CN109251983B - Frs2基因的拷贝数扩增及其应用、检测拷贝数扩增的特异性引物对 - Google Patents

Frs2基因的拷贝数扩增及其应用、检测拷贝数扩增的特异性引物对 Download PDF

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Abstract

本发明FRS2基因的拷贝数扩增及其应用、检测拷贝数扩增的特异性引物对，属于生物技术领域。所述拷贝数扩增的倍数为3倍以上。在拷贝数扩增的膀胱癌样本中新生血管密度大。在体外培养的膀胱癌细胞系中利用特异性siRNA干扰FRS2的表达从而抑制了膀胱癌细胞招募血管内皮细胞的能力和膀胱癌细胞诱导血管内皮细胞成小管的能力。所述的FRS2基因的拷贝数扩增在制备检测膀胱癌试剂盒中的应用。本发明具有以下优点：本发明的拷贝数扩增可以作为分子探针或靶向引物的生物检测指标之一，用来开发膀胱癌筛查试剂盒。

Description

FRS2基因的拷贝数扩增及其应用、检测拷贝数扩增的特异性 引物对
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及FRS2基因的拷贝数扩增及其应用、检测拷贝数 扩增的特异性引物对。
背景技术
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤。2004年WHO《泌尿系统及男性生殖器官肿瘤病理学和遗传学》中膀胱癌的病理类型包括膀胱尿路上皮癌、膀胱鳞状细胞癌、膀胱 腺癌，其他罕见的还有膀胱透明细胞癌、膀胱小细胞癌、膀胱类癌。其中最常见的是膀 胱尿路上皮癌，约占膀胱癌患者总数的90％以上，通常所说的膀胱癌就是指膀胱尿路上 皮癌，既往被称为膀胱移行细胞癌。
大约有90％以上的膀胱癌患者最初的临床表现是血尿，通常表现为无痛性、间歇性、 肉眼全程血尿，有时也可为镜下血尿。血尿可能仅出现1次或持续1天至数天，可自行减轻或停止，有时患者服药后与血尿自止的巧合往往给患者“病愈”的错觉。有些患者 可能在相隔若干时间后再次出现血尿。血尿的染色由浅红色至深褐色不等，常为暗红色， 有患者将其描述为洗肉水样、茶水样。出血量与血尿持续时间的长短，与肿瘤的恶性程 度、大小、范围和数目并不一定成正比。有时发生肉眼血尿时，肿瘤已经很大或已属晚 期；有时很小的肿瘤却出现大量血尿。有些患者是在健康体检时由B超检查时发现膀胱 内有肿瘤。有10％的膀胱癌患者可首先出现膀胱刺激症状，表现为尿频、尿急、尿痛和 排尿困难，而患者无明显的肉眼血尿。这多由于肿瘤坏死、溃疡、膀胱内肿瘤较大或数 目较多或膀胱肿瘤弥漫浸润膀胱壁，使膀胱容量减少或并发感染所引起。膀胱三角区及 膀胱颈部的肿瘤可梗阻膀胱出口，而出现排尿困难的症状。
对于40岁以上出现无痛性肉眼血尿，应考虑到泌尿系肿瘤的可能性，特别是膀胱癌。 综合患者既往史、家族史，结合症状和查体做出初步判断，并进一步进行相关检查。检查方法包括尿常规检查、尿脱落细胞学、尿肿瘤标记物、腹部和盆腔B超等检查。根据 上述检查结果决定是否行膀胱镜、静脉尿路造影、盆腔CT或/和盆腔MRI等检查明确诊 断。其中，膀胱镜检查是诊断膀胱癌的最主要方法。
在我国，膀胱癌发病率和死亡率均居泌尿系统肿瘤首位，且近年来其发病呈逐年上 升和年轻化趋势。膀胱癌多数(>90％)是膀胱上皮癌，这些膀胱癌被进一步分为浅表 非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)和肌层浸润性膀胱癌(MIBC)。浸润性膀胱癌病人预后 不佳，5年生存率仅为20-40％，其中50％以上的患者会由于发生转移而死亡。降低膀胱 癌转移率成为临床上迫切需要解决的重大问题。肿瘤血管生成是肿瘤原发部位或远端转 移器官形成新生血管的病理过程，是癌症的典型特征，通过向癌细胞提供足够的营养并 帮助肿瘤细胞转移到远端，促进肿瘤生长和进展。因此，靶向肿瘤血管新生是癌症治疗 的有效靶点。膀胱癌是高度血管化的癌症，而其分子基础和涉及的信号传导途径还有待 研究。阐明膀胱癌病理性血管生成与遗传变异之间关联，揭示其作用机理，有利于现有 的抗血管生成药物在膀胱癌治疗中的应用，同时可为膀胱癌抗血管生成治疗提供潜在的 新靶点。
大部分膀胱癌患者术后会多次复发，需要反复进行膀胱镜检查及手术切除，导致膀 胱癌治疗费用高昂。膀胱癌可以分为肌层浸润型和非肌层浸润型，两者具有不同的临床转归与分子特征。膀胱癌是一种分子异质性疾病，其基因组包含从单核苷酸水平突变到 染色体结构变异的各种形式体细胞遗传改变；不同病理亚型膀胱癌分子发病机理各异， 其发生、复发分子机制尚未系统阐明，临床上缺乏早诊、控制复发有效靶标。
膀胱癌病理学诊断结果对治疗方案的选择具有重要作用，但判断肿瘤恶性程度时， 缺乏客观和精准的危险度分级方法，无法在治疗前判断化疗敏感性和复发倾向。过去研 究证实：膀胱癌在基因突变、表达改变、甲基化等层面都存在跨越病理分期与分级的分子亚型，不同分子亚型病人具有不同的临床预后、复发倾向、化疗药物敏感性。基于膀 胱癌多组学分子分型结果，可以开发出相关分子靶标，进行尿液早期无创诊断及术后复 发预测及监测等方面临床应用。
发明内容
针对我国目前膀胱癌发病率和死亡率均居泌尿系统肿瘤首位，并且近年来其发病呈 逐年上升和年轻化趋势的问题，我们急需筛选和鉴定出与膀胱癌发生发展及转移密切相 关的重要基因并分析该基因表达对人体所产生的影响。
针对上述问题，本发明通过对65例膀胱癌进行全基因组分析揭示了FRS2基因在6例膀胱癌中因基因组结构变异的影响，发生了明显的拷贝扩增，基因扩增倍数在3～25 倍；此外在另一组膀胱癌队列中(n＝196)通过定量PCR进行靶向验证，进一步证明了膀胱 癌中FRS2的高频拷贝扩增情况。
本发明的目的在于公开了FRS2基因的拷贝数扩增。
本发明第二个目的在于公开了FRS2基因的拷贝数扩增的应用。
本发明第三个目的在于公开了用于检测FRS2基因拷贝数扩增的特异性引物对。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
FRS2基因的拷贝数扩增，其中：所述拷贝数扩增的倍数为3倍以上。
上述技术方案所述的FRS2基因的拷贝数扩增，其中：所述拷贝数扩增的倍数为3～25倍。
上述技术方案所述的FRS2基因的拷贝数扩增，其中：在拷贝数扩增的体外膀胱癌样 本中新生血管密度大。
上述技术方案所述的FRS2基因的拷贝数扩增，其中：在体外培养的膀胱癌细胞系中 利用特异性siRNA干扰FRS2的表达从而抑制了膀胱癌细胞招募血管内皮细胞的能力和膀胱癌细胞诱导血管内皮细胞成小管的能力；所述特异性siRNA是针对FRS2的特异性siRNA。
上述技术方案所述的FRS2基因的拷贝数扩增在制备检测膀胱癌试剂盒中的应用。
一种用于检测FRS2基因拷贝数扩增的特异性引物对，其中，所述特异性引物对为FRS2基因的引物对P，序列为：
F：5’ATGGGAATGAGTTAGGTTCTGGC3’
R：5’GCGGGTGTATAAAATCAGTTCTGTG3’。
一种用于检测FRS2基因拷贝数扩增的特异性引物对，其中，所述特异性引物对包括 FRS2基因的引物对P和参考基因GAPDH的引物对P1，其中引物对P的序列为：
F：5’ATGGGAATGAGTTAGGTTCTGGC3’
R：5’GCGGGTGTATAAAATCAGTTCTGTG3’；
引物对P1的序列为：
F：5’CATGTTCCAATATGATTCCAC3’
R：5’CCTGGAAGATGGTGATG3’。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明公开了在膀胱癌患者中FRS2基因的拷贝数发生了扩增，并确定了在拷贝数扩增的体外膀胱癌样本中FRS2高表达并且新生血管密度大。
2、本发明揭示了特异性siRNA通过干扰FRS2的表达从而抑制了膀胱癌细胞招募血管内皮细胞的能力和膀胱癌细胞诱导血管内皮细胞成小管的能力。
3、FRS2基因拷贝数的扩增可以作为分子探针或靶向引物的生物检测指标之一，用来开发膀胱癌筛查试剂盒。
附图说明：
1、图1为全基因组测序分析揭示FRS2在膀胱癌组织中拷贝数扩增的结果。
2、图2为FRS2拷贝数扩增的验证的结果。
3、图3为FRS2拷贝数扩增对FRS2表达及肿瘤组织中微血管生成的影响结果。
4、图4为干扰FRS2抑制膀胱癌细胞血管生成能力的结果。
具体实施方式：
为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对FRS2基因在检测膀胱癌中 的应用、特异性引物及应用作进一步的说明。
实施例1：样本收集与全基因组测序分析：
在符合医学伦理且征得患者同意的情况下，从深圳大学泌尿外科研究所中新近诊断 的膀胱癌个体获得65对配对膀胱肿瘤组织和外周血样本，用于全基因组测序分析的65例 膀胱癌患者的临床信息表如表1所示。
表1 全基因组测序分析的65例膀胱癌患者临床信息表
Figure BDA0001765633680000041
Figure BDA0001765633680000051
Figure BDA0001765633680000061
对表1所示的65例膀胱癌患者提取基因组DNA进行全基因组测序。具体方法如下：
1、使用SOAPnuke(v.1.5)过滤原始数据以删除适配器顺序和低质量读数。通过Burrows-Wheeler Aligner(BWA)将高质量的读长与人参照基因组(hg19,NCBI GRCh37) 按照默认参数进行比对。使用Genome Analysis Toolkit(v.1.0.6076)完成局部重新排列并提 高准精度，分别使用Mutect(v1.1.4)和Strelka(v.1.0.15)软件检测点突变和小片段插入与缺 失。Segseq(v1.01)和Meerkat(v0.185)软件使用默认设置识别拷贝数变化和结构变化。
2、通过Meerkat0.18523算法和建议的参数进行膀胱癌基因组的结构变异(SV)鉴定。 简而言之，我们将所有测序读长与人类参考基因组(hg19)进行比对，以获得错义剪切和 未匹配的读长，并将这些读数重新映射到参考基因组来鉴定不一致的读长。然后，预测支持读长的断点，并通过局部对齐重新定义了精确的断点。SV形成的机制基于同源性和 断点特征来确定。通过筛选种系SV和依赖于基因组过滤程序确定的低假阳性SV来鉴定 体细胞SV，对高度可信的SV开展进一步的分析。
结果：
FRS2(Fibroblast growth factor Receptor Substrate2)即人的成纤维生长因子受体底物 2，是成纤维生长因子(FGF)信号通路的主要信号传导分子，NCBI(NationalCenter for Biotechnology Information)的登录号Gene ID:10818。
结果如图1所示，在全基因组测序分析的65例膀胱癌样本中，FRS2在6例肿瘤组 织中因基因组结构变异的影响，发生了明显的拷贝数扩增，基因扩增倍数在3～25倍。
实施例2：FRS2拷贝数扩增的验证：
在符合医学伦理的情况下，从深圳大学泌尿外科研究所样本库保存的膀胱癌石蜡切 块中筛选196例没有经过放化疗治疗的样本，该196例样本的信息如表2所示。
表2 靶向验证的196例膀胱癌患者临床信息表
Figure BDA0001765633680000062
Figure BDA0001765633680000071
Figure BDA0001765633680000081
Figure BDA0001765633680000091
Figure BDA0001765633680000101
Figure BDA0001765633680000111
为了进一步验证FRS2基因在膀胱癌中的拷贝扩增情况，设计了针对FRS2的特异性引物，以GAPDH基因作为内参，体检健康人群的血细胞与尿液脱落细胞作为对照，采 用相对定量的方法，在新入组的196例膀胱癌样本中进行靶向验证。具体步骤为：
对表2所示的196例样本使用TIANamp FFPE DNA试剂盒(Tiangen Biotech),参照说 明书的规范流程提取DNA，通过定量PCR(q-PCR)的方法，分析验证FRS2在膀胱癌组 织中的拷贝情况。设计了用于q-PCR分析的FRS2和参考基因GAPDH的引物对(序列如 下)。使用QuantStudioDx仪器(Life Technologies)，利用TransStart Tip Green qPCR SuperMix荧光定量检测试剂盒(全式金)进行q-PCR分析，应用相对定量方法计算膀胱癌 中FRS2拷贝数相对于正常血液样本中FRS2的拷贝数变化。
引物序列如下：
FRS2：ATGGGAATGAGTTAGGTTCTGGC(F)
GCGGGTGTATAAAATCAGTTCTGTG(R)
GAPDH：CATGTTCCAATATGATTCCAC(F)
CCTGGAAGATGGTGATG(R)
具体步骤如下：
(1)、在冰上配制qPCR反应体系。
Figure BDA0001765633680000112
(注：每个样本设三个平行孔。)
(2)、反应条件：
Figure BDA0001765633680000121
融解曲线分析产物特异性
结果：
结果如图2所示，进一步证实了膀胱癌石蜡切块样本中FRS2基因发生了拷贝数扩增。
实施例3：FRS2拷贝数扩增对FRS2表达及肿瘤组织中微血管生成的影响：
为了进一步探究FRS2基因在膀胱癌中拷贝数扩增对肿瘤的影响，通过免疫组化的方 法分析了FRS2基因编码的蛋白在肿瘤组织中的表达情况，同时基于FRS2具有促进血管生成的生物学功能，分析了FRS2拷贝数扩增对肿瘤组织中血管密度的影响。
在196例验证FRS2拷贝数扩增的膀胱癌肿瘤样本中，利用免疫组化的方法分别对FRS2基因高拷贝与低拷贝样本中FRS2蛋白的表达及肿瘤组织中微血管的生成进行分 析。具体步骤如下：
微血管的数目通过CD31的免疫组化结果进行评估。利用特异性抗体抗FRS2(Abcam， 目录号ab150058)和抗CD31(Abcam，目录号ab28364)，按照免疫组化分析的标准流程开 展组化分析实验。具体步骤如下：
(1)、将组织切片在60℃烤箱中烘烤1h后脱蜡与水化(二甲苯I 10min；二甲苯II10 min；100％乙醇I 5min；100％乙醇II 5min；95％乙醇5min；90％乙醇5min；80％ 乙醇5min；70％乙醇5min；蒸馏水5min)；
(2)、用0.3％过氧化氢溶液避光室温孵育30min，封闭内源性过氧化物酶的活性，再用蒸馏水冲洗3次，每次2min；
(3)、在0.01M枸橼酸盐缓冲液中微波修复抗原15min，室温冷却至常温，PBS洗3次，每次2min，再用PBST漂洗3次，每次5min；
(4)、5％BSA(PBS配制)室温孵育封闭30min；
(5)、一抗4℃冰箱孵育过夜后，用PBS洗涤3次，5min/次；
(6)、将切片在PBST溶液中过水一次，滴加50uL二抗室温孵育30min，用PBS洗 涤3次，5min/次；
(7)、DAB显示液滴片，观察显色反应，及时流水终止；
(8)、苏木素复染1min，自来水漂洗干净；
(9)、梯度酒精脱水和二甲苯透明(蒸馏水5min；70％乙醇5min；80％乙醇5min；90％乙醇5min；95％乙醇5min；100％乙醇II 5min；100％乙醇I 5min；二甲苯II 10 min；二甲苯I 10min)；
(10)、通风橱里晾30min后中性树脂封片，镜检。
每列样本中所检测蛋白的免疫反应评分以染色细胞的百分比(0％-100％)与染色强 度(无＝1，弱＝2，中等＝3，强＝4)的乘积表示。以肿瘤组织中微血管的密度评估血管生成情况：使用抗CD31抗体来鉴定肿瘤组织中的血管内皮细胞；通过40X倍率的低倍镜 扫描整个切片后指定新生血管热点区域，然后在200X倍率的高倍镜下计数新生血管的数 目；与相邻微血管或其他结缔组织分离的任何染色的内皮细胞被认为代表单个微血管； 使用数字成像软件(Image-Pro Plus 6.0)对微血管进行计数，每个病例选取三个新血管热点 进行统计分析。
结果：
实验结果如图3所示，其中图3(a)表明FRS2拷贝数扩增的样本中FRS2高表达；图 3(b)表明FRS2拷贝数扩增的样本中新生血管密度大。
实施例4：干扰FRS2表达对膀胱癌细胞系5637与SW780表型的影响：
进一步在膀胱癌细胞系5637与SW780中探究了干扰FRS2基因表达对膀胱癌细胞的表 型，特别是血管生成能力的影响。首先，根据FRS2基因的序列，设计特异性的干扰siRNA，通过RT-qPCR与Western blotting免疫印迹的方法验证siRNA的干扰效率。然后，在膀胱癌细胞5637与SW780中利用siRNA干扰FRS2表达，通过血管内皮招募实验与成血管实验分 析在膀胱癌细胞中干扰FRS2对其血管生成能力的影响。具体步骤如下：
本发明使用的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和膀胱癌细胞系5637与SW780均来源于ATCC(American Tissue Culture Collection)。所有细胞经检测，确定无支原体感染。将这些细胞在RPMI-1640(5637)，DMEM(SW780)或ECM(HUVECs)培养基中(补充10％胎牛 血清)，置于37℃，5％CO2的培养箱条件中培养。
一、细胞转染和条件培养基收集：
(一)、合成针对人FRS2(siFRS2)和非靶向阴性对照siRNA(siCon)的siRNA寡核苷酸 (序列如下)，用来转染膀胱癌5637和SW780细胞，敲低目的基因。
siRNA序列如下：
siFRS2：CUAAAUGGCUACCAUAAUAAU(Sense)
UAUUAUGGUAGCCAUUUAGAG(Antisense)
siCon：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT(Sense)
ACGUGACACGUUCGGAGAATT(Antisense)
(二)、将5637和SW780细胞接种到6孔板中，并将siRNA和LipofectamineRNAiMAX试剂(Invitrogen)的混合液加入6孔板中，每个孔siRNA终浓度为30nM。siRNA转染24小 时后，将培养基更换为0.2％FBS RPMI-1640或DMEM，继续培养24小时后收集条件培养 基，用于后续的成管实验。siRNA转染及条件培养基收集的具体步骤如下：
(1)、在转染的前一天将5637和SW780细胞接种到6孔板中，待细胞长到70％～80％时 进行转染；
(2)、按照LipofectamineRNAiMAX试剂(Invitrogen)的说明书准备A与B两种混合液 (A液：siRNA储存液加入至150uLopti-MEM培养基中混匀；B液：9uLLipofectamineRNAiMAX试剂加入至150uLopti-MEM培养基中混匀)；
(3)、混匀A、B液，室温孵育5min；
(4)、取混合液250μL添加到移除培养基的6孔板细胞中，并加入750μL不含FBS的RPMI-1640或DMEM培养基，轻轻摇匀，每孔siRNA的终浓度为30nM,转染6h后加入1 mL含10％胎牛血清的新鲜培养基；
(5)、siRNA转染24h后，将培养基更换为0.2％FBS RPMI-1640或DMEM培养基，继 续培养24小时后收集培养基，0.22um过滤器过滤后保存在-20℃作为条件培养基用于后 续的成管实验。
二、RT-qPCR与Western blotting：
通过逆转录定量PCR(RT-qPCR)与Western blotting免疫印迹的方法检测分析siRNA 寡核苷酸对目标蛋白FRS2表达的干扰效率。
(一)、使用
Figure BDA0001765633680000142
Total RNA Kit(Omega Bio-tek)试剂盒，按照试剂盒说明书的流程 提取总RNA，并使用PrimeScript RT试剂盒(Takara)进行cDNA合成；cDNA合成的具体步 骤如下：
(1)、基因组DNA去除：在冰上配制RT-PCR反应体系，42℃，反应2min。
Figure BDA0001765633680000141
(2)、逆转录反应：37℃，15min；85℃,5s；4℃，5min。
Figure BDA0001765633680000151
(二)、结合FRS2或GAPDH引物(序列如下)，用TransStart Tip Green qPCRSuperMix(TransGen)进行RT-qPCR。GAPDH作为实验内参。
引物序列如下：
FRS2：AAGCCCGCAAGCTAAGTAGG(F)
GCACTTGCTGGCACTGTTAC(R)
GAPDH：GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG(F)
GAGCCCCAGCCTTCTCCATG(R)
1、qPCR的具体操作如下：
(1)、在冰上配制RT-PCR反应体系。
Figure BDA0001765633680000152
(注：每个样本设三个平行孔。)
(2)、反应条件：
Figure BDA0001765633680000153
融解曲线分析产物特异性。
2、Western blotting免疫印迹实验过程如下：
(1)、在添加有蛋白酶抑制剂的RIPA混合液中裂解细胞收集物，12,000g离心15min， 取上清；
(2)、Bradford法测定每个样品蛋白浓度，SDS-PAGE电泳分离各样本中的蛋白组分， 电泳结束后将凝胶分离的蛋白转移到甲醇活化的PVDF膜上；
(3)、转印结束后，5％的脱脂奶粉室温封闭PVDF膜1h；
(4)、根据目的蛋白的大小与预染蛋白Marker的指示，将膜剪成两部分，分别含有目 的蛋白与内参蛋白，分别用FRS2(R&D Systems，MAB4069)和GAPDH(Cell Signaling，2118S)的一抗4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜3次，每次10min；
(5)、用辣根过氧化物酶标记的二抗室温避光孵育PVDF膜1h，使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法显示蛋白条带。
三、脐静脉血管内皮细胞招募与成管实验：
(一)、将HUVECs(1×104)接种到用Matrigel(10mg/ml)包被的96孔板中，并在上述收 集的指定条件培养基：ECM培养基(1:2)中培养。大约4～6小时后，在相差显微镜下拍照，并在三个重复孔中计数成管数。具体步骤如下：
(1)、将基质胶Matrigel提前一天置于4℃冰箱过夜，使其溶解，并预冷实验所需的枪 头、EP管等实验耗材；
(2)、将融化后的基质胶加入96孔板，50ul/孔，37℃、5％CO2的培养箱内包被1h；
(3)、将HUVECs细胞悬液50ul/孔(含1×104细胞)接种于基质胶包被好的96孔板中， 在上述收集的指定条件培养基：ECM培养基(1:2)中培养，设置3个重复组；
(4)、在培养箱培养大约4-6小时后，在相差显微镜下拍照，并在三个重复孔中计数成管数。
(二)、血管内皮细胞招募实验在聚碳酸酯薄膜的transwell套板(24孔，孔径8.0um)中 进行测定：用指定的siRNA转染接种在下室中的5637和SW780细胞(8×104/孔)，孵育36小 时后，换成0.2％FBS ECM培养基；然后在上室中接种悬浮在50uL 0.2％FBS ECM培养基 中血清饥饿的HUVEC细胞(6×104个)；在37℃共培养30小时后，结晶紫染色迁移到膜下 表面的HUVEC细胞，并在光学显微镜下计数5个视野/孔中的细胞迁移数。
结果：
干扰FRS2抑制膀胱癌细胞血管生成能力的结果如图4所示，实验结果表明干扰FRS2 基因的表达能明显抑制了膀胱癌细胞5637与SW780的成血管能力；图4(a)为RT-qPCR与Western blotting免疫印迹表明针对FRS2的特异性siRNA能干扰膀胱癌细胞FRS2的 表达；图4(b)为干扰FRS2的表达从而抑制了膀胱癌细胞招募血管内皮细胞的能力；图4(c)为干扰FRS2的表达从而抑制了膀胱癌细胞诱导血管内皮成小管的能力。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制， 凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技 术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍 属于本发明的技术方案的范围内。
序列表
<110> 深圳市罗湖区人民医院
<120> FRS2基因的拷贝数扩增及其应用、检测拷贝数扩增的特异性引物对
<130> YL118-222
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> FRS2正向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<400> 1
atgggaatga gttaggttct ggc 23
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> FRS2反向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<400> 2
gcgggtgtat aaaatcagtt ctgtg 25
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> GAPDH正向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<400> 3
catgttccaa tatgattcca c 21
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> GAPDH反向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<400> 4
cctggaagat ggtgatg 17
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> siFRS2正义链
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<400> 5
cuaaauggcu accauaauaa u 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> siFRS2反义链
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<400> 6
uauuauggua gccauuuaga g 21
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> siCon正义链
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<400> 7
uucuccgaac gugucacgut t 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> siCon反义链
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<400> 8
acgugacacg uucggagaat t 21

Claims (3)

1.检测FRS2基因拷贝数扩增的试剂在制备诊断膀胱癌试剂盒中的应用，其特征在于：体外膀胱癌样本中FRS2基因拷贝数扩增的倍数为正常样本中FRS2基因数的3倍以上。
2.根据权利要求1所述的检测FRS2基因拷贝数扩增的试剂在制备诊断膀胱癌试剂盒中的应用，其特征在于：在体外膀胱癌样本中FRS2基因拷贝数扩增的体外膀胱癌样本中新生血管密度大。
3.特异性siRNA在制备抑制膀胱癌细胞系招募血管内皮细胞和诱导血管内皮细胞成小管的能力的试剂中的应用，其中特异性siRNA为干扰FRS2表达的siRNA，其序列为：
siFRS2： CUAAAUGGCUACCAUAAUAAU
UAUUAUGGUAGCCAUUUAGAG。
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Amplification of FRS2 and Activation of FGFR/FRS2 Signaling Pathway in High-Grade Liposarcoma;Zhang, KQ等;《CANCER RESEARCH》;20130215;第73卷(第4期);第1301页左栏第3段、第1302页右栏第1段、图1A、图3和图4B *
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Whole-genome sequencing identifies ADGRG6 enhancer mutations and FRS2 duplications as angiogenesis-related drivers in bladder cancer;Wu, S等;《NATURE COMMUNICATIONS》;20190212;第10卷;第1-12页 *
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