JP2022539077A - ホモシスチン尿症を処置するための酵素療法のためのｐｅｇ化シスタチオニンベータ合成酵素 - Google Patents

ホモシスチン尿症を処置するための酵素療法のためのｐｅｇ化シスタチオニンベータ合成酵素 Download PDF

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Abstract

本開示は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＰＥＧ化ＣＢＳタンパク質を備える医薬品のための製剤を提供する。それを必要とする対象におけるホモシスチン尿症を処置するための投与量および投与レジメンが提供される。さらに、それを必要とする対象におけるホモシステイン（Ｈｃｙ）レベルを低下させる、あるいはシステイン（Ｃｙｓ）および／またはシスタチオニン（Ｃｔｈ）レベルを上昇させるための投与量および投与レジメンも提供される。

Description

本開示は、本明細書に記載される医薬品を使用してホモシスチン尿症を処置するための酵素療法のための組成物および方法に関する。
古典的ホモシスチン尿症（ＨＣＵ）またはＨＣＵ１型としても知られる、シスタチオニンβ合成酵素欠損ホモシスチン尿症（ＣＢＳＤＨ）は、小児と成人の両方で罹患する希少疾患である。ＣＢＳＤＨは、シスタチオニンβ合成酵素（ＣＢＳ）酵素の活性低下または非存在による、尿、組織および血漿中の過剰の化合物ホモシステイン（Ｈｃｙ）を特徴とする稀な常染色体劣性代謝状態である（それぞれ全体が本願明細書に援用される、非特許文献１；非特許文献２参照）。
ＣＢＳＤＨの診断は、非特許文献２に記載されるＣＢＳ遺伝子の分子遺伝検査によって確認され得る。ＣＢＳは、食事中のタンパク質に存在する硫黄アミノ酸メチオニン（Ｍｅｔ）の代謝における酵素である（全体が本願明細書に援用される、非特許文献３参照）。したがって、ＣＢＳＤＨは、血漿中の総メチオニン濃度の著しい増加の測定によっても診断され得る。これらの上昇したアミノ酸の所見は、ＣＢＳ酵素活性低下の検出またはシスタチオニンβ合成酵素をコードする遺伝子における二対立遺伝子病原性変異体の検出によって実証され得る（全体が本願明細書に援用される、非特許文献４参照）。ＣＢＳ欠損はまた、シスタチオニン（Ｃｔｈ）およびシステイン（Ｃｙｓ）のレベル低下につながる（全体が本願明細書に援用される、非特許文献５参照）。
ＣＢＳＤＨは、以下（非特許文献４）：１）水晶体偏位（眼の水晶体の脱落）および／または重度の近視、無力体質（長身で痩せた）、骨格異常、早発性骨粗鬆症、および／または血栓塞栓性イベント、不明な発達遅延／知的障害を含む臨床所見；２）高メチオニン血症の新生児スクリーニング、または具体的にはＣＢＳ欠損の陽性家族歴が発症前患者識別につながり得る（全体が本願明細書に援用される、非特許文献６参照）；ならびに３）家族歴に基づいて疑われ得る。患者間でこれらの臨床徴候および症状発生年齢の全てにおいてかなりの変動性がある。現在のスクリーニング手法は通常、あまり重度でないＣＢＳ欠損を有する新生児を検出することができず、より重度のＣＢＳＤＨを有する患者のごく少数を検出するにすぎない（それぞれ全体が本願明細書に援用される、非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９参照）。これは、世界中で推定有病率１：２０００００～１：３３５０００の、最も一般的な硫黄代謝の遺伝障害である。硫黄代謝経路において、必須アミノ酸Ｌ－メチオニンはＨｃｙに代謝され、これに最初にＣｔｈ、最後にＣｙｓへの二段階硫黄転移が続く。ＣＢＳは、主に肝臓および腎臓で見られ、ＨｃｙをＣｔｈに触媒する。過剰のＨｃｙはベタイン－Ｈｃｙ ５－メチルトランスフェラーゼによってメチオニンに再メチル化され、血漿Ｍｅｔのレベルも上げ得る。
一部の患者は、生後まもなく疾患と診断されるが、しばしば、ＣＢＳＤＨの診断は、古典的臨床症状を発症した後、晩年に行われる（共に全体が本願明細書に援用される、非特許文献７；非特許文献８参照）。ＣＢＳＤＨは、発達遅延／知的障害、水晶体偏位および／または重度の近視、骨格異常（過剰な身長および手足の長さ）、および血栓塞栓症を特徴とする。患者間でこれらの臨床徴候の全てにおいてかなりの変動性がある。
正常な総ホモシステイン（ｔＨｃｙ）レベルは、年齢、性別および栄養状態で変動するが、典型的には４．５～１１μｍｏｌ／Ｌの間の範囲である（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１０参照）。男性は女性よりもわずかに（１～２μｍｏｌ／Ｌ）高いｔＨｃｙレベルを有する傾向があり、患者が小児から８０歳になるにつれて、平均値のおおよその倍加が観察される（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１１参照）。葉酸補充集団では、ｔＨｃｙレベルの上限（９７．５％）が、６５歳未満の成人でおおよそ１２μｍｏｌ／Ｌ、６５歳超の成人で１６μｍｏｌ／Ｌである。多くのＣＢＳＤＨ患者が、１００μｍｏｌ／Ｌ超の総ｔＨｃｙレベルで重度の高ホモシステイン血症を呈示するが、軽度～数倍の正常の範囲の上昇を呈す者もいる（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２参照）。ｔＨｃｙレベルは、疾患の重症度と高度に相関することが観察されている（全体が本願明細書に援用される、非特許文献６参照）。
ＣＢＳＤＨは、眼（水晶体偏位および／または重度の近視）、骨格系（過度の身長、長い手足、脊柱側弯症および漏斗胸）、血管系（血栓塞栓症）、および中枢神経系（ＣＮＳ）（発達遅延／知的障害）の状態を特徴とする。患者間でこれらの臨床徴候の変動的発現があり、全ての系の関与またはわずか１つの関与があり得る。一部の患者は重度の小児発症多系統疾患を有するが、あまり重度でない疾患を呈示する者は成人期まで無症候のままであり得る。より重度の患者では、処置をしないと、平均余命が著しく減少する（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２参照）。
研究により、ＣＢＳＤＨ患者におけるＨｃｙレベルの低下が、臨床症状のあまり重度でない顕在化と相関することが示されている（全体が本願明細書に援用される、非特許文献６参照）。Ｈｃｙレベルがこれらの系に対する損傷を引き起こす経路は広く記載されており（例えば、それぞれ全体が本願明細書に援用される、非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５）、一般集団におけるＨｃｙの役割を同様に調査するための研究につながっている。
現在、ＣＢＳＤＨを管理するために利用可能な治療はわずかである。現在の治療は、以下：１）タンパク質および／またはＭｅｔ摂取量を減少させるための食事修正；２）以下：葉酸、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ６の一部または全部の補充；ならびに３）蓄積したＨｃｙのＭｅｔへの酵素的再メチル化を増強するためのメチルドナーであるベタインの補充のうちの１つまたは複数の組み合わせを通して硫黄代謝経路を標的とする。ＣＢＳＤＨ患者の生活の質（ＱｏＬ）についての研究は公開されていないが、患者およびその介護者は、高度に制限され、社会的に孤立している食事に従い、これを管理することの社会心理的効果に苦しんでいることが観察されており、疾患の長期の医学的結果について極めて不安を覚えている。多くの患者が、その長期の見込みを損なうことなく、食事を楽にすることができることへの切望を報告している。
クラウスら（Ｋｒａｕｓ ｅｔ ａｌ．）、カーメル アール（Ｃａｒｍｅｌ Ｒ）、ヤコブセン ディーダブリュー（Ｊａｃｏｂｓｅｎ ＤＷ）編．Ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ．英国ケンブリッジ：ケンブリッジ大学出版局（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）；２００１：２２３－２４３ サシャロフら（Ｓａｃｈａｒｏｗ ｅｔ ａｌ．）、シスタチオニンベータ合成酵素欠損によって引き起こされるホモシスチン尿症（Ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ Ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ Ｂｅｔａ－Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）．アダム エムピー（Ａｄａｍ ＭＰ）、アーディンガー エイチエイチ（Ａｒｄｉｎｇｅｒ ＨＨ）、パゴン アールエー（Ｐａｇｏｎ ＲＡ）、ウォレス エスイー（Ｗａｌｌａｃｅ ＳＥ）、ビーン エルジェイエイチ（Ｂｅａｎ ＬＪＨ）、メフォード エイチシー（Ｍｅｆｆｏｒｄ ＨＣ）ら編．ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓＴＭ［インターネット］．シアトル（ワシントン州）：ワシントン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）、シアトル、２０１７ マクリーンら（Ｍａｃｌｅａｎ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１２；２８７（３８）：３１９９４－３２００５ ピッカーら（Ｐｉｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．）、シスタチオニンベータ合成酵素欠損によって引き起こされるホモシスチン尿症（Ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ Ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ Ｂｅｔａ－Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）．２００４年１月１５日［２０１４年１１月１３日更新］．パゴン アールエー（Ｐａｇｏｎ ＲＡ）、アダム エムピー（Ａｄａｍ ＭＰ）、アーディンガー エイチエイチ（Ａｒｄｉｎｇｅｒ ＨＨ）ら編 ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓＴＭ［インターネット］．シアトル（ワシントン州）：ワシントン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）、シアトル；１９９３－２０１６、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖから入手可能 ベアランキら（Ｖｅｅｒａｎｋｉ ｅｔ ａｌ．）Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０１３年７月１８日；１４（７）：１５０７４－９１ ヤップら（Ｙａｐ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ １９９８；２１：７３８－４７ ヒューマーら（Ｈｕｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ．２０１５年１１月；３８（６）：１００７－１９ ヤップ（Ｙａｐ）、Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ［オンライン定期］．２００５、１－１３頁 シッフら（Ｓｃｈｉｆｆ ｅｔ ａｌ．）Ｎｅｕｒｏｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．２０１２年１２月；４３（６）：２９５－３０４ Ｑｕｅｓｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒａｎｇｅ；ｑｕｅｓｔｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．ｃｏｍ レフサムら（Ｒｅｆｓｕｍ ｅｔ ａｌ．）Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２００４；５０：３－３２ モリスら（Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ２０１７；４０：４９－７４ アジスら（Ａｊｉｔｈ ｅｔ ａｌ．）Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ ２０１５；４５０：３１６－３２１ 佐藤ら（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．）Ｂｏｎｅ ２００５；３６：７２１－７２６ ベヘラら（Ｂｅｈｅｒａ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２０１６
したがって、現行の治療よりも患者に対する有効性が高く、負の効果が少ない、ＣＢＳＤＨを処置する方法が、当技術分野で長い間必要とされている。
本開示の様々な実施形態は、（ａ）配列番号１を含む単離シスタチオニンβ合成酵素（ＣＢＳ）タンパク質と；（ｂ）ＣＢＳタンパク質に共有結合的に結合したＰＥＧ分子とを備える原薬を提供する。本明細書に記載される原薬の一定の実施形態では、ＰＥＧ分子がＭＥ－２００ＧＳである。
本開示の様々な実施形態は、原薬と、薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体とを備える医薬組成物を提供する。
一定の実施形態では、製剤が凍結乾燥されている。本開示の様々な実施形態は、再構成すると、再構成された液体製剤がリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）；約１１．４ｍＭのリン酸水素二ナトリウム；約１３７ｍＭの塩化ナトリウム；約２．７０ｍＭの塩化カリウム；約１．９８ｍＭのリン酸二水素カリウム中、約２０～３０ｍｇ／ｍｌの間または約２５ｍｇ／ｍｌの濃度の即時使用可能な医薬品を備える、凍結乾燥製剤を提供する。本明細書の即時使用可能な医薬品は、治療有効量の医薬品、例えば配列番号１のアミノ酸配列を有するＰＥＧ化ヒト切断型ＣＢＳタンパク質（例えば、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ）の原薬を含む単位用量の医薬組成物を備える液体医薬製剤である。即時使用可能な医薬品は、対象への投与を容易にするために、バイアルまたは類似の容器で提供することができる。
本開示の様々な実施形態は、再構成すると、再構成された液体製剤が２０～３０ｍｇまたは約２５ｍｇの原薬と；１ｍＬの水と；２ｍｇのリン酸水素二ナトリウム（二水和物）と；８ｍｇの塩化ナトリウムと；０．２ｍｇの塩化カリウムと；０．３ｍｇのリン酸二水素カリウムとを備える、凍結乾燥製剤を提供する。あるいは、凍結乾燥製剤を、原薬と、緩衝液と、賦形剤とを備えるように再構成することができる。一定の実施形態では、緩衝液が１５ｍＭリン酸カリウムである。一定の実施形態では、賦形剤が８％（ｗ／ｖ）トレハロースである。
本開示の様々な実施形態は、治療有効量の本明細書に記載される医薬組成物の製剤を対象に投与する工程を備える、対象におけるホモシスチン尿症を処置する方法を提供する。
一定の実施形態では、治療有効量が約０．２５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲から選択される投与量である。例えば、投与量は、約０．３３ｍｇ／ｋｇ、約０．６６ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇまたは約１．５ｍｇ／ｋｇである。あるいは、用量は、約２ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇおよび約１０ｍｇ／ｋｇである。例えば、用量は約０．５ｍｇ／ｋｇであり得る。あるいは、治療有効量は、約５．０ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇおよび約１０．０ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇの範囲から選択される投与量である。例えば、投与量は、約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．３３ｍｇ／ｋｇ、約０．６６ｍｇ／ｋｇ、約１．００ｍｇ／ｋｇ、約１．５０ｍｇ／ｋｇ、約２．００ｍｇ／ｋｇ、約３．００ｍｇ／ｋｇ、約４．００ｍｇ／ｋｇ、約５．００ｍｇ／ｋｇ、約６．００ｍｇ／ｋｇ、約７．００ｍｇ／ｋｇ、約８．００ｍｇ／ｋｇ、約９．００ｍｇ／ｋｇ、約１０．０ｍｇ／ｋｇ、約１１．０ｍｇ／ｋｇ、約１２．０ｍｇ／ｋｇ、約１３．０ｍｇ／ｋｇ、約１４．０ｍｇ／ｋｇ、約１５．０ｍｇ／ｋｇ、約１６．０ｍｇ／ｋｇ、約１７．０ｍｇ／ｋｇ、約１８．０ｍｇ／ｋｇ、約１９．０ｍｇ／ｋｇ、約２０．０ｍｇ／ｋｇ、約２１．０ｍｇ／ｋｇ、約２２．０ｍｇ／ｋｇ、約２３．０ｍｇ／ｋｇ、約２４．０ｍｇ／ｋｇ、約２５．０ｍｇ／ｋｇ、約２６．０ｍｇ／ｋｇ、約２７．０ｍｇ／ｋｇ、約２８．０ｍｇ／ｋｇ、約２９．０ｍｇ／ｋｇ、約３０．０ｍｇ／ｋｇ、約３１．０ｍｇ／ｋｇ、約３２．０ｍｇ／ｋｇ、約３３．０ｍｇ／ｋｇ、約３４．０ｍｇ／ｋｇ、約３５．０ｍｇ／ｋｇ、約３６．０ｍｇ／ｋｇ、約３７．０ｍｇ／ｋｇ、約３８．０ｍｇ／ｋｇ、約３９．０ｍｇ／ｋｇ、約４０．０ｍｇ／ｋｇ、約４１．０ｍｇ／ｋｇ、約４２．０ｍｇ／ｋｇ、約４３．０ｍｇ／ｋｇ、約４４．０ｍｇ／ｋｇ、約４５．０ｍｇ／ｋｇ、約４６．０ｍｇ／ｋｇ、約４７．０ｍｇ／ｋｇ、約４８．０ｍｇ／ｋｇ、約４９．０ｍｇ／ｋｇ、および約５０．０ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される。
一定の実施形態では、本方法が、ピリドキシン、ビタミンＢ６およびベタインからなる群から選択される少なくとも１つを対象に投与する工程をさらに備える。一定の実施形態では、対象がメチオニン（Ｍｅｔ）制限食を受けている。一定の実施形態では、本方法が、抗血小板薬を投与する工程をさらに備える。一定の実施形態では、抗血小板薬がワルファリン血液希釈剤または抗凝固薬である。一定の実施形態では、投与する工程が約３日に１回行われる。一定の実施形態では、投与する工程が約１日に１回行われる。一定の実施形態では、投与する工程が約１週間に１回行われる。一定の実施形態では、投与する工程が約６週間にわたって繰り返される。一定の実施形態では、投与する工程が約３か月間にわたって繰り返される。一定の実施形態では、投与する工程が約６か月間にわたって繰り返される。一定の実施形態では、投与する工程が６か月間超にわたって繰り返される。一定の実施形態では、投与する工程が対象の残りの寿命にわたって繰り返される。
本開示の様々な実施形態は、治療有効量の本明細書に記載される医薬組成物の製剤を対象に投与する工程を備える、対象におけるホモシステイン（Ｈｃｙ）レベルを低下させる方法を提供する。
一定の実施形態では、Ｈｃｙレベルが、投与する工程後に約８０μＭ未満である。一定の実施形態では、Ｈｃｙレベルが、投与する工程後に最大１０％低下する。一定の実施形態では、Ｈｃｙレベルが、投与する工程後に最大２０％低下する。一定の実施形態では、Ｈｃｙレベルが、投与する工程後に最大３０％低下する。一定の実施形態では、Ｈｃｙレベルが、投与する工程後に最大４０％低下する。一定の実施形態では、Ｈｃｙレベルが、投与する工程後に最大５０％低下する。一定の実施形態では、Ｈｃｙレベルが、投与する工程後に最大６０％低下する。一定の実施形態では、Ｈｃｙレベルが、投与する工程後に最大７０％低下する。一定の実施形態では、Ｈｃｙレベルが、投与する工程後に最大８０％低下する。一定の実施形態では、Ｈｃｙレベルが、投与する工程後に最大９０％低下する。一定の実施形態では、Ｈｃｙレベルが、投与する工程後に約１０μＭ～約２０μＭの範囲内にある。一定の実施形態では、Ｈｃｙレベルが、投与する工程後に１０μＭ未満である。一定の実施形態では、Ｈｃｙレベルが、投与する工程後に約５５μＭである。
一定の実施形態では、治療有効量が約０．２５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲から選択される投与量である。例えば、投与量は、約０．３３ｍｇ／ｋｇ、約０．６６ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ、約１．５０ｍｇ／ｋｇ、約２．０ｍｇ／ｋｇ、約７．０ｍｇ／ｋｇまたは約１０ｍｇ／ｋｇであり得る。一定の実施形態では、投与量が１０ｍｇ／ｋｇ未満である。
一定の実施形態では、本方法が、ピリドキシン、ビタミンＢ６およびベタインからなる群から選択される少なくとも１つを対象に投与する工程をさらに備える。一定の実施形態では、対象がメチオニン（Ｍｅｔ）制限食を受けている。一定の実施形態では、本方法が、抗血小板薬を投与する工程をさらに備える。一定の実施形態では、抗血小板薬がワルファリン血液希釈剤または抗凝固薬である。一定の実施形態では、投与する工程が約３日に１回行われる。一定の実施形態では、投与する工程が約１日に１回行われる。一定の実施形態では、投与する工程が約１週間に１回行われる。一定の実施形態では、投与する工程が約６週間にわたって繰り返される。一定の実施形態では、投与する工程が約３か月間にわたって繰り返される。一定の実施形態では、投与する工程が約６か月間にわたって繰り返される。一定の実施形態では、投与する工程が６か月間超にわたって繰り返される。一部の実施形態では、投与する工程が対象の残りの寿命にわたって繰り返される。
本開示の様々な実施形態は、治療有効量の本明細書に記載される医薬組成物の製剤を対象に投与する工程を備える、対象におけるシステイン（Ｃｙｓ）レベルを上昇させる方法を提供する。
本開示の様々な実施形態は、治療有効量の本明細書に記載される医薬組成物の製剤を対象に投与する工程を備える、対象におけるシスタチオニン（Ｃｔｈ）レベルを上昇させる方法を提供する。
本開示の様々な実施形態は、対象の眼系、骨格系、血管系および／または中枢神経系に関連付けられる負の臨床転帰を処置、緩和または予防する方法であって、治療有効量の本明細書に記載される医薬組成物の製剤を対象に投与する工程を備える方法を提供する。
前記のおよび他の目的、特徴および利点は、付随する図面に例示される、本開示の特定の実施形態の以下の説明から明らかになるであろう。図面は必ずしも縮尺通りではない；代わりに、本開示の様々な実施形態の原理の例示に重点が置かれている。
本明細書に記載される一定の実施形態で利用されるＰＥＧ化プロセスの流れ図。 ３日の検査期間中の各試行についてのパズルボックス検査における参入条件の図。 変動する食事（標準メチオニン食（「ＳＴＤ」）、高メチオニン食（「ＨＭＤ」）および／または低もしくは制限メチオニン食（「ＭＲＤ」））のバックグラウンドにある２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ（図では「ＰＥＧ ＣＢＳ Ｃ１５Ｓ」と呼ばれる）による長期連続処置を採用しているホモシスチン尿症のマウスモデルにおける前臨床試験結果を示す図。
Ｉ．導入
シスタチオニンベータ合成酵素欠損ホモシスチン尿症（ＣＢＳＤＨ）は、高レベルのＭｅｔおよび低下した濃度のシステイン（Ｃｙｓ）と一緒に、上昇したレベルの血漿ホモシステイン（Ｈｃｙ）を特徴とする（それぞれ全体が本願明細書に援用される、ヤップ エス（Ｙａｐ Ｓ．）シスタチオニンベータ合成酵素欠損によるホモシスチン尿症（Ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ ｄｕｅ ｔｏ ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ ｂｅｔａ－ｓｙｎｔｈａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）．Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ［定期オンライン］２００５；非特許文献１２；ＮＯＲＤ、クラウス ジェイピー（Ｋｒａｕｓ ＪＰ）．シスタチオニンベータ合成酵素欠損によるホモシスチン尿症（Ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ ｄｕｅ ｔｏ ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ ｂｅｔａ－ｓｙｎｔｈａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）．ＮＯＲＤ［定期オンライン］２０１７参照）。今日までに、ＣＢＳＤＨに関連付けられるＣＢＳ遺伝子の１８０超の異なる変異が識別されている（全体が本願明細書に援用される、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ．２０１７．Ｒｅｆ Ｔｙｐｅ：オンラインソース．ｈｇｍｄ．ｃｆ．ａｃ．ｕｋ／ａｃ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐで入手可能、参照）。ホモシステイン（Ｈｃｙ）は、セリンと一緒に、ＣＢＳ酵素の基質として働く、天然に存在するアミノ酸である。ＣＢＳは、メチル基転移、硫黄転移および再メチル化経路の交差点で作動することによって、メチオニン（Ｍｅｔ）からシステイン（Ｃｙｓ）への硫黄の一方向性流を支配する（全体が本願明細書に援用される、非特許文献３参照）。天然ＣＢＳは、アロステリック活性化因子Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）の結合によって活性化され、ピリドキサール－５’－リン酸（ピリドキシンまたはビタミンＢ６）依存的に、セリンがＨｃｙと縮合してシスタチオニン（Ｃｔｈ）を形成するβ置換反応を触媒する。ＣＢＳの下流で作動する、シスタチオニンγ－リアーゼ（ＣＧＬ）は、Ｃｔｈを基質として使用してＣｙｓを作製する。よって、ＣＢＳの適した機能は、Ｈｃｙ、ＭｅｔおよびＣｙｓの代謝の調節にとって重要である。
ＣＢＳＤＨ徴候および症状の重症度および呈示は、患者間で広く変動する（それぞれ全体が本願明細書に援用される、カラカら（Ｋａｒａｃａ ｅｔ ａｌ．）Ｇｅｎｅ ２０１４；５３４：１９７－２０３；トロンドルら（Ｔｒｏｎｄｌｅ ｅｔ ａｌ．）Ａｃｔａ Ｍｅｄ Ａｕｓｔｒｉａｃａ ２００１；２８：１４５－１５１；クルイトマンら（Ｋｌｕｉｊｔｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９９９；６５：５９－６７参照）。多くの患者が、１００μｍｏｌ／Ｌ超の総ホモシステイン（ｔＨｃｙ）レベルで重度の高ホモシステイン血症を呈示するが、軽度～数倍の正常の範囲のｔＨｃｙ上昇を呈す者もいる（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２参照）。有意に上昇したｔＨｃｙレベルは、通例重度の呈示と相関し、より低いレベルは、典型的にはより軽度の形態の疾患と相関する。正常なｔＨｃｙレベルは年齢および栄養状態で変動するが、典型的には１０～１５μｍｏｌ／Ｌの間の範囲である。
ＣＢＳＤＨは、一般的には、罹患個体が、正常なＣＢＳ機能に要求されるＣＢＳ酵素補因子であるピリドキシン（ビタミンＢ６）による総ホモシステイン（ｔＨｃｙ）低下処置に応答するかどうかに従って分類される（全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１；アボットら（Ａｂｂｏｔｔ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ １９８７；２６：９５９－９６９参照）。通例、ピリドキシンに応答性の患者は、より軽度の形態の障害をもたらす、より低いｔＨｃｙレベルを有する。これらの患者は、晩年に、ただ１つのまたは数種のＣＢＳＤＨ症状を呈示し得、多くは未診断のままである。結果として、ピリドキシンに高度に応答性の患者は、ほとんどの研究で標本として不十分であると考えられる。
後ろ向き研究により、最高のｔＨｃｙレベルを有する患者（処置または未処置）が、より重度の症状を、人生の早期に呈示することが示されている（共に全体が本願明細書に援用される、非特許文献６；マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１参照）。上昇したｔＨｃｙレベルを有する未処置個体は、典型的には成長障害、血栓塞栓症、眼の水晶体のその後の脱臼を伴う重度の近視、骨粗鬆症型骨折、マルファン様体質（特に長骨の伸長）、および学習困難を含む精神医学的異常を呈示する（それぞれ全体が本願明細書に援用される、ヤップ エス（Ｙａｐ Ｓ．）シスタチオニンベータ合成酵素欠損によるホモシスチン尿症（Ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ ｄｕｅ ｔｏ ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ ｂｅｔａ－ｓｙｎｔｈａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）．Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ［定期オンライン］２００５；非特許文献１２；ＮＯＲＤ、クラウス ジェイピー（Ｋｒａｕｓ ＪＰ．）シスタチオニンベータ合成酵素欠損によるホモシスチン尿症（Ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ ｄｕｅ ｔｏ ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ ｂｅｔａ－ｓｙｎｔｈａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）．ＮＯＲＤ［定期オンライン］２０１７参照）。上昇したｔＨｃｙレベルを有する一部の患者は重度の小児発症多系統疾患を有する。より重度の患者では、処置をしないと、平均余命が著しく減少する（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２参照）。
正常なヒト血漿は、ｔＨｃｙとして測定され、遊離チオールホモシステイン（Ｈｃｙ－ＳＨまたはｆＨｃｙ）、ジスルフィド（ホモシステイン－システインおよびホモシステインなど）およびタンパク質結合ホモシステインからなる、１６ｍＭ未満のＨｃｙ由来化合物を含有する（それぞれ全体が本願明細書に援用される、ウィーランド（Ｕｅｌａｎｄ）；Ｎｏｒｄ Ｍｅｄ １９８９；１０４：２９３－２９８；マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９９５；３３３：３２５；マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２０００；２０：１７０４－１７０６参照）。病態生理学的効果の多くはＨｃｙ中のスルフヒドリル基の存在に依存するので（それぞれ全体が本願明細書に援用される、ヤップ エス（Ｙａｐ Ｓ．）シスタチオニンベータ合成酵素欠損によるホモシスチン尿症（Ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ ｄｕｅ ｔｏ ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ ｂｅｔａ－ｓｙｎｔｈａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）．Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ［定期オンライン］２００５；ウィーランドら（Ｕｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．）；Ｎｏｒｄ Ｍｅｄ １９８９；１０４：２９３－２９８；マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９９５；３３３：３２５参照）、スルフヒドリル型（ホモシステイン；Ｈｃｙ）とジスルフィド型（ホモシステイン）の区別（全体が本願明細書に援用される、ヤップ エス（Ｙａｐ Ｓ．）シスタチオニンベータ合成酵素欠損によるホモシスチン尿症（Ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ ｄｕｅ ｔｏ ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ ｂｅｔａ－ｓｙｎｔｈａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）．Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ［定期オンライン］２００５参照）が重要である。
ＣＢＳは主に、肝臓、膵臓、腎臓および脳で発現される（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２参照）。触媒ドメインはピリドキサール５’－リン酸（ピリドキシンまたはビタミンＢ６としても知られる補因子）に結合し、調節ドメインはＳＡＭ（アロステリック活性化因子）に結合する。
不十分なレベルのＣＢＳ酵素活性は、第１の工程で硫黄転移経路を遮断し、Ｈｃｙ蓄積、上昇したＳＡＨおよびＭｅｔレベル、ならびに低下したＣｔｈおよびＣｙｓレベルをもたらす。これらの臨床的証拠として、本明細書で概説される調節不全Ｍｅｔ代謝産物は、上昇したＨｃｙ（多くの場合、血漿ｔＨｃｙとして臨床的に測定される）がＣＢＳＤＨの病態生理学に最も強力に関係していることを実証している。
正常よりも高いＨｃｙレベルはタンパク質上のスルフヒドリル基を修飾し、正しいタンパク質架橋を妨げ、複数の身体系にわたる構造的異常につながる。上昇したＨｃｙレベルはまた、細胞内シグナル伝達を損ない、内皮機能障害、ならびに最終的には血栓塞栓症および血管疾患をもたらす。ＣＢＳＤＨでは、Ｈｃｙの蓄積が、眼、骨格、血管および心理学的顕在化につながる。
ＣＢＳＤＨの診断は時々、ＣＢＳ遺伝子の分子遺伝検査によって確認される（全体が本願明細書に援用される、非特許文献２参照）。現在のスクリーニング手法は通常、あまり重度でないＣＢＳ欠損を有する新生児を検出することができず、より重度のＣＢＳＤＨを有する患者のごく少数を検出するにすぎない（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９参照）。
臨床試料中のＨｃｙレベルを決定するために一般的に好まれる測定は、遊離Ｈｃｙならびにタンパク質に結合したＨｃｙまたはジスルフィド型のＨｃｙを含むｔＨｃｙである。正常なｔＨｃｙレベルは、年齢、性別および栄養状態で変動するが、典型的には４．５～１１μＭの間の範囲である（ＱＵＥＳＴ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ（商標）参照範囲）。多くのＣＢＳＤＨ患者が、１００μＭ超の総ｔＨｃｙレベルで重度の高ホモシスチン尿症を呈するが、軽度～数倍の正常の範囲の上昇を呈す者もいる（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２参照）。ｔＨｃｙレベルは、疾患の重症度と高度に相関する（非特許文献６参照）。
研究により、ＣＢＳＤＨ患者におけるＨｃｙレベルの低下が、臨床症状のあまり重度でない顕在化と相関することが示されている（共に全体が本願明細書に援用される、非特許文献６；ヤップら（Ｙａｐ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．２００１年１２月；２１（１２）：２０８０－５参照）。ホモシステインレベルがこれらの系に対する損傷を引き起こす経路は広く記載されており（例えば、全体が本願明細書に援用される、非特許文献１３；非特許文献１５；サハら（Ｓａｈａ ｅｔ ａｌ．）ＦＡＳＥＢ Ｊ ２０１６；３０：４４１－４５６参照）、疾患におけるＨｃｙの有意な病理学的役割を暴く、一般集団におけるＨｃｙの役割を調査する研究につながっている。
本明細書に記載される医薬品による処置の１つの目標は、循環におけるＣＢＳ酵素活性を増加させて、改善された代謝制御をもたらし、それによって、疾患の臨床的顕在化を改良し、さらなる悪化を遅くさせるまたは予防することである。酵素などの高分子量化合物は、限定された組織浸透能力を有し、よって、血漿中に主に存在する。これらのタンパク質は、典型的には、いくつかの機序によって血流から除去されるので、短期間、循環中に維持される（全体が本願明細書に援用される、ブグメイスターら（Ｖｕｇｍｅｙｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１２；３（４）：７３－９２参照）。理想的には、投与されたＣＢＳが、硫黄アミノ酸代謝に対する定常的な効果を有するのに十分な時間にわたって血漿中で高い活性を維持するであろう。この目標は、ＰＥＧ部分のタンパク質表面上への付加であるＰＥＧ化によって達成され得る。タンパク質のＰＥＧ化は、広く受け入れられており、タンパク質安定性およびサイズを増加させ、腎排出を減少させながら、タンパク質分解、免疫応答および抗原性を最小化することが示されている戦略である（全体が本願明細書に援用される、カンら（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．）２００９；１４（２）：３６３－３８０参照）。本明細書に記載される医薬品は、対象に投与するために製剤化され、長期全身曝露用に設計されたＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ酵素である。
Ａ．ホモシスチン尿症の臨床的顕在化
ＣＢＳＤＨ患者で一般的に罹患する４つの系（眼、骨格、心血管および神経）における上昇したｔＨｃｙレベルおよび負の臨床転帰の因果効果を指し示す有意な証拠がある。これらのデータは、軽度に上昇したレベルのｔＨｃｙと負の転帰との間の強力な関係を実証する一般集団における研究によってさらに補足される。
１．眼
眼に罹患する異常は、ＣＢＳＤＨの早期臨床徴候であり得る。多くの個体は、眼球の中心からの眼の水晶体の変位（水晶体偏位）を発症する。罹患個体はまた、通常、重度の近視（近眼）および虹彩振盪（眼の着色部分の震え）を発症する。水晶体偏位および近視は通常、１歳以降で、未処置個体では、１０歳前に発症する（全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１参照）。あまり頻繁でなく起こる他の眼異常には、白内障、視神経変性および緑内障が含まれる。一部の個体は、霧視または視野中の「浮遊物」の出現を引き起こし得る網膜剥離を有し得る（全体が本願明細書に援用される、バークら（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．）Ｂｒ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、１９８９；７３（６）：４２７－３１参照）。
上昇したＨｃｙレベルは、ＣＢＳＤＨ患者および一般集団において、眼合併症、特に水晶体脱臼の強力な独立したリスクファクターである（全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１；非特許文献１３；ミュルビヒルら（Ｍｕｌｖｉｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．）Ｊ ＡＡＰＯＳ ２００１；５：３１１－３１５参照）。処方された薬理学的介入および食事介入を用いた場合でさえ、ＣＢＳＤＨ患者の大部分が、最終的に眼合併症を呈示する。Ｈｃｙレベルを低下させることが、ＣＢＳＤＨ患者において水晶体脱臼を遅延させ、もしかすると、予防することが観察されている（全体が本願明細書に援用される、非特許文献６参照）。
２．中枢神経系
精神遅滞などの発達遅延および学習問題も、１～３歳で起こるＣＢＳＤＨの早期徴候であり得る（全体が本願明細書に援用される、Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（ＳＴＡＲ－Ｇ）Ｐｒｏｊｅｃｔ．２０１６．Ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ．ｎｅｗｂｏｒｎｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．ｉｎｆｏで入手可能；米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）（ＮＩＨ）、米国国立医学図書館（ＵＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｈｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ．Ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ．２０１６．ｇｈｒ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）。ＣＢＳＤＨを有する個体における知能指数（ＩＱ）は、１０～１３８の範囲であると報告されている。最高のｔＨｃｙレベルを有する患者は、あまり重度でない罹患患者（平均ＩＱ７９）と比較して低いＩＱを有する可能性が高い（未処置の場合、平均ＩＱ５７）（全体が本願明細書に援用される、非特許文献２参照）。
発作は、ＣＢＳＤＨを有する未処置個体のおおよそ２０％で起こる（全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１参照）。多くの個体は、パーソナリティ障害、不安、うつ病、強迫性行動および精神病エピソードを含む精神医学問題を有する（非特許文献２参照）。ジストニアなどの錐体外路徴候も起こり得る（全体が本願明細書に援用される、Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（ＳＴＡＲ－Ｇ）Ｐｒｏｊｅｃｔ．２０１６．Ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ．ｎｅｗｂｏｒｎｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．ｉｎｆｏで入手可能、参照）。
研究により、低Ｍｅｔ食、葉酸／Ｂビタミン補充ならびに／あるいはピリドキシンおよびベタイン療法によって誘導されるＨｃｙレベルの早期低下が、様々な神経障害の進行を遅延、および時々、予防または逆転し、ＣＢＳＤＨ患者における正常なＩＱの発達を可能にすることができることが示された（全体が本願明細書に援用される、エル・バシールら（Ｅｌ Ｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．）ＪＩＭＤ Ｒｅｐ ２０１５；２１：８９－９５；ヤップら（Ｙａｐ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ２００１；２４：４３７－４４７参照）。上昇したＨｃｙレベルと、精神遅滞、神経変性疾患、発作、ジストニア、精神病、認知障害、認知症およびうつ病を含む中枢神経系（ＣＮＳ）症状との間の関連は、ＣＢＳＤＨ患者および一般集団において明確に記録されている（全体が本願明細書に援用される、アボットら（Ａｂｂｏｔｔ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ １９８７；２６：９５９－９６９；シムケら（Ｓｃｈｉｍｋｅ ｅｔ ａｌ．）ＪＡＭＡ １９６５；１９３：７１１－７１９；ヘルマンら（Ｈｅｒｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｌａｂ Ｍｅｄ ２０１１；４９：４３５－４４１参照）。
３．骨格系
ＣＢＳＤＨを有する個体は、種々の骨格異常を頻繁に発症する。罹患個体は、しばしば、長骨の菲薄化および伸長（くも肢）、脚をまっすぐにした場合に、膝が触れるように内側に曲がっている膝（「外反膝」またはＸ脚）、高度に反った足（凹足）、脊柱の異常な横湾曲（脊柱側弯症）、異常に突き出た胸（鳩胸）または異常に沈んだ胸（漏斗胸）を含む、「マルファン様」体質を有し、長身で痩せている。１０代までに、個体の５０％が骨粗鬆症の徴候を示す（全体が本願明細書に援用される、Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（ＳＴＡＲ－Ｇ）Ｐｒｏｊｅｃｔ．２０１６．Ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ．ｎｅｗｂｏｒｎｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．ｉｎｆｏで入手可能、参照）。ＣＢＳＤＨは、部分的には低い骨塩密度に起因し得る骨粗鬆症性骨折の増加したリスクに関連付けられている（全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１；ウェバーら（Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ ２０１６；１１７：３５１－３５４参照）。
２５年間にわたって追った２５人のアイルランド人ＣＢＳＤＨ患者の研究で、骨格異常のリスクが、非遵守患者と比較して、Ｈｃｙ低下処置を良く遵守している患者でかなり低いことが分かった（全体が本願明細書に援用される、非特許文献６参照）。
４．心血管系
ＣＢＳＤＨと血管疾患との間の関係は、ホモ接合型ＣＢＳＤＨにより中等度～重度に上昇したＨｃｙレベルを有する患者における疫学的研究で１９８５年に最初に実証された（全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１参照）。血栓塞栓症は、ＣＢＳＤＨの最も重篤な、しばしば生命を脅かす合併症であり、いずれの血管にも罹患し得る。血栓塞栓症は、ＣＢＳＤＨ患者における罹患率および早死にの主因である（全体が本願明細書に援用される、ヤップら（Ｙａｐ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．２００１年１２月；２１（１２）：２０８０－５参照）。
血栓塞栓性イベントのリスクは、１６歳までにおおよそ２５％、２９歳までに５０％であった。いくつかの報告が、どのようにｔＨｃｙレベルを低下させる処置がＣＢＳＤＨ患者において罹患率の主因である血管イベントの発生率を有意に減少させたかを記載した（全体が本願明細書に援用される、ウィルケンら（Ｗｉｌｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ １９９７；２０：２９５－３００；ヤップら（Ｙａｐ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．２００１年１２月；２１（１２）：２０８０－５参照）。それ以来、いくつかの他の研究が、ＣＢＳＤＨ患者における血管イベント、特に静脈血栓症の増加したリスクを実証した（全体が本願明細書に援用される、ケリーら（Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２００３；６０：２７５－２７９；マグナーら（Ｍａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ２０１１；３４：３３－３７参照）。
５．追加の顕在化
あまり一般的ではないが、極度にきめの細かい脆い皮膚、傷みやすい髪、皮膚の変色（色素沈着減少）、および頬の発疹（頬部潮紅）を含むいくつかの追加の所見が、ＣＢＳＤＨ患者で報告されている。一部の個体は、肝臓の脂肪変化、腹壁の裂傷を通した腸の一部の突出（鼠径ヘルニア）または膵臓の炎症を発症し得る。脊柱の異常な前から後ろへの湾曲（脊柱後弯症）および虚脱肺（自然気胸）もＣＢＳＤＨを有する個体で報告されている（全体が本願明細書に援用される、非特許文献８参照）。
要約すると、ＭＲＤ単独では、血漿Ｈｃｙ濃度を推奨レベル未満に低下させることができず、増加した不安および減少した骨石灰化につながるにもかかわらず、ＨＣＵの複数の症状を矯正するのに有効である。他方で、本明細書に記載される２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳによる酵素療法は、血漿Ｈｃｙ濃度を１００μＭの示唆閾値未満に低下させ、ＨＣＵの監視される症状全てを矯正した。さらに、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳは、Ｍｅｔ制限下でその有効性を保持し、十分に正常化した血漿生化学プロファイルを与える。これらのデータをヒト患者に外挿することによって、本発明者らの結果は、単一終生療法としての２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳが、ＨＣＵの臨床症状の予防および矯正に効果的となり得ることを確立している。加えて、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳによる処置は、Ｍｅｔ／食事制限の排除を可能にし、よって、今度は、ＨＣＵ患者およびその家族の生活の質を実質的に改善するはずである。
ＩＩ．組成物
Ａ．天然ヒトＣＢＳ酵素
ＣＢＳ完全天然酵素は、各単量体（サイズが６３ｋＤａである）が３つの機能的ドメインに組織化されている、４つの同一の単量体を含む四量体である。第１は、ヘムに結合し、酸化還元感知および／または酵素折り畳みで機能すると考えられる、約７０個のアミノ酸のＮ末端領域である。第２は、触媒コアを含有し、ＩＩ型ファミリーＰＬＰ（ピリドキサール－５’－リン酸）依存性酵素の折り畳みを示す中心ドメインである。補酵素ＰＬＰは、Ｎ末端ドメインとＣ末端ドメインとの間のくぼみに深く埋設されている。第３の領域は、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）に結合すると、酵素を活性化する、ＣＢＳモチーフのタンデムペアからなるＣ末端調節ドメインである。調節領域の除去によって、構成的に活性な酵素が作製される（全体が本願明細書に援用される、マイルズら（Ｍｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００４年７月１６日；２７９（２９）：２９８７１－４参照）。
ピリドキサール－５’－リン酸（ＰＬＰ）依存性酵素折り畳みはヘム基を含有する。この酵素は、Ｌ－ホモシステインをＬ－セリンと縮合させてＬ－シスタチオニンを形成するＰＬＰ依存性ベータ置換反応を触媒する。この酵素は、Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン（Ａｄｏ－Ｍｅｔ）がＣ末端調節ドメインに結合して、これらのドメインのコンフォメーション再配列および自己抑制ブロックの放出をもたらすことによって、アロステリックに調節される。ＣＢＳ活性化は、Ｃ末端調節ドメインを完全に除去して、構成的に活性な酵素の二量体形態を作製することによっても達成することができる（それぞれ全体が本願明細書に援用される、マイルズら（Ｍｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００４年７月１６日；２７９（２９）：２９８７１－４；エレノ－オルベアら（Ｅｒｅｎｏ－Ｏｒｂｅａ ｅｔ ａｌ．）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１１（３７）、Ｅ３８４５－３８５２（２０１４）参照）。
本明細書に記載される医薬品中の活性物質は、本配列表の配列番号２およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の付加によって修飾された天然ＣＢＳタンパク質を表す国際公開第２０１７／０８３３２７号（全体が本願明細書に援用される）の配列番号２のアミノ酸配列と比較して、タンパク質のアミノ酸１５位でのシステインからセリンへの置換を有する組換えヒト切断型ＣＢＳタンパク質（ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ）である。この酵素はｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓとしても知られる。一定の実施形態では、原薬ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓが、配列番号１のアミノ酸配列を有する。
この形態の酵素は、凝集に向かう傾向が高く、ヒトＣＢＳ（ｈＣＢＳ）の製造および生成に大きな制約を課す。ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（本明細書に定義される「２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ」を含む）は、四量体ではなくて凝集の影響を受けにくい二量体を形成するように操作されている。酵素などの高分子量化合物は、タンパク質分解による分解および様々なクリアランス機序によって循環から除去される（全体が本願明細書に援用される、ブグメイスターら（Ｖｕｇｍｅｙｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１２；３（４）：７３－９２参照）。ＰＥＧ化は、タンパク質安定性を増加させ、腎排出を減少させながら、タンパク質分解および免疫原性を最小化することが公知である（全体が本願明細書に援用される、カンら（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．）２００９；１４（２）：３６３－３８０参照）。これらの構造修飾は、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓを備える本明細書に記載される医薬品を、ＣＢＳＤＨのための酵素療法（ＥＴ）として天然ｈＣＢＳよりも適切な候補にする。
天然ＣＢＳは細胞内酵素であり、その酵素を細胞外環境からその主な細胞内作用部位に取り込むための機序が存在することは知られていないが、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓは細胞外で作用する。天然内因性ＣＢＳとは異なり、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓは、循環中で直接的に、および組織中で間接的に作動することによって代謝異常を矯正し、活性化のためにＳＡＭを要求することなくそうする。天然ｈＣＢＳ酵素は、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）がそのＣ末端調節ドメインに結合すると、細胞内で活性化される。しかしながら、患者と健康な個体の両方において、循環中のＳＡＭレベルは、ＣＢＳ活性化に要求されるレベルよりはるかに低い（全体が本願明細書に援用される、スタブラーら（Ｓｔａｂｌｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、２００２．５１（８）：９８１－８頁参照）。したがって、ＣＢＳは活性化しないので、天然ＣＢＳの循環への投与は無効であろう。ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓは、循環中にとどまり、細胞に進入しないが、ＣＢＳ Ｃ末端調節ドメインの除去によってＳＡＭ活性化の必要性を回避して、酵素を構成的に活性にするよう操作されている。
Ｂ．酵素療法（ＥＴ）
ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓは、ＣＢＳＤＨを処置するためのＥＴのための、１５位でのシステインからセリンへの置換を有するＰＥＧ化切断型ｈＣＢＳである。この修飾は、四量体ではなく二量体を形成するよう酵素を最適化し、構成的に活性である。
ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓは、不完全なＣＢＳ活性を補充し、それによって、ＣＢＳＤＨ患者におけるホモシステイン（Ｈｃｙ）およびメチオニン（Ｍｅｔ）の血漿、尿および組織レベルを低下させ、シスタチオニン（Ｃｔｈ）レベルを上昇させ、システイン（Ｃｙｓ）レベルを正常化する。総Ｈｃｙ（ｔＨｃｙ）レベルの低下が現在の処置標的であり（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２参照）、臨床（眼、骨格、血管および神経学）転帰の改良と強力に相関する（全体が本願明細書に援用される、非特許文献８）。
ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓは、天然ヒトＣＢＳ酵素の組換え型であり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌で産生される。天然ヒトＣＢＳのＤＮＡ配列（本配列表の配列番号３および全体が本願明細書に援用される国際公開第２０１７／０８３３２７号の配列番号１）を遺伝子改変して、Ｃ末端調節領域（アミノ酸４１４～５５１）（本配列表の配列番号４および国際公開第２０１７／０８３３２７号の配列番号３）を除去して、ヒト切断型ＣＢＳを形成した。ヒト切断型ＣＢＳのＤＮＡ配列をさらに改変して、ＤＮＡコード領域の４３位にＴ→Ａの点突然変異を導入して、翻訳されたタンパク質の１５位にシステインからセリンへの置換をもたらし、ヒト切断型ＣＢＳ Ｃ１５Ｓ（ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ）（本配列表の配列番号５および国際公開第２０１７／０８３３２７号の配列番号１３）を作製した。この変化は、凝集を減少させ、天然ｈＣＢＳと比較してバッチ間一貫性を可能にする。
この酵素を、発現中に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌中でさらに改変して、配列番号１に示されるタンパク質から第１のＭｅｔを除去する。その精製後、ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ酵素を、タンパク質の表面上の第一級アミンと反応するＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル官能化２０ｋＤａ ＰＥＧ部分によるＰＥＧ化によってさらに修飾する。おおよその平均で５．１個のＰＥＧ分子が、酵素の各単量体単位に付着して、平均分子量２９０ｋＤａの異種二量体生成物を与える。
Ｃ．２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳを生成するためのｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳのＰＥＧ化
ＭＥ－２００ＧＳ（メトキシ－ＰＥＧ－ＣＯ（ＣＨ２）３ＣＯＯ－ＮＨＳとも呼ばれる）を、ｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳをＰＥＧ化するために本明細書で使用する：
Figure 2022539077000002
ＭＥ－２００ＧＳは、分子量２０ｋＤａおよび化学名α－スクシンイミジルオキシグルタリル－ω－メトキシ，ポリオキシエチレンを有する。ＭＥ－２００ＧＳは、ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの表面上の遊離アミンを標的化する。アミド結合が、ＰＥＧとｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ上のリジン残基との間に形成される。得られた分子は、本開示の全体を通して、「２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ」と呼ばれ、配列番号１で提供される、切断されているとともにＣ１５Ｓ変異を有するＰＥＧ化ヒトシスタチオニンベータ合成酵素分子である。
１００ｋＤａの分子量カットオフおよび１５体積交換を用いたタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）を使用して、遊離ＰＥＧおよび他のＰＥＧ化不純物を枯渇させ、その後、ＰＢＳ緩衝液に対する製剤化に使用する。アンモニウムイオンおよびその他、イミダゾール、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ならびにＰＥＧ化中にＰＥＧから放出されるＮＨＳ基を含む全てのプロセス関連物質は、２つのサイクルの大カットオフＴＦＦ透析濾過工程後に微量レベルであると予想される。
ＰＥＧ ＭＥ－２００ＧＳは、図１に提供されるプロセスの流れ図に従って、ｃＧＭＰ条件下で、日油株式会社（ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって製造される。ＭＥ－２００ＧＳ生成物の製造に使用される全ての原材料は、合成または無機性質のものである。ＰＥＧ ＭＥ－２００ＧＳ原材料中に潜在的に存在し得る不純物は低分子である。
Ｄ．翻訳後修飾
翻訳後修飾は、修飾ポリペプチドと未修飾ポリペプチドを分離するための追加のバイオプロセス工程を要求し、生物製剤の生成のコストを増加させ、効率を低下させるおそれがある。したがって、一部の実施形態では、翻訳後修飾に影響を及ぼすタンパク質をコードする標的遺伝子の発現をモジュレートすることによって、細胞内でのポリペプチド剤の生成を増強する。追加の実施形態では、第１の翻訳後修飾に影響を及ぼすタンパク質をコードする第１の標的遺伝子の発現をモジュレートし、第２の翻訳後修飾に影響を及ぼすタンパク質をコードする第２の標的遺伝子の発現をモジュレートすることによって、生物製剤の生成を増強する。
さらに加えて、原核細胞または真核細胞で発現されるタンパク質は、生物学的生成物の生成ならびに／あるいは構造、生物学的活性、安定性、均一性および／または他の特性を損なうおそれがあるいくつかの翻訳後修飾を受け得る。これらの修飾の多くは、細胞成長およびポリペプチド発現中に自発的に起こり、所与のポリペプチドのペプチド骨格、アミノ酸側鎖、ならびにアミノおよび／またはカルボキシル末端を含むいくつかの部位で起こり得る。加えて、所与のポリペプチドは、いくつかの異なる型の修飾を含み得る。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞で発現されたタンパク質は、アセチル化、ヒストンクリッピング、カルボキシル化および／または脱アミドの対象となり得る（全体が本願明細書に援用される、ヤンら（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．）、ＰＮＡＳ １１１（５２）Ｅ５６３３－Ｅ５６４２（２０１４）参照）。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの鳥類および哺乳動物細胞で発現されるタンパク質は、アセチル化、カルボキシル化、ガンマカルボキシル化、ヒストンクリッピング、脱アミド、Ｎ末端グルタミン環化および脱アミド、およびアスパラギン脱アミドの対象となり得る。
一部の実施形態では、タンパク質脱アミドに関与するタンパク質をコードする標的遺伝子の発現をモジュレートすることによって、タンパク質の生成を増強する。タンパク質は、Ｎ末端グルタミンの環化および脱アミドならびにアスパラギンの脱アミドを含むいくつかの経路を介して脱アミドすることができる。よって、一実施形態では、タンパク質脱アミドに関与するタンパク質がＮ末端アスパラギンアミノヒドロラーゼである。タンパク質脱アミドは、変更された構造特性、低下した効力、低下した生物活性、低下した有効性、増加した免疫原性および／または他の望ましくない特性につながるおそれがあり、それだけに限らないが、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、等電点電気泳動、キャピラリー電気泳動、ネイティブゲル電気泳動、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、質量分析またはＬ－イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼの使用による、電荷に基づくタンパク質の分離を含むいくつかの方法によって測定することができる。
一部の実施形態では、タンパク質分泌に影響を及ぼすタンパク質が、Ｈｓｐ４０、ＨＳＰ４７（セルピンペプチダーゼ阻害剤、クレードＨ；熱ショックタンパク質４７とも呼ばれる）、ＨＳＰ６０、Ｈｓｐ７０、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ１００、プロテインジスルフィドイソメラーゼ、ペプチジルプロリルイソメラーゼ、カルネキシン、Ｅｒｐ５７（プロテインジスルフィドイソメラーゼファミリーＡ、メンバー３）、およびＢＡＧ１からなる群から選択される分子シャペロンである。一部の実施形態では、タンパク質分泌に影響を及ぼすタンパク質が、γ－セクレターゼ、ｐ１１５、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）タンパク質、セクレチン、およびキナーゼ（例えば、ＭＥＫ）からなる群から選択される。
ヌクレオチドを体系的に付加または除去してより長いまたはより短い配列を作製し、その点から標的ＲＮＡの上または下により長いまたはより短いサイズのウィンドウを進むことによって作製された配列を検査することによって、さらなる最適化を達成することができることが企図される。新たな候補標的を作製することに向けたこの手法を、当技術分野で公知のまたは本明細書に記載される阻害アッセイにおける標的配列に基づくＲＮＡエフェクター分子の有効性についての検査とカップリングすることで、阻害効率におけるさらなる改善につながり得る。なおさらに、例えば本明細書に記載されるもしくは当技術分野で公知の修飾ヌクレオチドの導入、オーバーハングの付加もしくは変化、または発現阻害剤としての分子をさらに最適化する（例えば、血清安定性または循環半減期を増加させる、熱安定性を増加させる、膜横断送達を増強する、特定の位置または細胞型に向けた標的化、サイレンシング経路酵素との相互作用を増加させる、エンドソームからの放出を増加させる等）ための当技術分野で公知のおよび／もしくは本明細書に論じられる他の修飾によって、このような最適化配列を調整することができる。
Ｅ．安定性
原薬または医薬品は、種々の温度および貯蔵条件で安定である。一部の実施形態では、原薬または医薬品が、－６５℃および－２０℃で貯蔵した場合に、安定である。あるいは、原薬または医薬品は、約２℃～約８℃の範囲の温度で貯蔵した場合に、安定であり得る。あるいは、原薬または医薬品は、２５℃±２℃の範囲の温度で貯蔵した場合に、安定であり得る。例えば、原薬または医薬品は、２０℃～２５℃の間で安定なままである。一定の実施形態では、原薬または医薬品が、還元条件下で安定である。一定の実施形態では、原薬または医薬品が、非還元条件下で安定である。一部の実施形態では、原薬または医薬品が、少なくとも２日間、少なくとも７日間、少なくとも１か月間、少なくとも２か月間、少なくとも３か月間、少なくとも６か月間、または少なくとも１２か月間にわたって安定なままである。例えば、原薬または医薬品は、約２日間にわたる貯蔵中、安定なままである。例えば、原薬または医薬品は、約７日間にわたる貯蔵中、安定なままである。例えば、原薬または医薬品は、約１か月間にわたる貯蔵中、安定なままである。例えば、原薬または医薬品は、約２か月間にわたる貯蔵中、安定なままである。例えば、原薬または医薬品は、約３か月間にわたる貯蔵中、安定なままである。例えば、原薬または医薬品は、約６か月間にわたる貯蔵中、安定なままである。例えば、原薬または医薬品は、約１２か月間にわたる貯蔵中、安定なままである。例えば、原薬または医薬品は、約１８か月間にわたる貯蔵中、安定なままである。
一部の実施形態では、原薬または医薬品が、－６５℃で最大１８か月間の貯蔵にわたって安定なままである。一部の実施形態では、原薬または医薬品が、約２℃～約８℃の間で最大３か月間の貯蔵にわたって安定なままである。一部の実施形態では、原薬または医薬品が、２５℃±２℃で最大１か月間の貯蔵にわたって安定なままである。
一部の実施形態では、原薬または医薬品が、少なくとも３回の凍結および解凍サイクルにわたって安定なままである。一部の実施形態では、原薬または医薬品が、最大６回の凍結および解凍サイクルにわたって安定なままである。例えば、原薬または医薬品は、５回の凍結および解凍サイクルにわたって安定なままである。一定の実施形態では、医薬品が、注射器からの駆出後に安定である。
ＩＩＩ．医薬組成物
ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓを備える、本明細書に記載される医薬品は、ＣＢＳＤＨ患者においてホモシステインレベルを低下させ、システインレベルを正常化することによって、代謝制御を回復し、疾患の臨床顕在化を改良することを意図している。ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）を使用した組換え技術によって製造され、リン酸緩衝生理食塩水に無菌医薬品として製剤化される。医薬品は、皮下（ＳＣ）注射による投与を意図している。
循環中のＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓ活性は、組織中の代謝産物プロファイルも改善した、または完全に正常化さえした（全体が本願明細書に援用される、国際公開第２０１７／０８３３２７号参照）。したがって、医薬品は、必ずしもその自然細胞内環境に送達される必要がない。
医薬品は、ＣＢＳＤＨ患者の循環、尿および組織中の毒性Ｈｃｙの蓄積を減少させる；循環および組織中のＣｙｓレベルを正常化する；循環および組織中のＣｔｈレベルを上昇させる；ならびに／またはＣＢＳＤＨ顕在化の発生を予防する、遅延するおよび／あるいは逆転させる。医薬品は、患者が正常食を楽しむことを可能にしながら、これらの利益のうちの少なくとも１つを達成する。実際、通常食（例えば、４．０ｇ／ｋｇのＭＥＴ）を用いた場合でさえ増加したＣｔｈ活性は、医薬品の増加した活性および／または減少した腎排出の証拠であることが観察された。
２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ原薬を、注射用水（ＷＦＩ）で調製された、リン酸水素二ナトリウム（二水和物）（１１．４ｍＭ）、塩化ナトリウム（１３７ｍＭ）、塩化カリウム（２．７ｍＭ）およびリン酸二水素カリウム（１．９８ｍＭ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に、２０～３０ｍｇ／ｍＬの間または約２５ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化した。原薬は水溶液に自由に溶解可能であった。
ＳＥＣ／ＵＶ／ＭＳからの同位体的に平均された分子量から計算された原薬の分子量は、単量体については４５．２９０ｋＤａ、二量体については９０．５８ｋＤａである。
全てのバッチが、実際に目に見える粒子を含まず、暗赤色の透明な液体であった。さらに加えて、還元条件と非還元条件の両方で実施したＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって提供された結果は、各バッチについて互いに一貫性があった。これらの方法の各々を使用して、ＰＥＧ化バリアントの特有の、均一な、一定のパターンを実証した。抗凝固薬、ビタミンおよびミネラル補充、ベタイン、抗うつ薬を含む併用投薬を本明細書に記載される医薬品と組み合わせて、医薬組成物の有効性を増強することもできる。
ＩＶ．製剤
上記治療的使用について、投与される投与量は、採用される化合物、投与様式、所望の処置および指し示される障害により変動するであろう。例えば、本開示の化合物の１日投与量は、吸入する場合、１キログラム体重当たり０．０５マイクログラム（μｇ／ｋｇ）～１キログラム体重当たり１００マイクログラム（μｇ／ｋｇ）の範囲にあり得る。あるいは、化合物を経口投与する場合、本開示の化合物の１日投与量は、１キログラム体重当たり０．０１マイクログラム（μｇ／ｋｇ）～１キログラム体重当たり１００ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）の範囲にあり得る。
ＰＥＧ化されて本明細書に記載される原薬を形成する、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質はそのままで使用され得るが、通例、薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体と合わせて、医薬組成物の形態で投与される。したがって、本開示はさらに、薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体と合わせて、本明細書に記載される原薬を備える医薬組成物を提供する。
本開示の医薬組成物に使用され得る薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体は、医薬製剤の分野で慣用的に採用されているものであり、それだけに限らないが、糖、糖アルコール、デンプン、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩などの緩衝液物質、グリセリン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩などの塩または電解質、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレン－ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂（ラノリン）を含む。
本開示の医薬組成物は、経口、非経口、吸入スプレーにより、経腸、経鼻、頬側、経膣、または埋め込みリザーバーを介して投与され得る。一実施形態では、医薬組成物が経口投与され得る。一実施形態では、医薬組成物が皮下投与され得る。本開示の医薬組成物は、任意の慣用的な非毒性の薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体を含有し得る。本明細書で使用される非経口という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、関節滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内および頭蓋内注射または注入技術を含む。
医薬組成物は、例えば無菌注射水性または油性懸濁液としての、無菌注射調製物の形態であり得る。懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０など）および懸濁化剤を使用して、当技術分野で公知の技術に従って製剤化され得る。無菌注射調製物は、例えば１，３－ブタンジオール中溶液としての、非毒性の非経口的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体中無菌注射溶液または懸濁液であってもよい。採用され得る許容されるアジュバント、希釈剤および担体の中には、マンニトール、水、リンガー液および等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、無菌不揮発性油が、溶媒または懸濁媒として慣用的に採用される。この目的のために、合成モノ－またはジグリセリドを含む任意の無刺激不揮発性油が採用され得る。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は注射剤の調製に有用であり、とりわけそのポリオキシエチル化バージョンのオリーブ油またはヒマシ油などの天然の薬学的に許容される油も同様である。これらの油溶液または懸濁液は、長鎖アルコール希釈剤または分散剤も含有し得る。
本開示の医薬組成物は、それだけに限らないが、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤ならびに水性懸濁液および溶液を含む任意の経口的に許容される剤形で経口投与され得る。これらの剤形は、医薬製剤の分野で周知の技術に従って調製される。経口使用のための錠剤の場合、一般的に使用される担体は、ラクトースおよびコーンスターチを含む。ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤も典型的に添加される。カプセル形態での経口投与のために、有用な希釈剤はラクトースおよび乾燥コーンスターチを含む。水性懸濁液を経口投与する場合、活性成分を乳化剤および懸濁化剤と組み合わせる。所望であれば、一定の甘味剤および／または香味剤および／または着色剤を添加してもよい。
本開示の医薬組成物はまた、直腸投与のために坐剤の形態に製剤化され得る。活性成分を、室温で固体であるが、直腸温度で液体であるので、直腸内で融解して活性成分を放出する適切な非刺激性賦形剤と混合することによって、これらの組成物を調製することができる。このような材料には、それだけに限らないが、カカオ脂、蜜蝋およびポリエチレングリコールが含まれる。
本開示の医薬組成物は、鼻エアゾールまたは吸入によって投与され得る。このような組成物は、医薬製剤の分野で周知の技術に従って調製され、ベンジルアルコールもしくは他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティを増強するための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または当技術分野で公知の他の可溶化剤もしくは分散剤を採用して、生理食塩水中溶液として調製され得る。
本明細書の医薬組成物は、それぞれ全体が本願明細書に援用される、国際公開第２０１５／１５３１０２号、国際公開第２０１６／１８３４８２号および国際公開第２０１８／００９８３８号に示される、循環系を通して投与される形態であり得る。ＣＢＳタンパク質は、赤血球系細胞または血栓様細胞を含む除核造血細胞（ＥＨＣ）によって発現される組換え核酸によってコードされ得る。例えば、赤血球系細胞は、赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）、または網状赤血球である。例えば、血栓様細胞は血小板である。一定の実施形態では、コードされるＣＢＳタンパク質が、翻訳された膜アンカーポリペプチドに融合される。一定の実施形態では、ＣＢＳタンパク質が、ＥＨＣの表面上に局在化される。ＣＢＳタンパク質は、細胞外空間で酵素の活性化のために切断され得る。あるいは、内部局在化ＣＢＳタンパク質が、ＥＨＣの溶解によって細胞外空間に放出され得る。あるいは、ＣＢＳタンパク質の酵素標的がＥＨＣに進入し、次いで、変更後に膜を通して出る。一定の実施形態では、ＣＢＳタンパク質が、本配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号５、または国際公開第２０１７／０８３３２７号（全体が本願明細書に援用される）の配列番号２、３もしくは１３のアミノ酸配列を有する。
投与様式に応じて、医薬組成物は、０．０５～９９％ｗ（重量パーセント）、より具体的には０．０５～８０％ｗ、なおより具体的には０．１０～７０％ｗ、さらにより具体的には０．１０～５０％ｗの活性成分（全ての重量パーセンテージは全組成物に基づく）を含む。
適切な医薬製剤の選択および調製のための慣用的な手順は、例えば全体が本願明細書に援用される、「医薬－剤形設計の科学（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ－Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍ Ｄｅｓｉｇｎ）」、エム イー オールトン（Ｍ．Ｅ．Ａｕｌｔｏｎ）、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、１９８８に記載されている。
リン酸水素二ナトリウム（二水和物）、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよびリン酸二水素カリウムの緩衝溶液は、透析濾過を通して原薬に導入される。
医薬品は、ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４±０．２）中、２０～３０ｍｇ／ｍＬ、または約２５ｍｇ／ｍＬの標的濃度で製剤化される。ＰＢＳ緩衝液は、リン酸水素二ナトリウム（二水和物）（１１．４ｍＭ）、塩化ナトリウム（１３７ｍＭ）、塩化カリウム（２．７ｍＭ）およびリン酸二水素カリウム（１．９８ｍＭ）を含有する。表１は製剤の詳細を提供する。
Figure 2022539077000003
表２は、本明細書に記載される医薬品の例の単位用量組成物を提供する。
Figure 2022539077000004
一定の実施形態では、医薬品が、対象中約５０ｍＵ／μＬの曝露のために製剤化される。凍結乾燥製剤は、再構成でヒトへの投与のために使用され得る。
Ａ．凍結乾燥
医薬組成物は凍結乾燥製剤であり得る。一部の実施形態では、凍結乾燥製剤が、原薬と、緩衝液と、賦形剤とを備える。一定の実施形態では、適切な再構成緩衝液、水、または任意の他の薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤もしくは担体中で凍結乾燥製剤を再構成すると、原薬の濃度が約２０～３０ｍｇ／ｍｌの間である。一部の実施形態では、原薬の濃度が、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２１ｍｇ／ｍｌ、約２２ｍｇ／ｍｌ、約２３ｍｇ／ｍｌ、約２４ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌ、約２６ｍｇ／ｍｌ、約２７ｍｇ／ｍｌ、約２８ｍｇ／ｍｌ、約２９ｍｇ／ｍｌ、または約３０ｍｇ／ｍｌである。一部の実施形態では、原薬の濃度が約２５．４ｍｇ／ｍｌである。一定の実施形態では、適切な再構成緩衝液、水、または任意の他の薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤もしくは担体中で凍結乾燥製剤を再構成すると、緩衝液が１５ｍＭの濃度のリン酸カリウムである。一定の実施形態では、賦形剤が８％（ｗ／ｖ）の濃度のトレハロースである。一部の実施形態では、製剤が、適切な再構成緩衝液、水、または薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤もしくは担体中で凍結乾燥製剤を再構成すると、スクロースの濃度が５％となるように、スクロースを備える。一部の実施形態では、フリーズドライ顕微鏡法によって決定される崩壊発生温度（Ｔｃ，ｏｎ）が－２１℃である。一部の実施形態では、製剤がｐＨ７．５を有する。
一部の実施形態では、凍結乾燥プロセスが、結晶ケーク構造の融解なしに、４８時間以下で実施され得る。凍結乾燥プロセスは、それだけに限らないが、（ｉ）凍結乾燥製剤の減少した再構成時間（例えば、１分未満）、（ｉｉ）より濃縮された医薬品を可能にする減少した粘度、（ｉｉｉ）患者に対する疼痛を最小化するための等張性緩衝液の組み込み、および／または（ｉｖ）減少した脱ＰＥＧ化などの以下のパラメーターまたは特性のうちの１つまたは複数を調整するように最適化され得る。
凍結乾燥製剤は、以下のプロトコールを使用して調製され得る。製剤調製の３日前に、２０～３０ｍｇ／ｍｌまたは約２５ｍｇ／ｍｌの原薬（－８０℃で貯蔵）を冷蔵庫中２～８℃で７２時間解凍する。解凍後、原薬を穏やかに旋回することによってホモジナイズする。透析を制御された条件下、２～８℃で２４時間実施する。２０ｋＤａカットオフの透析カセットを使用し、緩衝液を各回１：５０以上の体積比で３回交換する。緩衝液は３時間および６時間の全透析時間後に交換する。最後の透析工程を一晩実施する。透析後、製剤を透析カセットから回収し、０．２２μｍポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）フィルタを使用することによって濾過する。濾過後、バイアルに層流条件下で１．０ｍｌの充填体積を充填する。
凍結乾燥をＥｐｓｉｌｏｎ ２－１２Ｄパイロットスケールフリーズドライヤー（マーチンクリスト社（Ｍａｒｔｉｎ Ｃｈｒｉｓｔ）、ドイツオステローデ）で実施する。チャンバー圧を静電容量ゲージによって制御し、真空ポンプおよび制御窒素投与量によって調節する。
バイアルを５℃に平衡化した後、バイアルを－４５℃に凍結し、－４５℃でさらに５時間平衡化する。棚温度を、一次乾燥で３１時間、－１５℃に設定する。二次乾燥を棚温度４０℃で２．５時間実施する。凍結乾燥プロセスの最後で、チャンバーを窒素で８００ｍｂａｒまで通気し、棚を持ち上げることによってバイアルに栓をする。栓をした後、チャンバーを窒素で大気圧まで通気する。表３は、サイクルの最適化後の凍結乾燥プロセスパラメーターを示す。
Figure 2022539077000005
フリーズドライプロセス中、生成物温度、棚温度、冷却器温度およびチャンバー圧（静電容量およびピラニゲージ）を監視する。生成物温度をＰｔ１００センサー（オメガ（ＯＭＥＧＡ）（商標））によって監視する。
Ｖ．疾患、障害または状態の処置
ＣＢＳＤＨを有する個体は、典型的には出生時に無症候性であり、処置しない限り、症状が経時的にこれらの個体で、一部は乳児期という早くに、多くは小児期に現れ、これがスペクトラム疾患である場合には、一部の患者では、症状が成人期でのみ現れる（それぞれ全体が本願明細書に援用される、ヤップ（Ｙａｐ）、２００５；マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１；モリスら（Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．）シスタチオニンベータ合成酵素欠損の診断および管理のためのガイドライン（Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ ｂｅｔａ－ｓｙｎｔｈａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ２０１７；４０：４９－７４；マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）スクリヴァー シーエル（Ｓｃｒｉｖｅｒ ＣＬ）、ボーデ エーエル（Ｂｅａｕｄｅｔ ＡＬ）、スライ ダブリューエス（Ｓｌｙ ＷＳ）、ヴァレ ディー（Ｖａｌｌｅ Ｄ）編 遺伝病の代謝および分子基礎（Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）．第７版、ニューヨーク：マグロウヒル（ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ）；２００１；１２７９－１３２７参照）。眼、骨格および血管系、ならびにＣＮＳの４つの主な器官系が典型的に関与している。肝臓、膵臓、消化管および皮膚（毛包を含む）などの他の器官も関与し得る（それぞれ全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１；非特許文献１２；ムアセヴィック－カタネックら（Ｍｕａｃｅｖｉｃ－Ｋａｔａｎｅｃ ｅｔ ａｌ．）Ｃｏｌｌ Ａｎｔｒｏｐｏｌ ２０１１；３５：１８１－１８５；スリら（Ｓｕｒｉ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ ２０１４； ３４７：３０５－３０９参照）。
蓄積されたデータは、Ｈｃｙレベルの低下が、ＣＢＳＤＨにおける酵素療法（ＥＴ）の成功した適用の指標として役立ち得ることを示している。これは、「医薬品に対する曝露に応じてレベルが変化する薬力学的／応答バイオマーカー」およびなおさらに、ＣＢＳＤＨのためのＥＴの場合には、薬物作用機序と密接に関連するマーカーのＮＩＨ－ＦＤＡ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐによる定義（全体が本願明細書に援用される、ＦＤＡ－ＮＩＨ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ．ＢＥＳＴ（Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ，ＥｎｄｐｏｉｎｔＳ，ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｔｏｏｌｓ）Ｒｅｓｏｕｒｃｅ［インターネット］．シルバースプリング（メリーランド州）：米国食品医薬品局（米国）；２０１６－．Ｒｅａｓｏｎａｂｌｙ Ｌｉｋｅｌｙ Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ Ｅｎｄｐｏｉｎｔ．２０１７年９月２５日．米国国立衛生研究所（米国）による共同出版、ベセスダ（メリーランド州）．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｏｏｋｓ／ＮＢＫ３２６７９１／参照）と一貫性がある。したがって、血液または血漿Ｈｃｙは、薬力学的研究のための有用なマーカーであるだけでなく、ホモシスチン尿症（ＨＣＵ）のための「合理的にふさわしい代用エンドポイント」としても以前から認識されている。
ＣＢＳＤＨを有する乳児および小児では、優先事項が、ＣＢＳＤＨに関連付けられる合併症を予防すること、ならびに適した成長および正常な知能の発達を確保することである（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２参照）。晩年に診断された患者では、処置の狙いは、生命を脅かす血栓塞栓症を予防すること、および既に確立された合併症の進行を最小化することであるべきである。これらの目標に対処するために、ＣＢＳＤＨに関連付けられる生化学的異常を改善、可能であれば、正常化しなければならない（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２参照）。
ＣＢＳＤＨの診断および管理のための２０１６年ガイドライン（２０１６ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ＣＢＳＤＨ）によると、Ｈｃｙレベルは可能な限り正常に近く維持されるべきである（１０～１５μｍｏｌ／Ｌまたはそれ未満）。これは、利用可能な処置を施されたＣＢＳＤＨ患者で典型的に可能ではないので、ピリドキシン応答性ＣＢＳＤＨ患者で５０μｍｏｌ／Ｌ未満、非ピリドキシン応答性患者で１００μｍｏｌ／Ｌ未満という野心的な目標が示唆されている（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２参照）。前に述べられたように、非ピリドキシン応答性患者は、ピリドキシン応答性患者よりも高いＨｃｙレベルを有する傾向がある。２つの目標が同じ疾患の患者に推奨されているが、これらの目標は、合併症を最小化するために、最適化ではなく達成可能となるよう設計された。
全体として、ＣＢＳＤＨを管理するために要求される長期処置の有効性は、とりわけ最も頻繁には食事制限および補充に依存するので、不足または一貫性のない生涯の遵守の対象となる。ＣＢＳＤＨのためのＥＴは、これらの落とし穴の多くを回避するであろう。重度のＭｅｔ制限もＣｙｓ補充も要求しない機序を通してＣＢＳＤＨにおける代謝欠陥を埋め合わせることによって、ＥＴは、Ｍｅｔレベルを危険に上昇させることなく、また食事の自由化または正常化を可能にしながら、より一貫性のあるＨｃｙ低下を達成すると予想される。
状態の根底にある遺伝的原因を矯正するＣＢＳＤＨのための治療法は目下のところないが、通例許容される治療目標は、ｔＨｃｙレベルを可能な限り低下させることである（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２参照）。結果として、現在の治療は、生化学的異常を矯正し、それによって、疾患の有害な臨床的顕在化のリスクを低下させることに向けられている。Ｈｃｙレベルは、ＣＢＳＤＨ患者のために現在利用可能な処置によってはめったに完全に正常化されない。
ほとんどの患者では、処置標的を達成するために、戦略の組み合わせが要求される。これらの処置戦略には、１）薬理学的用量のピリドキシン（葉酸と合わせて、ＣＢＳの補因子であるビタミンＢ６）をピリドキシン感受性患者に投与することによって、残留ＣＢＳ活性を増加させること（全体が本願明細書に援用される、ヤップら（Ｙａｐ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．２００１年１２月；２１（１２）：２０８０－５参照）；２）代謝遮断を越えて生成品で食事を補充しながら、重度の食事／タンパク質制限を通してメチオニン負荷を減少させること；および３）代替代謝経路を増強してＣＢＳ欠損の効果に対抗する、例えばベタイン（メチルドナー）を投与してＨｃｙのＭｅｔへの再メチル化を増強することが含まれる。一定の実施形態では、葉酸補充および（必要に応じて）ビタミンＢ１２補充物が提供される（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２参照）。
Ａ．ＣＢＳＤＨのための現在の治療
一部の実施形態では、ＣＢＳＤＨ患者が、適当な葉酸補充および（必要に応じて）ビタミンＢ１２補充物を受けるべきである（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２参照）。加えて、患者は、ピリドキシン療法（応答性の場合）、Ｍｅｔ制限、Ｃｙｓ補充食および／またはベタイン療法で処置されるべきである。ほとんどの患者で、処置標的を達成するために、戦略の組み合わせが要求される。
最も一般的な処方される処置は、食事とベタインの組み合わせに、ベタイン単独および食事単独が続くものであった（全体が本願明細書に援用される、アダムら（Ａｄａｍ ｅｔ ａｌ．）Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ ２０１３；１１０：４５４－４５９参照）。患者が１６歳を超えると、Ｍｅｔ制限食の成人患者の遵守が不足しているという認識で、これらの患者は多くの場合、食事はなしでベタインのみを処方される。しかしながら、成人におけるベタインの遵守も不足している。中央タンパク質摂取量は、患者間で広く変動し、年齢と共に劇的に増加した。
これらの所見と一貫して、近年の報告では、具体的なＣＢＳＤＨ－適正アミノ酸補充をした低タンパク質食を処方された２４人の患者の中のわずか４人の成人患者しかこの処置に従わなかったことが述べられた（全体が本願明細書に援用される、ロレンツィーニら（Ｌｏｒｅｎｚｉｎｉ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ．２０１７年１０月４日参照）。複数のＣＢＳＤＨ専門家が、米国において同様に広い変動性を記載している（米国のＣＢＳＤＨ専門家である医師で構成されたＯｒｐｈａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｄｖｉｃｅ Ｂｏａｒｄ）。未処置患者のｔＨｃｙ値と処置患者のｔＨｃｙ値を比較した研究（それぞれ２５人の患者および９３人の患者）は、これら２つの群間に有意な差がない（ｔＨｃｙはそれぞれ１５．７～２８１．４および４．８～３１２μｍｏｌ／Ｌの範囲であり；中央値はそれぞれ１２５．０および１１９．０μｍｏｌ／Ｌである）と結論付けたが、この研究は患者の処置レジメンについての詳細を提供しなかった（全体が本願明細書に援用される、スタブラーら（Ｓｔａｂｌｅｒ ｅｔ ａｌ．）ＪＩＭＤ Ｒｅｐ ２０１３；１１：１４９－１６３参照）。これらの結果は、以下の結論の全部または組み合わせを示唆している：患者は疾患の不均一な呈示を有した、標準的な処置は無効であった、および／または処置の遵守は不足していた。
１．ピリドキシン
診断時に、患者はＣＢＳの補因子であるピリドキシンに対する応答性について検査される。薬理学的用量のピリドキシン（ビタミンＢ６）の投与は、ピリドキシン応答性であると示された個体でＣＢＳの残留活性を増加させる。ピリドキシン応答性の定義はサイトごとに広く変動するが、ホモシスチン尿症およびメチル化欠陥（ＥＨＯＤ）のための欧州ネットワークおよびレジストリーの一部として書かれた、２０１６年のガイドラインは、ピリドキシン応答性を、ピリドキシン曝露の６週間以内のｔＨｃｙレベルの２０％の低下として定義した。重度に上昇したｔＨｃｙレベルを有する患者および軽度または中等度に上昇したｔＨｃｙレベルを有する患者が、非常に異なるｔＨｃｙレベルを呈示するにもかかわらず、共に応答性として定義されることがある。さらに、異なる処置センターがピリドキシン応答性を異なって定義しており、したがって、ピリドキシン応答性ではなくｔＨｃｙレベルによる患者の分類がより適正かつ厳密である。一般に、ピリドキシンに応答性の患者は、いくらかの残留ＣＢＳ活性、したがって、より低いｔＨｃｙレベルを有し、あまり重度でない呈示をもたらす。
ピリドキシンは、通例、ＣＢＳＤＨ患者において安全であると考えられる（全体が本願明細書に援用される、非特許文献８参照）。その最も一般的に報告される副作用には、９００ｍｇ／日超として定義される高用量で処置された患者における末梢神経障害（全体が本願明細書に援用される、シャンバーグら（Ｓｃｈａｕｍｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９８３；３０９：４４５－４４８；ルドルフら（Ｌｕｄｏｌｐｈ ｅｔ ａｌ．）Ｅｕｒ Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ １９９３；１５２：２７１参照）、５００ｍｇ／日のピリドキシンを受けている新生児における無呼吸および不応答（全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１参照）、ならびに横紋筋融解症（全体が本願明細書に援用される、ショウジら（Ｓｈｏｊｉ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ １９９８；２１：４３９－４４０参照）が含まれる。
ピリドキシン処置は広く使用されているが、ｔＨｃｙレベルの控えめな低下を提供し、それらの出発レベルは正常よりも何倍も上であるので、応答性として定義されるほとんどの患者は、ピリドキシン単独でｔＨｃｙレベルを有意に低下させることができず、まして正常化することができない（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２参照）。長期ピリドキシン処置に加えて、ピリドキシン応答性患者ＣＢＳＤＨ患者は、葉酸および要求に応じてビタミンＢ１２補充も受けることが推奨される。
２．食事制限
全てのＣＢＳＤＨ患者について、生涯の食事制限が以前から推奨されている（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２；ウォルターら（Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｅｕｒ Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ．１９９８年４月；１５７ 補遺２：Ｓ７１－６参照）。推奨されている食事は、極度に限定されており、タンパク質含有量の制限によってＭｅｔ摂取量を減少させることを目指している。
ＣＢＳＤＨ患者のための現行の治療の主軸は、Ｍｅｔを含まないＬ－アミノ酸を補充した、１日当たりわずか５ｇしか天然タンパク質を含まない生涯の低タンパク質食であり（ｗｗｗ．ｈｃｕｎｅｔｗｏｒｋａｍｅｒｉｃａ．ｏｒｇ）、多くの場合、食事を補充するために追加のＣｙｓ（全体が本願明細書に援用される、非特許文献６；非特許文献１２）が施される。重度の制限食は、低メチオニン穀物食、低メチオニン果実および野菜、低メチオニン医療食、油および糖からなる。中等度の量のＭｅｔを含有する肉、鶏肉、魚、卵、牛乳、ヨーグルト、チーズ、大豆製品、ナッツ、豆類ならびに多くの果実および野菜などの食品は回避すべきである。天然ＣＢＳがＭｅｔ代謝の重要な酵素であるので、多くの食品に見られる必須アミノ酸であるＭｅｔの摂取は、上昇したｔＨｃｙの血漿濃度ならびに低下した下流代謝産物ＣｔｈおよびＣｙｓの濃度をもたらす。
調製食品、パン類、および包装食品は、しばしば牛乳、卵または小麦粉を含有するので、高度に制限しなければならない。各ＣＢＳＤＨ患者によって必要とされるタンパク質および許容されるタンパク質の量は異なり、時と共に変動する可能性がある。この量は、頻繁な血液検査（ＡＳＩＥＭ Ｌｏｗ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ）で監視されるｔＨｃｙレベルに従って調整される。食事処置を受けている患者の大部分は、二次栄養失調を予防するため、および小児での適した成長のため、成人での適した栄養のために、味のよくない、Ｍｅｔを含まない合成アミノ酸配合物の毎日の消費も要求する（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２参照）。
ビタミン補充を組み合わせた食事修正は、高度制限食を十分遵守している個体でｔＨｃｙレベルをある度合い低下させることができるが、ほとんどのＣＢＳＤＨ患者のｔＨｃｙレベルは、正常の数倍～数桁高いままである。ほとんどの個体にとって、食事修正の完全な生涯の遵守を達成することは高度に困難なことであり、得られる代謝制御が不十分な期間が、累積的な有害効果を有する（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２参照）。食事の遵守は、青年期および成人期の間でしばしば不十分であり、通例さらに悪化する（全体が本願明細書に援用される、ウォルターら（Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｅｕｒ Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ．１９９８年４月；１５７ 補遺２：Ｓ７１－６；非特許文献９；ガーランドら（Ｇａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．）Ｐａｅｄｉａｔｒ Ｃｈｉｌｄ Ｈｅａｌｔｈ．１９９９年１１月；４（８）：５５７－６２参照）。その上、高Ｍｅｔ食品を食べることは、即時の負の身体反応を誘発せず、食事遵守の困難をさらにいっそうひどくする（ｗｗｗ．ｈｃｕｎｅｔｗｏｒｋａｍｅｒｉｃａ．ｏｒｇ）。Ｍｅｔ制限は、成長および発達を容易にするために十分なＭｅｔを確保する必要があるので、小児でさらにより困難である。食事処置を受けている患者の大部分は、小児での適した成長のため、成人での適した栄養のために、Ｃｙｓに富む、Ｍｅｔを含まないＬ－アミノ酸補充物も要求する（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２参照）。
近年の報告では、具体的なＣＢＳＤＨ－適正アミノ酸補充をした低タンパク質食を処方された２４人の患者の中のわずか４人の成人患者しかこの処置に従わなかったことが述べられた（全体が本願明細書に援用される、ロレンツィーニら（Ｌｏｒｅｎｚｉｎｉ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ．（２０１８）４１：１０９－１１５参照）。複数のＣＢＳＤＨ専門家が、米国において同様に広い変動性を記載している。
３．ベタイン補充
食事に大いに基づく治療に関連付けられる問題は、Ｈｃｙ低下のための他の手法、最も著しくは１日当たり少なくとも２回投与されるベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルグリシン、ＣＹＳＴＡＤＡＮＥ（商標）として市販されている）の補充を必要としている。ベタインは、単独療法としてはめったに有効ではなく（全体が本願明細書に援用される、坂本ら（Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｔ ２００３；４５：３３３－３３８）、普段はピリドキシンおよび／またはＭｅｔ制限食に対する補助として使用される（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２参照）。
ベタインは、根底にあるＣＢＳ欠損に対処するのではなく、代替経路を誘導し、ＨｃｙのＭｅｔへの再メチル化をもたらし、ＣＢＳ変異体の部分的ミスフォールディングを矯正する（全体が本願明細書に援用される、コペクタら（Ｋｏｐｅｃｋａ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ２０１１；３４：３９－４８参照）。ベタインの存在下では、酵素ベタインホモシステインメチルトランスフェラーゼ（ＢＨＭＴ）がＨｃｙをＭｅｔに再メチル化し（全体が本願明細書に援用される、スィングら（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．）Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｄ ２００４；６：９０－９５）、よって、既に高度に上昇したＭｅｔレベルを上昇させながら、Ｈｃｙレベルを部分的に低下させる。ＣＢＳの下流の代謝産物はベタイン投与によっては改良されず、Ｃｙｓ補充が必要となり得る。その上、ベタイン処置は、急性脳浮腫を有する（全体が本願明細書に援用される、デブリンら（Ｄｅｖｌｉｎ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ ２００４、１４４：５４５－５４８；ヤグマイら（Ｙａｇｈｍａｉ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ ２００２；１０８：５７－６３）および有さない（全体が本願明細書に援用される、バタナビチャンら（Ｖａｔａｎａｖｉｃｈａｒｎ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ２００８；３１ 補遺３：４７７－４８１；ブレントンら（Ｂｒｅｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１４；２９：８８－９２；ササイら（Ｓａｓａｉ ｅｔ ａｌ．）Ｔｏｈｏｋｕ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０１５；２３７：３２３－３２７）患者における、大脳白質異常－脳における血管損傷の徴候（全体が本願明細書に援用される、プリンスら（Ｐｒｉｎｓ ｅｔ ａｌ．）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１５；１１：１５７－１６５）に関連付けられている。
ベタインは味が悪く（全体が本願明細書に援用される、ウォルターら（Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｅｕｒ Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ． １９９８年４月；１５７ 補遺２：Ｓ７１－６）、不快な魚臭い体臭および／または息をもたらし得る（全体が本願明細書に援用される、マニングら（Ｍａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．）ＪＩＭＤ Ｒｅｐ ２０１２；５：７１－７５参照）。両効果は、高用量（成人および小児患者で６ｇ／日超）の要求によって潜在的に増悪した。結果として、遵守は通例不足している（全体が本願明細書に援用される、アダムら（Ａｄａｍ ｅｔ ａｌ．）Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ． ２０１３年１２月；１１０（４）：４５４－９；ウォルターら（Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｅｕｒ Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ．１９９８年４月；１５７ 補遺２：Ｓ７１－６；坂本ら（Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｔ ２００３；４５：３３３－３３８参照）。
ベタインの医薬製剤、ＣＹＴＡＤＡＮＥ（商標）は、２００６年にＦＤＡによって承認され、ＣＢＳ欠損、５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）欠損およびコバラミン補因子代謝（ｃｂｌ）欠陥を含むホモシスチン尿症障害における上昇した血液Ｈｃｙを低下させることが指し示されている（全体が本願明細書に援用される、Ｒｅｃｏｒｄａｔｉ．ＣＹＳＴＡＤＡＮＥＴＭ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＰＩ）．２０１７．Ｒｅｆ Ｔｙｐｅ：オンラインソース参照）。
ＣＢＳＤＨピリドキシン非応答性患者間での食事習慣に関する現在までの最大の調査は、ベタインが、特に遅く診断された患者、青年および成人において一般的な処置選択肢となることを指し示した。食事なしで施した場合のベタインの長期有効性を調べる対照研究はないので、食事なしで患者の３４％における一次療法としてのベタインの使用は、食事の遵守の欠如によると考えられる（全体が本願明細書に援用される、アダムら（Ａｄａｍ ｅｔ ａｌ．）Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ ２０１３；１１０：４５４－４５９参照）。実際、ＣＢＳＤＨマウスモデルにおける研究は、ベタイン処置がｔＨｃｙを有意に低下させる能力が経時的に低下することを見出した（全体が本願明細書に援用される、マックリーン ケーエヌ（Ｍａｃｌｅａｎ ＫＮ．）シスタチオニンベータ合成酵素欠損ホモシスチン尿症のベタイン処置：うまくいき、改善するであろうか？（Ｂｅｔａｉｎｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ ｂ－ｓｙｎｔｈａｓｅ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ；ｄｏｅｓ ｉｔ ｗｏｒｋ ａｎｄ ｃａｎ ｉｔ ｂｅ ｉｍｐｒｏｖｅｄ？）Ｄｏｖｅ ｐｒｅｓｓ ２０１２；２：２３－３３参照）。
４．抗血小板療法
Ｈｃｙ低下療法に加えて、不足して制御されたＨｃｙレベルを有する患者および／または血栓症の追加のリスクファクターを有する患者（例えば、第Ｖ因子ライデン、以前の血栓症および妊娠）は、抗血小板薬（例えば、アスピリン、ジピリダモールまたはクロピドグレル）による処置から利益を得ることができる（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２参照）。ＣＯＵＭＡＤＩＮ（商標）血液希釈剤も、以前静脈血栓症になった患者に使用され得る。しかしながら、抗凝固薬は増加した脳出血のリスクに関連付けられており、その使用は個々の患者に基づいて決定されるべきである（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２参照）。
５．現在の治療による臨床転帰
ＣＢＳＤＨの顕在化は、変動する程度の不能に達する古典的臨床症状と共に進行し続け、罹患個体の生活の質に影響する。個体の発生年齢にかかわらず、いずれの年齢における生化学的制御の喪失も、生命を脅かし得る深刻な合併症の発症に関連付けられる（全体が本願明細書に援用される、ウォルターら（Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｅｕｒ Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ．１９９８年４月；１５７ 補遺２：Ｓ７１－６参照）。
不足した代謝制御の期間は、重度の合併症および早死ににつながり得る累積的な有害効果を有するので、処置を、一生を通じて続けなければならない（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２参照）。
処置をしないと、ピリドキシン非応答性ＣＢＳＤＨの予後は悪く、患者の平均余命は著しく減少する。ＣＢＳＤＨが１９６２年に最初に記載されてから、ＣＢＳＤＨの食事療法または他の療法の無作為化対照試行が実行されていない（全体が本願明細書に援用される、カーソンら（Ｃａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｃｈ Ｄｉｓ Ｃｈｉｌｄ．１９６９年６月；４４（２３５）：３８７－９２；ガリットソンら（Ｇｅｒｒｉｔｓｅｎ ｅｔ ａｌ．）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．１９６２年１２月１９日；９：４９３－６参照）。しかしながら、いくつかの観察研究しか公開されていない。
６２９人の未処置ＣＢＳ患者の自然歴を記録した国際研究によって、合併症のリスクが年齢と共に増加することが示された（全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１参照）。処置（ピリドキシン、Ｍｅｔ制限食）は、血漿ｔＨｃｙレベルを低下させることが観察され、血栓塞栓性イベントおよび水晶体脱臼のリスクを著しく低下させたが、制限食の遵守が不足していることが観察された。
ヤップら（Ｙａｐ ｅｔ ａｌ．）（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ． ２００１年１２月；２１（１２）：２０８０－５）は、１５８人の処置患者で国際多施設共同研究を実行した。心血管イベントの発生率は、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）（全体が本願明細書に援用される、Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１）のヒストリカルコントロールデータと比較すると、この処置群で著しく減少した。この見かけ上の利益は、処置患者におけるより低い（しかし正常化されていない）ｔＨｃｙ血漿レベルと相関していた。要求されるレジメンの一貫性のある遵守は非常に困難であることが注目された。
全体として、いくつかのＣＢＳＤＨ処置戦略が利用可能であるが、これらはほとんどの患者を正常に近いｔＨｃｙレベルまで回復することはできない。その上、これらの長期有効性は、不足または一貫性のない生涯の遵守の対象となる。よって、一貫性のあるＨｃｙ低下はＣＢＳＤＨ患者で維持することが困難である。本明細書に記載される医薬品による処置は、これらの落とし穴の多くを回避することを目指している。重度のＭｅｔ制限もＣｙｓ補充も要求しない機序を通してＣＢＳＤＨにおける代謝欠陥を埋め合わせることによって、酵素療法（ＥＴ）という治療は、Ｍｅｔレベルを危険に上昇させることなく、より一貫性のあるＨｃｙ低下を達成すると予想される。
ＶＩ．用量および投与
一定の実施形態では、医薬品が、皮下（ＳＣ）、静脈内（ＩＶ）または腹腔内（ＩＰ）注射によって対象に投与され得る。一実施形態では、医薬品が、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回または２０回、対象に投与され得る。別の実施形態では、医薬品が２０回超投与される。別の実施形態では、医薬品が１００回超投与される。あるいは、医薬品が、対象の残りの寿命にわたって投与され得る。
一定の実施形態では、医薬品の投与が、１２時間毎、１３時間毎、１４時間毎、１５時間毎、１６時間毎、１７時間毎、１８時間毎、１９時間毎、２０時間毎、２１時間毎、２２時間毎、２３時間毎、毎日、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、１週間毎、２週間毎、３週間毎および１か月毎に繰り返され得る。一定の実施形態では、医薬品の投与が、３日に１回、２日に１回、または１日に１回実施される。
一定の実施形態では、医薬品の投与が、数分、数時間、数日または数週間離れた一連の投与であり得る。例えば、一連の投与の回数は、１回、２回、３回、４回、５回または６回であり得る。非限定的な例として、対象は、２４時間離れて３回投与される。別の非限定的な例として、対象は、１２時間離れて５回投与される。対象はヒトであり得る。
一定の実施形態では、医薬品の投与が、第１の一連の投与と第２の一連の投与との間にギャップを有する一連の投与の投与スケジュールに従い得る。投与間のギャップは、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、１か月間、２か月間、３か月間、４か月間、５か月間、６か月間、７か月間、８か月間、９か月間、１０か月間、１１か月間、１２か月間、１３か月間、１４か月間、１５か月間、１６か月間、１７か月間、または１８か月間であり得る。一連の投与の回数は２回、３回、４回、５回または６回であり得る。非限定的な例として、対象は、第１の一連の１２時間離れた５回の投与を投与され、次いで、第１の投与の１４日後、対象は、第２の一連の１２時間離れた５回の投与を投与される。別の非限定的な例として、対象は、第１の一連が２週間にわたる１週間に２回の投与１回であり、第２の一連の投与が６週間にわたる１週間に３回である、８週間の期間にわたる２連の投与を投与される。
一定の実施形態では、対象にベタインが投与された後、医薬品が少なくとも１回投与され得る。ベタイン投与と医薬品投与との間の時間は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、１か月間、２か月間、四半期、４か月間、５か月間、６か月間、７か月間、８か月間、９か月間、１０か月間、１１か月間、１２か月間、１３か月間、１４か月間、１５か月間、１６か月間、１７か月間、または１８か月間であり得る。非限定的な例として、対象にベタインが投与された１４日後に、医薬品が投与され得る。別の非限定的な例として、対象にベタインが投与された後、対象に医薬品が２回投与され得る。別の非限定的な例として、ベタイン投与の１４または１５日後に医薬品が投与され得る。
一定の実施形態では、医薬品がベタインと組み合わせて対象に投与され得る。組み合わせは、少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回および１５回投与され得る。一定の実施形態では、医薬品がベタインと組み合わせて１５回超投与され得る。患者に投与され得る追加の併用療法には、医薬品と、非常に低いタンパク質／Ｍｅｔ食および／またはビタミン／補充物などのｔＨｃｙレベルを低下させるための少なくとも１つの処置が含まれる。
一実施形態では、対象に投与される医薬品の用量が、約０．２５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの間であり得る。例えば、用量は、約０．３３ｍｇ／ｋｇ、約０．６６ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇまたは１．５ｍｇ／ｋｇのうちの１つである。あるいは、用量は約２ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇおよび約１０ｍｇ／ｋｇである。例えば、用量は約０．５ｍｇ／ｋｇであり得る。あるいは、治療有効量は、約５．０ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇおよび約１０．０ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇの範囲から選択される投与量である。例えば、投与量は、約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．３３ｍｇ／ｋｇ、約０．６６ｍｇ／ｋｇ、約１．００ｍｇ／ｋｇ、約１．１０ｍｇ／ｋｇ、約１．２０ｍｇ／ｋｇ、約１．３０ｍｇ／ｋｇ、約１．４０ｍｇ／ｋｇ、約１．５０ｍｇ／ｋｇ、約１．６０ｍｇ／ｋｇ、約１．７０ｍｇ／ｋｇ、約１．８０ｍｇ／ｋｇ、約１．９０ｍｇ／ｋｇ、約２．００ｍｇ／ｋｇ、約３．００ｍｇ／ｋｇ、約４．００ｍｇ／ｋｇ、約５．００ｍｇ／ｋｇ、約６．００ｍｇ／ｋｇ、約７．００ｍｇ／ｋｇ、約８．００ｍｇ／ｋｇ、約９．００ｍｇ／ｋｇ、約１０．０ｍｇ／ｋｇ、約１１．０ｍｇ／ｋｇ、約１２．０ｍｇ／ｋｇ、約１３．０ｍｇ／ｋｇ、約１４．０ｍｇ／ｋｇ、約１５．０ｍｇ／ｋｇ、約１６．０ｍｇ／ｋｇ、約１７．０ｍｇ／ｋｇ、約１８．０ｍｇ／ｋｇ、約１９．０ｍｇ／ｋｇ、約２０．０ｍｇ／ｋｇ、約２１．０ｍｇ／ｋｇ、約２２．０ｍｇ／ｋｇ、約２３．０ｍｇ／ｋｇ、約２４．０ｍｇ／ｋｇ、約２５．０ｍｇ／ｋｇ、約２６．０ｍｇ／ｋｇ、約２７．０ｍｇ／ｋｇ、約２８．０ｍｇ／ｋｇ、約２９．０ｍｇ／ｋｇ、約３０．０ｍｇ／ｋｇ、約３１．０ｍｇ／ｋｇ、約３２．０ｍｇ／ｋｇ、約３３．０ｍｇ／ｋｇ、約３４．０ｍｇ／ｋｇ、約３５．０ｍｇ／ｋｇ、約３６．０ｍｇ／ｋｇ、約３７．０ｍｇ／ｋｇ、約３８．０ｍｇ／ｋｇ、約３９．０ｍｇ／ｋｇ、約４０．０ｍｇ／ｋｇ、約４１．０ｍｇ／ｋｇ、約４２．０ｍｇ／ｋｇ、約４３．０ｍｇ／ｋｇ、約４４．０ｍｇ／ｋｇ、約４５．０ｍｇ／ｋｇ、約４６．０ｍｇ／ｋｇ、約４７．０ｍｇ／ｋｇ、約４８．０ｍｇ／ｋｇ、約４９．０ｍｇ／ｋｇ、および約５０．０ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される。
一定の実施形態では、医薬品がメチオニン制限食を受けている対象に投与される。あるいは、医薬品がメチオニン制限食を受けていない対象に投与される。
一定の実施形態では、医薬品が、ＣＢＳＤＨを処置するための別の治療薬と共投与され得る。本明細書で使用される場合、「共投与される」とは、２つ以上の構成成分の投与を意味する。共投与するためのこれらの構成成分には、それだけに限らないが、ベタインまたはビタミンＢ６が含まれる。共投与は、同時のまたは投与間の時間経過、例えば１秒間、５秒間、１０秒間、１５秒間、３０秒間、４５秒間、１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、７分間、８分間、９分間、１０分間、１１分間、１２分間、１３分間、１４分間、１５分間、１６分間、１７分間、１８分間、１９分間、２０分間、２１分間、２２分間、２３分間、２４分間、２５分間、２６分間、２７分間、２８分間、２９分間、３０分間、３１分間、３２分間、３３分間、３４分間、３５分間、３６分間、３７分間、３８分間、３９分間、４０分間、４１分間、４２分間、４３分間、４４分間、４５分間、４６分間、４７分間、４８分間、４９分間、５０分間、５１分間、５２分間、５３分間、５４分間、５５分間、５６分間、５７分間、５８分間、５９分間、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日間、１．５日間、２日間または３日間がある、２つ以上の構成成分の投与を指す。一定の実施形態では、２つ以上の構成成分の投与間の時間経過が３日間超である。
一定の実施形態では、医薬品が、１週間に１回の初期投与間隔で皮下（ＳＣ）注射を介して慢性的に患者に投与される、非経口剤として使用され得る。例えば、６回の投与にわたって毎週の薬物投与である。一定の実施形態では、対象が１８～６５歳の年齢範囲内にあり得る。一定の実施形態では、１６歳の若さの対象が同様に処置され得る。
一定の実施形態では、投与が、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間または６日間にわたって行われる。一定の実施形態では、投与が、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２１週間、２２週間、２３週間、２４週間、２５週間、２６週間、２７週間、２８週間、２９週間、３０週間、３１週間、３２週間、３３週間、３４週間、３５週間、３６週間、３７週間、３８週間、３９週間、４０週間、４１週間、４２週間、４３週間、４４週間、４５週間、４６週間、４７週間、４８週間、４９週間、５０週間、５１週間、または５２週間にわたって行われる。
一定の実施形態では、医薬品が、ピリドキシン（ビタミンＢ６とも呼ばれる）および／または抗血小板療法との併用療法として投与される。
ＶＩＩ．患者層別化
一定の実施形態では、本明細書に記載される医薬品を使用した有効な酵素療法に適格な個体が、ＣＢＳ遺伝子の変異分析による遺伝性ＣＢＳ欠損ホモシスチン尿症の確認および８０μＭ以上の血漿ｔＨｃｙレベルに基づいて、ＣＢＳＤＨの診断を受けている患者を含む。
Ａ．臨床的呈示
ＣＢＳＤＨの診断および管理のためのガイドラインによると、重度のまたは急速に進行するミオパシー、水晶体脱臼および／または発達遅延を呈示する小児で疾患を疑うべきである（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２参照）。血栓塞栓症および／または水晶体脱臼を呈示するが、他の症状を呈示していない成人、ならびに眼、結合組織、神経精神および血管合併症を含む多系統疾患を有する成人でも検査が正当化される（それぞれ全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１；非特許文献１２；ケリーら（Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２００３；６０：２７５－２７９参照）。
Ｂ．生化学的分析
血漿を還元剤で処置した後の全ての遊離ホモシステイン種と結合ホモシステイン種の合計を使用して、血漿ｔＨｃｙレベルを決定する。安定な食習慣を有する健康な個体では、ｔＨｃｙレベルは経時的に比較的一定なままである（それぞれ全体が本願明細書に援用される、非特許文献１１；マッキンリーら（ＭｃＫｉｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．）Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２００１；４７：１４３０－１４３６参照）。しかしながら、タンパク質に富む食事の消費は、ｔＨｃｙレベルを数時間の期間にわたっておおよそ１０％上昇させ得る（全体が本願明細書に援用される、ヴァーホフら（Ｖｅｒｈｏｅｆ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ２００５；８２：５５３－５５８参照）。高ホモシステイン血症（ｔＨｃｙ＞４０μｍｏｌ／Ｌ）を有する個体における研究により、個体内ｔＨｃｙレベルが、４～８か月の期間にわたって最大２５％変動することが見出された。しかしながら、データを解釈する能力を妨げる食事、アッセイ方法およびサンプリングの時間の変動性についての情報は提供されなかった（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１１参照）。
葉酸補充をしていない集団では、対応する参照上限はそれぞれおおよそ１５および２０μｍｏｌ／Ｌである。新生児におけるＣＢＳの診断を支持するために、血漿中のｔＨｃｙは５０～１００μｍｏｌ／Ｌ超の間であると予想され、血漿中のＭｅｔは２００～１５００μｍｏｌ／Ｌの間（すなわち、３～２３ｍｇ／ｄＬ）であると予想される（全体が本願明細書に援用される、非特許文献２参照）。未処置のより高齢の個体におけるＣＢＳの診断を支持するために、血漿中のｔＨｃｙは１００μｍｏｌ／Ｌ超であると予想され、血漿中のＭｅｔは５０μｍｏｌ／Ｌ超（すなわち、０．７ｍｇ／ｄＬ超）であると予想される。対照新生児またはより高齢の個体は、１５μｍｏｌ／Ｌ未満の血漿中ｔＨｃｙおよび１０～４０μｍｏｌ／Ｌ（０．２～０．６ｍｇ／ｄＬ）の間のＭｅｔを有すると予想される。
低～低－正常Ｃｔｈレベル（参照は、それぞれ０．０５～０．０８μｍｏｌ／Ｌおよび０．３５～０．５μｍｏｌ／Ｌの範囲である）と組み合わせた高～高－正常Ｍｅｔレベル（参照は、典型的にはそれぞれ４０～４５μｍｏｌ／Ｌおよび１２～１５μｍｏｌ／Ｌの範囲である）は、ＣＢＳＤＨをＨｃｙメチル化の遺伝障害および栄養障害によって引き起こされるＨＣＵと区別するのに有用であり得る（それぞれ全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２；スタブラーら（Ｓｔａｂｌｅｒ ｅｔ ａｌ．）ＪＩＭＤ Ｒｅｐ ２０１３；１１：１４９－１６３；バートルら（Ｂａｒｔｌ ｅｔ ａｌ．）Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ ２０１４；４３７：２１１－２１７参照）。別の有用な検査は、放射性または重水素標識物質を使用して、培養線維芽細胞中のＨｃｙおよびセリンからのＣｔｈ生成を決定する（それぞれ全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２；クラウス ジェイピー（Ｋｒａｕｓ ＪＰ．）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １９８７；１４３：３８８－３９４；スミスら（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ２０１２；９１１：１８６－１９１参照）。しかしながら、酵素分析は、ピリドキシン応答性個体と非応答性個体をいつも区別することができるとは限らず、酵素活性は、軽度の場合、正常であり得る（全体が本願明細書に援用される、アルカイデら（Ａｌｃａｉｄｅ ｅｔ ａｌ．）Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ ２０１５；４３８：２６１－２６５参照）。より最近では、器官から血漿中に放出されるＣＢＳの活性を測定する迅速で安定な同位元素アッセイが、ピリドキシン非応答性患者で１００％の感度を示したが、ピリドキシン応答者では８６％の感度しか示さなかった（共に全体が本願明細書に援用される、アルカイデら（Ａｌｃａｉｄｅ ｅｔ ａｌ．）Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ ２０１５；４３８：２６１－２６５；クライトら（Ｋｒｉｊｔ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ２０１１；３４：４９－５５参照）。
Ｃ．分子診断
分子遺伝的検査－ＣＢＳＤＨのゴールドスタンダード診断検査－は、単一遺伝子検査によって、または複数遺伝子パネルを使用して実施することができる（それぞれ全体が本願明細書に援用される、ヤップ エス（Ｙａｐ Ｓ．）シスタチオニンベータ合成酵素欠損によるホモシスチン尿症（Ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ ｄｕｅ ｔｏ ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ ｂｅｔａ－ｓｙｎｔｈａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）．Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ［定期オンライン］２００５；サシャロフ エスジェイ（Ｓａｃｈａｒｏｗ ＳＪ）、ピッカー ジェイディー（Ｐｉｃｋｅｒ ＪＤ）、レヴィ エイチエル（Ｌｅｖｙ ＨＬ）．シスタチオニンベータ合成酵素欠損によって引き起こされるホモシスチン尿症（Ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ Ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ Ｂｅｔａ－Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）．ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ ２０１７；非特許文献１２；カツァニスら（Ｋａｔｓａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ２０１３；１４：４１５－４２６；参照）。特定のＣＢＳ変異を有するリスクが高い個体は、標的化単一遺伝子検査を使用してスクリーニングすべきである。しかしながら、これは、共通のＣＢＳ変異を有する選択された集団（例えば、カタールのＣＢＳＤＨを有する個体の９３％はｐ．Ａｒｇ３３６Ｃｙｓ；ｃ．１００６Ｃ＞Ｔ変異を保有する）および既知の病原性変異体を有する家族の個体でのみ有用である。他の患者では、ＣＢＳ遺伝子を配列決定し、１つの病原性変異体が見られる場合、または病原体変異体が見られない場合にのみ、遺伝子標的化欠失／複製分析を実施することができる。あるいは、複数遺伝子パネルを使用して複数の遺伝子の同時の分子検査を実施することができる。使用される方法には、配列分析、欠失／複製分析および他の配列決定に基づかない検査が含まれ得る（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２参照）。通例、分子遺伝的検査は、限定された数の流行性変異を有する高リスク集団のためにある（それぞれ全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２；ヒューマーら（Ｈｕｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ２０１５；３８：１００７－１０１参照）。
Ｄ．ピリドキシン応答性検査
ピリドキシン応答性検査は、ＣＢＳＤＨ患者にピリドキシン補充を処方すべきかどうかを決定するために診療所で使用される。異なる処置センターがピリドキシン応答性を異なって定義しているので（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２参照）、ピリドキシン応答性ではなくｔＨｃｙレベルによる患者の分類がより厳密である。ピリドキシン応答性は、代謝制御の尺度ではなく、むしろいくらかの残留ＣＢＳ活性が残っていることの指標である。
Ｅ．新生児スクリーニング（ＮＢＳ）
一般に、ＣＢＳＤＨ欠損についてのＮＢＳ検査は、乾燥血液スポットを分析してＭｅｔレベルを決定することによって遂行される。あるいは、ＮＢＳのための乾燥血液スポット中のＭｅｔではなくｔＨｃｙレベルの評価が世界中の少数のセンターで利用可能である。これは、高Ｍｅｔレベルを有する個体におけるＮＢＳの偽陽性率を低下させるための第２層検査として採用され（全体が本願明細書に援用される、タージオンら（Ｔｕｒｇｅｏｎ ｅｔ ａｌ．）Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２０１０；５６：１６８６－１６９５参照）、感度を改善するために使用されるわけでもないし、偽陰性率を低下させるために使用されるわけでもない。
ＶＩＩＩ．表現型転帰
後ろ向き研究は、ｔＨｃｙレベルと転帰との間の比例関係を示している。最高のｔＨｃｙレベルを有する患者（処置または未処置）は人生の早期により重度の症状を呈示し、より低いｔＨｃｙレベルを有する患者は、より少ない症状を呈示し、あまり急速に進行しない（それぞれ全体が本願明細書に援用される、ヤップ エス（Ｙａｐ Ｓ．）シスタチオニンベータ合成酵素欠損によるホモシスチン尿症（Ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ ｄｕｅ ｔｏ ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ ｂｅｔａ－ｓｙｎｔｈａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）．Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ［定期オンライン］２００５；マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１参照）。上昇したｔＨｃｙレベルを有する個体は、典型的には成長障害、血栓塞栓症、眼の水晶体の後の脱臼を伴う重度の近視、骨粗鬆症型骨折、マルファン様体質（特に長骨の伸長）および／または学習困難などの精神医学異常を呈示する（それぞれ全体が本願明細書に援用される、ヤップ エス（Ｙａｐ Ｓ．）シスタチオニンベータ合成酵素欠損によるホモシスチン尿症（Ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ ｄｕｅ ｔｏ ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ ｂｅｔａ－ｓｙｎｔｈａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）．Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ［定期オンライン］２００５；非特許文献１２；ＮＯＲＤ、クラウス ジェイピー（Ｋｒａｕｓ ＪＰ．）シスタチオニンベータ合成酵素欠損によるホモシスチン尿症（Ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ ｄｕｅ ｔｏ ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ ｂｅｔａ－ｓｙｎｔｈａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）．ＮＯＲＤ［定期オンライン］２０１７参照）。ＣＢＳ欠損のスペクトルを反映して、一部の患者は重度の小児発生多系統疾患を有し、あまり重度に上昇していないＨｃｙを有する患者は成人期まで未診断のままであり得る（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２参照）。重度に上昇したＨｃｙレベルを有する患者では平均余命が著しく減少するが、中等度に上昇したｔＨｃｙレベルを有する患者でさえ、複数の負の臨床転帰に苦しむ。
上昇したｔＨｃｙレベルおよびＣＢＳＤＨ患者で一般的に罹患する４つの系（眼、骨格、心血管および神経）における負の臨床転帰の因果効果を指し示す有意な証拠が観察されている。眼系では、頻繁に観察される表現型転帰には水晶体偏位、虹彩振盪、近視が含まれ、少ない頻度で観察される表現型転帰には緑内障、視神経萎縮、網膜変性、網膜剥離、白内障および角膜異常が含まれる。骨格系では、頻繁に観察される表現型転帰には骨粗鬆症、両凹椎骨、脊柱側弯症、長骨の増加した長さ、不規則に広がった骨幹端、骨幹端針状骨、骨端の異常なサイズ／形状、成長停止線、凹足および高アーチ型口蓋が含まれ、少ない頻度で観察される表現型転帰にはクモ指症、拡大した手根骨、異常な骨年齢、鳩胸／漏斗胸、外反膝、脊柱後弯症および短い第４中手骨が含まれる。血管系では、頻繁に観察される表現型転帰には血管閉塞、頬部潮紅および網状皮斑が含まれる。中枢神経系では、頻繁に観察される表現型転帰には精神遅滞、精神障害および錐体外路徴候が含まれ、少ない頻度で観察される表現型転帰には発作および異常な脳波が含まれる。追加の身体系では、以下の表現型転帰、すなわち、色が薄く傷みやすい髪、薄い皮膚、肝臓の脂肪変化、鼠径ヘルニア、ミオパシー、内分泌異常、減少した凝固因子および特発性腸穿孔が頻繁に観察される。
軽度の上昇したｔＨｃｙレベルと負の転帰との間に強力な関係が観察されているが、データは、ｔＨｃｙレベルの低下が臨床的顕在化にプラスに影響することも指し示している。ＣＢＳＤＨに関する文献は、疾患の希少性およびその後のより小さな研究に悩まされているが、重度に上昇したＨｃｙレベルを有する集団における臨床転帰の拡大から利益を得ている。逆に、より幅広い集団での研究は大きな症例数から利益を得ているが、ｔＨｃｙレベルの上昇が小さい。まとめると、これらの研究は一貫して、上昇したｔＨｃｙレベルが負の臨床転帰を強力に予測し、これらのレベルを低下させるための薬理学的介入が有益であることを実証している。
本明細書に記載される医薬品によるＣＢＳＤＨの処置からの潜在的な転帰は、ＣＢＳＤＨのための他の治療で提供されるよりも高い濃度のＭｅｔおよび他の必須アミノ酸を含む、より楽にされた食事を維持しながら、血漿ｔＨｃｙ濃度を可能な最低レベルまで低下させることである。ＣＢＳＤＨを有する乳児および小児では、優先事項が、ＣＢＳＤＨに関連付けられる合併症を予防すること、ならびに適した成長および正常な知能の発達を確保することである（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２参照）。晩年に診断された患者では、優先事項が、生命を脅かす血栓塞栓症を予防すること、および既に確立された合併症の進行を最小化することであり得る。これらの目標に対処するために、ＣＢＳＤＨに関連付けられる生化学的異常が改善、可能であれば、正常化され得る（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２参照）。８つの欧州の国の２９のセンターにわたるＣＢＳＤＨ患者についての食事管理習慣を比較する調査は、血漿ｔＨｃｙレベルについての標的範囲に関する処置センターでのコンセンサスがほとんどなく、中央推奨標的が５５μＭ未満および２９のセンターの間で２０～１００μＭ未満の範囲内であることを見出した（全体が本願明細書に援用される、アダムら（Ａｄａｍ ｅｔ ａｌ．）Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．２０１３年１２月；１１０（４）：４５４－９参照）。
数か月離れて検査した血漿ｔＨｃｙレベルでの個人内変動２５％を考慮すると、約１００μＭの前の血漿ｔＨｃｙレベルを有する患者を除外することを回避して（それぞれ全体が本願明細書に援用される、非特許文献１１；グットルムセンら（Ｇｕｔｔｏｒｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１９９６、９８（９）：２１７４－８３参照）、少数の患者で臨床的に有意な低下を検出するのに十分高いレベルを提供するために、処置の適格性のためのｔＨｃｙレベルについて８０μＭ以上のカットオフ値を本明細書で選んだ。数か月離れて検査した血漿ｔＨｃｙレベルでの個人内変動２５％（それぞれ全体が本願明細書に援用される、非特許文献１１；グットルムセンら（Ｇｕｔｔｏｒｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１９９６、９８（９）：２１７４－８３参照）は、部分的には、経時的なＣＢＳＤＨ患者における食事、投薬、または補充物の変化により得る。
未処置の場合、ピリドキシン非応答性ＣＢＳＤＨ患者の予後は暗い（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２参照）。１９８５年に、処置前のイベントが発生するまでの時間分析による、６２９人の患者でのＣＢＳＤＨの自然歴を記録する国際的後ろ向き研究により、患者の７０％が１０歳までに水晶体脱臼を経験し、８５％が１２歳までに症状を発症することが示された（共に全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１；マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）、スコビー エフ（Ｓｋｏｖｂｙ Ｆ．）硫黄転移の障害（Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｓｕｌｆｕｒａｔｉｏｎ）． スクリヴァー シーエル（Ｓｃｒｉｖｅｒ ＣＬ）、ボーデ エーエル（Ｂｅａｕｄｅｔ ＡＬ）、スライ ダブリューエス（Ｓｌｙ ＷＳ）、ヴァレ ディー（Ｖａｌｌｅ Ｄ）編 Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．第７版、ニューヨーク：マグロウヒル（ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ）；２００１；１２７９－１３２７参照）。全体として、罹患個体の５０％が１５歳までにＸ線検査で検出される脊椎骨粗鬆症を有し、ピリドキシン非応答性患者の２３％（応答性患者の４％）が３０歳までに死亡した（全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１参照）。
全体としてまとめると、利用可能な証拠は、制限食および食事補充物の使用を含む、ＣＢＳＤＨの処置に向けた現在の手法が、ほとんどの患者で疾患進行の進行停止に無効であることを指し示している。結果として、ＣＢＳＤＨの代謝異常を改善または正常化し、疾患の臨床的顕在化の進行を遅延させるまたは停止する忍容性が高い治療を識別する実質的なアンメットメディカルニーズが存在する。
上昇したＨｃｙレベルと、眼合併症（特に、水晶体脱臼）、骨格転帰（特に、骨粗鬆症）、血管イベント（特に、脳卒中および小血管疾患）および様々なＣＮＳ転帰（特に、認知機能）を含むＣＢＳＤＨに関連付けられる重要な臨床転帰との間の因果効果が観察されている。上昇したｔＨｃｙレベルと負の臨床転帰との間の関係、および逆に、低下したＨｃｙレベルと改善した臨床転帰との間の関係は、一般集団における複数の研究によってさらに強化されている。全体として、これらの臨床所見は、早期ＣＢＳＤＨ診断の必要性を強調し、Ｈｃｙレベルを可能な限り正常に近く低下させるための処置を促す。
ＣＢＳＤＨ患者の生活の質（ＱｏＬ）に関する研究は公開されていないが、未公開の報告が、患者およびその介護者が、高度に制限され、社会的に孤立した食事に従い、これを管理することの心理社会的効果に苦しんでおり、疾患の長期医学的結果を極度に心配していることを指し示している。驚くことではないが、患者は、その長期見込みを損なうことなく、食事を楽にすることができることを切望している。
ＣＢＳＤＨ患者におけるｔＨｃｙレベルと重要な臨床転帰との間の強力な関係は、ｔＨｃｙレベルの変化が、ＣＢＳＤＨの臨床エンドポイントの組み合わせについての信頼できる代用マーカーであることを示している。したがって、ｔＨｃｙレベルの変化は、（ｉ）診療所で患者の進行を監視する、および（ｉｉ）臨床試験で新たな処置の臨床利益を予測する、および（ｉｉ）治療の有効性を予測するのに有用である。
例えば、医薬品は、医薬品を対象に投与する前と比較して、対象の大腿動脈柔軟性を正常化する、または増加させる。例えば、Ｉ２７８Ｔマウスは、野生型マウスと比較して有意に低い大腿動脈柔軟性を有する。Ｍｅｔ制限食は、実際に、医薬品で処置したマウスと処置していないマウスの両方において、通常食と比較してＩ２７８Ｔマウスで小さな大腿動脈直径をもたらし得る。
３匹の疾患マウスモデルで以前実行された研究は、全体が本願明細書に援用される、国際公開第２０１７／０８３３２７号に記載されるように、ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓが全身投与後に有効であることを実証した。これらの研究は、脳などの組織での細胞外Ｈｃｙ血漿レベルおよび細胞内Ｈｃｙレベルの最大９０％の低下を示した。医薬品の投与は、細胞内空間の高濃度から細胞外空間（医薬品がこれをさらに処理することができる）の低濃度までのＨｃｙの流束で、濃度勾配をもたらすことが観察された。細胞外ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓは、Ｈｃｙ「シンク」として働く。要約すると、医薬品は、ＣＢＳＤＨ動物モデルにおいてＭｅｔ代謝経路の制御を回復した。
これらの研究はまた、ＣＢＳＤＨマウスモデルにおけるＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ Ｃ１５ＳのＳＣ投与が、Ｃｔｈレベルの上昇およびＣｙｓレベルの正常化を含め、代謝産物レベルを矯正したことを示している。加えて、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓは、顔面脱毛症、肝臓組織学、骨粗鬆症、体組成、糖尿病性網膜症（おそらく腎疾患に続発性）、ならびに網膜血管閉塞または非動脈炎性虚血性視神経症による斑状萎縮および視神経萎縮、サイトカインおよび脂質レベルを含む、マウスにおける疾患の表現型発現にプラスの影響を及ぼした。ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓはまた、ＣＢＳノックアウト（ＫＯ）マウスを早死にから救済した（それぞれ全体が本願明細書に援用される、ルッカーら（Ｌｏｏｋｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ２００３；４６：７６６－７７２；プスパラジャら（Ｐｕｓｐａｒａｊａｈ ｅｔ ａｌ．）Ｆｒｏｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２０１６；７：２００；ガースら（Ｇｅｒｔｈ ｅｔ ａｌ．）Ｊ ＡＡＰＯＳ ２００８；１２：５９１－５９６；スタンガーら（Ｓｔａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｌａｂ Ｍｅｄ ２００５；４３：１０２０－１０２５；ケーヒルら（Ｃａｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２００３；１３６：１１３６－１１５０；ミンニーティら（Ｍｉｎｎｉｔｉ ｅｔ ａｌ．）Ｅｕｒ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２０１４；２４：７３５－７４３参照）。ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓはまた、疾患動物モデルにおける慢性投与で認められる毒物学的効果がなく忍容性が高いことが観察された。
ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓは、細胞外空間で作用し、患者の遺伝学、同時療法、またはベースラインｔＨｃｙレベルにかかわらず、ｔＨｃｙ血漿濃度を低下させると予期される。よって、研究の適格集団は、ピリドキシン応答性患者と非応答性患者の両方を含むべきである。
健康な個体では、ｔＨｃｙレベルがおおよそ５～１５μＭの範囲にあり（全体が本願明細書に援用される、ＯＥＣＤ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｓｅｒｉｅｓ ｏｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ．Ｎｏ．１ ＥＮＶ／ＭＣ／ＣＨＥＭ（９８）１７ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（１９９７年に改訂））、その９８％がジスルフィド型である、またはタンパク質結合している。ｔＨｃｙのわずか２％のみが、酵素の基質として働くことができる非結合型の遊離の還元アミノチオールとして存在する（共に全体が本願明細書に援用される、ＥＭＡ：Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｏｎ ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ、ＥＭＥＡ／ＣＨＭＰ／ＥＷＰ／１９２２１７／２００９、ｅｖ．１、２０１１年７月２１日；ＡＴＬ－１５－１４１９ Ａｔｌａｎｂｉｏ Ｓｔｕｄｙ Ｒｅｐｏｒｔ「研究５２９７３６中に収集されたサル血漿試料中のシスタチオニンβ合成酵素活性の産物としてのシスタチオニンＤ４のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ決定（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ－Ｄ４ ａｓ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ β－ｓｙｎｔｈａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｍｏｎｋｅｙ ｐｌａｓｍａ ｓａｍｐｌｅｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ５２９７３６）」参照）。他方で、ＣＢＳＤＨ患者は、４００μＭ以上に達し得る血漿レベルを呈示するだけでなく、遊離ホモシステインがｔＨｃｙ値の１０～２５％に達するという劇的に変更されたバランスも呈示する。
マウスモデルでは、ＰＥＧ化ｈｔＣＢＳ Ｃ１５Ｓの投与が、ｔＨｃｙレベルの最大９０％の低下をもたらした。よって、酵素に利用可能な遊離ホモシステインの初期レベル（全体の１０％～２５％）だけでは、記録されたｔＨｃｙレベルの有意な低下を説明することができず、追加のプールが酵素に利用可能にならなければならない。例えば、ＰＥＧ ｈｔＣＢＳ活性の結果として、遊離Ｈｃｙは乏しくなるので、血漿中の遊離ＨｃｙとＨｃｙ付加物（タンパク質結合型Ｈｃｙまたはジスルフィド型）との間のバランスは遊離Ｈｃｙの作製を支えるように変化し、これが酵素によってさらに処理され得る。
Ａ．眼合併症
上昇したＨｃｙレベルは、ＣＢＳＤＨ患者および一般集団において、眼合併症、特に水晶体脱臼の強力な独立したリスクファクターである。薬理学的介入および食事介入を処方された場合でさえ、ＣＢＳＤＨ患者の大部分は最終的に眼合併症を呈示する。Ｈｃｙレベルの低下が、ＣＢＳＤＨ患者で水晶体脱臼を遅延させ、もしかすると予防することが示されている（それぞれ全体が本願明細書に援用される、ヤップ エス（Ｙａｐ Ｓ．）シスタチオニンベータ合成酵素欠損によるホモシスチン尿症（Ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ ｄｕｅ ｔｏ ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ ｂｅｔａ－ｓｙｎｔｈａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）．Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ［定期オンライン］２００５；マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１；マルティネス－グティエレスら（Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ ｅｔ ａｌ．）Ｉｎｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ（２０１１） ３１：２２７－２３２；非特許文献１３；ミュルビヒルら（Ｍｕｌｖｉｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．）Ｊ ＡＡＰＯＳ ２００１；５：３１１－３１５；マルチ－カーバハルら（Ｍａｒｔｉ－Ｃａｒｖａｊａｌ ｅｔ ａｌ．）Ｃｏｃｈｒａｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔ Ｒｅｖ ２０１５；１：ＣＤ００６６１２；スウィーツァーら（Ｓｗｅｅｔｓｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１６、３７５：１８７９－１８９０；サディクら（Ｓａｄｉｑ ｅｔ ａｌ．）Ｓｅｍｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２０１３；２８：３１３－３２０；ライトら（Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．）ホモシステイン、葉酸および眼（Ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ，ｆｏｌａｔｅｓ，ａｎｄ ｔｈｅ ｅｙｅ）．Ｅｙｅ（Ｌｏｎｄ）２００８；２２：９８９－９９３；リーバーマンら（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １９６６、６１：２５２－２５５；ハリソンら（Ｈａｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ １９９８、１０５：１８８６－１８９０；ラムセイら（Ｒａｍｓｅｙ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １９７２；７４：３７７－３８５；コーサーら（Ｃｏｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｇｅｎｅｔ ２０１７、３８：９１－９４；ゴーバニハグジョら（Ｇｈｏｒｂａｎｉｈａｇｈｊｏ ｅｔ ａｌ．）Ｍｏｌ Ｖｉｓ ２００８、１４：１６９２－１６９７；ジャヴァドザデら（Ｊａｖａｄｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．）Ｍｏｌ Ｖｉｓ ２０１０；１６：２５７８－２５８４；セドンら（Ｓｅｄｄｏｎ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２００６；１４１：２０１－２０３；コーラルら（Ｃｏｒａｌ ｅｔ ａｌ．）Ｅｙｅ（Ｌｏｎｄ）２００６；２０：２０３－２０７；アクサー－シーゲルら（Ａｘｅｒ－Ｓｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２００４、１３７：８４－８９；ホイベルガーら（Ｈｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ２００２；７６：８９７－９０２；ファンら（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０１５；５：１０５８５；センら（Ｓｅｎ ｅｔ ａｌ．）Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２００８；２３：２５５－２５７；ヨウセフィら（Ｙｏｕｓｅｆｉ ｅｔ ａｌ．）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｌｅｔｔ ２０１３；２０：９３２－９４１；ガースら（Ｇｅｒｔｈ ｅｔ ａｌ．）Ｊ ＡＡＰＯＳ ２００８；１２：５９１－５９６；スタンガーら（Ｓｔａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｌａｂ Ｍｅｄ ２００５、４３：１０２０－１０２５；ケーヒルら（Ｃａｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２００３、１３６：１１３６－１１５０；ミンニーティら（Ｍｉｎｎｉｔｉ ｅｔ ａｌ．）Ｅｕｒ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２０１４、２４：７３５－７４３；タークら（Ｔｕｒｋｃｕ ｅｔ ａｌ．）Ｍｅｄｉｃｉｎａ （Ｋａｕｎａｓ）２０１３、４９：２１４－２１８；ヴェッサーニら（Ｖｅｓｓａｎｉ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２００３；１３６：４１－４６；リーボヴィッツら（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｃｈ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｇｌａｕｃｏｍａ ２００３、１２：３６－３９；リーボヴィッツら（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚｈ ｅｔ ａｌ．）Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）２０１６；９５：ｅ４８５８；ミカエルら（Ｍｉｃｈｅａｌ ｅｔ ａｌ．）Ｍｏｌ Ｖｉｓ ２００９；１５：２２６８－２２７８；クレメントら（Ｃｌｅｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｇｌａｕｃｏｍａ ２００９；１８：７３－７８；クムルクら（Ｃｕｍｕｒｃｕ ｅｔ ａｌ．）ＢＭＣ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２００６；６：６；ブライヒら（Ｂｌｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ（Ｖｉｅｎｎａ）２００２；１０９：１４９９－１５０４；リーら（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．）Ｃｕｒｒ Ｅｙｅ Ｒｅｓ ２０１７；１－６；ワンら（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２００４；１３７：４０１－４０６；ガナパシら（Ｇａｎａｐａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．）Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ２００９；５０：４４６０－４４７０参照）。薬理学的介入および食事介入を処方された場合でさえ、ＣＢＳＤＨ患者の大部分は最終的に眼合併症を呈示する。Ｈｃｙレベルの低下が、ＣＢＳＤＨ患者で水晶体脱臼を遅延させ、もしかすると予防することが示されている（全体が本願明細書に援用される、非特許文献６参照）。
ＣＢＳＤＨの最も一貫して存在し、最も早い顕在化のうちの１つは、水晶体偏位（水晶体脱臼）である（全体が本願明細書に援用される、ミュルビヒルら（Ｍｕｌｖｉｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．）Ｊ ＡＡＰＯＳ ２００１；５：３１１－３１５参照）。これは通常、２歳以降に起こり、未処置のピリドキシン非応答性患者のおおよそ５０％で６歳までに、未処置ピリドキシン応答性患者の５０％で１０歳までに存在する（全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１参照）。脱臼は部分的（亜脱臼）または完全であり得、下方にまたは鼻側に起こり得るが、通常は両側性である（共に全体が本願明細書に援用される、ミュルビヒルら（Ｍｕｌｖｉｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．）Ｊ ＡＡＰＯＳ ２００１；５：３１１－３１５；スウィーツァーら（Ｓｗｅｅｔｓｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１６；３７５：１８７９－１８９０参照）。
水晶体脱臼はしばしば、急速に進行する近視の期間に引き続いて、著しい乱視、単眼複視および低下した最高矯正視力につながり得る（全体が本願明細書に援用される、サディクら（Ｓａｄｉｑ ｅｔ ａｌ．）Ｓｅｍｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２０１３；２８：３１３－３２０参照）。全体として、近視（１ディオプトリー［Ｄ］超）は、ＣＢＳＤＨ患者のおおよそ８５％で罹患すると考えられ、非常に高い近視（５Ｄ超）は患者の５０～７６％で罹患する。虹彩振盪（眼球を動かした後の光彩の震え）は患者のおおよそ５６％で罹患し、球状水晶体（亜脱臼しやすい小さな球状の水晶体）は患者の５０％で罹患する（それぞれ全体が本願明細書に援用される、ヤップ エス（Ｙａｐ Ｓ．）シスタチオニンベータ合成酵素欠損によるホモシスチン尿症（Ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ ｄｕｅ ｔｏ ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ ｂｅｔａ－ｓｙｎｔｈａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）．Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ［定期オンライン］２００５；ミュルビヒルら（Ｍｕｌｖｉｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．）Ｊ ＡＡＰＯＳ ２００１；５：３１１－３１５参照）。ＣＢＳＤＨに関連付けられる追加の合併症には、白内障形成、慢性硝子体炎（硝子体液の炎症）および脈絡網膜炎症、急性および／または慢性閉塞隅角緑内障による瞳孔閉鎖、ならびに（小児では）弱視（ａｍｂｌｙｏｐｉａ）（弱視（ｌａｚｙ ｅｙｅ））が含まれる（全体が本願明細書に援用される、サディクら（Ｓａｄｉｑ ｅｔ ａｌ．）Ｓｅｍｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２０１３；２８：３１３－３２０参照）。
ＣＢＳＤＨを有する２４歳未満の２５人の患者での長期後ろ向き研究からの証拠は、ｔＨｃｙレベルを早い年齢から一貫して低下させている患者において、水晶体脱臼を予防する、または少なくとも有意に減少および遅延させることができることを示唆している（全体が本願明細書に援用される、非特許文献６参照）。早期のＨｃｙ低下処置はまた、悪化する近視を含む全体的な眼合併症の低下したリスクにも関連付けられた。裏付けとなる証拠は、３２人のＣＢＳＤＨ患者および２５人の同胞対照での症例対照研究から得られ、ここでは早期Ｈｃｙ低下処置が、晩年に処置されたまたは処置を完全に遵守しなかった患者と比較した眼合併症の有意な減少に関連付けられた（全体が本願明細書に援用される、エル・バシールら（Ｅｌ Ｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．）ＪＩＭＤ Ｒｅｐ ２０１５；２１：８９－９５参照）。
上昇したｔＨｃｙレベルを同様に特徴とする、コバラミンＣ欠損を有する２５人の患者の眼転帰の現在までの最大かつ最長の縦断的研究は、黄斑変性、視神経蒼白、眼振、斜視および血管変化が全て、患者の大部分に存在することを見出した。
ＣＢＳＤＨ患者および一般集団における多数の研究が、上昇したＨｃｙレベルと、近視および水晶体脱臼（それぞれ全体が本願明細書に援用される、ヤップ エス（Ｙａｐ Ｓ．）シスタチオニンベータ合成酵素欠損によるホモシスチン尿症（Ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ ｄｕｅ ｔｏ ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ ｂｅｔａ－ｓｙｎｔｈａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）．Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ［定期オンライン］２００５；マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１；マルティネス－グティエレスら（Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ ｅｔ ａｌ．）Ｉｎｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２０１１；３１：２２７－２３２；スリら（Ｓｕｒｉ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ ２０１４；３４７：３０５－３０９；ミュルビヒルら（Ｍｕｌｖｉｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．）Ｊ ＡＡＰＯＳ ２００１；５：３１１－３１５；リーバーマンら（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １９６６；６１：２５２－２５５；ハリソンら（Ｈａｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ １９９８；１０５：１８８６－１８９０；ラムセイら（Ｒａｍｓｅｙ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １９７２；７４：３７７－３８５；コーサーら（Ｃｏｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｇｅｎｅｔ ２０１７；３８：９１－９４参照）、虹彩振盪（全体が本願明細書に援用される、ミュルビヒルら（Ｍｕｌｖｉｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．）Ｊ ＡＡＰＯＳ ２００１；５：３１１－３１５参照）、網膜動脈硬化症（全体が本願明細書に援用される、ゴーバニハグジョら（Ｇｈｏｒｂａｎｉｈａｇｈｊｏ ｅｔ ａｌ．）Ｍｏｌ Ｖｉｓ ２００８；１４：１６９２－１６９７参照）、加齢黄斑変性（それぞれ全体が本願明細書に援用される、ジャヴァドザデら（Ｊａｖａｄｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．）Ｍｏｌ Ｖｉｓ ２０１０；１６：２５７８－２５８４；セドンら（Ｓｅｄｄｏｎ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２００６；１４１：２０１－２０３；コーラルら（Ｃｏｒａｌ ｅｔ ａｌ．）Ｅｙｅ（Ｌｏｎｄ）２００６；２０：２０３－２０７；アクサー－シーゲルら（Ａｘｅｒ－Ｓｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２００４；１３７：８４－８９参照）、加齢黄斑症（ＡＭＤ）（共に全体が本願明細書に援用される、ホイベルガーら（Ｈｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ２００２；７６：８９７－９０２；ファンら（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０１５；５：１０５８５参照）、白内障（共に全体が本願明細書に援用される、センら（Ｓｅｎ ｅｔ ａｌ．）Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２００８；２３：２５５－２５７；ヨウセフィら（Ｙｏｕｓｅｆｉ ｅｔ ａｌ．）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｌｅｔｔ ２０１３；２０：９３２－９４１参照）、糖尿病性網膜症（おそらく腎疾患に続発性）（共に全体が本願明細書に援用される、ルッカーら（Ｌｏｏｋｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ２００３；４６：７６６－７７２；プスパラジャら（Ｐｕｓｐａｒａｊａｈ ｅｔ ａｌ．）Ｆｒｏｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２０１６；７：２００参照）、ならびに網膜血管閉塞または非動脈炎性虚血性視神経症による斑状萎縮および視神経萎縮（それぞれ全体が本願明細書に援用される、ガースら（Ｇｅｒｔｈ ｅｔ ａｌ．）Ｊ ＡＡＰＯＳ ２００８；１２：５９１－５９６；スタンガーら（Ｓｔａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｌａｂ Ｍｅｄ ２００５；４３：１０２０－１０２５；ケーヒルら（Ｃａｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２００３；１３６：１１３６－１１５０；ミンニーティら（Ｍｉｎｎｉｔｉ ｅｔ ａｌ．）Ｅｕｒ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２０１４；２４：７３５－７４３参照）を含む種々の眼障害との間の関係を実証した（それぞれ全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１；非特許文献１３；ミュルビヒルら（Ｍｕｌｖｉｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．）Ｊ ＡＡＰＯＳ ２００１；５：３１１－３１５；ライトら（Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．）Ｅｙｅ（Ｌｏｎｄ）２００８；２２：９８９－９９３参照）。
６２９人のＣＢＳＤＨ患者の後ろ向き研究は、水晶体脱臼が通常、２歳以降に起こり、未処置のピリドキシン非応答性患者のおおよそ５０％で６歳までに、未処置ピリドキシン応答性患者の５０％で１０歳までに存在することを見出した（全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１参照）。上昇したｔＨｃｙレベルを同様に特徴とする、コバラミンＣ欠損を有する２５人の患者の眼転帰の現在までの最大かつ最長の縦断的研究は、黄斑変性、視神経蒼白、眼振、斜視および血管変化が全て、患者の大部分に存在することを見出した（全体が本願明細書に援用される、ブルックスら（Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ．２０１６年３月；１２３（３）：５７１－８２参照）。
ＣＢＳＤＨ患者および一般集団における多数の研究が、上昇したＨｃｙレベルと、近視および水晶体脱臼（それぞれ全体が本願明細書に援用される、ヤップ エス（Ｙａｐ Ｓ．）シスタチオニンベータ合成酵素欠損によるホモシスチン尿症（Ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ ｄｕｅ ｔｏ ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ ｂｅｔａ－ｓｙｎｔｈａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）．Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ［定期オンライン］２００５；マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１；マルティネス－グティエレスら（Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ ｅｔ ａｌ．）Ｉｎｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２０１１；３１：２２７－２３２；ミュルビヒルら（Ｍｕｌｖｉｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．）Ｊ ＡＡＰＯＳ ２００１；５：３１１－３１５；サディクら（Ｓａｄｉｑ ｅｔ ａｌ．）Ｓｅｍｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２０１３；２８：３１３－３２０；リーバーマンら（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １９６６；６１：２５２－２５５；ハリソンら（Ｈａｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ １９９８；１０５：１８８６－１８９０；ラムセイら（Ｒａｍｓｅｙ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １９７２；７４：３７７－３８５；コーサーら（Ｃｏｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｇｅｎｅｔ ２０１７；３８：９１－９４参照）、虹彩振盪（全体が本願明細書に援用される、ミュルビヒルら（Ｍｕｌｖｉｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．）Ｊ ＡＡＰＯＳ ２００１；５：３１１－３１５参照）、網膜動脈硬化症（全体が本願明細書に援用される、ゴーバニハグジョら（Ｇｈｏｒｂａｎｉｈａｇｈｊｏ ｅｔ ａｌ．）Ｍｏｌ Ｖｉｓ ２００８；１４：１６９２－１６９７参照）、加齢黄斑変性（それぞれ全体が本願明細書に援用される、ジャヴァドザデら（Ｊａｖａｄｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．）Ｍｏｌ Ｖｉｓ ２０１０；１６：２５７８－２５８４；セドンら（Ｓｅｄｄｏｎ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２００６；１４１：２０１－２０３；コーラルら（Ｃｏｒａｌ ｅｔ ａｌ．）Ｅｙｅ（Ｌｏｎｄ）２００６；２０：２０３－２０７；アクサー－シーゲルら（Ａｘｅｒ－Ｓｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２００４；１３７：８４－８９参照）、加齢黄斑症（ＡＭＤ）（共に全体が本願明細書に援用される、ホイベルガーら（Ｈｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ２００２；７６：８９７－９０２；ファンら（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０１５；５：１０５８５参照）、白内障（共に全体が本願明細書に援用される、センら（Ｓｅｎ ｅｔ ａｌ．）Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２００８；２３：２５５－２５７；ヨウセフィら（Ｙｏｕｓｅｆｉ ｅｔ ａｌ．）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｌｅｔｔ ２０１３；２０：９３２－９４１参照）、糖尿病性網膜症（おそらく腎疾患に続発性）（共に全体が本願明細書に援用される、ルッカーら（Ｌｏｏｋｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ２００３；４６：７６６－７７２；プスパラジャら（Ｐｕｓｐａｒａｊａｈ ｅｔ ａｌ．）Ｆｒｏｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２０１６；７：２００参照）、ならびに網膜血管閉塞または非動脈炎性虚血性視神経症による斑状萎縮および視神経萎縮（それぞれ全体が本願明細書に援用される、ガースら（Ｇｅｒｔｈ ｅｔ ａｌ．）Ｊ ＡＡＰＯＳ ２００８；１２：５９１－５９６；スタンガーら（Ｓｔａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｌａｂ Ｍｅｄ ２００５；４３：１０２０－１０２５；ケーヒルら（Ｃａｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２００３；１３６：１１３６－１１５０；ミンニーティら（Ｍｉｎｎｉｔｉ ｅｔ ａｌ．）Ｅｕｒ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２０１４；２４：７３５－７４３参照）を含む種々の眼障害との間の関係を実証した（それぞれ全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１；非特許文献１３；ミュルビヒルら（Ｍｕｌｖｉｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．）Ｊ ＡＡＰＯＳ ２００１；５：３１１－３１５；ライトら（Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．）Ｅｙｅ（Ｌｏｎｄ）２００８；２２：９８９－９９３参照）。
Ｈｃｙレベルと緑内障との間の関連を調査する研究は、一貫性のない結果を提供した。Ｈｃｙレベルと正常眼圧緑内障、偽落屑緑内障（ＰＥＸＧ）および原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）との間の正の関係を示すものもあったが、示さないものもあった（それぞれ全体が本願明細書に援用される、リーバーマンら（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １９６６；６１：２５２－２５５；タークら（Ｔｕｒｋｃｕ ｅｔ ａｌ．）Ｍｅｄｉｃｉｎａ（Ｋａｕｎａｓ）２０１３；４９：２１４－２１８；ヴェッサーニら（Ｖｅｓｓａｎｉ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２００３；１３６：４１－４６；リーボヴィッツら（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｃｈ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｇｌａｕｃｏｍａ ２００３；１２：３６－３９；リーボヴィッツら（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚｈ ｅｔ ａｌ．）男性および女性におけるホモシステインと眼圧との間の関係：集団ベース研究（Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ａｎｄ ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｉｎ ｍｅｎ ａｎｄ ｗｏｍｅｎ：Ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｓｔｕｄｙ）．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）２０１６；９５：ｅ４８５８；ミカエルら（Ｍｉｃｈｅａｌ ｅｔ ａｌ．）Ｍｏｌ Ｖｉｓ ２００９；１５：２２６８－２２７８；クレメントら（Ｃｌｅｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｇｌａｕｃｏｍａ ２００９；１８：７３－７８；クムルクら（Ｃｕｍｕｒｃｕ ｅｔ ａｌ．）ＢＭＣ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２００６；６：６；ブライヒら（Ｂｌｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ（Ｖｉｅｎｎａ）２００２；１０９：１４９９－１５０４；リーら（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．）Ｃｕｒｒ Ｅｙｅ Ｒｅｓ ２０１７；１－６；ワンら（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２００４；１３７：４０１－４０６参照）。しかしながら、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の喪失－緑内障を有する個体での共通の観察－が、ＣＢＳ遺伝子欠失によって引き起こされる内因的に上昇したＨｃｙレベルを有するマウスで実証され、ＣＢＳＤＨ患者における緑内障と上昇したｔＨｃｙレベルとの間のありそうな関連を示唆した（全体が本願明細書に援用される、ガナパシら（Ｇａｎａｐａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．）Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ２００９；５０：４４６０－４４７０参照）。
１．機序
眼の健康に対する上昇したＨｃｙレベルの効果を説明するいくつかの機序が提案されている（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１３参照）。上昇したｔＨｃｙの効果を説明する機序には、血管内皮機能障害、網膜神経節細胞のアポトーシス、細胞外マトリックスの変更、低下したリジル酸化酵素活性および酸化ストレス、ならびに水晶体混濁化および視神経損傷に寄与するように見えるＨｃｙの直接的な細胞傷害性効果および炎症促進性効果が含まれる。
潜在的な機序には、共に白内障形成に寄与する、カルシウムの細胞流入および増加した活性酸素種（ＲＯＳ）生成につながる、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体の活性化も含まれる。これらの変化は、Ｈｃｙの直接的な細胞傷害性効果と一緒に、内皮傷害を引き起こす可能性があり、これが血栓形成およびＲＧＣのアポトーシスを開始し、網膜症および緑内障につながる。上昇したＨｃｙレベルはまた、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＭＤＡ）のレベルを上昇させ、一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）活性を遮断し、それによって、一酸化窒素（ＮＯ）レベルを低下させることによって、血管収縮および視神経萎縮を引き起こすことも示されている。最後に、血管壁上へのホモシステイン化タンパク質の蓄積が、抗Ｈｃｙ抗体産生および炎症性応答を誘因し、食作用、酸化ストレス、ＲＧＣのアポトーシスおよび細胞外マトリックス（ＥＣＭ）変更につながり得る。まとめると、このような変化が脈管構造、水晶体タンパク質および視神経を損傷し、最終的に視覚機能障害を引き起こす。
ＣＢＳＤＨ患者では、水晶体脱臼が、小帯線維の変性変化、特にフィブリリン－１などのＣｙｓに富むマルチドメインＥＣＭタンパク質によって主に引き起こされると考えられている（それぞれ全体が本願明細書に援用される、サディクら（Ｓａｄｉｑ ｅｔ ａｌ．）Ｓｅｍｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２０１３；２８：３１３－３２０；フブマシェルら（Ｈｕｂｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１１；５０：５３２２－５３３２；フブマシェルら（Ｈｕｂｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００５；２８０：３４９４６－３４９５５；フブマシェルら（Ｈｕｂｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１０；２８５：１１８８－１１９８参照）。
健康な個体では、フィブリリン－１内の多数のドメイン内ジスルフィド結合の形成が、構造的完全性および機能に必須の正確なタンパク質折り畳みを可能にする。次いで、フィブリリン－１鎖は鎖内ジスルフィド結合を形成することができ、ミクロフィブリルとして知られる高分子量多タンパク質集合体の集合につながる（共に全体が本願明細書に援用される、キンゼイら（Ｋｉｎｓｅｙ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ ２００８；１２１：２６９６－２７０４；フブマシェルら（Ｈｕｂｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２００８；１０５：６５４８－６５５３参照）。
このプロセスは、フィブリリン－１とフィブロネクチンとの間の相互作用に高度に依存する（全体が本願明細書に援用される、フブマシェルら（Ｈｕｂｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１１；５０：５３２２－５３３２参照）。ミクロフィブリルは、皮膚、肺、血管／動脈、靭帯および眼に見られるものなどの弾性線維の形成において必須の工程であるトロポエラスチンの沈着のための足場を形成する（全体が本願明細書に援用される、フブマシェルら（Ｈｕｂｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１０；２８５：１１８８－１１９８参照）。フィブリリン－１の重要性は、結合組織機能障害が水晶体脱臼、器官脱出症、骨粗鬆症および関節過度可動性などの症状に関連付けられる、マルファン症候群－フィブリリン－１遺伝子の変異によって引き起こされる状態の患者によって例示される（共に全体が本願明細書に援用される、スクら（Ｓｕｋ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００４；２７９：５１２５８－５１２６５；コロド－ベローら（Ｃｏｌｌｏｄ－Ｂｅｒｏｕｄ ｅｔ ａｌ．）Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ ２００３；２２：１９９－２０８参照）。
インビトロ研究では、Ｈｃｙのフィブリリン－１への付加が、ジスルフィド結合形成を破壊し、今度はこれが異常なタンパク質折り畳み、タンパク質分解に対する増加した感受性ならびにＥＣＭおよび弾性線維の異常な形成につながることが示された（共に全体が本願明細書に援用される、フブマシェルら（Ｈｕｂｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１０；２８５：１１８８－１１９８；ホワイトマンら（Ｗｈｉｔｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．）Ａｎｔｉｏｘｉｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ ２００６；８：３３８－３４６参照）。Ｈｃｙのヒト皮膚線維芽細胞への付加も、最適以下でフィブリリン－１に結合したフィブロネクチンの還元型に関連付けられ、それによって、ミクロフィブリル形成を予防した（共に全体が本願明細書に援用される、フブマシェルら（Ｈｕｂｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１１；５０：５３２２－５３３２；フブマシェルら（Ｈｕｂｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１０；２８５：１１８８－１１９８参照）。
水晶体脱臼に加えて、ＣＢＳＤＨ患者における小帯線維の変性は、増加した水晶体湾曲、水晶体近視、乱視、網膜剥離、斜視、白内障および虹彩振盪につながり得る（全体が本願明細書に援用される、サディクら（Ｓａｄｉｑ ｅｔ ａｌ．）Ｓｅｍｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２０１３；２８：３１３－３２０参照）。未処置の場合、水晶体の前方脱臼が急性瞳孔閉鎖緑内障を引き起こし得る。極端な場合、完全な水晶体脱臼が、おそらく霧視に対する代償反応である、増加した眼軸長に関連付けられる（全体が本願明細書に援用される、ミュルビヒルら（Ｍｕｌｖｉｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．）Ｊ ＡＡＰＯＳ ２００１；５：３１１－３１５参照）。
国立ＮＢＳプログラムまたは臨床的呈示によって、臨床転帰に対するＨｃｙ低下療法の効果を調べるための後ろ向き研究が、１９７１年～１９９６年の間にアイルランドで検出された２５人のＣＢＳＤＨ症例で実施された（全体が本願明細書に援用される、非特許文献６参照）。症例の大部分（２４例／２５例）はピリドキシン非応答性であった。結果として、ほとんどの患者の処置は、Ｍｅｔを含まないＣｙｓ補充食と、必要に応じて、ビタミンＢ１２および葉酸補充物からなっていた。処置を、患者の６週齢前に開始し、処置が診断時に始まった異なる群および決して処置をしなかった１人の対照患者と比較した。平均フォローアップ期間は、６週齢前に処置した群で１４．３年（２．５～２３．４の範囲）、他の患者で１４．７年（１１．７～１８．８の範囲）であり、合計３６５．７患者処置年となった。ＮＢＳによって検出された２１人の患者のうち、１８人は処置中に合併症がないままであった。これらの個体のうち、１５人／１８人が２０：２０ビジョンを有し、３人／１８人が過去２年間にわたって近視が増加した。
マッドら（全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１参照）の所見と一貫して、遅くに診断された個体における水晶体脱臼は、およそ２歳で起こった。水晶体脱臼は、治療を良好に遵守した早期処置個体のいずれにおいても報告されなかった。「早期処置患者」のうちの３人（最高レベルのｆＨｃｙを有する者）は、水晶体脱臼を有さず近視悪化を有し、これはこの小患者群における比較的高いｆＨｃｙレベルのためである可能性が最も高かった。このことにより、進行性の近視が、患者の反対の主張にもかかわらず、食事遵守が不十分なことの、水晶体脱臼前の第１の徴候であり得ることを著者らが示唆することにつながった。これらの患者における近視悪化は、これらの患者の中立の臨床転帰と負の臨床転帰との間のバランスがどれほど薄弱であるかを強調している。遅くに検出された患者は全て水晶体偏位を発症した。このことは、処置が水晶体偏位を予防するのではなくその発生を遅延させることを示唆している。
生涯の中央血漿ｆＨｃｙレベルは、近視のない患者よりも近視のある患者で高かった（それぞれ、１８、１８および４８μｍｏｌ／Ｌ対１１μｍｏｌ／Ｌ）。処置が診断時に始まった群で合併症を発症した、ＮＢＳによって識別された３人の患者のうち、全員が食事を遵守していなかった。全体として、６人／２４人の患者が水晶体脱臼を有し；これらのうち、２人が早期診断を有したが、食事を遵守せず、４人が遅い診断を有し、決して処置されなかった１人を含んでいた。マッドら（全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５； ３７：１－３１参照）の所見と一貫して、遅くに診断された個体（すなわち、２歳より後に合併症を呈示する患者）における水晶体脱臼は、おおよそ２歳で起こった。研究が公開された時、治療を良く遵守している早期処置個体のいずれによっても水晶体脱臼は報告されなかった。
遵守患者は、ｆＨｃｙレベルを１２０μｍｏｌ／Ｌを大いに下回るｔＨｃｙ等価レベルに維持した。しかしながら、全ての患者が、公開時に２４歳未満であり、多くがまだ小児患者であった。タンパク質制限食の遵守は、青年期から成人期までに急速に減少することが示されている。上記の繊細なバランスは、これらの患者によって達成されたｔＨｃｙレベルの控えめな減少が、これらの患者が年を取るにつれて、症状の発生を予防するのではなく、これを遅延させ得ることを示唆している。
これらの結果（それぞれ全体が本願明細書に援用される、非特許文献６；マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１参照）は、３２のＣＢＳＤＨ症例および２５の同胞対照における、視覚障害を含む、転帰について報告している、カタールで実行された類似の症例対照研究からの結果（全体が本明細書に援用される、エル・バシールら（Ｅｌ Ｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．）ＪＩＭＤ Ｒｅｐ ２０１５；２１：８９－９５参照）によって支持された。対象の平均年齢は１１．２歳（０．６～２９の範囲）であり、５６％が男性であった。全体として、９症例／３２症例（２８％）が、ＮＢＳによって診断され、生後１か月で処置された。残りは１４月齢～２４０月齢の間で診断された。ｔＨｃｙレベルおよびＭｅｔレベルは、臨床的に診断された者と比較して、ＮＢＳを通して診断された者で有意に低かった。これはおそらく、人生の早い段階で食事および投薬を良く遵守したことに起因した。ＮＢＳによって識別された９症例のいずれも、遅くに診断された群の１８人（７８％）と比較して、研究が公開された時に視力の問題を有さなかった（群間でｐ＜０．００１）。しかしながら、上記の２５人の患者のアイルランドの研究と同様に、この研究の患者は０．６～２９歳の範囲であり、長期合併症はまだ分からない。
ヤップ（Ｙａｐ）およびノートン（Ｎａｕｇｈｔｅｎ）（全体が本願明細書に援用される、非特許文献６参照）のデータとマッドらによって作成されたカプランマイヤー曲線の比較により、水晶体脱臼および骨粗鬆症を有する処置遵守「早期処置」患者の割合は、未処置ＣＢＳＤＨ患者について予想されるものより有意に低いことが示された（ｐ≦０．００１）。
したがって、上昇したＨｃｙレベルは、ＣＢＳＤＨ患者および一般集団において、眼合併症、特に水晶体脱臼の強力な独立したリスクファクターであると考えられる（例えば、ヤップら（Ｙａｐ ｅｔ ａｌ．）およびマッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）に示される）。このことは、早期ＣＢＳＤＨ診断および処置、ならびに患者による処置遵守の必要性を強調している。
Ｂ．骨格合併症
ＣＢＳＤＨは、部分的には低い骨塩密度に起因し得る骨粗鬆症性骨折の増加したリスクに関連付けられる（それぞれ全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）およびウェバーら（Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ ２０１６；１１７：３５１－３５４参照）。
８年間にわたる１９人のＣＢＳＤＨ患者からのデータの後ろ向き診療録レビューは、低い骨塩密度（ＢＭＤ）が小児ＣＢＳＤＨ患者と成人ＣＢＳＤＨ患者の両方の間で共通していることを見出した（ウェバーら（Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．）参照）。この研究は、骨格成長にとって極めて重要な期間である小児期および青年期中の骨量の自然増加がＣＢＳＤＨでは欠損しており、ピーク骨量の実現に負に影響し得ることを示唆した。この研究はまた、正常範囲よりわずか５倍高い中等度に上昇したｔＨｃｙレベルを有する、どれほど食事を遵守した患者でさえ小児期に骨格臨床転帰不良で既に苦しんでいることを強調した。
マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）によると、ＣＢＳＤＨ患者の８０％が、３０歳より前に骨粗鬆症を発症する。その上、上昇したＨｃｙレベルが、ＣＢＳＤＨを有さない患者においてさえ、骨粗鬆症性骨折の増加したリスクに関連付けられる（それぞれ全体が本願明細書に援用される、佐藤ら（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．）Ｂｏｎｅ ２００５、３６：７２１－７２６；ヴァン・メールスら（ｖａｎ Ｍｅｕｒｓ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００４；３５０：２０３３－２０４１；マクリーンら（ＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００４；３５０：２０４２－２０４９参照）。
２００２年～２０１０年の間に臨床的ＤＸＡ骨密度測定を受けた１９人の対象（３．５～４９．２歳の年齢の９人の男性）からのデータの後ろ向き診療録レビューは、低いＢＭＤが小児ＣＢＳＤＨ患者と成人ＣＢＳＤＨ患者の両方の間で共通していることを見出した（全体が本願明細書に援用される、ウェバーら（Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ ２０１６；１１７：３５１－３５４参照）。最初のＤＸＡスキャンの時点で、平均腰椎（ＬＳ）ＢＭＤ Ｚスコアは－１．２±１．３であり、股関節ＢＭＤ Ｚスコアは－０．８９±０．４であり；共にそれぞれｐ＝０．００２および０．０２で０（一般集団の予想平均Ｚスコア）より有意に低かった。診断時のＬＳ ＢＭＤ Ｚスコアは２１歳未満の患者で－１．２６±１．４、成人で－１．０６±１．１であった。全体として、患者の３８％が年齢に対して低いＢＭＤを有していた（－２以下のＺスコアによって定義される）。ｔＨｃｙレベルとＭｅｔレベルの両方が、複数の線形回帰モデルにおいてＬＳ ＢＭＤ Ｚスコアと正に関連付けられた（全体が本願明細書に援用される、ウェバーら（Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ ２０１６；１１７：３５１－３５４参照）。これらの１９人の個体についての平均ｔＨｃｙレベルはわずか５９．２μｍｏｌ／Ｌであり、１９人の患者の大部分が小児であった。この研究は、骨格成長にとって極めて重要な期間である小児期および青年期中の骨量の自然増加がＣＢＳＤＨでは欠損しており、ピーク骨量の実現に負に影響し得ることを示唆している。この研究はまた、正常範囲よりわずか５倍高い中等度に上昇したｔＨｃｙレベルを有する、どれほど食事を遵守した患者でさえ小児期に骨格臨床転帰不良で既に苦しんでいることを強調している。
以前の研究は、高齢集団におけるＨｃｙレベルと骨折リスクとの間の明確な関係を実証した（それぞれ全体が本願明細書に援用される、佐藤ら（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．）Ｂｏｎｅ ２００５、３６：７２１－７２６；ヴァン・メールスら（ｖａｎ Ｍｅｕｒｓ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００４；３５０：２０３３－２０４１；マクリーンら（ＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００４；３５０：２０４２－２０４９参照）。５５歳以上の２４０６人の対象を含む、２つの前向き集団ベース研究からの結果は、骨折の年齢調整リスクおよび性別調整リスクが、ｔＨｃｙレベルの各１のＳＤ増加について３０％増加することを示した（全体が本願明細書に援用される、ヴァン・メールスら（ｖａｎ Ｍｅｕｒｓ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００４；３５０：２０３３－２０４１参照）。最高年齢別四分位数のホモシステインレベルは、骨折リスクの１．９倍の増加に関連付けられた。ホモシステインレベルと骨折リスクとの間の関連は、骨塩密度および骨折の他の潜在的なリスクファクターとは独立しているように見えた。上昇したホモシステインレベルは、骨折および心血管疾患についての確立されたリスクファクターと、大きさにおいて類似した一般集団の高齢男性および女性における骨粗鬆症性骨折の強力な独立したリスクファクターであった（全体が本願明細書に援用される、ヴァン・メールスら（ｖａｎ Ｍｅｕｒｓ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００４；３５０：２０３３－２０４１参照）。さらに、８２５人の男性および１１７４人の女性の米国の前向き研究（ＨＯＰＥ－２試行サブスタディ）は、最高四分位数の血清ｔＨｃｙレベルが、最低四分位数の血清ｔＨｃｙレベルと比較して、女性の間の股関節骨折の１．９倍増加したリスクおよび男性の間の４倍増加したリスクに関連付けられることを見出した（全体が本願明細書に援用される、サフカら（Ｓａｗｋａ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．２００７年１０月２２日；１６７（１９）：２１３６－９参照）。ｔＨｃｙレベルと骨折リスクとの間の関連は、ＢＭＤおよび骨折の他の潜在的なリスクファクターとは独立していた（それぞれ全体が本願明細書に援用される、ヴァン・メールスら（ｖａｎ Ｍｅｕｒｓ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００４；３５０：２０３３－２０４１；マクリーンら（ＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００４；３５０：２０４２－２０４９；サフカら（Ｓａｗｋａ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．２００７年１０月２２日；１６７（１９）：２１３６－９参照）。
これらの結果と一貫して、６５歳超の４３３人の脳卒中患者での研究は、大腿骨頸部骨折について１０００人年当たりの年齢調整発生率が、Ｈｃｙレベルの最低四分位数で２．８９から最高四分位数で２７．８７までほぼ線形に増加することを見出した（全体が本願明細書に援用される、佐藤ら（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．）Ｂｏｎｅ ２００５；３６：７２１－７２６参照）。まとめると、これらの結果は、上昇したＨｃｙレベルが、高齢男性および女性における骨粗鬆症性骨折の強力な独立したリスクファクターであることを示唆している。
骨格異常は、出生時には存在せず、乳児および非常に幼い小児では珍しい（全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１参照）。骨格併発の最初の徴候は、通常、外反膝および凹足であり、しばしば思春期近くに発症する、マルファン症候群の典型的な特徴である、長骨の伸長を伴う（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２参照）。とりわけ椎骨および長骨の、骨粗鬆症は、ＣＢＳＤＨ患者で一般的であり、脊柱側弯症／脊柱後弯症および／または脊椎陥没につながり得る（それぞれ全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１；ウェバーら（Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ ２０１６；１１７：３５１－３５４参照）。他の骨格顕在化には、突出した上歯および高い口蓋によって引き起こされるマルファン様人相特徴、ならびに漏斗胸または鳩胸などの前胸壁変形が含まれ得る（それぞれ全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２；スウィーツァーら（Ｓｗｅｅｔｓｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１６；３７５：１８７９－１８９０；ブレントンら（Ｂｒｅｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ Ｂｒ １９７２；５４：２７７－２９８参照）。マルファン症候群とＣＢＳＤＨとの間でのこれらの共有された骨格特徴のために、ＣＢＳＤＨ患者は時々マルファン患者として誤って特徴付けられる。
２５年にわたって追った２５人のアイルランド人ＣＢＳＤＨ患者における研究は、骨粗鬆症のリスクが、非遵守患者または診断が遅い患者と比較して、Ｈｃｙ低下処置を良く遵守した（食事、ビタミンおよび／またはベタイン）、新生児スクリーニングを通して識別された患者でかなり低いことを見出した（非特許文献６参照）。これらの結果の裏付けとなる証拠は、優れた長期代謝制御をしている５人のＣＢＳＤＨ患者における小さな韓国の研究から来た。この研究では、早期Ｈｃｙ低下療法を受けた患者が、遅く診断された患者よりも少ない骨格異常を有していた（全体が本願明細書に援用される、リムら（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．）Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ Ｉｎｔ ２０１３、２４：２５３５－２５３８参照）。最後に、ＣＢＳＤＨのマウスモデルを使用した研究では、ＣＢＳ ＥＴによる処置によるｔＨｃｙレベルの正常化が、骨粗鬆症予防に関連付けられた（全体が本願明細書に援用される、マジタンら（Ｍａｊｔａｎ ｅｔ ａｌ．）酵素置換はマウスホモシスチン尿症における新生仔死亡、肝臓損傷および骨粗鬆症を予防する（Ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｎｅｏｎａｔａｌ ｄｅａｔｈ，ｌｉｖｅｒ ｄａｍａｇｅ，ａｎｄ ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ）、ＦＡＳＥＢ Ｊ ２０１７参照）。
ＣＢＳＤＨ患者において低いＢＭＤおよび骨格脆弱性につながる正確な機序は完全には理解されていない（共に全体が本願明細書に援用される、ウェバーら（Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ ２０１６；１１７：３５１－３５４；リム ジェイエス（Ｌｉｍ ＪＳ）、リー ディーエイチ（Ｌｅｅ ＤＨ）．ＣＢＳ欠損によって引き起こされる十分に制御されたホモシスチン尿症を有する小児の骨塩密度および骨組成の変化（Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｂｏｎｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ａｎｄ ｂｏｄｙ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ｗｅｌｌ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ＣＢＳ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）．Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ Ｉｎｔ ２０１３；２４：２５３５－２５３８参照）。しかしながら、ＣＢＳＤＨ患者における結合組織障害の多くは、マルファン症候群で見られるもの、フィブリリン－１遺伝子の変異によって引き起こされ、長骨の伸長および骨粗鬆症型骨折を含む特徴を特徴とする結合組織障害に似ている（共に全体が本願明細書に援用される、フブマシェルら（Ｈｕｂｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１１；５０：５３２２－５３３２；フブマシェルら（Ｈｕｂｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１０；２８５：１１８８－１１９８参照）。上昇したＨｃｙレベルは、２つの別個の経路を介して骨脆弱性および骨折につながると考えられている（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１５参照）。第１は、フィブリリン集合障害を介して小児期および青年期の間に骨量の自然増加の減少をもたらす。第２の経路は、骨リモデリング障害につながり、コラーゲン架橋形成の減少を介して脆い骨をもたらす（共に全体が本願明細書に援用される、非特許文献１５；カンら（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９７３；５２：２５７１－２５７８参照）。まとめると、これらのデータは、骨格成長にとって極めて重要な期間である小児期および青年期中の骨量の自然増加がＣＢＳＤＨ患者では欠損していること、およびこのことがピーク骨量の実現に負に影響することを示唆している。
その上、高齢集団では、Ｈｃｙレベルと骨折のリスクとの間に強力な関係が存在する（それぞれ全体が本願明細書に援用される、佐藤ら（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．）Ｂｏｎｅ ２００５；３６：７２１－７２６；ヴァン・メールスら（ｖａｎ Ｍｅｕｒｓ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００４；３５０：２０３３－２０４１；マクリーンら（ＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００４；３５０：２０４２－２０４９参照）。５５歳以上の２４０６人の対象を含む、２つの国際的な前向き集団ベース研究からの結果は、最高年齢別四分位数のホモシステインレベルが、骨折リスクの１．９倍の増加に関連付けられることを示した（全体が本願明細書に援用される、ヴァン・メールスら（ｖａｎ Ｍｅｕｒｓ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００４；３５０：２０３３－２０４１参照）。上昇したホモシステインレベルは、骨折（低い骨塩密度、認知障害、最近の転倒）および心血管疾患についての確立されたリスクファクターと、大きさにおいて類似した一般集団の高齢男性および女性における骨粗鬆症性骨折の強力な独立したリスクファクターであった（全体が本願明細書に援用される、ヴァン・メールスら（ｖａｎ Ｍｅｕｒｓ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００４；３５０：２０３３－２０４１参照）。さらに、１９９９人の対象の米国の前向き研究（ＨＯＰＥ－２試行サブスタディ）は、最高四分位数の血清ｔＨｃｙレベルが、最低四分位数の血清ｔＨｃｙレベルと比較して、女性の間の大腿骨頸部骨折の１．９倍増加したリスクおよび男性の間の４倍増加したリスクに関連付けられることを見出した（全体が本願明細書に援用される、サフカら（Ｓａｗｋａ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．２００７年１０月２２日；１６７（１９）：２１３６－９参照）。ｔＨｃｙレベルと骨折リスクとの間の関連は、ＢＭＤおよび骨折の他の潜在的なリスクファクターとは独立していた（それぞれ全体が本願明細書に援用される、ヴァン・メールスら（ｖａｎ Ｍｅｕｒｓ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００４；３５０：２０３３－２０４１；マクリーンら（ＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００４；３５０：２０４２－２０４９；サフカら（Ｓａｗｋａ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．２００７年１０月２２日；１６７（１９）：２１３６－９参照）。これらの結果と一貫して、６５歳超の４３３人の脳卒中患者における研究は、大腿骨頸部骨折について１０００人年当たりの年齢調整発生率が、Ｈｃｙレベルの最低四分位数で２，８９から最高四分位数で２７．８７までほぼ線形に増加することを見出した（全体が本願明細書に援用される、佐藤ら（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．）Ｂｏｎｅ ２００５；３６：７２１－７２６参照）。まとめると、これらの結果は、上昇したＨｃｙレベルが、高齢男性および女性における骨粗鬆症性骨折の強力な独立したリスクファクターであることを示唆している。
ＣＢＳＤＨ患者において低いＢＭＤおよび骨格脆弱性につながる正確な機序は完全には理解されていない（共に全体が本願明細書に援用される、ウェバーら（Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ ２０１６；１１７：３５１－３５４；リム ジェイエス（Ｌｉｍ ＪＳ）、リー ディーエイチ（Ｌｅｅ ＤＨ）．ＣＢＳ欠損によって引き起こされる十分に制御されたホモシスチン尿症を有する小児の骨塩密度および骨組成の変化（Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｂｏｎｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ａｎｄ ｂｏｄｙ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ｗｅｌｌ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ＣＢＳ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）．Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ Ｉｎｔ ２０１３；２４：２５３５－２５３８参照）。しかしながら、ＣＢＳＤＨ患者における結合組織障害の多くは、マルファン症候群で見られるもの、フィブリリン－１遺伝子の変異によって引き起こされ、長骨の伸長および骨粗鬆症型骨折を含む特徴を特徴とする結合組織障害に似ている（それぞれ全体が本願明細書に援用される、ブレントンら（Ｂｒｅｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ Ｂｒ １９７２；５４：２７７－２９８）；フブマシェルら（Ｈｕｂｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１１；５０：５３２２－５３３２；フブマシェルら（Ｈｕｂｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１０；２８５：１１８８－１１９８参照）。
健康な個体では、フィブリリン－１が、コラーゲンおよびエラスチンポリマーと一緒に、集合して、骨形成、恒常性および修復のための構築上の足場であるＥＣＭを形成する（全体が本願明細書に援用される、オリビエリら（Ｏｌｉｖｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．）Ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｐａｉｒ ２０１０；３：２４参照）。研究は、上昇したｔＨｃｙレベルが、多量体化を妨げ、フィブリリン－１分解につながる、フィブリリン－１断片の構造修飾につながり得ることを示している（共に全体が本願明細書に援用される、フブマシェルら（Ｈｕｂｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００５；２８０：３４９４６－３４９５５；フブマシェルら（Ｈｕｂｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１０；２８５：１１８８－１１９８参照）。このプロセスは、フィブリリン－１多量体化に必要なフィブロネクチン－フィブリリン複合体の形成を阻むフィブロネクチンのホモシステイン化によってさらに損なわれる（全体が本願明細書に援用される、フブマシェルら（Ｈｕｂｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１１；５０：５３２２－５３３２参照）。このような所見は、上昇したＨｃｙレベルがＥＣＭ形成に対する有害な効果を有することを示唆している。
健康な個体では、フィブリリン集合体（すなわち、ミクロフィブリル）が、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ－ベータ）および骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の貯蔵および活性化を通して、骨石灰化において重要な役割を果たす（共に全体が本願明細書に援用される、ニスタラら（Ｎｉｓｔａｌａ ｅｔ ａｌ．）Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ２０１０；１１９２：２５３－２５６；ニスタラら（Ｎｉｓｔａｌａ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１０；２８５：３４１２６－３４１３３参照）。ＴＧＦベータおよびＢＭＰの活性化障害は、マルファン症候群とＣＢＳＤＨの両方で観察される骨格表現型に潜在的に寄与する可能性があり、軽度の型のＣＢＳＤＨで観察されるように、骨塩量を減少させるおそれもある（全体が本願明細書に援用される、ハーマンら（Ｈｅｒｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２００５；５１：２３４８－２３５３参照）。その上、Ｈｃｙが減少したコラーゲン架橋形成を通して骨強度を弱め得るインビボおよびインビトロの証拠がある（全体が本願明細書に援用される、カンら（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９７３；５２：２５７１－２５７８参照）。まとめると、これらのデータは、骨格成長にとって極めて重要な期間である小児期および青年期中の骨量の自然増加がＣＢＳＤＨ患者では欠損していること、およびこのことがピーク骨量の実現に負に影響し得ることを示唆している。
上昇したＨｃｙレベルは、骨沈着に対する効果に加えて、破骨細胞（ＯＣ）活性を増加させ、骨芽細胞（ＯＢ）活性を低下させることによって、骨リモデリング速度を増加させる（それぞれ全体が本願明細書に援用される、非特許文献１５；ハーマンら（Ｈｅｒｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２００５；５１：２３４８－２３５３；バセクら（Ｖａｃｅｋ ｅｔ ａｌ．）Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｌａｂ Ｍｅｄ ２０１３；５１：５７９－５９０；ヴィジャヤンら（Ｖｉｊａｙａｎ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ２０１７； ２３３：２４３－２５５参照）。ＯＢ活性とＯＣ活性との間の不均衡が、脆い骨および増加した骨折発生率につながり得る。ＯＢ活性のＨｃｙ媒介低下につながる機序は、減少した骨血流（減少したＮＯ利用可能性の結果として）（全体が本願明細書に援用される、ティアギら（Ｔｙａｇｉ ｅｔ ａｌ．）Ｖａｓｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｉｓｋ Ｍａｎａｇ ２０１１；７：３１－３５参照）および増加したＯＢアポトーシス速度（図２および表１４）（共に全体が本願明細書に援用される、非特許文献１５；キムら（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．）Ｂｏｎｅ ２００６；３９：５８２－５９０参照）を含むと考えられている。増強したＯＣ活性につながる機序は、増加したマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）活性を介してＯＣ分化とＯＣ活性の両方を増強する細胞内ＲＯＳの上昇したレベル（全体が本願明細書に援用される、バセクら（Ｖａｃｅｋ ｅｔ ａｌ．）Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｌａｂ Ｍｅｄ ２０１３；５１：５７９－５９０参照）およびＯＣアポトーシスの抑制（それぞれ全体が本願明細書に援用される、非特許文献１５；ハーマンら（Ｈｅｒｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２００５；５１：２３４８－２３５３；コーら（Ｋｏｈ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ２００６；２１：１００３－１０１１参照）を含むと考えられている。実際、高Ｈｃｙ食を与えられたＣＤ１マウスにおける近年の研究は、短期（７日）Ｈｃｙ投与が組織ミネラル密度（ＴＭＤ）の喪失および増加したＯＣ数に関連付けられ、長期Ｈｃｙ投与（３０日）がＯＣリプログラミング、アポトーシスおよび石灰化につながり、ＴＭＤを元に戻すが、組織生体力学特性を損なうことを示した（全体が本願明細書に援用される、ヴィジャヤンら（Ｖｉｊａｙａｎ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ２０１７；２３３：２４３－２５５参照）。
よって、上昇したＨｃｙレベルは、２つの別個の経路を介して骨脆弱性および骨折につながり得る（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１５参照）。第１は、ＥＣＭ形成障害ならびにフィブリリン－１関連ＴＧＦベータおよびＢＭＰの活性化抑制を介して、小児期および青年期中に骨量の自然増加の減少をもたらす。第２の経路は、増加したＯＣ活性および低下したＯＢ活性を介して、骨リモデリング障害につながり、脆い骨をもたらす。
上昇したＨｃｙレベルは、骨微小環境において増加した酸化ストレスに関連付けられる。増加したＲＯＳは骨芽細胞アポトーシスを誘導し、それによって、骨芽細胞発生を減少させる。この酸化ストレスの増加は、スーパーオキシドアニオンの生成を通してＮＯ利用可能性をさらに減少させ、これが骨血流および血管新生も減少させ得る。このプロセスによって作製されるＲＯＳは、単球融合によって破骨細胞発生を活性化し、ＢＭＤの喪失にさらに寄与し、骨粗鬆症につながる。
Ｍｅｔを制限しない標準的な齧歯類固形飼料で維持した、新生児ＣＢＳノックアウト（ＫＯ）マウスにおける近年の研究は、５か月間にわたって組換えＰＥＧ化ヒト切断型ＣＢＳ（ＰＥＧ－ＣＢＳ）を使用した、ＣＢＳ ＥＴの皮下投与が、これらの動物において骨塩密度の減少を予防し、また晩年に処置された動物でこれらの値を正常化し得ることを見出した（全体が本願明細書に援用される、マジタンら（Ｍａｊｔａｎ ｅｔ ａｌ．）酵素置換はマウスホモシスチン尿症における新生仔死亡、肝臓損傷および骨粗鬆症を予防する（Ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｎｅｏｎａｔａｌ ｄｅａｔｈ，ｌｉｖｅｒ ｄａｍａｇｅ，ａｎｄ ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ）．ＦＡＳＥＢ Ｊ ２０１７参照）。この研究では、ＫＯモデルとＣＢＳＤＨ患者の両方を特徴付ける体組成の変化が予防された。血漿と組織の両方で、ｔＨｃｙレベルおよびＣｙｓレベルが正常化され、Ｃｔｈレベルが上昇し、ＳＡＭ／ＳＡＨ比が改善した。
骨格転帰に対するＨｃｙ低下の効果の裏付けとなる証拠は、２５人のアイルランド人ＣＢＳＤＨ患者の２５年調査から得られる（全体が本願明細書に援用される、非特許文献６参照）。この研究では、骨粗鬆症（ＤＸＡではなく放射線検査によって診断される）が、ＮＢＳによって識別された３人の処置非遵守患者のうちの１人および診断が遅い（２歳の時）４人の患者のうちの１人に存在していた。早期処置（６週齢から）を遵守した１８人の患者のいずれも骨粗鬆症の徴候を示さなかった。
３．４年間にわたる代謝制御が良好な、全て若齢で診断された（ＮＢＳで３人および７歳時２人）５人のＣＢＳＤＨ患者（３人の少年および３人の少女）における小研究が韓国で実行された（全体が本願明細書に援用される、リムら（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．）Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ Ｉｎｔ ２０１３；２４：２５３５－２５３８参照）。診断時の平均血漿ｔＨｃｙレベルは３４．３±５２．６（１３～７８．６）μｍｏｌ／Ｌであった。血漿Ｍｅｔは７１６±１３４７．６（２４．３～１５６６）μｍｏｌ／Ｌであり、処置はピリドキシン、ベタインおよび葉酸を補充した低Ｍｅｔ食を備えていた。全ての患者について体組成測定値およびＢＭＤは韓国集団についての正常範囲内であり、経時的に骨格形態の有意な変化は観察されなかった。３人の患者（６０％）がＴ－Ｌ椎の軽度の脊柱側弯症を有し（コブ角７．３°、７．６°および１０．３°）、３人の患者で４回骨折が報告された。これらのうち、２例はスポーツ外傷によって引き起こされ、１例は交通事故によって引き起こされた。腰椎の軽度の圧迫骨折の２つの症例がＸ線撮影によって検出され、重度の背部痛の病歴が記録された。早期診断を受けた患者は、診断が遅い患者よりも少ない骨格異常を示した。しかしながら、この研究は、食事処置を遵守し、ごくわずか～中等度に上昇したｔＨｃｙレベルを有する、ＮＢＳによって早期診断を受けた患者でさえ、小児として骨格異常および複数の骨折を既に表示していることを示した。
まとめると、これらの所見は、ＣＢＳＤＨ患者における骨格転帰に対する早期Ｈｃｙ低下処置の有益な効果を示唆している。処置遵守患者では、ｔＨｃｙレベルが低下したが、正常化はされず、これらの患者ではより少ない骨格異常が存在したが、この大いに若い患者群で有意な負の臨床転帰（骨粗鬆症および骨折）が認められることに留意すべきである。
Ｃ．血管合併症
ＣＢＳＤＨと血管疾患との間の関係は、ホモ接合性ＣＢＳＤＨによる中等度から重度に上昇したＨｃｙレベルを有する患者における疫学的研究で、１９８５年に最初に実証された（全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１参照）。
血栓塞栓症は、ＣＢＳＤＨ患者における罹患率および早死にの主因である（それぞれ全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１；カラカら（Ｋａｒａｃａ ｅｔ ａｌ．）Ｇｅｎｅ ２０１４； ５３４：１９７－２０３；ヤップ エス（Ｙａｐ Ｓ．）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ２００３；２６：２５９－２６５参照）。未処置ＣＢＳＤＨを有する患者における血栓塞栓症イベントの全体的な比率は１年当たりおおよそ１０％であり（全体が本願明細書に援用される、カッタネオ エム（Ｃａｔｔａｎｅｏ Ｍ．）Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ ２００６；３２：７１６－７２３参照）、リスクは外科手術後および妊娠中または妊娠直後に増加する（共に全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１；ノーヴィら（Ｎｏｖｙ ｅｔ ａｌ．）Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２０１０；１０３：８７１－８７３参照）。血栓塞栓症はいずれの血管にも罹患し得るが、ＣＢＳＤＨ患者では、静脈血栓症（特にＣＳＶＴ）が動脈血栓症よりも一般的である（それぞれ全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１；カラカら（Ｋａｒａｃａ ｅｔ ａｌ．）Ｇｅｎｅ ２０１４；５３４：１９７－２０３；エスラミエら（Ｅｓｌａｍｉｙｅｈ ｅｔ ａｌ．）Ｉｒａｎ Ｊ Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１５；９：５３－５７；ソブールら（Ｓａｂｏｕｌ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１５；３０：１０７－１１２参照）。脳血管発作、特にＣＳＶＴは乳児で記載されているが（全体が本願明細書に援用される、マハレら（Ｍａｈａｌｅ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１７年４月～６月；１２（２）：２０６－２０７参照）、より典型的には若年成人で現れる（全体が本願明細書に援用される、ヤップら（Ｙａｐ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２００１；２１：２０８０－２０８５参照）。
血栓塞栓性イベントのリスクは、１６歳までにおおよそ２５％、２９歳までに５０％であった。１９９９年に、ハンキーらは、ＨＣＵの全３つの遺伝的原因（ＣＢＳＤＨ、ＭＴＨＦＲ欠損およびビタミンＢ１２欠損）が、３０歳までに全てのホモ接合体の半分に罹患する、早期心血管（ＣＶ）疾患の高いリスクに関連付けられることを報告した（全体が本願明細書に援用される、ハンキーら（Ｈａｎｋｅｙ ｅｔ ａｌ．）Ｌａｎｃｅｔ １９９９；３５４：４０７－４１３参照）。３つ全ての障害に共通するただ１つの生化学的変化は、上昇した血清Ｈｃｙレベルである（しばしば１００μｍｏｌ／Ｌ超）（全体が本願明細書に援用される、ファエら（Ｆａｅｈ ｅｔ ａｌ．）Ｓｗｉｓｓ Ｍｅｄ Ｗｋｌｙ ２００６；１３６：７４５－７５６参照）。いくつかの報告が、どのようにｔＨｃｙレベルを低下させる処置がＣＢＳＤＨ患者における罹患率の主因である血管イベントの発生率を有意に低下させるかを記載した（共に全体が本願明細書に援用される、ヤップら（Ｙａｐ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ２００１；２４：４３７－４４７；ウィルケン ディーイー（Ｗｉｌｃｋｅｎ ＤＥ）、ウィルケン ビー（Ｗｉｌｃｋｅｎ Ｂ）．ホモシスチン尿症における血管疾患の自然歴および処置の効果（Ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）．Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ １９９７；２０：２９５－３００参照）。それ以来、いくつかの他の研究が、ＣＢＳＤＨ患者における血管イベント、特に静脈血栓症の増加したリスクを実証した（それぞれ全体が本願明細書に援用される、カラカら（Ｋａｒａｃａ ｅｔ ａｌ．）Ｇｅｎｅ ２０１４；５３４：１９７－２０３；ケリーら（Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２００３；６０：２７５－２７９；ルサナら（Ｌｕｓｓａｎａ ｅｔ ａｌ．）Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ ２０１３；１３２：６８１－６８４；マグナーら（Ｍａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ２０１１；３４：３３－３７参照）。
上昇した血漿ｔＨｃｙレベルは、血管疾患のリスクファクターおよびＣＢＳＤＨを有する場合と有さない場合の両方の冠動脈疾患の患者における死亡率の強力な予測因子である（それぞれ全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１；カラカら（Ｋａｒａｃａ ｅｔ ａｌ．）Ｇｅｎｅ ２０１４；５３４：１９７－２０３；ケリーら（Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２００３；６０：２７５－２７９；ファエら（Ｆａｅｈ ｅｔ ａｌ．）Ｓｗｉｓｓ Ｍｅｄ Ｗｋｌｙ ２００６；１３６：７４５－７５６；ボウシェイら（Ｂｏｕｓｈｅｙ ｅｔ ａｌ．）ＪＡＭＡ １９９５；２７４：１０４９－１０５７；クラーク アールら（Ｃｌａｒｋｅ Ｒ ｅｔ ａｌ．）ＪＡＭＡ ２００２；２８８：２０１５－２０２２；ハンキーら（Ｈａｎｋｅｙ ｅｔ ａｌ．）Ｌａｎｃｅｔ １９９９；３５４：４０７－４１３；カーンら（Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ．）Ｓｔｒｏｋｅ ２００８；３９：２９４３－２９４９；グラハムら（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．）Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ Ａｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｊｅｃｔ．ＪＡＭＡ １９９７；２７７：１７７５－１７８１；クラークら（Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９９１；３２４：１１４９－１１５５；クラークら（Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．）Ｉｒ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ １９９２；１６１：６１－６５；ウッドワードら（Ｗｏｏｄｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．）Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ２００６；１７：１－５；レフサムら（Ｒｅｆｓｕｍ ｅｔ ａｌ．）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ １９９８；４９：３１－６２；ヨーら（Ｙｏｏ ｅｔ ａｌ．）Ｓｔｒｏｋｅ １９９８；２９：２４７８－２４８３；セルフーブら（Ｓｅｌｈｕｂ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９９５；３３２：２８６－２９１；ウォルドら（Ｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．）ＢＭＪ ２００２；３２５：１２０２；バウティスタら（Ｂａｕｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ ２００２；５５：８８２－８８７；ブラットストロームら（Ｂｒａｔｔｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．）Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １９９０；８１：５１－６０；ルサナら（Ｌｕｓｓａｎａ ｅｔ ａｌ．）Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ ２０１３；１３２：６８１－６８４；カサスら（Ｃａｓａｓ ｅｔ ａｌ．）Ｌａｎｃｅｔ ２００５；３６５：２２４－２３２；マッカリー ケーエス（ＭｃＣｕｌｌｙ ＫＳ．）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １９６９；５６：１１１－１２８；マグナーら（Ｍａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ２０１１；３４：３３－３７；ウィルケンら（Ｗｉｌｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９７６；５７：１０７９－１０８２；ナイガードら（Ｎｙｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９９７；３３７：２３０－２３６参照）。ｔＨｃｙレベルとＣＶリスクとの間の関係についての証拠があるが（全体が本願明細書に援用される、ボウシェイら（Ｂｏｕｓｈｅｙ ｅｔ ａｌ．）ＪＡＭＡ １９９５；２７４：１０４９－１０５７参照）、ｔＨｃｙと脳卒中／末梢動脈疾患との間の関係がかなり強力である（それぞれ全体が本願明細書に援用される、クラークら（Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．）ＪＡＭＡ ２００２；２８８：２０１５－２０２２；カーンら（Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ．）Ｓｔｒｏｋｅ ２００８；３９：２９４３－２９４９；ウォルドら（Ｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．）ＢＭＪ ２００２；３２５：１２０２；カサスら（Ｃａｓａｓ ｅｔ ａｌ．）Ｌａｎｃｅｔ ２００５；３６５：２２４－２３２；ブラットストロームら（Ｂｒａｔｔｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．）Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ １９８９；１９ 補遺１：３５－４４参照）。一般集団における大規模研究（ＮＯＲＶＩＴ、ＨＯＰＥ－２、ＶＩＴＡＴＯＰＳ）は、最初に、Ｈｃｙレベルの低下が主な血管イベントおよび再発性心血管疾患に対するわずかな効果しか有さないと結論付けたが、データのさらなる、より具体的な分析は、脳卒中に対するｔＨｃｙ低下の臨床的利益を明確に示した。
Ｈｃｙ低下が、軽度に上昇したｔＨｃｙレベルを有する一般集団で脳卒中リスクを低下させるというかなりの証拠がある（それぞれ全体が本願明細書に援用される、サポスニックら（Ｓａｐｏｓｎｉｋ ｅｔ ａｌ．）Ｓｔｒｏｋｅ ２００９；４０：１３６５－１３７２；ホーら（Ｈｕｏ ｅｔ ａｌ．）ＪＡＭＡ ２０１５；３１３：１３２５－１３３５；ロンら（Ｌｏｎｎ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００６；３５４：１５６７－１５７７；ハンキーら（Ｈａｎｋｅｙ ｅｔ ａｌ．）Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１２；１１：５１２－５２０；スペンス ジェイディー（Ｓｐｅｎｃｅ ＪＤ）、Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．２００７年９月；６（９）：８３０－８参照）。５５５２人の患者のＨＯＰＥ－２研究（全体が本願明細書に援用される、サポスニックら（Ｓａｐｏｓｎｉｋ ｅｔ ａｌ．）Ｓｔｒｏｋｅ ２００９；４０：１３６５－１３７２参照）では、ｔＨｃｙレベルのわずかな低下（プラセボに対し３ｍｍｏｌ／Ｌ）が脳卒中発生率の有意な減少につながり（２７％の相対的リスク低下、１．３％の絶対的リスク低下）、ｔＨｃｙレベルの小さな低下でさえ有益となり得ることを示唆している。この効果は、４．３％の絶対的リスク低下を有する上位四分位数のベースラインＨｃｙを有する患者で最も明白であった。Ｈｃｙ低下が軽度に上昇したｔＨｃｙを有し、ＣＢＳＤＨを有さない患者で全体的なＣＶ転帰に影響を及ぼすかどうかは不明確なままであるが（全体が本願明細書に援用される、マルチ－カルバハルら（Ｍａｒｔｉ－Ｃａｒｖａｊａｌ ｅｔ ａｌ．）Ｃｏｃｈｒａｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔ Ｒｅｖ ２０１５；１：ＣＤ００６６１２参照）、その血管利益はＣＢＳＤＨ患者で一貫して実証されている（それぞれ全体が本願明細書に援用される、非特許文献６；エスラミエら（Ｅｓｌａｍｉｙｅｈ ｅｔ ａｌ．）Ｉｒａｎ Ｊ Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１５；９：５３－５７；ソブールら（Ｓａｂｏｕｌ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１５；３０：１０７－１１２；ヤップら（Ｙａｐ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２００１；２１：２０８０－２０８５；ウッドら（Ｗｏｏｄｓ ｅｔ ａｌ．）ＢＭＪ Ｃａｓｅ Ｒｅｐ ２０１７；ウィルケンら（Ｗｉｌｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ １９９７；２０：２９５－３００；ヤップら（Ｙａｐ ｅｔ ａｌ．）Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ ２０００；２６：３３５－３４０；ルホイら（Ｒｕｈｏｙ ｅｔ ａｌ．）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１４；５０：１０８－１１１参照）。
１．機序
いくつかの研究により、上昇したＨｃｙレベルが、ＮＦ－κＢを介した炎症および免疫活性化（共に全体が本願明細書に援用される、ロドリゲス－アヤラら（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ａｙａｌａ ｅｔ ａｌ．）Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ２００５；１８０：３３３－３４０；ヴァン・グルデナーら（ｖａｎ Ｇｕｌｄｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｃｕｒｒ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ Ｒｅｐ ２００３；５：２６－３１参照）を含む、酸化ストレス関連機序を通して粥状動脈硬化または血栓症の発症に寄与することが示されている（それぞれ全体が本願明細書に援用される、ファベルザーニら（Ｆａｖｅｒｚａｎｉ ｅｔ ａｌ．）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ２０１７；ノヴァクら（Ｎｏｗａｋ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２０１７；３７：ｅ４１－ｅ５２；ヴァンジンら（Ｖａｎｚｉｎ ｅｔ ａｌ．）Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ ２０１１；１０４：１１２－１１７；ヴァンジンら（Ｖａｎｚｉｎ ｅｔ ａｌ．）Ｇｅｎｅ ２０１４；５３９：２７０－２７４；ヴァンジンら（Ｖａｎｚｉｎ ｅｔ ａｌ．）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ２０１５；３５：８９９－９１１参照）。血栓症につながる医学的損傷は、Ｈｃｙ媒介内皮機能障害（それぞれ全体が本願明細書に援用される、ジャンら（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２００５；２５：２５１５－２５２１；フセインら（Ｈｏｓｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００３；２７８：３０３１７－３０３２７；カイら（Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．）Ｂｌｏｏｄ ２０００；９６：２１４０－２１４８；チャンら（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００１；２７６：３５８６７－３５８７４；パパペトロプーロスら（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２００９；１０６：２１９７２－２１９７７；サボーら（Ｓｚａｂｏ ｅｔ ａｌ．）Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２０１１；１６４：８５３－８６５；チクら（Ｃｈｉｋｕ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００９；２８４：１１６０１－１１６１２；ワンら（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．）Ａｎｔｉｏｘｉｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ ２０１０；１２：１０６５－１０７７；サハら（Ｓａｈａ ｅｔ ａｌ．）ＦＡＳＥＢ Ｊ ２０１６；３０：４４１－４５６；エビングら（Ｅｂｂｉｎｇ ｅｔ ａｌ．）ＪＡＭＡ ２００８；３００：７９５－８０４；ボナアら（Ｂｏｎａａ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００６；３５４：１５７８－１５８８；マルチ－カルバハルら（Ｍａｒｔｉ－Ｃａｒｖａｊａｌ ｅｔ ａｌ．）Ｃｏｃｈｒａｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔ Ｒｅｖ ２０１５；１：ＣＤ００６６１２；セレルマジェルら（Ｃｅｌｅｒｍａｊｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ １９９３；２２：８５４－８５８；ルッバら（Ｒｕｂｂａ ｅｔ ａｌ．）Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ １９９０；３９：１１９１－１１９５参照）、増強された凝固経路（それぞれ全体が本願明細書に援用される、スペンス ジェイディー（Ｓｐｅｎｃｅ ＪＤ．）Ｉｎｔ Ｊ Ｓｔｒｏｋｅ．２０１６年１０月；１１（７）：７４４－７；フライアーら（Ｆｒｙｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ １９９３；１３：１３２７－１３３３；レンツら（Ｌｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９１；８８：１９０６－１９１４参照）および増加した血管拡張によって引き起こされると考えられている。このような血栓形成促進性機序は、マルファン患者で観察されるものに類似している（それぞれ全体が本願明細書に援用される、ケリーら（Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２００３；６０：２７５－２７９；トゥリパーティー ピー（Ｔｒｉｐａｔｈｉ Ｐ．）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｆｏｒｕｍ Ｊ ２０１６；６：１３；ヴァン・グルデナーら（ｖａｎ Ｇｕｌｄｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｃｕｒｒ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ Ｒｅｐ ２００３；５：２６－３１；ハッカムら（Ｈａｃｋａｍ ｅｔ ａｌ．）ＪＡＭＡ ２００３；２９０：９３２－９４０；バウムバッハら（Ｂａｕｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．）Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ２００２；９１：９３１－９３７；エヴァンジェリスティら（Ｅｖａｎｇｅｌｉｓｔｉ ｅｔ ａｌ．）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ ２００９；１３４：２５１－２５４；デ ヴァークら（ｄｅ Ｖａｌｋ ｅｔ ａｌ．）Ｓｔｒｏｋｅ １９９６；２７：１１３４－１１３６参照）。
２７の研究（４０００人超の患者）からのデータのメタアナリシスに由来するｔＨｃｙレベルとＣＶリスクとの間の因果関係は、ＣＶ、脳血管および末梢血管の粥状動脈硬化の等級付けリスクを示し、結果としてＨｃｙの５μＭの上昇が女性に８０％のリスク増加、男性に６０％のリスク増加を付与した（全体が本願明細書に援用される、ボウシェイら（Ｂｏｕｓｈｅｙ ｅｔ ａｌ．）ＪＡＭＡ １９９５；２７４：１０４９－１０５７参照）。５０７３件の虚血性心疾患（ＩＨＤ）イベントおよび１１１３件の脳卒中に関与する３０の前向きまたは後ろ向き研究からのデータのメタアナリシスは、通常より２５％低い（回帰希釈バイアスについて補正）Ｈｃｙレベル（おおよそ３μｍｏｌ／Ｌ）が、１１％（オッズ比（ＯＲ）、０．８９；９５％ＣＩ、０．８３～０．９６）低いＩＨＤリスクおよび１９％（ＯＲ、０．８１；９５％ＣＩ、０．６９～０．９５）低い脳卒中リスクに関連付けられることを見出した（全体が本願明細書に援用される、クラーク アールら（Ｃｌａｒｋｅ Ｒ，ｅｔ ａｌ．）ＪＡＭＡ ２００２；２８８：２０１５－２０２２参照）。
既存の血管疾患を有するおよび有さない患者における研究は、１人／２１人のＭＩを有する対象（５％）、１４人／３７人の大動脈腸骨動脈疾患を有する対象（３８％）および１７人／５３人の脳血管疾患を有する対象（３２％）におけるＭｅｔ負荷後の、血漿Ｈｃｙの上昇（同等の健康な対照となる対象の最高値を超える）を実証した。このことは、Ｈｃｙレベルと末梢動脈疾患（ＰＡＤ）および脳卒中との間の関連が、ＨｃｙレベルとＭＩとの間の関連よりもかなり大きいことを示唆している（全体が本願明細書に援用される、ブラットストロームら（Ｂｒａｔｔｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．）Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ １９８９；１９ 補遺１：３５－４４参照）。Ｈｃｙレベルと脳卒中との間の独立した等級付けの関連は、同じコミュニティの４５７人の脳卒中患者および１７９人の対照となる対象の英国コホートの間で実行された前向き研究で記載された（カーンら（Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ．）Ｓｔｒｏｋｅ ２００８；３９：２９４３－２９４９参照）。小血管病（ＳＶＤ）患者で最高Ｈｃｙレベルが見られた（年齢、性別、血管リスクファクター、ビタミンレベルおよび腎機能について調整後、脳卒中を有さない対照となる対象の１１．８μｍｏｌ／Ｌに対して１６．２μｍｏｌ／Ｌ、ｐ＜０．００１）。ＳＶＤ症例内では、集密的白質病変を有するラクナ梗塞を有する個体で最高Ｈｃｙレベルが観察された。その上、Ｈｃｙレベルと白質病変の重症度との間に相関があった（ｒ＝－０．２２５；ｐ＜０．００１）。
これらの所見は、Ｈｃｙ代謝を調節するＭＴＨＦＲ多型と脳卒中リスクとの間の遺伝的関連を実証するメンデル無作為化研究によってさらに支持された（全体が本願明細書に援用される、カサスら（Ｃａｓａｓ ｅｔ ａｌ．）Ｌａｎｃｅｔ ２００５；３６５：２２４－２３２参照）。脳卒中リスクにおけるＨｃｙレベルとＭＴＨＦＲ ＴＴおよびＣＣ多型との間の関連に関する全ての関連する研究についての文献検索は、心血管疾患（ＣＶＤ）を有さない１５６３５人の個体を含む１１１の研究を識別した。ＴＴホモ接合体とＣＣホモ接合体との間のＨｃｙレベルの加重平均差は１．９３μｍｏｌ／Ｌ（９５％ＣＩ １．３８～２．４７）であった。血漿Ｈｃｙレベルの５μｍｏｌ／Ｌの上昇が１．５９（１．２９～１．９６）の脳卒中のＯＲに対応する、前向き研究の以前のメタアナリシスからの結果に基づいて、ＴＴ遺伝子型を有する健康な個体におけるＨｃｙレベルの１．９３μｏｌ／Ｌの上昇は、１．２０（１．１０～１．３１）の脳卒中の予想ＯＲをもたらすであろう（全体が本願明細書に援用される、ウォルドら（Ｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．）ＢＭＪ ２００２；３２５：１２０２参照）。この結果と一貫して、カーンら（Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ．）は、年齢群、民族性または地理的位置にかかわりなく、ＣＣホモ接合体に対するＴＴホモ接合体の脳卒中の１．２６（１．１４～１．４０）ＯＲを報告した（ｐ＝０．２９）。まとめると、これらの結果は、一般集団における脳卒中発病における上昇したＨｃｙレベルの因果的役割を示唆した。
一般集団で実行されたものよりはるかに小さい研究で血管疾患が調査されたので、ヘテロ接合性ＣＢＳＤＨを有する患者に典型的な血清Ｈｃｙにおける中等度の上昇が。マッドらによると、ヘテロ接合性ＣＢＳＤＨにより軽度に上昇したｔＨｃｙレベルを有する患者（５０歳までに５％未満）における血管イベントのリスクは、一般集団におけるリスクと同様である（全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８１；３３：８８３－８９３参照）。これと一貫して、ホモ接合性およびヘテロ接合性ＣＢＳＤＨを有する個体における超音波研究は、４歳という若さのホモ接合性小児の全身動脈における内皮機能障害を見出したが、ヘテロ接合性成人では、内皮機能は大部分が未罹患であった（全体が本願明細書に援用される、セレルマジェルら（Ｃｅｌｅｒｍａｊｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ １９９３；２２：８５４－８５８参照）。
類似の研究がホモ接合体とヘテロ接合体の両方における早期動脈疾患の徴候を実証したが、ホモ接合性障害を有する個体は、はるかに若い年齢（４５歳に対して１９歳）で徴候を発症し、疾患重症度がかなり高かった（全体が本願明細書に援用される、ルッバら（Ｒｕｂｂａ ｅｔ ａｌ．）Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ １９９０；３９：１１９１－１１９５参照）。
全体として、ＣＢＳＤＨ患者における観察は、血管リスクがＨｃｙレベルと共に増加するという以前の研究のものと一貫していた（それぞれ全体が本願明細書に援用される、ボウシェイら（Ｂｏｕｓｈｅｙ ｅｔ ａｌ．）ＪＡＭＡ １９９５；２７４：１０４９－１０５７；クラークら（Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．）ＪＡＭＡ ２００２；２８８：２０１５－２０２２；カーンら（Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ．）Ｓｔｒｏｋｅ ２００８；３９：２９４３－２９４９参照）。
これらの結果は、上昇したＨｃｙレベルがＣＶ疾患のリスクファクターであることを示唆している。加えて、Ｈｃｙレベルの低下が、一般集団およびＣＢＳＤＨ患者において脳卒中のリスクを有意に低下させることが示された。
研究により、ＣＢＳＤＨによって引き起こされる上昇したＨｃｙレベルが、様々な機序を介して粥状動脈硬化および／または血栓症の発症に潜在的に寄与し得ることが示された。これらには、酸化ストレスのならびにＮＦ－κＢ（活性化Ｂ細胞の核内因子カッパ軽鎖エンハンサー）、炎症促進性および他の損傷関連遺伝子を調節する転写因子の活性化などのその下流効果の誘導などの分子イベントが含まれる。内皮機能障害または動脈スティフネスにつながるものなどの血管壁の生理化学的特性をモジュレートする様々なＨｃｙ媒介効果が、高血圧、血栓症または他の血管異常の発症に寄与し得る。最後に、Ｈｃｙによる凝固経路、血栓につながるより直接的なルートの直接的誘導の証拠がある（それぞれ全体が本願明細書に援用される、ファベルザーニら（Ｆａｖｅｒｚａｎｉ ｅｔ ａｌ．）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ２０１７；ヘインズワースら（Ｈａｉｎｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２０１６；１８６２：１００８－１０１７；ガングリーら（Ｇａｎｇｕｌｙ ｅｔ ａｌ．）Ｎｕｔｒ Ｊ ２０１５；１４：６；トゥリパーティー ピー（Ｔｒｉｐａｔｈｉ Ｐ．）心血管疾患におけるホモシステインの分子および生化学的側面（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｉｎ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ）．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｆｏｒｕｍ Ｊ ２０１６；６：１３；フライアーら（Ｆｒｙｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ １９９３；１３：１３２７－１３３３参照）。粥状動脈硬化の分子および生化学的機序の簡潔な説明の後、以下の小節は、ＣＢＳＤＨを有する個体を含む、上昇したｔＨｃｙレベルを有する個体において血管疾患につながる潜在的な機序を概説する。
２．粥状動脈硬化
血栓症および結果として血管閉塞につながる最も良く研究されている状態の中に、冠動脈、脳および末梢循環に罹患する進行性の炎症性疾患である粥状動脈硬化がある（全体が本願明細書に援用される、リビーら（Ｌｉｂｂｙ ｅｔ ａｌ．）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００５；１１１：３４８１－３４８８参照）。その初期段階では、血管傷害が内皮細胞（ＥＣ）活性化、内膜への単球動員およびマクロファージ活性化につながる。単球由来、脂質搭載マクロファージ（泡沫細胞）およびＴリンパ球を備える炎症性粥状動脈硬化病変（脂肪線条）が形成される。進行性の脂質蓄積により、線維皮膜によって囲まれた脂質コアが形成される。後期の間に、活性化マクロファージは、線維皮膜を弱める酵素を分泌し、プラーク破綻、出血または血栓症および虚血発作／急性冠動脈症候群につながる。プラーク破綻は、組織因子を動脈内腔内の血液に曝露し、凝固第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子と複合体を形成することを可能にする。このプロセスは凝固カスケードを開始し、血栓形成につながる。崩壊したプラークは壁在血栓症または閉塞性血栓症につながり、それぞれ部分閉塞または完全閉塞を引き起こし得る。壁在血栓症は不安定狭心症などの虚血性症状を引き起こし、閉塞性血栓症はＭＩおよび脳卒中などの急性冠動脈イベントにつながる。サイトカインは、粥状動脈硬化の全ての段階に関与しており、その発病に対する深い影響を有する（全体が本願明細書に援用される、ラムジら（Ｒａｍｊｉ ｅｔ ａｌ．）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ ２０１５；２６：６７３－６８５参照）。粥状動脈硬化に続発性であることに加えて、血栓症はまた、例えば、心房細動の結果として、または凝固カスケードの直接的活性化によって、プラーク形成の非存在下で活性化され得る。
３．酸化ストレス
上昇したＨｃｙレベルを有する患者における研究により、様々な組織における脂質、タンパク質およびＤＮＡ酸化損傷を反映する変更されたバイオマーカーによって証明されるように、処置患者およびとりわけ未処置患者が酸化ストレスに感受性であることが示された（それぞれ全体が本願明細書に援用される、ヴァンジンら（Ｖａｎｚｉｎ ｅｔ ａｌ．）Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ ２０１１；１０４：１１２－１１７；ヴァンジンら（Ｖａｎｚｉｎ ｅｔ ａｌ．）Ｇｅｎｅ ２０１４；５３９：２７０－２７４；ヴァンジンら（Ｖａｎｚｉｎ ｅｔ ａｌ．）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ２０１５；３５：８９９－９１１参照）。酸化還元恒常性の不均衡として定義される酸化ストレスは、低密度リポタンパク質の酸化修飾、内皮活性化および血管炎症応答の開始が関係している、粥状動脈硬化およびその関連血栓症のような血管病理学において重要な役割を果たす（全体が本願明細書に援用される、ノヴァクら（Ｎｏｗａｋ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２０１７；３７：ｅ４１－ｅ５２参照）。酸化ストレスは、上昇したＲＯＳ（例えば、スーパーオキシド（Ｏ２－）およびヒドロキシル（ＨＯ－）ラジカルならびに過酸化水素（Ｈ２Ｏ２））レベルおよび／または低下した組織抗酸化剤（例えば、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼ）レベルによって引き起こされ得る（共に全体が本願明細書に援用される、ファベルザーニら（Ｆａｖｅｒｚａｎｉ ｅｔ ａｌ．）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ２０１７；ノヴァクら（Ｎｏｗａｋ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２０１７；３７：ｅ４１－ｅ５２参照）。健康な個体では、ＲＯＳが正常な酸化的代謝の副産物として生成される。しかしながら、加えて、ＲＯＳ生成は、タバコの煙、アルコール消費、高コレステロール血症、高血圧、糖尿病および上昇したＨｃｙレベルのようなＣＶリスクファクターによって誘因される。
分子レベルでは、一部が以前論じられた、Ｈｃｙが増加した酸化ストレスを引き起こし得る多数の方法がある。例えば、血管壁における免疫原性ホモシステイン化タンパク質の蓄積は、活性化食細胞による炎症、および結果としてＲＯＳ（Ｏ２－）生成を促進し得る。別の潜在的な機序は、ＲＯＳ生成につながるシグナル伝達経路を誘因する、ＮＭＤＡ受容体のＨｃｙ誘導活性化である。心臓微小血管ＥＣでは、Ｈｃｙが、とりわけ活性化細胞で、最高レベルのＯ２－を生成する細胞表面酵素であるＮＡＤＰＨ酸化酵素の上昇したレベルを誘導した。近年の研究（全体が本願明細書に援用される、チェンら（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．）Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１７年７月３１日；７（１）：６９３２参照）は、虚血性ラット脳において、Ｈｃｙが増加したＲＯＳ生成の予想される結果で、ミトコンドリア機能障害を誘導することを示唆した。Ｈｃｙはまた、有益な血管拡張剤ＮＯのバイオアベイラビリティを低下させると考えられている。Ｏ２－はＮＯと反応して反応性窒素種ペルオキシナイトライトを与え、実際、ペルオキシナイトライト誘導タンパク質損傷の指標であるチロシンニトロ化のＨｃｙ誘導増加も報告されている（全体が本願明細書に援用される、ティアギら（Ｔｙａｇｉ ｅｔ ａｌ．）Ｖａｓｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｉｓｋ Ｍａｎａｇ ２０１１；７：３１－３５参照）。より大まかには、Ｈｃｙに関与するチオール－チオール相互作用が、細胞酸化還元状態を攪乱させ、例えば、還元型グルタチオンの利用可能性を潜在的に減少させ、さらにはタンパク質集合および折り畳みを損なうと予想される。
処置の前後のＣＢＳＤＨ患者の研究では、ピリドキシン、葉酸、ベタインおよびビタミンＢ１２補充物による処置が、患者の脂質酸化損傷を減弱したが、共に組織抗酸化能力の指標であるスルフヒドリル含有量も全抗酸化状態も変化させなかった。それにもかかわらず、スルフヒドリル基含有量とＨｃｙレベルとの間の有意な負の相関、および脂質過酸化生成物マロンジアルデヒドのレベルとＨｃｙのレベルとの間の正の相関があった。このことは、ＣＢＳＤＨで観察された酸化損傷におけるＨｃｙの潜在的な機構的役割を示唆した（全体が本願明細書に援用される、ヴァンジンら（Ｖａｎｚｉｎ ｅｔ ａｌ．）Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ ２０１１；１０４：１１２－１１７参照）。変更された脂質プロファイル、特に低下した高密度リポタンパク質のレベルおよび炎症促進性脂質種の富化が、未処置ＣＢＳＤＨ患者および処置ＣＢＳＤＨ患者の血漿で観察された（全体が本願明細書に援用される、ヴァンジンら（Ｖａｎｚｉｎ ｅｔ ａｌ．）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ２０１５；３５：８９９－９１１参照）。別の研究では、健康な個体よりもＣＢＳＤＨ患者で有意なより多くのＤＮＡ損傷が報告された（全体が本願明細書に援用される、ヴァンジンら（Ｖａｎｚｉｎ ｅｔ ａｌ．）Ｇｅｎｅ ２０１４；５３９：２７０－２７４参照）。まとめると、これらの所見は、酸化ストレスを上昇したＨｃｙレベルに関連付けられる血管損傷の発病に関係付けている。Ｍｅｔレベルと任意の酸化ストレス関連パラメーターとの間に相関は見られず、Ｍｅｔおよびその誘導体がＣＢＳＤＨにおける酸化損傷にほとんど寄与しないことを示唆している（全体が本願明細書に援用される、ヴァンジンら（Ｖａｎｚｉｎ ｅｔ ａｌ．）Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ ２０１１；１０４：１１２－１１７参照）。
大量の他の分子効果の中で、酸化ストレスは、粥状動脈硬化および血栓症の開始および進行に関与することが知られている、サイトカインなどの炎症促進性遺伝子の発現を調節する転写因子の群であるＮＦ－κＢの活性化に関連付けられている（全体が本願明細書に援用される、ロドリゲス－アヤラら（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ａｙａｌａ ｅｔ ａｌ．）Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ２００５；１８０：３３３－３４０参照）。インビトロ研究により、ＨｃｙによるＥＣの処置がＲＯＳ生成を介してＮＦ－κβを活性化することが示された（全体が本願明細書に援用される、ヴァン・グルデナーら（ｖａｎ Ｇｕｌｄｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｃｕｒｒ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ Ｒｅｐ ２００３；５：２６－３１参照）。遺伝子発現をモジュレートすることに加えて、酸化ストレスによる細胞高分子の化学修飾は、節の残りの部分で論じられるように、脈管構造の構造および機能に直接影響し、他の局所または全身効果を有し得る。
４．血管壁の変化
内皮機能障害は、通例、血管収縮性と弛緩をモジュレートする内皮関連因子の間の不均衡として定義される。これらの因子の中でも、ＮＯまたは「内皮由来弛緩因子」が最も周知であり、硫化水素（Ｈ２Ｓ）が近年記載されている別のものである（全体が本願明細書に援用される、ジャンら（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２００５；２５：２５１５－２５２１参照）。いくつかのインビトロ研究が、非常に高レベルのＨｃｙを使用するが、内皮機能に対するＨｃｙの効果を調査した（それぞれ全体が本願明細書に援用される、ジャンら（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２００５；２５：２５１５－２５２１；フセインら（Ｈｏｓｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００３；２７８：３０３１７－３０３２７；カイら（Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．）Ｂｌｏｏｄ ２０００；９６：２１４０－２１４８；チャンら（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００１；２７６：３５８６７－３５８７４参照）。１つのこのような研究が、Ｈｃｙで処置したヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）における折り畳まれていないタンパク質応答およびプログラム細胞死を報告したが、Ｈｃｙ濃度はＨｃｙレベルが重度に上昇した患者で観察されたものより数倍高かった（全体が本願明細書に援用される、全体が本明細書に援用される、チャンら（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００１； ２７６：３５８６７－３５８７４参照）。他の報告では、Ｃｔｈ代謝に関与する酵素であるＣｔｈガンマリアーゼ（ＣＧＬ）が、Ｈｃｙレベルが上昇した患者で過剰なＨ２Ｓを作製した（それぞれ全体が本願明細書に援用される、パパペトロプーロスら（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２００９；１０６：２１９７２－２１９７７；サボー シーら（Ｓｚａｂｏ Ｃ ｅｔ ａｌ．）Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２０１１；１６４：８５３－８６５；チクら（Ｃｈｉｋｕ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００９；２８４：１１６０１－１１６１２参照）。上昇したＨ２Ｓレベルが側副血管成長、毛細血管密度および局所的組織血流を有意に増加させることが報告されたので、この観察は重要であった（全体が本願明細書に援用される、ワンら（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．）Ａｎｔｉｏｘｉｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ ２０１０；１２：１０６５－１０７７参照）。しかしながら、高いＨｃｙレベル（０．００２～２ｍＭ）は、インビトロでＥＣ増殖にもホスホ－ｅＮＯＳレベルにも有意に影響を及ぼさなかった（全体が本願明細書に援用される、サハら（Ｓａｈａ ｅｔ ａｌ．）シスタチオニンベータ合成酵素はタンパク質Ｓ－スルフヒドリル化を介して内皮機能を調節する（Ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ ｂｅｔａ－ｓｙｎｔｈａｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｖｉａ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ－ｓｕｌｆｈｙｄｒａｔｉｏｎ）．ＦＡＳＥＢ Ｊ ２０１６；３０：４４１－４５６参照）。全体として、インビトロで検査したＨｃｙレベルが高いために、ＨｃｙがインビボでＥＣに直接影響を及ぼすかどうかはまだ明らかではないが、これらの結果は内皮機能障害におけるＨｃｙの役割の可能性を示唆している。
近年の薬理学的および遺伝的研究で、ＥＣにおけるＣＢＳ機能の喪失が、細胞ＲＯＳレベルの付随的増加と共に細胞Ｈ２Ｓの５０％減少およびグルタチオンの４００％の減少に関連付けられた（全体が本願明細書に援用される、サハら（Ｓａｈａ ｅｔ ａｌ．）ＦＡＳＥＢ Ｊ ２０１６；３０：４４１－４５６参照）。ＥＣにおけるＣＢＳのサイレンシングは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する表現型応答およびシグナル伝達応答を損ない、この効果は、血管内皮増殖因子受容体－２（ＶＥＧＦＲ－２）およびニューロピリン－１（ＮＲＰ－１）、血管新生などの内皮機能を調節する主な受容体の転写減少によって増悪した。ＶＥＧＦＲ－２およびＮＲＰ－１の転写下方調節は、Ｈ２Ｓのスルフヒドリル化標的である転写因子特異性タンパク質１（Ｓｐ１）の減少した安定性によって媒介された。ＣＢＳサイレンシングＥＣにおけるグルタチオンではなくＨ２Ｓの補給は、Ｓｐ１レベルおよびＶＥＧＦＲ－２プロモーターへのＳｐ１結合を回復すると同時に、ＶＥＧＦＲ－２およびＮＲＰ－１発現ならびにＶＥＧＦ依存性細胞増殖および移動を増加させた。このことは、ＣＢＳ媒介タンパク質Ｓ－スルフヒドリル化が、ＣＢＳＤＨ患者が内皮機能障害を呈すという以前の観察（共に全体が本願明細書に援用される、セレルマジェルら（Ｃｅｌｅｒｍａｊｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ １９９３；２２：８５４－８５８；ルッバら（Ｒｕｂｂａ ｅｔ ａｌ．）Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ １９９０；３９：１１９１－１１９５参照）を支持して、血管の健康および機能を維持するのに重要であることを示唆しており、ＣＢＳＤＨ患者が、他の原因によって上昇したＨｃｙレベルを有する個体で観察された種類の血管損傷に加えて、追加のおよび別個の種類の血管損傷に苦しむ可能性を上げる。
内皮機能の調節不全、または血管収縮性に対する他の効果は、血圧（ＢＰ）異常につながり得る。血漿ＨｃｙレベルはＢＰに直接関連しており、葉酸を使用したＨｃｙ低下はＢＰ低下に関連付けられた（共に全体が本願明細書に援用される、トゥリパーティー ピー（Ｔｒｉｐａｔｈｉ Ｐ．）心血管疾患におけるホモシステインの分子および生化学的側面（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｉｎ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ）．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｆｏｒｕｍ Ｊ ２０１６；６：１３；ハッカムら（Ｈａｃｋａｍ ｅｔ ａｌ．）ＪＡＭＡ ２００３；２９０：９３２－９４０参照）。これらの効果につながる機序は不明確であったが、Ｈｃｙレベルは、拡張期ＢＰよりも収縮期ＢＰに強力に関連付けられる。このことは、上昇したＨｃｙレベルが動脈スティフネスを増加させることを示唆している。動脈スティフネスの程度は、平滑筋細胞（ＳＭＣ）の数および機能、ＥＣＭにおけるコラーゲン：エラスチン比、コラーゲンの質ならびに内皮機能によって主に決定される（全体が本願明細書に援用される、トゥリパーティー ピー（Ｔｒｉｐａｔｈｉ Ｐ．）心血管疾患におけるホモシステインの分子および生化学的側面（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｉｎ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ）．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｆｏｒｕｍ Ｊ ２０１６；６：１３参照）。
潜在的に、高レベルのＨｃｙは、増加したＳＭＣ増殖、コラーゲン産生およびエラスチン線維形成のために、増加した動脈スティフネスに関連付けられる（全体が本願明細書に援用される、ヴァン・グルデナーら（ｖａｎ Ｇｕｌｄｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｃｕｒｒ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ Ｒｅｐ ２００３；５：２６－３１参照）。しかしながら、Ｈｃｙが、コラーゲン架橋を損なうことによって動脈スティフネスを減少させることも可能である。ミニブタで実行された研究では、食事によって誘導されたＨｃｙ上昇が、過剰拍動性動脈、収縮期（拡張期ではない）高血圧および大動脈の拡張による導管動脈の延長された反応性充血を伴う「メガ動脈症候群」につながった（全体が本願明細書に援用される、ヴァン・グルデナーら（ｖａｎ Ｇｕｌｄｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ａｎｄ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ．Ｃｕｒｒ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ Ｒｅｐ ２００３；５：２６－３１参照）。大動脈スティフネスと相関した、動脈壁弾性板の破砕もあった。
これらの所見と一貫して、ＣＢＳＤＨを有するおよび有さないマウスで実行された研究は、血管壁の横断面積が、対照食を供給されたＣＢＳ＋／＋（３２４±１８μｍ２）マウスと比較して、対照食を供給されたＣＢＳ＋／－マウス（４３７±２２μＭ２）ならびに高Ｍｅｔ食を供給されたＣＢＳ＋／＋（４４２±３６μｍ２）およびＣＢＳ＋／－（４７１±４６μｍ２）マウスで有意に大きいことを見出した（ｐ＜０．０５）（全体が本願明細書に援用される、バウムバッハら（Ｂａｕｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．）シスタチオニンベータ合成酵素欠損マウスにおける脳細動脈の構造（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｉｏｌｅｓ ｉｎ ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ ｂｅｔａ－ｓｙｎｔｈａｓｅ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ）．Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ２００２；９１：９３１－９３７参照）。
最大血管拡張中、対照食のＣＢＳ＋／－マウスならびに高Ｍｅｔ食のＣＢＳ＋／＋およびＣＢＳ＋／－マウスの脳細動脈の応力－ひずみ曲線は、対照食のＣＢＳ＋／＋マウスについての曲線の右にシフトした。これは、脳細動脈伸展性が、血漿ｔＨｃｙレベルが上昇したマウスで大きいことを指し示した。これらの結果は、上昇したＨｃｙレベルが脳血管肥大を誘導し、脳血管力学を変更したことを示唆しており、両効果は、粥状動脈硬化の非存在下でさえ、血栓症、例えば脳卒中の発生率の増加に潜在的に寄与する（全体が本願明細書に援用される、バウムバッハら（Ｂａｕｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．）Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ２００２；９１：９３１－９３７参照）。
血管拡張に対する上昇したＨｃｙの効果のさらなる支持は、ＣＢＳＤＨを有し、ｔＨｃｙレベルが１９３．６～３４２μｍｏｌ／Ｌの範囲の５人のイタリア人患者における研究に由来する（全体が本願明細書に援用される、エヴァンジェリスティら（Ｅｖａｎｇｅｌｉｓｔｉ ｅｔ ａｌ．）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ ２００９；１３４：２５１－２５４参照）。患者は、軽度の心臓弁逸脱および／または閉鎖不全ならびに結合組織顕在化の徴候を示した。
５．血栓症
複数の研究がＭＩのリスクとの関連を見出すことができなかったが、上昇したＨｃｙレベルは、深部静脈血栓症、脳静脈洞血栓症および網膜静脈血栓症のより高いリスクと関連付けられている（全体が本願明細書に援用される、スペンス ジェイディー（Ｓｐｅｎｃｅ ＪＤ．）Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．２００７年９月；６（９）：８３０－８参照）。これらの結果と一貫して、小さいが追加の研究が、ＣＢＳＤＨが血栓症に関連付けられるが、粥状動脈硬化に必ずしも関連付けられないことを示唆している。家族性高コレステロール血症（ＦＨ）およびＣＢＳＤＨの患者の血管イメージングは、ＦＨ患者が血流減少につながる頸動脈のびまん性および限局性の肥厚ならびに内皮機能障害を呈するが、ＣＢＳＤＨ患者が頸動脈にプラークを有し、内中膜複合体厚（ＩＭＴ）と中大脳動脈における血流速度の両方に関して健康な対照となる対象と類似であることを示した（全体が本願明細書に援用される、ルッバら（Ｒｕｂｂａ ｅｔ ａｌ．）Ｓｔｒｏｋｅ １９９４；２５：９４３－９５０参照）。この研究は、典型的な粥状動脈硬化病変がＣＢＳＤＨにおける血栓性イベントに先行することを要求せず、血栓症につながる内側損傷が動脈拡張によっても引き起こされ得ることを示唆している。
この観察の支持は、正常なＭｅｔ負荷検査結果を有する１２人の健康な対象と比較して、酵素的に証明されたヘテロ接合性ＣＢＳＤＨを有する１３人の患者において、頸動脈および大腿部粥状動脈硬化（ＩＭＴおよび足関節上腕血圧指数によって決定される）の有病率を比較する研究に由来する（全体が本願明細書に援用される、バークら（Ｖａｌｋ ｅｔ ａｌ．）Ｓｔｒｏｋｅ １９９６；２７：１１３４－１１３６参照）。５つの動脈セグメントのそれぞれの平均ＩＭＴ値、ＩＭＴ度数分布またはＩＭＴにおける有意差は群間で観察されなかった。これらの結果は、ヘテロ接合性個体が構造的血管変化を発症するのには若すぎた（全て５０歳未満）という事実によって説明され得るであろう。しかしながら、これらのデータはまた、上昇したＨｃｙレベルが、少なくともより若い患者で、凝固カスケードに主に影響を及ぼし得ることを示唆している。実際、３人の非血縁ＣＢＳＤＨ患者の症例報告は、ある患者が腔内血栓症による脳卒中を経験し、別の患者が頭頸部粥状動脈硬化の証拠なしに、心臓または動脈血栓塞栓症を経験したことを見出した（全体が本願明細書に援用される、ケリーら（Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２００３；６０：２７５－２７９参照）。
これらの観察と一貫して、ＨＵＶＥＣおよびＣＶ１ ＥＣへのＨｃｙ添加は、抗凝固剤、プロテインＣおよびトロンボモジュリンを不可逆的に不活性化した（全体が本願明細書に援用される、レンツら（Ｌｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９１；８８：１９０６－１９１４参照）。その上、培養されたヒトＥＣへのＨｃｙ添加によって、凝血原組織因子活性が時間および濃度依存的に増加した（全体が本願明細書に援用される、フライアーら（Ｆｒｙｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ １９９３；１３：１３２７－１３３３参照）。
両研究では、Ｈｃｙが、その遊離チオール基に関与する機序を介して凝固経路を増強した。まとめると、これらのデータは、血管凝固剤機序の攪乱がＣＢＳＤＨ患者における血管リスクの増加に寄与し、これが、粥状動脈硬化に対するＨｃｙの効果が明らかになる前に、ＣＢＳＤＨ患者における早期の役割を果たし得るという仮説を支持する。
血漿Ｈｃｙレベルの低下はＣＢＳＤＨ患者および一般集団における血管合併症、特に脳卒中のリスクを低下させる
近年の分析は、上昇したｔＨｃｙと脳卒中リスクとの間の一般集団における強力な関連を見出した（それぞれ全体が本願明細書に援用される、サポスニックら（Ｓａｐｏｓｎｉｋ ｅｔ ａｌ．）Ｓｔｒｏｋｅ ２００９；４０：１３６５－１３７２；スペンス ジェイディー（Ｓｐｅｎｃｅ ＪＤ．）脳卒中予防のためのホモシステイン低下：証拠の複雑さの解明（Ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｌｏｗｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｓｔｒｏｋｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ：Ｕｎｒａｖｅｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｖｉｄｅｎｃｅ．） Ｉｎｔ Ｊ Ｓｔｒｏｋｅ．２０１６年１０月；１１（７）：７４４－７；ハンキーら（Ｈａｎｋｅｙ ｅｔ ａｌ．）Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１２；１１：５１２－５２０参照）。
過去に、一部の研究は血管リスクの低下を示しており（それぞれ全体が本願明細書に援用される、非特許文献６；ヤップら（Ｙａｐ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２００１；２１：２０８０－２０８５；ウィルケンら（Ｗｉｌｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ １９９７；２０：２９５－３００；ヤップら（Ｙａｐ ｅｔ ａｌ．）Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ ２０００； ２６：３３５－３４０；サポスニクら（Ｓａｐｏｓｎｉｋ ｅｔ ａｌ．）Ｓｔｒｏｋｅ ２００９；４０：１３６５－１３７２；ホーら（Ｈｕｏ ｅｔ ａｌ．）ＪＡＭＡ ２０１５；３１３：１３２５－１３３５；ハンキーら（Ｈａｎｋｅｙ ｅｔ ａｌ．）Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１２；１１：５１２－５２０参照）、他は利益を示さず（それぞれ全体が本願明細書に援用される、マルチ－カルバハルら（Ｍａｒｔｉ－Ｃａｒｖａｊａｌ ｅｔ ａｌ．）Ｃｏｃｈｒａｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔ Ｒｅｖ ２０１５；１：ＣＤ００６６１２；エビングら（Ｅｂｂｉｎｇ ｅｔ ａｌ．）ＪＡＭＡ ２００８；３００：７９５－８０４；ボナアら（Ｂｏｎａａ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００６；３５４：１５７８－１５８８；リムら（Ｌｉｅｍ ｅｔ ａｌ．）Ｈｅａｒｔ ２００５；９１：１２１３－１２１４；トゥールら（Ｔｏｏｌｅ ｅｔ ａｌ．）ＪＡＭＡ ２００４；２９１：５６５－５７５；脳卒中を予防するためのビタミン（ＶＩＴＡＴＯＰＳ）試行：無作為化、二重盲検、並行、プラセボ対照試行における近年の一過的虚血性発作または脳卒中を有する患者におけるＢビタミン（Ｂ ｖｉｔａｍｉｎｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｃｅｎｔ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ａｔｔａｃｋ ｏｒ ｓｔｒｏｋｅ ｉｎ ｔｈｅ ＶＩＴＡｍｉｎｓ ＴＯ Ｐｒｅｖｅｎｔ Ｓｔｒｏｋｅ （ＶＩＴＡＴＯＰＳ）ｔｒｉａｌ： ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ－ｂｌｉｎｄ， ｐａｒａｌｌｅｌ，ｐｌａｃｅｂｏ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ）（Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１０；９：８５５－８６５参照；アルバートら（Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．）ＪＡＭＡ ２００８；２９９：２０２７－２０３６参照）、Ｈｃｙレベルが上昇した患者におけるＨｃｙ低下介入の利益が混合しているように見えた。これらの試行の多くは、Ｈｃｙ低下のためのビタミン介入、主にＢビタミン（Ｂ６およびＢ１２）および葉酸補充を検査した。結果として、研究転帰は、対象が、葉酸強化が実践される地域に住んでいるかどうか、対象をコバラミン毒性に対してより弱くする腎機能障害を有するかどうか、高齢者に比較的一般的な吸収不良に関連するビタミンＢ１２欠損を有するかどうか、または抗血小板薬投薬を受けているかどうかなどの交絡因子の対象となった。これらの近年の分析はこれらの交絡因子を考慮し、このような重要な可変要素を説明する場合、上昇したｔＨｃｙが一般集団で脳卒中のリスクを増加させると結論付けた（それぞれ全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２０００；２０：１７０４－１７０６；スペンス ジェイディー（Ｓｐｅｎｃｅ ＪＤ．）Ｉｎｔ Ｊ Ｓｔｒｏｋｅ．２０１６年１０月；１１（７）：７４４－７；スペンス ジェイディー（Ｓｐｅｎｃｅ ＪＤ）、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｌａｂ Ｍｅｄ．２０１３年３月１日；５１（３）：６３３－７参照）。
Ｈｃｙ低下療法は、ＣＢＳＤＨを有さない個体でさえ、脳卒中のリスクを低下させる。ＨＯＰＥ－２（心臓転帰予防評価２）試行では、血管疾患または糖尿病の病歴および少なくとも１つの追加のＣＶリスクファクターを有する５５歳以上の５５２２人の成人を、５年間にわたって、ビタミン補充（葉酸、ビタミンＢ６およびビタミンＢ１２）またはプラセボに無作為化した（全体が本願明細書に援用される、サポスニクら（Ｓａｐｏｓｎｉｋ ｅｔ ａｌ．）Ｓｔｒｏｋｅ ２００９；４０：１３６５－１３７２参照）。平均ベースラインＨｃｙ濃度は両群で１１．５μｍｏｌ／Ｌであり、ベースラインで０．２ｍｇ超の葉酸を含有する毎日のビタミン補充物を服用している患者は試験から除外した。全体として、Ｈｃｙ低下（プラセボに対して平均３．０μｍｏｌ／Ｌ）は、脳卒中における有意な２７％の相対リスク低下（１．３％絶対低下）（ＨＲ、０．７５；９５％ＣＩ、０．５９～０．９７）ならびに虚血性脳卒中（ＨＲ、０．８１；９５％ＣＩ、０．６０～１．０９）および出血性脳卒中（ＨＲ、０．８０；９５％ＣＩ、０．３２～２．０２）における有意でない低下に関連付けられた。亜群分析では、最高四分位数のベースラインＨｃｙレベルを有する患者の間で、脳卒中の相対リスクが最も低下した（４．３％の絶対リスク低下）。処置利益は、６９歳未満の患者、葉酸食事強化のない地域の患者および登録時に抗血小板薬も脂質低下薬も受けていない患者で最大であった。よって、ＨＯＰＥ－２試行は、プラセボに対してＢビタミンを受けている個体における脳卒中の発生率の減少を報告した（ハザード比（ＨＲ）０．７５；９５％ＣＩ、０．５９～０．９７）が、ＭＩのリスクは両処置群で類似であった（ＲＲ０．９８；９５％ＣＩ、０．８５～１．１４）（共に全体が本願明細書に援用される、サポスニクら（Ｓａｐｏｓｎｉｋ ｅｔ ａｌ．）Ｓｔｒｏｋｅ ２００９；４０：１３６５－１３７２；ロン イー（Ｌｏｎｎ Ｅ）、ユースフ エス（Ｙｕｓｕｆ Ｓ）、アーノルド エムジェイら（Ａｒｎｏｌｄ ＭＪ ｅｔ ａｌ．）血管疾患における葉酸およびＢビタミンによるホモシステイン低下（Ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｌｏｗｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ Ｂ ｖｉｔａｍｉｎｓ ｉｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ）．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００６；３５４：１５６７－１５７７参照）。
ＨＯＰＥ－２試行からの結果と一貫して、最近の脳卒中または一過的虚血発作を有する８１６４人の患者を中央３．４年間にわたって、Ｂビタミンまたはプラセボによる二重盲検処置に無作為化したＶＩＴＡＴＯＰＳ試行のサブ分析は、Ｂビタミンが、ベースラインで抗血小板療法を受けていない患者間で、主要複合転帰（脳卒中、ＭＩまたは血管原因による死亡）を有意に減少させることを見出した（プラセボによる２１％に対して１７％；ＨＲ０．７６、０．６０～０．９６）。抗血小板療法を受けている個体では、Ｂビタミンの有意な効果は観察されなかった（全体が本願明細書に援用される、ハンキーら（Ｈａｎｋｅｙ ｅｔ ａｌ．）以前脳卒中または一過的虚血発作を有した患者における抗血小板療法およびＢビタミンの効果：ＶＩＴＡＴＯＰＳ、無作為化、プラセボ対照試行の事後サブ分析（Ａｎｔｉｐｌａｔｅｌｅｔ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｂ ｖｉｔａｍｉｎｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐｒｅｖｉｏｕｓ ｓｔｒｏｋｅ ｏｒ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ａｔｔａｃｋ：ａ ｐｏｓｔ－ｈｏｃ ｓｕｂ－ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＶＩＴＡＴＯＰＳ，ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｐｌａｃｅｂｏ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ）．Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１２；１１：５１２－５２０参照）。この研究では、患者が抗血小板療法を受けたかどうかにかかわらず、ｔＨｃｙレベルがベースラインで１２．４～１３．７μｍｏｌ／Ｌからビタミン療法後に９．９～１０．５μｍｏｌ／Ｌに有意に低下した（両処置群についてｐ＜０．０００１）（全体が本願明細書に援用される、ハンキーら（Ｈａｎｋｅｙ ｅｔ ａｌ．）Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１２；１１：５１２－５２０参照）。
炎症性カスケードは、虚血性脳卒中発病に寄与すると考えられている。３２２４人の参加者におけるフラミンガム子孫研究からの報告（全体が本願明細書に援用される、ショアマネシュら（Ｓｈｏａｍａｎｅｓｈ ｅｔ ａｌ．）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ． ２０１６年９月；８７（１２）：１２０６－１１参照）は、ｔＨｃｙおよび他の３つの炎症マーカーの上昇したレベルが、虚血性脳卒中のリスクに強力に関連付けられ、フラミンガム脳卒中リスクプロファイルスコアの予測能力を改善することを見出した。
ＶＩＳＰおよびＶＩＴＡＴＯＰＳ研究からのデータのメタアナリシスは、高用量シアノコバラミンに以前曝露されなかった正常な腎機能を有する患者が、高用量シアノコバラミンを含むビタミン療法から有意に利益を得る（０．７８、０．６７～０．９０；相互作用ｐ＝０．０３）が、高用量シアノコバラミン（ビタミンＢの形態）を含むビタミン療法は、腎機能障害を有する個体における脳卒中リスクに対する効果を有さない（ＲＲ１．０４、９５％ＣＩ０．８４～１．２７）ことを見出した（全体が本願明細書に援用される、スペンス ジェイディー（Ｓｐｅｎｃｅ ＪＤ．）Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．２００７年９月；６（９）：８３０－８参照）。これらの結果は、有意な腎機能障害を有する患者における、シアン化物蓄積に関連付けられる、腎毒性として知られる、シアノコバラミンの潜在的交絡効果を示唆した（全体が本願明細書に援用される、スペンス ジェイディー（Ｓｐｅｎｃｅ ＪＤ）、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｌａｂ Ｍｅｄ．２０１３年３月１日；５１（３）：６３３－７参照）。これと一貫して、ＤＩＶＩＮｅ試行（腎症におけるビタミンによる糖尿病介入）では、１０００μｇのシアノコバラミンを含む高用量Ｂビタミンが有害であり、ｅＧＦＲ減少を増悪させた（共に全体が本願明細書に援用される、スペンス ジェイディー（Ｓｐｅｎｃｅ ＪＤ．）Ｉｎｔ Ｊ Ｓｔｒｏｋｅ．２０１６年１０月；１１（７）：７４４－７；ハウスら（Ｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．）ＪＡＭＡ ２０１０；３０３：１６０３－１６０９参照）。まとめると、このような所見は、脳卒中のリスクが高い個体、とりわけ腎不全を有する個体におけるＨｃｙレベルを低下させるための、シアノコバラミンの代わりの、メチルコバラミンなどの非シアン化物含有Ｂビタミンの使用を支持する。
シアノコバラミンおよびシアン化物毒性は、ＣＳＰＰＴ（中国脳卒中一次予防試行）からの結果により、腎障害の存在下での交絡因子として以前の試行でさらに関係付けられた（全体が本願明細書に援用される、ホーら（Ｈｕｏ ｅｔ ａｌ．）ＪＡＭＡ． ２０１５年４月７日；３１３（１３）：１３２５－３５参照）。ＣＳＰＰＴにおいて腎障害で実証された処置利益は、おそらく後の試行でのシアノコバラミン処置により、ＤＩＶＩＮｅ、ＶＩＳＰおよびＶＩＴＯＰＳ試行で観察された利益の欠如と正反対であった。
中国では、葉酸強化がまだ実践されていなかったので、ここではｔＨｃｙレベルの低下に対する葉酸補充の効果を大きな集団で研究することができた。ＣＳＰＰＴは、高血圧を有するが、脳卒中の病歴もＭＩの病歴も有さない２０７０２人の成人で実行された無作為化二重盲検試行であり、葉酸が最初の脳卒中（葉酸なしの３．４％に対して２．７％、ＨＲ０．７９；９５％ＣＩ０．６８～０．９３）、最初の虚血性脳卒中（葉酸なしの２．８％に対して２．２％、ＨＲ０．７６；９５％ＣＩ０．６４～０．９１）および複合ＣＶイベント（ＣＶ死、ＭＩおよび脳卒中；葉酸なしの３．９％に対して３．１％、ＨＲ０．８０；９５％ＣＩ０．６９～０．９２）のリスクを有意に低下させることを実証した。対照的に、２つの群間で出血性脳卒中のリスク、あらゆる原因による死亡およびＡＥの頻度における有意な差はなかった。ＣＳＰＰＴのサブスタディ（全体が本願明細書に援用される、スーら（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．）ＪＡＭＡ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．２０１６年１０月１日；１７６（１０）：１４４３－１４５０参照）では、腎障害（６０ｍＬ／分／１．７３ｍ２未満のｅＧＦＲ）を有する対象と有さない対象の両方が葉酸から利益を得て、サブスタディはさらに、葉酸で処置された群が葉酸を受けていない群よりもはるかに大きい血清Ｈｃｙの降下を有することを確認した（それぞれ１．９対０．２μｍｏｌ／Ｌ、ｐ＜０．００１）。
７４４２２人の参加者が関与する１５の無作為化対照試行を分析する、２０１７コクランレビュー（全体が本願明細書に援用される、マルチ－カルバハルら（Ｍａｒｔｉ－Ｃａｒｖａｊａｌ ｅｔ ａｌ）Ｃｏｃｈｒａｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔ Ｒｅｖ．２０１７年８月１７日；８：ＣＤ００６６１２参照）は、脳卒中に対するＢビタミンによるＨｃｙ低下の効果の小さな差を報告したが、ＭＩ、あらゆる原因による死亡またはＡＥに対する効果はなかった。プラセボ／標準ケアと比較して、Ｈｃｙ低下介入は、一般集団において、非致死性もしくは致死性脳卒中の減少した発生率に関連付けられた（対照について５．１％に対して４．３３％；ＲＲ０．９０、９５％ＣＩ０．８２～０．９９）が、非致死性もしくは致死性ＭＩの発生率（プラセボについて６．０％に対して７．１％；相対リスク（ＲＲ）１．０２、９５％ＣＩ０．９５～１．１０）またはあらゆる原因による死亡（プラセボについて１２．３％に対して１１．７％；ＲＲ１．０１、９５％ＣＩ０．９６～１．０６）に対する効果を有さなかった。このレビューは、ＣＶイベントに対するＨｃｙ低下介入の効果を支持する証拠がないと以前結論付けたが、２０１５レビューが脳卒中の減少した発生率における有意でない動向を指し示した、３つの前のバージョン（２００９、２０１３および２０１５）の最新版であった（全体が本願明細書に援用される、マルチ－カルバハル（Ｍａｒｔｉ－Ｃａｒｖａｊａｌ）Ｃｏｃｈｒａｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔ Ｒｅｖ ２０１５；１：ＣＤ００６６１２参照）。追加の試行が利用可能になったので、脳卒中に対するＨｃｙ低下介入での証拠の強度が強くなった。
このレビューに含まれる研究は、Ｈｃｙ低下療法としてビタミン補充の様々なレジメンを使用した（全体が本願明細書に援用される、マルチ－カルバハルら（Ｍａｒｔｉ－Ｃａｒｖａｊａｌ ｅｔ ａｌ．）Ｃｏｃｈｒａｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔ Ｒｅｖ．２０１７年８月１７日；８：ＣＤ００６６１２参照）。２０１７レビューは、２０１５レビューの試行に３つの新たな試行を加えた。全体のうち、１０の試行がピリドキシン＋ビタミンＢ９（葉酸）およびＢ１２を使用し、５つがビタミンＢ９のみを使用し、１０のうちの１つが葉酸の代わりに５－メチルテトラヒドロ葉酸を使用した。一部の試行が併用薬（対照群とビタミン処置群の両方で）を含み、７つの試行が脂質低下を含み、１つが抗高血圧剤を含んでいた。全体として、Ｈｃｙ低下処置は、平均ｔＨｃｙレベルの比較的小さな低下をもたらした。その上、３つの研究は葉酸強化集団で実施され、２つは混合集団（一部の対象が強化食を受け、他は受けていない）で実施され、Ｈｃｙ低下効果を隠したかもしれない。このような研究に影響し得る交絡因子を考慮すると、以前のレビューがビタミン処置レジメンの有意なＣＶ効果を識別しなかったこと、および最新のレビューで脳卒中に対する控えめな効果しか報告されなかったことは驚くべきことではない。上昇したＨｃｙレベルの多くの潜在的な原因がコクランレビューに含まれる研究で調べられなかったことも注目に値する（全体が本願明細書に援用される、マルチ－カルバハルら（Ｍａｒｔｉ－Ｃａｒｖａｊａｌ ｅｔ ａｌ．）Ｃｏｃｈｒａｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔ Ｒｅｖ ２０１５；１：ＣＤ００６６１２参照）。ＣＢＳＤＨを有する、一般集団よりも若い年齢の患者における血管リスクの病態生理学に影響を及ぼす追加の因子があり得る。Ｈｃｙレベルの控えめな低下さえ、脳卒中リスクの低下に有意に関連付けられることは注目すべきことである。
これらの分析のうちのいくつかから生じる興味深い疑問は、なぜ一部の研究が脳卒中に対するＨｃｙレベルの効果を指し示したが、ＭＩに対する効果を指し示さなかったのかである。この疑問に関連して、スペンス（全体が本願明細書に援用される、スペンス ジェイディー（Ｓｐｅｎｃｅ ＪＤ．）Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．２００７年９月；６（９）：８３０－８参照）は、脳梗塞は血栓症／塞栓性イベントに密接に関連付けられるが、ｉｎ ｓｉｔｕ血栓症はほぼ全てのＭＩイベントで冠動脈のプラーク破綻に続発性であるという、ＭＩと脳梗塞との間の重要な差異を指摘した。よって、スペンスは、脳卒中の実質的割合が、上がったｔＨｃｙに関連付けられ得る血栓性プロセスに関連すると結論付けた。
上昇したｔＨｃｙレベルは、心原性脳塞栓症だけでなく、粥状塞栓およびラクナ梗塞においても重要であり得る。抗凝固療法で処置された心房細動を有する高齢患者における研究は、高レベルのｔＨｃｙ（９０パーセンタイル超）が、虚血性合併症の４．７倍増加に関連付けられることを見出した（全体が本願明細書に援用される、ポーリら（Ｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ２００９； ５４：９９９－１００２参照）。原因不明の虚血性脳卒中患者における別の研究は、卵円孔開存（脳梗塞のリスクファクター）を有する患者が、有さない患者よりも有意に高い血漿ｔＨｃｙレベルを有することを見出した（それぞれ８．９±３対７．９±２．６μｍｏｌ／Ｌ；ｐ＝０．０２１）（全体が本願明細書に援用される、オズデミールら（Ｏｚｄｅｍｉｒ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ ２００８；２７５：１２１－１２７参照）。このような所見のレビューで、スペンス（全体が本願明細書に援用される、スペンス ジェイディー（Ｓｐｅｎｃｅ ＪＤ．）脳卒中予防のためのホモシステイン低下：証拠の複雑性の解明（Ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｌｏｗｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｓｔｒｏｋｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ：Ｕｎｒａｖｅｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｖｉｄｅｎｃｅ）．Ｉｎｔ Ｊ Ｓｔｒｏｋｅ．２０１６年１０月；１１（７）：７４４－７参照）は、Ｈｃｙが主に赤色血栓（うっ滞の設定で形成する捕らえた赤血球によるフィブリン重合体メッシュ）の形成に影響を及ぼすが、ｔＨｃｙレベルはまた経頭蓋ドプラ法で微小塞栓を有する患者で有意に高かった（１６．２対１０．１ｍｍｏｌ／Ｌ）ので、ラクナ梗塞および頸動脈プラークもｔＨｃｙに有意に関連しており、ほとんどのこのような微小塞栓が、二重抗血小板療法によって減少する、血小板凝集体であると考えられることを示唆した（全体が本願明細書に援用される、スペンス ジェイディー（Ｓｐｅｎｃｅ ＪＤ．）脳卒中予防のためのホモシステイン低下：証拠の複雑性の解明（Ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｌｏｗｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｓｔｒｏｋｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ：Ｕｎｒａｖｅｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｖｉｄｅｎｃｅ）．Ｉｎｔ Ｊ Ｓｔｒｏｋｅ．２０１６年１０月；１１（７）：７４４－７参照）。
合計５３９患者－年について、ピリドキシン、葉酸およびヒドロコバラミンで処置された３２人のＣＢＳＤＨ患者（９～６６歳の間）で行われた研究は、処置中の２つの血管イベント（１つは致死性肺塞栓症、１つはＭＩ）を報告した（全体が本願明細書に援用される、ウィルケンら（Ｗｉｌｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ １９９７；２０：２９５－３００参照）。マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）による疫学的研究によると、２１のイベントは、処置なしでも同じ期間にわたって予想されていた（ＲＲ０．０９（９５％ＣＩ０．０２～０．３８）；ｐ＝０．０００１）。２．５～７０歳の間の、３つの国の８４人の患者で実行された第２の研究は、１３１４患者－処置年の間に５症例の静脈塞栓症（ＶＥ）を報告し、１症例は肺塞栓症、２症例はＭＩ、２症例は腹部大動脈瘤であった（全体が本願明細書に援用される、ヤップら（Ｙａｐ ｅｔ ａｌ．）Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ ２０００；２６：３３５－３４０参照）。マッドら（全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１参照）によると、未処置患者では、５３症例のＶＥが予想されていた（ＲＲ０．０９１（９５％ＣＩ０．０４３～０．１９０）；ｐ＜０．００１）。
これらの結果の裏付けとなる証拠は、大部分が１０～３０歳の範囲である、１５８人のＣＢＳＤＨ患者の大規模国際多施設共同観察研究に由来する（全体が本願明細書に援用される、ヤップら（Ｙａｐ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２００１；２１：２０８０－２０８５参照）。この研究では、１７件の血管イベントが１２人の処置個体間で観察され、３症例が肺塞栓症であり、２症例がＭＩであり、５症例が深部静脈血栓症であり、３症例が脳血管発作であり、１症例が一過的虚血発作であり、１症例が矢状洞血栓症であり、２症例が腹部大動脈瘤であった。処置なしでは、同様の集団で、１１２件の血管イベントが予想されていた（ＲＲ０．０９（９５％ＣＩ０．０３６～０．２２８）；ｐ＜０．０００１）。この研究はまた、処置され、広く従った若年成人ＣＢＳＤＨ患者でさえ一般集団と比較して不十分な臨床転帰にどれほど苦しむかを強調している。
上昇した血漿ｔＨｃｙレベルは、ＣＢＳＤを有するものと有さないものの両方のＣＡＤ患者における血管疾患のリスクファクターおよび死亡率の強力な予測因子である（それぞれ全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１；カラカら（Ｋａｒａｃａ ｅｔ ａｌ．）Ｇｅｎｅ ２０１４；５３４：１９７－２０３；ケリーら（Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２００３；６０：２７５－２７９；ファエら（Ｆａｅｈ ｅｔ ａｌ．）Ｓｗｉｓｓ Ｍｅｄ Ｗｋｌｙ ２００６；１３６：７４５－７５６；ボウシェイら（Ｂｏｕｓｈｅｙ ｅｔ ａｌ．）ＪＡＭＡ １９９５；２７４：１０４９－１０５７；クラークら（Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．）ＪＡＭＡ ２００２；２８８：２０１５－２０２２；ハンキーら（Ｈａｎｋｅｙ ｅｔ ａｌ．）Ｌａｎｃｅｔ １９９９；３５４：４０７－４１３；カーンら（Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ．）Ｓｔｒｏｋｅ ２００８；３９：２９４３－２９４９；グラハムら（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．）ＪＡＭＡ １９９７；２７７：１７７５－１７８１；クラークら（Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９９１；３２４：１１４９－１１５５；クラークら（Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．）Ｉｒ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ １９９２；１６１：６１－６５；ウッドワードら（Ｗｏｏｄｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．）Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ２００６；１７：１－５；レフサムら（Ｒｅｆｓｕｍ ｅｔ ａｌ．）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ １９９８；４９：３１－６２；ヨーら（Ｙｏｏ ｅｔ ａｌ．）Ｓｔｒｏｋｅ １９９８；２９：２４７８－２４８３；セルサンら（Ｓｅｌｓｕｎ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９９５；３３２：２８６－２９１；ウォルドら（Ｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．）ＢＭＪ ２００２；３２５：１２０２；バウティスタら（Ｂａｕｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ ２００２；５５：８８２－８８７；ブラットストロームら（Ｂｒａｔｔｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．）Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １９９０；８１：５１－６０；ルサナら（Ｌｕｓｓａｎａ ｅｔ ａｌ．）Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ ２０１３；１３２：６８１－６８４；カサスら（Ｃａｓａｓ ｅｔ ａｌ．）Ｌａｎｃｅｔ ２００５；３６５：２２４－２３２；マッカリー ケーエス（ＭｃＣｕｌｌｙ ＫＳ．）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １９６９；５６：１１１－１２８；マグナーら（Ｍａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ２０１１；３４：３３－３７；ウィルケンら（Ｗｉｌｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９７６；５７：１０７９－１０８２；ナイガードら（Ｎｙｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９９７；３３７：２３０－２３６参照）。
ｔＨｃｙレベルとＣＶリスクとの間の因果関係についての証拠（全体が本願明細書に援用される、ボウシェイら（Ｂｏｕｓｈｅｙ ｅｔ ａｌ．）ＪＡＭＡ １９９５；２７４：１０４９－１０５７参照）のうち、ホモ接合性ＣＢＳ変異を有する患者およびヘテロ接合性ＣＢＳ変異を有する患者の両方（全体が本願明細書に援用される、ルッバら（Ｒｕｂｂａ ｅｔ ａｌ．）Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ １９９０；３９：１１９１－１１９５参照）を含めて、ｔＨｃｙと脳卒中またはＰＡＤとの間で最も強力な関係が実証された（それぞれ全体が本願明細書に援用される、クラークら（Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．）ＪＡＭＡ ２００２；２８８：２０１５－２０２２；カーンら（Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ．）Ｓｔｒｏｋｅ ２００８；３９：２９４３－２９４９；ウォルドら（Ｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．）ＢＭＪ ２００２；３２５：１２０２；カサスら（Ｃａｓａｓ ｅｔ ａｌ．）Ｌａｎｃｅｔ ２００５；３６５：２２４－２３２；ブラットストロームら（Ｂｒａｔｔｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．）Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ １９８９；１９ 補遺１：３５－４４参照）。
上昇したＨｃｙを血管損傷と潜在的に関連させる機序は変動し、複雑である。いくつかの研究が、ＮＦ－κＢを介した炎症性／免疫活性化（共に全体が本願明細書に援用される、ロドリゲス－アヤラら（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ａｙａｌａ ｅｔ ａｌ．）Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ２００５；１８０：３３３－３４０；ヴァン グルデナーら（ｖａｎ Ｇｕｌｄｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｃｕｒｒ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ Ｒｅｐ ２００３；５：２６－３１参照）によるものを含む、酸化ストレスを関係付けた（それぞれ全体が本願明細書に援用される、ファベルザーニら（Ｆａｖｅｒｚａｎｉ ｅｔ ａｌ．）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ２０１７；ノヴァクら（Ｎｏｗａｋ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２０１７；３７：ｅ４１－ｅ５２；ヴァンジンら（Ｖａｎｚｉｎ ｅｔ ａｌ．）Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ ２０１１；１０４：１１２－１１７；ヴァンジンら（Ｖａｎｚｉｎ ｅｔ ａｌ．）Ｇｅｎｅ ２０１４；５３９：２７０－２７４；ヴァンジンら（Ｖａｎｚｉｎ ｅｔ ａｌ．）Ｌｉｐｉｄ，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ２０１５；３５：８９９－９１１参照）。このような炎症性プロセスは粥状動脈硬化に特徴的であるが、典型的な粥状動脈硬化病変がＣＢＳＤＨ患者で血栓性イベントに先行する必要はない（共に全体が本願明細書に援用される、ルッバら（Ｒｕｂｂａ ｅｔ ａｌ．）Ｓｔｒｏｋｅ １９９４；２５：９４３－９５０；デ ヴァークら（ｄｅ Ｖａｌｋ ｅｔ ａｌ．）Ｓｔｒｏｋｅ １９９６；２７：１１３４－１１３６参照）。実際、血栓症につながる中央損傷は、Ｈｃｙ媒介内皮機能障害（それぞれ全体が本願明細書に援用される、マルチ－カルバハルら（Ｍａｒｔｉ－Ｃａｒｖａｊａｌ ｅｔ ａｌ．）Ｃｏｃｈｒａｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔ Ｒｅｖ ２０１５；１：ＣＤ００６６１２；セレルマジェルら（Ｃｅｌｅｒｍａｊｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ １９９３；２２：８５４－８５８；ルッバら（Ｒｕｂｂａ ｅｔ ａｌ．）Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ １９９０；３９：１１９１－１１９５；ジャンら（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２００５；２５：２５１５－２５２１；フセインら（Ｈｏｓｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００３；２７８：３０３１７－３０３２７；カイら（Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．）Ｂｌｏｏｄ ２０００；９６：２１４０－２１４８；チャンら（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００１；２７６：３５８６７－３５８７４；パパペトロプーロスら（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２００９；１０６：２１９７２－２１９７７；サボーら（Ｓｚａｂｏ ｅｔ ａｌ．）Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２０１１；１６４：８５３－８６５；チクら（Ｃｈｉｋｕ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００９；２８４：１１６０１－１１６１２；ワンら（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．）Ａｎｔｉｏｘｉｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ ２０１０；１２：１０６５－１０７７；サハ エスら（Ｓａｈａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．）ＦＡＳＥＢ Ｊ ２０１６；３０：４４１－４５６；エビングら（Ｅｂｂｉｎｇ ｅｔ ａｌ．）ＪＡＭＡ ２００８；３００：７９５－８０４；ボナアら（Ｂｏｎａａ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００６；３５４：１５７８－１５８８参照）、増強した凝固経路（それぞれ全体が本願明細書に援用される、スペンス ジェイディー（Ｓｐｅｎｃｅ ＪＤ．）Ｉｎｔ Ｊ Ｓｔｒｏｋｅ．２０１６年１０月；１１（７）：７４４－７；フライアーら（Ｆｒｙｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ １９９３；１３：１３２７－１３３３；レンツら（Ｌｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９１；８８：１９０６－１９１４参照）、およびマルファン患者に関係している血栓性プロセスに類似の増加した血管拡張（それぞれ全体が本願明細書に援用される、ケリーら（Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２００３；６０：２７５－２７９；トゥリパーティー ピー（Ｔｒｉｐａｔｈｉ Ｐ．）心血管疾患におけるホモシステインの分子および生化学的側面（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｉｎ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ．）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｆｏｒｕｍ Ｊ ２０１６；６：１３；ヴァン グルデナーら（ｖａｎ Ｇｕｌｄｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｃｕｒｒ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ Ｒｅｐ ２００３；５：２６－３１；ハッカムら（Ｈａｃｋａｍ ｅｔ ａｌ．）ＪＡＭＡ ２００３；２９０：９３２－９４０；バウムバッハら（Ｂａｕｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．）Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ２００２；９１：９３１－９３７；エヴァンジェリスティら（Ｅｖａｎｇｅｌｉｓｔｉ ｅｔ ａｌ．）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ ２００９；１３４：２５１－２５４；デ ヴァークら（ｄｅ Ｖａｌｋ ｅｔ ａｌ．）Ｓｔｒｏｋｅ １９９６；２７：１１３４－１１３６参照）によって引き起こされると考えられている。ＣＢＳＤＨ患者における内皮機能障害の観察と一貫して、薬理学および遺伝子研究調査が、ＣＢＳ媒介タンパク質Ｓ－スルフヒドリル化を血管の健康および機能の維持に関係付けた（共に全体が本願明細書に援用される、セレルマジェルら（Ｃｅｌｅｒｍａｊｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ １９９３；２２：８５４－８５８；ルッバら（Ｒｕｂｂａ ｅｔ ａｌ．）Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ １９９０；３９：１１９１－１１９５参照）。よって、ＣＢＳＤＨ患者における血管損傷の機序は、ＣＶ疾患を有する一般集団よりも変動する可能性がある。
Ｈｃｙ低下がＣＢＳＤＨを有するおよび有さない個体における脳卒中リスクに対して有益であるというかなりの証拠がある（それぞれ全体が本願明細書に援用される、サポスニクら（Ｓａｐｏｓｎｉｋ ｅｔ ａｌ．）Ｓｔｒｏｋｅ ２００９；４０：１３６５－１３７２；ホーら（Ｈｕｏ ｅｔ ａｌ．）ＪＡＭＡ ２０１５；３１３：１３２５－１３３５；ロンら（Ｌｏｎｎ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００６；３５４：１５６７－１５７７；ハンキーら（Ｈａｎｋｅｙ ｅｔ ａｌ．）Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１２；１１：５１２－５２０；スペンス ジェイディー（Ｓｐｅｎｃｅ ＪＤ．）Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．２００７年９月；６（９）：８３０－８参照）。一般集団で実行された研究では、平均ベースラインＨｃｙレベルが比較的低かったが、脳卒中発生率の減少がＨｃｙ低下介入と有意に相関しており、ｔＨｃｙレベルの小さな減少でさえの利益を指していた。
関連する試行の最新のレビューが、脳卒中におけるＨｃｙ低下処置の有益な効果を支持している（全体が本願明細書に援用される、マルチ－カルバハルら（Ｍａｒｔｉ－Ｃａｒｖａｊａｌ ｅｔ ａｌ．）Ｃｏｃｈｒａｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔ Ｒｅｖ．２０１７年８月１７日；８：ＣＤ００６６１２参照）。患者を高用量シアノコバラミンに対して弱くしておく葉酸強化、ビタミンＢ１２欠損もしくは腎機能不全があるかどうか、または対象が抗血小板薬投薬を受けているかどうかなどの交絡因子が試行転帰をぼやけさせた。近年の分析は、このような因子を説明する場合、一般集団でｔＨｃｙと脳卒中リスクとの間の関連が強力であることを実証した（全体が本願明細書に援用される、スペンス ジェイディー（Ｓｐｅｎｃｅ ＪＤ）、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｌａｂ Ｍｅｄ．２０１３年３月１日；５１（３）：６３３－７参照）。しかしながら、重要なことに、一般集団よりもはるかに高いｔＨｃｙレベルを有するＣＢＳＤＨ患者では、Ｈｃｙ低下の血管利益が一貫して実証されている（それぞれ全体が本願明細書に援用される、非特許文献６；エスラミエら（Ｅｓｌａｍｉｙｅｈ ｅｔ ａｌ．）Ｉｒａｎ Ｊ Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１５；９：５３－５７；ソブールら（Ｓａｂｏｕｌ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１５；３０：１０７－１１２；ヤップら（Ｙａｐ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２００１；２１：２０８０－２０８５；ウッズら（Ｗｏｏｄｓ ｅｔ ａｌ．）ＢＭＪ Ｃａｓｅ Ｒｅｐ ２０１７；２０１７；ウィルケンら（Ｗｉｌｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ １９９７；２０：２９５－３００；ヤップら（Ｙａｐ ｅｔ ａｌ．）Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ ２０００；２６：３３５－３４０；ルホイら（Ｒｕｈｏｙ ｅｔ ａｌ．）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１４；５０：１０８－１１１参照）。
これらの所見は、上昇したＨｃｙレベルが、ＣＢＳＤＨを有するおよび有さない患者におけるＣＶ疾患、とりわけ脳卒中のリスクファクターであること、および長期Ｈｃｙ低下療法を通してＣＶまたは脳血管リスクを低下させることができることを示唆している。
血栓塞栓症は、ＣＢＳＤＨ患者における罹患率および早死にの主因である（それぞれ全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１；カラカら（Ｋａｒａｃａ ｅｔ ａｌ．）Ｇｅｎｅ ２０１４；５３４：１９７－２０３；ヤップ エス（Ｙａｐ Ｓ．）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ２００３；２６：２５９－２６５参照）。未処置ＣＢＳＤＨを有する患者における血栓塞栓症イベントの全体的な比率は１年当たりおおよそ１０％であり（全体が本願明細書に援用される、カッタネオ エム（Ｃａｔｔａｎｅｏ Ｍ．）Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ ２００６；３２：７１６－７２３参照）、リスクは外科手術後および妊娠中または妊娠直後に増加する（共に全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１；ノーヴィら（Ｎｏｖｙ ｅｔ ａｌ．）Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２０１０；１０３：８７１－８７３参照）。血栓塞栓症はいずれの血管にも罹患し得るが、ＣＢＳＤＨ患者では、静脈血栓症（特に脳静脈洞血栓症（ＣＳＶＴ））が動脈血栓症よりも一般的である（それぞれ全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１；カラカら（Ｋａｒａｃａ ｅｔ ａｌ．）Ｇｅｎｅ ２０１４；５３４：１９７－２０３；エスラミエら（Ｅｓｌａｍｉｙｅｈ ｅｔ ａｌ．）Ｉｒａｎ Ｊ Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１５；９：５３－５７；ソブールら（Ｓａｂｏｕｌ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１５；３０：１０７－１１２参照）。
６２９人の未処置ＣＢＳＤＨ患者における研究は、観察された２５３件の血管イベント（１５８人の患者で起こった）のうち、８１件（３２％）が脳血管発作であり、１３０件（５１％）が末梢静脈に罹患し（うち３２件が肺塞栓症をもたらした）、１０件（４％）が心筋梗塞（ＭＩ）につながり、２８件（１１％）が末梢動脈に罹患し、４件（２％）がこれらのカテゴリーのうちのいずれにも入らなかった（全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１参照）。脳血管発作、とりわけＣＳＶＴは、乳児で記載されている（全体が本願明細書に援用される、マハレら（Ｍａｈａｌｅ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１７年４月～６月；１２（２）：２０６－２０７参照）が、より典型的には若年成人で現れる（全体が本願明細書に援用される、ヤップら（Ｙａｐ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２００１；２１：２０８０－２０８５参照）。脳血管イベントは、患者のピリドキシン応答カテゴリーにごくわずかに関連していると報告された。
血管イベントのリスクは２０歳未満の患者でおおよそ３０％であり、３０歳までに５０％に上昇した。しかしながら、症状はいずれの年齢でも起こることがあり、致死性血栓症は６か月という若さの乳児で記載されている（全体が本願明細書に援用される、カルドら（Ｃａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．）Ｄｅｖ Ｍｅｄ Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ １９９９；４１：１３２－１３５参照）。１０歳より後では、２５年当たりに１件の血管イベントが予想される。一般に、小児におけるＣＢＳＤＨの最初の徴候は、生後１年もしくは２年の間に発達遅延として呈示する精神遅滞、および／または水晶体脱臼／高度の近視である。対照的に、成人は血管イベントを呈示する可能性が高い。
Ｄ．表現型転帰に対する食事の効果
一部の実施形態では、ＨＣＵのマウスモデルであるＩ２７８Ｔマウスを使用して、ヒト患者に関連する臨床エンドポイントに対する２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳによるＨＣＵのための酵素療法の長期影響を査定した。正常メチオニン摂取（ＲＥＧ）およびメチオニン制限食（ＭＲＤ）のバックグラウンドでの２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ、ならびにＭＲＤ単独による有効性。２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳによる処置は、血漿ホモシステイン濃度の９０％の低下、ならびに学習／認知、内皮機能障害、止血、骨石灰化、およびＨＣＵに関連付けられる体組成表現型の矯正をもたらすことができる。一定の実施形態では、ＭＲＤのバックグラウンドでの２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳによる処置が血漿Ｈｃｙを正常化した。ＭＲＤ単独では、Ｉ２７８Ｔマウスにおいて、血漿Ｈｃｙを６７％低下させ、ＨＣＵ表現型を矯正することが観察された。しかしながら、ＭＲＤは、Ｉ２７８Ｔマウスと野生型対照の両方で、不安を増加させ、骨塩量を減少させた。したがって、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳが、ＲＥＧまたはＭｅｔ制限食のバックグラウンドの対象におけるＨＣＵを処置するのに高度に効果的である。実際、正常Ｍｅｔ摂取のバックグラウンドの２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳによるＥＴは、Ｍｅｔ制限食と比較して、性能が等しい、またはより優れた結果を与える。
Ｅ．神経合併症
研究により、低Ｍｅｔ食、葉酸／Ｂビタミン補充ならびに／またはピリドキシンおよびベタイン療法によって誘導されるＨｃｙレベルの早期低下が、様々な神経障害を予防し、時々、その進行を逆転させ、ＣＢＳＤＨ患者における正常なＩＱ発達を可能にすることができることが示された（それぞれ全体が本願明細書に援用される、エル・バシールら（Ｅｌ Ｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．）ＪＩＭＤ Ｒｅｐ ２０１５；２１：８９－９５；ヤップら（Ｙａｐ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ２００１；２４：４３７－４４７；メック エーダブリュー（Ｍｅｃｈ ＡＷ）、ファラー エー（Ｆａｒａｈ Ａ）．ＭＴＨＦＲ Ｃ６７７ＴまたはＡ１２９８Ｃ多型が陽性のＭＤＤ患者における還元型Ｂビタミンによる治療中の臨床応答とホモシステイン低下の相関：無作為化、二重盲検、プラセボ対照試験（Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｗｉｔｈ ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ Ｂ ｖｉｔａｍｉｎｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＭＤＤ ｗｈｏ ａｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｆｏｒ ＭＴＨＦＲ Ｃ６７７Ｔ ｏｒ Ａ１２９８Ｃ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ－ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｓｔｕｄｙ）．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２０１６；７７：６６８－６７１；グローブ エイチ（Ｇｒｏｂｅ Ｈ）．Ｅｕｒ Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ １９８０；１３５：１９９－２０３参照）。Ｈｃｙレベルの有意な低下、さらには正常化がＣＮＳ転帰の完全なまたは部分的な矯正をもたらしたさらなる証拠が、ＣＢＳＤＨ患者における症例研究で提供される（それぞれ全体が本願明細書に援用される、ヤップら（Ｙａｐ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ２００１；２４：４３７－４４７；ブレントンら（Ｂｒｅｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１４；２９：８８－９２；レザザデら（Ｒｅｚａｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．）Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ Ｏｐｅｎ ２０１４；１：２３２９０４８Ｘ１４５４５８７０；ケーザーら（Ｋａｅｓｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １９６９；３２：８８－９３；コラフランセスコら（Ｃｏｌａｆｒａｎｃｅｓｃｏ ｅｔ ａｌ．）Ｅｕｒ Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ ２０１５；１７４：１２６３－１２６６；横井ら（Ｙｏｋｏｉ ｅｔ ａｌ．）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｔ ２００８；５０：６９４－６９５；リら（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．）Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １９９９；３１：２２１－２２４参照）。
上昇したＨｃｙレベルと、精神遅滞、神経変性疾患、発作、ジストニア、精神病、認知障害、認知症およびうつ病を含むＣＮＳ症状との間の関連付けは、ＣＢＳＤＨ患者および一般集団でよく記録されている（それぞれ全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２；アボットら（Ａｂｂｏｔｔ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ １９８７；２６：９５９－９６９；マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）硫黄転移の障害（Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｓｕｌｆｕｒａｔｉｏｎ）．スクリヴァー シーエル（Ｓｃｒｉｖｅｒ ＣＬ）、ボーデ エーエル（Ｂｅａｕｄｅｔ ＡＬ）、スライ ダブリューエス（Ｓｌｙ ＷＳ）、ヴァレ ディー（Ｖａｌｌｅ Ｄ）編．遺伝病の代謝および分子基礎（Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）．第７版 ニューヨーク：マグロウヒル（ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ）；２００１；１２７９－１３２７；イダルゴら（Ｈｉｄａｌｇｏ ｅｔ ａｌ．）Ｅｕｒ Ｃｈｉｌｄ Ａｄｏｌｅｓｃ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２０１４；２３：２３５－２３８；スミスら（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１０；５：ｅ１２２４４；セシャドリら（Ｓｅｓｈａｄｒｉ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００２；３４６：４７６－４８３；ボッティグリエリら（Ｂｏｔｔｉｇｌｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２０００；６９：２２８－２３２；ビェランら（Ｂｊｅｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｃｈ Ｇｅｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２００３；６０：６１８－６２６；トルムネンら（Ｔｏｌｍｕｎｅｎ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ２００４；８０：１５７４－１５７８；カエサルら（Ｋａｅｓｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １９６９；３２：８８－９３；ゴリムベットら（Ｇｏｌｉｍｂｅｔ ｅｔ ａｌ．）Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ Ｒｅｓ ２００９；１７０：１６８－１７１；クラークら（Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ １９９８；５５：１４４９－１４５５；ペルモダ－オシップら（Ｐｅｒｍｏｄａ－Ｏｓｉｐ ｅｔ ａｌ．）Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１４；６９：１０７－１１１；オリベイラら（Ｏｌｉｖｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．）ＢＭＪ Ｃａｓｅ Ｒｅｐ ２０１６；２０１６；トロエンら（Ｔｒｏｅｎ ｅｔ ａｌ．）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２００８；１０５：１２４７４－１２４７９；サダスら（Ｓｕｄｄｕｔｈ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ ２０１３；３３：７０８－７１５；ヘインズワースら（Ｈａｉｎｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２０１６；１８６２：１００８－１０１７；ヘルマンら（Ｈｅｒｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｌａｂ Ｍｅｄ ２０１１；４９：４３５－４４１；キムら（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｎｕｔｒ ２００７；１３７：２０９３－２０９７；セルフーブら（Ｓｅｌｈｕｂ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ２０００；７１：６１４Ｓ－６２０Ｓ；マッカドンら（ＭｃＣａｄｄｏｎ ｅｔ ａｌ．）Ｄｅｍｅｎｔ Ｇｅｒｉａｔｒ Ｃｏｇｎ Ｄｉｓｏｒｄ ２００１；１２：３０９－３１３；スモールウッドら（Ｓｍａｌｌｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．）Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ａｐｐｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ２０１２；３８：３３７－３４３；ベイドゥンら（Ｂｅｙｄｏｕｎ ｅｔ ａｌ．）ＢＭＣ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ２０１４；１４：６４３；ゲルツら（Ｇｏｒｔｚ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ ２００４；２１８：１０９－１１４；Ｈｅａｌｔｈ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｏ．ビタミンＢ１２および認知機能：証拠に基づく分析（Ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ１２ ａｎｄ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ａｎ ｅｖｉｄｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ）．Ｏｎｔ．Ｈｅａｌｔｈ Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｓｓｅｓｓ．Ｓｅｒ．１３（２３）、１ｅ４５．２０１３．Ｒｅｆ Ｔｙｐｅ：オンラインソース；サラグレら（Ｓａｌａｇｒｅ ｅｔ ａｌ．）Ｅｕｒ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２０１７；４３：８１－９１参照）。Ｈｃｙレベルが上昇した個体におけるＣＮＳにつながる機序は、ｔＨｃｙ媒介ニューロン損傷（それぞれ全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）硫黄転移の障害（Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｓｕｌｆｕｒａｔｉｏｎ）．スクリヴァー シーエル（Ｓｃｒｉｖｅｒ ＣＬ）、ボーデ エーエル（Ｂｅａｕｄｅｔ ＡＬ）、スライ ダブリューエス（Ｓｌｙ ＷＳ）、ヴァレ ディー（Ｖａｌｌｅ Ｄ）編．遺伝病の代謝および分子基礎（Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）．第７版 ニューヨーク：マグロウヒル（ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ）；２００１；１２７９－１３２７；ヘインズワースら（Ｈａｉｎｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２０１６；１８６２：１００８－１０１７；ステファネロら（Ｓｔｅｆａｎｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．）Ｍｅｔａｂ Ｂｒａｉｎ Ｄｉｓ ２００７；２２：１７２－１８２；トボレクら（Ｔｏｂｏｒｅｋ ｅｔ ａｌ．）Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １９９５；１１５：２１７－２２４参照）、Ｈｃｙ媒介酸化ストレスによって引き起こされる血管内皮の損傷（全体が本願明細書に援用される、ビビツキーら（Ｖｉｖｉｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ ＩｎｔｅｇｒＣｏｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２００４；２８７：Ｒ３９－Ｒ４６参照）、ニューロン喪失（共に全体が本願明細書に援用される、イェガーネら（Ｙｅｇａｎｅｈ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２０１３；５０：５５１－５５７；ハイダーら（Ｈｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ 補遺 ２００４；１－１３参照）およびニューラルネットワーク活性の減弱（全体が本願明細書に援用される、ゲルツら（Ｇｏｒｔｚ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ ２００４；２１８：１０９－１１４参照）に関与すると考えられている。うつ病および痙攣は、少なくとも部分的に、Ｈｃｙによって媒介される脳アデノシンレベルの低下とノルエピネフリンおよびドーパミンレベルのその後の低下によって引き起こされると考えられている（それぞれ全体が本願明細書に援用される、メックら（Ｍｅｃｈ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２０１６；７７：６６８－６７１；ドマガラら（Ｄｏｍａｇａｌａ ｅｔ ａｌ．）Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ １９９７；８７：４１１－４１６；ビビツキーら（Ｖｉｖｉｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ ＩｎｔｅｇｒＣｏｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２００４；２８７：Ｒ３９－Ｒ４６；フォルスタインら（Ｆｏｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２００７；１６４：８６１－８６７参照）。
これらの所見が、ＣＢＳＤＨ患者におけるＨｃｙレベルと増加したＣＮＳ障害のリスクとの間の強力な相関を実証した。早期Ｈｃｙ低下療法は、早期発生ＣＢＳＤＨを有する小児の正常な発達および晩年にＣＢＳＤＨと診断された患者におけるＣＮＳ障害の矯正または改善に必須である。
６３人のＣＢＳＤＨ患者における研究は、５１％が不安および挿話性うつ病（１０％）、慢性行動障害（例えば、攻撃性および薬物またはアルコール乱用）（１７％）、慢性強迫性障害（５％）およびパーソナリティ障害（１９％）を含む精神医学障害を有することを見出した（全体が本願明細書に援用される、アボットら（Ａｂｂｏｔｔ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ １９８７；２６：９５９－９６９参照）。精神病は青年期における呈示徴候であり得る（全体が本願明細書に援用される、イダルゴら（Ｈｉｄａｌｇｏ ｅｔ ａｌ．）Ｅｕｒ Ｃｈｉｌｄ Ａｄｏｌｅｓｃ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２０１４；２３：２３５－２３８参照）。
未処置の場合、ピリドキシン非応答性患者のおおよそ９０％が学習困難を有し（全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８５；３７：１－３１参照）、未処置ピリドキシン応答性患者の７９および遵守が良好な処置ピリドキシン応答性患者の１０５と比較して、ＩＱはピリドキシン非応答性個体で典型的には１０～１３８の範囲であり、平均５７である（全体が本願明細書に援用される、ヤップら（Ｙａｐ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ２００１；２４：４３７－４４７参照）。発作は１２歳までに非応答性患者の２０％で罹患し、ポリミオクローヌス、ジストニアおよびパーキンソン病を含む、大脳基底核梗塞に関連しない運動障害のいくつかの症例が報告された（共に全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２；レザザデら（Ｒｅｚａｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．）Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ Ｏｐｅｎ ２０１４；１：２３２９０４８Ｘ１４５４５８７０参照）。
ＣＢＳＤＨと神経精神症状との間の関連付けは、１９６５年にシムケらによって最初に記載された（全体が本願明細書に援用される、シムケら（Ｓｃｈｉｍｋｅ ｅｔ ａｌ．）ＪＡＭＡ １９６５；１９３：７１１－７１９参照）。関連付けは、ＣＢＳ欠損患者の５０％超で精神病理学を報告する研究によって後に支持された（全体が本願明細書に援用される、アボットら（Ａｂｂｏｔｔ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ １９８７；２６：９５９－９６９参照）。それ以来、多数の疫学的研究が、均一な血漿ｔＨｃｙの軽度の上昇と、精神遅滞および神経変性疾患を含むＣＮＳ障害のリスクとの間の正の用量依存的関係を示した（それぞれ全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２；セシャドリら（Ｓｅｓｈａｄｒｉ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００２；３４６：４７６－４８３；クラークら（Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ １９９８；５５：１４４９－１４５５；ヘインズワースら（Ｈａｉｎｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２０１６；１８６２：１００８－１０１７；ヘルマンら（Ｈｅｒｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｌａｂ Ｍｅｄ ２０１１；４９：４３５－４４１；キム ジェイら（Ｋｉｍ Ｊ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｎｕｔｒ ２００７；１３７：２０９３－２０９７；セルフーブら（Ｓｅｌｈｕｂ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ２０００；７１：６１４Ｓ－６２０Ｓ；マッカドンら（ＭｃＣａｄｄｏｎ ｅｔ ａｌ．）Ｄｅｍｅｎｔ Ｇｅｒｉａｔｒ Ｃｏｇｎ Ｄｉｓｏｒｄ ２００１；１２：３０９－３１３；スモールウッドら（Ｓｍａｌｌｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．）Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ａｐｐｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ２０１２；３８：３３７－３４３；ベイドゥンら（Ｂｅｙｄｏｕｎ ｅｔ ａｌ．）ＢＭＣ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ２０１４；１４：６４３参照）。一般に、Ｈｃｙレベルが重度に上昇した（５０～２００μＭ／Ｌ）患者は発作および精神病を含む急性ニューロン機能障害を呈示する傾向があり、より中等度のＨｃｙレベル（１５～５０μＭ／Ｌ）は認知障害および認知症に関連付けられている（共に全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）硫黄転移の障害（Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｓｕｌｆｕｒａｔｉｏｎ）．スクリヴァー シーエル（Ｓｃｒｉｖｅｒ ＣＬ）、ボーデ エーエル（Ｂｅａｕｄｅｔ ＡＬ）、スライ ダブリューエス（Ｓｌｙ ＷＳ）、ヴァレ ディー（Ｖａｌｌｅ Ｄ）編 遺伝病の代謝および分子基礎（Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）．第７版 ニューヨーク：マグロウヒル（ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ）；２００１；１２７９－１３２７；ゲルツら（Ｇｏｒｔｚ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ ２００４；２１８：１０９－１１４参照）。
上昇したＨｃｙレベルは、認知障害（共に全体が本願明細書に援用される、スミスら（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１０；５：ｅ１２２４４；セシャドリら（Ｓｅｓｈａｄｒｉ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００２；３４６：４７６－４８３参照）、認知症の発生（全体が本願明細書に援用される、Ｈｅａｌｔｈ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｏ．ビタミンＢ１２および認知機能：証拠に基づく分析（Ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ１２ ａｎｄ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ａｎ ｅｖｉｄｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ）．Ｏｎｔ．Ｈｅａｌｔｈ Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｓｓｅｓｓ．Ｓｅｒ．１３（２３）、１ｅ４５．２０１３．Ｒｅｆ Ｔｙｐｅ：オンラインソース参照）およびアルツハイマー病（全体が本願明細書に援用される、セシャドリら（Ｓｅｓｈａｄｒｉ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００２；３４６：４７６－４８３参照）の堅牢な独立したリスクファクターとして広く受け入れられている。加えて、上昇したＨｃｙレベル（１５μｍｏｌ／Ｌ超）は、うつ病患者の最大９０％に存在することが示され（共に全体が本願明細書に援用される、ボッティグリエリら（Ｂｏｔｔｉｇｌｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２０００；６９：２２８－２３２；ビェランら（Ｂｊｅｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｃｈ Ｇｅｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２００３；６０：６１８－６２６参照）、ｔＨｃｙレベルの上三分位数の男性は下三分位数の男性より２倍超うつ病に苦しむ可能性が高い（全体が本願明細書に援用される、トルムネンら（Ｔｏｌｍｕｎｅｎ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ２００４；８０：１５７４－１５７８参照）。上昇したＨｃｙレベルは、統合失調症、多発性硬化症、パーキンソン病、線維筋痛症／慢性疲労症候群（それぞれ全体が本願明細書に援用される、カエサルら（Ｋａｅｓｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １９６９；３２：８８－９３；ゴリムベットら（Ｇｏｌｉｍｂｅｔ ｅｔ ａｌ．）Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ Ｒｅｓ ２００９；１７０：１６８－１７１；クラークら（Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ １９９８；５５：１４４９－１４５５参照）および脳血管疾患を有さない反復性ジストニア（全体が本願明細書に援用される、シンクレアら（Ｓｉｎｃｌａｉｒ ｅｔ ａｌ．）Ｍｏｖ Ｄｉｓｏｒｄ ２００６；２１：１７８０－１７８２参照）の症例で一般的に報告されている。ＣＢＳ遺伝子のＴ８３３Ｃ多型と双極性障害との間の考えられる関連付けが記載され（全体が本願明細書に援用される、ペルモダ－オシップら（Ｐｅｒｍｏｄａ－Ｏｓｉｐ ｅｔ ａｌ．）Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１４；６９：１０７－１１１参照）、近年のメタアナリシスが、双極性疾患を有する個体における上昇したＨｃｙレベルと躁病／気分正常との間の関係を指し示した（全体が本願明細書に援用される、サラグレら（Ｓａｌａｇｒｅ ｅｔ ａｌ．）Ｅｕｒ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２０１７；４３：８１－９１参照）。ＣＢＳＤＨに関連付けられる末梢神経障害の最初に知られた症例は、ＣＢＳＤＨを有する１８歳の男性で近年記載され（全体が本願明細書に援用される、オリベイラら（Ｏｌｉｖｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．）ＢＭＪ Ｃａｓｅ Ｒｅｐ ２０１６；２０１６参照）、精神病の致死性症例は以前診断未確定のＣＢＳＤＨを有する１７歳で記載された（全体が本願明細書に援用される、イダルゴら（Ｈｉｄａｌｇｏ ｅｔ ａｌ．）Ｅｕｒ Ｃｈｉｌｄ Ａｄｏｌｅｓｃ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２０１４；２３：２３５－２３８参照）。
Ｈｃｙレベルと認知症との間の関係の直接的な証拠は、Ｈｃｙ投与が脳病変の発症に関連付けられた動物研究に由来する（それぞれ全体が本願明細書に援用される、トロエンら（Ｔｒｏｅｎ ｅｔ ａｌ．）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２００８；１０５：１２４７４－１２４７９；サダスら（Ｓｕｄｄｕｔｈ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ ２０１３；３３：７０８－７１５参照）。第１のこのような研究では、Ｈｃｙレベルが上昇した（ビタミンＢ欠損食によって誘導される）雄Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスが、併発神経膠腫も神経変性もない海馬微小血管系の有意な粗鬆化と共に、有意に損なわれた空間学習および記憶を有した（全体が本願明細書に援用される、トロエンら（Ｔｒｏｅｎ ｅｔ ａｌ．）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２００８；１０５：１２４７４－１２４７９参照）。全海馬毛細血管長は、モリス水迷路逃避潜時（ｒ＝－０．７５７、ｐ＜０．００１）および血漿ｔＨｃｙ（ｒ＝－０．６３１、ｐ＜０．００７）と逆相関していた。Ｍｅｔ富化食を与えられたマウスは、類似であるが、あまり明白でない効果を示した。これらの所見は、上昇したＨｃｙレベルが、神経変性の非存在下のまたは神経変性に先行する認知機能障害につながる脳微小血管粗鬆化に関連付けられることを示唆した。これは、ヒトにおける上昇したＨｃｙレベルと認知低下との間の関連を説明し得る。
第２の研究では、健康なマウスに、葉酸、ビタミンＢ６およびＢ１２が欠損しており、Ｍｅｔを補充した食事を与えて、中等度に上昇したＨｃｙレベルを誘導した（血漿ｔＨｃｙ８２．９３±３．５６μｍｏｌ／Ｌ）。これらのマウスは、２日間のラジアルアーム水迷路で評価される、空間記憶欠損を有した（全体が本願明細書に援用される、サダスら（Ｓｕｄｄｕｔｈ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ ２０１３；３３：７０８－７１５参照）。ＭＲＩおよび組織学は、有意な微小出血率を明らかにした。神経炎症ならびにＭＭＰ２およびＭＭＰ９（両酵素とも脳出血の発病に関係している）の増加した発現および活性も観察された。このことは、上昇したＨｃｙレベルと、アルツハイマー病などの血管性認知症との間の関連を示唆した。
ヒトでは、ＣＢＳＤＨを有する個体（それぞれ全体が本願明細書に援用される、エル・バシールら（Ｅｌ Ｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．）ＪＩＭＤ Ｒｅｐ ２０１５；２１：８９－９５；バタナビチャンら（Ｖａｔａｎａｖｉｃｈａｒｎ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ２００８；３１ 補遺３：４７７－４８１；ブレントンら（Ｂｒｅｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１４；２９：８８－９２；ルホイら（Ｒｕｈｏｙ ｅｔ ａｌ．）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１４；５０：１０８－１１１参照）と有さない個体（それぞれ全体が本願明細書に援用される、ホーゲルフォルストら（Ｈｏｇｅｒｖｏｒｓｔ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ ２００２；５９：７８７－７９３；クロッペンボルグら（Ｋｌｏｐｐｅｎｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０１４；８２：７７７－７８３参照）の両方で、白質の変化（血管損傷の徴候）が上昇したＨｃｙレベルに頻繁に関連付けられる。しかしながら、これらの変化は、脳卒中の証拠に必ずしも関連付けられるわけではない。加えて、ＣＢＳＤＨ患者における脳イメージング研究はしばしば、萎縮または静脈閉塞の徴候を示している（全体が本願明細書に援用される、バタナビチャンら（Ｖａｔａｎａｖｉｃｈａｒｎ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ２００８；３１ 補遺３：４７７－４８１参照）。
スキャンにより、大脳半球、主に頭頂後頭領域の皮質下白質、およびより少ない度合いで、深部白質のびまん性対称異常増加シグナルが明らかになる。
１．機序
上昇したＨｃｙレベルが神経学的健康に影響を及ぼす正確な機序は不明である。いくつかの動物研究により、上昇したｔＨｃｙレベルと、神経毒性ならびに付随する神経および精神障害との間の関連付けが示された。
早期の研究により、非常に高い腹腔内用量のＨｃｙが、運動皮質にコバルト誘導病変を有するラットで全般痙攣性てんかん重積持続状態を誘導することが示された（全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）硫黄転移の障害（Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｓｕｌｆｕｒａｔｉｏｎ）．スクリヴァー シーエル（Ｓｃｒｉｖｅｒ ＣＬ）、ボーデ エーエル（Ｂｅａｕｄｅｔ ＡＬ）、スライ ダブリューエス（Ｓｌｙ ＷＳ）、ヴァレ ディー（Ｖａｌｌｅ Ｄ）編 遺伝病の代謝および分子基礎（Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）．第７版 ニューヨーク：マグロウヒル（ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ）；２００１；１２７９－１３２７参照）。発作は、ＭｅｔおよびビタミンＢの添加によって増強され、シナプス後ｇアミノ酪酸受容体の遮断におけるピリドキサール５’－リン酸およびＨｃｙの相乗効果のいくらかの証拠があった。その上、齧歯類新皮質組織のＨｃｙ処置は、ＡｄｏＨｃｙの形態でのアデノシン捕集につながった（全体が本願明細書に援用される、ハイネーケら（Ｈｅｉｎｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９８７；２６２：１００９８－１０１０３参照）。著者らは、アデノシンが優勢に脳活動における抑制剤であり、痙攣状態および高レベルのＨｃｙに関連付けられる精神変化が脳アデノシンレベルの低下によって媒介され得ると述べた。
Ｈｃｙは、神経毒性と脳の形態変化の両方に関連付けられる（全体が本願明細書に援用される、ヘインズワースら（Ｈａｉｎｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２０１６；１８６２：１００８－１０１７参照）。例えば、ラットおよびウサギにおける研究により、ニューロン損傷が、酸化ストレスの指標である、チオ酪酸反応性物質（ＴＢＡＲＳ）のＨｃｙ媒介増加によって引き起こされることが示された（共に全体が本願明細書に援用される、ステファネロら（Ｓｔｅｆａｎｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．）Ｍｅｔａｂ Ｂｒａｉｎ Ｄｉｓ ２００７；２２：１７２－１８２；トボレクら（Ｔｏｂｏｒｅｋ ｅｔ ａｌ．）Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １９９５；１１５：２１７－２２４参照）。経口投与Ｍｅｔ負荷後のヒトにおいても血漿ＴＢＡＲＳの同様の増加が観察された（全体が本願明細書に援用される、ドマガラら（Ｄｏｍａｇａｌａ ｅｔ ａｌ．）Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ １９９７；８７：４１１－４１６参照）。その上、上昇したＨｃｙレベルについてのマウスモデルにおける研究は、低下したＣｙｓレベルが低レベルのニューロングルタチオン、グルタミン酸、Ｃｙｓおよびグリシンから合成される重要な抗酸化剤をもたらすので、酸化ストレスによって引き起こされる細胞損傷がＣＢＳＤＨ患者で増強され得ることを示唆した（全体が本願明細書に援用される、ビビツキーら（Ｖｉｖｉｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ ＩｎｔｅｇｒＣｏｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２００４；２８７：Ｒ３９－Ｒ４６参照）。
ラット脳の左室へのインビボＨｃｙ注射は用量依存的ニューロン喪失を生成し（全体が本願明細書に援用される、イェガーネら（Ｙｅｇａｎｅｈ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２０１３；５０：５５１－５５７参照）、ラットの中脳被蓋ニューロンとＨｃｙのインキュベーションはより少なく、より短いドーパミン作動性神経突起につながった（全体が本願明細書に援用される、ハイダーら（Ｈｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ 補遺２００４；１－１３参照）。両研究では、Ｈｃｙの効果が、ＨｃｙとＮＭＤＡおよび代謝調節型グルタミン酸受容体のアンタゴニストの共投与によって鈍らせられ、Ｈｃｙ誘導ニューロン損傷についてのグルタミン酸受容体媒介経路を示唆した。この経路のさらなる証拠は、Ｈｃｙ投与がラット脳シナプトソームで用量依存的脂質過酸化につながった研究に由来する（全体が本願明細書に援用される、ハラ－プラドら（Ｊａｒａ－Ｐｒａｄｏ ｅｔ ａｌ．）Ｎｅｕｒｏｔｏｘ Ｒｅｓ ２００３；５：２３７－２４３参照）。もう一度、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストの投与によって効果が阻害された。
自発的活性胚性ラット皮質ニューロンにおける研究により、重度に上昇したＨｃｙの範囲より上のＨｃｙレベルが、ニューロンネットワーク活性の用量依存的抑制を引き起こすことが示された（全体が本願明細書に援用される、ゲルツら（Ｇｏｒｔｚ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ ２００４；２１８：１０９－１１４参照）このような過大なＨｃｙレベルはＣＢＳＤＨ患者で決して達しないので、この研究で観察される効果は臨床的に関連していなかった。しかしながら、ホモシステインスルフィン酸およびホモシステイン酸（上昇したＨｃｙレベルを有する患者でしばしば見られるＨｃｙの酸化形態）の控えめな上昇が同様の効果を有していた。各症例で、ニューラルネットワークに対する損傷が２－アミノ－５－ホスホノ吉草酸によって阻害され、ＮＭＤＡ受容体をこのＨｃｙによって誘導されるニューロン機能障害のメディエーターとして同様に関係付けている。これらの結果は、上昇したＨｃｙレベルに関連付けられるニューロン機能障害が、Ｈｃｙ自体ではなくＨｃｙの酸化形態によって引き起こされる可能性があることを示唆した。
マルファン症候群および他の結合組織障害を有する患者における精神遅滞、痙攣および他のＣＮＳ障害の非存在は、ＣＢＳＤＨ患者における神経障害が、フィブリリンの欠陥によってもコラーゲンの欠陥によっても引き起こされないことを示唆している（全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）硫黄転移の障害（Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｓｕｌｆｕｒａｔｉｏｎ）．スクリヴァー シーエル（Ｓｃｒｉｖｅｒ ＣＬ）、ボーデ エーエル（Ｂｅａｕｄｅｔ ＡＬ）、スライ ダブリューエス（Ｓｌｙ ＷＳ）、ヴァレ ディー（Ｖａｌｌｅ Ｄ）編 遺伝病の代謝および分子基礎（Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）．第７版 ニューヨーク：マグロウヒル（ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ）；２００１；１２７９－１３２７参照）。未処置ＣＢＳＤＨを有する患者では、上昇したＳＡＭレベルおよび低下したＳＡＨレベルが、ミエリン合成に要求されるメチル基転移反応を阻害して、さらなる神経損傷につながる（全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）硫黄転移の障害（Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｓｕｌｆｕｒａｔｉｏｎ）．スクリヴァー シーエル（Ｓｃｒｉｖｅｒ ＣＬ）、ボーデ エーエル（Ｂｅａｕｄｅｔ ＡＬ）、スライ ダブリューエス（Ｓｌｙ ＷＳ）、ヴァレ ディー（Ｖａｌｌｅ Ｄ）編 遺伝病の代謝および分子基礎（Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）．第７版 ニューヨーク：マグロウヒル（ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ）；２００１；１２７９－１３２７参照）。減少したミエリン合成は、増加した再メチル化速度により、ＣＢＳＤＨ患者における低いセリンレベルによっても引き起こされ得る（全体が本願明細書に援用される、オレンダックら（Ｏｒｅｎｄａｃ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ２００３；２６：７６１－７７３参照）。最後に、Ｈｃｙ代謝は、ノルエピネフリンおよびドーパミンの生成のためのメチル基を提供することによってモノアミンの合成において重要な役割を果たす（共に全体が本願明細書に援用される、メックら（Ｍｅｃｈ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２０１６；７７：６６８－６７１；フォルスタインら（Ｆｏｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２００７；１６４：８６１－８６７参照）。実際、「うつ病のホモシステイン仮説（ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）」（全体が本願明細書に援用される、フォルスタインら（Ｆｏｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２００７；１６４：８６１－８６７参照）は、上昇したＨｃｙレベルにより結果として生じる、低レベルのノルエピネフリンおよびドーパミンが、うつ病主因であると述べている。
ラット脳生検の電子顕微鏡法は、高Ｈｃｙ食を８週間与えられた動物における脳血管構造変更を示した。これらの変更は、高血漿ｔＨｃｙレベルに関連付けられた（全体が本願明細書に援用される、リーら（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｎｕｔｒ ２００５；１３５：５４４－５４８参照）。さらに８週間の食事性葉酸の消費によって、血漿ｔＨｃｙレベルが正常レベルに低下し、損傷血管の発生率が有意に低下した。このことは、葉酸補充を使用したＨｃｙ低下が、実験的に誘導された上昇したＨｃｙレベルの血管内皮に対する有害な効果を減少させ得ることを示唆した。
少なくとも１つのＭＴＨＦＲ多型による、大うつ病性障害（ＭＤＤ）およびＣＢＳＤＨを有する成人（Ｎ＝３３０）での単剤療法としての還元型Ｂビタミンの有効性および安全性を評定するように設計された研究は、還元型Ｂビタミンの組み合わせによる処置が１３１人の処置患者（８２．４％）でｔＨｃｙレベルを有意に低下させる（この亜群における平均低下は２５％であった；ｐ＜０．００１）が、プラセボ処置患者はｔＨｃｙレベルの小さな上昇を実証することを見出した（全体が本願明細書に援用される、メックら（Ｍｅｃｈ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２０１６；７７：６６８－６７１参照）。処置患者は、平均で、８週目までにモンゴメリー・アスベルグうつ病評価尺度（ＭＡＤＲＳ）における１２ポイントの減少を有し、４２％が完全緩解を達成した（ｐ＜０．００１）。さらなる臨床的改善は、応答者の大部分でｔＨｃｙレベルの有意な低下と相関していた。この研究はＣＢＳＤＨ患者で実行されなかったが、うつ病を有する個体におけるＨｃｙ低下についての明確な利益を実証し、「うつ病のＨｃｙ仮説（Ｈｃｙ ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）」（全体が本願明細書に援用される、フォルスタインら（Ｆｏｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２００７；１６４：８６１－８６７参照）を支持した。
ＣＢＳＤＨに関連付けられる精神医学症状を有する個体におけるＨｃｙ低下療法の利益は、１２人の遅く診断された患者の研究において最初に実証された（全体が本願明細書に援用される、グローブ エイチ（Ｇｒｏｂｅ Ｈ）．Ｅｕｒ Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ １９８０；１３５：１９９－２０３参照）。これらの患者のうちの３人は、決して有効に処置されず、深刻な心理学的障害を有し、早死にした。残りの８人の患者は１～２６歳の範囲であり（平均１３歳）、全員が被刺激性、ＡＤＨＤ、アパシーおよび精神病を含む精神医学症状を有していた。２～９年間にわたるピリドキシンまたは補充Ｌ－システインを用いた低Ｍｅｔ食による処置は、生化学的正常化と相関した、行動および知的発達の印象的な改善に関連付けられた。著者らは、研究で観察されたＣＢＳＤＨに関連付けられた続発症の可逆性および改善のために、診断時および処置前の年齢にかかわらず、全ての患者を処置する必要性を力説した。
アイルランドのスクリーニングプログラムからのさらに最近のデータを使用して、２３人のＣＢＳＤＨを有するピリドキシン非応答性個体の精神能力（３３９患者－処置年）を１０人の未罹患同胞対照の精神能力と比較した（全体が本願明細書に援用される、ヤップら（Ｙａｐ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ２００１；２４：４３７－４４７参照）。識別された２３人の患者のうち、１９人が、ＮＢＳを通してＣＢＳＤＨと診断され、人生の早い段階で処置され（生後６週間以内）、２人が後に検出され（年齢２．２歳および２．９歳）、２人が評価時点で未処置であった。全ての患者を、必要に応じて、Ｍｅｔを含まない、システイン補充合成アミノ酸混合物、ビタミンＢ１２および葉酸補充物で処置した。食事の遵守が不足した早期処置患者および後に検出されたＣＢＳＤＨを有する全ての患者で、処置の補助として最後の５年でベタインを使用した。
全体として、早期処置群（平均年齢１４．４歳；４．４～２４．９の範囲）の１９人の患者のうちの１３人は、処置を遵守し（１１μｍｏｌ／Ｌ未満の生涯血漿ｆＨｃｙ中央値によって定義される）、合併症を有さなかったが、遵守が不足していた残りの６人（平均年齢１９．９歳；１３．８～２５．５の範囲）は、合併症を発症した。平均全検査ＩＱ（ＦＩＱ）は、遵守が不足している群の８０．８（４０～１０３の範囲）と比較して、遵守した群で１０５．８（８４～１２０の範囲）であった。平均年齢１９．４歳（９．７～３２．９の範囲）の対照群（ｎ＝１０）は、平均ＦＩＱが１０２（７６～１１６の範囲）であった。１８．９歳および１８．８歳の、２人の後に検出された患者はそれぞれ、ＦＩＱが８０および１０２であり、２２．４歳および１１．７歳の、２人の未処置患者はそれぞれ、ＦＩＱが５２および５３であった。罹患同胞で有意に高かったＦＩＱを除いて（ｐ＝０．０３９７）、遵守した早期処置個体とその未罹患同胞（対照）との間に有意な差はなかった。比較的少数にもかかわらず、これらの結果は、優れた生化学的制御による早期処置が精神遅滞を予防することを示唆している。
カタールでの３２症例のＣＢＳＤＨおよび２５例の同胞対照における神経発生的、教育的および認知的転帰に関して報告する症例対照研究でも同様の結果が得られた（全体が本願明細書に援用される、エル・バシールら（Ｅｌ Ｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．）ＪＩＭＤ Ｒｅｐ ２０１５；２１：８９－９５参照）。この研究における対象の平均年齢は１１．２歳（０．６～２９の範囲）であり、５６％が男性であった。未罹患同胞と比較して、罹患個体は、低い全ＩＱ（特に短期記憶、定量推理および視覚－空間領域に関して）を有し、有意な数の青年および成人症例が、医学併存症ならびに行動および感情面の問題を有していた。これらのうち、ＣＢＳＤＨの９症例（２８％）がＮＢＳによって診断され、生後１か月で処置された。残りは１４～２４０月齢の間に診断された。おそらく人生の早い段階での食事および投薬の良好な遵守のために、臨床的に診断された者よりもＮＢＳを通して診断された者で処置時ｔＨｃｙおよびＭｅｔレベルが有意に優れていた。早期診断患者と臨床的に診断された患者との間でＩＱの有意な差異が観察された。言語領域、特殊学校への出席およびクラスの特別なサポートへのアクセスにおける差異は群間で統計学的に有意でなかったが、「臨床的に検出された」群は明らかにより多くの困難を報告した。
ここで研究された患者の数は少ないが、出生時に診断された小児と、幼児として診断された小児との間で注目すべき差異が見られる。臨床的に診断された群における１１５μｍｏｌ／Ｌの平均ｔＨｃｙレベルは、不足しているな臨床転帰および非常に低いＩＱと関連付けられた。
ＣＢＳＤＨ患者における精神病理学でのＨｃｙ低下処置の利益のさらなる証拠は、１９６３年からボストン小児病院で呈示している全ＨＣＵ患者からのデータの後ろ向き診療録レビューに由来する（エム アルムクビルら（Ｍ．Ａｌｍｕｑｂｉｌ ｅｔ ａｌ．）の好意による未公開データ）。全体として、１９人のＨＣＵ患者が識別され、これらのうちの３人が、ＣＢＳＤＨに加えておそらくメチルマロン酸血症（同様に心理学的欠陥に関連付けられる）の交絡させる存在のために、分析から除外された。残りの１６人の患者のうち、７人（６人がＣＢＳＤＨを有し、１人がコバラミン（Ｃｂｌ）欠損を有する）が、早期処置を良好に遵守した（４人は食事のみ、２人は食事＋ベタイン、１人はＣｂｌ）。これらの患者のうちの６人は、軽度の認知欠損以外の明らかな精神医学症状を有さなかった。対照的に、９人の患者（７人がピリドキシン非応答性ＣＢＳＤＨを有し、２人がＣｂｌＧ欠損を有する）が、処置の遵守が不足しているか、または変動的であった（２人がベタインおよび食事、１人が食事のみ、３人がＢビタミン、２人が葉酸およびベタイン）。ＣＢＳＤＨを有し、遵守が不足している７人の患者全員が、うつ病（ｎ＝４）、妄想経験（ｎ＝２）、妄想症および妄想精神病（ｎ＝１）、不安および気分調節不全（ｎ＝１）ならびに優れた代謝制御により改善したＡＤＨＤ（ｎ＝１）を含む、精神医学的な問題を有していた。２つのＣｂｌＧ症例は著しく不安または興奮型であった。年齢、性別および認知レベルは、精神医学的罹患個体と非罹患個体との間で有意に差別化できるようには見えなかった。これらの結果は、優れた代謝制御（Ｈｃｙおよび／またはＭｅｔ低下）が、ＣＢＳＤＨ患者において精神医学および行動状態の発生を遅延させ、おそらくは予防する潜在力を有することを示唆している。しかしながら、この研究は、制御が不足しているＣＢＳＤＨが精神病理学につながるかどうか、または精神病理学との併存症自体が処置転帰の優れた遵守を妨げるかどうかを確認はしなかった。
上昇したＨｃｙレベルと、精神遅滞、神経変性疾患、発作、ジストニア、精神病、認知障害、認知症およびうつ病を含むＣＮＳ症状との間の関連付けは、ＣＢＳＤＨを有するおよび有さない個体でよく記録されている（それぞれ全体が本明細書に援用される、非特許文献１２；アボットら（Ａｂｂｏｔｔ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ １９８７；２６：９５９－９６９；マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）硫黄転移の障害（Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｓｕｌｆｕｒａｔｉｏｎ）．スクリヴァー シーエル（Ｓｃｒｉｖｅｒ ＣＬ）、ボーデ エーエル（Ｂｅａｕｄｅｔ ＡＬ）、スライ ダブリューエス（Ｓｌｙ ＷＳ）、ヴァレ ディー（Ｖａｌｌｅ Ｄ）編 遺伝病の代謝および分子基礎（Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）．第７版 ニューヨーク：マグロウヒル（ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ）；２００１；１２７９－１３２７；イダルゴら（Ｈｉｄａｌｇｏ ｅｔ ａｌ．）Ｅｕｒ Ｃｈｉｌｄ Ａｄｏｌｅｓｃ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２０１４；２３：２３５－２３８；シムケら（Ｓｃｈｉｍｋｅ ｅｔ ａｌ．）ＪＡＭＡ １９６５；１９３：７１１－７１９；スミスら（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１０；５：ｅ１２２４４；セシャドリら（Ｓｅｓｈａｄｒｉ ｅｔ ａｌ．）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００２；３４６：４７６－４８３；ボッティグリエリら（Ｂｏｔｔｉｇｌｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２０００；６９：２２８－２３２；ビェランら（Ｂｊｅｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｃｈ Ｇｅｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２００３；６０：６１８－６２６；トルムネンら（Ｔｏｌｍｕｎｅｎ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ２００４；８０：１５７４－１５７８；カエサルら（Ｋａｅｓｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １９６９；３２：８８－９３；ゴリムベットら（Ｇｏｌｉｍｂｅｔ ｅｔ ａｌ．）Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ Ｒｅｓ ２００９；１７０：１６８－１７１；クラークら（Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．）Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ １９９８；５５：１４４９－１４５５；シンクレアら（Ｓｉｎｃｌａｉｒ ｅｔ ａｌ．）Ｍｏｖ Ｄｉｓｏｒｄ ２００６；２１：１７８０－１７８２；ペルモダ－オシップら（Ｐｅｒｍｏｄａ－Ｏｓｉｐ ｅｔ ａｌ．）Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１４；６９：１０７－１１１；オリベイラら（Ｏｌｉｖｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．）ＢＭＪ Ｃａｓｅ Ｒｅｐ ２０１６；２０１６；トロエンら（Ｔｒｏｅｎ ｅｔ ａｌ．）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２００８；１０５：１２４７４－１２４７９；サダスら（Ｓｕｄｄｕｔｈ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ ２０１３；３３：７０８－７１５；ヘインズワースら（Ｈａｉｎｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２０１６；１８６２：１００８－１０１７；ヘルマンら（Ｈｅｒｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｌａｂ Ｍｅｄ ２０１１；４９：４３５－４４１；キムら（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｎｕｔｒ ２００７；１３７：２０９３－２０９７；セルフーブら（Ｓｅｌｈｕｂ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ２０００；７１：６１４Ｓ－６２０Ｓ；マッカドンら（ＭｃＣａｄｄｏｎ ｅｔ ａｌ．）Ｄｅｍｅｎｔ Ｇｅｒｉａｔｒ Ｃｏｇｎ Ｄｉｓｏｒｄ ２００１；１２：３０９－３１３；スモールウッドら（Ｓｍａｌｌｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．）Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ａｐｐｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ２０１２；３８：３３７－３４３；ベイドゥンら（Ｂｅｙｄｏｕｎ ｅｔ ａｌ．）ＢＭＣ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ２０１４；１４：６４３；ゲルツら（Ｇｏｒｔｚ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ ２００４；２１８：１０９－１１４；Ｈｅａｌｔｈ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｏ．ビタミンＢ１２および認知機能：証拠に基づく分析（Ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ１２ ａｎｄ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ： ａｎ ｅｖｉｄｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ．）Ｏｎｔ．Ｈｅａｌｔｈ Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｓｓｅｓｓ．Ｓｅｒ．１３（２３）、１ｅ４５．２０１３．Ｒｅｆ Ｔｙｐｅ：オンラインソース；サラグレら（Ｓａｌａｇｒｅ ｅｔ ａｌ．）Ｅｕｒ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２０１７；４３：８１－９１参照）。Ｈｃｙレベルが上昇した個体におけるＣＮＳ障害につながる機序は、ｔＨｃｙ媒介ニューロン損傷（それぞれ全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）硫黄転移の障害（Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｓｕｌｆｕｒａｔｉｏｎ）．スクリヴァー シーエル（Ｓｃｒｉｖｅｒ ＣＬ）、ボーデ エーエル（Ｂｅａｕｄｅｔ ＡＬ）、スライ ダブリューエス（Ｓｌｙ ＷＳ）、ヴァレ ディー（Ｖａｌｌｅ Ｄ）編 遺伝病の代謝および分子基礎（Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）．第７版 ニューヨーク：マグロウヒル（ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ）；２００１；１２７９－１３２７；ヘインズワースら（Ｈａｉｎｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２０１６；１８６２：１００８－１０１７；ステファネロら（Ｓｔｅｆａｎｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．）Ｍｅｔａｂ Ｂｒａｉｎ Ｄｉｓ ２００７；２２：１７２－１８２；トボレクら（Ｔｏｂｏｒｅｋ ｅｔ ａｌ．）Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １９９５；１１５：２１７－２２４参照）、Ｈｃｙ媒介酸化ストレスによって引き起こされる血管内皮の損傷（全体が本願明細書に援用される、ビビツキーら（Ｖｉｖｉｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ ＩｎｔｅｇｒＣｏｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２００４；２８７：Ｒ３９－Ｒ４６参照）、ニューロン喪失（共に全体が本願明細書に援用される、イェガーネら（Ｙｅｇａｎｅｈ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２０１３；５０：５５１－５５７；ハイダーら（Ｈｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ 補遺２００４；１－１３参照）およびニューラルネットワーク活性の減弱（全体が本願明細書に援用される、ゲルツら（Ｇｏｒｔｚ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ ２００４；２１８：１０９－１１４参照）に関与すると考えられている。うつ病および痙攣は、少なくとも部分的に、Ｈｃｙによって媒介される脳アデノシンレベルの低下とその後のノルエピネフリンおよびドーパミンのレベルの低下によって引き起こされると考えられている（それぞれ全体が本願明細書に援用される、メックら（Ｍｅｃｈ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２０１６；７７：６６８－６７１；ドマガラら（Ｄｏｍａｇａｌａ ｅｔ ａｌ．）Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ １９９７；８７：４１１－４１６；ビビツキーら（Ｖｉｖｉｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ ＩｎｔｅｇｒＣｏｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２００４；２８７：Ｒ３９－Ｒ４６；フォルスタインら（Ｆｏｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．）Ａｍ Ｊ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２００７；１６４：８６１－８６７参照）。
ＣＢＳＤＨの動物モデル（全体が本願明細書に援用される、リーら（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｎｕｔｒ ２００５；１３５：５４４－５４８参照）とＣＢＳＤＨ患者（それぞれ全体が本願明細書に援用される、エル・バシールら（Ｅｌ Ｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．）ＪＩＭＤ Ｒｅｐ ２０１５；２１：８９－９５；ヤップら（Ｙａｐ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ２００１；２４：４３７－４４７；メックら（Ｍｅｃｈ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２０１６；７７：６６８－６７１；グローブ エイチ（Ｇｒｏｂｅ Ｈ．）Ｅｕｒ Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ １９８０；１３５：１９９－２０３参照）の両方での多数の研究により、低Ｍｅｔ食、葉酸／Ｂビタミン補充および／またはピリドキシン／ベタイン療法によって誘導される早期のＨｃｙレベルの低下が、様々な神経障害の進行を予防し、時々、逆転させることができることが示された。さらなる証拠は、Ｈｃｙレベルの有意な低下、さらには正常化がＣＮＳ転帰の完全なまたは部分的な矯正をもたらした、ＣＢＳＤＨ患者における一連の６症例研究によって提供される（それぞれ全体が本願明細書に援用される、ヤップら（Ｙａｐ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ２００１；２４：４３７－４４７；ブレントンら（Ｂｒｅｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１４；２９：８８－９２；レザザデら（Ｒｅｚａｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．）Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ Ｏｐｅｎ ２０１４；１：２３２９０４８Ｘ１４５４５８７０；カエサルら（Ｋａｅｓｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １９６９；３２：８８－９３；コラフランセスコら（Ｃｏｌａｆｒａｎｃｅｓｃｏ ｅｔ ａｌ．）Ｅｕｒ Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ ２０１５；１７４：１２６３－１２６６；横井ら（Ｙｏｋｏｉ ｅｔ ａｌ．）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｔ ２００８；５０：６９４－６９５；リら（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．）Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １９９９；３１：２２１－２２４参照）。
これらの所見は、ＣＢＳＤＨ患者および一般集団におけるＨｃｙレベルと増加したＣＮＳ障害のリスクとの間の強力な相関を実証している。早期Ｈｃｙ低下療法は、早期発生ＣＢＳＤＨを有する小児の正常な発達および晩年にＣＢＳＤＨと診断された患者におけるＣＮＳ障害の矯正または改善に必須である。
ＩＸ．定義
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上別段の明確な指示がない限り、複数の言及を含む。
値の範囲が提供される場合、範囲の上限と下限との間の各介在値およびその明言される範囲中の任意の他の明言される値または介在値が本開示内に包含され、具体的に開示されることが意図される。例えば、１μｍ～８μｍの範囲が明言される場合、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍおよび７μｍ、ならびに１μｍ以上の値の範囲および８μｍ以下の値の範囲も明示的に開示されていることが意図されている。
本明細書で使用される場合、「共投与される」または「共投与」は、医薬組成物を含む２種以上の治療用構成成分の投与を意味する。
本明細書で使用される場合、「医薬品」は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＰＥＧ化ヒト切断型ＣＢＳタンパク質（例えば、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ）の原薬を含む医薬組成物の剤形を指す。
本明細書で使用される場合、「原薬」は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＰＥＧ化ＣＢＳタンパク質（例えば、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ）を指す。
本明細書で使用される場合、「負の臨床転帰」は、疾患、障害または状態により結果として生じる望ましくない表現型転帰を指す。
本明細書で使用される場合、「組換え」は、例えば細胞、核酸、ポリペプチド、発現カセットまたはベクターへの言及で使用される場合、新たな部分の導入もしくは既存の部分の変更によって改変された、またはこれと同一であるが、合成材料から生成されるもしくは合成材料に由来する材料、または自然もしくは天然形態の材料に対応する材料を指す。例えば、組換え細胞は、天然（非組換え）形態の細胞内で見られない遺伝子（すなわち、「外因性核酸」）を発現する、または異なるレベルで発現される、典型的には低発現または全く発現されない天然遺伝子を発現する。
組換え技術は、例えば、発現ベクターなどの発現系に挿入するために、タンパク質をコードするｃＤＮＡまたはアンチセンス配列などの組換え核酸の使用を含むことができる；得られた構築物が細胞に導入され、この細胞が核酸および適切な場合、タンパク質を発現する。組換え技術はまた、核酸と、異なる源のコード配列またはプロモーター配列の、融合タンパク質の発現、タンパク質の構成的発現、またはタンパク質の誘導性発現のための１つの発現カセットまたはベクターへのライゲーションを包含する。
本明細書で使用される場合、「対象」、「個体」または「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳動物を指す。哺乳動物には、それだけに限らないが、ヒトが含まれる。
本明細書で使用される場合、「関連付けられる」は、疾患、状態または表現型の発症または顕在化との一致を指す。関連付けは、それだけに限らないが、その変更が種々の疾患および状態の基礎を提供し得るハウスキーピング機能を担う遺伝子、特定の疾患、状態または表現型に関与する経路の一部であるもの、ならびに疾患、状態または表現型の顕在化に間接的に寄与するものにより得る。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される賦形剤」または「薬学的に許容される担体」は、場合により本開示の組成物に含まれ得る、患者に対する有意な有害な毒物学的効果を引き起こさない賦形剤を指す。特に、本例では、これが、対象に対する有意な有害な毒物学的効果なしに、活性化合物（ここではＰＥＧ化ｈｔＣＢＳまたは「２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ」）と関連して哺乳動物対象の体に入れられ得る賦形剤を指す。
本明細書で使用される場合、「アジュバント」、「希釈剤」または「担体」という用語は、治療剤を送達するための担体として使用され、対象、例えば哺乳動物への投与に適した、あるいはその取り扱いもしくは貯蔵特性を改善する、または経口投与に適したカプセル剤もしくは錠剤などの離散的物品への組成物の投与単位の形成を可能にするもしくは容易にするために医薬組成物に添加される、それ自体は治療剤ではない任意の物質を意味する。「アジュバント」、「希釈剤」または「担体」という用語は、その用語が本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される賦形剤」、「ビヒクル」、「溶媒」などを含む「賦形剤」を包含する。賦形剤およびビヒクルは、非毒性であり、有害に組成物の他の構成成分と相互作用しない、当技術分野で公知の任意のこのような材料、例えば任意の液体、ゲル、溶媒、液体希釈剤、安定剤などを含む。投与は、経口投与、吸入、経腸投与、給餌、または静脈内注射による接種を意味することができる。賦形剤は、標準的な医薬賦形剤を含み得、ヒトおよび／または動物消費用の食品および飲料、飼料または餌配合物あるいは他の食糧を調製するために使用され得る任意の構成成分も含み得る。
本明細書で使用される場合、「薬物」または「薬理学的活性剤」または任意の他の同様の用語は、それだけに限らないが、（１）生物に対する予防効果を有し、感染症を予防するなど望ましくない生物学的効果を予防する、（２）疾患によって引き起こされる状態を緩和する、例えば疾患の結果として引き起こされる疼痛もしくは炎症を緩和する、および／または（３）疾患を緩和する、減少させるまたは生物から完全に排除することを含み得る、所望の生物学的または薬理学的効果を誘導する、当技術分野で以前から公知の方法および／または本開示で教示される方法による投与に適した、ペプチドを含む、任意の化学的もしくは生物学的材料または化合物を意味する。効果は局所的、例えば局所的麻酔効果を提供する、または全身的であり得る。本開示は、新規な浸透物も新規なクラスの活性剤も描いていない。むしろ、本開示は、先行技術に存在する、または活性剤として後に確立され得、本開示による送達に適した薬剤または浸透物の送達様式に限定される。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特に所与の量への言及において、＋または－５％の偏差を包含することを意味している。
本明細書で使用される場合、「薬理学的有効量」または「治療有効量」という用語は、本組成物に関する場合、非毒性であるが、処置される対象において血流中もしくは作用部位で（例えば細胞内）所望のレベルを提供する、および／またはホモシスチン尿症の顕在化の改良などの所望の生理学的、生物物理学的、生化学的、薬理学的もしくは治療的応答を提供するのに十分な活性剤（または活性剤を含有する組成物）の量を指す。要求される正確な量は対象ごとに変動し、活性剤、組成物の活性、採用される送達デバイス、組成物の物理的特性、意図される患者使用（すなわち、１日当たりに投与される投与数）、ならびに対象の種、年齢および全身状態などの患者の考慮事項、処置される状態の重症度、対象によって服用される追加の薬物、投与様式などの多数の因子に依存する。これらの因子および考慮事項は、本明細書で提供される情報に基づいて、当業者によって容易に決定され得る。任意の個々の症例の適正な「有効」量は、本明細書で提供される情報に基づいて、日常的な実験を使用して、当業者によって決定され得る。
本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態であり得、メッセンジャーＲＮＡ、合成ＲＮＡおよびＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ならびにゲノムＤＮＡを含み得る。ＤＮＡは二本鎖であっても一本鎖であってもよく、一本鎖である場合、コード鎖であっても非コード（アンチセンス、相補）鎖であってもよい。
本明細書で使用される場合、「変異体」は、グリコシル化、タンパク質安定化および／またはリガンド結合に関する特性または機能を変更させるように設計または操作された変異タンパク質である。
本明細書で使用される場合、所与の細胞、ポリペプチド、核酸、形質または表現型に関する「天然」または「野生型」という用語は、典型的に自然に見られる形態を指す。
本明細書で使用される場合、「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」という用語は、その慣用的な意味を有し、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、脂質修飾、ミリスチル化、ユビキチン化等）にかかわらず、アミド結合によって共有結合的に連結された少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを表すために互換的に使用される。さらに、本明細書に記載されるポリペプチドは、特定の長さに限定されない。Ｄ－およびＬ－アミノ酸、ならびにＤ－およびＬ－アミノ酸の混合物がこの定義に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに当技術分野で公知の他の修飾（天然に存在するものと天然に存在しないものの両方）を指さない、またはこれを除外する。ポリペプチドはタンパク質全体であっても、その部分配列であってもよい。ポリペプチドはまた、エピトープ、すなわちポリペプチドの免疫原性特性を実質的に担い、免疫応答を誘起することができる抗原決定基を備えるアミノ酸配列を指し得る。
本明細書で使用される場合、「～に対応する位置」などは、別の参照核酸分子またはタンパク質における位置に対する核酸分子またはタンパク質における目的の位置（すなわち、塩基番号または残基番号）を指す。対応する位置は、例えば配列間の同一性が９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超または９９％超となるように、合致するヌクレオチドまたは残基の数を最大化するように配列を比較および整列することによって決定することができる。次いで、目的の位置に、参照核酸分子で割り当てられる番号を受け取る。例えば、遺伝子Ｘにおける特定の多型が配列番号Ｘのヌクレオチド２０７３で起こる場合、別の対立遺伝子または単離物の対応するヌクレオチドを識別するために、配列が割り当てられ、次いで、２０７３に並ぶ位置が識別される。様々な対立遺伝子が異なる長さであり得るので、２０７３を指定する位置は、ヌクレオチド２０７３ではない場合があるが、代わりに、参照配列における位置に「対応する」位置である。
本明細書で使用される場合、「長期投与」という用語は、６週間以上の期間にわたる、ＰＥＧ部分にコンジュゲートしたＣＢＳ酵素、ｈｔＣＢＳまたはｈｔＣＢＳ変異体（例えば、Ｃ１５Ｓ変異を有する）の投与を指す。
本明細書で使用される場合、「連続投与」という用語は、皮下注射または埋め込み型浸透圧ポンプを介した、試験の経過全体を通したＰＥＧ部分にコンジュゲートしたＣＢＳ酵素、ｈｔＣＢＳまたはｈｔＣＢＳ変異体（例えば、Ｃ１５Ｓ変異を有する）の繰り返される投与を指す。
システインからセリンへのアミノ酸１５位の変異を有するＰＥＧ化ヒト切断型ＣＢＳタンパク質を含む、本明細書に記載される医薬品を用いた酵素療法（ＥＴ）を通したホモシスチン尿症を処置する方法が本明細書に記載される。
本開示の１つまたは複数の実施形態の詳細は、以下の付属の説明に明らかにされる。本明細書に記載されるものと類似のまたは等価な任意の材料および方法を本開示の実施または検査で使用することができるが、好ましい材料および方法をここで記載する。本開示の他の特徴、目的および利点は説明から明らかになるであろう。説明では、単数形が、文脈が別段の指示を明確にしない限り、複数形を含む。特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合は、本説明が優先する。
本開示を以下の非限定的な実施例によってさらに例示する。
実施例１．実験プロトコール
Ａ．発酵
切断型ヒトＣＢＳをコードする配列を持つ発現ベクターをＢ１－２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌に形質転換させ、カナマイシン耐性クローンの細菌を、３０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む５ｍｌのルリア－ベルターニ（ＬＢ）培地中、２７５ｒｐｍの回転振盪機において３７℃で一晩増殖させた。１ｍＬの一晩培養物を、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む１００ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地に添加し、一晩増殖させた。次いで、１０ｍｌのプレ培養物を、０．００１％のチアミン－ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．００２５％のピリドキシン－ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．３ｍＭ δ－ＡＬＡ ｐＨ８．０、１５０μＭ塩化第二鉄、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する１ＬのＴＢ培地に添加した。次いで、ＯＤ６００が約０．６～０．７の値に達するまで、培養物を２７５ｒｐｍの回転振盪機において３０℃で増殖させ、１ｍＭ ＩＰＴＧの添加によってタンパク質発現を誘導した。発酵をさらに１６時間続けた。細胞を１０分間の４℃で６０００相対遠心力（ｒｃｆ）の遠心分離によって収穫し、氷冷０．９％ＮａＣｌで洗浄し、上記のように再遠心分離し、－８０℃で凍結した。次いで、溶解緩衝液（２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２、４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＰＬＰ）を細胞ペレットに添加し、細胞ペレットをＤｏｕｎｃｅホモジナイザーでホモジナイズし、リゾチーム（最終２ｍｇ／ｍＬ）で処置し、揺動プラットフォームにおいて４℃で１時間インキュベートし、超音波処理して粘度を低下させ、５３０００ｒｃｆで遠心分離した。次いで、可溶性画分を備える上清を－８０℃で貯蔵した。
ＣＢＳの高レベル発現のための発酵プロセス、５－アミノレブリン酸（ＡＬＡ）、チアミン（ビタミンＢ１）、ピリドキシンＨＣｌおよび／または塩化第二鉄などの培地補充物、Ｃ源の量および添加プロファイル、ならびにそれらの開始および供給条件、温度、ｐＨ、ならびに誘導条件（誘導物質濃度および誘導期間の長さ）を確立するよう最適化およびスケールアップ計画を設計した。
３０℃で２４時間の誘導期間中、合計０．０５ｇ／Ｌ Ｂ６および０．５ｇ／Ｌ ＡＬＡを補充した、最小塩培地（Ｃ源：グリセロール）で、最高の細胞密度および最良の発現レベルが達成された。
発酵の最後（ＥＯＦ）に、おおよそ１１０±１０の６００ｎｍでの細胞密度（ＯＤ６００）が達成され、これはおおよそ９０±１０ｇ／Ｌの湿潤重量に対応していた。発酵プロセスのＣＢＳ力価は、放射性および比色活性アッセイによって決定した場合、おおよそ２．５～３．０ｇ ＣＢＳ／Ｌであった。
Ｂ．精製
少なくとも３つのクロマトグラフィー工程が要求されると仮定すると、細胞溶解物から精製された酵素の全体的な酵素活性回収標的は３０％であった。開発されたプロセスを６０ｍＬ捕捉カラムのスケールで評定した。
１．捕捉工程
陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）を組換えＣＢＳの生成における第１の捕捉工程として使用した。次いで、溶離液を、中性付近のｐＨでＤＥＡＥ－セファロース樹脂への捕捉、引き続いてＫＨ２ＰＯ４の線形勾配によってさらなる精製のために洗練した。ＤＥＡＥ－セファロースは弱交換体であり、これは系の電荷が周囲のｐＨに依存していたことを意味する。それによって、ｐＨは樹脂の動的結合容量（ＤＢＣ）との密接な関係を有する。結合ｐＨを６．４に低下させても捕捉工程の性能は低下しなかった。細胞ペーストの希釈が可溶化のために５倍体積の破壊緩衝液を使用した場合、ローディング時間は約３０分間であった。
洗浄を、決定された７ｇ／Ｌ ＣＢＳ（樹脂１Ｌ当たりおおよそ３５ｇの全タンパク質のＤＢＣに等価である）の最大に近いローディング容量で、１０カラム体積について実施した。１２０ｍＭ ＮａＣｌの存在下、１６ｍＳ／ｃｍの溶出導電率条件下で溶出を実施した。
細胞抽出物を狭い時間枠内でローディングする限り、回収は約９０％であることが観察された。細胞抽出物内のＣＢＳ力価に応じて、この捕捉工程によっておおよそ３．５の精製係数に達した。
２．固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）
亜鉛（Ｚｎ）イオンを用いる、Ｃｏ２＋固定化金属アフィニティークロマトグラフィーとも呼ばれる、ＩＭＡＣは、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）由来のＣＢＳ間の直交分離のために結合選択性を使用する。約２．５の精製係数が観察された。
溶出工程は、ＣＢＳ画分の脱塩と組み合わせて、１１ｍＭイミダゾールを含んでいた。塩化ナトリウム濃度を、溶出緩衝液内で４００ｍＭ（ローディング／洗浄）から５０ｍＭまで低下させた。導電率が溶出挙動自体に大きく影響することが小規模スクリーニングで示され得る。例えば、イミダゾールを含まない、純水のみによって、ＣＢＳを溶出することが可能であった。溶出緩衝液内の塩化ナトリウムの量を増加させることによって、ＣＢＳの安定性が増加した。１５０ｍＭ塩化ナトリウムで、溶出挙動はわずかに変化したにすぎなかった。
緩衝系としてＨＥＰＥＳを使用して、１２～１５ｇ／ＬのＤＢＣを測定することができた。さらに加えて、試料の安定性が沈殿について増加しただけでなく、分解が減少した。ＥＤＴＡの添加によって、ここで使用されているリン酸緩衝液系と対照的に、ＨＥＰＥＳ緩衝液を使用することによって、分解を止めた。スケールアップにおいては、分解を阻害するＥＤＴＡおよび硫酸アンモニウムを、溶出が終了した後、直ちに添加した。さらに加えて、この状況でのインキュベーション時間を短く保つために、可能な限り速く以下の洗練を実施した。ＩＭＡＣ溶出プールを洗練の３時間以内に疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムにローディングした。
３．洗練工程
ＣＢＳ精製列の最後のクロマトグラフィー工程での分離は疎水性相互作用に基づいていた。主カラムは、溶出条件の差異によって、目的のタンパク質であるＣＢＳをＨＣＰの大半から分離した。ＨＣＰの大半は、ＣＢＳよりもＨＩＣに強力に結合し、ＣＢＳが残りのＨＣＰの大半よりも疎水性でないことを指し示している。
ＩＭＡＣと対照的に、ＨＩＣは低い結合分離（１０％未満）を有する。残りのＨＣＰ不純物の９０％超を溶出工程によってＨＩＣから分離した。ＨＩＣのＣＢＳ回収は約９５％であった。ＤＢＣは約１６ｇ／Ｌ～約１８ｇ／Ｌの間であった。この洗練工程の性能は極めて堅牢であった。溶出工程のｐＨは６～８の間であった。緩衝系（リン酸塩または２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）は測定可能な影響がなかった。
この洗練工程の精製係数は、最終クロマトグラフィー工程に典型的な、ローディング内の低い残りのＨＣＰ含有量のために、約１．１であった。全ての実施された下流生成プロセス間の最終ＣＢＳの純度は同様に高く、この洗練工程がローディング内の様々な程度の不純物を埋め合わせたことを指し示している。
プロセス工程を既存の装置に適合させ、生成のための１００Ｌ発酵体積への後のスケールアップを可能にするために、適合を実施することができる。信頼できる生成物品質を確保するために、ＥＤＴＡ（例えば、１０ｍＭ）をいくつかのプロセス工程に添加して、メタロプロテアーゼによって引き起こされる生成物分解を予防することができる。
Ｃ．ＰＥＧ化
ＰＥＧ化反応は、生成物によって誘導される阻害により二次反応のように振る舞っていた。ＮＨＳ－ＰＥＧでの加水分解は反応の阻害の理由になり得ず、４時間のＰＥＧ化後に最終的なＰＥＧ化パターンに達したので、残りの（約５０％）ＮＨＳ－ＰＥＧはまだ活性であることが観察された。興味深いことに、反応ミックスへのさらなるＮＨＳ－ＰＥＧの添加により、ＰＥＧ化パターンが増加した。ＤＭＳＯの非存在下、ＮＨＳ－ＰＥＧ対ＣＢＳ比を増加させることなく、所望のＰＥＧ化パターンを得るために、ＣＢＳ濃度は反応混合物内で８ｇ／Ｌとした。
Ｄ．データおよび統計分析
表４は、本明細書の実施例においてデータ分析に使用したソフトウェア、分析ツールおよびアルゴリズムの詳細を提供するものである。
Figure 2022539077000006
全てのクロマトグラムを分析者が見直して、クロマトグラフィーピーク形状およびピーク積分が満足のいくものであることを確保した。手動で移されたデータは、試験生データの一部であるソースデータに対してクロスチェックした。実行受け入れ基準は、較正標準、ＱＣおよびブランクＱＣからの結果に基づいて、分析前に設定した。データは平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として呈示する。
統計分析を、ＡＮＯＶＡ、引き続いてテューキーの多重比較検定を使用して実行して、有意性を決定した。
Ｅ．放射標識Ｓｅｒの変換に基づくＣＢＳ活性アッセイ
ＣＢＳは、セリン（Ｓｅｒ）がピリドキサール５’－リン酸（ＰＬＰ）依存的にＨｃｙと縮合してＣｔｈを形成するβ置換反応を触媒する。ＣＢＳ酵素の活性は、１４Ｃ標識Ｓｅｒを基質として使用する放射性同位体アッセイによって決定した：
１４Ｃ－Ｌ－Ｓｅｒ＋Ｌ－Ｈｃｙ→１４Ｃ－Ｌ－Ｃｔｈ＋Ｈ２Ｏ
希釈緩衝液（１ｍＭ ＤＴＴ、１０μＭ ＰＬＰおよび０．５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．６）中７μｌ（合計４２０ｎｇ）のアリコートの純粋な２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ、または７μｌの血漿（Ｄ２５およびＤ２７試料については希釈の必要性なし）を、８８μｌの反応混合物（１０ｍＭ Ｌ－Ｓｅｒ、０．５ｍＭ ＰＬＰ、０．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡおよび０．３μＣｉ Ｌ－［１４Ｃ（Ｕ）］－Ｓｅｒを含有する０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．６）に添加した。水浴中で５分間インキュベートすることによって、試料を３７℃に対して平衡化した。５μｌの０．２Ｍ Ｈｃｙ（最終濃度１０ｍＭ）で反応を開始し、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。
アッセイ開始および得られた混合物のサンプリングは、各反応時間が正確に３０分間となるように重ならないようにずらした。下降展開ペーパークロマトグラフィーを使用して、放射性生成物（Ｃｔｈ）を標識基質（Ｓｅｒ）から分離した。反応を中止するために、アッセイ混合物を氷浴中で冷却し、２０μｌのアリコートを分離のためにグレード３のＣＨＲクロマトグラフィーペーパー（ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）、ジーイーヘルスヘア社（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、米国ペンシルバニア州ピッツバーグ）にピペットでのせた。反応で形成された１４Ｃ－Ｃｔｈを、２－プロパノール：ギ酸：Ｈ２Ｏ（７５：５．７：１８．９ｖ／ｖ）による一晩の溶出によって１４Ｃ－Ｓｅｒから分離した。クロマトグラフィーペーパーの各面上の試料に沿ってＣｔｈおよびＳｅｒの混合物を含有する標準を流した。クロマトグラフィーペーパーを乾燥させ、標準レーンを酸性ニンヒドリン溶液で染色した。標識Ｃｔｈを含有する各試料レーンの区域を切除し、５ｍｌのＯｐｔｉ－ｆｌｏｕｒシンチレーションカクテル（パーキンエルマー社（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、米国マサチューセッツ州ノース・ビレリカ）に沈め、ベックマン社（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＬＳ－３８０１シンチレーションカウンターでカウントした。酵素を含まない試料をブランクとして使用してバックグラウンド放射活性を監視し、これを各試料のカウントから差し引いた。純粋な酵素対照については、ＣＢＳ比活性値を、ＣＢＳ１ｍｇ当たりの酵素単位（１μｍｏｌのＣｔｈ／ｈを生成する酵素の量）（すなわち、Ｕ／ｍｇタンパク質）として表現した。血漿試料については、活性値を、血漿１μｌ当たりのミリ単位（１ｎｍｏｌのＣｔｈ／ｈを生成する酵素の量）（すなわち、ｍＵ／μｌ血漿）として表現した。
２５ｍｇ／ｍｌ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）中２４．８～２６．７ｍｇ／ｍｌ）の公称範囲を有するこれらのストック溶液を、－８０℃で、アリコートで貯蔵した。各処置日に、ストック溶液をＰＢＳに希釈して１ｍｇ／ｍｌの最終濃度にすることによって、酵素の単回使用の新鮮な溶液を調製し、これらを７．５ｍｇ／ｋｇの用量でマウスに送達した。標的用量を投与するために注射される体積は、指し示される日の体重に基づいて計算した。その日の注射の完了時に残っている溶液は廃棄した。
Ｆ．ウエスタンブロット法
医薬品を４匹のＩ２７８Ｔ－／－マウスに注射し、最初の注射の２４時間後および最後の注射の７２時間後に血液を収集して、対照として役立てた。実施例５における全ての群のＤ２５およびＤ２７血漿試料をウエスタンブロット法によって分析して、潜在的インビボ脱ＰＥＧ化を検出した。血漿試料（１レーン当たり４μｌ）を勾配（４％～２０％）ＭｉｎｉＰｒｏｔｅａｎ ＴＧＸゲル（バイオ・ラッド社（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、米国カリフォルニア州ヘラクレス）にローディングし、変性、還元条件下、電気泳動によってタンパク質を分離した。分子量マーカー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄ、バイオ・ラッド社（Ｂｉｏ－Ｒａｄ））および各調製物からのアリコート（１レーン当たり１５０～５００ｎｇ）を同様に処理し、血漿試料に沿って電気泳動した。電気泳動分離後、タンパク質バンドをＰＶＤＦ膜（バイオ・ラッド社（ＢｉｏＲａｄ））に移した。個々の膜をブロッキング溶液（０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ中５％脱脂乳）中、４℃で一晩ブロッキングした。次いで、膜を洗浄し、ウサギポリクローナル抗ｈＣＢＳ抗体（オーファンテクノロジーズ社（Ｏｒｐｈａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＵＣＤ Ｋｒａｕｓ実験室バッチ番号Ｒ２Ｂ２、ブロッキング溶液に５０００倍希釈した抗血清）と１時間インキュベートした。次いで、膜を洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗ウサギＩｇＧ（ジャクソン・ラボラトリーズ社（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、米国メイン州バーハーバー、ブロッキング溶液に５０００倍希釈した）と３０分間インキュベートした。膜を洗浄した後、バンドを化学発光基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＷｅｓｔＰｉｃｏ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｈｉｅｎｔｉｆｉｃ）、米国マサチューセッツ州ウォルサム）と５分間インキュベートし、引き続いてクリアブルーＸ線フィルム（ＣＬ－Ｘｐｏｓｕｒｅ Ｆｉｌｍ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｈｉｅｎｔｉｆｉｃ））でのシグナル捕捉によって可視化した。展開したフィルムを、フラットベッドスキャナー（Ｐｅｒｆｅｃｔｉｏｎ Ｖ５５０ Ｐｈｏｔｏ Ｃｏｌｏｒ Ｓｃａｎｎｅｒ、エプソン社（Ｅｐｓｏｎ）、米国カリフォルニア州ロングビーチ）を使用してスキャンした。
Ｇ．化学物質
特に明言しない限り、全ての材料はシグマ社（Ｓｉｇｍａ）またはフィッシャーサイエンティフィック社（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から購入した。Ｌ－［Ｕ－１４Ｃ］－セリンはパーキンエルマーライフサイエンス社（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）から得た。
Ｈ．血漿収集および分析
顎下出血のための単回使用ランセットを、リチウムヘパリンを含むＢＤ Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ ＰＳＴチューブ（ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）、米国ニュージャージー州）への血液収集に使用した。次いで、チューブを１００００×ｇで５分間遠心分離し、引き続いて血漿を１．５ｍｌチューブに移し、－８０℃で貯蔵した。他の場所に記載される安定な同位体希釈液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によって血漿硫黄アミノ酸代謝産物を決定した。
Ｉ．動物試験
ヒトＩ２７８Ｔ変異体ＣＢＳ導入遺伝子を発現するマウスのＣＢＳノックアウト株（Ｉ２７８Ｔ ＣＢＳ－／－（Ｉ２７８Ｔ－／－）マウス）を使用して試験を実行した。Ｃ５７ＢＬ６バックグラウンドのヘテロ接合性トランスジェニックＩ２７８Ｔマウスのつがいは、ドクターウォーレンクルーガー（Ｄｒ．Ｗａｒｒｅｎ Ｋｒｕｇｅｒ）（Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、米国ペンシルパニア州フィラデルフィア）によって提供された。マウスは、マウスＣＢＳ遺伝子がノックダウンされており、またメタロチオネインプロモーターの制御下で、Ｉ２７８ＴヒトＣＢＳを発現する（全体が本願明細書に援用される、ワンら（Ｗａｎｇ， ｅｔ ａｌ．）（２００５）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １４，２２０１－２２０８参照）。変異体酵素は約２％～３％のＣＢＳ ＷＴ活性を有し、結果として導入遺伝子発現は、ＣＢＳノックアウトホモ接合性マウスで普段観察される新生仔致死を救済する（それぞれ全体が本願明細書に援用される、渡辺ら（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．）（１９９５）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ ９２、１５８５－１５８９；マクリーンら（Ｍａｃｌｅａｎ ｅｔ ａｌ．）（２０１０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ １０１、１６３－１７１参照）。特に指し示さない限り、動物を標準的な照射された押出し齧歯類用固形飼料で維持した（Ｔｅｋｌａｄ ２９２０Ｘ、エンヴィーゴ社（Ｅｎｖｉｇｏ）、米国インディアナ州インディアナポリス）。
ＣＢＳホモ接合性トランスジェニック試験動物を生成するために、ホモ接合性またはヘテロ接合性雄をヘテロ接合性雌と交配して、全てＩ２７８Ｔ導入遺伝子を発現する、他の遺伝子型の中でもＣＢＳホモ接合性（－／－）の仔を含有する同腹仔を生成した。つがいおよび新生仔マウスに亜鉛（飲料水中２５ｍＭ硫酸亜鉛）を提供して、導入遺伝子発現を誘導した。ホモ接合性株（Ｉ２７８Ｔ－／－）は、ホモシスチン尿症（ＨＣＵ）表現型を有し、ＣＢＳＤＨのモデルとして役立つが、得られる他の遺伝子型はこの試験では使用しなかった（全体が本願明細書に援用される、ワンら（Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．）（２００５）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １４、２２０１－２２０８参照）。
この試験で使用した全ての動物手順は、全ての連邦、州および地域の法、規制および政策に従う、コロラド大学デンバー校ＩＡＣＵＣによって見直され、承認された。コロラド大学デンバー校は、ＡＡＡＬＡＣ認定され（番号００２３５）、公衆衛生サービス保証され（番号Ａ ３２６９－０１）、ＵＳＤＡ認可された（番号８４－Ｒ－００５９）機関である。マウスが関与する手順は、ＩＡＣＵＣ承認プロトコール番号Ｂ－４９４１４（０３）１Ｅの下で実施された。
マウスを、全体が本願明細書に援用される、ワンら（Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．）（２００５）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １４、２２０１－２２０８に以前記載されたように、本発明者らの施設で繁殖させ、遺伝子型を同定した。つがいを押出し標準食２９２０Ｘ（エンヴィーゴ社（Ｅｎｖｉｇｏ）、米国カリフォルニア州）および２５ｍＭ ＺｎＣｌ２を含有する水で維持して、導入遺伝子発現を誘導し、よって、ホモ接合性Ｉ２７８Ｔ仔を新生仔死亡から救済した。２１日齢での離乳後、ホモ接合性Ｉ２７８ＴマウスおよびそのＷＴ同胞を８つの群のうちの１つに割り当てた。２４日齢で、マウスを、正常（エンヴィーゴ社（Ｅｎｖｉｇｏ）ＴＤ．１７００６３、４％Ｍｅｔ；Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ群）または制限されたメチオニン含有量（エンヴィーゴ社（Ｅｎｖｉｇｏ）ＴＤ．１１０５９１、０．５％Ｍｅｔ；Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨ群）のアミノ酸規定食に切り替えた。２４日目の新たな食事に加えて、マウスはまた、２２週齢まで１週間に３回（月曜、水曜、金曜）、ＰＢＳビヒクル（Ａ、Ｃ、ＥおよびＧ群）または１０ｍｇ／ｋｇ ２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ（Ｂ、Ｄ、ＦおよびＨ群）の皮下注射を受けた。マウスは毎週体重を量り、体重を使用してその週の２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ注射量を計算した。
Ｊ．酵素貯蔵および調製物
液体製剤の２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳを本明細書に記載されるｃＧＭＰ下で実施した安定性試験に使用し、この試験から、以下の試料を得た：－６５℃未満で貯蔵した対照酵素または「対照調製物」（Ｔ０－８０Ｃ）、ならびに２５℃の加速安定性条件下で２日間（Ｔ２Ｄ－２５Ｃ）、１か月間（Ｔ１Ｍ－２５Ｃ）および６か月間（Ｔ６Ｍ－２５Ｃ）インキュベートした酵素試料。
実施例２．医薬品調製物におけるＰＥＧ化のレベルの低下の測定
医薬品を２５℃で２日間、１か月間または６か月間インキュベートすることによって、医薬品についての「医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理の基準」（ＧＭＰ）条件下で実施される加速安定性試験のために、様々な程度の脱ＰＥＧ化を有する医薬品調製物を作製した。対照試料を推奨される温度範囲、すなわち－６５℃未満で貯蔵した。
調製物間のＰＥＧ化の差異を、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって確認した。１０種の高度にＰＥＧ化されたおよびあまりＰＥＧ化されていない種、ならびにＰＥＧ化を有さず、酵素変性でヘム補因子（Ｐ１０）が放出したＣＢＳを区別した。各試料における脱ＰＥＧ化の度合いを、変動的ＰＥＧ化または完全脱ＰＥＧ化種に対応するピークの相対面積を比較することによって決定した。ＲＰ－ＨＰＬＣ結果を表５に示す。「ＣＢＳ」は天然（未修飾）酵素であり、残りのピークは様々なレベルのＰＥＧ化を有する調製物である。
Figure 2022539077000007
ＲＰ－ＨＰＬＣ分析により、対照試料と比較して、２５℃で１か月間、なおさらには、６か月間インキュベートした調製物に有意な脱ＰＥＧ化が存在することが指し示された。表５に示されるように、これらの試料は、あまりＰＥＧ化されていない形態に対応するピーク（例えば、Ｐ３）の高い割合および付随してよりＰＥＧ化された形態のピーク（例えば、Ｐ６およびＰ７）の低い存在量を示した。加えて、６か月間インキュベートした調製物においては、未修飾（または完全脱ＰＥＧ化）ＣＢＳに対応するピークが最も突出していた。しかしながら、２５℃で２日間インキュベートした調製物では、変動的ＰＥＧ化種の分布が、－６５℃以下で常に貯蔵した対照酵素のものとより類似であった。
実施例３．マウスにおける低下したＰＥＧ化レベルを有する調製物の有効性
医薬品およびその脱ＰＥＧ化調製物間の生物学的等価性を評価するために、ＣＢＳＤＨの生化学的続発症、すなわち、上昇したホモシステイン（Ｈｃｙ）および抑制されたシステイン（Ｃｙｓ）を含むメチオニン（Ｍｅｔ）代謝産物の血漿レベルの異常を反復するモデルであるＩ２７８Ｔ ＣＢＳ－／－（Ｉ２７８Ｔ－／－）マウスで有効性を分析した。血漿アミノチオール（全ＣｙｓおよびＨｃｙ）および残りのアミノ酸、ならびにＳＡＭおよびＳＡＨを、全体が本願明細書に援用される、アーニングら（Ａｒｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．）（２０１６） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １３７８、２５５－２６２に記載されるように行われるＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定した。
Ｉ２７８Ｔ ＣＢＳ－／－（Ｉ２７８Ｔ－／－）マウスは、マウスＣＢＳ遺伝子が欠損しており、ＣＢＳＤＨ患者において最も広く見られる病原性変異を保有する、Ｉ２７８Ｔ変異体ヒトＣＢＳ遺伝子を発現する。これらのマウスは、おおよそ２％～３％の野生型ＣＢＳ活性を発現し、ホモシスチン尿症（ＨＣＵ）表現型を有する（全体が本願明細書に援用される、ワンら（Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．）（２００５）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １４、２２０１－２２０８参照）。これには、Ｈｃｙ、ＭｅｔおよびＳ－アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）の血漿レベルと組織レベルの両方の上昇、ならびに血漿ＣｔｈおよびＣｙｓレベルの付随する低下が含まれる。このマウス株は、元々Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ（米国ベンシルバニア州フィラデルフィア）のウォーレン ディー クルーガー教授（Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ Ｗａｒｒｅｎ Ｄ．Ｋｒｕｇｅｒ）から得た。
標準（ＲＥＧ）食で維持した雄と雌の両方の成体Ｉ２７８Ｔ－／－マウスを使用して有効性を試験した。試験開始時、マウスを４つの調製物に対応する４つの群に分けた。血液を投与の少なくとも１週間前にベースライン測定のために収集した。血液は、リチウムヘパリンおよびゲルを含む血漿調製物チューブ（グライナーバイオワン社（Ｇｒａｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）、米国ノースカロライナ州モンローまたは他の販売業者の等価物）への顎下サンプリングのために設計した使い捨てランセットを使用して、意識のある試験動物の顎下静脈から収集した。血漿を１２００×ｇで１０分間の遠心分離後に血液試料から収集し、分析まで１．５ｍｌチューブ中、－８０℃で貯蔵した。
１日目（Ｄ１）の始まりで、マウスは、その実験群に対応するそれぞれの調製物の１週間当たり、それぞれ７．５ｍｇ／ｋｇでの３回（月曜、水曜および金曜）の皮下（ＳＣ）注射を受けた。
処置を２４日間続けた。調製物注射日はＤ１、Ｄ３、Ｄ５、Ｄ８、Ｄ１０、Ｄ１２、Ｄ１５、Ｄ１７、Ｄ１９、Ｄ２２およびＤ２４であった。血液を１週間に少なくとも１回、注射の２４時間後、ならびに最後の注射の７２時間後に収集した。ベースライン（Ｄ０）収集に加えて、血液サンプリングをＤ２、Ｄ１１、Ｄ１８、Ｄ２５およびＤ２７に実施した。血漿を収集直後の全血液試料から調製し、分析まで凍結アリコートとして貯蔵した。各試料のアリコートをＭｅｔ代謝産物について分析し、一部（Ｄ２５およびＤ２７）のアリコートを実施例４に記載されるようにＣＢＳ活性についてもアッセイした。アッセイしたＭｅｔ代謝産物は、Ｈｃｙ、Ｃｔｈ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｂｅｔ、ジメチルグリシン（ＤＭＧ）、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）およびＳ－アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）であった。特に指し示されない限り、両性別についての結果をプールした。
調製物を、皮下注射によって施された場合に、分析したＭｅｔ代謝産物の血漿レベルを改善する能力に基づいて比較した。加えて、調製物のインビボ脱ＰＥＧ化を同じマウスで調べた。
ベースライン（Ｄ０）に加えて、血液サンプリングをＤ２、Ｄ１１、Ｄ１８、Ｄ２５およびＤ２７に実施した。血漿を収集直後の全血液試料から調製し、分析まで凍結してアリコートにして貯蔵した。各試料のアリコートをＭｅｔ代謝産物について分析し、一部（Ｄ２５およびＤ２７）のアリコートをＣＢＳ活性についてもアッセイした。選択されたアリコート（Ｄ２およびＤ２７）をウエスタンブロット法によっても分析して、インビボ２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ脱ＰＥＧ化を評価した。
ＣＢＳＤＨ患者では、ＨｃｙおよびしばしばＭｅｔの血漿レベルおよび組織レベルが高いが、ＣｔｈおよびＣｙｓのレベルは低い。標準食のＩ２７８Ｔ－／－マウスは、血漿中の上昇したＨｃｙレベルおよび低下したＣｙｓレベルを有し、よって、ＣＢＳＤＨ患者で観察される代謝調節不全の重要な側面を反復する（全体が本願明細書に援用される、ワンら（Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．）（２００５） Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １４、２２０１－２２０８参照）。この試験で分析した代謝産物の中で、血漿Ｈｃｙが臨床的に最も一般的に監視されるマーカーである（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２参照）。
血漿Ｈｃｙ、Ｃｙｓ、ＣｔｈおよびＭｅｔレベル（平均±ＳＥＭ）を表６に示す。
Figure 2022539077000008
表６に示されるように、Ｉ２７８Ｔ－／－マウスの血漿Ｈｃｙレベルは非常に高く（Ｄ０で４５０μＭ以上）、調製物にかかわらず、最初の注射の実質的に２４時間以内に降下した。実質的な脱ＰＥＧ化を受けた、２５℃で１か月間インキュベートした調製物（Ｔ１Ｍ－２５Ｃ）は、－６５℃未満で貯蔵した対照調製物（Ｔ０－８０Ｃ）および２５℃で２日間インキュベートした調製物（Ｔ２Ｄ－２５Ｃ）と同等の有効性を呈した。全体的な効果の統計分析により、６か月間インキュベートした調製物（Ｔ６Ｍ－２５Ｃ）が、Ｈｃｙレベルに基づいて、他の調製物よりも有意に有効性が低い（ｐ＜０．００５０１）ことが指し示された。Ｄ２７で、Ｈｃｙレベルは、他の２つの調製物についてはＤ０よりも低いままであった（ｐ＜０．０１）。対照的に、６か月間インキュベートした調製物（Ｔ６Ｍ－２５Ｃ）は、依然として効果的であったが、他のものほど有意に効果的でなく（ｐ＜０．０１）、他の３つの群の８８～１４５μＭと比較して、約２００μＭの血漿Ｈｃｙレベルをもたらした。最後の注射の７２時間後では、Ｈｃｙレベルが部分的に上昇したが、未処置マウスのレベルにはまだ戻らなかった（対照調製物（Ｔ０－８０Ｃ）および２日間インキュベートした調製物（Ｔ２Ｄ－２５Ｃ）についてＤ０に対してＤ２７でｐ＜０．０１であったが、１か月間（Ｔ１Ｍ－２５Ｃ）および６か月間（Ｔ６Ｍ－２５Ｃ）インキュベートした調製物については有意な差はなかった）。これらの結果は、全体が本願明細書に援用される、マジタンら（Ｍａｊｔａｎ ｅｔ ａｌ．）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ２００、１５－２５（２０１８）の以前の薬力学的研究と一貫していた。
全体的な効果の統計分析により、６か月間インキュベートした調製物が他の調製物よりもＣｙｓレベルに対する有意に低い効果を有することが指し示された（ｐ＜０．００１）。ＣＢＳＤＨモデルマウスにおいて抑制された血漿Ｃｙｓレベルは、６か月間インキュベートした調製物（Ｔ６Ｍ－２５Ｃ）を除いて、全ての調製物によって正常化された（約２００～２５０μＭ）。上昇したＣｙｓレベルは、注射スケジュールが終了した後７２時間以内にベースラインに戻った。
高度に変動的であるが、血漿Ｃｔｈレベルは全ての調製物による処置によって上昇し、全ての調製物がＣＢＳ触媒活性を有するという観察と一貫していた。したがって、６か月間インキュベートした調製物（Ｔ６Ｍ－２５Ｃ）は、他の３つの調製物と比較して、薬力学の代わりに薬物動態学の差異を有する可能性が高い。
血漿Ｍｅｔレベルは、処置に応答して突出したパターンを示さず、血漿Ｍｅｔレベルが、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ処置ありまたはなしのＣＢＳＤＨモデルマウスにおいて主に食事性Ｍｅｔ摂取を反映するという以前の観察と一貫している（マジタンら（Ｍａｊｔａｎ ｅｔ ａｌ．）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ４１（補遺１）、Ｓ５６（２０１８））。統計分析は、４種の調製物間でＣｔｈレベルの有意な差を指し示さなかった。
Ｈｃｙ、Ｃｙｓ、ＣｔｈおよびＭｅｔに加えて、いくつかの他の分析物を代謝産物パネルに含めたが、これらの代謝産物のレベルは、群間で有意な差を示さなかった。追加の分析物を表７に示す。
Figure 2022539077000009
表７に示されるように（また表６に提供されるように）Ｔ０－８０Ｃは対照調製物を指し、Ｔ２Ｄ－２５Ｃは－２５℃で２日間インキュベートした調製物を指し、Ｔ１Ｍ－２５Ｃは２５℃で１か月間インキュベートした調製物を指し、Ｔ６Ｍ－２５Ｃは２５℃で６か月間インキュベートした調製物を指す。ＲＰ－ＨＰＬＣ結果は、有意な脱ＰＥＧ化が、２５℃で１か月間、およびさらには６か月間インビトロでインキュベートした２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳで起こったことを指し示した。それにもかかわらず、最も有意に脱ＰＥＧ化された試料（２５℃で６か月間インキュベートした調製物）では、低下が有意に明白ではなかったが（ｐ＜０．０１）、４種全ての調製物によるＩ２７８Ｔ－／－マウスの処置が血漿Ｈｃｙレベルの劇的な低下をもたらした。同様に、また、２５℃で６か月間インキュベートした調製物は他のものより有意に有効性が低かったが（ｐ＜０．００１）、血漿Ｃｙｓレベルは全ての調製物によって上昇した。処置期間の間に収集された全ての試料が、ベースラインレベル（Ｄ０）と比較して、変動的であるが上昇した、基質Ｈｃｙから各調製物によって形成される生成物であるＣｔｈの血漿レベルを示した。このことは、調製物が全て触媒的に活性であること、注射前に調製物で実施された比活性測定と一貫した所見を指し示した。血漿Ｍｅｔレベルは処置によって有意には影響されず、Ｍｅｔレベルが、医薬品処置によってではなく、食事性摂取によって主に影響を及ぼされるように見えるという本発明者らの以前の所見、および全てのマウスが試験全体を通して標準食を受けているという事実と合っている。全ての処置が血漿ＣＢＳ活性の上昇につながったが、他の群と比較して、２５℃で６か月間インキュベートした調製物を受けているマウスでは活性が有意に低かった（ｐ＜０．０１）。よって、最も脱ＰＥＧ化された調製物による処置は、インビボでのより低い有効性に解釈される、血漿中のより低い酵素活性をもたらし、他の２種の２５℃でインキュベートした調製物は対照試料と同程度有効であった。注目すべきことに、対照と比較して有意に脱ＰＥＧ化された、１か月間インキュベートした調製物は、対照と同様の有効性を示した。２日間、１か月間または６か月間のインキュベーション後に観察された脱ＰＥＧ化レベルは、おそらく加速安定性試験条件下でのみ達成され、臨床設定においてはあまりに起こりそうもない。
実施例４．低下したＰＥＧ化レベルを有する調製物の酵素活性
最後の注射後２４時間および７２時間で、血漿ＣＢＳ活性、すなわち、Ｄ２５およびＤ２７で収集した血漿試料中の調製物の触媒活性を測定した。
全体が本願明細書に援用される、カヤスタら（Ｋａｙａｓｔｈａ ｅｔ ａｌ）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９３（２）、２００－２０３（１９９１）に記載される比色アッセイを使用すると、安定性試験結果は、６か月のインキュベーション期間の間、ＣＢＳ比活性（２００±１００Ｕ／ｍｇバッチのタンパク質）の喪失を指し示さず、活性測定値は対照、２日間、１か月間および６か月間調製物についてそれぞれ１４５、２０４、１７０および２０５Ｕ／ｍｇタンパク質であった。
実施例１に記載される放射標識Ｓｅｒの変換に基づく別のＣＢＳ活性アッセイも実施した。ＣＢＳ活性の測定値を表８に示す。
Figure 2022539077000010
所見に基づいて、インビボでの脱ＰＥＧ化は有意でなかった。さらに、インキュベートした調製物のレベルを含めてそのレベルまでインビトロで加速した場合、脱ＰＥＧ化がＣＢＳ活性またはインビボ有効性に影響を及ぼすことは観察されなかった。
Ｍｅｔ代謝産物の改善と一貫して、全ての調製物が全ての群における上昇した血漿ＣＢＳ活性につながったが、６か月間インキュベートした調製物はＤ２５では他よりも有意に低く（ｐ＜０．０４）、Ｄ２７ではそうではないことが観察された。また、１か月間インキュベートした調製物における有意な脱ＰＥＧ化は、インビボで達成される血漿ＣＢＳ活性レベルに影響を及ぼさず、対照による結果と同等の結果であった。
放射性Ｓｅｒ変換を監視する同じ方法を使用してアッセイすると、対照、２日間インキュベートした調製物、１か月間インキュベートした調製物および６か月間インキュベートした調製物の比活性はそれぞれ２３２４．１１、１７１４．１９、１７８６．０８および１３１８．７６Ｕ／ｍｇタンパク質であった。対照と比較して有意に脱ＰＥＧ化された、１か月間インキュベートした調製物（Ｔ１Ｍ－２５Ｃ）は、対照と同様の活性を示した。
実施例５．インビボにおける脱ＰＥＧ化のウエスタンブロット分析
医薬品がインビボで脱ＰＥＧ化の対象となるかどうかを評価するために、対照で処置したＣＢＳＤＨモデルマウスからの血漿アリコートをウエスタンブロット法によって分析した。Ｄ２では、血漿試料におけるＰＥＧ化パターンは、注射前の対照のＰＥＧ化パターンと類似であることが観察され、未ＰＥＧ化酵素は検出されず、あまりＰＥＧ化されていないバンドのより高い存在量に向かう明らかな動向はなかった。最後の注射の７２時間後に収集した、Ｄ２７では、全てのマウスで未ＰＥＧ化酵素のわずかな増加が検出された。しかしながら、注射前材料と比較すると、ＰＥＧ化パターンの変化は軽微であり、Ｄ２７の様々なバンド間の比はＤ２とおおよそ同じであった。同様に、注射前、１か月間および６か月間インキュベートした調製物は、ＲＰ－ＨＰＬＣによって、とりわけ６か月間インキュベートした調製物で、実質的なレベルの未修飾ＣＢＳを含む脱ＰＥＧ化酵素を示したが、インビボにおける脱ＰＥＧ化は他の調製物で最小であった。これらのほとんど脱ＰＥＧ化された形態は注射後により迅速に分解した、または取り除かれ、したがって、ウエスタンブロット法によって分析した血漿試料中に存在しなかった可能性がある。他の３種の調製物の同様の分析も、これらをインビボで注射すると、最小の脱ＰＥＧ化を示した。
実施例６．２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳによる長期処置とＭｅｔ制限食の有効性の比較
硫黄アミノ酸代謝の調節不全は、ヒト患者と疾患のマウスモデルの両方におけるＨＣＵ表現型の重要な特徴である。代謝制御の持続的な改善または復帰が処置成功の重要な側面である（それぞれ全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２；マジタンら（Ｍａｊｔａｎ ｅｔ ａｌ．）（２０１７）ＦＡＳＥＢ Ｊ ３１、５４９５－５５０６；マジタンら（Ｍａｊｔａｎ ｅｔ ａｌ．）（２０１８）酵素置換療法はマウスホモシスチン尿症の複数の症状を改良する（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｔｈｅｒａｐｙ Ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆ Ｍｕｒｉｎｅ Ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２６、８３４－８４４参照）。４週齢から始まって、２２週齢の試験終了まで、マウスを正常（ＲＥＧ）または制限（ＭＲＤ）メチオニン含有量を含む食事で維持し、ＰＢＳビヒクルまたは１０ｍｇ／ｋｇ ２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳの皮下注射を１週間に３回受けさせた。表９は、１８週齢のマウスにおける血漿硫黄代謝産物のレベルを示す。全ホモシステイン、全システイン、シスタチオニン、メチオニンの血漿濃度およびＳＡＭ／ＳＡＨ比の代表的なスナップショットを提供する。本明細書のこの実施例および後の実施例で記載および分析される試験群を以下の通り要約する：
ＷＴ（ＲＥＧ＋ＰＢＳ）は、ＰＢＳの皮下注射を受けている、正常食の野生型マウスを指す。
ＷＴ（ＲＥＧ＋２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ）は、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳの皮下注射を受けている、正常食の野生型マウスを指す。
Ｉ２７８Ｔ（ＲＥＧ＋ＰＢＳ）は、ＰＢＳの皮下注射を受けている、正常食のＩ２７８Ｔマウスを指す。
Ｉ２７８Ｔ（ＲＥＧ＋２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ）は、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳの皮下注射を受けている、正常食のＩ２７８Ｔマウスを指す。
ＷＴ（ＭＲＤ＋ＰＢＳ）は、ＰＢＳの皮下注射を受けている、Ｍｅｔ制限食の野生型マウスを指す。
ＷＴ（ＭＲＤ＋２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ）は、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳの皮下注射を受けている、Ｍｅｔ制限食の野生型マウスを指す。
Ｉ２７８Ｔ（ＭＲＤ＋ＰＢＳ）は、ＰＢＳの皮下注射を受けている、Ｍｅｔ制限食のＩ２７８Ｔマウスを指す。
Ｉ２７８Ｔ（ＭＲＤ＋２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ）は、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳの皮下注射を受けている、Ｍｅｔ制限食のＩ２７８Ｔマウスを指す。
Figure 2022539077000011
表９に示されるように、血漿Ｈｃｙレベルは、食事または処置にかかわらず、ＷＴマウスにおいて正常な健康な範囲（約１６μＭ）にあった。しかしながら、ビヒクルを受けているＲＥＧ食のＩ２７８Ｔマウスでは、対照と比較して血漿Ｈｃｙレベルが大いに上昇した（４２３μＭ、ｐ＜０．００１）。ＭＲＤ食では、血漿Ｈｃｙレベルが実質的に低かった（１４０μＭ、すなわち６７％低下）が、対照と比較して依然として著しく上昇したままであった（ｐ＜０．００１）。２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ処置は、ビヒクル注射Ｉ２７８Ｔマウスと比較して、ＲＥＧ食のＩ２７８Ｔマウスの血漿Ｈｃｙレベルを４１μＭまで低下させ（９０％低下、ｐ＜０．００１）、ＭＲＤ食のマウスで１４μＭと完全に正常化した（ｐ＜０．００１）。血漿Ｃｙｓレベルは、対照と比較してビヒクルを受けているＲＥＧ食のＩ２７８Ｔマウスでほぼ３倍低く（１０５対２９５μＭ、ｐ＜０．００１）、残りの全ての群で正常範囲内にあった。２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳによって触媒される反応の生成物としての役割と一貫して、血漿Ｃｔｈレベルは、ビヒクル注射対応物と比較して、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ処置を受けている全てのマウスで上昇した。血漿Ｃｔｈの上昇は、限定する基質であるＨｃｙの濃度に依存し、ＲＥＧ食およびＭＲＤ食のＩ２７８Ｔマウスでそれぞれ７６μＭおよび１８μＭに達した（ｐ＜０．００１）。ビヒクルを受けているものと比較して２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ処置対照における約８倍高い血漿Ｃｔｈレベルによって指し示されるように基質濃度が非常に低い場合であっても、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳはその有効性を保持した。血漿Ｍｅｔレベルは、ＭＲＤ食よりもＲＥＧ食の全ての群で高かった。しかしながら、ＭＲＤのＩ２７８Ｔにおける血漿ＭｅｔレベルはＲＥＧ食の対照と類似であり（５１対５２μＭ、ｐ＝ｎｓ）、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ処置によって正常化された（３０μＭ、ｐ＜０．００１）。メチル化能力を反映するＳＡＭ対ＳＡＨの比は、ＲＥＧ食のＩ２７８Ｔマウスで実質的に減少し（０．１２）、それぞれの対照と比較してＭＲＤ食で部分的に増加した（１．７７）（ＲＥＧ食およびＭＲＤ食のＷＴでそれぞれ３．２９および３．８４；ｐ＜０．００１）。２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ処置により、ＳＡＭ／ＳＡＨ比が有意に改善し、ＲＥＧ（２．２６、ｐ＜０．００１）およびＭＲＤ（４．０１、ｐ＜０．００１）のＩ２７８Ｔマウスでそれぞれ完全に正常化された。一般に、Ｗ１８時点について本明細書に記載される群間の差異は、試験の経過全体の間に観察されるものと一貫していた。
ＣＢＳ欠損ＨＣＵの管理のガイドラインは、ピリドキシンに完全応答性の患者および非応答性の患者のそれぞれで血漿総Ｈｃｙ濃度を５０μＭ未満および１００μＭ未満に保つことを推奨した（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２参照）。本発明者らの研究では、Ｉ２７８Ｔマウスは、マウスについての標準的推奨摂取よりも８倍少ないＭｅｔを受ける重度のＭｅｔ制限で維持した場合でさえ（ＭＲＤ食では０．５ｇ／ｋｇおよびＲＥＧ食では４ｇ／ｋｇ）、この標的レベルを達成することができなかった。６週齢で採取した初期試料を除いて、血漿Ｈｃｙレベルは、試験の間、ＭＲＤのＩ２７８Ｔマウスで１２１～１９５μＭの間で推移した。全体が本願明細書に援用される、グプタら（Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．）（２０１４）低メチオニン食で成長するシスタチオニンベータ合成酵素欠損マウス（Ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ ｂｅｔａ－ｓｙｎｔｈａｓｅ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ｔｈｒｉｖｅ ｏｎ ａ ｌｏｗ－ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｄｉｅｔ）．ＦＡＳＥＢ Ｊ ２８、７８１－７９０に示されるのと同じマウスモデルを使用すると、０．５ｇ／ｋｇ Ｍｅｔを含有する同様のＭＲＤ食は、３４週齢Ｉ２７８Ｔマウスで血清Ｈｃｙを８１μＭまで低下されることが見出された。この差異はマウスの齢および食事での維持の長さに起因し得る。対照的に、ＲＥＧ食の、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳで処置したＩ２７８Ｔマウスの血漿Ｈｃｙレベルは、２２週齢で採取した最後の試料を除いて、２６～４１μＭの範囲内で変動した。その上、ＭＲＤ食のＩ２７８Ｔマウスへの２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳの投与は、血漿Ｈｃｙを１５μＭ未満に完全に正常化した。このデータは、ＥＴと異なり、重度のＭｅｔ制限でさえ、ＨＣＵマウスにおいて血漿Ｈｃｙレベルを治療標的にもっていくことはできないことを示唆している。完全な代謝的正常化が望まれる場合、この目標を達成するためには、ＥＴとあるレベルのＭｅｔ制限の組み合わせが必要となるであろう。
これらの結果は、ＨＣＵ表現型の矯正を達成するのに完全な代謝的正常化は要求されず、よって、マウスでのＨＣＵ表現型の顕在化ということになると、閾値効果が存在するように見えることの証拠である。実際、１７０～３００μＭの間の血漿Ｈｃｙレベルを有するＨＣＵのあまり重度でないマウスモデルは、はるかに重度でない表現型を有していた（グプタら（Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．）（２００９）参照）。シスタチオニンベータ合成酵素欠損のマウスモデルは、高ホモシステイン血症の有意な閾値効果を明らかにしている（全体が本願明細書に援用される、ＦＡＳＥＢ Ｊ ２３、８８３～８９３）、またはＨＣＵの臨床症状を示さなかった（全体が本願明細書に援用される、マジタンら（Ｍａｊｔａｎ ｅｔ ａｌ．）（２０１８）Ｈｕｍａｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ ３９、２１０－２１８参照）。この閾値はヒト患者にも適用されるように見え、ならびに処置されたＨＣＵ患者は、代謝的正常化を達成することができなかったにもかかわらず、血管イベントの減少したリスクおよび発生率を示した（それぞれ全体が本願明細書に援用される、ウィルケンら（Ｗｉｌｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．）（１９９７）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅ ２０、２９５－３００；ヤップら（Ｙａｐ ｅｔ ａｌ．）（２０００）シスタチオニンベータ合成酵素欠損によるホモシスチン尿症患者における重度の高ホモシステイン血症の血管合併症：ホモシステイン低下療法の効果（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｅｖｅｒｅ ｈｙｐｅｒｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅｍｉａ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ ｄｕｅ ｔｏ ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ ｂｅｔａ－ｓｙｎｔｈａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｌｏｗｅｒｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｙ）．Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ２６、３３５－３４０；ヤップら（Ｙａｐ ｅｔ ａｌ．）（２００１）慢性的に処置されているシスタチオニンベータ合成酵素欠損によるホモシスチン尿症患者における血管転帰：多施設共同観察研究（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ ｄｕｅ ｔｏ ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ ｂｅｔａ－ｓｙｎｔｈａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｔｒｅａｔｅｄ ｃｈｒｏｎｉｃａｌｌｙ：ａ ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｙ）．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ２１、２０８０－２０８５参照）。
実施例７．血流依存性血管拡張反応（ＦＭＤ）
Ｉ２７８Ｔマウスは内皮機能障害に苦しみ、血栓塞栓症がＨＣＵ患者の罹患率および早死にの主因である（全体が本願明細書に援用される、マジタンら（Ｍａｊｔａｎ ｅｔ ａｌ．）（２０１８）Ｈｕｍａｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ ３９、２１０－２１８参照）。内皮機能障害の存在は心血管リスクに密接に関連付けられているので、試験マウスの大腿動脈で内皮依存性血流依存性血管拡張反応（ＦＭＤ）を評定した（データは示さない）。内皮依存性血流依存性血管拡張反応を、（全体が本願明細書に援用される、シューラーら（Ｓｃｈｕｌｅｒ ｅｔ ａｌ．）（２０１４）マウスにおける内皮依存性血管拡張反応の測定－要約した報告書（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｖａｓｏｄｉｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ－－ｂｒｉｅｆ ｒｅｐｏｒｔ）．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ３４、２６５１－２６５７参照）に記載されるように実施した。マウスをイソフルラン（３％誘導および１．５％維持）で麻酔した。体温を、ＥＫＧ電極も備えた加熱検査台を使用することによって３７±１℃に保ち、直腸検温器プローブを使用して監視した。後肢を剪毛し、加温超音波ゲルで覆った。超音波プローブを定位ホルダーに取り付け、大腿静脈が上内腿で目に見えるように手動で整列させた。３０～７０ＭＨｚ直線配列マイクロスキャントランスデューサ（フジフイルムビジュアルソニックス社（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ）、カナダオンタリオ州トロント）を備えた高周波、高解像度Ｖｅｖｏ ２１００イメージングプラットフォームを使用して、マウスの大腿動脈をイメージングした。血管オクルーダー（ドックス社（Ｄｏｃｘ）、米国カリフォルニア州ユカイア）を下肢の周りに配置して、虚血トリガーとして遠位後肢の閉塞を誘導した。いったん血管壁のはっきりとした像が得られ、ベースライン読み取りを記録したら、５分間の血管オクルーダーの膨張によって実験を開始した。後肢虚血後、カフをしぼませ、ＦＡ直径測定値を３０秒間隔で５分間連続的に記録した。取得した像の大腿動脈直径をオフラインで、手動で決定した。
マウスＨＣＵの臨床症状に対する医薬品の長期投与の効果を決定するために、Ｍｅｔ制限食（ＭＲＤ）のＩ２７８Ｔマウス（＋／＋および－／－）に、ビヒクル（ＰＢＳ）または１０ｍｇ／ｋｇの２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ（医薬品）を２２週齢まで１週間に３回投与した。マウスを２種類の食事のうちの一方にした：１）４．０ｇ／ｋｇ Ｍｅｔを含む通常食（ＲＥＧ）、または２）０．５ｇ／ｋｇ Ｍｅｔを含むＭｅｔ制限食（ＭＲＤ）。マウスを以下の群に分けた：Ａ（＋／＋、ＲＥＧ、ＰＢＳ）；Ｂ（＋／＋、ＲＥＧ、医薬品）；Ｃ（－／－、ＲＥＧ、ＰＢＳ）；Ｄ（－／－、ＲＥＧ、医薬品）；Ｅ（＋／＋、ＭＲＤ、ＰＢＳ）；Ｆ（＋／＋、ＭＲＤ、医薬品）；Ｇ（－／－、ＭＲＤ、医薬品）；Ｈ（－／－、ＭＲＤ、医薬品）。
Ｉ２７８Ｔマウスは、薬物処置が表現型を正常化する対照群（＋／＋）と比較して、大腿動脈柔軟性の有意な喪失（すなわち、動脈剛性）を示すことが観察された。ベースラインＴ０の大腿動脈直径は、ＲＥＧ食のマウスで観察されるものよりもＭＲＤのマウスで小さいことが観察された。ベースライン値を記録した後、５分間の血流のない閉塞により、ベースラインに戻る前の動脈直径の一時的増加を特徴とする反応性充血が誘導された。表１０は、１９週齢のマウスで評価される、ＲＥＧ食またはＭＲＤ食のマウスの大腿動脈直径を示す。
Figure 2022539077000012
表１０に示されるように、ビヒクルを受けているＲＥＧ食のＩ２７８Ｔマウスは、対照（２３８および２３５μｍ、ｐ＜０．００１）ならびに同じ食事であるが、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ処置を受けているＩ２７８Ｔマウス（共に２３２μｍ、ｐ＜０．０１）と比較して、５分間の虚血後に、６０秒および９０秒時点で大腿動脈の有意に低い最大拡張（共に２１６μｍ）によって指し示される内皮機能障害を明らかに示した。ＲＥＧ食のビヒクルを受けているＩ２７８Ｔマウスは、他の全ての群と比較して有意に減少した応答を示した。対照的に、ＭＲＤ食のマウスのいずれも損なわれた内皮機能の徴候を示さず、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ処置ありおよびなしで、虚血に対する正常な血管応答を呈さなかった。
ＭＲＤのＩ２７８Ｔマウスの処置は、大腿動脈直径をＲＥＧ食のマウスと同じレベルに正常化することが観察された。
実施例８．頸動脈化学損傷血栓症モデル（ＣＩＴＭ）
測定頸動脈化学損傷血栓症モデル（ＣＩＴＭ）を、全体が本願明細書に援用される、マルキら（Ｍａｒｃｈｉ ｅｔ ａｌ．）（２０１２）Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ １０８、５１６－５２６に記載されるように実施した。マウスをケタミン（誘導用量８０～１００ｍｇ／ｋｇ、次いで、維持のために１０～２０ｍｇ／ｋｇ／時間）とキシラジン（誘導用量８～１６ｍｇ／ｋｇ、次いで、維持のために１～２ｍｇ／ｋｇ／時間）の組み合わせの腹腔内注射で麻酔し、加熱パッドを使用して体温を３６～３８℃で維持し、直腸検温器プローブで監視した。気管を露出させ、カニューレ処置し、動物を空気および補充酸素で機械的に人工呼吸した。総頸動脈を露出させ、０．５ＰＢＳドップラー流量プローブ（トランソニックシステムズ社（Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、米国ニューヨーク州イサカ）でベースライン流を監視した。動脈損傷のために、１０％塩化第二鉄溶液に浸漬した１×１ｍｍワットマン濾紙を頸動脈上に１分間配置した。血管中の血流を、超音波プローブを使用して、最大２０分間監視および記録した。閉塞までの時間（ＴＴＯ）を、ＦｅＣｌ３投与と１分間の血流の欠如との間の時間として定義した。血液を下大静脈から３．２％クエン酸ナトリウムで流した注射器に採取し、５０００×ｇで１０分間の遠心分離によって血小板が乏しい血漿に処理した。手順の最後に、マウスを頚椎脱臼によって安楽死させ、引き続いて両側開胸した。表１１は、頸動脈化学損傷血栓症モデル（ＣＩＴＭ）の結果を示す。１０％ＦｅＣｌ３によって誘導される化学損傷後の頸動脈における安定な閉塞までの時間を２２週齢のマウスで決定した。ＲＥＧ食でビヒクルを受けているＩ２７８Ｔマウスのみが有意に増加した閉塞までの時間を示し、ＭＲＤ食および／または２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳによる処置はこのパラメーターを対照レベルに正常化した。表１１中の「ＣＢＳ」は２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳを表す。
Figure 2022539077000013
Ｉ２７８Ｔマウスは実験的血栓症の遅延を示し、これはいずれかの処置によって正常化された。Ｉ２７８Ｔマウスが血栓形成促進性表現型を呈示するかどうか、およびその場合、食事および酵素療法がこれにどのように影響を及ぼすかを評価するために、１０％ＦｅＣｌ３を使用して、総頸動脈の実験的血栓症を誘導した。ＲＥＧ食のビヒクル注射Ｉ２７８Ｔマウスは、他の群が呈示するよりも実質的に長い安定な閉塞までの時間を呈示し（１０分５９秒）、ＨＣＵ患者と異なり、Ｉ２７８Ｔマウスが血栓形成促進性表現型を示さないことを指し示しており、その上、対照（８分４２秒、ｐ＜０．０５）と比較して有意な血栓症の遅延を示した。興味深いことに、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ（８分４９秒）またはＭＲＤ食（７分３４秒）によるＩ２７８Ｔマウスの処置は、閉塞の時間を対照で見られる値に正常化した。
血栓塞栓症は、ＨＣＵにおける罹患率および死亡率の主因であるが（それぞれ全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）（２００１）硫黄転移の障害（Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｓｕｌｆｕｒａｔｉｏｎ）．遺伝病の代謝および分子基礎（Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ）（スクリヴァー シーアール（Ｓｃｒｉｖｅｒ Ｃ．Ｒ．）、ボーデ エーエル（Ｂｅａｕｄｅｔ Ａ．Ｌ．）、スライ ダブリューエス（Ｓｌｙ Ｗ．Ｓ．）、ヴァレ ディー（Ｖａｌｌｅ Ｄ．）、チャイルズ ビー（Ｃｈｉｌｄｓ，Ｂ．）、キンズラー ケイ（Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．）およびフォーゲルシュタイン ビー（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．）編）２００７～２０５６頁、マグロウヒル（ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ）、ニューヨーク；非特許文献１２参照）、プラセボを受けているＲＥＧ食のＩ２７８Ｔマウスは、有意な内皮機能障害にもかかわらず、血栓症の性向を呈すことができなかった。同様の所見は、同じＩ２７８Ｔマウスモデルを使用して（全体が本願明細書に援用される、ダイヤルら（Ｄａｙａｌ ｅｔ ａｌ．）（２０１２）Ｂｌｏｏｄ １１９、３１７６－３１８３参照）ならびに全ＣＢＳノックアウトマウスについて（全体が本願明細書に援用される、マクリーンら（Ｍａｃｌｅａｎ ｅｔ ａｌ．）（２０１０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ １０１、１６３－１７１参照）以前報告された。
内皮機能障害と、逆説的に長期の閉塞までの時間の両方が、ＭＲＤ食のＩ２７８Ｔマウス、またはＲＥＧ食であるが、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳで処置されたマウスで正常化されている。これらの結果は、Ｉ２７８Ｔマウスにおける凝固亢進状態の欠如にもかかわらず、Ｍｅｔ制限または２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳの投与が、ＨＣＵの他のマウスモデル、およびより重要なことには、ヒト患者で観察される病的止血の矯正に有効であり得ることを指し示している。
実施例９．行動試験
全ての行動試験で、実験を、マウスの遺伝子型、食事および処置に関して盲検化した。オープンフィールド課題は、不安様行動の側面を調べるものである（全体が本願明細書に援用される、プルトら（Ｐｒｕｔ ｅｔ ａｌ．）（２００３）Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４６３、３－３３参照）。マウスは、１０分間の試行にわたって上から追跡されながら、オープンボックス（４４×４４×２４ｃｍ）を自由に探索した。試行を開始する前に、動物追跡ソフトウェア（Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ ＸＴ、ノルダス社（Ｎｏｌｄｕｓ）、オランダ ワーヘニンゲン）を使用して、中心および周辺を描写した。このソフトウェアを使用して、周囲に対して中心で費やされた時間の量、ならびに移動距離を決定した。
パズルボックス課題を、全体が本願明細書に援用される、ベン アブドゥッラーら（Ｂｅｎ Ａｂｄａｌｌａｈ ｅｔ ａｌ．）（２０１１）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２２７、４２－５２に以前記載されたように実施した。マウスにゴールボックス（１５×２８×２８ｃｍ）に入るために３分与えた。マウスがゴールボックスに入らなかった場合、実験者が励まし、道を教えた。覆われたゴールボックスは明るい覆われていないアリーナ（５８×２８×２８ｃｍ）に隣接していた。ゴールボックスの入り口は出入口（試行１）として出発し、次いで、アンダーパス（試行２、３、４）に変化させ、次いで、アンダーパスをおがくずで満たし（試行５、６、７）、次いで、満たされたアンダーパスを厚紙の小さな長方形片で覆った（試行８、９）。各マウスは３日間の期間にわたって９回の試行を受けた。初日は試行１～３からなり、２日目は試行４～６からなり、試行７～９は３日目に行われた。
高次認知機能を試験するために、マウスが限定された量の時間内に困難性が増加する課題を完全に逃れることを要求される、問題解決試験を施行した。パズルボックスアリーナは、黒色障壁によって、スタートゾーンとゴールゾーンの２つの区画に分けられたＰＬＥＸＩＧＬＡＳ（商標）白色ボックスを用いて設計した。マウスを明るく照らされたスタートゾーンに導入し、狭いアンダーパスを通してアクセス可能な、より小さな覆われた／暗いゴールゾーンを好むことを観察した。これらの試験は、３連続日にわたって分布させた９回の試行からなり、その間、マウスはゴールゾーンにアクセスするためにアンダーパスでの妨害を克服するよう訓練される。妨害は３種であり、初級から中級および上級の範囲であった。表１２は試行１～９（Ｔ１～Ｔ９）の要約である。
Figure 2022539077000014
Ｉ２７８Ｔマウスのいずれかの処置は、学習能力および認知を改善するが、Ｍｅｔ制限は不安を増加させる。発達遅延および様々な精神医学症状はＨＣＵ患者間で一般的である。最初に、オープンフィールド試験を実施して、試験マウスにおける不安レベルおよび自発運動活性を評価した。表１３および表１４はオープンフィールド試験の結果を示す。表１３はマウスの各群についての移動距離を示す。
Figure 2022539077000015
表１４はマウスの各群についての中心で費やされた時間を示す。
Figure 2022539077000016
対照マウスとＩ２７８Ｔマウスの両方の不安レベルまたは自発運動に対する２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ処置の有意な影響は観察されなかった。しかしながら、ＭＲＤのマウスは、遺伝子型にもかかわらず、ＲＥＧ食のマウスと比較して、有意に増加した試験アリーナでの移動距離を示し（ｐ＜０．０１）、アリーナの中心で費やした時間が少なかったのでより不安であった（ｐ＜０．００１）。マウスの性別およびＰＢＳビヒクルまたは２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ注射はマウスの行動に対する有意な影響を示さなかったが、ＲＥＧ（塗りつぶされた記号）およびＭＲＤ（白い記号）食はＷＴマウスとＩ２７８Ｔマウスの両方で自発運動および不安レベルの変化をもたらした。
第２に、試験マウスの認知／実行機能を、マウスが明るく照らされたアリーナを逃れるために暗いゴールボックスに達しなければならないパズルボックス試験で評定した（図２）。表１５は、ビヒクルまたは２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳを受けているいずれかの食事のＷＴマウスおよびＩ２７８Ｔマウスにおけるゴールボックスに達するまでの時間を示す。この順序は、問題解決能力（試行番号２、５および８）および学習／短期記憶（試行番号３、６および９）の評価を可能にした。加えて、翌日の繰り返しにより、長期記憶の尺度が提供された（試行番号４および７）。
Figure 2022539077000017
ゴールボックスまでのアクセスは、試験群のマウスがゴールボックスに着くために９回の試行のそれぞれで要求される時間（秒）を示す表１５に指し示されるように、各試行によってより困難になった。平均および平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表１５で提供される結果について計算した（データは示さない）。ビヒクルまたは２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳを受けているいずれかの食事の対照マウスは、認知障害の徴候はなく、同様にふるまった。他方、ＲＥＧ食のＩ２７８Ｔマウスは、ＭＲＤ食のマウスまたは対照と比較して、認知障害を指し示す有意に不足したふるまいを示した（ｐ＜０．００１）。２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ処置では、Ｉ２７８Ｔマウスは、両食事で、対照マウスと同様にふるまった。
ＲＥＧ食およびＰＢＳ注射のＩ２７８Ｔマウスは、ＭＲＤ食およびＰＢＳ注射のＩ２７８Ｔマウス、ならびに医薬品を注射したＲＥＧ食とＭＲＤ食の両方のマウスと比較して、認知障害が観察された。この結論は、課題の困難性が増加すると（すなわち、試行５～１０）、ＰＢＳ注射をしたＲＥＧ食のマウスが遅れずにゴールボックスに達することができないことによって支持された。両群とも医薬品を投与された、ＲＥＧ食またはＭＲＤ食のマウス間で、ゴールボックスに達するまでの時間の有意な差は観察されなかった。
精神病、強迫性障害、うつ病および行動／パーソナリティ障害などの多くの心理学的および精神医学的状態がＨＣＵ患者で一般的である（全体が本願明細書に援用される、アボットら（Ａｂｂｏｔｔ ｅｔ ａｌ．）（１９８７）Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２６、９５９－９６９参照）。加えて、ＨＣＵを有する個体は、多くの発達および認知困難を有し、有意な数の症例が学習障害および低いＩＱを有する（全体が本願明細書に援用される、エル・バシールら（Ｅｌ Ｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．）ＪＩＭＤ ｒｅｐｏｒｔｓ ２１、８９－９５参照）。本発明者らのマウスの行動試験は、この表現型が実際に、対照およびＭＲＤで維持されたまたは２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳで処置されたＩ２７８Ｔマウスと比較して、ＲＥＧ食で維持し、ビヒクルを受けた場合に認知障害を示すＩ２７８Ｔマウスで再現されることを示した（図２および表１５）。本発明者らの知る限り、これは、このような表現型およびＣＢＳ欠損ＨＣＵの任意のマウスモデルにおけるその矯正の成功の最初の報告である。加えて、マウスは、ＲＥＧ食のマウスと比較してＭＲＤで維持した場合に、有意に上昇した活性および不安レベルを示した。
ＲＥＧ食のビヒクルを受けているＩ２７８Ｔマウスは、ゴールボックスに達するまでの時間が長いことによって指し示されるように、ＭＲＤ食のマウスと比較して有意に認知機能障害であった（表１５）。しかしながら、ＲＥＧ食の２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳを注射されたＩ２７８Ｔは、対照またはＭＲＤ食のＩ２７８Ｔマウスと同様にふるまった（表１５）。塗りつぶされた記号による実線および白い記号による破線は、それぞれＲＥＧ食およびＭＲＤ食のマウスを指定する。全てのプロットのデータポイントは平均値を表し、エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を示す。
これらの行動特質は、遺伝子型および２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ処置にかかわらず、マウスに影響を及ぼしたので、ＨＣＵに関連しない可能性がある。Ｍｅｔ制限を含む必須アミノ酸欠乏は、前梨状皮質で感知され、その後のグルタミン酸作動性シグナル伝達がマウスの行動に影響することが示されている（全体が本願明細書に援用される、アンソニーら（Ａｎｔｈｏｎｙ ｅｔ ａｌ．）（２０１３）中枢神経系のアミノ酸欠乏の検出（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ）．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｃａｒｅ １６、９６－１０１参照）。グルタミン酸は中枢神経系における主な興奮性神経伝達物質であり、これが自発運動、不穏状態および不安レベルの増加を説明し得る。
実施例１０．二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＥＸＡ）
ＧＥ Ｌｕｎａｒ ＰＩＸＩｍｕｓスキャナー（ルナー社（Ｌｕｎａｒ Ｃｏｒｐ．）、米国ウィスコンシン州マディソン）を使用して、骨密度および体組成を麻酔したマウス（ＰＢＳ中６０ｍｇ／ｋｇケタミンと１５ｍｇ／ｋｇキシラジンの組み合わせを腹腔内注射）で評価した。マウスを、腹部を下にしてトレイに配置し、尾を除いて首から下にスキャンした。スキャン後、マウスをケージに戻して回収した。
Ｍｅｔ制限は骨石灰化および体組成を損なうが、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ処置がＲＥＧ食のＩ２７８Ｔの表現型を正常化する。ＨＣＵ患者で観察される臨床症状の中には、痩せ、低いボディマス指数および骨粗鬆症がある（全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）（２００１）硫黄転移の障害（Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｓｕｌｆｕｒａｔｉｏｎ）．遺伝病の代謝および分子基礎（Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ）（スクリヴァー シーアール（Ｓｃｒｉｖｅｒ Ｃ．Ｒ．）、ボーデ エーエル（Ｂｅａｕｄｅｔ Ａ．Ｌ．）、スライ ダブリューエス（Ｓｌｙ Ｗ．Ｓ．）、ヴァレ ディー（Ｖａｌｌｅ Ｄ．）、チャイルズ ビー（Ｃｈｉｌｄｓ，Ｂ．）、キンズラー ケイ（Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．）およびフォーゲルシュタイン ビー（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．）編）２００７～２０５６頁、マグロウヒル（ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ）、ニューヨーク参照）。よって、ＤＥＸＡを使用してマウスを試験して、その骨塩量および体組成を評定た。表１６はＤＥＸＡによる骨石灰化および体組成評価の結果を示す。マウスが２２週齢に達したら、ＤＥＸＡスキャンを実施した。表１６は骨塩量、体脂肪量および除脂肪量を含む。
Figure 2022539077000018
ＲＥＧ食では、骨塩量（ＢＭＣ）が、対照と比較して、ビヒクルを受けているＩ２７８Ｔマウスで有意に低かったが（０．３３対０．３９ｇ、ｐ＜０．００１）、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳによる処置がこれを完全に正常化した（０．４対０．４ｇ、ｐ＝ｎｓ）。ＭＲＤ食では、全ての群が同等のＢＭＣを示し（０．３４～０．３６ｇ）、これはＲＥＧ食の対照と比較して有意に減少しており（ｐ＜０．０５）、ＲＥＧ食のビヒクル注射Ｉ２７８Ｔマウスと同様であった。ＲＥＧ食では、ビヒクルを受けているＩ２７８Ｔマウスが他の群よりも有意に痩せており、特に対照よりも少ない脂肪組織（２．６３対４．２４ｇ、ｐ＜０．０１）および除脂肪量（１３．８１対１６．９７、ｐ＜０．００１）を含有していた。２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳによる処置は、ＲＥＧ食のＩ２７８Ｔマウスの体組成を正常化した。ＭＲＤ食では、体脂肪量が全ての群で同等であり、対照またはＲＥＧ食の２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ処置Ｉ２７８Ｔマウスの体脂肪量と同様であった。同じように、除脂肪量もＭＲＤ食の全ての群で同様であったが（１４．７１～１６．０２ｇ）、対照およびＲＥＧ食の２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ処置Ｉ２７８Ｔマウスと比較して有意に減少していた（ｐ＜０．０５）。
骨格異常および結合組織欠陥が、ＨＣＵ患者で最も突出した臨床症状である（全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）（２００１）硫黄転移の障害（Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｓｕｌｆｕｒａｔｉｏｎ）．遺伝病の代謝および分子基礎（Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ）（スクリヴァー シーアール（Ｓｃｒｉｖｅｒ Ｃ．Ｒ．）、ボーデ エーエル（Ｂｅａｕｄｅｔ Ａ．Ｌ．）、スライ ダブリューエス（Ｓｌｙ Ｗ．Ｓ．）、ヴァレ ディー（Ｖａｌｌｅ Ｄ．）、チャイルズ ビー（Ｃｈｉｌｄｓ，Ｂ．）、キンズラー ケイ（Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．）およびフォーゲルシュタイン ビー（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．）編）２００７～２０５６頁、マグロウヒル（ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ）、ニューヨーク参照）。しばしば脊柱側弯症に関連付けられる骨粗鬆症、および低いボディマス指数は、疾患の重症度にかかわらず、未処置患者または遅く診断された患者における典型的な所見である（それぞれ全体が本願明細書に援用される、マッドら（Ｍｕｄｄ ｅｔ ａｌ．）（２００１）硫黄転移の障害（Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｓｕｌｆｕｒａｔｉｏｎ）．遺伝病の代謝および分子基礎（Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ）（スクリヴァー シーアール（Ｓｃｒｉｖｅｒ Ｃ．Ｒ．）、ボーデ エーエル（Ｂｅａｕｄｅｔ Ａ．Ｌ．）、スライ ダブリューエス（Ｓｌｙ Ｗ．Ｓ．）、ヴァレ ディー（Ｖａｌｌｅ Ｄ．）、チャイルズ ビー（Ｃｈｉｌｄｓ，Ｂ．）、キンズラー ケイ（Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．）およびフォーゲルシュタイン ビー（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．）編）２００７～２０５６頁、マグロウヒル（ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ）、ニューヨーク；パロットら（Ｐａｒｒｏｔ ｅｔ ａｌ．）（２０００）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ２３、３３８－３４０参照）。減少した骨石灰化、低い脂肪量および低い全重量は、ＨＣＵのＫＯおよびＩ２７８Ｔマウスモデルで見られたが（それぞれ全体が本願明細書に援用される、マジタンら（Ｍａｊｔａｎ ｅｔ ａｌ．）（２０１７）ＦＡＳＥＢ Ｊ ３１、５４９５－５５０６；グプタら（Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．）（２００９）ＦＡＳＥＢ Ｊ ２３、８８３－８９３；マジタンら（Ｍａｊｔａｎ ｅｔ ａｌ．）（２０１８）酵素置換療法はマウスホモシスチン尿症の複数の症状を改良する（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｔｈｅｒａｐｙ Ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆ Ｍｕｒｉｎｅ Ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２６、８３４－８４４参照）、ＨＯマウスモデルでは見られなかった（全体が本願明細書に援用される、マジタンら（Ｍａｊｔａｎ ｅｔ ａｌ．）（２０１８）Ｈｕｍａｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ ３９、２１０－２１８参照）。表１６に示されるように、これらの所見は、ビヒクルを受けているＲＥＧ食のＩ２７８Ｔマウスならびにこの表現型の正常化における２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳの有効性で支持された。他方、重度のＭｅｔ制限は、ＲＥＧ食のＷＴマウスと比較して、遺伝子型および処置にかかわらず、ＭＲＤの全てのマウスで減少した骨石灰化、少ない量の除脂肪量および正常～増加した量の体脂肪量をもたらした。体脂肪量を除いて、ＭＲＤは、ビヒクルを受けているＲＥＧ食の未処置Ｉ２７８Ｔマウスと非常に類似した全体像を本質的に与えた。以前、ＭＲＤ食は、骨石灰化を含むＩ２７８ＴマウスにおけるＨＣＵ表現型の矯正で非常に有効であることが分かった（それぞれ全体が本願明細書に援用される、グプタら（Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．）（２０１４）ＦＡＳＥＢ Ｊ ２８、７８１－７９０；クルーガーら（Ｋｒｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）（２０１６）Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １３６３、８０－９０参照）。
実施例１１．高Ｍｅｔ食のＨＣＵマウスの死因
マウスに関するデータは、ＨＣＵ患者における重度のＭｅｔ制限が望ましくない転帰につながり得ることを指し示した。雄ＨＯマウスではそうではないが、雌ＨＯマウスは、８．２ｇのＭｅｔ／食事のｋｇを含む高メチオニン食（ＨＭＤ）への切り替え後に、突然死亡することが観察された。死因を分析するために、成体雌ＨＯマウスをＨＭＤにかけ、青年期Ｉ２７８ＴマウスをＨＭＤ食、ＲＥＧ食（Ｍｅｔ ４．０ｇのＭｅｔ／食事のｋｇ）、またはＲＥＧ＋水中０．１／０．２／０．４％Ｍｅｔにかけた。マウスを毎日監視し、定期的に体重を量り、出血させた。新たに見られた死体を剖検および組織学的分析に供した。
マウスを６つの群（Ａ～Ｆ）に分類した。Ａ群はＨＭＤの７匹の雌ＨＯマウスからなっていた。Ｂ群はＨＭＤの１匹の雄Ｉ２７８Ｔマウスおよび１匹のメスＩ２７８Ｔマウスからなっていた。Ｃ群は０．４％Ｍｅｔを補充したＲＥＧ食の１匹の雄Ｉ２７８Ｔマウスおよび１匹の雌Ｉ２７８Ｔマウスからなっていた。Ｄ群は０．２％Ｍｅｔを補充したＲＥＧ食の１匹の雄Ｉ２７８Ｔマウスおよび２匹の雌Ｉ２７８Ｔマウスからなっていた。Ｅ群は０．１％Ｍｅｔを補充したＲＥＧ食の１匹の雄Ｉ２７８Ｔマウスおよび１匹の雌Ｉ２７８Ｔマウスからなっていた。Ｆ群はＲＥＧ食の１匹の雌Ｉ２７８Ｔマウスおよび２匹の雄Ｉ２７８Ｔマウスからなっていた。肉眼剖検用の対照は４匹の雌ＨＯマウス；２匹の雄および２匹の雌成体Ｉ２７８ＴおよびＷＴ、２匹の雌青年期Ｉ２７８Ｔマウス、ならびに３匹の雄および３匹の雌青年期Ｉ２７８ＴおよびＷＴマウスを含んでいた。全ての剖検対照は標準（ＳＴＤ）食であった。
ＨＭＤの７匹の雌ＨＯマウスのうちの３匹が１１日目～１８日目の間に死亡した。これらのマウスは成長しておらず、体重減少している、または体重増加が完全に休止していた。ＨＭＤでは、ＨｃｙとＭｅｔの両方が実質的に増加していることが観察され、Ｃｙｓは常に低く維持されていた。予備的組織学的所見は、変性した卵胞、脂肪の鹸化を伴う膵外分泌部、液胞、および心筋の多巣性石灰化、死んだニューロンを含む髄質、Ｔリンパ球の突出したアポトーシスを伴う胸腺異形成、脂肪肝、炎症および線維症を示した。
Ｉ２７８Ｔマウスについては、血漿Ｈｃｙが、食事からではなく、水中の補充Ｍｅｔを受けているマウスで増加することが観察された。血漿Ｍｅｔは、Ｈｃｙと同様に増加することが観察されたが、ＲＥＧ食の対照マウスを除いて、Ｍｅｔ摂取に依存していた。Ｉ２７８Ｔマウスについての予備的組織学的所見は、線維症および炎症を伴う膵外分泌部、肝臓炎症、脂肪症、変性した毛包および腸管上皮、Ｔリンパ球の突出したアポトーシスを伴う胸腺異形成、および十二指腸の血液を示した。
時間経過にわたる体重および代謝産物レベルを測定した。肉眼剖検および光学組織学も実施した。
実施例１２．非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における毒性試験
本明細書に記載される医薬品の毒性を、２６週間にわたるＮＨＰへの３日に１回および１日１回の皮下（ＳＣ）投与後に決定した。
８匹の雄および雌カニクイザルの群に、以下の試験設計に従って、ビヒクル対照（ＰＢＳ）または医薬品（投与体積約０．４ｍＬ／ｋｇ）のＳＣ注射を受けさせた。この試験における最高用量は、製剤中の２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳの最大の達成可能な濃度および慢性的にＳＣ注射によってサルに安全に投与することができる最大用量体積に基づく最大の実行可能な用量を表す（全体が本願明細書に援用される、ガッドら（Ｇａｄ ｅｔ ａｌ．）Ｉｎｔ Ｊ Ｔｏｘｉｃｏｌ．２０１６年３月～４月；３５（２）：９５－１７８参照）。用量範囲は、予期される治療用量範囲に及ぶ（０．５～７ｍｇ／ｋｇ）。最高用量は、皮下注射用の製剤の粘度、サルにおける慢性注射用の推奨体積、およびヒトと比較してサルにおいて計画される曝露時間の考慮に基づいていた。表１７は処置群１～６についての詳細を示す。
Figure 2022539077000019
毒性の評価は、死亡率；臨床観察；体重および体温；血圧；定性的摂食量；眼科観察；身体、神経学的および呼吸検査；ＥＣＧ；ならびに臨床および解剖病理学に基づいた。代謝産物および活性、補体（ＣＨ５０）、ＡＤＡおよび抗ＰＥＧ抗体、ならびにＴＫ分析のために血液試料を収集した。
いずれの群についても、投与時期中に、ＰＲ間隔、ＱＲＳ継続期間、ＱＴ間隔、補正ＱＴ（ＱＴｃ）間隔または心拍数の医薬品に関連する変化は観察されなかった。ＥＣＧの定性評価中に、医薬品に起因する律動異常も定性的ＥＣＧ変化もなかった。
計画された屠殺時に、臨床病理学、器官重量、巨視的肉眼所見に対する医薬品に関連する効果は観察されなかった。全ての動物が計画された屠殺まで生き延びた。さらに加えて、いずれの投与量についても、医薬品に関連する臨床観察；体重、体重増加もしくは血圧の変更；または神経行動学的観察、体温もしくは呼吸の変化は認められなかった。
したがって、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳについての安全性データベースの完全性を考えると、ＰＥＧ関連空胞形成は、ヒト研究でリスクがあると予想されない。カニクイザルにおける繰り返し投与毒物学データは、最大６か月間にわたる繰り返し投与後のＣＢＳＤＨの様々なマウスモデルにおける安全性データと組み合わせて、臨床試験におけるヒト開始用量および用量漸増を支持するのに適正かつ十分であると考えられる。
上記の試験中にＳＣ注射部位を観察した。繰り返し投与の医薬品を注射したＮＨＰにおいて、１つまたは複数の皮下注射部位での極小～わずかな血管周囲単核浸潤物が観察された。
実施例１３．ヒトにおけるホモシスチン尿症の処置
ヒトにおけるホモシスチン尿症の処置を分析するために、遺伝学的に確認されたＣＢＳＤＨ患者で、２パート二重盲検無作為化プラセボ対照試験を実施する。適格患者を登録し、３：１比の医薬品を受ける患者とプラセボを受ける患者に無作為化する。コホートは、ＣＢＳＤＨの遺伝子確認および８０μＭ以上の上昇した血漿ｔＨｃｙレベルを有する、１６～６５歳の間（１６歳および６５歳を含む）の患者を含む。ＣＢＳＤＨの診断および管理についての２０１６ガイドラインによると、ｔＨｃｙレベルを可能な限り正常に近く（１０～１５μＭまたはそれ未満）、確実に１００μＭ未満に維持すべきである（全体が本願明細書に援用される、非特許文献１２参照）。８０μＭ以上の組み入れ基準は、日毎のおよびアッセイの変動性に同意し、１００μＭの典型的なレベルを有する患者の組み入れを可能にする。あるいは、３０μＭ以上のｔＨｃｙレベルを使用してＣＢＳＤＨ患者を定義することができる。
医薬品は、２ｍＬ単回使用バイアルに充填された２５±３ｍｇ／ｍＬの原薬の１ｍＬ滅菌溶液として供給する。処置はセンチネル投与で１２週間続き、投与期間と試験薬物（医薬品またはプラセボ）ウォッシュアウト期間に分けられる。
試験薬物（医薬品またはプラセボ）はＳＣ注射を介して投与する。注射は、注射の投与者によって決定されるように、腕、腹部、大腿または臀部で行われる。１注射部位当たりの最大体積は２ｍＬまたは機関の標準的な手順によった。
３種の用量レベルを、３つの連続コホートを介して順次評定するよう計画する。各用量レベルコホートは４人の対象を含む：３人の対象は活性薬物（２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ）を受けるよう無作為化され、１人の対象はプラセボを受けるよう無作為化される（活性／プラセボの３：１無作為化比）。試験薬物を毎週ＳＣ投与する。各コホートに以下の投与量を投与する：
コホート１：０．３３ｍｇ／ｋｇ；
コホート２：０．６６ｍｇ／ｋｇ；および
コホート３：１．０ｍｇ／ｋｇ。
投与期間は試験薬物の６回の毎週投与からなり、これに試験薬物を投与しない６週間の期間が続く。以下のプロトコールを使用した延長された投与期間の試験を１２週間超にわたって実施する。
１週目の１日目の間、各対象は最小で２４時間にわたって入院患者として臨床現場に入院し、その間、投与前および投与後安全性監視（バイタルサイン、１２誘導ＥＣＧ）、安全性の実験室パラメーター用の採血、薬物動態（ＰＫ）／薬力学（ＰＤ）評価用の採血、ならびに抗体レベル（投与前のみ）を受け、引き続いて最初の試験薬物投与を受ける。
ＰＫ／ＰＤ評価用の採血、およびバイタルサイン、１２誘導ＥＣＧのフォローアップ安全性監視、および副作用（ＡＥ）または重大な副作用（ＳＡＥ）の評価、ならびに安全性の実験室パラメーター用の採血も、２日目に始めて実施する。血液試料およびフィンガースティック血液スポット試料を、投与前（０時間）および現場での試験薬物投与の２、４、８、１２時間後（１日目）および２４時間後（２日目、退院前）に採取する。ＤＢＳおよびＰＳＤでの血液スポットからの探索的フィンガースティックｔＨｃｙ評価を現場で実行する。臨床評価および他の安全性評価も実施する。
３日目に、対象は、ＰＫ／ＰＤ評価用の採血（４８時間採血）、ＤＢＳおよびＰＳＤの探索的フィンガースティックｔＨｃｙ評価、ならびにＡＥまたはＳＡＥの安全性監視のフォローアップ、バイタルサイン、１２誘導ＥＣＧならびに安全性の実験室パラメーター用の採血のために現場に戻る。
４、５、６および７日目に、対象は、試験薬物の投与の７２時間後［４日目］、９６時間後［５日目］、１２０時間後［６日目］および１４４時間後［７日目］に、ＡＥまたはＳＡＥの安全性監視のフォローアップ、バイタルサイン、および安全性の実験室パラメーター用の採血、およびＰＫ／ＰＤ評価のために、訪問認定医療専門家によって実行される往診評価を受ける。安全性のシグナル／懸念によって指し示される場合、対象は完全な評価のために予定外の現場訪問をするよう指導される。
２～５週目の間、各対象は、訪問４、５、６および７で、試験薬物投与、安全性評価、免疫原性（３週目のみ）、ＰＫ／ＰＤ採血、ならびに脳深部刺激療法（ＤＢＳ）およびパワースペクトル密度（ＰＳＤ）の探索的フィンガースティックｔＨｃｙ評価のために毎週の現場訪問をする。
ウォッシュアウト期間は、試験薬物投与期間が完了したら、３６日目に始まる。この期間中に、安全性監視ならびに経時的ＰＫ／ＰＤ評価を実行する。各対象は、訪問医療専門家による毎週の往診、引き続いて６週間のウォッシュアウトの終わりに１回の現場訪問を経験する。この期間中の評価は、安全性、バイタルサインの監視、および日常的な実験室試験、ＰＫ、ＰＤおよび免疫原性用の採血を含む。ＤＢＳおよびＰＳＤの血液スポットからの探索的フィンガースティックｔＨｃｙ評価を、ウォッシュアウト期間の最後の訪問時に臨床現場で実行した。
安全性に関して、１週間に１回の０．３３ｍｇ／ｋｇの開始用量は、ＮＨＰにおけるＮＯＡＥＬ（すなわち、３日に１回の１０ｍｇ／ｋｇ）よりも約３０倍低い。１．０ｍｇ／ｋｇの計画された最高用量は、ＮＨＰにおけるＮＯＡＥＬよりも約１０倍低い。よって、プロトコールの計画された用量範囲は大きな安全域を提供する。
安全性の考慮事項に加えて、マウス、ラットおよびＮＨＰからのＰＫ／ＰＤデータの外挿は、計画された用量および間隔がＣＢＳＤＨ患者において治療上関連する血漿濃度を達成することを指し示す。マウスにおける薬理学試験は、単回注射後の、約５０ｍＵ／μＬの曝露が効果的であったことを指し示している。ヒトにおけるＰＫ／ＰＤ外挿は、１週間に２回の０．３３ｍｇ／ｋｇまたは１週間に１回の０．６６ｍｇ／ｋｇの用量が、６週間の投与後にこの効果的なレベルに達することを指し示している。ヒトにおける外挿／予測半減期は１７５時間または７．３日である。
実施例１４．予備的フェーズ１／２臨床試験結果
（実施例１３に詳細に記載されるように）８０μＭ以上の総ホモシステイン（ｔＨｃｙ）レベルを有する、ＣＢＳの遺伝的欠損に続発性の記録されたＨＣＵ歴を有する、１２～６５歳の間（１２歳および６５歳を含む）の患者を調べる、進行中のフェーズ１／２試験からの予備的結果は、小児患者と成人患者の両方における、最大１年間、最大６か月間、最大４５日間、または最大１か月間の期間にわたる曝露により、１週間に１回または２回投与される１ｍｇ／ｋｇ用量の２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳの有効性を確認している。試験は、低い安全性リスクおよび低い免疫原性で、優れた安全性プロファイルを実証している。例えば、ほとんどのＴＥＡＥ（処置下で発現した有害事象）は軽度で、少数が中等度であった。わずか１例のＳＡＥ（有意な有害事象）が患者で記録された；この患者は２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳの１投与を抜かし、問題なく投与を再開した。
軽度の免疫原性が観察された。観察された抗薬物抗体（ＡＤＡ）力価は、１人の患者を除いて投与前力価と同様であり、最大力価は４１００であった。その上、検出された抗体はＰＫ結果に基づいて非中和である。観察された抗ＰＥＧ力価は、投与前力価と同様であり、同じようにＰＫ結果に基づいて非中和である。これらの結果は、比較酵素療法、例えば、３か月までに１００００００のＡＤＡ力価および１か月までに約１００００の抗ＰＥＧ力価を示したＰａｌｙｎｚｉｑよりも優れている。他の酵素療法は、日常的に１０００以上の力価を観察する。
予備的結果は、４つの非盲検コホートのうちの３つで、（１週間に１回または２回の１ｍｇ／ｋｇで）１週目および６週目にベースラインｔＨｃｙレベルからの最大約５０％の平均減少を実証している（４つのコホートのうちの１つはプラセボ対照を受けており、活性医薬品を受けていない）。１週目および６週目の間の毎日のサンプリングは、４つの非盲検コホートのうちの３つで、ベースラインｔＨｃｙレベルからのおおよそ４０～６０％の減少を示した（４つのコホートのうちの１つはプラセボ対照を受けており、活性医薬品を受けていない）。（４つの非盲検コホートのうちの１つで）観察されたピーク有効性は、２／３の患者で、約１００μＭ～約２００μＭのベースラインレベルからおおよそ５０μＭへのｔＨｃｙレベルの降下をもたらした。２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳレベルは、患者ごとにｔＨｃｙ低下と密接に相関していた。更新されたモデルは、１週間に２回の投与（１または１．５ｍｇ／ｋｇ）が、観察されるピーク有効性の二倍超となり、ｔＨｃｙの定常状態レベルを達成すると予測している。
これらの結果は、上記の方法に従って対象に投与された２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳが、（天然酵素とは異なって）血漿中で活性かつ安定であり、根底にある病理学から独立して、上昇したｔＨｃｙレベル（細胞内および血漿）を劇的に低下させることを実証している。
実施例１５．２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳはホモシスチン尿症のマウスモデルにおいて食事を楽にすることおよびベタインの中止を可能にする
ホモシスチン尿症のマウスモデルにおける予備的試験は、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳによる長期連続処置（例えば、最大１６週間）が、食事にかかわらず、ｔＨｃｙレベルを有意に低下させる、および／または正常化することを実証している。図３に示されるように、標準メチオニン食（「ＳＴＤ」）のＨＯマウスは、ベタインを投与していても、上昇したｔＨｃｙレベル（例えば、１００μＭ超）を有していた。２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳの投与は、ベタインを取り止めた後でさえ、ｔＨｃｙレベルを劇的に低下させた、または正常化した。
ＨＯマウスを使用して、ヒト対象におけるホモシスチン尿症の重要な生化学的指標を再現した。雄と雌の両方のＨＯマウスを使用し、特に指し示さない限り、標準完全食（ＳＴＤ、５．０ｇ／ｋｇ Ｍｅｔおよび３．０ｇ／ｋｇシステインを含むテクラッド社（Ｔｅｋｌａｄ）完全食２９２０Ｘ）で維持した。マウスを、Ａ、ＢおよびＣの３つの群に分けた。Ａ群は１０週目までＳＴＤのままとした。Ｂ群およびＣ群は、１０週目まで、それぞれ、高Ｍｅｔ食（ＨＭＤ、Ｍｅｔに富むアミノ酸規定食ＴＤ．０１０８４、８．２ｇ／ｋｇ Ｍｅｔおよび３．５ｇ／ｋｇシステイン）およびＭｅｔ制限食（ＭＲＤ、Ｍｅｔ欠乏アミノ酸規定食ＴＤ．１１０５９１、０．５ｇ／ｋｇ Ｍｅｔおよび３．５ｇ／ｋｇシステイン）とした。３つの群を、追加の処置なしで、最初の２週間にわたってこれらの食事で維持した。（この期間中のＢ群における死亡は、試験を完了するために追加のマウスの登録を必要とした）。マウスはこれらの食事を続け、３週目～５週目にベタイン（飲料水中２％ｗ／ｖ）も施した。食事およびベタインを続けているマウスを、６週目に始めて、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ（１週間に３回の７．５ｍｇ／ｋｇ ＳＣ）でも処置した。次いで、ベタインを９週目から中断し、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ処置を試験の最後（１６週目）まで続けた。食事の切り替えを以下の通り実施した：切り替え１回目（１１週目～１２週目）、Ａ、ＢおよびＣ群をそれぞれＨＭＤ、ＭＲＤおよびＳＴＤに切り替えた；切り替え２回目（１３週目～１４週目）、Ａ、ＢおよびＣ群をそれぞれＭＲＤ、ＳＴＤおよびＨＭＤに切り替えた；切り替え３回目（１５週目～１６週目）、Ａ、ＢおよびＣ群をそれぞれ元の食事であるＳＴＤ、ＨＭＤおよびＭＲＤに切り替えて戻した。血液を、試験全体を通して１週間に１～３回、収集し、Ｈｃｙ、ＭｅｔおよびＣｙｓを含む代謝産物の血漿レベルをアッセイした。血液試料は、顎下サンプリング用に設計された使い捨てランセットを使用して、意識のある試験動物の顎下静脈からＣａｐｉｊｅｃｔ Ｔ－ＭＬＨＧリチウムヘパリンチューブ（テルモメディカル社（Ｔｅｒｕｍｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、米国ニュージャージー州サマセット）に収集した。血漿を、１２００×ｇで１０分間の遠心分離後に血液試料から収集し、１．５ｍｌチューブに－８０℃で貯蔵した。血漿アミノチオール（総ＣｙｓおよびＨｃｙ）および残りのアミノ酸、ならびにＳＡＭおよびＳＡＨを、その内容全体が本願明細書に援用される、アーニング（Ａｒｎｉｎｇ）およびボッティグリエリ（Ｂｏｔｔｉｇｌｉｅｒｉ）、生体分子分析における質量分析の臨床適用（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｉｎ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ）、編者ユー ガルグ（Ｕ．Ｇａｒｇ）２０１６、シュプリンガー社（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）：ニュージャージー州セコーカス、２５５－２６２頁に記載されるようにＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定した。要因ＡＮＯＶＡ、引き続いてテューキーのＨＳＤ事後検査を適用した。ｐ＜０．０５の値を統計学的に有意とみなした。
図３に示されるように、血漿Ｈｃｙレベルは、それぞれの食事におけるＭｅｔレベルに従って、ＳＴＤのマウスにおけるベースラインレベル（約９５～１６６μＭ）から劇的に変化した。よって、ＭＲＤ単独に切り替えた後、Ｈｃｙレベルは約２６～５６μＭに低下し、ＨＭＤはＨｃｙレベルを４００μＭ超に上昇させた。ベタインは、ＭＲＤのマウスでＨｃｙレベルを正常化した（１６μＭ以下）が、ＨＭＤおよびＳＴＤのマウスではそれぞれ部分的にのみ有効および無効であった。この観察は、ベタインとＭｅｔ制限の組み合わせでＨＣＵを処置する慣習を支持した。依然としてベタインを受けている、ＨＭＤまたはＳＴＤのマウスでは、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳの導入により、Ｈｃｙレベルが約２２～５５μＭに劇的に低下した。重要なことに、ベタインを中断したが、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ処置を続けた場合、これらの低いＨｃｙレベルは安定なままであり、ＭＲＤのマウスにおけるレベルは正常化したままであった。さらに、ＭＲＤのマウスをＳＴＤまたはＨＭＤに切り替えた場合でさえ、食事の切り替えで、血漿Ｈｃｙはまたこれらの低い安定なレベルのままであった。
ベタインを添加した場合（データは示さない）、ＨＭＤのＨＯマウスで血漿Ｍｅｔレベルは約２倍、さらにより重度には、最大７倍上昇した。これは、Ｈｃｙ上昇と一緒に、雌で増悪した、Ｂ群における高い死亡率に寄与した可能性がある。ＨＭＤのマウスにおいてベタインで観察された大いに上昇したＭｅｔは、Ｍｅｔが、ジメチルグリシン（ＤＭＧ）と一緒に、ベタイン－ホモシステインメチルトランスフェラーゼ（ＢＨＭＴ）によって触媒されるベタインとＨｃｙとの間の反応の生成物であるという事実と一貫していた。よって、ＤＭＧレベルもＢ群で最も高く、この群におけるＢＨＭＴ基質Ｈｃｙの利用可能性の増加と一貫していた。
ベタインに加えると、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ処置は、Ｂ群における血漿Ｍｅｔレベルを、ＡおよびＣ群のレベルと同等の値に低下させるのに高度に有効であった。また、これらの低Ｍｅｔレベルは、ベタインの取り止めおよびその後の食事の切り替えの後でさえ、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ処置によって維持された。別の興味深い観察は、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ処置をベタインと一緒に投与した場合、Ｂ群のＤＭＧレベルが約半分に降下したことであった（データは示さない）。このことは、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳが、Ｈｃｙについてベタインと有効に競合することを示唆していた。
ＨＯマウスの血漿ＣｙｓレベルはＷＴ対照（約２００μＭ）のレベルのおおよそ半分であるが、ＭＲＤのＨＯマウスでは完全に正常化された（約２２６～２３６μＭ）（データは示さない）。ベタイン単独では、いずれの群でもＣｙｓレベルを改善しなかったが、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳを添加すると、ＨＭＤ（約１５２～２１９μＭ）およびＳＴＤ（約１５６～１９５μＭ）のマウスのＣｙｓレベルが部分的～完全に正常化した。試験全体を通してかなりの推移があったが、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳによって正常化されたＣｙｓレベルは、ベタイン除去によっても、その後の食事の切り替えによっても影響を受けないように見えた。その触媒活性と一貫して、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳは全ての群で、特にＳＴＤまたはＨＭＤで始めた群でＣｔｈレベルを上昇させ、推移は大きいが、ＨｃｙレベルとＣｔｈレベルとの間の相関を示唆している（データは示さない）。
Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）とＳ－アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）の比も監視した（データは示さない）。他の群と比較して、Ｃ群のマウスではＳＡＭ／ＳＡＨ比が実質的に高く、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ処置でいくらか減少した。ＡおよびＢ群では、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ処置が、ＳＡＭ／ＳＡＨ比の中等度の増加を引き起こした。食事の切り替え前は、Ｃ群でわずかに高かったが、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ処置の間、全ての群のＳＡＭ／ＳＡＨ比は同様であった。
全体として、ベタインの存在下で、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ処置は、ＨＭＤを供給されたＨＯマウスの血漿ＭｅｔレベルおよびＨＭＤまたはＳＴＤを供給されたマウスのＨｃｙレベルを実質的に低下させた。ＭＲＤのＨＯマウスでは、ベタイン単独で血漿Ｈｃｙを正常化するのに十分であった。ＳＴＤまたはＨＭＤのマウスでは、ベタインはそうではなかったが、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳはＣｙｓレベルを正常化した。ベタインを除去して、食事の切り替えによってＭｅｔ摂取量を変動させた場合でさえ、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ単独でも、これらの代謝改善を維持するのに十分であった。この観察は、ＤＭＧレベルの変化と一緒に、ベタイン補充が、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳと共投与した場合に、追加された利点を提供しないことを指し示した。
実施例１６．凍結乾燥２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ製剤の調製および分析
（ｉ）凍結乾燥時間の減少、（ｉｉ）再構成時間の減少、（ｉｉｉ）粘度の低下、および／または（ｉｖ）２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳの脱ＰＥＧ化の減少をもたらした製剤を識別するために、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳの様々な製剤を試験した。以下に記載されるように、ｐＨ７．５の２５ｍＭリン酸カリウム、５％スクロース中２５．４ｍｇ／ｍｌの濃度の２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳを使用して、表１８に記載される製剤を調製した。
Figure 2022539077000020
活性製剤を凍結乾燥前（本明細書では「Ｔ－液体」と呼ぶ）ならびに凍結乾燥後（本明細書では「Ｔ－Ｌｙｏ」および安定性試験の「Ｔ０」と呼ぶ）に分析した。その後、凍結乾燥材料を５℃、２５℃／６０％相対湿度および４０℃／７５％相対湿度で最大３か月間（Ｔ３Ｍ）にわたって安定性試験に配置した。凍結乾燥製剤の安定性も１か月（Ｔ１Ｍ）で試験した。
Ａ．試料調製
製剤調製の３日前に、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ（２５ｍＭリン酸カリウム、５％スクロース、ｐＨ７．５中２５．４ｍｇ／ｍｌ）を冷凍庫（－８０℃）から取り出し、５℃の冷蔵庫中で７２時間解凍した。解凍後、２５ｍＭリン酸カリウム、５％スクロース、ｐＨ７．５中２５．４ｍｇ／ｍｌの２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳを穏やかに旋回することによってホモジナイズした。２０ｋＤａカットオフ透析カセットおよびそれぞれ１：４５以上の体積比の３回の緩衝液交換（１交換当たり３３００ｍｌの緩衝液）を使用して、５℃の制御された条件下で２４時間の透析によって製剤を生成した。緩衝液を３時間および６時間の全透析時間後に交換し、最後の透析工程を一晩実施した。透析後、製剤を透析カセットから除去し、引き続いてｐＨ、浸透圧およびタンパク質濃度を分析した。全ての製剤について、タンパク質濃度は２０～３０ｍｇ／ｍｌの仕様内であることが見出された。表１８に記載される製剤Ｆ３については、１０％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０（ＰＳ８０）のストック溶液を透析材料にスパイクして、その最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）を達成した。
Ｂ．凍結乾燥
Ｅｐｓｉｌｏｎ ２－１２Ｄパイロットスケールフリーズドライヤー（ＲＮＤ－ＦＤ０２、マーチンクリスト社（Ｍａｒｔｉｎ Ｃｈｒｉｓｔ）、ドイツ）を使用することによって、製剤のフリーズドライを実施した。一次乾燥の開始前に、全ての製剤を１つのフリーズドライヤー中に合わせた。静電容量ゲージによって、フリーズドライプロセス中の真空乾燥を制御した。最適化された凍結乾燥プロセスを表１９に要約する。５℃へのバイアルの平衡化後、バイアルを－４５℃に凍結し、－４５℃でさらに５時間平衡化した。一次乾燥中、棚温度を３１時間、－１５℃に設定した。二次乾燥は４０℃の棚温度で２．５時間実施した。凍結乾燥プロセスの最後に、チャンバーを窒素で８００ｍｂａｒまで通気し、棚を持ち上げることによって、バイアルに栓をした。栓をした後、チャンバーを窒素により大気圧まで通気した。
Ｃ．凍結乾燥製剤の再構成
凍結乾燥生成物を、高度純水を使用して再構成した。再構成体積を、凍結乾燥中の重量損失として重量測定で決定した。再構成時間を、液体を添加した後に凍結乾燥生成物の完全な再構成を達成するための時間として測定した。再構成挙動を、主に発泡に関して、判断した。安定性試験全体を通して全ての製剤の再構成時間を決定した。全体として、再構成時間は５４秒～４．７５分の範囲であった。製剤間で、完全な再構成に達するのにより多くの時間が必要とされた製剤Ｆ５を除いて、再構成時間に実質的な差異は観察されなかった。さらに、全ての製剤が、中等度～強度のレベルの同等の発泡形成を示した。
Ｄ．凍結乾燥製剤の分析
安定性試験のＴ０での凍結乾燥製剤の光学的外観を評定した。考慮したパラメーターは、ケークの緻密性、バイアル壁との接触、ケーク形状、色および全体的な外観を含んでいた。ケーク構造を有する全ての製剤が優れた外観を示し、高密度であり、実際は茶色がかっていた。さらに、結晶性ケークのわずかな縦方向の縮みが観察された。Ｆ１、Ｆ３およびＦ６はケーク内にいくらかの軽微な亀裂を示し、他の全ての製剤のケークは損傷を受けていないように見えた。全体として、製剤間で大きな差異は観察されなかった。試験した貯蔵条件のいずれについても、１か月の安定性試験後に、ケークの光学的外観は変化しなかった。３か月での製剤のサブセット（Ｆ１、Ｆ３およびＦ７）の光学的外観の評定も、光学的外観の変化を明らかにしなかった。
２０００～３７５０ルクスで、欧州薬局方（第９版；モノグラフ２．９．２０）に従って、白色背景の前で５秒間および黒色背景の前で５秒間の穏やかな手動による放射状の攪拌下で、眼に見える粒子の存在または非存在についてバイアルを点検した。全ての製剤が、眼に見えるタンパク質性粒子がないことが見出され、強い着色を特徴とした。その上、一部の試料は粘性溶液として分類された、または気泡を捕集する傾向を示した。
少ない試料体積のための通常のイオン強度電極（ＩｎＬａｂ（商標）Ｍｉｃｒｏ Ｐｒｏ ＩＳＭ）を使用して、較正したｐＨメーター（ＳｅｖｅｎＣｏｍｐａｃｔ（商標）ＳＣ Ｓ２１０－Ｂ、メトラートレド社（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｒｅｄｏ ＡＧ）、スイスシュヴェルツェンバハ）で製剤のｐＨ値を測定した。ｐＨ分析は、全ての製剤について、凍結乾燥前ならびに安定性試験の経過全体を通して実施した。全ての試料について、ｐＨ７．５±０．３の仕様範囲内のｐＨ値を測定した。
試料の浸透圧は、Ｇｏｎｏｔｅｃ ＯＳＭＯＭＡＴ ３０００浸透圧計（ゴノテック社（Ｇｏｎｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）、ドイツ）を使用して、凝固点降下の方法によって測定した。凍結乾燥製剤の浸透圧を、２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳ（２５ｍＭリン酸カリウム、５％スクロース、ｐＨ７．５中２５．４ｍｇ／ｍｌ）の浸透圧値と比較した。凍結乾燥前後で同等の浸透圧値が得られた。
全ての製剤のタンパク質濃度を、凍結乾燥前ならびに安定性試験全体を通して、ＵＶ分光法によって分析した。得られたタンパク質濃度の全てが、２０～３０ｍｇ／ｍｌの仕様範囲内にあった。凍結乾燥前後のタンパク質濃度を比較すると、全ての製剤について５％以下の差異が観察された。それ故に、タンパク質濃度と浸透圧の両方の分析は、フリーズドライ中の水分損失の正確な決定を指し示している。
Ｋｉｎｅｘｕｓ ｕｌｔｒａｐｌｕｓレオメーター（マルバーンインストルメンツ社（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、英国）を使用して、粘度測定を行った。決定された製剤の粘度は約１８～２７ｍＰａ＊ｓの範囲内であった。表２５。粘度に対する貯蔵時間の影響も時間の影響も観察されなかった。しかしながら、製剤を比較すると、実質的に異なる粘度が測定された。粘度値をＵＶ分光法の結果と比較すると、溶液粘度とタンパク質濃度の相関が明らかであった。
ＮＥＰＨＬＡ濁度計（ドクターランゲ社（Ｄｒ．Ｌａｎｇｅ）、ドイツ）を使用して、製剤の濁度を測定した。全体として、全ての製剤について、調製後ならびに安定性試験の経過全体を通して低い濁度が得られた。製剤間で実質的な差異は観察されなかった。２～８℃で貯蔵した２つの試料（Ｆ２およびＦ４）は、２５℃または４０℃で貯蔵したそれぞれの試料よりも高い濁度を示した。これらの増加した値は測定アーティファクトである可能性がある。
スペクトル比色計（ＬＩＣＯ ６９０ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ、英国）を使用することによって、液体の製剤の色も評価した。時点および製剤組成にかかわりなく、全ての試料が、赤スケール内のＲ１に最も近いと分類された。
マイクロフローイメージング（ＭＦＩ）を使用することによって、肉眼では見えない粒子（約１～１００μｍ）の定量化および可視化、ならびにシリコーン油液滴とタンパク質粒子の差別化を実施した。ＭＦＩによって決定される２μｍ以上の粒子の濃度を決定した。全体として、全ての製剤、貯蔵条件および時点について非常に低い粒子濃度が決定された。安定性試験の経過内の粒子含有量の変化に関する明らかな動向は識別されなかった。
製剤調製後ならびに凍結乾燥試料の再構成後の全ての安定性時点で、高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ－ＳＥＣ）を実施した。全体として、全ての試料が、安定性試験全体を通して、高いＰＥＧ－ＣＢＳ含有量を示し、非ＰＥＧ化分子の含有量の増加を示さなかった。
全ての試料について、逆相高速液体クロマトグラフィーも実施した。１０個の識別可能なピークがクロマトグラムで識別され、これらを保持時間の増加と共にピーク１～ピーク１０と命名した。ここで、ピーク６～９の相対面積の減少およびピーク１～４の相対面積の増加が観察可能であった。
フリーズドライ顕微鏡法（ＦＤＳＣ １９６、レザルテック社（Ｒｅｓｕｌｔｅｃ）、ドイツ）によって、真空下での凍結製剤の挙動を分析した。崩壊発生温度（Ｔｃ，ｏｎ）に従って凍結乾燥プロセスパラメーターを調整するために、フリーズドライ顕微鏡法（ＦＤＭ）測定をＴ－液体（凍結乾燥前の製剤）で実施した。決定されたＴｃ，ｏｎ値は－２２℃～－１４℃の範囲にあった。よって、凍結乾燥実行の一次乾燥中の棚の設定温度に対応する－２５℃より上の温度で製剤のいずれも崩壊を示さなかった。
要約すると、７種の製剤を、その再構成時間、粘度ならびに最大３か月間にわたる２～８℃、２５℃および４０℃での貯蔵後の安定性に関してスクリーニングした。ケーク再構成時間および試料粘度に関して、製剤間でも、分析時点間でも相当な差異は見られなかった。Ｆ５の生成物ケークについては、他の候補と比較して実質的に長い再構成時間が測定された。２～８℃または２５℃で貯蔵した全ての試料が、全体的に優れた安定性を示した。しかしながら、４０℃の貯蔵条件では、製剤間のいくらかの差異が明らかになった。例えば、ＨＰ－ＳＥＣ分析は、１か月間の貯蔵後のピーク１の相対含有量の増加と組み合わせて、製剤Ｆ２、Ｆ４およびＦ６についてのＰＥＧ－ＣＢＳの相対含有量の減少を示した。ＲＰ－ＨＰＬＣ分析は、製剤Ｆ２およびＦ５のピーク１～４の相対面積の増加に付随する、ピーク６～９の相対面積の減少を示した。よって、凍結の間にアニーリング工程を受ける試料は、全体として、凍結の間にアニーリング工程を受けない試料よりも安定性が低いように見えた。
試験した製剤の中で、Ｆ１、Ｆ３およびＦ７製剤は、全ての貯蔵条件で（少数の例外を含む）、非常に高い安定性を示した。まとめると、製剤Ｆ１、Ｆ３およびＦ７は、これらの中で、および全ての分析時点で、同等の優れた結果を示した。
実施例１７．凍結乾燥プロセスパラメーターの分析および最適化
１５ｍＭリン酸Ｋ、８％トレハロース、ｐＨ７．５からなる実施例１６に記載されるＦ１製剤を使用して凍結乾燥プロセスを最適化した。最適化された凍結乾燥の予想される成果には、（ｉ）ケーク融解のない、凍結乾燥サイクル時間の減少、（ｉｉ）再構成時間の減少、および（ｉｉｉ）２０ＮＨＳ ＰＥＧ－ＣＢＳの脱ＰＥＧ化の減少が含まれる。
様々なプロセスパラメーターでの３回の連続凍結乾燥サイクルの経過で凍結乾燥プロセス最適化を実施した。特に、（ｉ）一次乾燥（ＰＤ）時間、（ｉｉ）ＰＤ温度、および（ｉｉｉ）二次乾燥（ＳＤ）時間をサイクル間で変動させた。サイクル１の狙いは一次乾燥パラメーターを最適化することであり、サイクル２の焦点は二次乾燥特性評価であり、サイクル３はプロセス時間を４８時間未満に減少させることを目指した。
３回の連続凍結乾燥サイクルをＥｐｓｉｌｏｎ ２－１２Ｄパイロットスケールフリーズドライヤーで実施した。チャンバー温度を静電容量ゲージによって制御し、真空ポンプおよび制御された窒素投与量によって調節した。
Figure 2022539077000021
最適化された凍結乾燥プロセスから得られた凍結乾燥製剤を本明細書に記載される分析方法によって評価した。
フリーズドライしたケークを乾燥後に光学的に評定した。考慮したパラメーターには、ケークの緻密性、バイアル壁との接触、ケーク形状、色および全体的な外観が含まれていた。凍結乾燥試料の分析により、高密度の構造および茶色がかった着色を有する優れた外観が明らかになった。
電量カールフィッシャー滴定装置Ａｑｕａ ４０．００（アナリティクイエナ社（Ａｎａｌｙｔｉｋ Ｊｅｎａ ＧｍｂＨ））を使用することによって、凍結乾燥ケークの含水量を決定した。全ての試料の低い残留含湿量が観察された。
凍結乾燥生成物のガラス転移温度（Ｔｇ）、結晶化および吸熱融解を測定するために、Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｒｅｄｏ ＤＳＣ１＿９４３（メトラートレド社（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ）、ドイツ）での示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を実施した。全体として、結果は１１１℃～１１７℃の間の範囲であり、安定な生成物ケークを指し示した。目視検査、濁度、ＵＶ分光法、ＨＰ－ＳＥＣおよびＲＰ－ＨＰＬＣによる分析の前に、凍結乾燥バイアルを再構成した。水を使用してバイアルを再構成した。観察された再構成時間は短く、同等であり、約１～約１．５分間の範囲であった。再構成すると、凍結乾燥生成物は中等度～強力な発泡を示した。
２０００～３７５０ルクスの間で、欧州薬局方（第９版；モノグラフ２．９．２０）に従って、白色背景の前で５秒間および黒色背景の前で５秒間の穏やかな手動による放射状の攪拌下で、眼に見える粒子の存在または非存在について目視検査を実施した。検査は２人の訓練された試験者によって独立に実施した。プロセス条件にかかわらず、分析した試料のいずれにも目に見える粒子は検出されなかった。全ての溶液が着色しており、粘性であるように見えた。さらに加えて、再構成後に一部の例で気泡が検出された。
８６０ｎｍで作動し、９０°角度で検出する、ＮＥＰＨＬＡ濁度計（ドクターランゲ社（Ｄｒ．Ｌａｎｇｅ）、ドイツデュッセルドルフ）を濁度測定に使用した。試験全体を通して全ての試料について非常に低い濁度が得られた。最適化サイクルの様々なプロセスパラメーターの修正は、製剤の濁度に影響を及ぼさなかった。
Ｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＳｏｌｏＶＰＥ機器を使用することによって、ＵＶ分光法を実施した。全てのタンパク質濃度が２０～３０ｍｇ／ｍｌの仕様内にあった。ほとんどの測定値について、Ｔ－液体と比較して凍結乾燥および再構成（Ｔ－Ｌｙｏ）後により高いタンパク質濃度に向かうわずかな動向が観察された。３回のサイクル全てのＴ－Ｌｙｏ試料の場合のより高い吸光度は、例えば目視検査でも観察された気泡によって引き起こされた、光散乱の結果として生じた可能性がある。
試験全体を通して、９３～９５％の間の高いＰＥＧ－ＣＢＳ含有量と同等のＨＰ－ＳＥＣプロファイルが決定された。試料のいずれにおいても脱ＰＥＧ化ＣＢＳは検出されなかった。したがって、変更した凍結乾燥プロセスパラメーターは試料のＰＥＧ化に影響を及ぼさず、ＨＰ－ＳＥＣによって検出可能な新たな種の作製にもつながらなかった。ＨＰ－ＳＥＣプロファイルと一貫して、修正された凍結乾燥プロセス条件もＰＥＧ化プロファイルに対する影響を明らかにしなかった。
Ａ２８０ｎｍ ＧＰＢＴ１１９８を使用してタンパク質濃度を決定した。ＲＰ－ＨＰＬＣ ＧＰＢＴ３０７８を介して遊離ＰＥＧ含有量を決定した。凍結乾燥前後の試料のタンパク質濃度における明確な変化も、中心と縁のバイアル試料の間の明確な変化も観察されなかった。凍結乾燥前後の試料を比較すると、遊離ＰＥＧ含有量および活性の実質的な変化は決定されなかった。よって、最適化された凍結乾燥サイクルパラメーターは、分析された生成物の品質属性に負の影響を及ぼさなかった。
要約すると、凍結、ＰＤおよびＳＤパラメーターを調整することによって、凍結乾燥プロセスを最適化することに成功した。最適化されたプロセスは、４８時間以下の実質的に減少した実行時間を特徴とする。適用された固体または液体状態分析方法のいずれも、生成物品質に対するプロセス最適化の障害を指し示さなかった。その上、サイクル３内の縁と中心のバイアル位置の比較は、生成物がＰＤ中のバッチ生成物温度不均質性に対して堅牢であることを示した。
実施例１８．下流精製プロセスパラメーターの評定
既存のプロセスの収率および回収を改善する目標で、酵素シスタチオニンβ合成酵素（ＣＢＳ）を精製するための代替下流プロセスを大規模で実施した。１０Ｌスケールの最小培地で流加発酵（高細胞密度発酵）によってバイオマスを生成した。収穫時、バイオマスを、遠心分離を介して培地から分離し、溶解緩衝液に再懸濁し、高圧ホモジナイゼーションを介して破壊した。遠心分離を介して細胞片から細胞抽出物を分離した後、ＣＢＳ含有上清を深層濾過順序によって清澄化し、次いで、（ｉ）ＨｉＴｒａｐ ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥ）を使用した捕捉工程としての陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）、（ｉｉ）Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥ）を使用した固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）（Ｚｎ２＋荷電培地を使用）中間工程、および（ｉｉｉ）Ｂｕｔｙｌ－Ｓ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ ＦＦ（ＧＥ）を使用した洗練工程としての疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を備えるその後のクロマトグラフィー列のための出発材料として使用した。精製したＣＢＳのタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）による透析濾過後、ＰＥＧ化を実施した。製剤化のために、ＰＥＧ化ＣＢＳを再度ＴＦＦによって透析濾過および濃縮した。細胞溶解物のＰＥＩ沈殿（０．３５％）、リン酸塩からＨＥＰＥＳへの緩衝液系の変化、およびＴｗｅｅｎ（商標）２０によるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の置き換えを代替プロセスで使用した。
Ａ．発酵
精製プロセス最適化およびスケールアップに必要とされるバイオマス作製のために、２つの一貫した１０Ｌ流加発酵を最小培地で実施した。全てのスケールアップ実行のために、発酵槽２で生成されたバイオマス（収穫量９．２Ｌ；バイオマス：１７９１ｇ）を使用した。
Ｂ．下流精製プロセスのスケールアップ
精製プロセス１は、以下の工程（ｉ）細胞収穫、（ｉｉ）細胞再懸濁、（ｉｉｉ）細胞破壊、（ｉｖ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）沈殿、（ｖ）遠心分離、（ｖｉ）滅菌濾過、（ｖｉｉ）リン酸塩からＨＥＰＥＳへの再緩衝化のための第３の洗浄工程によるＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦを使用した捕捉、（ｖｉｉｉ）亜鉛イオンで帯電したキレートＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦを使用した中間工程、（ｉｘ）ブチル－ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ ＦＦを使用した洗練工程、（ｘ）ＴＦＦ、（ｘｉ）ＰＥＧ化のうちの１つまたは複数を含んでいた。
精製プロセス２は、以下の工程（ｉ）細胞収穫、（ｉｉ）細胞再懸濁、（ｉｉｉ）細胞破壊、（ｉｖ）遠心分離、（ｖ）深層濾過、（ｖｉ）滅菌濾過、（ｖｉｉ）ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓ ＦＦを使用した捕捉、（ｖｉｉｉ）亜鉛イオンで帯電したＣｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦを使用した中間工程、（ｉｘ）ＨＥＰＥＳからリン酸塩への再緩衝化のために含まれる第２の洗浄工程によるブチル－ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ ＦＦを使用した洗練工程およびＣＢＳの沈殿を回避するために含まれる希釈工程、（ｘ）ＴＦＦ、（ｘｉ）ＰＥＧ化のうちの１つまたは複数を含んでいた。
Ｃ．捕捉工程
高圧ホモジナイゼーションを介した細胞破壊後、ＰＥＩ沈殿、引き続いて滅菌濾過を実行した。捕捉工程の総ＣＢＳ回収率は５８．１％（５．４ｇ ＣＢＳ；２．５ｇ／Ｌ ＣＢＳ）であった。捕捉溶出プールの総タンパク質含有量は７．５ｇであった。精製プロセス２ａのＣＢＳ回収率および収率を確認したところ（回収率８５．１％；５．４ｇ ＣＢＳ；２．６ｇ／Ｌ ＣＢＳ）、精製プロセス１（回収率４７．７％；５．３ｇ ＣＢＳ；１．０３ｇ／Ｌ ＣＢＳ）よりも高かった。全体として、ＰＥＩ沈殿およびカラムの再緩衝化は収率に対する明らかな負の効果を有さなかった。
Ｄ．中間工程
捕捉溶出プールを４℃～８℃で一晩貯蔵し、亜鉛イオンで帯電したＣｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦを使用した中間工程でプロセス２日目にさらに処理した。
Ｅ．洗練工程
中間溶出プールを２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液で希釈して、およそ１．６ｇ／ＬのＣＢＳ濃度を得た。その後、１０ｍＭ ＥＤＴＡを４℃～８℃で一晩の貯蔵のために添加した。プロセス３日目に、洗練カラムにローディングする前に、硫酸アンモニウム（最終濃度１．４Ｍ）を添加した。
フロースルーでは、吸光度シグナルは測定されなかった、すなわち、タンパク質はなく、ＣＢＳは洗い流されなかった。精製プロセスの溶出プロファイルを決定した。
精製プロセスは、９２．９％以上のＣＢＳ回収率を与えた。中間溶出プールの予備希釈により、洗練カラムでの濃縮効果およびＣＢＳの沈殿は観察されず、およそ８％の回収率の増加をもたらした。試験した全ての精製プロセスについて、全体ＣＢＳ回収率は３８．７％以上であった。溶出プールをＰＥＧ化緩衝液に対して透析濾過し、ＴＦＦ（Ｖｉｖａｆｌｏｗ ２００、５０ｋＤａ、ＰＥＳ）を介して４０ｇ／Ｌ ＣＢＳに濃縮した。ＴＦＦ保持液で、ＣＢＳ品質を決定するために、網羅的分析を実行した。
Ｆ．ＰＥＧ化
少量（１ｍＬ）のＴＦＦ保持液を小規模でＰＥＧ化し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ（ＳＥ－、ＲＰ－およびＡＥＸ－）およびＩＥＦによって分析し、ＰＥＧ－ＣＢＳ参照標準と比較した。ＳＥ－ＨＰＬＣ（４～５時間おきに測定）でＰＥＧ化速度論を監視し、相対保持＝ｔＲ（ＰＥＧ－ＣＢＳ）／ｔＲ（ＣＢＳ）×１００％（ｔＲはそれぞれの種の保持時間である）を決定した。相対保持（整数として施される）が８５％より大きかった場合、これは追加のＰＥＧを添加する必要があり得ることを指し示していた。４．３時間後の相対保持時間は８２．４％であった、すなわち、これは８５％の閾値未満であった。したがって、追加のＰＥＧを添加しなかった。２４時間のＰＥＧ化後、相対保持時間は８２．８％であった。
等価物および範囲
当業者であれば、日常的な実験にすぎないものを使用して、本明細書に記載される開示に従って、具体的な実施形態の多くの等価物を認識する、または確かめることができる。本開示の範囲は、上記の説明に限定されることを意図しておらず、むしろ添付の特許請求の範囲に明らかにされる通りである。
特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」などの冠詞は、反対のことを指し示さない限り、また文脈から明らかでない限り、１つまたは２つ以上を意味し得る。反対のことを指し示さない限り、また文脈から明らかでない限り、群のメンバーの１つ、２つ以上、または全てが所与の生成物またはプロセスに存在する、採用される、または関連する場合に、群の１つまたは複数のメンバー間に「または」を含む特許請求の範囲または説明が満たされるとみなされる。本開示は、群の正確に１つのメンバーが所与の生成物またはプロセスに存在する、採用されるまたは関連する実施形態を含む。本開示は、２つ以上の群のメンバーまたは群のメンバー全体が所与の生成物またはプロセスに存在する、採用されるまたは関連する実施形態を含む。
「～を備える」という用語は、オープンであることを意図しており、追加の要素または工程の算入を許すが、要求しないことも留意されたい。「～を備える」という用語が本明細書で使用される場合、「～からなる」という用語も包含および開示される。
範囲が施される場合、終点が含まれる。さらに、特に指し示さない限り、また文脈および当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表現される値が、文脈上別段の意味を定義することが明らかな場合を除き、本開示の様々な実施形態で明言される範囲内の任意の具体的な値または部分範囲を、その範囲の下限の単位の１０分の１まで考えることができることが理解されるべきである。
加えて、先行技術内に入る本開示の任意の特定の実施形態は、１つまたは複数の請求項から明示的に除外され得ることが理解されるべきである。このような実施形態は当業者公知と思われるので、除外が本明細書で明示的に明らかにされていない場合であっても、除外され得る。先行技術の存在に関連しようがしまいが、任意の理由で、本開示の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、任意の抗生物質、治療薬または活性成分；任意の生成方法；任意の使用方法；等）を１つまたは複数の請求項から除外することができる。
使用されている単語は限定ではなく説明の単語であること、ならびにその広範な態様において本開示の真の範囲および精神から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲の権限内で変更を行うことができることが理解されるべきである。
本開示をいくつかの記載される実施形態に関してある長さで、およびある特殊性で記載してきたが、本開示がこのような詳細もしくは実施形態または任意の特定の実施形態に限定されることを意図しておらず、本開示は、先行技術に照らして添付の特許請求の範囲の最も広い可能な解釈を提供し、したがって、本開示の意図される範囲を有効に包含するようにこのような特許請求の範囲を参照して解釈されるべきである。

Claims (61)

  1. （ａ）配列番号１を含む単離シスタチオニンβ合成酵素（ＣＢＳ）タンパク質；および
    （ｂ）前記ＣＢＳタンパク質に共有結合的に結合したＰＥＧ分子
    を備える原薬。
  2. 前記ＰＥＧ分子がＭＥ－２００ＧＳである、請求項１に記載の原薬。
  3. 請求項１または２に記載の原薬と、薬学的に許容される賦形剤、アジュバント、希釈剤または担体とを備える医薬組成物。
  4. 凍結乾燥されている、請求項３に記載の医薬組成物の製剤。
  5. 再構成すると、再構成された液体製剤が、
    （ａ）約２０～３０ｍｇ／ｍｌの濃度の前記原薬；
    （ｂ）約１５ｍＭのリン酸カリウム；および
    （ｃ）約８％（ｗ／ｖ）トレハロース
    を備える、請求項４に記載の凍結乾燥された製剤。
  6. 前記製剤の単位用量が、
    （ａ）約２５ｍｇの前記原薬；および
    （ｂ）１ｍＬの水
    を備える、再構成された、請求項５に記載の製剤。
  7. 治療有効量の請求項４～６のいずれか１項に記載の医薬組成物の製剤を対象に投与する工程を備える、対象におけるホモシスチン尿症を処置する方法。
  8. 前記治療有効量が約０．２５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲から選択される投与量である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記投与量が約０．３３ｍｇ／ｋｇである、請求項８に記載の方法。
  10. 前記投与量が約０．６６ｍｇ／ｋｇである、請求項８に記載の方法。
  11. 前記投与量が約１．０ｍｇ／ｋｇである、請求項８に記載の方法。
  12. 前記投与量が約１．５ｍｇ／ｋｇである、請求項８に記載の方法。
  13. ピリドキシン、ビタミンＢ６およびベタインからなる群から選択される少なくとも１つを前記対象に投与する工程をさらに備える、請求項７～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記対象がメチオニン（Ｍｅｔ）制限食を受けている、請求項７～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 抗血小板薬を投与する工程をさらに備える、請求項７～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記抗血小板薬がワルファリン血液希釈剤または抗凝固薬である、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記投与する工程が約３日に１回行われる、請求項７～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記投与する工程が約１日に１回行われる、請求項７～１６のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記投与する工程が約１週間に１回行われる、請求項７～１６のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記投与する工程が約６週間にわたって繰り返される、請求項７～１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記投与する工程が約３か月間にわたって繰り返される、請求項７～１９のいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記投与する工程が約６か月間にわたって繰り返される、請求項７～１９のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記投与する工程が６か月間超にわたって繰り返される、請求項７～１９のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記投与する工程が前記対象の残りの寿命にわたって繰り返される、請求項７～１９のいずれか１項に記載の方法。
  25. 治療有効量の請求項４～６のいずれか１項に記載の医薬組成物の製剤を対象に投与する工程を備える、対象におけるホモシステイン（Ｈｃｙ）レベルを低下させる方法。
  26. 前記Ｈｃｙレベルが、前記投与する工程後に約８０μＭ未満である、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記Ｈｃｙレベルが、前記投与する工程後に最大１０％低下する、請求項２５に記載の方法。
  28. 前記Ｈｃｙレベルが、前記投与する工程後に最大２０％低下する、請求項２５に記載の方法。
  29. 前記Ｈｃｙレベルが、前記投与する工程後に最大３０％低下する、請求項２５に記載の方法。
  30. 前記Ｈｃｙレベルが、前記投与する工程後に最大４０％低下する、請求項２５に記載の方法。
  31. 前記Ｈｃｙレベルが、前記投与する工程後に最大５０％低下する、請求項２５に記載の方法。
  32. 前記Ｈｃｙレベルが、前記投与する工程後に最大６０％低下する、請求項２５に記載の方法。
  33. 前記Ｈｃｙレベルが、前記投与する工程後に最大７０％低下する、請求項２５に記載の方法。
  34. 前記Ｈｃｙレベルが、前記投与する工程後に最大８０％低下する、請求項２５に記載の方法。
  35. 前記Ｈｃｙレベルが、前記投与する工程後に最大９０％低下する、請求項２５に記載の方法。
  36. 前記Ｈｃｙレベルが、前記投与する工程後に約１０μＭ～約２０μＭの範囲内にある、請求項２５～３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記Ｈｃｙレベルが、前記投与する工程後に１０μＭ未満である、請求項２５～３５のいずれか１項に記載の方法。
  38. 前記Ｈｃｙレベルが、前記投与する工程後に約５５μＭである、請求項２５～３５のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記治療有効量が約０．２５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲から選択される投与量である、請求項２５～３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記投与量が約０．３３ｍｇ／ｋｇである、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記投与量が約０．６６ｍｇ／ｋｇである、請求項３９に記載の方法。
  42. 前記投与量が約１．０ｍｇ／ｋｇである、請求項３９に記載の方法。
  43. 前記投与量が約１．５ｍｇ／ｋｇである、請求項３９に記載の方法。
  44. 前記投与量が約７．０ｍｇ／ｋｇである、請求項３９に記載の方法。
  45. 前記投与量が約１０ｍｇ／ｋｇである、請求項３９に記載の方法。
  46. 前記投与量が１０ｍｇ／ｋｇ未満である、請求項３９に記載の方法。
  47. ピリドキシン、ビタミンＢ６およびベタインからなる群から選択される少なくとも１つを前記対象に投与する工程をさらに備える、請求項２５～４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 前記対象がメチオニン（Ｍｅｔ）制限食を受けている、請求項２５～４７のいずれか１項に記載の方法。
  49. 抗血小板薬を投与する工程をさらに備える、請求項２５～４８のいずれか１項に記載の方法。
  50. 前記抗血小板薬がワルファリン血液希釈剤または抗凝固薬である、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記投与する工程が約３日に１回行われる、請求項２５～５０のいずれか１項に記載の方法。
  52. 前記投与する工程が約１日に１回行われる、請求項２５～５０のいずれか１項に記載の方法。
  53. 前記投与する工程が約１週間に１回行われる、請求項２５～５０のいずれか１項に記載の方法。
  54. 前記投与する工程が約６週間にわたって繰り返される、請求項２５～５０のいずれか１項に記載の方法。
  55. 前記投与する工程が約３か月間にわたって繰り返される、請求項２５～５０のいずれか１項に記載の方法。
  56. 前記投与する工程が約６か月間にわたって繰り返される、請求項２５～５０のいずれか１項に記載の方法。
  57. 前記投与する工程が６か月間超にわたって繰り返される、請求項２５～５０のいずれか１項に記載の方法。
  58. 前記投与する工程が前記対象の残りの寿命にわたって繰り返される、請求項２５～５０のいずれか１項に記載の方法。
  59. 治療有効量の請求項４～６のいずれか１項に記載の医薬組成物の製剤を対象に投与する工程を備える、対象におけるシステイン（Ｃｙｓ）レベルを上昇させる方法。
  60. 治療有効量の請求項４～６のいずれか１項に記載の医薬組成物の製剤を対象に投与する工程を備える、対象におけるシスタチオニン（Ｃｔｈ）レベルを上昇させる方法。
  61. 対象の眼系、骨格系、血管系および／または中枢神経系に関連付けられる負の臨床転帰を処置、緩和または予防する方法であって、治療有効量の請求項４～６のいずれか１項に記載の医薬組成物の製剤を前記対象に投与する工程を備える方法。
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