CN113832226B - 研究gnl3与肝癌发展的相关性的方法及gnl3作为肝肿瘤干细胞、肝癌标志物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种研究GNL3与肝癌发展的相关性的方法,通过所述方法能够获取GNL3与肝脏肿瘤干细胞、肝癌发展的相关性,为进一步研究GNL3的作用机制提供基础,以便后续基于GNL3制备治疗肝癌的药物,促进肿瘤诊断、治疗领域的发展。还能验证GNL3作为肝脏肿瘤干细胞的特异性标志物,方便从肿瘤干细胞层面应用GNL3以制定靶向肝脏肿瘤干细胞的治疗方法或药物,突破现有治疗方案所受的复发、转移、耐药性制约,提高治疗效果。同时,基于GNL3作为一种标志物,本发明还提供了一种检测GNL3的产品在制备诊断肝癌、预测肝癌治疗预后情况、检测肝脏肿瘤干细胞的工具中的应用和GNL3基因在制备治疗肝癌的药物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤诊断及治疗领域,更具体地,涉及一种研究GNL3与肝癌发展的相关性的方法及GNL3作为肝肿瘤干细胞、肝癌标志物的用途。
背景技术
目前,原发性肝细胞癌(肝癌)(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,位居全球恶性肿瘤发病率第六位,死因在消化系统恶性肿瘤中排第三位。现有的治疗方法包括根治性手术切除,局部射频、化疗栓塞、索拉非尼的靶向治疗、介入及肝移植等方法,虽然基于上述方法能起到一定的治疗效果,但其仍然受到肝癌术后早期肝内高复发率、肝外高转移率和对化疗药物的不敏感的制约,无法实现更好治疗效果。
肿瘤干细胞(CSCs)是一种特殊的肿瘤细胞,具备干细胞特性,它最初在白血病中提出,后在各实体肿瘤中也有报道。一些假设认为肿瘤干细胞群对中、低分化的肿瘤复发、转移及耐药性具有决定性作用;而肝脏肿瘤干细胞可能正因为具有这一特性,所以造成肝癌在恶化进展期,肝癌细胞增生、转移加剧,且对化疗方案不敏感。但迄今为止,仅有少量报道表明肝癌中有肝脏肿瘤干细胞,但其对肝脏肿瘤干细胞的作用机制并不明确。所以,基于肿瘤干细胞或许能获取新的肿瘤标志物或治疗靶点,从而突破现有治疗技术所受到的制约。
核干细胞因子(nucleostemin,NS,GNL3)是新兴的肿瘤干细胞特异标记分子,其表达和细胞增殖活跃相关,在正常和肿瘤干细胞中表达强而在不分裂的细胞中表达弱,在维持干细胞的连续增殖和某些类型的癌症细胞中发挥核心作用,能同时参与调节干细胞和癌细胞的增殖行为,如:GNL3缺失造成的损伤可以导致细胞周期停滞于G2/M期。同时,现有研究发现:GNL3在组织再生和多种人类的肿瘤疾病(包括乳腺癌、脑癌、胃癌、结肠癌、食道癌、肺癌、卵巢癌、白血病、鳞状上皮细胞、宫颈上皮、膀胱和前列腺肿瘤)中的表达水平均有升高;在乳腺癌、急性粒细胞白血病、神经胶质瘤的体内体外实验显示:GNL3高表达的细胞比GNL3低表达的细胞显示出更强致瘤性。所以,GNL3在肿瘤细胞的生长和增殖过程中非常重要,可能在肿瘤恶化过程中发挥作用。早期研究认为GNL3和P53之间是以复合体形式连接共同维持调节细胞增殖的,且NS通过调节P53实现共同维持调节细胞增殖的,但部分研究报告却表示:野生型P53细胞中NS缺失能导致P53诱导的细胞停滞;P53缺乏时NS仍然促进细胞增殖;P53缺失未能促进敲除NS的生长缺陷型小鼠胚胎成纤维细胞的生长;P53的存在与否并未能真正改变NS缺陷的细胞在G2/M检验点的反应。即表明NS对细胞增殖和胚胎发生是必需的,P53参与并不能完全阐明NS的作用机制,且NS发挥作用可能是非P53途径,甚至可能NS位于P53的上游。同时,还有研究显示:在albGNL3cko小鼠模型研究中,于小鼠出生后的第一周、肝细胞的生长时敲除GNL3,将导致1-2周龄DNA损伤的增加,在3-4周龄时,albGNL3cko肝脏模型显示肝细胞凋亡,坏死以及再生的反应性结节增加;在四氯化碳(CCL4)引起的急性肝损伤和70%部分切除肝切除的肝模型中,敲除GNL3的肝细胞显示了生长停滞、再生延长增加并有DNA的损伤;相对于癌旁组织,GNL3在肝癌组织中高表达,敲除GNL3可以增强紫外线和血清饥饿导致的MHCC97H和BeI7402肝癌细胞系的凋亡。即GNL3与肝癌的发展密切相关。
基于以上研究背景,肿瘤干细胞可能是导致癌症复发、转移、治疗耐药的原因,而GNL3又与肝癌的发生、发展密切相关,且GNL3本身还作为一种新兴的肿瘤干细胞标记存在,通过选择GNL3进行与肝脏肿瘤干细胞、肝癌发展的相关性研究并深入探讨GNL3的体内外特性、作用机制,有望突破临床上癌症治疗受到的复发、转移、耐药性的制约,并增加临床上用于肝癌诊断、治疗、预后的分子靶标。
发明内容
本发明旨在克服上述现有技术的至少一种不足,提供一种研究GNL3与肝癌发展的相关性的方法及GNL3作为肝肿瘤干细胞、肝癌标志物的用途,通过该方法能够确定GNL3为肿瘤干细胞的特异性标志物并获得GNL3与肝癌发生、发展的相关性关系,提供新的肝癌研究方向;通过将GNL3作为肝脏肿瘤干细胞、肝癌的标志物,有助于提供肝癌的新的诊断、预后预测、治疗靶标,为克服现有技术因肝脏肿瘤干细胞引起的复发、转移、耐药性提供研究基础。
本发明的采取的技术方案是:
本发明提供了检测GNL3的产品在制备诊断肝癌、预测肝癌治疗预后情况、检测肝脏肿瘤干细胞的工具中的应用。
检测GNL3的产品检测GNL3基因的表达情况以及相关产物的表达情况,从而依据研究所得GNL3与肝癌发生、发展进程中的对应关系,能够对肝癌进行诊断,结合GNL3在临床样本中的表达和统计,能够在肝癌治疗过程中实现预测预后,从而有助于基于预测预后进行针对性的治疗。GNL3作为肝脏肿瘤标志物时有助于检测GNL3的产品检测肝癌中的肝脏肿瘤干细胞,从而基于肝脏肿瘤干细胞情况间接诊断肝癌或进行肝癌发展的预测以及治疗方案的拟定。所以,基于检测GNL3的产品能够制备出诊断肝癌、预测肝癌治疗预后情况、检测肝脏肿瘤干细胞的工具,能够利用该工具获得的结果采取针对性的预防和治疗措施,从而提高预防、治疗等效果。
进一步的,所述的GNL3基因相关产物包括GNL3基因、GNL3基因的剪接体、GNL3基因的反义寡核苷酸、小干扰RNA、GNL基因编码的肽段和GNL3基因的抗体。
进一步的,其中诊断肝癌包括诊断是否有肝癌以及肝癌是否发生恶化。
进一步的,所述预测肝癌治疗预后情况包括对肝癌治疗后复发的预测以及对肝癌治疗后转移的预测。
进一步的,所述检测GNL3的产品包括检测GNL3基因表达量的产品,包括检测GNL3基因mRNA水平的产品和/或检测GNL3蛋白水平的产品。
进一步的,所述产品包括:通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测GNL3基因表达以诊断肝癌、预测肝癌治疗预后情况、检测肝脏肿瘤干细胞的产品;所述用RT-PCR诊断肝癌、预测肝癌治疗预后情况、检测肝脏肿瘤干细胞的产品至少包括一对特异扩增GNL3基因的引物;所述用实时定量PCR诊断肝癌、预测肝癌治疗预后情况、检测肝脏肿瘤干细胞的产品至少包括一对特异扩增GNL3基因的引物;所述用免疫检测诊断肝癌、预测肝癌治疗预后情况、检测肝脏肿瘤干细胞的产品包括:与GNL3蛋白特异性结合的抗体;所述用原位杂交诊断肝癌、预测肝癌治疗预后情况、检测肝脏肿瘤干细胞的产品包括:与GNL3基因的核酸序列杂交的探针;所述用芯片诊断肝癌、预测肝癌治疗预后情况、检测肝脏肿瘤干细胞的产品包括:蛋白芯片和基因芯片;其中,蛋白芯片包括与GNL3蛋白特异性结合的抗体,基因芯片包括与GNL3基因的核酸序列杂交的探针。
进一步的,本发明还提供了检测GNL3的产品在检测GNL3与临床肝癌发展的相关性的应用方法,包括步骤:
S1、从肝癌临床标本库中选取若干肝癌患者的肝癌组织以及癌旁组织;
S2、利用检测GNL3的产品进行GNL3分子表达检测,并依据包括患者的临床分级、病理分级、生存率、是否早期复发转移的临床资料进行统计学分析,至少获取GNL3与原发性肝癌的临床分级、病理分级、生存率、是否早期复发转移的关系。
通过检测GNL3的产品检测临床样本中肝癌患者的肝癌组织与癌旁组织中GNL3的表达,有助于结合临床样本对应的临床资料进行统计学分析,从而获取GNL3基因表达与原发性肝癌的临床分级、病理分级、生存率、是否早期复发转移的关系,从而为诊断肝癌以及预测肝癌预后提供基础,方便使用GNL3作为肝癌发生、发展各个过程的标志物,从而准确的、特异的进行患者肝癌发展情况的判断,以便提出针对性的治疗方案。如,根据肝癌患者手术后标本GNL3表达高低以及对应肝癌后续发展情况能够预测未知病人的预后:对未知新临床肝癌患者手术后,通过检测患者术后标本GNL3的表达高低判断患者术后的预后,从而及时干预治疗。
本发明还提供了GNL3基因在制备治疗肝癌的药物中的应用。因为GNL3基因的表达与肝癌的发生、发展密切相关,且GNL3本身是细胞增殖所必需的,所以有望基于GNL3作为治疗肝癌的靶标,制备药物以干扰肝癌的发展,从而实现治疗效果;或,可能是GNL3相关产物或与GNL3相互作用的其他物质受到GNL3的调控而促进肝癌发展,此时则能基于GNL3基因制备靶向GNL3相关产物或靶向与GNL3蛋白相互作用的物质,以干扰肿瘤的发展。或,GNL3作为肿瘤干细胞的标记物,GNL3基因能够成为药物靶向作用的靶标或能够成为药物靶向肝脏肿瘤干细胞的靶标,从而干预肿瘤干细胞,以突破现有技术中复发、转移、耐药性对治疗效果的制约,提高治疗效果。
进一步的,所述药物靶向作用于肝脏肿瘤干细胞。
本发明还提供了一种研究GNL3、GNL3+肝脏肿瘤干细胞、肝癌发展三者相关性的实验方法,包括以下步骤:
S1、检测非肝癌组织与肝癌组织中的GNL3表达,验证GNL3在肝癌发生中的特异性表达;通过检测GNL3的特异性表达,能够明确GNL3与肝癌的发生、发展过程密切联系,方便进行后续GNL3与肝脏肿瘤干细胞、肝癌之间的相关性研究。
S2、基于S1获得的GNL3特异性表达结果,构建GNL3-GFP小鼠模型种群,包括注射肝致癌物的实验组和不注射肝致癌物的对照组;即确认GNL3作为一种肝癌的特异性标志后,构建GNL3-GFP小鼠模型种群,从而进行后续基于正常组织、肝癌组织的研究。具体的,利用所述GNL3-GFP标记,具有基因型稳定的优势;所述GFP代表荧光标记。
S3、分别获取步骤S2获得的小鼠模型于多个时间点的肝脏样本;研究GNL3+在肝癌发展过程不同时间点的表达率和分布,并记录不同表达率对应的时间点;获取不同时间点GNL3+的表达能够获取GNL3在肝癌恶化的各个阶段的表达,从而基于GNL3进行关于肝癌发展机理的研究,并有助于提供预测预后、诊断肝癌阶段的动物实验基础。且通过研究GNL3+在肝癌发展过程中的分布,有助于研究GNL3在促进肝癌转移的过程中的作用,有望后续基于GNL3提供针对性的治疗方法或药物以防止肝癌转移。所述GNL3+代表GNL3阳性表达。
S4、在以获得特定范围GNL3+表达率的最佳时间点收取实验组小鼠肝脏样本,并进行GNL3+肝肿瘤干细胞和GNL3-非肿瘤干细胞的分离;所述最佳时间点为肝癌恶化进程中GNL3+阳性表达率在20%-25%的时间点;所述GNL3+肝肿瘤干细胞为肝癌小鼠中肝脏肿瘤内表达GNL3的细胞,所述GNL3-非肝肿瘤干细胞包括肝脏肿瘤内不表达GNL3的细胞。所述最佳时间点为GNL3+表达率在以方便后续研究的特定范围内时的时间点。通过将GNL3+肝肿瘤干细胞和GNL3-非肿瘤干细胞的分离有助于后续针对性的进行GNL3+肝肿瘤干细胞的特性的研究,以发现包括其分子机制、致癌性等的特性,方便后续针对性的制备靶向药物。
进一步的,基于小鼠肝标本配合纤维外科镜行瘤体包膜内切除,尽量多剔除外层可疑组织,取得纯瘤;通过该方式获得的肿瘤纯度高,虽然每次样本收集量可能比较少,但可以增加标本数量以解决。
S5、验证GNL3+为肝脏肿瘤干细胞的特异性标记,并检测GNL3+肝脏肿瘤干细胞的特性、功能。验证GNL3+为肝脏肿瘤干细胞的特异性标记,能够为研究GNL3作用于肝癌发生的机制提供研究基础,同时也确认了GNL3不仅是肝癌的标志物,更是肝脏肿瘤干细胞的标志物。除了能促进对肝脏肿瘤干细胞的作用机制研究外,且基于GNL3能够靶向于肝脏肿瘤干细胞,有望提供一种新的靶向药物,以作用于肝脏肿瘤干细胞治疗肝癌。
更进一步的,步骤S1具体包括:
S11、在小鼠出生特定时间间隔后注射肝致癌物;
S12、获取步骤S1所得注射后小鼠特定生长时期的肝脏标本,所述特定生长时期包括非肝癌时期和肝癌时期;通过比较非肝癌时期与肝癌时期GNL3的表达,能够确定GNL3在肝癌组织中是否为特异性表达。
S13、对步骤S2获得的肝脏标本进行切片染色,染色包括HE染色、Ki67免疫组化染色、针对GNL3+的GNL3抗体免疫组化染色;和/或,进行Q-RT-PCR检测分析,获取GNL3+细胞与GNL转录的相关性。
更进一步的,所述GNL3-GFP小鼠模型种群构建过程包括以下步骤:
S21、构建GNL3-GFP小鼠模型,传代和繁殖至特定数目后进行分组,每次试验分为多个时间小组,且每个时间小组需同等数量的实验组、对照组小鼠,所述特定数目与所述试验次数所需总数目对应;通过分成多个时间小组,能够方便检测肝癌恶化过程中每个时间点的GNL3表达情况,也能方便基于某一特定时间组获得同一条件的小鼠,减少了其它干扰因素,保证了研究肝癌恶化的分子基础相同,提高实验的准确性。
S22、所述实验组使用DEN(20mg/kg体重)对14-15天龄小鼠进行腹腔注射以诱导肿瘤生长,并于第28天开始,对小鼠进行TCPOBOP(3mg/kg体重)注射,每2周1次,总共8次,以促进肿瘤生长;对照组则使用生理盐水腹腔注射;通过采用腹腔注射DEN+TCPOBOP两步法取代传统方法诱导形成GNL3-GFP小鼠肝癌模型,只要4个月左右就能快速诱导肝癌产生,且转化肝癌阳性率高,大大节省了时间成本和老鼠饲养的经费成本。
更进一步的,GNL3+肝肿瘤干细胞和GNL3-非肿瘤干细胞的分离包括以下步骤:
S41、采用流式细胞术从收取到的DEN+TCPOBOP诱导的实验组小鼠的肝癌组织中分离出GNL3+肝脏肿瘤干细胞和GNL3-非肝脏肿瘤干细胞;
S42、使用磁珠将血液细胞去除,并用流式仪去除死亡细胞;
S43、分开GFP+和GFP-细胞,获得纯化的活的GNL3+肝脏肿瘤干细胞和GNL3-非肝脏肿瘤干细胞。
进一步的,当FACS取到的GNL3+/GNL3-活细胞较少,培养时细胞可能不生长时,能够通过增加检测的灵敏度、增加样品数、改变培养液的生长因子和激素浓度以增加存活率以解决。
进一步的,步骤S5中采用体外移植实验验证GNL3+为肝脏肿瘤干细胞的特异性标记,分别将GNL3+肝脏肿瘤干细胞和GNL3-非肝脏肿瘤干细胞注入健康小鼠肝脏并检测对应小鼠肝脏致癌情况,依据GNL3+肝脏肿瘤干细胞的致癌效果验证GNL3为肝脏肿瘤干细胞的特异性标记;当表达GNL3的肝脏肿瘤干细胞移植正常小鼠后致瘤而未表达GNL3的非肝脏肿瘤干细胞并未致瘤,则说明GNL3为肝脏肿瘤干细胞的特异性标记物。
步骤S5检测GNL3+肝脏肿瘤干细胞的特性、功能包括利用细胞克隆形成实验检测GNL3+肝脏肿瘤干细胞的致癌能力、利用Q-RT-PCR实验检测并比较GNL3+肝脏肿瘤干细胞的分子谱和其他肝脏肿瘤内干细胞的分子表达、利用RNA-Seq检测比较GNL3+肝脏肿瘤干细胞与GNL3-非肝脏肿瘤干细胞分子特性的差异。通过检测GNL3+肝脏肿瘤干细胞的致癌能力,能基于其致癌能力研究肝癌的发展过程和机制,还能基于GNL3+肝脏肿瘤干细胞的致癌能力进行靶向治疗肝癌的药物的研究。比较GNL3+肝脏肿瘤干细胞的分子谱和其他肝脏肿瘤内干细胞的分子表达则能阐明GNL3标记肝脏肿瘤干细胞的特异性和有效性。利用RNA-Seq检测比较GNL3+肝脏肿瘤干细胞与GNL3-非肝脏肿瘤干细胞分子特性的差异,有助于筛查出除GNL3以外的下游肝癌恶化进程中新的潜在靶基因,为下一步继续研究肝癌恶化进程的分子机制打下基础。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:通过本发明提供的实验方法,能够获取GNL3在肝癌发展过程中的表达变化,从而以实现基于GNL3的肝癌诊断、预后预测;也为进一步研究GNL3的作用机制提供基础,以便后续基于GNL3制备靶向治疗肝癌的药物,促进肿瘤诊断、治疗领域的发展。同时,还能验证GNL3作为肝脏肿瘤干细胞的特异性标志物,方便从肿瘤干细胞层面应用GNL3以制备靶向肝脏肿瘤干细胞的治疗方法或药物,突破现有治疗方法受复发、转移、耐药性的制约,提高治疗效果。基于GNL3与肝脏肿瘤干细胞、肝癌发展的相关性研究,则能促进肝脏肿瘤干细胞其他分子靶标获取、肝脏肿瘤干细胞促癌机制研究、肝脏肿瘤干细胞与GNL3共同促癌机制研究的进展,推动肝癌治疗领域的发展。更重要的是,基于GNL3在肝癌中的特异性表达,能够以GNL3作为一种肝癌标志物以用于肝癌诊断、预后预测、肝癌治疗,提高诊断、预测、治疗的特异性和效果;而当GNL3作为肝脏肿瘤干细胞的特异性标志物时,则有助于在肝脏肿瘤干细胞层面上应用GNL3于肝癌诊断、预后预测、检测肝脏肿瘤干细胞、靶向肝脏肿瘤干细胞治疗;不仅为癌症领域提供新的标志物,还为肝癌的诊断、治疗提供新的研究方向及选择,有望于基于GNL3的特异性及临床应用以提高现有治疗方法的治疗效果,提高患者的生存率。
附图说明
图1为本发明的实验原理图。
图2为本发明的技术路线流程图。
图3为本发明的技术路线模拟图。
图4显示GNL3在DEN诱导的小鼠肝肿瘤中的表达。
图5为本发明的体内移植实验操作示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如ISambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold SpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例
一种研究GNL3、GNL3+肝脏肿瘤干细胞、肝癌发展三者相关性的实验方法,包括以下步骤:
S1、检测非肝癌组织与肝癌组织中的GNL3表达,验证GNL3在肝癌发生中的特异性表达;
具体的,S1包括步骤:S11、在小鼠出生特定时间间隔后注射肝致癌物;S12、获取步骤S11所得注射后小鼠特定生长时期的肝脏标本,所述特定生长时期包括非肝癌时期和肝癌时期;S13、对步骤S12获得的肝脏标本进行切片染色,染色包括HE染色、Ki67免疫组化染色、针对GNL3+的GNL3抗体免疫组化染色;和/或,进行Q-RT-PCR检测分析,获取GNL3+细胞与GNL转录的相关性。
本实施例步骤S1中,为了评估GNL3(NS)和原发性肝细胞癌恶化的进程发生、发展的相关性,即验证GNL3在肝癌发生中的特异性表达,检测了DEN诱导的小鼠肝癌模型:S11、小鼠出生后15天接受单剂量腹腔注射肝致癌物DEN(5ug/g);S12、分别在小鼠8个月和14个月收集小鼠肝脏标本;S13、对步骤S2获得的肝脏标本进行切片染色,染色包括HE染色、Ki67免疫组化染色、针对GNL3+的GNL3抗体免疫组化染色,并进行Q-RT-PCR检测分析,获取GNL3+细胞与GNL转录的相关性。实验结果如图4(图中:A1:8个月的HE染色为混合型结节;A2:8个月Ki67免疫组化染色;B1:14个月HE染色为肝癌;B2:14个月Ki67免疫组化染色;B3:14个月GNL3(NS+)抗体(Ab1138)进行GNL3+(NS+)免疫组化染色;C:正常肝细胞、混合型肝结节、肝细胞癌中GNL3+(NS+)和Ki67+细胞的比较;D:qRT-PCR检测GNL3(NS)转录的含量)所示:8个月大的肝脏包含多个发育异常的混合性结节(细胞核的异形性和嗜碱性的细胞质增加:图4A1);14个月大的肝脏有明显的肝癌结节(细胞核与细胞质比率上升,细胞核浓染,结构变形:图4B1);有丝分裂活动和GNL3(NS)表达分别由Ki67和anti-GNL3(Ab138)在相邻的切片部分染色(图4A2、B2、B3);和正常肝细胞中的GNL3+(NS+)相比,混合性肝结节中GNL3+(NS+)表达率无显著提高,但肝细胞癌中的GNL3+(NS+)表达率明显增加(图4C);并且GNL3+(NS+)细胞的显著增加是伴随着有丝分裂活跃(Ki67+)激增;Q-RT-PCR检测分析,肝癌晚期GNL3+(NS+)细胞的增加与GNL3(NS)转录增加正相关(图4D)。即GNL3在肝癌的发生、发展过程中呈特异性表达。
S2、基于S1获得的GNL3特异性表达结果,构建GNL3-GFP小鼠模型种群,包括注射肝致癌物的实验组和不注射肝致癌物的对照组;所述GNL3-GFP小鼠模型种群构建过程包括以下步骤:S21、构建GNL3-GFP小鼠模型,传代和繁殖至特定数目后进行分组,每次试验分为多个时间小组,且每个时间小组需同等数量的实验组、对照组小鼠,所述特定数目与所述试验次数所需总数目对应;S22、所述实验组使用DEN(20mg/kg体重)对14-15天龄小鼠进行腹腔注射以诱导肿瘤生长,并于第28天开始,对小鼠进行TCPOBOP(3mg/kg体重)注射,每2周1次,总共8次,以促进肿瘤生长;对照组则使用生理盐水腹腔注射。本实施例中每次实验需要5个时间小组,每个时间小组包括实验组6只、对照组6只,共进行5次重复实验,所以本实施例为检测肝癌恶化进程中GNL3的表达共需要300只带GNL3-GFP的转基因小鼠模型。
S3、分别获取步骤S2获得的小鼠模型于多个时间点的肝脏样本;研究GNL3+在肝癌发展过程不同时间点的表达率和分布,并记录不同表达率对应的时间点;
本实施例从第6个月起,分5个时间组(第6、7、8、9、10个月)收集实验组和对照组的小鼠肝脏标本进行免疫组化实验:标本用2%PFA液进行冲洗及灌注,并固定于4%PFA液中过夜。石蜡包埋后,切片厚度为5um,做免疫组织化,用Ab1138检测GNL3,同时流式细胞分析,检测GFP及内在GNL3蛋白的表达情况。不仅能比较和研究GNL3和GFP表达相关,还能比较在正常组织和肝癌组织恶化进程中不同时间点GNL3阳性表达率的变化。从而获取各个时间点对应的GNL3表达情况,便于后续利用GNL3进行治疗预后判断以及诊断等应用。
S4、在以获得特定GNL3+表达率的最佳时间点收取实验组小鼠肝脏样本,并进行GNL3+肝肿瘤干细胞和GNL3-非肿瘤干细胞的分离。
本实施例中选择在肝癌恶化进程中GNL3阳性表达率在20%-25%的时间点作为检测肝癌恶化进程中GNL3的功能和重要性实验的最佳标本收取时间。具体的,收取标本过程中,需收取100只DEN+TCPOBOP诱导的GNL3-GFP的转基因肝癌实验组小鼠模型,并选择在肝癌恶化进程中GNL3阳性表达率在20%-25%的时间点,收取对应100只肝癌实验组小鼠的肝癌组织进行检测肝癌恶化进程中GNL3的特性、功能和重要性。
所述GNL3+肝肿瘤干细胞和GNL3-非肿瘤干细胞的分离:采用流式细胞术从收取到的DEN+TCPOBOP诱导的实验组小鼠的肝癌组织中分离出GNL3+肝脏肿瘤干细胞和GNL3-非肝脏肿瘤干细胞;使用磁珠将血液细胞去除,并用流式仪去除死亡细胞,最后可以将GFP+和GFP-细胞分开,获得纯化的活的GNL3+肝脏肿瘤干细胞和GNL3-非肝脏肿瘤干细胞。
S5、验证GNL3+为肝脏肿瘤干细胞的特异性标记,并检测GNL3+肝脏肿瘤干细胞的特性、功能。
步骤S5中采用体内移植实验验证GNL3+为肝脏肿瘤干细胞的特异性标记,分别将GNL3+肝脏肿瘤干细胞和GNL3-非肝脏肿瘤干细胞注入健康小鼠肝脏并检测对应小鼠肝脏致癌情况,依据GNL3+肝脏肿瘤干细胞的致癌效果验证GNL3为肝脏肿瘤干细胞的特异性标记;具体的,本实施例中收取20只GNL3-GFP转基因健康小鼠模型,分别将分离纯化出来的GNL3+肝肿瘤干细胞注入10只健康小鼠肝脏(实验组),GNL3-非肝脏肿瘤干细胞注入另外10只健康小鼠肝脏(对照组),继续饲养两组小鼠,分3个月和6个月后两次取小鼠肝脏标本观察两组小鼠肝脏致癌情况,从而证明GNL3+是否是肝癌干细胞的标记物。体内移植操作步骤与图5标号对应,包括:a.腹部正中手术切口;b.剑突下分离肌层组织;c.切除剑突、暴露肝脏;d.使用湿润的无菌棉签托出肝脏;e.用明胶海绵覆盖注射部位;f.注入纯化的20ul GNL3+肝脏肿瘤干细胞(实验组)或GNL3-非肝脏肿瘤干细胞(对照组);g.检查注射部位后,用无菌棉签将肝叶放回腹腔h.连续缝合关闭肌层。
步骤S5检测GNL3+肝脏肿瘤干细胞的特性、功能包括利用细胞克隆形成实验检测GNL3+肝脏肿瘤干细胞的致癌能力、利用Q-RT-PCR实验检测并比较GNL3+肝脏肿瘤干细胞的分子谱和其他肝脏肿瘤内干细胞的分子表达、利用RNA-Seq检测比较GNL3+肝脏肿瘤干细胞与GNL3-非肝脏肿瘤干细胞分子特性的差异。
其中,利用细胞克隆形成实验检测GNL3+肝脏肿瘤干细胞的致癌能力的过程包括:先将流式分选出的细胞培养在添加HGF,EGF及OSM的完全培养液中。前3天为建立起需要的细胞株,培养液中添加25ng/ml Noggin,30%Wnt CM及10uM Y27632,3天后,随即更换成不含Noggin、Wnt及Y27632的培养液。10-14天后,将克隆体从基底胶中移出,分成小碎片,然后再移入新鲜的基质中。传代每7-10天按1:4-1:8的分离比率进行,并在培养过程中统计出生长曲线与扩张比率。其中,扩张比率基于以下过程获得:将3×103的细胞在上述培养液中生长7或10天,加入TrypLE Express(GIBCO)来分离细胞株,直至形成若干个的单个细胞;然后在指示时间点,利用台盼蓝拒染法进行细胞数目的计数;依据指数曲线基本公式:y(t)=y0xe(growth rate xt),(y=最终时间点的细胞数目,y0=起始时间点的细胞数目,t=时间),获得细胞生长率;且倍增时间依据下式计算,倍增时间=1n(2)/每个时间窗分析的生长率。
其中,利用Q-RT-PCR实验检测并比较GNL3+肝脏肿瘤干细胞的分子谱和其他肝脏肿瘤内干细胞的分子表达过程具体为:用定量RT-PCR(qRT-PCR)法,使用随机六聚体与M-MLV逆转录酶将总的RNAs(5ug)逆转录为第一链cDNAs。qPCR中,目标基因(GNL3,LGR5,EpiCAM,CD-24,CK-7,CK-19,AFP,CD-133)和参考基因(Rp1p0)之间的ΔC(t)标准值由MyiQ单色RT-PCR检测系统与超混SYBR绿色试剂所确定;从三个生物学重复、两个技术重复(n=6)到比较不同组别间目标基因序列的相关表达水平,来测量ΔC(t)标准值;所有最终结果与第二参考基因(HMG-14)相比较来确认,从而检测获得GNL3+肝脏肿瘤干细胞的分子谱。同时,还能检测GNL3+和其它肿瘤干细胞因子的表达和相关性,如:EpCAM、CD133,CD90,CD44,CD24和椭圆形细胞标记物OV6。从而阐明GNL3标记肝脏肿瘤干细胞的特异性和有效性。
其中,利用RNA-Seq检测比较GNL3+肝脏肿瘤干细胞与GNL3-非肝脏肿瘤干细胞分子特性的差异过程具体为:选取流式细胞仪分离出来的分离出GNL3+肝脏肿瘤干细胞和GNL3-非肝脏肿瘤干细胞进行RNA-seq检测,通过RNA-seq有助于获得GNL3+肝脏肿瘤干细胞和GNL3-非肝脏肿瘤干细胞分子变化的差异,有助于筛查出除GNL3以外的下游肝癌恶化进程中新的潜在靶基因,为进一步研究肝癌恶化进程的分子机制提供基础。
本实施例还提供一种利用检测GNL3的产品检测GNL3与临床肝癌发展的相关性方法,包括步骤:
S1、从肝癌临床标本库中选取若干肝癌患者的肝癌组织以及癌旁组织;S2、利用检测GNL3的产品进行GNL3分子表达检测,并依据包括患者的临床分级、病理分级、生存率、是否早期复发转移的临床资料进行统计学分析,至少获取GNL3与原发性肝癌的临床分级、病理分级、生存率、是否早期复发转移的关系。
本实施例中则是,从我们肝癌临床标本库中选取50位肝癌患者的肝癌组织及癌旁组织,采用IHC及Western-Blotting技术,进行GNL3分子表达检测,并结合患者的临床分级、病理分级、生存率、是否早期复发转移等临床随访资料,进行统计学分析,找出GNL3和原发性肝癌的临床分级、病理分级、早期复发转移和生存率的关系。以确认GNL3是否可作为判断肝癌恶化进程的分子靶标。
且在GNL3可作为判断肝癌恶化进程的分子靶标时,能够根据肝癌患者手术后标本GNL3表达高低以及对应肝癌后续发展情况能够预测未知病人的预后:对未知新临床肝癌患者手术后,通过检测患者术后标本GNL3的表达高低判断患者术后的预后。从而及时干预治疗,以进行针对性治疗,提高治疗效果。
具体的,本实施例中计量资料两组间比较采用t或t’检验,多组间比较采用方差分析,计数资料组间比较采用卡方检验。P值小于或等于0.05为统计学有显著性差异。
显然,本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例,而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种利用研究GNL3、GNL3+肝脏肿瘤干细胞、肝癌发展三者相关性的实验获取GNL3在肝癌发展过程中的表达变化的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、检测非肝癌组织与肝癌组织中的GNL3表达,验证GNL3在肝癌发生中的特异性表达;
S2、基于S1获得的GNL3特异性表达结果,构建GNL3-GFP小鼠模型种群,包括注射肝致癌物的实验组和不注射肝致癌物的对照组;
S3、分别获取步骤S2获得的小鼠模型于多个时间点的肝脏样本,研究GNL3+在肝癌发展过程不同时间点的表达情况和分布,并记录不同表达率对应的时间点;具体包括:从第6个月起,分5个时间组即第6、7、8、9、10个月,收集实验组和对照组的小鼠肝脏标本进行免疫组化实验:标本用2%PFA液进行冲洗及灌注,并固定于4%PFA液中过夜;石蜡包埋后,切片厚度为5um,做免疫组织化,用Ab1138检测GNL3,同时流式细胞分析,检测GFP及内在GNL3蛋白的表达情况;
S4、在以获得特定GNL3+表达率的最佳时间点收取实验组小鼠肝脏样本,并进行GNL3+肝肿瘤干细胞和GNL3-非肿瘤干细胞的分离;所述最佳时间点为肝癌恶化进程中GNL3+阳性表达率在20%-25%的时间点;
S5、验证GNL3+为肝脏肿瘤干细胞的特异性标记,并检测GNL3+肝脏肿瘤干细胞的特性、功能;
步骤S5中采用体外移植实验验证GNL3+为肝脏肿瘤干细胞的特异性标记,分别将GNL3+肝脏肿瘤干细胞和GNL3-非肝脏肿瘤干细胞注入健康小鼠肝脏并检测对应小鼠肝脏致癌情况,依据GNL3+肝脏肿瘤干细胞的致癌效果验证GNL3为肝脏肿瘤干细胞的特异性标记;步骤S5检测GNL3+肝脏肿瘤干细胞的特性、功能包括利用细胞克隆形成实验检测GNL3+肝脏肿瘤干细胞的致癌能力、利用Q-RT-PCR实验检测并比较GNL3+肝脏肿瘤干细胞的分子谱和其他肝脏肿瘤内干细胞的分子表达、利用RNA-Seq检测比较GNL3+肝脏肿瘤干细胞与GNL3-非肝脏肿瘤干细胞分子特性的差异。
2.根据权利要求1所述的一种利用研究GNL3、GNL3+肝脏肿瘤干细胞、肝癌发展三者相关性的实验获取GNL3在肝癌发展过程中的表达变化的方法,其特征在于,步骤S1具体包括:
S11、在小鼠出生特定时间间隔后注射肝致癌物;
S12、获取步骤S11所得注射后小鼠特定生长时期的肝脏标本,所述特定生长时期包括非肝癌时期和肝癌时期;
S13、对步骤S12获得的肝脏标本进行切片染色,染色包括HE染色、Ki67免疫组化染色、针对GNL3+的GNL3抗体免疫组化染色;和/或,进行Q-RT-PCR检测分析,获取GNL3+细胞与GNL3转录的相关性。
3.根据权利要求1-2任一项所述的一种利用研究GNL3、GNL3+肝脏肿瘤干细胞、肝癌发展三者相关性的实验获取GNL3在肝癌发展过程中的表达变化的方法,其特征在于,
所述GNL3-GFP小鼠模型种群构建过程包括以下步骤:
S21、构建GNL3-GFP小鼠模型,传代和繁殖至特定数目后进行分组,每次试验分为多个时间小组,且每个时间小组需同等数量的实验组、对照组小鼠,所述特定数目与所述试验次数所需总数目对应;
S22、所述实验组使用DEN对14-15天龄小鼠进行腹腔注射以诱导肿瘤生长,并于第28天开始,对小鼠进行TCPOBOP注射,每2周1次,总共8次,以促进肿瘤生长;对照组则使用生理盐水腹腔注射;
GNL3+肝肿瘤干细胞和GNL3-非肿瘤干细胞的分离包括以下步骤:
S51、采用流式细胞术从收取到的DEN+TCPOBOP诱导的实验组小鼠的肝癌组织中分离出GNL3+肝脏肿瘤干细胞和GNL3-非肝脏肿瘤干细胞;
S52、使用磁珠将血液细胞去除,并用流式仪去除死亡细胞;
S53、分开GFP+和GFP-细胞,获得纯化的活的GNL3+肝脏肿瘤干细胞和GNL3-非肝脏肿瘤干细胞。
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Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008102012A (ja) * | 2006-10-19 | 2008-05-01 | Kanazawa Univ | 癌幹細胞の同定および単離方法 |
CN101538554A (zh) * | 2009-04-30 | 2009-09-23 | 北京弘润天源生物技术有限公司 | 经耐受性筛选的肿瘤干细胞、其制法、应用和试剂盒及其抗原组合物、制法、应用和试剂盒 |
WO2015072247A1 (ja) * | 2013-11-14 | 2015-05-21 | 独立行政法人国立がん研究センター | がん幹細胞標的薬組成物 |
CN105407922A (zh) * | 2013-07-31 | 2016-03-16 | 生物技术公司 | 涉及癌症干细胞的癌症的诊断与治疗 |
Family Cites Families (3)
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WO2011014845A1 (en) * | 2009-07-31 | 2011-02-03 | Nanoink, Inc. | Screening system to identify patterns on substrate surfaces for inducing stem cell differentiation and producing homogenous population of a desired cell type |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008102012A (ja) * | 2006-10-19 | 2008-05-01 | Kanazawa Univ | 癌幹細胞の同定および単離方法 |
CN101538554A (zh) * | 2009-04-30 | 2009-09-23 | 北京弘润天源生物技术有限公司 | 经耐受性筛选的肿瘤干细胞、其制法、应用和试剂盒及其抗原组合物、制法、应用和试剂盒 |
CN105407922A (zh) * | 2013-07-31 | 2016-03-16 | 生物技术公司 | 涉及癌症干细胞的癌症的诊断与治疗 |
WO2015072247A1 (ja) * | 2013-11-14 | 2015-05-21 | 独立行政法人国立がん研究センター | がん幹細胞標的薬組成物 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Nucleostemin siRNA对肝癌细胞HepG2增殖的影响;袁富文 等;《中国生物化学与分子生物学报》;第29卷(第11期);第1041-1047页 * |
核干细胞因子蛋白(NS)在肝癌中的表达及临床意义;薛磊;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》(2013年7期);文章号E072-72 * |
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