CN101096670A - 干扰人甲胎蛋白基因的siRNA及重组腺病毒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种干扰人甲胎蛋白基因的siRNA及重组腺病毒，一种干扰人甲胎蛋白基因的siRNA，具有序列表SEQ ID No 1所述的寡核苷酸序列，和序列表SEQ ID No 2所述的寡核苷酸序列，一种表达针对人甲胎蛋白基因的siRNA的重组腺病毒效果明显，体外及体内动物实验均已表明它对肝癌细胞及已形成的肝肿瘤的生长都具有明显的抑制作用，一种表达针对人甲胎蛋白基因的siRNA的重组腺病毒是一增殖缺陷的病毒，因而病毒本身在体内不能扩增，具有安全性特点，易于制备和纯化。

Description

干扰人甲胎蛋白基因的siRNA及重组腺病毒

技术领域

本发明属于生物医药领域，特别是涉及一种干扰人甲胎蛋白基因的siRNA及一种表达针对人甲胎蛋白基因的siRNA的重组腺病毒。

背景技术

原发性肝癌(或称肝细胞癌，HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一，在我国的恶性肿瘤中死亡率居第二位。因此，对原发性肝癌的病因和治疗学等方面的研究始终是肿瘤学研究中的热点问题。甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)作为肝癌特异性最强的肿瘤标记物，是诊断肝癌的主要指标。

AFP其合成部位主要是在胚胎的肝脏，但也可在卵黄囊及胃肠道等。在正常情况下，AFP的功能可能主要在于维持正常妊娠，并保持胚胎不受母体排斥。AFP在成人血清的重新出现提示病理情况的出现，特别是肝癌和恶性畸胎瘤。因而过去AFP一直被认为是诊断原发性肝癌的特异性肿瘤标志物，具有早期诊断、鉴别诊断及确立诊断的作用。动态测定血清甲胎蛋白对肝癌手术、化疗、中西医结合治疗、放疗等疗效及预后判断有其重要的临床价值。

AFP在肿瘤发生发展中的诊断价值是勿庸置疑的，但是AFP调节肿瘤细胞生长的生物学作用却未得到重视。近十几年，研究者们发现甲胎蛋白是一种与肿瘤细胞生长密切相关的内源性蛋白，而不仅仅是单纯作为一种伴随出现的肿瘤特异性蛋白而存在。目前，人们已经认识到AFP的临床潜在作用(①Mizejewski GJ.Biological role ofalpha-fetoprotein in cancer：prospects for anticancer therapy.Expert RevAnticancer Ther.2002 Dec；2(6)：709-35.②Mizejewski GJ，Muehlemann M，DauphineeM.Update of alpha fetoprotein growth-inhibitory peptides as biotherapeutic agentsfor tumor growth and metastasis.Chemotherapy.2006；52(2)：83-90.③Muehlemann M，Miller KD，Dauphinee M，Mizejewski GJ.Review of Growth Inhibitory Peptide as abiotherapeutic agent for tumor growth，adhesion，and metastasis.Cancer MetastasisRev.2005 Sep；24(3)：441-67.)，其研究主要集中于以下几个方面：(1)AFP可作为抗肿瘤药物的结合物。研究显示AFP通过受体介导的细胞内吞途径容易结合并选择性进入肿瘤细胞。(2)AFP在细胞生长过程中的生长调节作用。有研究表明AFP在多种肿瘤细胞与正常细胞中表现有生长调节活性。AFP在高浓度的情况下以诱导细胞发生凋亡的形式体外抑制多种肿瘤细胞的生长。AFP还可以通过胞浆信号传导过程中蛋白与蛋白间的相互作用调控细胞生长。并且，AFP及其来源的肽段可以介导G蛋白偶联的信号转导从而调节细胞的生长。(3)AFP作为重要的蛋白因子可影响肿瘤免疫。(4)AFP来源的生长抑制肽(growth-inhibitory peptide，GIP)可作为抗肿瘤的生物治疗剂。GIP可以有效地抑制肿瘤的生长和转移，但对正常的成人细胞无影响。

近年来，有研究报道一些AFP型别可作为双向调节因子促进和抑制细胞的生长。在多种细胞类型中，如肝、胎盘、卵巢、子宫、淋巴、表皮、内皮、乳房和特定类型的肿瘤中，AFP上调和下调生长与分化的能力是与剂量密切相关的。外源性高剂量(＞100μg/ml)的AFP在体外实验中表现为生长抑制，可诱导肿瘤细胞的死亡，这种现象出现于多种肿瘤细胞，包括肝癌细胞HepG2，鼠的原始纤维细胞瘤细胞L-929和乳腺癌细胞MCF-7等。而低剂量的AFP(＜100μg/ml)则不但不能抑制细胞的生长，反而显示出轻微的刺激生长的效应。这些体外实验的数据表明AFP促进或抑制生长的作用与AFP的浓度密切相关。推测AFP调控细胞生长的可能机制包括凋亡调节、胞浆信号调节和受体脱敏等作用。最近几年，研究者发现AFP通过与细胞表面的受体结合，激活cAMP-PKA信号转导途径，改变K-ras p21基因的表达，进而影响细胞增殖。但是肝癌细胞本身表达的AFP对肝癌细胞的生长影响尚不清楚。因而本发明以确定内源性的AFP对肝癌细胞生长的影响为目标，采用了最为有效的抑制内源性基因表达的技术(即RNA干扰技术)。

核糖核酸干扰技术(RNAi)被评为2002年十大科技热点之一的是近年来发现的生物系统的一种比反义核酸更为有效的细胞内基因干扰系统[①Fire A，et al.Potent andspecific genetic interference by double-strand RNA in Caenorhabditis elegans，Nature《自然杂志》1998，391：806-871.②Tuschl T，et al.Target mRNA dergradationby double-strand RNA in vitro.Gene & Development《基因与进化杂志》1999，13：3191-3197]，或基因免疫系统即细胞内双链核糖核酸(dsRNA)介导对其相应单链靶序列特异性降解，达到阻止目标基因的表达，这种双链RNA作用效果好，比反义RNA(基因是单链)对RNA降解酶的抵抗力要强。在植物中可对外源性感染的病毒在基因(RNA)水平上进行有效的降解，从而达到抵抗病毒感染的作用[Voinnet O.RNA silencing as a plantimmune system against viruses.Trends in Genetics《遗传学趋势杂志》2001，17(8)：449-459]。但是这种双链核苷酸与一般化学药物相比的缺点是：其分子量比较大，制备合成时的技术要求相对复杂。

人们进一步发现双链RNA在降解过程中是通过裂解成21-25碱基的双链RNA(称为小干扰性RNA，siRNA)而发挥直接作用的[Elbashir SM，et al.Duplexes of 21-nucleotidesRNAs mediated RNA interference in cultured mammalian cells.Nature《自然杂志》2001，411：494-498]。根据这些原理，Gitlin等利用合成的小干扰性RNA特异阻止了脊髓灰质炎(Polio)病毒在细胞培养系统中的繁殖[Gitlin L，et al.Short interfering RNAconfers intrcellular activiral immunity in human cells.Nature《自然杂志》2002，418：430-434]，对丙型肝炎病毒的基因表达在细胞培养系统中的抑制可达90％以上[Willson JA，et al.RNA interference block gene expression and RNA synthesis fromhepatitis C replicons propagated in human liver cell.Proc.Natl.Acad.Sci.《美国国家科学院院刊》2003，100(5)：2783-2788]，和在小鼠体内对丙型肝炎病毒的抑制作用[McCaffrey AP，et al.RNA interference in adult mice.Nature《自然杂志》2002，418：38-39]等。这些研究结果已表明RNA干扰技术原理已作为一种有效的新药开发途径。因而，本发明选用了使用比反义核酸技术更为有效的核糖核酸干扰技术(RNAi)作为抑制肝癌细胞内源性AFP功能的一种手段，并研发抑制甲胎蛋白(AFP)性的抗肿瘤药物或处理方法。

到目前为止合成siRNA的方法主要有三大类：化学合成dsRNAs；体外生物转录双链/发夹结构RNAs(small hairpin RNA，shRNA)；利用质粒或病毒体内转录双链/发夹结构RNAs。但由于化学方法合成，其价格非常昂贵而且它诱导的基因沉默具有一过性的特点，因而在此之后又产生了基因工程技术途径合成的方法。siRNAs合成体外直dsRNA体外生物转录双链/发夹结构RNAs(small hairpin RNA，shRNA)再导入有机体内；利用适当的质粒或者病毒载体嵌入目的基因片段(一种人工设计shRNA的RNA分子)转入有机体后进行表达发夹结构RNAs，在体内加工为成熟的siRNA，从而引发基因沉默的作用。

我们在本发明中选择了腺病毒载体。因为目前，将遗传性物质导入人源性细胞最普遍使用的载体即为腺病毒。腺病毒有几大特点使其更适用于基因治疗。首先，腺病毒非常普遍。现已从大量不同物种中分离出腺病毒，并且已有报道的血清型有100多种，其中人类有43种。用于基因治疗的腺病毒多数成年人已经有过接触史(血清型2和5)。其次，腺病毒载体可以快速感染多种人类细胞，并且和其他现有载体相比，腺病毒载体趋向于产生高水平的转移基因产物。第三，腺病毒载体在人体中具有较低的致病性：它可以导致较轻症状的普通感冒。第四，腺病毒载体可以容纳相对较大的DNA片段(大于7.5kb)并可在非增殖细胞中转导这些基因。第五，病毒基因组的重排几率较低，插入的外源性基因在连续的病毒复制过程中通常不会发生改变。最后，腺病毒载体通过应用DNA重组技术比较容易操作。亚临床研究显示腺病毒载体DNA通常表达于肝，骨骼肌，心脏，肺，胰和肿瘤组织(Stephan A.Vorburger，Kelly K.Hunt.Adenoviral Gene Therapy.Oncologist，2002；7(1)：46-59)。当腺病毒载体通过静脉给入时，多数病毒集中于肝脏。因此，这将有利于肝癌的基因治疗。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种干扰人甲胎蛋白基因的siRNA。

本发明的第二个目的是提供一种表达针对人甲胎蛋白基因的siRNA的重组腺病毒。

本发明的第三个目的是提供一种采用siRNA干扰技术开发针对人甲胎蛋白基因mRNA(cDNA)全长2032个碱基序列为基础的临床应用产品。

本发明的技术方案概述如下：

一种干扰人甲胎蛋白基因的siRNA，具有序列表SEQ ID No 1所述的寡核苷酸序列，和序列表SEQ ID No 2所述的寡核苷酸序列。

一种表达针对人甲胎蛋白基因的siRNA的重组腺病毒(Adv-AFPsiRNA)，是用下述方法构建的：

(1)以人甲胎蛋白基因mRNA全长2032个碱基序列，应用软件进行小干扰RNA预测设计，筛选出最佳的RNA干扰靶位点区域，并针对此区域设计出干扰人甲胎蛋白基因的siRNA，发卡状siRNA及其发卡状siRNA互补的cDNA双链，所述干扰人甲胎蛋白基因的siRNA为序列表SEQ ID No 1所述的寡核苷酸序列，和序列表SEQ ID No 2所述的寡核苷酸序列，所述cDNA双链为序列表SEQ ID No 3所述的寡核苷酸序列，序列表SEQ ID No 4所述的寡核苷酸序列；

(2)合成SEQ ID No 3所述的寡核苷酸序列，SEQ ID No 4所述的寡核苷酸序列，退火，分别插入到pENTR/U6载体，构建成pENTR/U6/AFPsiRNA，转插入pAD/BLOCK-IT^TM-DEST载体，构建成了重组表达干扰AFPsiRNA的pAD/BLOCK-IT^TM-DEST/AFPsiRNA载体；

(3)转染293A细胞，筛选出一种表达针对人甲胎蛋白基因的siRNA的重组腺病毒。

采用siRNA干扰技术开发针对人甲胎蛋白基因mRNA(cDNA)全长2032个碱基序列为基础的临床应用产品。

本发明的特点是：

1.特异性强，针对肝癌特异性表达的甲胎蛋白的基因，对正常肝细胞及其它组织细胞不具有明显作用。

2.效果明显，体外及体内动物实验均已表明一种表达针对人甲胎蛋白基因的siRNA的重组腺病毒对肝癌细胞及已形成的肝肿瘤的生长都具有明显的抑制作用。

3.重组治疗肝癌的腺病毒是一增殖缺陷的病毒，因而病毒本身在体内不能扩增，具有安全性特点。

4.易于制备和纯化。

附图说明

图1为治疗肝癌的重组腺病毒(Adv-AFPsiRNA)对肝癌细胞(HepG2细胞)中AFP的表达的有效而特异的抑制作用。

A图中的C与B图中的control代表空白对照HepG2细胞组。

Control：代表空白对照HepG2细胞组；Adv-LacZsiRNA：表达无关siRNA的重组腺病毒组；Adv-AFPsiRNA：治疗肝癌的重组腺病毒组。

A.Western blot结果显示与对照相比，AFP的表达受到明显抑制。

B.柱形图显示与空白及阴性对照相比，AFPsiRNA对于靶蛋白表达的抑制率达75％。

图2为治疗肝癌的重组腺病毒(Adv-AFPsiRNA)对肝癌细胞(HepG2细胞)生长的抑制作用。

Adv-LacZsiRNA：表达无关siRNA的重组腺病毒组；Adv-AFPsiRNA：治疗肝癌的重组腺病毒组。

图3为治疗肝癌的重组腺病毒(Adv-AFPsiRNA)对(HepG2)肝癌肿瘤在裸鼠体内生长的抑制作用。

Untreated：PBS缓冲液对照组；Adv-LacZsiRNA：表达无关siRNA的重组腺病毒组；Adv-AFPsiRNA：治疗肝癌的重组腺病毒组

A.显示Adv-AFPsiRNA处理肿瘤组，Adv-LacZsiRNA处理肿瘤组与未处理肿瘤组之间肿瘤体积的显著性差异。在治疗结束时从动物体内取出肿瘤，每组6只动物。

B.显示Adv-AFPsiRNA处理肿瘤组，Adv-LacZsiRNA处理肿瘤组与未处理肿瘤组之间肿瘤体积的显著性差异。Adv-AFPsiRNA处理肿瘤组与其他两组的差异具有统计学意义(p＜0.01)。而另两组肿瘤体积并无统计学上的差异。

治疗肝癌的重组腺病毒(含Adv-AFPsiRNA的有义链)可转录出发卡状siRNA，形成SEQ IDNo 1和SEQ ID No 2，可以抑制甲胎蛋白基因转录的mRNA翻译甲胎蛋白的过程，进而对肝癌肿瘤的生长产生了抑制作用。

具体实施方式

下面对本发明作进一步的说明。

(1)以人甲胎蛋白基因mRNA(cDNA)全长2032个碱基序列，应用德国网上软件进行小干扰RNA(siRNA)预测设计，筛选出最佳的RNA干扰靶位点区域。并针对此区域设计出了干扰人AFP的siRNA和发卡状siRNA及其发卡状siRNA互补的cDNA序列。

将发卡状siRNA互补的cDNA的双链(即有义链与反义链)由美国IDT公司(Iowa，USA)合成。合成的序列为：

发卡状AFPsiRNA-有义链：(SEQ ID No 3)

5’-CACCGTACAAGGAAGTAAGCAAAATGTCGAAACATTTTGCTTACTTCCTTGTA-3’；

发卡状AFPsiRNA-反义链：(SEQ ID No 4)

5’-AAAATACAAGGAAGTAAGCAAAATGTTTCGACATTTTGCTTACTTCCTTGTAC-3’.

SEQ ID No 3中从5’端的第6-第26个碱基与SEQ ID No 2碱基序列互补，而第33-第53个碱基与SEQ ID No 1碱基序列互补，由SEQ ID No 3可转录出发卡状AFPsiRNA，从而形成SEQ ID No 1和SEQ ID No 2。

SEQ ID No 1：5’UACAAGGAAGUAAGCAAAAUG 3’

SEQ ID No 2：3’AUGUUCCUUCAUUCGUUUUAC 5’

(5’CAUUUUGCUUACUUCCUUGUA3’)

发卡状无关siRNA-有义链：

5’CACCGCTACACAAATCAGCGATTTCGAAAAATCGCTGATTTGTGTAG-3’

发卡状无关siRNA-反义链：

5’-AAAACTACACAAATCAGCGATTTTTCGAAATCGCTGATTTGTGTAGC-3’.

(2)将合成的发卡状AFPsiRNA-有义链，发卡状AFPsiRNA-反义链进行退火，同时合成的发卡状无关siRNA的有义链与发卡状无关siRNA-反义链进行退火，分别插入到pENTR/U6载体(Invitrogen，USA)，构建成pENTR/U6/AFPsiRNA与pENTR/U6/LacZsiRNA载体，然后转插入pAD/BLOCK-IT^TM-DEST载体(Invitrogen，USA)，从而构建成了重组表达干扰AFPsiRNApAD/BLOCK-IT^TM-DEST/AFPsiRNA和无关对照siRNA(LacZsiRNA)pAD/BLOCK-IT^TM-DEST/LacZsiRNA的载体，将此载体转染293A细胞，筛选出重组表达干扰AFP siRNA的腺病毒，大量制备，并滴定其病毒量。

将重组的腺病毒在体外培养的人肝癌细胞进行特异性AFP表达抑制实验及其生长抑制实验。

在裸鼠体内肝癌移植模型中进行重组治疗肝癌腺病毒实验性研究。

本发明流程

1.质粒的构建

1.1 pENTR/U6/AFPsiRNA与pENTR/U6/LacZsiRNA的构建

设计有义链与反义DNA链。

AFP的首链DNA长寡聚物(SEQ ID No 3)：

5’CACCGTACAAGGAAGTAAGCAAAATGTTCAAGAGACATTTTGCTT ACTTCC TTGTA-3’

AFP的底链DNA长寡聚物(SEQ ID No 4)：

5’-AAAATACAAGGAAGTAAGCAAAATGTCTCTTGAACATTTTGCTTAC TTCCTTGTAC-3’

LacZ的首链DNA长寡聚物：

5’-CACCGCTACACAAATCAGCGATTTCGAAAAATCGCTGATTTGTGTAG-3’

LacZ的底链DNA长寡聚物：

5’-AAAACTACACAAATCAGCGATTTTTCGAAATCGCTGATTTGTGTAGC-3’

(2)产生双链DNA核苷酸(ds oligo)。

无菌离心管中，室温下将首链DNA长寡聚物、底链DNA长寡聚物、退火缓冲液、无DNase/RNase水混合，经变性、室温下冷却后，瞬时离心5秒，混合均匀，-20℃保存。

(3)退火混合物中取出1μl按1∶20稀释。

(4)检测DNA双链退火效果。

应用5μl 1∶20稀释度的溶液进行检测，并与相应浓度的起始DNA单链进行比较。3％琼脂糖胶电泳，80V，30分钟。

(5)连接反应

室温下将连接缓冲液、pENTR^TM/U6、产生的双链DNA核苷酸(ds oligo)、无DNase/RNase水和T4 DNA连接酶混合，反复吹打均匀，室温下孵育两小时，这样就将DNA双链克隆入pENTR^TM/U6载体。

(6)用连接反应物转化TOP10感受态E.coli。

A.连接反应物与TOP10感受态E.coli混合，冰上放置，经热休克，再冰浴加入250μlSOC培养基，37℃水平振荡1小时，取出适量的转化液体，铺于预热好的含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂板上，37℃孵育过夜，挑取10个克隆进行检测

(7)分析转化株：

A.挑取10个卡那霉素抗性的克隆，在含有50μg/ml卡那霉素的LB或SOB培养液中培养过夜。

B.碱裂解法小量提取质粒DNA。

C.选定正确克隆，QIAGEN 100柱提取纯化pENTR/U6/AFPsiRNA与pENTR/U6/LacZsiRNA质粒。

1.2 pAD/BLOCK-IT^TM-DEST/AFPsiRNA和pAD/BLOCK-IT^TM-DEST/LacZsiRNA的构建

(1)建立LR重组反应体系

pENTR/U6/AFPsiRNA(或LacZsiRNA)(150ng/反应)    5μl

pAD/BLOCK-IT^TM-DEST(150ng/μl)                1μl

TE缓冲液，pH8.0                               2μl

LR克隆酶                                      4μl

混合均匀。

(2)25℃18小时。

(3)加入2μl蛋白酶K溶液。37℃ 10分钟。

(4)取出2μl转化TOP10，筛选正确克隆并纯化。

2治疗肝癌的重组腺病毒(一种表达针对人甲胎蛋白基因的siRNA的重组腺病毒)的制备与滴定

2.1病毒的制备

(1)PacI内切酶处理质粒pAD/BLOCK-IT^TM-DEST/AFPsiRNA(LacZsiRNA)：

pAd/BLOCK-iT^TM-DEST表达克隆转染293A细胞前，必须暴露左右两侧的病毒ITRs以进行正确的病毒复制和包装。过程如下：

A.应用Pac I酶切5μg纯化的pAD/BLOCK-IT^TM-DEST/AFPsiRNA或pAD/BLOCK-IT^TM-DEST/LacZsiRNA。

B.酚/氯仿抽提纯化酶切的质粒DNA，应用乙醇沉淀。

C.用10μl TE缓冲液，pH 8.0，重悬洗提纯化的质粒。

(2)转染293A细胞(生含有10％FBS的MEM-α培养液)

A.制备DNA-LipofectAmine^TM 2000复合体

稀释1μg Pac I酶切的pAD/BLOCK-IT^TM-DEST/AFPsiRNA(LacZsiRNA)至250μlOpti-MEM I无血清培养基中，混合均匀。

LipofectAmine^TM 2000用前轻轻混匀，取3μl稀释至250μl Opti-MEM I无血清培养基中，混合均匀，室温下孵育5分钟。

将稀释的DNA与LipofectAmine^TM 2000混合均匀。

室温下孵育20分钟，使得DNALipofectAmine^TM 2000复合体形成。

B.在培养293A细胞的6孔板中，先更换不含抗生素10％FBS的MEM-α培养液。再将DNA-LipofectAmine^TM 2000复合体滴加入每孔中，混合均匀，37℃、CO₂孵箱中孵育过夜。次日，更换MEM-α完全培养基。

C.每2-3天更换5％FBS MEM-α培养基一次，直至可见细胞病变(CPE)G.更换培养液，使得病变继续进展，直至80％CPE产生

D.将含有病毒的细胞由培养板上吹打下来，将细胞和培养液共同转移至无菌的1.5ml离心管中。

(3)制备病毒裂解粗提物

A.将含有细胞和培养液的离心管在-80℃放置30分钟，再取出于室温下融解。重复两次。

B.台式离心机离心细胞裂解物，室温下3000转/分钟(936g)离心15分钟以沉降细胞碎片。

C.将含有病毒颗粒的上清转移分装至1.5ml离心管中，每管1ml，保存于-80℃。

2.2病毒的浓缩与纯化

(1)293A细胞传至15cm玻璃平皿内，待生长至80-90％时，更换2％FBS的MEM-α，加入5×10⁶pfu重组腺病毒。37℃，5％ CO₂孵箱内孵育。

(2)48小时，细胞病变达80％左右，小心吸取上清，保存于-80℃。每平皿于细胞单层上添加8ml PBS，于-80℃反复冻融三次后与上清混合。

(3)4℃，7000转/分钟(5000g)离心15分钟，小心取上清。

(4)加入3M NaCl 8ml，终浓度为0.5M，充分混匀。

(5)加入无菌的50％聚乙二醇(PEG8000)9ml，至终浓度8％，充分混匀，4℃搅拌过夜。

(6)4℃，10000g 30分钟，弃上清。

(7)400μl PBS重悬沉淀，分装至1.5ml离心管中，100μl/管，保存于-80℃。2.3滴定制备病毒：

(1)转染前一天(第一天)，消化并计数293A细胞，以80-90％的密度传入培养板中，37℃过夜。

(2)转染当天(第二天)，融解病毒并准备10倍系列稀释的液体，由10^-4至10^-9。对于每个稀释度，将病毒原液用2％FBS的MEM-α培养基稀释至300μl，注意不要涡旋。

(3)弃去细胞培养液，将稀释好的病毒液加入各孔中(总体积300μl)。

(4)轻轻将培养基摇匀，37℃孵育5个小时。

(5)弃去含有病毒的培养液并在每孔中加入1ml琼脂糖溶液覆盖。制备琼脂糖溶液方法如下：

A.对于一块24孔板，轻轻混合24ml 37℃预热的培养液和2.4ml，65℃预热的4％琼脂糖，注意不要产生气泡。

B.将混合液小心延孔壁加入孔(每孔加入1ml)中。

C.室温下将24孔板水平放置直至琼脂糖凝固。将24孔板放回37℃、CO₂孵箱。

(6)加入琼脂糖胶3-4天后(第6-7天)，每孔再额外加入0.5ml琼脂糖胶，制备过程同上。待胶凝固后放回37℃、CO₂孵箱。

(7)观察平板直至可见空斑(通常感染后8-12天)。计数空斑数即可得到病毒的滴度。

3.治疗肝癌的重组腺病毒(一种表达针对人甲胎蛋白基因的siRNA的重组腺病毒)体外对HepG2细胞AFP表达及其生长抑制作用

3.1治疗肝癌的重组腺病毒(一种表达针对人甲胎蛋白基因的siRNA的重组腺病毒)体外对HepG2细胞AFP表达，结果见图1。

(1)感染前一天，消化并计数HepG2细胞，以80-90％的密度传入24孔培养板中，37℃过夜。

(2)感染当天，融解病毒并用2％FBS的MEM-α培养基稀释病毒至300μl，MOI＝20，充分混匀。

(3)弃去细胞培养液(24孔板)，将稀释好的病毒液加入各孔中(总体积300μl)。

(4)轻轻将培养基摇匀，37℃孵育5个小时。

(5)弃去含有病毒的培养液并在每孔中加入10％FBS的MEM-α完全培养基，将24孔板放回37℃、CO₂孵箱。

(6)48小时后获取细胞进行分析。细胞用PBS清洗一次。

(7)24孔板培养细胞，每孔加入100μl RIPA；6cm平皿培养细胞，每平皿加入400μl RIPA。置于4℃，裂解25分钟。

(8)收集裂解液，反复吹打20次，4℃ 16000g，离心10分钟，收集上清。

(9)考马司亮蓝G-250法测定蛋白含量，各样品均取出50μg进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳。

(10)目的蛋白电泳至胶体中部，取出聚丙烯酰胺凝胶进行硝酸纤维素膜电转移。4℃，100mA，转移过夜。

(11)出硝酸纤维素膜，置于Blotto封闭液中，室温下封闭3个小时。

(12)加入一抗，室温下孵育两个小时。

(13)TBST清洗4次，每次5分钟。

(14)加入二抗，室温下孵育一个小时。

(15)TBST清洗4次，每次5分钟。

(16)按照使用说明加入增强化学发光试剂，作用3分钟，曝光，观察结果。

3.2治疗肝癌的重组腺病毒(一种表达针对人甲胎蛋白基因的siRNA的重组腺病毒)体外对HepG2细胞生长的抑制作用

采用克隆形成实验，为检测AFP静默的HepG2细胞的增殖能力(克隆形成能力)，我们进行了三次独立的实验，应用Adv-AFPsiRNA和Adv-LacZsiRNA分别感染HepG2细胞，以检测其克隆形成能力的差异。三种pSilencer2.1-U6neo/AFPsiRNA转染HepG2细胞稳定筛选克隆和对照未处理HepG2细胞的克隆形成检测运用相同方法进行。结果见图2。

(1)Adv-AFPsiRNA和Adv-LacZsiRNA感染HepG2细胞48小时后，消化，计数，保证以相同的密度接种至六孔板中。

(2)每种细胞各2×10³个重悬于2.4ml软琼脂培养基(0.3％琼脂糖，10％FBS的MEM-α培养基)，接种到含有基底层(0.5％琼脂糖，10％FBS的MEM-α培养基)的六孔板中。

(3)室温下静置，待软琼脂凝固后，每孔加入2ml MEM-α完全培养基。每三天更换一次。

观察细胞三周，肉眼观察克隆形成情况并进行计数。

Adv-AFPsiRNA的有义链可转录出发卡状siRNA，形成序列SEQ ID No 1和SEQ IDNo 2，可以抑制甲胎蛋白基因转录的mRNA翻译甲胎蛋白的过程，进而对HepG2细胞的生长产生了抑制作用。

4.治疗肝癌的重组腺病毒(一种表达针对人甲胎蛋白基因的siRNA的重组腺病毒)对肝癌生长的抑制作用

采用肝癌细胞(HepG2)裸鼠成瘤移植模型中进行实验，结果见图3。

(1)选择4-6周龄BALB/c无胸腺裸鼠。于裸鼠右腋下注射1×10⁷ HepG2细胞/200μl。

(2)待肿瘤生长至直径5mm时，随机分配至Adv-AFPsiRNA注射组(n＝6)；Adv-LacZsiRNA注射组(n＝6)；无处理组(n＝6)。

(3)重组Adv-AFPsiRNA注射组与Adv-LacZsiRNA注射组分别共注射4次。前两次为每两天一次，后两次为每三天一次。每次注射的重组腺病毒用PBS稀释至3×10⁸pfu/100μl。注射时，分三个方向进针进行注射。

(4)裸鼠成瘤第16天处死，用电子标尺衡量肿瘤长度与宽度。肿瘤体积用公式(长×宽²)/2计算，并表示为平均值±SDmm³。肿瘤保存于-80℃。

(5)应用SPSS11.0中的one-way ANOVA(Scheffe test)方法分析各组间肿瘤体积的差异。

(6)肿瘤固定于10％甲醛溶液，石蜡包被，制备肿瘤组织切片并进行HE染色。

局部通过瘤内注射本发明的一种表达针对人甲胎蛋白基因的siRNA的重组腺病毒，其治疗显示肿瘤的生长明显受到抑制，这与Adv-AFPsiRNA对于HepG2细胞生长影响的体外实验结果是一致的。研究表明，瘤内注射重组腺病毒可能导致皮下肿瘤转基因的非均一性表达。这种局限可导致最终肿瘤的再生。考虑到这一点，我们首先将瘤内注射分为三个不同的角度，尽量使重组腺病毒在瘤体内均一分布。同时，我们在注射重组腺病毒后第十六天停止观察，收集肿瘤样本。结果显示Adv-AFPsiRNA导致明显的肿瘤生长抑制。

Claims (2)

1.一种干扰人甲胎蛋白基因的siRNA，其特征是具有序列表SEQ ID No 1所述的寡核苷酸序列，和序列表SEQ ID No 2所述的寡核苷酸序列。

2.一种表达针对人甲胎蛋白基因的siRNA的重组腺病毒，其特征是用下述方法构建的：(1)以人甲胎蛋白基因mRNA全长2032个碱基序列，应用软件进行小干扰RNA预测设计，筛选出最佳的RNA干扰靶位点区域，并针对此区域设计出干扰人甲胎蛋白基因的siRNA，发卡状siRNA及其发卡状siRNA互补的cDNA双链，所述干扰人甲胎蛋白基因的siRNA为序列表SEQ ID No 1所述的寡核苷酸序列，和序列表SEQ ID No 2所述的寡核苷酸序列，所述cDNA双链为序列表SEQ ID No 3所述的寡核苷酸序列，序列表SEQ ID No 4所述的寡核苷酸序列；

(2)合成SEQID No 3所述的寡核苷酸序列，SEQID No 4所述的寡核苷酸序列，退火，分别插入到pENTR/U6载体，构建成pENTR/U6/AFPsiRNA，转插入pAD/BLOCK-IT^TM-DEST载体，构建成了重组表达干扰AFPsiRNA的pAD/BLOCK-IT^TM-DEST/AFPsiRNA载体；

(3)转染293A细胞，筛选出一种表达针对人甲胎蛋白基因的siRNA的重组腺病毒。

3.采用siRNA干扰技术开发针对人甲胎蛋白基因mRNA(cDNA)全长2032个碱基序列为基础的临床应用产品。

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