CN101862448A - Afp基因修饰树突状细胞瘤苗对原发性肝癌发生发展的免疫保护作用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及构建了AFP分泌型C57BL/6J小鼠肝癌动物模型和制备AFP基因修饰的树突状细胞(DCs)瘤苗及其抗肿瘤作用。包括以下步骤：A、建立AFP分泌型C57BL/6J小鼠原发性肝癌模型；B、从小鼠原发性肝癌细胞中克隆甲胎蛋白(mAFP)基因并测序鉴定；C、构建pAdBM5-mAFP重组腺病毒载体、筛选并克隆获得高滴度重组腺病毒(AdBM5-mAFP)；D、树突状细胞的诱导扩增及表型分析；E、重组腺病毒转导DC(AdBM5-mAFP-DC)，从而获得表达AFP基因的树突状细胞瘤苗。本发明的AFP基因修饰的树突状细胞瘤苗对肝癌的发生有一定的免疫保护作用，也可用于肝癌的治疗。

Description

AFP基因修饰树突状细胞瘤苗对原发性肝癌发生发展的免疫保护作用

一、技术领域：本发明涉及一种转基因树突状细胞(DC)瘤苗的制备和一种小鼠原发性肝癌动物模型的建立

二、背景技术：

肝细胞癌(HCC)是一种常见的恶性肿瘤，复发转移率高，预后差，严重威胁着人类的健康。除了传统的手术、放疗、化疗之外，目前的研究热点已经集中到肿瘤的免疫与基因治疗上来。由于传统的防治方法显然不能很好地解决肝癌的早期预防和治疗问题。故如何寻找有效的肝癌特异性预防措施，是摆在我们面前的首要问题。机体的抗肿瘤免疫反应需要抗原抗体介导强有力的免疫反应，而肿瘤患者本身处于一种免疫无能状态，因此如何消除机体T细胞的免疫无能，重新激发机体免疫细胞(如CTL)对肿瘤抗原的的特异性的识别作用是需要解决的关键问题。

树突状细胞(Dendritic cells，DC)介导的肿瘤免疫治疗是目前免疫学和肿瘤学研究的一个热点领域，然而DC用于肝癌发生的免疫预防研究国内外尚未见报道。由于树突状细胞是专职的抗原递呈细胞，其抗原递呈能力是巨噬细胞的数十倍，可通过对其进行修饰以增加CTL对肿瘤抗原的特异性识别和杀伤作用。AFP是肝癌最为确定的肿瘤相关抗原，它在80％的肝细胞癌中高表达，因而通过病毒载体转导，AFP基因修饰DC，将特异性抗原信号强化传递给免疫效应细胞，使长期处于免疫耐受状态的自身抗原重新获得强的免疫原性，从而重新激活CTL对AFP抗原的识别作用，并刺激机体产生特异性的抗肿瘤免疫反应成是一条可行的途径。

基于以上目的，本发明从小鼠原发性肝癌细胞中克隆甲胎蛋白(murinealpha fetoprotein，mAFP)基因，用腺病毒载体(pAdBM5)介导的方法将mAFP基因转导DC(AdBM5-mAFP-DC)，使DC高表达mAFP抗原肽，从而构建树突状细胞转基因瘤苗，再将重组转基因DC瘤苗免疫C57BL/6J小鼠，可望刺激机体产生特异性抗肿瘤免疫反应，杀灭突变的肿瘤细胞，使肿瘤消灭在萌芽状态，从而获得免疫保护。

三、本发明内容：

本发明是构建一种既能用于肝癌预防又能用于肝癌治疗的重组树突状细胞瘤苗并建立一种用于肝癌研究的具有AFP分泌功能的小鼠肝癌动物模型

四、附图说明：

图1肝脏表面布满了0.5-2mm左右的灰白色斑点，质中等。

图2肝脏表面可见肝癌结节0.2-1cm大小，灰白色，突出于肝脏表面，包膜不完整，切面灰白色。

图3高分化肝细胞癌，可见病理性核分裂(×400)。

图4中分化肝细胞癌，细胞异型性明显，核大小不一，形状各异，可见瘤巨细胞，染色质明显增粗，排列结构紊乱(×400)。

图5胆小管上皮细胞高度增生。

图6肝脏大量纤维结缔组织增生，肝小叶结构破坏。

图7肝细胞异型增生，间质大量炎细胞浸润图(×100)。

图8第1道为Marker；第2道为正常肝组织，第3、4道为小鼠肝癌组织，可见AFP基因表达(474bp)，第5道为内参照。

图9mAFP1含有PmeI和BglII位点，长度为1850bp，mAFP2含KpnI和XbaI位点，长度为1856bp。

图10mAFP1测序峰图。

图11重组腺病毒制备原理及流程

图12mAFP1含有PmeI和Bg1II位点，长度为1850bp，mAFP2含KpnI和XbaI位点，长度为1856bp。

图13对pAdBM5-mAFP和pcDNA3.1(+)-mAFP质粒双酶切鉴定，1ane1为pcDNA3.1(+)-mAFP；1ane2为pAdBM5-mAFP。

图14、图15重组质粒和病毒DNA共转染293细胞后，出现CPE的细胞增大呈球形，易脱落。在荧光倒置显微镜下，胞浆可见绿色荧光蛋白表达(×100)。

图16收获的重组腺病毒再次感染293细胞，以大量扩增重组腺病毒，感染第3d可见绿色荧光蛋白表达。

图17重组腺病毒转染293细胞后，覆盖1.25％Seaplaque^R琼脂糖混合物，7天后可见明显明显噬斑形成。

图18SDS-PAGE电泳检测AFP蛋白在HEK293A细胞中的表达情况。

图19骨髓来源的DC的生长特性曲线

图20培养第1d的DC，细胞圆型，分布均匀；

图21培养第3d的DC，细胞体积增大，可见形成小集落，部分细胞表面出现突起。

图22培养第6d的DC，细胞呈集落生长。

图23培养第9d的DC，细胞突起明显，交织成网状。

图24未成熟DC低表达DC Marker(10.35％)，成熟过程中DC Marker表达逐渐增高(42.56％)。

图25透射电镜观察可见细胞胞质或突起内有较多的囊泡结构，存在大量粗面内质网、线粒体及等成分，细胞核不规则，细胞有细而长的突起。

图26、图27分别为放大250倍和400倍下重组腺病毒感染阳性的DC，可见GFP表达。

图28FCS分析，重组腺病毒转染DC后，与转染前比较，其MHC I、MHC II、CD18a、CD54、CD80和CD86等表面分子表达明显上调(p＜0.05)。

图29不同抗原[IL2(A)、EL4(B)和mAFP-EL4(C)]诱导靶向性CTL时，不同时间TNF-α分泌变化水平。

图30不同抗原[IL2(A)、EL4(B)和mAFP-EL4(C)]刺激诱导靶向性CTL时，不同时间IFN-γ分泌变化情况。

图31正常对照组肝脏肝细胞排列整齐，肝小叶，汇管区结构清晰，肝细胞大小形态正常，无炎细胞浸润(×100)。

图32pAdBM5-mAFP-DC免疫组间质及汇管区有大量淋巴细胞浸润(×100)。

图33Hepa-pAdBM5-mAFP-DC免疫组汇管区及间质大量炎性细胞浸润(×100)

图34单纯DC免疫组肝脏间质及汇管区有少量淋巴细胞浸润(×100)。

图35单纯重组质粒(pAdBM5-mAFP)免疫组间质及汇管区有少量淋巴细胞浸润(×100)。

图36癌前病变肝脏纤维结缔组织增生，胆管上皮过度增生，肝细胞异型增生，排列紊乱(×100)。

图37、38可见癌细胞大小形态不一，排列紊乱，核增大，染色质增粗，可见瘤巨细胞和病理性核分裂。

图39肝癌结节，灰白色，质地较硬，无明显包膜。与周围组织分界清。

五、具体实施方式

一、C57BL/6J小鼠肝癌动物模型的建立

1.诱癌方法：二乙基亚硝胺(DEN)大剂量一次腹腔注射C57BL/6J小鼠100mg/kg(生理盐水配制)。3天后开始灌胃四氯化碳(CCl₄)和橄榄油(配制体积比20∶80)，0.05ml/10g，2次/周。第3周DEN再灌胃1次，50mg/kg，同时开始给予含有9％乙醇饮用水，第4周开始CCl₄加大剂量到0.08ml/10g，每周一次，连续20周，同时喂以正常小鼠颗粒饲料。该方法诱癌成功率为78.89％(见表1)。小鼠死亡率低，诱癌期短。

表1实验组C57BL/6J小鼠肝癌发生情况

本实验在诱癌过程中，诱癌组死亡8例，死亡率是8.89％(8/90)，与文献报道的52.22％(47/90)有较大差异，因此极大限度地降低了小鼠在诱癌过程中死亡的发生，且死亡的小鼠均在头2个月内。因个体差异，个别小鼠对致癌药物的耐受性差。诱癌后期未见小鼠死亡。本研究经过20w的DEN/CCl4/乙醇联合诱癌，90只小鼠中，71只出现了典型的肝癌病灶，诱癌成功率为78.89％，11只出现了不同程度的慢性药物中毒性肝炎或/和肝硬化病变。诱癌结束后病理学检查发现(见图1-图8)，肝脏的病变有肝炎，肝硬化，非典型增生和肝癌四种不同的病变。提示肝癌的发生可能与人肝癌的发生有相似的过程。通过RT-PCR方法发现，所有的肝癌组织中均有AFP基因高表达，而在正常小鼠肝组织中不表达(见图8)。

二、mAFP基因克隆

通过设计特异性引物(含及AFP基因全长)，5′-AGATCTCTGCGGTGAAGGAACAAG-3′，5′-GGTTTAAACGCCCAAAGCATC-3′，成功从上述小鼠原发性肝癌细胞中克隆出mAFP基因(图9)。将RT-PCR扩增的mAFP基因产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳，显示在1850bp处有扩增条带，片段大小与理论预期值一致(图9)。将回收的目的片段连接到pGM-T Easy载体构建克隆载体pGM-T-mAFP，并用Bgl II和Pme I双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳在3015bp和1850bp处分别可见两条带，测序结果进一步证实克隆的序列完全正确(图10，图12)。将测序正确的mAFP基因亚克隆定向构建到pAdBM5穿梭质粒中，并用BglII和Pme I双酶切鉴定，从而构建出重组pAdBM5-mAFP质粒(图13)。mAFP基因含有一个1818bp的开放性读框，编码的蛋白质序列含605个氨基酸，分子量为67.336.KD；含有61强碱性氨基酸(K，R)；75个强酸性氨基酸201亲水性氨基酸(A，I，L，F，W，V)和190个极性氨基酸(N，C，Q，S，T，Y)。其等电点为5.771(PH 7.0)。

三、AdBM5-mAFP重组腺病毒制备

本研究将肝癌较为特异的甲胎蛋白(AFP)基因构建到含有强力启动子的pAdBM5腺病毒载体中，通过磷酸钙共沉淀法，将重组质粒和病毒DNA共转染293细胞，在293细胞中根据基因同源重组的原理，将小鼠AFP基因成功构建到腺病毒中，获得了高滴度具有感染性的重组腺病毒颗粒，病毒滴度达到3.2×10⁸PFU/ml(图11)。报告基因绿色荧光蛋白(GFP)是目前唯一在细胞内稳定表达、不需底物及辅助因子、无种属、组织及位置特异性的基因，而且其产物对细胞也无毒性，结果可靠、检测简单(图14-图18)。由于PFU测定法噬斑形成需要多个感染周期，需要3周左右才能得到结果，而且通常一个实验的结果很少能在其它的实验中得到重复，甚至在同一实验室的其他实验员也难以重复出同样的结果。因此本研究采用TCID50病毒滴度测定法，该方法的优点是快速(10d左右)，操作更简单，结果易于计算，不同人员实验或不同批次实验之间重复性更好。

●重组腺病毒在293细胞中扩增步骤：

1.在100mm培养皿或75cm²培养瓶中，接种5×10⁶个293A细胞，内含10ml5％DMEM。

2.取第一次扩增获得的病毒储备液0.5ml，加入5％DMEM至总体积为1ml，混匀。稀释后的感染复数(MOI)约为5。

3.去掉培养基，小心添加病毒储备液，注意不要搅起单层的293细胞，以交叉的方式缓慢摇动平板3次，使之扩展开来。37℃，5％CO₂孵箱中培养90min。

4.添加9ml 5％DMEM。

5.37℃，5％CO₂孵箱中培养72h。此时10ml 5％DMEM中应含有2.5×10⁹PFU。进行MOI试验，估计需要的病毒滴度。如果此时获得的病毒量足够的话，则可直接进行病毒滴度测定。此时，收集细胞，以600g离心5min，去上清，应用最少的体积重悬细胞。典型的是按1∶10的原体积比例或大约1ml体积。然后进行3个冻融周期(-80℃，至少2h，37℃至完全溶解)。收集沉淀细胞碎片于15ml离心管中。最大速离心10min，去除细胞碎片，收集上清于另一15ml锥形离心管中，进行滴度测定。

6.进行3个冻融周期(-80℃，至少2h，37℃至完全溶解)。

7.收集沉淀细胞碎片于15ml离心管中。最大速离心10min，收集上清于另一15ml锥形离心管中，存于-20℃或-80℃。

8.接种3×10⁷个293细胞于3×175cm²培养瓶中(1×10⁷个细胞/每瓶)。

9.将3ml步骤7获得的病毒裂解物上清与12ml的5％DMEM混合。去掉瓶中培养基，然后小心添加5ml裂解物于单层293细胞上，注意勿搅起细胞，以交叉的方式缓慢摇动平板3次，使之扩展开来。37℃，5％CO₂孵箱中培养90min。此时病毒的MOI应达到25。

10.用5％DMEM补足培养液至体积为30ml/每瓶。

11.37℃，5％CO₂孵箱中培养48-72h。此时90ml 5％DMEM中应含有1.5×10¹⁰PFU。进行MOI试验，如果此时获得的病毒量足够的话，则可直接转到病毒滴度测定步骤。注意应用最少的体积重悬细胞。

12.进行3个冻融周期(-80℃，至少2h，37℃至完全溶解)。

13.收集沉淀细胞碎片于50ml离心管中。最大速离心10min，收集上清于另一50ml锥形离心管中，存于-20℃或-80℃。

●病毒滴度测定

1.组织培养感染剂量(TCID₅₀)测定法

2.细胞准备

3.收集细胞并计数。

4.准备20ml 10×10⁵个细胞/ml悬液(2％DMEM)。

5.将上述悬液加入2块96孔平底平板，每孔100μl(10⁴个细胞，需无菌操作)。

6.病毒稀释

7.准备8个5ml稀释用一次性无菌离心管。每管加入1.8ml 2％DMEM，第一管加入0.2ml病毒储备液。

8.上下吹吸5次混匀。

9.每次稀释需更换tip头。

10.取0.2ml 10^-1的稀释液转入第二管。

11.重复稀释直到需要的最高稀释倍数。

12.用同样的病毒储存液进行第二系列的稀释。

13.加样完毕后，将培养板置于37℃，CO2孵箱中培养10天。

14.10天后用倒置显微镜读板分析。分排计数CPE个数。即使孔中只有一个小白点或只有几个细胞显示有CPE，也应记为阳性。如果对是CPE或是死细胞有怀疑，可参照阴性对照。

15.用法计算病毒的滴度：100μl的稀释液

16.(病毒滴度)T＝3.2×10⁸TCID₅₀/1ml PFU/ml

本研究采用的是pAdBM5腺病毒表达系统。pAdBM5腺病毒表达系统可使重组蛋白在293细胞中表达达到极高的水平。pAdBM5载体的主要特征是其增强子序列能显著增强重组腺病毒异位主要晚期启动子(major late promoter，MLP)活性，感染293细胞不需要辅助病毒的参与。重组腺病毒在293细胞中同源重组比在细菌细胞中同源重组更为可靠，原理简单，转染效率较高，宿主范围广，可感染静止期和分裂期细胞，同时又不整合到宿主细胞基因组中，而且产生的病毒滴度高，体内外转染效率也高。

四、pAdBM5-mAFP-DC瘤苗对小鼠肝癌发生发展的阻断作用

1小鼠骨髓来源DC的生物学特性

本研究中的DC来源于小鼠骨髓造血干细胞，在GM-CSF、IL-4等的诱导下逐渐向DC方向分化，即MDC。本研究发现，MDC在由幼稚向成熟DC发育的过程中，细胞形态和功能均发生了显著的变化。早期未成熟DC的突起少，在趋向成熟的过程中，细胞由圆形逐渐向多角形转变，细胞突起明显增多。在倒置显微镜下观察，DC前体细胞大小一致，呈圆形，分布均匀。次日细胞部分贴壁生长，部分形成集落，并有少量突起形成，第三日即可见明显的树突形成，细胞集落逐渐增多，细胞大小不一，分裂扩增出来的DC成半悬浮生长。至第9天，细胞增殖达到高峰。成熟的DC突起交织成网状，贴壁生长，呈现典型的树枝状形态特征(图19-图24)。在透射电镜下，可见培养9天DC部分细胞胞质或突起内有较多的囊泡结构，存在大量粗面内质网、线粒体及等成分，细胞核不规则，偏向细胞一侧，细胞有细而长的突起(图25)。

2重组腺病毒颗粒转染DC

将编码mAFP基因的重组腺病毒颗粒，以MOI 100转染DC，在荧光倒置显微镜下可观察到转染阳性的细胞会产生绿色荧光蛋白(图26-图27)。分别用大鼠抗小鼠荧光标记抗体标记转染前后的DC，发现转染后的DC分子的MHC I(34.8％，69.3％)、MHC II(17.2％，41.0％)、CD18a(20.7％，42.1％)、CD54(16.3％，63.2％)、CD80(27.3％，39.4％)和CD86(22.3％，38.6％)等分子显著增高，尤其是MHC II类分子、CD54和CD18a分子增高具有显著性差异(图28)。这些DC分子的显著增高，说明DC在遇到外来抗原刺激时，得到了进一步的活化，使DC进一步趋向成熟，有助于活化Th1型T细胞，从而发挥对肿瘤细胞的杀伤作用。DC表达的MHC I类和II类分子与其抗原呈递功能密切相关，为抗原识别和诱导免疫应答不可缺少的免疫分子。DC摄取外源性抗原后，抗原在细胞内降解为抗原肽，抗原肽与MHC II类分子结合形成MHC II-抗原肽复合物，并提呈至细胞表面，特异性CD4⁺ Th细胞识别MHC II类分子抗原肽复合物并被活化，启动特异性免疫应答。MHC I类分子主要是提呈内源性抗原，但外源性多肽也可由DC通过MHCI类分子提呈给CD8⁺T细胞。

3靶向性细胞毒性CTL的诱导及对AFP分泌性肝癌细胞的杀伤作用

C57BL/6J小鼠脾细胞经单纯IL-2诱导和EL4、EL4-mAFP冻融抗原刺激后，分别诱导出LAK、EL4-CTL和EL4-mAFP-CTL。在诱导前、诱导后12h、24h和48h分别检测其上清TNF-α、IFN-γ分泌水平。结果表明，基因转染的EL4(mAFP-EL4)抗原刺激诱导TNFα和IFN-γ分泌水平明显高于对照组，在诱导24h时达到峰值，随后分泌水平逐渐降低。这些细胞因子的分泌可协同提高CTL对肿瘤细胞的杀伤作用(图29，图30)。采用非放射性LDH释放法检测不同效靶比对肿瘤细胞杀伤试验，结果表明，EL4-mAFP抗原刺激诱导出的CTL对表达mAFP基因的EL4细胞的杀伤活性明显高于单纯EL4和Jurkat细胞，说明EL4-mAFP-CTL有针对AFP分泌细胞的靶向性细胞毒性。随着效靶比增加，效应细胞的杀伤活性逐渐增强，在效靶比为20∶1时，其杀伤活性明显增强。在40∶1时，EL4-mAFP-CTL对EL4-mAFP细胞的杀伤活性最高可达73.25％(见表2)。

表2靶向性CTL的细胞毒作用(

％)

统计方法  计数资料分析：多个样本均数比较及两两比较，EL4-mAFP-CTL对EL4-mAFP的杀瘤率可达73.25％，与其它组比较具有显著性差异(p＜0.01)，在20∶1以上效靶比时，其杀伤活性最强。

4mAFP转基因DC瘤苗对肝癌发生发展的免疫保护作用

在给诱癌剂的同时，我们用构建的重组腺病毒转基因DC瘤苗免疫小鼠，以观察瘤苗对小鼠肝癌发生的影响。我们发现，本研究未见肺、胃肠道、胰腺等内脏肿瘤，或转移肿瘤，亦未见淋巴结肿大。组织病理学检查发现(图31-图39)，免疫组肝细胞间质和汇管区均有不同程度的炎性细胞(淋巴细胞)浸润，但以pAdBM5-AFP-DC免疫组明显，单纯DC组和单纯重组质粒组，仅有轻度的淋巴细胞浸润。这是因为机体在受到伤害刺激时，不同的免疫制剂会激发不同强度的免疫保护作用。发生的肝细胞癌的组织学类型主要是中或高分化癌为主。肝硬化组织，可见纤维组织明显增生，胆管上皮增生明显多见，可见假胆管形成，肝小叶结构改建等。间质中有不等的炎细胞浸润。这些为肝癌的早期病变，进一步在诱癌剂的作用下，可发展为肝细胞癌。60只免疫小鼠中，单纯DC免疫组，肝细胞癌发生13例(13/20，65％)，肝纤维化4例(20％)，正常3例；重组质粒pAdBM5-AFP免疫组与单纯DC免疫组比较无显著性差异；而mAFP转基因DC瘤苗免疫组，肝细胞癌发生率仅为25％(5/20)，无瘤率为75％(15/20)，与DC组和pAdBM5-AFP组比较，无瘤率有显著性差异。对照组在诱癌过程中，未用任何免疫剂，肝癌的发生率为75％(15/20)，肝纤维化发生率为25％(5/20)，无正常小鼠(见表3)。由此说明，小鼠AFP基因修饰的转基因DC瘤苗对肝癌的自然发生有一定的免疫保护作用。

表3重组转基因DC瘤苗免疫小鼠与未免疫小鼠肝癌发生情况

统计方法  计数资料分析：多个样本率比较。^*组与^▲组比较，x²≥4.95，p＜0.05；^*组之间比较，p＞0.05，无显著性差异。

五、mAFP转基因DC瘤苗对肝癌移植瘤的抑制作用

40只C57BL/6J小鼠随机分为A、B、C、D和E组，每组8只。以免疫表达mAFP基因的重组腺病毒转染DC(pAdBM5-mAFP-DC)为A组；空pAdBM5质粒免疫为B组；以免疫表达mAFP基因的质粒DNA(pAdBM5-mAFP)为C组，单纯免疫DC为D组；以注射单纯PBS为对照组E组。免疫方法：A组和D组在每只小鼠的右腋下注射5×10⁵个细胞，B组和C组在每只小鼠的右腋下注射10.0μg质粒；E组，仅注射0.1ml PBS，每周注射1次，连续免疫4次。在初次免疫后的第3周给所有小鼠移植Hepa1-6肝癌细胞。观察小鼠移植瘤的生长情况，于移植肿瘤第14天处死小鼠，观察成瘤情况，计算抑瘤率。结果表明：A组有3只小鼠未长出移植瘤。处死小鼠称瘤重，发现A组瘤重与其他各对照组瘤重比较有显著性差异(P＜0.05或0.01)。A、B、C、D各组肿瘤抑制率分别为：68.31％、13.23％、52.1％和38.54％，A组抑瘤率显著高于其它各组(P＜0.05或0.01，见表4)。

表4各组小鼠成瘤率及瘤重比较

表1显示：A组成瘤率与其他各组分别比较，有显著性差异(P＜0.05)；A组平均瘤重与其它各组比较，P＜0.05或0.01。

小结：

1.本发明联合采用DEN/CCl4/乙醇三种药物诱导出C57BL/6J甲胎蛋白分泌性小鼠肝癌，模型稳定，诱导时间相对较短，癌变率高，经历了肝炎、肝硬化阶段，与人肝癌的发生发展过程相似，是较理想的研究肝癌的实验动物模型。

2.本发明成功构建了重组腺病毒载体(pAdBM5-mAFP)，获得了高滴度表达mAFP基因的重组腺病毒。

3.本发明成功构建了mAFP基因转染的DC瘤苗，转染后的DC细胞表面高表达MHC I、MHC II、CD18a、CD54、CD80和CD86等分子，尤其是高表达MHCII、CD54和CD18a分子；这些表面分子的高表达对于增强DC靶向抗原递呈，消除T细胞的免疫无能产生关键作用。

4.转基因DC瘤苗免疫Hepa1-6移植瘤C57BL/6J小鼠，能够显著增强小鼠对肝癌细胞的免疫力，从而有效减少肝癌的发生。

5.用构建的转基因DC瘤苗免疫自然诱癌的C57BL/6J小鼠，能诱导产生针对AFP分泌的肝癌细胞产生靶向性细胞毒性CTL，并通过分泌大量TNF-α和IFN-γH杀伤肿瘤细胞，从而有效地降低了肝癌的发生率，对肝癌的发生有一定的免疫保护作用。

6.本发明可用于原发性肝癌的免疫预防，也可以用于原发性肝癌的免疫治疗。

Claims (4)

1.AFP基因修饰树突状细胞瘤苗，特征在于采用以下方法制备：

A、采用二乙基亚硝胺(DEN)大剂量一次腹腔注射C57BL/6J小鼠100mg/kg(生理盐水配制)。3天后开始灌胃四氯化碳(CCl₄)和橄榄油(配制体积比20∶80)，0.05ml/10g，2次/周。第3周DEN再灌胃1次，50mg/kg，同时开始给予含有9％乙醇饮用水，第4周开始CCl₄加大剂量到0.08ml/10g，每周一次，连续20周，建立C57BL/6J小鼠肝癌模型。

B、通过RT-PCR法扩增的小鼠AFP基因编码区全长通过BglII和PmeI定向构建到pAdBM5穿梭质粒中。

C、重组质粒与腺病毒骨架在HEK293细胞中重组，扩增获得高滴度的重组腺病毒(AdBM5-AFP)，通过报告基因绿色荧光蛋白基因(GFP)进行阳性克隆的筛选。

D、用小鼠IL-4和GM-CSF从小鼠骨髓中扩增树突状细胞(DC)。

E、将重组腺病毒转染DC，获得AFP基因修饰树突状细胞瘤苗。

2.权利要求1的小鼠肝癌模型建立，其中采用DEN/CCl₄/乙醇联合诱发，建立AFP分泌型C57BL/6J小鼠肝癌模型。

3.权利要求1的AFP基因修饰树突状细胞瘤苗制备，其中将重组AdBM5-AFP-DC瘤苗免疫DEN/CCl₄/乙醇联合诱发小鼠自然肝癌。

4.权利要求1AFP基因修饰树突状细胞瘤苗抗肿瘤作用，将重组AdBM5-AFP-DC瘤苗用于原发性肝癌的预防和治疗。

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