，将LNA-FAM83H-AS1（对照为NC）细胞种在 6 孔板上，3×10⁵个细胞 / 孔。24h后流式细胞术测细胞周期。

结果测定：如图 6所示。

结果分析：LNA降低FAM83H-AS1表达后，与对照组相比，A549细胞出现细胞周期G1期阻滞增加，S期分布减少，提示干扰FAM83H-AS1表达可引起G1期阻滞抑制非小细胞肺癌细胞的增殖。

实施例6、细胞划痕实验检测迁移能力（wound healing）：

1）先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。

2）接种适当的细胞，转染24h后预计细胞融合度为90%。

3）转染24h后用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。

4）用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。

5）放入37度5%CO2培养箱，培养。按0，6，12，24，36h取样，拍照。

如上述方法，将LNA-FAM83H-AS1（对照为NC）细胞种在 6 孔板上，3×10⁵个细胞 / 孔。24h后开始细胞划痕实验。

结果测定：如图 7所示。

结果分析：LNA降低FAM83H-AS1表达后，与对照组相比，A549细胞移动较慢，划痕愈合较少，提示干扰FAM83H-AS1表达抑制非小细胞肺癌细胞的迁移。

实施例7、Matrigel小室实验检测侵袭能力

试剂盒使用BD BioCoat™ Matrigel™ Invasion Chamber：

1）水化预铺胶：Matrigel侵袭小室加入500ml无血清培养基，移到预先加入约750μl基础培养基的孔中，置37℃ 5% CO₂及饱和湿度的细胞培养箱中培养2h；

2）细胞转染后24h，收集对数期细胞，用PBS和无血清培养基先后洗涤一次，用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整细胞悬液浓度为1×105 /ml；

3）在下室（即24孔板底部）加入750μl 含10％血清的培养基，上室加入500μl细胞悬液（可添加FBS至浓度为0.5—1%，保持一定的渗透压），继续在孵箱培养24小时（24-48h，根据细胞侵袭能力调整）；

4）培养24h后，用镊子小心取出小室，吸干上室液体，移到预先加入约800μl甲醛的孔中，室温固定30分钟；

5）取出小室，吸干上室固定液，移到预先加入约800μl 结晶紫染液的孔中，室温染色15－30分钟；

6）轻轻用清水冲洗浸泡数次，取出小室，吸去上室液体，用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞；

7）晾干，倒置显微镜下取5个随机视野计数，统计结果。

如上述方法，将 LNA-FAM83H-AS1（对照为NC）细胞种在 6 孔板上，3×105 个细胞 / 孔。24h后开始Matrigel实验。

结果测定：如图 8所示。

结果分析：LNA降低FAM83H-AS1表达后，与对照组相比，A549细胞穿胶数目较少，侵袭能力较差，提示干扰FAM83H-AS1表达抑制非小细胞肺癌细胞的侵袭。

实施例7、LNA在 A459细胞异体移小鼠植模型中应用：

1）12只 BALB/C雌性裸鼠，5-6周，体重18 -25g，置于洁净、恒温通风环境，保证 12 小时明暗交替，提供充足的食物和水源。

2）选择人肺腺癌细胞株A549，将处于对数生长期的 A549 细胞用胰酶消化，和离心处理后制成2x10⁷的细胞悬液，无菌注射器吸取0.2 mL，皮下注射注射建立裸鼠肺癌成瘤模型。

3）2周后小鼠随机分为两组，第一组皮下注射LNA-FAM83H-AS1，250 mg/kg/每周；第二组注射LNA-NC，250 mg/kg/每周。持续注射5周。

4）第7周手术切除小鼠皮下荷瘤并4-0可吸收线缝合，用毫米游标卡尺测量只鼠肿瘤最大、小直径，按照以下公式计算出体积（mm3）= ab²/2= ab²/2 = ab²/2 = ab²/2，a为肿瘤长径，b为肿瘤短径。

5）LNA注射后第12周，处死裸鼠取出肺组织，观察拍照记录，肿块在液氮或多聚甲醛中保存组织做后续相关处理。

如上述方法，建立A459细胞异体移小鼠植模型，行LNA-FAM83H-AS1治疗。LNA注射后第12周，处死裸鼠做后续相关处理。

结果测定：如图9所示。

结果分析：对皮下荷瘤及转移瘤组织qPCR检测，结果显示LNA-FAM83H-AS1治疗组各成瘤FAM83H-AS表达水平明显低于阴性对照。同时，LNA- FAM83H-AS1治疗组皮下成瘤的肿瘤的大小和质量均低于LNA-NC处理组。LNA- FAM83H-AS1治疗组肺癌原发灶大小、转移灶数目均小于对照组。上述结果提示LNA- FAM83H-AS1能够抑制非小细胞肺癌的增殖及侵袭转移，FAM83H-AS1有望成为治疗非小细胞肺的新靶标。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省肿瘤医院

<120> 长链非编码RNA FAM83H-AS1在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用

<130> 20160530

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2743

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

gucgcuagga aacgagcgag cccgacgcca ggggcggagc ucuggccucc ucgccgaguu 60

gggggaggca ggugcgacag gagaauggac aguaagaagg ggagacccaa agcugcagcu 120

gggaaguggc agacgcucca cccugggccc aagacaagag cugcugcugg gaagcccggg 180

gagaaccgcc cgccgcagag gaaagcgggc uggcaggcga gggagcccgc gucggcugag 240

agcccacagg cccccacaga uggaguuucg cucuguugcc aggcuggagu gcacuggggc 300

uuggcucacu gcuaccuccg ccucccaggu ucaggcaauu cuccugccuc agccuccuga 360

guagcuggga cuacaggcac ccaccaccac acccagcuag uuuuuguguu uuuaguagag 420

acaggguuuc accauguugg ccaggauggu cucgaucucu ugaccuugug auccgcccgu 480

cucagccucc caaagugcug ggauuacagg cgugagccac caggccuggc uccuuuucca 540

cuuucaugga cccucgugau ugcauuggau cuccccgggu aaucugggau guucuuccug 600

gccuaagguc agcugauuag caaccuuagu ucaucugcag ucuccauucu cuuuuugcug 660

aaucacguca aguauucaca aguuccaggg ggcaggaggu ggacaucuuu gggggacauu 720

auuccgccca ccagaaaacc caggagcagc cacagcccca agacgaggca gggaaggagu 780

gcugcugucu gccggugaag augaacugcu ucugacccuc ccgagcgagg auauugagaa 840

gaaagaauuu gccaagaugc uagucacaca ccaaguacag aggcuauguu ggucggcugc 900

agcaaaaaga ccacucgcgg cguggcagcu cucacuggcc cugcugccuc uucaaguuga 960

cugcagucca ucacccacgg ucauuauuaa uuuguuuuug caaaggccag gcaggugaau 1020

cuaauggaga uggaaaccac cacaccugcu ucccuggucu cugauguugg uguuaaccuc 1080

ugcaauuccu caagcaaagc acuccuucua ucaggcucac ugucuugcug gagggaggaa 1140

guuccacagg cucucacuug guucuuucug ccguaacaac ccuuacuccu ccggccaagg 1200

agccaaugug agcauucagc uggcagcuaa gaauguguau cccaauaaac agggcagacc 1260

uacagaccca cuggacccac uagagaugga cuugggccac agugccuucc augacuucag 1320

uaaacagagg ggugugguga ucuugucaaa guccuggcgu caaugucagu guccggcuac 1380

acaccauguu cccguccucg aaaagccucu cuguaccccu cuauguuggu gacacaaccc 1440

uggcaaaugg ccacagacuc cuuuggggac agaguaggag cguaacuggu gggagugguu 1500

ggcaugcuuu guauugggag agccgcacgc ccuagggcuu ccagccuccu cuucaguuug 1560

gcagcuguga gucugaauuu cacucaaauc uggaaacugg gugagagacu guggcagcug 1620

cuguccggcu ggcagagccu gacgugucuc ugaucauacu cacuggguca gcaacacccu 1680

acugaccuug uccagaaucc cacaucccag uugauaucag ggcaaucagu uuccuggcug 1740

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cgcccaggcu ggagugcagu ggagcgaucu cggcucauug caaccuccgc cuccuggguu 1920

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cccagcuaau uuuuguauuu uuaguagaga ugggguuuca ucauguugcc caggcugguc 2040

ucaaauuccu gaccucaggu gaucugcccu cagccuccca aagugcuggg auuacaggcu 2100

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gcuaggacua uaggcacaca gcaccaugcc ccggcuauuu uuuuauuuug uagagauggg 2340

gucucacuau guugcccagg cuaguauuga acuccuggcc ucaagcaauc cucccaccuc 2400

ggccucccaa agugcuggga uuaaaggcgu gagccaccgu accuugcccu ugguggaauc 2460

uuuaggguuu ucuauucaua cauauaaaau cauaucauug gcaaacagag auaauuuuac 2520

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<210> 2

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cttactgtcc attct 15

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aacacgtcta tacgc 15

Claims (6)

1.长链非编码RNA FAM83H-AS1在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述的长链非编码RNA FAM83H-AS1的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征是，通过锁核酸序列调控FAM83H-AS1表达。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征是，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

5.权利要求4所述的特异性锁核酸在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。

6.经权利要求4所述的特异性锁核酸修饰的长链非编码RNA FAM83H-AS1在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。