CN111712254A - 人工抗原呈递细胞和使用方法 - Google Patents

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T.J.威克汉姆
T.F-Y.陈
S.埃洛尔
R.S.萨尔瓦特
N.J.道登
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Abstract

本公开涉及人工抗原呈递细胞(aAPC)，特别是经工程化改造以激活或抑制T细胞的工程化红系细胞和去核细胞(例如去核红系细胞和血小板)。

Description

人工抗原呈递细胞和使用方法
相关申请
本申请要求于2017年12月23日提交的美国临时专利申请号62/610,149，于2018年3月29日提交的美国临时专利申请号62/650,250，于2018年5月1日提交的美国临时专利申请号62/665,445，于2018年6月4日提交的美国临时专利申请号62/680,544，于2018年6月18日提交的美国临时专利申请号62/686,656，于2018年6月21日提交的美国临时专利申请号62/688,324，于2018年6月29日提交的美国临时专利申请号62/692,623，于2018年10月12日提交的美国临时专利申请号62/745,253，于2018年11月8日提交的美国临时专利申请号62/757,741的优先权，其每一篇的全部内容为了所有目的通过引用并入本文。
序列表
本申请含有一份已经以ASCII格式电子递交的序列表并且将其在此以其整体通过引用并入。创建于2018年12月21日的所述ASCII副本被命名为129267-00120_SL.txt，并且大小是588,687字节。
发明背景
主动免疫应答依赖于抗原呈递细胞(APC)对抗原和共刺激信号的有效呈递。抗原内化后，APC可以在膜上显示抗原I类和II类主要组织相容性复合物(MHC)以及共刺激信号以激活抗原特异性T细胞，所述抗原特异性T细胞在适应性免疫应答中起关键作用。在体内，T细胞应答的诱导高度依赖于与专职抗原呈递细胞(APC)，特别是树突状细胞(DC)的相互作用，所述专职抗原呈递细胞(APC)呈递例如肿瘤特异性抗原。通常，在将抗原特异性T细胞转移回患者之前，可以对其进行离体引发(prime)和扩增。例如，在过继性细胞转移(ACT)中，分离肿瘤特异性T细胞，然后对其进行离体扩增以获得大量用于输血的细胞。作为APC之一，树突状细胞(DC)通常用于最大化T细胞的离体刺激。但是，使用天然APC(如DC)遇到了某些挑战，包括缺乏对最佳抗原加载DC的了解，并且在临床试验中发现了混合结果(SteenblockE.R.et al.,Expert Opin.Biol.Ther.2009；9:451-464；Melief CMJ Immunity.2008；29:372-383；Palucka K.and Banchereau J.Immunity.2013；39:38-48)。另外，自体DC的分离和离体刺激是耗时且昂贵的，并且离体生成的DC的质量可能是可变的(Steenblock E.R.etal.2009；Kim J.V.et al.Nat.Biotechnol.2004；22:403-410)。因此，患者衍生的自体DC的使用限制了基于DC的治疗方案的标准化(Steenblock E.R.et al.2009；Kim J.V.etal.2004)。
人工APC(aAPC)是用于T细胞激活和扩增的工程化平台，其旨在在模仿DC与T细胞之间的相互作用时避免上述障碍。它们包括多个系统，包括经工程化以激活和/或扩增所期望的免疫细胞群体(例如T细胞)的合成生物材料。这些系统可以通过模仿DC和T细胞之间的相互作用来起作用。例如，已经开发了几种细胞大小的刚性珠如乳胶微珠、包被有聚苯乙烯的磁性微珠和可生物降解的聚(乳酸-共-乙醇酸)微粒。这些珠在诱导免疫细胞的激活和/或扩增中的功效似乎高度依赖于所使用的材料的性质。例如，大于200nm的珠通常保留在接种部位，而较小的颗粒则可以被DC吸收(参见例如，Reddy et al.(2006)J.Control.Release 112:26–34)。相反，天然APC的膜比这些珠的外表面具有大得多的动态性。
仍然需要提供用于过继免疫疗法的刺激T细胞并传播(promulgate)足够数目的治疗性T细胞的改进方法。本发明提供了新的且独创的红细胞治疗剂(RCT)，特别是模仿APC(如树突状细胞(DC))的功能的aAPC，以刺激T细胞并诱导例如抗肿瘤或传染病免疫应答，或抑制T细胞活性以预防例如自身免疫性病症。
发明概述
本公开涉及人工抗原呈递细胞(aAPC)，特别是经工程化改造以激活或抑制T细胞的红系细胞和去核细胞(例如去核红系细胞和血小板)。工程化红系细胞可以是有核的，例如红细胞前体细胞。工程化红系细胞也可以是去核红系细胞，例如网织红细胞或红细胞。
与使用球形纳米颗粒(如刚性的基于珠的aAPC)相比，本文所述的aAPC提供了许多优势。仅作为一个实例，纳米颗粒的外表面是刚性且不可移动的，因此限制了多肽在其表面上的运动，而如本文所述的aAPC的外膜(即，红系细胞或去核细胞)是动态且流动的。因此，与纳米颗粒相比，本公开的aAPC允许更大的分子移动性和更有效的分子重组，这对于免疫突触形成和T细胞刺激是高度有利的。
因此，在一方面，本公开提供了经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含去核细胞，其中去核细胞在细胞表面上包含表1或表14、15和20-24中公开的至少一种外源抗原性多肽。在一些实施方案中，至少一种外源抗原性多肽是肿瘤抗原、自身免疫疾病抗原、病毒抗原、细菌抗原或寄生物。在一些实施方案中，至少一种外源抗原性多肽选自下组：黑素瘤抗原基因-A(MAGE-A)抗原、嗜中性粒细胞颗粒蛋白酶抗原、NY-ESO-1/LAGE-2抗原、端粒酶抗原、糖蛋白100(gp100)抗原、埃巴病毒(EBV)抗原、人乳头瘤病毒(HPV)抗原和乙型肝炎病毒(HBV)抗原。
在一方面，本公开提供了经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含去核细胞，其中去核细胞在细胞表面上包含第一外源抗原性多肽和第二外源抗原性多肽，并且其中第一外源抗原性多肽和第二外源抗原性多肽具有重叠至少2个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，重叠在2个氨基酸和23个氨基酸之间。
在一些实施方案中，第一外源抗原性多肽、第二外源多肽或第一和第二外源抗原性多肽是肿瘤抗原、自身免疫疾病抗原、病毒抗原、细菌抗原或寄生物。在一些实施方案中，第一外源抗原性多肽、第二外源多肽或第一和第二外源抗原性多肽是表1或表14、15和20-24中公开的多肽。在一些实施方案中，第一外源抗原性多肽、第二外源多肽或第一和第二外源抗原性多肽选自下组：黑素瘤抗原基因-A(MAGE-A)抗原、嗜中性粒细胞颗粒蛋白酶抗原、NY-ESO-1/LAGE-2抗原、端粒酶抗原、糖蛋白100(gp100)抗原、埃巴病毒(EBV)抗原、人乳头瘤病毒(HPV)抗原和乙型肝炎病毒(HBV)抗原。
在一些实施方案中，aAPC在细胞表面上进一步包含外源抗原呈递多肽。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽、MHC I类单链融合蛋白、MHC II类多肽或MHCII类单链融合蛋白。在一些实施方案中，MHC I类多肽选自下组：HLA A、HLA B和HLA C。在一些实施方案中，MHC II类多肽选自下组：HLA-DPα、HLA-DPβ、HLA-DM、HLA DOA、HLA DOB、HLADQα、HLA DQβ、HLADRα和HLADRβ。
在另一方面，本公开提供了经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含去核细胞，其中去核细胞在细胞表面上包含外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类单链融合蛋白或MHC II类单链融合蛋白。
在一些实施方案中，MHC I类单链融合蛋白包含α链和β2m链。在一些实施方案中，MHC I类单链融合蛋白进一步包含膜锚。在一些实施方案中，外源抗原性多肽经由接头与MHC I单链融合蛋白连接。在一些实施方案中，接头是可切割的接头。在一些实施方案中，MHC II类单链融合蛋白包含α链和β链。在一些实施方案中，MHC II类单链融合蛋白进一步包含膜锚。在一些实施方案中，外源抗原性多肽经由接头与MHC II单链融合蛋白连接。在一些实施方案中，接头是可切割的接头。在一些实施方案中，锚包含血型糖蛋白A(GPA)蛋白质或小整合膜蛋白1(SMIM1)的跨膜域。在一些实施方案中，外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽共价结合。在一些实施方案中，外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽非共价结合。
在一些实施方案中，aAPC在细胞表面上进一步包含至少一种外源共刺激性多肽。在一些实施方案中，至少一种外源共刺激性多肽选自下组：4-1BBL、LIGHT、抗CD28、CD80、CD86、CD70、OX40L、GITRL、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD83、CD155、CD112、与IL-15融合的IL-15Rα、IL-21、ICAM-1、LFA-1的配体、抗CD3及其组合。在一些实施方案中，aAPC在细胞表面上包含至少2种、至少3种、至少4种或至少5种外源共刺激性多肽。
在一些实施方案中，aAPC在细胞表面上进一步包含外源细胞因子多肽。在一些实施方案中，外源细胞因子多肽选自下组：IL2、IL15、与IL-15融合的15Rα、IL7、IL12、IL18、IL21、IL4、IL6、IL23、IL27、IL17、IL10、TGF-beta、IFN-gamma、IL-1beta、GM-CSF和IL-25。
在一些实施方案中，aAPC能够激活与aAPC相互作用的T细胞。在一些实施方案中，激活包含CD8+ T细胞的激活、CD4+ T细胞的激活、T细胞的细胞毒性活性的刺激、T细胞的细胞因子分泌的刺激和/或其任何组合。
在另一方面，本公开提供了经工程化改造以抑制T细胞活性的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含去核细胞，其中去核细胞在细胞表面上包含外源抗原呈递多肽、外源抗原性多肽和表7中公开的至少一种外源共抑制性多肽。
在另一方面，本公开提供了经工程化改造以抑制T细胞活性的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含去核细胞，其中去核细胞在细胞表面上包含外源抗原呈递多肽、表1或表16-19中公开的外源抗原性多肽和至少一种外源共抑制性多肽。
在一些实施方案中，aAPC进一步包含改变代谢物的多肽。
在另一方面，本公开提供了经工程化改造以抑制T细胞活性的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含去核细胞，其中去核细胞在细胞表面上包含外源抗原呈递多肽、外源抗原性多肽和至少一种改变代谢物的多肽。
在一些实施方案中，aAPC进一步包含外源共抑制性多肽。在一些实施方案中，外源共抑制性多肽是IL-35、IL-10、VSIG-3或LAG3激动剂。在一些实施方案中，改变代谢物的多肽是IDO、Arg1、CD39、CD73、TDO、TPH、iNOS、COX2或PGE合酶。
在一些实施方案中，aAPC能够抑制与aAPC相互作用的T细胞。在一些实施方案中，抑制包含T细胞增殖的抑制、T细胞的无反应化(anergizing)或T细胞凋亡的诱导。在一些实施方案中，T细胞是CD4+ T细胞或CD8+ T细胞。
在另一方面，本公开提供了经工程化改造以激活调节性T细胞(Treg细胞)的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含去核细胞，其中去核细胞在细胞表面上包含外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽。
在一些实施方案中，aAPC在细胞表面上进一步包含外源Treg扩增多肽。在一些实施方案中，外源Treg扩增多肽是CD25特异性IL-2、TNFR2特异性TNF、抗DR3激动剂(VEGI/TL1A特异性)、41BBL、TGFβ。
在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC II类多肽或MHC II类单链融合蛋白。在一些实施方案中，MHC II类多肽选自下组：HLA-DPα、HLA-DPβ、HLA-DM、HLA DOA、HLADOB、HLA DQα、HLA DQβ、HLA DRα和HLA DRβ。在一些实施方案中，MHC II类单链融合蛋白包含α链和β链。在一些实施方案中，MHC II类单链融合蛋白进一步包含膜锚。在一些实施方案中，外源抗原性多肽经由接头与MHC II类单链融合物连接。在一些实施方案中，接头是可切割的接头。在一些实施方案中，锚包含血型糖蛋白A(GPA)蛋白质或小整合膜蛋白1(SMIM1)的跨膜域。在一些实施方案中，外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽共价结合。在一些实施方案中，外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽非共价结合。
在一些实施方案中，外源抗原性多肽为8个氨基酸长至24个氨基酸长。
在一些实施方案中，去核细胞是去核红系细胞或血小板。
在另一方面，本公开提供了激活抗原特异性T细胞的方法，方法包括使T细胞与上述方面的任一项的aAPC接触，从而激活抗原特异性T细胞。
在另一方面，本公开提供了用于诱导表达受体分子的T细胞的增殖的方法，方法包括使T细胞与上述方面的任一项的aAPC接触，其中共刺激性多肽与受体分子特异性结合，从而诱导所述T细胞的增殖。
在另一方面，本公开提供了扩增T细胞群体的亚组的方法，方法包括使包含亚组的至少一种T细胞的T细胞群体与上述方面的任一项的aAPC接触，其中aAPC的表面上包含的外源共刺激性多肽与亚组的至少一种T细胞上的受体分子特异性结合，并且其中外源共刺激性多肽与受体分子的结合诱导亚组的至少一种T细胞的增殖，从而扩增T细胞群体的亚组。
在另一方面，本公开提供了抑制T细胞的活性的方法，方法包括使T细胞与上述方面的任一项的aAPC接触，从而抑制T细胞的活性。
在另一方面，本公开提供了用于激活Treg细胞的方法，方法包括使Treg细胞与上述方面的任一项的aAPC接触，从而激活Treg细胞。
在另一方面，本公开提供了治疗需要改变的免疫应答的受试者的方法，方法包括使受试者的T细胞与上述方面的任一项的aAPC接触，从而治疗需要改变的免疫应答的受试者。
在一些实施方案中，接触是体外的。在一些实施方案中，接触是体内的。
在另一方面，本公开提供了治疗需要改变的免疫应答的受试者的方法，方法包括：a)确定受试者中的细胞上抗原的表达谱，b)选择人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC是工程化去核细胞，其在细胞表面上包含抗原呈递多肽和至少一种第一外源抗原性多肽，和c)对受试者施用aAPC，从而治疗需要改变的免疫应答的受试者。
在另一方面，本公开提供了治疗需要改变的免疫应答的受试者的方法，方法包括：a)确定受试者的HLA状态，b)选择与受试者免疫学相容的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC是工程化去核细胞，其在细胞表面上包含至少一种第一外源抗原性多肽和至少一种抗原呈递多肽，和c)对受试者施用aAPC，从而治疗需要改变的免疫应答的受试者。
在一些实施方案中，受试者需要增加的免疫应答。在一些实施方案中，受试者患有癌症或传染病。在一些实施方案中，受试者需要降低的免疫应答。在一些实施方案中，受试者患有自身免疫疾病或变应性疾病。
在另一方面，本公开提供了在有此需要的受试者中诱导对抗原的T细胞应答的方法，所述方法包括：从受试者获得细胞群体，其中群体包含T细胞，使细胞群体与上述方面的任一项的aAPC接触，其中使细胞群体与aAPC接触诱导对至少一种外源抗原性多肽特异性的抗原特异性T细胞的增殖，和对受试者施用抗原特异性T细胞，从而在有此需要的受试者中诱导对抗原的T细胞应答。在一些实施方案中，方法进一步包括从细胞群体分离抗原特异性T细胞。
在另一方面，本公开提供了扩增调节性T(Treg)细胞群体的方法，方法包括：从受试者获得细胞群体，其中群体包含Treg细胞，使群体与上述方面的任一项的aAPC接触，其中使群体与aAPC接触诱导Treg细胞的增殖，从而扩增Treg细胞群体。在一些实施方案中，方法进一步包括从细胞群体分离Treg细胞。在一些实施方案中，方法进一步包括对受试者施用Treg细胞。
在另一方面，本公开提供了制备上述方面的任一项的aAPC的方法，方法包括：将编码外源抗原性多肽的外源核酸引入有核细胞中；和在适于去核和产生外源抗原性多肽的条件下培养有核细胞，从而制备去核细胞，从而制备aAPC。
在一个实施方案中，有核细胞是有核红系前体细胞。在一个实施方案中，去核细胞(例如工程化去核细胞)是去核红系细胞，例如红细胞或网织红细胞。在一个实施方案中，去核细胞(例如工程化去核细胞)是血小板。
在另一方面，本公开提供了制备上述方面的任一项的aAPC的方法，方法包括：将编码外源抗原呈递多肽的外源核酸引入有核细胞中；在适于去核和产生外源抗原呈递多肽的条件下培养有核细胞，从而制备去核细胞；和使去核细胞与至少一种外源抗原性多肽接触，其中至少一种外源抗原性多肽与去核细胞的细胞表面上存在的外源抗原呈递多肽结合，从而制备aAPC。
在一个实施方案中，至少一种外源抗原性多肽与去核细胞的细胞表面上存在的外源抗原呈递多肽特异性结合。
在一个实施方案中，有核细胞是有核红系前体细胞。在一个实施方案中，去核细胞(例如工程化去核细胞)是去核红系细胞，例如红细胞或网织红细胞。在一个实施方案中，去核细胞(例如工程化去核细胞)是血小板。
在另一方面，本公开提供了制备上述方面的任一项的aAPC的方法，方法包括：将编码外源抗原性多肽的外源核酸引入有核细胞中；将编码外源抗原呈递多肽的外源核酸引入有核细胞中；和在适于去核和产生外源抗原性多肽和外源抗原呈递多肽的条件下培养有核细胞，从而制备去核细胞，从而制备aAPC。
在一个实施方案中，有核细胞是有核红系前体细胞。在一个实施方案中，去核细胞(例如工程化去核细胞)是去核红系细胞，例如红细胞或网织红细胞。在一个实施方案中，去核细胞(例如工程化去核细胞)是血小板。
在一些实施方案中，外源核酸包含DNA。在一些实施方案中，外源核酸包含RNA。
在一些实施方案中，引入步骤包括病毒转导。在一些实施方案中，引入步骤包括电穿孔。在一些实施方案中，引入步骤包括利用以下的一种或多种：脂质体介导的转移、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、基于逆转录病毒的载体、脂质转染和慢病毒载体。
在另一方面，本公开提供了制备免疫学相容的人工抗原呈递细胞(aAPC)的方法，其中aAPC包含在细胞表面上包含外源抗原性多肽的去核细胞，方法包括：使有核细胞与切割内源核酸的至少一种gRNA和核酸酶接触，以导致内源抗原呈递多肽、内源锚多肽或内源共刺激性多肽的产生；或导致内源微小RNA表达的抑制；将编码外源抗原性多肽的外源核酸引入有核细胞中；和在适于去核以及产生和通过内源抗原呈递多肽呈递外源抗原性多肽的条件下培养有核细胞，从而制备去核细胞，从而制备免疫学相容的aAPC。
在一些实施方案中，外源核酸与核酸酶和至少一种gRNA接触。
在又一方面，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞或去核细胞，其中红系细胞或去核细胞呈递，例如在细胞表面上包含，表1中公开的至少一种外源抗原性多肽。
在一些实施方案中，至少一种外源抗原性多肽是肿瘤抗原、自身免疫疾病抗原、病毒抗原、细菌抗原或寄生物。
在另一方面，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞或去核细胞，其中红系细胞或去核细胞呈递，例如在细胞表面上包含，第一外源抗原性多肽和第二外源抗原性多肽，并且其中第一外源抗原性多肽和第二外源抗原性多肽具有重叠至少2个氨基酸的氨基酸序列。
在一些实施方案中，重叠在2个氨基酸和23个氨基酸之间。
在一些实施方案中，aAPC进一步呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽。
在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽、MHC I类单链融合物、MHCII类多肽或MHC II类单链融合物。
在一些实施方案中，MHC I类多肽选自下组：HLA A、HLA B和HLA C。
在一些实施方案中，MHC II类多肽选自下组：HLA-DPα、HLA-DPβ、HLA-DM、HLA DOA、HLA DOB、HLA DQα、HLA DQβ、HLA DRα和HLA DRβ。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，红系细胞是去核红系细胞。
在又一方面，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞或去核细胞，其中红系细胞或去核细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类单链融合物或MHC II类单链融合物，其中例如外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合。
在一些实施方案中，MHC I类单链融合物包含锚、α链和β2m链。在一些实施方案中，外源抗原性多肽经由接头与MHC I单链融合物连接。在一些实施方案中，接头是可切割的接头。
在一些实施方案中，MHC II类单链融合物包含锚、α链和β链。在一些实施方案中，外源抗原性多肽经由接头与MHC II单链融合物连接。在一些实施方案中，接头是可切割的接头。在一些实施方案中，锚是1型膜蛋白。在一些实施方案中，锚是2型膜蛋白。在一些实施方案中，锚是GPI连接的蛋白质。在一些实施方案中，锚是GPA或SMIM1。
在一些实施方案中，外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽结合。在一些实施方案中，外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽共价或非共价结合。
在一些实施方案中，前述方面的任一项的aAPC进一步呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源共刺激性多肽。
在一些实施方案中，至少一种外源共刺激性多肽选自下组：4-1BBL、LIGHT、抗CD28、CD80、CD86、CD70、OX40L、GITRL、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD83、CD155、CD112、IL-7、IL-12、与IL-15融合的IL-15Rα、IL-21、ICAM-1、LFA-1的配体、抗CD3及其组合。
在一些实施方案中，aAPC呈递，例如在细胞表面上包含，至少2种、至少3种、至少4种或至少5种外源共刺激性多肽。
在一些实施方案中，aAPC能够激活与aAPC相互作用的T细胞。在一些实施方案中，激活包含CD8+ T细胞的激活、CD4+ T细胞的激活、T细胞的细胞毒性活性的刺激、T细胞的细胞因子分泌的刺激和/或其任何组合。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，红系细胞是去核红系细胞。
在又一方面，本公开的特征在于经工程化改造以抑制T细胞活性的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞或去核细胞，其中红系细胞或去核细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽、外源抗原性多肽和表7中公开的至少一种外源共抑制性多肽，其中例如外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合。在一些实施方案中，红系细胞是去核红系细胞。
在另一方面，本公开的特征在于经工程化改造以抑制T细胞活性的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞或去核细胞，其中红系细胞或去核细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽、表1中公开的外源抗原性多肽和至少一种外源共抑制性多肽，其中例如外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合。在一些实施方案中，红系细胞是去核红系细胞。
在一些实施方案中，aAPC进一步包含改变代谢物的多肽。
在另一方面，本公开的特征在于经工程化改造以抑制T细胞活性的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞或去核细胞，其中红系细胞或去核细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽、外源抗原性多肽和至少一种改变代谢物的多肽，其中例如外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合。
在一些实施方案中，aAPC进一步包含外源共抑制性多肽。在一些实施方案中，外源共抑制性多肽是IL-35、IL-10、VSIG-3或LAG3激动剂。
在一些实施方案中，改变代谢物的多肽是IDO、Arg1、CD39、CD73、TDO、TPH、iNOS、COX2或PGE合酶。
在一些实施方案中，aAPC能够抑制与aAPC相互作用的T细胞。
在一些实施方案中，抑制包含T细胞增殖的抑制、T细胞的无反应化或T细胞凋亡的诱导。在一些实施方案中，T细胞是CD4+ T细胞或CD8+ T细胞。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，红系细胞是去核红系细胞。
在另一方面，本公开的特征在于经工程化改造以激活调节性T细胞(Treg细胞)的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞或去核细胞，其中红系细胞或去核细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中例如外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合。
在一些实施方案中，aAPC进一步呈递，例如在细胞表面上包含，外源Treg扩增多肽。
在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC II类多肽或MHC II类单链融合物。在一些实施方案中，MHC II类多肽选自下组：HLA-DPα、HLA-DPβ、HLA-DM、HLA DOA、HLA DOB、HLA DQα、HLA DQβ、HLA DRα和HLA DRβ。在一些实施方案中，MHC II类单链融合物包含锚、α链和β链。
在一些实施方案中，外源抗原性多肽经由接头与MHC II类单链融合物连接。在一些实施方案中，接头是可切割的接头。
在一些实施方案中，锚是GPA或SMIM1。
在一些实施方案中，外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽结合。在一些实施方案中，外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽共价或非共价结合。
在一些实施方案中，外源Treg扩增多肽是IL-2、CD25特异性IL-2、TNFR2特异性TNF、抗DR3激动剂(VEGI/TL1A特异性)、4-1BBL、TGFβ。
在一些实施方案中，外源抗原性多肽为8个氨基酸长至24个氨基酸长。
在一些实施方案中，去核细胞是红系细胞或血小板。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，红系细胞是去核红系细胞。
在另一方面，本公开的特征在于激活抗原特异性T细胞的方法，方法包括使T细胞与本文公开的aAPC接触，从而激活抗原特异性T细胞。
在另一方面，本公开的特征在于用于诱导表达受体分子的T细胞的增殖的方法，方法包括使T细胞与本文公开的aAPC接触，其中共刺激性多肽与受体分子特异性结合，从而诱导所述T细胞的增殖。
在另一方面，本公开的特征在于扩增T细胞群体的亚组的方法，方法包括使包含亚组的至少一种T细胞的T细胞群体与本文公开的aAPC接触，其中aAPC上呈递的外源共刺激性多肽与亚组的至少一种T细胞上的受体分子特异性结合，并且其中外源共刺激性多肽与受体分子的结合诱导亚组的至少一种T细胞的增殖，从而扩增T细胞群体的亚组。
在另一方面，本公开的特征在于抑制T细胞的活性的方法，方法包括使T细胞与本文公开的aAPC接触，从而抑制T细胞的活性。
在另一方面，本公开的特征在于用于激活Treg细胞的方法，方法包括使Treg细胞与本文公开的aAPC接触，从而激活Treg细胞。
在另一方面，本公开的特征在于治疗需要改变的免疫应答的受试者的方法，方法包括使受试者的T细胞与本文公开的aAPC接触，从而治疗需要改变的免疫应答的受试者。
在一些实施方案中，接触是体外的或体内的。
在另一方面，本公开的特征在于治疗需要改变的免疫应答的受试者的方法，方法包括：a)确定受试者中的细胞上抗原的表达谱；b)选择人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC是表达抗原呈递多肽和至少一种第一外源抗原性多肽的工程化红系细胞；和c)对受试者施用aAPC，从而治疗需要改变的免疫应答的受试者。
在另一方面，本公开的特征在于治疗需要改变的免疫应答的受试者的方法，方法包括：a)确定受试者的HLA状态；b)选择与受试者免疫学相容的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC是表达至少一种第一外源抗原性多肽和至少一种抗原呈递多肽的工程化红系细胞；和c)对受试者施用aAPC，从而治疗需要改变的免疫应答的受试者。
在一些实施方案中，受试者需要增加的免疫应答。在一些实施方案中，受试者患有癌症或传染病。在一些实施方案中，受试者需要降低的免疫应答。在一些实施方案中，受试者患有自身免疫疾病或变应性疾病。
在另一方面，本公开的特征在于在有此需要的受试者中诱导对抗原的T细胞应答的方法，所述方法包括：从受试者获得细胞群体，其中群体包含T细胞；使细胞群体与本文公开的aAPC接触，其中使细胞群体与aAPC接触诱导对至少一种外源抗原性多肽特异性的抗原特异性T细胞的增殖，和对受试者施用抗原特异性T细胞，从而在有此需要的受试者中诱导对抗原的T细胞应答。
在一些实施方案中，方法进一步包括从细胞群体分离抗原特异性T细胞。
在另一方面，本公开的特征在于扩增调节性T(Treg)细胞群体的方法，方法包括：从受试者获得细胞群体，其中群体包含Treg细胞；使群体与本文公开的aAPC接触，其中使群体与aAPC接触诱导Treg细胞的增殖，从而扩增Treg细胞群体。
在一些实施方案中，方法进一步包括从细胞群体分离Treg细胞。
在一些实施方案中，方法进一步包括对受试者施用Treg细胞。
在上述每个方法的一些实施方案中，红系细胞是去核红系细胞。
在另一方面，本公开的特征在于制备本发明的aAPC的方法，方法包括：将编码外源抗原性多肽的外源核酸引入有核细胞中；和在适于表达和呈递外源抗原性多肽以及去核的条件下培养有核细胞，从而制备去核细胞，从而制备aAPC。
在另一方面，本公开的特征在于制备本发明的aAPC的方法，方法包括：将编码外源抗原呈递多肽的外源核酸引入有核细胞中；在适于表达和呈递外源抗原呈递多肽以及去核的条件下培养有核细胞，从而制备去核细胞；和使去核细胞与至少一种外源抗原性多肽接触，其中至少一种外源抗原性多肽与去核细胞上呈递的外源抗原呈递多肽结合，从而制备aAPC。
在一些实施方案中，外源核酸包含DNA或RNA。
在一些实施方案中，引入步骤包括病毒转导。在一些实施方案中，引入步骤包括电穿孔。在一些实施方案中，引入步骤包括利用以下的一种或多种：脂质体介导的转移、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、基于逆转录病毒的载体、脂质转染和慢病毒载体。
在另一方面，本公开的特征在于制备免疫学相容的人工抗原呈递细胞(aAPC)的方法，其中aAPC包含呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原性多肽的去核细胞，方法包括：使有核细胞与切割内源核酸的至少一种gRNA和核酸酶接触，以导致内源抗原呈递多肽、内源锚多肽或内源共刺激性多肽的表达；或导致内源微小RNA表达的抑制；将编码外源抗原性多肽的外源核酸引入有核细胞中；和在适于表达和通过内源抗原呈递多肽呈递外源抗原性多肽以及去核的条件下培养有核细胞，从而制备去核细胞，从而制备免疫学相容的aAPC。
在一些实施方案中，使外源核酸与核酸酶和至少一种gRNA接触。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，红系细胞是去核红系细胞。
附图简述
附图意在说明本发明的一个或多个特征、方面或实施方案，而无意于限制。
图1A和图1B是显示用于在红系细胞上表达MHCI和MHCII分子的各种设计的示意图。图1A显示用于表达单链肽-MHCII构建体的设计的示意图。如图1A中所示，外源肽与MHCIIβ链连接，与MHCIIα链连接，与膜锚(如GPA或SMIM)连接。图1B显示用于表达单链肽-MHCI构建体的设计的示意图。如图1B中所示，外源肽与MHCIβ-2m亚基连接，与MHCIα亚基连接，所述MHCIα亚基与膜锚(如GPA或SMIM)连接。
图2是显示呈递MHC I(卵清蛋白)和4-1BBL的工程化鼠红细胞激活ova特异性T细胞的图。
图3是显示用呈递MHC I(卵清蛋白)和4-1BBL的鼠红细胞扩增的ova特异性T细胞在肿瘤细胞杀伤中是高度有效和特异性的图。
图4A是显示用于研究OT1-T细胞在淋巴结和脾中增殖的实验设计的示意图。
图4B是代表性数据的示意图，显示mRCT-4-1BBL OVA特异性扩增并激活OT1-T细胞，而没有在细胞表面上呈递卵清蛋白肽的MHCI的mRCT-4-1BBL不扩增和激活OT1-T细胞。如本文通篇所用，小鼠红细胞治疗剂(或mRCT)是指本文所述的鼠工程化红系细胞(例如工程化去核细胞)。如本文通篇所用，RCT(红细胞治疗剂)是指本文所述的人工程化红系细胞(例如工程化去核细胞)。
图4C是显示在循环、脾和淋巴结中OT1-T细胞增殖和被mRCT-4-1BBL OVA激活的体内观察的图。
图5A-D是显示经工程化改造以呈递MHCI(卵清蛋白)和4-1BBL的红系细胞在体内表现出体内剂量应答ova特异性T细胞的图。
图6是显示经工程化改造以呈递MHCI(卵清蛋白)和4-1BBL的第二剂量的红系细胞显著加强淋巴结和脾两者中的CD8+OT1 T细胞的图。
图7是显示经工程化改造以呈递MHCI(gp100)和4-1BBL的红系细胞在体外激活gp100特异性T细胞的图。
图8A是显示在RCT上表达的HLA-A2(HPV E7)的不同形式的示意图。图8A公开了“YMLDLQPETGGGGS(G4S)2”作为SEQ ID NO:895和“(G4S)4”作为SEQ ID NO:733。
图8B和8C是显示在RCT上表达的HLA-A2(HPV E7)在体外刺激HPV特异性T细胞中的活性的图。
图9是显示肿瘤随机化后平均肿瘤体积(mm3)随时间的变化的图，其中在OT1 CD8+T细胞注射后的第1、4和8天用mRCT(对照)和mRCT-OVA-4-1BBL对小鼠给药。
图10是显示肿瘤随机化后个体肿瘤体积(mm3)随时间的变化的图，其中在OT1 CD8+ T细胞注射后的第1、4和8天用mRCT(对照)和mRCT-OVA-4-1BBL对小鼠给药。
图11是显示肿瘤随机化后小鼠随时间的生存百分比的图，其中在OT1 CD8+ T细胞注射后的第1、4和8天用mRCT(对照)和mRCT-OVA-4-1BBL对小鼠给药。
图12显示流式细胞术实验的结果，门控CD44+表达，以确定OT1 CD8+ T细胞增殖。
图13是显示在将mRCT(对照和点击(clicked))与OT1 CD8+ T细胞共温育后的第4天的OT1 CD8+ T细胞计数的图。图14A是显示三重点击的mRCT(mRCT-OVA-4-1BBL-IL7、mRCT-OVA-4-1BBL-IL12或mRCT-OVA-4-1BBL-IL15)比双重点击的mRCT(mRCT-OVA-4-1BBL)显示出增加的OT1 CD8+ T细胞增殖的图。
图14B是一组图，显示由双重点击的mRCT(mRCT-OVA-4-1BBL)或三重点击的mRCT(mRCT-OVA-4-1BBL-IL7、mRCT-OVA-4-1BBL-IL12或mRCT-OVA-4-1BBL-IL15)激活的记忆干T细胞(Tscm)、中央记忆T细胞(Tcm)和效应记忆T细胞(Tem)的百分比。
图15A和15B是显示用mRCT-OVA-4-1BBL治疗的小鼠即使用EG7.OVA肿瘤细胞重攻击后也显示出EG7.OVA肿瘤控制的图。
图16A是显示用OVA肽(SIINFEKL(SEQ ID NO:721))+不完全弗氏佐剂(IFA)重攻击的小鼠的时间线的示意图。
图16B是显示在脾和淋巴结两者中，与仅用mRCT给药的小鼠相比，用mRCT-OVA治疗的小鼠在OVA肽重攻击时具有更低的OT1细胞计数的图。
图16C是显示在脾和淋巴结两者中，与仅用mRCT给药的小鼠相比，内源CD8+ T细胞计数在OVA肽重攻击时不受影响的图。
图17A是显示用于在RCT的表面上呈递信号1和2的配置的不同选项的示意图。
图17B是显示用于在RCT的表面上呈递信号1、2和3的配置的不同选项的示意图。
发明详述
本公开基于具有有效信号呈递的人工抗原呈递细胞(aAPC)的开发，其可用于例如，体内aAPC免疫疗法和离体用于T细胞扩增。特别地，本公开至少部分地基于以下令人惊讶的发现，即红系细胞，特别是工程化红系细胞可以经工程化改造以尤其激活、扩增或分化/去分化T细胞，抑制T细胞活性，抑制T效应细胞和/或刺激和扩增T调节细胞。
受益于前述说明书和相关附图中呈现的教导，这些发明所属领域的技术人员将容易想到本文阐述的本发明的许多修改和其他实施方案。因此，应当理解，本发明不限于所公开的特定实施方案，并且修改和其他实施方案旨在被包括在所附权利要求书的范围内。尽管本文采用了特定术语，但是它们仅以一般性和描述性意义使用，而不是出于限制的目的。
定义
如本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述/该”包括复数引用，除非内容另外明确指出。
替代方案(例如“或”)的使用应理解为意指替代方案之一、两者或其任何组合。
如本文所用，术语“约”在指可测量值如量、持续时间等时，意在涵盖相对于指定值±20％或±10％，更优选地±5％，甚至更优选地±1％，且仍更优选地±0.1％的变化，因为此类变化适合于进行所公开的方法。
如本文所用，除非另有说明，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数的值，以及在适当时其分数(如整数的十分之一和百分之一)。
如本文所用，“包含”意在与“包括”或“含有”同义，并且是包含性或开放性的术语，其指定了随后内容(例如组分)的存在，且不排除或阻止存在本领域已知的或其中公开的另外的未叙述的组分、特征、元件、成员、步骤。
如本文所用，术语“如”、“例如”等旨在指示例性实施方案，而不意图限制本公开的范围。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管在实践中可以使用与本文描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料来测试本发明，但是本文描述了优选的材料和方法。
如本文所用，“施用”及其变体是指将组合物或药剂引入到受试者中，并且包括并行或顺序引入组合物或药剂。“施用”可以指例如治疗、药代动力学、诊断、研究、安慰剂和实验方法。“施用”还涵盖体外和离体治疗。通过任何合适的途径将组合物或药剂引入到受试者中，所述途径包括口服、肺、鼻内、肠胃外(静脉内、肌内、腹膜内或皮下)、直肠、淋巴内或局部。施用包括自我施用和他人施用。可以通过任何合适的途径进行施用。合适的施用途径允许组合物或药剂进行其预期功能。例如，如果合适的途径是静脉内，则通过将组合物或药剂引入到受试者的静脉中来施用组合物。
如本文所用，术语“抗原呈递细胞(APC)”是指可以加工和展示与其表面上的主要组织相容性复合物(MHC)分子缔合的外来抗原的细胞。
如本文所用，术语“人工抗原呈递细胞”是指已被工程化改造以引入一种或多种分子(例如外源多肽)的细胞，所述分子提供免疫突触形成所需的必需的T细胞受体(TCR)、共刺激和/或粘附事件。
如本文所用，术语“自身免疫病症”通常是指受试者的免疫系统攻击身体自身细胞，从而导致组织破坏的状况。可以使用血液测试、脑脊液分析、肌电图(测量肌肉功能)和脑的磁共振成像来诊断自身免疫病症，但对于自身抗体(self-antibody)(或自抗体(auto-antibody))，血液中抗体测试尤其有用。通常，IgG类抗体与自身免疫疾病相关。
如本文所用，术语“生物样品”是指从受试者分离的任何类型的生物来源的材料，包括例如DNA、RNA、脂质、碳水化合物和蛋白质。术语“生物样品”包括从受试者分离的组织、细胞和生物流体。生物样品包括例如但不限于全血、血浆、血清、精液、唾液、泪、尿液、粪便、汗液、口腔物(buccal)、皮肤、脑脊液、骨髓、胆汁、毛发、肌肉活检、器官组织或本领域普通技术人员已知的生物来源的其他材料。生物样品可以从受试者获得以用于诊断或研究，或者可以从健康受试者获得，作为对照或用于基础研究。
如本文所用，术语“癌症”是指其中异常细胞不受控制地分裂并且能够侵袭其他组织的疾病。有超过100种不同类型的癌症。大多数癌症都以其起始的器官或细胞类型来命名-例如，起始于结肠中的癌症称为结肠癌；起始于皮肤黑素细胞的癌症称为黑素瘤。癌症类型可以分组为更广泛的类别。癌症的主要类别包括：癌(意指起始于皮肤或起始于作为内部器官的衬里或覆盖内部器官的癌症及其亚型，包括腺癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌和移行细胞癌)；肉瘤(意指起始于骨、软骨、脂肪、肌肉、血管或其他结缔组织或支持组织的癌症)；白血病(意指起始于血液形成组织(例如骨髓)并导致大量异常血细胞产生并进入血液的癌症；淋巴瘤和骨髓瘤(意指起始于免疫系统细胞的癌症)；以及中枢神经系统(CNS)癌症(意指起始于脑和脊髓的组织中的癌症)。术语“骨髓增生异常综合征”是指其中骨髓不能产生足够的健康血细胞(白细胞、红细胞和血小板)，并且血液和/或骨髓中存在异常细胞的一种癌症类型。骨髓增生异常综合征可能成为急性髓样白血病(AML)。在某些实施方案中，癌症选自以下癌症，其包括但不限于急性淋巴母细胞白血病(ALL)、急性髓样白血病(AML)、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、肠癌、脑瘤、乳腺癌、原发性未知癌症(cancer of unknownprimary)、扩散至骨的癌症、扩散至脑的癌症、扩散至肝的癌症、扩散至肺的癌症、类癌、宫颈癌、绒毛膜癌、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓样白血病(CML)、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、眼癌、胆囊癌、胃癌(gastric cancer)、妊娠滋养细胞肿瘤(GTT)、毛细胞白血病、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤皮肤癌、间皮瘤、男性癌症、葡萄胎妊娠、口腔和口咽癌、骨髓瘤、鼻和窦癌、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、食道癌、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、前列腺癌、罕见癌、直肠癌、唾液腺癌、继发性癌症、皮肤癌(非黑素瘤)、软组织肉瘤、胃癌(stomach cancer)、睾丸癌、甲状腺癌、未知原发性癌、子宫癌、阴道癌和外阴癌。
如本文所用，术语“点击反应”是指用于共价连接第一和第二部分的一系列反应，以方便产生连接产物。它通常具有以下一个或多个特征：它是快速的，是特异性的，是高产率的，是高效的，是自发的，不显著改变连接实体的生物相容性，具有高反应速率，产生稳定的产物，有利于产生单一的反应产物，具有高原子经济学，是化学选择性的，是模块化的，是立体选择性的，是对氧不敏感的，是对水不敏感的，是高纯度的，仅生成无害或相对无毒性的副产物，其可以通过非色谱方法(例如，结晶或蒸馏)去除，不需要溶剂或可以在良性或生理学相容的溶剂(例如，水)中进行，在生理条件下稳定。实例包括炔烃/叠氮化物反应、二烯/亲二烯体反应或硫醇/烯烃反应。可以使用其他反应。在一些实施方案中，点击反应是快速的、特异性的和高产率的。
如本文所用，术语“点击柄(click handle)”是指在点击反应中能够与第二点击柄反应以产生点击特征(signature)的化学部分。在一些实施方案中，点击柄由偶联试剂组成，并且偶联试剂可以进一步包含底物反应部分。
如本文所用，术语“细胞因子”是指由细胞分泌的对其他细胞具有多种作用的小的可溶性蛋白质物质。细胞因子介导许多重要的生理功能，包括生长、发育、伤口愈合和免疫应答。它们如下起作用：通过与其位于细胞膜中的细胞特异性受体结合，这允许在细胞中开始独特的信号转导级联反应，其最终将导致靶细胞中发生生化和表型改变。细胞因子可以在局部和远离释放部位起作用。它们包括I型细胞因子，其涵盖许多白介素以及几种造血生长因子；II型细胞因子，包括干扰素和白介素10；肿瘤坏死因子(“TNF”)相关分子，包括TNFα和淋巴毒素；免疫球蛋白超家族成员，包括白介素1(“IL-1”)；以及趋化因子，一种在极其多种免疫和炎症功能中起关键作用的分子家族。取决于细胞状态，相同的细胞因子对细胞可具有不同的作用。细胞因子通常调节其他细胞因子的表达并触发其级联。细胞因子的非限制性实例包括例如IL-1α、IL-β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12/IL-23P40、IL13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、TGF-β、IFN-γ、GM-CSF、Groα、MCP-1和TNF-α。
如本文所用，术语“内源”意指化合物(例如，小分子)或过程的天然形式。例如，在一些实施方案中，术语“内源”是指核酸或多肽在生物体或生物体基因组中的其天然位置中的天然形式。
如本文所用，如本文所用的术语“工程化细胞”是经遗传修饰的细胞或其后代。在一些实施方案中，工程化细胞(例如工程化去核细胞)可以使用偶联试剂将外源多肽连接至细胞表面来产生(例如使用点击化学)。
如本文所用，术语“去核”是指缺乏核的细胞，例如，网织红细胞或成熟红细胞(红细胞)。在一个实施方案中，去核细胞是通过从前体细胞，例如造血干细胞(例如CD34+细胞)、普通髓样祖细胞(CMP)、巨核细胞红细胞祖细胞(MEP)、爆发形成单位红细胞(BFU-E)、集落形成单位红细胞(CFU-E)、原成红细胞、早期嗜碱性成红细胞、晚期嗜碱性成红细胞、多染性成红细胞或正染性成红细胞或诱导性多能细胞分化为网织红细胞或成熟红细胞而失去其核的细胞。在一个实施方案中，去核细胞是通过从前体细胞，例如造血干细胞(例如CD34+细胞)、普通髓样祖细胞(CMP)、巨核细胞红细胞祖细胞(MEP)、爆发形成单位红细胞(BFU-E)、集落形成单位红细胞(CFU-E)、原成红细胞、早期嗜碱性成红细胞、晚期嗜碱性成红细胞、多染性成红细胞或正染性成红细胞或诱导多能细胞体外分化为网织红细胞或成熟红细胞而失去其核的细胞。在一个实施方案中，去核细胞缺乏DNA。在一个实施方案中，去核细胞不能表达多肽，例如不能将DNA转录和/或翻译成蛋白质，例如缺少将DNA转录和/或翻译成蛋白质所必需的细胞机制。在一些实施方案中，去核细胞是红细胞、网织红细胞或血小板。
在一些实施方案中，去核细胞不是血小板，因此是“无血小板去核”细胞(“PFE”细胞)。应当理解，血小板不具有核，并且在该特定实施方案中，血小板不旨在被涵盖在内。
如本文所用，“红系细胞”包括有核红细胞、红细胞前体、去核成熟红细胞和网织红细胞。如本文所用，红系细胞包括红系前体细胞，能够分化成网织红细胞或红细胞的细胞。例如，红系细胞前体细胞包括脐带血干细胞、CD34+细胞、造血干细胞(HSC)、脾集落形成(CFU-S)细胞、普通髓样祖细胞(CMP)、胚细胞集落形成细胞、爆发形成单位红系(BFU-E)、巨核细胞-红系祖细胞(MEP)、红系集落形成单位(CFU-E)、网织红细胞、红细胞、诱导性多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞(MSC)、多染性正成红细胞、正染性正成红细胞的任何一种。红系细胞的制剂可以包括这些细胞中的任何一种或其组合。在一些实施方案中，红系前体细胞是永生或永生化的细胞。例如，可以通过逆转录病毒转导CD34+造血祖细胞以表达Oct4、Sox2、Klf4、cMyc并抑制TP53来生成永生化的成红细胞(例如，如Huang et al.,Mol Ther(2014)Mol.Ther.22(2):451-63中所述，其全部内容通过引用并入本文)。另外，这些细胞可以旨在用于自体使用或提供同种异体输血的来源。在一些实施方案中，培养红系细胞。在一个实施方案中，红系细胞是去核红细胞。
如本文所用，当在核酸的上下文中使用时，术语“外源”包括转基因和重组核酸。
如本文所用，术语“外源核酸”是指对细胞不是天然的，而是被引入到细胞或细胞的祖细胞中的核酸(例如，基因)。外源核酸可以包括与对细胞天然的内源核酸同源或相同的区域或开放阅读框(例如基因)。在一些实施方案中，外源核酸包含RNA。在一些实施方案中，外源核酸包含DNA。在一些实施方案中，外源核酸整合到细胞的基因组中。在一些实施方案中，外源核酸通过细胞机制加工以产生外源多肽。在一些实施方案中，外源核酸不被引入有外源核酸的细胞或细胞后代的细胞保留。
如本文所用，术语“外源多肽”是指不由该类型的野生型细胞产生的多肽，或者以比含有该外源多肽的细胞中更低的水平存在于野生型细胞中的多肽。在一些实施方案中，外源多肽是指被引入到细胞中或细胞上，或者通过将编码外源多肽的外源核酸引入到细胞或细胞的祖细胞中而导致由细胞表达的多肽。在一些实施方案中，外源多肽是由被引入到细胞或细胞的祖细胞中的外源核酸编码的多肽，该核酸任选地不被细胞保留。在一些实施方案中，外源多肽是通过化学或酶促手段缀合至细胞表面的多肽。
如本文所用，术语“表达”是指产生多肽的过程，包括转录和翻译。表达可以例如通过多种方法来增加，包括：增加编码多肽的基因的数目，增加基因的转录(例如通过将基因置于组成型启动子的控制下)，增加基因的翻译，敲除竞争性基因或这些的组合和/或其他方法。
如本文所用，关于外源多肽或核酸的术语“第一”、“第二”和“第三”等用于在存在超过一种类型的外源多肽或核酸时方便区分。除非明确说明，否则使用这些术语无意赋予外源多肽或核酸的特定顺序或方向。
如本文所用，术语“流式细胞术”是指用于询问细胞的表型和特征的工具。它在细胞或颗粒在液体流中移动通过激光(通过辐射的受激发射进行光放大)/光束通过感测区域时感测它们。测量微观粒子的相对光散射和颜色区分的荧光。细胞的流动分析和分化基于大小、粒度以及细胞是否携带抗体或染料形式的荧光分子。当细胞通过激光束时，光在所有方向上散射，并且与轴成小角度(0.5-10°)沿向前方向散射的光与球半径的平方成比例，因此与细胞或颗粒的大小成比例。光可以进入细胞；因此，可以用荧光染料连接的抗体标记90°光(直角，侧面)散射，或用荧光膜、细胞质或核染料对其进行染色。因此，可以促进细胞类型的分化、膜受体和抗原的存在、膜电位、pH、酶活性和DNA含量。流式细胞仪是多参数的，记录每个细胞上的多个测量值。因此，有可能在异质群体内鉴定出同质亚群(MarionG.Macey,Flow cytometry:principles and applications,Humana Press,2007)。荧光激活细胞分选(FACS)(允许物理特征过于相似以至于无法通过大小或密度分离的不同细胞群体的分离)使用荧光标签以检测差异表达的表面蛋白，从而允许在物理上同质的细胞群体之间进行精细区分。
如本文所用，术语“基因”广泛地用于指与给定RNA或蛋白质的表达相关的核酸的任何区段。因此，基因包括编码表达的RNA的区域(其通常包括多肽编码序列)，并且通常包括其表达所需的调节序列。基因可以从多种来源获得，包括从感兴趣的来源进行克隆或从已知或预测的序列信息进行合成，并且可以包括设计成具有特定所需参数的序列。
如本文所用，术语“激活”、“刺激”、“增强”、“增加”和/或“诱导”(以及类似术语)可互换使用，通常是指直接或间接地改进或增加相对于自然、预期或平均或相对于对照状况的浓度、水平、功能、活性或行为的动作。“激活”是指通过细胞表面部分的连接诱导的主要应答。例如，在受体的上下文中，此类刺激需要受体的连接和随后的信号转导事件。关于T细胞的刺激，此类刺激是指T细胞表面部分的连接(如结合TCR/CD3复合物)，其在一些实施方案中随后诱导信号转导事件。此外，刺激事件可以激活细胞并上调或下调分子的表达或分泌。因此，即使在不存在直接的信号转导事件的情况下，细胞表面部分的连接也可以导致细胞骨架结构的重组，或在细胞表面部分的聚结(coalescing)中，其每一个都可以用来增强、修饰或改变随后的细胞应答。“激活”包括CD8+ T细胞的激活、CD4+ T细胞的激活、T细胞的细胞毒性活性的刺激、T细胞的细胞因子分泌的刺激、可检测的效应子功能、T细胞分化状态的修饰(例如促进扩增和从T效应细胞至T记忆细胞的分化)，和/或其任何组合。术语“激活的T细胞”尤其是指正在进行细胞分裂的T细胞。
如本文所用，“改变的免疫应答”是指改变免疫应答的形式或特征，例如刺激或抑制免疫应答，例如，如通过ELISPOT测定法(细胞免疫应答)、ICS(细胞内细胞因子染色测定法)和主要组织相容性复合物(MHC)四聚体测定法所测量的，以通过可测量的量检测和定量抗原特异性T细胞、定量抗原特异性CD4+ T细胞的血液群体或定量抗原特异性CD8+ T细胞的血液群体，或者其中当与合适的对照(例如，其中树突状细胞未加载肿瘤特异性细胞，或未加载衍生自肿瘤特异性细胞的肽的对照组合物)相比时，增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少100％。
如本文所用，本文中称为“重组”的多肽是指已经通过重组DNA方法学产生的多肽，包括通过依赖于人工重组方法的规程如聚合酶链式反应(PCR)和/或使用限制酶克隆到载体中而生成的多肽。
如本文所用，“单链抗体(scFv)”是指其中VL和VH区经由接头(例如，氨基酸残基的合成序列)接合以形成连续蛋白质链的抗体。接头足够长，以允许蛋白质链自身折回并形成单价抗原结合位点(参见例如，Bird et al.,1988,Science 242:423-26和Huston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-83)。
如本文所用，术语“特异性结合”是指多肽或多肽复合物在体外或体内识别并结合配体而基本上不识别或结合周围环境中的其他分子的能力。在一些实施方案中，特异性结合可以通过至少约1x106M或更小的平衡解离常数来表征(例如，较小的平衡解离常数表示更紧密的结合)。用于确定两个分子是否特异性结合的方法是本领域众所周知的，并且包括例如平衡透析、表面等离振子共振等。
如本文所用，术语“受试者”、“个体”、“宿主”和“患者”在本文可互换使用，并且是指期望对其进行诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者，特别是人类。本文描述的方法适用于人类疗法和兽医应用两者。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，并且在特定实施方案中，受试者是人类。
如本文所用，短语“有需要的受试者”是指如下受试者：(i)将对其施用根据所述发明的aAPC(或包含aAPC的药物组合物)，(ii)正在接受根据所述发明的aAPC(或包含aAPC的药物组合物)；或(iii)已接受根据所述发明的aAPC(或包含aAPC的药物组合物)，除非该短语的上下文和用法另有说明。
如本文所用，术语“阻抑(suppress)”、“降低”、“干扰”、“抑制(inhibit)”和/或“减少”(以及类似术语)通常是指直接或间接减少相对于自然、预期或平均或相对于对照状况的浓度、水平、功能、活性或行为的动作。
如本文所用，术语“阻抑免疫细胞”或“抑制免疫细胞”是指引起或导致抑制或阻抑免疫细胞的一种或多种细胞应答或活性或导致免疫细胞无反应化或诱导免疫细胞凋亡的过程(例如，信号传导事件)，所述细胞反应或活性选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和激活标志物的表达。用于测量免疫细胞抑制或阻抑的合适测定法是本领域已知的并且在本文中描述。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括任何标准药物载体，如磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳剂如油/水或水/油，以及各种类型的润湿剂。该术语还涵盖任何经美国联邦政府监管机构批准或在美国药典中列出的用于动物(包括人)中的药剂，以及不对受试者造成明显刺激且不消除所施用化合物的生物学活性和特性的任何载体或稀释剂。
如本文所用，活性剂(例如如本文所述的aAPC)的术语“治疗量”、“治疗有效量”、“有效量”或“药学有效量”可互换使用以指足以提供预期的治疗益处的量。然而，剂量水平基于多种因素，包括损伤的类型，患者的年龄、体重、性别、医疗状况，状况的严重程度，施用途径以及所采用的特定活性剂。因此，剂量方案可以广泛变化，但是可以由医师使用标准方法常规确定。另外，术语“治疗量”、“治疗有效量”和“药物有效量”包括所述发明的组合物的防范量或预防量。在所描述的发明的防范或预防性应用中，将药物组合物或药物以下述量对易患疾病、病症或状况，或者以其他方式有患疾病、病症或状况的风险的患者施用：所述量足以消除或降低疾病、病症或状况的风险、减轻疾病、病症或状况的严重程度或延缓疾病、病症或状况的发作(包括疾病、病症或状况的生化、组织学和/或行为症状，其并发症)以及在疾病、病症或状况的发展期间出现的中间病理表型。通常优选使用最大剂量，即根据一些医学判断的最高安全剂量。术语“剂(dose)”和“剂量(dosage)”在本文可互换使用。
如本文所用，术语“治疗效果”是指治疗后果，其结果被判断是期望的且有益的。治疗效果可以包括直接或间接地阻止、减少或消除疾病表现。治疗效果还可以包括直接或间接地阻止、减少或消除疾病表现的进展。
对于本文所述的任何治疗剂，治疗有效量可以首先从初步的体外研究和/或动物模型中确定。治疗有效剂量也可以从人类数据确定。可以基于所施用化合物的相对生物利用度和效力来调整所施加的剂量。基于上述方法和其他众所周知的方法来调整剂量以达到最大功效在普通技术人员的能力范围内。确定治疗有效性的一般原理总结如下，其可以在Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,第10版,McGraw-Hill(New York)(2001)的第1章(通过引用并入本文)中找到。
药代动力学原理提供了修改剂量方案以获得具有最小的不可接受的副作用的所期望程度的治疗功效的基础。在可以测量药物的血浆浓度并与治疗窗口相关的情况下，可以获得剂量修改的其他指导。
如本文所用，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转状况的进展，基本上改善状况的临床症状或基本上防止状况的临床症状的出现，获得有益或期望的临床结果。治疗进一步指完成以下一项或多项：(a)降低病症的严重程度；(b)限制所治疗病症特征性症状的发展；(c)限制所治疗的病症特征性症状的恶化；(d)限制先前患有病症的患者中该病症的复发；以及(e)限制以前对病症无症状的患者中症状的复发。
有益或期望的临床结果，如药理和/或生理作用，包括但不限于在可能易感疾病、病症或状况但尚未经历或表现出该疾病的症状的受试者中预防该疾病、病症或状况发生(防范性治疗)，减轻疾病、病症或状况的症状，减轻疾病、病症或状况的程度，稳定(即不恶化)疾病、病症或状况，预防疾病、病症或状况的传播，延迟或减缓疾病、病症或状况进展，改善或缓解疾病、病症或状况及其组合，以及与未接受治疗所预期的生存相比延长的生存。
如本文所用，术语“外源抗原性多肽”是指能够诱导免疫应答的外源多肽。外源抗原性多肽能够结合外源抗原呈递多肽。
如本文所用，术语“外源抗原呈递多肽”是指结合抗原并将其展示在细胞表面上以被适当的T细胞识别的一组细胞表面蛋白。MHC基因家族分为三个亚组：I类、II类和III类。MHC I类分子是异二聚体，其由两条多肽链，一条α链和一条β2微球蛋白(b2m)链组成。I类MHC分子具有β2亚基，因此只能被CD8共受体识别。MHC II类分子也是由α和β多肽链组成的异二聚体。链的亚称(subdesignation)，例如α1、α2等，是指HLA基因内的独立域。II类MHC分子具有β1和β2亚基，并且可以被CD4共受体识别。人MHC也称为HLA(人白细胞抗原)复合物。在一些实施方案中，“外源抗原呈递多肽”是指细胞表面蛋白HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1、HLA-DPB1，其能够结合抗原并将其展示在细胞表面上。外源抗原呈递多肽在下面更详细地描述。
如本文所用，术语“外源T细胞共刺激性多肽”包括抗原呈递细胞(例如aAPC)上的多肽，其特异性结合T细胞上的关联共刺激性分子(例如MHC分子、B和T淋巴细胞衰减剂(attenuator)(CD272)和Toll样受体)，从而提供信号，该信号除了由例如TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子结合提供的主要信号外，还介导T细胞应答，包括但不限于增殖、激活、分化等。共刺激性多肽尤其还涵盖与存在于T细胞上的共刺激性分子特异性结合的抗体。示例性的外源共刺激性多肽在下面更详细地描述。
如本文所用，术语“外源T细胞共抑制性多肽”是指抑制T细胞的任何多肽，包括抑制T细胞活性、抑制T细胞增殖、T细胞的无反应化或诱导T细胞凋亡。示例性的外源共抑制性多肽在下面更详细地描述。
如本文所用，术语“改变代谢物的外源多肽”是指参与细胞中代谢物的分解代谢或合成代谢的任何多肽，其中改变代谢物的多肽可以影响T细胞的代谢。示例性的改变代谢物的多肽在下面更详细地描述。
如本文所用，术语“Treg共刺激性多肽”是指扩增调节性T细胞(Treg)的外源多肽。在一些实施方案中，Treg共刺激性多肽通过刺激参与Treg细胞发育的三种信号中的至少一种来刺激Treg细胞。示例性的外源Treg共刺激性多肽在下面更详细地描述。
如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语应用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。天然存在的氨基酸的此类类似物的本质性质是，当掺入蛋白质中时，该蛋白质与针对相同的但完全由天然存在的氨基酸组成的蛋白质引发的抗体具有特异性反应性。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”还包括修饰，包括但不限于糖基化、脂质附着、硫酸化、谷氨酸残基的gamma-羧化、羟基化和ADP-核糖基化。应当理解，众所周知且如上所述，多肽可以不是完全线性的。例如，多肽可以由于泛素化而分支，并且它们可以是环状的，带有或不带有分支，通常是由于翻译后事件，包括自然加工事件和不自然发生的人为操纵而导致的事件所致。环状的、分支的和分支环状的多肽也可以通过非翻译天然过程合成并且也可以通过完全合成的方法来合成。在一些实施方案中，肽具有任何长度或大小。
如本文所用，术语“核酸分子”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。它包括染色体DNA和自我复制质粒、载体、mRNA、tRNA、siRNA等，其可以是重组的，并且当将核酸引入到细胞中后可以从其表达外源多肽。
以下术语在本文中用于描述两个或更多个核酸或多核苷酸之间的序列关系：(a)“参考序列”、(b)“比较窗口”、(c)“序列一致性”、(d)“序列一致性的百分比”和(e)“基本一致性”。(a)术语“参考序列”是指用作序列比较基础的序列。参考序列可以是指定序列的亚组或全部；例如，作为全长cDNA或基因序列的区段，或完整的cDNA或基因序列。(b)术语“比较窗口”是指多核苷酸序列的连续且特定的区段，其中可以将多核苷酸序列与参考序列进行比较，并且其中为了两个序列的最佳比对，与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗口中多核苷酸序列的一部分可以包含添加或缺失(即空位)。通常，比较窗口的长度为至少20个连续核苷酸，并且可以任选地长度为至少30个连续核苷酸，长度为至少40个连续核苷酸，长度为至少50个连续核苷酸，长度为至少100个连续核苷酸，或更长。本领域技术人员理解，为了避免由于在多核苷酸序列中包括空位而导致与参考序列的高度相似性，通常引入空位罚分并将其从匹配数中减去。用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的。用于比较的序列的最佳比对可以如下实施：通过Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法；通过Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法；通过Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444(1988)的搜索相似性方法；通过这些算法的计算机化实现，包括但不限于：Intelligenetics,Mountain View,Calif.的PC/Gene程序中的CLUSTAL；Wisconsin Genetics软件包,Genetics ComputerGroup(GCG),575Science Dr.,Madison,Wis.,USA中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA；CLUSTAL程序充分描述于Higgins and Sharp,Gene 73:237-244(1988)；Higginsand Sharp,CABIOS 5:151-153(1989)；Corpet,et al.,Nucleic Acids Research 16:10881-90(1988)；Huang,et al.,Computer Applications in the Biosciences,8:155-65(1992)和Pearson,et al.,Methods in Molecular Biology,24:307-331(1994)。可以用于数据库相似性搜索的BLAST系列程序包括：用于针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列的BLASTN；用于针对蛋白质数据库序列的核苷酸查询序列的BLASTX；用于针对蛋白质数据库序列的蛋白质查询序列的BLASTP；用于针对核苷酸数据库序列的蛋白质查询序列的TBLASTN；和用于针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列的TBLASTX。参见，CurrentProtocols in Molecular Biology,第1章9,Ausubel,et al.,Eds.,Greene Publishingand Wiley-Interscience,New York(1995)。除非另有说明，否则本文提供的序列一致性/相似性值是指使用BLAST 2.0程序套件使用默认参数获得的值。Altschul et al.,NucleicAcids Res.25:3389-3402(1997)。用于进行BLAST分析的软件是可公开获得的，例如通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology-Information)。该算法涉及首先通过鉴别查询序列中长度W的短词来鉴别高分序列对(HSP)，这些短词在与数据库序列中相同长度的词比对时匹配或满足一些正值阈值得分T。T被称为邻近词得分阈值(Altschul等人，同上)。这些最初的邻近词命中(hit)充当启动搜索以查找包含它们的较长HSP的种子。然后，词命中沿着每个序列在两个方向上延伸，直到可以增加累积比对得分为止。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；始终>0)和N(错配残基的罚分；始终<0)来计算累积得分。对于氨基酸序列，使用得分矩阵来计算累积得分。在以下情况下，将停止词命中在每个方向上的延伸：累积比对得分从其最大达到值下降数量X；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分变为零或更低；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用词长度(W)为11，期望(E)为10，截断为100，M＝5，N＝-4，以及比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用词长度(W)为3，期望(E)为10和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)。除了计算序列一致性百分比外，BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见例如，Karlin&Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小总和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。BLAST搜索假定可以将蛋白质建模为随机序列。然而，许多真实蛋白质包含非随机序列的区域，其可以是均聚物束、短期重复序列或富含一种或多种氨基酸的区域。此类低复杂度区域可以在不相关的蛋白质之间进行比对，即使蛋白质的其他区域完全不相似。可以采用许多低复杂度的滤器程序来减少此类低复杂度比对。例如，可以单独或组合采用SEG(Wootenand Federhen,Comput.Chem.,17:149-163(1993))和XNU(Claverie and States,Comput.Chem.,17:191-201(1993))低复杂度滤器。(c)在两个核酸或多肽序列的上下文中，术语“序列一致性”或“一致性”在本文中用于指两个序列中当在指定的比较窗口上比对以获得最大对应性时相同的残基。当关于蛋白质使用序列一致性百分比时，应认识到不相同的残基位置通常仅相差保守的氨基酸取代，即其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，并因此不改变分子的功能特性。在序列在保守取代中不同的情况下，可以向上调整序列一致性百分比以针对取代的保守性质进行校正。通过此类保守取代而不同的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行该调整的手段是本领域技术人员众所周知的。通常，这涉及将保守取代打分为部分错配而不是全部错配，从而增加序列一致性百分比。因此，例如，在对相同氨基酸给予1评分且对非保守取代给予零评分的情况下，对保守取代给予零和1之间的评分。例如，根据Meyers and Miller,Computer Applic.Biol.Sci.,4:11-17(1988)的算法计算保守取代的得分，例如，如在程序PC/GENE(Intelligenetics,Mountain View,Calif.,USA)中所实现的。(d)本文使用的术语“序列一致性百分比”意指通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列而确定的值，其中为了两个序列的最佳比对，与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗口中多核苷酸序列的一部分可以包含添加或缺失(即空位)。通过确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100以产生序列一致性的百分比来计算百分比。(e)多核苷酸序列的术语“基本一致性”意指使用所述比对程序之一使用标准参数，多核苷酸包含与参考序列相比具有至少70％序列一致性、至少80％序列一致性、至少90％序列一致性和至少95％序列一致性的序列。本领域技术人员将认识到，可以通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等适当地调整这些值以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应身份。为了这些目的，氨基酸序列的基本一致性通常意指至少60％或至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的序列一致性。核苷酸序列基本相同的另一个指示是两个分子是否在严格条件下相互杂交。然而，如果严格条件下彼此不杂交的核酸编码的多肽是基本相同的，则它们仍然是基本相同的。例如，当使用遗传密码所允许的最大密码子简并性创建核酸拷贝时，可能发生这种情况。两个核酸序列基本相同的一个指示是第一核酸编码的多肽与第二核酸编码的多肽具有免疫交叉反应性。还可以通过参考遗传密码，包括考虑密码子简并性，对本发明蛋白质的核苷酸序列进行突变。
如本文所用，术语“变体”是指通过一个或多个氨基酸取代、缺失、插入或其他修饰与原始蛋白质不同的多肽。这些修饰不显著改变原始蛋白质的生物学活性。在许多情况下，变体保留了原始蛋白质的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的生物学活性。变体的生物学活性也可以高于原始蛋白质的生物学活性。变体可以是天然存在的，如通过等位基因变异或多态性，或者是经故意工程化改造的。
变体的氨基酸序列与原始蛋白质的氨基酸序列基本相同。在许多实施方案中，变体与原始蛋白质共享至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的全局序列一致性或相似性。可以使用本领域已知的各种方法来确定序列一致性或相似性，如基本局部比对工具(Basic Local AlignmentTool，BLAST)、点矩阵分析或动态编程方法。在一个实例中，序列一致性或相似性通过使用Genetics Computer Group(GCG)程序GAP(Needleman-Wunsch算法)确定。变体和原始蛋白质的氨基酸序列在一个或多个区域中可以基本相同，但是在其他区域中分歧。变体可以包括片段(例如，多肽的生物学活性片段)。在一些实施方案中，与全长多肽相比，片段可以在多肽的N端、C端或两个末端(各自独立地)上缺少多达约1、2、3、4、5、10、20、30、40、50或100个氨基酸残基。
I.免疫系统的细胞
存在大量组成免疫系统的细胞相互作用。这些相互作用通过在两个方向上进行信号传导的特定受体-配体对发生，因此每个细胞都基于那些信号的时间和空间分布接收指令。
鼠模型在发现免疫调节途径中非常有用，但是这些途径的临床效用并不总是从近交小鼠品系转化为远交人类群体，因为远交人类群体可具有在不同程度上依赖于个体免疫调节途径的个体。
免疫系统的细胞包括淋巴细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突状细胞、密切相关的朗格汉斯细胞、自然杀伤(NK)细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和髓样细胞系的其他成员。另外，一系列专门的上皮细胞和基质细胞提供了解剖环境，其中通常通过分泌调节免疫系统细胞中生长和/或基因激活的关键因子发生免疫，所述因子在应答的诱导和效应子阶段中也起着直接作用。(Paul,W.E.,“第1章:The immune system:an introduction,”FundamentalImmunology,第4版,Ed.Paul,W.E.,Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia,(1999),第102页)。
免疫系统的细胞存在于周围组织化的组织中，如脾、淋巴结，肠的派尔集合淋巴结(Peyer’s patch)和扁桃体。淋巴细胞还存在于它们经历发育步骤的中央淋巴样器官、胸腺和骨髓中，所述发育步骤装备它们以介导成熟免疫系统的无数应答。很大一部分的淋巴细胞和巨噬细胞组成了血液和淋巴中存在的循环细胞库，从而提供了将免疫活性细胞递送至需要它们的部位并允许局部生成的免疫力变得普遍化的手段。(Paul,W.E.,“第1章:Theimmune system:an introduction,”Fundamental Immunology,第4版,Ed.Paul,W.E.,Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia,(1999),在102页)。
术语“淋巴细胞”是指小的白细胞，其在全身淋巴组织中形成，并且在正常成年人中约占循环血液中白细胞总数的22-28％，其在保护身体免受疾病中起着重要作用。个别淋巴细胞是特化的，因为它们定型为通过其遗传物质的重组(例如，以产生T细胞受体和B细胞受体)来响应有限的一组结构相关抗原。在免疫系统与给定抗原首次接触之前存在的此定型(commitment)通过淋巴细胞表面膜上抗原上决定簇(表位)的特异性受体的存在来表达。每个淋巴细胞都具有独特的受体群，所有受体都具有相同的结合位点。一组的淋巴细胞或淋巴细胞的克隆在其受体结合区的结构上与另一克隆不同，并且因此在其可以识别的表位中有所不同。淋巴细胞不仅在其受体的特异性上彼此不同，而且在其功能上也不同。(Paul,W.E.,“第1章:The immune system:an introduction,”Fundamental Immunology,第4版,Ed.Paul,W.E.,Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia,(1999),在102页)。
公认的淋巴细胞有两大类：作为抗体分泌细胞前体的B淋巴细胞(B细胞)和T淋巴细胞(T细胞)。
B淋巴细胞
B淋巴细胞衍生自骨髓的造血细胞。成熟的B细胞可以用表达被其细胞表面识别的表位的抗原激活。激活过程可以是直接的，取决于通过抗原的膜Ig分子的交联(交联依赖性B细胞激活)，或者是间接的，在称为关联辅助的过程中经由与辅助T细胞相互作用。在许多生理情况下，受体交联刺激和关联辅助协同以产生更强力的B细胞应答(Paul,W.E.,“第1章:The immune system:an introduction,”Fundamental Immunology,第4版,Ed.Paul,W.E.,Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia,(1999))。
交联依赖性B细胞激活需要抗原表达与细胞表面受体结合位点互补的表位的多个拷贝，因为每个B细胞表达具有相同的可变区的Ig分子。通过具有重复表位的其他抗原，如微生物的荚膜多糖或病毒包膜蛋白，满足此类需求。交联依赖性B细胞激活是针对这些微生物的主要保护性免疫应答(Paul,W.E.,“第1章:The immune system:an introduction”,Fundamental Immunology,第4版,Ed.Paul,W.E.,Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia,(1999))。
关联辅助允许B细胞针对无法交联受体的抗原发出应答，并且同时提供共刺激性信号，其在B细胞受到弱交联事件刺激时挽救其免于失活。关联辅助依赖于B细胞膜免疫球蛋白(Ig)对抗原的结合，抗原的内吞作用及其在细胞的内体/溶酶体区室内片段化成肽。一些所得的肽被加载到一组特化的细胞表面蛋白中的沟中，该蛋白质称为II类主要组织相容性复合物(MHC)分子。所得的II类/肽复合物在细胞表面上表达，并充当一组T细胞(称为CD4+ T细胞)的抗原特异性受体的配体。CD4+ T细胞在其表面上具有B细胞II类/肽复合物特异性的受体。B细胞激活不仅依赖于T细胞通过其T细胞受体(TCR)的结合，而且这种相互作用还允许T细胞上的激活配体(CD40配体)与其在B细胞上的受体(CD40)结合，从而信号传导B细胞激活。此外，T辅助细胞通过结合B细胞上的细胞因子受体来分泌几种调节受刺激的B细胞的生长和分化的细胞因子(Paul,W.E.,“第1章:The immune system:an introduction,“Fundamental Immunology,第4版,Ed.Paul,W.E.,Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia,(1999))。
在产生抗体的关联辅助期间，CD40配体在激活的CD4+ T辅助细胞上瞬时表达，并且它与抗原特异性B细胞上的CD40结合，从而转导第二共刺激性信号。后一信号通过防止已遇到抗原的生发中心B细胞的凋亡对于B细胞生长和分化以及生成记忆B细胞至关重要。B和T细胞两者中CD40配体的超表达与人类SLE患者的致病性自身抗体产生有关(Desai-Mehta,A.et al.,“Hyperexpression of CD40 ligand by B and T cells in human lupus andits role in pathogenic autoantibody production,”J.Clin.Invest.Vol.97(9),2063-2073,(1996))。
T淋巴细胞
来源于造血组织中的前体的T淋巴细胞在胸腺中经历分化，然后接种至外周淋巴样组织和淋巴细胞再循环库。T淋巴细胞或T细胞介导一大批的免疫学功能。这包括帮助B细胞发育为抗体产生细胞的能力，增加单核细胞/巨噬细胞杀微生物作用的能力、抑制某些类型的免疫应答、直接杀伤靶细胞和动员炎症应答。这些作用依赖于特异性细胞表面分子的T细胞表达和细胞因子的分泌(Paul,W.E.,“第1章:The immune system:an introduction”,Fundamental Immunology,第4版,Ed.Paul,W.E.,Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia,(1999))。
T细胞与B细胞在其识别抗原的机制上不同。B细胞的受体免疫球蛋白与可溶性分子或颗粒表面上的个别表位结合。B细胞受体识别天然分子的表面上表达的表位。抗体和B细胞受体经演化以与细胞外液中的微生物结合并针对细胞外液中的微生物提供保护，而T细胞识别其他细胞表面上的抗原并通过与这些抗原呈递细胞(APC)相互作用并改变其行为来介导其功能。可以激活T细胞的外周淋巴样器官中的APC主要有三种类型：树突状细胞、巨噬细胞和B细胞。这些中最有效力的是树突状细胞，其唯一功能是将外来抗原呈递至T细胞。未成熟的树突状细胞位于整个身体的组织中，包括皮肤、肠和呼吸道。当它们在这些部位遇到入侵的微生物时，其吞噬病原体及其产物，并经由淋巴将其携带至局部淋巴结或肠相关的淋巴样器官。与病原体的相遇诱导树突状细胞从抗原捕获细胞成熟到可以激活T细胞的APC。APC在其表面上展示出三种类型的蛋白质分子，它们具有激活T细胞成为效应子细胞的作用：(1)MHC蛋白，其将外来抗原呈递至T细胞受体；(2)共刺激性蛋白质，其与T细胞表面上的互补受体结合；和(3)细胞-细胞粘附分子，其使T细胞能够与APC结合足够长以被激活(“第24章:The adaptive immune system,”Molecular Biology of the Cell,Alberts,B.et al.,Garland Science,NY,(2002))。
T细胞基于其表达的细胞表面受体细分为两种不同的类别。大多数T细胞表达由α链和β链组成的TCR。小部分T细胞表达由γ链和δ链制成的受体。在α/βT细胞中有2个亚系：表达共受体分子CD4的T细胞(CD4+ T细胞)和表达CD8的T细胞(CD8+ T细胞)。这些细胞的差异在于它们如何识别抗原以及其效应子和调节功能。
CD4+ T细胞是免疫系统的主要调节细胞。它们的调节功能取决于它们的细胞表面分子(如CD40配体，当T细胞激活时其表达被诱导)的表达，以及它们在激活时分泌的一大批细胞因子。
T细胞也介导重要的效应子功能，其中一些取决于它们所分泌的细胞因子的模式。细胞因子对靶细胞可以是直接有毒性的并且可以动员有力的炎症机制。
此外，T细胞(尤其是CD8+ T细胞)可以发育为能够有效裂解表达CTL识别的抗原的靶细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)(Paul,W.E.,“第1章:The immune system:anintroduction,”Fundamental Immunology,第4版,Ed.Paul,W.E.,Lippicott-RavenPublishers,Philadelphia,(1999))。
T细胞受体(TCR)识别由通过蛋白水解与II类或I类MHC蛋白的特化沟结合的抗原衍生的肽组成的复合物。CD4+ T细胞仅识别肽/II类复合物，而CD8+T细胞识别肽/I类复合物(Paul,W.E.,“第1章:The immune system:an introduction,”Fundamental Immunology,第4版,Ed.Paul,W.E.,Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia,(1999))。
TCR的配体(即肽/MHC蛋白复合物)是在APC内创建的。通常，II类MHC分子结合由APC通过内吞过程摄取的蛋白质衍生的肽。然后，将这些载有肽的II类分子在细胞表面上表达，在那里它们可用于被具有能够识别表达的细胞表面复合物的TCR的CD4+ T细胞结合。因此，CD4+ T细胞特化为与衍生自细胞外来源的抗原发生反应(Paul,W.E.,“第1章:Theimmune system:an introduction,”Fundamental Immunology,第4版,Ed.Paul,W.E.,Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia,(1999))。
相比之下，I类MHC分子主要加载有衍生自内部合成蛋白质(如病毒蛋白质)的肽。这些肽是通过蛋白体的蛋白水解从胞质蛋白质产生的，并被转运到粗面内质网中。通常由长度为九个氨基酸组成的此类肽结合到I类MHC分子中，并被带到细胞表面，在那里它们可以由表达适当受体的CD8+ T细胞识别。这对T细胞系统(特别是CD8+ T细胞)给予检测表达下述蛋白质的细胞的能力，所述蛋白质不同于生物体的其余部分的细胞的蛋白质(例如，病毒抗原)或突变体抗原(如活性癌基因产物)，或者以比生物体的其余部分的细胞的蛋白质(例如，病毒抗原)或突变体抗原(如活性癌基因产物)大得多的量产生，即使这些蛋白质以其完整形式既不在细胞表面上表达也不被分泌(Paul,W.E.,“第1章:The immune system:anintroduction,”Fundamental Immunology,第4版,Ed.Paul,W.E.,Lippicott-RavenPublishers,Philadelphia,(1999))。
T细胞也可以基于其功能分类为辅助T细胞；参与诱导细胞免疫的T细胞；抑制性T细胞；和细胞毒性T细胞。
辅助T细胞
辅助T细胞是刺激B细胞对蛋白质和其他T细胞依赖性抗原产生抗体应答的T细胞。T细胞依赖性抗原是一种免疫原，其中个别表位仅出现一次或有限次数，使得它们无法交联B细胞的膜免疫球蛋白(Ig)或无效地交联。B细胞通过其膜Ig结合抗原，并且复合物经历内吞。在内体和溶酶体区室中，抗原通过蛋白水解酶片段化为肽，并且一种或多种生成的肽被加载到II类MHC分子中，该分子通过该囊泡区室进行运输。然后将所得的肽/II类MHC复合物输出至B细胞表面膜。具有对肽/II类分子复合物具有特异性的受体的T细胞识别B细胞表面上的该复合物。(Paul,W.E.,“第1章:The immune system:an introduction,”FundamentalImmunology,第4版,Ed.Paul,W.E.,Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia(1999))。
B细胞激活取决于T细胞通过其TCR的结合以及T细胞CD40配体(CD40L)与B细胞上CD40的相互作用。T细胞不组成性表达CD40L。确切地，CD40L表达作为与表达由T细胞的TCR识别的关联抗原和CD80或CD86两者的APC相互作用的结果而受到诱导。CD80/CD86通常由激活但不静止的B细胞表达，因此涉及激活的B细胞和T细胞的辅助相互作用可以导致有效的抗体产生。但是，在许多情况下，T细胞上CD40L的初始诱导取决于它们对组成型表达CD80/86的APC(如树突状细胞)表面上抗原的识别。然后，此类激活的辅助T细胞可以有效地与B细胞相互作用并帮助B细胞。即使效率低下，B细胞上膜Ig的交联也可以与CD40L/CD40相互作用协同以产生强力的B细胞激活。B细胞应答中的后续事件(包括增殖、Ig分泌和所表达的Ig类的类别转换)取决于T细胞衍生的细胞因子的作用或被其增强(Paul,W.E.,“第1章:Theimmune system:an introduction,”Fundamental Immunology,第4版,Ed.Paul,W.E.,Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia,(1999))。
CD4+ T细胞倾向于分化为主要分泌细胞因子IL-4、IL-5、IL-6和IL-10的细胞(TH2细胞)，或者分化为主要产生IL-2、IFN-γ和淋巴毒素的细胞(TH1细胞)。TH2细胞在帮助B细胞发育为产生抗体的细胞方面非常有效，而TH1细胞则是细胞免疫应答的有效诱导剂，涉及单核细胞和巨噬细胞杀微生物活性的增强，并因此提高了细胞内囊泡区室中微生物裂解的效率。尽管具有TH2细胞表型(即IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)的CD4+ T细胞是有效的辅助细胞，但TH1细胞也具有作为辅助者的能力(Paul,W.E.,“第1章:The immune system:anintroduction,“Fundamental Immunology,第4版,Ed.Paul,W.E.,Lippicott-RavenPublishers,Philadelphia,(1999))。
T细胞参与细胞免疫诱导
T细胞还可以发挥作用以增强单核细胞和巨噬细胞破坏细胞内微生物的能力。特别是，辅助T细胞产生的干扰素-gamma(IFN-γ)增强了单个核吞噬细胞破坏细胞内细菌和寄生物的几种机制，包括一氧化氮的生成和肿瘤坏死因子(TNF)产生。由于TH1细胞产生IFN-γ，因此其有效增强杀微生物作用。相反，TH2细胞产生的两种主要细胞因子IL-4和IL-10阻断了这些活性(Paul,W.E.,“第1章:The immune system:an introduction,”Fundamental Immunology,第4版,Ed.Paul,W.E.,Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia,(1999))。
调节性T(Treg)细胞
免疫稳态是通过免疫应答的启动和下调之间的受控平衡来维持的。凋亡和T细胞无反应性(一种耐受机制，其中在遇到抗原后T细胞本质上功能失活(Scwartz,R.H.,“Tcell anergy”,Annu.Rev.Immunol.,Vol.21:305-334(2003))两者的机制有助于免疫应答的下调。第三种机制是通过抑制性或调节性CD4+T(Treg)细胞主动抑制激活的T细胞而提供的(综述于Kronenberg,M.et al.,“Regulation of immunity by self-reactive Tcells”,Nature,Vol.435:598-604(2005)中)。组成性表达IL-2受体alpha(IL-2Rα)链(CD4+CD25+)的CD4+ Treg是天然存在的T细胞亚组，其是无反应的且抑制性的(Taams,L.S.etal.,“Human anergic/suppressive CD4+CD25+ T cells:a highly differentiated andapoptosis-prone population”,Eur.J.Immunol.Vol.31:1122-1131(2001))。耗竭CD4+CD25+ Treg导致小鼠中系统性自身免疫疾病，此外，这些Treg的转移预防自身免疫性疾病的发展。人CD4+CD25+ Treg与其鼠对应物相似，在胸腺中生成，并且其特征在于通过细胞-细胞接触依赖性机制抑制响应者T细胞的增殖，无法产生IL-2以及体外的无反应性表型。根据CD25的表达水平，人CD4+CD25+ T细胞可以分为抑制性(CD25高)和非抑制性(CD25低)细胞。叉头(forkhead)转录因子家族的成员FOXP3已显示在鼠和人CD4+CD25+ Treg中表达，并且似乎是控制CD4+CD25+ Treg发育的主要基因(Battaglia,M.et al.,“Rapamycin promotesexpansion of functional CD4+CD25+Foxp3+regulator T cells of both healthysubjects and type 1diabetic patients”,J.Immunol.,Vol.177:8338-8347,(2006))。
细胞毒性T淋巴细胞
识别来自靶细胞内产生的蛋白质的肽的CD8+ T细胞具有细胞毒性特性，因为它们导致靶细胞的裂解。CTL诱导的裂解机制涉及通过CTL产生穿孔蛋白，所述穿孔蛋白是可以插入到靶细胞膜中并促进该细胞的裂解的分子。穿孔蛋白介导的裂解被颗粒酶增强，所述颗粒酶是激活的CTL产生的一系列酶。许多活性CTL还在其表面上表达大量的fas配体。CTL表面上的fas配体与靶细胞表面上的fas的相互作用启动靶细胞中的凋亡，从而导致这些细胞的死亡。CTL介导的裂解似乎是破坏病毒感染细胞的主要机制。
淋巴细胞激活
术语“激活”或“淋巴细胞激活”是指通过特异性抗原、非特异性丝裂原(mitogen)或同种异体细胞刺激淋巴细胞，从而导致RNA、蛋白质和DNA的合成以及淋巴因子的产生；随后是各种效应子细胞和记忆细胞的增殖和分化。T细胞激活取决于TCR/CD3复合物与其关联配体的相互作用，所述关联配体是结合在I类或II类MHC分子沟中的肽。通过受体衔接而运动的分子事件是复杂的。最早的步骤之一似乎是酪氨酸激酶的激活，导致一组控制若干信号传导途径的底物的酪氨酸磷酸化。这些包括一组将TCR连接至ras途径的衔接蛋白，磷脂酶Cγ1，其酪氨酸磷酸化增加其催化活性并参与肌醇磷脂代谢途径，从而导致细胞内游离钙浓度升高和蛋白激酶C的激活，以及控制细胞生长和分化的一系列其他酶。除了受体衔接外，T细胞的完全应答性还需要辅助性细胞递送的共刺激性活性，例如T细胞上的CD28通过APC上的CD80和/或CD86的衔接。
T记忆细胞
通过适应性免疫应答识别并根除病原体后，绝大多数(90-95％)的T细胞经历凋亡，其余细胞形成记忆T细胞库，称为中央记忆T细胞(TCM)、效应子记忆T细胞(TEM)和驻留记忆T细胞(TRM)(Clark,R.A.,“Resident memory T cells in human health anddisease”,Sci.Transl.Med.,7,269rv1,(2015))。CD45RA在幼稚T细胞以及CD4和CD8两者中的效应子细胞上表达。经历抗原后，中央和效应子记忆T细胞获得CD45RO的表达并且失去CD45RA的表达。因此，通常使用CD45RA或CD45RO区分幼稚群体与记忆群体。CCR7和CD62L是另两个可以用于区分中央和效应子记忆T细胞的标志物。幼稚和中央记忆细胞表达CCR7和CD62L，以迁移至次级淋巴样器官。因此，幼稚T细胞为CD45RA+CD45RO–CCR7+CD62L+，中央记忆T细胞为CD45RA–CD45RO+CCR7+CD62L+，并且效应子记忆T细胞为CD45RA–CD45RO+CCR7–CD62L–。
与标准T细胞相比，这些记忆T细胞寿命长，具有独特的表型，如特定的表面标志物的表达，不同细胞因子谱的快速产生，直接效应子细胞功能的能力以及独特的归巢分布模式。记忆T细胞在重新暴露于其各自的抗原后表现出快速反应以消除冒犯者的再感染，从而迅速恢复免疫系统的平衡。越来越多的证据证实，自身免疫记忆T细胞阻碍了大多数治疗或治愈自身免疫疾病的尝试(Clark,R.A.,“Resident memory T cells in human healthand disease”,Sci.Transl.Med.,Vol.7,269rv1,(2015))。
II.人工抗原呈递细胞(aAPC)
本公开的特征在于经工程化改造以激活或抑制T细胞的红系细胞(例如去核红系细胞)和去核细胞。在一些实施方案中，去核细胞是红系细胞，例如其通过从红细胞前体细胞分化而失去其核。然而，应理解，并非所有去核细胞都是红系细胞，因此，本文所涵盖的去核细胞还可以包括例如血小板。在一些实施方案中，去核细胞不是血小板，并因此是无血小板的去核细胞。在本公开的某些方面，去核细胞是网织红细胞或红细胞(完全成熟的红细胞(RBC))。与其他细胞相比，红细胞提供许多优势，包括非自体(例如，基本上缺乏主要的组织相容性复合物(MHC))、在受试者中具有更长的循环时间(例如，大于30天)以及适合大量生产。
基于本文提供的公开内容，熟练技术人员将理解，一旦掌握了本文提供的教导，许多免疫调节分子可以用于产生几乎无限种类的aAPC。也就是说，在本领域中存在关于与T细胞的激活和诱导有关的事件和分子的广泛的知识。
在一些方面，本公开提供了工程化红系细胞或去核细胞，其包含外源多肽，例如，在细胞表面上包含或呈递外源多肽。本公开的外源多肽包括但不限于外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、外源代谢调控多肽和外源Treg共刺激性多肽。
外源抗原性多肽
外源抗原性多肽是能够诱导免疫应答的多肽。在一些实施方案中，外源抗原性多肽是下述多肽，其通过诱导免疫应答来抑制癌症，例如，减少或减轻癌症的原因或症状，或改进与癌症相关的参数的值。在一些实施方案中，外源抗原性多肽是下述多肽，其通过诱导免疫应答来抑制传染病，例如减少或减轻传染病的原因或症状，或改进与传染病相关的参数的值。在一些实施方案中，外源抗原性多肽是下述多肽，其通过诱导免疫应答来抑制自身免疫疾病，例如减少或减轻自身免疫疾病的原因或症状，或改进与自身免疫疾病相关的参数的值。
在某些实施方案中，外源抗原性多肽包含选自表1的抗原性多肽或其片段或变体，或针对其的抗体分子或者由选自表1的抗原性多肽或其片段或变体，或针对其的抗体分子组成。
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在其他实施方案中，抗原性多肽是来自本文公开的任何一种抗原的抗原性多肽。例如，在一些实施方案中，抗原性多肽是来自选自表1和14-24中公开的抗原的抗原的抗原性多肽。在一些实施方案中，抗原性多肽是来自选自表16中公开的抗原的抗原的抗原性多肽。在一些实施方案中，抗原性多肽是来自选自表17中公开的抗原的抗原的抗原性多肽。在一些实施方案中，抗原性多肽是来自选自表18中公开的抗原的抗原的抗原性多肽。在一些实施方案中，抗原性多肽是来自选自表19中公开的抗原的抗原的抗原性多肽。在一些实施方案中，抗原性多肽是来自选自表20中公开的抗原的抗原的抗原性多肽。在一些实施方案中，抗原性多肽是来自选自表21中公开的抗原的抗原的抗原性多肽。在一些实施方案中，抗原性多肽是来自选自表22中公开的抗原的抗原的抗原性多肽。在一些实施方案中，抗原性多肽是来自选自表23中公开的抗原的抗原的抗原性多肽。在一些实施方案中，抗原性多肽是来自选自表24中公开的抗原的抗原的抗原性多肽。
选自表1或表14-24的示例性抗原性多肽，例如人多肽包括：
a)人多肽的天然存在形式，例如与疾病状态无关的人多肽的天然存在形式；
b)具有出现在2017年12月22日的数据库(例如GenBank数据库)中的序列的人多肽，例如具有出现在2017年12月22日的数据库(例如GenBank数据库)中的序列的与疾病状态无关的人多肽的天然存在形式；
c)人多肽，其具有与a)或b)的序列相差不超过1、2、3、4、5或10个氨基酸残基的序列；
d)人多肽，其具有与a)或b)的序列相差不超过1、2、3、4、5或10％的其氨基酸残基的序列；
e)人多肽，其具有与a)或b)的序列基本没有不同的序列；或
f)具有c)、d)或e)的序列的人多肽，其与具有a)或b)的序列的人多肽在生物学活性方面，例如酶活性(例如特异性或周转(turnover))或结合活性(例如结合特异性或亲和力)上基本上没有差异。f)下的候选肽可以如本文所述制备并针对类似活性进行筛选，并且如果在如本文所述的工程化红系细胞中表达则在下文是等同的。
在实施方案中，外源抗原性多肽包含人多肽或其片段，例如前述段落的a)、b)、c)、d)、e)或f)的人多肽的全部或片段。在一个实施方案中，外源多肽包含融合多肽，其包含前述段落的a)、b)、c)、d)、e)或f)的人多肽的全部或片段以及另外的氨基酸序列。在一个实施方案中，另外的氨基酸序列包含不同人多肽的前述段落的a)、b)、c)、d)、e)或f)的人多肽的全部或片段。
在某些实施方案中，外源抗原性多肽在抗原呈递多肽上呈递，例如，外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽，例如组织相容性分子(MHCI或MHCII)特异性结合。
在一些实施方案中，外源抗原性多肽为8个氨基酸长至24个氨基酸长，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个氨基酸长。在进一步的实施方案中，将可切割的位点引入外源抗原性多肽中。
MAGE-A
MAGE-A抗原在极其多种的不同组织学起源和生殖细胞的癌症中表达。MAGE-A抗原属于较大的癌症/睾丸抗原(CTA)家族，其表达在不同组织学起源和生殖细胞的癌症中得到一致检测(Simpson et al.Nat Rev Cancer.2005Aug；5(8):615-25)。MAGE-A基因家族有12个成员(MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12)，其位于染色体Xq28上(Chomez et al.,CancerRes.2001Jul 15；61(14):5544-51；DePlaen et al.,Immunogenetics.1994；40(5):360-9)。MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12在相当大比例的各种组织学类型的原发性和转移性肿瘤中表达，并且是肿瘤抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的靶标。单独MAGE-A的表达从一种肿瘤类型变化到另一种，但是总的来说，大多数肿瘤表达至少一种MAGE-A抗原。通过免疫组织化学已在不同组织学来源的癌症中鉴定出特定基因产物，包括高百分比的非小细胞肺癌(NSCLC)、膀胱癌、食道癌和头颈癌、骨髓瘤、肉瘤和三阴性乳腺癌(Juretic etal.Lancet Oncol.2003Feb；4(2):104-9；Curigliano et al.,Ann Oncol.2011Jan；22(1):98-103；vanBaren et al.,Ann Oncol.2011Jan；22(1):98-103；Antonescu et al.,HumPathol.2002Feb；33(2):225-9)。
在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是MAGE-A抗原。在进一步的实施方案中，MAGE-A抗原选自MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11和MAGE-A12。在一些实施方案中，红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，红系细胞是有核细胞。
在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是MAGE-A1抗原。在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是MAGE-A2抗原。在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是MAGE-A3抗原。在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是MAGE-A4抗原。在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是MAGE-A5抗原。在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是MAGE-A6抗原。在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是MAGE-A7抗原。在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是MAGE-A8抗原。在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是MAGE-A9抗原。在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是MAGE-A10抗原。在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是MAGE-A11抗原。在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是MAGE-A12抗原。在另一方面，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或MHC II类多肽或单链融合物，其中外源抗原性多肽是MAGE-A抗原。在一些实施方案中，MAGE-A抗原选自MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11和MAGE-A12。在一些实施方案中，MAGE-A抗原选自MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10和MAGE-A12。
在一些实施方案中，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或MHC II类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是MAGE-A1抗原。在一些实施方案中，MAGE-A1抗原选自下组：EADPTGHSY(SEQ ID NO:123)、KVLEYVIKV(SEQ ID NO:126)、SLFRAVITK(SEQ ID NO:127)、EVYDGREHSA(SEQ ID NO:129)、RVRFFFPSL(SEQ ID NO:130)、EADPTGHSY(SEQ ID NO:123)、REPVTKAEML(SEQ ID NO:131)、KEADPTGHSY(SEQ ID NO:132)、DPARYEFLW(SEQ ID NO:133)、ITKKVADLVGF(SEQ ID NO:134)、SAFPTTINF(SEQ ID NO:135)、SAYGEPRKL(SEQ ID NO:136)、RVRFFFPSL(SEQ ID NO:130)、SAYGEPRKL(SEQ ID NO:136)、TSCILESLFRAVITK(SEQ ID NO:137)、PRALAETSYVKVLEY(SEQ ID NO:138)、FLLLKYRAREPVTKAE(SEQ ID NO:139)和EYVIKVSARVRF(SEQ ID NO:140)。
在一些实施方案中，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽，例如组织相容性分子(MHCI、MHCII)特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或MHC II类单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是MAGE-A2抗原。在一些实施方案中，MAGE-A2抗原选自下组：YLQLVFGIEV(SEQ ID NO:141)、EYLQLVFGI(SEQ ID NO:145)、REPVTKAEML(SEQ ID NO:131)、EGDCAPEEK(SEQ ID NO:146)和LLKYRAREPVTKAE(SEQ ID NO:147)。
在一些实施方案中，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽，例如组织相容性分子(MHCI、MHCII)特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或MHC II类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是MAGE-A3抗原。在一些实施方案中，MAGE-A3抗原选自下组：EVDPIGHLY(SEQ ID NO:148)、FLWGPRALVD(SEQ ID NO:149)、KVAELVHFL(SEQ ID NO:150)、TFPDLESEF(SEQ ID NO:153)、VAELVHFLL(SEQ ID NO:154)、MEVDPIGHLY(SEQ ID NO:155)、EVDPIGHLY(SEQ ID NO:148)、REPVTKAEML(SEQ ID NO:131)、AELVHFLLLI(SEQ ID NO:157)、EVDPIGHLY(SEQ ID NO:148)、WQYFFPVIF(SEQ ID NO:158)、EGDCAPEEK(SEQ ID NO:146)、KKLLTQHFVQENYLEY(SEQ ID NO:159)、RKVAELVHFLLLKYR(SEQID NO:160)、KKLLTQHFVQENYLEY(SEQ ID NO:159)、ACYEFLWGPRALVETS(SEQ ID NO:161)、RKVAELVHFLLLKYR(SEQ ID NO:160)、VIFSKASSSLQL(SEQ ID NO:162)、VIFSKASSSLQL(SEQID NO:162)、VFGIELMEVDPIGHL(SEQ ID NO:163)、GDNQIMPKAGLLIIV(SEQ ID NO:164)、TSYVKVLHHMVKISG(SEQ ID NO:165)、RKVAELVHFLLLKYRA(SEQ ID NO:166)和FLLLKYRAREPVTKAE(SEQ ID NO:139)。
在一些实施方案中，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽，例如组织相容性分子(MHCI、MHCII)特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或MHC II类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是MAGE-A4抗原。在实施方案中，MAGE-A4抗原选自下组：EVDPASNTYJ(SEQ ID NO:167)和GVYDGREHTV(SEQ ID NO:168)。
在一些实施方案中，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽，例如组织相容性分子(MHCI、MHCII)特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或MHC II类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是MAGE-A5抗原。
在一些实施方案中，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽，例如组织相容性分子(MHCI、MHCII)特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或MHC II类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是MAGE-A6抗原。在一些实施方案中，MAGE-A6抗原选自下组：SESLKMIF(SEQ ID NO:170)、MVKISGGPR(SEQ ID NO:171)、EVDPIGHVY(SEQ ID NO:172)、REPVTKAEML(SEQ ID NO:131)、EGDCAPEEK(SEQ ID NO:146)、ISGGPRISY(SEQ ID NO:173)、LLKYRAREPVTKAE(SEQ ID NO:147)。
在一些实施方案中，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽，例如组织相容性分子(MHCI、MHCII)特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或MHC II类多肽或单链融合物，其中外源抗原性多肽是MAGE-A7抗原。
在一些实施方案中，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽，例如组织相容性分子(MHCI、MHCII)特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或MHC II类多肽或单链融合物，其中外源抗原性多肽是MAGE-A8抗原。
在一些实施方案中，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽，例如组织相容性分子(MHCI、MHCII)特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或MHC II类多肽或单链融合物，其中外源抗原性多肽是MAGE-A9抗原(SEQ ID NO:176)。在一些实施方案中，MAGE-A9抗原是ALSVMGVYV。
在一些实施方案中，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽，例如组织相容性分子(MHCI、MHCII)特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或MHC II类多肽或单链融合物，其中外源抗原性多肽是MAGE-A10抗原。在一些实施方案中，MAGE-A10抗原选自下组：GLYDGMEHLI(SEQ ID NO:715)和DPARYEFLW(SEQ ID NO:133)。
在一些实施方案中，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽，例如组织相容性分子(MHCI、MHCII)特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或MHC II类多肽或单链融合物，其中外源抗原性多肽是MAGE-A11抗原。
在一些实施方案中，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽，例如组织相容性分子(MHCI、MHCII)特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或MHC II类多肽或单链融合物，其中外源抗原性多肽是MAGE-A12抗原。在一些实施方案中，MAGE-A12抗原选自下组：FLWGPRALVE(SEQ ID NO:179)、VRIGHLYIL(SEQ ID NO:180)、EGDCAPEEK(SEQ ID NO:146)、REPFTKAEMLGSVIR(SEQ ID NO:181)和AELVHFLLLKYRAR(SEQID NO:182)。
本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其包含MAGE-A家族的几种肿瘤抗原共有的表位。在一些实施方案中，外源抗原性多肽包含表位p248v9(YLEYRQVPV(SEQ ID NO:124))，一种由HLA-A*0201呈递并能够诱导识别所有MAGE-A抗原的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的免疫原性肽。在一些实施方案中，外源抗原性多肽包含表位p248g9(YLEYRQVPG(SEQID NO:156))，一种能够诱导识别MAGE-A2、A3、A4、A6、A10、A12的CTL的免疫原性肽。在一些实施方案中，外源抗原性多肽包含表位p248d9(YLEYRQVPD(SEQ ID NO:125))，一种能够诱导识别MAGE-A1的CTL的免疫原性肽。
在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是p248v9(YLEYRQVPV(SEQ ID NO:124))。在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源性抗原多肽是p248g9(YLEYRQVPG(SEQ ID NO:156))。在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源性抗原多肽是p248d9(YLEYRQVPD(SEQ ID NO:125))。
本公开还涵盖了经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽，例如组织相容性分子(MHCI、MHCII)特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或MHC II类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是p248v9(YLEYRQVPV(SEQ ID NO:124))。在一些实施方案中，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽，例如组织相容性分子(MHCI、MHCII)特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或MHC II类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是p248g9(YLEYRQVPG(SEQ ID NO:156))。在一些实施方案中，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽，例如组织相容性分子(MHCI、MHCII)特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或MHC II类多肽或单链融合物并且其中外源抗原性多肽是p248d9(YLEYRQVPD(SEQ ID NO:125))。在实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I HLA-A，例如MHC I HLA-A*201。
在一个特定的实施方案中，人工抗原呈递细胞包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，p248v9(YLEYRQVPV(SEQ ID NO:124))，其融合至外源抗原呈递多肽，MHCI HLA-A*201，其融合至GPA跨膜域(GPA)。在一个特定的实施方案中，人工抗原呈递细胞包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，p248g9(YLEYRQVPG(SEQ ID NO:156))，其融合至外源抗原呈递多肽，MHCI HLA-A*201，其融合至GPA跨膜域(GPA)。在一个特定的实施方案中，人工抗原呈递细胞包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，p248d9(YLEYRQVPD(SEQ ID NO:125))，其融合至外源抗原呈递多肽，MHCI HLA-A*201，其融合至GPA跨膜域(GPA)。
在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是如表1中列出的MAGE-A抗原。在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是如表1中列出的MAGE-A抗原，并且进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含4-1BBL的外源多肽。在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是选自表1中列出的MAGE-A抗原的MAGE-A抗原，并且进一步呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是特定MAGE-A抗原的表1中列出的相应的MHC I类或MHCII类HLA。在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是选自表1中列出的MAGE-A抗原的MAGE-A抗原，并且进一步呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽以及包含4-1BBL的外源多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是特定MAGE-A抗原的表1中列出的相应的MHC I类或MHC II类HLA。在另一个实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是选自表1中列出的MAGE-A抗原的MAGE-A抗原，并且进一步呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽以及包含4-1BBL的外源多肽，其中至少一种外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是特定MAGE-A抗原的表1中列出的相应的MHC I类HLA。
在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽包含选自以下的MAGE-A抗原，或由选自以下的MAGE-A抗原组成：EADPTGHSY(SEQ ID NO:123)、KVLEYVIKV(SEQ ID NO:126)、SLFRAVITK(SEQ ID NO:127)、EVYDGREHSA(SEQ ID NO:129)、RVRFFFPSL(SEQ ID NO:130)、EADPTGHSY(SEQ ID NO:123)、REPVTKAEML(SEQ ID NO:131)、KEADPTGHSY(SEQ ID NO:132)、DPARYEFLW(SEQ ID NO:133)、ITKKVADLVGF(SEQ IDNO:134)、SAFPTTINF(SEQ ID NO:135)、SAYGEPRKL(SEQ ID NO:136)、RVRFFFPSL(SEQ IDNO:130)、SAYGEPRKL(SEQ ID NO:136)、TSCILESLFRAVITK(SEQ ID NO:137)、PRALAETSYVKVLEY(SEQ ID NO:138)、FLLLKYRAREPVTKAE(SEQ ID NO:139)、EYVIKVSARVRF(SEQ ID NO:140)、YLQLVFGIEV(SEQ ID NO:141)、EYLQLVFGI(SEQ ID NO:145)、REPVTKAEML(SEQ ID NO:131)、EGDCAPEEK(SEQ ID NO:146)、LLKYRAREPVTKAE(SEQ ID NO:147)、EVDPIGHLY(SEQ ID NO:148)、FLWGPRALVD(SEQ ID NO:149)、KVAELVHFL(SEQ ID NO:150)、TFPDLESEF(SEQ ID NO:153)、VAELVHFLL MEVDPIGHLY(SEQ ID NO:716)、EVDPIGHLY(SEQ IDNO:148)、REPVTKAEML(SEQ ID NO:131)、AELVHFLLLI(SEQ ID NO:157)、MEVDPIGHLY(SEQ IDNO:155)、WQYFFPVIF(SEQ ID NO:158)、EGDCAPEEK(SEQ ID NO:146)、KKLLTQHFVQENYLEY(SEQ ID NO:159)、RKVAELVHFLLLKYR(SEQ ID NO:160)、KKLLTQHFVQENYLEY(SEQ ID NO:159)、ACYEFLWGPRALVETS(SEQ ID NO:161)、RKVAELVHFLLLKYR(SEQ ID NO:160)、VIFSKASSSLQL(SEQ ID NO:162)、VIFSKASSSLQL(SEQ ID NO:162)、VFGIELMEVDPIGHL(SEQID NO:163)、GDNQIMPKAGLLIIV(SEQ ID NO:164)、TSYVKVLHHMVKISG(SEQ ID NO:165)、RKVAELVHFLLLKYRA(SEQ ID NO:166)、FLLLKYRAREPVTKAE(SEQ ID NO:139)、EVDPASNTYj(SEQ ID NO:167)、GVYDGREHTV(SEQ ID NO:168)、NYKRCFPVI(SEQ ID NO:169)、SESLKMIF(SEQ ID NO:170)、MVKISGGPR(SEQ ID NO:171)、EVDPIGHVY(SEQ ID NO:172)、REPVTKAEML(SEQ ID NO:131)、EGDCAPEEK(SEQ ID NO:146)、ISGGPRISY(SEQ ID NO:173)、LLKYRAREPVTKAE(SEQ ID NO:147)、ALSVMGVYV(SEQ ID NO:176)、GLYDGMEHLI(SEQ ID NO:715)、DPARYEFLW(SEQ ID NO:133)、FLWGPRALVE(SEQ ID NO:179)、VRIGHLYIL(SEQ ID NO:180)、EGDCAPEEK(SEQ ID NO:146)、REPFTKAEMLGSVIR(SEQ ID NO:181)和AELVHFLLLKYRAR(SEQ ID NO:182)。
在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽包含选自以下的MAGE-A抗原，或由选自以下的MAGE-A抗原组成：EADPTGHSY(SEQ ID NO:123)、KVLEYVIKV(SEQ ID NO:126)、SLFRAVITK(SEQ ID NO:127)、EVYDGREHSA(SEQ ID NO:129)、RVRFFFPSL(SEQ ID NO:130)、EADPTGHSY(SEQ ID NO:123)、REPVTKAEML(SEQ ID NO:131)、KEADPTGHSY(SEQ ID NO:132)、DPARYEFLW(SEQ ID NO:133)、ITKKVADLVGF(SEQ IDNO:134)、SAFPTTINF(SEQ ID NO:135)、SAYGEPRKL(SEQ ID NO:136)、RVRFFFPSL(SEQ IDNO:130)、SAYGEPRKL(SEQ ID NO:136)、TSCILESLFRAVITK(SEQ ID NO:137)、PRALAETSYVKVLEY(SEQ ID NO:138)、FLLLKYRAREPVTKAE(SEQ ID NO:139)、EYVIKVSARVRF(SEQ ID NO:140)、YLQLVFGIEV(SEQ ID NO:141)、EYLQLVFGI(SEQ ID NO:145)、REPVTKAEML(SEQ ID NO:131)、EGDCAPEEK(SEQ ID NO:146)、LLKYRAREPVTKAE(SEQ ID NO:147)、EVDPIGHLY(SEQ ID NO:148)、FLWGPRALVD(SEQ ID NO:149)、KVAELVHFL(SEQ ID NO:150)、TFPDLESEF(SEQ ID NO:153)、VAELVHFLL MEVDPIGHLY(SEQ ID NO:716)、EVDPIGHLY(SEQ IDNO:148)、REPVTKAEML(SEQ ID NO:131)、AELVHFLLLI(SEQ ID NO:157)、MEVDPIGHLY(SEQ IDNO:155)、WQYFFPVIF(SEQ ID NO:158)、EGDCAPEEK(SEQ ID NO:146)、KKLLTQHFVQENYLEY(SEQ ID NO:159)、RKVAELVHFLLLKYR(SEQ ID NO:160)、KKLLTQHFVQENYLEY(SEQ ID NO:159)、ACYEFLWGPRALVETS(SEQ ID NO:161)、RKVAELVHFLLLKYR(SEQ ID NO:160)、VIFSKASSSLQL(SEQ ID NO:162)、VIFSKASSSLQL(SEQ ID NO:162)、VFGIELMEVDPIGHL(SEQID NO:163)、GDNQIMPKAGLLIIV(SEQ ID NO:164)、TSYVKVLHHMVKISG(SEQ ID NO:165)、RKVAELVHFLLLKYRA(SEQ ID NO:166)、FLLLKYRAREPVTKAE(SEQ ID NO:139)、EVDPASNTYj(SEQ ID NO:167)、GVYDGREHTV(SEQ ID NO:168)、NYKRCFPVI(SEQ ID NO:169)、SESLKMIF(SEQ ID NO:170)、MVKISGGPR(SEQ ID NO:171)、EVDPIGHVY(SEQ ID NO:172)、REPVTKAEML(SEQ ID NO:131)、EGDCAPEEK(SEQ ID NO:146)、ISGGPRISY(SEQ ID NO:173)、LLKYRAREPVTKAE(SEQ ID NO:147)、ALSVMGVYV(SEQ ID NO:176)、GLYDGMEHLI(SEQ ID NO:715)、DPARYEFLW(SEQ ID NO:133)、FLWGPRALVE(SEQ ID NO:179)、VRIGHLYIL(SEQ ID NO:180)、EGDCAPEEK(SEQ ID NO:146)、REPFTKAEMLGSVIR(SEQ ID NO:181)和AELVHFLLLKYRAR(SEQ ID NO:182)，并且其中红系细胞进一步包含含有4-1BBL的外源多肽。
在进一步的实施方案中，如本文所述的aAPC可以经工程化改造以进一步包含含有4-1BBL的外源多肽，所述aAPC包含含有MAGE-A抗原(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11或MAGE-A12抗原，如上所述)的任何外源抗原性多肽。在另一个进一步的实施方案中，如本文所述的aAPC可以经工程化改造以进一步包含含有4-1BBL的外源多肽，所述aAPC包含至少一种含有与一种或多种MAGE-A抗原共有的表位(例如p248v9、p248g9和/或p248d9)的外源抗原性多肽。
如本文所述的aAPC可以用于治疗癌症，所述aAPC包含含有MAGE-A抗原(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11或MAGE-A12抗原，如上所述)的任何外源抗原性多肽，如下文所更详细描述的。如本文所述的aAPC可以用于治疗癌症，所述aAPC包含含有MAGE-A抗原(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11或MAGE-A12抗原，如上所述)的任何外源抗原性多肽并进一步包含含有4-1BBL的外源多肽，如下文所更详细描述的。此外，如本文所述的aAPC可以用于治疗癌症，所述aAPC包含含有与一种或多种MAGE-A抗原共有的表位(例如p248v9、p248g9和/或p248d9)的外源抗原性多肽，如下文所更详细描述的。此外，如本文所述的aAPC可以用于治疗癌症，所述aAPC包含含有与一种或多种MAGE-A抗原共有的表位(例如p248v9、p248g9和/或p248d9)的外源抗原性多肽，并进一步包含含有4-1BBL的外源多肽，如下文所更详细描述的。
嗜中性粒细胞颗粒蛋白酶
嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、蛋白酶3和组织蛋白酶G是三种同源蛋白酶，其属于丝氨酸蛋白酶的胰凝乳蛋白酶超家族。它们与活性氧种类组合发挥作用以帮助降解吞噬溶酶体内的吞没的微生物。这些蛋白酶在嗜中性粒细胞在炎性部位处活化期间也以活性形式外化，从而有助于炎性和免疫应答的调节。除了参与病原体的破坏和促炎过程的调节外，嗜中性粒细胞丝氨酸蛋白酶(NSP)还参与多种炎性人类状况，包括慢性肺疾病(慢性阻塞性肺疾病、囊性纤维化、急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征)和癌症。例如，蛋白酶3在急性骨髓性白血病和前列腺癌细胞中高表达(Kolnin et al.,Blood 2016 128:1025)。已经显示蛋白酶3和嗜中性粒细胞弹性蛋白酶在乳腺癌细胞中异常表达(Desmedt et al.Int J Cancer,2006Dec 1:119)。
嗜中性粒细胞弹性蛋白酶是人类中由ELANE基因编码的酶。嗜中性粒细胞弹性蛋白酶在炎症期间由嗜中性粒细胞和巨噬细胞分泌，并破坏细菌和宿主组织。蛋白酶3是人类中由PRTN3基因编码的酶。在人类嗜中性粒细胞中，蛋白酶3有助于抗微生物肽的蛋白水解生成。它也是c-ANCA(胞质亚型)类的抗嗜中性粒细胞胞质抗体(ANCA)的靶标，c-ANCA是在疾病肉芽肿病伴多血管炎中经常发现的一类抗体。组织蛋白酶G是人类中由CTSG基因编码的蛋白质。编码的蛋白酶具有与胰凝乳蛋白酶C相似的特异性，并且可以参与吞没的病原体的杀伤和消化，并参与炎症部位的结缔组织重塑。另外，编码的蛋白质是抗微生物的，具有针对金黄色葡萄球菌(S.aureus)和淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae)的杀细菌活性。
在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是嗜中性粒细胞颗粒蛋白酶抗原。在进一步的实施方案中，嗜中性粒细胞颗粒蛋白酶选自嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、蛋白酶3和组织蛋白酶G。在一些实施方案中，红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，红系细胞是有核细胞。
在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抗原。在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是蛋白酶3抗原。在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是组织蛋白酶G抗原。I
在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抗原，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种包含4-1BBL的外源多肽。在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是蛋白酶3抗原，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种包含4-1BBL的外源多肽。在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是组织蛋白酶G抗原，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种包含4-1BBL的外源多肽。
在另一方面，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或者MHCII类多肽或单链融合物，其中外源抗原性多肽是嗜中性粒细胞颗粒蛋白酶抗原。在进一步的实施方案中，嗜中性粒细胞颗粒蛋白酶选自嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、蛋白酶3和组织蛋白酶G。
在另一方面，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物，其中外源抗原性多肽是嗜中性粒细胞颗粒蛋白酶抗原，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种包含4-1BBL的外源多肽。在进一步的实施方案中，嗜中性粒细胞颗粒蛋白酶选自嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、蛋白酶3和组织蛋白酶G。
在另一方面，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，其中外源抗原性多肽是嗜中性粒细胞颗粒蛋白酶抗原，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种包含4-1BBL的外源多肽。在进一步的实施方案中，嗜中性粒细胞颗粒蛋白酶选自嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、蛋白酶3和组织蛋白酶G。
在一些实施方案中，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抗原。在一些实施方案中，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是蛋白酶3抗原。在一些实施方案中，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是组织蛋白酶G抗原。
PR1(VLQELNVTV(SEQ ID NO:225))是从髓样蛋白蛋白酶3和嗜中性粒细胞弹性蛋白酶衍生的HLA-A2限制性肽。PR1在髓样白血病细胞上由优先杀伤白血病并有助于细胞遗传学缓解的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别。
因此，本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是PR1。
本公开还涵盖了经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是PR1。
本公开还涵盖了经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是PR1，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种包含4-1BBL的外源多肽。
本公开还涵盖了经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是PR1。在实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2多肽或单链融合物。
本公开还涵盖了经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是PR1，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种包含4-1BBL的外源多肽。在实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2多肽或单链融合物。
在一个特定的实施方案中，人工抗原呈递细胞包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽PR1，其与外源抗原呈递多肽MHCI HLA-A2融合，所述外源抗原呈递多肽MHCI HLA-A2与GPA跨膜域(GPA)融合。
在一个特定的实施方案中，人工抗原呈递细胞包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽PR1，其与外源抗原呈递多肽MHCI HLA-A2融合，所述外源抗原呈递多肽MHCI HLA-A2与GPA跨膜域(GPA)融合，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种包含4-1BBL的外源多肽。
如本文所述的aAPC可以用于治疗癌症，所述aAPC包含任何含有嗜中性粒细胞颗粒蛋白酶抗原(例如嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抗原、蛋白酶3抗原或组织蛋白酶G抗原)的外源抗原性多肽，如下文所更详细描述的。如本文所述的aAPC可以用于治疗癌症，所述aAPC包含任何含有嗜中性粒细胞颗粒蛋白酶抗原(例如嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抗原、蛋白酶3抗原或组织蛋白酶G抗原)的外源抗原性多肽并进一步包括包含4-1BBL的外源多肽，如下文所更详细描述的。如本文所述的aAPC可以用于治疗癌症，所述aAPC包括包含PR1的外源抗原性多肽，如下文所更详细描述的。如本文所述的aAPC可以用于治疗癌症，所述aAPC包括包含PR1的外源抗原性多肽并进一步包括包含4-1BBL的外源多肽，如下文所更详细描述的。
NY-ESO-1/LAGE-2
癌症/睾丸(C/T)抗原是一类具有正常表达的肿瘤抗原，其限于睾丸中的雄性生殖细胞而不在成年体细胞组织中。在一些情况下，CT抗原也在卵巢和滋养层中表达。在恶性疾病中，该基因调节被破坏，导致一定比例的各种类型的肿瘤中的CT抗原表达。癌症/睾丸抗原1(也称为自身免疫原性癌症/睾丸抗原NY-ESO-1或LAGE-2)是人类中由CTAG1B基因编码的蛋白质。最初通过SEREX(重组肿瘤cDNA表达文库的血清学分析)方法从食道癌克隆的癌症-睾丸抗原NY-ESO-1在大部分患有表达NY-ESO-1的癌症的患者中引起体液和细胞免疫应答(Stockert et al.,J.Exp.Med.1998；187:1349–1354；Jager et al.J.Exp.Med.1998；187:265–270)。
在一方面，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是NY-ESO-1/LAGE-2抗原。在一些实施方案中，红系细胞是去核红系细胞。在一些实施方案中，红系细胞是有核细胞。
在一方面，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是NY-ESO-1/LAGE-2抗原，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种包含4-1BBL的外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞。
在另一方面，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物，其中外源抗原性多肽是NY-ESO-1/LAGE-2抗原。在实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2或HLA-A24多肽或单链融合物。在实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC II类DP4多肽或单链融合物。在一些实施方案中，红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，红系细胞是有核细胞。
在另一方面，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物，其中外源抗原性多肽是NY-ESO-1/LAGE-2抗原，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种包含4-1BBL的外源多肽。在实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2或HLA-A24多肽或单链融合物。在实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC II类DP4多肽或单链融合物。在一些实施方案中，红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，红系细胞是有核细胞。
在一些实施方案中，本公开的aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是如表1中列出的NY-ESO-1/LAGE-2抗原。在一些实施方案中，本公开的aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是如表1中列出的NY-ESO-1/LAGE-2抗原，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种包含4-1BBL的外源多肽。在一些实施方案中，本公开的aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是选自表1中列出的NY-ESO-1/LAGE-2抗原的NY-ESO-1/LAGE-2抗原，并且进一步呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是表1中针对特定NY-ESO-1/LAGE-2抗原列出的相应MHC I类/II类HLA的MHCI类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物。在一些实施方案中，本公开的aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是选自表1中列出的NY-ESO-1/LAGE-2抗原的NY-ESO-1/LAGE-2抗原，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是表1中针对特定NY-ESO-1/LAGE-2抗原列出的相应MHC I类/II类HLA的MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种包含4-1BBL的外源多肽。
本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种包含NY-ESO-1/LAGE-2衍生肽的外源抗原性多肽。在一些实施方案中，NY-ESO-1/LAGE-2衍生肽是从NY-ESO-1/LAGE-2衍生的HLAI类结合多肽。在一些实施方案中，从NY-ESO-1/LAGE-2衍生的HLA I类结合多肽是SLLMWITQC(SEQ ID NO:110)。在一些实施方案中，红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种包含至少一种从NY-ESO-1/LAGE-2衍生的外源HLA II类结合多肽的外源抗原性多肽。在一些实施方案中，从NY-ESO-1/LAGE-2衍生的HLAII类结合多肽是SLLMWITQCFLPVF(SEQ ID NO:114)。
在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是SLLMWITQC(SEQ ID NO:110)。在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是SLLMWITQCFLPVF(SEQ ID NO:114)。
本公开还涵盖了经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是SLLMWITQC(SEQ ID NO:110)。在一些实施方案中，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是SLLMWITQCFLPVF(SEQ ID NO:114)。
本公开还涵盖了经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是SLLMWITQC(SEQ ID NO:110)。在实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2或HLA-A24多肽或单链融合物。在一些实施方案中，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC II类单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是SLLMWITQCFLPVF(SEQ ID NO:114)。在实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC II类DP4多肽或单链融合物。
在一个特定的实施方案中，人工抗原呈递细胞包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，SLLMWITQC(SEQ ID NO:110)，其与外源抗原呈递多肽MHCI HLA-A2或HLA-24融合，所述外源抗原呈递多肽与GPA跨膜域(GPA)融合。
在一个特定的实施方案中，人工抗原呈递细胞包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽SLLMWITQCFLPVF(SEQ ID NO:114)，其与外源抗原呈递多肽(MHCII HLA-DP4)融合，所述外源抗原呈递多肽与GPA跨膜域(GPA)融合。
在实施方案中，至少一种外源抗原性多肽是选自以下的NY-ESO-1/LAGE-2抗原：SLLMWITQC(SEQ ID NO:110)、MLMAQEALAFL(SEQ ID NO:109)、YLAMPFATPME(SEQ ID NO:204)、ASGPGGGAPR(SEQ ID NO:205)、LAAQERRVPR(SEQ ID NO:111)、TVSGNILTIR(SEQ IDNO:206)、APRGPHGGAASGL(SEQ ID NO:207)、MPFATPMEAEL(SEQ ID NO:208)、KEFTVSGNILTI(SEQ ID NO:209)、MPFATPMEA(SEQ ID NO:210)、FATPMEAEL(SEQ ID NO:211)、FATPMEAELAR(SEQ ID NO:212)、LAMPFATPM(SEQ ID NO:213)、ARGPESRLL(SEQ ID NO:214)、SLLMWITQCFLPVF(SEQ ID NO:114)、LLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQ(SEQ ID NO:215)、LLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQ(SEQ ID NO:215)、EFYLAMPFATPM(SEQ ID NO:216)、PGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR(SEQ ID NO:217)、RLLEFYLAMPFA(SEQ ID NO:218)、QGAMLAAQERRVPRAAEVPR(SEQ ID NO:115)、PFATPMEAELARR(SEQ ID NO:219)、PGVLLKEFTVSGNILTIRLT(SEQ ID NO:220)、VLLKEFTVSG(SEQ ID NO:221)、AADHRQLQLSISSCLQQL(SEQ ID NO:116)、LLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQ(SEQ ID NO:215)、LKEFTVSGNILTIRL(SEQ ID NO:222)、PGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR(SEQ ID NO:217)、LLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQ(SEQ ID NO:215)、KEFTVSGNILT(SEQ ID NO:223)、LLEFYLAMPFATPM(SEQ ID NO:224)和AGATGGRGPRGAGA(SEQ ID NO:119)。
在一些实施方案中，本公开的aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是选自以下的NY-ESO-1/LAGE-2抗原：SLLMWITQC(SEQ ID NO:110)、MLMAQEALAFL(SEQ ID NO:109)、YLAMPFATPME(SEQ ID NO:204)、ASGPGGGAPR(SEQ ID NO:205)、LAAQERRVPR(SEQ ID NO:111)、TVSGNILTIR(SEQ ID NO:206)、APRGPHGGAASGL(SEQ ID NO:207)、MPFATPMEAEL(SEQID NO:208)、KEFTVSGNILTI(SEQ ID NO:209)、MPFATPMEA(SEQ ID NO:210)、FATPMEAEL(SEQID NO:211)、FATPMEAELAR(SEQ ID NO:212)、LAMPFATPM(SEQ ID NO:213)、ARGPESRLL(SEQID NO:214)、SLLMWITQCFLPVF(SEQ ID NO:114)、LLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQ(SEQ ID NO:215)、LLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQ(SEQ ID NO:215)、EFYLAMPFATPM(SEQ ID NO:216)、PGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR(SEQ ID NO:217)、RLLEFYLAMPFA(SEQ ID NO:218)、QGAMLAAQERRVPRAAEVPR(SEQ ID NO:115)、PFATPMEAELARR(SEQ ID NO:219)、PGVLLKEFTVSGNILTIRLT(SEQ ID NO:220)、VLLKEFTVSG(SEQ ID NO:221)、AADHRQLQLSISSCLQQL(SEQ ID NO:116)、LLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQ(SEQ ID NO:215)、LKEFTVSGNILTIRL(SEQ ID NO:222)、PGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR(SEQ ID NO:217)、LLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQ(SEQ ID NO:215)、KEFTVSGNILT(SEQ ID NO:223)、LLEFYLAMPFATPM(SEQ ID NO:224)和AGATGGRGPRGAGA(SEQ ID NO:119)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种包含4-1BBL的外源多肽。
在一些实施方案中，本公开的aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是选自以下的NY-ESO-1/LAGE-2抗原：SLLMWITQC(SEQ ID NO:110)、MLMAQEALAFL(SEQ ID NO:109)、YLAMPFATPME(SEQ ID NO:204)、ASGPGGGAPR(SEQ ID NO:205)、LAAQERRVPR(SEQ ID NO:111)、TVSGNILTIR(SEQ ID NO:206)、APRGPHGGAASGL(SEQ ID NO:207)、MPFATPMEAEL(SEQID NO:208)、KEFTVSGNILTI(SEQ ID NO:209)、MPFATPMEA (SEQ ID NO:210)、FATPMEAEL(SEQ ID NO:211)、FATPMEAELAR(SEQ ID NO:212)、LAMPFATPM(SEQ ID NO:213)、ARGPESRLL(SEQ ID NO:214)、SLLMWITQCFLPVF(SEQ ID NO:114)、LLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQ(SEQID NO:215)、LLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQ(SEQ ID NO:215)、EFYLAMPFATPM(SEQ ID NO:216)、PGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR(SEQ ID NO:217)、RLLEFYLAMPFA(SEQ ID NO:218)、QGAMLAAQERRVPRAAEVPR(SEQ ID NO:115)、PFATPMEAELARR(SEQ ID NO:219)、PGVLLKEFTVSGNILTIRLT(SEQ ID NO:220)、VLLKEFTVSG(SEQ ID NO:221)、AADHRQLQLSISSCLQQL(SEQ ID NO:116)、LLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQ(SEQ ID NO:215)、LKEFTVSGNILTIRL(SEQ ID NO:222)、PGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR(SEQ ID NO:217)、LLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQ(SEQ ID NO:215)、KEFTVSGNILT(SEQ ID NO:223)、LLEFYLAMPFATPM(SEQ ID NO:224)和AGATGGRGPRGAGA(SEQ ID NO:119)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是表1中针对特定NY-ESO-1/LAGE-2抗原列出的相应MHC I类/II类HLA的MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种包含4-1BBL的外源多肽。
在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是SLLMWITQC(SEQ ID NO:110)，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含4-1BBL的外源多肽。
在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是SLLMWITQCFLPVF(SEQ ID NO:114)，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含4-1BBL的外源多肽。
如本文所述的aAPC可以用于治疗癌症，所述aAPC包含(例如在细胞表面上包含)包含NY-ESO-1/LAGE-2抗原的外源抗原性多肽，如下文所更详细描述的。如本文所述的aAPC可以用于治疗癌症，所述aAPC包含(例如在细胞表面上包含)包含NY-ESO-1/LAGE-2抗原的外源抗原性多肽，并且进一步包含(例如在细胞表面上包含)包含4-1BBL的外源多肽，如下文所更详细描述的。如本文所述的aAPC可以用于治疗癌症，所述aPAC包含(例如在细胞表面上包含)如本文所述的至少一种外源NY-ESO-1/LAGE-2衍生肽(例如SLLMWITQC(SEQ ID NO:110)或SLLMWITQCFLPVF(SEQ ID NO:114))，如下文所更详细描述的。如本文所述的aAPC可以用于治疗癌症，所述aPAC包含(例如在细胞表面上包含)如本文所述的至少一种外源NY-ESO-1/LAGE-2衍生肽(例如SLLMWITQC(SEQ ID NO:110)或SLLMWITQCFLPVF(SEQ ID NO:114))，并且进一步包括包含4-1BBL的外源多肽，如下文所更详细描述的。
端粒酶/hTERT
端粒酶逆转录酶(缩写为TERT，或人类中缩写为hTERT)是大多数真核生物中染色体末端复制所必需的核糖核蛋白酶。端粒酶通过添加端粒重复序列TTAGGG来维持端粒末端。端粒酶表达在细胞衰老中起作用，因为它通常在出生后的体细胞中受到抑制，导致端粒的逐渐缩短。端粒酶活性与细胞能分裂的次数有关，在细胞系(如癌细胞)的永生性中起着重要作用。
在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是端粒酶抗原。在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是端粒酶抗原，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含4-1BBL的外源多肽。在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是人端粒酶(hTERT)抗原。在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是人端粒酶(hTERT)抗原，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含4-1BBL的外源多肽。在一些实施方案中，红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，红系细胞是有核细胞。
在另一方面，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物，其中外源抗原性多肽是端粒酶抗原。在一些实施方案中，端粒酶抗原是人端粒酶(hTERT)抗原。在一些实施方案中，红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，红系细胞是有核细胞。
在另一方面，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物，其中外源抗原性多肽是端粒酶抗原，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含4-1BBL的外源多肽。在一些实施方案中，端粒酶抗原是人端粒酶(hTERT)抗原。在一些实施方案中，红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，红系细胞是有核细胞。
本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是ILAKFLHWL(SEQID NO:658)。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是RLVDDFLLV(SEQ ID NO:659)。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是RPGLLGASVLGLDDI(SEQ ID NO:663)。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是LTDLQPYMRQFVAHL(SEQ ID NO:664)。本公开还涵盖了经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是ILAKFLHWL(SEQID NO:658)。本公开还涵盖了经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是RLVDDFLLV(SEQ ID NO:659)。本公开还涵盖了经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是RPGLLGASVLGLDDI(SEQ ID NO:663)。本公开还涵盖了经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是LTDLQPYMRQFVAHL(SEQ ID NO:664)。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是ILAKFLHWL(SEQ IDNO:658)，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含4-1BBL的外源多肽。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是RLVDDFLLV(SEQ ID NO:659)，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含4-1BBL的外源多肽。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是RPGLLGASVLGLDDI(SEQ IDNO:663)，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含4-1BBL的外源多肽。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是LTDLQPYMRQFVAHL(SEQID NO:664)，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含4-1BBL的外源多肽。本公开还涵盖了经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是ILAKFLHWL(SEQ ID NO:658)，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含4-1BBL的外源多肽。本公开还涵盖了经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是RLVDDFLLV(SEQ IDNO:659)，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含4-1BBL的外源多肽。本公开还涵盖了经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是RPGLLGASVLGLDDI(SEQ ID NO:663)，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含4-1BBL的外源多肽。本公开还涵盖了经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是LTDLQPYMRQFVAHL(SEQ ID NO:664)，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含4-1BBL的外源多肽。
本公开还涵盖了经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是ILAKFLHWL(SEQ ID NO:658)。在实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2多肽或单链融合物。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2单链融合物。
本公开还涵盖了经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是ILAKFLHWL(SEQ ID NO:658)，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含4-1BBL的外源多肽。在实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2多肽或单链融合物。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2单链融合物。
本公开还涵盖了经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是RLVDDFLLV(SEQ ID NO:659)。在实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2多肽或单链融合物。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2单链融合物。
本公开还涵盖了经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是RLVDDFLLV(SEQ ID NO:659)，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含4-1BBL的外源多肽。在实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2多肽或单链融合物。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2单链融合物。
本公开还涵盖了经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC II类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是RPGLLGASVLGLDDI(SEQ IDNO:663)。在实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC II类HLA-DR7多肽或单链融合物。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC II类HLA-DR7单链融合物。
本公开还涵盖了经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC II类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是RPGLLGASVLGLDDI(SEQ IDNO:663)，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含4-1BBL的外源多肽。在实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC II类HLA-DR7多肽或单链融合物。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC II类HLA-DR7单链融合物。
本公开还涵盖了经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC II类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是LTDLQPYMRQFVAHL(SEQ IDNO:664)。在实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC II类HLA-DR11多肽或单链融合物。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC II类HLA-DR11单链融合物。
本公开还涵盖了经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC II类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是LTDLQPYMRQFVAHL(SEQ IDNO:664)，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含4-1BBL的外源多肽。在实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC II类HLA-DR11多肽或单链融合物。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC II类HLA-DR11单链融合物。
在一个特定的实施方案中，人工抗原呈递细胞包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽ILAKFLHWL(SEQ ID NO:658)，其与外源抗原呈递多肽(MHCI HLA-A2)融合，所述外源抗原呈递多肽与GPA跨膜域(GPA)融合。
在一个特定的实施方案中，人工抗原呈递细胞包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽ILAKFLHWL(SEQ ID NO:658)，其与外源抗原呈递多肽(MHCI HLA-A2)融合，所述外源抗原呈递多肽与GPA跨膜域(GPA)融合，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含4-1BBL的外源多肽。
如本文所述的aAPC可以用于治疗癌症，所述aAPC呈递(例如在细胞表面上包含)端粒酶抗原，特别是hTERT抗原，如下文所更详细描述的。如本文所述的aAPC可以用于治疗癌症，所述aAPC呈递(例如在细胞表面上包含)端粒酶抗原，特别是hTERT抗原，并且进一步呈递(例如在细胞表面上包含)包含4-1BBL的外源多肽，如下文所更详细描述的。如本文所述的aAPC可以用于治疗癌症，所述aAPC呈递(例如在细胞表面上包含)上述hTERT抗原，如下文所更详细描述的。如本文所述的aAPC可以用于治疗癌症，所述aAPC呈递(例如在细胞表面上包含)上述hTERT抗原，并且进一步呈递(例如在细胞表面上包含)包含4-1BBL的外源多肽，如下文所更详细描述的。
髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)
髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)是一种在少突胶质细胞表面和髓鞘最外表面上表达的膜蛋白。由于这种定位，MOG是参与免疫介导的脱髓鞘的主要靶抗原。MOG蛋白可以参与髓鞘的完成和维持以及细胞间的通信。
在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是MOG抗原。在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是MOG抗原，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共抑制性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共抑制性多肽是PD-L1。在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是MOG抗原，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含Treg扩增多肽的外源多肽。在一些实施方案中，Treg扩增多肽是IL-2。在一些实施方案中，Treg扩增多肽是CD25特异性IL-2。在一些实施方案中，MOG抗原是人MOG抗原。在一些实施方案中，红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，红系细胞是有核细胞。
在另一方面，本公开的特征在于经工程化改造以抑制T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物，其中外源抗原性多肽是MOG抗原。在另一方面，本公开的特征在于经工程化改造以抑制T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物，其中外源抗原性多肽是MOG抗原，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共抑制性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共抑制性多肽是PD-L1。在另一方面，本公开的特征在于经工程化改造以激活调节性T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物，其中外源抗原性多肽是MOG抗原，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含Treg扩增多肽的外源多肽。在一些实施方案中，Treg扩增多肽是CD25特异性IL-2。在一些实施方案中，MOG抗原是人MOG抗原。在一些实施方案中，红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，红系细胞是有核细胞。
本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK(SEQ ID NO:690)。
本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK(SEQ ID NO:690)，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共抑制性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共抑制性多肽是PD-L1。
本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK(SEQ ID NO:690)，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含Treg扩增多肽的外源多肽。在一些实施方案中，Treg扩增多肽是CD25特异性IL-2。
本公开还涵盖了经工程化改造以激活调节性T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC II类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK(SEQ ID NO:690)。
本公开还涵盖了经工程化改造以抑制T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC II类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK(SEQ ID NO:690)，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共抑制性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共抑制性多肽是PD-L1。
在一个特定的实施方案中，人工抗原呈递细胞包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是MOG抗原，其与外源抗原呈递多肽(MHCII)融合，所述外源抗原呈递多肽与GPA跨膜域(GPA)融合。在一些实施方案中，MOG抗原是人MOG抗原。在一些实施方案中，作为单链融合物，MOG抗原与外源抗原呈递多肽(MHCII)融合，所述外源抗原呈递多肽与GPA融合。
在一个特定的实施方案中，人工抗原呈递细胞包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是MOG抗原，其与外源抗原呈递多肽(MHCII)融合，所述外源抗原呈递多肽与GPA跨膜域(GPA)融合，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共抑制性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共抑制性多肽是PD-L1。在一些实施方案中，MOG抗原是人MOG抗原。在一些实施方案中，作为单链融合物，MOG抗原与外源抗原呈递多肽(MHCII)融合，所述外源抗原呈递多肽与GPA融合。
在一个特定的实施方案中，人工抗原呈递细胞包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是MOG抗原，其与外源抗原呈递多肽(MHCII)融合，所述外源抗原呈递多肽与GPA跨膜域(GPA)融合，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含Treg扩增多肽的外源多肽。在一些实施方案中，Treg扩增多肽是IL-2。在一些实施方案中，Treg扩增多肽是CD25特异性IL-2。在一些实施方案中，MOG抗原是人MOG抗原。在一些实施方案中，作为单链融合物，MOG抗原与外源抗原呈递多肽(MHCII)融合，所述外源抗原呈递多肽与GPA融合。
如本文所述的aAPC可以用于治疗多发性硬化症，所述aAPC呈递(例如在细胞表面上包含)MOG抗原，如下文所更详细描述的。如本文所述的aAPC可以用于治疗多发性硬化症，所述aAPC呈递(例如在细胞表面上包含)MOG抗原，并且进一步呈递(例如在细胞表面上包含)包含共抑制性多肽的外源多肽，如下文所更详细描述的。如本文所述的aAPC可以用于多发性硬化症，所述aAPC呈递(例如在细胞表面上包含)MOG抗原，并且进一步呈递(例如在细胞表面上包含)包含共抑制性多肽的外源多肽，其中共抑制性多肽是PD-L1，如下文所更详细描述的。如本文所述的aAPC可以用于治疗多发性硬化症，所述aAPC呈递(例如在细胞表面上包含)MOG抗原，并且进一步呈递(例如在细胞表面上包含)包含Treg扩增多肽的外源多肽，如下文所更详细描述的。如本文所述的aAPC可以用于多发性硬化症，所述aAPC呈递(例如在细胞表面上包含)MOG抗原，并且进一步呈递(例如在细胞表面上包含)包含Treg扩增多肽的外源多肽，其中Treg扩增多肽是CD25特异性IL-2，如下文所更详细描述的。
gp100
糖蛋白100、gp100或黑色素细胞蛋白PMEL是黑色素体中富集的I型跨膜糖蛋白。
在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是gp100抗原。在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是gp100抗原，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。在一些实施方案中，gp100抗原是人gp100抗原。在一些实施方案中，红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，红系细胞是有核细胞。
在另一方面，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物，其中外源抗原性多肽是gp100抗原。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHCI。在另一方面，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物，其中外源抗原性多肽是gp100抗原，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHCI。在一些实施方案中，gp100抗原是人gp100抗原。在一些实施方案中，红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，红系细胞是有核细胞。
本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是RLMKQDFSV(SEQID NO:314)。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是RLPRIFCSC(SEQ ID NO:315)。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是LIYRRRLMK(SEQ ID NO:316)。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是ALLAVGATK(SEQ ID NO:317)。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是IALNFPGSQK(SEQ ID NO:318)。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是RSYVPLAHR(SEQ ID NO:319)。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是ALNFPGSQK(SEQ ID NO:320)。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是ALNFPGSQK(SEQ ID NO:320)。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是VYFFLPDHL(SEQ ID NO:321)。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是RTKQLYPEW(SEQ ID NO:322)。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是HTMEVTVYHR(SEQ ID NO:323)。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是SSPGCQPPA(SEQ ID NO:324)。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是VPLDCVLYRY(SEQ ID NO:325)。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是LPHSSSHWL(SEQ ID NO:326)。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是SNDGPTLI(SEQ IDNO:327)。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是GRAMLGTHTMEVTVY(SEQ ID NO:328)。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是WNRQLYPEWTEAQRLD(SEQ ID NO:329)。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是TTEWVETTARELPIPEPE(SEQ ID NO:330)。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是TGRAMLGTHTMEVTVYH(SEQ ID NO:331)。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是GRAMLGTHTMEVTVY(SEQ ID NO:328)。
本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是RLMKQDFSV(SEQID NO:314)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是RLPRIFCSC(SEQ ID NO:315)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是LIYRRRLMK(SEQ IDNO:316)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是ALLAVGATK(SEQ ID NO:317)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是IALNFPGSQK(SEQ IDNO:318)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是RSYVPLAHR(SEQ ID NO:319)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是ALNFPGSQK(SEQ IDNO:320)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是ALNFPGSQK(SEQ ID NO:320)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是VYFFLPDHL(SEQ IDNO:321)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是RTKQLYPEW(SEQ ID NO:322)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是HTMEVTVYHR(SEQ IDNO:323)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是SSPGCQPPA (SEQ ID NO:324)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是VPLDCVLYRY(SEQ IDNO:325)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是LPHSSSHWL(SEQ ID NO:326)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是SNDGPTLI(SEQ IDNO:327)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是GRAMLGTHTMEVTVY(SEQ ID NO:328)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是WNRQLYPEWTEAQRLD(SEQ ID NO:329)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是TTEWVETTARELPIPEPE(SEQ ID NO:330)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是TGRAMLGTHTMEVTVYH(SEQ ID NO:331)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是GRAMLGTHTMEVTVY(SEQ ID NO:328)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。
本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是RLMKQDFSV(SEQID NO:314)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是RLPRIFCSC(SEQ ID NO:315)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是LIYRRRLMK(SEQID NO:316)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是ALLAVGATK(SEQ ID NO:317)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是IALNFPGSQK(SEQ ID NO:318)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是RSYVPLAHR(SEQ ID NO:319)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是ALNFPGSQK(SEQ ID NO:320)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是ALNFPGSQK(SEQ ID NO:320)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是VYFFLPDHL(SEQ ID NO:321)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是RTKQLYPEW(SEQ ID NO:322)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是HTMEVTVYHR(SEQ ID NO:323)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是SSPGCQPPA(SEQ ID NO:324)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是VPLDCVLYRY(SEQ ID NO:325)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是LPHSSSHWL(SEQ ID NO:326)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是SNDGPTLI(SEQ ID NO:327)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是GRAMLGTHTMEVTVY(SEQ IDNO:328)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是WNRQLYPEWTEAQRLD(SEQ ID NO:329)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是TTEWVETTARELPIPEPE(SEQ ID NO:330)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是TGRAMLGTHTMEVTVYH(SEQ ID NO:331)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是GRAMLGTHTMEVTVY(SEQ ID NO:328)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物。
本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是RLMKQDFSV(SEQID NO:314)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是RLPRIFCSC(SEQ ID NO:315)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是LIYRRRLMK(SEQ ID NO:316)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是ALLAVGATK(SEQ ID NO:317)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是IALNFPGSQK(SEQ ID NO:318)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是RSYVPLAHR(SEQ ID NO:319)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是ALNFPGSQK(SEQ ID NO:320)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是ALNFPGSQK(SEQ ID NO:320)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是VYFFLPDHL(SEQ ID NO:321)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是RTKQLYPEW(SEQ ID NO:322)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是HTMEVTVYHR(SEQ ID NO:323)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是SSPGCQPPA(SEQ ID NO:324)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是VPLDCVLYRY(SEQ ID NO:325)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是LPHSSSHWL(SEQ ID NO:326)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是SNDGPTLI(SEQ ID NO:327)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是GRAMLGTHTMEVTVY(SEQ ID NO:328)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是WNRQLYPEWTEAQRLD(SEQ ID NO:329)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是TTEWVETTARELPIPEPE(SEQ ID NO:330)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是TGRAMLGTHTMEVTVYH(SEQ ID NO:331)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是GRAMLGTHTMEVTVY(SEQ ID NO:328)，和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。
如本文所述的aAPC可以用于治疗癌症，所述aAPC呈递，例如在细胞表面上包含，gp100抗原，如下面所详细描述的。如本文所述的aAPC可以用于治疗癌症，所述aAPC呈递，例如在细胞表面上包含，gp100抗原，并且进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽，如下面所详细描述的。如本文所述的aAPC可以用于治疗癌症，所述aAPC呈递，例如在细胞表面上包含，gp100抗原，并且进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽，其中共刺激性多肽是4-1BBL，如下面所详细描述的。如本文所述的aAPC可以用于治疗癌症，所述aAPC呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是gp100抗原，如下面所详细描述的。如本文所述的aAPC可以用于治疗癌症，所述aAPC呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是gp100抗原，并且进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽，其中共刺激性多肽是4-1BBL，如下面所详细描述的。在某些实施方案中，癌症是黑色素瘤。
埃巴病毒(EBV)
EBV是一种对B淋巴细胞具有向性的人类gamma疱疹病毒(Kieff and Liebowitz,in Virology,eds.Fields,B.N.,Knipe,D.M.et al.,p.1889-1919,Raven Press,Ltd.:NewYork,1990)。EBV是一种极为常见的环境媒介物，其感染全世界80-100％的个体。初始或原发感染可以是急性或亚临床的。这随后是EBV感染潜伏在循环血液、淋巴结和脾中的B淋巴细胞中的长时间段。
在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是EBV抗原。在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是EBV抗原，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。在一些实施方案中，EBV抗原是人EBV抗原。在一些实施方案中，红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，红系细胞是有核细胞。
在另一方面，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物，其中外源抗原性多肽是EBV抗原。在另一方面，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物，其中外源抗原性多肽是EBV抗原，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。在一些实施方案中，EBV抗原是人EBV抗原。在一些实施方案中，红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，红系细胞是有核细胞。
本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是gp350抗原性肽。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是VLQWASLAV(SEQ IDNO:698)。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是EBNA1抗原性多肽。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是FMVFLQTHI(SEQ IDNO:699)。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是FLQTHIFAEV(SEQ ID NO:700)。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是SIVCYFMVFL(SEQ ID NO:701)。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是CLGGLLTMV(SEQ ID NO:691)。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是GLCTLVAML(SEQ ID NO:692)。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是FLYALALLL(SEQ ID NO:693)。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是YVLDHLIVV(SEQ ID NO:694)。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是RLRAEAQVK(SEQ ID NO:695)。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是AVFDRKSDAK(SEQ ID NO:696)。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是RPPIFIRLL(SEQ ID NO:697)。
本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是gp350抗原性多肽，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是VLQWASLAV(SEQ ID NO:698)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是EBNA1抗原性多肽，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是FMVFLQTHI(SEQ ID NO:699)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是FLQTHIFAEV(SEQ ID NO:700)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是SIVCYFMVFL(SEQ ID NO:701)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是CLGGLLTMV(SEQ ID NO:691)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是GLCTLVAML(SEQ ID NO:692)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是FLYALALLL(SEQ ID NO:693)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是YVLDHLIVV(SEQ ID NO:694)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是RLRAEAQVK(SEQ ID NO:695)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是AVFDRKSDAK(SEQ ID NO:696)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是RPPIFIRLL(SEQ ID NO:697)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。
本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是gp350抗原性多肽。在实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2多肽或单链融合物。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2单链融合物。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是VLQWASLAV(SEQ ID NO:698)。在实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2多肽或单链融合物。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2单链融合物。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是EBNA1抗原性多肽。在实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2多肽或单链融合物。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2单链融合物。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHCI类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是FMVFLQTHI(SEQ ID NO:699)。在实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2多肽或单链融合物。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2单链融合物。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHCI类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是FLQTHIFAEV(SEQ ID NO:700)。在实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2多肽或单链融合物。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2单链融合物。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是SIVCYFMVFL(SEQ ID NO:701)。在实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2多肽或单链融合物。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2单链融合物。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是CLGGLLTMV(SEQ ID NO:691)。在实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2多肽或单链融合物。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2单链融合物。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是GLCTLVAML(SEQ ID NO:692)。在实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2多肽或单链融合物。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2单链融合物。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是FLYALALLL(SEQ ID NO:693)。在实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2多肽或单链融合物。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2单链融合物。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是YVLDHLIVV(SEQ ID NO:694)。在实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2多肽或单链融合物。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2单链融合物。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是RLRAEAQVK(SEQ ID NO:695)。在实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A3多肽或单链融合物。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A3单链融合物。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是AVFDRKSDAK(SEQ ID NO:696)。在实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A11多肽或单链融合物。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A11单链融合物。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是RPPIFIRLL(SEQ ID NO:697)。在实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-B7多肽或单链融合物。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-B7单链融合物。
本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是gp350抗原性肽，例如VLQWASLAV(SEQ ID NO:698)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。在实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2多肽或单链融合物。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2单链融合物。
本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是EBNA1抗原性肽，例如FMVFLQTHI(SEQ ID NO:699)、FLQTHIFAEV(SEQ ID NO:700)、SIVCYFMVFL(SEQ ID NO:701)或表1中列出的EBV抗原性多肽之一，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。在实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2多肽或单链融合物。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2单链融合物。
如本文所述的aAPC可以用于治疗与感染原(infectious agent)相关的自身免疫疾病，所述aAPC呈递，例如在细胞表面上包含，EBV抗原。在某些实施方案中，外源抗原性多肽在抗原呈递多肽上呈递，例如外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽，例如组织相容性分子(MHCI、MHCII)特异性结合。在一些实施方案中，与感染原相关的自身免疫疾病是多发性硬化症(MS)，如下文所更详细描述的。如本文所述的aAPC可以用于治疗感染原相关的自身免疫疾病，所述aAPC呈递，例如在细胞表面上包含，EBV抗原，并且进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，与感染原相关的自身免疫疾病是多发性硬化症(MS)，如下文所更详细描述的。如本文所述的aAPC可以用于治疗感染原相关的自身免疫疾病，所述aAPC呈递，例如在细胞表面上包含，EBV抗原，并且进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽，其中共刺激性多肽是4-1BBL。在一些实施方案中，与感染原相关的自身免疫疾病是多发性硬化症(MS)，如下文所更详细描述的。
人乳头瘤病毒(HPV)
乳头瘤病毒是具有高度物种特异性的小DNA肿瘤病毒。到目前为止，已经描述了70多种个别的人乳头瘤病毒(HPV)基因型。HPV通常对皮肤(例如HPV-1和-2)或粘膜表面(例如HPV-6和-11)具有特异性，并且通常导致持续数月或数年的良性肿瘤(疣)。一些HPV也与癌症相关，如HPV阳性的头颈癌和宫颈癌。HPV与人类癌症之间最强的正相关是HPV-16和HPV-18与宫颈癌之间存在的正相关。
在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是HPV抗原。在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是HPV-E7抗原。在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是HPV-E6抗原。在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是HPV抗原，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是HPV-E7抗原，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。在一些实施方案中，HPV抗原是人HPV抗原。在一些实施方案中，红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，红系细胞是有核细胞。
在另一方面，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物，其中外源抗原性多肽是HPV抗原。在另一方面，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物，其中外源抗原性多肽是HPV-E7抗原。在另一方面，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物，其中外源抗原性多肽是HPV抗原，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在另一方面，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物，其中外源抗原性多肽是HPV-E7抗原，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。在一些实施方案中，HPV抗原是人HPV抗原。在一些实施方案中，红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，红系细胞是有核细胞。
本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是YMLDLQPET(SEQID NO:713)、YMLDLQPETT(SEQ ID NO:714)或TIHDIILECV(SEQ ID NO:712)。在一些实施方案中，外源抗原性多肽是YMLDLQPET(SEQ ID NO:713)。
本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是YMLDLQPET(SEQID NO:713)、YMLDLQPETT(SEQ ID NO:714)或TIHDIILECV(SEQ ID NO:712)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，外源抗原性多肽是YMLDLQPET(SEQ ID NO:713)。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。
本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是HPV-E7。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是YMLDLQPET(SEQ ID NO:713)、YMLDLQPETT(SEQ IDNO:714)或TIHDIILECV(SEQ ID NO:712)。在一些实施方案中，外源抗原性多肽是YMLDLQPET(SEQ ID NO:713)。在实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2多肽或单链融合物。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2单链融合物。
本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是HPV-E7，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。本公开还涵盖了包含红系细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是YMLDLQPET(SEQ ID NO:713)、YMLDLQPETT(SEQ ID NO:714)或TIHDIILECV(SEQ ID NO:712)，其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，外源抗原性多肽是YMLDLQPET(SEQ ID NO:713)。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。在实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2多肽或单链融合物。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类HLA-A2单链融合物。
在一个特定的实施方案中，人工抗原呈递细胞包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是HPV抗原，其与外源抗原呈递多肽(MHC I类HLA-A2)融合，所述外源抗原呈递多肽与GPA跨膜域(GPA)融合。在一些实施方案中，HPV抗原是人HPV抗原。在一个特定的实施方案中，人工抗原呈递细胞包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是HPV-E7，其与外源抗原呈递多肽(MHC I类HLA-A2)融合，所述外源抗原呈递多肽与GPA跨膜域(GPA)融合。在一个特定的实施方案中，人工抗原呈递细胞包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是TIHDIILECV(SEQ ID NO:712)，所述外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽(MHC I类HLA-A2)融合，所述外源抗原呈递多肽与GPA跨膜域(GPA)融合。
如本文所述的aAPC可以用于治疗与致癌病毒(例如HPV)相关的癌症，所述aAPC呈递HPV抗原。如本文所述的aAPC可以用于治疗与致癌病毒(例如HPV)相关的癌症，所述aAPC呈递HPV抗原，并且进一步呈递包含共刺激性多肽的外源多肽。如本文所述的aAPC可以用于治疗与致癌病毒(例如HPV)相关的癌症，所述aAPC呈递HPV抗原，并且进一步呈递包含共刺激性多肽的外源多肽，其中共刺激性多肽是4-1BBL，如下文所更详细描述的。在实施方案中，HPV相关癌症是HPV阳性头颈癌。在一些实施方案中，HPV相关癌症是HPV阳性宫颈癌。
在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是CD33。
在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是CD123。
在一些实施方案中，本公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中至少一种外源抗原性多肽是CD38。
在前述方面的各种实施方案中，aAPC呈递，例如在细胞表面上包含，至少2种、至少3种、至少4种或至少5种外源抗原性多肽。
在另一方面，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞(例如细胞毒性CD8+ T细胞)的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽来自埃巴病毒(EBV)。aAPC可以进一步包含如本文所公开的外源共刺激性多肽。
在另一方面，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞(例如细胞毒性CD8+ T细胞)的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是gp350或其自身免疫原性肽。在一个特定的实施方案中，gp350的免疫原性肽包含HLAA2肽(VLQWASLAV(SEQ ID NO:698)或由该HLAA2肽组成。aAPC可以进一步包含如本文所公开的外源共刺激性多肽。在一个特定的实施方案中，外源共刺激性多肽是4-1BBL。
在另一方面，本公开的特征在于经工程化改造以激活T细胞(例如细胞毒性CD8+ T细胞)的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是EBNA1或其自身免疫原性肽。在一个特定的实施方案中，EBNA1的免疫原性肽包含选自FMVFLQTHI(SEQ ID NO:699)、FLQTHIFAEV(SEQ IDNO:700)和SIVCYFMVFL(SEQ ID NO:701)的肽或由该肽组成。aAPC可以进一步包含如本文所公开的外源共刺激性多肽。在一个特定的实施方案中，外源共刺激性多肽是4-1BBL。
在另一方面，本公开的特征在于经工程化改造以扩增调节性T细胞(Treg)的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽来自埃巴病毒(EBV)。aAPC可以进一步包含如本文所公开的外源共刺激性多肽。
在另一方面，本公开的特征在于经工程化改造以抑制自身反应性T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽来自埃巴病毒(EBV)。aAPC可以进一步包含如本文所公开的外源共刺激性多肽。
在另一方面，本公开的特征在于经工程化改造以激活病原体特异性T细胞的aAPC，其包含红系细胞(例如去核红系细胞)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽是来自表21-24中列出的病原体或感染原的抗原性多肽或其自身免疫原性肽。aAPC可以进一步包含如本文所公开的外源共刺激性多肽。
在另一方面，本公开的特征在于经工程化改造以激活乙型肝炎病毒(HBV)特异性T细胞的aAPC，其包含红系细胞(例如去核红系细胞)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物，并且其中外源抗原性多肽来自乙型肝炎病毒(HBV)。aAPC可以进一步包含(例如在细胞表面上)如本文所公开的外源共刺激性多肽。在实施方案中，至少一种共刺激性多肽选自下组：4-1BBL，IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21及其任何组合，例如IL-12和IL-15或4-1BBL和IL-15。在一些实施方案中，aAPC进一步包含另外的外源多肽，其中另外的外源多肽包含(例如在细胞表面上)检查点抑制剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂是针对PD1的抗体分子。在一个特定的实施方案中，aAPC包含红系细胞，其中红系细胞包含(例如在细胞表面上)一种或多种外源多肽，其中一种或多种外源多肽包含：包含HBV特异性抗原的外源抗原性多肽或其免疫原性肽，外源抗原呈递多肽例如MHC I类或MHC I类多肽或单链融合物，外源共刺激性多肽例如IL-12或4-1BBL，以及检查点抑制剂例如针对PD1的抗体。
外源抗原呈递多肽
本公开的外源抗原呈递多肽包括MHC基因家族的多肽，其被分为三个亚组：I类、II类和III类。
MHC I类分子是异二聚体，由两条多肽链，一条α链和一条β2-微球蛋白(b2m)链组成。I类α链由单个多肽组成，该多肽由三个名为α1、α2和α3的细胞外域、一个将其锚定在质膜中的跨膜区域和一个短的胞质内尾巴组成。b2m由与α链非共价结合的单个分子组成。只有α链是多态的，且由HLA基因编码，而b2m亚基不是多态的，且由Beta-2微球蛋白基因编码。I类MHC分子具有β2亚基，因此只能被CD8共受体识别。
在本公开的一些实施方案中，包含在aAPC中的外源抗原呈递多肽是I类MHC分子，并包括信号序列。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是I类MHC分子，并且不包括信号序列。
MHC II类分子也是由α和β多肽链组成的异二聚体。链的亚称，例如为α1、α2以及β1和β2，是指HLA基因和β基因内的不同域(或亚基)。CD4与β2区结合。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是II类MHC分子，并包括信号序列。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是II类MHC分子，并且不包括信号序列。
本公开的外源抗原呈递多肽可以包括细胞表面复合物或细胞表面分子的亚基，例如MHCI或MHCII，其中MHCI或MHCII发挥功能以结合外源抗原性多肽。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHCII的亚基，并且功能是结合外源抗原性多肽。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHCI的亚基，并且功能是结合外源抗原性多肽。在一些实施方案中，MHCI类多肽或MHC II类多肽包含前导(信号)序列。在一些实施方案中，MHC I类多肽或MHC II类多肽不包含前导(信号)序列。在一些实施方案中，前导序列与外源抗原呈递多肽(例如，缺少其前导(信号)序列的MHC I类或MHC II类多肽)融合。在一些实施方案中，MHC I类多肽是包含前导序列的融合多肽。在一些实施方案中，MHC II类多肽是包含前导序列的融合多肽。在一些实施方案中，前导序列选自表2中列出的序列。
表2.前导序列
Figure BDA0002631423640001461
在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是功能性MHC I，并且外源抗原呈递多肽是MHC I(alpha链1-3)和beta-2微球蛋白或其片段或变体。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是功能性MHC II，并且外源抗原呈递多肽是MHC II alpha链(alpha链1和2)和MHC IIbeta链(beta链1和2)或片段或变体。在一些实施方案中，MHC分子包含人MHC I或II类，例如，MHC II alpha亚基和MHC II beta亚基，或包含两个亚基或其抗原呈递片段的融合分子。在一些实施方案中，HLAα链与β链共价结合(例如，与其在融合蛋白中)或非共价结合。
在一些实施方案中，如本文所述的包含具有本文所述的抗原呈递多肽(例如MHC I和MHC II)的红系细胞(例如去核红系细胞)或去核细胞的aAPC用于免疫诱导和/或抗原呈递。在一些实施方案中，aAPC包含单一蛋白质，其是MHC分子和抗原之间的融合物，例如，包含MHC I或MHC II多肽和外源抗原性多肽的单链肽-MHC构建体。在其他实施方案中，复合物的非膜拴系组分，例如肽或β2微球蛋白在转运至表面之前与细胞内的另一种试剂组装在一起，被细胞分泌，然后被多聚体的膜拴系组分在表面上捕获，或以纯化的形式添加到aAPC。
在一些实施方案中，抗原呈递多肽包含MHCIα链和MHC I b2m链两者。在一些实施方案中，抗原呈递多肽仅包含MHC Iα链。在一些实施方案中，抗原呈递多肽仅包含MHC Ib2m链。在一些实施方案中，抗原呈递多肽包含MHCIα链和MHC I b2m链两者，并且MHC Iα链和MHC I b2m链非共价连接。在一些实施方案中，抗原呈递多肽包含MHCIα链和MHC I b2m链两者，并且MHC Iα链和MHC I b2m链共价连接或融合。在一些实施方案中，抗原呈递多肽包含MHC I单链融合物，其中外源抗原性多肽与MHCIα链连接。在一些实施方案中，抗原呈递多肽包含MHC I单链融合物，其中外源抗原性多肽与MHC I b2m链连接。在一些实施方案中，抗原呈递多肽包含MHC I单链融合物，其中外源抗原性多肽与MHCIβ2m亚基连接，所述MHCIβ2m亚基与MHCIα亚基连接。
在一些实施方案中，抗原呈递多肽包含MHC IIα链和MHC IIβ链两者。在一些实施方案中，抗原呈递多肽仅包含MHC IIα链。在一些实施方案中，抗原呈递多肽仅包含MHC IIβ链。在一些实施方案中，抗原呈递多肽包含MHC IIα链和MHC IIβ链两者，并且MHC IIα链和MHC IIβ链非共价连接。在一些实施方案中，抗原呈递多肽包含MHC IIα链和MHC IIβ链两者，并且MHC IIα链和MHC IIβ链共价连接或融合。在一些实施方案中，抗原呈递多肽包含MHC II单链融合物，其中外源抗原性多肽与MHCIIα链连接。在一些实施方案中，抗原呈递多肽包含MHC II单链融合物，其中外源抗原性多肽与MHC IIβ链连接。在一些实施方案中，抗原呈递多肽包含MHC II单链融合物，其中外源抗原性多肽与MHCIIβ-链连接，所述MHCIIβ-链与MHCIIα-链连接。
在一些实施方案中，MHC I单链融合物或MHC II单链融合物包含锚。在一些实施方案中，锚是1型膜蛋白。在一些实施方案中，1型膜蛋白锚选自下组：血型糖蛋白A(GPA)；血型糖蛋白B(GPB)；Basigin(也称为CD147)；CD44；CD58(也称为LFA3)；细胞间粘附分子4(ICAM4)；基底细胞粘附分子(BCAM)；CR1；CD99；成红细胞膜相关蛋白(ERMAP)；连接粘附分子A(JAM-A)；neuroplastin(NPTN)；AMIGO2；和DS细胞粘附分子样1(DSCAML1)。在一些实施方案中，锚是2型膜蛋白。在一些实施方案中，2型膜蛋白锚选自下组：小整合膜蛋白1(SMIM1)，转铁蛋白受体(CD71)；FasL跨膜；和Kell。在一些实施方案中，锚是GPI连接的膜蛋白。在一些实施方案中，GPI连接的膜蛋白锚选自下组：CD59；CD55；和Semaphorin 7A(SEMA7A)。在一些实施方案中，锚是小整合膜蛋白1(SMIM1)。在一些实施方案中，锚是血型糖蛋白锚，并且特别是血型糖蛋白A(GPA)或其片段。在一些实施方案中，锚选自表3中列出的氨基酸序列。
表3.锚序列
Figure BDA0002631423640001481
Figure BDA0002631423640001491
在一些实施方案中，外源抗原性多肽经由接头与MHC I类或MHC II类单链融合物连接。在一些实施方案中，MHC I类或MHC II类单链融合物经由接头与锚序列连接。在一个实施方案中，接头是可切割的接头。在一些实施方案中，接头选自表4中列出的氨基酸序列。
表4.接头序列
Figure BDA0002631423640001492
在一些实施方案中，外源抗原性多肽加载在MHCI分子上，并且一个功能是呈递外源抗原性多肽。在一些实施方案中，外源抗原性多肽加载在MHCII分子上，并且一个功能是呈递外源抗原性多肽。在一些实施方案中，外源抗原性多肽在抗原呈递多肽上呈递，例如，外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽(例如MHC I类和/或II类分子)特异性结合。外源抗原性多肽可以与抗原呈递多肽共价或非共价结合。在一些实施方案中，外源抗原性肽是游离的，并且可以与人工抗原呈递细胞的细胞表面上存在的抗原呈递多肽特异性结合。在一些实施方案中，偶联剂可以用于将外源多肽连接至细胞表面上存在的抗原呈递多肽。在一些实施方案中，如本文所详细描述的点击化学可以用于将外源多肽连接至细胞表面上存在的抗原呈递多肽。
用于评估结合亲和力和/或确定抗原性多肽是否特异性结合特定配体(例如MHC分子)的多种测定法是本领域已知的。例如，在一些实施方案中，表面等离振子共振
Figure BDA0002631423640001493
可以用于确定两个多肽之间复合物的结合常数。在该测定法中，可以通过监测当缓冲液经过芯片时相对于时间的折射率变化来确定复合物的解离常数。用于测量一种多肽与另一多肽的结合的其他合适的测定法包括例如免疫测定法，如酶联免疫吸附测定法(ELISA)和放射免疫测定法(RIA)，或通过使用荧光、UV吸收、圆二色性或核磁共振(NMR)监测蛋白质的光谱或光学性质的变化来测定结合。其他示例性测定包括但不限于Western印迹、分析超速离心法和光谱学(参见例如，Scatchard et al(1949)Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660；Wilson(2002)Science 295:2103；Woffi et al.(1993)Cancer Res.53:2560；美国专利号5,283,173,5,468,614；和国际专利公开号WO 2018/005559)。或者，可以使用预测算法确定抗原性多肽与特定配体(例如MHC分子)的结合。例如，用于预测MHC II类和II类表位的方法是本领域众所周知的，并且包括TEPITOPE(参见例如，Meister et al.(1995)Vaccine13:581-91)、EpiMatrix(De Groot et al.(1997)AIDS Res Hum Retroviruses 13:529-31)、预测方法(Yu et al.(2002)Mol.Med.8:137-48)、SYFPEITHI表位预测算法(Schuleret al.(2007)Methods Mol Biol.409:75-93和Rankpep(Reche et al.(2002)HumImmunol.63(9):701-9)。用于预测MHC I类和II类表位的另外的算法描述于例如Kesslerand Melief(2007)Leukemia 21(9):1859-74中。
在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽选自下组：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1、HLA-DPB1，其能够结合抗原并在细胞表面上展示它们。
在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或MHC I类单链融合物。在进一步的实施方案中，MHC I类多肽是HLA-A。在一些实施方案中，HLA-A多肽包含HLA-A单链融合物多肽，其中HLA-A多肽与外源抗原性多肽连接。在一些实施方案中，HLA-A单链融合物多肽包括膜锚。在一些实施方案中，膜锚选自表3中所示的膜锚。在一些实施方案中，HLA-A单链融合物多肽包括接头(例如，抗原性肽和beta链之间，beta链和alpha链之间，或alpha链和锚之间)。在一些实施方案中，接头选自表4中所示的序列。在一些实施方案中，HLA-A单链融合物多肽包括前导序列。在一些实施方案中，前导序列选自表2中所示的序列。在一些实施方案中，HLA-A前导序列与外源抗原呈递多肽融合，所述外源抗原呈递多肽与膜锚连接。
在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或MHC I类单链融合物。在进一步的实施方案中，MHC I类多肽是HLA-B。在一些实施方案中，HLA-B多肽包含HLA-B单链融合物多肽，其中HLA-B多肽与外源抗原性多肽连接。在一些实施方案中，HLA-B单链融合物多肽包括膜锚。在一些实施方案中，膜锚选自表3中所示的膜锚。在一些实施方案中，HLA-B单链融合物多肽包括接头(例如，抗原性肽和beta链之间，beta链和alpha链之间，或alpha链和锚之间)。在一些实施方案中，接头选自表4中所示的序列。在一些实施方案中，HLA-B单链融合物多肽包括前导序列。在一些实施方案中，前导序列选自表2中所示的序列。在一些实施方案中，HLA-B前导序列与外源抗原呈递多肽融合，所述外源抗原呈递多肽与膜锚连接。
在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或MHC I类单链融合物。在进一步的实施方案中，MHC I类多肽是HLA-C。在一些实施方案中，HLA-C多肽包含HLA-C单链融合物多肽，其中HLA-C多肽与外源抗原性多肽连接。在一些实施方案中，HLA-C单链融合物多肽包括膜锚。在一些实施方案中，膜锚选自表3中所示的序列。在一些实施方案中，HLA-C单链融合物多肽包括接头(例如，抗原性肽和beta链之间，beta链和alpha链之间，或alpha链和锚之间)。在一些实施方案中，接头选自表4中所示的序列。在一些实施方案中，HLA-C单链融合物多肽包括前导序列。在一些实施方案中，前导序列选自表2中所示的序列。在一些实施方案中，HLA-C前导序列与外源抗原呈递多肽融合，所述外源抗原呈递多肽与膜锚连接。
在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC II类多肽或MHC II类单链融合物。在进一步的实施方案中，MHC II类多肽选自下组：HLA-DPα、HLA-DPβ、HLA-DM、HLA DOA、HLA-DOB、HLA-DQα、HLA-DQβ、HLA-DRα和HLA-DRβ。在一些实施方案中，HLA-DPA多肽包含HLA-DPA单链融合物多肽，其中HLA-DPA多肽与外源抗原性多肽连接。在一些实施方案中，HLA-DPB多肽包含HLA-DPB单链融合物多肽，其中HLA-DPB多肽与外源抗原性多肽连接。在一些实施方案中，HLA-DM多肽包含HLA-DM单链融合物多肽，其中HLA-DM多肽与外源抗原性多肽连接。在一些实施方案中，HLA-DOA多肽包含HLA-DOA单链融合物多肽，其中HLA-DOA多肽与外源抗原性多肽连接。在一些实施方案中，HLA-DOB多肽包含HLA-DOB单链融合物多肽，其中HLA-DOB多肽与外源抗原性多肽连接。在一些实施方案中，HLA-DQA多肽包含HLA-DQA单链融合物多肽，其中HLA-DQA多肽与外源抗原性多肽连接。在一些实施方案中，HLA-DQB多肽包含HLA-DQB单链融合物多肽，其中HLA-DQB多肽与外源抗原性多肽连接。在一些实施方案中，HLA-DRA多肽包含HLA-DRA单链融合物多肽，其中HLA-DRA多肽与外源抗原性多肽连接。在一些实施方案中，HLA-DRB多肽包含HLA-DRB单链融合物多肽，其中HLA-DRB多肽与外源抗原性多肽连接。在一些实施方案中，单链融合物多肽包括膜锚。在一些实施方案中，膜锚选自表3中所示的序列。在一些实施方案中，单链融合物多肽包括接头(例如，抗原性肽和beta链之间，beta链和alpha链之间，或alpha链和锚之间)。在一些实施方案中，接头选自表4中所示的序列。在一些实施方案中，单链融合物多肽包括前导序列。在一些实施方案中，前导序列选自表2中所示的序列。
已知MHC I类和II类基因的蛋白质产物是高度多态的，因此本公开也涵盖MHC多态性。一些人类MHC I类和II类基因有超过200个等位基因。除了功能上是单态的DRα基因座外，每个基因座都有许多等位基因(Janeway CA Jr,Travers P,Walport M,etal.Immunobiology:The Immune System in Health and Disease.第5版New York:Garland Science；2001，以其整体通过引用并入本文)，每个等位基因都以相对高的频率在群体中存在。
在一些实施方案中，MHC I类多肽是HLA-A。在一些实施方案中，HLA-A多肽包含选自下组的HLA-A等位基因：A*01:01、A*02:01、A*03:01、A*24:02、A*11:01、A*29:02、A*32:01、A*68:01、A*31:01、A*25:01、A*26:01、A*23:01、A*30:01。
在一些实施方案中，MHC I类多肽是HLA-B。在一些实施方案中，HLA-B多肽包含选自下组的HLA-B等位基因：B*08:01、B*07:02、B*44:02、B*15:01、B*40:01、B*44:03、B*35:01、B*51:01、B*27:05、B*57:01、B*18:01、B*14:02、B*13:02、B*55:01、B*14:01、B*49:01、B*37:01、B*38:01、B*39:01、B*35:03、B*40:02。
在一些实施方案中，MHC I类多肽是HLA-C。在一些实施方案中，HLA-C多肽包含选自下组的HLA-C等位基因：C*07:01、C*07:02、C*05:01、C*06:02、C*04:01、C*03:04、C*03:03、C*02:02、C*16:01、C*08:02、C*12:03、C*01:02、C*15:02、C*07:04、C*14:02。
在一些实施方案中，MHC II类多肽选自下组：HLA-DPα、HLA-DPβ、HLA-DM、HLA DOA、HLA-DOB、HLA-DQα、HLA-DQβ、HLA-DRα和HLA-DRβ。在一些实施方案中，HLA-DPα多肽包含选自下组的HLA-DPα等位基因：DPA1*01:03、DPA1*02:01、DPA1*02:07。在一些实施方案中，HLA-DPβ多肽包含选自下组的HLA-DPβ等位基因：DPB1*04:01、DPB1*02:01、DPB1*04:02、DPB1*03:01、DPB1*01:01、DPB1*11:01、DPB1*05:01、DPB1*10:01、DPB1*06:01、DPB1*13:01、DPB1*14:01和DPB1*17:01。在一些实施方案中，HLA-DQα多肽包含选自下组的HLA-DQα等位基因：DQA1*05:01、DQA1*03:01、DQA1*01:02、DQA1*02:01、DQA1*01:01、DQA1*01:03和DQA1*04:01。在一些实施方案中，HLA-DQβ多肽包含选自下组的HLA-DQβ等位基因：DQB1*03:01、DQB1*02:01、DQB1*06:02、DQB1*05:01、DQB1*02:02、DQB1*03:02、DQB1*06:03、DQB1*03:03、DQB1*06:04、DQB1*05:03和DQB1*04:02。在一些实施方案中，HLA-DRβ多肽包含选自下组的HLA-DRβ等位基因：DRB1*07:01、DRB1*03:01、DRB1*15:01、DRB1*04:01、DRB1*01:01、DRB1*13:01、DRB1*11:01、DRB1*04:04、DRB1*13:02、DRB1*08:01、DRB1*12:01、DRB1*11:04、DRB1*09:01、DRB1*14:01、DRB1*04:07和DRB1*14:04。
在一些实施方案中，抗原呈递多肽包含HLA等位基因多肽，所述HLA等位基因多肽包含表5中所示的氨基酸序列，或由表5中所示的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，MHC等位基因多肽包含信号肽。在其他实施方案中，MHC等位基因多肽不包括信号肽。因此，在一些实施方案中，抗原呈递多肽包含图5中所示的SEQ ID NO 741-838的任一个的氨基酸序列，排除信号肽氨基酸序列(在表5中的序列中以下划线显示)。在其他实施方案中，抗原呈递多肽包含图5中所示的SEQ ID NO 741-838的任一个的氨基酸序列，包括信号肽氨基酸序列(在表5中以下划线显示)。
表5.HLA等位基因
Figure BDA0002631423640001531
Figure BDA0002631423640001541
Figure BDA0002631423640001551
Figure BDA0002631423640001561
Figure BDA0002631423640001571
Figure BDA0002631423640001581
Figure BDA0002631423640001591
Figure BDA0002631423640001601
Figure BDA0002631423640001611
Figure BDA0002631423640001621
Figure BDA0002631423640001631
Figure BDA0002631423640001641
Figure BDA0002631423640001651
Figure BDA0002631423640001661
Figure BDA0002631423640001671
Figure BDA0002631423640001681
Figure BDA0002631423640001691
Figure BDA0002631423640001701
Figure BDA0002631423640001711
Figure BDA0002631423640001721
另外的MHC等位基因氨基酸序列是本领域已知的并且是可获得的，例如在IMGT/HLA数据库中(可从ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/在万维网上获得；参见Robinson etal.Nucl.Acids Res.43:D423-431(2015))。
在某些实施方案中，多肽是如本文所述的外源抗原呈递多肽。示例性外源抗原呈递多肽包括：
a)人多肽的天然存在形式；
b)具有出现在2017年12月22日的数据库(例如GenBank数据库)中的序列的人多肽；
c)人多肽，其具有与a)或b)的序列相差不超过1、2、3、4、5或10个氨基酸残基的序列；
d)人多肽，其具有与a)或b)的序列相差不超过1、2、3、4、5或10％的其氨基酸残基的序列；
e)人多肽，其具有与a)或b)的序列基本没有不同的序列；或
f)具有c)、d)或e)的序列的人多肽，其与具有a)或b)的序列的人多肽在生物学活性，例如酶活性(例如特异性或周转)或结合活性(例如抗原性肽的结合特异性或亲和力)上基本上没有差异。f)下的候选肽可以如本文所述制备并针对类似活性进行筛选，并且如果在如本文所述的工程化红系细胞中表达则在下文是等同的。
在实施方案中，外源抗原呈递多肽包含人多肽或其片段，例如前述段落的a)、b)、c)、d)、e)或f)的人多肽的全部或片段。在一个实施方案中，外源抗原呈递多肽包含融合多肽，其包含前述段落的a)、b)、c)、d)、e)或f)的人多肽的全部或片段以及另外的氨基酸序列。在一个实施方案中，另外的氨基酸序列包含不同人外源抗原呈递多肽的前述段落的a)、b)、c)、d)、e)或f)的人多肽的全部或片段。
在本公开的一些实施方案中，人工抗原呈递细胞包含不包含内源抗原呈递多肽(例如，MHC I类或MHC II类分子)的红系细胞或去核细胞。在一些实施方案中，人工抗原呈递细胞包括从尚未遗传修饰以缺失和/或改变内源抗原呈递多肽(例如，MHC I类或MHC II类分子)表达的红系前体细胞衍生的红系细胞或去核细胞。
外源共刺激性多肽
外源共刺激性多肽包括在抗原呈递细胞(例如，aAPC)上的多肽，其特异性结合T细胞上的关联共刺激性分子(例如，MHC分子、B和T淋巴细胞衰减剂(CD272)和Toll配体受体)，从而提供介导T细胞应答的信号，包括但不限于增殖、激活、分化等。共刺激性多肽尤其还涵盖与存在于T细胞上的共刺激性分子特异性结合的抗体。此类抗体优选结合T细胞上的共刺激性分子并充当T细胞上的共刺激性分子的激动剂。
在一些实施方案中，期望的应答是例如被感染细胞的细胞死亡。在一些实施方案中，共刺激性多肽触发多个T细胞活化途径以诱导免疫应答。在一些实施方案中，尤其包含共刺激性多肽的aAPC促进T细胞增殖。在实施方案中，一种或多种(例如2、3、4或5种或更多种)共刺激性多肽包含下表6的激活多肽或其T细胞激活变体(例如片段)。在实施方案中，一种或多种(例如2、3、4或5种或更多种)共刺激性多肽包含结合表6的靶受体的抗体分子(例如激动抗体)或其T细胞激活变体(例如片段)。在一些实施方案中，共刺激性多肽包含不同的T细胞激活配体，例如，表6的一种或多种激活多肽，以其任何组合，以刺激T细胞。在一些实施方案中，aAPC包含呈递，例如在细胞表面上包含，4-1BBL、OX40L和CD40L或其片段或变体的红系细胞(例如去核细胞)。在实施方案中，这些蛋白质通过互补激活途径进行信号传导。共刺激性多肽可以衍生自内源T细胞激活配体或衍生自针对靶受体的抗体分子。
表6.共刺激性多肽
激活多肽(配体) T细胞上的靶受体
B7-H2(例如，登录号NP_056074.1) ICOS，CD28(例如，登录号NP_006130.1)
B7-1(例如，登录号NP_005182.1) CD28(例如，登录号NP_006130.1)
B7-2(例如，登录号AAA86473) CD28(例如，登录号NP_006130.1)
CD70(例如，登录号NP_001243.1) CD27(例如，登录号NP_001233.1)
LIGHT(例如，登录号NP_003798.2) HVEM(例如，登录号AAQ89238.1)
HVEM(例如，登录号AAQ89238.1) LIGHT(例如，登录号NP_003798.2)
CD40L(例如，登录号BAA06599.1) CD40(例如，登录号NP_001241.1)
4-1BBL(例如，登录号NP_003802.1) 4-1BB(例如，登录号NP_001552.2)
OX40L(例如，登录号NP_003317.1) OX40(例如，登录号NP_003318.1)
TL1A(例如，登录号NP_005109.2) DR3(例如，登录号NP_683866.1)
GITRL(例如，登录号NP_005083.2) GITR(例如，登录号NP_004186.1)
CD30L(例如，登录号NP_001235.1), CD30(例如，登录号NP_001234.3)
TIM4(例如，登录号NP_612388.2) TIM1(例如，登录号NP_036338.2)
SLAM(例如，登录号AAK77968.1) SLAM(例如，登录号AAK77968.1)
CD48(例如，登录号CAG33293.1) CD2(例如，登录号NP_001315538.1)
CD58(例如，登录号CAG33220.1) CD2(例如，登录号NP_001315538.1)
CD155(例如，登录号NP_001129240.1) CD226(例如，登录号NP_006557.2)
CD112(例如，登录号NP_001036189.1) CD226(例如，登录号NP_006557.2)
CD137L(例如，登录号NP_003802.1) CD137(例如，登录号NP_001552.2)
在一些实施方案中，包含4-1BBL的多肽是N端截短的4-1BBL(例如SEQ ID NO:851)。在一些实施方案中，包含4-1BBL的多肽是全长4-1BBL。
在一些实施方案中，一种或多种共刺激性多肽包含激活细胞因子、干扰素或TNF家族成员，例如IFNα、IL2、IL6或其任何组合。可用于本发明的激活细胞因子、干扰素和TNF家族成员在下面进一步讨论。在实施方案中，一种或多种共刺激性多肽包含一种或多种激活细胞因子、干扰素或TNF家族成员，并且进一步包含一种或多种激活多肽或配体(例如表6的)或其T细胞激活变体(例如片段)，或结合靶共刺激性T细胞受体(例如表6的)的一种或多种抗体分子(例如激动抗体)或其T细胞激活变体(例如片段)。
T细胞扩增
在某些实施方案中，本公开的特征在于可以用于特异性诱导表达已知共刺激性分子的T细胞的增殖的aAPC。方法包括使待扩增的T细胞与呈递(例如，在细胞表面上包含)与该T细胞表达的共刺激性分子特异性结合的外源多肽的aAPC接触。因此，使T细胞与aAPC接触刺激T细胞并诱导T细胞增殖，使得大量特定T细胞可以容易地产生，所述aAPC尤其包含特异性结合T细胞表面上表达的关联共刺激性分子的共刺激性配体。aAPC“特异性”扩增T细胞，因为仅表达特定共刺激性分子的T细胞被aAPC扩增。因此，若待扩增的T细胞存在于细胞混合物中，其中一些或大多数不表达共刺激性分子，则将仅诱导感兴趣的T细胞增殖并扩增细胞数目。可以使用极其多种细胞分离和纯化技术，如本领域已知的和/或本文其他地方描述的技术，进一步纯化T细胞。
如本领域技术人员将理解的，基于本文提供的公开，在使用aAPC扩增之前不需要鉴定或分离感兴趣的T细胞。这是因为aAPC具有选择性，且将只扩增表达关联共刺激性分子的T细胞。
在某些实施方案中，多肽是如本文所述的外源共刺激性多肽。示例性共刺激性多肽包括：
a)人多肽的天然存在形式；
b)具有出现在2017年12月22日的数据库(例如GenBank数据库)中的序列的人多肽；
c)人多肽，其具有与a)或b)的序列相差不超过1、2、3、4、5或10个氨基酸残基的序列；
d)人多肽，其具有与a)或b)的序列相差不超过1、2、3、4、5或10％的其氨基酸残基的序列；
e)人多肽，其具有与a)或b)的序列基本没有不同的序列；或
f)具有c)、d)或e)的序列的人多肽，其与具有a)或b)的序列的人多肽在生物学活性，例如酶活性(例如特异性或周转)或结合活性(例如结合特异性或亲和力)上基本上没有差异。f)下的候选肽可以如本文所述制备并针对类似活性进行筛选，并且如果在如本文所述的工程化红系细胞中表达则在下文是等同的。
在实施方案中，外源共刺激性多肽包含人多肽或其片段，例如前述段落的a)、b)、c)、d)、e)或f)的人多肽的全部或片段。在一个实施方案中，外源共刺激性多肽包含融合多肽，其包含前述段落的a)、b)、c)、d)、e)或f)的人多肽的全部或片段以及另外的氨基酸序列。在一个实施方案中，另外的氨基酸序列包含不同人共刺激性多肽的前述段落的a)、b)、c)、d)、e)或f)的人多肽的全部或片段。
在实施方案中，aAPC细胞例如使用在aAPC上共表达(或共呈递)的配体或抗体分子或两者组合地靶向多个T细胞激活途径(例如，如以上表6中所述)。
在一些实施方案中，至少一种外源共刺激性多肽选自下组：4-1BBL、LIGHT、CD80、CD86、CD70、IL-7、IL-12、OX40L、GITRL、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD83、CD155、CD112、与IL-15融合的IL-15Rα、IL-2、IL-21、ICAM-1的配体、LFA-1的配体及其组合。在一些实施方案中，至少一种外源共刺激性多肽是针对关联共刺激性配体受体的激动剂抗体。例如，在某些实施方案中，共刺激性多肽是针对以下的激动剂抗体：4-1-BB、LIGHT受体(HVEM)、CD80受体、CD86受体、OX40、GITR、TIM4受体(TIM1)、SLAM受体、CD48受体(CD2)、CD58受体(CD2)、CD 83受体、CD155受体(CD226)、CD112受体(CD226)、IL-2受体(CD25、CD122、CD132)、IL-21受体、ICAM及其组合。在某些实施方案中，至少一种外源共刺激性多肽是抗CD3抗体或抗CD38抗体及其组合。在另一个实施方案中，aAPC呈递，例如在细胞表面上包含，至少2种、至少3种、至少4种或至少5种外源共刺激性多肽。在一些实施方案中，共刺激性蛋白质彼此融合，例如与IL-2融合的IL-21。
在一些实施方案中，一种或多种共刺激性多肽包括膜锚或者与膜锚融合。在一些实施方案中，膜锚选自表3中所示的序列。在一些实施方案中，一种或多种共刺激性多肽包括前导序列或者与前导序列融合。在一些实施方案中，前导序列选自表2中所示的序列。
外源共抑制性多肽
外源共抑制性多肽是抑制T细胞的任何多肽，包括T细胞活性的抑制、T细胞增殖的抑制、T细胞的无应答化或T细胞凋亡的诱导。
在一些实施方案中，外源共抑制性多肽是抗原呈递细胞上的抑制性多肽配体，其特异性结合T细胞上的关联共抑制性分子。在一些实施方案中，共抑制性多肽配体是表7中所示的抑制性多肽。
在一些实施方案中，外源共抑制性多肽是特异性结合T细胞上共抑制性受体的激动剂(例如抗体)。在一些实施方案中，激动剂是与选自下组的受体结合的抗体：PD1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160和2B4。在其他实施方案中，激动剂是结合表7中所示的T细胞上的靶受体的抗体。
表7.共抑制性多肽
抑制性多肽 T细胞上的靶受体
B7-1 CTLA4、B7H1
B7-2 CTLA4
B7DC PD1
B7H1 PD1、B7-1
HVEM CD160、BTLA
COLLAGEN LAIR1
GALECTIN9 TIM3
CD48、TIM4 TIM4R
CD48 2B4
CD155、CD112、CD113 TIGIT
PDL1 PD1
LAG3
在一些实施方案中，外源共抑制性多肽是阻断共刺激性多肽与其关联共刺激性受体结合的抗体。在各种实施方案中，外源共抑制性多肽是阻断4-1BBL、LIGHT、CD80、CD86、CD70、OX40L、GITRL、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD83、CD155、CD112、与IL-15融合的IL-15Rα、IL-2、IL-21、ICAM、LFA-1的配体、抗CD3抗体或抗CD28抗体与其受体结合的抗体。
在其他实施方案中，共抑制性多肽选自IL-35、IL-10或VSIG-3。
在一些实施方案中，外源共抑制性多肽是VSIG-3。
在其他实施方案中，aAPC细胞例如使用在aAPC上共表达的配体或抗体分子或两者组合地靶向多种T细胞抑制途径(例如，如以上表7中所述)。
在某些实施方案中，多肽是如本文所述的外源共抑制性多肽。示例性共抑制性多肽包括：
a)人多肽的天然存在形式；
b)具有出现在2017年12月22日的数据库(例如GenBank数据库)中的序列的人多肽；
c)人多肽，其具有与a)或b)的序列相差不超过1、2、3、4、5或10个氨基酸残基的序列；
d)人多肽，其具有与a)或b)的序列相差不超过1、2、3、4、5或10％的其氨基酸残基的序列；
e)人多肽，其具有与a)或b)的序列基本没有不同的序列；或
f)具有c)、d)或e)的序列的人多肽，其与具有a)或b)的序列的人多肽在生物学活性，例如酶活性(例如特异性或周转)或结合活性(例如结合特异性或亲和力)上基本上没有差异。f)下的候选肽可以如本文所述制备并针对类似活性进行筛选，并且如果在本文所述的工程化红系细胞中表达则在下文是等同的。
在实施方案中，外源共抑制性多肽包含人多肽或其片段，例如前述段落的a)、b)、c)、d)、e)或f)的人多肽的全部或片段。在一个实施方案中，外源共抑制性多肽包含融合多肽，其包含前述段落的a)、b)、c)、d)、e)或f)的人多肽的全部或片段以及另外的氨基酸序列。在一个实施方案中，另外的氨基酸序列包含不同人共抑制性多肽的前述段落的a)、b)、c)、d)、e)或f)的人多肽的全部或片段。
在一些实施方案中，aAPC呈递，例如在细胞表面上包含，至少2种、至少3种、至少4种或至少5种外源共抑制性多肽。
在一些实施方案中，一种或多种共抑制性多肽包括膜锚或者与膜锚融合。在一些实施方案中，膜锚选自表3中所示的序列。在一些实施方案中，一种或多种共抑制性多肽包括前导序列或者与前导序列融合。在一些实施方案中，前导序列选自表2中所示的序列。
T细胞激活信号
为了有效诱导T细胞增殖、激活和扩增，需要将几种信号从aAPC传输到幼稚T细胞。这些信号通常称为信号1、信号2和信号3，并在下面进行描述。在一些实施方案中，本文所述的aAPC以如下所述的任意组合包含一种或多种包含信号1的外源多肽，一种或多种包含信号2的外源多肽和/或一种或多种包含信号3的外源多肽。在一些实施方案中，除信号1、信号2和信号3外，本文所述的aAPC进一步包含一种或多种外源多肽，其包含一种或多种细胞粘附分子以进一步促进T细胞与aAPC之间的相互作用。应当理解，当aAPC包含一种或多种包含信号1的外源多肽和/或一种或多种包含信号2的外源多肽和/或一种或多种包含信号3的外源多肽(和任选地一种或多种包含细胞粘附分子的多肽)时，包含信号1和/或信号2和/或信号3和/或细胞粘附分子的外源多肽都包含在同一aAPC上。
与使用球形纳米颗粒(如刚性的、基于珠的aAPC)相比，本文所述的aAPC提供了许多优势。例如，如本文所述的aAPC(即工程化红系细胞或去核细胞)的膜比刚性且不可移动(因此限制了在其表面上多肽的运动)的纳米颗粒的外表面具有大得多的动态性和流动性。aAPC膜的流动性允许更大的分子移动性和更有效的分子重组，并且对于免疫学突触形成和T细胞刺激是有利的。在一些实施方案中，在细胞表面上以如下所述的任意组合包含一种或多种包含信号1的外源多肽、一种或多种包含信号2的外源多肽，和/或一种或多种包含信号3的外源多肽的本文所述的aAPC提供了对T细胞的更受控的刺激，从而允许具有特定表型和活性的T细胞繁殖。在一些实施方案中，通过对aAPC进行工程化改造以在细胞表面上包含信号1和/或信号2和/或信号3，aAPC对提供给T细胞的信号提供最佳控制。
信号1-抗原识别
在T细胞受体(TCR)识别在如本文所述的aAPC的MHC复合物上呈递的特定肽抗原之后，发生T细胞活化。通常，与CD4 T细胞共受体一起，TCR识别在MHC I类上呈递的外源抗原性多肽。与CD8 T细胞共受体一起，TCR识别在MHC I类上呈递的外源抗原性多肽。通过肽-MHC复合物对TCR的连接导致T细胞活化所必需的信号转导。
在一些实施方案中，信号1包含一种或多种包含抗原呈递多肽的外源多肽。在一些实施方案中，信号1包含与抗原性肽特异性(例如共价或非共价)结合(呈递抗原性肽)的抗原呈递多肽。在一些实施方案中，抗原呈递多肽是MHC I类多肽、MHC I类单链融合物、MHCII类多肽或MHC II类单链融合物。在一些实施方案中，MHC I类多肽选自下组：HLA A、HLA B和HLA C。在一些实施方案中，MHC II类多肽选自下组：HLA-DPα、HLA-DPβ、HLA-DM、HLA DOA、HLA DOB、HLA DQα、HLA DQβ、HLADRα和HLADRβ。
信号2-共刺激
为了变得完全活化，T细胞除了TCR介导的抗原识别外还需要第二信号。该第二信号(或共刺激)对正确的T细胞活化是重要的。在一些实施方案中，信号2包含一种或多种外源共刺激性多肽。在一些实施方案中，一种或多种外源共刺激性多肽选自下组：4-1BBL、LIGHT、抗CD28、CD80、CD86、CD70、OX40L、GITRL、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD83、CD155、CD112、IL-15、与IL-15融合的IL-15Rα、IL-21、ICAM-1、LFA-1的配体、抗CD3抗体及其任何组合。在一些实施方案中，信号2包含选自下组的一种或多种外源共刺激性多肽：4-1BBL、CD80、CD86、CD83、CD70、LIGHT、HVEM、CD40L、OX40L、TL1A、GITRL和CD30L。
信号3-细胞因子
为了诱导T细胞更有效的扩增和特异性分化，可以使用第三信号(信号3)。在一些实施方案中，信号3包含一种或多种包含一种或多种细胞因子的外源多肽。在一些实施方案中，信号3包含选自下组的一种或多种外源多肽：IL2、IL15、IL7、IL12、IL18、IL21、IL4；IL6、IL23、IL27、IL17、IL10、TGF-beta、IFN-gamma、IL-1beta、GM-CSF、IL-15、与IL-15融合的IL-15Rα和IL-25。
除了免疫刺激性细胞因子外，免疫抑制性细胞因子也能够减弱免疫应答或可以导致耐受。因此，在一些实施方案中，信号3包含一种或多种外源共抑制性多肽。在一些实施方案中，一种或多种外源共抑制性多肽选自下组：IL-35、IL-10、VSIG-3和LAG3激动剂。
在一些实施方案中，aAPC在细胞表面处包括包含信号1的外源多肽。
在一些实施方案中，aAPC在细胞表面处包括包含信号1的外源多肽和包含信号2的外源多肽。在一些实施方案中，aAPC在细胞表面处包括包含信号1的外源多肽、包含信号2的外源多肽和包含信号3的外源多肽。在一些实施方案中，aAPC在细胞表面处包括包含超过一种信号1的超过一种外源多肽和包含信号2的外源多肽。在一些实施方案中，aAPC在细胞表面处包括包含超过一种信号1的超过一种外源多肽、包含信号2的外源多肽和包含信号3的外源多肽。在一些实施方案中，aAPC在细胞表面处包括包含信号1的外源多肽和含有超过一种信号2的超过一种外源多肽。在一些实施方案中，aAPC在细胞表面处包括包含信号1的外源多肽、含有超过一种信号2的超过一种外源多肽和包含信号3的外源多肽。在一些实施方案中，aAPC在细胞表面处包括包含信号1的外源多肽、包含信号2的外源多肽和含有超过一种信号3的超过一种外源多肽。在一些实施方案中，aAPC在细胞表面处包括包含超过一种信号1的超过一种外源多肽、包含信号2的外源多肽和含有超过一种信号3的超过一种外源多肽。在一些实施方案中，aAPC在细胞表面处包括包含超过一种信号1的超过一种外源多肽、含有超过一种信号2的超过一种外源多肽和包含信号3的外源多肽。在一些实施方案中，aAPC在细胞表面处包括包含超过一种信号1的超过一种外源多肽、含有超过一种信号2的超过一种外源多肽和含有超过一种信号3的超过一种外源多肽。
在一些实施方案中，aAPC包括包含信号1的外源多肽和包含信号2的外源多肽，其中信号1和信号2选自以下组合：MHC I类和4-1BBL；MHC II类和4-1BBL；MHC I类和CD80；MHCII类和CD80；MHC I类和CD86；MHC II类和CD86；MHC I类和CD83；MHC II类和CD83；MHC I类和CD70；MHC II类和CD70；MHC I类和LIGHT；MHC II类和LIGHT；MHC I类和HVEM；MHC II类和HVEM；MHC I类和CD40L；MHC II类和CD40L；MHC I类和OX40L；MHC II类和OX40L；MHC I类和TL1A；MHC II类和TL1A；MHC I类和GITRL；MHC II类和GITRL；MHC I类和CD30L；或MHC II类和CD30L。
在一些实施方案中，aAPC包括包含信号1的外源多肽、包含信号2的外源多肽和包含信号3的外源多肽，其中信号1、信号2和信号3选自以下组合：
MHC I类、4-1BBL和IL2；MHC II类、4-1BBL和IL2；MHC I类、CD80和IL2；MHC II类、CD80和IL2；MHC I类、CD86和IL2；MHC II类、CD86和IL2；MHC I类、CD83和IL2；MHC II类、CD83和IL2；MHC I类、CD70和IL2；MHC II类、CD70和IL2；MHC I类、LIGHT和IL2；MHC II类、LIGHT和IL2；MHC I类、HVEM和IL2；MHC II类、HVEM和IL2；MHC I类、CD40L和IL2；MHC II类、CD40L和IL2；MHC I类、OX40L和IL2；MHC II类、OX40L和IL2；MHC I类、TL1A和IL2；MHC II类、TL1A和IL2；MHC I类、GITRL和IL2；MHC II类、GITRL和IL2；MHC I类、CD30L和IL2；MHC II类、CD30L和IL2；MHC I类、4-1BBL和IL15；MHC II类、4-1BBL和IL15；MHC I类、CD80和IL15；MHCII类、CD80和IL15；MHC I类、CD86和IL15；MHC II类、CD86和IL15；MHC I类、CD83和IL15；MHCII类、CD83和IL15；MHC I类、CD70和IL15；MHC II类、CD70和IL15；MHC I类、LIGHT和IL15；MHC II类、LIGHT和IL15；MHC I类、HVEM和IL15；HC II类、HVEM和IL15；MHC I类、CD40L和IL15；MHC II类、CD40L和IL15；MHC I类、OX40L和IL15；MHC II类、OX40L和IL15；MHC I类、TL1A和IL15；MHC II类、TL1A和IL15；MHC I类、GITRL和IL15；MHC II类、GITRL和IL15；MHC I类、CD30L和IL15；MHC II类、CD30L和IL15；MHC I类、4-1BBL和IL7；MHC II类、4-1BBL和IL7；MHC I类、CD80和IL7；MHC II类、CD80和IL7；MHC I类、CD86和IL7；MHC II类、CD86和IL7；MHCI类、CD83和IL7；MHC II类、CD83和IL7；MHC I类、CD70和IL7；MHC II类、CD70和IL7；MHC I类、LIGHT和IL7；MHC II类、LIGHT和IL7；MHC I类、HVEM和IL7；MHC II类、HVEM和IL7；MHC I类、CD40L和IL7；MHC II类、CD40L和IL7；MHC I类、OX40L和IL7；MHC II类、OX40L和IL7；MHCI类、TL1A和IL7；MHC II类、TL1A和IL7；MHC I类、GITRL和IL7；MHC II类、GITRL和IL7；MHC I类、CD30L和IL7；MHC II类、CD30L和IL7；MHC I类、4-1BBL和IL12；MHC II类、4-1BBL和IL12；MHC I类、CD80和IL12；MHC II类、CD80和IL12；MHC I类、CD86和IL12；MHC II类、CD86和IL12；MHC I类、CD83和IL12；MHC II类、CD83和IL12；MHC I类、CD70和IL12；MHC II类、CD70和IL12；MHC I类、LIGHT和IL12；MHC II类、LIGHT和IL12；MHC I类、HVEM和IL12；MHC II类、HVEM和IL12；MHC I类、CD40L和IL12；MHC II类、CD40L和IL12；MHC I类、OX40L和IL12；MHCII类、OX40L和IL12；MHC I类、TL1A和IL12；MHC II类、TL1A和IL12；MHC I类、GITRL和IL12；MHC II类、GITRL和IL12；MHC I类、CD30L和IL12；MHC II类、CD30L和IL12；MHC I类、4-1BBL和IL18；MHC II类、4-1BBL和IL18；MHC I类、CD80和IL18；MHC II类、CD80和IL18；MHC I类、CD86和IL18；MHC II类、CD86和IL18；MHC I类、CD83和IL18；MHC II类、CD83和IL18；MHC I类、CD70和IL18；MHC II类、CD70和IL18；MHC I类、LIGHT和IL18；MHC II类、LIGHT和IL18；MHC I类、HVEM和IL18；MHC II类、HVEM和IL18；MHC I类、CD40L和IL18；MHC II类、CD40L和IL18；MHC I类、OX40L和IL18；MHC II类、OX40L和IL18；MHC I类、TL1A和IL18；MHC II类、TL1A和IL18；MHC I类、GITRL和IL18；MHC II类、GITRL和IL18；MHC I类、CD30L和IL18；MHCII类、CD30L和IL18；MHC I类、4-1BBL和IL21；MHC II类、4-1BBL和IL21；MHC I类、CD80和IL21；MHC II类、CD80和IL21；MHC I类、CD86和IL21；MHC II类、CD86和IL21；MHC I类、CD83和IL21；MHC II类、CD83和IL21；MHC I类、CD70和IL21；MHC II类、CD70和IL21；MHC I类、LIGHT和IL21；MHC II类、LIGHT和IL21；MHC I类、HVEM和IL21；MHC II类、HVEM和IL21；MHC I类、CD40L和IL21；MHC II类、CD40L和IL21；MHC I类、OX40L和IL21；MHC II类、OX40L和IL21；MHC I类、TL1A和IL21；MHC II类、TL1A和IL21；MHC I类、GITRL和IL21；MHC II类、GITRL和IL21；MHC I类、CD30L和IL21；MHC II类、CD30L和IL21；MHC I类、4-1BBL和IL4；MHC II类、4-1BBL和IL4；MHC I类、CD80和IL4；MHC II类、CD80和IL4；MHC I类、CD86和IL4；MHC II类、CD86和IL4；MHC I类、CD83和IL4；MHC II类、CD83和IL4；MHC I类、CD70和IL4；MHC II类、CD70和IL4；MHC I类、LIGHT和IL4；MHC II类、LIGHT和IL4；MHC I类、HVEM和IL4；MHC II类、HVEM和IL4；MHC I类、CD40L和IL4；MHC II类、CD40L和IL4；MHC I类、OX40L和IL4；MHC II类、OX40L和IL4；MHC I类、TL1A和IL4；MHC II类、TL1A和IL4；MHC I类、GITRL和IL4；MHC II类、GITRL和IL4；MHC I类、CD30L和IL4；MHC II类、CD30L和IL4；MHC I类、4-1BBL和IL6；MHC II类、4-1BBL和IL6；MHC I类、CD80和IL6；MHC II类、CD80和IL6；MHC I类、CD86和IL6；MHC II类、CD86和IL6；MHC I类、CD83和IL6；MHC II类、CD83和IL6；MHC I类、CD70和IL6；MHC II类、CD70和IL6；MHC I类、LIGHT和IL6；MHC II类、LIGHT和IL6；MHC I类、HVEM和IL6；MHC II类、HVEM和IL6；MHC I类、CD40L和IL6；MHC II类、CD40L和IL6；MHC I类、OX40L和IL6；MHC II类、OX40L和IL6；MHC I类、TL1A和IL6；MHC II类、TL1A和IL6；MHC I类、GITRL和IL6；MHC II类、GITRL和IL6；MHC I类、CD30L和IL6；MHC II类、CD30L和IL6；MHC I类、4-1BBL和IL23；MHC II类、4-1BBL和IL23；MHC I类、CD80和IL23；MHC II类、CD80和IL23；MHC I类、CD86和IL23；MHCII类、CD86和IL23；MHC I类、CD83和IL23；MHC II类、CD83和IL23；MHC I类、CD70和IL23；MHCII类、CD70和IL23；MHC I类、LIGHT和IL23；MHC II类、LIGHT和IL23；MHC I类、HVEM和IL23；MHC II类、HVEM和IL23；MHC I类、CD40L和IL23；MHC II类、CD40L和IL23；MHC I类、OX40L和IL23；MHC II类、OX40L和IL23；MHC I类、TL1A和IL23；MHC II类、TL1A和IL23；MHC I类、GITRL和IL23；MHC II类、GITRL和IL23；MHC I类、CD30L和IL23；MHC II类、CD30L和IL23；MHCI类、4-1BBL和IL27；MHC II类、4-1BBL和IL27；MHC I类、CD80和IL27；MHC II类、CD80和IL27；MHC I类、CD86和IL27；MHC II类、CD86和IL27；MHC I类、CD83和IL27；MHC II类、CD83和IL27；MHC I类、CD70和IL27；MHC II类、CD70和IL27；MHC I类、LIGHT和IL27；MHC II类、LIGHT和IL27；MHC I类、HVEM和IL27；MHC II类、HVEM和IL27；MHC I类、CD40L和IL27；MHC II类、CD40L和IL27；MHC I类、OX40L和IL27；MHC II类、OX40L和IL27；MHC I类、TL1A和IL27；MHC II类、TL1A和IL27；MHC I类、GITRL和IL27；MHC II类、GITRL和IL27；MHC I类、CD30L和IL27；MHC II类、CD30L和IL27；MHC I类、4-1BBL和IL17；MHC II类、4-1BBL和IL17；MHC I类、CD80和IL17；MHC II类、CD80和IL17；MHC I类、CD86和IL17；MHC II类、CD86和IL17；MHC I类、CD83和IL17；MHC II类、CD83和IL17；MHC I类、CD70和IL17；MHC II类、CD70和IL17；MHCI类、LIGHT和IL17；MHC II类、LIGHT和IL17；MHC I类、HVEM和IL17；MHC II类、HVEM和IL17；MHC I类、CD40L和IL17；MHC II类、CD40L和IL17；MHC I类、OX40L和IL17；MHC II类、OX40L和IL17；MHC I类、TL1A和IL17；MHC II类、TL1A和IL17；MHC I类、GITRL和IL17；MHC II类、GITRL和IL17；MHC I类、CD30L和IL17；MHC II类、CD30L和IL17；MHC I类、4-1BBL和IL10；MHCII类、4-1BBL和IL10；MHC I类、CD80和IL10；MHC II类、CD80和IL10；MHC I类、CD86和IL10；MHC II类、CD86和IL10；MHC I类、CD83和IL10；MHC II类、CD83和IL10；MHC I类、CD70和IL10；MHC II类、CD70和IL10；MHC I类、LIGHT和IL10；MHC II类、LIGHT和IL10；MHC I类、HVEM和IL10；MHC II类、HVEM和IL10；MHC I类、CD40L和IL10；MHC II类、CD40L和IL10；MHC I类、OX40L和IL10；MHC II类、OX40L和IL10；MHC I类、TL1A和IL10；MHC II类、TL1A和IL10；MHC I类、GITRL和IL10；MHC II类、GITRL和IL10；MHC I类、CD30L和IL10；MHC II类、CD30L和IL10；MHC I类、4-1BBL和TGF-beta；MHC II类、4-1BBL和TGF-beta；MHC I类、CD80和TGF-beta；MHC II类、CD80和TGF-beta；MHC I类、CD86和TGF-beta；MHC II类、CD86和TGF-beta；MHC I类、CD83和TGF-beta；MHC II类、CD83和TGF-beta；MHC I类、CD70和TGF-beta；MHC II类、CD70和TGF-beta；MHC I类、LIGHT和TGF-beta；MHC II类、LIGHT和TGF-beta；MHC I类、HVEM和TGF-beta；MHC II类、HVEM和TGF-beta；MHC I类、CD40L和TGF-beta；MHC II类、CD40L和TGF-beta；MHC I类、OX40L和TGF-beta；MHC II类、OX40L和TGF-beta；MHC I类、TL1A和TGF-beta；MHC II类、TL1A和TGF-beta；MHC I类、GITRL和TGF-beta；MHC II类、GITRL和TGF-beta；MHC I类、CD30L和TGF-beta；MHC II类、CD30L和TGF-beta；MHC I类、4-1BBL和IFN-gamma；MHC II类、4-1BBL和IFN-gamma；MHC I类、CD80和IFN-gamma；MHC II类、CD80和IFN-gamma；MHC I类、CD86和IFN-gamma；MHC II类、CD86和IFN-gamma；MHC I类、CD83和IFN-gamma；MHC II类、CD83和IFN-gamma；MHC I类、CD70和IFN-gamma；MHC II类、CD70和IFN-gamma；MHC I类、LIGHT和IFN-gamma；MHC II类、LIGHT和IFN-gamma；MHC I类、HVEM和IFN-gamma；MHC II类、HVEM和IFN-gamma；MHC I类、CD40L和IFN-gamma；MHC II类、CD40L和IFN-gamma；MHC I类、OX40L和IFN-gamma；MHC II类、OX40L和IFN-gamma；MHC I类、TL1A和IFN-gamma；MHC II类、TL1A和IFN-gamma；MHC I类、GITRL和IFN-gamma；MHC II类、GITRL和IFN-gamma；MHC I类、CD30L和IFN-gamma；MHC II类、CD30L和IFN-gamma；MHC I类、4-1BBL和IL-1beta；MHC II类、4-1BBL和IL-1beta；MHC I类、CD80和IL-1beta；MHC II类、CD80和IL-1beta；MHC I类、CD86和IL-1beta；MHC II类、CD86和IL-1beta；MHC I类、CD83和IL-1beta；MHC II类、CD83和IL-1beta；MHC I类、CD70和IL-1beta；MHC II类、CD70和IL-1beta；MHC I类、LIGHT和IL-1beta；MHC II类、LIGHT和IL-1beta；MHC I类、HVEM和IL-1beta；MHC II类、HVEM和IL-1beta；MHC I类、CD40L和IL-1beta；MHC II类、CD40L和IL-1beta；MHC I类、OX40L和IL-1beta；MHC II类、OX40L和IL-1beta；MHC I类、TL1A和IL-1beta；MHC II类、TL1A和IL-1beta；MHC I类、GITRL和IL-1beta；MHC II类、GITRL和IL-1beta；MHC I类、CD30L和IL-1beta；MHC II类、CD30L和IL-1beta；MHC I类、4-1BBL和GM-CSF；MHC II类、4-1BBL和GM-CSF；MHC I类、CD80和GM-CSF；MHC II类、CD80和GM-CSF；MHC I类、CD86和GM-CSF；MHC II类、CD86和GM-CSF；MHC I类、CD83和GM-CSF；MHC II类、CD83和GM-CSF；MHC I类、CD70和GM-CSF；MHC II类、CD70和GM-CSF；MHC I类、LIGHT和GM-CSF；MHC II类、LIGHT和GM-CSF；MHC I类、HVEM和GM-CSF；MHC II类、HVEM和GM-CSF；MHC I类、CD40L和GM-CSF；MHC II类、CD40L和GM-CSF；MHC I类、OX40L和GM-CSF；MHC II类、OX40L和GM-CSF；MHC I类、TL1A和GM-CSF；MHC II类、TL1A和GM-CSF；MHC I类、GITRL和GM-CSF；MHC II类、GITRL和GM-CSF；MHC I类、CD30L和GM-CSF；MHC II类、CD30L和GM-CSF；MHC I类、4-1BBL和IL-25；MHC II类、4-1BBL和IL-25；MHC I类、CD80和IL-25；MHC II类、CD80和IL-25；MHC I类、CD86和IL-25；MHC II类、CD86和IL-25；MHC I类、CD83和IL-25；MHC II类、CD83和IL-25；MHC I类、CD70和IL-25；MHC II类、CD70和IL-25；MHC I类、LIGHT和IL-25；MHC II类、LIGHT和IL-25；MHC I类、HVEM和IL-25；MHC II类、HVEM和IL-25；MHC I类、CD40L和IL-25；MHC II类、CD40L和IL-25；MHC I类、OX40L和IL-25；MHC II类、OX40L和IL-25；MHC I类、TL1A和IL-25；MHC II类、TL1A和IL-25；MHC I类、GITRL和IL-25；MHC II类、GITRL和IL-25；MHC I类、CD30L和IL-25；或MHC II类、CD30L和IL-25。
将理解的是，对于任何前述信号1、信号2和/或信号3的组合，MHC I类分子可以是任何本文所述的MHC I类抗原呈递多肽或MHC I类单链融合物多肽。类似地，将理解的是，对于任何前述信号1、信号2和/或信号3的组合，MHC II类分子可以是任何本文所述的MHC II类抗原呈递多肽或MHC II类单链融合物多肽。
细胞粘附分子
在一些实施方案中，除了信号1、信号2和/或信号3外，本文所述的aAPC进一步在细胞表面处包含一种或多种包含细胞粘附分子的外源多肽。细胞粘附分子进一步促进T细胞与aAPC之间的相互作用。在一些实施方案中，细胞粘附分子介导或促进免疫学突触的形成。在一些实施方案中，一种或多种细胞粘附分子选自下组：ICAM4/LW、CD36、CD58/LFA3、CD47、VLA4、BCAM/Lu、CD44、CD99/MIC2、ICAM1、JAM1和CD147或其任何组合。
在一些实施方案中，aAPC在细胞表面处包括包含信号1的外源多肽、包含信号2的外源多肽和一种或多种包含细胞粘附分子的外源多肽。在一些实施方案中，aAPC在细胞表面处包括包含信号1的外源多肽、包含信号2的外源多肽、包含信号3的外源多肽和一种或多种包含细胞粘附分子的外源多肽。
在一些实施方案中，aAPC在细胞表面处包括包含超过一种信号1的超过一种外源多肽、包含信号2的外源多肽和一种或多种包含细胞粘附分子的外源多肽。在一些实施方案中，aAPC在细胞表面处包括包含超过一种信号1的超过一种外源多肽、包含信号2的外源多肽、包含信号3的外源多肽和一种或多种包含细胞粘附分子的外源多肽。
在一些实施方案中，aAPC在细胞表面处包括包含信号1的外源多肽、含有超过一种信号2的超过一种外源多肽和一种或多种包含细胞粘附分子的外源多肽。在一些实施方案中，aAPC在细胞表面处包括包含信号1的外源多肽、含有超过一种信号2的超过一种外源多肽、包含信号3的外源多肽和一种或多种包含细胞粘附分子的外源多肽。
在一些实施方案中，aAPC在细胞表面处包括包含信号1的外源多肽、包含信号2的外源多肽、含有超过一种信号3的超过一种外源多肽和一种或多种包含细胞粘附分子的外源多肽。
在一些实施方案中，aAPC在细胞表面处包括包含超过一种信号1的超过一种外源多肽、包含信号2的外源多肽、含有超过一种信号3的超过一种外源多肽和一种或多种包含细胞粘附分子的外源多肽。
在一些实施方案中，aAPC在细胞表面处包括包含超过一种信号1的超过一种外源多肽、含有超过一种信号2的超过一种外源多肽、包含信号3的外源多肽和一种或多种包含细胞粘附分子的外源多肽。
在一些实施方案中，aAPC在细胞表面处包括包含超过一种信号1的超过一种外源多肽、含有超过一种信号2的超过一种外源多肽、含有超过一种信号3的超过一种外源多肽和一种或多种包含细胞粘附分子的外源多肽。
在一些实施方案中，一种或多种包含信号1的外源多肽、一种或多种包含信号2的外源多肽、一种或多种包含信号3的外源多肽和一种或多种包含细胞粘附分子的外源多肽选自表8中所示的外源多肽。
表8.细胞粘附分子
Figure BDA0002631423640001871
Figure BDA0002631423640001881
在aAPC包括包含信号1的多肽和包含信号2的多肽的实施方案中，多肽可以以不同的构造存在于aAPC的表面上，例如，如图17A中所示。在一些实施方案中，包含信号1的多肽和包含信号2的多肽以独立、单独的多肽(例如，每个包含锚的多肽)的形式存在，并例如由存在于两个单独的慢病毒载体上的核酸编码，该载体用于连续转导或共转导红系前体细胞(两个慢病毒载体)。
在一些实施方案中，包含信号1的多肽和包含信号2的多肽以例如通过接头序列连接或拴系的融合多肽存在，其中每个多肽包含锚(信号1+2作为融合物)。在这些实施方案中，融合多肽由单个慢病毒载体编码，该载体用于转导红系前体细胞。
在一些实施方案中，包含信号1的多肽和包含信号2的多肽存在于细胞表面上(例如，每个包含锚的多肽)，其中多肽由病毒衍生的2A元件分开。多个2A元件在本领域中是已知的，并且可以如本文所述使用，其包括T2A、P2A、E2A和F2A(参见例如，Liu et al.(2017)Sci.Rep.7(1):2193，以其整体通过引用并入)。在一些实施方案中，包含信号1的多肽和包含信号2的多肽由T2A(跳跃T2A标签)分开。在这些实施方案中，多肽由单个慢病毒载体编码，该载体用于转导红系前体细胞。
在aAPC包括包含信号1的多肽、包含信号2的多肽和包含信号3的多肽的实施方案中，多肽可以以不同的构造存在于aAPC的表面上，例如，如图17中所示。在一些实施方案中，包含信号1的多肽和包含信号2的多肽以例如通过接头连接的融合多肽存在，并且包含信号3的多肽是单独的多肽(选项1)。在一些实施方案中，包含信号1的多肽和包含信号3的多肽以例如通过接头连接的融合多肽存在，并且包含信号2的多肽是单独的多肽(选项2)。在一些实施方案中，包含信号2的多肽和包含信号3的多肽以例如通过接头连接的融合多肽存在，并且包含信号1的多肽是单独的多肽(选项3)。在这些实施方案中，应理解，在制备aAPC时，融合多肽(包含信号1和2、信号2和3，或信号1和3)可以由一个慢病毒载体编码，而单独的多肽(信号1、信号2或信号3)可以由第二慢病毒载体编码。
在一些实施方案中，信号1和信号2之间、信号1和信号3之间或信号2和信号3之间的拴系或接头是聚GlySer接头。在一些实施方案中，信号1和信号2之间、信号1和信号3之间或信号2和信号3之间的拴系或接头是snorkel接头。
包含信号1和信号2的示例性融合物构建体的实例在下表9中提供。
表9.构建体
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Figure BDA0002631423640002011
Figure BDA0002631423640002021
在另一方面，本公开提供了对应于表9中列出的融合蛋白的任何一种多肽序列。在一个实施方案中，融合多肽包含Beta 2微球蛋白前导序列(B2ML)-HPV16 E711-19肽–Beta 2微球蛋白(B2M)-HLA-A*02:01，如SEQ ID NO:843中所示。在一个实施方案中，融合多肽包含B2ML-HPV16 E711-19肽–B2M-HLA-A*02:01Y84A，如SEQ ID NO:844中所示。在一个实施方案中，融合多肽包含B2ML-HPV16 E711-19肽–B2M-HLA-A*02:01Y84C，如SEQ ID NO:845中所示。在一个实施方案中，融合多肽包含B2ML-HPV16E711-19肽–B2M-HLA-A*02:01–血型糖蛋白A(GPA)，如SEQ ID NO:726中所示。在一个实施方案中，融合多肽包含B2ML-HPV16 E711-19肽–B2M-HLA-A*02:01Y84A–GPA，如SEQ ID NO:846中所示。在一个实施方案中，融合多肽包含B2ML-HPV16 E711-19肽–B2M-HLA-A*02:01Y84C–GPA，如SEQ ID NO:847中所示。在一个实施方案中，融合多肽包含Beta 2微球蛋白前导(B2ML)-HPV16 E711-19肽–接头–Beta 2微球蛋白(B2M)–接头-HLA-A*02:01Y84A–接头–GPA–T2A–GPA 信号肽–N端截短的4-1BBL–接头v17–GPA，如SEQ ID NO:848中所示。在一个实施方案中，融合多肽包含Beta 2微球蛋白前导(B2ML)-HPV16 E711-19肽–接头–Beta2微球蛋白(B2M)–接头-HLA-A*02:01Y84A–接头–GPA–T2A，如SEQ ID NO:849中所示。在一个实施方案中，融合多肽包含SMIM1–接头–IL12p40–接头–IL12p35，如SEQ ID NO:873中所示。在一个实施方案中，融合多肽包含GPA信号肽–4-1BBL–接头v17–GPA，如SEQ ID NO:850中所示。在一个实施方案中，融合多肽包含GPA信号肽–N端截短的4-1BBL–接头–GPA –T2A-Beta 2微球蛋白前导(B2ML)-HPV16 E711-19肽–接头–beta 2微球蛋白–接头-HLA-A*02:01Y84A-接头–GPA，如SEQ ID NO:854中所示。在一个实施方案中，融合多肽包含GPA信号肽–N端截短的4-1BBL–接头–GPA–T2A，如SEQ ID NO:855中所示。在一个实施方案中，融合多肽包含T2A-Beta 2微球蛋白前导(B2ML)-HPV16 E711-19肽–接头–beta 2微球蛋白–接头-HLA-A*02:01Y84A–接头–GPA，如SEQ ID NO:856中所示。在一个实施方案中，融合多肽包含Beta 2微球蛋白前导(B2ML)-HPV16 E711-19肽–接头–beta 2微球蛋白(B2M)–接头-HLA-A*02:01Y84A-接头-GPA–接头–全长4-1BBL，如SEQ ID NO:857中所示。在一个实施方案中，融合多肽包含Beta 2微球蛋白前导(B2ML)-HPV16 E711-19肽–接头–beta 2微球蛋白(B2M)–接头-HLA-A*02:01Y84A-接头-GPA–snorkel接头–接头–N端截短的4-1BBL，如SEQ ID NO:859中所示。在一个实施方案中，融合多肽包含Beta 2微球蛋白前导(B2ML)-HPV16 E711-19肽–接头–beta 2微球蛋白(B2M)–接头-HLA-A*02:01Y84A-接头-GPA–接头–SMIM1–接头–IL12p40–接头–IL12p35，如SEQ ID NO:860中所示。在一个实施方案中，融合多肽包含Beta 2微球蛋白前导(B2ML)-HPV16 E711-19肽–接头–beta 2微球蛋白(B2M)–接头-HLA-A*02:01Y84A-接头-GPA–snorkel接头–SMIM1–接头–IL12p40–接头–IL12p35，如SEQ ID NO:863中所示。在一个实施方案中，融合多肽包含Beta 2微球蛋白前导(B2ML)-HPV16 E711-19肽–接头–beta 2微球蛋白(B2M)–接头-HLA-A*02:01Y84A-接头-GPA–snorkel接头–接头–IL12p40–接头–IL12p35，如SEQ ID NO:864中所示。在一个实施方案中，融合多肽包含Beta 2微球蛋白前导(B2ML)-HPV16E711-19肽–接头–beta 2微球蛋白(B2M)–接头-HLA-A*02:01Y84A-接头-GPA–T2A–GPA信号肽–IL7–接头v14–GPA，如SEQ ID NO:865中所示。在一个实施方案中，融合多肽包含Beta 2微球蛋白前导(B2ML)-HPV16E711-19肽–接头–beta2微球蛋白(B2M)–接头-HLA-A*02:01Y84A-接头-GPA–T2A，如SEQ ID NO:849中所示。在一个实施方案中，融合多肽包含GPA信号肽–IL7–接头v14–GPA，如SEQ ID NO:866中所示。在一个实施方案中，融合多肽包含Beta 2微球蛋白前导(B2ML)-HPV16 E711-19肽–接头–beta 2微球蛋白(B2M)–接头-HLA-A*02:01Y84A-接头-GPA–T2A–GPA信号肽–IL15–接头–IL15Ra–接头v14–GPA，如SEQ ID NO:868中所示。在一个实施方案中，融合多肽包含GPA信号肽–IL15–接头–IL15Ra–接头v14–GPA，如SEQ ID NO:869中所示。在一个实施方案中，融合多肽包含Beta2微球蛋白前导(B2ML)-HPV16 E711-19肽–接头–beta 2微球蛋白(B2M)–接头-HLA-A*02:01Y84A-接头-GPA–T2A––SMIM1–接头–IL12p40–接头–IL12p35，如SEQ ID NO:872中所示。
在一些实施方案中，本公开提供了编码包含表9中所示氨基酸序列的融合多肽的核酸。在一些实施方案中，核酸编码融合多肽，其中融合多肽与表9中所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。在一些实施方案中，核酸编码融合多肽，其中融合多肽与SEQ ID NO:843具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。在一些实施方案中，核酸编码融合多肽，其中融合多肽与SEQ ID NO:844具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。在一些实施方案中，核酸编码融合多肽，其中融合多肽与SEQ ID NO:845具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。在一些实施方案中，核酸编码融合多肽，其中融合多肽与SEQ IDNO:726具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。在一些实施方案中，核酸编码融合多肽，其中融合多肽与SEQ ID NO:846具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。在一些实施方案中，核酸编码融合多肽，其中融合多肽与SEQ ID NO:847具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。在一些实施方案中，核酸编码融合多肽，其中融合多肽与SEQ ID NO:848具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。在一些实施方案中，核酸编码融合多肽，其中融合多肽与SEQ ID NO:849具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。在一些实施方案中，核酸编码融合多肽，其中融合多肽与SEQ ID NO:850具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。在一些实施方案中，核酸编码融合多肽，其中融合多肽与SEQ ID NO:854具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。在一些实施方案中，核酸编码融合多肽，其中融合多肽与SEQ ID NO:855具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。在一些实施方案中，核酸编码融合多肽，其中融合多肽与SEQ ID NO:856具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。在一些实施方案中，核酸编码融合多肽，其中融合多肽与SEQ ID NO:857具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。在一些实施方案中，核酸编码融合多肽，其中融合多肽与SEQ ID NO:859具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。在一些实施方案中，核酸编码融合多肽，其中融合多肽与SEQ ID NO:860具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。在一些实施方案中，核酸编码融合多肽，其中融合多肽与SEQ ID NO:863具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。在一些实施方案中，核酸编码融合多肽，其中融合多肽与SEQ ID NO:864具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。在一些实施方案中，核酸编码融合多肽，其中融合多肽与SEQ ID NO:865具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。在一些实施方案中，核酸编码融合多肽，其中融合多肽与SEQ IDNO:849具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。在一些实施方案中，核酸编码融合多肽，其中融合多肽与SEQ ID NO:866具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。在一些实施方案中，核酸编码融合多肽，其中融合多肽与SEQ ID NO:868具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。在一些实施方案中，核酸编码融合多肽，其中融合多肽与SEQ ID NO:869具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。在一些实施方案中，核酸编码融合多肽，其中融合多肽与SEQ ID NO:872具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。
在一些实施方案中，包含4-1BBL的多肽是N端截短的4-1BBL(SEQ ID NO:851)。在一些实施方案中，包含4-1BBL的多肽是全长4-1BBL。
本公开还提供了包含第一外源多肽和第二外源多肽的aAPC，其中第一外源多肽包括包含外源抗原性肽、外源抗原呈递多肽和膜锚多肽的融合蛋白，其中第二外源多肽包含一种或多种选自下组的多肽：外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、外源Treg扩增多肽和外源细胞因子多肽，并且其中aAPC通过如下的过程产生，所述过程包括：将编码第一外源多肽的外源核酸引入有核细胞(例如有核红系前体细胞)；将编码第二外源多肽的外源核酸引入有核细胞(例如有核红系前体细胞)；以及在适于去核和产生第一外源多肽和第二外源多肽两者的条件下培养该有核细胞(例如有核红系前体细胞)。在一些实施方案中，外源抗原性多肽选自表1或表14-24中所公开的抗原性多肽。在一些实施方案中，第一外源多肽包括包含与外源抗原呈递多肽融合的外源抗原性肽的融合蛋白，所述外源抗原呈递多肽与膜锚多肽融合。在一些实施方案中，外源抗原性多肽选自下组：黑色素瘤抗原基因-A(MAGE-A)抗原、嗜中性粒细胞颗粒蛋白酶抗原、NY-ESO-1/LAGE-2抗原、端粒酶抗原、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)抗原、糖蛋白100(gp100)抗原、埃巴病毒(EBV)抗原、人乳头瘤病毒(HPV)抗原和乙型肝炎病毒(HBV)抗原。在一些实施方案中，外源抗原性多肽进一步包含前导序列。在一些实施方案中，前导序列是beta 2微球蛋白(B2M)前导序列或GPA信号肽。在一些实施方案中，膜锚是血型糖蛋白A(GPA)或其片段，或小整合膜蛋白1(SMIM1)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽、MHC I类单链融合物、MHC II类多肽或MHC II类单链融合物。在一些实施方案中，MHC I类多肽选自下组：HLA-A、HLA-B和HLA-C。在一些实施方案中，MHC II类多肽选自下组：HLA-DPα、HLA-DPβ、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQα、HLA-DQβ、HLA-DRα和HLA-DRβ。在一些实施方案中，MHC I类单链融合物包含α链和β2m链，以及任选地锚多肽。在一些实施方案中，外源抗原性多肽经由接头与MHC I单链融合物连接。在一些实施方案中，接头是可切割的接头。在一些实施方案中，MHC II类单链融合物包含锚、α链，以及任选地β链。在一些实施方案中，外源抗原性多肽经由接头与MHC II单链融合物连接。在一些实施方案中，接头是可切割的接头。在一些实施方案中，外源细胞因子多肽选自下组：IL2、IL15、与IL-15融合的IL-15Rα、IL7、IL12、IL18、IL21、IL4、IL6、IL23、IL27、IL17、IL10、TGF-beta、IFN-gamma、IL-1beta、GM-CSF和IL-25。在一些实施方案中，外源共刺激性多肽选自下组：4-1BBL、LIGHT、抗CD28、CD80、CD86、CD70、OX40L、GITRL、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD83、CD155、CD112、与IL-15融合的IL-15Rα、IL-21、ICAM-1、LFA-1的配体、抗CD3及其组合。在一些实施方案中，外源共抑制性多肽选自下组：IL-35、IL-10、VSIG-3和LAG3激动剂。在一些实施方案中，外源Treg扩增多肽选自下组：CD25特异性IL-2、TNFR2特异性TNFα、抗DR3激动剂(VEGI/TL1A特异性)、4-1BBL、TGFβ及其组合。在一些实施方案中，aAPC进一步包括包含粘附分子的外源多肽。在一些实施方案中，粘附分子选自下组：ICAM4/LW、CD36、CD58/LFA3、CD47、VLA4、BCAM/Lu、CD44、CD99/MIC2、ICAM1和CD147。在一些实施方案中，权利要求90的aAPC，其中外源核酸包含DNA或RNA。在一些实施方案中，引入步骤包括病毒转导或电穿孔。在一些实施方案中，引入步骤包括利用以下的一种或多种：脂质体介导的转移、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、基于逆转录病毒的载体、脂质转染和慢病毒载体。在一些实施方案中，引入步骤包括通过用慢病毒载体转导来引入编码第一外源多肽的第一外源核酸和编码第二外源多肽的第二外源核酸，其中第一外源核酸和第二外源核酸包含在相同的慢病毒载体中。在一些实施方案中，引入步骤包括通过用第一慢病毒载体转导来引入编码第一外源多肽的第一外源核酸，和通过用第二慢病毒载体转导来引入编码第二外源多肽的第二外源核酸。在一些实施方案中，第一和/或第二外源核酸包含选自下组的启动子：beta-珠蛋白启动子、鼠干细胞病毒(MSCV)启动子、长臂猿白血病病毒(GALV)启动子、人延伸因子1alpha(EF1alpha)启动子、CAG CMV立即早期增强子和鸡beta-肌动蛋白(CAG)启动子以及人磷酸甘油酸激酶1(PGK)启动子。
免疫学突触
如本文所述，本公开的工程化红系细胞(即，aAPC)相对于使用球形纳米颗粒(如刚性、基于珠的aAPC)提供了许多优点。分子移动性(例如配体在细胞膜中的移动)和分子聚簇是免疫学突触形成的重要特征。本文所述的aAPC的膜比纳米颗粒的外表面具有大得多的动态性和流动性，并因此在免疫学突触形成期间或在介导胞啃作用(trogocytosis)时允许有效得多的分子重组和MHC聚簇。此外，与纳米颗粒的小尺寸相反，本发明的aAPC提供更大的表面积用于在免疫学突触中形成功能性微米级簇。在一些实施方案中，如本文所述的aAPC经工程化改造以形成免疫学突触，其中免疫学突触促进T细胞活化。
免疫学突触(或免疫突触，或IS)是抗原呈递细胞和淋巴细胞(如T/B细胞或NK细胞)之间的界面。免疫学突触可以由参与T细胞活化的分子组成，这些分子构成典型的模式，称为激活簇。根据研究最深入的模型，免疫学突触也称为超分子激活簇(SMAC)(Monks etal.,Nature 1998,395(6697):82–86；以其整体通过引用并入本文)，其由同心环(中央、外周或远端区域)组成，每个环含有分离的蛋白质簇。免疫学突触中的分子包括抗原呈递分子(例如，MHC I类或MHC II类分子)、粘附分子、共刺激性分子和共抑制性分子。
免疫学突触是在T细胞受体一起聚簇在微簇中后形成的动态的结构，所述微簇最终移向免疫学突触中心。这些分子在T淋巴细胞和APC界面处的空间和时间的变化调节了免疫学突触的结构和T淋巴细胞免疫应答。通常，有效的CD4+和CD8+ T细胞活化与功能性免疫学突触的形成有关(Y.Kaizuka,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,104(2007),pp.20296-20301，以其整体通过引用并入本文)。
在一些实施方案中，本公开的特征在于可以在aAPC和免疫细胞如T细胞、B细胞或NK细胞之间形成免疫学突触的aAPC。在一些实施方案中，本发明的aAPC具有在免疫学突触中组装超过一个MHC分子的能力。
免疫学突触的初始相互作用在存在于T细胞的外周SMAC中的淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)与APC上的整联蛋白粘附分子(如ICAM-1或ICAM-2)之间发生。当与APC结合时，T细胞然后可以延伸假足并扫描靶细胞的表面以寻找特定的肽-MHC复合物。当T细胞受体(TCR)与抗原呈递细胞上的肽-MHC复合物结合并通过微簇/脂筏的形成引发信号传导激活时，形成的过程就开始了(Varma et al.,Immunity.2006Jul；25(1):117-27；以其整体通过引用并入本文)。
本公开的令人惊讶的发现是，尽管本发明的工程化红系细胞或去核细胞(即，aAPC)在其表面上不存在内源ICAM1，却能够起始并形成活性的免疫学突触。不希望受到任何特定理论的束缚，据信天然存在于红系细胞表面上的其他整联蛋白，如JAM1和/或ICAM-4，能够代替ICAM-1在形成功能性免疫学突触中的作用。
因此，在一些实施方案中，本公开的aAPC包含一种或多种外源细胞粘附多肽以介导或促进免疫学突触的形成。在一些实施方案中，一种或多种细胞粘附分子选自下组：ICAM4/LW、CD36、CD58/LFA3、CD47、VLA4、BCAM/Lu、CD44、CD99/MIC2、ICAM1、JAM1和CD147，或其任何组合。
本发明的一个优点是本文所述的工程化红系细胞(即，aAPC)具有提供动态分子运动并因此允许有效的分子重组和MHC聚簇的流体细胞膜，所述MHC聚簇是T细胞刺激所需要的。信号传导在TCR微簇中起始并维持，所述TCR微簇在免疫学突触的外周中连续形成，并被转运至中心以形成中央SMAC。在中央SMAC的形成期间，微簇可以彼此独立移动，并且可以融合以形成具有连续运动的较大簇。需要阈值MHCI簇密度来维持活性免疫信号传导(Anikeeva et al.,PLoS One.2012；7(8):e41466；Bullock et al.,J Immunol.2000Mar1；164(5):2354-61；Bullock et al.,J Immunol.2003Feb 15；170(4):1822-9；Jiang etal.,Immunity.2011Jan 28；34(1):13-23；其每一篇以其整体通过引用并入本文)。因此，在一些实施方案中，本文提供的aAPC可以以以有效形成功能性免疫学突触和激活免疫信号传导的密度介导MHC分子的聚簇。
免疫学突触形成中分子重组的另一个结果是APC膜蛋白向T细胞的细胞间转移。T细胞通过称为胞啃作用的机制，从APC中获得MHC I类和II类糖蛋白，以及共刺激性分子和膜片(membrane patch)。如本文所述，本文提供的aAPC的膜由于其流动性而允许有效的分子重组和MHC聚簇。在一些实施方案中，本发明的aAPC允许或介导免疫突触形成中的分子重组，使得胞啃作用发生。
免疫学突触的大小可以通过本领域已知的许多方法来确定，包括显微术，如全内反射荧光显微术(TIRFM)(Varma et al.,2006)。研究表明，免疫学突触由微米级SMAC组成(Varma et al.,2006；Dustin et al.,Science.2002,298(5594):785-9；以其整体通过引用并入本文)。在一些实施方案中，本发明的aAPC可以形成平均直径为约0.5μm和5.0μm之间的免疫学突触。在一些实施方案中，本发明的aAPC可以形成平均直径为至少约0.5μm的免疫学突触。在一些实施方案中，本发明的aAPC可以形成平均直径为约0.5μm和4.5μm之间、约0.5μm和4.0μm之间、约0.5μm和3.5μm之间、约0.5μm和3.0μm之间、约0.5μm和2.5μm之间、约0.5μm和2.0μm之间、约0.5μm和1.5μm之间、约0.5μm和1.0μm之间、约1.0μm和5.0μm之间、约1.0μm和4.5μm之间、约1.0μm和4.0μm之间、约1.0μm和3.5μm之间、约1.0μm和3.0μm之间、约1.0μm和2.5μm之间、约1.0μm和2.0μm之间、约1.0μm和1.5μm之间、约1.5μm和5.0μm之间、约1.5μm和4.5μm之间、约1.5μm和4.0μm之间、约1.5μm和3.5μm之间、约1.5μm和3.0μm之间、约1.5μm和2.5μm之间、约1.5μm和2.0μm之间、约2.0μm和5.0μm之间、约2.0μm和4.5μm之间、约2.0μm和4.0μm之间、约2.0μm和3.5μm之间、约2.0μm和3.0μm之间、约2.0μm和2.5μm之间、约2.0μm和5.0μm之间、约2.5μm和4.5μm之间、约2.5μm和4.0μm之间、约2.5μm和3.5μm之间、约2.5μm和3.0μm之间、约3.0μm和5.0μm之间、约3.0μm和4.5μm之间、约3.0μm和4.0μm之间、约3.0μm和3.5μm之间、约3.5μm和5.0μm之间、约3.5μm和4.5μm之间、约3.5μm和4.0μm之间、约4.0μm和5.0μm之间、约4.0μm和4.5μm之间、约4.5μm和5.0μm之间的功能性免疫学突触。在一些实施方案中，本发明的aAPC可以形成平均直径为至少0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1.0μm、1.5μm、2.0μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4.0μm或5μm的功能性免疫学突触。
如本文所述，本公开的aAPC的优点是aAPC细胞膜的流动性，其允许有效的分子重组。特定的信号传导途径通过使T细胞的中心体朝向免疫学突触的位点定向而导致T细胞的极化。肌动蛋白的积累和极化是由TCR/CD3与整联蛋白和小GTP酶相互作用引起的。这些相互作用促进肌动蛋白聚合，并且随着肌动蛋白的积累和重组，它促进TCR和整联蛋白的聚簇。这些高度动态的接触的特征在于连续的细胞骨架重塑事件，该事件不仅构成界面，而且还施加相当大量的机械力，这影响了信息进出免疫细胞的转移(Basu et al.,Trends CellBiol.2017Apr；27(4):241–254；Hivroz et al.,Front Immunol.2016；7:46；以其整体通过引用并入本文)。可以通过例如原子力显微术、生物膜力探针(BFP)技术、牵引力显微术等方法确定免疫学突触部位处TCR和整联蛋白之间抗张强度(tensile strength)的粘附力(Hivroz et al.,Front Immunol.2016；7:46；以其整体通过引用并入本文)。
在一些实施方案中，抗张强度是由aAPC形成的T细胞受体和免疫学突触的分子，例如肽-MHC复合物之间的粘附力的量度。在一些实施方案中，aAPC能够形成具有足以激活免疫细胞的抗张强度的免疫学突触。在一些实施方案中，本公开的aAPC可以形成具有约1pN和30,000pN之间的抗张强度的突触。在一些实施方案中，本公开的aAPC可以形成具有约1pN和20,000pN之间、约1pN和10,000pN之间、约1pN和9,000pN之间、约1pN和8,000pN之间、约1pN和7,000pN之间、约1pN和6,000pN之间、约1pN和5,000pN之间、约1pN和4,000pN之间、约1pN和3,000pN之间、约1pN和2,000pN之间、约1pN和1,000pN之间、约1,000pN和30,000pN之间、约1,000pN和20,000pN之间、约1,000pN和10,000pN之间、约1,000pN和9,000pN之间、约1,000pN和8,000pN之间、约1,000pN和7,000pN之间、约1,000pN和6,000pN之间、约1,000pN和5,000pN之间、约1,000pN和4,000pN之间、约1,000pN和3,000pN之间、约1,000pN和2,000pN之间的抗张强度的突触。在一些实施方案中，在免疫学突触处肽-MHC复合物和TCR之间的最佳机械力为至少1pN、1.5pN、2.0pN、3.0pN、4.0pN、5.0pN、6.0pN、7.0pN、8.0pN、9.0pN、10pN、20pN、30pN、40pN、50pN、60pN、70pN、80pN、90pN、100pN、500pN、1,000pN、2,000pN、3,000pN、4,000pN、5,000pN、6,000pN、7,000pN、8,000pN、9,000pN、10,000pN、11,000pN、12,000pN、13,000pN、14,000pN、15,000pN或20,000pN。在一些实施方案中，如本文所述的aAPC可以在免疫学突触处触发肽-MHC复合物与TCR之间的机械力，以激活免疫细胞。
Treg共刺激性和共抑制性多肽
调节性T细胞(“Treg”)是T细胞的特化亚群，其抑制免疫系统的激活，从而维持对自身抗原的耐受性。在人类和啮齿动物中，Treg细胞占CD4+ T细胞的5-10％。在人类和啮齿动物中，Treg细胞占CD4+ T细胞的5-10％，并组成性表达CD4和CD25以及参与其发育和功能的转录因子FoxP3(CD4+CD25+FoxP3+)。IL-2在Treg细胞发育和稳态中也似乎起着重要作用，因为缺乏IL-2或其受体组分的动物会发展T细胞过度增殖和自身免疫疾病，其可以通过过继转移来自初始(naive)动物的Treg细胞来校正。同样，缺乏通过CD28/CD80相互作用的信号传导与Treg细胞的降低的数量和功能性有关，这表明该受体/配体系统在Treg细胞的发育和功能中起着重要作用。
在某些实施方案中，本公开的特征在于Treg共刺激性多肽，其是扩增调节性T细胞(Treg)细胞的外源多肽。在一些实施方案中，Treg共刺激性多肽通过刺激参与Treg细胞发育的三种信号中的至少一种来扩增Treg细胞。信号1涉及TCR，并且可以用抗体(如抗CD3抗体)或用通过TCR进行信号传导的抗原刺激。信号2可以由几种不同的分子介导，包括免疫共刺激性分子如CD80和4-1BBL。信号3经由细胞因子例如IL-2或TGFβ转导。在一些实施方案中，Treg共刺激性多肽刺激这些信号之一。在另一个实施方案中，Treg共刺激性多肽刺激这些信号的两个。在另一个实施方案中，Treg共刺激性多肽刺激这些信号的三个。
信号1
可用作刺激信号1的Treg共刺激性多肽的抗原包括与靶疾病或状况相关的抗原。例如，自身抗原和胰岛素(特别适合于治疗1型糖尿病)、胶原(特别适合于治疗类风湿性关节炎)、髓磷脂碱性蛋白(特别适合于治疗多发性硬化症)和MHC(用于治疗和预防外来移植物排斥)。抗原可以作为缀合物的一部分施用。任选地，抗原作为MHC/抗原复合物的一部分提供。在该实施方案中，MHC和抗原可以独立地是外来的或同基因的(syngeneic)。例如，可以使用供体MHC和同种异体或同基因抗原。
信号2
用于刺激信号2的示例性Treg共刺激性多肽包括B7和TNF家族的成员，例如下表10中所示的B7和CD28家族成员，以及表11中所示的TNF家族成员。
表10.Treg共刺激性多肽：B7和CD28家族成员
配体 受体
B7.1(CD80) CD28、CTLA-4(CD 152)
B7.2(CD86) CD28、CTLA-4
ICOSL(B7h、B7-H2、B7RP-1, ICOS(AILIM)
GL5O、LICOS)
PD-L1(B7-H1) PD-1
PD-L2(B7-DC) PD-1
B7-H3 未知
B7-H4(B7x；B7S1) 未知(BTLA？)
未知(HVEM*) BTLA
ICOSL(B7h、B7-H2、B7RP-1, ICOS(AILIM)
表11.Treg共刺激性多肽：TNF家族成员
配体 受体
OX40L OX40(CD134)
4-1BBL 4-1BB(CD137)
CD40L(CD154) CD40
CD27L(CD70) CD27
CD30L CD30
LIGHT HVEM、LTβR、DcR3
GITRL GITR
BAFF(BLyS)** BAFF-R、TACI、BCMA
APRIL** TACI、BCMA
VEGI/TL1A DR3
TNF alpha(突变体) TNFR2
信号3
用于刺激信号3的示例性Treg共刺激性多肽包括刺激信号3的细胞因子和生长因子，如IL-2、IL-4和TGF-β(包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3)。可用于免疫治疗方法的IL-2和IL-4部分是本领域已知的。参见例如，Earle et al.,2005，同上；Thorton et al.,2004,J.Immunol.172:6519-23；Thorton et al.,2004,Eur.J.Immunol.34:366-76。根据一个实施方案，使用细胞因子的成熟部分。
在一些实施方案中，Treg共刺激性多肽是CD25特异性IL-2。在一些实施方案中，Treg共刺激性多肽是TNFR2特异性TNF。在一些实施方案中，Treg共刺激性多肽是抗DR3激动剂(VEGI/TL1A特异性的)。在一些实施方案中，Treg共刺激性肽是4-1BBL。在一些实施方案中，Treg共刺激性肽是TGFbeta。
在其他实施方案中，本公开的特征在于Treg共抑制性多肽，其是抑制Treg细胞的外源多肽。在某些实施方案中，Treg抑制可用于治疗癌症，例如，通过靶向参与Treg运输的趋化因子。其他Treg抑制剂可以靶向表10或表11中列出的任何受体，例如抗OX40、抗GITR或抗CTLA4或TLR配体。
在一些实施方案中，可以将Treg共刺激性多肽或其活性片段与结合对成员连接或表达为融合蛋白，以用于根据本发明的用途。示例性的结合对是生物素和链霉抗生物素蛋白(SA)或抗生物素蛋白。
在一些实施方案中，Treg共刺激性多肽或其活性片段是融合蛋白的一部分，所述融合蛋白包含Treg共刺激性多肽和结合对成员，如CSA。融合蛋白可以通过本领域已知的许多不同方法中的任何一种来制备。例如，融合蛋白的一种或多种组分多肽可以化学合成或者可以使用众所周知的重组核酸技术产生。(如本文所用，“核酸”是指RNA或DNA。)可以使用例如聚合酶链式反应(PCR)获得可用于本发明的核酸序列。各种PCR方法描述于例如PCRPrimer:A Laboratory Manual,Dieffenbach 7Dveksler,Eds.,Cold Spring HarborLaboratory Press,1995中。融合物在下文中更详细地讨论。
缀合物可以包括结合对成员和共刺激性部分之间的接头，如肽接头。可以选择接头的长度和组成以增强该部分的任一功能末端的活性。接头可以大于20个氨基酸长。在一些实施方案中，接头通常为约3至约30个氨基酸长，例如约5至约20个氨基酸长、约5至约15个氨基酸长、约1至约10个氨基酸长。但是，可以使用更长或更短的接头，或者可以完全免除接头。在这方面，可以使用诸如已经用于连接单链抗体的重链和轻链的柔性接头(例如(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:1))。参见，例如，Huston et al.,1988,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879-5883；美国专利号5,091,513、5,132,405、4,956,778；5,258,498和5,482,858，其每一篇的整体通过引用并入本文。其他接头是FENDAQAPKS(SEQ ID NO:717)或LQNDAQAPKS(SEQ ID NO:718)。免疫球蛋白Fc区的一个或多个域(例如CH1、CH2和/或CH3)也可以用作接头。
在某些实施方案中，多肽是如本文所述的外源Treg共刺激性多肽。示例性Treg共刺激性多肽包括：
a)人多肽的天然存在形式；
b)具有出现在2017年12月22日的数据库(例如GenBank数据库)中的序列的人多肽；
c)人多肽，其具有与a)或b)的序列相差不超过1、2、3、4、5或10个氨基酸残基的序列；
d)人多肽，其具有与a)或b)的序列相差不超过1、2、3、4、5或10％的其氨基酸残基的序列；
e)人多肽，其具有与a)或b)的序列基本没有不同的序列；或
f)具有c)、d)或e)的序列的人多肽，其与具有a)或b)的序列的人多肽在生物学活性，例如酶活性(例如特异性或周转)或结合活性(例如结合特异性或亲和力)上基本上没有差异。f)下的候选肽可以如本文所述制备并针对类似活性进行筛选，并且如果在本文所述的工程化红系细胞中表达则在下文是等同的。
在实施方案中，外源Treg共刺激性多肽包含人多肽或其片段，例如前述段落的a)、b)、c)、d)、e)或f)的人多肽的全部或片段。在一个实施方案中，外源Treg共刺激性多肽包含融合多肽，其包含前述段落的a)、b)、c)、d)、e)或f)的人多肽的全部或片段以及另外的氨基酸序列。在一个实施方案中，另外的氨基酸序列包含不同人外源Treg共刺激性多肽的前述段落的a)、b)、c)、d)、e)或f)的人多肽的全部或片段。
在一些实施方案中，aAPC呈递，例如在细胞表面上包含，至少2种、至少3种、至少4种或至少5种外源Treg共刺激性多肽。
在一些实施方案中，一种或多种Treg共刺激性或共抑制性多肽包括膜锚或者与膜锚融合。在一些实施方案中，膜锚选自表3中所示的序列。在一些实施方案中，一种或多种Treg共刺激性或共抑制性多肽包括前导序列或者与前导序列融合。在一些实施方案中，前导序列选自表2中所示的序列。
改变代谢物的外源多肽
在本发明的一些实施方案中，改变代谢物的外源多肽是指参与细胞中代谢物的分解代谢或合成代谢的任何多肽，其中改变代谢物的多肽可以影响T细胞的代谢。如本文所述的示例性耗竭代谢物的多肽改变了细胞局部环境中代谢物的水平。例如，在一些实施方案中，耗竭代谢物的多肽促进色氨酸的氧化分解代谢。
示例性的改变代谢物的多肽包括CD39、CD73、可以用于精氨酸耗竭的精氨酸酶(Arg1)、可以用于色氨酸耗竭的吲哚胺2,3-二加氧酶(IDO)；可以用于色氨酸耗竭的色氨酸2,3-二加氧酶(TDO-2)抑制剂；可以减少5-HT合成并且可以用于色氨酸耗竭的色氨酸5-羟化酶(TPH)抑制剂；可以用于生成前列腺素E2(PGE2)的环氧合酶2(COX-2)和前列腺素(PGE)合酶(PGES)；和可以用于生成NO的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)。
在某些实施方案中，多肽是如本文所述的改变代谢物的外源多肽。示例性改变代谢物的多肽包括：
a)人多肽的天然存在形式；
b)具有出现在2017年12月22日的数据库(例如，GenBank数据库)中的序列的人多肽；
c)人多肽，其具有与a)或b)的序列相差不超过1、2、3、4、5或10个氨基酸残基的序列；
d)人多肽，其具有与a)或b)的序列相差不超过1、2、3、4、5或10％的其氨基酸残基的序列；
e)人多肽，其具有与a)或b)的序列基本没有不同的序列；或
f)具有c)、d)或e)的序列的人多肽，其与具有a)或b)的序列的人多肽在生物学活性，例如酶活性(例如特异性或周转)或结合活性(例如结合特异性或亲和力)上基本上没有差异。f)下的候选肽可以如本文所述制备并针对类似活性进行筛选，并且如果在本文所述的工程化红系细胞中表达则在下文是等同的。
在实施方案中，改变代谢物的外源多肽包含人多肽或其片段，例如前述段落的a)、b)、c)、d)、e)或f)的人多肽的全部或片段。在一个实施方案中，改变代谢物的外源多肽包含融合多肽，其包含前述段落的a)、b)、c)、d)、e)或f)的人多肽的全部或片段以及另外的氨基酸序列。在一个实施方案中，另外的氨基酸序列包含不同的改变代谢物的人多肽的前述段落的a)、b)、c)、d)、e)或f)的人多肽的全部或片段。
在一些实施方案中，一种或多种改变代谢物的外源多肽包括膜锚或者与膜锚融合。在一些实施方案中，膜锚选自表3中所示的序列。在一些实施方案中，一种或多种改变代谢物的外源多肽包括前导序列或者与前导序列融合。在一些实施方案中，前导序列选自表2中所示的序列。
细胞因子/趋化因子
另外，本公开涵盖用编码至少一种细胞因子，至少一种趋化因子或两者的核酸转导的aAPC。因此，本公开涵盖细胞因子，包括细胞因子的全长、片段、同源物、变体或突变体。细胞因子包括能够影响另一细胞的生物学功能的蛋白质。受细胞因子影响的生物学功能可以包括但不限于细胞生长、细胞分化或细胞死亡。优选地，本公开的细胞因子能够结合细胞表面上的特定受体，从而影响细胞的生物学功能。
优选的细胞因子尤其包括造血生长因子、白介素、干扰素、免疫球蛋白超家族分子、肿瘤坏死因子家族分子和/或趋化因子。本公开的更优选的细胞因子包括粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子alpha(TNFα)、肿瘤坏死因子beta(TNFβ)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、白介素-1(IL-1)、白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素5(IL-5)、白介素6(IL-6)、白介素7(IL-7)、白介素10(IL-10)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、白介素21(IL-21)、白介素35(IL-35)、干扰素alpha(IFN-α)、干扰素beta(IFN-β)、干扰素gamma(IFN-γ)和IGIF等。
趋化因子(包括其同源物、变体、突变体或片段)涵盖alpha趋化因子或beta趋化因子，其包括但不限于C5a、白介素8(IL-8)、单核细胞趋化蛋白1alpha(MIP1α)、单核细胞趋化蛋白1beta(MIP1β)、单核细胞化学引诱(chemoattractant)蛋白1(MCP-1)、单核细胞化学引诱蛋白3(MCP-3)、血小板激活因子(PAFR)、N-甲酰基-甲硫酰基-亮氨酰-[3H]苯丙氨酸(FMLPR)、白三烯B4(LTB4R)、胃泌素释放肽(GRP)、RANTES、嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)、淋巴细胞趋化因子(lymphotactin)、IP10、1-309、ENA78、GCP-2、NAP-2和/或MGSA/gro。一旦掌握了本文提供的教导，本领域技术人员将理解，本公开涵盖趋化因子和细胞因子，如本领域众所周知的以及将来发现的任何趋化因子和细胞因子。
在一些实施方案中，aAPC上的细胞因子充当刺激信号3的多肽。应当理解，在一些实施方案中，本公开的aAPC可以通过刺激参与T细胞发育的所有三种信号来扩增和/或激活T细胞。信号1涉及TCR，并且可以用通过TCR进行信号传导的抗原刺激。信号2可以由几种不同的分子介导，包括本文所述的任何免疫共刺激性分子，如4-1BBL。信号3可以经由细胞因子如IL-15转导。不受理论的束缚，认为除了分别来自第一和第二外源多肽(例如如本文所述的抗原和共刺激性多肽)的信号1和2之外，例如来自aAPC上的第三外源多肽的信号3的存在增加了aAPC加强记忆T细胞群体的能力，并因此提供了更长的功效，例如，针对肿瘤的复发或用感染原的再次攻击的功效。在一些实施方案中，用于刺激信号3的多肽是IL-15。在一些实施方案中，aAPC包含刺激信号3的第三外源多肽。在一个实施方案中，刺激信号3的第三外源多肽是IL15。
在一些实施方案中，工程化红系细胞，例如去核细胞，包含来自表12的一个或多个(例如2、3、4、5或更多个)细胞因子受体亚基或其细胞因子结合变体或片段。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含来自表12的单行的两个或三个(例如，全部)细胞因子受体亚基或其细胞因子结合变体或功能片段。细胞因子受体可以存在于红系细胞的表面上。表达的受体通常具有能够结合并隔离其靶配体的野生型人受体序列或其变体或片段。在实施方案中，两个或更多个细胞因子受体亚基彼此连接，例如作为融合蛋白。
在实施方案中，将一种或多种(例如2种或全部)细胞因子融合至跨膜域(例如，本文所述的GPA跨膜域或其他跨膜域)，例如使得细胞因子在红系细胞的表面上。在实施方案中，红系细胞进一步包含靶向部分，例如WO2007030708(例如，其中第34-45页)中描述的地址部分或靶向部分，该申请以其整体通过引用并入本文。
在一些实施方案中，一种或多种细胞因子包括膜锚或者与膜锚融合。在一些实施方案中，膜锚选自表3中所示的序列。在一些实施方案中，一种或多种细胞因子包括前导序列或者与前导序列融合。在一些实施方案中，前导序列选自表2中所示的序列。
表12.细胞因子和受体
Figure BDA0002631423640002181
Figure BDA0002631423640002191
工程化红系细胞
在一些方面，本公开提供了经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞或去核细胞，其中红系细胞或去核细胞呈递，例如在细胞表面上包含，表1中公开的外源抗原性多肽。因此，本公开涵盖包含编码如表1中所示的感兴趣的抗原的核酸的aAPC。在某些实施方案中，至少一种外源抗原性多肽是肿瘤抗原、自身免疫疾病抗原、病毒抗原或细菌抗原。在一些实施方案中，去核细胞是例如通过从红细胞前体细胞分化而失去其核的红系细胞。然而，应理解，并非所有去核细胞都是红系细胞，并因此，本文所涵盖的去核细胞还可以包括例如血小板。在一些实施方案中，去核细胞不是血小板，并因此是无血小板去核细胞。在本公开的某些方面，红系细胞是网织红细胞或红细胞(红细胞(RBC))。与其他细胞相比，红细胞具有许多优势，包括非自体(例如，基本上缺乏主要组织相容性复合物(MHC))、在受试者中具有更长的循环时间(例如，大于30天)以及适合大量生产。在本公开的某些方面，工程化红系细胞是有核的。
红系细胞任选地进一步包含第二种不同的外源多肽。红系细胞任选地进一步包含第二和第三种不同的外源多肽。红系细胞任选地进一步包含第二、第三和第四种不同的外源多肽。红系细胞任选地进一步包含第二、第三、第四和第五种不同的外源多肽。在一些实施方案中，红系细胞任选地进一步包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20种或更多种不同的外源多肽。在一些实施方案中，红系细胞任选地进一步包含1-100种、1-200种之间的不同外源多肽。
在某些实施方案中，包含抗原(例如外源抗原性多肽)的红系细胞(例如工程化红系细胞)可以在外源抗原呈递多肽，例如MHC(其中也用编码MHC I类或II类分子的核酸对细胞进行转导)的背景下加工和呈递抗原，其中外源抗原性多肽与外源性抗原呈递多肽(例如MHC I类或II类分子)特异性结合，从而产生抗原特异性T细胞并扩增其群体。因此，可以将感兴趣的抗原引入本发明的aAPC中，其中然后aAPC在MHC I类或II类复合物的背景下呈递抗原(例如，抗原性多肽与MHC I类或II类复合物特异性结合)，即MHC分子“加载”了抗原，并且aAPC可以用于产生抗原特异性T细胞。因此，在一些方面，本公开提供了经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含工程化红系细胞，其中工程化红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽(例如，MHC I类或II类分子)特异性结合。
在其他实施方案中，红系细胞包含一种或多种未经加工和由MHC呈递的抗原，即，本公开提供了经工程化改造以激活T细胞而无MHC限制的人工抗原呈递细胞(aAPC)。在一些实施方案中，本公开提供了包括针对CD3的抗体(包括单链抗体)的aAPC。在一些实施方案中，针对CD3的抗体(包括单链抗体)在aAPC表面上表达。在一些实施方案中，本公开提供了包括针对CD4和CD8的抗体的aAPC。在其他实施方案中，针对CD4和CD8的抗体在aAPC表面上表达，以激活它们各自的免疫细胞群体。
在其他方面，本公开提供了经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含工程化红系细胞，其中工程化红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原性多肽和外源共刺激性多肽。
在一些方面，本公开提供了经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物。在上述方面和实施方案的一些实施方案中，工程化红系细胞是去核红系细胞。
在其他方面，本公开提供了经工程化改造以激活和扩增T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含工程化红系细胞，其中工程化红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽、外源抗原性多肽、外源共刺激性多肽和外源T细胞扩增多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽(例如，MHC I类或II类分子)特异性结合。
在一些实施方案中，aAPC能够激活与aAPC接触的T细胞。
在另一个实施方案中，刺激包含CD8+ T细胞的激活、CD4+ T细胞的激活、T细胞的细胞毒性活性的刺激、T细胞的细胞因子分泌的刺激和/或其任何组合。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞。
作为另一个实例，在免疫肿瘤学环境中，外源多肽包含T细胞激活配体和抑制免疫抑制性分子(例如，免疫抑制性受体)的试剂，例如CD80和抗PD1。在另一个实施方案中，一种试剂是激活性4-1BBL或其片段或变体，并且第二种试剂是阻断PD1信号传导的抗体分子(例如，针对PD1或PD-L1的抗体分子)。因此，在实施方案中，靶T细胞既得以激活又被防止受到抑制。
在一些实施方案中，目的是激活或抑制T细胞。如本文所述，为了确保T细胞比也可以表达激活或抑制性受体的其他免疫细胞优先靶向，在红系细胞上的外源多肽之一可以包含靶向部分，例如结合T细胞受体(TCR)或另一种T细胞标志物的抗体分子。靶向部分在下文中更详细地描述。在一些实施方案中，可以增强或抑制特定的T细胞亚型或克隆。在一些实施方案中，红系细胞上的一种或多种外源多肽是肽-MHC分子，其将以抗原特异性方式选择性地与T细胞受体结合。
在一些方面，本公开提供了经工程化改造以抑制T细胞活性的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽、外源抗原性多肽和表7中公开的至少一种外源共抑制性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽(例如MHC I类或II类分子)特异性结合。
在其他方面，本公开提供了经工程化改造以抑制T细胞活性的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽、表1中公开的外源抗原性多肽和至少一种外源共抑制性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽(例如MHC I类或II类分子)特异性结合。
在一些方面，本公开提供了经工程化改造以抑制T细胞活性的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽、外源抗原性多肽和至少一种改变代谢物的多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽(例如MHC I类或II类分子)特异性结合。
在其他方面，本公开提供了经工程化改造以抑制T效应细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含工程化红系细胞，其中工程化红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽、外源抗原、外源增殖抑制剂和外源耗竭氨基酸的多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽(例如MHC I类或II类分子)特异性结合。
在一些实施方案中，aAPC能够抑制与aAPC接触的T细胞。在其他实施方案中，aAPC能够抑制与aAPC相互作用的T细胞。在进一步的实施方案中，抑制包含T细胞增殖的抑制、T细胞的无应答化或T细胞凋亡的诱导。
在一些方面，本公开提供了经工程化改造以激活调节性T细胞(Treg细胞)的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽(例如MHC I类或II类分子)特异性结合。在一些实施方案中，aAPC进一步呈递，例如在细胞表面上包含，外源Treg扩增多肽。
在某些实施方案中，本文提出的方面和实施方案的任一个的T细胞是CD4+ T细胞或CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，红系细胞包含外源多肽(例如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、外源耗竭氨基酸的多肽和外源Treg共刺激性多肽)，其中红系细胞任选地进一步包含第二外源多肽(例如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、外源耗竭氨基酸的多肽和外源Treg共刺激性多肽)是本文所述的外源多肽。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞。
本公开也应解释为涵盖本文所述的外源多肽(或编码其的DNA)的“突变体”，“衍生物”和“变体”，所述突变体、衍生物和变体是共刺激性配体、细胞因子、抗原(例如，肿瘤细胞、病毒和其他抗原)，其在一个或多个氨基酸中发生了改变(或当涉及编码其的核苷酸序列时，在一个或多个碱基对中发生了改变)，从而使所得的肽(或DNA)与本文所述的序列不同，但具有与本文公开的肽相同的生物学特性，因为该肽具有本发明的共刺激性配体、细胞因子、抗原等的生物学/生化特性(例如，在表达蛋白质的aAPC与T细胞接触的情况下，通过aAPC的表达介导T细胞的增殖或以其他方式影响T细胞)。使用本领域熟知的重组DNA方法(如例如描述于Sambrook and Russell(2001,Molecular Cloning,A LaboratoryApproach,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)和Ausubel et al.(2002,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY)中)，任何数量的规程可以用于生成本发明的蛋白质的突变体、衍生物或变体形式。通过改变编码多肽的DNA序列而在蛋白质或多肽中引入氨基酸变化的规程是本领域众所周知的，并且在这些和其他论文中也进行了描述。
本公开预期可以如本文所述制备表1-24中列出的蛋白质的功能片段或其变体并针对类似活性进行筛选，并且如果在本文所述的工程化红系细胞中表达则在下文是等同的。
一旦掌握了本文提供的教导，本领域技术人员将理解，本公开的aAPC不以任何方式限于任何特定的抗原、细胞因子、共刺激性配体、特异性结合共刺激性分子的抗体等。确切地，本公开涵盖了包含许多分子的aAPC，这些分子或是全部在单个启动子/调控序列的控制下表达，或是在超过一个此类序列的控制下表达。此外，本公开涵盖本公开的一种或多种aAPC的施用，其中各种aAPC编码不同的分子。也就是说，各种分子(例如，共刺激性配体、抗原、细胞因子等)可以顺式(即，在相同的aAPC中和/或由相同的连续核酸编码或在相同的aAPC内的单独的核酸分子上)或反式(即各种分子由不同的aAPC表达)起作用。
包含三种或更多种外源多肽的工程化红系细胞
在实施方案中，本文所述的工程化红系细胞包含三种或更多种，例如至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、200、500或1000种外源多肽。在实施方案中，本文所述的红系细胞的群体包含三种或更多种，例如至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、200、500、1000、2000或5000种外源多肽，例如，其中群体中的不同红系细胞包含不同的外源多肽，或者其中群体中的不同红系细胞包含多种不同的外源多肽。
平铺(tiling)
在一些实施方案中，第一外源抗原性多肽和第二外源抗原性多肽具有重叠的氨基酸序列。在某些实施方案中，aAPC经工程化改造以激活T细胞，其中aAPC包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，第一外源抗原性多肽和第二外源抗原性多肽，并且其中第一外源抗原性多肽和第二外源抗原性多肽具有重叠至少2个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，重叠在2个氨基酸和23个氨基酸之间，例如，重叠为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个氨基酸。在一些实施方案中，外源抗原性多肽的长度在8-10个氨基酸之间，并且重叠在6-8个氨基酸之间。在一些实施方案中，外源抗原性多肽的长度在14-20个氨基酸之间，并且重叠在12-18个氨基酸之间。以这种方式平铺多肽提供了更广泛的抗原识别。在上述方面和实施方案的一些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞。
用于平铺多肽的方法是本领域已知的，并且描述于例如在Harding等人中，其描述了在基于人CD4+ T细胞的增殖测定法中测试的15聚体多肽(重叠12个氨基酸)的开发和测试(Molecular Cancer Therapeutics,November 2005,Volume 4,Issue 11，以其整体通过引用并入本文)。Sticker等人描述了一种基于人细胞的方法，以鉴定任何蛋白质中的功能性CD4(+)T细胞表位(J Immunol Methods.2003Oct 1；281(1-2):95-108，以其整体通过引用并入本文)。
修饰
一种或多种外源蛋白质可以具有真核细胞，例如哺乳动物细胞，例如人细胞特征性的翻译后修饰。在一些实施方案中，一种或多种(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种)外源蛋白质被糖基化、磷酸化或两者。糖蛋白的体外检测可以使用过碘酸希夫(Periodicacid-Schiff,PAS)方法的修改在SDS-PAGE凝胶和Western印迹上完成。糖蛋白的细胞定位可以利用本领域已知的凝集素荧光缀合物来完成。磷酸化可以通过使用磷酸特异性抗体的Western印迹来评估。
翻译后修饰还包括与疏水基团的缀合(例如肉豆蔻酰化、棕榈酰化、异戊二烯化、异戊烯化或糖基磷脂酰肌醇化(glypiation))，与辅因子的缀合(例如脂酰化(lipoylation)、黄素部分(例如FMN或FAD)、血红素C附着、磷酸泛酰巯基乙胺化(phosphopantetheinylation)或亚视黄基希夫碱(retinylidene Schiff base)形成)、白喉酰胺形成、乙醇胺磷酸甘油附着、hypusine形成、酰化(例如O-酰化、N-酰化或S-酰化)、甲酰化、乙酰化、烷基化(例如甲基化或乙基化)、酰胺化、丁酰化、gamma-羧化、丙二酰化、羟基化、碘化、核苷酸添加(如ADP-核糖基化)、氧化、磷酸酯(O-连接)或氨基磷酸酯(phosphoramidate)(N-连接)形成(例如，磷酸化或腺苷酰化)、丙酰化(propionylation)、焦谷氨酸盐/酯(pyroglutamate)形成、S-谷胱甘肽化、S-亚硝基化、琥珀酰化、硫酸化、ISG酰化、SUMO酰化、泛素化、Neddylation或氨基酸的化学修饰(例如，瓜氨酸化、脱酰胺、eliminylation或氨甲酰化)、二硫键的形成、外消旋化(例如脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸或甲硫氨酸的)。在实施方案中，糖基化包括向精氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、羟基赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或色氨酸添加糖基基团，从而产生糖蛋白。在实施方案中，糖基化包括例如O-连接的糖基化或N-连接的糖基化。
在一些实施方案中，一种或多种外源多肽是融合蛋白，例如是与内源红细胞蛋白或其片段，例如跨膜蛋白，例如GPA或其跨膜片段的融合物。在一些实施方案中，一种或多种外源多肽与促进二聚化或多聚化的域融合，例如与第二融合外源多肽(其任选地包含二聚化域)融合。在一些实施方案中，二聚化域包含抗体分子的一部分，例如Fc域或CH3域。在一些实施方案中，第一和第二二聚化域包含突出-入-孔(knob-in-hole)突变(例如，T366Y突出和Y407T孔)以促进异二聚化。
拷贝数
在一些实施方案中，第一外源多肽和第二外源多肽具有按重量或拷贝数计的约1:1、从约2:1至1:2、从约5:1至1:5、从约10:1至1:10、从约20:1至1:20、从约50:1至1:50、从约100:1至1:100的丰度比。
在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少10个拷贝、100个拷贝、1,000个拷贝、5,000个拷贝10,000个拷贝、25,000个拷贝、50,000个拷贝或100,000个拷贝的第一外源多肽和第二外源多肽的每一种。在一些实施方案中，第一外源多肽的拷贝数比第二外源多肽的拷贝数大不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或者大不超过2、5、10、20、50、100、200、500或1000倍。在一些实施方案中，第二外源多肽的拷贝数比第一外源多肽的拷贝数大不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或者大不超过2、5、10、20、50、100、200、500或1000倍。在一些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞是有核细胞。
在一些实施方案中，第一外源多肽包含约50,000至约600,000个拷贝的第一外源多肽，例如约50,000、60,000、60,000、80,000、90,000、100,000、110,000、120,000、130,000、140,000、150,000、155,000、160,000、165,000、170,000、175,000、180,000、185,000、190,000、195,000、200,000、205,000、210,000、215,000、220,000、225,000、230,000、235,000、240,000、245,000、250,000、255,000、260,000、265,000、270,000、275,000、280,000、285,000、290,000、295,000、300,000、305,000、310,000、315,000、320,000、325,000、330,000、335,000、340,000、345,000、350,000、355,000、360,000、365,000、370,000、375,000、380,000、385,000、390,000、395,000、400,000、450,000、500,000、550,000、600,000个拷贝的第一多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含约50,000-600,000之间、约100,000-600,000之间、约100,000-500,000个之间、约100,000-400,000个之间、约100,000–150,000个之间、约150,000-300,000个之间或150,000-200,000个之间拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约75,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约100,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约125,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约150,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约175,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约200,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约250,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约300,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约400,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约500,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，第二外源多肽包含约50,000至约600,000个之间拷贝的第二外源多肽，例如约50,000、60,000、60,000、80,000、90,000、100,000、110,000、120,000、130,000、140,000、150,000、155,000、160,000、165,000、170,000、175,000、180,000、185,000、190,000、195,000、200,000、205,000、210,000、215,000、220,000、225,000、230,000、235,000、240,000、245,000、250,000、255,000、260,000、265,000、270,000、275,000、280,000、285,000、290,000、295,000、300,000、305,000、310,000、315,000、320,000、325,000、330,000、335,000、340,000、345,000、350,000、355,000、360,000、365,000、370,000、375,000、380,000、385,000、390,000、395,000、400,000、450,000、500,000、550,000、600,000个拷贝的第二多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含约50,000-600,000个之间、约100,000-600,000个之间、约100,000-500,000个之间、约100,000-400,000个之间、约100,000–150,000个之间、约150,000-300,000之间或150,000-200,000之间个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约75,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约100,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约125,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约150,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约175,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约200,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约250,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约300,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约400,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约500,000个拷贝的第二外源多肽。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞。在上述方面和实施方案的一些实施方案中，工程化红系细胞是有核细胞。
体内半衰期
在一些实施方案中，本文所述的外源多肽当包含在工程化红系细胞或去核细胞中或包含在工程化红系细胞或去核细胞上并施用于受试者时，与单独施用的相应外源多肽(即不在本文所述的细胞上或本文所述的细胞中)相比，其展示出延长的体内半衰期。在一些实施方案中，外源多肽的体内半衰期比其单独施用的相应外源多肽的体内半衰期或单独施用的相应聚乙二醇化形式的外源多肽的体内半衰期长。在一些实施方案中，外源多肽的体内半衰期约为约24小时和240天之间(例如24小时、36小时、48小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天、40天、41天、42天、43天、44天、45天、46天、47天、48天、49天、50天、51天、52天、53天、54天、55天、56天、57天、58天、59天、60天、61天、62天、63天、64天、65天、66天、67天、68天、69天、70天、71天、72天、73天、74天、75天、76天、77天、78天、79天、80天、81天、82天、83天、84天、85天、86天、87天、88天、89天、90天、91天、92天、93天、94天、95天、96天、97天、98天、99天、100天、101天、102天、103天、104天、105天、106天、107天、108天、109天、110天、111天、112天、113天、114天、115天、116天、117天、118天、119天、120天、121天、122天、123天、124天、125天、126天、127天、128天、129天、130天、131天、132天、133天、134天、135天、136天、137天、138天、139天、140天、141天、142天、143天、144天、145天、146天、147天、148天、149天、150天、151天、152天、153天、154天、155天、156天、157天、158天、159天、160天、161天、162天、163天、164天、165天、166天、167天、168天、169天、170天、171天、172天、173天、174天、175天、176天、177天、178天、179天、180天、181天、182天、183天、184天、185天、186天、187天、188天、189天、190天、191天、192天、193天、194天、195天、196天、197天、198天、919天、200天、201天、202天、203天、204天、205天、206天、207天、208天、209天、210天、211天、212天、213天、214天、215天、216天、217天、218天、219天、220天、221天、222天、223天、224天、225天、226天、227天、228天、229天、230天、231天、232天、233天、234天、235天、236天、237天、238天、239天或240天。在一些实施方案中，外源多肽的体内半衰期大于1天、2天、3天、5天、10天、25天、50天、75天、100天、125天、150天、175天、200天、225天、235天或250天。在一些实施方案中，外源多肽的体内半衰期为1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、一年或更多。
在一些实施方案中，本公开的aAPC在施用于受试者后驻留在循环中至少约1天至约240天(例如至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天、40天、41天、42天、43天、44天、45天、46天、47天、48天、49天、50天、51天、52天、53天、54天、55天、56天、57天、58天、59天、60天、61天、62天、63天、64天、65天、66天、67天、68天、69天、70天、71天、72天、73天、74天、75天、76天、77天、78天、79天、80天、81天、82天、83天、84天、85天、86天、87天、88天、89天、90天、91天、92天、93天、94天、95天、96天、97天、98天、99天、100天、101天、102天、103天、104天、105天、106天、107天、108天、109天、110天、111天、112天、113天、114天、115天、116天、117天、118天、119天、120天、121天、122天、123天、124天、125天、126天、127天、128天、129天、130天、131天、132天、133天、134天、135天、136天、137天、138天、139天140天、141天、142天、143天、144天、145天、146天、147天、148天、149天、150天、151天、152天、153天、154天、155天、156天、157天、158天、159天、160天、161天、162天、163天、164天、165天、166天、167天、168天、169天、170天、171天、172天、173天、174天、175天、176天、177天、178天、179天、180天、181天、182天、183天、184天、185天、186天、187天、188天、189天、190天、191天、192天、193天、194天、195天、196天、197天、198天、199天、200天、201天、202天、203天、204天、205天、206天、207天、208天、209天、210天、211天、212天、213天、214天、215天、216天、217天、218天、219天、220天、221天、222天、223天、224天、225天、226天、227天、228天、229天、230天、231天、232天、233天、234天、235天、236天、237天、238天、239天或240天。
在一些实施方案中，本公开的aAPC在aAPC通过脉管系统的循环期间呈递抗原性多肽。在一些实施方案中，本公开的aAPC在脾中呈递抗原性多肽。
基因编辑
在一些方面，本公开的特征在于制备免疫学相容的人工抗原呈递细胞(aAPC)的方法，其中aAPC包含表达外源抗原性多肽的工程化红系细胞，所述方法包括使aAPC与切割内源MHC核酸的核酸酶和至少一种gRNA接触，其中内源MHC核酸通过基因编辑途径得以修复并导致内源MHC核酸的表达水平降低，从而制备免疫学相容的aAPC。在一些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞是有核细胞。
在一些实施方案中，使用靶向一种或多种选择的DNA序列的核酸酶对细胞进行遗传修饰。此类方法可以用于在内源基因组基因座的选定位点诱导精确切割。使用可靶向的核酸酶例如在感兴趣的限定位点处将DNA插入基因组中，在基因组中替换或从基因组中去除的基因工程称为“基因组编辑”。此类核酸酶的实例包括锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、工程化大范围核酸酶归巢内切核酸酶和RNA导向核酸酶，如CRISPR(规律间隔成簇短回文重复序列)相关的(Cas)核酸酶，例如，衍生自II型细菌CRISPR/Cas系统(例如，Cas9)。
在一些实施方案中，首先使用CRISPR引入改变(即增加MHCI的内源表达)。然后，用于呈递的抗原也经由CRISPR引入并在内部进行加工。
在一些实施方案中，核酸酶包含DNA切割域和将核酸酶靶向特定DNA序列的DNA结合域(DBD)，从而允许核酸酶以序列特异性方式用于工程化改造基因组改变。DNA切割域可以在其靶向序列处或附近产生双链断裂(DSB)或切口。ZFN包含基于锌指(ZF)蛋白质的DBD选择或设计的DBD。ZF蛋白的DBD通过一个或多个锌指以序列特异性的方式结合DNA，所述锌指是氨基酸序列的区域，其结构通过锌离子的配位得以稳定。TALEN包含基于黄单胞菌属种(Xanthomonas spp.)的转录激活物样(TAL)效应物(TALE)的DBD选择或设计的DBD。ZFN或TALEN二聚体诱导刺激DNA损伤应答途径的靶向DNA DSB。设计的锌指域的结合特异性将ZFN导向特定的基因组位点。TALE含有多个33-35个氨基酸的重复域，其每一个都识别单个碱基对。像ZFN一样，TALEN诱导靶向的DSB，所述DSB激活DNA损伤应答途径并实现定制改变。工程化位点特异性核酸酶的DNA切割域可以包含来自天然存在的内切核酸酶如Fok1核酸内切酶或其变体的催化域。在一些实施方案中，可以使用具有设计为改善切割特异性和/或切割活性的突变的Fok1切割域变体(参见例如Guo,J.,et al.(2010)Journal of MolecularBiology 400(1):96-107；Doyon,Y.,et al.,(2011)Nature Methods 8:74-79)。大范围核酸酶是序列特异性内切核酸酶，其特征在于大的识别位点(12至约40个碱基对的双链DNA序列)。在给定的基因组中，位点通常出现不超过一次。可以通过引入核酸酶的序列改变(例如在DNA结合域中)，然后选择能够切割天然识别位点的变体的功能性酶，或者通过将来自不同核酸酶的蛋白质域缔合或融合来改变大范围核酸酶的特异性。
在一些实施方案中，RNA导向核酸酶可以用于进行基因组编辑。例如，考虑使用基于CRISPR/Cas的系统。在一些实施方案中，将Cas核酸酶如Cas9(例如酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)或脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningiditis)的Cas9或其变体))与包含与感兴趣的序列互补的序列的引导RNA一起引入细胞(RNA有时称为单一引导RNA)。互补区域可以是例如约20个核苷酸长。Cas核酸酶，例如Cas9，通过引导RNA引导至特定的感兴趣的DNA序列。可以对引导RNA进行工程化改造以使其与基因组中的感兴趣的靶序列(例如，任何感兴趣的基因或基因间区域中的序列)具有互补性。Cas蛋白，例如Cas9的核酸酶活性切割DNA，其可以使基因失去能力或将其切开，从而允许插入不同的DNA序列。在一些实施方案中，将包含与不同基因，例如2、3、4、5或更多个基因互补的序列的多个sgRNA顺序或一起引入同一细胞中。在一些实施方案中，多个基因中的改变可以由此在同一步骤中产生。
通常，将基于核酸酶的系统用于基因工程，例如基因组编辑，需要将核酸酶引入细胞中并将细胞在一定条件下维持一段时间，所述条件和时间适合于核酸酶切割细胞的DNA。在CRISP/Cas系统的情况下，还引入了引导RNA。通常通过引入编码核酸酶的核酸将核酸酶引入细胞中。核酸可以可操作地与能够指导在细胞中表达的启动子连接，并且可以在质粒或其他载体中被引入细胞。在一些实施方案中，可以引入编码核酸酶的mRNA。在一些实施方案中，可以引入核酸酶本身。可以直接引入sgRNA(通过诸如转染的方法)或者可以通过从核酸构建体(如表达载体)表达sgRNA来引入sgRNA。在一些实施方案中，sgRNA和Cas蛋白从已经被引入细胞中的单一表达载体表达，或者在一些实施方案中，从不同的表达载体表达。在一些实施方案中，将包含与不同基因，例如2、3、4、5或更多个基因互补的序列的多个sgRNA单独或者一起作为RNA或者通过将编码sgRNA的一种或多种核酸构建体引入细胞中用于细胞内转录来引入同一细胞中。
在由核酸酶切割后，靶基因座(例如，在细胞的基因组中)可以经历DNA损伤修复的两个主要途径之一，即非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)。在不存在与在切割位点侧翼的序列包含足够同源性的合适的修复模板以刺激HDR的情况下(参见下面的讨论)，DSB通过NHEJ重新连接，这可能导致插入或缺失。NHEJ可以用于例如工程化改造基因敲除或生成活性改变的蛋白质。例如，外显子中的插入或缺失可以导致移码突变或提前终止密码子。可以生成两个或多个DSB，以在基因组中产生更大的缺失。
在一些实施方案中，除核酸酶之外，还将包含待在切割的位置处插入基因组中的感兴趣的序列的核酸(例如质粒或线性DNA)引入细胞中。在一些实施方案中，将感兴趣的序列插入到基因中。感兴趣的序列可以至少部分替换基因。在一些实施方案中，核酸包含与切割位点侧翼的序列同源的序列，从而刺激同源定向修复。在一些实施方案中，与切割位点处或附近的细胞基因组中存在的序列相比，核酸含有期望的改变。包含至少部分引入基因组中的序列的核酸，例如包含同源序列和期望的改变的核酸序列可以称为“供体序列”。供体序列可以在断裂位点处至少部分地物理整合到基因组中，或者可以用作修复断裂的模板，导致将供体中存在的全部或部分核苷酸序列引入到细胞的基因组中。因此，可以改变细胞基因组中的序列，并且在某些实施方案中，可以将其转化为供体核酸中存在的序列。在一些实施方案中，供体序列可以包含在环状DNA(例如质粒)、线性双链DNA(例如线性化质粒或PCR产物)或单链DNA，例如单链寡核苷酸中。在一些实施方案中，供体序列与基因组中靶位点的任一侧或每一侧具有约10-25bp和约50-100bp之间的同源性。在一些实施方案中，可以使用更长的同源序列，例如，在约100-500bp之间，直至约1-2kB，或更多。在一些实施方案中，将改变引入基因的一个等位基因中。在一些实施方案中，将第一改变引入基因的一个等位基因中，并且将不同的改变引入另一等位基因中。在一些实施方案中，将相同的改变引入两个等位基因中。在一些实施方案中，可以在单个步骤中对两个等位基因或靶位点(或更多个)进行遗传修饰。在一些实施方案中，可以在单独的步骤中对两个等位基因或靶位点(或更多个)进行遗传修饰。
设计、生成和使用ZFN和/或TALEN的方法描述于例如WO2011097036；Urnov,FD,etal.,Nature Reviews Genetics(2010),11:636-646；Miller JC,et al.,Nat Biotechnol.(2011)29(2):143-8；Cermak,T.,et al.Nucleic Acids Research(2011)39(12):e82,Sanjana,N.E.et al.A transcription activator-like effector toolbox for genomeengineering.Nat Protoc 7,171-192(2012)及以上任一个中的参考文献。用于基因组工程化的基于ZFN、TALEN和CRISPR/Cas的方法综述于Gaj,T.,et al.,TrendsBiotechnol.2013Jul；31(7):397-405.Epub 2013May 9中。CRISPR/Cas系统在基因组工程化中的用途描述于例如Cong L,et al.Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.Science.2013；339(6121):819-23；Mali P,et al.,RNA-guided humangenome engineering via Cas9.Science.2013；339(6121):823-6；Wang,H.et al.One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.Cell 153,910-918(2013)；Ran,F.A.et al.DoubleNicking by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome EditingSpecificity.Cell 154,1380-1389(2013)；Mali,P.,et al.,Nat Methods.2013；10(10):957-63；Ran,FA,Nat Protoc.2013；8(11):2281-308中。在一些实施方案中，仅切割dsDNA的一条链的核酸酶(切口酶)可以用于刺激HDR而不激活NHEJ修复途径。可以通过灭活双链切割所需的ZFN或TALEN二聚体中的一个核酸酶单体的催化活性或灭活Cas蛋白的催化域来产生切口酶。例如，催化残基之一(RuvC核酸酶域中的D10和HNH核酸酶域中的H840)的突变，例如突变为丙氨酸(D10A、H840A)，将Cas9转化为DNA切口酶。
在一些实施方案中，基于CRISP/Cas的系统可以用于调控基因表达。例如，引导RNA与缺乏核酸内切酶活性的无催化活性的Cas9的共表达生成了DNA识别复合物，其可以特异性地干扰转录延伸、RNA聚合酶结合或转录因子结合。该系统有时称为CRISPR干扰(CRISPRi)，其可以有效地抑制哺乳动物细胞中靶定基因的表达(Qi,S.,et al.,Cell,2013；152(5):1173-83；Larson,MH,et al,Nat Protoc.2013；8(l l):2180-96)。通过将多种效应物域中的任一个附接至无催化活性的Cas9，可以产生可以用于实现对基因表达和/或DNA修饰的序列特异性控制的嵌合Cas9蛋白。合适的效应物域包括例如转录激活域(如包含VP16反式激活域例如VP64的那些)、转录共激活域、转录抑制性或共抑制性域、蛋白质-蛋白质相互作用域、酶域等。引导RNA将嵌合Cas9蛋白引导至基因组中的感兴趣的位点(例如，在表达控制元件(如启动子)中或附近)，从而效应物域发挥作用如激活或抑制转录活性(参见例如，Gilbert LA,et al..Cell.2013；154(2):442-51；Maeder ML,et a..,NatMethods,2013；10(10):977-9)。适当的效应物域可以是天然存在的蛋白质中存在的任何效应物域，其能够进行感兴趣的功能(例如，抑制或激活转录)。
可以选择或分析已经历遗传工程化过程的细胞，以鉴定或分离表达期望的重组基因产物或缺乏已经经由基因工程失去能力的内源基因的表达或具有任何期望的遗传改变的细胞。例如，在一些实施方案中，供体序列或用于递送供体序列的载体可以包含可选择标志物，其可以用于选择已经将包含可选择标志物的供体序列的至少一部分掺入其基因组中的细胞。在一些实施方案中，不使用选择。在一些实施方案中，可以例如通过Southern印迹来筛选细胞，以鉴定具有期望的遗传改变的那些细胞或克隆。如果期望，可以测试细胞的重组基因产物或内源基因产物的表达水平或活性，或者测试与重组或内源基因产物相关的一种或多种功能特性或通过重组或内源基因产物赋予的一种或多种功能特性，或任何其他感兴趣的标准。合适的分析方法是本领域普通技术人员已知的，并且包括例如Western印迹、流式细胞术、FAGS、免疫荧光显微术、ELISA测定法、基于亲和力的方法，其中细胞与能够与感兴趣的蛋白质结合的试剂(其标记或保留表达该蛋白质的细胞)等接触。可以基于重组基因产物的身份、内源基因产物和/或感兴趣的功能或特性来选择功能测定法。例如，功能特性可以是与感兴趣的抗原结合的能力或针对表达感兴趣的抗原的靶细胞施加细胞毒性的能力。可以例如通过PGR、Southern印迹或测序来分析细胞，以确定插入的DNA序列的数目、其位置，和/或确定是否已经发生所期望的基因组改变。具有期望的改变、表达水平和/或功能特性的一种或多种细胞可以经鉴定、繁殖、扩增。细胞或它们的后代可以用于生成细胞系，进行分类(sortagging)和/或存储以备将来使用。
工程化红系细胞的群体
在一方面，本发明的特征在于包含本发明的工程化红系细胞的细胞群体，例如多个工程化红系细胞或工程化红系细胞群体。在各种实施方案中，工程化红系细胞群体包含主要去核的细胞、主要有核的细胞或去核和有核细胞的混合物。在此类细胞群体中，去核细胞可以包含网织红细胞、红细胞或网织红细胞和红细胞的混合物。在一些实施方案中，去核细胞是网织红细胞。在一些实施方案中，去核细胞是红细胞。
在一些实施方案中，工程化红系细胞群体基本上由去核细胞组成。在一些实施方案中，工程化红系细胞群体主要或基本上包含去核细胞。例如，在一些实施方案中，工程化红系细胞的群体包含至少约80％或更多的去核细胞。在一些实施方案中，本文提供的群体包含至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99或约100％的去核细胞。在一些实施方案中，本文提供的群体包含大于约80％的去核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞的群体包含大于约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的去核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞的群体包含约80％和约100％之间的去核细胞，例如约80％和约95％、约80％和约90％、约80％和约85％、约85％和约100％、约85％和约95％、约85％和约90％、约90％和约100％、约90％和约95％或约95％和约100％之间的去核细胞。
在一些实施方案中，工程化红系细胞的群体包含小于约20％的有核细胞。例如，在实施方案中，工程化红系细胞的群体包含小于约1％、约2％、约3％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％或小于约20％的有核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞的群体包含小于约1％的有核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞的群体包含小于约2％的有核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞的群体包含小于约3％的有核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞的群体包含小于约4％的有核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞的群体包含小于约5％的有核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞的群体包含小于约10％的有核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞的群体包含小于约15％的有核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞的群体包含0％和20％之间的有核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞的群体包含约0％和20％之间的有核细胞，例如约0％和19％之间、约0％和15％之间、约0％和10％之间、约0％和5％之间、约0％和4％之间、约0％和3％之间、约0％和2％之间的有核细胞，或约5％和20％之间、约10％和20％之间或约15％和20％之间的有核细胞。
在一些实施方案中，本公开的特征在于本发明的工程化红系细胞的群体，其中工程化红系细胞的群体包含小于20％的有核细胞和至少80％的去核细胞，或包含小于15％的有核细胞和至少85％的有核细胞，或包含小于10％的有核细胞和至少90％的去核细胞，或包含小于5％的有核细胞和至少95％的去核细胞。在一些实施方案中，本公开的特征在于本发明的工程化红系细胞的群体，其中工程化红系细胞的群体包含约0％的有核细胞和约100％的去核细胞、约1％的有核细胞和约99％的去核细胞、约2％的有核细胞和约98％的去核细胞、约3％的有核细胞和约97％的去核细胞、约4％的有核细胞和约96％的去核细胞、约5％的有核细胞和约95％的去核细胞、约6％的有核细胞和约94％的去核细胞、约7％的有核细胞和约93％的去核细胞、约8％的有核细胞和约92％的去核细胞、约9％的有核细胞和约91％的去核细胞、约10％的有核细胞和约90％的去核细胞、约11％的有核细胞和约89％的去核细胞、约12％的有核细胞和约88％的去核细胞、约13％的有核细胞和约87％的去核细胞、约14％的有核细胞和约86％的去核细胞、约85％的有核细胞和约85％的去核细胞、约16％的有核细胞和约84％的去核细胞、约17％的有核细胞和约83％的去核细胞、约18％的有核细胞和约82％的去核细胞、约19％的有核细胞和约81％的去核细胞或约20％的有核细胞和约80％的去核细胞。
在另一个实施方案中，工程化红系细胞群体包含主要或基本上有核的细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞群体基本上由有核细胞组成。在各个实施方案中，工程化红系细胞群体中的有核细胞是红细胞(或完全成熟的红细胞)前体细胞。在实施方案中，红细胞前体细胞选自下组：多能造血干细胞(HSC)、多能髓样祖细胞、CFU-S细胞、BFU-E细胞、CFU-E细胞、原正成红细胞、嗜碱性正成红细胞、多染性正成红细胞或正染性正成红细胞。
在一些实施方案中，红细胞前体细胞例如造血干细胞来自O-阴性供体。
在某些实施方案中，工程化红系细胞的群体包含至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％的有核细胞。
应理解的是，在本发明的工程化的红系细胞的制备期间，细胞的某些级分可以不与外源多肽缀合或被转导以表达外源多肽。因此，在一些实施方案中，本文提供的工程化红系细胞群体包含工程化红系细胞和未经修饰的红系细胞的混合物，即，该群体中的一些细胞的级分将不包含、不呈递或不表达外源多肽。例如，在各种实施方案中，工程化红系细胞的群体可以包含至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的工程化红系细胞，其中群体中剩余的红系细胞未经工程化。在实施方案中，工程化红系细胞的单一单位剂量可以在各种实施方案中包含至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的工程化红系细胞，其中剂量中剩余的红系细胞未经工程化。
III.制备人工抗原呈递细胞的方法
本公开考虑了各种制备aAPC的方法。
制备包含外源试剂(例如多肽)的去核红系细胞的方法描述于例如国际申请公开号WO2015/073587和WO2015/153102中，其每一篇均以其整体通过引用并入。
在一些实施方案中，使造血祖细胞，例如CD34+造血祖细胞(例如，人(例如成年人类)或小鼠细胞)与编码一种或多种外源多肽的一种或多种核酸接触，并允许细胞在培养中扩增和分化。在一些实施方案中，CD34+细胞被永生化，例如包含人乳头瘤病毒(HPV；例如HPV 16型)E6和/或E7基因。在一些实施方案中，永生化CD34+造血祖细胞是BEL-A细胞系细胞(参见Trakarnasanga et al.(2017)Nat.Commun.8:14750)。在美国专利号9,951,350和8,975,072中描述了其他永生化的CD34+造血祖细胞。在一些实施方案中，使永生化的CD34+造血祖细胞与编码一种或多种外源多肽的一种或多种核酸接触，并允许细胞在培养中扩增和分化。
在一个方面，本公开的特征在于一种制备免疫学相容的人工抗原呈递细胞(aAPC)的方法，其中aAPC包含呈递(例如在细胞表面上包含)外源抗原性多肽的红系细胞或去核细胞，该方法包括使有核细胞与切割内源核酸的核酸酶和至少一种gRNA接触，以导致内源抗原呈递多肽、内源锚多肽或内源共刺激性多肽的表达；或导致内源微小RNA表达的抑制；将编码外源抗原性多肽的外源核酸引入有核细胞中；并在适于通过内源抗原呈递多肽表达和呈递外源抗原性多肽以及去核的条件下培养有核细胞，从而制备去核细胞，从而制备免疫学相容的aAPC。本文描述了制备aAPC的方法，但是应当理解，这些方法是非限制性的。
工程化红系细胞的物理特征
在一些实施方案中，本文所述的红系细胞具有本文所述的一种或多种(例如2、3、4种或更多种)物理特性，例如渗透脆性、细胞大小、血红蛋白浓度或磷脂酰丝氨酸含量。尽管不希望受理论束缚，但在一些实施方案中，表达外源蛋白质的工程化红系细胞具有与野生型未经处理的红细胞类似的物理特征。相反，低渗负荷的红系细胞有时表现出异常的物理特性，例如渗透脆性增加、细胞大小改变、血红蛋白浓度降低或细胞膜外叶上的磷脂酰丝氨酸水平增加。
在一些实施方案中，工程化红系细胞，例如去核细胞，包含由外源核酸编码的外源蛋白质，所述外源核酸未被细胞保留、尚未纯化或尚未完全存在于红系细胞外。在一些实施方案中，红系细胞在缺乏稳定剂的组合物中。
渗透脆性
在一些实施方案中，工程化红系细胞(例如去核细胞)表现出与不包含外源多肽的分离的未培养的红系细胞基本上相同的渗透膜脆性。在一些实施方案中，工程化红系细胞群体在0.3％、0.35％、0.4％、0.45％或0.5％NaCl下具有小于50％细胞裂解的渗透脆性。可以使用WO 2015/073587(以其整体通过引用并入本文)的实施例59的方法测定渗透脆性。
细胞大小
在一些实施方案中，工程化红系细胞(例如去核细胞)具有与野生型未处理的红系细胞近似的直径或体积。在一些实施方案中，红系细胞群体具有约4、5、6、7或8微米的平均直径，并且任选地，群体的标准差小于1、2或3微米。在一些实施方案中，一种或多种红系细胞具有约4-8、5-7或约6微米的直径。在一些实施方案中，红系细胞的直径小于约1微米，大于约20微米，在约1微米和约20微米之间、在约2微米和约20微米之间、在约3微米和约20微米之间、在约4微米和约20微米之间、在约5微米和约20微米之间、在约6微米和约20微米之间、在约5微米和约15微米之间、或在约10微米和约30微米之间。在一些实施方案中，使用Advia 120血液系统测量细胞直径。
在一些实施方案中，红系细胞的平均红细胞体积的体积大于10fL、20fL、30fL、40fL、50fL、60fL、70fL、80fL、90fL、100fL、110fL、120fL、130fL、140fL、150fL、或大于150fL。在一些实施方案中，红系细胞的平均红细胞体积小于30fL、40fL、50fL、60fL、70fL、80fL、90fL、100fL、110fL、120fL、130fL、140fL、150fL、160fL、170fL、180fL、190fL、200fL、或小于200fL。在一些实施方案中，红系细胞的平均红细胞体积在80-100、100-200、200-300、300-400或400-500飞升(fL)之间。在一些实施方案中，红系细胞群体具有此段落所列出的平均红细胞体积，并且群体的标准差小于50fL、40fL、30fL、20fL、10fL、5fL或2fL。在一些实施方案中，使用血液学分析仪(例如，Coulter计数器)测量平均红细胞体积。
血红蛋白浓度
在一些实施方案中，工程化红系细胞(例如去核细胞)具有与野生型未经处理的红系细胞类似的血红蛋白含量。在一些实施方案中，红系细胞包含超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或超过10％的胎儿血红蛋白。在一些实施方案中，红系细胞包含至少约20、22、24、26、28或30pg，且任选地高达约30pg的总血红蛋白。在一些实施方案中，使用WO2015/073587(以其整体通过引用并入本文)的实施例33的德拉布坎(Drabkin’s)试剂方法测定血红蛋白水平。
磷脂酰丝氨酸含量
在一些实施方案中，工程化红系细胞(例如如本文所述的人工抗原呈递细胞或去核细胞)在其细胞膜的外叶上具有与野生型未处理的红系细胞大致相同的磷脂酰丝氨酸含量。磷脂酰丝氨酸主要位于野生型未处理的红系细胞细胞膜的内叶上，并且低渗负荷可以导致磷脂酰丝氨酸分布至它可以引发免疫应答的外叶中。在一些实施方案中，工程化红系细胞(例如如本文所述的人工抗原呈递细胞)或去核细胞的群体包含对膜联蛋白V染色呈阳性的少于约30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的细胞。在一些实施方案中，通过染色优先结合PS的膜联蛋白-V-FITC和通过流式细胞术测量FITC荧光，例如使用WO 2015/073587(以其整体通过引用并入本文)的实施例54的方法，来评估磷脂酰丝氨酸暴露。
其他特征
在一些实施方案中，工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞，或者工程化红系细胞或工程化去核细胞的群体包含一种或多种(例如全部)内源GPA(C235a)、转铁蛋白受体(CD71)、Band 3(CD233)或整联蛋白alpha4(C49d)。可以例如如国际申请公开号WO2018/009838(以其整体通过引用并入本文)的实施例10中所述测量这些蛋白质。GPA阳性细胞和Band 3阳性细胞的百分比通常在红系细胞成熟期间增加，而整联蛋白alpha4阳性的百分比通常在整个成熟期间保持很高。
在一些实施方案中，红系细胞的群体包含对GPA呈阳性的至少约50％、60％、70％、80％、90％或95％(并且任选地高达90％或100％)的细胞。在一些实施方案中，使用FACS检测GPA的存在。
在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含至少约50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的GPA+(即CD235a+)细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含约50％和约100％之间(例如，从约60％和约100％、从约65％和约100％、从约70％和约100％、从约75％至约100％、从约80％至约100％、从约85％至约100％、从约90％至约100％、从约95％至约100％、从约75％至约99％、从约80％至约99％、从约85％至约99％、从约90％至约99％、从约95％至约99％、从约75％至约95％、从约80％至约95％、从约85％至约95％、从约90％至约95％、从约95％至约98％)的GPA+细胞。在一些实施方案中，使用FACS检测GPA的存在。
在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含至少约50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％CD71+细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含约70％和约100％之间(例如，从约75％至约100％、从约80％至约100％、从约85％至约100％、从约90％至约100％、从约95％至约100％、从约75％至约99％、从约80％至约99％、从约85％至约99％、从约90％至约99％、从约95％至约99％、从约75％至约95％、从约80％至约95％、从约85％至约95％、从约90％至约95％、从约95％至约98％)CD71+细胞。在一些实施方案中，使用FACS检测CD71(转铁蛋白受体)的存在。
在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含至少约50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％CD233+细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含约70％和约100％之间(例如，从约75％至约100％、从约80％至约100％、从约85％至约100％、从约90％至约100％、从约95％至约100％、从约75％至约99％、从约80％至约99％、从约85％至约99％、从约90％至约99％、从约95％至约99％、从约75％至约95％、从约80％至约95％、从约85％至约95％、从约90％至约95％、从约95％至约98％)CD233+细胞。在一些实施方案中，使用FACS检测CD233(Band 3)的存在。
在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含至少约50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％CD47+细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含约70％和约100％之间(e.g.、从约75％至约100％、从约80％至约100％、从约85％至约100％、从约90％至约100％、从约95％至约100％、从约75％至约99％、从约80％至约99％、从约85％至约99％、从约90％至约99％、从约95％至约99％、从约75％至约95％、从约80％至约95％、从约85％至约95％、从约90％至约95％、从约95％至约98％)CD47+细胞。在一些实施方案中，使用FACS检测CD47(整联蛋白相关蛋白)的存在。
在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含至少约50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％CD36-(CD36阴性)细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含约70％和约100％之间(例如，从约75％至约100％、从约80％至约100％、从约85％至约100％、从约90％至约100％、从约95％至约100％、从约75％至约99％、从约80％至约99％、从约85％至约99％、从约90％至约99％、从约95％至约99％、从约75％至约95％、从约80％至约95％、从约85％至约95％、从约90％至约95％、从约95％至约98％)CD36-(CD36阴性)细胞。在一些实施方案中，使用FACS检测CD36的存在。
在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含至少约50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％CD34-(CD34阴性)细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含约70％和约100％之间(例如，从约75％至约100％、从约80％至约100％、从约85％至约100％、从约90％至约100％、从约95％至约100％、从约75％至约99％、从约80％至约99％、从约85％至约99％、从约90％至约99％、从约95％至约99％、从约75％至约95％、从约80％至约95％、从约85％至约95％、从约90％至约95％、从约95％至约98％)CD34-(CD34阴性)细胞。在一些实施方案中，使用FACS检测CD34的存在。
在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含至少约50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％CD235a+/CD47+/CD233+细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含约70％和约100％之间(e.g.、从约75％至约100％、从约80％至约100％、从约85％至约100％、从约90％至约100％、从约95％至约100％、从约75％至约99％、从约80％至约99％、从约85％至约99％、从约90％至约99％、从约95％至约99％、从约75％至约95％、从约80％至约95％、从约85％至约95％、从约90％至约95％、从约95％至约98％)CD235a+/CD47+/CD233+细胞。
在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含至少约50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％CD235a+/CD47+/CD233+/CD34-/CD36-细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含约70％和约100％之间(例如，从约75％至约100％、从约80％至约100％、从约85％至约100％、从约90％至约100％、从约95％至约100％、从约75％至约99％、从约80％至约99％、从约85％至约99％、从约90％至约99％、从约95％至约99％、从约75％至约95％、从约80％至约95％、从约85％至约95％、从约90％至约95％、从约95％至约98％)CD235a+/CD47+/CD233+/CD34-/CD36-细胞。
在一些实施方案中，包含红系细胞的工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的棘红细胞(echinocytes)。
在一些实施方案中，包含红系细胞的工程化红系细胞(例如，如本文所述的人工抗原呈递细胞)的群体包含小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的棘红细胞。
在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的核细胞(pyrenocyte)。
在一些实施方案中，红系细胞是去核的，例如本文所述的用作治疗制剂的包含红系细胞的细胞群体大于50％、60％、70％、80％、90％去核。在一些实施方案中，细胞(例如红系细胞)含有非功能性核，例如已经失活的。在一些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞是有核细胞。
分离红细胞
可以使用各种方法来分离成熟的红细胞，如例如，细胞洗涤器、连续流动细胞分离器、密度梯度分离、荧光激活细胞分选(FACS)、Miltenyi免疫磁性耗竭(MACS)或这些方法的组合(参见例如，van der Berg et al.,Clin.Chem.33:1081-1082(1987)；Bar-Zvi etal.,J.Biol.Chem.262:17719-17723(1987)；Goodman et al.,Exp.Biol.Med.232:1470-1476(2007))。
可以通过简单的离心从全血中分离出红细胞(参见例如，van der Berg et al.,Clin.Chem.33:1081-1082(1987))。例如，可以将EDTA抗凝全血在4℃下以800xg离心10分钟。去除富含血小板的血浆和血沉棕黄层，并用等渗盐溶液(NaCl，9g/L)将红细胞洗涤三次。
或者，可以使用密度梯度离心和各种分离介质，如例如Ficoll、Hypaque、Histopaque、Percoll、Sigmacell或其组合，来分离红细胞。例如，一定体积的Histopaque-1077放置在等体积的Histopaque-1119的顶部。将等体积的等渗盐溶液(NaCl，9g/L)中1:1稀释的EDTA抗凝全血分层放置在Histopaque的顶部，并将样品在室温下以700xg离心30分钟。在这些条件下，粒细胞迁移到1077/1119界面，淋巴细胞、其他单核细胞和血小板保留在血浆/1077界面，并且红细胞沉淀。用等渗盐溶液将红细胞洗涤两次。
或者，可以通过使用Percoll阶梯梯度离心分离红细胞(参见例如，Bar-Zvi etal.,J.Biol.Chem.262:17719-17723(1987))。例如，将新鲜血液与含有75mM柠檬酸钠和38mM柠檬酸的抗凝溶液混合，并且在Hepes缓冲盐水中短暂洗涤细胞。通过用α-纤维素和Sigmacell(1：1)的混合物吸附来去除白细胞和血小板。通过在Sorvall SS34转子中通过45/75％Percoll阶梯梯度以2500rpm离心10分钟，进一步从网织红细胞和残留的白细胞中分离出红细胞。红细胞在沉淀中回收，而网织红细胞带在45/75％界面处，其余白细胞带在0/45％界面处。通过在Hepes缓冲盐水中进行几次洗涤将Percoll从红细胞中去除。其他可以用于产生密度梯度以分离红细胞的材料包括OPTIPREP，一种60％的碘克沙醇水溶液(来自Axis-Shield,Dundee,Scotland)。
例如，可以使用流式细胞术将红细胞与网织红细胞分开(参见例如，Goodman elal.,Exp.Biol.Med.232:1470-1476(2007))。在这种情况下，将全血离心(550xg，20分钟，25℃)以从血浆中分离细胞。将细胞沉淀重悬于磷酸盐缓冲盐水溶液中，并进一步在Ficoll-Paque(1.077密度)上进行分级分离，例如，通过离心(400xg，30分钟，25℃)将红细胞与白细胞分离。将得到的细胞沉淀重悬于补充有10％胎牛血清的RPMI中，并基于大小和粒度在FACS仪器，如例如Becton Dickinson FACSCalibur(BD Biosciences,Franklin Lakes,N.J.,USA)上分类。
可以通过免疫磁性耗竭分离红细胞(参见例如，Goodman,el al.,(2007)Exp.Biol.Med.232:1470-1476)。在这种情况下，具有细胞类型特异性抗体的磁珠用于消除非红细胞。例如，使用本文所述的密度梯度将红细胞与大多数其他血液组分分离，然后对任何残留的网织红细胞进行免疫磁性耗竭。在25℃下用人抗体血清将细胞预处理20分钟，然后用针对网织红细胞特异性抗原(如CD71和CD36)的抗体进行处理。抗体可以直接附着于磁珠或与PE缀合，其与例如带有抗PE抗体的磁珠反应。抗体-磁珠复合物能够选择性地从例如红细胞群体中提取残留的网织红细胞。
还可以使用单采血液分离术(apheresis)分离红细胞。单采血液分离术的过程涉及从患者或供体中取出全血，使用离心或细胞分选术分离血液组分，去除一个或多个分离部分，并将剩余组分输回患者或供体中。当前有许多仪器用于此目的，如例如来自Baxter的Amicus和Alyx仪器(Deerfield,Ill.,USA)、来自Gambro BCT的Trima Accel仪器(Lakewood,Colo.,USA)以及来自Haemonetics的MCS+9000仪器(Braintree,Mass.,USA)。为了达到适当的细胞纯度，可能需要另外的纯化方法。
网织红细胞是未成熟的红细胞，并占人体中红细胞的约1％。网织红细胞在骨髓中发育并成熟。一旦释放到循环中，网织红细胞迅速经历终末分化为成熟的红细胞。像成熟的红细胞一样，网织红细胞也没有细胞核。与成熟的红细胞不同，网织红细胞保持进行蛋白质合成的能力。在一些实施方案中，aAPC包含去核红细胞。
基于网织红细胞成熟时细胞密度的差异，可以从外周血中分离出不同龄的网织红细胞。网织红细胞可以通过使用各种密度梯度的差异离心从外周血中分离出来。例如，Percoll梯度可以用于分离网织红细胞(参见例如，Noble el al.,Blood 74:475-481(1989))。通过将Percoll(Sigma-Aldrich,Saint Louis,Mo.,USA)稀释至10mM三乙醇胺、117mM NaCl、5mM葡萄糖和1.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的最终浓度制备密度为1.096和1.058g/ml的无菌等渗Percoll溶液。这些溶液的渗透压在295至310mOsm之间。例如，将5毫升的第一Percoll溶液(密度1.096)添加到无菌的15ml锥形离心管中。例如，将2毫升的第二Percoll溶液(密度1.058)放置在较高密度的第一Percoll溶液上。2至4毫升的全血放置在试管顶部。将试管在带有外摆试管架(swing-out tube holder)的冷冻离心机中以250xg离心30分钟。网织红细胞和一些白细胞迁移到两个Percoll层之间的界面。将界面处的细胞转移至新试管中，并用具有5mM葡萄糖、0.03mM叠氮化钠和1mg/ml BSA的磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤两次。在尺寸排阻柱上的PBS中通过色谱法去除残留的白细胞。
或者，可以使用免疫磁分离方法通过阳性选择来分离网织红细胞(参见例如，Brunet al.,Blood 76:2397-2403(1990))。该方法利用了成熟前网织红细胞表面相对于红细胞表达的大量转铁蛋白受体。包被有针对转铁蛋白受体的抗体的磁珠可以用于从混合的血细胞群体中选择性分离网织红细胞。针对多种哺乳动物物种(包括人)的转铁蛋白受体的抗体可从商业来源获得(例如，Affinity BioReagents,Golden,Colo.,USA；Sigma-Aldrich,Saint Louis,Mo.,USA)。转铁蛋白抗体可以直接与磁珠连接。或者，转铁蛋白抗体可以经由第二抗体间接与磁珠连接。例如，可以将针对人转铁蛋白的小鼠单克隆抗体10D2(AffinityBioReagents,Golden,Colo.,USA)与包被有绵羊抗小鼠免疫球蛋白G(Dynal/Invitrogen,Carlsbad,Calif.,USA)的免疫磁珠混合。然后将免疫磁珠与白细胞耗竭的红细胞级分温育。将珠子和红细胞在22℃下温和混合温育60-90分钟，然后使用磁场将附着有网织红细胞的珠子分离。可以使用例如DETACHaBEAD溶液(来自Invitrogen,Carlsbad,Calif.,USA)从磁珠中去除分离的网织红细胞。或者，可以使用本文所述的方法从CD34+造血干细胞的体外生长和成熟中分离网织红细胞。
终末分化的去核红细胞可以基于其DNA含量与其他细胞分离。在非限制性实例中，首先用重要的DNA染料如Hoechst 33342(Invitrogen Corp.)标记细胞。Hoechst 33342是与双链DNA结合时发出蓝色荧光的渗透细胞的核复染物。培养物中未分化的前体细胞、巨噬细胞或其他有核细胞通过Hoechst 33342染色，而去核红细胞则为Hoechst阴性。可以通过使用荧光激活的细胞分选仪或其他细胞分选技术从去核红细胞中分离出Hoechst阳性细胞。可以通过透析或其他合适的方法从分离的红细胞中去除Hoechst染料。
本文所述多肽的媒介物
尽管在本文的许多实施方案中，一种或多种(例如，两种或更多种)外源多肽位于去核红系细胞上或去核红系细胞中，但应理解，本文所述的任何多肽或外源多肽的组合也可以位于另一个媒介物上或另一个媒介物中。媒介物可以包含例如细胞、红系细胞、小体(corpuscle)、纳米颗粒、微团(micelle)、脂质体或外泌体。例如，在一些方面，本公开提供了媒介物(例如细胞、红系细胞、小体、纳米颗粒、微团、脂质体或外泌体)，其在其表面上包含本文所述的一种或多种试剂。在一些实施方案中，一种或多种试剂包含选自表1或14-24中任一个的多肽，或其片段或变体，或其抗体分子的试剂。在一些实施方案中，媒介物包含本文所述的两种或更多种试剂，例如本文所述的任何一对试剂。
细胞的异质群体
尽管在本文的许多实施方案中，一种或多种(例如，两种或更多种)外源多肽位于单个细胞上或单个细胞中，但应理解，本文所述的任何多肽或多肽的组合也可以位于多个细胞上。例如，在一些方面，本公开提供了多个红系细胞，其中多个的第一细胞包含第一外源多肽，而多个的第二细胞包含第二外源多肽。在一些实施方案中，多个细胞包含本文所述的两种或更多种多肽，例如，本文所述的任何一对多肽。在一些实施方案中，群体中少于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％或1％的细胞包含第一外源多肽和第二外源多肽两者。
包封在膜中的细胞
在一些实施方案中，本文所述的去核红系细胞或其他媒介物被包封在膜例如半透膜中。在一些实施方案中，膜包含多糖，例如阴离子海藻多糖。在一些实施方案中，半透膜不允许细胞通过，但允许小分子或大分子例如代谢物、蛋白质或DNA通过。在一些实施方案中，膜是描述于Lienert et al.,“Synthetic biology in mammalian cells:nextgeneration research tools and therapeutics”Nature Reviews Molecular CellBiology 15,95–107(2014)(以其整体通过引用并入本文)中的膜。尽管不希望受到理论的束缚，但在一些实施方案中，膜使细胞免受免疫系统的影响和/或使多个细胞保持邻近，从而促进彼此之间或彼此的产物之间的相互作用。
红细胞前体细胞
本文提供了工程化红细胞前体细胞，以及制备工程化红细胞前体细胞、网织红细胞和红细胞的方法。
多能干细胞通过红细胞生成过程产生红细胞。干细胞看起来像小淋巴细胞并缺乏红细胞的功能性能力。干细胞具有无限分裂的能力，这是成熟细胞所缺乏的。干细胞产生的一些子细胞随世代和时间获得红系特征。骨髓中大多数红系细胞具有独特的形态，但即使在尚未获得红系谱系独特的形态特征的细胞中也可见到红系细胞成熟的定型。这些细胞通过它们在体外形成的集落类型所识别。识别出两种此类细胞。爆发形成单位红系(BFU-E)来自干细胞，并产生集落形成单位红系(CFU-E)。CFU-E产生了原正成红细胞(具有独特形态的最不成熟的红系细胞)。BFU-E和CFU-E形成骨髓细胞的很小一级分。从形态上讲，在用罗曼诺夫斯基(Romanovsky)染色剂染色的骨髓中可鉴定出五种红系细胞前体。从最不成熟到最成熟的五个阶段是原成红细胞、嗜碱性正成红细胞(早期成红细胞)、多染性正成红细胞(中间成红细胞)、正染性正成红细胞(晚期成红细胞)和网织红细胞。BFU-E(爆发形成单位-红系)、CFU-E(红系集落形成单位)、原正成红细胞(原成红细胞)、嗜碱性原正成红细胞、多染性正成红细胞和正染性正成红细胞受谱系限制。
下表13总结了红细胞前体和红细胞的形态特征。
表13.红细胞前体和红细胞的形态特征
Figure BDA0002631423640002491
正常人红细胞表达CD36，一种单核细胞、血小板和内皮细胞的粘附分子(vanSchravendijk MR et al.,Blood.1992Oct 15；80(8):2105-14)。因此，在一些实施方案中，抗CD36抗体可以用于鉴定人红细胞。
可以根据本文所述的方法修饰本领域已知的能够分化为红细胞的任何类型的细胞，即任何红细胞前体细胞，以产生工程化红细胞前体细胞。在某些实施方案中，根据本文所述的方法修饰的红细胞前体细胞是处于分化为红细胞的过程中的细胞，即，细胞是已知在哺乳动物红细胞生成期间存在的类型的细胞。例如，细胞可以是多能造血干细胞(HSC)或CD34+细胞、多能髓样祖细胞、CFU-S细胞、BFU-E细胞、CFU-E细胞、原正成红细胞(原成红细胞)、嗜碱性正成红细胞、多染性正成红细胞和正染性正成红细胞。可以使用本领域已知的方法，即使用已知促进红细胞生成的分子，例如SCF、促红细胞生成素、IL-3和/或GM-CSF，在体外将本文提供的修饰的红细胞前体细胞分化为工程化网织红细胞或红细胞，如下所述。或者，在本发明的组合物中提供了修饰的红细胞前体细胞，并且在体内施用于受试者后能够分化为红细胞。
在一些实施方案中，未对红系前体细胞进行遗传修饰以缺失和/或改变内源抗原呈递多肽(例如MHC I类或MHC II类分子)的表达。
在一些实施方案中，红细胞前体细胞例如造血干细胞来自O-阴性供体。
培养
本文所述的生成aAPC的来源包括循环细胞，如红系细胞。合适的细胞来源可以如本文所述从患者衍生的造血或红系祖细胞分离，衍生自永生化的红系细胞系或衍生自诱导多能干细胞，任选地进行培养和分化。用于使用细胞培养技术产生红细胞的方法在本领域中是众所周知的，例如，Giarratana et al.,Blood 2011,118:5071,Huang et al.,MolTher 2013,epub ahead of print September 3或Kurita et al.,PLOS One 2013,8:e59890，其每一篇的内容以其整体通过引用并入本文。方案根据生长因子、起始细胞系、培养期和所得细胞特征所在的形态特征而有所不同。还建立了用于血液生产的培养系统，该系统可以替代供体输血(Fibach et al.1989Blood 73:100)。近来，CD34+细胞分化为网织红细胞阶段，随后成功输到人类受试者中(Giarratana et al.,Blood 2011,118:5071)。将理解的是，在一些实施方案中，患者衍生的造血或红系祖细胞，例如造血干细胞，来自O-阴性供体。
本文提供了用于红系细胞和衍生自红系细胞的aAPC的培养方法。可以从造血祖细胞中培养红系细胞，所述造血祖细胞包括例如CD34+造血祖细胞(Giarratana et al.,Blood 2011,118:5071)、诱导多能干细胞(Kurita et al.,PLOS One 2013,8:e59890)和胚胎干细胞(Hirose et al.2013Stem Cell Reports 1:499)。适合于扩增和分化祖细胞的生长和分化因子的混合物是本领域已知的。合适的扩增和分化因子的实例包括但不限于干细胞因子(SCF)、白介素(IL)如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、CSF、G-CSF、血小板生成素(TPO)、GM-CSF、促红细胞生成素(EPO)、Flt3、Flt2、PIXY321和白血病抑制因子(LIF)。
通过使祖细胞与确定的因子在多步培养过程中接触，可以从造血祖细胞(如CD34+细胞)培养红系细胞。例如，可以在三步过程种从造血祖细胞培养红系细胞。
第一步可以包括使培养物中的细胞与1-1000ng/mL的干细胞因子(SCF)、1-100U/mL的促红细胞生成素(EPO)和0.1-100ng/mL的白介素3(IL-3)接触。第一步任选地包括使培养物中的细胞与结合并激活下述核激素受体的配体接触，所述受体如例如是糖皮质激素受体、雌激素受体、孕激素受体、雄激素受体或孕烷x受体。这些受体的配体包括，例如，皮质类固醇，如例如10nM-100μM的地塞米松或10nM-100μM的氢化可的松；雌激素，如例如10nM-100μM的beta-雌二醇；孕激素，如例如10nM-100μM的孕酮、10nM-100μM的羟基孕酮、10nM-100μM的5a-二氢孕酮、10nM-100μM的11-脱氧皮质酮，或合成的孕激素(progestin)，如例如10nM-100μM的醋酸氯地孕酮；雄激素，如例如10nM-100μM的睾酮、10nM-100μM的二氢睾酮或10nM-100μM的雄烯二酮；或孕烷x受体配体，如例如10nM-100μM的利福平、10nM-100的贯叶金丝桃素(hyperforin)、10nM-100μM的St.John's Wort(金丝桃素)或维生素E样分子，如例如，10nM-100的生育酚。第一步还可以任选地包括使培养物中细胞与下述胰岛素样分子接触，所述胰岛素样分子如例如1-50μg/mL的胰岛素、1-50μg/mL的胰岛素样生长因子1(IGF-1)、1-50μg/mL的胰岛素样生长因子2(IGF-2)或1-50μg/mL的机械生长因子。第一步可以进一步任选地包括使培养物中的细胞与0.1-5mg/mL的转铁蛋白接触。
第一步可以任选地包括使培养物中的细胞与下述一种或多种白介素(IL)或生长因子接触，如例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、血小板生成素、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子beta(TGF-B)、肿瘤坏死因子alpha(TNF-A)、巨核细胞生长发育因子(MGDF)、白血病抑制因子(LIF)和Flt3配体。每种白介素或生长因子通常可以以0.1-100ng/mL的浓度提供。第一步还可以任选地包括使培养物中的细胞与下述血清蛋白或非蛋白质分子接触，如例如胎牛血清(1-20％)、人血浆(1-20％)、人血浆蛋白粉(plasmanate)(1-20％)、人血清(1-20％)、白蛋白(0.1-100mg/mL)或肝素(0.1-10U/mL)。
第二步可以包括使培养物中的细胞与1-1000ng/mL的干细胞因子(SCF)和1-100U/mL的促红细胞生成素(EPO)接触。第二步还可以任选地包括使培养物中的细胞与下述胰岛素样分子接触，如例如1-50μg/mL的胰岛素、1-50μg/mL的胰岛素样生长因子1(IGF-1)、1-50μg/mL的胰岛素样生长因子2(IGF-2)或1-50μg/mL的机械生长因子。第二步可以进一步任选地包括使培养物中的细胞与0.1-5mg/mL的转铁蛋白接触。第二步还可以任选地包括使培养物中的细胞与下述血清蛋白或非蛋白质分子接触，如例如胎牛血清(1-20％)、人血浆(1-20％)、plasmanate(1-20％)、人血清(1-20％)、白蛋白(0.1-100mg/mL)或肝素(0.1-10U/mL)。
第三步可以包括使培养物中的细胞与1-100U/mL的促红细胞生成素(EPO)接触。第三步可以任选地包括使培养物中的细胞与1-1000ng/mL的干细胞因子(SCF)接触。第三步可以进一步任选地包括使培养物中的细胞与下述胰岛素样分子接触，如例如1-50μg/mL的胰岛素、1-50μg/mL的胰岛素样生长因子1(IGF-1)、1-50μg/mL的胰岛素样生长因子2(IGF-2)或1-50μg/mL的机械生长因子。第三步还可以任选地包括使培养物中的细胞与0.1-5mg/mL的转铁蛋白接触。第三步还可以任选地包括使培养物中的细胞与下述血清蛋白或非蛋白质分子接触，如例如胎牛血清(1-20％)、人血浆(1-20％)、plasmanate(1-20％)、人血清(1-20％)、白蛋白(0.1-100mg/mL)或肝素(0.1-10U/mL)。
在一些实施方案中，扩增和分化包含呈递(例如在细胞表面上包含)一种或多种外源多肽的红系细胞(例如去核细胞)的aAPC的方法不包括在包含骨髓增殖性受体(mpl)配体的培养基中培养aAPC。
培养过程可以任选地包括通过本领域已知的方法使细胞与下述分子接触，例如DNA分子、RNA分子、mRNA、siRNA、微小RNA、lncRNA、shRNA、激素或小分子(其激活或敲低一种或多种基因)。靶基因可以包括例如编码转录因子、生长因子或生长因子受体的基因，其包括但不限于，例如，GATA1、GATA2、CMyc、hTERT、p53、EPO、SCF、胰岛素、EPO-R、SCF-R、转铁蛋白-R、胰岛素-R。
在一些实施方案中，将CD34+细胞置于含有不同量的IMDM、FBS、谷氨酰胺、BSA、全转铁蛋白(holotransferrin)、胰岛素、地塞米松、beta-雌二醇、IL-3、SCF和促红细胞生成素的培养物中，三个单独的分化阶段中共22天。
在一些实施方案中，将CD34+细胞置于含有不同量的IMDM、FBS、谷氨酰胺、BSA、全转铁蛋白、胰岛素、地塞米松、beta-雌二醇、IL-3、SCF和血小板生成素的培养物中，三个单独的分化阶段中共14天。
在一些实施方案中，将CD34+细胞置于含有不同量的IMDM、FBS、谷氨酰胺、BSA、全转铁蛋白、胰岛素、地塞米松、beta-雌二醇、IL-3、SCF和GCSF的培养物中，三个单独的分化阶段中共15天。
在一些实施方案中，红系细胞扩增至少100、1000、2000、5000、10,000、20,000、50,000或100,000倍(以及任选地高达100,000、200,000或500,000倍)。在一些实施方案中，使用自动细胞计数器测量细胞数。在一些实施方案中，红系细胞的群体包含至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或98％(以及任选地高达约80、90或100％)的工程化红系细胞。在一些实施方案中，使用核染色通过FACS测量去核。在一些实施方案中，群体中至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80％(以及任选地高达约70、80、90或100％)的红系细胞包含一种或多种(例如2、3、4或更多种)的外源多肽。在一些实施方案中，使用针对多肽的标记抗体通过红系细胞来测量多肽的表达。在一些实施方案中，群体中至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80％(以及任选地高达约70、80、90或100％)的红系细胞是去核的并且包含一种或多种(例如2、3、4或更多种)的外源多肽。在一些实施方案中，红系细胞的群体包含约1x109–2x109、2x109–5x109、5x109–1x1010、1x1010–2x1010、2x1010–5x1010、5x1010–1x1011、1x1011–2x1011、2x1011–5x1011、5x1011–1x1012、1x1012–2x1012、2x1012–5x1012或5x1012–1x1013个细胞。
在一些实施方案中，可能期望在培养过程中在体外仅部分分化红系祖细胞，例如造血干细胞，从而允许进一步分化(例如分化为网织红细胞或完全成熟的红细胞)在体内引入受试者时发生(参见例如，Neildez-Nguyen et al.,Nature Biotech.20:467-472(2002))。将理解的是，在本发明的各种实施方案中，体外成熟和/或分化可以在期望的任何阶段被阻止。例如，分离的CD34+造血干细胞可以如本文其他地方所述在体外扩增，例如在含有各种因子的培养基中扩增以达到期望的分化阶段，所述因子包括例如白介素3、Flt3配体、干细胞因子、血小板生成素、促红细胞生成素、转铁蛋白和胰岛素生长因子。所得工程化红系细胞的特征可以在于CD36和GPA的表面表达，以及特定于特定所期望细胞类型的其他特征，并且可以输注至允许终末分化为成熟红细胞的受试者中。
在一些实施方案中，工程化红系细胞从红系祖细胞部分扩增至去核之前(但不包括去核)的成熟的任何阶段，因此保留有核细胞，例如红细胞前体细胞。在某些实施方案中，所得细胞是有核的，并且限制红系谱系。在某些实施方案中，所得细胞选自多能髓样祖细胞、CFU-S细胞、BFU-E细胞、CFU-E细胞、原正成红细胞(原成红细胞)、嗜碱性正成红细胞、多染性正成红细胞和正染性正成红细胞。最终的分化步骤，包括去核，仅在将工程化红系细胞施用于受试者后才发生，也就是说，在此类实施方案中，去核步骤在体内发生。在另一个实施方案中，工程化红系细胞在体外通过去核阶段扩增和分化成为例如网织红细胞。在工程化红系细胞分化为网织红细胞阶段的此类实施方案中，变成红细胞的最终分化步骤仅在将工程化红系细胞施用于受试者后才发生，也就是说，终末分化步骤在体内发生。在另一个实施方案中，工程化红系细胞在体外通过终末分化阶段进行扩增和分化以成为红细胞。
将进一步认识到，在一些实施方案中，工程化红系细胞可以从红系细胞祖细胞例如造血干细胞扩增和分化，以变成不同谱系的造血细胞，例如变成血小板。用于成熟和分化各种谱系如血小板的造血细胞的方法是本领域技术人员众所周知的。在一些实施方案中，如本文所述的表达外源多肽的此类工程化血小板被认为涵盖在本发明中。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞。在上述方面和实施方案的一些实施方案中，工程化红系细胞是有核细胞。
在一些实施方案中，本文提供的去核细胞是血小板。体外制备血小板的方法是本领域已知的(参见例如Wang and Zheng(2016)Springerplus 5(1):787,和美国专利号9,574,178)。制备包括外源多肽的血小板的方法描述于例如国际专利申请公开号WO2015/073587和WO2015/153102，其每一篇均以其整体通过引用并入。血小板生成部分受血小板生成素(TPO)及其细胞受体TPOR/MPUc-MPL之间相互作用诱导的信号传导机制调节。另外，多种细胞因子(例如，干细胞因子(SCF)、IL-1、IL-3、IL-6、IL-11、白血病抑制因子(LIF)、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、促红细胞生成素(EPO)、kit配体和干扰素)已显示具有血小板生成活性。
在一些实施方案中，血小板从造血祖细胞，例如CD34+造血干细胞、诱导多能干细胞或胚胎干细胞产生。在一些实施方案中，通过在多步培养过程中使祖细胞与确定的因子接触来产生血小板。在一些实施方案中，多步培养过程包括：在适合于产生巨核细胞祖细胞群体的条件下培养造血祖细胞群体，以及在适合于产生血小板的条件下培养巨核细胞祖细胞群体。适合于扩增和分化祖细胞并产生血小板的生长和分化因子的混合物是本领域已知的。合适的扩增和分化因子的实例包括但不限于干细胞因子(SCF)、Flt-3/Flk-2配体(FL)、TPO、IL-11、IL-3、IL-6和IL-9。例如，在一些实施方案中，可以通过将CD34+HSC以2-4x 104个细胞/mL接种在无血清培养基中，并在培养第4天加入等体积的培养基更新培养基来生产血小板。在培养第6天，对细胞进行计数和分析：洗涤1.5x 105个细胞，并将其置于1mL的补充有包含TPO(30ng/mL)、SCF(1ng/mL)、IL-6(7.5ng/mL)和IL-9(13.5ng/mL)的细胞因子混合物的相同的培养基中以诱导巨核细胞分化。在培养第10天，用新鲜培养基替换约有四分之一到一半的悬浮培养物。在最初的6个培养日中在39℃，并且在最后8个培养日中在37℃，在湿润气氛(10％CO2)中培养细胞。台盼蓝染色后，用血细胞计数器对有核细胞进行计数。如国际专利申请公开号WO2015/073587(通过引用并入本文)的实施例44和45中所述，可以通过流式细胞术或定量PCR来评估培养物中血小板的分化状态。
外源多肽的表达
在一些实施方案中，通过使合适的分离的细胞，例如红系细胞、网织红细胞、红系细胞前体、血小板或血小板前体与编码本公开的多肽的外源核酸(例如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、外源耗竭氨基酸的多肽和外源Treg共刺激性多肽)接触，来生成包含呈递一种或多种外源多肽的工程化红系细胞或去核细胞的aAPC。
在一些实施方案中，外源多肽由DNA编码，该DNA与有核红系前体细胞或有核血小板前体细胞接触。在一些实施方案中，外源多肽由RNA编码，该RNA与血小板、有核红系细胞、有核血小板前体细胞或网织红细胞接触。在一些实施方案中，外源多肽与原代血小板、有核红系细胞、有核血小板前体细胞、网织红细胞或红细胞接触。
外源多肽可以通过电穿孔、化学或聚合转染、病毒转导、机械膜破坏或其他方法从引入红系细胞中的转基因表达；由通过电穿孔、化学或聚合转染、病毒转导、机械膜破坏或其他方法引入细胞中的mRNA表达的外源多肽；通过引入外部因子例如转录激活物、转录阻遏物或分泌途径增强物而从天然基因座过表达的外源多肽；和/或从生产细胞或其他外部系统合成、提取或生产并掺入红系细胞中的多肽。
可以通过转染单拷贝或多拷贝基因、用病毒转导或在存在DNA或RNA的情况下进行电穿孔引入外源多肽(例如外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、外源耗竭氨基酸的多肽和外源Treg共刺激性多肽)。在哺乳动物细胞中表达外源蛋白质的方法是本领域众所周知的。例如，通过CD34+祖细胞的病毒转导来诱导造血细胞中外源因子IX的表达，参见Chang et al.,Nat Biotechnol 2006,24:1017。
在一些实施方案中，两个或更多个多肽在单个核酸(例如单个载体)中编码。在实施方案中，单个载体对于每个基因具有单独的启动子，具有最初转录成在中间具有蛋白酶切割位点的单个多肽的两个蛋白质，使得随后的蛋白水解加工产生两个蛋白质或任何其他合适的构型。在一些实施方案中，两个或更多个多肽在两个或更多个核酸中编码，例如，每个载体编码多肽之一。
可以将核酸，例如用于产生外源多肽的DNA表达载体或mRNA引入适合于产生本文所述外源多肽的祖细胞(例如红系细胞祖细胞或血小板祖细胞等)中。可以经由如本文提供的常规重组技术从原始来源分离祖细胞或从扩增的祖细胞群体获得祖细胞。在一些情况下，可以设计表达载体，使得它们可以通过本领域已知的方法通过同源或非同源重组掺入细胞基因组中。
在一些实施方案中，使造血祖细胞，例如CD34+造血祖细胞与编码一种或多种外源多肽的一种或多种核酸接触，并使细胞在培养物中扩增和分化。
在一些情况下，例如，对于作为包含一种或多种外源多肽(例如外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽，外源T细胞扩增多肽、外源共抑制性多肽、外源增殖抑制物、外源耗竭氨基酸的多肽、外源调节性T细胞扩增多肽、外源占位多肽)的红系细胞的aAPC，编码可以选择性靶向和切割基因组的多肽的核酸，例如CRISPR/Cas9、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)或锌指核酸酶，用于指导将编码外源多肽的表达载体的外源核酸插入特定的基因组位置，例如CR1基因座(1q32.2)、血红蛋白基因座(11p15.4)。因此，在一方面，本公开的特征在于制备免疫学相容的人工抗原呈递细胞(aAPC)的方法，其中aAPC包含表达外源抗原性多肽的工程化红系细胞，所述方法包括使aAPC与切割内源MHC核酸的核酸酶和至少一种gRNA接触，其中内源MHC核酸通过基因编辑途径修复并导致内源MHC核酸的表达水平降低，从而制备免疫学相容的aAPC。
在一些实施方案中，可以将一种或多种外源多肽(例如外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、外源耗竭氨基酸的多肽和外源Treg共刺激性多肽)克隆到质粒构建体中用于转染。用于将表达载体转移到适合产生本文所述的aAPC的细胞中的方法包括但不限于病毒介导的基因转移、脂质体介导的转移、转化、基因枪、转染和转导，例如病毒介导的基因转移，如基于DNA病毒(如腺病毒、腺相关病毒和疱疹病毒)的载体以及基于逆转录病毒的载体的使用。基因转移模式的实例包括例如裸DNA、CaPO4沉淀、DEAE葡聚糖、电穿孔，原生质体融合、脂质转染和细胞显微注射。
在一些实施方案中，可以将编码每种外源多肽的重组DNA克隆到慢病毒载体质粒中，以整合到红系细胞中。在一些实施方案中，慢病毒载体包含编码单个外源多肽以整合到红系细胞中的DNA。在其他实施方案中，慢病毒载体包含两种、三种、四种或更多种本文所述的外源多肽，以整合到红系细胞中。在一些实施方案中，可以将编码一种或多种外源多肽的重组DNA克隆到编码可选择性状如抗生素抗性基因的质粒DNA构建体中。在一些实施方案中，可将编码外源多肽的重组DNA克隆到适于在红系细胞中稳定表达每种重组蛋白质的质粒构建体中。
在一些实施方案中，可以采用慢病毒系统，其中将具有外源多肽序列(例如，一个、两个、三个、四个或更多个外源多肽序列)的转移载体、包膜载体和包装载体各自转染到宿主细胞中以用于病毒生产。在一些实施方案中，可以通过磷酸钙沉淀转染、基于脂质的转染或电穿孔中的任一种将慢病毒载体转染到宿主细胞中，并温育过夜。对于其中外源多肽序列可以伴有荧光报道物的实施方案，可以在过夜温育后检查宿主细胞的荧光检查。可以每8-12小时收获包含病毒颗粒的宿主细胞的培养基2或3次，并离心以沉淀分离的细胞和碎片。然后可以根据需要直接使用、冷冻或浓缩培养基。
可以在允许分化为成熟去核红细胞的合适条件下培养经受编码外源多肽的外源核酸转移的祖细胞，例如本文所述的体外培养方法。所得去核红细胞展示与成熟红细胞相关的蛋白质，例如血红蛋白、血型糖蛋白A以及可以通过标准方法(例如Western印迹或FACS分析)进行验证和定量的外源多肽。包含外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽的分离的成熟去核红细胞和包含外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽的血小板是本公开的aAPC的两个非限制性实例。
在一些实施方案中，通过使网织红细胞与编码抗原性多肽的外源核酸接触来产生aAPC。在一些实施方案中，抗原性多肽由与网织红细胞接触的RNA编码。在一些实施方案中，抗原性多肽是与网织红细胞接触的多肽。
可以用编码一种或多种外源多肽(例如外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽，外源耗竭氨基酸的多肽和外源Treg共刺激性多肽)的mRNA转染分离的网织红细胞以产生aAPC。信使RNA可以衍生自含有对应于一种或多种外源多肽的编码序列的cDNA质粒构建体的体外转录。例如，可以将对应于外源多肽的cDNA序列插入含有与特定RNA聚合酶相容的启动子序列的克隆载体中。例如，克隆载体ZAP EXPRESSpBK-CMV(Stratagene,La Jolla,Calif.,USA)含有分别与T3和T7 RNA聚合酶相容的T3和T7启动子序列。对于有义mRNA的体外转录，将质粒在对应于外源多肽编码序列末端的终止密码子下游的限制性位点处线性化。使用可商购的试剂盒，如例如RNAMAXX高产率转录试剂盒(来自Stratagene,La Jolla,Calif.,USA)，从线性DNA模板转录mRNA。在一些情况下，可以期望产生5'-m7GpppG-帽的mRNA。这样，可以使用例如来自Ambion(Austin,Tex.,USA)的mMESSAGE mMACHINE高产率带帽RNA转录试剂盒进行线性化cDNA模板的转录。转录可以在37℃下以20-100μl的反应体积进行30分钟至4小时。通过用DNase I短暂处理以消除线性化的DNA模板，然后在存在氯化锂、乙酸钠或乙酸铵的情况下于70％乙醇中沉淀，从反应混合物中纯化转录的mRNA。可以使用琼脂糖甲醛凝胶或可商购的Novex预制TBE凝胶(例如Novex,Invitrogen,Carlsbad,Calif.,USA)进行电泳来评估转录的mRNA的完整性。
可以使用多种方法，包括例如脂质转染和电穿孔将编码一种或多种外源多肽(例如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、外源耗竭氨基酸的多肽和外源Treg共刺激性多肽)的信使RNA引入网织红细胞中(van Tandeloo etal.,Blood 98:49-56(2001))。为了进行脂质转染，例如，将5μg的Opti-MEM(Invitrogen,Carlsbad,Calif.,USA)中体外转录的mRNA与阳离子脂质DMRIE-C(Invitrogen)以1:4的比率温育5-15分钟。或者，多种其他阳离子脂质或阳离子聚合物可以用于用mRNA转染细胞，包括例如DOTAP、各种形式的聚乙烯亚胺和聚L-赖氨酸(Sigma-Aldrich,Saint Louis,Mo.,USA)，和Superfect(Qiagen,Inc.,Valencia,Calif.,USA；参见例如，Bettinger et al.,Nucleic Acids Res.29:3882-3891(2001))。将得到的mRNA/脂质复合物与细胞(1-2×106个细胞/ml)在37℃下温育2小时，洗涤并返回培养。对于电穿孔，例如，将500μl的Opti-MEM(Invitrogen,Carlsbad,Calif.,USA)中的约5至20x106个细胞与约20μg的体外转录的mRNA混合，并在0.4厘米的比色杯中使用例如Easyject Plus设备(EquiBio,Kent,UnitedKingdom)进行电穿孔。在一些情况下，可能有必要测试各种电压、电容和电穿孔体积，以确定将特定mRNA转染到网织红细胞中的有用条件。通常，有效地用mRNA转染细胞所需的电穿孔参数似乎比DNA电穿孔所需的电穿孔参数对细胞的危害小(van Tandeloo et al.,Blood98:49-56(2001))。
或者，可以使用肽介导的RNA递送策略将mRNA转染到网织红细胞中(参见例如，Bettinger et al.,Nucleic Acids Res.29:3882-3891(2001))。例如，可以将阳离子脂质聚乙烯亚胺2kDA (Sigma-Aldrich,Saint Louis,Mo.,USA)与蜂毒肽(mellitin peptide)(Alta Biosciences,Birmingham,UK)组合以提高mRNA转染的效率，特别是在有丝分裂后原代细胞中。可以使用二硫化物交联剂，如例如，异双功能交联剂琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯，将蜂毒肽与PEI缀合。将体外转录的mRNA与蜂毒肽-PEI预温育5至15分钟，以形成RNA/肽/脂质复合物。然后在37℃，5％CO2湿润的环境中，将此复合物添加到无血清培养基中的细胞2至4小时，然后将其除去，并允许转染的细胞继续在培养物中生长。
在一些实施方案中，通过使合适的分离的红系细胞前体或血小板前体与编码一种或多种外源多肽(例如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、外源耗竭氨基酸的多肽和外源Treg共刺激性多肽)的外源核酸接触来产生aAPC。在一些实施方案中，外源多肽由DNA编码，该DNA与有核红系前体细胞或有核血小板前体细胞接触。在一些实施方案中，外源多肽由RNA编码，该RNA与血小板、有核红系细胞或有核血小板前体细胞接触。
可以使用各种DNA技术(包括瞬时或稳定转染和基因治疗方法)将一种或多种外源多肽(例如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、外源耗竭氨基酸的多肽和外源Treg共刺激性多肽)遗传引入终末分化之前的红系细胞前体、血小板前体或有核红系细胞中。外源多肽可以在成熟红细胞或血小板的表面上和/或细胞质中表达。
病毒基因转移可以用于用编码一种或多种外源多肽(例如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、外源耗竭氨基酸的多肽和外源Treg共刺激性多肽)的DNA转染细胞。许多病毒可以用作基因转移媒介物，包括例如莫洛尼氏鼠白血病病毒(MMLV)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)、慢病毒如人免疫缺陷病毒1(HIV 1)和泡沫病毒(spumavirus)如泡沫病毒(foamy virus)(参见例如，Osten etal.,HEP 178:177-202(2007))。例如，逆转录病毒可以有效地转导包括人类细胞在内的哺乳动物细胞并整合到染色体中，从而赋予稳定的基因转移。
可以将一种或多种外源多肽(例如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、外源耗竭氨基酸的多肽和外源Treg共刺激性多肽)转染到红系细胞前体、血小板前体或有核红系细胞中、表达并随后保留并在成熟的红细胞或血小板中展示。合适的载体是莫洛尼氏鼠白血病病毒(MMLV)载体主链(Malik et al.,Blood91:2664-2671(1998))。基于MMLV(致癌逆转录病毒)的载体目前用于基因疗法临床试验中(Hossle et al.,News Physiol.Sci.17:87-92(2002))。例如，可以使用标准分子生物学技术在MMLV载体主链中产生含有编码外源多肽的cDNA的DNA构建体。将构建体转染到包装细胞系(如例如PA317细胞)中，并且将病毒上清液用于转染生产细胞(如例如PG13细胞)。PG13病毒上清液与已经如本文所述分离并培养或新鲜分离的红系细胞前体、血小板前体或有核红系细胞一起温育。可以使用FACS分析(荧光激活的细胞分选)，例如用针对外源多肽的荧光标记抗体来监测外源多肽的表达(如果其位于aAPC的表面上)。可以使用类似的方法来表达位于aAPC内部的外源多肽。
任选地，可以使用基于病毒的方法转染荧光跟踪分子，如例如绿色荧光蛋白(GFP)(Tao et al.,Stem Cells 25:670-678(2007))。使用包装细胞如例如Phoenix-Eco细胞系(由Orbigen,San Diego,Calif.配销)包装含有编码增强的绿色荧光蛋白(EGFP)或红色荧光蛋白(例如，DsRed-Express)的DNA的异位逆转录病毒载体。包装细胞系稳定地表达适当的病毒包装所需的病毒蛋白，包括例如gag、pol和env。来自已经沉积了病毒颗粒的Phoenix-Eco细胞的上清液用于转导例如红系细胞前体、血小板前体或有核红系细胞。在一些情况下，可以在特定包被的表面上进行转导，如例如重组纤连蛋白的片段，以提高逆转录病毒介导的基因转移的效率(例如，RetroNectin,Takara Bio USA,Madison,Wis.)。将细胞与逆转录病毒Phoenix-Eco上清液加合适的辅因子一起在RetroNectin包被的板中温育。第二天可以重复进行转导。在这种情况下，可以通过FACS评估表达EGFP或DsRed-Express的细胞的百分比。其他可以用于评估转导效率的报告物基因包括，例如，beta-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶和萤光素酶以及低亲和力神经生长因子受体(LNGFR)，和人细胞表面CD24抗原(Bierhuizen et al.,Leukemia 13:605-613(1999))。
非病毒载体可以用于将遗传物质引入合适的红系细胞、血小板或其前体中以产生alphaAPC。非病毒介导的基因转移与病毒介导的基因转移的不同之处在于，质粒载体不含蛋白质、毒性较小、易于扩大规模并且没有宿主细胞的偏好。质粒载体的“裸DNA”本身不能有效地将编码多肽的遗传物质递送至细胞，因此与能够进入细胞的基因递送方法相组合。可以使用多种递送方法将非病毒载体转移到合适的红系细胞、血小板或其前体中，包括化学和物理方法。
可以使用合成的大分子，如阳离子脂质和聚合物将编码一种或多种外源多肽(例如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、外源耗竭氨基酸的多肽和外源Treg共刺激性多肽)的非病毒载体引入合适的红系细胞、血小板或其前体中(Papapetrou et al.,Gene Therapy12:S118-S130(2005))。阳离子脂质体例如通过电荷相互作用与DNA形成复合物。带正电的DNA/脂质复合物与负细胞表面结合，并通过内吞作用被细胞吸收。该方法可以用于例如转染造血细胞(参见例如，Keller et al.,GeneTherapy6:931-938(1999))。对于红系细胞、血小板或其前体，将质粒DNA(在25-100μL的无血清培养基如例如OptiMEM(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)中大约0.5μg)与阳离子脂质体(在25μL的无血清培养基中约4μg)如可商购的转染试剂Lipofectamine.TM.(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)混合并允许温育至少20分钟以形成复合物。将DNA/脂质体复合物添加到合适的红系细胞、血小板或其前体中，并温育5-24小时，之后可以测定多肽的转基因表达。或者，可以使用其他可商购脂质体转染剂(例如，In vivo GeneSHUTTLE.,Qbiogene,Carlsbad,Calif.)。
任选地，阳离子聚合物，如聚乙烯亚胺(PEI)可以用于有效转染红系细胞祖细胞，例如造血和脐带血来源的CD34+细胞(参见例如，Shin et al.,Biochim.Biophys.Acta1725:377-384(2005))。从人脐带血中分离出人CD34+细胞，并在补充有200ng/ml干细胞因子和20％热失活的胎牛血清的Iscove改良的Dulbecco培养基中培养。将编码外源多肽的质粒DNA与大小在0.8K至750K之间的支链或线性PEI(Sigma Aldrich,Saint Louis,Mo.,USA；Fermetas,Hanover,Md.,USA)温育。将PEI制备为4.2mg/ml蒸馏水的储备溶液，并使用HCl轻微酸化至pH 5.0。可以在室温下以不同的氮/磷酸盐比率将DNA与PEI混合30分钟，基于以下计算：1μg的DNA含有3nmol磷酸盐，1μl的PEI储备液含有10nmol胺氮。用DNA/阳离子复合物接种分离的CD34+细胞，以280xg离心5分钟，并在培养基中温育4个或更多个小时直到评估多肽的基因表达。
可以使用物理方法如粒子介导的转染、“基因枪”、生物弹药(biolistics)或粒子轰击技术的将质粒载体引入合适的红系细胞、血小板或其前体中(Papapetrou,et al.,(2005)Gene Therapy 12:S118-S130)。在这种情况下，编码多肽的DNA被吸收到金颗粒上，并通过粒子枪施用于细胞。该方法可以用于例如转染红系细胞祖细胞，例如衍生自脐带血的造血干细胞(参见例如，Verma et al.,Gene Therapy 5:692-699(1998))。这样，分离出脐带血并在磷酸盐缓冲盐水中稀释三倍。使用抗CD34单克隆抗体组合包被有第二抗体的磁性微珠和磁性分离系统(例如，Miltenyi MiniMac系统,Auburn,Calif.,USA)纯化CD34+细胞。可以如本文所述培养富含CD34+的细胞。为了转染，通过用氯化钙和亚精胺处理，将编码多肽的质粒DNA沉淀到颗粒例如金珠上。在用乙醇洗涤包被有DNA的珠子之后，可以使用例如Biolistic PDS-1000/He系统(Bio-Rad,Hercules,Calif.,USA)将珠子递送到培养的细胞中。可以使用报告物基因，如例如beta-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、萤光素酶或绿色荧光蛋白来评估转染效率。
任选地，可以使用电穿孔方法将质粒载体引入合适的红系细胞、血小板或其前体中。电穿孔在细胞膜上产生瞬时孔，从而允许将各种分子(包括例如DNA和RNA以及抗体和药物)引入细胞。这样，如本文所述分离并培养CD34+细胞。紧接在电穿孔之前，通过在室温下以250xg离心10分钟来分离细胞，并以0.2-10x106个活细胞/ml重悬于电穿孔缓冲液中，如例如补充有1.0％人血清白蛋白(HSA)的X-VIVO 10。将质粒DNA(1-50μg)与500μl细胞悬液一起添加到适当的电穿孔比色杯中。电穿孔可以使用例如ECM 600电穿孔仪(Genetronics,San Diego,Calif.,USA)以200V至280V的电压范围和25至70毫秒的脉冲长度来完成。许多可替代的电穿孔仪器是可商购的，并且可以用于该目的(例如，Gene Pulser XCELL,BioRad,Hercules,Calif.；Cellject Duo,Thermo Science,Milford,Mass.)。或者，也可以使用以下参数对分离的CD34+细胞进行有效的电穿孔：4mm比色杯、1600μF、550V/cm和以1x105个细胞/ml每500μl的细胞10μg的DNA(Oldak et al.,Acta Biochimica Polonica49:625-632(2002))。
核转染(电穿孔的一种形式)也可以用于转染合适的红系细胞、血小板或其前体。在这种情况下，在细胞类型特异性溶液中使用能够使DNA(或其他试剂)直接转运至核从而降低在细胞质中可能降解的风险的电参数进行转染。例如，人CD34细胞核转染试剂盒(来自Amaxa Inc.)可以用于转染合适的红系细胞、血小板或其前体。在这种情况下，将人CD34细胞核转染溶液中的1-5x106个细胞与1-5μg的DNA混合，并使用制造商确定的预编程设置在核转染仪器中进行转染。
可以用常规表达载体对红系细胞、血小板或其前体进行非病毒转染，所述常规表达载体除非整合到基因组中否则不能在哺乳动物细胞中自我复制。或者，可以用附加型载体转染红系细胞、血小板或其前体，所述附加型载体可以作为自主复制的遗传单位而保留在宿主核中而不整合到染色体中(Papapetrou et al.,Gene Therapy 12:S118-S130(2005))。这些载体利用了从在潜伏感染后通常在细胞中染色体外复制的病毒衍生的遗传元件，所述病毒如例如EBV、人多瘤病毒BK、牛乳头瘤病毒1(BPV-1)、单纯疱疹病毒1(HSV)和猿猴病毒40(SV40)。哺乳动物人工染色体也可以用于非病毒基因转移(Vanderbyl et al.,Exp.Hematol.33:1470-1476(2005))。
编码一种或多种外源多肽(例如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、外源耗竭氨基酸的多肽和外源Treg共刺激性多肽)的外源核酸可以通过本领域已知的标准分子生物学方法组装成表达载体，例如限制性消化、重叠延伸PCR和Gibson组装。
外源核酸可以包含编码一种或多种外源多肽(例如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、外源耗竭氨基酸的多肽和外源Treg共刺激性多肽)的基因，所述外源多肽通常不在例如红系细胞的细胞表面表达，与编码内源或天然膜蛋白的基因融合，使得外源多肽在细胞表面上表达。例如，可以将编码外源抗原性多肽的外源基因克隆在1型膜蛋白前导序列后的N端，2型膜蛋白的C端或GPI连接的膜蛋白的GPI附着位点的上游。
可以使用标准的克隆方法在两个融合基因之间引入柔性氨基酸接头。例如，柔性接头是聚甘氨酸聚丝氨酸接头，如[Gly4Ser]3_(SEQ ID NO:1)，其通常用于从全长抗体中生成单链抗体片段(Antibody Engineering:Methods&Protocols,Lo 2004)，或ala-gly-ser-thr多肽，如用于产生单链Arc阻遏物的多肽(Robinson&Sauer,PNAS 1998)。在一些实施方案中，与没有柔性接头的等同构建体相比，柔性接头为多肽提供了更大的柔性和空间自由度。
表位标签可以置于两个融合基因之间，如例如，编码HA表位标签的氨基酸序列-氨基酸YPYDVPDYA(SEQ ID NO:2)、CMyc标签-氨基酸EQKLISEEDL(SEQ ID NO:3)或Flag标签-氨基酸DYKDDDDK(SEQ ID NO:4)。表位标签可以用于通过流式细胞仪、western印迹或免疫沉淀使用针对表位标签的抗体，方便地检测和定量表达。
在一些实施方案中，aAPC包含一种或多种外源多肽(例如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、外源耗竭氨基酸的多肽和外源Treg共刺激性多肽)和至少一种其他异源多肽。至少一种其他异源多肽可以是荧光蛋白。荧光蛋白可以用作报告物以评估转导效率。在一些实施方案中，如果两者均由相同的转录物制备，则将荧光蛋白用作报告物以评估外源多肽的表达水平。在一些实施方案中，至少一种其他多肽是异源的并且提供功能，如例如多种抗原、多种捕获靶标、酶级联。在一些实施方案中，重组核酸包含编码抗原性多肽的基因和第二基因，其中第二基因通过病毒来源的T2A序列(gagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggsgsstcccggccct(SEQ ID NO:5))与编码抗原性多肽的基因分开，其翻译后被切割成两个成熟蛋白质。
在一些实施方案中，编码外源抗原呈递多肽的外源核酸包含MHC细胞表面蛋白质的基因序列，其与Kell的序列的3’末端融合并使用PCR扩增。在一些实施方案中，编码外源抗原呈递多肽的外源核酸包含MHC细胞表面蛋白质的基因序列，其与聚甘氨酸/丝氨酸接头融合，随后是Kell的序列的3’末端，并使用PCR扩增。在一些实施方案中，编码外源抗原呈递多肽的外源核酸包含与表位标签序列融合的MHC细胞表面蛋白质的基因序列的3’末端，其可以是以下之一或组合：HA标签、绿色荧光蛋白标签、Myc标签、甲壳质结合蛋白、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S转移酶、聚(His)标签、硫氧还蛋白、聚(NANP)、FLAG标签、V5标签、Avi标签、钙调蛋白标签、聚谷氨酸标签、E标签、S标签、SBP标签、Softag-1、Softag-3、Strep标签、TC标签、VSV标签、Xpress标签、Isopep标签、SpyTag、生物素羧基载体蛋白、Nus标签、Fc标签或Ty标签。将整个构建体融合到Kell的序列的3’末端，然后使用PCR进行扩增。例如，随后将编码各种外源抗原呈递多肽的外源基因构建体加载到慢病毒载体中，并用于转导细胞群体。
在一些实施方案中，将红系细胞群体与慢病毒载体一起温育，所述慢病毒载体包含编码一种或多种外源多肽(例如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、外源耗竭氨基酸的多肽和外源Treg共刺激性多肽)的外源核酸，其特定质粒可以包括pLKO.1puro、PLKO.1--TRC克隆载体、pSico、FUGW、pLVTHM、pLJM1、pLion11、pMD2.G、pCMV-VSV-G、pCI-VSVG、pCMV-dR8.2 dvpr、psPAX2、pRSV-Rev和pMDLg/pRRE以生成aAPC。可以以10、100、1,000、10,000pfu施用载体，并温育12小时。
在某些实施方案中，aAPC是呈递，例如在细胞表面上包含，与一种或多种外源抗原性多肽缀合的外源抗原呈递多肽的红系细胞。在其他实施方案中，aAPC是呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽、外源抗原性多肽和至少一种作为缀合物对的一部分的外源共刺激性多肽的红系细胞。在其他实施方案中，aAPC是呈递，例如在细胞表面上包含，外源抗原呈递多肽、外源抗原性多肽和至少一种作为缀合物对的一部分的外源共抑制性多肽的红系细胞。在一些实施方案中，红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，红系细胞是有核细胞。
缀合可以化学或酶促实现。化学缀合可以在使用或不使用接头的情况下通过外源抗原呈递多肽和一种或多种外源抗原性多肽的共价键合来实现。化学缀合可以在使用或不使用接头的情况下通过共刺激性多肽和结合对成员的共价键合来实现。化学缀合可以在使用或不使用接头的情况下通过共抑制性多肽和结合对成员的共价键合来实现。此类缀合物的形成在本领域技术人员的技术范围内，并且已知各种技术可用于完成缀合，其中特定技术的选择由待缀合的材料指导。向多肽(C端或N端)添加氨基酸，所述氨基酸含有可离子化的侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸、组氨酸或酪氨酸)且不包含在多肽序列的活性部分中，以其未质子化的状态用作有效力的亲核试剂以参与与附接到聚合物(如同双功能或异双功能的PEG)上的反应基团的各种生物缀合反应(例如，Lutolf andHubbell,Biomacromolecules 2003；4:713-22,Hermanson,Bioconjugate Techniques,London.Academic Press Ltd；1996)。
在一个实施方案中，外源抗原呈递多肽可以通过生物素-链霉抗生物素桥与一种或多种外源抗原性多肽结合。在其他实施方案中，共刺激性多肽和结合对成员通过生物素-链霉抗生物素桥结合。在其他实施方案中，共抑制性多肽和结合对成员通过生物素-链霉抗生物素桥结合。
例如，生物素化的抗原性多肽可以通过链霉抗生物素桥与外源抗原呈递多肽的非特异性生物素化的表面连接。生物素缀合可以通过许多化学方法发生(参见例如，Hirschet al.,Methods Mol.Biol.295:135-154(2004))。可以使用胺反应性生物素化试剂队外援抗原呈递多进行生物素化，如例如EZ-Link Sulfo-NHS-SS-生物素(磺基琥珀酰亚胺基2-(生物素酰胺)-乙基-1,3-二硫代丙酸酯；Pierce-Thermo Scientific,Rockford,Ill.,USA；参见例如，Jaiswal et al.,Nature Biotech.21:47-51(2003))。例如，分离的红系细胞可以在4℃下磷酸盐缓冲盐水中1mg/ml的硫代-NHS-SS中温育30分钟。通过用Tris缓冲盐水洗涤细胞来去除过量的生物素试剂。然后在存在链霉抗生物素的情况下使生物素化的细胞与生物素化的外源抗原性多肽反应，以形成呈递外源抗原呈递多肽的aAPC，所述外源呈递多肽通过生物素-链霉抗生物素桥与一种或多种外源抗原性多肽结合。
还可以使用偶联试剂将外源多肽与细胞连接来产生本文所述的红系细胞。例如，可以使用点击化学。例如，当外源多肽是复杂的或难以表达的多肽，例如多肽，例如多聚体多肽；大多肽；体外衍生的多肽；对红系细胞可能具有毒性或无法在红系细胞中有效表达的外源多肽时，偶联试剂可以用于将外源多肽偶联至细胞。用于功能化红细胞的点击化学和其他缀合方法描述于国际申请号PCT/US2018/000042中，该申请要求2017年2月17日提交的美国临时申请号62/460589和2017年7月8日提交的美国临时申请号62/542142的优先权。
因此，在一些实施方案中，本文所述的红系细胞包含每细胞多达、至少、超过或约5,000、10,000、50,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000个偶联试剂。在一些实施方案中，红系细胞通过以下方法制备：a)将第一偶联试剂偶联至红系细胞，从而制备药物制剂、产物或中间体。在一个实施方案中，方法进一步包括：b)使细胞与偶联于第二偶联试剂的外源多肽接触，例如在适合于第一偶联试剂与第二偶联试剂反应的条件下。在实施方案中，将两种或更多种外源多肽偶联至细胞(例如使用点击化学)。在实施方案中，将第一外源多肽偶联至细胞(例如使用点击化学)，并且第二外源多肽包含从外源核酸表达的多肽。
在一些实施方案中，一种或更多种偶联试剂用于将一种或多种外源多肽偶联至本文所述的红系细胞。在一些实施方案中，两种或更多种偶联试剂用于将两种或更多种外源多肽偶联至本文所述的红系细胞。在一些实施方案中，使用相同的偶联试剂将两种或更多种外源多肽偶联至细胞(例如使用点击化学)。在一些实施方案中，使用不同的偶联试剂将两种或更多种外源多肽偶联至细胞(例如使用点击化学)。在一些实施方案中，使用第一偶联试剂将第一外源多肽偶联至细胞(例如使用点击化学)，并且使用第二偶联试剂将第二外源多肽偶联至细胞(例如使用点击化学)。在一些实施方案中，使用相同的偶联试剂将三种或更多种外源多肽偶联至细胞(例如使用点击化学)。在一些实施方案中，使用不同的偶联试剂将三种或更多种外源多肽偶联至细胞(例如使用点击化学)。在一些实施方案中，使用第一偶联试剂将第一外源多肽偶联至细胞(例如使用点击化学)，使用第一偶联试剂将第二外源多肽偶联至细胞(例如使用点击化学)，并且使用第二偶联试剂将第三外源多肽偶联至细胞(例如使用点击化学)。在一些实施方案中，使用第一偶联试剂将第一外源多肽偶联至细胞(例如使用点击化学)，使用第二偶联试剂将第二外源多肽偶联至细胞(例如使用点击化学)，并且使用第一偶联试剂将第三外源多肽偶联至细胞(例如使用点击化学)。在一些实施方案中，使用第一偶联试剂将第一外源多肽偶联至细胞(例如使用点击化学)，使用第二偶联试剂将第二外源多肽偶联至细胞(例如使用点击化学)，并且使用第二偶联试剂将第三外源多肽偶联至细胞(例如使用点击化学)。
在一个实施方案中，一种或更多种偶联试剂用于将一种或多种外源多肽偶联至本文所述的红系细胞，其中红系细胞是人红系细胞。在一些实施方案中，红系细胞是人细胞，并且两种或更多种偶联试剂用于将两种或更多种外源多肽偶联至红系细胞。在一些实施方案中，红系细胞是人细胞，并且使用相同的偶联试剂将两种或更多种外源多肽偶联至细胞(例如使用点击化学)。在一些实施方案中，红系细胞是人细胞，并且使用不同的偶联试剂将两种或更多种外源多肽偶联至细胞(例如使用点击化学)。在一些实施方案中，红系细胞是人细胞，并且使用第一偶联试剂将第一外源多肽偶联至细胞(例如使用点击化学)，并且使用第二偶联试剂将第二外源多肽偶联至细胞(例如使用点击化学)。在一些实施方案中，红系细胞是人细胞，并且使用相同的偶联试剂将三种或更多种外源多肽偶联至细胞(例如使用点击化学)。在一些实施方案中，红系细胞是人细胞，并且使用不同的偶联试剂将三种或更多种外源多肽偶联至细胞(例如使用点击化学)。在一些实施方案中，红系细胞是人细胞，并且使用第一偶联试剂将第一外源多肽偶联至细胞(例如使用点击化学)，使用第一偶联试剂将第二外源多肽偶联至细胞(例如使用点击化学)，并且使用第二偶联试剂将第三外源多肽偶联至细胞(例如使用点击化学)。在一些实施方案中，红系细胞是人细胞，并且使用第一偶联试剂将第一外源多肽偶联至细胞(例如使用点击化学)，使用第二偶联试剂将第二外源多肽偶联至细胞(例如使用点击化学)，并且使用第一偶联试剂将第三外源多肽偶联至细胞(例如使用点击化学)。在一些实施方案中，红系细胞是人细胞，并且使用第一偶联试剂将第一外源多肽偶联至细胞(例如使用点击化学)，使用第二偶联试剂将第二外源多肽偶联至细胞(例如使用点击化学)，并且使用第二偶联试剂将第三外源多肽偶联至细胞(例如使用点击化学)。
在实施方案中，本公开的优点是采用两种不同的偶联剂以将三种或更多种外源多肽点击到红系细胞，特别是人红系细胞。不受理论的束缚，本公开设想在包含使用不同的偶联试剂偶联至细胞(例如使用点击化学)的三种或更多种外源多肽的红系细胞中，减少外源多肽之间对偶联试剂的竞争，并且因此使外源多肽的拷贝数最大化。
在一些实施方案中，偶联试剂包括叠氮化物偶联试剂。在一些实施方案中，叠氮化物偶联试剂包含叠氮烷基部分、叠氮芳基部分或叠氮杂芳基部分。示例性叠氮化物偶联试剂包括3-叠氮丙酸磺基-NHS酯、叠氮乙酸NHS酯、叠氮基-PEG-NHS酯、叠氮基丙胺、叠氮基-PEG-胺、叠氮基-PEG-马来酰亚胺、双砜-PEG-叠氮化物或其衍生物。偶联试剂还可以包含烯烃部分，例如反式环烯烃部分、氧杂降冰片二烯部分或四嗪部分。另外的偶联试剂可以在点击化学工具(https://clickchemistrytools.com/)或Lahann,J(ed)(2009)ClickChemistry for Biotechnology and Materials Science中找到，其每一篇均以其整体通过引用并入本文。
在另一个实施方案中，抗原性多肽经由共价附接而附接到细胞，例如红系细胞，以产生包含呈递一种或多种外源抗原性多肽(例如第一外源抗原性多肽或第一抗原性多肽和第二个外源抗原性多肽)的红系细胞的aAPC。例如，可以使用含有亲电基团的偶联化合物将抗原性多肽衍生化并与红细胞或血小板结合，所述亲电基团将与红系细胞或血小板上的亲核试剂反应形成相互键合的关系。这些亲电基团的代表是αβ不饱和羰基、烷基卤化物和硫醇试剂，如取代的马来酰亚胺。另外，偶联化合物可以经由多肽中的一个或多个官能团，如氨基、羧基和酪氨酸基团与抗原性多肽偶联。为此目的，偶联化合物应包含游离羧基、游离氨基、芳族氨基和其他能够与酶官能团反应的基团。还可以制备高电荷的抗原性多肽以通过静电键合固定化在例如红系细胞或血小板上以产生aAPC。这些衍生物的实例包括聚赖氨酰和聚谷氨酰酶。
衍生物中包含的反应性基团的选择取决于用于使亲电子与红系细胞或血小板上的亲核基团偶联以进行固定化的反应条件。一个控制因素是期望在偶联通过与红系细胞或血小板的附着而固定化的外源多肽之前不使偶联试剂失活。此类偶联固定化反应可以以多种方式进行。通常，偶联试剂可以用于在外源多肽与红系细胞或血小板之间形成桥。在这种情况下，偶联试剂应具有可以使之与外源多肽反应的官能团，如羧基。制备用于缀合的外源多肽的一种方法包括利用偶联试剂中的羧基形成与外源多肽反应的混合酸酐，其中使用能够形成混合酸酐的激活物。此类激活物的代表是氯甲酸异丁酯或其他氯甲酸酯，其与偶联试剂如5,5'-(二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、对氯汞苯甲酸酯(CMB)或间马来酰亚胺基苯甲酸(MBA)产生混合酸酐。偶联试剂的混合酸酐与外源多肽反应以产生反应性衍生物，该反应性衍生物继而可以与红系细胞或血小板上的亲核基团反应以固定化外源多肽。
可以用碳二亚胺等激活物激活抗原性多肽上的官能团，如羧基，。随后，桥接试剂上的官能团，如氨基，将与外源多肽上的激活基团反应形成反应性衍生物。另外，偶联试剂应具有第二反应性基团，其将与红系细胞或血小板上的适当亲核基团反应形成桥。此类反应性基团的典型代表是烷基化剂，如碘乙酸、αβ不饱和羰基化合物，如丙烯酸等，硫醇试剂，如汞、取代的马来酰亚胺等。
或者，可以激活抗原性多肽上的官能团，以便与例如红系细胞或血小板上的亲核试剂直接反应，从而消除了对形成桥的化合物的需要。为此目的，使用激活物如伍德沃德试剂K或类似的试剂，其使外源多肽中的羧基形成烯醇酯，与混合酸酐不同。随后，外源多肽的烯醇酯衍生物与例如红系细胞或血小板上的亲核基团反应以实现抗原性多肽的固定化，从而产生aAPC。
在一些实施方案中，通过使红系细胞与抗原性多肽和任选的有效负载(payload)接触来产生包含呈递(例如，在细胞表面上包含)一种或多种外源抗原性多肽的红系细胞的aAPC，其中接触不包括使用以下附接位点将抗原性多肽与红系细胞缀合，所述附接位点包含Band 3(CD233)、水通道蛋白-1、Glut-1、Kidd抗原、RhAg/R1i50(CD241)、Rli(CD240)、Rh30CE(CD240CE)、Rh30D(CD240D)、Kx、血型糖蛋白B(CD235b)、血型糖蛋白C(CD235c)、血型糖蛋白D(CD235d)、Kell(CD238)、Duffy/DARCi(CD234)、CR1(CD35)、DAF(CD55)、红细胞糖苷脂、CD44、ICAM-4(CD242)、Lu/B-CAM(CD239)、XG1/XG2(CD99)、EMMPRIN/neurothelin(CD147)、JMH、糖基转移酶、Cartwright、Dombrock、C4A/CAB、Scianna、MER2、stomatin、BA-1(CD24)、GPIV(CD36)、CD108、CD139或H抗原(CD173)。在一些实施方案中，红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，红系细胞是有核细胞。
在一些实施方案中，aAPC包含呈递(例如在细胞表面上包含)一种或多种外源抗原性多肽的红系细胞，其中一种或多种外源抗原性多肽是酶缀合的。
在具体的实施方案中，可以通过各种化学和酶促方法将抗原性多肽缀合至例如红系细胞或血小板的表面，包括但不限于与双功能交联剂如例如NHS酯-马来酰亚胺异双功能交联剂，以将伯胺基与还原的硫醇基连接。这些方法还包括酶促策略，如例如，由分选酶介导的转肽酶反应，以使包含受体序列LPXTG(SEQ ID NO:6)或LPXTA(SEQ ID NO:7)的一个多肽与包含N端供体序列GGG的多肽连接，参见例如Swee et al.,PNAS 2013。方法还包括组合方法，如例如分选酶介导的点击化学柄(叠氮化物和炔烃)分别在抗原和细胞上的缀合，然后通过环加成反应将抗原化学键合到细胞上，参见例如Neves et al.,BioconjugateChemistry,2013。分选酶介导的蛋白质修饰描述于国际申请号PCT/US2014/037545和国际申请号PCT/US2014/037554，两者以其整体通过引用并入本文。
在一些实施方案中，通过缀合包含氨基酸、肽、蛋白质、多核苷酸、碳水化合物、标签、金属原子、造影剂、催化剂、非多肽聚合物、识别元件、小分子、脂质、接头、标记、表位、抗原、治疗剂、毒素、放射性同位素、颗粒或包含反应性化学基团(例如点击化学柄)的部分的分选酶底物来修饰蛋白质。
如果需要，可以在细胞内或细胞外在例如红系细胞或血小板上或之内表达形成催化键的多肽结构域。存在许多形成催化键的多肽，包括转肽酶、分选酶和异肽酶，包括衍生自Spy0128(从酿脓链球菌分离的蛋白质)的多肽。
在一些实施方案中，使用分选酶不将本文所述的任何多肽缀合至细胞。
已经证明，分裂Spy0128的自催化异肽键形成亚基(CnaB2结构域)导致两个截然不同的多肽，其彼此保留特异性的催化活性。该系统中的多肽称为SpyTag和SpyCatcher。混合后，SpyTag和SpyCatcher在SpyTag上的Asp117和SpyCatcher上的Lys31之间进行异肽键形成(Zakeri and Howarth,JACS 2010,132:4526)。该反应与细胞环境兼容并且对蛋白质/肽结合具有高度特异性(Zakeri,B.；Fierer,J.O.；Celik,E.；Chittock,E.C.；Schwarz-Linek,U.；Moy,V.T.；Howarth,M.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2012,109,E690-E697)。SpyTag和SpyCatcher已显示指导弹性蛋白样蛋白质的翻译后拓扑修饰。例如，将SpyTag放置在N端并将SpyCatcher放置在C端指导形成环状弹性蛋白样蛋白质(Zhang et al,Journal of the American Chemical Society,2013)。
可以互换组分SpyTag和SpyCatcher，使得其中分子A与SpyTag融合且分子B与SpyCatcher融合和分子A与SpyCatcher融合且分子B与SpyTag融合的系统在功能上等同。出于本文档的目的，当使用SpyTag和SpyCatcher时，应理解，互补分子可以代替其位置。
形成催化键的多肽，如SpyTag/SpyCatcher系统，可以用于将抗原性多肽附着到例如红细胞，例如工程化红系细胞的表面，以产生aAPC。SpyTag多肽序列可以在红系细胞的细胞外表面表达。可以例如将SpyTag多肽融合至1型或3型跨膜蛋白(例如血型糖蛋白A)的N端，融合至2型跨膜蛋白(例如Kell)的C端，并框内插入多通道跨膜蛋白的细胞外末端或细胞外环中，例如，Band3与GPI受体多肽融合，例如，CD55或CD59与脂质链锚定的多肽融合，或与外周膜蛋白融合。编码SpyTag融合物的核酸序列可以在aAPC内表达。抗原性多肽可以与SpyCatcher融合。编码SpyCatcher融合蛋白的核酸序列可以从表达SpyTag融合蛋白的同一红系细胞中表达和分泌。或者，可以在例如细菌、真菌、昆虫、哺乳动物或无细胞的生产系统中外源地产生编码SpyCatcher融合物的核酸序列。SpyTag和SpyCatcher多肽反应后，将形成共价键，该键将抗原性多肽附着在红系细胞的表面上以形成aAPC。包含抗原性多肽融合物的红系细胞是包含缀合的抗原性多肽的aAPC的实例。
在一些实施方案中，可以在红系细胞中在Gatal启动子的控制下，将SpyTag多肽表达为与血型糖蛋白A的N端的融合物。与SpyCatcher多肽序列融合的外源多肽(例如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、外源耗竭氨基酸的多肽和外源Treg共刺激性多肽)可以在同一红系细胞中Gatal启动子的序列控制下表达。当两种融合多肽均表达后，异肽键将在SpyTag和SpyCatcher多肽之间形成，从而在红系细胞表面和外源多肽之间形成共价键。
在另一个实施方案中，可以在红系细胞中在Gatal启动子的控制下，将SpyTag多肽表达为与血型糖蛋白A的N端的融合物。与SpyCatcher多肽序列融合的外源多肽(例如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、外源耗竭氨基酸的多肽和外源Treg共刺激性多肽)可以在合适的哺乳动物细胞表达系统，例如HEK293细胞中表达。在红系细胞上表达SpyTag融合多肽后，可以使SpyCatcher融合多肽与细胞接触。在合适的反应条件下，异肽键将在SpyTag和SpyCatcher多肽之间形成，从而在红系细胞表面和抗原性多肽之间形成共价键。包含抗原性多肽融合物的红系细胞是包含缀合的抗原性多肽的aAPC的一个实例。
其他分子融合物可以在外源多肽之间形成并且包括直接或间接缀合。外源多肽可以彼此直接缀合或通过接头间接缀合。接头可以是肽、聚合物、适体或核酸。聚合物可以是例如天然的、合成的、线性的或支链的。抗原性多肽可以包括包含第一多肽和第二多肽的异源融合蛋白，其中融合蛋白包含彼此直接连接或在一个或两个末端具有中间接头序列和/或其他序列的多肽。与接头的缀合可以通过共价键或离子键进行。
在某些实施方案中，将多肽加载到包含红系细胞的aAPC中。在一些实施方案中，将多肽加载到包含去核细胞的aAPC中。在一些实施方案中，将多肽加载到包含有核细胞的aAPC中。在一些实施方案中，通过向例如红系细胞或血小板加载一种或多种外源多肽，从而使一种或多种外源多肽在红系细胞或血小板种内化来产生包含红系或去核细胞的aAPC。任选地，红系细胞或血小板可以另外加载有效载荷，例如治疗剂。
可以使用多种方法来向例如红系细胞或血小板中加载外源多肽。合适的方法包括，例如低渗裂解、低渗透析、渗透、渗透脉冲、渗透休克、离子电泳、电穿孔、超声、显微注射、钙沉淀、膜插层、脂质介导的转染、去污剂处理、病毒感染、扩散、受体介导的内吞作用、蛋白质转导结构域的使用、粒子发射、膜融合、冻融、机械破坏和过滤。任何一种此类方法或其组合可以用于产生包含呈递(例如在细胞表面上包含)本文所述的一种或多种外源多肽(例如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、外源耗竭氨基酸的多肽和外源Treg共刺激性多肽)的工程化红系细胞的aAPC。
对于低渗裂解，例如，将红系细胞暴露于低离子强度的缓冲液中使其破裂。外源多肽分布在细胞内。可以通过向分离的红细胞沉淀中添加30-50倍体积的5mM磷酸盐缓冲液(pH 8)来低渗裂解红系细胞，特别是红细胞。通过离心分离得到的裂解的细胞膜。将裂解的红细胞膜沉淀重悬并在外源多肽存在下在低离子强度缓冲液中温育例如30分钟。或者，可以将裂解的红细胞膜与外源多肽温育少至一分钟或长达几天，这取决于确定有效负载红系细胞的最佳条件。
或者，可以使用针对低渗溶液的受控透析来向红系细胞，特别是红细胞(例如红细胞)加载外源多肽，以使细胞溶胀并在细胞膜中形成孔(参见例如，美国专利号4,327,710；5,753,221；和6,495,351)。例如，将分离的红细胞沉淀重悬于10mM HEPES、140mM NaCl、5mM葡萄糖pH 7.4中，并在含有10mM NaH2PO4、10mM NaHCO3、20mM葡萄糖和4mM MgCl2，pH 7.4的低离子强度缓冲液进行透析。30-60分钟后，将红细胞进一步用含有外源多肽的16mMNaH2PO4，pH 7.4溶液透析另外30-60分钟。所有这些程序都可以在4℃的温度下有利地进行。在一些情况下，通过透析方法加载大量的红系细胞，特别是红细胞可能是有益的，并且可以使用为此目的设计的特定设备(参见例如美国专利号4,327,710、6,139,836和6,495,351B2)。
可以在生理溶液如例如0.9％盐水、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、细胞培养基、血浆或淋巴液的存在下，通过温和加热来重新密封加载的红系细胞，特别是红细胞。例如，可以通过在60℃的温度下例如100mM磷酸盐(pH 8.0)和150mM氯化钠的150mM盐溶液中处理破坏的红系细胞(特别是红细胞)1-2分钟来产生密封良好的膜。或者，可以将细胞在25-50℃的温度下温育30分钟至4小时(参见例如，美国专利申请2007/0243137A1)。或者，可以通过在37℃的温度下在5mM腺嘌呤、100mM肌苷、2mM ATP、100mM葡萄糖、100mM丙酮酸钠、4mMMgCl2、194mM NaCl、1.6M KCl和35mM NaH2PO4，pH 7.4中温育20-30分钟来重新密封破坏的红细胞(参见例如，美国专利号5,753,221)。
对于电穿孔，例如将红系细胞或血小板暴露于电场中，该电场在细胞膜上引起瞬时孔，从而允许一种或多种外源多肽(例如外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源T细胞扩增多肽、外源共抑制性多肽、外源增殖抑制物、外源耗竭氨基酸的多肽、外源调节性T细胞扩增多肽、外源占位多肽)扩散到细胞中(参见例如，美国专利号4,935,223)。红系细胞，特别是红细胞，例如悬浮在生理和导电介质，如向其中添加一种或多种外源多肽的无血小板血浆中。将体积为0.2至1.0ml的混合物放入电穿孔比色杯中，并在冰上冷却10分钟。将比色杯放置在电穿孔设备中，如例如，ECM 830(来自BTX InstrumentDivision,Harvard Apparatus,Holliston,Mass.)。用大约2.4毫秒长的单个脉冲和大约2.0kV/cm的场强对细胞进行电穿孔。或者，可以使用Bio-Rad Gene Pulsar设备(Bio-Rad,Hercules,Calif.,USA)以0.25.mu.F递送2.2kV的双脉冲对红系细胞特别是红细胞进行电穿孔，以实现载量超过60％(Flynn et al.,Cancer Lett.82:225-229(1994))。将比色杯返回到冰浴中10-60分钟，然后置于37℃水浴中以诱导细胞膜的重新密封。任何合适的电穿孔方法均可以用于产生本文所述的aAPC。
对于超声处理，例如，将红系细胞暴露于高强度声波中，引起细胞膜的瞬时破坏，从而允许一种或多种外源多肽(例如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、外源耗竭氨基酸的多肽和外源Treg共刺激性多肽)扩散到细胞中。任何合适的超声处理方法可以用于产生本文所述的aAPC。
对于去污剂处理，例如，用通过产生孔瞬时破坏细胞膜的温和去污剂处理红系细胞，一种或多种外源多肽(例如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、外源耗竭氨基酸的多肽和外源Treg共刺激性多肽)可以通过所述孔扩散。加载细胞后，将去污剂从细胞中冲洗掉。例如，去污剂可以是皂苷。任何合适的去污剂处理方法均可以用于产生本文所述的aAPC。
对于受体介导的内吞作用，例如，红系细胞可以具有下述表面受体，该表面受体在结合一种或多种外源多肽(例如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、外源耗竭氨基酸的多肽和外源Treg共刺激性多肽)时诱导受体和相关外源多肽的内化。如本文所述，任何合适的内吞方法可以用于产生包含呈递(例如在细胞表面上包含)一种或多种外源多肽的红系细胞的aAPC。
对于机械射击，可以用附着在重的或带电的粒子(例如金微载体)上并受到机械或电加速的一种或多种外源多肽(例如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、外源耗竭氨基酸的多肽和外源Treg共刺激性多肽)轰击红系细胞，使得它们穿过细胞膜。可以使用例如Helios基因枪(来自，例如，Bio-Rad,Hercules,Calif.,USA)实现微粒轰击。任何合适的微粒轰击方法可以用于产生本文所述的aAPC。
对于过滤，可以迫使红系细胞或血小板和外源多肽通过孔径小于细胞的滤器，从而引起细胞膜的瞬时破坏并允许外源多肽进入细胞。可以使用任何合适的过滤方法来产生包含呈递(例如在细胞表面上包含)如本文所述外源多肽的工程化红系细胞的aAPC。
对于冻融，对红系细胞进行数次冻融循环，导致细胞膜破裂(参见例如，美国专利申请2007/0243137 A1)。在这种情况下，将堆积的红细胞(0.1-1.0ml)沉淀与等体积(0.1-1.0ml)的含有一种或多种外源多肽的等渗溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)混合。将含有细胞和一种或多种外源多肽的试管浸入液氮中将红细胞冷冻。或者，可以通过将试管置于-20℃或-80℃的冷冻室中来冷冻细胞。然后将细胞在例如23℃的水浴中解冻，并在必要时重复循环以增加加载。可以使用任何合适的冻融方法来产生包含呈递(例如在细胞表面上包含)如本文所述外源多肽的工程化红系细胞的aAPC。
可以在aAPC上检测外源多肽。外源多肽的存在可以使用标准分子生物学方法，例如Western印迹或FACS分析来验证和定量。细胞内环境中存在的外源多肽可以在细胞裂解或使用荧光检测时进行定量。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，红系细胞是去核细胞。在上述方面和实施方案的一些实施方案中，红系细胞是有核细胞。
本文所述多肽的媒介物
在一方面，本文所述的一种或多种多肽加载、附着(例如固定化或缀合)在非细胞递送媒介物的表面上和/或包封在非细胞递送媒介物中。非细胞递送媒介物可以是例如纳米脂质凝胶、聚合物颗粒、琼脂糖颗粒、乳胶颗粒、二氧化硅颗粒、脂质体或多层囊泡。在一些实施方案中，非细胞递送媒介物包含直径为约1nm至约900nm的纳米颗粒或由其组成。在一些实施方案中，非细胞递送媒介物包含平均直径为约0.1至约20微米(如约0.5微米至约10微米，例如约5微米或更小(例如约2.5至约5微米))。在一些实施方案中，非细胞递送媒介物包含平均直径为约1μm至约10μm。在一些实施方案中，非细胞递送媒介物包含可生物降解的聚合物。在一些实施方案中，非细胞递送媒介物包含天然聚合物。在一些实施方案中，非细胞递送媒介物包含合成聚合物。代表性的聚合物包括但不限于聚(羟基酸)、聚羟基链烷酸酯、聚己内酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酯酰胺、聚(丙烯酰胺)、聚(酯)、聚(氰基丙烯酸烷基酯)、聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)和聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)及其组合。在一些实施方案中，非细胞递送媒介物包含琼脂糖、乳胶或聚苯乙烯。可以使用本领域已知的标准方法将本文所述的一种或多种多肽缀合至非细胞递送媒介物(参见例如，Ulbrich etal.(2016)Chem Rev.116(9):5338-431)。缀合可以是共价的或非共价的。例如，在其中非细胞递送媒介物是脂质体的实施方案中，本文所述的多肽可以经由聚乙二醇(PEG)链附接至脂质体。多肽与脂质体的缀合也可以涉及硫酯键，例如通过硫醇和马来酰亚胺基团的反应。交联剂可以用于产生巯基基团以使多肽附接至非细胞递送媒介物(参见例如Paszko andSenge(2012)Curr.Med.Chem.19(31):5239-77)。在一些实施方案中，包含一种或多种本文所述的多肽的非细胞递送媒介物可以用于本文提供的任何治疗方法中。
IV.人工抗原呈递细胞的使用方法
本公开涵盖使用本文所述的aAPC的各种方法。如本领域技术人员将理解的，基于本文提供的公开，可以针对本文所述的每种应用特别地调整aAPC的施用剂量和时机。更具体地，在期望使用由aAPC或几个aAPC表达的某些分子对T细胞提供刺激，随后使用表达不同的(即使重叠的)一组分子的另一个aAPC或几个aAPC刺激的情况下，则可以使用顺式和反式方法的组合。本质上，本公开的aAPC和本文公开的方法提供了几乎无限数量的变型，并且本公开不以任何方式限于任何特定的组合或方法。具有本文提供的教导和本领域可获得的知识的技术人员可以容易地确定每种特定T细胞的所需方法。
在一方面，本公开的特征在于激活抗原特异性T细胞的方法，该方法包括使T细胞与本文所述的aAPC接触，从而激活抗原特异性T细胞。在一些实施方案中，激活抗原特异性T细胞包括激活具有中央记忆表型的抗原特异性T细胞。在某些实施方案中，激活抗原特异性T细胞包括促进记忆T细胞的扩增。在其他实施方案中，激活抗原特异性T细胞包括分化或去分化T细胞。例如，长寿命的记忆CD8 T细胞是通过去分化过程从效应T细胞的亚组中衍生而来的。
在另一方面，本公开的特征在于抑制T细胞活性的方法，该方法包括使T细胞与经工程化改造以抑制T细胞活性的aAPC接触，从而抑制T细胞的活性。
在另一方面，本发明的特征在于用于激活Treg细胞的方法，该方法包括使Treg细胞与经工程化改造以激活调节性T细胞(Treg)的aAPC接触，从而激活Treg细胞。
在另一方面，本发明的特征在于诱导表达受体分子的T细胞增殖的方法，该方法包括使T细胞与本文所述的aAPC接触，其中共刺激性多肽与受体分子特异性结合，从而诱导所述T细胞的增殖。
本公开还涵盖用于特异性诱导表达已知共刺激性分子的T细胞增殖的方法。该方法包括使包含至少一种表达已知的共刺激性分子的T细胞的T细胞群体与经工程化改造以呈递共刺激性分子的配体的aAPC接触。如本文其他地方所公开的，在aAPC表达至少一种与T细胞上的共刺激性分子特异性结合的共刺激配体的情况下，共刺激性分子与其同源共刺激性配体的结合诱导T细胞的增殖。因此，感兴趣的T细胞经诱导以增殖，而不必首先从细胞群体中纯化细胞。而且，该方法提供了一种快速测定法，用于确定群体中是否有任何细胞表达特定的感兴趣的共刺激性分子，因为将细胞与aAPC接触将诱导增殖和检测正在生长的细胞，从而鉴定出样品中存在表达感兴趣的共刺激性分子的T细胞。以此方式，可以扩增和分离其中在细胞表面上至少一种共刺激性分子是已知的任何感兴趣的T细胞。
本公开还包括用于特异性扩增T细胞群体亚组的方法。更具体地，该方法包括使包含至少一种感兴趣的亚组的T细胞的T细胞群体与能够扩增该T细胞的aAPC或至少表达至少一种与T细胞表面的同源共刺激性分子特异性结合的共刺激性配体的aAPC接触。共刺激性分子与其结合配偶体共刺激性配体的结合诱导了T细胞的增殖，从而特异性地扩增T细胞群体的亚组。基于本文提供的公开，本领域技术人员将理解，T细胞亚组包括T辅助(TH1和TH2)细胞、表达CD4的细胞、细胞毒性T淋巴(CTL)(Tc1或Tc2)细胞、T调节(TREG)细胞、TC/S、初始、记忆、中央记忆、效应记忆和γΔT细胞。因此，使用本公开的方法可以容易地产生针对特定T细胞亚组富集的细胞群体。
在某些实施方案中，T细胞扩增至约100至约1,000,000倍，或约1,000和约1,000,000倍之间，例如1,000和约100,000倍之间。
离体扩增后T细胞的适应性是它们在体内起作用的能力的极好的预测指标。因此，在某些实施方案中，还测量了aAPC诱导关键细胞存活基因Bcl-xL的能力。扩增过程期间培养物中凋亡细胞的百分比用于确定是否有任何基于细胞的aAPC赋予扩增的T细胞特定的存活优势。另外，可以测量离体扩增后细胞的端粒长度，以确定特定的aAPC是否在保留其扩增的细胞的复制潜能方面更有效。
本公开还包括用于鉴定共刺激性配体或其组合的方法，其特异性诱导T细胞亚组的激活。简而言之，该方法包括使T细胞群体与呈递(例如在细胞表面上包含)至少一种共刺激性配体的aAPC接触，并将与aAPC接触的T细胞亚组的增殖水平与未与aAPC接触的其他方面相同的T细胞亚组的增殖水平进行比较。与未与aAPC接触的其他方面相同的T细胞亚组的增殖水平相比，与aAPC接触的T细胞亚组的增殖水平更高，这表明在共刺激性配体上特异性诱导该T细胞所属的T细胞亚组的激活。
该方法允许鉴定特异性扩增T细胞亚组的共刺激性配体，其中先前不知道哪个因素扩增该T细胞亚组。本领域技术人员将理解，为了使筛选的次数最少，优选转导尽可能多的编码共刺激性配体的核酸，从而可以减少测定的次数。此外，该方法通过组合各种蛋白质(例如刺激性配体、共刺激性配体、抗原、细胞因子等)来允许评估哪种因子组合将使aAPC或aAPC的组合最有效以扩增T细胞亚组。通过这种方式，可以检查每个T细胞亚组对生长和激活的各种要求。此外，为了评估T细胞扩增，可以使用CFSE染色。将aAPC与CD8 T细胞(例如来自患有疾病或病症，如自身免疫疾病、传染病或癌症的受试者)混合。为了比较细胞扩增的初始速率，对细胞进行CFSE染色以确定每种aAPC诱导所有T细胞增殖的程度。CFSE染色提供了更多的定量终点，并允许同时对扩增的细胞进行表型分析。刺激后每天，从每种培养物中取出等分的细胞，并通过流式细胞术进行分析。CFSE染色使细胞高度发荧光。细胞分裂后，荧光减半，并因此细胞分裂的次数越多，荧光就越少。每种aAPC诱导T细胞增殖的能力通过测量分裂一次、两次、三次等的细胞数进行定量。在特定时间点诱导最多细胞分裂的aAPC认为是最有效力的扩增物。
为了确定这些aAPC促进T细胞长期生长的能力，生成了细胞生长曲线。这些实验的设置与CFSE实验完全相同，但未使用CFSE。每隔培养的2-3天，将T细胞从各自的培养物中取出，并使用Coulter计数器进行计数，该计数器测量存在的细胞数和细胞的平均体积。平均细胞体积是何时重新评估细胞的最佳预测物。通常，当适当刺激T细胞时，它们的细胞体积增加三倍。当此体积减少到初始爆发的一半以上时，可能有必要重新刺激T细胞以维持对数线性扩增(Levine et al.,1996,Science 272:1939-1943；Levine et al.,1997,J.Immunol.159:5921-5930)。计算每种aAPC诱导20个群体加倍所需的时间。每种aAPC诱导此水平的T细胞扩增的相对差异是关于特定aAPC用于进行临床试验的重要标准。
由每种aAPC扩增的细胞表型的特征在于确定特定亚组是否优先扩增。在每次再刺激之前，使用Appay等人(2002,Nature Med.8,379-385)提出的CD27和CD28定义和Sallusto等人(1999,Nature 401:708-712)提出的CCR7定义对扩增的T细胞群体进行表型分析，以定义扩增的T细胞的分化状态。(2002，Nature Med.8，379-385)。穿孔素和颗粒酶B细胞内染色用于进行总体测量以评估溶细胞潜能。
在一方面，该方法包括在不首先表征T细胞亚组表面上的共刺激性分子的情况下使各种aAPC与T细胞亚组接触。而且，本公开涵盖其中在使aAPC与细胞接触之前检查存在于T细胞亚组表面上的共刺激性分子的方法。因此，本公开提供了用于确定各种T细胞亚组的生长需求的新测定法。
在另一方面，本公开的特征在于治疗需要改变的免疫应答的受试者的方法，该方法包括使受试者的T细胞与本文所述的APC接触，从而治疗需要改变的免疫应答的受试者。在一些实施方案中，接触是体外或体内的。在一些实施方案中，接触是体外的。在一些实施方案中，接触是体内的。
在另一方面，本公开的特征在于治疗需要改变的免疫应答的受试者的方法，该方法包括a)确定受试者的HLA状态，b)选择与受试者免疫学相容的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC是表达第一外源抗原性多肽的工程化红系细胞，以及c)将aAPC施用于受试者，从而治疗需要改变的免疫应答的受试者。
在另一方面，本公开的特征在于治疗需要改变的免疫应答的受试者的方法，该方法包括a)确定受试者中抗原的表达谱，b)选择人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC是表达第一外源抗原性多肽的工程化红系细胞，以及c)将aAPC施用于受试者，从而治疗需要改变的免疫应答的受试者。
通过施用本公开的aAPC在受试者中诱导的免疫应答可以包括能够杀伤肿瘤和感染细胞的由CD8+ T细胞介导的细胞免疫应答，以及CD4+ T细胞反应。也可以诱导主要由B细胞介导的体液免疫应答，该B细胞在由CD4+ T细胞激活后产生抗体。可以使用多种技术来分析由本公开的组合物诱导的免疫应答的类型，这在本领域中已得以充分描述；例如，Coligan et al.,Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons Inc.,1994。
CD8+细胞毒性T细胞对与MHC I分子缔合的抗原有反应。CD4+辅助T细胞对与MHCII分子缔合的抗原有反应。激活的CD4+ T细胞继而激活新的和现有的CD8+ T细胞(抗原特异性和初始CD8+ T细胞两者)。因此，预期在本发明的一些实施方案中，可以将扩增和激活抗原特异性CD8+ T细胞的aAPC(包含与MHC I缔合的抗原的aAPC)与激活CD4+ T细胞的aAPC(包含与MHC II缔合的抗原的aAPC)一起施用，从而增强免疫应答。在一些实施方案中，可以将扩增并激活抗原特异性CD8+ T细胞的aAPC与激活CD4+ T细胞的aAPC一起施用，从而协同增加免疫应答的稳健性。在一些实施方案中，可以将包含与MHC I和共刺激性多肽缔合的抗原的aAPC与包含与MHC II缔合的抗原的aAPC一起施用。在其他实施方案中，可以将包含与MHC I缔合的抗原的aAPC与包含与MHC II和共刺激性多肽缔合的抗原的aAPC一起施用。在一些实施方案中，可以将包含与MHC I和共刺激性多肽缔合的抗原的aAPC与包含与MHC II和共刺激性多肽缔合的抗原的aAPC一起施用。
在一些实施方案中，将包含外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽的aAPC，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或MHC I类单链融合物，以及包含外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽的aAPC，其中外源抗原呈递多肽是MHC II类多肽或MHC II类单链融合物，一起施用于受试者。施用和与MHC II缔合的抗原组合的与MHC I缔合的抗原提供CD8+和CD4+ T细胞的互补作用。
在进一步的方面，本发明还提供了通过细胞表面部分连接来扩增T细胞群体的方法。另外，一个目的是提供诱导受试者的T细胞群体长期快速指数增殖至足够数量以用于研究目的的方法，该方法包括从受试者分离T细胞群体，通过使T细胞离体接触至少一种向T细胞提供初级激活信号的外源多肽来激活T细胞群体；和用至少一种提供共刺激性信号的第二外源多肽刺激激活的T细胞，从而使已接受初级激活信号的T细胞受刺激以迅速增殖。特别地，一个目的是提供当受试者是人类时的此类方法，并且其中该方法进一步包括使用激活的T细胞在受试者中鉴定抗原。此外，当受试者感染具有与其相关的至少一种抗原的疾病或病症时，所提供的方法进一步包括使用激活的T细胞来鉴定至少一种抗原。抗原可以包含例如并不限于肿瘤抗原、与自身免疫病症或状况有关的抗原，或传染病或病原体。该方法进一步包括筛选至少一种抗原作为靶分子用于研究目的，或用于基于该至少一种抗原开发疫苗。
治疗将从T细胞反应的调控中受益的状况
施用包含(例如呈递)外源试剂(例如多肽)的工程化红系细胞的方法描述于例如WO2015/073587和WO2015/153102中，其每一篇均以其整体通过引用并入本文。
在实施方案中，将包含本文所述的工程化红系细胞的aAPC施用于受试者，例如哺乳动物，例如人。可以治疗的示例性哺乳动物包括但不限于人类、家养动物(例如狗、猫等)、农场动物(例如牛、绵羊、猪、马等)和实验动物(例如猴、大鼠、小鼠、兔、豚鼠等)。本文所述的方法适用于人类疗法和兽医应用两者。在一些实施方案中，红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，红系细胞是有核细胞。
在一些实施方案中，每1、2、3、4、5或6个月向患者施用红系细胞。
在一些实施方案中，红系细胞的剂量包含约1x109-2x109、2x109-5x109、5x109-1x1010、1x1010-2x1010、2x1010-5x1010、5x1010-1x1011、1x1011-2x1011、2x1011-5x1011、5x1011-1x1012、1x1012-2x1012、2x1012-5x1012或5x1012-1x1013个细胞。
在一些实施方案中，以足以在2周至一年(例如，一个月至一年或更长时间，例如，至少2周、4周、6周、8周、3个月、6个月、1年、2年)的时间段内维持患者血液中所施用的红系细胞的功能的剂量方案(施用的剂量和周期)向患者施用红系细胞。
在一些实施方案中，将红系细胞(例如本文所述的aAPC)以两个剂量或更多(例如2、3、4或更多个剂量)施用于患者。在进一步的实施方案中，将红系细胞(例如本文所述的aAPC)以两个剂量或更多施用于患者，其中当确定T细胞增殖处于峰值时，在第一剂量之后的时间施用第二剂量。在一些实施方案中，以第一剂量施用本公开的aAPC，其中第一剂量刺激T细胞增殖和活化。在第一剂量之后，当T细胞被激活并且增殖达到其峰值时，以第二剂量施用本发明的aAPC以刺激T细胞扩增。不受理论的束缚，以两个剂量或更多施用本公开的aAPC，增加了aAPC加强记忆T细胞群体的能力，从而提供了更长的功效，例如，针对肿瘤复发或用感染原再次攻击的功效。
可以使用技术人员已知的方法确定T细胞增殖峰值。例如，可以通过3H-胸苷掺入，通过增殖的T细胞或通过用荧光染料5,6-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记增殖的T细胞来确定T细胞增殖峰值。
在一些方面，本公开提供了治疗本文所述的疾病或状况的方法，其包括向有此需要的受试者施用本文所述的组合物，例如本文所述的aAPC。在一些实施方案中，疾病或状况是癌症。在一些实施方案中，疾病或状况是自身免疫疾病。在一些实施方案中，疾病或状况是与感染原相关或由其触发的自身免疫疾病。在一些实施方案中，疾病或状况是传染病。
在一些方面，本公开提供了本文所述的aAPC在治疗本文所述的疾病或状况中，例如癌症、自身免疫疾病，如由感染原触发的自身免疫疾病，或传染病的用途。在一些方面，本公开提供了本文所述的aAPC在制备用于治疗本文所述的疾病或状况的药物中的用途，所述疾病或状况例如癌症、自身免疫疾病，如由感染原触发的自身免疫疾病，或传染病。
在一些实施方案中，aAPC包含第一外源多肽，其包含第一治疗剂(例如抗癌治疗剂、自身免疫治疗剂、传染病治疗剂)。在某些优选的实施方案中，第一治疗剂是抗原，例如肿瘤抗原、与自身免疫病症或状况(如由感染原触发的自身免疫疾病)有关的抗原或与传染病或病原体有关的抗原。在实施方案中，aAPC进一步包含第二外源多肽，其中第二外源多肽包含抗原呈递多肽，例如MHCI或MHCII。在实施方案中，aAPC进一步包含第三外源多肽，其中第三外源多肽包含至少一种如本文所公开的共刺激性多肽、共抑制性多肽或Treg扩增多肽。
在一些实施方案中，aAPC包含第一外源多肽，其包含第一治疗剂(例如抗癌治疗剂、自身免疫治疗剂、传染病治疗剂)和第二外源多肽，其包含第二治疗剂(例如抗癌治疗剂、自身免疫治疗剂、传染病治疗剂)。在某些优选的实施方案中，治疗剂是抗原性多肽，例如肿瘤抗原、与自身免疫病症或状况(如由感染原触发的自身免疫疾病)有关的抗原或与传染病或病原体有关的抗原。在实施方案中，aAPC进一步包含第三外源多肽，其中第三外源多肽包含抗原呈递多肽，例如MHCI或MHCII。在实施方案中，aAPC进一步包含第四外源多肽，其中第四外源多肽包含至少一种如本文所公开的共刺激性多肽、共抑制性多肽或Treg扩增多肽。
在一些实施方案中，aAPC包含第一外源多肽，其包含第一治疗剂(例如抗癌治疗剂、自身免疫治疗剂、传染病治疗剂)，第二外源多肽，其包含第二治疗剂(例如抗癌治疗剂、自身免疫治疗剂、传染病治疗剂)和第三外源多肽，其包含第三种治疗剂(例如抗癌治疗剂、自身免疫治疗剂、传染病治疗剂)。在某些优选的实施方案中，治疗剂是抗原性多肽，例如肿瘤抗原，与自身免疫病症或状况有关的抗原或与传染病或病原体有关的抗原。在实施方案中，aAPC进一步包含第四外源多肽，其中第四外源多肽包含抗原呈递多肽，例如MHCI或MHCII。在实施方案中，aAPC进一步包含第五外源多肽，其中第三外源多肽包含至少一种本文所公开的共刺激性多肽、共抑制性多肽或Treg扩增多肽。
在实施方案中，第一、第二和第三治疗剂中的任何两种或更多种可以识别、结合和/或作用于相同靶标，例如细胞表面受体和/或内源人蛋白质。或者，第一、第二和第三治疗剂可以作用于不同的靶标。
第一、第二或第三靶标可以是同一生物途径的成员，其中任选地，靶标是细胞表面受体、内源人蛋白质。如本文所用，术语“途径”或“生物途径”是指以顺序方式一起起作用的多个生物分子，例如多肽。途径的实例包括信号转导级联和补体级联。在一些实施方案中，途径以检测细胞外信号开始，并以靶基因的转录变化结束。在一些实施方案中，途径从检测细胞质信号开始，并以靶基因的转录变化结束。途径可以是线性的或分支的。如果分支，则它可以具有多个输入(收敛)或多个输出(发散)。
第一、第二或第三靶标可以在相同细胞类型上或在不同细胞类型上。在一些实施方案中，第一外源多肽结合第一细胞，例如第一细胞类型，并且第二外源多肽结合第二细胞，例如第二细胞类型。在一些实施方案中，第一和第二细胞类型是相同的。在一些实施方案中，第一和第二细胞类型是不同的。在一些实施方案中，第一外源多肽将工程化红系细胞定位在期望的位点，例如人细胞，并且第二外源多肽具有治疗活性，例如抗原呈递活性。
在某些实施方案中，治疗剂是合适的外源抗原，其被选择与特定靶标相互作用。合适的靶标包括与特定疾病、病症或装(例如癌症、自身免疫疾病、传染病)有关的实体。但是，也可以独立于特定疾病、病症或状况选择靶标。
在一些实施方案中，第一和第二外源多肽或第一和第二和第三外源多肽的作用是协同的。术语“协同的”或“协同作用”意指与它们的单独作用相比，两种或更多种试剂(例如，作为工程化红系细胞的一部分的多肽)的组合的超过累加的作用。在某些实施方案中，协同活性是包含第一多肽和第二多肽的工程化红系细胞与包含第一多肽的工程化红系细胞和包含第二多肽的工程化红系细胞相比的超过累加的作用。在一些实施方案中，当第一试剂产生可检测水平的输出X，第二试剂产生可检测水平的输出X，并且第一和第二试剂一起产生输出X的超出累加水平时，存在协同活性。
癌症
在某些实施方案中，本公开提供了包含红系细胞(例如去核红系细胞)或去核细胞的aAPC，其包含一种或多种外源多肽，其中一种或多种外源多肽之一包含用于治疗癌症的治疗剂(抗癌治疗剂)。在一些实施方案中，aAPC包括包含第一抗癌治疗剂的第一外源多肽和包含第二抗癌治疗剂的第二外源多肽。在一些实施方案中，aAPC包括包含第一抗癌治疗剂的第一外源多肽，包含第二抗癌治疗剂的第二外源多肽和包含第三抗癌治疗剂的第三外源多肽。第一、第二和第三抗癌治疗剂中的任何两种或更多种可以作用于相同的靶标，例如细胞表面受体和/或内源人蛋白质。或者，第一、第二和第三抗癌治疗剂可以作用于不同的靶标。第一、第二和第三靶标中的任何两种或更多种可以是同一生物途径的成员，其中任选地，靶标是细胞表面受体、内源人蛋白质。第一、第二或第三靶标可以在不同的细胞类型上。在一些实施方案中，第一外源多肽将工程化红系细胞定位在期望的位点，例如人细胞，并且第二外源多肽具有治疗活性，例如抗原呈递活性。
在某些优选的实施方案中，第一治疗剂是抗原，例如肿瘤抗原。在某些实施方案中，第一治疗剂和第二治疗剂是抗原，例如肿瘤抗原。在某些实施方案中，第一、第二和第三治疗剂是抗原，例如肿瘤抗原。
在实施方案中，aAPC进一步包含另外的外源多肽，其中另外的外源多肽包含抗原呈递多肽，例如MHC分子(例如MHCI或MHCII)。在实施方案中，aAPC进一步包含另外的外源多肽，其中另外的外源多肽包含至少一种共刺激性多肽。在一些实施方案中，aAPC进一步包括包含抗原呈递多肽的另外的外源多肽和包含至少一种共刺激性多肽的另外的外源多肽。
在一些实施方案中，aAPC包含第一外源多肽，其包含抗原呈递多肽，例如MHC分子(例如MHCI或MHCII)，并且第二外源多肽包含抗原(例如，肿瘤相关抗原)。
在本发明的一些实施方案中，预期可以将肿瘤中扩增和激活抗原特异性CD8+ T细胞的aAPC(包含与MHC I缔合的抗原的aAPC)与激活CD4+ T细胞的aAPC(包含与MHC II缔合的抗原的aAPC)一起施用，其激活肿瘤和淋巴结中的抗原特异性和初始CD8+ T细胞两者，从而增强稳健的抗肿瘤反应。在一些实施方案中，可以将肿瘤中扩增和激活抗原特异性CD8+T细胞的aAPC与激活CD4+ T细胞的aAPC一起施用，其激活肿瘤和淋巴结中的抗原特异性和初始CD8+ T细胞两者，从而协同增加免疫应答的稳健性。
在一些实施方案中，aAPC包含第一外源抗原呈递多肽和包含抗原(例如第一肿瘤相关抗原)的第二外源多肽，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或者将MHC I类单链融合物，该aAPC与包含第一外源抗原呈递多肽和包含抗原(例如第二肿瘤相关抗原)的第二外源多肽的aAPC一起施用于受试者，其中外源呈递抗原的多肽是MHC II类多肽或者将MHC II类单链融合物施用于受试者。在一些实施方案中，可以将包含与MHC I缔合的抗原和共刺激性多肽的aAPC与包含与MHC II的缔合抗原的aAPC一起施用。在其他实施方案中，可以将包含与MHC I缔合的抗原的aAPC与包含与MHC II缔合的抗原和共刺激性多肽的aAPC一起施用。在一些实施方案中，可以将包含与MHC I缔合的抗原和共刺激性多肽的aAPC与包含与MHC II缔合的抗原和共刺激性多肽的aAPC一起施用。
不受理论的束缚，认为MHC I和MHC II肿瘤抗原呈递与有效的共刺激相结合具有产生持续的肿瘤特异性杀伤的潜力。
本发明涵盖抗原可以是本领域已知的任何肿瘤抗原或其抗原性部分，包括但不限于表1中所示的任何一种或多种抗原或其抗原性部分。本领域技术人员将认识到，包含表1中所示抗原的aAPC可以用于治疗癌症，例如对应于如表1中所示特定抗原或抗原性肽的特定癌症。
因此，在一些方面，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的本文所述的aAPC，从而治疗癌症。
在另一方面，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源多肽，其中一种或多种外源多肽之一包含肿瘤相关抗原，从而治疗癌症。本发明设想了特定癌症(作为在方法中待治疗的癌症)和肿瘤相关抗原(作为在aAPC上存在的抗原)的任何组合，如表1中所示。
在另一方面，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源多肽，其中一种或多种外源多肽包含MAGE-A抗原，从而治疗癌症。在一些实施方案中，红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，红系细胞是有核细胞。在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源多肽，其中一种或多种外源多肽包含MAGE-A1抗原，从而治疗癌症。在一些实施方案中，MAGE-A1抗原是表1中所示的MAGE-A1抗原。在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源多肽，其中一种或多种外源多肽之一包含MAGE-A2抗原，从而治疗癌症。在一些实施方案中，MAGE-A2抗原是表1中所示的MAGE-A2抗原。在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源多肽，其中一种或多种外源多肽之一包含MAGE-A3抗原，从而治疗癌症。在一些实施方案中，MAGE-A3抗原是表1中所示的MAGE-A3抗原。在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源多肽，其中一种或多种外源多肽之一包含MAGE-A4抗原，从而治疗癌症。在一些实施方案中，MAGE-A4抗原是表1中所示的MAGE-A4抗原。在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源多肽，其中一种或多种外源多肽之一包含MAGE-A5抗原，从而治疗癌症。在一些实施方案中，MAGE-A5抗原是表1中所示的MAGE-A5抗原。在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源多肽，其中一种或多种外源多肽之一包含MAGE-A6抗原，从而治疗癌症。在一些实施方案中，MAGE-A6抗原是表1中所示的MAGE-A6抗原。在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源多肽，其中一种或多种外源多肽之一包含MAGE-A7抗原，从而治疗癌症。在一些实施方案中，MAGE-A7抗原是表1中所示的MAGE-A7抗原。在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源多肽，其中一种或多种外源多肽之一包含MAGE-A8抗原，从而治疗癌症。在一些实施方案中，MAGE-A8抗原是表1中所示的MAGE-A8抗原。在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源多肽，其中一种或多种外源多肽之一包含MAGE-A9抗原，从而治疗癌症。在一些实施方案中，MAGE-A9抗原是表1中所示的MAGE-A9抗原。在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源多肽，其中一种或多种外源多肽之一包含MAGE-A10抗原，从而治疗癌症。在一些实施方案中，MAGE-A10抗原是表1中所示的MAGE-A10抗原。在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源多肽，其中一种或多种外源多肽之一包含MAGE-A11抗原，从而治疗癌症。在一些实施方案中，MAGE-A11抗原是表1中所示的MAGE-A11抗原。在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源多肽，其中一种或多种外源多肽之一包含MAGE-A12抗原，从而治疗癌症。在一些实施方案中，MAGE-A12抗原是表1中所示的MAGE-A1抗原。在一些实施方案中，MAGE-A2抗原是表1中所示的MAGE-A12抗原。
在一些实施方案中，癌症是急性骨髓性白血病(AML)。在一些实施方案中，癌症是黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是实体瘤。
在另一方面，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源抗原性多肽，其中一种或多种外源抗原性多肽之一包含MAGE-A抗原的免疫原性肽。在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源抗原性多肽，其中一种或多种外源抗原性多肽之一包含MAGE-A家族的几种肿瘤抗原共有的表位。在一些实施方案中，外源抗原性多肽是p248v9，其是由HLA-A*0201呈递的免疫原性肽，并且能够诱导识别所有MAGE-A抗原的细胞毒性T淋巴细胞。在一些实施方案中，外源抗原性多肽是免疫原性肽p248g9(YLEYRQVPG(SEQ ID NO:156))。在一些实施方案中，外源抗原性多肽是免疫原性肽p248d9(YLEYRQVPD(SEQ ID NO:125))。
在一些实施方案中，癌症是急性骨髓性白血病(AML)。在一些实施方案中，癌症是黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是实体瘤。
在另一方面，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源多肽，其中一种或多种外源多肽之一包含嗜中性粒细胞颗粒蛋白酶抗原，从而治疗癌症。在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源抗原性多肽，其中一种或多种外源抗原性多肽之一包含嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抗原，从而治疗癌症。在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源抗原性多肽，其中一种或多种外源抗原性多肽之一包含蛋白酶3抗原，从而治疗癌症。在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源抗原性多肽，其中一种或多种外源抗原性多肽之一包含组织蛋白酶G抗原，从而治疗癌症。
在一些实施方案中，癌症是急性骨髓性白血病(AML)。在一些实施方案中，癌症是慢性骨髓性白血病(CML)。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，癌症是肺癌。在一些实施方案中，癌症是黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是实体瘤。
在另一方面，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源多肽，其中一种或多种外源多肽之一包含PR1(VLQELNVTV(SEQ ID NO:225))。
在一些实施方案中，癌症是急性骨髓性白血病(AML)。在一些实施方案中，癌症是慢性骨髓性白血病(CML)。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，癌症是肺癌。在一些实施方案中，癌症是黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是实体瘤。
在另一方面，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源抗原性多肽，其中一种或多种外源抗原性多肽之一包含NY-ESO-1/LAGE-2抗原，从而治疗癌症。
在一些实施方案中，癌症是多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症是非小细胞肺癌。在一些实施方案中，癌症是卵巢癌。在一些实施方案中，癌症是黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是实体瘤。
在另一方面，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源抗原性多肽，其中一种或多种外源抗原性多肽之一包含至少一种NY-ESO-1/LAGE-2衍生肽。在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源抗原性多肽，其中一种或多种外源抗原性多肽之一包含至少一种衍生自NY-ESO-1/LAGE-2的外源HLAI类结合多肽。在一些实施方案中，多肽是SLLMWITQC(SEQ ID NO:110)。在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源抗原性多肽，其中一种或多种外源抗原性多肽之一包含至少一种衍生自NY-ESO-1/LAGE-2的外源HLA II类结合多肽。在一些实施方案中，多肽是SLLMWITQCFLPVF(SEQ ID NO:114)。
在一些实施方案中，外源抗原性多肽包含选自以下的NY-ESO-1/LAGE-2抗原：SLLMWITQC(SEQ ID NO:110)、MLMAQEALAFL(SEQ ID NO:109)、YLAMPFATPME(SEQ ID NO:204)、ASGPGGGAPR(SEQ ID NO:205)、LAAQERRVPR(SEQ ID NO:111)、TVSGNILTIR(SEQ IDNO:206)、APRGPHGGAASGL(SEQ ID NO:207)、MPFATPMEAEL(SEQ ID NO:208)、KEFTVSGNILTI(SEQ ID NO:209)、MPFATPMEA(SEQ ID NO:210)、FATPMEAEL(SEQ ID NO:211)、FATPMEAELAR(SEQ ID NO:212)、LAMPFATPM(SEQ ID NO:213)、ARGPESRLL(SEQ ID NO:214)、SLLMWITQCFLPVF(SEQ ID NO:114)、LLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQ(SEQ ID NO:215)、LLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQ(SEQ ID NO:215)、EFYLAMPFATPM(SEQ ID NO:216)、PGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR(SEQ ID NO:217)、RLLEFYLAMPFA(SEQ ID NO:218)、QGAMLAAQERRVPRAAEVPR(SEQ ID NO:115)、PFATPMEAELARR(SEQ ID NO:219)、PGVLLKEFTVSGNILTIRLT(SEQ ID NO:220)、VLLKEFTVSG(SEQ ID NO:221)、AADHRQLQLSISSCLQQL(SEQ ID NO:116)、LLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQ(SEQ ID NO:215)、LKEFTVSGNILTIRL(SEQ ID NO:222)、PGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR(SEQ ID NO:217)、LLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQ(SEQ ID NO:215)、KEFTVSGNILT(SEQ ID NO:223)、LLEFYLAMPFATPM(SEQ ID NO:224)和AGATGGRGPRGAGA(SEQ ID NO:119)。在一些实施方案中，NY-ESO-1/LAGE-2抗原是表1中所示的一种或更多种NY-ESO-1/LAGE-2抗原。
在一些实施方案中，癌症是多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症是非小细胞肺癌。在一些实施方案中，癌症是卵巢癌。在一些实施方案中，癌症是黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是实体瘤。
在另一方面，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源抗原性多肽，其中一种或多种外源抗原性多肽之一是gp100多肽。在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源抗原性多肽，其中一种或多种外源抗原性多肽之一是gp100多肽，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽(例如，MHC I类或II类分子)特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物，其中外源抗原性多肽是gp100抗原。在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽(例如，MHC I类或II类分子)特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物或者MHC II类多肽或单链融合物，其中外源抗原性多肽是gp100抗原，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽(例如，MHCI类或II类分子)特异性结合，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，其中外源抗原性多肽是gp100抗原。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHCI-2Db。在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽或单链融合物，其中外源抗原性多肽是gp100抗原，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，包含共刺激性多肽的外源多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽是4-1BBL。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是MHCI-2Db。
在一些实施方案中，外源抗原性多肽包含选自以下的gp100抗原：KTWGQYWQV(SEQID NO:306)、(A)MLGTHTMEV(SEQ ID NO:307)、IMDQVPFSV(SEQ ID NO:308)、ITDQVPFSV(SEQID NO:309)、YLEPGPVTA(SEQ ID NO:310)、LLDGTATLRL(SEQ ID NO:311)、VLYRYGSFSV(SEQID NO:312)、SLADTNSLAV(SEQ ID NO:313)、RLMKQDFSV(SEQ ID NO:314)、RLPRIFCSC(SEQID NO:315)、LIYRRRLMK(SEQ ID NO:316)、ALLAVGATK(SEQ ID NO:317)、IALNFPGSQK(SEQID NO:318)、RSYVPLAHR(SEQ ID NO:319)、ALNFPGSQK(SEQ ID NO:320)、ALNFPGSQK(SEQ IDNO:320)、VYFFLPDHL(SEQ ID NO:321)、RTKQLYPEW(SEQ ID NO:322)、HTMEVTVYHR(SEQ IDNO:323)、SSPGCQPPA(SEQ ID NO:324)、VPLDCVLYRY(SEQ ID NO:325)、LPHSSSHWL(SEQ IDNO:326)、SNDGPTLI(SEQ ID NO:327)、GRAMLGTHTMEVTVY(SEQ ID NO:328)、WNRQLYPEWTEAQRLD(SEQ ID NO:329)、TTEWVETTARELPIPEPE(SEQ ID NO:330)、TGRAMLGTHTMEVTVYH(SEQ ID NO:331)、GRAMLGTHTMEVTVY(SEQ ID NO:328)。在一些实施方案中，gp100抗原是表1中所示的一种或更多种gp100抗原。
在一些实施方案中，癌症是多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症是非小细胞肺癌。在一些实施方案中，癌症是卵巢癌。在一些实施方案中，癌症是黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是实体瘤。
在另一方面，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源抗原性多肽，其中一种或多种外源抗原性多肽之一包含端粒酶抗原，从而治疗癌症。在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源抗原性多肽，其中一种或多种外源抗原性多肽之一包含人端粒酶，从而治疗癌症。在一些实施方案中，癌症是急性骨髓性白血病(AML)。
在另一方面，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源抗原性多肽，其中一种或多种外源抗原性多肽之一包含ILAKFLHWL(SEQ ID NO:658)。
在另一方面，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源抗原性多肽，其中一种或多种外源抗原性多肽之一包含RLVDDFLLV(SEQ ID NO:659)。
在另一方面，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源抗原性多肽，其中一种或多种外源抗原性多肽之一包含RPGLLGASVLGLDDI(SEQ ID NO:663)。
在另一方面，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源抗原性多肽，其中一种或多种外源抗原性多肽之一包含LTDLQPYMRQFVAHL(SEQ ID NO:664)。
在一些实施方案中，癌症是急性骨髓性白血病(AML)。
在另一方面，本公开提供了治疗患有急性骨髓性白血病(AML)的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源抗原性多肽，其中一种或多种外源抗原性多肽之一包含PR1(VLQELNVTV(SEQID NO:225))。在另一方面，本公开提供了治疗患有急性骨髓性白血病(AML)的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源抗原性多肽，其中一种或多种外源抗原性多肽之一包含PR1(VLQELNVTV(SEQ ID NO:225))，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种包含共刺激性多肽的外源多肽。在另一方面，本公开提供了治疗患有急性骨髓性白血病(AML)的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源抗原性多肽，其中一种或多种外源抗原性多肽之一包含PR1(VLQELNVTV(SEQ ID NO:225))，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种包含4-1BBL的外源多肽。另一方面，本公开提供了治疗患有急性骨髓性白血病(AML)的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含至少一种外源抗原性多肽(PR1(VLQELNVTV(SEQ ID NO:225)))，与外源抗原呈递多肽(MHCI HLA-A2)融合，与GPA跨膜结构域(GPA)融合，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种包含共刺激性多肽的外源多肽。另一方面，本公开提供了治疗患有急性骨髓性白血病(AML)的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含至少一种外源抗原性多肽(PR1(VLQELNVTV(SEQ ID NO:225)))，与外源抗原呈递多肽(MHCI HLA-A2)融合，与GPA跨膜结构域(GPA)融合，并且其中红系细胞进一步呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种包含4-1BBL的外源多肽。
本公开不限于某种类型的癌症，而是任何癌症都认为是由本文所述的aAPC治疗。在某些实施方案中，癌症包括但不限于选自以下的癌症：急性淋巴母细胞性白血病(ALL)，急性髓样白血病(AML)、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、肠癌、脑肿瘤、乳腺癌、原发灶未知癌症(cancer of unknown primary)、扩散至骨的癌症、扩散至脑的癌症、扩散至肝的癌症、扩散至肺的癌症、类癌、宫颈癌、绒毛膜癌、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓样白血病(CML)、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、眼癌、胆囊癌、胃癌(gastric cancer)、妊娠滋养细胞肿瘤(GTT)、毛细胞白血病、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤皮肤癌、间皮瘤、男性癌症、葡萄胎妊娠、口腔和口咽癌、骨髓瘤、鼻和窦癌、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、食道癌、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、前列腺癌、罕见癌、直肠癌、唾液腺癌、继发性癌症、皮肤癌(非黑素瘤)、软组织肉瘤、胃癌(stomach cancer)、睾丸癌、甲状腺癌、未知原发性癌、子宫癌、阴道癌和外阴癌。
在某些实施方案中，癌症是白血病，例如AML或ALL。在其他实施方案中，癌症是肝细胞癌。在其他实施方案中，癌症选自宫颈癌、头颈癌、淋巴瘤和肾透明细胞癌。
新抗原是一类肿瘤抗原，其源于改变基因组编码蛋白质的氨基酸序列的肿瘤特异性突变。新抗原可以包括多肽序列或核苷酸序列。突变可以包括移码或非移码插入/缺失(插入或缺失)、错义或无义取代、剪接位点改变、基因组重排或基因融合，或引起neoORF的任何基因组或表达改变。突变也可以包括剪接变体。特异于肿瘤细胞的翻译后修饰可以包括异常磷酸化。特异于肿瘤细胞的翻译后修饰也可以包括蛋白酶体产生的剪接抗原。参见Liepe et al.,A large fraction of HLA class I ligands are proteasome-generatedspliced peptides；Science.2016Oct.21；354(6310):354-358。肿瘤新抗原是存在于受试者的肿瘤细胞或组织中但不存在于受试者的相应正常细胞或组织中的新抗原。
癌症基因组图谱(TCGA)数据集的最新分析已将肿瘤的基因组情况(genomiclandscape)与肿瘤免疫力联系在一起，暗示了新抗原加载驱动T细胞反应(Brown et al.,Genome Res.2014May；24(5):743-50,2014)并鉴定与免疫浸润有关的体细胞突变(Rutledge et al.,Clin Cancer Res.2013Sep 15；19(18):4951-60,2013)。Rooney等(2015Jan 15；160(1-2):48-61)表明，新抗原和病毒很可能驱动溶细胞活性，并揭示使肿瘤能够抵抗免疫攻击已知和新的突变。
在一些实施方案中，抗原是从受试者的癌细胞中鉴定的新抗原。在一些实施方案中，新抗原是共享的新抗原。鉴定新抗原的方法在本领域中是已知的，并且在例如美国专利号10,055,540号进行了描述，其以其整体通过引用并入本文。新抗原多肽和共享的新抗原多肽描述于例如PCT/US2016/033452，美国公开号20180055922，Schumacher和Hacohen等(Curr Opin Immunol.2016Aug；41:98-103)，Gubin,MM等(Nature.2014Nov 27；515(7528):577-81)，Schumacher and Schreiber,Science.2015Apr 3；348(6230):69-74),Ott PA.,et al.,Nature.2017Jul 13；547(7662):217-221，其全部以其整体通过引用并入本文。
因此，在一些实施方案中，外源抗原性多肽是新抗原多肽。在一些实施方案中，外源抗原性多肽是在《综合肿瘤特异性新抗原数据库》(The Comprehensive Tumor-SpecificNeoantigen Database)(TSNAdb v1.0)中列出的新抗原多肽；可在biopharm.zju.edu.cn/tsnadb上获得，并描述于Wu et al.,Genomics Proteomics Bioinformatics 16(2018)276-282中。在一些实施方案中，外源抗原性多肽是美国专利号10,055,540中所示的新抗原多肽，其以其整体通过引用并入本文。在一些实施方案中，新抗原多肽选自表14中列出的多肽。
表14.新抗原多肽
HLA I类等位基因 新抗原肽
HLA-A*01:01 YEMFNDKSF(SEQ ID NO:874)
HLA-A*02:01 HROEIFSHDFJ(SEQ ID NO:875)
HLA-B*07:02 FJIEJFOESS(SEQ ID NO:876)
HLA-B*08:01 NEIOREIREI(SEQ ID NO:877)
HLA-C*01:03 JFKSIFEMMSJDSSU(SEQ ID NO:878)
HLA-C*01:04 KNFLENFIESOFI(SEQ ID NO:879)
在一些实施方案中，新抗原多肽选自表15中列出的多肽。
表15.新抗原多肽
Figure BDA0002631423640002961
对于高度侵袭性的中线胶质瘤，组蛋白3基因(H3F3A)的复发点突变导致位置27的氨基酸从赖氨酸变为甲硫氨酸(K27M)。Ochs等(Oncoimmunology.2017；6(7):e1328340，以其整体通过引用并入本文)显示，针对K27M突变组蛋白3的肽疫苗能够诱导主要组织相容性复合物(MHC)人源化小鼠模型中有效的、突变特异性的、细胞毒性的T细胞和T细胞-辅助-1-细胞介导的免疫应答。因此，在一些实施方案中，新抗原多肽是H3F3A(K27M)(SEQ ID NO:890)。
在一些实施方案中，癌症是与致癌病毒有关的癌症，例如埃巴病毒(EBV)、乙型和丙型肝炎(HBV和HCV)、人乳头瘤病毒(HPV)、卡波西肉瘤病毒(KSV)和多瘤病毒。在其他某些实施方案中，癌症是其中识别出逆转录病毒表位的癌症。与病毒有关并且可以使用本发明的方法治疗的癌症包括但不限于宫颈癌、头颈癌、淋巴瘤和肾透明细胞癌。
人白细胞抗原(HLA)分子对于免疫识别和随后的通过免疫系统杀伤肿瘤细胞是必需的，因为肿瘤抗原必须以HLA限制的方式呈递以被T细胞受体识别。一些肿瘤细胞使用非经典HLA-I分子(HLA-E和HLA-G)(其作为免疫功能细胞的抑制物配体发挥功能)的异常表达来逃避免疫识别并促进肿瘤免疫逃逸(Moreau et al.,Cell Mol Life Sci.2002Sep；59(9):1460-6，以其整体通过引用并入本文)。HLA I类组织相容性抗原，alpha链G(HLA-G)是包含一条重α链的非经典的MHC I类分子，所述重α链包含alpha1、alpha2和alpha3结构域中的一个或多个。
在一些实施方案中，人工抗原呈递细胞在细胞表面上包含外源抗原性多肽，其中外源抗原性多肽是HLA-G衍生的多肽。在一些实施方案中，HLA-G衍生的多肽选自以下所示的多肽：
HLA-G146-154-DYLALNEDL(SEQ ID NO:891)
HLA-G194-202-RYLENGKEM(SEQ ID NO:892)
HLA-G139-148-RYAYDGKDYL(SEQ ID NO:893)
HLA-G141-150-AYDGKDYLAL(SEQ ID NO:894)
在一些实施方案中，以上显示的肽(SEQ ID NO 891-894)结合至特定的HLA-A等位基因：HLA-A*24:02(例如，HLA-A*24:02:01:01)。在一些实施方案中，以上显示的肽(SEQ IDNO 891-894)结合本文所述的其他HLA等位基因。
在一个具体的实施方案中，人工抗原呈递细胞包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽PR1(人白细胞抗原(HLA)-A2限制性肽)，与外源抗原呈递多肽(MHCI HLA-A2)融合，与GPA跨膜结构域(GPA)融合(PR1-HLA-A2-GPA)。在一些实施方案中，红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，红系细胞是有核细胞。
在某些实施方案中，本公开的aAPC用于治疗高度血管化的肿瘤。不受理论的束缚，更大的血管形成使肿瘤更易于包含本公开的去核细胞(例如，红系细胞)的aAPC进入。可以例如通过毛细血管间距离(认为反映肿瘤的氧合作用)和微血管密度(提供肿瘤血管生成的组织学评估)来测量肿瘤血管。高血管肿瘤可以是任何血管起源的肿瘤，例如血管瘤、淋巴管瘤、血管内皮瘤、卡波西肉瘤、血管肉瘤、血管母细胞瘤。
在其他实施方案中，本公开的aAPC用于治疗具有渗漏的脉管系统的肿瘤。人们普遍认为肿瘤血管异常。这种异常的一种表现是内皮的缺陷和渗漏。血管渗漏不仅影响肿瘤的内部环境，并且可能影响血管生成的速度，而且其还控制治疗方法的使用。不受理论的束缚，渗漏更多的血管将提供对包含本公开的去核细胞(例如，红系细胞)的aAPC的更多通路。
自身免疫疾病
在过去的二十年中，在一系列自身免疫病症的治疗方面取得了长足的进步，许多患者因此而生活质量得到了改善。尽管取得了成功，但当前针对自身免疫疾病的治疗方法一般地或者特异性地具有免疫抑制作用，将患者暴露于机会感染和血液系统癌的风险增加，如JAK抑制剂、抗TNF抗体和抗CD20靶向抗体一样。在多达三分之一的病例中，自身免疫病症患者对治疗无反应，并且大多数有反应的患者最终随时间失去反应。
尽管大多数自身免疫疾病的起因仍然未知，但普遍认为临床疾病是对自身细胞耐受力下降的结果。公认的疾病模型假设环境事件触发了遗传易感性，其导致T细胞介导的免疫抑制的崩溃。原则上，恢复外周耐受性应该为患者提供完全或部分的治愈。
多年来，已经研究了一系列竞争性方法来恢复外周耐受性。这些措施包括口服施用或直接注射具有或不具有免疫抑制作用的蛋白质或肽，产生带有肽的纳米颗粒以及工程化调节性T细胞的过继转移。迄今为止，尚未证明这些方法在后期临床试验中是成功的，但是该领域仍在继续发展。肽和纳米颗粒的直接施用遭受生物分布、稳定性、呈递和定向挑战，这限制了细胞间信号传导的有效性。迄今为止，过继转移方法都是自体的，并且受到限制其他细胞疗法应用的一些相同的处理和可扩展性问题的阻碍。
因此，在某些实施方案中，本公开的aAPC提供了治疗自身免疫疾病的新的且改善的方法。提供的用于治疗自身免疫疾病的方法具有许多优点，包括例如与抗原呈递多肽(例如MHC I或II)一起对细胞表面(红系细胞)上抗原的有效呈递，以及循环中aAPC的极长半衰期，因此可以延长暴露于适当呈递的抗原的时间。
因此，在某些实施方案中，本公开提供了包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源多肽，其中一种或多种外源多肽之一包含自身免疫疾病治疗剂。在一些实施方案中，aAPC包括包含第一自身免疫治疗剂的第一外源多肽和包含第二自身免疫治疗剂的第二外源多肽。在一些实施方案中，aAPC包括包含第一自身免疫治疗剂的第一外源多肽、包含第二自身免疫治疗剂的第二外源多肽和包含第三自身免疫治疗剂的第三外源多肽。在一些实施方案中，红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，红系细胞是有核细胞。
第一、第二和第三种自身免疫治疗剂可以作用于相同的靶标，例如细胞表面受体和/或内源人蛋白质。或者，第一、第二和第三抗癌治疗剂可以作用于不同的靶标。第一、第二或第三靶标可以是同一生物途径的成员，其中任选地，靶标是细胞表面受体和/或内源人蛋白质。第一、第二或第三靶标可以在不同的细胞类型上。在实施方案中，第一、第二和/或第三自身免疫治疗剂是本文所述的第一、第二和/或第三外源多肽。例如，在一些实施方案中，第一外源多肽将工程化红系细胞定位于所需位点，例如人细胞，而第二外源多肽具有治疗活性，例如抗原呈递活性。
在一些实施方案中，第一外源多肽包含抗原呈递多肽，例如MHC分子(例如MHCI或MHCII)，并且第二外源多肽包含抗原。在一些实施方案中，MHCI选自HLA A、HLA B和HLA C。在一些实施方案中，MHCII选自HLA-DPα、HLA-DPβ、HLA-DM、HLA DOA、HLA DOB、HLA DQα、HLADQβ、HLA DRα和HLA DRβ。本领域技术人员将认识到，在优选的实施方案中，抗原与自身免疫病症相关或为自身免疫疾病的原因或起因。例如，抗原可以是自身免疫应答所针对的自身抗原。在一些实施方案中，抗原选自表16中列出的抗原或其抗原部分。在一些实施方案中，抗原选自表17中列出的抗原或其抗原部分。在一些实施方案中，抗原选自表18中列出的抗原或其抗原部分。在提供的用于治疗自身免疫病症的方法中，其中aAPC包含抗原呈递多肽和表16、17或18中列出的抗原或其抗原部分，可以将aAPC施用于受试者以治疗对应于表16、17或18中提供的抗原的自身免疫病症。
在一方面，将aAPC设计为抑制与自身免疫病症有关或驱动自身免疫病症的不期望的T细胞活性。因此，在一些实施方案中，aAPC进一步包含至少一种如本文所述的外源共抑制性多肽。在一些实施方案中，外源共抑制性多肽选自表7中列出的共抑制性多肽。在一些实施方案中，外源共抑制性多肽选自IL-35、IL-10、VSIG-3和LAG3激动剂。在一些实施方案中，共抑制性多肽抑制自身反应性T细胞。
在另一方面，将aAPC设计为刺激T调节细胞，从而使免疫系统偏向回到更耐受的状态。因此，在一些实施方案中，aAPC进一步包含至少一种本文所述的共刺激性多肽。在这方面，在优选的实施方案中，至少一种外源共刺激性多肽扩增调节性T细胞(Treg)，并且是例如本文所述的外源Treg共刺激性多肽。在一些实施方案中，外源共刺激性多肽选自表10中列出的共刺激性多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽选自表11中列出的共刺激性多肽。
在另一方面，将aAPC设计为扩增和刺激T细胞，例如细胞毒性CD8+ T细胞。在这方面，自身免疫病症优选是由感染原导致或触发的自身免疫疾病。在实施方案中，aAPC进一步包含至少一种本文所述的外源共刺激性多肽。在实施方案中，至少一种外源共刺激性多肽扩增细胞毒性CD8+ T细胞。在一些实施方案中，外源共刺激性多肽选自表6中列出的共刺激性多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽选自4-1BBL、LIGHT、抗CD28、CD80、CD86、CD70、OX40L、IL-7、IL-12、GITRL、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD83、CD155、CD112、与IL-15融合的IL-15Rα、IL-21、ICAM-1、LFA-1的配体、抗CD3及其组合。这方面在下面更详细地描述。
在一些方面，本公开提供了治疗患有自身免疫疾病的受试者的方法，其包括向该受试者施用有效数量的本文所述的红系细胞，从而治疗该自身免疫疾病。在各种实施方案中，自身免疫疾病可以是表16、17或18中提供的自身免疫疾病。在此类方法中，可用于治疗自身免疫病症的aAPC包含外源抗原呈递多肽和抗原性多肽，其中抗原性多肽可以是表16、17或18中列出的抗原或其抗原性部分，其中包含表16、17或18中提供的抗原的aAPC用于治疗表16、17或18中列出的相应自身免疫病症。
例如，在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有自身免疫疾病多发性硬化症(MS)的受试者的方法。在一些实施方案中，人工抗原呈递细胞包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中抗原性肽是MOG。在一个具体的实施方案中，人工抗原呈递细胞包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中抗原性肽是MOG，以及外源抗原呈递多肽，其是MHCII单链融合物，其中抗原呈递多肽与GPA融合(MOG-MHCII-GPA)。在一些实施方案中，人工抗原呈递细胞包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中抗原性肽是MOG，外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽(其是MHCII单链融合物)特异性结合，和至少一种Treg扩增/共刺激性多肽。在一些实施方案中，Treg扩增/共刺激性肽是CD25特异性IL-2。在进一步的实施方案中，人工抗原呈递细胞包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中抗原性肽是MOG，外源抗原呈递多肽，其中外源抗原性多肽与外源抗原呈递多肽(其是MHCII单链融合物)特异性结合，和至少一种共抑制性多肽。在一些实施方案中，共抑制性多肽是PD-L1。
在一些实施方案中，红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，红系细胞是有核细胞。
在一些实施方案中，自身免疫疾病是单一抗原疾病。单一抗原疾病及其相关抗原的实例在下表16中示出。
表16.自身免疫疾病和相关单一抗原
Figure BDA0002631423640003011
在另一个实施方案中，自身免疫疾病是多抗原疾病。在自身免疫疾病是多抗原疾病的实施方案中，可以用靶向超过一种，例如两种、三种、四种或更多种抗原的aAPC治疗受试者。本领域技术人员将认识到，多种抗原可以存在于相同的aAPC上，或者它们可以存在于不同的aAPC上，其中将包含单一抗原的两种、三种、四种或更多种不同的aAPC的组合施用于受试者以治疗病症。多抗原疾病及其相关抗原的实例示于下表17。
表17.自身免疫疾病和相关多抗原
疾病 抗原
I型糖尿病(T1DM) 胰岛素/胰岛素原/前胰岛素原
I型糖尿病(T1DM) 谷氨酸脱羧酶(GAD65)
I型糖尿病(T1DM) 胰岛素瘤抗原-2(IA-2)
多发性硬化(MS) 髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)
多发性硬化(MS) 髓鞘碱性蛋白(MBP)
多发性硬化(MS) 蛋白脂质蛋白(PLP)
抗磷脂综合征(APS)/CAPS beta-2糖蛋白1(b2GP1)
乳糜泻 A-麦醇溶蛋白
在某些实施方案中，自身免疫疾病选自下组：寻常性天疱疮、重症肌无力、视神经脊髓炎、大疱性天疱疮、乳糜泻、多发性硬化症、1型糖尿病、类风湿性关节炎和膜性肾小球性肾炎。在一些实施方案中，自身免疫疾病选自下表18中列出的那些。
表18.MS、1型糖尿病、RA和膜性肾炎的抗原
Figure BDA0002631423640003021
Figure BDA0002631423640003031
在某些实施方案中，本发明的aAPC用于驱动患有I型糖尿病的受试者的耐受性诱导。在一个具体的实施方案中，人工抗原呈递细胞包含红系细胞，其中红系细胞呈递，例如在细胞表面上包含，至少一种外源抗原性多肽，其中抗原性肽是胰岛素B链，并且特别是胰岛素B链的一部分。在某些实施方案中，胰岛素B链的部分是胰岛素B链的氨基酸9-23。在一些实施方案中，红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，红系细胞是有核细胞。
免疫激活的疾病还包括炎性疾病，如例如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、乳糜泻或其他特发性炎性肠病。免疫激活的疾病还包括变应性疾病，如例如哮喘、花生变态反应、贝类变态反应、花粉变态反应、乳蛋白变态反应、昆虫叮咬变态反应和乳胶变态反应、动物皮屑变态反应、黑胡桃和英国胡桃(English walnut)变态反应、巴西坚果变态反应、腰果变态反应、栗子变态反应、尘螨变态反应、蛋变态反应、鱼类变态反应、榛子变态反应、霉菌变态反应、花粉变态反应、草变态反应、贝类变态反应、大豆变态反应、坚果(tree nut)变态反应和小麦变态反应。
免疫激活疾病还包括响应于为治疗原发性状况而施用的治疗性蛋白质的免疫激活，其降低了治疗性蛋白质的功效，如例如血友病A中的凝血因子VIII、血友病B中的凝血因子IX、类风湿性关节炎和其他炎性疾病中的抗肿瘤坏死因子alpha(TNFa)抗体、高歇氏病(Gaucher's disease)中的葡萄糖脑苷脂酶、用于酶替代疗法的任何重组蛋白或急性成淋巴细胞性白血病(ALL)中的天冬酰胺酶。
在一些实施方案中，患者患有自身免疫疾病或状况或自身抗体介导的疾病或状况，其中患者的免疫系统对内源(自身)分子例如蛋白质抗原具有活性，使得免疫系统攻击内源分子，诱导炎症，损害组织并以其他方式引起自身免疫或自身抗体疾病或状况的症状。免疫应答可以由与内源分子结合的抗体驱动，或者可以由攻击表达内源分子的细胞的过度活跃的T细胞驱动，或者可以由其他免疫细胞(如调节性T细胞、NK细胞、NKT细胞或B细胞)驱动。在这些实施方案中，对应于内源(自身)分子的抗原性蛋白质或其片段可以在包含红系细胞的aAPC上表达，从而呈递(例如在细胞表面上包含)一种或多种外源多肽，如本文所述。当对患有疾病或状况的患者一次或多次施用时，aAPC将足以诱导对抗原性蛋白质的耐受性，从而使其不再诱导免疫系统的激活，并因此将治疗或减轻潜在疾病或状况的症状。在某些实施方案中，aAPC用于刺激T调节细胞，从而使免疫系统偏向回到内源(自身)分子的更耐受的状态。
在一些实施方案中，患者患有变应性疾病，例如对动物皮屑、黑胡桃、巴西坚果、腰果、栗子、尘螨、蛋、英国胡桃、鱼、榛子、昆虫毒液、乳胶、乳、霉菌、花生、花粉、草、贝类、大豆、坚果或小麦的变态反应。患有变态反应的患者在与过敏原的抗原片段接触后可引发免疫应答，例如通过饮食、皮肤接触、注射或环境暴露。免疫应答可涉及IgE抗体、敏化的肥大细胞、脱粒、组胺释放和过敏反应，以及诸如T细胞、B细胞、树突状细胞、T调节细胞、NK细胞、嗜中性粒细胞和NKT细胞等规范免疫细胞。变应性反应可引起不适或可以严重到足以致死，因此需要患者及其家人和看护者时刻保持警惕。在这些实施方案中，抗原蛋白或其片段可以存在于本公开的aAPC的红系细胞上。这些细胞群体在一次或多次施用于变应性疾病或状况的患者时，足以诱导对抗原蛋白的耐受性，从而使其在接触后不再诱导免疫系统的激活，因此可治疗或改善潜在的变应性疾病或状况的症状。
与感染原有关的自身免疫疾病
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗与感染原相关或由其引起的自身免疫疾病或病症的方法。表19中提供了与感染原相关或由感染原引发的示例性自身免疫疾病或病症。
表19.自身免疫疾病和相关感染原
Figure BDA0002631423640003051
与感染原有关的任何自身免疫病症，包括但不限于表19中列出的那些病症，都考虑用本发明的aAPC治疗。
如本公开所提供的，可以通过向受试者施用aAPC来治疗与感染原相关的自身免疫疾病，所述aAPC包括包含抗原呈递多肽(例如，MHC分子如MHCI或MHCII)的第一外源多肽和包含来自感染原的抗原或其片段的第二外源多肽(即，靶向触发疾病的特定感染原)。
在一个具体的实施方案中，可用于治疗与感染原相关的自身免疫病症的aAPC进一步包含第三外源多肽，其包含至少一种共刺激性多肽。在一个实施方案中，共刺激性多肽激活细胞毒性CD8+ T细胞以靶向和消除被感染原感染的细胞。例如，细胞毒性CD8+ T细胞可以靶向、抑制和/或消除被感染原感染的自身反应性B细胞。共刺激性多肽可以是本文所述的任何共刺激性多肽。在实施方案中，至少一种外源共刺激性多肽扩增细胞毒性CD8+ T细胞。在一些实施方案中，外源共刺激性多肽选自表6中列出的共刺激性多肽。在一些实施方案中，共刺激性多肽选自下组：4-1BBL、LIGHT、抗CD28、CD80、CD86、CD70、OX40L、IL-7、IL-12、GITRL、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD83、CD155、CD112、与IL-15融合的IL-15Rα、IL-21、ICAM-1、LFA-1的配体、抗CD3及其组合。
在一些实施方案中，与感染原有关的自身免疫疾病是多发性硬化症(MS)。几种感染原与MS有关。表20中提供了与MS相关的示例性感染原。在实施方案中，与自身免疫病症相关的感染原为病毒。
表20.与多发性硬化症(MS)相关的感染原
Figure BDA0002631423640003061
Figure BDA0002631423640003071
在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有MS的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源多肽，其中一种或多种外源多肽之一包含来自表20中所列出的感染原的抗原或其免疫原性肽，从而治疗MS。在实施方案中，aAPC进一步包含MHC分子，和任选地共刺激性多肽。
在一个具体的实施方案中，与MS相关的感染原是埃巴病毒(EBV)。尽管不希望受到任何特定理论的束缚，但可以相信，在初次感染期间，EBV感染扁桃体中的自身反应性初始B细胞，驱使它们进入生发中心，在那里它们迅速增殖并分化为潜伏感染的自身反应性记忆B细胞，然后从扁桃体中退出并在血液中循环。EBV感染的B细胞的数量通常由EBV特异性的细胞毒性CD8+ T细胞控制，该细胞杀伤增殖的和裂解性感染的B细胞，但如果这种防御机制存在缺陷则不会。幸存的受EBV感染的自身反应性记忆B细胞进入CNS，并在那里停留并产生寡克隆IgG和致病性自身抗体，其攻击髓磷脂和CNS的其他组分。已由常见的系统性感染在外周淋巴样器官中激活的自身反应性T细胞在血液中循环并进入CNS，在那里它们被EBV感染的自身反应性B细胞(其呈递与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的CNS肽(Cp))重新激活。这些受EBV感染的B细胞向自身反应性T细胞上的CD28受体提供共刺激性存活信号(B7)，从而抑制了激活诱导的T细胞凋亡，这通常在自身反应性T细胞进入CNS并与不表达B7共刺激性分子的非专职抗原呈递细胞(如星形胶质细胞和小胶质细胞)相互作用时发生。自身反应性T细胞由EBV感染的自身反应性B细胞重新激活后，其产生细胞因子如白细胞介素2(IL-2)、干扰素-γ(IFNγ)和肿瘤坏死因子(TNF)，并策划对CNS的自身免疫攻击导致少突胶质细胞和髓磷脂的破坏。
因此，在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有MS的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源多肽，其中一种或多种外源多肽之一包含EBV抗原。在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有MS的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源多肽，其中一种或多种外源多肽之一包含来自表1的EBV抗原。在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有MS的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源多肽，其中一种或多种外源多肽之一包含选自gp350或EBNA1抗原的EBV抗原。在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有MS的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源多肽，其中一种或多种外源多肽之一包含选自以下的EBV抗原：VLQWASLAV(SEQ ID NO:698)、FMVFLQTHI(SEQ ID NO:699)、FLQTHIFAEV(SEQ ID NO:700)、SIVCYFMVFL(SEQ ID NO:701)、CLGGLLTMV(SEQ ID NO:691)、GLCTLVAML(SEQ ID NO:692)、FLYALALLL(SEQ ID NO:693)、YVLDHLIVV(SEQ ID NO:694)、RLRAEAQVK(SEQ ID NO:695)、AVFDRKSDAK(SEQ ID NO:696)、RPPIFIRLL(SEQ ID NO:697)。预期此类aAPC消除感染EBV的自身反应性B细胞，从而治疗MS。在实施方案中，aAPC进一步包含MHC分子，和任选地共刺激性多肽。在一些实施方案中，来自EBV的抗原是gp350或其免疫原性肽(例如HLAA2肽VLQWASLAV(SEQ ID NO:698))。在一些实施方案中，来自EBV的抗原是EBNA1或其免疫原性肽(例如，FMVFLQTHI(SEQ ID NO:699)、FLQTHIFAEV(SEQ ID NO:700)或SIVCYFMVFL(SEQ ID NO:701))。在一些实施方案中，来自EBV的抗原是FMVFLQTHI(SEQ ID NO:699)。在一些实施方案中，来自EBV的抗原是FLQTHIFAEV(SEQ ID NO:700)。在一些实施方案中，来自EBV的抗原是SIVCYFMVFL(SEQ IDNO:701)。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有MS的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源多肽，其中一种或多种外源多肽之一包含gp350或其免疫原性肽，从而治疗MS。在一些实施方案中，gp350的免疫原性肽包含HLAA2肽VLQWASLAV(SEQ ID NO:698)或由其组成。在一些实施方案中，gp350的免疫原性肽能够诱导识别gp350抗原的细胞毒性CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有MS的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源多肽，其中一种或多种外源多肽之一包含EBNA1或其免疫原性肽，从而治疗MS。在一些实施方案中，EBNA1的免疫原性肽包含选自以下的肽或由其组成：FMVFLQTHI(SEQ ID NO:699)、FLQTHIFAEV(SEQ ID NO:700)和SIVCYFMVFL(SEQ ID NO:701)。在一些实施方案中，EBNA1的免疫原性肽能够诱导识别EBNA1抗原的细胞毒性CD8+ T细胞。
如本文所提供的，可以设计aAPC并用于治疗与受试者中的感染原相关或由其引起的自身免疫疾病的几种替代方式。例如，与感染原有关的自身免疫疾病可以替代地通过向受试者施用下述aAPC来治疗，所述aAPC包括包含抗原呈递多肽(例如，MHC分子如MHCI或MHCII)的第一外源多肽、包含抗原或其片段的第二外源多肽，和任选地包含至少一种共抑制性多肽或至少一种Treg共刺激性多肽(本文也称为Treg扩增多肽)的第三外源多肽。在一些实施方案中，抗原或其抗原性片段来自感染原(即，靶向引发疾病的感染原)。在一些实施方案中，抗原或其抗原性片段是与感染诱导的自身免疫病症相关的抗原(例如，自身多肽)。
在一些实施方案中，如上所述，对于任何自身免疫病症更一般的是，可用于治疗与感染原相关的自身免疫病症的aAPC包含Treg共刺激性/扩增多肽。Treg共刺激性/扩增多肽可以是本文所述的任何Treg扩增多肽。在一个实施方案中，Treg共刺激性/扩增多肽扩增Treg，其继而抑制响应于感染原在受试者中产生的T细胞。
在一些实施方案中，如上所述，对于任何自身免疫病症更一般的是，可用于治疗与感染原相关的自身免疫疾病的aAPC包含共抑制性多肽。共抑制性多肽可以是本文所述的任何共抑制性多肽。在一个实施方案中，共抑制性多肽抑制响应于感染原在受试者中产生的T细胞。
在另一个实施方案中，自身免疫疾病不与感染原相关。对于与感染原无关的自身免疫疾病，基于本文其他地方的公开，本领域技术人员将认识到，可以通过向受试者施用下述aAPC治疗自身免疫疾病，所述aAPC包括包含抗原呈递多肽(例如，MHC分子如MHCI或MHCII)的第一外源多肽、包含抗原或其片段的第二外源多肽(例如，来自自身免疫活性所针对的内源(自身)多肽的抗原性多肽)，和任选地包含至少一种共抑制性多肽或至少一种Treg扩增多肽的第三外源多肽。在这些实施方案中，将aAPC施用于受试者，以诱导对触发自身免疫应答的抗原的外周耐受。
传染病
在某些实施方案中，本公开提供了包含红系细胞(例如去核红系细胞)或去核细胞的aAPC，其包含一种或多种外源多肽，其中一种或多种外源多肽之一包含传染病治疗剂。在一些实施方案中，红系细胞是去核红系细胞。在一些实施方案中，红系细胞是有核的红系细胞。
如本文所用，“传染病治疗剂”是指抑制传染病，例如，减少或减轻传染病的原因或症状，或提高与传染病相关的参数例如病毒负荷或细菌负荷的值的外源多肽。在实施方案中，传染病治疗剂是第一或第二外源多肽，当其与另一外源多肽一起存在或表达时，其抑制传染病。在一个实施方案中，第一或第二传染病治疗剂在不存在另一个的情况下具有活性。在实施方案中，传染病治疗剂直接例如通过杀伤病原体来抑制传染病。在实施方案中，传染病治疗剂通过刺激受试者的免疫应答例如作为疫苗来抑制传染病。
在一些实施方案中，aAPC包括包含第一传染病治疗剂的第一外源多肽和包含第二传染病治疗剂的第二外源多肽。在一些实施方案中，aAPC包括包含第一传染病治疗剂的第一外源多肽、包含第二传染病治疗剂的第二外源多肽和包含第三传染病治疗剂的第三外源多肽。
第一、第二和第三传染病治疗剂可以作用于相同的靶标，例如细胞表面受体和/或内源人蛋白质。或者，第一、第二和第三抗癌治疗剂可以作用于不同的靶标。第一、第二或第三靶标可以是同一生物途径的成员，其中任选地，靶标是细胞表面受体、内源人蛋白质。第一、第二或第三靶标可以在不同的细胞类型上。在一些实施方案中，第一外源多肽将工程化红系细胞定位在期望的位点，例如人细胞，并且第二外源多肽具有治疗活性，例如抗原呈递活性。
在某些优选的实施方案中，传染病治疗剂是抗原，例如来自病原体或感染原的抗原(其中“病原体”和“感染原”在本文中可互换使用)。在一些实施方案中，第一治疗剂是抗原，例如来自病原体的抗原。在一些实施方案中，第一治疗剂和第二治疗剂是抗原，例如来自病原体的抗原。在某些实施方案中，第一、第二和第三治疗剂是抗原，例如来自病原体的抗原。
在实施方案中，aAPC进一步包含另外的外源多肽，其中另外的外源多肽包含抗原呈递多肽，例如MHC分子(例如MHCI或MHCII)。在实施方案中，aAPC进一步包含另外的外源多肽，其中另外的外源多肽包含至少一种共刺激性多肽。在一些实施方案中，aAPC进一步包括包含抗原呈递多肽的另外的外源多肽和包含至少一种共刺激性多肽的另外的外源多肽。
在一些实施方案中，aAPC包含第一外源多肽，其包含抗原呈递多肽，例如MHC分子(例如MHCI或MHCII)，并且第二外源多肽包含抗原。在各种实施方案中，抗原是病原体的抗原，例如病毒病原体、细菌病原体、真菌病原体或寄生病原体。
本发明涵盖抗原可以是本领域已知的任何病原性抗原或其抗原性部分。下文详细描述了可以在本发明的红系细胞上呈递一种或多种抗原性肽的示例性病原体，但并不旨在限制本发明。在各种实施方案中，抗原性肽来自下表21、22、23和24中任一项所提供的病原体。在一些实施方案中，抗原性肽来自表21中提供的病原体。在一些实施方案中，抗原性肽来自表22中提供的病原体。在一些实施方案中，抗原性肽来自表23中提供的病原体。在一些实施方案中，抗原性肽来自表24中提供的病原体。本领域技术人员将认识到，本文所提供的包含来自特定病原体或感染原的抗原的aAPC可以施用于受试者以治疗由该病原体或感染原引起的感染。本领域技术人员将进一步认识到，本文提供的包含来自特定病原体或感染原的抗原的aAPC可以施用于受试者以治疗受试者的疾病或病症，其中疾病、病症是通过用该病原体或感染原直接或间接引起的。
在一些方面，本公开提供了治疗患有传染病的受试者的方法，该方法包括向所述受试者施用有效数量的本文所述的红系细胞，从而治疗传染病。
在另一方面，本公开提供了治疗患有传染病的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)或去核细胞的aAPC，其包含一种或多种外源抗原性多肽，其中一种或多种外源抗原性多肽之一包含致病性抗原，从而治疗传染病。
在某些实施方案中，传染病治疗剂选自可公开获得的生物信息数据库中列出的抗微生物多肽，如CAMP、CAMP版本2(抗微生物肽的序列和结构的集合)、抗微生物肽数据库(可在aps.unmc.edu/AP/main.php找到)、LAMP、BioPD和ADAM(抗微生物肽数据库)(可在bioinformatics.cs.ntou.edu.tw/adam/找到)。基于抗微生物肽数据库所含肽的来源，可以将其分为两类，即特定数据库和通用数据库。这些数据库具有用于抗微生物肽分析和预测的各种工具。例如，CAMP包含AMP预测、特征计算器、BLAST搜索、clustalW、VAST、PRATT、Helical wheel等。此外，ADAM允许用户搜索或浏览AMP序列-结构关系。
在某些实施方案中，传染病治疗剂选自病毒多肽。在这些实施方案中，aAPC包含红系细胞(例如去核红系细胞)或去核细胞，其包含一种或多种外源抗原性多肽，其中一种或多种外源抗原性多肽之一包含抗原性病毒多肽，并且将aAPC施用于受试者以治疗病毒感染。
病毒感染包括腺病毒、柯萨奇病毒、甲肝病毒、脊髓灰质炎病毒、埃巴病毒、单纯疱疹1型、单纯疱疹2型、人巨细胞病毒、人疱疹病毒8型、水痘-带状疱疹病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、乳头瘤病毒、狂犬病病毒和风疹病毒。其他病毒靶标包括副粘病毒科(例如，肺炎病毒、麻疹病毒、变性肺病毒(metapneumovirus)、呼吸道病毒或风疹病毒)、腺病毒科(例如，腺病毒)、沙粒病毒科(Arenaviridae)(例如沙粒病毒，例如淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus))、动脉病毒科(例如，猪呼吸道或生殖综合征病毒或马动脉炎病毒)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)(例如，白蛉病毒或汉坦病毒)、嵌杯病毒科(例如，诺沃克病毒)、冠状病毒科(例如，冠状病毒或环曲病毒(torovirus))、纤丝病毒科(例如，埃博拉样病毒(Ebola-like viruses))、黄病毒科(例如，肝炎病毒或黄病毒)、疱疹病毒科(例如单纯病毒、水痘病毒、巨细胞病毒、蔷薇疹病毒或淋巴细胞隐病毒)、正粘病毒科(例如流感病毒或索戈托病毒(thogotovirus))、痘病毒科(例如细小病毒)、微RNA病毒科(Picomaviridae)(例如肠道病毒或嗜肝病毒)、痘病毒科(例如正痘病毒、禽痘病毒、或兔病毒)，逆转录病毒科(例如慢病毒或泡沫病毒(spumavirus))、呼肠孤病毒科(例如轮状病毒)，弹状病毒科(例如狂犬病病毒、弹状病毒或水疱病毒)和披膜病毒科(例如甲病毒或风疹病毒)。这些病毒的具体实例包括人呼吸道冠状病毒、流感病毒A-C、肝炎病毒A至G和单纯疱疹病毒1-9。
示例性病毒病原体显示在下表21中。在某些实施方案中，病毒病原体选自乙肝病毒、丙肝病毒、埃巴病毒、巨细胞病毒(CMV)。
表21.病毒病原体
Figure BDA0002631423640003131
Figure BDA0002631423640003141
在某些实施方案中，抗原选自病毒、逆转录病毒和睾丸抗原。例如，在某些实施方案中，病毒选自埃巴病毒(EBV)、乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(HCV)、人乳头瘤病毒(HPV)、卡波西肉瘤病毒(KSV)和多瘤病毒。在一些实施方案中，病毒是乙型肝炎(HBV)。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有与致癌病毒(例如HPV)有关的癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源多肽，其中一种或多种外源多肽之一包含表1的HPV抗原。在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有与致癌病毒(例如HPV)有关的癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源多肽，其中一种或多种外源多肽之一包含HPV-E7抗原。在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有与致癌病毒(例如HPV)有关的癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)或去核细胞的aAPC，其包含外源多肽，其中外源多肽包含YMLDLQPET(SEQ ID NO:713)、YMLDLQPETT(SEQ ID NO:714)或TIHDIILECV(SEQ ID NO:712)。在一些实施方案中，外源多肽包含YMLDLQPET(SEQ ID NO:713)。在一些实施方案中，外源多肽是YMLDLQPET(SEQ ID NO:713)。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有病毒感染的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源多肽，其中一种或多种外源多肽之一包含来自表21中所列的感染原的抗原或其免疫原性肽，从而治疗病毒感染。在实施方案中，aAPC进一步包含MHC分子，和任选地共刺激性多肽。
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗乙型肝炎感染例如慢性HBV感染的方法。据估计，全球多达2.5亿人患有慢性乙型肝炎，其主要在子宫内或分娩期间传播。慢性HBV导致肝硬化和肝细胞癌。HBV的病理可能是由于非抗原特异性T细胞的乙型肝炎抗原特异性T细胞募集所致，所述T细胞分泌引起肝损伤的细胞因子。已经提出，耗尽的T细胞是慢性肝炎病因的关键。据报道，HBV特异性T细胞通过PD1阻断(例如通过抗PD1和/或IL-12)重新激活(Schirdewahnet al.J.Infect.Dis.2017；Fisicaro et al Gastroenterology2010；and Schurich PLOS Pathogens,2013，其每一篇的全部内容通过引用并入本文)。因此，本发明预见到，本文提供的aAPC可以通过重新激活HBV特异性T细胞而用于治疗慢性HBV，例如用于细胞溶解或非细胞溶解的抗病毒活性。
因此，在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有乙型肝炎病毒(HBV)感染(例如慢性乙型肝炎)的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效数量的包含红系细胞(例如去核红系细胞)的aAPC，其包含一种或多种外源多肽，其中一种或多种外源多肽之一包含HBV特异性抗原或其免疫原性肽，从而治疗HBV感染。在一些实施方案中，HBV感染是慢性HBV感染。在实施方案中，aAPC进一步包含外源抗原呈递多肽，即MHC分子，例如，MHC I类或MHCI类单链融合物。在一些实施方案中，aAPC进一步包含至少一种外源共刺激性多肽。在实施方案中，至少一种共刺激性多肽选自下组：4-1BBL、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21及其任何组合，例如IL-12和IL-15或4-1BBL和IL-15。在一些实施方案中，aAPC进一步包含另外的外源多肽，其中另外的外源多肽包含检查点抑制剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂是针对PD1的抗体分子。在一个具体的实施方案中，aAPC包括包含一种或多种外源多肽的红系细胞，其中一种或多种外源多肽包含：包含HBV特异性抗原的外源抗原性多肽或其免疫原性肽，外源抗原呈递多肽，例如，MHCI类或MHCI类单链融合物，外源共刺激性多肽，例如IL-12或4-1BBL，以及检查点抑制剂，例如，针对PD1的抗体。
在某些实施方案中，传染病治疗剂选自细菌多肽。在这些实施方案中，aAPC包含红系细胞(例如，去核红系细胞)或去核细胞，其包含一种或多种外源多肽，其中一种或多种外源多肽之一包含抗原性细菌多肽，并且将aAPC施用于受试者以治疗细菌感染。
细菌感染包括但不限于分枝杆菌(Mycobacteria)、立克次体属(Rickettsia)、支原体、脑膜炎奈瑟氏球菌、淋病奈瑟氏球菌、军团菌(Legionella)、霍乱弧菌、链球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白喉杆菌、梭菌种(Clostridium spp.)、肠毒性大肠杆菌、炭疽芽孢杆菌、立克次体属、汉赛巴尔通体(Bartonella henselae)、五日热巴尔通体(Bartonella quintana)、伯内特考克斯体(Coxiella burnetii)、衣原体(chlamydia)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、沙门氏菌(Salmonella)；志贺氏菌(shigella)；小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)；假结核病耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)；嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)；结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)；单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)；支原体(Mycoplasma spp.)；荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)；霍乱弧菌(Vibriocholerae)；嗜血杆菌流感(Haemophilus influenzae)；炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)；苍白密螺旋体；钩端螺旋体；疏螺旋体属(Borrelia)；白喉棒杆菌；弗朗西丝菌属；马尔他布鲁杆菌(Brucella melitensis)；空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)；肠杆菌属(Enterobacter)；奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)；变形杆菌属(Proteus)和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)。
示例性细菌病原体在下表22中所示。
表22.细菌病原体
Figure BDA0002631423640003161
Figure BDA0002631423640003171
Figure BDA0002631423640003181
Figure BDA0002631423640003191
在某些实施方案中，传染病治疗剂选自真菌多肽。在这些实施方案中，aAPC包含红细胞(例如，去核红系细胞)或去核细胞，其包含一种或多种外源多肽，其中一种或多种外源多肽之一包含抗原性真菌多肽，并且将aAPC施用于受试者以治疗真菌感染。
示例性真菌病原体如下表23中所示。
表23：真菌病原体
Figure BDA0002631423640003192
Figure BDA0002631423640003201
Figure BDA0002631423640003211
在某些实施方案中，传染病治疗剂选自寄生多肽。在这些实施方案中，aAPC包含红细胞(例如，去核红系细胞)或去核细胞，其包含一种或多种外源多肽，其中一种或多种外源多肽之一包含抗原性寄生多肽，并且将aAPC施用于受试者以治疗寄生物感染。
示例性寄生病原体如下表24中所示。
表24.寄生性病原体
Figure BDA0002631423640003212
Figure BDA0002631423640003221
Figure BDA0002631423640003231
Figure BDA0002631423640003241
Figure BDA0002631423640003251
在一些实施方案中，传染病是多药抗性葡萄球菌。在另一个实施方案中，传染病是假单胞菌。在另一个实施方案中，传染病是难以治疗的医院感染(即由感染原或毒素的反应引起的任何系统性或局部性状况)，例如由艰难梭菌(Clostridium difficile)引起的感染。
其他
预期其他疾病和病症通过本公开的aAPC治疗。实例包括但不限于心血管疾病和免疫疾病。
受试者
本文所述的方法旨在与可以体验到这些方法的益处的任何受试者一起使用。因此，“受试者”、“患者”和“个体”(可互换使用)包括人类以及非人类受试者，尤其是家养动物。
在一些实施方案中，受试者和/或动物是哺乳动物，例如人、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪、兔、绵羊或非人灵长类，例如猴、黑猩猩或狒狒。在其他实施方案中，受试者和/或动物是非哺乳动物。在一些实施方案中，受试者和/或动物是人。在一些实施方案中，人是儿科人。在其他实施方案中，人是成年人。在其他实施方案中，人是老年人。在其他实施方案中，人可以被称为患者。
在某些实施方案中，人的年龄范围为从约0个月至约6个月大、从约6至约12个月龄、从约6至约18个月龄、从约18至约36个月龄、从约1至约5岁龄、从约5至约10岁龄、从约10至约15岁龄、从约15至约20岁龄、从约20至约25岁龄、从约25至约30岁龄、从约30至约35岁龄、从约35至约40岁龄、从约40至约45岁龄、从约45至约50岁龄、从约50至约55岁龄、从约55至约60岁龄、从约60至约65岁龄、从约65至约70岁龄、从约70至约75岁龄、从约75至约80岁龄、从约80至约85岁龄、从约85至约90岁龄、从约90至约95岁龄或从约95至约100岁龄。
在其他实施方案中，受试者是非人类动物，因此本公开涉及兽医用途。在一个具体的实施方案中，非人类动物是家养宠物。在另一个具体的实施方案中，非人类动物是家畜动物。在某些实施方案中，受试者是不能接受化学疗法的人类癌症患者，例如患者对化学疗法无反应或病情严重以不具有合适的化学疗法的治疗窗口(例如，经历太多的剂量或方案限制的副作用)。在某些实施方案中，受试者是患有晚期和/或转移性疾病的人类癌症患者。
在一些实施方案中，选择受试者用于用aAPC治疗，该aAPC包含呈递(例如在细胞表面上包含)本发明的一种或多种外源多肽的红系细胞。在一些实施方案中，选择受试者用于用aAPC治疗癌症，该aAPC包含呈递(例如在细胞表面上包含)本发明的一种或多种外源多肽的红系细胞。在一些实施方案中，选择受试者用于用aAPC治疗自身免疫疾病，该aAPC包含呈递(例如在细胞表面上包含)本发明的一种或多种外源多肽的红系细胞。在一些实施方案中，选择受试者用于用aAPC治疗传染病，该aAPC包含呈递(例如在细胞表面上包含)本发明的一种或多种外源多肽的红系细胞。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，红系细胞是去核红系细胞。在上述方面和实施方案的一些实施方案中，红系细胞是有核红系细胞。
V.药物组合物
本公开涵盖包含本公开的aAPC作为活性成分的药物组合物的制备和用途。此类药物组合物可以由单独的活性成分组成，作为至少一种活性成分(例如，有效剂量的aAPC)的组合以适合于施用于受试者的形式，或者药物组合物可以包含活性成分以及一种或多种药学上可接受的载体、一种或多种另外的(活性和/或非活性)成分或这些的一些组合。
在一些实施方案中，本公开的特征在于药物组合物，其包含多个本文所述的aAPC和药物载体。在其他实施方案中，本公开的特征在于药物组合物，其包含如本文所述的aAPC群体和药物载体。应当理解，如本文其他地方所述的任何单个aAPC、多个aAPC或aAPC群体可以存在于本发明的药物组合物中。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物包含工程化(即，修饰的)红系细胞和未修饰的红系细胞。例如，在各种实施方案中，单个单位剂量的aAPC可以包含约、至少或不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的工程化红系细胞，其中组合物中其余的红系细胞未经工程化。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物包含aAPC，其包含工程化去核红系细胞和有核红系细胞。例如，在各种实施方案中，单个单位剂量的工程化红系细胞(例如去核和有核红系细胞)可以包含约或至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％去核红系细胞，其中组合物中剩余的红系细胞是有核的。
本公开的药物组合物可以以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。尽管可以通过临床试验确定适当的剂量，但是施用的量和频率将由诸如患者的状况以及患者的疾病的类型和严重性等因素来确定。
药物组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过气雾吸入、注射、摄入、输血、植入或移植。本公开的组合物可以皮下、皮内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射或腹腔内施用于患者。可以将药物组合物直接注射到肿瘤或淋巴结中。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指可以与活性成分组合，并且在组合后可以用于向受试者施用活性成分的化学组合物。
本文所述的药物组合物的配制剂可以通过药理学领域中已知的或以后开发的任何方法来制备。通常，此类制备方法包括以下步骤：使活性成分与载体或一种或多种其他辅助成分缔合，然后，如果必要或期望，将产品成型或包装成所需的单剂量或多剂量单位。
尽管本文提供的药物组合物的描述主要针对适合于对人类进行伦理施用的药物组合物，但是本领域技术人员将理解，此类组合物通常适合于施用于所有种类的动物。为了使组合物适合于向各种动物施用，适合于对人给药的药物组合物的修饰是众所周知的，并且普通技术的兽医药理师可以仅通过普通的(若有任何)实验来设计和进行此类修饰。预期施用本公开的药物组合物的受试者包括但不限于人和其他灵长类，哺乳动物，包括商业相关的哺乳动物，如非人灵长类、牛、猪、马、绵羊、猫和狗、鸟类，包括商业相关的鸟类，如鸡、鸭、鹅和火鸡；鱼类，包括农场饲养的鱼和观赏鱼以及甲壳类动物，例如农场饲养的贝类。
可用于本公开的方法的药物组合物可以以适合于口服、直肠、阴道、肠胃外、局部、肺、鼻内、病灶内、口腔、眼、静脉内、器官内或另一施用途径的配制剂制备、包装或出售。其他预期的配制剂包括预计的纳米颗粒、脂质体制剂、含有活性成分的重新密封的红细胞和基于免疫学的配制剂。
本公开的药物组合物可以作为单个单位剂量或作为多个单个单位剂量散装制备、包装或出售。如本文所用，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将被施用于受试者的活性成分的剂量或该剂量的方便的分数，例如该剂量的一半或三分之一。
本公开的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的载体和任何另外的成分的相对量将根据所治疗受试者的身份、大小和状况而变化并进一步取决于组合物施用的途径。举例来说，组合物可以包含0.1％和100％(w/w)之间的活性成分。
除活性成分外，本发明的药物组合物可以进一步包含一种或多种另外的药物活性剂。特别考虑的另外的试剂包括止吐药和清除剂，如氰化物和氰酸盐清除剂和AZT、蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、白介素-2、干扰素、细胞因子等。
可以使用常规技术来制备本公开的药物组合物的控释或缓释配制剂。
如本文所用，药物组合物的“肠胃外施用”包括特征在于对受试者的组织进行物理破坏并通过组织中的破坏进行药物组合物的施用的任何施用途径。因此，肠胃外施用包括但不限于通过注射组合物，通过手术切口施用组合物，通过穿透组织的非手术伤口施用组合物等来施用药物组合物。特别地，肠胃外给药预期包括但不限于皮下、腹膜内、肌内、胸骨内注射和肾透析输注技术。
适用于肠胃外施用的药物组合物的配制剂包含与药学上可接受的载体(如无菌水或无菌等渗盐水)组合的活性成分。此类配制剂可以以适合于推注施用或连续施用的形式制备、包装或出售。可注射配制剂可以以单位剂型(如在安瓿或含有防腐剂的多剂量容器中)制备、包装或出售。肠胃外施用的配制剂包括但不限于悬浮液、溶液、油性或水性媒介物中的乳液、糊剂和可植入的缓释或可生物降解配制剂。此类配制剂可以进一步包含一种或多种另外的成分，包括但不限于悬浮剂，稳定剂或分散剂。
药物组合物可以以无菌可注射的水性或油性悬浮液或溶液的形式制备、包装或出售。该悬浮液或溶液可以根据已知技术进行配制，并且除了活性成分外，还可以包含另外的成分，如本文所述的分散剂、湿润剂或悬浮剂。可以使用无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂，如水或1,3-丁二醇，来制备此类无菌可注射配制剂。其他可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和不挥发性油，如合成的甘油单酯或甘油二酯。其他有用的可胃肠外施用的配制剂包括那些以微晶形式，在脂质体制剂中或作为可生物降解的聚合物系统的组分包含活性成分的配制剂。用于缓释或植入的组合物可以包含药学上可接受的聚合物或疏水材料，如乳液、离子交换树脂、微溶聚合物或微溶盐。
可以将本公开的aAPC和/或使用aAPC扩增的T细胞施用于动物，优选人。当施用使用本公开的aAPC扩增的T细胞时，施用的细胞量可以在约100万个细胞至约3000亿的范围内。在施用aAPC本身的情况下，无论是否在其中扩增T细胞，可以以约100,000至约十亿个细胞的量施用它们，其中将细胞输注到动物，优选地，有此需要的人类患者中。尽管精确施用的剂量取决于许多因素，包括但不限于动物的类型和所治疗疾病状态的类型、动物的年龄和施用途径。
可以每天多次对动物施用aAPC，或者可以较不频繁地施用aAPC，如每天一次、每周一次、每两周一次、每月一次或甚至更不频繁，如每几个月一次，或甚至一年一次或更少。剂量的频率对技术人员而言是显而易见的，并且将取决于许多因素，如但不限于所治疗疾病的类型和严重性、动物的类型和年龄等。
可以将aAPC(或由此扩增的细胞)与各种其他化合物(细胞因子、化学治疗和/或抗病毒药物等)共同施用。或者可以在aAPC(或由此扩增的细胞)之前的一小时、一天、一周、一个月或甚至更长时间或其任何排列施用化合物。此外，可以在施用aAPC(或由此扩增的细胞)之后的一小时、一天、一周或甚至更长时间或其任何排列施用化合物。频率和施用方案对本领域技术人员而言是显而易见的，并且将取决于许多因素，如但不限于所治疗疾病的类型和严重性、动物的年龄和健康状态、待施用的一种或多种化合物的身份、各种化合物和aAPC(或由此扩增的细胞)的施用途径等。
此外，基于本文提供的公开内容，本领域技术人员将认识到，在将aAPC施用于哺乳动物的情况下，对细胞进行处理，以使其处于“无生长状态”；也就是说，当施用于哺乳动物细胞时，细胞不能分裂。如本文其他地方所公开的，一旦施用于哺乳动物，可以对细胞进行辐照以使其不能生长或分裂。在本领域中已知其他方法，包括半抗原化(例如，使用二硝基苯基和其他化合物)，以使待施用的细胞，特别是对人施用的细胞不能生长，并且这些方法在本文中不再进一步讨论。而且，已经致使不能体内分裂的aAPC的施用的安全性已经在I期临床试验中确定，该临床试验使用用编码本文讨论的一些分子的质粒载体转染的aAPC。
联合疗法
在一些实施方案中，本公开提供了进一步包括向受试者施用另外的试剂的方法。在一些实施方案中，本公开涉及共同施用和/或共同配制。
在一些实施方案中，当与另一种试剂共同施用时，aAPC的施用协同起作用，并且以比当将此类试剂用作单一疗法时通常使用的剂量低的剂量来施用。
在一些实施方案中，包括但不限于癌症应用，本公开内容涉及作为另外的试剂的化学治疗剂。化学治疗剂的实例包含(但不限于)烷基化剂，例如噻替哌(thiotepa)及CYTOXAN环磷酰胺(cyclosphosphamide)；磺酸烷基酯，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，例如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米得哌(meturedopa)及乌得哌(uredopa)；乙撑亚胺及甲基密胺，包含六甲密胺(altretamine)、三乙撑密胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫化磷酰胺及三羟甲基密胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯(acetogenin)(例如布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包含合成类似物托泊替康(topotecan))；苔藓虫素(bryostatin)；卡利抑制素(callystatin)；CC-1065(包含其合成类似物阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)及比折来新(bizelesin))；念珠藻素(cryptophycin)(例如念珠藻素1及念珠藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；多卡米星(duocarmycin)(包含合成类似物KW-2189及CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustard)，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯乙酸氮芥胆甾醇酯(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfmaide)、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素(calicheamicin)，尤其卡奇霉素gammall及卡奇霉素omegall；达内霉素(dynemicin)，包含达内霉素A；双膦酸盐类，例如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素发色团(neocarzinostatin chromophore)及相关色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、氮杂丝氨酸、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡拉霉素(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、ADRIAMYCIN多柔比星(doxorubicin)(包含吗啉基-多柔比星、氰吗啉基-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星及脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)(例如丝裂霉素C)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，例如胺甲蝶呤(methotrexate)及5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸(denopterin)、胺甲喋呤、蝶罗呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-阿扎尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，例如卡普睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪内酯酮(testolactone)；抗肾上腺素，例如胺鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如亚叶酸；乙酰葡醛酸内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；百思布什(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(eflornithine)；依利乙铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；蘑菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；类美坦辛(maytansinoid)，例如美坦辛(maytansine)及柄型菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；尼群克林(nitraerine)；喷托他汀(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖复合物)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofuran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2’,2”-三氯三乙胺(2,2',2”-trichlorotriethylamine)；单端孢霉烯(trichothecene)(例如T-2毒素、疣疱菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A及蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达喀尔巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；噶萨托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷(taxoid)，例如TAXOL太平洋紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-MyersSquibb Oncology,Princeton,N.J.)、ABRAXANE无克列莫佛(Cremophor-free)、白蛋白工程化太平洋紫杉醇纳米颗粒制剂及TAXOTERE多西紫杉醇(doxetaxel)；苯丁酸氮芥；GEMZAR；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，例如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)及卡铂(carboplatin)；长春花碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱(vincristine)；NAVELBINE.长春瑞滨(vinorelbine)；诺安托(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙；道诺霉素(daunomycin)；氨蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(Camptosar CPT-11)(包括伊立替康与5-FU和亚叶酸钙(leucovorin)的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视色素，例如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；考布他汀(combretastatin)；亚叶酸钙(LV)；奥沙利铂(oxaliplatin)，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；拉帕替尼(lapatinib)(TYKERB)；降低细胞增殖的PKC-α.,Raf,H-Ras,EGFR(例如厄洛替尼(Tarceva))和VEGF-A抑制剂以及上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。另外，治疗方法还可包括使用放射。
一些人类肿瘤可以通过患者的免疫系统消除。例如，施用靶向免疫“检查点”分子的单克隆抗体可以导致完全应答和肿瘤缓解。此类抗体的作用方式是通过抑制已被肿瘤选作抗肿瘤免疫应答的保护的免疫调节分子。通过抑制这些“检查点”分子(例如，用拮抗性抗体)，可以允许患者的CD8+ T细胞增殖并破坏肿瘤细胞。
例如，靶向，例如但不限于，CTLA-4或PD-1的单克隆抗体的施用可以导致完全应答和肿瘤缓解。此类抗体的作用方式是通过抑制已被肿瘤选作抗肿瘤免疫应答的保护的CTLA-4或PD-1。通过抑制这些“检查点”分子(例如，用拮抗性抗体)，可以允许患者的CD8+ T细胞增殖并破坏肿瘤细胞。
因此，包含呈递(例如，在细胞表面上包含)本文提供的一种或多种外源多肽的去核细胞或红系细胞的aAPC可以与靶向免疫“检查点”分子的一种或多种封闭抗体组合使用。例如，在一些实施方案中，本文提供的组合物可以与靶向分子如CTLA-4或PD-1的一种或多种封闭抗体组合使用。例如，本文提供的组合物可以与阻断、减少和/或抑制PD-1和PD-L1或PD-L2和/或PD-1与PD-L1或PD-L2的结合的试剂组合使用(作为非限制性实例，以下的一种或多种：尼武单抗(nivolumab)(ONO-4538/BMS-936558,MDX1106,OPDIVO,BRISTOL MYERSSQUIBB)、派姆单抗(pembrolizumab)(KEYTRUDA,Merck)、pidilizumab(CT-011,CURETECH)、MK-3475(MERCK)、BMS 936559(BRISTOL MYERS SQUIBB)、MPDL328OA(ROCHE))。在一个实施方案中，本文提供的组合物可以与阻断、减少和/或抑制CTLA-4的活性和/或CTLA-4与一种或多种受体(例如CD80、CD86、AP2M1、SHP-2和PPP2R5A)的结合的试剂组合使用。例如，在一些实施方案中，免疫调节剂是抗体，如但不限于伊匹单抗(ipilimumab)(MDX-010,MDX-101,Yervoy,BMS)和/或曲美单抗(tremelimumab)(Pfizer)。可以从例如BristolMyers Squibb(New York,N.Y.)、Merck(Kenilworth,N.J.)、Medlmmune(Gaithersburg,Md.)和Pfizer(New York,N.Y.)获得针对这些分子的封闭抗体。
此外，本文提供的aAPC组合物可以与一种或多种靶向免疫“检查点”分子的封闭抗体组合使用，所述免疫“检查点”分子例如BTLA、HVEM、TIM3、GALS、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160(也称为BY55)、CGEN-15049、CHK 1和CHK2激酶、A2aR、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、GITR、GITRL、半乳凝素-9、CD244、CD160、TIGIT、SIRPα、ICOS、CD172a和TMIGD2以及各种B-7家族配体(包括但不限于B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H5、B7-H6和B7-H7)。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，红系细胞是去核红系细胞。在上述方面和实施方案的一些实施方案中，红系细胞是有核红系细胞。
在一些实施方案中，本公开的特征在于药物组合物，其包含多个本文所述的工程化红系细胞以及药物载体。在其他实施方案中，本公开的特征在于药物组合物，其包含本文所述的工程化红系细胞的群体和药物载体。应当理解，如本文其他地方所述的任何单个工程化红系细胞、多个工程化红系细胞或工程化红系细胞的群体可以存在于本发明的药物组合物中。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物包含工程化(即，修饰的)红系细胞和未修饰的红系细胞。例如，在各种实施方案中，单个单位剂量的红系细胞(例如，修饰的和未修饰的红系细胞)可以包含约、至少或不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的工程化红系细胞，其中组合物中剩余的红系细胞未经工程化。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物包含工程化去核红系细胞和有核红系细胞。例如，在各种实施方案中，单个单位剂量的工程化红系细胞(例如去核和有核红系细胞)可以包含约或至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％去核红系细胞，其中组合物中剩余的红系细胞是有核的。
VI.试剂盒
本公开包括各种试剂盒，其包含本公开的aAPC、编码各种蛋白质的核酸、与T细胞表面上的共刺激性分子特异性结合的抗体和/或编码本公开的抗体的核酸、抗原，或细胞因子、施加器(applicator)和说明材料，其描述了试剂盒用于执行本公开的方法的用途。尽管下面描述了示例性试剂盒，但是根据本公开，其他有用的试剂盒的内容对于本领域技术人员将是显而易见的。这些试剂盒中的每一个都包括在本公开内。
本公开包括用于特异性诱导表达已知的共刺激性分子的T细胞的增殖的试剂盒。这是因为使T细胞与aAPC接触特异性诱导T细胞的增殖。试剂盒根据本公开中所公开的方法使用。简而言之，试剂盒可以用于向表达至少一种共刺激性分子的T细胞施用本公开的aAPC。这是因为，如本文其他地方更全面地公开的，本文公开的数据表明，使T细胞与包含共刺激性配体的aAPC接触介导T细胞的刺激和激活，所述共刺激性配体与T细胞上存在的同源共刺激性分子特异性结合。另外，使用该试剂盒产生的T细胞可以施用于动物以获得治疗效果。
试剂盒进一步包含用于将aAPC施用于T细胞的施加器。试剂盒中包括的特定施加器将取决于，例如，用于施用aAPC的方法以及由aAPC扩增的T细胞，并且此类施加器是本领域众所周知的，并且除其他外，还可以包括：移液器、注射器、滴管等。此外，试剂盒包含用于试剂盒使用的说明材料。这些说明仅使本文提供的公开具体化。
该试剂盒包括药学上可接受的载体。以如本文其他地方所述的适当量提供组合物。此外，施用途径和施用频率如本文先前其他地方所述。
试剂盒涵盖包含大量分子的aAPC，如但不限于本文所述的那些。然而，掌握了本文提供的教导的技术人员将容易理解，本公开绝不限于这些或任何其他分子组合。而是，本文阐述的组合是出于说明性目的，并且它们绝不限制本公开涵盖的组合。此外，试剂盒包含下述试剂盒，其中待转导到aAPC中的每个分子作为编码分子的分离核酸的、包含编码分子的核酸的载体及其任意组合提供，包括其中至少两个分子由连续的核酸编码和/或由相同的载体编码的情况。
出于所有目的，在本说明书中引用的所有出版物和专利申请以其整体通过引用并入本文，就好像每个单独的出版物或专利申请均被明确地和单独地指出出于所有目的通过引用并入。本文讨论的出版物仅针对其在本申请的提交日期之前的公开而提供。本文中的任何内容均不得解释为承认本文所述的发明人由于先前的公开或由于任何其他原因而无权先于此类公开。
实施例
实施例1.经基因工程化改造以表达MOG-MHCII-GPA融合蛋白的红系细胞的产生
结果
转导红系细胞表达以融合蛋白，该融合蛋白包含外源抗原性肽(髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG))，与外源抗原呈递多肽(特别是MHCII)融合，与GPA跨膜结构域(GPA)融合，所述GPA跨膜结构域(GPA)充当膜锚(MOG-MHCII-GPA)。图1A显示用于表达MOG肽和MHCII作为单链融合物的设计示意图，其中外源肽(MOG)连接至MHCIIβ链，该MHCIIβ链连接至MHCIIα链，该MHCIIα链连接至GPA膜锚。如下文“方法”部分所述进行细胞培养和转导，以产生表达由MHCII在细胞表面上呈递的MOG的红系细胞，其用GPA跨膜结构域锚定。
别藻蓝蛋白(APC)标记或藻红蛋白(PE)标记的抗MOG抗体的结合用于验证抗原性肽在工程化红系细胞中的表达。APC标记或PE标记的抗MHCII抗体的结合用于验证MHCII抗原呈递肽在工程化红系细胞中的表达。
方法
慢病毒载体的产生
将编码MOG-MHCII-GPA融合蛋白的基因克隆到来自System Biosciences的具有MSCV启动子序列的慢病毒载体pCDH的多克隆位点中。通过用pPACKH1(SystemBiosciences)和含有MOG-MHCII-GPA基因的pCDH慢病毒载体转染细胞在293T细胞中产生慢病毒。然后将细胞置于新鲜的培养基中。培养基改变后48小时，通过以1,500rpm离心5分钟来收集病毒上清液。收集上清液并在-80℃下等分冷冻。
红系细胞的扩增和分化
从正常人供体动员的外周血细胞衍生的人CD34+细胞是从AllCells Inc.冷冻购买的。扩增/分化规程包括3个阶段。在第一阶段，将解冻的CD34+红系前体在包含重组人胰岛素、人转铁蛋白，重组人干细胞因子和重组人白介素3的Iscove的MDM培养基中进行培养。在第二阶段，将红系细胞在补充有牛血清白蛋白、重组人胰岛素、人转铁蛋白、人重组干细胞因子、人重组促红细胞生成素和L-谷氨酰胺的Iscove的MDM培养基中进行培养。在第三阶段，在补充有人转铁蛋白、重组人胰岛素、人重组促红细胞生成素和肝素的Iscove的MDM培养基中培养红系细胞。将培养物维持在37℃下的5％CO2培养箱中。
红系前体细胞的转导
在上述培养过程的步骤1期间转导红系前体细胞。将培养基中的红系细胞与慢病毒上清液和聚凝胺混合。通过旋转接种在室温下以2000rpm旋转平板90分钟来实现感染。旋转接种后，将细胞在37℃下温育过夜。
抗体结合
使用APC标记或PE标记的抗MHCII抗体(例如，抗人HLA-DR(HLA II类)单克隆抗体，别藻蓝蛋白缀合的，来自Beckman Coulter Life Sciences的克隆Immu-357)的结合来验证工程化红系细胞中的MHCII抗原呈递肽的表达。通过针对APC荧光或PE荧光的流式细胞术测量抗体的结合。基于染色的未转导的细胞设置门控。
实施例2.经基因工程化改造以共表达MOG-MHCII-GPA融合蛋白和共抑制多肽的红系细胞的产生和体外验证
结果
如实施例1中所述，转导红系细胞以表达融合蛋白，该融合蛋白包含外源抗原性肽(MOG)，与外源抗原呈递多肽(MHCII)融合，与GPA跨膜结构域(GPA)融合(MOG-MHCII-GPA)。共转导红系细胞以另外表达外源共抑制性肽PD-L1。如下文“方法”部分所述进行细胞培养和转导，以产生表达由MHCII在细胞表面上呈递的MOG的红系细胞，其用GPA跨膜结构域锚定，并共表达PD-L1。
也如实施例1中所述，APC标记或PE标记的抗MHCII抗体的结合用于验证MHCII抗原呈递肽在工程化红系细胞中的表达。APC标记或PE标记的抗PD-L1抗体的结合用于验证PD-L1在工程化红系细胞中的表达。
通过确定一种或多种对抑制T细胞的作用，包括(1)抑制T细胞活性，(2)抑制T细胞增殖，和/或(3)诱导T细胞凋亡来评估工程化红系细胞(MOG-MHCII-GPA和PD-L1)的作用。
方法
慢病毒载体的产生
构建了MOG-MHCII-GPA融合蛋白和PD-L1的基因。将编码蛋白质的基因克隆到来自System Biosciences的具有MSCV启动子序列的慢病毒载体pCDH的多克隆位点中，使得一个载体包含两种外源蛋白质的基因。通过用pPACKH1(System Biosciences)和pCDH慢病毒载体(含有MOG-MHCII-GPA和PD-L1的基因)转染细胞在293T细胞中生产慢病毒。将细胞置于新鲜的培养基中。培养基改变后48小时，通过以1,500rpm离心5分钟来收集病毒上清液。收集上清液并在-80℃下等分冷冻。
红系前体细胞的转导
根据实施例1，用上述慢病毒载体进行红系细胞的扩增和分化。在培养过程的步骤1期间转导红系前体细胞。将培养基中的红系细胞与慢病毒上清液和聚凝胺混合。通过旋转接种在室温下以2000rpm旋转平板90分钟来实现感染。旋转接种后，将细胞在37℃下温育过夜。
抗体结合
如实施例1中所述进行APC标记的或PE标记的抗MHCII抗体的结合以验证MHCII抗原呈递肽在工程化红系细胞中的表达。使用APC标记的或PE标记的抗PD-L1抗体(例如APC抗人CD274(B7-H1，PD-L1)抗体(Biolegend))的结合以验证PD-L1在工程化红系细胞中的表达。通过针对APC荧光或PE荧光的流式细胞术测量抗体的结合。基于染色的未转导的细胞设置门控。
功能验证测定法
通过确定(1)抑制T细胞活性，(2)抑制T细胞增殖和(3)诱导T细胞凋亡中的一种或多种来评估共表达MOG-MHCII-GPA和PD-L1的工程化红系细胞对T细胞抑制的作用。例如，通过使用用于人IL-2、IFN-γ和IL-10的可商购ELISA试剂盒(R&D Systems)对上清液进行细胞因子分析来确定T细胞活性的抑制。例如，在用工程化的红系细胞处理后，检测到活化的T细胞对IL-2分泌的抑制，将表明共表达MOG-MHCII-GPA和PD-L1的工程化红系细胞的抗增殖作用。例如，通过用荧光染料5,6-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记细胞来测定T细胞增殖的抑制。响应工程化红系细胞增殖的那些细胞显示CFSE荧光强度降低，其通过流式细胞术直接测量。或者，放射性胸苷掺入可以用于评估用经工程化改造以共表达MOG-MHCII-GPA融合蛋白和PD-L1共抑制性多肽的红系细胞刺激的T细胞的生长速率。使用例如荧光物缀合的膜联蛋白V染色测定通过共表达MOG-MHCII-GPA和PD-L1的工程化红系细胞对T细胞凋亡的诱导。BATF是bZIP转录因子，其在调节许多淋巴细胞谱系的分化和功能中起重要作用。在CD8+ T细胞谱系中，耗尽的CD8+ T细胞中BATF表达的增加抑制了其效应子功能。已显示BAFT是早期效应CD8+ T细胞分化的中央调节物。因此，对转录因子如碱性亮氨酸拉链转录因子ATF样(BATF)的表达的评估可以用于确定MOG-MHCII-GPA和PD-L1对T细胞抑制的作用。
实施例3.经基因工程化改造以共表达MOG-MHCII-GPA融合蛋白和Treg扩增多肽的红系细胞的产生和体外验证
结果
如实施例1中所述，转导红系细胞以表达融合蛋白，该融合蛋白包含外源抗原性肽(MOG)，与外源抗原呈递多肽(MHCII)融合，与GPA跨膜结构域(GPA)融合(MOG-MHCII-GPA)。还转导红系细胞以另外表达外源Treg扩增多肽，即TNFR2特异性TNFα多肽。如下文“方法”部分所述进行细胞培养和转导，以产生表达由MHCII在细胞表面上呈递的MOG的红系细胞，其用GPA跨膜结构域锚定，并共表达TNFR2特异性TNFα多肽。
APC标记或PE标记的抗TNFα的结合用于验证抗原性肽在工程化红系细胞中的表达。APC标记或PE标记的抗MHCII抗体的结合用于验证MHCII抗原呈递肽在工程化红系细胞中的表达。如实施例2中所述，使用基于人法CD4+ T细胞的增殖测定评估了工程化红系细胞(MOG-MHCII-GPA和TNFR2特异性TNFα)的作用的功能活性。
方法
慢病毒载体的产生
构建了MOG-MHCII-GPA融合蛋白和TNFR2特异性TNFα的基因。将编码蛋白质的基因克隆到来自System Biosciences的具有MSCV启动子序列的慢病毒载体pCDH的多克隆位点中，使得一个载体包含两种外源蛋白质的基因。通过用pPACKH1(System Biosciences)和pCDH慢病毒载体(含有MOG-MHCII-GPA和TNFR2特异性TNFα的基因)转染细胞在293T细胞中生产慢病毒。将细胞置于新鲜的培养基中。培养基改变后48小时，通过以1,500rpm离心5分钟来收集病毒上清液。收集上清液并在-80℃下等分冷冻。
红系前体细胞的转导
根据实施例1，用上述慢病毒载体进行红系细胞的扩增和分化。在培养过程的步骤1期间转导红系前体细胞。将培养基中的红系细胞与慢病毒上清液和聚凝胺混合。通过旋转接种在室温下以2000rpm旋转平板90分钟来实现感染。旋转接种后，将细胞在37℃下温育过夜。
抗体结合
如实施例1中所述进行APC标记的或PE标记的抗MHCII抗体的结合以验证MHCII抗原呈递肽在工程化红系细胞中的表达。使用APC标记的或PE标记的TNFα抗体的结合以验证TNFR2特异性TNFα突变体在工程化红系细胞中的表达。通过针对APC荧光或PE荧光的流式细胞术测量抗体的结合。基于染色的未转导的细胞设置门控。
功能验证测定法
使用基于人CD4+ T细胞的增殖测定法评估功能活性。用荧光染料5,6-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记细胞。响应工程化红细胞而增殖的那些细胞显示CFSE荧光强度降低，其通过流式细胞术直接测量。或者，放射性胸苷掺入可以用于评估用经工程化改造以共表达MOG-MHCII-GPA融合蛋白和CD25特异性IL2 Treg扩增多肽的红系细胞刺激的T细胞的生长速率。
还使用体外Treg抑制测定法评估功能活性。此类测定法描述于Collinson andVignali(Methods Mol Biol.2011；707:21–37，以其整体通过引用并入本文)。
实施例4.在鼠EAE模型中共表达MOG-MHCII-GPA融合蛋白和共抑制性多肽或Treg扩增多肽的去核红系细胞的活性
实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)是最常用于研究潜在药物治疗多发性硬化症(MS)功效的模型。由于其与MS的许多相似之处，EAE用于研究自身免疫、CNS炎症、脱髓鞘、细胞运输和耐受诱导的发病机理。EAE的特征在于麻痹(在某些模型中，麻痹是复发缓解型)、CNS炎症和脱髓鞘。用于在C57BL/6小鼠(Hooke Laboratories)中诱发EAE的Hooke KitsTM用于在雌性C57BL/6小鼠中诱发EAE。使用此方法，通过在完全弗氏佐剂(CFA)中用MOG35-55或MOG1-125乳剂免疫，在C57BL/6小鼠中诱导EAE，然后在免疫当天首先施用PBS中的百日咳毒素，然后在第二天再一次。典型的EAE发作是在免疫后9到14天，每只小鼠在发作后3到5天达到疾病高峰。高峰持续1至3天，然后部分恢复。最初部分恢复后，约25％的小鼠将显示EAE严重性增加(复发)。这通常在免疫后20-27天发生。使用10至12只小鼠的组，每笼4至6只小鼠。
在适合于去核红系细胞的缓冲液中配制包含MOG-MHCII-GPA和PD-L1或MOG-MHCII-GPA和CD25特异性IL2的工程化去核红系细胞。在EAE发作时开始用工程化去核红系细胞进行治疗。如果正在测试工程化去核红系细胞的逆转慢性EAE过程的能力，则应在疾病发作后7-14天开始治疗。在小鼠发展EAE(滚动入组)时或在免疫后的固定时间将小鼠分配至治疗组，但始终以平衡的方式获得具有相似EAE发作时间和相似EAE发作得分的组。如果入组在EAE发作后，则在入组前也要平衡小鼠的最大得分。
剂量以临床得分＝1进行，如下表25中所示。
动物的剂量每天可以进行1-3次。给药频率为每2-14天，例如每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天。
使用以下一种或多种确定对表达MOG-MHCII-GPA和PD-L1的工程化去核红系细胞或包含MOG-MHCII-GPA和CD25特异性IL2的红系细胞的作用的评估：(1)EAE评分；(2)体重变化和(3)组织学分析，如下详述。
EAE评分
通常，当临床情况介于两个定义的得分之间时，EAE的评分范围为0至5，包括“中间”得分(即0.5、1.5、2.5、3.5)。对于每只个体小鼠，评分方法根据疾病的阶段(发作/高峰与恢复)而略有不同。为了避免在评分时无意识的偏见，通过不知晓那只小鼠接受了哪种治疗的人对小鼠进行盲评分。
表25.小鼠EAE评分-发作和高峰
Figure BDA0002631423640003421
Figure BDA0002631423640003431
Figure BDA0002631423640003441
在EAE的恢复阶段，大多数小鼠的尾巴将不再瘫软，但也不正常。感觉僵硬，被“钩住”。后腿可以开始移动(踩踏)，但小鼠无法行走。任何一种变化都使得分变得困难。因此，如果是这种情况，则对这些小鼠使用对以上评分标准的以下修改，如下表26所示：
表26.小鼠EAE得分-修改
Figure BDA0002631423640003442
Figure BDA0002631423640003451
体重
在EAE过程期间，体重的变化反映出疾病的严重程度。免疫后的第二天，小鼠通常失去小量体重。这似乎是由于所施用的佐剂和百日咳毒素的作用。然后，小鼠稳步增加其体重，直到疾病发作。在EAE发作的那天，小鼠持续失去1-2g的体重(体重的5-10％)。随着EAE严重程度的发展，体重减轻持续，在疾病高峰，体重减轻达到其发病前体重的20％左右。体重减轻最有可能是由于麻痹和食物摄入减少两者以及炎症的急性期期间促炎性细胞因子(如TNF)的大量产生。达到疾病高峰后，即使临床得分没有改善，小鼠也逐渐增重。体重增加可能是由于炎症的下调，导致血液中促炎细胞因子水平降低。未经处理或经媒介物处理的小鼠在免疫后28天通常具有约90％的免疫前体重。
组织学
在研究结束时(通常在免疫后约28天左右)或媒介物组达到疾病高峰时(通常在免疫后14-18天)进行组织学分析。EAE中的炎症通常始于脊髓的腰部区域，并在疾病高峰时扩散到整个脊髓。
在疾病发作时，炎性病灶的数量与疾病的严重程度密切相关。病灶的数量在疾病高峰之前有所增加，此时在整个脊髓中通常发现6-15个炎性病灶/切片。在EAE的慢性阶段(从疾病高峰后的几天开始)，许多炎性病灶消退，通常在免疫后约28天时在每个脊髓切片中导致3-4个炎性病灶。
因为在病程的早期存在最多的炎性病灶，所以如果在研究结束时进行组织学分析，则EAE发作较晚的小鼠在脊髓中通常具有比可以从其临床得分预期的更多的炎性病灶。例如，在28天的研究中，免疫后27天EAE发作且最终临床评分为2的小鼠比免疫后9天EAE发作且最终评分为3.5的小鼠可能具有更多的炎性病灶。同样，在研究结束前不久复发的小鼠(复发定义为临床得分增加1个或更多点)在研究结束时通常比患有稳定的慢性疾病的小鼠具有更多的炎性病灶，即使两者在研究结束时具有相同的临床得分。
脱髓鞘通常在疾病发作后的前两天内未发现，但在疾病高峰期(EAE发作后4-5天)发现，并在EAE的慢性期期间持续。脱髓鞘得分在免疫高峰后和28天之间变化不大，通常平均为1.2至2.5。
在Luxol坚蓝染色切片(LFB)和H&E切片两者中均对脱髓鞘进行评分。在LFB切片中，脊髓白质染色为深蓝色，脱髓鞘区域为浅蓝色，并伴有较大的液泡。在H&E染色的切片中，带有大液泡的正常结构的破坏表明脱髓鞘。
凋亡细胞在H&E切片中识别，并且通常在疾病发展的前两天期间未发现。它们是在EAE的高峰和慢性阶段发现的。每切片中凋亡细胞的平均数量通常为2和4之间。
在实施方案中，施用表达MOG-MHCII-GPA和PD-L1的去核红系细胞或表达MOG-MHCII-GPA和CD25特异性IL2的红系细胞将导致以下的一种或多种：EAE得分改善或降低与媒介物处理的对照小鼠相比炎性病灶的数量。
实施例5.基因工程化以表达PR1-HLA-A2-GPA融合蛋白的红系细胞的产生
结果
转导红系细胞表达以融合蛋白，该融合蛋白包含PR1(人白细胞抗原(HLA)-A2限制肽)，与外源抗原呈递多肽(MHCI HLA-A2)融合，与GPA跨膜结构域(GPA)融合(PR1-HLA-A2-GPA)。图1B显示用于表达PR1肽和MHCI作为单链融合物的设计示意图。如下文“方法”部分所述进行细胞培养和转导，以产生表达由MHCI在细胞表面上呈递的PR1的红系细胞，其用GPA跨膜结构域锚定。
APC标记或PE标记的抗PR1抗体的结合用于验证抗原性肽在工程化红系细胞中的表达。APC标记或PE标记的抗MHCI抗体的结合用于验证MHCI抗原呈递肽在工程化红系细胞中的表达。
方法
慢病毒载体的产生
将编码PR1-HLA-A2-GPA融合蛋白的基因克隆到来自System Biosciences的具有MSCV启动子序列的慢病毒载体pCDH的多克隆位点中。通过用pPACKH1(SystemBiosciences)和含有PR1-HLA-A2-GPA基因的pCDH慢病毒载体转染细胞在293T细胞中产生慢病毒。然后将细胞置于新鲜的培养基中。培养基改变后48小时，通过以1,500rpm离心5分钟来收集病毒上清液。收集上清液并在-80℃下等分冷冻。
红系细胞的扩增和分化
从正常人供体动员的外周血细胞衍生的人CD34+细胞是从AllCells Inc.冷冻购买的。扩增/分化规程包括3个阶段。在第一阶段，将解冻的CD34+红系前体在包含重组人胰岛素、人转铁蛋白，重组人干细胞因子和重组人白介素3的Iscove的MDM培养基中进行培养。在第二阶段，将红系细胞在补充有牛血清白蛋白、重组人胰岛素、人转铁蛋白、人重组干细胞因子、人重组促红细胞生成素和L-谷氨酰胺的Iscove的MDM培养基中进行培养。在第三阶段，在补充有人转铁蛋白、重组人胰岛素、人重组促红细胞生成素和肝素的Iscove的MDM培养基中培养红系细胞。将培养物维持在37℃下的5％CO2培养箱中。
红系前体细胞的转导
在上述培养过程的步骤1期间转导红系前体细胞。将培养基中的红系细胞与慢病毒上清液和聚凝胺混合。通过旋转接种在室温下以2000rpm旋转平板90分钟来实现感染。旋转接种后，将细胞在37℃下温育过夜。
抗体结合
使用别藻蓝蛋白(APC)标记或藻红蛋白(PE)标记的抗PR1-HLA-A2抗体(例如，抗PR1/HLA-A2单克隆抗体Hu8F4)的结合来验证工程化红系细胞中的PR1-HLA-A2-GPA融合蛋白的表达。通过针对APC荧光或PE荧光的流式细胞术测量抗体的结合。基于染色的未转导的细胞设置门控。
使用APC标记或PE标记的抗MHCI抗体(例如，HLA-A2抗体(MA1-80117),Invitrogen)的结合来验证工程化红系细胞中的MHCI抗原呈递肽的表达。通过针对APC荧光或PE荧光的流式细胞术测量任何一种抗体的结合。基于染色的未转导的细胞设置门控。
实施例6.经基因工程化改造以共表达PR1-HLA-A2-GPA融合蛋白和共刺激性多肽的红系细胞的产生和体外验证
结果
转导红系细胞表达以融合蛋白，该融合蛋白包含PR1(人白细胞抗原(HLA)-A2限制肽)，与外源抗原呈递多肽(MHCI HLA-A2)融合，与GPA跨膜结构域融合(PR1-HLA-A2-GPA)。图1B显示用于表达PR1肽和MHCI作为单链融合物的设计示意图。红系细胞也经转导以另外表达外源共刺激性肽4-1BBL。如下文“方法”部分所述进行细胞培养和转导，以产生表达由MHCI在细胞表面上呈递的PR1的红系细胞，其用GPA跨膜结构域锚定。
APC标记或PE标记的抗PR1或抗4-1BBL抗体与外源肽PR1和4-1BBL的结合用于验证各自的肽在工程化红系细胞中的表达。APC标记或PE标记的抗MHCI抗体的结合用于验证MHCI抗原呈递肽在工程化红系细胞中的表达。
评估工程化红系细胞(PR1-HLA-A2-GPA，4-1BBL)的作用的功能活性为了其刺激原代CD8+ T细胞的初始激活和增殖的能力。
方法
慢病毒载体的产生
构建了PR1-HLA-A2-GPA融合蛋白和4-1BBL的基因。将编码蛋白质的基因克隆到来自System Biosciences的具有MSCV启动子序列的慢病毒载体pCDH的多克隆位点中，使得一个载体包含两种外源蛋白质的基因。通过用pPACKH1(System Biosciences)和含有PR1-HLA-A2-GPA和4-1BBL的基因的pCDH慢病毒载体转染细胞在293T细胞中产生慢病毒。然后将细胞置于新鲜的培养基中。培养基改变后48小时，通过以1,500rpm离心5分钟来收集病毒上清液。收集上清液并在-80℃下等分冷冻。
红系前体细胞的转导
用上述慢病毒载体根据实施例5进行红系细胞的扩增和分化。在培养过程的步骤1期间转导红系前体细胞。将培养基中的红系细胞与慢病毒上清液和聚凝胺混合。通过旋转接种在室温下以2000rpm旋转平板90分钟来实现感染。旋转接种后，将细胞在37℃下温育过夜。
抗体结合
如实施例5中所述，使用APC标记或PE标记的抗PR1抗体的结合来验证工程化红系细胞中的PR1-HLA-A2-GPA融合物的表达。同样如实施例5中所述，使用APC标记或PE标记的抗MHCI抗体的结合来验证工程化红系细胞中MHCI抗原呈递多肽的表达。使用APC标记或PE标记的抗4-1BBL抗体(R&D Systems)的结合来验证工程化红系细胞中4-1BBL的表达。通过针对APC荧光或PE荧光的流式细胞术测量抗体的结合。基于染色的未转导的细胞设置门控。
功能验证测定法
对经过基因工程化改造以共表达PR1-HLA-A2-GPA融合蛋白和4-1BBL共刺激性多肽的红系细胞，测试其刺激原代CD8+ T细胞初始活化和增殖的能力。用工程化红系细胞刺激T细胞，并评估以下参数：(1)用aAPC刺激的T细胞的生长速率，通过标准的胸苷掺入测定法确定，得出大量培养物中合成的DNA总量；(2)诱导CD4+ T细胞的增殖和细胞分裂；(3)通过膜联蛋白V和碘化丙啶的荧光染色，在培养期间各种aAPC刺激的CD8+ T细胞的活力；(4)使用定量实时RT-PCR测定Bcl-xL和IL-2的表达，这两个基因分别涉及T细胞存活和增殖，以确定编码Bcl-xL和IL-2的稳态mRNA水平。
细胞因子产生
细胞因子是重要的效应分子，并提供有关T细胞分化的见解。定量经工程化改造以共表达PR1-HLA-A2-GPA融合物和共刺激性肽4-1BBL的红系细胞从CD8 T细胞诱导某些细胞因子的能力，例如IL-2(离体扩增的关键T细胞生长因子和细胞诱导IL-2的能力与其长期生长潜力密切相关)；IL-4(TH2分化的标志物)；和IL-10(免疫抑制性细胞因子，其可以替代T调节细胞的外生长)。其他细胞因子包括但不限于TGF-β(与IL-10相同的理由)；IFN-γ(TH1分化的标志物和重要的效应细胞因子)；和TNFα(重要的效应细胞因子)。可以使用ELISPOT(酶联免疫斑点)技术进行定量，该技术检测响应抗原性刺激而分泌给定细胞因子(例如，gamma干扰素[IFN-γ])的T细胞。在已经用抗IFN-γ抗体包被的孔中用抗原呈递细胞培养T细胞。由包被的抗体捕获分泌的IFN-γ，然后用与偶联至生色底物的第二抗体揭示。因此，局部分泌的细胞因子分子形成斑点，每个斑点对应于一个分泌IFN-γ的细胞。点的数量允许确定分析样品中特定抗原的IFN-γ分泌细胞的频率。还描述了ELISPOT测定法用于检测肿瘤坏死因子alpha、白介素4(IL-4)、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。
实施例7.在急性骨髓性白血病(AML)鼠体内癌症模型中经工程化改造以共表达PR1-HLA-A2-GPA融合蛋白和共刺激性多肽的去核红系细胞的活性
已显示PR1肽是人白血病抗原。研究显示，从健康供体体外诱发的PR1特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)可以溶解来自患者的P3表达AML细胞。此外，已显示体外产生的PR1-CTL的过继转移与NOD/SCID小鼠中的AML细胞减少有关(Molldrem et al.,CancerRes.1999；59:2675–2681；Molldrem et al.,Nat Med.2000；6:1018–1023；Rezvani etal.,Blood.2003；102:2892–2900；其每一篇的全部内容通过引用并入本文)。
成熟的NOD/SCID小鼠被用作模型来确定接受PR1-CTL的小鼠的骨髓抽吸物是否比接受PR1-CTL加上经工程化改造以共表达PR1-HLA-A2-GPA融合蛋白和4-1BBL的去核红系细胞的小鼠在高细胞骨髓中具有更多的AML胚细胞(blast)。该模型还用于确定与未接受去核红系细胞的小鼠相比，接受经工程化改造以共表达PR1-HLA-A2-GPA融合蛋白和4-1BBL的去核红系细胞的小鼠中PR1-CTL水平是否更高。该模型还用于确定接受工程化改造以共表达PR1-HLA-A2-GPA融合蛋白和4-1BBL的去核红系细胞的小鼠与未接受去核红系细胞的小鼠相比是否维持CD45RA-CD28+效应子表型。
PR1-CTL生产
PR1-CTL使用具有一些修改的先前描述的方法在批量培养中扩增(Molldrem etal.,Blood.1996；88:2450–2457，其全部内容通过引用并入本文)。自体树突状细胞(DC)由HLA-A2.1+健康供体产生。简而言之，用细胞因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(500IU/mL)和干扰素(INF)-α的组合刺激正常供体的粘附单核细胞7天。收集活化的DC，并通过FACS分析一部分细胞的CD80和CD14表达。在存在IL-2(20IU/ml)的情况下，用PR1、PR2或pp65肽对DC进行脉冲处理。PR2(RLFPDFFTRV(SEQ ID NO:720))是衍生自蛋白酶3的另一种HLA-A2限制性肽，但是PR2-CTL不能杀伤白血病细胞(Molldrem et al.,Blood.1996)。每周用肽脉冲的自体DC刺激外周血单核细胞(PMBC)3-4周。收获一部分PR1-CTL，并使用先前使用的CTL细胞毒性测定法(Molldrem et al.,Blood.1996，其全部内容通过引用并入本文)来测试特异性裂解。用分选器从大量培养物中纯化剩余的CTL同时使用抗体耗竭CD4、B和自然杀伤(NK)细胞。
NOD/SCID AML异种移植模型
NOD/SCID-HLA-A2.1小鼠用于AML细胞的植入。获得人AML骨髓样品，并将来自患者的AML细胞静脉内转移到经辐照(200cGy)的NOD/SCID小鼠中。基于转移后2周以各种剂量成功移植到骨髓中的能力来选择AML骨髓样品。将少量PR1特异性T细胞过继转移到植入有AML(单独地或与经工程化改造以共表达PR1-HLA-A2-GPA融合蛋白和4-1BBL的去核红系细胞一起)的NOD-SCID小鼠。转移后2周将动物处死，并收获组织进行流式细胞术(FACS)和免疫组织化学(IHC)分析。人CD45 Ab和小鼠CD45.2 Ab用于鉴定人源细胞。对细胞离心制备物和从骨髓制备的涂片进行差异细胞计数。用苏木精和曙红染色对收获的组织器官的福尔马林固定的石蜡包埋的切片染色。
CD45RA-CD28+效应子表型
使用APC标记或PE标记的抗CD45RA抗体(Biolegend)和APC标记或PE标记的抗CD28抗体(Biolegend)以验证CD45RA-CD28+效应子表型。通过针对APC荧光或PE荧光的流式细胞术测量抗体的结合。基于染色的未转导的细胞设置门控。
在实施方案中，接受PR1-CTL的小鼠的骨髓抽吸物比接受PR1-CTL加上经工程化改造以共表达PR1-HLA-A2-GPA融合蛋白和4-1BBL的去核红系细胞的小鼠在高细胞骨髓中具有更多的AML胚细胞。在其他实施方案中，与未接受去核红系细胞的小鼠相比，接受经工程化改造以共表达PR1-HLA-A2-GPA融合蛋白和4-1BBL的去核红系细胞的小鼠中PR1-CTL水平更高。在其他实施方案中，接受工程化改造以共表达PR1-HLA-A2-GPA融合蛋白和4-1BBL的去核红系细胞的小鼠与未接受去核红系细胞的小鼠相比维持CD45RA-CD28+效应表型。
实施例8.经基因工程化改造以共表达gp100-H-2Db-GPA融合蛋白和共刺激性多肽的红系细胞的产生和体外验证
结果
转导红系细胞表达以融合蛋白，该融合蛋白包含gp100(黑素瘤抗原)，与外源抗原呈递多肽(MHCI H-2Db)融合，与GPA跨膜结构域融合(gp100-H-2Db-GPA)。红系细胞也经转导以另外表达外源共刺激性肽4-1BBL。如下文“方法”部分所述进行细胞培养和转导，以产生表达由MHCI在细胞表面上呈递的gp100的红系细胞，其用GPA跨膜结构域锚定。
APC标记或PE标记的抗gp100或抗41-BBL抗体与外源肽gp100和4-1BBL的结合用于验证各自的肽在工程化红系细胞中的表达。APC标记或PE标记的抗MHCI抗体的结合用于验证MHCI抗原呈递肽在工程化红系细胞中的表达。
评估工程化红系细胞(gp100-H-2Db-GPA，4-1BBL)的作用的功能活性为了其刺激原代CD8+ T细胞的初始激活和增殖的能力。
方法
慢病毒载体的产生
构建了gp100-H-2Db-GPA融合蛋白和4-1BBL的基因。将编码蛋白质的基因克隆到来自System Biosciences的具有MSCV启动子序列的慢病毒载体pCDH的多克隆位点中，使得一个载体包含两种外源蛋白质的基因。通过用pPACKH1(System Biosciences)和含有gp100-H-2Db-GPA和4-1BBL的基因的pCDH慢病毒载体转染细胞在293T细胞中产生慢病毒。然后将细胞置于新鲜的培养基中。培养基改变后48小时，通过以1,500rpm离心5分钟来收集病毒上清液。收集上清液并在-80℃下等分冷冻。
红系前体细胞的转导
用上述慢病毒载体根据实施例5进行红系细胞的扩增和分化。在培养过程的步骤1期间转导红系前体细胞。将培养基中的红系细胞与慢病毒上清液和聚凝胺混合。通过旋转接种在室温下以2000rpm旋转平板90分钟来实现感染。旋转接种后，将细胞在37℃下温育过夜。
抗体结合
使用生物素化的抗gp100抗体(例如TB-M505-M，MBL International Corp.)的结合来验证gp100-H-2Db-GPA融合蛋白在工程化红系细胞中的表达。在细胞表面标记和流式细胞术/荧光激活细胞分选(FACS)中，用抗生物素蛋白缀合物检测生物素化抗体的结合。使用APC标记或PE标记的抗MHCI抗体(例如MHC I类(H-2Db)单克隆抗体(28-14-8)，PE，Thermofisher Scientific)的结合以验证MHCI抗原呈递肽在工程化红系细胞中的表达。使用APC标记或PE标记的抗4-1BBL抗体(R&D Systems)的结合来验证工程化红系细胞中4-1BBL的表达。通过针对APC荧光或PE荧光的流式细胞术测量抗体的结合。基于染色的未转导的细胞设置门控。
功能验证测定法
对经过基因工程化改造以共表达gp100-H-2Db-GPA融合蛋白和4-1BBL共刺激性多肽的红系细胞，测试其刺激原代CD8+ T细胞初始活化和增殖的能力。用工程化红系细胞刺激T细胞，并评估以下参数：(1)用aAPC刺激的T细胞的生长速率，通过标准的胸苷掺入测定法确定，得出大量培养物中合成的DNA总量；(2)诱导CD4+ T细胞的增殖和细胞分裂；(3)通过膜联蛋白V和碘化丙啶的荧光染色，在培养期间各种aAPC刺激的CD8+ T细胞的活力；(4)使用定量实时RT-PCR测定Bcl-xL和IL-2的表达，这两个基因分别涉及T细胞存活和增殖，以确定编码Bcl-xL和IL-2的稳态mRNA水平。
细胞因子产生
定量经工程化改造以共表达gp100-H-2Db-GPA融合物和共刺激性肽4-1BBL的红系细胞从CD8 T细胞诱导某些细胞因子的能力，例如IL-2(离体扩增的关键T细胞生长因子和细胞诱导IL-2的能力与其长期生长潜力密切相关)；IL-4(TH2分化的标志物)；和IL-10(免疫抑制性细胞因子，其可以替代T调节细胞的外生长)。其他细胞因子包括但不限于TGF-β(与IL-10相同的理由)；IFN-γ(TH1分化的标志物和重要的效应细胞因子)；和TNFα(重要的效应细胞因子)。可以使用ELISPOT(酶联免疫斑点)技术进行定量，该技术检测响应抗原性刺激而分泌给定细胞因子(例如，gamma干扰素[IFN-γ])的T细胞。在已经用抗IFN-γ抗体包被的孔中用抗原呈递细胞培养T细胞。由包被的抗体捕获分泌的IFN-γ，然后用与偶联至生色底物的第二抗体揭示。因此，局部分泌的细胞因子分子形成斑点，每个斑点对应于一个分泌IFN-γ的细胞。点的数量允许确定分析样品中特定抗原的IFN-γ分泌细胞的频率。还描述了ELISPOT测定法用于检测肿瘤坏死因子alpha、白介素4(IL-4)、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。
实施例9.经工程化改造以共表达gp100-H-2Db-GPA融合蛋白和共刺激性多肽的去核红系细胞在黑素瘤的B-16小鼠肿瘤模型中的活性
可以通过施用重组白介素2(rIL-2)成功治疗患有转移性黑素瘤患者的亚组，有时还可以与已经离体扩增的自体黑素瘤反应性淋巴细胞一起给予(Rosenberg,1997；Rosenberg,1999)。最近，许多不同的实验室已使用这些抗肿瘤淋巴细胞以克隆与黑素瘤相关的抗原，这些抗原通常是非突变的黑素细胞分化抗原(MDA)，该组包括gp100(Overwijkand Restifo,Curr Protoc Immunol.2001May；CHAPTER:Unit–20.1，其全部内容通过引用并入本文)。
皮下模型广泛用于许多肿瘤模型(包括B16黑素瘤)中的治疗评估。皮下注射后，B16将在5至10天之内形成明显的肿瘤，并在14至21天之内长成1×1×1–cm的肿瘤。当允许肿瘤长得更大时，肿瘤通常在中心坏死并开始溃疡或出血；建议在该点之前处死小鼠。使用的典型剂量是1×105个细胞/小鼠，其是正常C57BL/6小鼠中最小致瘤剂量的1.5至2倍。
使用B16黑素瘤小鼠模型作为模型来确定经工程化改造以共表达gp100-H-2Db-GPA融合物和共刺激性肽4-1BBL的去核红系细胞是否可以消除小鼠中的B16黑素瘤细胞。
B-16细胞制备和小鼠接种的方法描述于Overwijk和Restifo(Curr ProtocImmunol.2001May；CHAPTER:Unit–20.1，以其整体通过引用并入本文)中。当肿瘤变得明显时，开始用工程化红系细胞进行给药。将细胞配制在PBS或其他缓冲液中。
在实施方案中，与未修饰的对照细胞相比，施用工程化去核红系细胞将导致抑制肿瘤细胞植入或减小肿瘤大小中的一种或两种。
实施例10.经工程改造以呈递MHCI(卵清蛋白)和4-1BBL的红系细胞在体外激活ova特异性T细胞
使用点击方法将鼠红系细胞与呈递卵清蛋白肽的MHCI和4-1BBL缀合(用于功能红系细胞的点击化学描述于国际申请号PCT/US2018/000042，其要求2017年2月17日提交的美国临时申请号62/460589和2017年7月8日提交的美国临时申请号62/542142的优先权，以其整体通过引用并入本文)。简而言之，将小鼠外周血通过PAL去白细胞过滤器过滤，并在室温下在pH8 PBS中用0.04mM 6’叠氮基-NHS-酯标记30分钟。叠氮基标记的mRCT与40uM m4-1BBL-DBCO-Thiolinker在室温下温育1小时，并进一步在4C温育过夜。通过在室温下与1uM水溶性DBCO生物素温育1h，然后以1:1的生物素和中性亲和素的摩尔比与中性亲和素温育，用生物素点击mRCT-m4-1BBL。然后将与中性亲和素结合的细胞与生物素化的H-2KbSIINFEKL(SEQ ID NO:721)单体以1:1的生物素和单体的摩尔比在室温下温育1小时。
使用来自Miltenyi的阴性选择试剂盒从OT1转基因小鼠的次级淋巴样器官中纯化CD8+ T细胞，并用1uM CFSE标记。将2E5 CFSE标记的OT1 CD8+T细胞铺板到96孔板的每个孔中。将不同量(3E6、1E6、3.3E5或1.1E5个细胞)的mRCT、mRCT-4-1BBL、mRCT-MHC(ova)或mRCT-MHC(ova)+4-1BBL铺板到含有OT1 CD8+ T细胞的孔中的cRPMI培养基中并在37C下温育两天。收集培养上清液以通过细胞因子ELISA测量IL2和IFN-γ浓度。洗涤细胞并用抗CD8、活死染料和抗CD44染色以定量T细胞的扩增和激活。
如图2中所示，在细胞表面上呈递MHC I(卵清蛋白)和4-1BBL的鼠红系细胞，或呈递单独的MHC I(卵清蛋白)的鼠红系细胞(RCT-aAPC(ova))在体外有效激活ova特异性T细胞。这些结果证明了使用本文所述的工程化去核细胞有效和选择性地扩增和激活抗原特异性T细胞的能力。
在与以上呈现的研究相似的研究中，人红系细胞经转导以共表达ova和4-1BBL，而不是使用点击方法进行缀合。在这些实验中，来自健康人类供体的CD34+细胞以MOI 20用HA-GPA、GPA-m4-1BBL或b2ML-OVAH2Kb-GPA浓缩慢病毒进行扩增和转导。通过分别以MOI 20用GPA-m4-1BBL和b2ML-OVAH2Kb-GPA浓缩慢病毒进行双重(同时)转导来生成hRCT-MHC(ova)+4-1BBL。在成熟第9天收获hRCT，并通过PAL去白细胞过滤器进行过滤，以富集去核细胞。通过用抗m4-1BBL和抗SIINFEKL(SEQ ID NO:721)结合的H2Kb染色确定表达水平和拷贝数，并根据Bangs磁珠标准曲线进行校准。
使用来自Miltenyi的阴性选择试剂盒从OT1转基因小鼠的次级淋巴样器官中纯化CD8+ T细胞，并用1uM CFSE标记。将3E5 CFSE标记的OT1 CD8+T细胞铺板到96孔板的每个孔中。将不同量(3E6、6E5、3E5或1.5E5个细胞)的hRCT-HA-GPA、hRCT-m4-1BBL、hRCT-MHC(ova)或hRCT-MHC(ova)+4-1BBL铺板到含有OT1 CD8+ T细胞的孔中。调整每个孔中的hRCT-m4-1BBL和hRCT-MHC(ova)细胞数，以使m4-1BBL和MHC(ova)的分子数与相应hRCT-MHC(ova)+m4-1BBL的孔中的总分子数匹配。将hRCT和OT1细胞在37C下温育3天。收集培养上清液以通过细胞因子ELISA测量IL2和IFN-γ浓度。洗涤细胞，并用抗CD8、活死染料和抗CD44染色以定量T细胞的扩增和激活。这项研究的结果表明，经转导以共表达ova和m4-1BBL的人红系细胞在体外有效激活ova特异性T细胞，显示出高CD44表达，类似于使用点击技术构建的mRCT获得的结果(如上所述并在图2中呈现)。
实施例11.通过呈递MHCI(卵清蛋白)和4-1BBL的红系细胞扩增和激活的卵清蛋白特异性T细胞在体外选择性杀伤表达卵清蛋白的肿瘤细胞
使用点击方法将鼠红系细胞与呈递卵清蛋白肽的MHCI和4-1BBL缀合(用于功能红系细胞的点击化学描述于2017年2月17日提交的美国临时申请号62/460589和2017年7月8日提交的美国临时申请号62/542142的优先权，以其整体通过引用并入本文)。简而言之，将小鼠外周血通过PAL去白细胞过滤器过滤，并在室温下在pH8 PBS中用0.04mM 6’叠氮基-NHS-酯标记30分钟。叠氮基标记的mRCT与40uM m4-1BBL-DBCO-Thiolinker在室温下温育1小时，并进一步在4C温育过夜。通过在室温下与1uM水溶性DBCO生物素温育1h，然后以1:1的生物素和中性亲和素的摩尔比与中性亲和素温育，用生物素点击mRCT-m4-1BBL。然后将与中性亲和素结合的细胞与生物素化的H-2Kb SIINFEKL(SEQ ID NO:721)单体以1:1的生物素和单体的摩尔比在室温下温育1小时。
使用来自Miltenyi的阴性选择试剂盒从OT1转基因小鼠的次级淋巴样器官中纯化CD8+ T细胞，并用1uM CFSE标记。将1.2E6 CFSE标记的OT1 CD8+ T细胞与1.2E7 aAPC(mRCT-4-1BBL H2Kb OVA)在24孔板的每个孔中培养。温育三天后收获OT1细胞，并用ACK缓冲液处理以裂解mRCT。为了测试OT1细胞在肿瘤细胞上的活性，然后将1E4细胞微量远红色标记的肿瘤细胞(亲本肿瘤细胞EL4或表达卵清蛋白的肿瘤细胞EG7.OVA(每个靶细胞))铺板到96孔U底板的每个孔中。将OT1细胞(效应细胞)以10:1、5:1、2:1、1:1或0:1效应子与靶标(E:T)的比率的比例添加到孔中。温育22小时后，将细胞用活死染料染色，并用2％多聚甲醛固定，以计数每个孔中的活靶细胞。
该实验的结果示于图3中。令人惊讶的是，观察到通过呈递MHC I(卵清蛋白)和4-1BBL的鼠红系细胞扩增并激活的卵清蛋白特异性T细胞(OT1-T细胞)选择性地杀伤表达卵清蛋白的肿瘤细胞或EG7.OVA细胞，而不表达卵清蛋白的亲本细胞(EL4细胞)未受到攻击和杀伤。显著扩增并激活特定的肿瘤特异性T细胞群体以在体内杀伤肿瘤的能力与CAR T方法相似，所述CAR T方法在患者中施用可以扩增(有时不受控)的肿瘤特异性T细胞群体。本发明的显著优点是，通过控制本文所述的工程化去核细胞的剂量，可以更有效地控制肿瘤特异性T细胞的扩增以及最终疗法的安全性和有效性。
实施例12.经工程化改造以呈递MHCI(卵清蛋白)和4-1BBL的红系细胞体内激活运输到淋巴结的ova特异性T细胞
使用点击方法将鼠红系细胞与呈递卵白蛋白肽的MHCI和4-1BBL缀合(用于功能化红系细胞的点击化学方法记载于2017年2月17日提交的美国临时申请号62/460589和2017年7月8日提交的美国临时申请号62/542142，在此通过引用将其全部内容并入)。简而言之，将小鼠外周血通过PAL去白细胞滤器过滤，并在室温下在pH8 PBS中用0.04mM 6'叠氮基-NHS-酯标记30分钟。叠氮基标记的mRCT与40uM m4-1BBL-DBCO-硫接头在室温下温育1h，然后在4C再温育过夜。通过在室温下与1uM水溶性DBCO生物素温育1h，然后以生物素和中性亲和素的摩尔比为1：1与中性亲和素温育，将mRCT-m4-1BBL用生物素进行点击。然后将与中性亲和素结合的细胞与生物素化的H-2Kb SIINFEKL(SEQ ID NO:721)单体以1：1的生物素和单体摩尔比在室温下温育1小时。
使用来自Miltenyi的阴性选择试剂盒从RAG2-/-OT1转基因小鼠的次级淋巴样器官中纯化CD8+ T细胞，并用荧光染料(10uM CFSE)标记。在第-1天将1.8E6 OT1细胞静脉内注射到C57BL/6小鼠中。在第0天，给小鼠静脉内注射1E8 aAPC(mRCT-4-1BBL或mRCT-4-1BBLH2Kb OVA)。在第4天，处死小鼠，并将其脾脏和淋巴结的单细胞悬液用NIR Zombie，APC41BB，太平洋蓝CD44，BV650 CD8和BV785 CD62L染色，并通过流式细胞术进行分析。通过追踪在淋巴结或脾脏中荧光染料信号稀释来监测OT1 T细胞的增殖。图4A示出了描述实验设计的示意图。实验结果显示在图4B和4C中，其中图4B是代表性数据的示意图，显示mRCT-4-1BBL OVA特异性扩增和激活OT1-T细胞，而在细胞表面上没有呈递卵清蛋白的MHCI的mRCT-4-1BBL不扩增并激活OT1-T细胞。
如图4C所示，该小鼠体内实验的结果证明了，mRCT-4-1BBL H2Kb OVA特异性地扩增和激活OTI T细胞，如CD44表达增加所证明的。此外，发现大多数被激活的OT1-T细胞表现出中央记忆表型，其已被发现是驱动基于T细胞疗法的有效性的关键群体。结果进一步显示了，这些OTI T细胞运输到淋巴结，在那里预期它们进行进一步的扩增和激活，从而支持它们在体内有效动员的潜力，并运输到肿瘤以支持强大的抗肿瘤应答。相反，在细胞表面上没有呈递卵清蛋白肽的MHCI的mRCT 4 1BBL不扩增或激活OTI T细胞，从而表明mRCT aAPC在体内模拟抗原呈递细胞的功能。
实施例13.经基因工程改造以共表达gp350-HLA-A2-GPA融合蛋白和共刺激性多肽的红系细胞的产生和体外验证
结果
转导红系细胞以表达融合蛋白，该融合蛋白包含(HLA)-A2限制性的来自埃巴病毒编码的糖蛋白350(gp350)的免疫原性肽，其与外源抗原呈递多肽MHCI HLA-A2融合，所述外源抗原呈递多肽与GPA跨膜结构域350(gp350)(gp350-HLA-A2-GPA)融合。使用的示例性的gp350免疫原性肽是VLQWASLAV(SEQ ID NO:698)。还转导了红系细胞以另外表达外源共刺激性肽4-1BBL。如下文“方法”部分所述进行细胞培养和转导，以产生表达由MHCI在表面上表达的gp350的红系细胞，并锚定有GPA跨膜结构域。
APC标记或PE标记的抗gp350或抗4-1-BBL抗体与外源肽gp350和4-1BBL的结合可用于验证工程化红系细胞中各个肽的表达。APC标记或PE标记的抗MHCI抗体的结合可用于验证MHCI抗原呈递肽在工程化红系细胞中的表达。
对工程化红系细胞(gp350-HLA-A2-GPA，4-1BBL)效果的功能活性评估其刺激原代CD8+ T细胞的初始活化和增殖的能力。
方法
慢病毒载体的生产
构建了gp350-HLA-A2-GPA融合蛋白和4-1BBL的基因。将编码蛋白的基因克隆到来自System Biosciences的具有MSCV启动子序列的慢病毒载体pCDH的多克隆位点，使得一个载体包含两种外源蛋白的基因。通过用pPACKH1(System Biosciences)和含有gp350-HLA-A2-GPA和4-1BBL基因的pCDH慢病毒载体转染293T细胞生产慢病毒。将细胞置于新鲜的培养培养基中。培养基更换后48小时，通过以1,500rpm离心5分钟来收集病毒上清液。收集上清液并在-80℃将等分试样冷冻。
红细胞前体细胞的转导
根据实施例5，进行红系细胞的扩增和分化，并且用上述慢病毒载体转导。在培养过程的步骤1期间转导红系细胞前体细胞。将培养基中的红系细胞与慢病毒上清液和聚凝胺混合。通过旋转接种在室温下以2000rpm旋转平板90分钟来实现感染。旋转接种后，将细胞在37℃下温育过夜。
抗体结合
使用APC标记的或PE标记的的抗gp350抗体的结合来验证gp350-HLA-A2-GPA融合物在工程红系细胞中的表达。通过APC荧光或PE荧光的流式细胞术测量抗体的结合。对染色的未转导的细胞设置门。APC标记或PE标记的抗MHCI抗体的结合可用于验证工程化红系细胞中MHCI抗原呈递肽的表达，如实施例5中所述。APC标记或PE标记的抗4-1BBL抗体(R&DSystems)的结合可用于验证4-1BBL在工程化红系细胞中的表达。通过APC荧光或PE荧光的流式细胞术测量任一种抗体的结合。基于染色的未转导细胞设置门。
功能验证分析
对经过基因工程化改造以共表达gp350-HLA-A2-GPA融合蛋白和4-1BBL共刺激性多肽的红系细胞，测试其刺激原代CD8+ T细胞初始活化和增殖的能力。用工程化红系细胞刺激T细胞，并评估以下参数：(1)用aAPC刺激的T细胞的生长速率，通过标准的胸苷掺入测定法确定，得出散装培养物中合成的DNA总量；(2)诱导CD4+ T细胞的增殖和细胞分裂；(3)通过膜联蛋白V和碘化丙啶的荧光染色，在培养期间各种aAPC刺激的CD8+ T细胞的活力；(4)使用定量实时RT-PCR测定Bcl-xL和IL-2的表达，这两个基因分别涉及T细胞存活和增殖，以确定编码Bcl-xL和IL-2的稳态mRNA水平。
细胞因子产生
细胞因子是重要的效应分子，并提供有关T细胞分化的见解。定量经工程化改造以共表达gp350-HLA-A2-GPA融合物和共刺激性肽4-1BBL的红系细胞从CD8 T细胞诱导某些细胞因子的能力，例如IL-2(离体扩增的关键T细胞生长因子和细胞诱导IL-2的能力与其长期生长潜力密切相关)；IL-4(TH2分化的标志物)；和IL-10(免疫抑制性细胞因子，其可以替代T调节细胞的外生长)。其他细胞因子包括但不限于TGF-β(与IL-10相同的理由)；IFN-γ(TH1分化的标志物和重要的效应细胞因子)；和TNFα(重要的效应细胞因子)。可以使用ELISPOT(酶联免疫斑点)技术进行定量，该技术检测响应抗原性刺激而分泌给定细胞因子(例如，gamma干扰素[IFN-γ])的T细胞。在已经用抗IFN-γ抗体包被的孔中用抗原呈递细胞培养T细胞。由包被的抗体捕获分泌的IFN-γ，然后用与偶联至生色底物的第二抗体揭示。因此，局部分泌的细胞因子分子形成斑点，每个斑点对应于一个分泌IFN-γ的细胞。点的数量允许确定分析样品中特定抗原的IFN-γ分泌细胞的频率。还描述了ELISPOT测定法用于检测肿瘤坏死因子alpha、白介素4(IL-4)、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。
实施例14.在小鼠EBV模型中体内经工程化改造以共表达EBV-HLA-A2-GPA融合蛋白和共刺激性多肽的去核红系细胞的活性
几种EBV肽已经显示是人类白血病抗原。此外，几种小鼠系统已经用作EBV感染和相关疾病的疾病模型。NOD/NSG EBV异种移植小鼠模型可用于测试RTX-aAPC的EBV相关MS(如Fujiwara et al.,2013,Pathogens,Mar14；2(1):153-76最初所述，其全部内容通过引用并入本文)以测试系统抑制EBV激活的自身反应性B细胞的能力。使用NOD/LtSz-scid IL-2rg-/-(NSG)建立NOD/NSG EBV异种移植模型。在移植当天，将2-5天的小鼠接受100cGy辐照，并从胎肝或脐带血中分离出的人CD34+细胞进行肝内移植。EBV腹膜内接种。然后，给小鼠施用具有呈现EBV肽的I类MHC或II类MHC分子以及共刺激分子(即4-1BBL)的aAPC。aAPC是用载有EBV肽的MHC分子和共刺激分子点击的小鼠RBC，或者是经过工程改造以表达EBV肽-MHC I类-GPA融合蛋白和共刺激分子的人去核红系细胞(例如如实施例13所述的aAPC。预期这些aAPC激活对EBV肽具有特异性的CD8或CD4 T细胞，进而通过I类或II类MHC杀死呈递EBV肽的细胞。这可包括耗尽已成为淋巴增生性的B细胞。转移后4-10周将动物处死，并使用IFN-γELISPOT测定法对EBV特异性T细胞反应进行分析，如先前所述(J Exp Med.2009Jun8；206(6):1423-34，通过引用将其内容并入本文)。在施用aAPC之后，还对T细胞的活化标志物进行染色，所述活化标记包括例如CD62L，CD44和/或41BB，以评估在施用或不施用aAPC的小鼠之间的表型。
实施例15.经工程化改造以呈递MHCI(卵清蛋白)和4-1BBL的红系细胞在体内表现出体内剂量应答的ova特异性T细胞
使用点击方法将鼠红系细胞与呈递卵白蛋白肽的MHCI和4-1BBL缀合(在国际申请号PCT/US2018/000042中描述了用于功能化红系细胞的点击化学方法，该申请要求2017年2月17日提交的美国临时申请号62/460589和2017年7月8日提交的美国临时申请号62/542142的优先权，在此通过引用将其全部内容并入)。简而言之，将小鼠外周血通过PAL去白细胞滤器过滤，并在室温下在pH8 PBS中用0.04mM 6'叠氮基-NHS-酯标记30分钟。叠氮基标记的mRCT与40uM m4-1BBL-DBCO-硫接头和H-2Kb SIINFEKL-DBCO-硫接头(SEQ ID NO:721)单体在室温下温育1h，然后在4C再温育过夜。
使用来自Miltenyi的阴性选择试剂盒从OT1转基因小鼠的次级淋巴样器官中纯化CD8+ T细胞，并用荧光染料(10uM CFSE)标记。在第0天将2E6 OT1细胞静脉内注射到C57BL/6小鼠中。在OT1注射后的第0、4天，向小鼠静脉内注射1E6、1E7或1E8 aAPC(mRCT-4-1BBLH2Kb OVA)。在第4天，处死小鼠，并用PE cy7 CD44，APC CD122，ad BV650 CD27将其脾脏和淋巴结的单细胞悬液染色，并通过流式细胞术进行分析。通过追踪在淋巴结或脾脏中荧光染料信号的稀释来监测OT1 T细胞的活化和增殖。
如图5所示，呈现MHC I(卵清蛋白)(mRCT-aAPC(ova)4-1BBL)的鼠红系细胞在体内以剂量依赖性方式有效诱导ova特异性T细胞的活化和增殖，如增加的CFSE荧光强度(图5A)和CD44表达(图5B)所证明。结果还显示，被激活的OT1 T细胞表现出记忆表型，如体内关键记忆标志物CD122和CD27的上调所证明的(图5C和5D)。这些结果证明了使用如本文所述的工程化去核细胞有力且选择性地扩增和激活抗原特异性T细胞的能力。
实施例16.第二剂的工程化改造以呈递MHCI(卵清蛋白)和4-1BBL的红系细胞显著增强淋巴结和脾脏两者中的CD8+OT1 T细胞。
如实施例15中所述产生鼠红系细胞。如实施例15中所述，从OT1转基因小鼠的次级淋巴样器官中纯化CD8+ T细胞。简而言之，在第0天和第3天给小鼠静脉内注射1E9 aAPC(mRCT-4-1BBL或mRCT-4-1BBL H2Kb OVA)。在第6天，处死小鼠，并将其脾和淋巴结的单细胞悬液用NIR Zombie，FITC CD44，BV650 CD8和BV785 CD62L染色，并通过流式细胞术进行分析。
通过追踪在淋巴结或脾脏中荧光染料信号稀释来监测OT1 T细胞的增殖。将在PBS中稀释的SIINFEKL肽(SEQ ID NO:721)(10μg)和佐剂LPS(50ng)作为阳性对照施用以诱导OT-1T细胞的增殖。实验结果示于图6中，其显示了相对于第3天的第二剂量的LPS和肽，在第3天第二剂的mRCT-4-1BBL OVA显著增加了OT1-T细胞的细胞计数。此时，施用第二剂aAPC驱动在外周血和次级淋巴样器官中具有记忆样表型的OT1细胞的>200倍扩增。相反，在第7天第二剂量的mRCT-4-1BBL OVA没有显著增加OT1-T细胞的细胞计数(数据未显示)。观察到，在最初施用RCT后的3-4天期间，T细胞计数处于峰值。因此，尽管不希望受到理论的束缚，但认为在最初的OT-1T细胞计数的高峰期(第3至4天之间)施用第二剂将最有效诱导T细胞计数的显著变化。
实施例17.工程化改造以呈递MHCI(gp100)和4-1BBL的红系细胞在体外激活gp100特异性T细胞
使用点击方法将鼠红系细胞与呈现肿瘤肽gp100的MHCI和4-1BBL缀合(在国际申请号PCT/US2018/000042中描述了用于功能化红系细胞的点击化学方法，该申请要求2017年2月17日提交的美国临时申请号62/460589和2017年7月8日提交的美国临时申请号62/542142的优先权，在此通过引用将其全部内容并入)。简而言之，将小鼠外周血通过PAL去白细胞滤器过滤，并在室温下在pH8 PBS中用0.04mM 6’叠氮基-NHS-酯标记30分钟。叠氮基标记的mRCT与40uM m4-1BBL-DBCO-硫醚在室温下温育1小时，然后在4C再温育过夜。通过在室温下与1uM水溶性DBCO生物素温育1h，然后以生物素和中性亲和素(neutravidin)的摩尔比为1:1与中性亲和素温育，将mRCT-m4-1BBL用生物素进行点击。然后将与中性亲和素结合的细胞与生物素化的H-2Db gp100(KVPRNQDWL(SEQ ID NO:722))单体以1:1的生物素和单体摩尔比在室温下温育1小时。
使用来自Miltenyi的阴性选择试剂盒从次级淋巴样器官小鼠中纯化Pmel-1细胞(针对gp100的转基因CD8+ T细胞群体)，并用1uM CFSE标记。将2E5 CFSE标记的原代CD8+ T细胞分配到96孔板的每个孔中。将不同量的(3E6、1E6、3.3E5或1.1E5细胞)mRCT、mRCT-4-1BBL、mRCT-gp100-H2Db或mRCT-gp100-H2Db+4-1BBL在cRPMI培养基中以mRCT:T细胞比率为10：1、3.3：1、1.1：1和0.37：1分配到含CD8+ T细胞的孔中(图7中从左到右)，并在37℃下温育两天。洗涤细胞，并用抗CD8、活死染料染色以定量T细胞的扩增和活化。
如图7所示，相对于仅呈现MHC I(gp100)的鼠红系细胞，在细胞表面上呈现MHC I(gp100)和4-1BBL的鼠红系细胞在体外有力激活gp100特异性T细胞。这些结果证明，使用如本文所述的工程化去核细胞，与OVA特异性T细胞相比有力且选择性地扩增另一种类型的抗原特异性T细胞的能力。
实施例18.在RCT上表达的不同形式的HLA-A2(HPV E7)的产生。
使用三种不同形式的HLA-A2的DNA构建体(HLA-A2野生型、HLA-A2Y84A和HLA-A2Y84C+L2C)表达HPV P1(HPV16 E7 11-20)(如图8A中描述)并且还表达HPV P1-2(HPV16 E711-19)。这些构建体的序列描述如下。参见，例如，Hansen et al.,2010,TrendsImmunol.31(10):363–369.
HLA-A2v1(野生型):
MSRSVALAVLALLSLSGLEAYMLDLQPETTGGGGSGGGGSGGGGSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQPTIPIGSGSGSGSEDGSGSGSGSLSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ*(SEQ ID NO:723)
HLA-A2v2(Y84A):
MSRSVALAVLALLSLSGLEAYMLDLQPETTGGGGSGGGGSGGGGSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGAYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQPTIPIGSGSGSGSEDGSGSGSGSLSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ*(SEQ ID NO:724)
HLA-A2v3(Y84C和L2C):
MSRSVALAVLALLSLSGLEAYMLDLQPETTGCGGSGGGGSGGGGSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQPTIPIGSGSGSGSEDGSGSGSGSLSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ
HLA-A2的这3种形式用于表达单链变体HPV P1-2-HLA-A2-GPA：
MSRSVALAVLALLSLSGLEAYMLDLQPETGGGGSGGGGSGGGGSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQPTIPIGSGSGSGSEDGSGSGSGSLSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ(SEQID NO:726)
慢病毒载体的生产
构建了HPV P1-HLA-A2-GPA融合蛋白和4-1BBL的基因。将编码蛋白质的基因克隆到具有System Biosciences的MSCV启动子序列的慢病毒载体pCDH的多克隆位点中，使得一个载体包含这两种外源蛋白质的基因。通过用pPACKH1(System Biosciences)和含有HPVP1-HLA-A2-GPA和4-1BBL的基因的pCDH慢病毒载体转染细胞在293T细胞中产生慢病毒。可以使用含有HPV P1-HLA-A2-GPA和4-1BBL基因的备选不同载体。将细胞置于新鲜的培养基中。培养基更换后48小时，通过以1,500rpm离心5分钟来收集病毒上清液。收集上清液，并将等分试样冷冻于-80℃。
红系前体细胞的转导
根据实施例5，用上述慢病毒载体进行红系细胞的扩增和分化。在培养过程的步骤1过程中转导红系细胞前体细胞。将培养基中的红系细胞与慢病毒上清液和聚凝胺(polybrene)混合。在室温下以2000rpm旋转平板90分钟，通过旋转接种(spinoculation)实现感染。旋转接种后，将细胞在37℃下温育过夜
抗体结合
如实施例5中所述，使用APC标记的或PE标记的抗β2微球蛋白抗体的结合来验证HPV P1-HLA-A2-GPA融合物在工程化的红系细胞中的表达。使用APC标记的或PE标记的抗MHCI抗体来验证MHCI抗原呈递多肽在工程化的红系细胞中的表达，也如实施例5中所述。使用APC标记或PE标记的抗4-1BBL抗体(R&D Systems)的结合来验证4-1BBL在工程红系细胞中的表达。通过APC荧光或PE荧光的流式细胞术测量任何一种抗体的结合。基于染色的未转导的细胞设置门。
实施例19：在RCT上表达的HLA-A2(HPV E7)在体外刺激HPV特异性T细胞中的活性
基本上如实施例18中所述制备表达4-1BBL、HLA-A2 HPV P1或4-1BBL和HLA-A2HPV P1两者的人RCT。对这些共表达HPV P1-HLA-A2-GPA融合蛋白和4-1BBL共刺激性多肽的RCT测试刺激原代CD8+ T细胞的初始活化和增殖的能力，基本上如实施例6中所述。将用CMV或HPV肽脉冲的T2细胞用作阳性对照。
原代人CD8+细胞购自Astarte Biologics。将不同量的人RCT以10：1、2：1和0.4：1的RCT：T细胞比率在cRPMI培养基中分配到含有4E4或2E4 CD8+ T细胞的孔中(左至右，对于每个RCT，在图8B和8C中)并在37℃温育两天。
使用细胞内染色测量Nur77和IFN-γ的细胞水平。简而言之，将细胞用200μL的IC固定缓冲液固定，并在黑暗中于室温温育20-60分钟。将样品在室温下以400-600x g离心5分钟。弃去上清液，并且加入200μL透化缓冲液。将样品在室温下以400-600x g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀用1X透化缓冲液重悬于约100μL中。无需洗涤，直接加入缀合的抗体(抗Nur77 PE和抗IFN-γAPC)，然后在黑暗中于室温温育至少30分钟。在将RCT与原代CD8+ T细胞温育后的2、6和24小时，分析Nur77和IFN-γ。
流式细胞术分析表明，所有测试形式的HLA-A2(HPV E7)在人RCT的表面上均表达良好(数据未显示)。此外，如通过Nur77表达(图8B)和IFNγ分泌(图8C)所确定的，所有三种形式均导致HPV E7特异性T细胞的活化。这些结果证明了使用如本文所述的工程化去核细胞有力且选择性地激活抗原特异性T细胞，例如HPV特异性T细胞的能力。
实施例20.由呈递MHCI(卵清蛋白)和4-1BBL的红系细胞扩增和激活的卵清蛋白特异性T细胞减少了肿瘤体积
如实施例15中所述，使用点击方法，将鼠红系细胞与呈递卵白蛋白肽的MHCI和4-1BBL缀合。简而言之，将小鼠外周血通过PAL去白细胞滤器过滤并。在室温下在pH8 PBS中用0.04mM 6’叠氮基-NHS-酯标记30分钟。将叠氮基标记的mRCT在室温下与40μMm4-1BBL-DBCO-硫接头(Thiolinker)和40μMH-2Kb SIINFEKL-DBCO-硫接头单体(SEQ ID NO:721)温育1h，然后在4℃温育过夜。
使用来自Miltenyi的阴性选择试剂盒从OT1转基因小鼠的次级淋巴样器官中纯化CD8+ T细胞，并用10uM Cell-Trace Violet标记。
在给药前7天，将2个106个表达卵清蛋白(EG7.OVA)的肿瘤细胞皮下注射(s.c.)到B6 Cd45.1小鼠中。实验组小鼠(每组7只)如下：
(1)OT1剂量：2x 106OT1(i.v.)；细胞剂量：1x 109鼠RCT(mRCT)(i.v.)；
(2)OT1剂量：2x 106OT1(i.v.)；细胞剂量：1x 109鼠RCT，其呈递MHCI(卵清蛋白)和4-1BBL(mRCT-OVA-4-1BBL)(i.v.)。
根据肿瘤体积确定用OT1和mRCT给药的第一天。在第0天，将肿瘤按照60-193mm3的肿瘤体积随机化，平均体积为141mm3。通过静脉内注射入野生型小鼠中(第1天)以上述组(1)和(2)中设定的剂量进行OT1的过继T细胞转移。然后在第1、4和8天，按照上述组(1)和(2)中设定给小鼠给药1x 109mRCT或mRCT-OVA-41-BBL。如通过CTV稀释测量，在给药后3-4天观察到显著的OT1增殖。在第一剂后4天给予第二剂，对应于最大OT1细胞扩增的时间。在第1-14天测量肿瘤体积，一旦肿瘤体积大于2000mm3，对小鼠实施安乐死。
该实验的结果示于图9-11中。图9显示了肿瘤随机化后平均肿瘤体积(mm3)随时间的变化，其中在第1、4和8天进行给药。图10显示了肿瘤随机化后随时间的个别肿瘤体积(mm3)，其中在第1、4和8天进行给药。图9和图10的结果显示mRCT-OVA-4-1BBL能够以2x106的剂量激活肿瘤特异性T细胞(OT1)，如与mRCT相比，随着时间的推移，EG7.OVA肿瘤体积的减少所显示。与对照相比，在给药后第7天，向携带EG7.OVA肿瘤的小鼠施用aAPC mRCT-OVA-4-1BBL引起了60％的肿瘤生长抑制，这对应于OT1s的扩增增加(图9)。图11是显示小鼠随时间存活百分比的图。如图11中显示，7只接受mRCT-OVA-4-1BBL给药的小鼠中的7只在随机化后存活到第14天，而7只接受mRCT给药的小鼠中只有4只在随机化后存活到第14天。此外，在一个单独的类似实验中，观察到所有用aAPC给药的小鼠均表现出OT1浸润到EG7.OVA肿瘤中增加，其中一些肿瘤另外表明内源性OVA特异性T细胞浸润(数据未显示)。
大致如上所述，重复该实验，只是以5x105 OT1(i.v.)的剂量进行OT1的过继T细胞转移，并且在一组用mRCT-OVA-4-1BBL给药的小鼠外，包括以下另外的对照组(每组12只小鼠)：磷酸盐缓冲盐水(PBS)，SIINFEKL肽(SEQ ID NO:721)和脂多糖(LPS)，mRCT-OVA和mRCT-4-1BBL。在该实验中，在第-9天将2x 106个表达卵清蛋白(EG7.OVA)的肿瘤细胞皮下(s.c.)注射到野生型小鼠中，当肿瘤体积在52-130mm3之间并且平均为97mm3时在第0天进行肿瘤随机化，在第1天进行OT1给药，并且第1、5和9天进行mRCT给药。
这些实验的结果(数据未显示)证明了与第一个实验类似，mRCT-OVA-4-1BBL激活肿瘤特异性T细胞(OT1)，如相比于对照mRCT，PBS和肽+LPS，EG7.OVA肿瘤体积随时间的推移而减少证明的。在这些对照之间未观察到显著差异。此外，与对照mRCT相比，mRCT-OVA和mRCT-4-1BBL未观察到肿瘤体积减小。这些结果指示在mRCT上OVA和4-1BBL的组合对于观察到的肿瘤控制是必要的。
实施例21.呈递MHCI(卵清蛋白)，4-1BBL和IL-15(OVA-H2Kb+4-1BBL+IL15)的红系细胞的产生
使用点击方法的修改，将鼠红系细胞与呈递卵白蛋白肽(OVA-H2Kb)MHCI，4-1BBL和IL-15的每种缀合(在国际申请号PCT/US2018/000042中描述了用于功能化红系细胞的点击化学方法，该申请要求2017年2月17日提交的美国临时申请号62/460589和2017年7月8日提交的美国临时申请号62/542142的优先权，在此通过引用将其全部内容并入)。在这里，使用两个不同的手柄，二苯并环辛炔基团(dibenzocyclooctyne，DBCO)和反式环辛烯(trans-cyclooctene,TCO)实现将三种肽缀合到鼠红系细胞上。用以下试剂产生三重点击细胞：Fc-hIL15TP(TCO标记)；Fc-hIL-15TP(DBCO标记)；m4-1BBL(DBCO硫接头)和OVA-H2Kb(DBCO硫接头)。简而言之，反应如下进行：
OVA-4-1BBL-IL15(MTZ-TCO)
将小鼠外周血通过PAL去白细胞滤器过滤，并在室温下在pH8 PBS中用0.04mM 6’叠氮基-NHS-酯和0.04mM甲基四嗪-PEG-NHS-酯(MTZ)标记1x 108mRCT。加入5ul 20μMFc-hIL-15TP(TCO标记)和5ul 50μM OVA-H2Kb-DBCO-硫接头，并在室温下温育1小时。将5ul 50μM m4-1BBL-DBCO-硫接头加入到细胞中，并将混合物在4℃下温育过夜。
OVA-4-1BBL-IL15(AZ-DBCO)
将小鼠外周血通过PAL去白细胞滤器过滤，并在室温下在pH8 PBS中用0.04mM 6’叠氮基-NHS-酯将1x 108mRCT标记30分钟。将叠氮基标记的mRCT与5ul 20μM Fc-hIL-15TP-DBCO和5ul 50μM OVA-H2Kb-DBCO-硫接头在室温下温育1小时。将5ul 50μM的m4-1BBL-DBCO-硫接头加入到细胞中，并将混合物在4℃下温育过夜。
OVA-4-1BBL
将小鼠外周血通过PAL去白细胞滤器过滤，并在室温下在pH8 PBS中用0.04mM 6’叠氮基-NHS-酯将1x 108mRCT标记30分钟。叠氮基标记的mRCT与5ul 50μM m4-1BBL-DBCO-硫接头和5ul 50μM OVA-H2Kb-DBCO-硫接头一起温育，并将混合物在4℃温育过夜。
确定了用OVA-4-1BBL-IL15(MTZ-TCO)或OVA-4-1BBL-IL15(AZ-DBCO)三重点击的mRCT和用OVA-4-1BBL双重点击的mRCT的IL15，OVA和4-1BBL的拷贝数。尽管OVA和4-1BBL中每种的拷贝数在三组之间相似，但用OVA-4-1BBL-IL15(AZ-DBCO)三重点击的mRCT相比，用OVA-4-1BBL-IL15(MTZ-TCO)三重点击的mRCT显示相当高的IL15拷贝数(参阅下表27)。
表27.拷贝数
Figure BDA0002631423640003701
尽管不希望受到理论的束缚，但认为使用备选点击柄(MTZ-TCO)进行三重点击的mRCT绕过了与DBCO的潜在竞争，从而实现更高的IL-15拷贝数。
实施例22：呈递MHCI(卵清蛋白)，4-1BBL和IL-15(OVA-H2Kb+4-1BBL+IL15)的红系细胞比呈递MHCI(卵清蛋白)和4-1BBL(OVA-H2Kb+4-1BBL)的细胞显示增加的OT1 CD8+ T细胞增殖
如实施例20中所述制备鼠RCT。使用来自Miltenyi的阴性选择试剂盒从OT1转基因小鼠的脾中纯化CD8+ T细胞，并用10uM CFSE标记。将2E5 CFSE标记的OT1 CD8+ T细胞分配到96孔板的每个孔中。未点击的mRCT，三重点击的mRCT(OVA-4-1BBL-IL15(MTZ-TCO)和OVA-4-1BBL-IL15(AZ-DBCO))或双重点击的mRCT(OVA-4-1BBL和OVA-4-1BBL+可溶性IL-15(20ng/ml)和OT1 CD8+ T细胞以25：1、10：1和4：1(mRCT：OT1)的比例共温育并在37℃和5％CO2温育4天。在第4天，将细胞用Pacific blue CD44和BV785 CD62L染色并通过流式细胞术进行分析，将CD44用作CD8+ T细胞增殖的标志物。该实验的结果在图12中显示。与mRCT-OVA-4-1BBL(双重点击)相比，用OVA-4-1BBL-IL15(MTZ-TCO)三重点击的mRCT到第4天驱动OT1 CD8+ T细胞增殖的增加，并且用OVA-4-1BBL-IL15(MTZ-TCO)三重点击的mRCT到第4天驱动与mRCT OVA-4-1BBL(双重点击)与可溶性IL15的组合相似的OT1 CD8+ T细胞增殖。如图12所示，从左数第二个图，用备用点击柄(MTZ-D BCO)三重点击的mRCT到第4天也驱动OT1CD8+ T细胞的增殖。
还确定在第4天的OT1 CD8+ T细胞增殖。如图13显示的结果证明了用OVA-4-1BBL-IL15(MTZ-TCO)三重点击的mRCT刺激OT1 CD8+ T细胞大量增殖，并达到与mRCT OVA-4-1BBL(双重点击)和可溶性IL-15的组合达到的相似水平。此外，与使用DBCO柄，OVA-H2Kb+4-1BBL(AZ-DBCO)三重点击的mRCT相比，用OVA+4-1BBL+IL15(MTZ-TCO)三重点击的mRCT将OT1 CD8+ T细胞的增殖提高到更高的水平。如上表27所示，与使用OVA-4-1BBL-IL15(AZ-DBCO)三重点击的mRCT相比，用OVA-4-1BBL-IL15(MTZ-TCO)三重点击的mRCT显示出更高的IL15拷贝数，这指示了这里，观察到的OT1 CD8+ T细胞增殖增加至少部分是由于IL15拷贝数增加。此外，确定了OT1 CD8+ T细胞群体中效应T细胞和记忆T细胞的百分比。发现在双重点击的mRCT和三重点击mRCT组之间，作为效应或记忆T细胞的CD8+ T细胞的百分比没有显著差异(数据未显示)。
总之，该实验的结果显示，RBC上信号1、2和3的组合，尤其是OVA，4-1BBL和IL-15的组合，比单独的信号1和2，即OVA和4-1BBL促进更大的CD8+ T细胞增殖。
实施例23.产生呈递MHCI(卵清蛋白)，4-1BBL和IL-12(OVA-H2Kb+4-1BBL+IL12)的红系细胞
使用点击方法的修改，将鼠红系细胞与呈递卵清蛋白肽(OVA-H2Kb)的MHCI，4-1BBL和IL-12的每种缀合(在国际申请号PCT/US2018/000042中描述了用于功能化红系细胞的点击化学方法，该申请要求2017年2月17日提交的美国临时申请号62/460589和2017年7月8日提交的美国临时申请号62/542142的优先权，在此通过引用将其全部内容并入)。用以下试剂产生三重点击细胞：Fc-mIL12Fc(TCO-PEG4-NHS酯标记)；m4-1BBL(DBCO硫接头)和OVA-H2Kb(DBCO硫接头)。简而言之，反应如下进行：
OVA-4-1BBL-IL12(MTZ-TCO)
将小鼠外周血通过PAL去白细胞滤器过滤，并在室温在pH 9PBS中于0.04mM 6’叠氮基-NHS-酯和0.02mM甲基四嗪-PEG-NHS-酯(MTZ)将1x 108mRCT标记30分钟。加入5ul 20μM Fc-mIL12Fc-TCO-PEG4-NHS酯和5ul 50μM OVA-H2Kb-DBCO-硫接头，并在室温下温育1小时。将5ul 50μM的m4-1BBL-DBCO-硫接头加入到细胞中，并将混合物在4℃下温育过夜。
OVA-4-1BBL
将小鼠外周血通过PAL去白细胞滤器过滤，并于室温在pH 9PBS中于0.04mM 6’叠氮基-NHS-酯和0.02mM甲基四嗪-PEG-NHS-酯(MTZ)将1x 108mRCT标记30分钟。叠氮基标记的mRCT与5ul 50μM m4-1BBL-DBCO-硫接头和5ul 50μM OVA-H2Kb-DBCO-硫接头一起温育，并将混合物在4℃温育过夜。
确定了用OVA-4-1BBL-IL12三重点击的mRCT和用OVA-4-1BBL双重点击的mRCT的IL12，OVA和4-1BBL的拷贝数。(参见下面的表28)。
表28.拷贝数
Figure BDA0002631423640003721
实施例24.产生呈递MHCI(卵清蛋白)，4-1BBL和IL-7(OVA-H2Kb+4-1BBL+IL7)的红系细胞
使用点击方法的修改，将鼠红系细胞与呈递卵清蛋白肽(OVA-H2Kb)的MHCI，4-1BBL和IL-7的每种缀合(在国际申请号PCT/US2018/000042中描述了用于功能化红系细胞的点击化学方法，该申请要求2017年2月17日提交的美国临时申请号62/460589和2017年7月8日提交的美国临时申请号62/542142的优先权，在此通过引用将其全部内容并入)。用以下试剂产生三重点击细胞：Fc-mIL-7(DBCO-磺基-NHS酯标记)；m4-1BBL(DBCO硫接头)和OVA-H2Kb(DBCO硫接头)。简而言之，反应如下进行：
OVA-4-1BBL-IL7(AZ-DBCO)
将小鼠外周血通过PAL去白细胞滤器过滤，并于室温在pH 9PBS中于0.04mM 6'叠氮基-NHS-酯和0.02mM甲基四嗪-PEG-NHS-酯(MTZ)将1x 108mRCT标记30分钟。叠氮基标记的mRCT与5ul 20μM Fc-mIL-7-DBCO-磺基-NHS酯和5ul 50μM OVA-H2Kb-DBCO-硫接头在室温下温育1小时。将5ul 50μM的m4-1BBL-DBCO-硫接头加入到细胞中，并将混合物在4℃下温育过夜。
OVA-4-1BBL
将小鼠外周血通过PAL去白细胞滤器过滤，并在室温在pH 9PBS中用0.04mM 6’叠氮基-NHS-酯和0.02mM甲基四嗪-PEG-NHS-酯(MTZ)将1x 108mRCT标记30分钟。叠氮基标记的mRCT与5ul 50μM m4-1BBL-DBCO-硫接头和5ul 50μM OVA-H2Kb-DBCO-硫接头一起温育，并将混合物在4℃温育过夜。
确定了用OVA-4-1BBL-IL7三重点击的mRCT和用OVA-4-1BBL双重点击的mRCT的IL7，OVA和4-1BBL的拷贝数。(参见下面的表29)。
表29.拷贝数
Figure BDA0002631423640003731
实施例25：呈递MHCI(卵清蛋白)和4-1BBL与IL-7(OVA-H2Kb+4-1BBL+IL7)，IL-12(OVA-H2Kb+4-1BBL+IL12)或IL-15(OVA-H2Kb+4-1BBL+IL15)的红系细胞显示相对于呈递4-1BBL的细胞(OVA-H2Kb+41-BBl)的增加的OT1 CD8+ T细胞的增殖
例如，如实施例21、23和24中所述制备鼠RCT。使用来自Miltenyi的阴性选择试剂盒从OT1转基因小鼠的脾和淋巴结中纯化CD8+ T细胞，并用1uM Cell-Trace Violet标记。将2E5 Cell-Trace Violet标记的OT1 CD8+ T细胞分配到96孔板的每个孔中。未点击的mRCT或三重点击的mRCT(OVA-4-1BBL-IL7，OVA-4-1BBL-IL12或OVA-4-1BBL-IL15)和OT1CD8+ T细胞以1:1.1、1:3.3、和1:10(mRCT:OT1)的比率共同温育并在37℃和5％CO2下温育4天。在第4天，通过多色流式细胞术分析了OT1 T细胞的增殖，活化和记忆标志物。将细胞用FITC CD44，APC CD122和BV785 CD62L染色。该实验的结果示于图14。结果证明了，与mRCTOVA-4-1BBL(双重点击)相比，到第4天，用OVA-4-1BBL-IL7，OVA-4-1BBL-IL12或OVA-4-1BBL-IL15三重点击的mRCT驱动OT1 CD8+ T细胞增殖增加(图14A)。此外，确定了OT1 CD8+T细胞群体中记忆干T细胞(Tscm)，中央记忆T细胞(Tcm)和效应记忆T细胞(Tem)表型的百分比。已发现用OVA-4-1BBL-IL7， OVA-4-1BBL-IL12或OVA-4-1BBL-IL15三重点击的mRCT驱动Tcm表型的激活，而用mRCT OVA-4-1BBL双重点击的mRCT驱动几乎相等的Tem和Tcm表型(图14B)。
总之，该实验的结果表明，RBC上信号1、2和3的组合，特别是OVA-4-1BBL-IL7，OVA-4-1BBL-IL12或OVA-4-1BBL-IL15的组合与单独的信号1和2，即OVA和4-1BBL相比，促进更大的CD8+ T细胞增殖。
实施例26：用呈递MHCI(卵清蛋白)和4-1BBL的红系细胞处理的小鼠即使在用EG7.OVA肿瘤细胞再次攻击后仍表明EG7.OVA肿瘤控制。
如实施例15中所述，使用点击方法，将鼠红系细胞与呈递卵白蛋白肽的MHCI和4-1BBL缀合。简而言之，将小鼠外周血通过PAL去白细胞滤器过滤并在室温下在pH9 PBS中用0.04mM 6’叠氮基-NHS-标记30分钟。叠氮基标记的mRCT与40μM m4-1BBL-DBCO-硫接头和5ul 50μM OVA-H2Kb-DBCO-硫接头在室温下温育1h，然后在4℃再温育过夜。使用来自Miltenyi的阴性选择试剂盒从OT1转基因小鼠的次级淋巴样器官中纯化CD8+ T细胞，并用1uM Cell-Trace Violet标记。
给C57BL/6小鼠皮下注射2E6 EG7.OVA肿瘤细胞。当肿瘤达到约140mm3时，将这些小鼠随机分为两组，每组7只。在随机化后的第1天，给这些小鼠转移2E6 OT1 T细胞中，并在随机化后第1、4和8天给药1E9 mRCT或mRCT-OVA-4-1BBL。在原发肿瘤注射后37天，将mRCT-OVA-4-1BBL(n＝2)治愈的小鼠再次用2E5 EG7.OVA攻击，与年龄相匹配的未处理的小鼠并排。未处理的小鼠在注射肿瘤7天后也接受5E5 OT1 CD8 T细胞转移。每2-3天测量一次肿瘤负担。如图15A所示，该实验的结果证明了先前用mRCT-OVA-4-1BBL治疗的小鼠能够排斥对EG7.OVA肿瘤细胞的再攻击，如通过与未经治疗的小鼠相比EG7.OVA肿瘤体积随时间降低证明。
在一个独立的实验中，向C57BL/6小鼠皮下注射2E6 EG7.OVA细胞。当肿瘤达到约100mm3时，将这些小鼠随机分为两组，每组12只。然后给它们转移5E5 OT1 T细胞，并在随机后第0、4和8天给药1E9 mRBC或mRBC-OVA-4-1BBL。在原发肿瘤注射后35天，将mRBC-OVA-4-1BBL(n＝1)治愈的小鼠再次用2E5 EG7.OVA攻击，与年龄相匹配的未处理的小鼠并排。未处理的小鼠在注射肿瘤后11天也接受4E5 OT1 CD8 T细胞转移。每2-3天测量一次肿瘤负担。如图15B所示，该实验的结果证明即使再次受到EG7.OVA肿瘤细胞的攻击，mRCT-OVA-4-1BBL继续激活肿瘤特异性T细胞(OT1)，如与未治疗的小鼠相比，随着时间的推移，EG7.OVA肿瘤体积的减少证明的。
总体而言，这些结果表明，先前通过mRCT治疗治愈EG7.OVA肿瘤的小鼠在受到EG7.OVA肿瘤细胞的再攻击后，通过防止肿瘤的生长来维持记忆应答。
实施例27：用仅呈递MHCI(卵清蛋白)的红系细胞处理的小鼠在用抗原+佐剂再次攻击后表明抗原T细胞特异性无反应性
如实施例15中所述，使用点击方法，将鼠红系细胞与呈递卵白蛋白肽的MHCI缀合。简而言之，将小鼠外周血通过PAL去白细胞滤器过滤，并在室温在pH8 PBS中用0.04mM 6'叠氮基-NHS-酯标记30分钟。叠氮基标记的mRCT与50μM OVA-H2Kb-DBCO-硫接头在室温下温育1h，然后在4℃温育过夜。使用来自Miltenyi的阴性选择试剂盒从OT1转基因小鼠的次级淋巴样器官中纯化CD8+ T细胞，并用10uM Cell-Trace Violet标记。
在第0天向C57BL/6小鼠转移2E6 OT1 T细胞，并在第0、4和7天给药1E9 mRCT或mRCT-OVA。在第13天，用OVA肽(SIINFEKL(SEQ ID NO:721))+不完全弗氏佐剂(IFA)再攻击小鼠，如图16A所示。与仅在脾脏和淋巴结中均用mRCT给药的小鼠相比，用mRCT-OVA处理的小鼠在OVA肽再攻击时具有更低的OT1细胞计数，如图16B所示。如图16C所证明，任一种处理不影响内源性CD8+ T细胞计数。总体而言，这些结果证明mRCT-OVA能够驱动抗原特异性T细胞无反应性或删除，如OT1计数的减少所显示。
序列表
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<151> 2018-06-21
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成肽”
<400> 2
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成肽”
<400> 3
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成肽”
<400> 4
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 5
<211> 54
<212> DNA
<213>阿西尼亚病毒(Thosea asigna virus)
<400> 5
gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt gacgtggagg sgsstcccgg ccct 54
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成肽”
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 任何氨基酸
<400> 6
Leu Pro Xaa Thr Gly
1 5
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
肽”
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 任何氨基酸
<400> 7
Leu Pro Xaa Thr Ala
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Ala Leu Asp Val Tyr Asn Gly Leu Leu
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Phe Leu Phe Leu Leu Phe Phe Trp Leu
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Thr Leu Met Ser Ala Met Thr Asn Leu
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Ile Leu Leu Trp Gln Pro Ile Pro Val
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Tyr Leu Pro Phe Arg Asn Cys Arg Pro
1 5
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 13
Asn Leu Val Arg Asp Asp Gly Ser Ala Val
1 5 10
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 14
Arg Leu Phe Ala Phe Val Arg Phe Thr
1 5
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 15
Val Val Gln Asn Phe Ala Lys Glu Phe Val
1 5 10
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 16
Phe Val Glu His Asp Asp Glu Ser Pro Gly Leu
1 5 10
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 17
Tyr Thr Asp Phe His Cys Gln Tyr Val
1 5
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 18
Phe Ile Ala Ser Asn Gly Val Lys Leu Val
1 5 10
<210> 19
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> D-氨基酸
<400> 19
Tyr Ser Val Tyr Phe Asn Leu Pro Ala Asp Thr Ile Tyr Thr Asn His
1 5 10 15
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 20
Phe Pro Ser Asp Ser Trp Cys Tyr Phe
1 5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
Ser Tyr Leu Asp Ser Gly Ile His Phe
1 5
<210> 22
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> D-氨基酸
<400> 22
Phe Ser Trp Ala Met Asp Leu Asp Pro Lys Gly Ala Glu
1 5 10
<210> 23
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 23
Ala Cys Asp Pro His Ser Gly His Phe Val
1 5 10
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 24
Cys Ile Leu Gly Lys Leu Phe Thr Lys
1 5
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> D-氨基酸
<400> 25
Ala Val Cys Pro Trp Thr Trp Leu Arg Gly
1 5 10
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 26
Ile Leu Asp Lys Val Leu Val His Leu
1 5
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> D-氨基酸
<400> 27
Thr Leu Tyr Gln Asp Asp Thr Leu Thr Leu Gln Ala Ala Gly Glu
1 5 10 15
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 28
Gly Leu Phe Gly Asp Ile Tyr Leu Ala
1 5
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 29
Lys Ile Leu Asp Ala Val Val Ala Gln Lys
1 5 10
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 30
Glu Thr Val Ser Glu Gln Ser Asn Val
1 5
<210> 31
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 31
Met Ile Phe Glu Lys His Gly Phe Arg Arg Thr Thr Pro Pro
1 5 10
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 32
Ser Leu Ala Asp Glu Ala Glu Val Tyr Leu
1 5 10
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 33
Thr Leu Asp Trp Leu Leu Gln Thr Pro Lys
1 5 10
<210> 34
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> D-氨基酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (10)..(10)
<223> /替换="Leu"
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(10)
<223> /记录=“序列中给出的变体残基相对于变体位置的注释中的那些没有偏爱”
<400> 34
Ile Leu Asn Ala Met Ile Ala Lys Ile Ile
1 5 10
<210> 35
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 35
Cys Tyr Met Glu Ala Val Ala Leu
1 5
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 36
Trp Arg Arg Ala Pro Ala Pro Gly Ala
1 5
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 37
Pro Val Thr Trp Arg Arg Ala Pro Ala
1 5
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<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 38
Cys Val Glu Trp Leu Arg Ile Tyr Leu Glu Asn Gly
1 5 10
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 39
Ser Leu Phe Glu Gly Ile Asp Ile Tyr Thr
1 5 10
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 40
Ala Glu Pro Ile Asn Ile Gln Thr Trp
1 5
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 41
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
1 5
<210> 42
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 42
Phe Leu Glu Gly Asn Glu Val Gly Lys Thr Tyr
1 5 10
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 43
Lys Thr Leu Thr Ser Val Phe Gln Lys
1 5
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 44
Phe Leu Asp Glu Phe Met Glu Gly Val
1 5
<210> 45
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 45
Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val
1 5 10
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 46
Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val
1 5
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 47
Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly
1 5
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 48
Glu Glu Lys Leu Ile Val Val Leu Phe
1 5
<210> 49
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 49
Ser Glu Leu Phe Arg Ser Gly Leu Asp Ser Tyr
1 5 10
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 50
Phe Arg Ser Gly Leu Asp Ser Tyr Val
1 5
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 51
Glu Ala Phe Ile Gln Pro Ile Thr Arg
1 5
<210> 52
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> D-氨基酸
<400> 52
Arg Val Ile Lys Asn Ser Ile Arg Leu Thr Leu Glu
1 5 10
<210> 53
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 53
Gln Gln Ile Thr Lys Thr Glu Val
1 5
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 54
Lys Glu Leu Glu Gly Ile Leu Leu Leu
1 5
<210> 55
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 55
Pro Tyr Tyr Phe Ala Ala Glu Leu Pro Pro Arg Asn Leu Pro Glu Pro
1 5 10 15
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 56
Ile Leu Asp Thr Ala Gly Arg Glu Glu Tyr
1 5 10
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 57
Arg Pro His Val Pro Glu Ser Ala Phe
1 5
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 58
Lys Ile Phe Ser Glu Val Thr Leu Lys
1 5
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 59
Ser His Glu Thr Val Ile Ile Glu Leu
1 5
<210> 60
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 60
Gly Glu Leu Ile Gly Ile Leu Asn Ala Ala Lys Val Pro Ala Asp
1 5 10 15
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 61
Lys Ile Asn Lys Asn Pro Lys Tyr Lys
1 5
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 62
Lys Leu Ser Glu Gln Glu Ser Leu Leu
1 5
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 63
Met Leu Thr Asn Ser Cys Val Lys Leu
1 5
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 64
Phe Met Val Glu Leu Val Glu Gly Ala
1 5
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 65
Gly Val Arg Gly Arg Val Glu Glu Ile
1 5
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 66
Ser Ser Lys Ala Leu Gln Arg Pro Val
1 5
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 67
Ala Thr Gly Phe Lys Gln Ser Ser Lys
1 5
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 68
His Ser Ala Thr Gly Phe Lys Gln Ser Ser Lys
1 5 10
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 69
Lys Gln Ser Ser Lys Ala Leu Gln Arg
1 5
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 70
Gly Phe Lys Gln Ser Ser Lys Ala Leu
1 5
<210> 71
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 71
Ala Thr Gly Phe Lys Gln Ser Ser Lys Ala Leu Gln Arg Pro Val Ala
1 5 10 15
Ser
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 72
Leu Ala Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser
1 5
<210> 73
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 73
Leu Ala Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser Gly
1 5 10
<210> 74
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 74
Phe Gly Leu Ala Thr Glu Lys Ser Arg
1 5
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 75
Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Glu Lys
1 5
<210> 76
<211> 29
<212> PRT
<213> 智人
<400> 76
Glu Asp Leu Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Glu Lys
1 5 10 15
Ser Arg Trp Ser Gly Ser His Gln Phe Glu Gln Leu Ser
20 25
<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 77
Phe Leu Ile Ile Trp Gln Asn Thr Met
1 5
<210> 78
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 78
Thr Met Lys Gln Ile Cys Lys Lys Glu Ile Arg Arg Leu His Gln Tyr
1 5 10 15
<210> 79
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> D-氨基酸
<400> 79
Arg Ile Ala Glu Cys Ile Leu Gly Met Ile
1 5 10
<210> 80
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 80
Ile Gly Arg Ile Ala Glu Cys Ile Leu Gly Met Asn Pro Ser Arg
1 5 10 15
<210> 81
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 81
Tyr Val Asp Phe Arg Glu Tyr Glu Tyr Tyr
1 5 10
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 82
Val Val Met Ser Trp Ala Pro Pro Val
1 5
<210> 83
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> D-氨基酸
<400> 83
Ser Leu Tyr Lys Phe Ser Pro Phe Pro Leu Gly
1 5 10
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 84
Val Val Pro Cys Glu Pro Pro Glu Val
1 5
<210> 85
<211> 25
<212> PRT
<213> 智人
<400> 85
Asn Ser Asn His Val Ala Ser Gly Ala Gly Glu Ala Ala Ile Glu Thr
1 5 10 15
Gln Ser Ser Ser Ser Glu Glu Ile Val
20 25
<210> 86
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 86
Ser Pro Ala Asn Ser Ile Arg His Asn Leu
1 5 10
<210> 87
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 87
Ser Pro Gln Asn Ser Ile Arg His Asn Leu
1 5 10
<210> 88
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 88
Leu Leu Leu Asp Asp Leu Leu Val Ser Ile
1 5 10
<210> 89
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 89
Ala Met Ala Pro Ile Lys Val Arg Leu
1 5
<210> 90
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 90
Gly Tyr Asp Gln Ile Met Pro Lys Lys
1 5
<210> 91
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 91
Gly Tyr Asp Gln Ile Met Pro Lys Ile
1 5
<210> 92
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 92
Gln Arg Pro Tyr Gly Tyr Asp Gln Ile Met
1 5 10
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 93
Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Val
1 5
<210> 94
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> D-氨基酸
<400> 94
Arg Leu Ser Ser Cys Val Pro Val Ala Gly
1 5 10
<210> 95
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 95
Ala Ala Arg Ala Val Phe Leu Ala Leu
1 5
<210> 96
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 96
Lys Pro Leu Phe Arg Arg Met Ser Ser Leu Glu Leu Val Ile Ala
1 5 10 15
<210> 97
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 97
Phe Leu Asp Arg Phe Leu Ser Cys Met
1 5
<210> 98
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 98
Ser Leu Ile Ala Ala Ala Ala Phe Cys Leu Ala
1 5 10
<210> 99
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 99
Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg Tyr
1 5
<210> 100
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 100
Tyr Tyr Trp Pro Arg Pro Arg Arg Tyr
1 5
<210> 101
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> VARIANT
<222> (10)..(10)
<223> /替换=" "
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(10)
<223> /记录=“序列中给出的变体残基相对于变体位置的注释中的那些没有偏爱”
<400> 101
Val Leu Pro Asp Val Phe Ile Arg Cys Val
1 5 10
<210> 102
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 102
Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr Asp Leu
1 5
<210> 103
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 103
Ala Thr Phe Leu Gly Ser Leu Thr Trp Lys
1 5 10
<210> 104
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 104
Met Leu Ala Val Ile Ser Cys Ala Val
1 5
<210> 105
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 105
Arg Gln Lys Arg Ile Leu Val Asn Leu
1 5
<210> 106
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 106
Asn Tyr Asn Asn Phe Tyr Arg Phe Leu
1 5
<210> 107
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 107
Glu Tyr Ser Lys Glu Cys Leu Lys Glu Phe
1 5 10
<210> 108
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 108
Glu Tyr Leu Ser Leu Ser Asp Lys Ile
1 5
<210> 109
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 109
Met Leu Met Ala Gln Glu Ala Leu Ala Phe Leu
1 5 10
<210> 110
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 110
Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys
1 5
<210> 111
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 111
Leu Ala Ala Gln Glu Arg Arg Val Pro Arg
1 5 10
<210> 112
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 112
Glu Leu Val Arg Arg Ile Leu Ser Arg
1 5
<210> 113
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 113
Ala Pro Arg Gly Val Arg Met Ala Val
1 5
<210> 114
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 114
Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu Pro Val Phe
1 5 10
<210> 115
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 115
Gln Gly Ala Met Leu Ala Ala Gln Glu Arg Arg Val Pro Arg Ala Ala
1 5 10 15
Glu Val Pro Arg
20
<210> 116
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人
<400> 116
Ala Ala Asp His Arg Gln Leu Gln Leu Ser Ile Ser Ser Cys Leu Gln
1 5 10 15
Gln Leu
<210> 117
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人
<400> 117
Cys Leu Ser Arg Arg Pro Trp Lys Arg Ser Trp Ser Ala Gly Ser Cys
1 5 10 15
Pro Gly Met Pro His Leu
20
<210> 118
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 118
Ile Leu Ser Arg Asp Ala Ala Pro Leu Pro Arg Pro Gly
1 5 10
<210> 119
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 119
Ala Gly Ala Thr Gly Gly Arg Gly Pro Arg Gly Ala Gly Ala
1 5 10
<210> 120
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 120
Arg Tyr Cys Asn Leu Glu Gly Pro Pro Ile
1 5 10
<210> 121
<211> 24
<212> PRT
<213> 智人
<400> 121
Lys Trp Thr Glu Pro Tyr Cys Val Ile Ala Ala Val Lys Ile Phe Pro
1 5 10 15
Arg Phe Phe Met Val Ala Lys Gln
20
<210> 122
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 122
Lys Cys Cys Lys Ile Arg Tyr Cys Asn Leu Glu Gly Pro Pro Ile Asn
1 5 10 15
Ser Ser Val Phe
20
<210> 123
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 123
Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr
1 5
<210> 124
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 124
Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Val
1 5
<210> 125
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 125
Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Asp
1 5
<210> 126
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 126
Lys Val Leu Glu Tyr Val Ile Lys Val
1 5
<210> 127
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 127
Ser Leu Phe Arg Ala Val Ile Thr Lys
1 5
<210> 128
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 128
Asn Tyr Lys His Cys Phe Pro Glu Ile
1 5
<210> 129
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 129
Glu Val Tyr Asp Gly Arg Glu His Ser Ala
1 5 10
<210> 130
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 130
Arg Val Arg Phe Phe Phe Pro Ser Leu
1 5
<210> 131
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 131
Arg Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu
1 5 10
<210> 132
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 132
Lys Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr
1 5 10
<210> 133
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 133
Asp Pro Ala Arg Tyr Glu Phe Leu Trp
1 5
<210> 134
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 134
Ile Thr Lys Lys Val Ala Asp Leu Val Gly Phe
1 5 10
<210> 135
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 135
Ser Ala Phe Pro Thr Thr Ile Asn Phe
1 5
<210> 136
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 136
Ser Ala Tyr Gly Glu Pro Arg Lys Leu
1 5
<210> 137
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 137
Thr Ser Cys Ile Leu Glu Ser Leu Phe Arg Ala Val Ile Thr Lys
1 5 10 15
<210> 138
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 138
Pro Arg Ala Leu Ala Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu Glu Tyr
1 5 10 15
<210> 139
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 139
Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu
1 5 10 15
<210> 140
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 140
Glu Tyr Val Ile Lys Val Ser Ala Arg Val Arg Phe
1 5 10
<210> 141
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 141
Tyr Leu Gln Leu Val Phe Gly Ile Glu Val
1 5 10
<210> 142
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 142
Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr
1 5
<210> 143
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 143
Lys Met Val Glu Leu Val His Phe Leu
1 5
<210> 144
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 144
Leu Val Gln Glu Asn Tyr Leu Glu Tyr
1 5
<210> 145
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 145
Glu Tyr Leu Gln Leu Val Phe Gly Ile
1 5
<210> 146
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 146
Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys
1 5
<210> 147
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 147
Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 148
Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr
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<210> 149
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<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> D-氨基酸
<400> 149
Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Asp
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 150
Lys Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu
1 5
<210> 151
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 151
Leu Val Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val
1 5 10
<210> 152
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 152
Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile
1 5
<210> 153
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 153
Thr Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe
1 5
<210> 154
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 154
Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 155
Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr
1 5 10
<210> 156
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 156
Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> D-氨基酸
<400> 157
Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Ile
1 5 10
<210> 158
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 158
Trp Gln Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe
1 5
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<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 159
Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu Glu Tyr
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<210> 160
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 160
Arg Lys Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg
1 5 10 15
<210> 161
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 161
Ala Cys Tyr Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser
1 5 10 15
<210> 162
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 162
Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gln Leu
1 5 10
<210> 163
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 163
Val Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu
1 5 10 15
<210> 164
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 164
Gly Asp Asn Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val
1 5 10 15
<210> 165
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 165
Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu His His Met Val Lys Ile Ser Gly
1 5 10 15
<210> 166
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 166
Arg Lys Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala
1 5 10 15
<210> 167
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> VARIANT
<222> (10)..(10)
<223> /替换="Leu"
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(10)
<223> /记录=“序列中给出的变体残基相对于变体位置的注释中的那些没有偏爱”
<400> 167
Glu Val Asp Pro Ala Ser Asn Thr Tyr Ile
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<210> 168
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 168
Gly Val Tyr Asp Gly Arg Glu His Thr Val
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 169
Asn Tyr Lys Arg Cys Phe Pro Val Ile
1 5
<210> 170
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 170
Ser Glu Ser Leu Lys Met Ile Phe
1 5
<210> 171
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 171
Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro Arg
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 172
Glu Val Asp Pro Ile Gly His Val Tyr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 173
Ile Ser Gly Gly Pro Arg Ile Ser Tyr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 174
Lys Val Ala Glu Leu Val Arg Phe Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 175
Gly Leu Met Asp Val Gln Ile Pro Thr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 176
Ala Leu Ser Val Met Gly Val Tyr Val
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> D-氨基酸
<400> 177
Gly Leu Tyr Asp Gly Met Glu His Leu Leu
1 5 10
<210> 178
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 178
Ser Leu Leu Lys Phe Leu Ala Lys Val
1 5
<210> 179
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> D-氨基酸
<400> 179
Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 180
Val Arg Ile Gly His Leu Tyr Ile Leu
1 5
<210> 181
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 181
Arg Glu Pro Phe Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Ile Arg
1 5 10 15
<210> 182
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 182
Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg
1 5 10
<210> 183
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 183
Ile Leu Phe Gly Ile Ser Leu Arg Glu Val
1 5 10
<210> 184
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 184
Lys Val Val Glu Phe Leu Ala Met Leu
1 5
<210> 185
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 185
Ser Ser Ala Leu Leu Ser Ile Phe Gln Ser Ser Pro Glu
1 5 10
<210> 186
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 186
Ser Phe Ser Tyr Thr Leu Leu Ser Leu
1 5
<210> 187
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 187
Val Ser Ser Phe Phe Ser Tyr Thr Leu
1 5
<210> 188
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 188
Leu Leu Phe Gly Leu Ala Leu Ile Glu Val
1 5 10
<210> 189
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 189
Ala Leu Lys Asp Val Glu Glu Arg Val
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 190
Thr Leu Asp Glu Lys Val Ala Glu Leu Val
1 5 10
<210> 191
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 191
Lys Val Leu Glu Phe Leu Ala Lys Leu
1 5
<210> 192
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 192
Phe Leu Ala Lys Leu Asn Asn Thr Val
1 5
<210> 193
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 193
Val Ile Trp Glu Val Leu Asn Ala Val
1 5
<210> 194
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 194
Ser Glu Ser Ile Lys Lys Lys Val Leu
1 5
<210> 195
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 195
Ala Ser Ser Thr Leu Tyr Leu Val Phe
1 5
<210> 196
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 196
Ser Ser Thr Leu Tyr Leu Val Phe Ser Pro Ser Ser Phe Ser Thr
1 5 10 15
<210> 197
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 197
Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ala
1 5
<210> 198
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 198
Gln Leu Val Phe Gly Ile Glu Val Val
1 5
<210> 199
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 199
Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly
1 5 10 15
Val Thr Ser Ala
20
<210> 200
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 200
Gln Gly Gln His Phe Leu Gln Lys Val
1 5
<210> 201
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 201
Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu
1 5 10
<210> 202
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 202
Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr
1 5
<210> 203
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 203
Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Phe
1 5
<210> 204
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 204
Tyr Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu
1 5 10
<210> 205
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 205
Ala Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg
1 5 10
<210> 206
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 206
Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile Arg
1 5 10
<210> 207
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 207
Ala Pro Arg Gly Pro His Gly Gly Ala Ala Ser Gly Leu
1 5 10
<210> 208
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 208
Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu
1 5 10
<210> 209
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 209
Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile
1 5 10
<210> 210
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 210
Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala
1 5
<210> 211
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 211
Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu
1 5
<210> 212
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 212
Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala Arg
1 5 10
<210> 213
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 213
Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met
1 5
<210> 214
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 214
Ala Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu
1 5
<210> 215
<211> 25
<212> PRT
<213> 智人
<400> 215
Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala
1 5 10 15
Glu Leu Ala Arg Arg Ser Leu Ala Gln
20 25
<210> 216
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 216
Glu Phe Tyr Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met
1 5 10
<210> 217
<211> 25
<212> PRT
<213> 智人
<400> 217
Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu Thr
1 5 10 15
Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg
20 25
<210> 218
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 218
Arg Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Met Pro Phe Ala
1 5 10
<210> 219
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 219
Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala Arg Arg
1 5 10
<210> 220
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 220
Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu Thr
1 5 10 15
Ile Arg Leu Thr
20
<210> 221
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 221
Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly
1 5 10
<210> 222
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 222
Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile Arg Leu
1 5 10 15
<210> 223
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 223
Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu Thr
1 5 10
<210> 224
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 224
Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met
1 5 10
<210> 225
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 225
Val Leu Gln Glu Leu Asn Val Thr Val
1 5
<210> 226
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 226
Ala Leu Cys Asn Thr Asp Ser Pro Leu
1 5
<210> 227
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 227
Leu Leu Ala Ala Arg Ala Ile Val Ala Ile
1 5 10
<210> 228
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 228
Thr Ser Thr Thr Ser Leu Glu Leu Asp
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 229
Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 230
Asp Leu Trp Lys Glu Thr Val Phe Thr
1 5
<210> 231
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 231
Leu Tyr Ala Thr Val Ile His Asp Ile
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 232
Ile Leu Asp Ser Ser Glu Glu Asp Lys
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 233
Lys Ala Ser Glu Lys Ile Phe Tyr Val
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 234
Arg Leu Gln Gly Ile Ser Pro Lys Ile
1 5
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<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 235
Glu Lys Ile Gln Lys Ala Phe Asp Asp Ile Ala Lys Tyr Phe Ser Lys
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 236
Phe Gly Arg Leu Gln Gly Ile Ser Pro Lys Ile
1 5 10
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<211> 18
<212> PRT
<213> 智人
<400> 237
Trp Glu Lys Met Lys Ala Ser Glu Lys Ile Phe Tyr Val Tyr Met Lys
1 5 10 15
Arg Lys
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<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 238
Lys Ile Phe Tyr Val Tyr Met Lys Arg Lys Tyr Glu Ala Met Thr
1 5 10 15
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<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 239
Lys Ile Phe Tyr Val Tyr Met Lys Arg Lys Tyr Glu Ala Met
1 5 10
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<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 240
Ile Asn Lys Thr Ser Gly Pro Lys Arg Gly Lys His Ala Trp Thr His
1 5 10 15
Arg Leu Arg Glu
20
<210> 241
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 241
Tyr Phe Ser Lys Lys Glu Trp Glu Lys Met Lys Ser Ser Glu Lys Ile
1 5 10 15
Val Tyr Val Tyr
20
<210> 242
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 242
Met Lys Leu Asn Tyr Glu Val Met Thr Lys Leu Gly Phe Lys Val Thr
1 5 10 15
Leu Pro Pro Phe
20
<210> 243
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 243
Lys His Ala Trp Thr His Arg Leu Arg Glu Arg Lys Gln Leu Val Val
1 5 10 15
Tyr Glu Glu Ile
20
<210> 244
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 244
Leu Gly Phe Lys Val Thr Leu Pro Pro Phe Met Arg Ser Lys Arg Ala
1 5 10 15
Ala Asp Phe His
20
<210> 245
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 245
Lys Ser Ser Glu Lys Ile Val Tyr Val Tyr Met Lys Leu Asn Tyr Glu
1 5 10 15
Val Met Thr Lys
20
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 246
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 247
Ser Leu Gly Trp Leu Phe Leu Leu Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 248
Leu Ser Arg Leu Ser Asn Arg Leu Leu
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 249
Leu Thr Tyr Val Ser Phe Arg Asn Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 250
Asp Leu Pro Ala Tyr Val Arg Asn Leu
1 5
<210> 251
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 251
Phe Leu Thr Gly Asn Gln Leu Ala Val
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 252
Gly Ala Phe Glu His Leu Pro Ser Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 253
Arg Leu Ala Arg Leu Ala Leu Val Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 254
Pro Leu Ala Asp Leu Ser Pro Phe Ala
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 255
Ile Leu Leu Arg Asp Ala Gly Leu Val
1 5
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<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 256
Cys Glu Phe His Ala Cys Trp Pro Ala Phe Thr Val Leu Gly Glu
1 5 10 15
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 257
Ala Thr Thr Asn Ile Leu Glu His Tyr
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 258
Glu Val Ile Ser Cys Lys Leu Ile Lys Arg
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 259
Ser Tyr Arg Asn Glu Ile Ala Tyr Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 260
Arg Gln Lys Lys Ile Arg Ile Gln Leu
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<213> 智人
<400> 261
His Leu Gly Ser Arg Gln Lys Lys Ile Arg Ile Gln Leu Arg Ser Gln
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<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 262
Cys Ala Thr Trp Lys Val Ile Cys Lys Ser Cys Ile Ser Gln Thr Pro
1 5 10 15
Gly
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<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 263
Ala Phe Leu Arg His Ala Ala Leu
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 264
Asp Tyr Pro Ser Leu Ser Ala Thr Asp Ile
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 265
Tyr Met Met Pro Val Asn Ser Glu Val
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 266
Lys Leu Ala Thr Ala Gln Phe Lys Ile
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 267
Val Tyr Val Lys Gly Leu Leu Ala Lys Ile
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 268
Ala Leu Val Asp Ala Gly Val Pro Met
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 269
Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Tyr Ala
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 270
Arg Leu Leu Val Pro Thr Gln Phe Val
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 271
Asn Leu Ser Ser Ala Glu Val Val Val
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 272
Lys Thr Val Asn Glu Leu Gln Asn Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 273
Phe Leu Pro Asp His Ile Asn Ile Val
1 5
<210> 274
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 274
Lys Thr Pro Phe Val Ser Pro Leu Leu
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 275
Gln Leu Leu Asp Gly Phe Met Ile Thr Leu
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 276
Tyr Leu Val Gly Asn Val Cys Ile Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 277
Glu Leu Ser Asp Ser Leu Gly Pro Val
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 278
Ile Leu Ser Leu Glu Leu Met Lys Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 279
Ser Leu Glu Glu Asn Ile Val Ile Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 280
Lys Gly Ser Gly Lys Met Lys Thr Glu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 281
Glu Tyr Arg Gly Phe Thr Gln Asp Phe
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 282
Arg Leu Ala Glu Tyr Gln Ala Tyr Ile
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 283
Leu Leu Gln Ala Glu Ala Pro Arg Leu
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 284
Trp Leu Glu Tyr Tyr Asn Leu Glu Arg
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 285
Gln Ile Arg Pro Ile Phe Ser Asn Arg
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 286
Val Tyr Asp Tyr Asn Cys His Val Asp Leu
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 287
Ala Tyr Ile Asp Phe Glu Met Lys Ile
1 5
<210> 288
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> D-氨基酸
<400> 288
Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu Gly
1 5 10
<210> 289
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 289
Ile Met Ile Gly Val Leu Val Gly Val
1 5
<210> 290
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 290
Gly Val Leu Val Gly Val Ala Leu Ile
1 5
<210> 291
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 291
Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro Thr Val
1 5 10
<210> 292
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 292
Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Val
1 5
<210> 293
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 293
Ala Thr Val Gly Ile Met Ile Gly Val
1 5
<210> 294
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 294
His Leu Phe Gly Tyr Ser Trp Tyr Lys
1 5
<210> 295
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 295
Gln Tyr Ser Trp Phe Val Asn Gly Thr Phe
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 296
Thr Tyr Ala Cys Phe Val Ser Asn Leu
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 297
His Arg Trp Cys Ile Pro Trp Gln Arg Leu
1 5 10
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<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 298
Ala Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser Val Ser Ala Asn Arg Ser
1 5 10 15
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<211> 25
<212> PRT
<213> 智人
<400> 299
Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser Asp Leu Val Asn
1 5 10 15
Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val
20 25
<210> 300
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 300
Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val
1 5 10 15
<210> 301
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 301
Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn Leu Ser Leu Ser Cys
1 5 10
<210> 302
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 302
Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn
1 5 10
<210> 303
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 303
Tyr Ala Cys Phe Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser
1 5 10 15
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<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 304
Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro
1 5 10
<210> 305
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 305
Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile Thr Val Ser Ala Ser Gly
1 5 10
<210> 306
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 306
Lys Thr Trp Gly Gln Tyr Trp Gln Val
1 5
<210> 307
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> /替换=" "
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(10)
<223> /记录=“序列中给出的变体残基相对于变体位置的注释中的那些没有偏爱”
<400> 307
Ala Met Leu Gly Thr His Thr Met Glu Val
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<210> 308
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 308
Ile Met Asp Gln Val Pro Phe Ser Val
1 5
<210> 309
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 309
Ile Thr Asp Gln Val Pro Phe Ser Val
1 5
<210> 310
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 310
Tyr Leu Glu Pro Gly Pro Val Thr Ala
1 5
<210> 311
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 311
Leu Leu Asp Gly Thr Ala Thr Leu Arg Leu
1 5 10
<210> 312
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 312
Val Leu Tyr Arg Tyr Gly Ser Phe Ser Val
1 5 10
<210> 313
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 313
Ser Leu Ala Asp Thr Asn Ser Leu Ala Val
1 5 10
<210> 314
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 314
Arg Leu Met Lys Gln Asp Phe Ser Val
1 5
<210> 315
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 315
Arg Leu Pro Arg Ile Phe Cys Ser Cys
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 316
Leu Ile Tyr Arg Arg Arg Leu Met Lys
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 317
Ala Leu Leu Ala Val Gly Ala Thr Lys
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 318
Ile Ala Leu Asn Phe Pro Gly Ser Gln Lys
1 5 10
<210> 319
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 319
Arg Ser Tyr Val Pro Leu Ala His Arg
1 5
<210> 320
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 320
Ala Leu Asn Phe Pro Gly Ser Gln Lys
1 5
<210> 321
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 321
Val Tyr Phe Phe Leu Pro Asp His Leu
1 5
<210> 322
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 322
Arg Thr Lys Gln Leu Tyr Pro Glu Trp
1 5
<210> 323
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 323
His Thr Met Glu Val Thr Val Tyr His Arg
1 5 10
<210> 324
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 324
Ser Ser Pro Gly Cys Gln Pro Pro Ala
1 5
<210> 325
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 325
Val Pro Leu Asp Cys Val Leu Tyr Arg Tyr
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 326
Leu Pro His Ser Ser Ser His Trp Leu
1 5
<210> 327
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 327
Ser Asn Asp Gly Pro Thr Leu Ile
1 5
<210> 328
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 328
Gly Arg Ala Met Leu Gly Thr His Thr Met Glu Val Thr Val Tyr
1 5 10 15
<210> 329
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 329
Trp Asn Arg Gln Leu Tyr Pro Glu Trp Thr Glu Ala Gln Arg Leu Asp
1 5 10 15
<210> 330
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人
<400> 330
Thr Thr Glu Trp Val Glu Thr Thr Ala Arg Glu Leu Pro Ile Pro Glu
1 5 10 15
Pro Glu
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<211> 17
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<213> 智人
<400> 331
Thr Gly Arg Ala Met Leu Gly Thr His Thr Met Glu Val Thr Val Tyr
1 5 10 15
His
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 332
Phe Leu Asn Gln Thr Asp Glu Thr Leu
1 5
<210> 333
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 333
Met Gln Leu Ile Tyr Asp Ser Ser Leu
1 5
<210> 334
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 334
Lys Leu Leu Met Val Leu Met Leu Ala
1 5
<210> 335
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 335
Leu Ile Tyr Asp Ser Ser Leu Cys Asp Leu
1 5 10
<210> 336
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 336
Ala Ile Asp Glu Leu Lys Glu Cys Phe
1 5
<210> 337
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 337
Thr Thr Asn Ala Ile Asp Glu Leu Lys
1 5
<210> 338
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 338
Pro Leu Leu Glu Asn Val Ile Ser Lys
1 5
<210> 339
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> /替换=" "
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(10)
<223> /记录=“序列中给出的变体残基相对于变体位置的注释中的那些没有偏爱”
<400> 339
Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val
1 5 10
<210> 340
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 340
Ile Leu Thr Val Ile Leu Gly Val Leu
1 5
<210> 341
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 341
Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val
1 5 10
<210> 342
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> VARIANT
<222> (10)..(10)
<223> /替换=" "
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(10)
<223> /记录=“序列中给出的变体残基相对于变体位置的注释中的那些没有偏爱”
<400> 342
Ala Glu Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr
1 5 10
<210> 343
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 343
Arg Asn Gly Tyr Arg Ala Leu Met Asp Lys Ser
1 5 10
<210> 344
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
多肽"
<400> 344
Tyr Thr Thr Ala Glu Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val Ile
1 5 10 15
Leu Gly Val Leu Leu Leu Ile Gly Cys Trp Tyr Cys Arg Arg
20 25 30
<210> 345
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 345
Glu Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val Ile
1 5 10
<210> 346
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 346
Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val Ile Leu Gly Val Leu
1 5 10
<210> 347
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> D-氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> D-氨基酸
<400> 347
Ala Pro Pro Ala Tyr Glu Lys Leu Pro Ser Ala Glu Gln Phe
1 5 10
<210> 348
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人
<400> 348
Arg Asn Gly Tyr Arg Ala Leu Met Asp Lys Ser Leu His Val Gly Thr
1 5 10 15
Gln Cys Ala Leu Thr Arg Arg
20
<210> 349
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 349
Met Pro Arg Glu Asp Ala His Phe Ile Tyr Gly Tyr Pro Lys Lys Gly
1 5 10 15
His Gly His Ser
20
<210> 350
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 350
Lys Asn Cys Glu Pro Val Val Pro Asn Ala Pro Pro Ala Tyr Glu Lys
1 5 10 15
Leu Ser Ala Glu
20
<210> 351
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 351
Thr Ile Leu Leu Gly Ile Phe Phe Leu
1 5
<210> 352
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 352
Phe Leu Ala Leu Ile Ile Cys Asn Ala
1 5
<210> 353
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 353
Lys Leu Leu Gly Pro His Val Glu Gly Leu
1 5 10
<210> 354
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 354
Lys Leu Leu Gly Pro His Val Leu Gly Val
1 5 10
<210> 355
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 355
Gly Leu Phe Asp Glu Tyr Leu Glu Met Val
1 5 10
<210> 356
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 356
Ser Leu Ser Lys Ile Leu Asp Thr Val
1 5
<210> 357
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 357
Leu Leu Ser His Gly Ala Val Ile Glu Val
1 5 10
<210> 358
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 358
Leu Tyr Ser Ala Cys Phe Trp Trp Leu
1 5
<210> 359
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 359
Ile Met Leu Cys Leu Ile Ala Ala Val
1 5
<210> 360
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 360
Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val
1 5 10
<210> 361
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 361
Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 362
Val Leu His Trp Asp Pro Glu Thr Val
1 5
<210> 363
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 363
Phe Leu Arg Asn Phe Ser Leu Met Val
1 5
<210> 364
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 364
Phe Val Phe Leu Arg Asn Phe Ser Leu
1 5
<210> 365
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 365
Phe Leu Arg Asn Phe Ser Leu Met Leu
1 5
<210> 366
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 366
Met Ser Leu Gln Arg Gln Phe Leu Arg
1 5
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<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 367
Ile Ser Pro Asn Ser Val Phe Ser Gln Trp Arg Val Val Cys Asp Ser
1 5 10 15
Leu Glu Asp Tyr Asp
20
<210> 368
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 368
Ser Leu Pro Tyr Trp Asn Phe Ala Thr Gly
1 5 10
<210> 369
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 369
Ser Gln Trp Arg Val Val Cys Asp Ser Leu Glu Asp Tyr Asp Thr
1 5 10 15
<210> 370
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 370
Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu His Tyr
1 5 10
<210> 371
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 371
Ser Leu Asp Asp Tyr Asn His Leu Val
1 5
<210> 372
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 372
Phe Val Trp Leu His Tyr Tyr Ser Val
1 5
<210> 373
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 373
Ser Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu
1 5
<210> 374
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 374
Thr Leu Asp Ser Gln Val Met Ser Leu
1 5
<210> 375
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 375
Leu Leu Gly Pro Gly Arg Pro Tyr Arg
1 5
<210> 376
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 376
Ala Asn Asp Pro Ile Phe Val Val Leu
1 5
<210> 377
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 377
Gln Cys Thr Glu Val Arg Ala Asp Thr Arg Pro Trp Ser Gly Pro
1 5 10 15
<210> 378
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 378
Ala Leu Pro Tyr Trp Asn Phe Ala Thr Gly
1 5 10
<210> 379
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 379
Lys Cys Asp Ile Cys Thr Asp Glu Tyr
1 5
<210> 380
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 380
Asp Ser Asp Pro Asp Ser Phe Gln Asp Tyr
1 5 10
<210> 381
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 381
Ser Ser Asp Tyr Val Ile Pro Ile Gly Thr Tyr
1 5 10
<210> 382
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 382
Met Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu
1 5
<210> 383
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 383
Cys Leu Leu Trp Ser Phe Gln Thr Ser Ala
1 5 10
<210> 384
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 384
Tyr Met Asp Gly Thr Met Ser Gln Val
1 5
<210> 385
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 385
Ala Phe Leu Pro Trp His Arg Leu Phe
1 5
<210> 386
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 386
Ile Tyr Met Asp Gly Thr Ala Asp Phe Ser Phe
1 5 10
<210> 387
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 387
Gln Cys Ser Gly Asn Phe Met Gly Phe
1 5
<210> 388
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 388
Thr Pro Arg Leu Pro Ser Ser Ala Asp Val Glu Phe
1 5 10
<210> 389
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 389
Leu Pro Ser Ser Ala Asp Val Glu Phe
1 5
<210> 390
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 390
Leu His His Ala Phe Val Asp Ser Ile Phe
1 5 10
<210> 391
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> D-氨基酸
<400> 391
Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe Asp
1 5 10
<210> 392
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 392
Gln Asn Ile Leu Leu Ser Asn Ala Pro Leu Gly Pro Gln Phe Pro
1 5 10 15
<210> 393
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 393
Ser Tyr Leu Gln Asp Ser Asp Pro Asp Ser Phe Gln Asp
1 5 10
<210> 394
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 394
Phe Leu Leu His His Ala Phe Val Asp Ser Ile Phe Glu Gln Trp Leu
1 5 10 15
Gln Arg His Arg Pro
20
<210> 395
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 395
Ser Ala Cys Asp Val Ser Val Arg Val Val
1 5 10
<210> 396
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 396
Tyr Thr Asp Phe Val Gly Glu Gly Leu
1 5
<210> 397
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 397
Tyr Leu Ile Glu Leu Ile Asp Arg Val
1 5
<210> 398
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 398
Ser Val Ala Ser Thr Ile Thr Gly Val
1 5
<210> 399
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 399
Cys Ile Thr Phe Gln Val Trp Asp Val
1 5
<210> 400
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 400
Phe Leu Pro His Phe Gln Ala Leu His Val
1 5 10
<210> 401
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 401
Arg Ser Asp Ser Gly Gln Gln Ala Arg Tyr
1 5 10
<210> 402
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 402
Leu Leu Tyr Lys Leu Ala Asp Leu Ile
1 5
<210> 403
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 403
Ser Leu Ala Met Leu Asp Leu Leu His Val
1 5 10
<210> 404
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 404
Met Val Tyr Asp Leu Tyr Lys Thr Leu
1 5
<210> 405
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 405
Arg Leu Asp Phe Asn Leu Ile Arg Val
1 5
<210> 406
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 406
Gly Leu Gln His Trp Val Pro Glu Leu
1 5
<210> 407
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 407
Asn Leu Phe Glu Thr Pro Val Glu Ala
1 5
<210> 408
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 408
Lys Leu Asp Val Gly Asn Ala Glu Val
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 409
Tyr Leu Leu Gln Gly Met Ile Ala Ala Val
1 5 10
<210> 410
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 410
Tyr Leu Gln Gly Met Ile Ala Ala Val
1 5
<210> 411
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 411
Pro Leu Phe Asp Phe Ser Trp Leu Ser Leu
1 5 10
<210> 412
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 412
Trp Leu Ser Leu Lys Thr Leu Leu Ser Leu
1 5 10
<210> 413
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 413
Tyr Leu Asn Asp His Leu Glu Pro Trp Ile
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 414
Cys Gln Trp Gly Arg Leu Trp Gln Leu
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 415
Val Phe Leu Pro Cys Asp Ser Trp Asn Leu
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 416
Cys Ile Pro Pro Asp Ser Leu Leu Phe Pro Ala
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 417
Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser Leu Tyr Val
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 418
Phe Ile Ile Glu Asn Leu Lys Ala Ala
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 419
Phe Ile Leu Pro Val Leu Gly Ala Val
1 5
<210> 420
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 420
Val Leu Leu Gln Ala Gly Ser Leu His Ala
1 5 10
<210> 421
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 421
Leu Leu Gly Asn Cys Leu Pro Thr Val
1 5
<210> 422
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 422
Ser Leu Gln Ala Leu Lys Val Thr Val
1 5
<210> 423
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 423
Lys Phe Leu Asp Ala Leu Ile Ser Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 424
Leu Leu Asn Ala Phe Thr Val Thr Val
1 5
<210> 425
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 425
Phe Ala Trp Glu Arg Val Arg Gly Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 426
Gly Leu Gly Leu Pro Lys Leu Tyr Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 427
Leu Met Ala Gly Cys Ile Gln Glu Ala
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 428
Leu Leu Glu Glu Met Phe Leu Thr Val
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 429
Lys Val His Pro Val Ile Trp Ser Leu
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 430
Leu Met Leu Gln Asn Ala Leu Thr Thr Met
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 431
Tyr Val Asp Pro Val Ile Thr Ser Ile
1 5
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<213> 智人
<400> 432
Phe Met Thr Arg Lys Leu Trp Asp Leu
1 5
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<213> 智人
<400> 433
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1 5
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<211> 9
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<213> 智人
<400> 434
Ala Leu Tyr Gly Asp Ile Asp Ala Val
1 5
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<213> 智人
<400> 435
Leu Leu Asp Arg Phe Leu Ala Thr Val
1 5
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<213> 智人
<400> 436
Ile Leu Ile Asp Trp Leu Val Gln Val
1 5
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<213> 智人
<400> 437
Ala Lys Tyr Leu Met Glu Leu Thr Met
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<213> 智人
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Ala Gly Tyr Leu Met Glu Leu Cys Cys
1 5
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<400> 439
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1 5
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<213> 智人
<400> 440
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1 5 10 15
<210> 441
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 441
Val Leu Glu Gly Met Glu Val Val
1 5
<210> 442
<211> 10
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<213> 智人
<400> 442
Lys Leu Lys His Tyr Gly Pro Gly Trp Val
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 443
Asp Phe Met Ile Gln Gly Gly Asp Phe
1 5
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 444
Lys Phe His Arg Val Ile Lys Asp Phe
1 5
<210> 445
<211> 9
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<213> 智人
<400> 445
Trp Leu Gln Tyr Phe Pro Asn Pro Val
1 5
<210> 446
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<400> 446
Ala Leu Gly Gly His Pro Leu Leu Gly Val
1 5 10
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<400> 447
Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu
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<400> 448
Thr Met Asn Gly Ser Lys Ser Pro Val
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Tyr Gln Leu Asp Pro Lys Phe Ile Val
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Gly Leu Lys Ala Gly Val Ile Ala Val
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Leu Leu Gly Asp Leu Phe Gly Val
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Gly Leu Pro Pro Asp Val Gln Arg Val His
1 5 10
<210> 573
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 573
Ser Leu Phe Pro Asn Ser Pro Lys Trp Thr Ser Lys
1 5 10
<210> 574
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 574
Gln Leu Leu Ile Lys Ala Val Asn Leu
1 5
<210> 575
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 575
Ser Thr Leu Cys Gln Val Glu Pro Val
1 5
<210> 576
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 576
Ala Tyr Val Pro Gln Gln Ala Trp Ile
1 5
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 577
Val Tyr Ser Asp Ala Asp Ile Phe Leu
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 578
Asn Tyr Ser Val Arg Tyr Arg Pro Gly Leu
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 579
Leu Tyr Ala Trp Glu Pro Ser Phe Leu
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 580
Ser Thr Ala Pro Pro Val His Asn Val
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<212> PRT
<213> 智人
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Leu Leu Leu Leu Thr Val Leu Thr Val
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 582
Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val
1 5
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 583
Asp Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Lys
1 5
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 584
Val Pro Gly Trp Gly Ile Ala Leu Leu
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
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<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
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<213> 智人
<400> 596
Ser Met Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val
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<213> 智人
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Gly Leu Ala Pro Pro Gln His Leu Ile Arg Val
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 598
Lys Leu Cys Pro Val Gln Leu Trp Val
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 599
Lys Thr Cys Pro Val Gln Leu Trp Val
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 600
Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 601
Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 602
Thr Arg Val Leu Ala Met Ala Ile Tyr
1 5
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<213> 智人
<400> 603
Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met Ala Ile Tyr Lys Gln
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<213> 智人
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Lys Leu Ala Lys Pro Leu Ser Ser Leu
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<400> 606
Val Leu Leu Gly Met Glu Gly Ser Val
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<400> 607
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Ile Ile Gly Gly Gly Met Ala Phe Thr
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Ser Leu Tyr Ser Phe Pro Glu Pro Glu Ala
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<213> 智人
<400> 614
Ala Leu Tyr Val Asp Ser Leu Phe Phe Leu
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<212> PRT
<213> 智人
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Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu
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<220>
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<213> 智人
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Gly Gln His Leu His Leu Glu Thr Phe
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<213> 智人
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Phe Gly Leu Phe Pro Arg Leu Cys Pro Val
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<213> 智人
<400> 619
His Ser Thr Asn Gly Val Thr Arg Ile Tyr
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<213> 智人
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Val Leu Ala Gly Gly Phe Phe Leu Leu
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Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe
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Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe
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<400> 623
Leu Lys Leu Ser Gly Val Val Arg Leu
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<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> D-氨基酸
<400> 624
Pro Leu Pro Pro Ala Arg Asn Gly Gly Leu Gly
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<213> 智人
<400> 625
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<213> 智人
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<213> 智人
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Ile Met Phe Asp Val Thr Ser Arg Val
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<213> 智人
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His Pro Leu Val Phe His Thr Asn Arg
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<213> 智人
<400> 629
Ile Ile Met Phe Asp Val Thr Ser Arg
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<212> PRT
<213> 智人
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Leu Ala Ala Leu Pro His Ser Cys Leu
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 631
Gly Leu Ala Ser Phe Lys Ser Phe Leu Lys
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<213> 智人
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Met Ala Gln Lys Arg Ile His Ala Leu
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 633
Lys Asn Lys Arg Ile Leu Met Glu His
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<213> 智人
<400> 634
Arg Ala Gly Leu Gln Val Arg Lys Asn Lys
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<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> VARIANT
<222> (10)..(10)
<223> /替换=" "
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(10)
<223> /记录=“序列中给出的变体残基相对于变体位置的注释中的那些没有偏爱”
<400> 635
Ala Leu Trp Pro Trp Leu Leu Met Ala Thr
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Leu Pro Arg Trp Pro Pro Pro Gln Leu
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<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 639
Ala Tyr Asp Phe Leu Tyr Asn Tyr Leu
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<212> PRT
<213> 智人
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<213> 智人
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<212> PRT
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<213> 智人
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<213> 智人
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Ser Ala Trp Ile Ser Lys Pro Pro Gly Val
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<212> PRT
<213> 智人
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Met Tyr Ile Phe Pro Val His Trp Gln Phe
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
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Met Ile Ala Val Phe Leu Pro Ile Val
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<213> 智人
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
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1 5
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<213> 智人
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<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
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Gln Met Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 654
Leu Met Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu
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<213> 智人
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Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu
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<213> 智人
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Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<211> 15
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<213> 智人
<400> 664
Leu Thr Asp Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 665
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<213> 智人
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Phe Leu Tyr Asp Asp Asn Gln Arg Val
1 5
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<213> 智人
<400> 667
Tyr Gln Leu Cys Leu Thr Asn Ile Phe
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<211> 10
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<213> 智人
<400> 668
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<211> 9
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<213> 智人
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<211> 9
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<213> 智人
<400> 671
Ala Ser Leu Asp Ser Asp Pro Trp Val
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<211> 9
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<213> 智人
<400> 672
Asp Leu Leu Ser His Ala Phe Phe Ala
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 673
Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 674
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 675
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1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 676
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 677
Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
1 5
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 678
Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe
1 5
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 679
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<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 680
Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His
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<213> 智人
<400> 681
Leu Leu Ser Gly Gln Pro Ala Ser Ala
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<213> 智人
<400> 682
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<400> 683
Lys Leu Pro Asn Ser Val Leu Gly Arg
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<213> 智人
<400> 684
Arg Val Ala Ala Leu Ala Arg Asp Ala Pro
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 685
Leu Leu Val Leu Leu Tyr Ser Lys Leu
1 5
<210> 686
<211> 9
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<400> 686
Tyr Leu Met Asp Thr Ser Gly Lys Val
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<211> 9
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<213> 智人
<400> 687
Val Pro Tyr Gly Ser Phe Lys His Val
1 5
<210> 688
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 688
Arg Leu Tyr Pro Trp Gly Val Val Glu Val
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20
<210> 691
<211> 9
<212> PRT
<213> 埃巴病毒
<400> 691
Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val
1 5
<210> 692
<211> 9
<212> PRT
<213> 埃巴病毒
<400> 692
Gly Leu Cys Thr Leu Val Ala Met Leu
1 5
<210> 693
<211> 9
<212> PRT
<213> 埃巴病毒
<400> 693
Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu
1 5
<210> 694
<211> 9
<212> PRT
<213> 埃巴病毒
<400> 694
Tyr Val Leu Asp His Leu Ile Val Val
1 5
<210> 695
<211> 9
<212> PRT
<213> 埃巴病毒
<400> 695
Arg Leu Arg Ala Glu Ala Gln Val Lys
1 5
<210> 696
<211> 10
<212> PRT
<213> 埃巴病毒
<400> 696
Ala Val Phe Asp Arg Lys Ser Asp Ala Lys
1 5 10
<210> 697
<211> 9
<212> PRT
<213> 埃巴病毒
<400> 697
Arg Pro Pro Ile Phe Ile Arg Leu Leu
1 5
<210> 698
<211> 9
<212> PRT
<213> 埃巴病毒
<400> 698
Val Leu Gln Trp Ala Ser Leu Ala Val
1 5
<210> 699
<211> 9
<212> PRT
<213> 埃巴病毒
<400> 699
Phe Met Val Phe Leu Gln Thr His Ile
1 5
<210> 700
<211> 10
<212> PRT
<213> 埃巴病毒
<400> 700
Phe Leu Gln Thr His Ile Phe Ala Glu Val
1 5 10
<210> 701
<211> 10
<212> PRT
<213> 埃巴病毒
<400> 701
Ser Ile Val Cys Tyr Phe Met Val Phe Leu
1 5 10
<210> 702
<211> 11
<212> PRT
<213> 巨细胞病毒
<400> 702
Tyr Ser Glu His Pro Thr Phe Thr Ser Gln Tyr
1 5 10
<210> 703
<211> 9
<212> PRT
<213> 巨细胞病毒
<400> 703
Val Thr Glu His Asp Thr Leu Leu Tyr
1 5
<210> 704
<211> 9
<212> PRT
<213> 巨细胞病毒
<400> 704
Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val
1 5
<210> 705
<211> 9
<212> PRT
<213> 巨细胞病毒
<400> 705
Val Leu Glu Glu Thr Ser Val Met Leu
1 5
<210> 706
<211> 11
<212> PRT
<213> 巨细胞病毒
<400> 706
Thr Thr Val Tyr Pro Pro Ser Ser Thr Ala Lys
1 5 10
<210> 707
<211> 9
<212> PRT
<213> 巨细胞病毒
<400> 707
Gly Pro Ile Ser Gly His Val Leu Lys
1 5
<210> 708
<211> 10
<212> PRT
<213> 巨细胞病毒
<400> 708
Thr Pro Arg Val Thr Gly Gly Gly Ala Met
1 5 10
<210> 709
<211> 10
<212> PRT
<213> 巨细胞病毒
<400> 709
Arg Pro His Glu Arg Asn Gly Phe Thr Val
1 5 10
<210> 710
<211> 9
<212> PRT
<213> 流感病毒
<400> 710
Val Ser Asp Gly Gly Pro Asn Leu Tyr
1 5
<210> 711
<211> 9
<212> PRT
<213> 流感病毒
<400> 711
Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu
1 5
<210> 712
<211> 10
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 712
Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val
1 5 10
<210> 713
<211> 9
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 713
Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr
1 5
<210> 714
<211> 10
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 714
Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr
1 5 10
<210> 715
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 715
Gly Leu Tyr Asp Gly Met Glu His Leu Ile
1 5 10
<210> 716
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人
<400> 716
Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly
1 5 10 15
His Leu Tyr
<210> 717
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
肽”
<400> 717
Phe Glu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ser
1 5 10
<210> 718
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
肽”
<400> 718
Leu Gln Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ser
1 5 10
<210> 719
<211> 7
<212> PRT
<213> 人疱疹病毒6
<400> 719
Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser
1 5
<210> 720
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 720
Arg Leu Phe Pro Asp Phe Phe Thr Arg Val
1 5 10
<210> 721
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
肽”
<400> 721
Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
1 5
<210> 722
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
肽”
<400> 722
Lys Val Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu
1 5
<210> 723
<211> 597
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
多肽"
<400> 723
Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser
1 5 10 15
Gly Leu Glu Ala Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg
35 40 45
Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys
50 55 60
Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile
65 70 75 80
Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His
85 90 95
Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr
100 105 110
Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn
115 120 125
His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val
165 170 175
Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val
180 185 190
Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg
195 200 205
Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp
210 215 220
Asp Gly Glu Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val
225 230 235 240
Asp Leu Gly Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser
245 250 255
His Thr Val Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg
260 265 270
Phe Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile
275 280 285
Ala Leu Lys Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala
290 295 300
Gln Thr Thr Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu
305 310 315 320
Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu
325 330 335
Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His
340 345 350
Met Thr His His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp
355 360 365
Ala Leu Ser Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp
370 375 380
Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala
385 390 395 400
Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly
405 410 415
Gln Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys
420 425 430
Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro Thr Ile Pro Ile
435 440 445
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Glu Asp Gly Ser Gly Ser Gly Ser
450 455 460
Gly Ser Leu Ser Thr Thr Glu Val Ala Met His Thr Ser Thr Ser Ser
465 470 475 480
Ser Val Thr Lys Ser Tyr Ile Ser Ser Gln Thr Asn Asp Thr His Lys
485 490 495
Arg Asp Thr Tyr Ala Ala Thr Pro Arg Ala His Glu Val Ser Glu Ile
500 505 510
Ser Val Arg Thr Val Tyr Pro Pro Glu Glu Glu Thr Gly Glu Arg Val
515 520 525
Gln Leu Ala His His Phe Ser Glu Pro Glu Ile Thr Leu Ile Ile Phe
530 535 540
Gly Val Met Ala Gly Val Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr Gly
545 550 555 560
Ile Arg Arg Leu Ile Lys Lys Ser Pro Ser Asp Val Lys Pro Leu Pro
565 570 575
Ser Pro Asp Thr Asp Val Pro Leu Ser Ser Val Glu Ile Glu Asn Pro
580 585 590
Glu Thr Ser Asp Gln
595
<210> 724
<211> 597
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
多肽"
<400> 724
Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser
1 5 10 15
Gly Leu Glu Ala Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg
35 40 45
Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys
50 55 60
Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile
65 70 75 80
Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His
85 90 95
Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr
100 105 110
Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn
115 120 125
His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val
165 170 175
Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val
180 185 190
Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg
195 200 205
Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp
210 215 220
Asp Gly Glu Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val
225 230 235 240
Asp Leu Gly Thr Leu Arg Gly Ala Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser
245 250 255
His Thr Val Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg
260 265 270
Phe Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile
275 280 285
Ala Leu Lys Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala
290 295 300
Gln Thr Thr Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu
305 310 315 320
Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu
325 330 335
Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His
340 345 350
Met Thr His His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp
355 360 365
Ala Leu Ser Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp
370 375 380
Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala
385 390 395 400
Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly
405 410 415
Gln Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys
420 425 430
Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro Thr Ile Pro Ile
435 440 445
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Glu Asp Gly Ser Gly Ser Gly Ser
450 455 460
Gly Ser Leu Ser Thr Thr Glu Val Ala Met His Thr Ser Thr Ser Ser
465 470 475 480
Ser Val Thr Lys Ser Tyr Ile Ser Ser Gln Thr Asn Asp Thr His Lys
485 490 495
Arg Asp Thr Tyr Ala Ala Thr Pro Arg Ala His Glu Val Ser Glu Ile
500 505 510
Ser Val Arg Thr Val Tyr Pro Pro Glu Glu Glu Thr Gly Glu Arg Val
515 520 525
Gln Leu Ala His His Phe Ser Glu Pro Glu Ile Thr Leu Ile Ile Phe
530 535 540
Gly Val Met Ala Gly Val Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr Gly
545 550 555 560
Ile Arg Arg Leu Ile Lys Lys Ser Pro Ser Asp Val Lys Pro Leu Pro
565 570 575
Ser Pro Asp Thr Asp Val Pro Leu Ser Ser Val Glu Ile Glu Asn Pro
580 585 590
Glu Thr Ser Asp Gln
595
<210> 725
<211> 597
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
多肽"
<400> 725
Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser
1 5 10 15
Gly Leu Glu Ala Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Gly Cys
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg
35 40 45
Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys
50 55 60
Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile
65 70 75 80
Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His
85 90 95
Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr
100 105 110
Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn
115 120 125
His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val
165 170 175
Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val
180 185 190
Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg
195 200 205
Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp
210 215 220
Asp Gly Glu Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val
225 230 235 240
Asp Leu Gly Thr Leu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser
245 250 255
His Thr Val Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg
260 265 270
Phe Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile
275 280 285
Ala Leu Lys Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala
290 295 300
Gln Thr Thr Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu
305 310 315 320
Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu
325 330 335
Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His
340 345 350
Met Thr His His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp
355 360 365
Ala Leu Ser Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp
370 375 380
Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala
385 390 395 400
Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly
405 410 415
Gln Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys
420 425 430
Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro Thr Ile Pro Ile
435 440 445
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Glu Asp Gly Ser Gly Ser Gly Ser
450 455 460
Gly Ser Leu Ser Thr Thr Glu Val Ala Met His Thr Ser Thr Ser Ser
465 470 475 480
Ser Val Thr Lys Ser Tyr Ile Ser Ser Gln Thr Asn Asp Thr His Lys
485 490 495
Arg Asp Thr Tyr Ala Ala Thr Pro Arg Ala His Glu Val Ser Glu Ile
500 505 510
Ser Val Arg Thr Val Tyr Pro Pro Glu Glu Glu Thr Gly Glu Arg Val
515 520 525
Gln Leu Ala His His Phe Ser Glu Pro Glu Ile Thr Leu Ile Ile Phe
530 535 540
Gly Val Met Ala Gly Val Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr Gly
545 550 555 560
Ile Arg Arg Leu Ile Lys Lys Ser Pro Ser Asp Val Lys Pro Leu Pro
565 570 575
Ser Pro Asp Thr Asp Val Pro Leu Ser Ser Val Glu Ile Glu Asn Pro
580 585 590
Glu Thr Ser Asp Gln
595
<210> 726
<211> 596
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
多肽"
<400> 726
Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser
1 5 10 15
Gly Leu Glu Ala Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr
35 40 45
Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser
50 55 60
Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu
65 70 75 80
Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser
85 90 95
Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr
100 105 110
Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His
115 120 125
Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser
165 170 175
Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp
180 185 190
Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met
195 200 205
Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp
210 215 220
Gly Glu Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp
225 230 235 240
Leu Gly Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His
245 250 255
Thr Val Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe
260 265 270
Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala
275 280 285
Leu Lys Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln
290 295 300
Thr Thr Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg
305 310 315 320
Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met
340 345 350
Thr His His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala
355 360 365
Leu Ser Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly
370 375 380
Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly
385 390 395 400
Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln
405 410 415
Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro
420 425 430
Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro Thr Ile Pro Ile Gly
435 440 445
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Glu Asp Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
450 455 460
Ser Leu Ser Thr Thr Glu Val Ala Met His Thr Ser Thr Ser Ser Ser
465 470 475 480
Val Thr Lys Ser Tyr Ile Ser Ser Gln Thr Asn Asp Thr His Lys Arg
485 490 495
Asp Thr Tyr Ala Ala Thr Pro Arg Ala His Glu Val Ser Glu Ile Ser
500 505 510
Val Arg Thr Val Tyr Pro Pro Glu Glu Glu Thr Gly Glu Arg Val Gln
515 520 525
Leu Ala His His Phe Ser Glu Pro Glu Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly
530 535 540
Val Met Ala Gly Val Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr Gly Ile
545 550 555 560
Arg Arg Leu Ile Lys Lys Ser Pro Ser Asp Val Lys Pro Leu Pro Ser
565 570 575
Pro Asp Thr Asp Val Pro Leu Ser Ser Val Glu Ile Glu Asn Pro Glu
580 585 590
Thr Ser Asp Gln
595
<210> 727
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
多肽"
<400> 727
Met Tyr Gly Lys Ile Ile Phe Val Leu Leu Leu Ser Ala Ile Val Ser
1 5 10 15
Ile Ser Ala Leu Ser Thr Thr Glu Val Ala Met His Thr Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Ser Val Thr Lys Ser Tyr Ile Ser Ser Gln Thr Asn Asp Thr His
35 40 45
Lys Arg Asp Thr Tyr Ala Ala Thr Pro Arg Ala His Glu Val Ser Glu
50 55 60
Ile Ser Val Arg Thr Val Tyr Pro Pro Glu Glu Glu Thr Gly Glu Arg
65 70 75 80
Val Gln Leu Ala His His Phe Ser Glu Pro Glu Ile Thr Leu Ile Ile
85 90 95
Phe Gly Val Met Ala Gly Val Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr
100 105 110
Gly Ile Arg Arg Leu Ile Lys Lys Ser Pro Ser Asp Val Lys Pro Leu
115 120 125
Pro Ser Pro Asp Thr Asp Val Pro Leu Ser Ser Val Glu Ile Glu Asn
130 135 140
Pro Glu Thr Ser Asp Gln
145 150
<210> 728
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
多肽"
<400> 728
Leu Ser Thr Thr Glu Val Ala Met His Thr Ser Thr Ser Ser Ser Val
1 5 10 15
Thr Lys Ser Tyr Ile Ser Ser Gln Thr Asn Asp Thr His Lys Arg Asp
20 25 30
Thr Tyr Ala Ala Thr Pro Arg Ala His Glu Val Ser Glu Ile Ser Val
35 40 45
Arg Thr Val Tyr Pro Pro Glu Glu Glu Thr Gly Glu Arg Val Gln Leu
50 55 60
Ala His His Phe Ser Glu Pro Glu Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly Val
65 70 75 80
Met Ala Gly Val Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr Gly Ile Arg
85 90 95
Arg Leu Ile Lys Lys Ser Pro Ser Asp Val Lys Pro Leu Pro Ser Pro
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Ser Asp Gln
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
多肽"
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Ser Arg Asp Gly Val Ser Leu Gly Ala Val Ser Ser Thr Glu Glu Ala
20 25 30
Ser Arg Cys Arg Arg Ile Ser Gln Arg Leu Cys Thr Gly Lys Leu Gly
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Ile Ala Met Lys Val Leu Gly Gly Val Ala Leu Phe Trp Ile Ile Phe
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Ile Leu Gly Tyr Leu Thr Gly Tyr Tyr Val His Lys Cys Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
肽”
<400> 730
Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser
1 5 10 15
Gly Leu Glu Ala
20
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
肽”
<400> 731
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1 5 10 15
Ile Ser Ala
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
肽”
<400> 732
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
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<213> 人工序列
<220>
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肽”
<400> 733
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
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<220>
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<223> /记录=“人工序列描述：合成
肽”
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Gly Ser
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<220>
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肽”
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<220>
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<220>
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肽”
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
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<220>
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<223> /记录=“人工序列描述：合成
肽”
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Ser Gly Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Pro Ala
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<211> 24
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<213> 人工序列
<220>
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<223> /记录=“人工序列描述：合成
肽”
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
多肽"
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Thr Val Pro Ile Val Gly Ile Val Ala Gly Leu Ala Val Leu Ala Val
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Val Thr Ser Pro Leu Thr Val Glu Trp Arg Ala Arg Ser Glu Ser Ala
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Gln Ser Lys Met Leu Ser Gly Val Gly Gly Phe Val Leu Gly Leu Leu
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Phe Leu Gly Ala Gly Leu Phe Ile Tyr Phe Arg Asn Gln Lys Gly His
245 250 255
Ser Gly Leu Gln Pro Arg Gly Phe Leu Ser
260 265
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<213> 智人
<400> 806
Met Ile Leu Asn Lys Ala Leu Met Leu Gly Ala Leu Ala Leu Thr Thr
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<213> 智人
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<213> 智人
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20 25 30
Arg Asp Ser Pro Glu Asp Phe Val Tyr Gln Phe Lys Gly Met Cys Tyr
35 40 45
Phe Thr Asn Gly Thr Glu Arg Val Arg Leu Val Thr Arg Tyr Ile Tyr
50 55 60
Asn Arg Glu Glu Tyr Ala Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Val Tyr Arg
65 70 75 80
Ala Val Thr Pro Leu Gly Pro Pro Asp Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln
85 90 95
Lys Glu Val Leu Glu Arg Thr Arg Ala Glu Leu Asp Thr Val Cys Arg
100 105 110
His Asn Tyr Gln Leu Glu Leu Arg Thr Thr Leu Gln Arg Arg Val Glu
115 120 125
Pro Thr Val Thr Ile Ser Pro Ser Arg Thr Glu Ala Leu Asn His His
130 135 140
Asn Leu Leu Val Cys Ser Val Thr Asp Phe Tyr Pro Ala Gln Ile Lys
145 150 155 160
Val Arg Trp Phe Arg Asn Asp Gln Glu Glu Thr Thr Gly Val Val Ser
165 170 175
Thr Pro Leu Ile Arg Asn Gly Asp Trp Thr Phe Gln Ile Leu Val Met
180 185 190
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His Pro Ser Leu Gln Asn Pro Ile Ile Val Glu Trp Arg Ala Gln Ser
210 215 220
Glu Ser Ala Gln Ser Lys Met Leu Ser Gly Ile Gly Gly Phe Val Leu
225 230 235 240
Gly Leu Ile Phe Leu Gly Leu Gly Leu Ile Ile His His Arg Ser Gln
245 250 255
Lys Gly Leu Leu His
260
<210> 821
<211> 261
<212> PRT
<213> 智人
<400> 821
Met Ser Trp Lys Lys Ala Leu Arg Ile Pro Gly Asp Leu Arg Val Ala
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Met Leu Ala Met Leu Ser Ser Leu Leu Ala Glu Gly
20 25 30
Arg Asp Ser Pro Glu Asp Phe Val Tyr Gln Phe Lys Gly Met Cys Tyr
35 40 45
Phe Thr Asn Gly Thr Glu Arg Val Arg Leu Val Thr Arg His Ile Tyr
50 55 60
Asn Arg Glu Glu Tyr Ala Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Val Tyr Arg
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Thr Pro Leu Ile Arg Asn Gly Asp Trp Thr Phe Gln Ile Leu Val Met
180 185 190
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195 200 205
His Pro Ser Leu Gln Ser Pro Ile Thr Val Glu Trp Arg Ala Gln Ser
210 215 220
Glu Ser Ala Gln Ser Lys Met Leu Ser Gly Val Gly Gly Phe Val Leu
225 230 235 240
Gly Leu Ile Phe Leu Gly Leu Gly Leu Ile Ile Arg Gln Arg Ser Gln
245 250 255
Lys Gly Leu Leu His
260
<210> 822
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 822
Met Ser Trp Lys Lys Ser Leu Arg Ile Pro Gly Asp Leu Arg Val Ala
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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210 215 220
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225 230 235 240
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<211> 261
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<213> 智人
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Gly Leu Ile Phe Leu Gly Leu Gly Leu Ile Ile His His Arg Ser Gln
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260
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<213> 智人
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260
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
<400> 834
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His Val Thr Asp Phe Tyr Pro Gly Ser Ile Gln Val Arg Trp Phe Leu
145 150 155 160
Asn Gly Gln Glu Glu Thr Ala Gly Val Val Ser Thr Asn Leu Ile Arg
165 170 175
Asn Gly Asp Trp Thr Phe Gln Ile Leu Val Met Leu Glu Met Thr Pro
180 185 190
Gln Gln Gly Asp Val Tyr Ile Cys Gln Val Glu His Thr Ser Leu Asp
195 200 205
Ser Pro Val Thr Val Glu Trp Lys Ala Gln Ser Asp Ser Ala Arg Ser
210 215 220
Lys Thr Leu Thr Gly Ala Gly Gly Phe Val Leu Gly Leu Ile Ile Cys
225 230 235 240
Gly Val Gly Ile Phe Met His Arg Arg Ser Lys Lys Val Gln Arg Gly
245 250 255
Ser Ala
<210> 835
<211> 258
<212> PRT
<213> 智人
<400> 835
Met Met Val Leu Gln Val Ser Ala Ala Pro Arg Thr Val Ala Leu Thr
1 5 10 15
Ala Leu Leu Met Val Leu Leu Thr Ser Val Val Gln Gly Arg Ala Thr
20 25 30
Pro Glu Asn Tyr Val Tyr Gln Leu Arg Gln Glu Cys Tyr Ala Phe Asn
35 40 45
Gly Thr Gln Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Phe
50 55 60
Val Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu Leu
65 70 75 80
Gly Arg Pro Asp Glu Asp Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Leu Leu Glu
85 90 95
Glu Glu Arg Ala Val Pro Asp Arg Met Cys Arg His Asn Tyr Glu Leu
100 105 110
Asp Glu Ala Val Thr Leu Gln Arg Arg Val Gln Pro Lys Val Asn Val
115 120 125
Ser Pro Ser Lys Lys Gly Pro Leu Gln His His Asn Leu Leu Val Cys
130 135 140
His Val Thr Asp Phe Tyr Pro Gly Ser Ile Gln Val Arg Trp Phe Leu
145 150 155 160
Asn Gly Gln Glu Glu Thr Ala Gly Val Val Ser Thr Asn Leu Ile Arg
165 170 175
Asn Gly Asp Trp Thr Phe Gln Ile Leu Val Met Leu Glu Met Thr Pro
180 185 190
Gln Gln Gly Asp Val Tyr Ile Cys Gln Val Glu His Thr Ser Leu Asp
195 200 205
Ser Pro Val Thr Val Glu Trp Lys Ala Gln Ser Asp Ser Ala Arg Ser
210 215 220
Lys Thr Leu Thr Gly Ala Gly Gly Phe Val Leu Gly Leu Ile Ile Cys
225 230 235 240
Gly Val Gly Ile Phe Met His Arg Arg Ser Lys Lys Val Gln Arg Gly
245 250 255
Ser Ala
<210> 836
<211> 258
<212> PRT
<213> 智人
<400> 836
Met Met Val Leu Gln Val Ser Ala Ala Pro Arg Thr Val Ala Leu Thr
1 5 10 15
Ala Leu Leu Met Val Leu Leu Thr Ser Val Val Gln Gly Arg Ala Thr
20 25 30
Pro Glu Asn Tyr Val Tyr Gln Leu Arg Gln Glu Cys Tyr Ala Phe Asn
35 40 45
Gly Thr Gln Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Tyr
50 55 60
Ala Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu Leu
65 70 75 80
Gly Arg Pro Ala Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Ile Leu Glu
85 90 95
Glu Glu Arg Ala Val Pro Asp Arg Ile Cys Arg His Asn Tyr Glu Leu
100 105 110
Asp Glu Ala Val Thr Leu Gln Arg Arg Val Gln Pro Lys Val Asn Val
115 120 125
Ser Pro Ser Lys Lys Gly Pro Leu Gln His His Asn Leu Leu Val Cys
130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Ser Pro Val Thr Val Glu Trp Lys Ala Gln Ser Asp Ser Ala Arg Ser
210 215 220
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225 230 235 240
Gly Val Gly Ile Phe Met His Arg Arg Ser Lys Lys Val Gln Arg Gly
245 250 255
Ser Ala
<210> 837
<211> 258
<212> PRT
<213> 智人
<400> 837
Met Met Val Leu Gln Val Ser Ala Ala Pro Arg Thr Val Ala Leu Thr
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20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
Gly Arg Pro Asp Glu Asp Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Leu Leu Glu
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Glu Lys Arg Ala Val Pro Asp Arg Val Cys Arg His Asn Tyr Glu Leu
100 105 110
Asp Glu Ala Val Thr Leu Gln Arg Arg Val Gln Pro Lys Val Asn Val
115 120 125
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130 135 140
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Asn Gly Gln Glu Glu Thr Ala Gly Val Val Ser Thr Asn Leu Ile Arg
165 170 175
Asn Gly Asp Trp Thr Phe Gln Ile Leu Val Met Leu Glu Met Thr Pro
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Gln Gln Gly Asp Val Tyr Ile Cys Gln Val Glu His Thr Ser Leu Asp
195 200 205
Ser Pro Val Thr Val Glu Trp Lys Ala Gln Ser Asp Ser Ala Arg Ser
210 215 220
Lys Thr Leu Thr Gly Ala Gly Gly Phe Val Leu Gly Leu Ile Ile Cys
225 230 235 240
Gly Val Gly Ile Phe Met His Arg Arg Ser Lys Lys Val Gln Arg Gly
245 250 255
Ser Ala
<210> 838
<211> 258
<212> PRT
<213> 智人
<400> 838
Met Met Val Leu Gln Val Ser Ala Ala Pro Arg Thr Val Ala Leu Thr
1 5 10 15
Ala Leu Leu Met Val Leu Leu Thr Ser Val Val Gln Gly Arg Ala Thr
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Pro Glu Asn Tyr Val His Gln Leu Arg Gln Glu Cys Tyr Ala Phe Asn
35 40 45
Gly Thr Gln Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Phe
50 55 60
Val Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu Leu
65 70 75 80
Gly Arg Pro Asp Glu Asp Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Ile Leu Glu
85 90 95
Glu Glu Arg Ala Val Pro Asp Arg Met Cys Arg His Asn Tyr Glu Leu
100 105 110
Asp Glu Ala Val Thr Leu Gln Arg Arg Val Gln Pro Arg Val Asn Val
115 120 125
Ser Pro Ser Lys Lys Gly Pro Leu Gln His His Asn Leu Leu Val Cys
130 135 140
His Val Thr Asp Phe Tyr Pro Gly Ser Ile Gln Val Arg Trp Phe Leu
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Asn Gly Gln Glu Glu Thr Ala Gly Val Val Ser Thr Asn Leu Ile Arg
165 170 175
Asn Gly Asp Trp Thr Phe Gln Ile Leu Val Met Leu Glu Met Thr Pro
180 185 190
Gln Gln Gly Asp Val Tyr Thr Cys Gln Val Glu His Thr Ser Leu Asp
195 200 205
Ser Pro Val Thr Val Glu Trp Lys Ala Gln Ser Asp Ser Ala Arg Ser
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Lys Thr Leu Thr Gly Ala Gly Gly Phe Val Leu Gly Leu Ile Ile Cys
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Gly Val Gly Ile Phe Met His Arg Arg Ser Lys Lys Val Gln Arg Gly
245 250 255
Ser Ala
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<211> 99
<212> PRT
<213> 智人
<400> 839
Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu
1 5 10 15
Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro
20 25 30
Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys
35 40 45
Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp
85 90 95
Arg Asp Met
<210> 840
<211> 284
<212> PRT
<213> 智人
<400> 840
Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly
1 5 10 15
Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln
20 25 30
Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg
35 40 45
Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr
50 55 60
Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr
65 70 75 80
Leu Arg Gly Ala Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln
85 90 95
Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly
100 105 110
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Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys
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His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu
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165 170 175
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Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg
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Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu
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Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro Thr Ile Pro Ile
275 280
<210> 841
<211> 284
<212> PRT
<213> 智人
<400> 841
Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly
1 5 10 15
Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln
20 25 30
Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys
130 135 140
His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu
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Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys
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Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu
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Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro Thr Ile Pro Ile
275 280
<210> 842
<211> 284
<212> PRT
<213> 智人
<400> 842
Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly
1 5 10 15
Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln
20 25 30
Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg
35 40 45
Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr
50 55 60
Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr
65 70 75 80
Leu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln
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Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly
100 105 110
Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu
115 120 125
Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys
130 135 140
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Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys
165 170 175
Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His
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Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe
195 200 205
Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln
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Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr
225 230 235 240
Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg
245 250 255
Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu
260 265 270
Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro Thr Ile Pro Ile
275 280
<210> 843
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
多肽"
<400> 843
Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser
1 5 10 15
Gly Leu Glu Ala Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr
35 40 45
Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser
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Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr
100 105 110
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115 120 125
Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser
165 170 175
Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp
180 185 190
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195 200 205
Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp
210 215 220
Gly Glu Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp
225 230 235 240
Leu Gly Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His
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Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala
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Leu Lys Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln
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325 330 335
Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met
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Thr His His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala
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Leu Ser Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly
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Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly
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Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro
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Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro Thr Ile Pro Ile Gly
435 440 445
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Glu Asp Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
450 455 460
Ser
465
<210> 844
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
多肽"
<400> 844
Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser
1 5 10 15
Gly Leu Glu Ala Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr
35 40 45
Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser
50 55 60
Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu
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Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser
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Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr
100 105 110
Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His
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Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser
165 170 175
Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp
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Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met
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Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp
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Gly Glu Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp
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Leu Gly Thr Leu Arg Gly Ala Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His
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Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala
275 280 285
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305 310 315 320
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Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met
340 345 350
Thr His His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala
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370 375 380
Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly
385 390 395 400
Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln
405 410 415
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435 440 445
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Glu Asp Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
450 455 460
Ser
465
<210> 845
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
多肽"
<400> 845
Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser
1 5 10 15
Gly Leu Glu Ala Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Gly Cys Gly
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr
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Gly Gly Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser
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Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp
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Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met
195 200 205
Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp
210 215 220
Gly Glu Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp
225 230 235 240
Leu Gly Thr Leu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His
245 250 255
Thr Val Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe
260 265 270
Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala
275 280 285
Leu Lys Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln
290 295 300
Thr Thr Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg
305 310 315 320
Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met
340 345 350
Thr His His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala
355 360 365
Leu Ser Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly
370 375 380
Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly
385 390 395 400
Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln
405 410 415
Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro
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435 440 445
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Glu Asp Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
450 455 460
Ser
465
<210> 846
<211> 596
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
多肽"
<400> 846
Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser
1 5 10 15
Gly Leu Glu Ala Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Gly Gly Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser
165 170 175
Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp
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195 200 205
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225 230 235 240
Leu Gly Thr Leu Arg Gly Ala Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His
245 250 255
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260 265 270
Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala
275 280 285
Leu Lys Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln
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405 410 415
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420 425 430
Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro Thr Ile Pro Ile Gly
435 440 445
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Glu Asp Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
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565 570 575
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Thr Ser Asp Gln
595
<210> 847
<211> 596
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
多肽"
<400> 847
Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser
1 5 10 15
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275 280 285
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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Thr Ser Asp Gln
595
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<211> 998
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
多肽"
<400> 848
Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser
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Leu Gly Thr Leu Arg Gly Ala Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His
245 250 255
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Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala
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<211> 616
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
多肽"
<400> 849
Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser
1 5 10 15
Gly Leu Glu Ala Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Gly Gly Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr
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Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Glu Asp Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
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595 600 605
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610 615
<210> 850
<211> 382
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
多肽"
<400> 850
Pro Met Tyr Gly Lys Ile Ile Phe Val Leu Leu Leu Ser Glu Ile Val
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Ser Ile Ser Ala Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser
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Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser
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Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser
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Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Pro Glu Asp Glu Pro Gly
225 230 235 240
Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Ser Thr Thr Glu
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Val Ala Met His Thr Ser Thr Ser Ser Ser Val Thr Lys Ser Tyr Ile
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Ser Ser Gln Thr Asn Asp Thr His Lys Arg Asp Thr Tyr Ala Ala Thr
275 280 285
Pro Arg Ala His Glu Val Ser Glu Ile Ser Val Arg Thr Val Tyr Pro
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Pro Glu Glu Glu Thr Gly Glu Arg Val Gln Leu Ala His His Phe Ser
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Glu Pro Glu Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly Val Met Ala Gly Val Ile
325 330 335
Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr Gly Ile Arg Arg Leu Ile Lys Lys
340 345 350
Ser Pro Ser Asp Val Lys Pro Leu Pro Ser Pro Asp Thr Asp Val Pro
355 360 365
Leu Ser Ser Val Glu Ile Glu Asn Pro Glu Thr Ser Asp Gln
370 375 380
<210> 851
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
多肽"
<400> 851
Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala
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Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala
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Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp
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Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe
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Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val
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Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala
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Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala
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Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr
180 185 190
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195 200 205
<210> 852
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
肽”
<400> 852
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Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
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<210> 853
<211> 21
<212> PRT
<213> Thosea asigna virus
<400> 853
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20
<210> 854
<211> 998
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
多肽"
<400> 854
Met Tyr Gly Lys Ile Ile Phe Val Leu Leu Leu Ser Glu Ile Val Ser
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Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser
145 150 155 160
Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu
165 170 175
Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala
180 185 190
Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe
195 200 205
Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Pro Glu Asp Glu Pro Gly Ser
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Ser Thr Thr Glu Val
245 250 255
Ala Met His Thr Ser Thr Ser Ser Ser Val Thr Lys Ser Tyr Ile Ser
260 265 270
Ser Gln Thr Asn Asp Thr His Lys Arg Asp Thr Tyr Ala Ala Thr Pro
275 280 285
Arg Ala His Glu Val Ser Glu Ile Ser Val Arg Thr Val Tyr Pro Pro
290 295 300
Glu Glu Glu Thr Gly Glu Arg Val Gln Leu Ala His His Phe Ser Glu
305 310 315 320
Pro Glu Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly Val Met Ala Gly Val Ile Gly
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355 360 365
Ser Ser Val Glu Ile Glu Asn Pro Glu Thr Ser Asp Gln Gly Ser Gly
370 375 380
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385 390 395 400
Gly Pro Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser
405 410 415
Leu Ser Gly Leu Glu Ala Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Gly
420 425 430
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln
435 440 445
Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly
450 455 460
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465 470 475 480
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Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp
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<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
多肽"
<400> 855
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<223> /记录=“人工序列描述：合成
多肽"
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多肽"
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260 265 270
Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala
275 280 285
Leu Lys Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln
290 295 300
Thr Thr Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg
305 310 315 320
Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met
340 345 350
Thr His His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala
355 360 365
Leu Ser Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly
370 375 380
Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly
385 390 395 400
Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln
405 410 415
Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro
420 425 430
Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro Thr Ile Pro Ile Gly
435 440 445
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Glu Asp Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
450 455 460
Ser Leu Ser Thr Thr Glu Val Ala Met His Thr Ser Thr Ser Ser Ser
465 470 475 480
Val Thr Lys Ser Tyr Ile Ser Ser Gln Thr Asn Asp Thr His Lys Arg
485 490 495
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500 505 510
Val Arg Thr Val Tyr Pro Pro Glu Glu Glu Thr Gly Glu Arg Val Gln
515 520 525
Leu Ala His His Phe Ser Glu Pro Glu Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly
530 535 540
Val Met Ala Gly Val Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr Gly Ile
545 550 555 560
Arg Arg Leu Ile Lys Lys Ser Pro Ser Asp Val Lys Pro Leu Pro Ser
565 570 575
Pro Asp Thr Asp Val Pro Leu Ser Ser Val Glu Ile Glu Asn Pro Glu
580 585 590
Thr Ser Asp Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
595 600 605
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Met Gln Pro Gln
610 615 620
Glu Ser His Val His Tyr Ser Arg Trp Glu Asp Gly Ser Arg Asp Gly
625 630 635 640
Val Ser Leu Gly Ala Val Ser Ser Thr Glu Glu Ala Ser Arg Cys Arg
645 650 655
Arg Ile Ser Gln Arg Leu Cys Thr Gly Lys Leu Gly Ile Ala Met Lys
660 665 670
Val Leu Gly Gly Val Ala Leu Phe Trp Ile Ile Phe Ile Leu Gly Tyr
675 680 685
Leu Thr Gly Tyr Tyr Val His Lys Cys Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
690 695 700
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp
705 710 715 720
Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met
725 730 735
Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr
740 745 750
Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile
755 760 765
Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly
770 775 780
Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp
785 790 795 800
Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn
805 810 815
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820 825 830
Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys
835 840 845
Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala
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Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr
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Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser
885 890 895
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Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe
945 950 955 960
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Asn Leu Pro
1025 1030 1035
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1040 1045 1050
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Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr
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Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala
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Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser
1220 1225 1230
<210> 861
<211> 306
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
多肽"
<400> 861
Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr
1 5 10 15
Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu
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Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly
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Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly
50 55 60
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Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys
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Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr
115 120 125
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Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly
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Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala
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Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala
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Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro
290 295 300
Cys Ser
305
<210> 862
<211> 197
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
多肽"
<400> 862
Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu
1 5 10 15
His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys
20 25 30
Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp
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Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr
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Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser
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180 185 190
Tyr Leu Asn Ala Ser
195
<210> 863
<211> 1265
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
多肽"
<400> 863
Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser
1 5 10 15
Gly Leu Glu Ala Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr
35 40 45
Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser
50 55 60
Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu
65 70 75 80
Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser
85 90 95
Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr
100 105 110
Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His
115 120 125
Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser
165 170 175
Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp
180 185 190
Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met
195 200 205
Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp
210 215 220
Gly Glu Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp
225 230 235 240
Leu Gly Thr Leu Arg Gly Ala Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His
245 250 255
Thr Val Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe
260 265 270
Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala
275 280 285
Leu Lys Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln
290 295 300
Thr Thr Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg
305 310 315 320
Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met
340 345 350
Thr His His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala
355 360 365
Leu Ser Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly
370 375 380
Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly
385 390 395 400
Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln
405 410 415
Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro
420 425 430
Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro Thr Ile Pro Ile Gly
435 440 445
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Glu Asp Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
450 455 460
Ser Leu Ser Thr Thr Glu Val Ala Met His Thr Ser Thr Ser Ser Ser
465 470 475 480
Val Thr Lys Ser Tyr Ile Ser Ser Gln Thr Asn Asp Thr His Lys Arg
485 490 495
Asp Thr Tyr Ala Ala Thr Pro Arg Ala His Glu Val Ser Glu Ile Ser
500 505 510
Val Arg Thr Val Tyr Pro Pro Glu Glu Glu Thr Gly Glu Arg Val Gln
515 520 525
Leu Ala His His Phe Ser Glu Pro Glu Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly
530 535 540
Val Met Ala Gly Val Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr Gly Ile
545 550 555 560
Arg Arg Leu Ile Lys Lys Ser Pro Ser Asp Val Lys Pro Leu Pro Ser
565 570 575
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580 585 590
Thr Ser Asp Gln Ser Gly Arg Gly Ala Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser
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Gly Ser Gln Lys Lys Pro Arg Tyr Glu Ile Arg Trp Lys Val Val Val
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Ile Ser Ala Ile Leu Ala Leu Val Val Leu Thr Val Ile Ser Leu Ile
625 630 635 640
Ile Leu Ile Met Leu Trp Gly Ser Gly Met Gln Ser Pro Ala Met Gln
645 650 655
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Asp Gly Val Ser Leu Gly Ala Val Ser Ser Thr Glu Glu Ala Ser Arg
675 680 685
Cys Arg Arg Ile Ser Gln Arg Leu Cys Thr Gly Lys Leu Gly Ile Ala
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Met Lys Val Leu Gly Gly Val Ala Leu Phe Trp Ile Ile Phe Ile Leu
705 710 715 720
Gly Tyr Leu Thr Gly Tyr Tyr Val His Lys Cys Lys Gly Gly Gly Gly
725 730 735
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Trp Glu Leu Lys
740 745 750
Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly
755 760 765
Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr
770 775 780
Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu
785 790 795 800
Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His
805 810 815
Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys
820 825 830
Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro
835 840 845
Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg
850 855 860
Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser
865 870 875 880
Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly
885 890 895
Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr
900 905 910
Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu
915 920 925
Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys
930 935 940
Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro
945 950 955 960
Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln
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Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser
980 985 990
Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg
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Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val
1010 1015 1020
Ile Cys Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg
1025 1030 1035
Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser
1040 1045 1050
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1055 1060 1065
Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys
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Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu
1085 1090 1095
Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu
1100 1105 1110
Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val
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Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu
1130 1135 1140
Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala
1145 1150 1155
Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile
1160 1165 1170
Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn
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Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln
1190 1195 1200
Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe
1205 1210 1215
Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp
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Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe
1235 1240 1245
Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn
1250 1255 1260
Ala Ser
1265
<210> 864
<211> 1187
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
多肽"
<400> 864
Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser
1 5 10 15
Gly Leu Glu Ala Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Gly Gly Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr
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Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser
50 55 60
Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu
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Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser
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Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr
100 105 110
Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His
115 120 125
Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser
165 170 175
Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp
180 185 190
Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met
195 200 205
Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp
210 215 220
Gly Glu Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp
225 230 235 240
Leu Gly Thr Leu Arg Gly Ala Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His
245 250 255
Thr Val Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe
260 265 270
Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala
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Leu Lys Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln
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Thr Thr Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg
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Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met
340 345 350
Thr His His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala
355 360 365
Leu Ser Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly
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Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly
385 390 395 400
Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln
405 410 415
Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro
420 425 430
Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro Thr Ile Pro Ile Gly
435 440 445
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Glu Asp Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
450 455 460
Ser Leu Ser Thr Thr Glu Val Ala Met His Thr Ser Thr Ser Ser Ser
465 470 475 480
Val Thr Lys Ser Tyr Ile Ser Ser Gln Thr Asn Asp Thr His Lys Arg
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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Val Met Ala Gly Val Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr Gly Ile
545 550 555 560
Arg Arg Leu Ile Lys Lys Ser Pro Ser Asp Val Lys Pro Leu Pro Ser
565 570 575
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580 585 590
Thr Ser Asp Gln Ser Gly Arg Gly Ala Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser
595 600 605
Gly Ser Gln Lys Lys Pro Arg Tyr Glu Ile Arg Trp Lys Val Val Val
610 615 620
Ile Ser Ala Ile Leu Ala Leu Val Val Leu Thr Val Ile Ser Leu Ile
625 630 635 640
Ile Leu Ile Met Leu Trp Gly Ser Gly Met Gln Ser Pro Ala Gly Gly
645 650 655
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Trp Glu
660 665 670
Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala
675 680 685
Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly
690 695 700
Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys
705 710 715 720
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Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His
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Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys
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His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys
1040 1045 1050
Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg
1055 1060 1065
Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys
1070 1075 1080
Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp
1085 1090 1095
Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu
1100 1105 1110
Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu
1115 1120 1125
Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu
1130 1135 1140
Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys
1145 1150 1155
Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg
1160 1165 1170
Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser
1175 1180 1185
<210> 865
<211> 943
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
多肽"
<400> 865
Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser
1 5 10 15
Gly Leu Glu Ala Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr
35 40 45
Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser
50 55 60
Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu
65 70 75 80
Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser
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Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr
100 105 110
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115 120 125
Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser
165 170 175
Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp
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210 215 220
Gly Glu Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp
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Leu Gly Thr Leu Arg Gly Ala Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His
245 250 255
Thr Val Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe
260 265 270
Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala
275 280 285
Leu Lys Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln
290 295 300
Thr Thr Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg
305 310 315 320
Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met
340 345 350
Thr His His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala
355 360 365
Leu Ser Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly
370 375 380
Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly
385 390 395 400
Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln
405 410 415
Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro
420 425 430
Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro Thr Ile Pro Ile Gly
435 440 445
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Glu Asp Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
450 455 460
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465 470 475 480
Val Thr Lys Ser Tyr Ile Ser Ser Gln Thr Asn Asp Thr His Lys Arg
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
Arg Arg Leu Ile Lys Lys Ser Pro Ser Asp Val Lys Pro Leu Pro Ser
565 570 575
Pro Asp Thr Asp Val Pro Leu Ser Ser Val Glu Ile Glu Asn Pro Glu
580 585 590
Thr Ser Asp Gln Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys
595 600 605
Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Tyr Gly Lys Ile Ile Phe
610 615 620
Val Leu Leu Leu Ser Glu Ile Val Ser Ile Ser Ala Asp Cys Asp Ile
625 630 635 640
Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile
645 650 655
Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn
660 665 670
Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu
675 680 685
Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys
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705 710 715 720
Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys
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740 745 750
Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys
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Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly
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785 790 795 800
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Ser Thr Thr
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Ser Glu Pro Glu Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly Val Met Ala Gly Val
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Lys Ser Pro Ser Asp Val Lys Pro Leu Pro Ser Pro Asp Thr Asp Val
915 920 925
Pro Leu Ser Ser Val Glu Ile Glu Asn Pro Glu Thr Ser Asp Gln
930 935 940
<210> 866
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
多肽"
<400> 866
Pro Met Tyr Gly Lys Ile Ile Phe Val Leu Leu Leu Ser Glu Ile Val
1 5 10 15
Ser Ile Ser Ala Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr
20 25 30
Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys
35 40 45
Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg
50 55 60
His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala
65 70 75 80
Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp
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Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His Gly Gly Ser Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
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195 200 205
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305 310 315 320
Asn Pro Glu Thr Ser Asp Gln
325
<210> 867
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
多肽"
<400> 867
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
1 5 10 15
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
20 25 30
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
35 40 45
Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
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Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu
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Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
130 135 140
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145 150
<210> 868
<211> 1095
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
多肽"
<400> 868
Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser
1 5 10 15
Gly Leu Glu Ala Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr
35 40 45
Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser
50 55 60
Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu
65 70 75 80
Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser
85 90 95
Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr
100 105 110
Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His
115 120 125
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130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser
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195 200 205
Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp
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Gly Glu Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp
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Leu Gly Thr Leu Arg Gly Ala Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His
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Thr Val Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe
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Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala
275 280 285
Leu Lys Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln
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305 310 315 320
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Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met
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435 440 445
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Glu Asp Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
450 455 460
Ser Leu Ser Thr Thr Glu Val Ala Met His Thr Ser Thr Ser Ser Ser
465 470 475 480
Val Thr Lys Ser Tyr Ile Ser Ser Gln Thr Asn Asp Thr His Lys Arg
485 490 495
Asp Thr Tyr Ala Ala Thr Pro Arg Ala His Glu Val Ser Glu Ile Ser
500 505 510
Val Arg Thr Val Tyr Pro Pro Glu Glu Glu Thr Gly Glu Arg Val Gln
515 520 525
Leu Ala His His Phe Ser Glu Pro Glu Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly
530 535 540
Val Met Ala Gly Val Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr Gly Ile
545 550 555 560
Arg Arg Leu Ile Lys Lys Ser Pro Ser Asp Val Lys Pro Leu Pro Ser
565 570 575
Pro Asp Thr Asp Val Pro Leu Ser Ser Val Glu Ile Glu Asn Pro Glu
580 585 590
Thr Ser Asp Gln Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys
595 600 605
Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Tyr Gly Lys Ile Ile Phe
610 615 620
Val Leu Leu Leu Ser Glu Ile Val Ser Ile Ser Ala Asn Trp Val Asn
625 630 635 640
Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His
645 650 655
Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys
660 665 670
Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu
675 680 685
Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile
690 695 700
Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly
705 710 715 720
Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu
725 730 735
Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly
740 745 750
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Thr Cys
755 760 765
Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr
770 775 780
Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg
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Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr
805 810 815
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820 825 830
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835 840 845
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850 855 860
Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala Thr Thr Ala Ala
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Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser Pro Ser Thr Gly
885 890 895
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915 920 925
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930 935 940
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
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Gly Gly Gly Ser Leu Ser Thr Thr Glu Val Ala Met His Thr Ser Thr
965 970 975
Ser Ser Ser Val Thr Lys Ser Tyr Ile Ser Ser Gln Thr Asn Asp Thr
980 985 990
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1055 1060 1065
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1070 1075 1080
Ser Val Glu Ile Glu Asn Pro Glu Thr Ser Asp Gln
1085 1090 1095
<210> 869
<211> 479
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
多肽"
<400> 869
Pro Met Tyr Gly Lys Ile Ile Phe Val Leu Leu Leu Ser Glu Ile Val
1 5 10 15
Ser Ile Ser Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile
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Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu
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Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser
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Leu Ser Pro Ser Gly Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn
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Asn Thr Ala Ala Thr Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met
260 265 270
Pro Ser Lys Ser Pro Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu
275 280 285
Ser Ser His Gly Thr Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu
290 295 300
Thr Ala Ser Ala Ser His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His
305 310 315 320
Ser Asp Thr Thr Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser
325 330 335
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Ser Thr Thr
340 345 350
Glu Val Ala Met His Thr Ser Thr Ser Ser Ser Val Thr Lys Ser Tyr
355 360 365
Ile Ser Ser Gln Thr Asn Asp Thr His Lys Arg Asp Thr Tyr Ala Ala
370 375 380
Thr Pro Arg Ala His Glu Val Ser Glu Ile Ser Val Arg Thr Val Tyr
385 390 395 400
Pro Pro Glu Glu Glu Thr Gly Glu Arg Val Gln Leu Ala His His Phe
405 410 415
Ser Glu Pro Glu Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly Val Met Ala Gly Val
420 425 430
Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr Gly Ile Arg Arg Leu Ile Lys
435 440 445
Lys Ser Pro Ser Asp Val Lys Pro Leu Pro Ser Pro Asp Thr Asp Val
450 455 460
Pro Leu Ser Ser Val Glu Ile Glu Asn Pro Glu Thr Ser Asp Gln
465 470 475
<210> 870
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
多肽"
<400> 870
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
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<210> 871
<211> 175
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
多肽"
<400> 871
Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
1 5 10 15
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50 55 60
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65 70 75 80
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<210> 872
<211> 1228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
多肽"
<400> 872
Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser
1 5 10 15
Gly Leu Glu Ala Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr
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100 105 110
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115 120 125
Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser
165 170 175
Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp
180 185 190
Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met
195 200 205
Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp
210 215 220
Gly Glu Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp
225 230 235 240
Leu Gly Thr Leu Arg Gly Ala Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His
245 250 255
Thr Val Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe
260 265 270
Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala
275 280 285
Leu Lys Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln
290 295 300
Thr Thr Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg
305 310 315 320
Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met
340 345 350
Thr His His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala
355 360 365
Leu Ser Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly
370 375 380
Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly
385 390 395 400
Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln
405 410 415
Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro
420 425 430
Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro Thr Ile Pro Ile Gly
435 440 445
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Glu Asp Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
450 455 460
Ser Leu Ser Thr Thr Glu Val Ala Met His Thr Ser Thr Ser Ser Ser
465 470 475 480
Val Thr Lys Ser Tyr Ile Ser Ser Gln Thr Asn Asp Thr His Lys Arg
485 490 495
Asp Thr Tyr Ala Ala Thr Pro Arg Ala His Glu Val Ser Glu Ile Ser
500 505 510
Val Arg Thr Val Tyr Pro Pro Glu Glu Glu Thr Gly Glu Arg Val Gln
515 520 525
Leu Ala His His Phe Ser Glu Pro Glu Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly
530 535 540
Val Met Ala Gly Val Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr Gly Ile
545 550 555 560
Arg Arg Leu Ile Lys Lys Ser Pro Ser Asp Val Lys Pro Leu Pro Ser
565 570 575
Pro Asp Thr Asp Val Pro Leu Ser Ser Val Glu Ile Glu Asn Pro Glu
580 585 590
Thr Ser Asp Gln Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys
595 600 605
Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Gln Pro Gln Glu Ser His
610 615 620
Val His Tyr Ser Arg Trp Glu Asp Gly Ser Arg Asp Gly Val Ser Leu
625 630 635 640
Gly Ala Val Ser Ser Thr Glu Glu Ala Ser Arg Cys Arg Arg Ile Ser
645 650 655
Gln Arg Leu Cys Thr Gly Lys Leu Gly Ile Ala Met Lys Val Leu Gly
660 665 670
Gly Val Ala Leu Phe Trp Ile Ile Phe Ile Leu Gly Tyr Leu Thr Gly
675 680 685
Tyr Tyr Val His Lys Cys Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
690 695 700
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
705 710 715 720
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
725 730 735
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
740 745 750
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
755 760 765
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
770 775 780
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
785 790 795 800
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
805 810 815
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
820 825 830
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
835 840 845
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
850 855 860
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
865 870 875 880
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
885 890 895
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
900 905 910
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
915 920 925
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
930 935 940
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
945 950 955 960
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
965 970 975
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
980 985 990
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
995 1000 1005
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1010 1015 1020
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr
1025 1030 1035
Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu
1040 1045 1050
Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu
1055 1060 1065
Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile
1070 1075 1080
Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu
1085 1090 1095
Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe
1100 1105 1110
Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met
1115 1120 1125
Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr
1130 1135 1140
Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro
1145 1150 1155
Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp
1160 1165 1170
Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln
1175 1180 1185
Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys
1190 1195 1200
Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile
1205 1210 1215
Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser
1220 1225
<210> 873
<211> 612
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
多肽"
<400> 873
Pro Met Gln Pro Gln Glu Ser His Val His Tyr Ser Arg Trp Glu Asp
1 5 10 15
Gly Ser Arg Asp Gly Val Ser Leu Gly Ala Val Ser Ser Thr Glu Glu
20 25 30
Ala Ser Arg Cys Arg Arg Ile Ser Gln Arg Leu Cys Thr Gly Lys Leu
35 40 45
Gly Ile Ala Met Lys Val Leu Gly Gly Val Ala Leu Phe Trp Ile Ile
50 55 60
Phe Ile Leu Gly Tyr Leu Thr Gly Tyr Tyr Val His Lys Cys Lys Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Trp
85 90 95
Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp
100 105 110
Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp
115 120 125
Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly
130 135 140
Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr
145 150 155 160
Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu
165 170 175
His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln
180 185 190
Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr
195 200 205
Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu
210 215 220
Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val
225 230 235 240
Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn
245 250 255
Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro
260 265 270
Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala Val His
275 280 285
Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile
290 295 300
Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn
305 310 315 320
Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr
325 330 335
Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys
340 345 350
Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala
355 360 365
Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp
370 375 380
Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser
385 390 395 400
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg
405 410 415
Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His
420 425 430
His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala
435 440 445
Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His
450 455 460
Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro
465 470 475 480
Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser
485 490 495
Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met
500 505 510
Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln
515 520 525
Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg
530 535 540
Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met
545 550 555 560
Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu
565 570 575
Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu
580 585 590
His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr
595 600 605
Leu Asn Ala Ser
610
<210> 874
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
肽”
<400> 874
Tyr Glu Met Phe Asn Asp Lys Ser Phe
1 5
<210> 875
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
肽”
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Pyro-Lys
<220>
<221> VARIANT
<222> (11)..(11)
<223> /替换="Leu"
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(11)
<223> /记录=“序列中给出的变体残基相对于变体位置的注释中的那些没有偏爱”
<400> 875
His Arg Xaa Glu Ile Phe Ser His Asp Phe Ile
1 5 10
<210> 876
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> /替换="Leu"
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> /替换="Leu"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Pyro-Lys
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(10)
<223> /记录=“序列中给出的变体残基相对于变体位置的注释中的那些没有偏爱”
<400> 876
Phe Ile Ile Glu Ile Phe Xaa Glu Ser Ser
1 5 10
<210> 877
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
肽”
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Pyro-Lys
<400> 877
Asn Glu Ile Xaa Arg Glu Ile Arg Glu Ile
1 5 10
<210> 878
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
肽”
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> /替换="Leu"
<220>
<221> VARIANT
<222> (11)..(11)
<223> /替换="Leu"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> 硒代胱氨酸
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(15)
<223> /记录=“序列中给出的变体残基相对于变体位置的注释中的那些没有偏爱”
<400> 878
Ile Phe Lys Ser Ile Phe Glu Met Met Ser Ile Asp Ser Ser Xaa
1 5 10 15
<210> 879
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
肽”
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Pyro-Lys
<400> 879
Lys Asn Phe Leu Glu Asn Phe Ile Glu Ser Xaa Phe Ile
1 5 10
<210> 880
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
肽”
<400> 880
Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Glu Lys
1 5 10
<210> 881
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
肽”
<400> 881
Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val
1 5 10
<210> 882
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
肽”
<400> 882
Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val
1 5 10
<210> 883
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
肽”
<400> 883
Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val
1 5
<210> 884
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
肽”
<400> 884
Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Glu Lys
1 5 10
<210> 885
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
肽”
<400> 885
Ala Arg His Gly Gly Trp Thr Thr Lys Met
1 5 10
<210> 886
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
肽”
<400> 886
Ala Arg His Gly Gly Trp Thr Thr Lys Met
1 5 10
<210> 887
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
肽”
<400> 887
Ser Thr Arg Asp Pro Leu Ser Glu Ile Thr Lys
1 5 10
<210> 888
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
肽”
<400> 888
Phe Gly Leu Ala Thr Glu Lys Ser Arg Trp
1 5 10
<210> 889
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
肽”
<400> 889
Leu Ala Thr Glu Lys Ser Arg Trp
1 5
<210> 890
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
肽”
<400> 890
Arg Met Ser Ala Pro Ser Thr Gly Gly Val
1 5 10
<210> 891
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“未知物的描述：HLA-G
肽”
<400> 891
Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu Asp Leu
1 5
<210> 892
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“未知物的描述：HLA-G
肽”
<400> 892
Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Met
1 5
<210> 893
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“未知物的描述：HLA-G
肽”
<400> 893
Arg Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu
1 5 10
<210> 894
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“未知物的描述：HLA-G
肽”
<400> 894
Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Ala Leu
1 5 10
<210> 895
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列描述：合成
肽”
<400> 895
Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20

Claims (84)

1.经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中所述aAPC包含去核细胞，其中所述去核细胞在细胞表面上包含表1或表14、15和20-24中公开的至少一种外源抗原性多肽。
2.权利要求1的aAPC，其中所述至少一种外源抗原性多肽是肿瘤抗原、自身免疫疾病抗原、病毒抗原、细菌抗原或寄生物。
3.权利要求1的aAPC，其中所述至少一种外源抗原性多肽选自下组：黑素瘤抗原基因-A(MAGE-A)抗原、嗜中性粒细胞颗粒蛋白酶抗原、NY-ESO-1/LAGE-2抗原、端粒酶抗原、糖蛋白100(gp100)抗原、埃巴病毒(EBV)抗原、人乳头瘤病毒(HPV)抗原和乙型肝炎病毒(HBV)抗原。
4.经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中所述aAPC包含去核细胞，其中所述去核细胞在细胞表面上包含第一外源抗原性多肽和第二外源抗原性多肽，并且其中所述第一外源抗原性多肽和所述第二外源抗原性多肽具有重叠至少2个氨基酸的氨基酸序列。
5.权利要求4的aAPC，其中所述重叠在2个氨基酸和23个氨基酸之间。
6.权利要求4的aAPC，其中所述第一外源抗原性多肽、所述第二外源多肽或所述第一和第二外源抗原性多肽是肿瘤抗原、自身免疫疾病抗原、病毒抗原、细菌抗原或寄生物。
7.权利要求4的aAPC，其中所述第一外源抗原性多肽、所述第二外源多肽或所述第一和第二外源抗原性多肽是表1或表14、15和20-24中公开的多肽。
8.权利要求3的aAPC，其中所述第一外源抗原性多肽、所述第二外源多肽或所述第一和第二外源抗原性多肽选自下组：黑素瘤抗原基因-A(MAGE-A)抗原、嗜中性粒细胞颗粒蛋白酶抗原、NY-ESO-1/LAGE-2抗原、端粒酶抗原、糖蛋白100(gp100)抗原、埃巴病毒(EBV)抗原、人乳头瘤病毒(HPV)抗原和乙型肝炎病毒(HBV)抗原。
9.权利要求1-8中任一项的aAPC，其中所述aAPC在细胞表面上进一步包含外源抗原呈递多肽。
10.权利要求9的aAPC，其中所述外源抗原呈递多肽是MHC I类多肽、MHC I类单链融合蛋白、MHC II类多肽或MHC II类单链融合蛋白。
11.权利要求10的aAPC，其中所述MHC I类多肽选自下组：HLA A、HLA B和HLA C。
12.权利要求10的aAPC，其中所述MHC II类多肽选自下组：HLA-DPα、HLA-DPβ、HLA-DM、HLA DOA、HLA DOB、HLA DQα、HLA DQβ、HLA DRα和HLA DRβ。
13.经工程化改造以激活T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中所述aAPC包含去核细胞，其中所述去核细胞在细胞表面上包含外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，其中所述外源抗原呈递多肽是MHC I类单链融合蛋白或MHC II类单链融合蛋白。
14.权利要求10或权利要求13的aAPC，其中所述MHC I类单链融合蛋白包含α链和β2m链。
15.权利要求14的aAPC，其中所述MHC I类单链融合蛋白进一步包含膜锚。
16.权利要求14或权利要求15的aAPC，其中所述外源抗原性多肽经由接头与所述MHC I单链融合蛋白连接。
17.权利要求16的aAPC，其中所述接头是可切割的接头。
18.权利要求10或权利要求13的aAPC，其中所述MHC II类单链融合蛋白包含α链和β链。
19.权利要求18的aAPC，其中所述MHC II类单链融合蛋白进一步包含膜锚。
20.权利要求18或权利要求19的aAPC，其中所述外源抗原性多肽经由接头与所述MHCII单链融合蛋白连接。
21.权利要求20的aAPC，其中所述接头是可切割的接头。
22.权利要求15-17和19-21中任一项的aAPC，其中所述锚包含血型糖蛋白A(GPA)蛋白质或小整合膜蛋白1(SMIM1)的跨膜域。
23.权利要求9-22中任一项的aAPC，其中所述外源抗原性多肽与所述外源抗原呈递多肽共价结合。
24.权利要求9-22中任一项的aAPC，其中所述外源抗原性多肽与所述外源抗原呈递多肽非共价结合。
25.权利要求1-24中任一项的aAPC，其在细胞表面上进一步包含至少一种外源共刺激性多肽。
26.权利要求25的aAPC，其中所述至少一种外源共刺激性多肽选自下组：4-1BBL、LIGHT、抗CD28、CD80、CD86、CD70、OX40L、GITRL、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD83、CD155、CD112、与IL-15融合的IL-15Rα、IL-21、ICAM-1、LFA-1的配体、抗CD3及其组合。
27.权利要求25或权利要求26的aAPC，其中所述aAPC在细胞表面上包含至少2种、至少3种、至少4种或至少5种外源共刺激性多肽。
28.前述权利要求中任一项的aAPC，其中所述aAPC在细胞表面上进一步包含外源细胞因子多肽。
29.权利要求28的aAPC，其中所述外源细胞因子多肽选自下组：IL2、IL15、与IL-15融合的15Rα、IL7、IL12、IL18、IL21、IL4、IL6、IL23、IL27、IL17、IL10、TGF-beta、IFN-gamma、IL-1beta、GM-CSF和IL-25。
30.前述权利要求中任一项的aAPC，其中所述aAPC能够激活与所述aAPC相互作用的T细胞。
31.前述权利要求中任一项的aAPC，其中激活包含CD8+T细胞的激活、CD4+T细胞的激活、T细胞的细胞毒性活性的刺激、T细胞的细胞因子分泌的刺激和/或其任何组合。
32.经工程化改造以抑制T细胞活性的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中所述aAPC包含去核细胞，其中所述去核细胞在细胞表面上包含外源抗原呈递多肽、外源抗原性多肽和表7中公开的至少一种外源共抑制性多肽。
33.经工程化改造以抑制T细胞活性的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中所述aAPC包含去核细胞，其中所述去核细胞在细胞表面上包含外源抗原呈递多肽、表1或表16-19中公开的外源抗原性多肽和至少一种外源共抑制性多肽。
34.权利要求32或权利要求33的aAPC，其进一步包含改变代谢物的多肽。
35.经工程化改造以抑制T细胞活性的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中所述aAPC包含去核细胞，其中所述去核细胞在细胞表面上包含外源抗原呈递多肽、外源抗原性多肽和至少一种改变代谢物的多肽。
36.权利要求35的aAPC，其进一步包含外源共抑制性多肽。
37.权利要求33或权利要求36的aAPC，其中所述外源共抑制性多肽是IL-35、IL-10、VSIG-3或LAG3激动剂。
38.权利要求34-36中任一项的aAPC，其中所述改变代谢物的多肽是IDO、Arg1、CD39、CD73、TDO、TPH、iNOS、COX2或PGE合酶。
39.权利要求32-38中任一项的aAPC，其中所述aAPC能够抑制与所述aAPC相互作用的T细胞。
40.权利要求32-39中任一项的aAPC，其中所述抑制包含T细胞增殖的抑制、T细胞的无反应化(anergizing)或T细胞凋亡的诱导。
41.前述权利要求中任一项的aAPC，其中所述T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。
42.经工程化改造以激活调节性T细胞(Treg细胞)的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中所述aAPC包含去核细胞，其中所述去核细胞在细胞表面上包含外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽。
43.权利要求42的aAPC，其在细胞表面上进一步包含外源Treg扩增多肽。
44.权利要求42或权利要求43的aAPC，其中所述外源抗原呈递多肽是MHC II类多肽或MHC II类单链融合蛋白。
45.权利要求44的aAPC，其中所述MHC II类多肽选自下组：HLA-DPα、HLA-DPβ、HLA-DM、HLA DOA、HLA DOB、HLA DQα、HLA DQβ、HLA DRα和HLA DRβ。
46.权利要求44的aAPC，其中所述MHC II类单链融合蛋白包含α链和β链。
47.权利要求46的aAPC，其中所述MHC II类单链融合蛋白进一步包含膜锚。
48.权利要求46或权利要求47的aAPC，其中所述外源抗原性多肽经由接头与MHC II类单链融合物连接。
49.权利要求48的aAPC，其中所述接头是可切割的接头。
50.权利要求47-49中任一项的aAPC，其中所述锚包含血型糖蛋白A(GPA)蛋白质或小整合膜蛋白1(SMIM1)的跨膜域。
51.权利要求42-50中任一项的aAPC，其中所述外源抗原性多肽与所述外源抗原呈递多肽共价结合。
52.权利要求51的aAPC，其中所述外源抗原性多肽与所述外源抗原呈递多肽非共价结合。
53.权利要求43的aAPC，其中所述外源Treg扩增多肽是CD25特异性IL-2、TNFR2特异性TNF、抗DR3激动剂(VEGI/TL1A特异性)、41BBL、TGFβ。
54.前述权利要求中任一项的aAPC，其中所述外源抗原性多肽为8个氨基酸长至24个氨基酸长。
55.前述权利要求中任一项的aAPC，其中所述去核细胞是去核红系细胞或血小板。
56.激活抗原特异性T细胞的方法，所述方法包括使所述T细胞与权利要求1-31中任一项的aAPC接触，从而激活所述抗原特异性T细胞。
57.用于诱导表达受体分子的T细胞的增殖的方法，所述方法包括使所述T细胞与权利要求1-31中任一项的aAPC接触，其中所述共刺激性多肽与所述受体分子特异性结合，从而诱导所述T细胞的增殖。
58.扩增T细胞群体的亚组的方法，所述方法包括使包含所述亚组的至少一种T细胞的T细胞群体与权利要求1-31中任一项的aAPC接触，其中所述aAPC的表面上包含的所述外源共刺激性多肽与所述亚组的至少一种T细胞上的受体分子特异性结合，并且其中所述外源共刺激性多肽与所述受体分子的结合诱导所述亚组的至少一种T细胞的增殖，从而扩增所述T细胞群体的亚组。
59.抑制T细胞的活性的方法，所述方法包括使所述T细胞与权利要求32-41中任一项的aAPC接触，从而抑制所述T细胞的活性。
60.用于激活Treg细胞的方法，所述方法包括使所述Treg细胞与权利要求42-53中任一项的aAPC接触，从而激活所述Treg细胞。
61.治疗需要改变的免疫应答的受试者的方法，所述方法包括使所述受试者的T细胞与权利要求1-55中任一项的aAPC接触，从而治疗所述需要改变的免疫应答的受试者。
62.权利要求61的方法，其中所述接触是体外的。
63.权利要求61的方法，其中所述接触是体内的。
64.治疗需要改变的免疫应答的受试者的方法，所述方法包括：
a)确定所述受试者中的细胞上的抗原表达谱，
b)选择人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中所述aAPC是工程化去核细胞，其在细胞表面上包含抗原呈递多肽和至少一种第一外源抗原性多肽，和
c)对所述受试者施用所述aAPC，
从而治疗所述需要改变的免疫应答的受试者。
65.治疗需要改变的免疫应答的受试者的方法，所述方法包括：
a)确定所述受试者的HLA状态，
b)选择与所述受试者免疫学相容的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中所述aAPC是工程化去核细胞，其在细胞表面上包含至少一种第一外源抗原性多肽和至少一种抗原呈递多肽，和
c)对所述受试者施用所述aAPC，
从而治疗所述需要改变的免疫应答的受试者。
66.权利要求61-65中任一项的方法，其中所述受试者需要增加的免疫应答。
67.权利要求66的方法，其中所述受试者患有癌症或传染病。
68.权利要求61-65中任一项的方法，其中所述受试者需要降低的免疫应答。
69.权利要求68的方法，其中所述受试者患有自身免疫疾病或变应性疾病。
70.在有此需要的受试者中诱导对抗原的T细胞应答的方法，所述方法包括：
从所述受试者获得细胞群体，其中所述群体包含T细胞，
使所述细胞群体与权利要求5-23中任一项的aAPC接触，其中使所述细胞群体与所述aAPC接触诱导对所述至少一种外源抗原性多肽特异性的抗原特异性T细胞的增殖，和
对所述受试者施用所述抗原特异性T细胞，
从而在所述有此需要的受试者中诱导对所述抗原的T细胞应答。
71.权利要求70的方法，其进一步包括从所述细胞群体分离所述抗原特异性T细胞。
72.扩增调节性T(Treg)细胞群体的方法，所述方法包括：
从受试者获得细胞群体，其中所述群体包含Treg细胞，
使所述群体与权利要求34-44中任一项的aAPC接触，其中使所述群体与所述aAPC接触诱导所述Treg细胞的增殖，
从而扩增所述Treg细胞群体。
73.权利要求72的方法，其进一步包括从所述细胞群体分离所述Treg细胞。
74.权利要求72或权利要求73的方法，其进一步包括对所述受试者施用所述Treg细胞。
75.制备权利要求1-55中任一项的aAPC的方法，所述方法包括：
将编码所述外源抗原性多肽的外源核酸引入有核细胞中；和
在适于去核和产生所述外源抗原性多肽的条件下培养所述有核细胞，从而制备去核细胞，
从而制备所述aAPC。
76.制备权利要求9-55中任一项的aAPC的方法，所述方法包括：
将编码所述外源抗原呈递多肽的外源核酸引入有核细胞中；
在适于去核和产生所述外源抗原呈递多肽的条件下培养所述有核细胞，从而制备去核细胞；和
使所述去核细胞与至少一种外源抗原性多肽接触，其中所述至少一种外源抗原性多肽与所述去核细胞的细胞表面上存在的所述外源抗原呈递多肽结合，
从而制备所述aAPC。
77.制备权利要求9-55中任一项的aAPC的方法，所述方法包括：
将编码所述外源抗原性多肽的外源核酸引入有核细胞中；
将编码所述外源抗原呈递多肽的外源核酸引入所述有核细胞中；和
在适于去核和产生所述外源抗原性多肽和所述外源抗原呈递多肽的条件下培养所述有核细胞，从而制备去核细胞，
从而制备所述aAPC。
78.权利要求75-77中任一项的方法，其中所述外源核酸包含DNA。
79.权利要求75-77中任一项的方法，其中所述外源核酸包含RNA。
80.权利要求75-77中任一项的方法，其中所述引入步骤包括病毒转导。
81.权利要求75-77中任一项的方法，其中所述引入步骤包括电穿孔。
82.权利要求75-77中任一项的方法，其中所述引入步骤包括利用以下的一种或多种：脂质体介导的转移、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、基于逆转录病毒的载体、脂质转染和慢病毒载体。
83.制备免疫学相容的人工抗原呈递细胞(aAPC)的方法，其中所述aAPC包含在细胞表面上包含外源抗原性多肽的去核细胞，所述方法包括：
使有核细胞与切割内源核酸的至少一种gRNA和核酸酶接触，以导致内源抗原呈递多肽、内源锚多肽或内源共刺激性多肽的产生；或导致内源微小RNA表达的抑制；
将编码所述外源抗原性多肽的外源核酸引入所述有核细胞中；和
在适于去核以及产生和由所述内源抗原呈递多肽呈递所述外源抗原性多肽的条件下培养所述有核细胞，从而制备去核细胞，
从而制备所述免疫学相容的aAPC。
84.权利要求83的方法，其中所述外源核酸与核酸酶和至少一种gRNA接触。
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