WO2023033124A1 - 免疫制御法、免疫制御用核酸組成物およびその用途 - Google Patents

免疫制御法、免疫制御用核酸組成物およびその用途 Download PDF

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力成 華山
友義 山野
一隆 的場
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    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment

Definitions

  • the present invention relates to an immunoregulatory method, an immunoregulatory nucleic acid composition, and uses thereof.
  • Antigen-specific T cells e.g., cytotoxic T cells, helper T cells, etc.
  • Antigen-specific T cells play a central role in immune responses such as elimination of cancer cells by the body and regulation of responses to self-antigens, allergic substances, etc. known to do a good job.
  • Antigen-specific T cells recognize the binding complexes of MHC molecules on the cell surface of antigen-presenting cells such as dendritic cells and macrophages and antigens derived from cancer, allergic substances, etc., with T cell receptors. It activates, proliferates, differentiates, and the like.
  • Activated antigen-specific T cells specifically damage antigen-presenting cancer cells and regulate responses to autoantigens, allergic substances, and the like. Therefore, activation, proliferation, differentiation, etc. of antigen-specific T cells are considered to be particularly important in immune responses.
  • Non-Patent Document 1 discloses that exosomes in which IL-12 is expressed on the membrane via PTGFRN proliferates model antigen-specific CD8-positive T cells.
  • the present inventors tried a method using extracellular vesicles containing MHC molecules and T cell co-stimulatory molecules in their membranes as a new method for activating antigen-specific T cells.
  • a method using extracellular vesicles containing MHC molecules and T cell co-stimulatory molecules in their membranes as a new method for activating antigen-specific T cells.
  • antigen-specific T cells it was found for the first time that antigen-specific T cells could not be satisfactorily activated.
  • an object of the present invention is to provide a novel immunoregulatory method, an immunoregulatory nucleic acid composition, and uses thereof.
  • the present inventor unexpectedly discovered that by using a polynucleotide capable of producing cells or extracellular vesicles containing MHC molecules and T cell-stimulating cytokines in their membranes, The inventors have found that they can activate T cells, and completed the present invention.
  • the present invention includes: [0] Cells or extracellular vesicles that present antigen-presenting MHC molecules and T-cell-stimulating cytokines extramembranously.
  • Antigen-presenting cells or antigen-presenting extracellular vesicles the membrane of which contains: a protein capable of extramembranously presenting said antigen (A) comprising an antigen-presenting MHC molecule; and a protein capable of extramembranously presenting said T cell stimulating cytokine comprising a T cell stimulating cytokine or a subunit thereof (B ); Antigen-presenting cells or antigen-presenting extracellular vesicles.
  • a protein (A) capable of extramembrane presentation of the antigen comprising the antigen-presenting MHC molecule, An antigen-presenting MHC molecule and a membrane protein capable of being expressed on the membrane of a cell or extracellular vesicle or a transmembrane domain thereof, or a protein capable of binding to the membrane of a cell or extracellular vesicle or a membrane-binding domain thereof
  • the antigen-presenting cell or antigen-presenting extracellular vesicle of [1], which is a fusion protein or protein complex capable of extramembranely presenting the antigen comprising: [3] a protein (B) capable of extramembranely presenting the T cell-stimulating cytokine containing the T cell-stimulating cytokine or a subunit thereof, A T cell-stimulating cytokine or subunit thereof and a membrane protein or transmembrane domain thereof capable of being expressed on the membrane of a cell or extracellular vesicle
  • a protein (B) capable of extramembranely presenting the T cell-stimulating cytokine containing the T cell-stimulating cytokine or a subunit thereof 1) A fusion protein capable of extramembranally presenting the T cell-stimulating cytokine comprising a T cell-stimulating cytokine or a subunit thereof and a partial sequence of tetraspanin, wherein the partial sequence of tetraspanin is present in two membranes.
  • a fusion protein having at least a transmembrane domain, wherein said T cell stimulating cytokine is located between said two transmembrane domains; 2) a fusion protein comprising a T cell stimulatory cytokine or subunit thereof and MFG-E8 or a domain thereof, capable of extramembranely presenting said T cell stimulatory cytokine; 3) from its N-terminal side, (B-1) a partial sequence of tetraspanin containing, from the N-terminal side, transmembrane domain 1, small extracellular loop, transmembrane domain 2, small intracellular loop and transmembrane domain 3; (B-2) a spacer sequence that may be present, (B-3) the amino acid sequence of a T cell-stimulating cytokine; (B-4) a spacer sequence that may be present, and (B-5) the first T cell-stimulating cytokine comprising an amino acid sequence comprising, in this order, a partial sequence of tetraspan
  • a protein (C) comprising a T cell co-stimulatory molecule and capable of interacting with a T cell co-stimulatory molecule
  • the antigen-presenting cell or antigen-presenting extracellular vesicle of [1] further comprising [8] a protein (C) that contains a T cell costimulatory molecule and is capable of interacting with the T cell costimulatory molecule, a T cell co-stimulatory molecule and a membrane protein or its transmembrane domain capable of being expressed on the membrane of a cell or extracellular vesicle or a protein capable of binding to the membrane of a cell or extracellular vesicle or a domain thereof a fusion protein capable of interacting with said T cell co-stimulatory molecule and a T cell comprising;
  • Antigen-presenting cells or antigen-presenting extracellular vesicles the membrane of which contains: Antigen-presenting cells or extracellular antigen-presenting cells comprising a fusion protein (D) comprising an antigen-presenting MHC molecule and a T cell-stimulating cytokine or a subunit thereof, and capable of extramembranely presenting the antigen and the T-cell-stimulating cytokine vesicles.
  • D fusion protein
  • the antigen-presenting cell or antigen-presenting extracellular vesicle of [1A] comprising a protein capable of binding to a membrane or a membrane-binding domain thereof.
  • the fusion protein (D) is 1) from its N-terminal side, (D-1) MHC molecule-restricted antigen peptide, (D-2) a spacer sequence that may be present, (D-3) a single-chain MHC molecule, (D-4) a spacer sequence that may be present; and (D-5) a fusion comprising a tetraspanin or its transmembrane domain or MFG-E8 or its transmembrane domain and said T cell-stimulating cytokine or a subunit thereof peptide, an amino acid sequence encoding, in that order; 2) from its N-terminal side, (D-1) a fusion peptide comprising a tetraspanin or its transmembrane domain or MFG-E8 or its transmembrane domain and said T cell-stimulating cytokine or a subunit thereof (D-2) an optionally present spacer sequence; (D-3) a single-chain MHC molecule,
  • [9A] The antigen-presenting extracellular vesicle of [5A], wherein the MHC molecule-restricted antigenic peptide is an MHC class I molecule-restricted antigenic peptide, and the single-chain MHC molecule comprises an extracellular domain of MHC class I ⁇ chain.
  • [10A] [5A ].
  • [11A] The antigen-presenting cell of [7A], wherein the MHC molecule-restricted antigen peptide is an MHC class I molecule-restricted antigen peptide, and the single-chain MHC molecule containing the transmembrane domain contains an MHC class I ⁇ chain [12A].
  • the MHC molecule-restricted antigenic peptide is an MHC class II molecule-restricted antigenic peptide
  • the single-chain MHC molecule containing the transmembrane domain comprises an MHC class II ⁇ chain and/or an MHC class II ⁇ chain antigen-presenting cells.
  • the protein (C) can bind to the T cell co-stimulatory molecule and a membrane protein or its transmembrane domain that can be expressed on the membrane of a cell or an extracellular vesicle, or the membrane of an extracellular vesicle.
  • the antigen-presenting cell or antigen-presenting extracellular vesicle of [13A] which comprises a protein or a domain thereof.
  • [1B] The antigen-presenting cell or antigen-presenting extracellular vesicle according to [1], wherein the protein (A) and the protein (B) are fused to form a single protein.
  • C) [2B] The antigen-presenting cell or antigen-presenting extracellular vesicle of [8], wherein the protein (A) and the protein (C) are fused to form a single protein.
  • [4B] The antigen-presenting cell or antigen-presenting extracellular vesicle of [8], wherein the protein (A), the protein (B), and the protein (C) are fused to form a single protein.
  • [5B] The antigen-presenting cell or antigen-presenting extracellular vesicle according to [13A], wherein the protein (D) and the protein (C) are fused to form one protein, or the antigen-presenting extracellular vesicle [6B] extracellular vesicle is an exosome
  • a pharmaceutical composition comprising the antigen-presenting cells or antigen-presenting extracellular vesicles of any one of [1] to [6B] and a pharmacologically acceptable carrier.
  • a pharmaceutical composition comprising the antigen-presenting cells or antigen-presenting extracellular vesicles of any one of [1] to [6B] for treating or preventing cancer; Antigenic peptides include cancer antigenic peptides.
  • a pharmaceutical composition comprising the antigen-presenting cells or antigen-presenting extracellular vesicles of any one of [1] to [6B] for treating or preventing an autoimmune disease; wherein said antigenic peptide comprises an autoantigenic peptide.
  • a pharmaceutical composition comprising the antigen-presenting cells or antigen-presenting extracellular vesicles of any one of [1] to [6B] for treating or preventing an allergic disease; wherein said antigenic peptide comprises an allergen.
  • the immune checkpoint inhibitor is selected from the group consisting of an anti-PD-1 antibody or an active fragment thereof; an anti-CTLA-4 antibody or an active fragment thereof; and a PD-L1 antibody or an active fragment thereof; [4C] Or the pharmaceutical composition of [5C].
  • a medicament for treating or preventing an infectious disease comprising the antigen-presenting cells or antigen-presenting extracellular vesicles of any one of [1] to [6B] and a pharmacologically acceptable carrier A composition; wherein preferably said antigenic peptide is derived from an infectious agent causing said infectious disease.
  • the immune checkpoint inhibitor is selected from the group consisting of an anti-PD-1 antibody or an active fragment thereof; an anti-CTLA-4 antibody or an active fragment thereof; and a PD-L1 antibody or an active fragment thereof;
  • [1E] Use of the antigen-presenting cells or antigen-presenting extracellular vesicles of any one of [1] to [6B] in the manufacture of a medicament for treating or preventing cancer;
  • the peptides include cancer antigen peptides.
  • Said antigenic peptide comprises an autoantigenic peptide.
  • the antigenic peptide contains an allergen.
  • the immune checkpoint inhibitor is selected from the group consisting of an anti-PD-1 antibody or an active fragment thereof; an anti-CTLA-4 antibody or an active fragment thereof; and a PD-L1 antibody or an active fragment thereof; [4E] Or the use described in [5E].
  • [7E] use of the antigen-presenting cells or antigen-presenting extracellular vesicles of any one of [1] to [6B] in the manufacture of a medicament for treating or preventing an infectious disease;
  • the antigenic peptide is derived from an infectious agent that causes said infectious disease.
  • [1F] A method of treating or preventing cancer in a subject, comprising: administering an effective amount of the antigen-presenting cells or antigen-presenting extracellular vesicles of any one of [1] to [6B] to a subject to activate and activate T cells that recognize cancer antigens in the subject; A method of treating or preventing cancer by proliferating and allowing said activated and/or proliferated T cells to attack cancer cells; wherein preferably said activated and/or proliferated T cells are CD8-positive cytotoxic T cells, and preferably said antigenic peptide comprises a cancer antigenic peptide.
  • [2F] A method for treating or preventing an autoimmune disease in a subject, comprising administering an effective amount of the antigen-presenting cells or antigen-presenting extracellular vesicles of any one of [1] to [6B] to the subject. to activate and/or expand T cells in a subject that recognize the autoantigen and desensitize the immune response in the subject to said autoantigen, thereby treating or preventing an autoimmune disease method; wherein preferably said activated and/or expanded T cells are CD4 positive regulatory T cells (Treg) and preferably said antigenic peptide comprises an autoantigenic peptide.
  • Treg CD4 positive regulatory T cells
  • [3F] A method for treating or preventing an allergic disease in a subject, comprising administering an effective amount of the antigen-presenting cells or antigen-presenting extracellular vesicles of any one of [1] to [6B] to the subject. to activate and/or proliferate T cells in the subject that recognize the allergen and desensitize the immune response to the autoantigen in the subject, thereby treating or preventing an autoimmune disease.
  • said activated and/or expanded T cells are CD4 positive regulatory T cells (Treg) and preferably said antigenic peptide comprises an allergen.
  • [7F] A method for treating or preventing an infectious disease in a subject, comprising administering an effective amount of the antigen-presenting cells or antigen-presenting extracellular vesicles of any one of [1] to [6B] to the subject. hand, 1) activating the subject's innate immunity by secreting inflammatory cytokines; and/or 2) providing the subject with acquired immunity against the infectious agent that causes the infection,
  • a method of treating or preventing an infectious disease comprising eliminating and/or inhibiting the growth of the infectious agent causing said infectious disease in the body.
  • [1G] A method for activating and/or proliferating T cells against a specific antigen, comprising an effective amount of the antigen-presenting cells or antigen-presenting cells of any one of [1] to [6B] A method comprising contacting an outer vesicle with a T cell in vitro or ex vivo.
  • a fusion protein (A) comprising an antigen-presenting MHC molecule and capable of presenting the antigen-presenting MHC molecule outside the membrane of a cell or extracellular vesicle.
  • a fusion protein (B) comprising at least one T cell-stimulating cytokine or subunit thereof and capable of presenting said T cell-stimulating cytokine outside the membrane of a cell or extracellular vesicle.
  • a fusion protein (C) comprising a T cell co-stimulatory molecule and capable of presenting the T cell co-stimulatory molecule outside the membrane of a cell or extracellular vesicle.
  • [4H] a fusion protein comprising an antigen-presenting MHC molecule and at least one T cell-stimulating cytokine or subunit thereof, and capable of presenting the antigen and the T cell-stimulating cytokine outside the membrane of a cell or extracellular vesicle; (D).
  • [5H] comprising an antigen-presenting MHC molecule, at least one T-cell stimulatory cytokine or subunit thereof and a T-cell costimulatory molecule, wherein the antigen, the T-cell-stimulatory cytokine and the T-cell costimulatory molecule are combined into cells or
  • a fusion protein (E) that can be displayed outside the membrane of extracellular vesicles.
  • a sequence encoding a fusion protein comprising an antigen-presenting MHC molecule and capable of presenting the antigen-presenting MHC molecule outside the membrane of a cell or extracellular vesicle;
  • a sequence encoding a fusion protein comprising at least one T cell stimulating cytokine or subunit thereof, capable of presenting said T cell stimulating cytokine outside the membrane of a cell or extracellular vesicle;
  • a fusion protein comprising an antigen-presenting MHC molecule and at least one T cell-stimulating cytokine or subunit thereof and capable of presenting the antigen and the T cell-stimulating cytokine outside the membrane of a cell or extracellular vesicle
  • a polynucleotide comprising at least one sequence selected from the group consisting of:
  • the fusion protein defined in (A) above is combined with an antigen-presenting MHC molecule and a membrane protein that can be expressed on the membrane of a cell or extracellular vesicle or its transmembrane domain or on the membrane of a cell or extracellular vesicle
  • the polynucleotide of [1I] which comprises a protein capable of binding or a membrane-binding domain thereof.
  • the polynucleotide of [1I] wherein the fusion protein defined in (A) above comprises an antigen-presenting MHC molecule and tetraspanin or its transmembrane domain or MFG-E8 or its membrane-binding domain.
  • the fusion protein defined in (A) above is: From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence that may be present, (A-3) the amino acid sequence of a single-chain MHC molecule; (A-4) the optionally present spacer sequence, and (A-5) the amino acid sequence comprising the amino acid sequence of tetraspanin or its transmembrane domain in this order, the polynucleotide of [1I].
  • [6I] The fusion protein defined in (A) above, from its N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence that may be present, (A-3) MHC class I ⁇ chain, ⁇ 2 microglobulin, MHC class II ⁇ chain, or MHC class II ⁇ chain amino acid sequence (A-4) optionally present spacer sequence, and (A-5) tetraspanin or The polynucleotide of [1I], comprising an amino acid sequence comprising the amino acid sequence of its transmembrane domain in this order.
  • the fusion protein defined in (A) above is From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class I molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence that may be present, (A-3) the amino acid sequence of a single-chain MHC class I molecule; (A-4) an optionally present spacer sequence; and (A-5) an amino acid sequence comprising an amino acid sequence of a tetraspanin or its transmembrane domain in that order, the polynucleotide of [1I].
  • the fusion protein defined in (A) above is From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class II molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence that may be present, (A-3) amino acid sequence of MHC class II ⁇ chain, (A-4) the optionally present spacer sequence, and (A-5) the amino acid sequence comprising the amino acid sequence of tetraspanin or its transmembrane domain in this order, the polynucleotide of [1I].
  • the fusion protein defined in (A) above is From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class I molecule-restricted antigen peptide, (A-2) an optionally present spacer sequence, and (A-3) the amino acid sequence of a single-chain MHC class I molecule containing a transmembrane domain,
  • the polynucleotide described in [1I] comprising an amino acid sequence comprising in this order [15I] the fusion protein defined in (A), From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class II molecule-restricted antigen peptide, (A-2) an optionally present spacer sequence, and (A-3) the amino acid sequence of MHC class II ⁇ chain,
  • the polynucleotide of [1I] which comprises a domain or a protein capable of binding to the membrane of a cell or extracellular vesicle or a domain thereof.
  • the fusion protein defined in (B) above comprises at least one T cell-stimulating cytokine or subunit thereof and a tetraspanin partial sequence, wherein the tetraspanin partial sequence spans two transmembrane domains.
  • the polynucleotide of [1I] wherein the fusion protein defined in (B) above comprises at least one T cell-stimulating cytokine or subunit thereof and MFG-E8 or a membrane-binding domain thereof;
  • the fusion protein defined in (B) above from its N-terminal side, (B-1) a partial sequence of tetraspanin containing, from the N-terminal side, transmembrane domain 1, small extracellular loop, transmembrane domain 2, small intracellular loop and transmembrane domain 3; (B-2) a spacer sequence that may be present, (B-3) the amino acid sequence of the first T cell-stimulating cytokine; (B-4) the optionally present spacer sequence, and (B-5) the amino acid sequence comprising at least one T
  • the fusion protein defined in (B) above from its N-terminal side, (B-3) the amino acid sequence of the first T cell-stimulating cytokine; (B-4) the optionally present spacer sequence, and (B-5) the amino acid sequence comprising the amino acid sequence of MFG-E8 or its membrane-binding domain in this order, the polynucleotide of [1I].
  • the fusion protein defined in (B) comprises at least one T cell-stimulating cytokine or subunit thereof and CD8 or a transmembrane domain thereof.
  • the fusion protein defined in (B) above comprises, from its N-terminal side, (B-3) the amino acid sequence of the first T cell-stimulating cytokine; (B-4) the optionally present spacer sequence, and (B-5) the amino acid sequence comprising the amino acid sequence of CD8 or its transmembrane domain in this order, the polynucleotide of [1I].
  • [24I] of [1I] wherein the T cell-stimulating cytokine is IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, a subunit of IL-12, IL-15, or TGF- ⁇ Polynucleotide.
  • the fusion protein defined in (C) above comprises a T cell co-stimulatory molecule; A membrane protein capable of being expressed in the membrane of a cell or extracellular vesicle or a transmembrane domain thereof, or a protein capable of binding to the membrane of a cell or extracellular vesicle or a membrane-binding domain thereof, [ 1I].
  • the fusion protein defined in (C) above comprises a T cell co-stimulatory molecule; The polynucleotide of [1I], which comprises tetraspanin or its transmembrane domain, or MFG-E8 or its membrane-binding domain.
  • the polynucleotide of [1I] wherein the fusion protein defined in (C) above comprises a T cell co-stimulatory molecule comprising a transmembrane domain; [28I] the fusion protein defined in (C) above, from its N-terminal side, (C-1) the amino acid sequence of the T cell co-stimulatory molecule, (C-2) the optionally present spacer sequence, and (C-3) the amino acid sequence comprising the amino acid sequence of tetraspanin or its transmembrane domain in this order, the polynucleotide of [1I].
  • the fusion protein defined in (D) above is said antigen-presenting MHC molecule; said at least one T-cell stimulating cytokine or subunit thereof and a membrane protein or transmembrane domain thereof capable of localizing in the membrane of a cell or extracellular vesicle, or
  • the polynucleotide of [1I] which comprises a protein capable of binding to the membrane of cells or extracellular vesicles or a membrane-binding domain thereof.
  • the membrane protein capable of localizing in the extracellular vesicle membrane or the protein capable of binding to the extracellular vesicle membrane is tetraspanin or MFG-E8 of polynucleotides.
  • the fusion protein defined in (D) above is From the N-terminal side, (D-1) amino acid sequence of MHC molecule-restricted antigen peptide, (D-2) a spacer sequence that may be present, (D-3) the amino acid sequence of a single-chain MHC molecule; (D-4) an optionally present spacer sequence; and (D-5) tetraspanin or its transmembrane domain or MFG-E8 or its membrane-binding domain, and said at least one T cell-stimulating cytokine or sub-sequence thereof.
  • the fusion protein defined in (D) above is From the N-terminal side, (D-1) Amino acid sequence of a fusion peptide comprising tetraspanin or its transmembrane domain or MFG-E8 or its membrane binding domain and said at least one T cell-stimulating cytokine or subunit thereof (D-2) present an optional spacer sequence, (D-3) the amino acid sequence of a single-chain MHC molecule; (D-4) a spacer sequence that may be present, and (D-5) the amino acid sequence of the MHC molecule-restricted antigen peptide,
  • the polynucleotide of [1I] comprising an amino acid sequence comprising in this order: [34I] a fusion peptide comprising said tetraspanin or its transmembrane domain or MFG
  • said fusion peptide comprising a tetraspanin or its transmembrane domain or MFG-E8 or its membrane binding domain and said at least one T cell stimulating cytokine or subunit thereof, From the N-terminal side, (1) the amino acid sequence of said at least one T-cell stimulating cytokine or subunit thereof;
  • the polynucleotide of [32I] or [33I] which comprises (2) an optionally present spacer sequence, and (3) an amino acid sequence comprising, in that order, the amino acid sequence of MFG-E8 or its membrane-binding domain.
  • the fusion protein defined in (D) above is said antigen presenting MHC molecule and said at least one T cell stimulating cytokine or subunit thereof and a membrane protein or transmembrane domain thereof capable of localizing in the membrane of a cell or binding to the membrane of the cell.
  • the polynucleotide of [1I] which comprises a soluble protein or a membrane-binding domain thereof.
  • [37I] of [32I] or [33I] wherein the MHC molecule-restricted antigenic peptide is an MHC class I molecule-restricted antigenic peptide, and the single-chain MHC molecule comprises an extracellular region of an MHC class I ⁇ chain; Polynucleotide.
  • the MHC molecule-restricted antigen peptide is an MHC class II molecule-restricted antigen peptide, and the single-chain MHC molecule comprises an MHC class II ⁇ -chain extracellular domain and/or an MHC class II ⁇ -chain extracellular domain; , [32I] or [33I].
  • [1J] The polynucleotide of [1I], comprising the sequence defined in (a) above and the sequence defined in (b) above.
  • [2J] the polynucleotide of [1J], which encodes an amino acid sequence in which the fusion protein (A) and the fusion protein (B) are fused
  • [3J] the polynucleotide of [2J], which encodes an amino acid sequence in which fusion protein (A) and fusion protein (B) are fused via at least one 2A peptide
  • [4J] The polynucleotide of [1J], further comprising the sequence defined in (c) above.
  • [7J] From the 5' end, a sequence defined in (a) above; a sequence encoding a first at least one 2A peptide; the sequence defined in (b) above; The polynucleotide of [6J], comprising, in that order, a sequence encoding a second at least one 2A peptide; and a sequence defined in (c) above.
  • [13J] A vector comprising the polynucleotide of any one of [1I] to [12J].
  • [14J] A pharmaceutical composition comprising the polynucleotide of any one of [1I] to [12J] or the vector of [13J], and a pharmacologically acceptable carrier.
  • [1K] A cell transformed with the polynucleotide of any one of [1I] to [12J] or the vector of [13J].
  • [2K] A culture supernatant obtained by culturing the cells of [1K].
  • [3K] an antigen-presenting extracellular vesicle obtained from the culture supernatant of [2K];
  • [4K] A method for producing the antigen-presenting extracellular vesicles of [1], comprising the step of collecting the culture supernatant obtained by culturing the cells of [1K].
  • [5K] A pharmaceutical composition comprising the culture supernatant of [2K].
  • [1L] A pharmaceutical composition comprising the polynucleotide of any one of [1I] to [12J] or the vector of [13J] for treating or preventing cancer.
  • [2L] a pharmaceutical composition comprising the polynucleotide of any one of [1I] to [12J] or the vector of [13J] for treating or preventing an autoimmune disease; wherein said antigenic peptide comprises an autoantigenic peptide.
  • [3L] a pharmaceutical composition comprising the polynucleotide of any one of [1I] to [12J] or the vector of [13J] for treating or preventing an allergic disease; The antigenic peptide contains an allergen.
  • [4L] comprising the polynucleotide of any one of [1I] to [12J] or the vector of [13J] for treating or preventing an infectious disease, and a pharmacologically acceptable carrier;
  • a pharmaceutical composition wherein preferably said antigenic peptide is derived from an infectious agent causing an infection.
  • the peptides include cancer antigen peptides.
  • Said antigenic peptide comprises an autoantigenic peptide.
  • [3N] use of the polynucleotide of any one of [1I] to [12J] or the vector of [13J] in the manufacture of a medicament for treating or preventing an allergic disease;
  • the antigenic peptide contains an allergen.
  • [4N] use of the polynucleotide of any one of [1I] to [12J] or the vector of [13J] in the manufacture of a medicament for treating or preventing an infectious disease;
  • the antigenic peptide is derived from an infectious agent that causes said infectious disease.
  • a method of treating or preventing cancer in a subject comprising: An effective amount of the polynucleotide according to any one of [1I] to [12J] or the vector according to [13J] is administered to a subject to activate and activate T cells that recognize cancer antigens in the subject.
  • a method of treating or preventing cancer by proliferating and allowing said activated and/or proliferated T cells to attack cancer cells; wherein preferably said activated and/or proliferated T cells are CD8-positive cytotoxic T cells, and preferably said antigenic peptide comprises a cancer antigenic peptide.
  • a method for treating or preventing an autoimmune disease in a subject comprising administering an effective amount of the polynucleotide of any one of [1I] to [12J] or the vector of [13J] to the subject. to activate and/or expand T cells in a subject that recognize the autoantigen and desensitize the immune response in the subject to said autoantigen, thereby treating or preventing an autoimmune disease method; wherein preferably said activated and/or expanded T cells are CD4 positive regulatory T cells (Treg) and preferably said antigenic peptide comprises an autoantigenic peptide.
  • Treg CD4 positive regulatory T cells
  • a method for treating or preventing an allergic disease in a subject comprising administering an effective amount of the polynucleotide of any one of [1I] to [12J] or the vector of [13J] to the subject. to activate and/or proliferate T cells in the subject that recognize the allergen and desensitize the immune response to the autoantigen in the subject, thereby treating or preventing an autoimmune disease.
  • said activated and/or expanded T cells are CD4 positive regulatory T cells (Treg) and preferably said antigenic peptide comprises an allergen.
  • [4O] A method for treating or preventing an infectious disease in a subject, comprising administering an effective amount of the polynucleotide of any one of [1I] to [12J] or the vector of [13J] to the subject. hand, 1) activating the subject's innate immunity by secreting inflammatory cytokines; and/or 2) providing the subject with acquired immunity against the infectious agent that causes the infection,
  • a method of treating or preventing an infectious disease comprising eliminating and/or inhibiting the growth of the infectious agent causing said disease infection in the body.
  • [1P] A method for activating and/or proliferating T cells against a specific antigen, comprising the polynucleotide of any one of [1I] to [12J] or the vector of [13J] into cells in vitro or ex vivo to generate antigen-presenting cells and/or antigen-presenting extracellular vesicles, and introducing the generated antigen-presenting cells and/or antigen-presenting extracellular vesicles and T cells in vitro or ex vivo.
  • polynucleotides for producing cells (antigen-presenting cells) and extracellular vesicles (antigen-presenting extracellular vesicles) containing antigen-presenting MHC molecules and T cell-stimulating cytokines in their membranes
  • T cells can be activated or the like.
  • a model diagram of an antigenic peptide-single chain MHC class I molecule (sc-Trimer)-CD81 fusion protein is shown.
  • the amino acid sequence of the antigenic peptide-single chain MHC class I molecule (sc-Trimer)-CD81 fusion protein is shown.
  • a model diagram of a CD80-CD9 fusion protein is shown. Amino acid sequence of CD80-CD9 fusion protein is shown.
  • a model diagram of a CD63-IL-2 fusion protein is shown. Amino acid sequence of CD63-IL-2 fusion protein is shown.
  • Figure 2 shows a model diagram of an antigenic peptide-MHC class II beta chain (sc-Dimer)-CD81 fusion protein.
  • Amino acid sequence of antigenic peptide-MHC class II beta chain (sc-Dimer)-CD81 fusion protein is shown. Amino acid sequence of MHC class II ⁇ chain is shown.
  • a model diagram of the TGF- ⁇ -MFG-E8 fusion protein is shown. Amino acid sequence of TGF- ⁇ -MFG-E8 fusion protein is shown.
  • a model diagram of a CD81-IL-4 fusion protein is shown. Amino acid sequence of CD81-IL-4 fusion protein is shown.
  • Figure 3 shows the nucleic acid sequence of the sc-Trimer-CD81-IL-2 fusion protein.
  • Figure 3 shows the nucleic acid sequence of the CD63-AkaLuc fusion protein.
  • Figure 2 shows the nucleic acid sequence encoding sc-Trimer-T2A-IL-2-CD8-P2A-CD80.
  • 1 shows a model diagram of antigen-presenting extracellular vesicles of Example 1.
  • FIG. 1 shows a model diagram of antigen-presenting extracellular vesicles of Example 2.
  • FIG. 1 shows a model diagram of antigen-presenting extracellular vesicles of Example 3.
  • FIG. 1 shows a model diagram of antigen-presenting extracellular vesicles of Example 4.
  • FIG. 1 shows a model diagram of antigen-presenting extracellular vesicles of Example 5.
  • FIG. 1 shows a model diagram of antigen-presenting extracellular vesicles of Example 6.
  • FIG. 1 shows a model diagram of antigen-presenting extracellular vesicles of Example 1.
  • FIG. 1 shows a model diagram of antigen-presenting extracellular vesicles of Example 7.
  • FIG. 1 shows a model diagram of antigen-presenting extracellular vesicles of Example 8.
  • FIG. 1 shows a model diagram of antigen-presenting extracellular vesicles of Example 9.
  • FIG. 1 shows a model diagram of antigen-presenting extracellular vesicles of Example 11.
  • FIG. 1 illustrates a model diagram of an antigen-presenting extracellular vesicle of another embodiment.
  • Test Example 1-1 the results of analyzing the fusion protein contained in the membrane of the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 2 by flow cytometry are shown.
  • Test Example 1-2 the results of analyzing the fusion protein contained in the membrane of the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 3 by flow cytometry are shown.
  • Test Example 1-3 the results of analyzing the fusion protein contained in the membrane of the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 4 by flow cytometry are shown.
  • Test Example 1-4 the results of analyzing the fusion protein contained in the membrane of the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 5 by flow cytometry are shown.
  • Test Example 1-5 the results of analyzing the fusion protein contained in the membrane of the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 6 by flow cytometry are shown.
  • Test Example 1-6 the results of analyzing the fusion protein contained in the membrane of the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 7 by flow cytometry are shown.
  • Test Example 1-7 the results of analyzing the fusion protein contained in the membrane of the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 8 by flow cytometry are shown.
  • Test Example 1-8 the results of analyzing the fusion protein contained in the membrane of the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 9 by flow cytometry are shown.
  • Test Example 2 the results of in vitro evaluation of whether the antigen-presenting extracellular vesicles of Examples 1 and 2 activate antigen-specific CD8-positive T cells (OT-1 T cells) are shown.
  • FIG. 3 shows the results of in vivo evaluation of whether the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 2 activate antigen-specific CD8-positive T cells (OT-1) in Test Example 3.
  • FIG. 4 the results of in vitro evaluation of whether the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 3 activate antigen-specific CD4-positive T cells are shown.
  • Test Example 5 results of in vitro evaluation of whether the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 4 induce the differentiation of antigen-specific CD4-positive T cells (OT-2 T cells) into regulatory T cells.
  • Test Example 6 it was evaluated in vitro whether the antigen-presenting extracellular vesicles of Examples 3 and 5 induce differentiation of antigen-specific CD4-positive T cells (OT-2 T cells) into Th2 T cells. Show the results.
  • Test Example 7 the results of in vitro evaluation of whether the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 6 induce the differentiation of antigen-specific CD4-positive T cells into Th1 cells are shown.
  • Test Example 8 the results of in vitro evaluation of whether the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 7 induce the differentiation of antigen-specific CD4-positive T cells into Th17 cells are shown.
  • Test Example 9 shows that the antigen-presenting extracellular vesicles of Examples 1 and 8 significantly proliferated antigen-specific CD8-positive T cells.
  • Test Example 10 shows that the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 8 significantly suppressed the proliferation of B16 melanoma cells.
  • Test Example 11 the results of in vivo evaluation of whether the mRNA of Example 10 activates antigen-specific CD8-positive T cells (OT-1) are shown.
  • Test Example 12 the results of in vivo evaluation of whether the mRNA of Example 10 activates endogenous antigen-specific CD8-positive T cells are shown.
  • Test Example 13 the results of in vivo evaluation of whether the extracellular vesicles of Example 6 differentiate antigen-specific CD4-positive T cells into Th1 cells are shown.
  • Test Example 14 the results of in vivo evaluation of whether the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 6 suppress the proliferation of melanoma cells are shown.
  • Test Example 15 the results of flow cytometry of the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 11 are shown.
  • Test Example 16 the results of an in vitro evaluation of whether antigen-presenting extracellular vesicles of Example 11 differentiate antigen-specific CD4-positive T cells into Th1 cells are shown.
  • Test Example 17 the results of in vivo evaluation of whether the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 12 suppress the proliferation of T lymphoma cells are shown.
  • Test Example 1A shows the results of an in vitro evaluation of whether the mRNA of Example 1A expresses antigen-MHCI complexes, CD80 and IL-2 on cells.
  • Test Example 2A the results of an in vitro evaluation of whether antigen-presenting cells induced by the mRNA of Example 1A proliferate antigen-specific CD8-positive T cells are shown.
  • Test Example 3A shows the results of in vivo evaluation of whether the mRNA of Example 1A expresses antigen-MHCI complexes, CD80 and IL-2 on cells.
  • Test Example 4A shows the results of an in vivo evaluation of whether the mRNA of Example 1A proliferates endogenous OVA-reactive CD8 T cells.
  • (a) shows the nucleic acid sequence of the sc-Trimer-T2A-IL-15sa-P2A-CD80 fusion protein.
  • (b) shows the nucleic acid sequence of the sc-Trimer-T2A-IL-2-CD8-P2A-CD80 fusion protein displaying the neoantigen.
  • (c) shows the nucleic acid sequence of the OVAp-MHCII ⁇ -P2A-MHCII ⁇ -T2A-IL-12sc-CD8-P2A-CD80 fusion protein.
  • Test Example 5A shows the results of in vivo evaluation of whether the mRNA of Example 2A expresses antigen-MHCI complexes, CD80 and IL-15sa on cells.
  • Test Example 6A shows the results of an in vivo evaluation of whether the mRNA of Example 2A proliferates endogenous OVA-reactive CD8 T cells.
  • Test Example 7A shows the results of an in vivo evaluation of whether the mRNA of Example 3A expresses antigen-MHCI complexes, CD80 and IL-2 on cells.
  • Test Example 8A shows the results of an in vivo evaluation of whether the mRNA of Example 3A proliferates endogenous Gtf2i-reactive CD8 T cells.
  • Test Example 9A shows the results of an in vivo evaluation of whether the mRNA of Example 4A expresses antigen-MHCII complexes, CD80 and IL-12 on cells.
  • Test Example 10A shows the results of an in vivo evaluation of whether the mRNA of Example 4A proliferates endogenous OVA-reactive CD8 T cells.
  • Test Example 11A results of an in vivo evaluation of whether the mRNA of Example 5A proliferates endogenous RPL18-reactive CD8 T cells are shown.
  • Extracellular vesicles used herein are not particularly limited as long as they are vesicles secreted from cells, but for example, Exosomes, Microvesicles (MV; microvesicles), Apoptotic Bodies (apoptotic bodies), and the like.
  • exosome refers to an endocyto-cis pathway derived from about 20 to about 500 nm (preferably about 20 to about 200 nm, more preferably about 25 to about 150 nm, more preferably about 30 to about 100 nm).
  • components of exosomes include proteins, nucleic acids (mRNA, miRNA, non-coating RNA) and the like. Exosomes may have functions that govern intercellular communication.
  • Exosome marker molecules include, for example, Alix, Tsg101, tetraspanin, flotillin, phosphatidylserine and the like.
  • Microvesicle as used herein means a vesicle of about 50 to about 1000 nm derived from the cytoplasmic membrane.
  • components of microvesicles include proteins, nucleic acids (mRNA, miRNA, non-coating RNA, etc.) and the like.
  • Microvesicles can have functions such as controlling intercellular communication. Marker molecules for microvesicles include, for example, integrins, selectins, CD40, CD154 and the like.
  • Apoptotic body as used herein means a vesicle of about 500 to about 2000 nm derived from the cytoplasmic membrane.
  • Components of apoptotic bodies include, for example, fragmented nuclei, organelles, and the like. Apoptotic bodies can have functions such as inducing phagocytosis.
  • Marker molecules for apoptotic bodies include, for example, Annexin V, phosphatidylserine and the like.
  • Antigen-presenting extracellular vesicles as used herein means extracellular vesicles that present antigens outside the membrane.
  • antigen presenting cell means a cell that artificially presents one or more antigens on its membrane. Any one or more cytokines (eg, T cell-stimulating cytokines, etc. defined below) are preferably presented outside the membrane of the antigen-presenting cells. In antigen-presenting cells, said antigen is anchored extramembranely, more preferably by being anchored extramembranely in the form of a fusion molecule fused with a major histocompatibility complex molecule defined below (i.e., temporarily antigen is attached to the outer membrane), but is preferably presented extramembranely.
  • cytokines eg, T cell-stimulating cytokines, etc. defined below
  • transiently expressing antigen peptides and cytokines in antigen-presenting cells by introducing a polynucleotide comprising sequences encoding one or more antigenic peptides and sequences encoding one or more cytokines; It is preferably presented extramembranously.
  • the antigen-presenting cells present extramembranously any auxiliary signals (eg, T cell co-stimulatory molecules as defined below).
  • MHC Major Histocompatibility Complex Molecules
  • MHC molecules include antigen-binding clefts, T cells, T cells It is not particularly limited as long as it can bind to the antigen to be presented to the precursor or the like.
  • MHC molecules include MHC class I molecules, MHC class II molecules, and the like.
  • MHC molecules may be from any animal species. For example, human leukocyte antigen (HLA) and mouse H2 system can be mentioned.
  • HLA human leukocyte antigen
  • mouse H2 system can be mentioned.
  • HLA corresponding to MHC class I molecules may be classified into subtypes such as HLA-A, HLA-B, HLA-Cw, HLA-F, and HLA-G. Polymorphisms (alleles) are known for these subtypes.
  • HLA-A polymorphisms include, for example, HLA-A1, HLA-A0201, and HLA-A24
  • HLA-B polymorphisms include, for example, HLA-B7, HLA-B40, HLA-B4403, and the like.
  • HLA-Cw polymorphisms include HLA-Cw0301, HLA-Cw0401, HLA-Cw0602, and the like.
  • HLA corresponding to MHC class II molecules may be classified into subtypes such as HLA-DR, HLA-DQ, and HLA-DP.
  • MHC class II molecules e.g. MHC class II alpha chains such as SEQ ID NO:71, MHC such as SEQ ID NO:37 Class II ⁇ chain, single-chain MHC class II molecule, etc.
  • MHC class II alpha chains such as SEQ ID NO:71
  • MHC such as SEQ ID NO:37
  • MHC molecule described herein may have one or more amino acid deletions, insertions, additions relative to its wild-type amino acid sequence, as long as it can exhibit its function. and/or may be substituted or the like.
  • the term "antigen-presenting MHC molecule” used herein is not particularly limited as long as it is an MHC molecule that presents an antigen. Examples include antigen-presenting MHC class I molecules, antigen-presenting MHC class II molecules, etc. are mentioned.
  • the "antigen-presenting MHC class I molecule” includes, for example, a complex of an antigen and an MHC class I ⁇ chain or its extracellular domain and ⁇ 2 microglobulin; a complex of an antigen and a single-chain MHC class I molecule; fusion proteins bound by chain MHC class I molecules; fusion proteins of antigens with extracellular domains of MHC class I ⁇ chains and other proteins or domains or fragments thereof (e.g., extracellular domains of MHC class I ⁇ chains and antibodies a fusion protein with the Fc portion of MHC class I ⁇ chain; a fusion protein with the extracellular domain of the MHC class I ⁇ chain and the transmembrane domain of another membrane protein, etc.);
  • single-chain MHC molecule refers to an MHC molecule (or MHC class I molecule or MHC class II molecule) A fusion protein in which a chain or its extracellular domain and a ⁇ chain or its extracellular domain or ⁇ 2 microglobulin are linked via a spacer sequence or the like, if necessary.
  • Single-chain MHC class I molecules include, for example, fusion proteins in which MHC class I ⁇ -chain and ⁇ 2- microglobulin are linked optionally via a spacer sequence.
  • the "single-chain MHC class II molecule” includes, for example, a fusion protein in which an MHC class II ⁇ chain and an MHC class II ⁇ chain are optionally linked via a spacer sequence.
  • a “single-chain MHC molecule comprising a transmembrane domain” includes a transmembrane domain native to the MHC molecule (transmembrane domain of MHC class I ⁇ chain, MHC class II ⁇ chain, or MHC class II ⁇ chain).
  • a “single-chain MHC molecule” is meant.
  • a protein (or fusion protein, protein complex, etc.) capable of extramembrane presentation of the antigen (or antigenic peptide) comprising an antigen-presenting MHC molecule refers to at least an antigen-presenting MHC molecule. It means a protein (or fusion protein, protein complex, etc.) capable of presenting the antigen to T cells or the like by presenting the antigen (or antigen peptide) outside the membrane. "A protein (or fusion protein, protein complex, etc.) capable of presenting an antigen (or antigenic peptide) outside the membrane, including an antigen-presenting MHC molecule” is expressed on the membrane of an extracellular vesicle, such as a plasmid.
  • the "protein (or fusion protein, protein complex, etc.) capable of extramembranely presenting an antigen (or antigenic peptide) containing an antigen-presenting MHC molecule” is a soluble antigen-presenting MHC molecule (limited to However, for example, fusion proteins containing MHC class I ⁇ chain and immunoglobulin heavy chain described in Patent Document 1; soluble MHC class I molecules described in JP 2007-161719 A ), soluble antigen-presenting MHC molecules and extracellular vesicles may be bound to the extracellular vesicle membrane via a lipid linker, peptide linker or the like as necessary (for example, the method described in JP-A-2018-104341 may be referred to).
  • a desired tag e.g., His tag, FLAG tag, PNE tag (SEQ ID NO: 79: NYHLENEVARLKKL), etc.
  • the tag is, for example, , may be expressed as a fusion protein together with other constituent elements, or may be bound to a separately prepared soluble antigen-presenting MHC molecule via a linker or the like, if necessary
  • an antibody against the tag or its Proteins including antigen-binding fragments eg, scFv, Fab or nanobodies
  • Antigen used herein is not particularly limited as long as it can have antigenicity, and includes not only peptide antigens but also non-peptide antigens such as phospholipids and complex carbohydrates (e.g. , mycolic acids, bacterial membrane components such as lipoarabinoannans, etc.).
  • non-peptide antigens such as phospholipids and complex carbohydrates (e.g. , mycolic acids, bacterial membrane components such as lipoarabinoannans, etc.).
  • antigenic peptide used herein is not particularly limited as long as it is a peptide that can serve as an antigen. can be anything.
  • Antigenic peptides include, but are not limited to, WT-1, ⁇ -fetal protein, MAGE-1, MAGE-3, placental alkaline phosphatase sialyl-Lewis X, CA-125, CA-19, TAG -72, epithelial glycoprotein 2, 5T4, alpha fetal protein receptor, M2A, tyrosinase, Ras, p53, Her-2/neu, EGF-R, estrogen receptor, progesterone receptor, myc, BCR-ABL, HPV type 16, melanotransferrin, MUC1, CD10, CD19, CD20, CD37, CD45R, IL-2 receptor ⁇ chain, T cell receptor, prostatic acid phosphatase, GP100, MelanA/Mart-1, gp75/Brown, BAGE, S- Tumor-associated antigen
  • viruses e.g. adenovirus, herpes simplex viruses, papillomaviruses, respiratory syncytiaviruses, poxviruses, HIV, influenza viruses, coronaviruses such as SARS-CoV and SARS-CoV2), intracellular parasites (e.g. Chlamydiaceae, Mycoplasmaceae, Acholeplasmaceae, Rickettsiaceae) ), helminths (e.g.
  • Antigenic peptides may include allergens that cause allergic symptoms.
  • allergens include, in addition to peptides derived from protozoa, bacteria, fungi, intracellular parasites and helminths, foreign peptides such as house dust, mites, animals (e.g. companion animals such as cats and dogs), and Peptides derived from pollen (for example, Japanese cedar and Japanese cypress) are exemplified. More specifically, proteins contained in cedar pollen such as Cryj1 are exemplified.
  • the allergen that causes allergic symptoms may be of food origin. Examples of allergens that cause allergic symptoms to food include peptides derived from eggs, milk, wheat, buckwheat, crab, shrimp and peanuts.
  • MHC molecule-restricted antigenic peptide means an antigenic peptide capable of binding to MHC molecules in vitro, in vivo and/or ex vivo.
  • the "MHC molecule-restricted antigenic peptide” usually has about 7 to about 30 amino acid residues.
  • MHC molecule-restricted antigen peptides include MHC class I molecule-restricted antigen peptides, MHC class II molecule-restricted antigen peptides, and the like.
  • MHC class I molecule-restricted antigenic peptide means an antigenic peptide capable of binding to MHC class I molecules in vitro, in vivo and/or ex vivo.
  • MHC class I molecule-restricted antigenic peptide is presented outside the membrane of extracellular vesicles, for example, the antigenic peptide is recognized by precursor T cells and the like, and can induce cytotoxic T cells and the like.
  • the number of amino acid residues of the "MHC class I molecule-restricted antigenic peptide" is usually about 7 to about 30, preferably about 7 to about 25, more preferably about 7 to about 20, still more preferably. is from about 7 to about 15, and even more preferably from about 7 to about 12.
  • MHC class II molecule-restricted antigenic peptide means an antigenic peptide capable of binding to MHC class II molecules in vitro, in vivo and/or ex vivo.
  • MHC class II molecule-restricted antigenic peptide is presented outside the membrane of extracellular vesicles, for example, the antigenic peptide is recognized by precursor T cells and the like, and can induce helper T cells and the like.
  • the number of amino acid residues of the "MHC class II molecule-restricted antigenic peptide" is usually about 7 to about 30, preferably about 10 to about 25, more preferably about 12 to about 24.
  • MHC molecule-restricted antigenic peptide As “MHC molecule-restricted antigenic peptide”, “MHC class I molecule-restricted antigenic peptide” or “MHC class II molecule-restricted antigenic peptide”, binding to MHC molecule, MHC class I molecule or MHC class II molecule is not particularly limited as long as it is an antigenic peptide capable of
  • T-cell-stimulating cytokine refers to stimulating (e.g., activating, suppressing, etc.) T-cells via receptors expressed on the membrane of T-cells. It is not particularly limited as long as it is a cytokine capable of T cell stimulatory cytokines include, but are not limited to, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-15, TGF- ⁇ , IFN- ⁇ , IFN- ⁇ and the like. Among these, those capable of forming multimers of homo- or hetero-subunits (e.g., IL-12, TGF- ⁇ , etc.) are functional as long as they have the desired pharmacological activity.
  • IL-15 may be a continuous amino acid sequence, optionally linked via a peptide linker or the like. It may be conjugated or fused to other full-length proteins or subsequence peptides thereof (eg, the Sushi domain of the IL-15 receptor) so long as it retains the ability to stimulate T cells.
  • the T cell-stimulating cytokines described herein may be derived from any animal species.
  • rodents such as mice and rats; lagomorphs such as rabbits; ungulates such as pigs, cows, goats, horses and sheep; carnivora such as dogs and cats; humans, monkeys, rhesus monkeys, cynomolgus monkeys, marmosets, Examples include those derived from animals such as mammals such as primates such as orangutans and chimpanzees.
  • the T cell stimulatory cytokines described herein are preferably of rodent or mammalian origin, more preferably of mouse or human origin.
  • the T cell-stimulating cytokines described herein are wild-type amino acid sequences (for example, in the case of IL-2, for example, SEQ ID NO: 25, etc.; IL- 4, for example, SEQ ID NO: 53, etc.) has an amino acid sequence identity of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more, and even more preferably 99% The above may be used.
  • the T cell-stimulating cytokines described herein have one or more amino acid deletions relative to their wild-type amino acid sequence, as long as they are capable of exerting their functions. Insertions, additions and/or substitutions may be made.
  • a protein that contains a (first, second) T cell-stimulating cytokine and is capable of extramembranely presenting the (first, second) T cell-stimulating cytokine means a protein that contains at least a T cell-stimulating cytokine and is capable of presenting the T cell-stimulating cytokine outside the membrane of a cell or extracellular vesicle.
  • a protein that contains a (first, second) T cell-stimulating cytokine and is capable of extramembranely presenting the (first, second) T cell-stimulating cytokine is a cell or extracellular small It may be expressed as a fusion protein containing a T cell-stimulating cytokine and a membrane protein or a fragment containing its transmembrane domain using a plasmid or the like so as to be expressed in the membrane of the vesicle.
  • the "protein capable of extramembranely presenting the (first, second) T cell-stimulating cytokine containing the (first, second) T cell-stimulating cytokine” is a soluble T cell stimulatory cytokines such as, but not limited to, T cell stimulatory cytokines themselves; fusion proteins of T cell stimulatory cytokines with the Fc portion of antibodies; T cell stimulatory cytokines and said T cell stimulatory
  • an antibody that recognizes a cytokine, or an antigen-binding fragment thereof e.g., scFv, Fab or nanobody
  • a soluble T cell-stimulating cytokine and a cell or extracellular vesicle If necessary, it may be bound to the extracellular vesicle membrane via a lipid linker, peptide linker, etc.
  • a desired tag e.g., His tag, FLAG tag, PNE tag
  • the tag is, for example, a fusion protein together with other constituents.
  • the tag may be bound to a separately prepared soluble T-cell-stimulating cytokine via a linker or the like, if necessary), an antibody against the tag or an antigen-binding fragment thereof (e.g., scFv, Fab or nanobody), etc.
  • an antibody against the tag or an antigen-binding fragment thereof e.g., scFv, Fab or Nanobody
  • a fusion protein, etc. in which a Nanobody against the tag is bound to the N-terminal side or C-terminal side of a membrane protein or its transmembrane domain that can be expressed on the membrane of a cell or extracellular vesicle
  • It may be mixed with cells or extracellular vesicles containing in the membrane under desired conditions (for example, Raj D, et al., Gut., 2019 Jun;68(6):1052-1064 etc.
  • T cell-stimulating cytokine formed by a multimer of subunits
  • one of the subunits is As long as the protein can be presented outside the cell or extracellular vesicle membrane, the remaining subunits need not be in a form capable of being presented outside the membrane.
  • functional T cell-stimulating cytokines can be assembled outside the membrane of extracellular vesicles, provided that the protein is capable of being presented outside the membrane of the extracellular vesicle.
  • T-cell co-stimulatory molecule refers to activation of T cells by interacting with molecules present on the membrane of T cells such as CD28 and CD134. It means a molecule that can contribute.
  • T cell co-stimulatory molecules include, but are not limited to, molecules such as CD80 and CD86, or extracellular domains thereof or functional fragments thereof; antibodies such as anti-CD28 antibodies and anti-CD134 antibodies. , or antigen-binding fragments thereof (e.g., scFv, Fab or nanobody), etc.; be done.
  • T cell co-stimulatory molecule containing a transmembrane domain means "T cell co-stimulatory molecule” that also contains a transmembrane domain derived from the T cell co-stimulatory molecule.
  • the T cell co-stimulatory molecules described herein may be derived from any animal species.
  • rodents such as mice, rats, hamsters and guinea pigs; lagomorphs such as rabbits; ungulates such as pigs, cows, goats, horses and sheep; carnivora such as dogs and cats; Examples include those derived from animals such as mammals such as cynomolgus monkeys, marmosets, orangutans, chimpanzees and other primates.
  • the T cell co-stimulatory molecules described herein are preferably of rodent or mammalian origin, more preferably of mouse or human origin.
  • the T cell co-stimulatory molecules described herein can exhibit , the amino acid sequence identity may be 80% or higher, preferably 90% or higher, more preferably 95% or higher, even more preferably 98% or higher, even more preferably 99% or higher.
  • the T cell co-stimulatory molecules described herein have one or more amino acid deletions relative to their wild-type amino acid sequence, as long as they are capable of performing their functions. Insertions, additions and/or substitutions may be made.
  • a protein comprising a T cell co-stimulatory molecule and capable of interacting with a T cell co-stimulatory molecule means at least a T cell co-stimulatory molecule, means a protein capable of interacting with molecules present in That is, it means that at least the portion of the T cell co-stimulatory molecule capable of interacting with T cells is located outside the membrane of the cell or extracellular vesicle.
  • Proteins that contain T cell costimulatory molecules and are capable of interacting with T cell costimulatory molecules are expressed using a plasmid or the like so that they are expressed on the membrane of cells or extracellular vesicles. It can be anything.
  • the "protein, including a T cell co-stimulatory molecule, capable of interacting with a T cell co-stimulatory molecule” may be a soluble T cell co-stimulatory molecule, such as, but not limited to, When using a fusion protein of the extracellular domain of CD80 and the Fc portion of an antibody; an anti-CD28 antibody, or an antigen-binding fragment thereof (e.g., scFv, Fab or nanobody), etc., a soluble T cell co-stimulatory molecule and cells or And extracellular vesicles, optionally via a lipid linker, a spacer sequence, etc., may be bound to the membrane of cells or extracellular vesicles (e.g., JP-A-2018-104341, etc.
  • a soluble T cell co-stimulatory molecule such as, but not limited to, When using a fusion protein of the extracellular domain of CD80 and the Fc portion of an antibody; an anti-CD28 antibody, or an antigen
  • a desired tag e.g., His tag, FLAG tag, PNE tag
  • the tag is, for example, a fusion protein together with other constituents.
  • the tag may be bound to separately prepared soluble T cell co-stimulatory molecules via a linker or the like, if necessary), an antibody against the tag or an antigen-binding fragment thereof (e.g., scFv, Fab or nanobody), etc.
  • an antibody against the tag or an antigen-binding fragment thereof e.g., scFv, Fab or Nanobody
  • a fusion protein, etc. in which a Nanobody against the tag is bound to the N-terminal side or C-terminal side of a membrane protein or its transmembrane domain that can be expressed on the membrane of a cell or extracellular vesicle
  • It may be mixed with cells or extracellular vesicles containing in the membrane under desired conditions (for example, Raj D, et al., Gut., 2019 Jun;68(6):1052-1064 etc. may refer to the method using a PNE tag and an antibody against the tag, etc.).
  • membrane protein or transmembrane domain thereof capable of being expressed on the membrane of a cell refers to any membrane protein or its transmembrane domain as long as it can be expressed on the cell membrane. You can choose your domain.
  • Membrane proteins or transmembrane domains thereof include, but are not limited to, part or all of CD8, CD4, CD28, transferrin receptors, etc., and part of the FC region of membrane-bound immunoglobulin molecules such as IgG1, IgG2, IgG4, etc. Those containing part or all are preferred.
  • any protein or domain thereof capable of binding to the cell membrane is selected as long as it is capable of binding to the cell membrane. be able to.
  • membrane protein or transmembrane domain thereof capable of being expressed in the membrane of extracellular vesicles used herein, as long as it can be expressed in the membrane of extracellular vesicles, Any membrane protein or transmembrane domain thereof can be chosen.
  • membrane protein or transmembrane domain thereof capable of being expressed in the membrane of extracellular vesicles is a membrane protein known to be expressed in extracellular vesicles (e.g., exosomes, etc.) (e.g., tetraspanin , CD58, ICAM-1, PTGFRN (see, for example, Non-Patent Document 1, International Publication No. 2019/183578, etc.), or the transmembrane domains thereof are preferred.
  • a protein or a domain thereof capable of binding to the membrane of extracellular vesicles is any protein as long as it can bind to the membrane of extracellular vesicles. Or you can select that domain.
  • a protein or a domain thereof capable of binding to the membrane of extracellular vesicles is known to bind to the membrane of extracellular vesicles (e.g., exosomes, etc.) (e.g., MFG-E8 , or domains thereof (eg, C1 and C2 domains of MFG-E8 described in Alain Delcayre, et al., Blood Cells, Molecules, and Diseases 35 (2005) 158-168)).
  • a membrane protein capable of being expressed in the membrane of a cell or extracellular vesicle or its transmembrane domain or "a protein capable of binding to the membrane of a cell or extracellular vesicle” or
  • the “domain” may be from any animal species. For example, rodents such as mice and rats; lagomorphs such as rabbits; ungulates such as pigs, cows, goats, horses and sheep; carnivora such as dogs and cats; humans, monkeys, rhesus monkeys, cynomolgus monkeys, marmosets, Examples include those derived from animals such as mammals such as primates such as orangutans and chimpanzees.
  • a membrane protein capable of being expressed in the membrane of a cell or extracellular vesicle or its transmembrane domain or "a protein capable of binding to the membrane of a cell or extracellular vesicle” or
  • the “domain” is preferably of rodent or mammalian origin, more preferably of murine or human origin.
  • mammalian extracellular vesicle markers are classified as follows.
  • Membrane proteins or GPI-anchored proteins that can be used as extracellular vesicle marker proteins include: 1) Non-tissue specific Tetraspanins (CD63, CD9, CD81, CD82), other multi-membrane membrane proteins (CD47, heterotrimeric G protein (GNA: Guanine nucleotide-binding proteins), etc.) MHC class I (HLA-A/B/C, H2-K/D/Q), integrins (ITGA/ITGB), transferrin receptor (TFR2); LAMP 1/2; heparan sulfate proteoglycans (including syndecans (SDC)); extracellular matrix metalloprotease inducer (EMMPRIN) (also known as BSG or CD147); ADAM10; CD73 (NT5E), a GPI-anchored 5' nucleotidase, GPI-anchored complement binding proteins CD55 and CD59; Sonic hedgehog
  • a protein that is an extracellular vesicle marker is a "membrane protein that can be expressed in the membrane of an extracellular vesicle” or "binds to the membrane of an extracellular vesicle” in the present invention. may be used as a protein capable of
  • tetraspanin means a protein belonging to the tetraspanin family (eg, but not limited to, CD9, CD53, CD63, CD81, CD82, CD151, etc.). Tetraspanins generally have, from the N-terminal side, transmembrane domain 1 (hereinafter also referred to as "TM1”), small extracellular loop (hereinafter also referred to as "SEL”), and transmembrane domain 2 (hereinafter referred to as "TM2").
  • TM1 transmembrane domain 1
  • SEL small extracellular loop
  • TM2 transmembrane domain 2
  • TM4 small intracellular loop
  • TM3 transmembrane domain 3
  • LEL large extracellular loop
  • TM4 transmembrane domain 4
  • Each domain (e.g., TM1, SEL, SIL, LTL, etc.) in the "tetraspanins" described herein may be derived from the same tetraspanin, or all or part thereof may be derived from different tetraspanins. may be
  • the tetraspanins described herein are wild-type amino acid sequences (e.g., in the case of full-length CD9, e.g., SEQ ID NO: 21; CD63, for example, SEQ ID NO: 27; full-length CD81, for example, SEQ ID NO: 15, etc.) have an amino acid sequence identity of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, More preferably 98% or more, still more preferably 99% or more.
  • the tetraspanins described herein have one or more amino acid deletions relative to their wild-type amino acid sequence, as long as they can be expressed in the membrane of extracellular vesicles. , insertions, additions and/or substitutions.
  • Partial sequences of tetraspanins described herein (e.g., each domain; TM1, SEL, TM2, SIL and TM3) ); a partial sequence containing TM4 (e.g., SEQ ID NO: 59 for CD63; SEQ ID NO: 63 for CD81)) has an amino acid sequence identity of 80% or more to the wild-type amino acid sequence. , preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more.
  • the tetraspanin partial sequences described herein have one or more amino acid deletions, insertions, additions and/or substitutions with respect to the wild-type amino acid sequence. good too.
  • MFG-E8 described herein differs from its wild-type amino acid sequence (eg, SEQ ID NO: 49, etc.) as long as it is capable of binding to the membrane of extracellular vesicles.
  • the identity may be 80% or higher, preferably 90% or higher, more preferably 95% or higher, even more preferably 98% or higher, even more preferably 99% or higher.
  • the MFG-E8 described herein has one or more amino acid residues relative to its wild-type amino acid sequence, as long as it is capable of binding to the membrane of extracellular vesicles. Deletions, insertions, additions and/or substitutions may be made.
  • CD58, PTGFRN, etc. described herein can be expressed on the membrane of extracellular vesicles or can bind to the membrane of extracellular vesicles.
  • the amino acid sequence identity is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more with respect to the wild-type amino acid sequence.
  • the CD58, PTGFRN, etc. described herein are capable of being expressed on the membrane of extracellular vesicles or capable of binding to the membrane of extracellular vesicles. As long as it has one or more amino acid deletions, insertions, additions and/or substitutions with respect to the wild-type amino acid sequence.
  • spacer sequence means any sequence having at least one amino acid residue that is present between two or more proteins or subsequences or domains thereof, or the like. Spacer sequences can be used, for example, in linking two or more proteins or subsequences or domains thereof. Spacer sequences include peptide linkers. The spacer sequence is generally 1 to about 50, preferably about 2 to about 28, more preferably about 4 to about 25 amino acid residues in length. Examples of spacer sequences include, but are not limited to, (GGGXS) n G m (where X is independently A or G, n is 1 to 8).
  • n G m (wherein n is 1 to 10 and m is 0 to 3); Ta S b (GGX) n G m (wherein each occurrence of X is independently S or T, n is 1-8, and m is 0-3 , a is 0 or 1, and b is 0 or 1) (eg, SEQ ID NO: 77, etc.);
  • extracellular vesicles that present antigen-presenting MHC molecules and T cell-stimulating cytokines outside the membrane are provided (Figure 2K(1)). exemplifies the model).
  • Such extracellular vesicles may present antigen-presenting MHC molecules and T cell-stimulating cytokines extramembranously by including proteins defined in the following (A) and (B) in the membrane, Antigen-presenting MHC molecules and T cell-stimulating cytokines may be presented extramembranely by including the protein defined in D) in the membrane.
  • isolated extracellular vesicles may be subsequently attached to their membrane surface with antigen-presenting MHC molecules and T cell-stimulating cytokines.
  • antigen-presenting MHC molecules are attached to the membrane surface by binding phospholipids to antigen-presenting MHC molecules and T cell-stimulating cytokines, respectively, and incorporating the phospholipid moieties into the membrane of extracellular vesicles. and T cell stimulatory cytokines may be attached.
  • Phosphatidylserine is present on the surface of extracellular vesicles.
  • MFG-E8 which binds to phosphatidylserine, is synthesized and purified by fusing an antigen-presenting MHC molecule or a T cell-stimulating cytokine to be presented, and the fusion protein is mixed with extracellular vesicles.
  • extracellular vesicles can be produced that present antigen-presenting MHC molecules and T cell-stimulating cytokines on the membrane surface.
  • PNE-tagged antigen-presenting MHC molecules and T cell-stimulating cytokines were added to extracellular vesicles in which peptide neoepitope (PNE) nanobodies were pre-expressed to present them on the membrane surface of the extracellular vesicles.
  • PNE peptide neoepitope
  • Biotinylated antigen-presenting MHC molecules and T cell-stimulating cytokines may be added to streptavidin-expressing extracellular vesicles and presented on the membrane surface of the extracellular
  • multiple types (2, 3, 4, 5) of antigen-presenting MHC molecules and multiple types (2, 3, 4, 5) of T cell stimulating cytokines (each T cell stimulating hereinafter, may be referred to as a first T cell-stimulating cytokine, a second T cell-stimulating cytokine, a further T cell-stimulating cytokine, etc.) is presented extramembranely in order to identify the sex cytokine It may be an extracellular vesicle. Alternatively, it may be an extracellular vesicle that presents one type of antigen-presenting MHC molecule and multiple types of cell-stimulating cytokines outside the membrane (Fig. 2K(3) shows one type of antigen-presenting MHC molecule and two types of T exemplify a model of extracellular vesicles that present cell-stimulatory cytokines extramembranously).
  • cells are provided that display antigen-presenting MHC molecules and T cell-stimulating cytokines extramembranously (corresponding to the model of extracellular vesicles in FIG. 2K(1)).
  • antigen-presenting cells may present antigen-presenting MHC molecules and T cell-stimulating cytokines extramembranously by including proteins defined in (A) and (B) below in their membranes, or (D ) in the membrane, antigen-presenting MHC molecules and T cell-stimulating cytokines may be presented extramembranely.
  • multiple types (2, 3, 4, 5) of antigen-presenting MHC molecules and multiple types (2, 3, 4, 5) of T cell stimulating cytokines (each T cell stimulating hereinafter, may be referred to as a first T cell-stimulating cytokine, a second T cell-stimulating cytokine, a further T cell-stimulating cytokine, etc.) is presented extramembranely in order to identify the sex cytokine It may be a cell. Alternatively, it may be a cell that presents one type of antigen-presenting MHC molecule and multiple types of cell-stimulating cytokines outside the membrane (corresponding to the extracellular vesicle model in FIG. 2K(3)).
  • an antigen-presenting cell or antigen-presenting extracellular vesicle the membrane of which comprises: (A) a protein capable of extramembranously presenting said antigen, comprising an antigen-presenting MHC molecule; and (B) comprising a first T cell stimulating cytokine, presenting said first T cell stimulating cytokine extramembranously. possible proteins;
  • An antigen-presenting cell or antigen-presenting extracellular vesicle comprising:
  • the above-mentioned "protein that can present an antigen outside the membrane, including an antigen-presenting MHC molecule" of (A) above is a protein that can present an antigen outside the membrane of a cell or extracellular vesicle. In addition to, other proteins or domains thereof may be included.
  • the above (A) comprises an antigen-presenting MHC molecule and a membrane protein or its transmembrane domain that can be expressed on the membrane of a cell or extracellular vesicle, or a cell or extracellular vesicle.
  • a fusion protein or protein complex capable of extramembrane presentation of the antigen comprising a protein or domain thereof capable of binding to the membrane.
  • (A) above is (A) A fusion protein capable of extramembrane presentation of an antigenic peptide, from its N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC molecule-restricted antigen peptide, (A-2) an optionally present spacer sequence, and (A-3) the amino acid sequence of a single-chain MHC molecule containing a transmembrane domain, a fusion protein comprising an amino acid sequence comprising, in that order, or (A) a protein complex capable of presenting an antigenic peptide outside the membrane, From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC molecule-restricted antigen peptide, (A-2) optionally present spacer sequence, and (A-3) consisting of MHC class I ⁇ chain, fusion protein of ⁇ 2 microglobulin and MHC class I ⁇ chain, MHC class II ⁇ chain, or MHC class II ⁇ chain a fusion protein comprising an amino acid sequence;
  • (A) above is (A) A fusion protein capable of extramembrane presentation of an antigenic peptide, from its N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class I molecule-restricted antigen peptide, (A-2) an optionally present spacer sequence, and (A-3) the amino acid sequence of a single-chain MHC class I molecule containing a transmembrane domain, is a fusion protein capable of presenting the antigen peptide outside the membrane, comprising an amino acid sequence containing in this order:
  • the above (A) is (A) A fusion protein capable of extramembrane presentation of an antigenic peptide, from its N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class II molecule-restricted antigen peptide, (A-2) an optionally present spacer sequence, and (A-3)) the amino acid sequence of a single-chain MHC class II molecule comprising a
  • (A) above is (A) A protein complex capable of presenting an antigenic peptide outside the membrane, From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class I molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence that may be present, (A-3) Amino acid sequence of fusion protein of ⁇ 2 microglobulin and MHC class I ⁇ chain, in that order.
  • the above (A) is (A) A protein complex capable of presenting an antigenic peptide outside the membrane, From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class I molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence that may be present, and (A-3) an amino acid sequence of an MHC class I ⁇ chain, a fusion protein comprising an amino acid sequence comprising, in that order, (A-6) A protein complex comprising a protein comprising the amino acid sequence of ⁇ 2 - microglobulin.
  • the above (A) is (A) A protein complex capable of presenting an antigenic peptide outside the membrane, From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class II molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence that may be present, (A-3) amino acid sequence of MHC class II ⁇ chain, a fusion protein comprising an amino acid sequence comprising, in that order, (A-6) A protein complex comprising a protein comprising an amino acid sequence of MHC class II ⁇ chain.
  • the above (A) is (A) A protein complex capable of presenting an antigenic peptide outside the membrane, From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class II molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence that may be present, and (A-3) an amino acid sequence of an MHC class II ⁇ chain, a fusion protein comprising an amino acid sequence comprising, in that order, (A-6) A protein complex comprising a protein comprising an amino acid sequence of an MHC class II ⁇ chain.
  • the above (A) is a fusion protein or protein capable of extramembrane presentation of the antigen, comprising an antigen-presenting MHC molecule and tetraspanin or its transmembrane domain or MFG-E8 or its domain. Complex.
  • (A) above is From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence that may be present, (A-3) the amino acid sequence of a single-chain MHC molecule; (A-4) a spacer sequence that may be present, and (A-5) a fusion protein comprising an amino acid sequence comprising, in this order, the amino acid sequence of tetraspanin or its membrane-binding domain, or from its N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence that may be present, (A-3) Amino acid sequence of extramembrane domain of MHC class I ⁇ chain, ⁇ 2 microglobulin, extramembrane domain of MHC class II ⁇ chain, or extramembrane domain of MHC class II ⁇ chain (A-4) even if present A fusion protein
  • (A) above is From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class I molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence that may be present, (A-3) the amino acid sequence of a single-chain MHC class I molecule; (A-4) a spacer sequence that may be present, and (A-5) a fusion capable of extramembranely presenting the antigen peptide, comprising an amino acid sequence comprising the amino acid sequence of tetraspanin or its transmembrane domain in this order. is protein.
  • the above (A) is From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class II molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence that may be present, (A-3) the amino acid sequence of a single-chain MHC class II molecule; (A-4) a spacer sequence that may be present, and (A-5) a fusion capable of extramembranely presenting the antigen peptide, comprising an amino acid sequence comprising the amino acid sequence of tetraspanin or its transmembrane domain in this order. is protein.
  • (A) above is From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class I molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence that may be present, (A-3) amino acid sequence of ⁇ 2 microglobulin, (A-4) an optionally present spacer sequence, and (A-5) an amino acid sequence comprising, in that order, the amino acid sequence of a tetraspanin or transmembrane domain thereof; and (A-6) A protein complex comprising a protein comprising an amino acid sequence of MHC class I ⁇ chain.
  • the above (A) is (A) A protein complex capable of presenting an antigenic peptide outside the membrane, From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class I molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence that may be present, (A-3) amino acid sequence of extramembrane region of MHC class I ⁇ chain, (A-4) an optionally present spacer sequence, and (A-5) an amino acid sequence comprising, in that order, the amino acid sequence of a tetraspanin or transmembrane domain thereof; and (A-6) A protein complex comprising a protein comprising the amino acid sequence of ⁇ 2 - microglobulin.
  • the above (A) is (A) A protein complex capable of presenting an antigenic peptide outside the membrane, From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class II molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence that may be present, (A-3) the amino acid sequence of the extramembrane region of the MHC class II ⁇ chain, (A-4) an optionally present spacer sequence, and (A-5) an amino acid sequence comprising, in that order, the amino acid sequence of a tetraspanin or transmembrane domain thereof; and (A-6) A protein complex comprising a protein comprising an amino acid sequence of MHC class II ⁇ chain.
  • the above (A) is (A) A protein complex capable of presenting an antigenic peptide outside the membrane, From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class II molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence that may be present, (A-3) Amino acid sequence of extramembrane region of MHC class II ⁇ chain, (A-4) a spacer sequence that may be present, and (A-5) a fusion protein comprising an amino acid sequence comprising tetraspanin in that order; (A-6) A protein complex comprising a protein comprising an amino acid sequence of an MHC class II ⁇ chain.
  • the "single-chain MHC class I molecule" is a "single-chain MHC class I molecule"
  • the “single-chain MHC class I molecule” is ⁇ 2 microglobulin (e.g., SEQ ID NO: 7, etc., or those having an amino acid sequence identity of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more)
  • exist optional spacer sequence if present, e.g., SEQ ID NO: 5, 11, 29, 39, 77, etc.
  • MHC class I ⁇ chain e.g., SEQ ID NO: 9, etc., or amino acid sequence identity thereto
  • the "single-chain MHC class I molecule” is SEQ ID NO: 65, or 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more.
  • the "single-chain MHC class II molecule” when the "single-chain MHC class II molecule" is a "single-chain MHC class II molecule", the “single-chain MHC class II molecule” is an MHC class II ⁇ chain from the N-terminal side, It consists of a good spacer sequence and an MHC class II ⁇ chain.
  • MHC class I ⁇ chain is SEQ ID NO: 9, or an amino acid Sequence identity is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more.
  • the "MHC class II ⁇ chain” is SEQ ID NO: 37, or an amino acid Sequence identity is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more.
  • MHC class II ⁇ chain is SEQ ID NO: 71, or amino acids Sequence identity is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more.
  • (A-2) and (A-4) in each of the above embodiments, if present, can be selected independently.
  • A-2 if present, may be a spacer sequence such as SEQ ID NO: 5, 11, 29, 39, 77, for example.
  • A-4 if present, may be a spacer sequence such as SEQ ID NO: 5, 11, 29, 39, 77, for example.
  • the tetraspanin (A-5) in each of the above embodiments is selected from the group consisting of CD9, CD63 and CD81.
  • the tetraspanin of (A-5) in each of the above embodiments is CD81 (preferably, SEQ ID NO: 15, etc., or has an amino acid sequence identity of 80% or more, preferably 90%, to CD81. above, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more).
  • (A) above is From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class I molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence of SEQ ID NO: 5; (A-3) SEQ ID NO: 65 (or amino acid sequence identity to 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more) and (A-5) SEQ ID NO: 15 (or 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more amino acid sequence identity to it) , more preferably 98% or more, even more preferably 99% or more) of the tetraspanin or its transmembrane domain in that order.
  • (A) above is (A) A protein complex capable of presenting an antigenic peptide outside the membrane, From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class II molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence of SEQ ID NO: 39; (A-3) SEQ ID NO: 37 (or amino acid sequence identity to 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more (A-5) SEQ ID NO: 15 (or amino acid sequence identity to 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and further (A-6) SEQ ID NO: 71 (or this 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more of the amino acid sequence identity with the MHC class II ⁇ chain amino acid sequence is a protein complex containing
  • the "protein capable of extramembranely presenting the first T cell-stimulating cytokine containing the first T cell-stimulating cytokine" of (B) above expresses the first T cell-stimulating cytokine extramembranously.
  • other proteins or domains thereof may be included as long as the protein can be presented.
  • the above (B) comprises a first T cell-stimulating cytokine and a membrane protein capable of being expressed in the membrane of a cell or extracellular vesicle or its transmembrane domain or extracellular small
  • a fusion protein capable of extramembranously presenting said first T cell stimulating cytokine comprising a protein or domain thereof capable of binding to the membrane of the vesicle.
  • the above (B) is a fusion capable of extramembranally presenting the first T cell stimulating cytokine and the first T cell stimulating cytokine comprising CD8 or a transmembrane domain thereof. is protein.
  • (B) above is From the N-terminal side, (B-3) a first T cell-stimulating cytokine; (B-4) a spacer sequence that may be present, and (B-5) a fusion capable of extramembranely presenting the first T cell-stimulating cytokine, comprising an amino acid sequence consisting of CD8 or a transmembrane domain thereof is protein.
  • (B) above is (B) a fusion protein capable of extramembranally presenting the first T cell-stimulating cytokine, comprising a first T cell-stimulating cytokine and a partial sequence of tetraspanin, wherein the partial sequence of tetraspanin is a fusion protein having at least two transmembrane domains, wherein said first T cell stimulating cytokine is disposed between said two transmembrane domains; or (B) a first T cell stimulating cytokine and MFG-E8 or a domain thereof, capable of extramembranely presenting the first T-cell stimulating cytokine.
  • a partial sequence of tetraspanin has at least two transmembrane domains, and said first T cell stimulating cytokine is located between said two transmembrane domains
  • the tetraspanin partial sequence comprises at least TM1 and TM2 of the tetraspanin, and the first T-cell stimulating cytokine is located between TM1 and TM2, the tetraspanin partial sequence is tetraspanin
  • it includes at least TM3 and TM4
  • the first T cell-stimulating cytokine is located between TM3 and TM4.
  • (B) above is From the N-terminal side, (B-1) a partial sequence of tetraspanin containing, from the N-terminal side, transmembrane domain 1, small extracellular loop, transmembrane domain 2, small intracellular loop and transmembrane domain 3; (B-2) a spacer sequence that may be present, (B-3) a first T cell-stimulating cytokine; (B-4) a spacer sequence that may be present, and (B-5) an amino acid sequence consisting of a partial sequence of a tetraspanin containing transmembrane domain 4, the first T cell-stimulating cytokine extramembranely a displayable fusion protein, or (B) from its N-terminal side, (B-3) a first T cell-stimulating cytokine; (B-4) a spacer sequence that may be present, and (B-5) MFG-E8 A fusion protein capable of extramembranously presenting said
  • tetraspanins can be expressed in membranes even if their large extracellular loops (LELs) have been replaced in whole or in part with different amino acid sequences. It has been reported. Therefore, the first T cell-stimulating cytokine (B-3) may be inserted in place of the tetraspanin LEL via an optionally present spacer sequence, or may be inserted in or in the tetraspanin LEL. It may be inserted at any position in the partial sequence.
  • (B-1) "Tetraspanin partial sequence containing transmembrane domain 1, small extracellular loop, transmembrane domain 2, small intracellular loop and transmembrane domain 3" usually contains transmembrane domain 4 of tetraspanin. do not have.
  • (B-1) "Tetraspanin partial sequence containing transmembrane domain 1, small extracellular loop, transmembrane domain 2, small intracellular loop and transmembrane domain 3" contains a large extracellular loop or a partial sequence thereof You can stay.
  • Each of the transmembrane domain 1, the small extracellular loop, the transmembrane domain 2, the small intracellular loop and the transmembrane domain 3 in (B-1) may be a sequence derived from a different tetraspanin, They may all be sequences derived from the same tetraspanin.
  • each of the transmembrane domain 1, the small extracellular loop, the transmembrane domain 2, the small intracellular loop and the transmembrane domain 3 in (B-1) is the same tetraspanin-derived sequence.
  • the partial sequences of tetraspanin comprising transmembrane domain 1, small extracellular loop, transmembrane domain 2, small intracellular loop and transmembrane domain 3 in (B-1) are all CD9 derived, CD63-derived or CD81-derived partial sequences.
  • the partial sequences of tetraspanin comprising transmembrane domain 1, small extracellular loop, transmembrane domain 2, small intracellular loop and transmembrane domain 3 of (B-1) are all CD63 or CD81 derived partial sequence (preferably SEQ ID NO: 57 or SEQ ID NO: 61, etc., or amino acid sequence identity to it of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more , and more preferably 99% or more).
  • the "partial sequence of tetraspanin containing transmembrane domain 4" of (B-5) usually includes transmembrane domain 1, small extracellular loop, transmembrane domain 2, small intracellular loop and transmembrane domain 3 of tetraspanin. do not have.
  • the “partial sequence of tetraspanin containing transmembrane domain 4” of (B-5) may contain a large extracellular loop or a partial sequence thereof.
  • the transmembrane domain 4 in (B-5) may be a tetraspanin-derived sequence different from (B-1), or may be the same tetraspanin-derived sequence as (B-1).
  • transmembrane domain 4 in (B-5) is the same tetraspanin-derived sequence as in (B-1).
  • the partial sequence of tetraspanin containing transmembrane domain 4 in (B-5) is a partial sequence derived from CD9, CD63 or CD81.
  • the partial sequence of tetraspanin containing transmembrane domain 4 of (B-5) is a partial sequence derived from CD63 or CD81 (preferably SEQ ID NO: 59 or SEQ ID NO: 63, etc., or and have an amino acid sequence identity of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more).
  • the "partial sequence of tetraspanin containing transmembrane domain 1, small extracellular loop, transmembrane domain 2, small intracellular loop and transmembrane domain 3" of (B-1) is derived from CD63.
  • the “partial sequence of tetraspanin containing transmembrane domain 4” of (B-5) is a CD63-derived partial sequence (preferably, SEQ ID NO: 59, etc., or amino acid sequence identity of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more).
  • the "partial sequence of tetraspanin containing transmembrane domain 1, small extracellular loop, transmembrane domain 2, small intracellular loop and transmembrane domain 3" of (B-1) is derived from CD81.
  • the “partial sequence of tetraspanin containing transmembrane domain 4” of (B-5) is a CD81-derived partial sequence (preferably, SEQ ID NO: 63, etc., or amino acid sequence identity of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more).
  • the fusion protein of (B) above is a fusion protein comprising a partial sequence of tetraspanin, and one or more of (A) above and (C) optionally present below comprises a fusion protein comprising an amino acid sequence of tetraspanin.
  • the fusion protein of (B) above may be a separate fusion protein from the optionally present fusion protein of (A) and/or below (C), or It may constitute a part of the fusion protein of (C) that is present in the case of.
  • the fusion protein of (B) above "constitutes a part of the fusion protein of (A) above and/or (C) optionally present below” means, for example, that the tetraspanin of (A-5) is (B) and/or a case where the tetraspanin (C-3), which is optionally present as described below, constitutes the fusion protein (B).
  • MFG-E8 of (B-5) above preferably has an amino acid sequence identity of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more to SEQ ID NO: 49 or the like, and further It is preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher.
  • the first T cell-stimulating cytokine in (B-3) of each of the above embodiments is IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-15 or TGF - ⁇ .
  • the first T cell-stimulating cytokine in (B-3) of each of the above embodiments is IL-2 (preferably SEQ ID NO: 25, or 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more, even more preferably 99% or more), IL-4 (preferably, SEQ ID NO: 53, or with amino acid sequence identity of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more), or TGF- ⁇ (preferably, the sequence No. 73, or 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more amino acid sequence identity
  • (B-2) and (B-4) of each of the above embodiments can be selected independently.
  • (B-2), if present, may be a spacer sequence such as SEQ ID NO: 5, 11, 29, 39, 77, for example.
  • (B-4), if present, may be a spacer sequence such as SEQ ID NO: 5, 11, 29, 39, 77, for example.
  • (B) above is From the N-terminal side, (B-1) SEQ ID NO: 57 (or amino acid sequence identity to it of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more a partial sequence of the tetraspanins of (B-2) a spacer sequence of SEQ ID NO: 29; (B-3) SEQ ID NO: 25 (or amino acid sequence identity to it of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more (B-4) the spacer sequence of SEQ ID NO: 29, and (B-5) SEQ ID NO: 59 (or with amino acid sequence identity to 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more of the partial sequence of tetraspanin. It is a fusion protein
  • the above (B) is SEQ ID NO: 31 (or a above, and even more preferably above 99%), the fusion protein capable of extramembranously presenting said first T cell stimulating cytokine.
  • (B) above is From the N-terminal side, (B-1) SEQ ID NO: 61 (or amino acid sequence identity of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more to SEQ ID NO: 61) partial sequence of tetraspanins of (B-2) a spacer sequence of SEQ ID NO: 29; (B-3) SEQ ID NO: 53 (or amino acid sequence identity to it of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more a first T cell-stimulating cytokine, which is IL-4 of (B-4) the spacer sequence of SEQ ID NO: 29, and (B-5) SEQ ID NO: 63 (or amino acid sequence identity to 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and further preferably 98% or more, more preferably 99% or more to SEQ ID NO
  • the above (B) is SEQ ID NO: 55 (or 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% amino acid sequence identity to it) above, and even more preferably above 99%), the fusion protein capable of extramembranously presenting said first T cell stimulating cytokine.
  • (B) above is From the N-terminal side, (B-3) SEQ ID NO: 73 (or amino acid sequence identity to it of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more a first T cell-stimulating cytokine, which is TGF- ⁇ of (B-4) a spacer sequence of SEQ ID NO: 29, and (B-5) SEQ ID NO: 49 (or amino acid sequence identity to 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and further preferably 98% or more, even more preferably 99% or more) of MFG-E8
  • a fusion protein capable of extramembranously presenting said first T cell stimulating cytokine which is an amino acid sequence consisting of:
  • the above (B) is SEQ ID NO: 75 (or 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% amino acid sequence identity to SEQ ID NO: 75). above, and even more preferably above 99%), the fusion protein capable of extramembranously presenting said first T cell stimulating cytokine.
  • a second (or more) T cell-stimulating cytokine are, in addition to the first T cell-stimulating cytokine, a second (or more) T cell A stimulatory cytokine may also be included.
  • the antigen presenting cells or antigen presenting extracellular vesicles described herein further comprise a second T cell stimulating cytokine.
  • the antigen-presenting MHC molecule is an antigen-presenting MHC class II molecule
  • the antigen-presenting cells or antigen-presenting extracellular vesicles described herein comprise a second T cell-stimulating cytokine. is preferred.
  • the second (or more) T cell-stimulating cytokine may, for example, be inserted into (B) above (for example, N A second (or more) T cell-stimulating cytokine may be linked to the terminal side and/or the C-terminal side via a spacer sequence or the like, if necessary).
  • the second (or more) T cell-stimulatory cytokine has the same composition as component (B) described herein, thereby membrane of an antigen-presenting cell or antigen-presenting extracellular vesicle as described herein, as well as the first T cell-stimulating cytokine may be included in
  • the second T cell stimulatory cytokine is IL-2, IL-4, IL-6, IL-12 or TGF- ⁇ .
  • the second T cell stimulatory cytokine is TGF- ⁇ (preferably SEQ ID NO: 73, or 80% or more, preferably 90% or more, more than 80% amino acid sequence identity to it). preferably 95% or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more).
  • the first T cell stimulatory cytokine is IL-2 or IL-4 (preferably SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 53, or an amino acid sequence identity of 80% or greater thereto) , preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more, even more preferably 99% or more), and the second T cell stimulatory cytokine is TGF- ⁇ (preferably is SEQ ID NO: 73, or has an amino acid sequence identity of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more) is.
  • TGF- ⁇ preferably is SEQ ID NO: 73, or has an amino acid sequence identity of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more
  • an antigen-presenting cell or antigen-presenting extracellular vesicle as described herein wherein the membrane comprises: (A) an antigen-presenting MHC molecule and a membrane protein capable of being expressed on the membrane of a cell or an extracellular vesicle or a transmembrane domain thereof, or a protein capable of binding to the membrane of an extracellular vesicle or a domain thereof and (B) a first T cell-stimulating cytokine and a membrane protein capable of being expressed on the membrane of a cell or extracellular vesicle.
  • An antigen-presenting cell or antigen-presenting extracellular vesicle comprising
  • an antigen-presenting cell as described herein, whose membrane comprises: (A) A protein complex capable of presenting an antigenic peptide outside the membrane, From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class I molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence that may be present, and (A-3) an amino acid sequence of an MHC class I ⁇ chain, a fusion protein comprising an amino acid sequence comprising, in that order, (A-6) a protein complex comprising a protein comprising the amino acid sequence of ⁇ 2 microglobulin; and (B) from the N-terminal side, (B-3) the amino acid sequence of the first T cell-stimulating cytokine; (B-4) a spacer sequence that may be present, and (B-5) an amino acid sequence comprising the amino acid sequence of CD8 or its transmembrane domain in this order, It is an antigen-presenting cell that contains a fusion protein that can be presented to the outside
  • an antigen-presenting extracellular vesicle as described herein wherein the membrane comprises: (A) a fusion protein or protein complex capable of extramembrane presentation of the antigen, comprising an antigen-presenting MHC molecule and a tetraspanin or its transmembrane domain or MFG-E8 or its domain; and (B) a first T A fusion protein capable of extramembranously presenting said first T cell stimulating cytokine comprising a cell-stimulating cytokine and a tetraspanin partial sequence, wherein said tetraspanin partial sequence comprises at least two transmembrane domains.
  • first T cell stimulatory cytokine is disposed between said two transmembrane domains; or (B) a first T cell stimulatory cytokine and MFG-E8 or its a fusion protein capable of extramembranely presenting said first T cell stimulating cytokine comprising a domain; is an antigen-presenting extracellular vesicle containing
  • an antigen-presenting extracellular vesicle as described herein wherein the membrane comprises: (A) A fusion protein capable of extramembrane presentation of an antigenic peptide, from its N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence that may be present, (A-3) the amino acid sequence of a single-chain MHC molecule; (A-4) a spacer sequence that may be present, and (A-5) a fusion protein comprising an amino acid sequence comprising the amino acid sequence of a tetraspanin or its transmembrane domain in this order, or (A) an antigenic peptide that is transmembrane An externally-presentable protein complex, From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence that may be present, (A-3) MHC class I
  • an antigen-presenting extracellular vesicle as described herein wherein the membrane comprises: (A) A protein complex capable of presenting an antigenic peptide outside the membrane, From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class II molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence that may be present, (A-3) amino acid sequence of MHC class II ⁇ chain, (A-4) an optionally present spacer sequence, and (A-5) an amino acid sequence comprising, in that order, the amino acid sequence of a tetraspanin or transmembrane domain thereof; and (A-6) a protein complex comprising a protein comprising an amino acid sequence of an MHC class II ⁇ chain; is an antigen-presenting extracellular vesicle containing
  • the first T cell stimulatory cytokine is IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-15 or TGF- ⁇ of antigen-presenting extracellular vesicles.
  • extracellular vesicles as described herein which additionally present T cell co-stimulatory molecules outside their membrane (illustrating the model in Figure 2K(2)).
  • Such extracellular vesicles may display T cell co-stimulatory molecules outside the membrane by including a protein defined in (C) below in the membrane.
  • isolated extracellular vesicles may be subsequently attached to their membrane surface with T cell co-stimulatory molecules.
  • the method of attachment is not particularly limited, by binding each phospholipid to the T cell co-stimulatory molecule and incorporating the phospholipid portion into the membrane of extracellular vesicles, antigen-presenting MHC molecules and T cell-stimulating molecules are attached to the membrane surface. Cytokines may be attached.
  • an antigen-presenting extracellular vesicle as described herein wherein the membrane comprises: (C) a protein comprising a T cell co-stimulatory molecule and capable of interacting with the T cell co-stimulatory molecule; is an antigen-presenting extracellular vesicle containing
  • C The above-mentioned (C) "a protein capable of interacting with a T cell co-stimulatory molecule and a T cell, including a T cell co-stimulatory molecule" is a protein capable of interacting with the T cell co-stimulatory molecule and T cells. To the extent possible, other proteins or domains thereof may be included in addition to the T cell co-stimulatory molecule.
  • the above (C) comprises a T cell co-stimulatory molecule and a membrane protein or transmembrane domain thereof capable of being expressed on the membrane of a cell or extracellular vesicle, or the membrane of an extracellular vesicle.
  • a fusion protein capable of interacting with said T cell co-stimulatory molecule and a T cell comprising a protein or domain thereof capable of binding to
  • the above (C) is a protein that contains a T cell co-stimulatory molecule containing a transmembrane domain and is capable of interacting with the T cell co-stimulatory molecule.
  • the above (C) comprises a T cell costimulatory molecule and a tetraspanin or a transmembrane domain thereof or MFG-E8 or a domain thereof, wherein the T cell costimulatory molecule interacts with T cells. It is an operable fusion protein.
  • (C) above is (C) from its N-terminal side, (C-1) the amino acid sequence of the T cell co-stimulatory molecule, (C-2) a spacer sequence that may be present; and (C-3) an amino acid sequence comprising an amino acid sequence of a tetraspanin or a transmembrane domain thereof in this order, and the T cell co-stimulatory molecule and the T cell It is an interactable fusion protein.
  • the T cell co-stimulatory molecule (C-1) is CD80 or CD86.
  • the T cell co-stimulatory molecule in (C-1) is CD80 (preferably SEQ ID NO: 67 or the like, or has an amino acid sequence identity of 80% or more, preferably 90% or more to CD80). , more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more).
  • spacer sequence that may be present in (C-2) above, if present, may be, for example, a spacer sequence such as SEQ ID NO: 5, 11, 29, 39, 77, or the like.
  • the tetraspanin of (C-3) is selected from the group consisting of CD9, CD63 and CD81.
  • the tetraspanin in (C-3) is CD9 (preferably SEQ ID NO: 21, etc., or has an amino acid sequence identity of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more).
  • (C) above is (C) from its N-terminal side, (C-1) SEQ ID NO: 67 (or amino acid sequence identity to it of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more and (C-3) SEQ ID NO: 21 (or 80% or more, preferably 90% or more amino acid sequence identity to it, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, even more preferably 99% or more of the T cell co-stimulatory molecule and the T cell comprising the amino acid sequence of tetraspanin or its transmembrane domain in that order. is a fusion protein that can interact with
  • (C) is SEQ ID NO: 69 (or 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% amino acid sequence identity to SEQ ID NO: 69). above, and even more preferably above 99%), the fusion protein is capable of interacting between said T cell co-stimulatory molecule and T cells.
  • an antigen-presenting extracellular vesicle as described herein wherein the membrane comprises: (A) A fusion protein capable of extramembrane presentation of an antigenic peptide, from its N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class I molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence of SEQ ID NO: 5, (A-3) SEQ ID NO: 65 (or amino acid sequence identity to it of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more and (A-5) SEQ ID NO: 15 (or 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more amino acid sequence identity to it) , more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more) of tetraspanin or its transmembrane domain amino acid sequence in this order; and (B) from the N-terminal side, (B-1) SEQ ID NO: 15 (or
  • an antigen-presenting extracellular vesicle as described herein wherein the membrane comprises: (A) A fusion protein capable of extramembrane presentation of an antigenic peptide, from its N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class I molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence of SEQ ID NO: 5, (A-3) SEQ ID NO: 65 (or amino acid sequence identity to it of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more and (A-5) SEQ ID NO: 15 (or 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more amino acid sequence identity to it) , more preferably 98% or more, even more preferably 99% or more) of tetraspanins or transmembrane domains thereof in that order; and (B) SEQ ID NO: 31 (or On the other hand, the first
  • an antigen-presenting extracellular vesicle as described herein wherein the membrane comprises: (A) A fusion protein capable of extramembrane presentation of an antigenic peptide, from its N-terminal side, (A-1) MHC class I molecule-restricted antigenic peptide, (A-2) a spacer sequence of SEQ ID NO: 5, (A-3) SEQ ID NO: 65 (or amino acid sequence identity to it of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more and (A-5) SEQ ID NO: 15 (or 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 95% or more amino acid sequence identity to is 98% or more, even more preferably 99% or more) of the amino acid sequence consisting of tetraspanins; (B) from the N-terminal side, (B-1) SEQ ID NO: 57 (or amino acid
  • an antigen-presenting extracellular vesicle as described herein wherein the membrane comprises: (A) A fusion protein capable of extramembrane presentation of an antigenic peptide, from its N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class I molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence of SEQ ID NO: 5, (A-3) SEQ ID NO: 65 (or amino acid sequence identity to 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more) and (A-5) SEQ ID NO: 15 (or 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more amino acid sequence identity to it) , more preferably 98% or more, even more preferably 99% or more) of tetraspanins or transmembrane domains thereof in that order; (B) SEQ ID NO: 31 (or 80% or more, preferably 90% or
  • an antigen-presenting extracellular vesicle as described herein wherein the membrane comprises: (A) A protein complex capable of presenting an antigenic peptide outside the membrane, From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class II molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence of SEQ ID NO: 39; (A-3) SEQ ID NO: 37 (or 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more amino acid sequence identity to it) (A-5) SEQ ID NO: 15 (or amino acid sequence identity to 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and further amino acid sequences of tetraspanins or transmembrane domains thereof, preferably 98% or more, even more preferably 99% or more; and (A-6) SEQ ID NO: 71 (or 80% or more, preferably 90% or
  • a fusion protein capable of extramembranely presenting the first T cell-stimulating cytokine; and (C) from the N-terminal side, (C-1) SEQ ID NO: 67 (or amino acid sequence identity to it of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more and (C-3) SEQ ID NO: 21 (or 80% or more, preferably 90% or more amino acid sequence identity to it, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, even more preferably 99% or more) of the T cell co-stimulatory molecule and the T cell comprising the amino acid sequence of tetraspanin or its transmembrane domain in that order.
  • a fusion protein capable of interacting with; is an antigen-presenting extracellular vesicle containing
  • an antigen-presenting extracellular vesicle as described herein wherein the membrane comprises: (A) A protein complex capable of presenting an antigenic peptide outside the membrane, From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class II molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence of SEQ ID NO: 39; (A-3) SEQ ID NO: 37 (or amino acid sequence identity to 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more (A-5) SEQ ID NO: 15 (or amino acid sequence identity to 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and further preferably 98% or more, even more preferably 99% or more) of the amino acid sequence of a tetraspanin or its transmembrane domain; (A-6) SEQ ID NO: 71 (or amino acid sequence identity to 80% or more,
  • an antigen-presenting extracellular vesicle as described herein wherein the membrane comprises: (A) A protein complex capable of presenting an antigenic peptide outside the membrane, From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class II molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence of SEQ ID NO: 39; (A-3) SEQ ID NO: 37 (or 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more amino acid sequence identity to it) (A-5) SEQ ID NO: 15 (or amino acid sequence identity to 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and further amino acid sequences of tetraspanins or transmembrane domains thereof, preferably 98% or more, even more preferably 99% or more; and (A-6) SEQ ID NO: 71 (or 80% or more, preferably 90% or
  • a fusion protein capable of interacting with; is an antigen-presenting extracellular vesicle containing
  • an antigen-presenting extracellular vesicle as described herein wherein the membrane comprises: (A) A protein complex capable of presenting an antigenic peptide outside the membrane, From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class II molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence of SEQ ID NO: 39; (A-3) SEQ ID NO: 37 (or 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more amino acid sequence identity to it) (A-5) SEQ ID NO: 15 (or amino acid sequence identity to 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and further preferably 98% or more, even more preferably 99% or more) of the amino acid sequence of tetraspanin or its membrane-binding domain; and (A-6) SEQ ID NO: 71 (or 80% or more, preferably 90% or more,
  • a fusion protein capable of interacting with said T cell co-stimulatory molecule and T cells is an antigen-presenting extracellular vesicle containing
  • an antigen-presenting extracellular vesicle as described herein wherein the membrane comprises: (A) A protein complex capable of presenting an antigenic peptide outside the membrane, From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class II molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence of SEQ ID NO: 39; (A-3) SEQ ID NO: 37 (or 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more amino acid sequence identity to it) (A-5) SEQ ID NO: 15 (or amino acid sequence identity to 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and further amino acid sequences of tetraspanins or transmembrane domains thereof, preferably 98% or more, even more preferably 99% or more; and (A-6) SEQ ID NO: 71 (or 80% or more, preferably 90% or
  • a fusion protein capable of extramembranely presenting the first T cell-stimulating cytokine; and (C) from the N-terminal side, (C-1) SEQ ID NO: 67 (or amino acid sequence identity to it of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more and (C-3) SEQ ID NO: 21 (or 80% or more, preferably 90% or more amino acid sequence identity to it, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, even more preferably 99% or more of the T cell co-stimulatory molecule and the T cell comprising the amino acid sequence of tetraspanin or its transmembrane domain in that order.
  • a fusion protein capable of interacting with; is an antigen-presenting extracellular vesicle containing
  • an antigen-presenting extracellular vesicle as described herein wherein the membrane comprises: (A) A protein complex capable of presenting an antigenic peptide outside the membrane, From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class II molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence of SEQ ID NO: 39; (A-3) SEQ ID NO: 37 (or 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more amino acid sequence identity to it) (A-5) SEQ ID NO: 15 (or amino acid sequence identity to 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and further amino acid sequences of tetraspanins or transmembrane domains thereof, preferably 98% or more, even more preferably 99% or more; and (A-6) SEQ ID NO: 71 (or 80% or more, preferably 90% or
  • the above (A), (B) and (C) may be fused to form one molecule, or (B) and (C ) may be fused to form one molecule, or (A), (B) and (C) may be fused to form one molecule.
  • Such a fusion molecule may be translated as a single protein molecule with or without a spacer sequence between (A), (B) and (C), or (A), (B) and (C) ) may be fused into one molecule by chemically cross-linking (for example, disulfide bonds between cysteine residues).
  • the above (A), (B) and (C) are elements for localizing the protein in cells or extracellular vesicles, i.e., "capable of being expressed in the membrane of cells or extracellular vesicles functionally fused by sharing a portion of a "membrane protein or transmembrane domain thereof" or "a protein or domain thereof capable of binding to the membrane of a cell or extracellular vesicle".
  • a membrane protein capable of being expressed in the membrane of a cell or extracellular vesicle or its transmembrane domain or "a protein capable of binding to the membrane of a cell or extracellular vesicle” Or fused in a way that shares the "domain” part, (1) an antigen-presenting MHC molecule; (2) at least one T cell-stimulating cytokine; and (3) "membrane protein or transmembrane domain thereof capable of being expressed on the membrane of a cell or extracellular vesicle” or "of a cell or extracellular vesicle.
  • a fusion protein (D) comprising a protein or domain thereof capable of binding to membranes;
  • a membrane protein capable of being expressed on the membrane of an extracellular vesicle or a transmembrane domain thereof or "a protein capable of binding to the membrane of an extracellular vesicle or a domain thereof” fused in a form that shares parts, (1) an antigen-presenting MHC molecule; (2) a T cell co-stimulatory molecule; and (3) a "membrane protein or transmembrane domain thereof capable of being expressed in the membrane of a cell or extracellular vesicle” or “binding to the membrane of a cell or extracellular vesicle.” or a fusion protein (F) comprising a protein or domain thereof capable of In (B) and (C), "a membrane protein capable of being expressed in the membrane of a cell or extracellular vesicle or its transmembrane domain” or "a protein capable of binding to the membrane of a cell or extracellular
  • the component (A) "a membrane protein capable of being expressed on the membrane of a cell or extracellular vesicle or its transmembrane domain or capable of binding to the membrane of an extracellular vesicle instead of the constituent requirement (B), the constituent requirement ( It may be a cell containing a fusion protein (D) having the functions of A) and the component (B), or an antigen-presenting extracellular vesicle cell.
  • a fusion protein (D) having the functions of the component (A) and the component (B) is (D) It may be a fusion protein comprising an antigen-presenting MHC molecule and at least one T cell-stimulating cytokine, and capable of extramembranely presenting the antigen and the T cell-stimulating cytokine.
  • Said fusion protein comprises said antigen-presenting MHC molecule, said at least one T-cell stimulating cytokine, and a membrane protein or transmembrane domain thereof capable of localizing in the membrane of a cell or extracellular vesicle or a cell or It may also include a protein or membrane-binding domain thereof capable of binding to the membrane of extracellular vesicles.
  • the membrane protein capable of localizing in the cell membrane or the protein capable of binding to the cell membrane is CD8 or an MHC molecule containing a transmembrane domain may serve that function.
  • (D-1) amino acid sequence of MHC molecule-restricted antigen peptide (D-2) a spacer sequence that may be present, (D-3) the amino acid sequence of a single-chain MHC molecule; (D-4) a spacer sequence that may be present; and (D-5) a fusion peptide comprising CD8 or a transmembrane domain thereof and said at least one T cell-stimulating cytokine, It may also include amino acid sequences encoding in this order.
  • (D-1) amino acid sequence of MHC molecule-restricted antigen peptide (D-2) a spacer sequence that may be present, (D-3) an amino acid sequence of a single-chain MHC molecule containing a transmembrane domain; (D-4) an optionally present spacer sequence, and (D-5) at least one T cell-stimulating cytokine, It may also include amino acid sequences encoding in this order.
  • a membrane protein capable of localizing on the membrane of the extracellular vesicle or binds to the membrane of the extracellular vesicle may be tetraspanin or MFG-E8.
  • (D-1) amino acid sequence of MHC molecule-restricted antigen peptide (D-2) a spacer sequence that may be present, (D-3) the amino acid sequence of a single-chain MHC molecule; (D-4) a spacer sequence that may be present, (D-5) It may contain an amino acid sequence encoding a fusion peptide comprising a tetraspanin or its transmembrane domain or MFG-E8 or its transmembrane domain and said at least one T cell-stimulating cytokine, in that order.
  • a fusion peptide comprising a tetraspanin or its transmembrane domain or MFG-E8 or its transmembrane domain and said at least one T cell-stimulating cytokine
  • D-2 an optionally present spacer sequence
  • D-3 the amino acid sequence of a single-chain MHC molecule
  • D-4) an optionally present spacer sequence
  • D-5) an MHC molecule-restricted antigen peptide, It may also contain amino acid sequences encoding in this order.
  • the amino acid sequence of said at least one T-cell stimulating cytokine From the N-terminal side of the fusion peptide, (1) the amino acid sequence of said at least one T-cell stimulating cytokine; (2) an optional spacer sequence; and (3) an amino acid sequence encoding the amino acid sequence of MFG-E8 or its membrane-binding domain, in that order.
  • the MHC molecule-restricted antigenic peptide is an MHC class I molecule-restricted antigenic peptide
  • the single-chain MHC molecule may comprise an extracellular region of an MHC class I ⁇ chain
  • the antigenic peptide may be an MHC class II molecule-restricted antigenic peptide
  • the single-chain MHC molecule may comprise an extracellular domain of MHC class II ⁇ chain and/or an extracellular domain of MHC class II ⁇ chain.
  • the membrane may further comprise a protein capable of interacting with said T cell co-stimulatory molecule and the T cell; said protein capable of interacting with T cells comprises said at least one T cell co-stimulatory molecule and a membrane protein or transmembrane domain thereof capable of being expressed in the membrane of a cell or extracellular vesicle or a cell or extracellular small molecule a protein or domain thereof capable of binding to the membrane of the vesicle; Said protein capable of interacting with T cells may comprise said at least one T cell co-stimulatory molecule and a tetraspanin or transmembrane domain thereof or MFG-E8 or a domain thereof. Said protein capable of interacting with T cells may comprise one T cell co-stimulatory molecule comprising a transmembrane domain.
  • extracellular vesicles are exosomes.
  • antigen-presenting cells or antigen-presenting extracellular vesicles described herein may contain substances that may be therapeutically beneficial (e.g., low-molecular-weight compounds, nucleic acids, etc.) in their membranes or membranes. may be combined. Methods for encapsulating the substance within the membrane of cells or extracellular vesicles include, but are not limited to, suitable A method of mixing in a solvent and the like can be mentioned.
  • antigen-presenting cells or antigen-presenting extracellular vesicles may comprise any protein formulation.
  • the protein preparation is not particularly limited, but may be a naturally occurring protein such as erythropoietin, a non-naturally occurring synthetic protein such as an immunoglobulin-CTLA4 fusion protein, a monoclonal antibody or an active fragment thereof. It's okay.
  • These protein preparations are membrane proteins or transmembrane domains thereof capable of localizing in the membrane of cells or extracellular vesicles or proteins capable of binding to membranes of cells or extracellular vesicles or membrane-bound proteins thereof. It may be localized on the surface of antigen-presenting extracellular vesicles as a fusion protein with the domain.
  • Such antigen-presenting cells or antigen-presenting extracellular vesicles can be produced by transfecting any cell with a vector to express the fusion protein; 1) to produce antigen-presenting cells; Cells can be transfected to secrete antigen-presenting extracellular vesicles.
  • Each fusion protein or protein complex or protein preparation contained in the antigen-presenting cell or antigen-presenting extracellular vesicle membrane described herein may contain one or more detectable labels.
  • fusion proteins or protein complexes or protein formulations may be labeled with specific reporter molecules, fluorophores, radioactive materials, enzymes (eg, peroxidases, phosphatases), etc., by conventional methods. These may be linked to the N-terminal side or C-terminal side of the fusion protein, protein complex or protein preparation, for example, as a component of the fusion protein, protein complex or protein preparation.
  • each fusion protein in (A) and (B), and optionally present (C) is contained in the membrane of an antigen-presenting cell or antigen-presenting extracellular vesicle as described herein. Or provide a polynucleotide encoding the protein complex. In one embodiment of the invention there is provided a polynucleotide encoding each of the fusion proteins or protein complexes in (A)-(G) as defined herein.
  • a sequence encoding a fusion protein comprising an antigen-presenting MHC molecule and capable of presenting the antigen-presenting MHC molecule outside the membrane of a cell or extracellular vesicle;
  • a sequence encoding a fusion protein comprising at least one T cell stimulating cytokine or subunit thereof, capable of presenting said T cell stimulating cytokine outside the membrane of a cell or extracellular vesicle;
  • a fusion protein comprising an antigen-presenting MHC molecule and at least one T cell-stimulating cytokine or subunit thereof and capable of presenting the antigen and the T cell-stimulating cytokine outside the membrane of a cell or extracellular vesicle
  • sequences (a) to (e) are sequences specifically described in the present specification and sequences with high homology (preferably 90% or more, more preferably 95% or more, further preferably 99% or more homology gender), but is not particularly limited.
  • Paralogs gene sequences generated by gene duplication
  • orthologs groups of genes with homologous functions existing in different organisms
  • Polynucleotide as used herein means a single-stranded or double-stranded DNA molecule, an RNA molecule, a DNA-RNA chimeric molecule, or the like. Polynucleotides include genomic DNA, cDNA, hnRNA, mRNA, etc., and all naturally occurring or artificially modified derivatives thereof, and the like. Polynucleotides may be linear or circular.
  • a person skilled in the art can appropriately determine the polynucleotide encoding each of the fusion proteins or protein complexes in (A) to (G) above by referring to the amino acid sequences of the fusion proteins or protein complexes.
  • the amino acid sequence of each fusion protein or protein complex in (A) to (G) is each component in each fusion protein or protein complex (for example, in the case of (A), (A-1) ⁇ (A-5), and optionally (A-6)) can be appropriately determined with reference to the amino acid sequence.
  • Any type of codon can be selected for use in determining the polynucleotide.
  • the polynucleotide may be determined in consideration of the codon frequency of cells to be transformed with the vector containing the polynucleotide.
  • a polynucleotide encoding a signal peptide may optionally be added to the N-terminal side of the polynucleotide encoding each fusion protein or protein complex in (A) to (G) above. .
  • any amino acid sequence can be used for the signal peptide, and may be determined, for example, in consideration of the amino acid sequence of the fusion protein to be expressed.
  • polynucleotides encoding signal peptides include polynucleotides (eg, SEQ ID NO: 2) encoding the signal peptide of ⁇ 2 microglobulin (eg, SEQ ID NO: 1), and polynucleotides encoding the signal peptide of MHC class I ⁇ chain.
  • nucleotides nucleotides, polynucleotides encoding MHC class II ⁇ chain signal peptides, polynucleotides (eg SEQ ID NO: 34) encoding MHC class II ⁇ chain signal peptides (eg SEQ ID NO: 33), and the like.
  • amino acid sequences such as signal peptides, and information on polynucleotides encoding them can be obtained from, for example, known literature and NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/) You may acquire it suitably by searching databases, such as.
  • amino acid sequences in the partial sequences of tetraspanin eg, partial sequences in (C-1) and (C-5)
  • the polynucleotides encoding the same may be referred to WO 2016/139354.
  • (a) comprises: (A) A fusion protein capable of extramembrane presentation of an antigenic peptide, from its N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC molecule-restricted antigen peptide, (A-2) an optionally present spacer sequence, and (A-3) an amino acid sequence of a single-chain MHC molecule containing a transmembrane domain, in that order, which encodes a fusion protein.
  • (a) comprises: (A) A protein complex capable of presenting an antigenic peptide outside the membrane, From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC molecule-restricted antigen peptide, (A-2) optionally present spacer sequence, and (A-3) consisting of MHC class I ⁇ chain, fusion protein of ⁇ 2 microglobulin and MHC class I ⁇ chain, MHC class II ⁇ chain, or MHC class II ⁇ chain a fusion protein comprising an amino acid sequence comprising the amino acid sequences in that order; (A-6) a sequence encoding a protein complex, including a protein comprising the amino acid sequence of ⁇ 2 microglobulin, MHC class I ⁇ chain, MHC class II ⁇ chain, or MHC class II ⁇ chain; When translated, (A-3) and (A-6) preferably pair to form an MHC class I molecule or an MHC class II molecule.
  • (a) is the amino acid sequence consisting of (A-1) to (A-3) above and the sequence of (A-6) is the following 2A peptide sequence: T2A: (GSG)EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 211) P2A: (GSG)ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 212) E2A (GSG)QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 213) F2A (GSG) VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 214) may also include a sequence that has become a fusion protein-encoding sequence through at least one of the .
  • the 2A peptide sequence undergoes ribosome skipping, and fusion proteins containing amino acid sequences consisting of independent (A-1) to (A-3) and independent (A -6) is translated, and the two translated proteins form an MHC class I molecule or an MHC class II molecule.
  • (a) is (A) A fusion protein capable of extramembrane presentation of an antigenic peptide, from its N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class I molecule-restricted antigen peptide, (A-2) an optionally present spacer sequence, and (A-3) the amino acid sequence of a single-chain MHC class I molecule containing a transmembrane domain, may comprise a sequence encoding a fusion protein capable of extramembranely presenting the antigen peptide, comprising an amino acid sequence comprising in this order, (A) A fusion protein capable of extramembrane presentation of an antigenic peptide, from its N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class II molecule-restricted antigen peptide, (A-2) an optionally present spacer sequence, and (A-3) the amino acid sequence of a single-chain MHC class II molecule containing a transmembrane domain, It may
  • (a) above is (A) A protein complex capable of presenting an antigenic peptide outside the membrane, From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class I molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence that may be present, and (A-3) an amino acid sequence of a fusion protein of ⁇ 2 microglobulin and MHC class I ⁇ chain, in that order.
  • (a) above is (A) A protein complex capable of presenting an antigenic peptide outside the membrane, From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class I molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence that may be present, and (A-3) an amino acid sequence of an MHC class I ⁇ chain, a fusion protein comprising an amino acid sequence comprising, in that order, (A-6) a sequence encoding a protein complex comprising a protein comprising the amino acid sequence of ⁇ 2- microglobulin, the amino acid sequence consisting of (A-1) to (A-3) and (A- The amino acid sequence of 6) may comprise a sequence encoding one fusion protein via at least one 2A peptide sequence.
  • (a) above is (A) A protein complex capable of presenting an antigenic peptide outside the membrane, From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class II molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence that may be present, (A-3) amino acid sequence of MHC class II ⁇ chain, a fusion protein comprising an amino acid sequence comprising, in that order, (A-6) may contain a sequence encoding a protein complex containing a protein containing an amino acid sequence of MHC class II ⁇ chain, and an amino acid sequence consisting of (A-1) to (A-3) and (A -6) may comprise a sequence encoding one fusion protein via at least one 2A peptide sequence.
  • the above (a) is (A) A protein complex capable of presenting an antigenic peptide outside the membrane, From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class II molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence that may be present, and (A-3) an amino acid sequence of an MHC class II ⁇ chain, a fusion protein comprising an amino acid sequence comprising, in that order, (A-6) may include a sequence encoding a protein complex, including a protein, including an amino acid sequence of an MHC class II ⁇ chain.
  • the above (A) is a fusion protein or protein capable of extramembrane presentation of the antigen, comprising an antigen-presenting MHC molecule and tetraspanin or its transmembrane domain or MFG-E8 or its domain. Complex.
  • (a) above is (A) A fusion protein capable of extramembrane presentation of an antigenic peptide, from its N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence that may be present, (A-3) the amino acid sequence of a single-chain MHC molecule; (A-4) an optionally present spacer sequence; and (A-5) a sequence encoding a fusion protein comprising an amino acid sequence comprising, in that order, the amino acid sequence of a tetraspanin or transmembrane domain thereof, or (A) a protein complex capable of presenting an antigenic peptide outside the membrane, From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence that may be present, (A-3) amino acid sequence of MHC class I ⁇ chain, ⁇ 2 microglobulin,
  • the above (a) is (A) A fusion protein capable of extramembrane presentation of an antigenic peptide, from its N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class II molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence that may be present, (A-3) an amino acid sequence of a single-chain MHC class II molecule, (A-4) an optionally present spacer sequence, and (A-5) an amino acid sequence consisting of the amino acid sequence of a tetraspanin or its transmembrane domain may contain a sequence encoding a fusion protein capable of extramembrane presentation of the antigenic peptide.
  • (a) above comprises: (A) A fusion protein capable of extramembrane presentation of an antigenic peptide, from its N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence that may be present, (A-3) MHC class I ⁇ chain, ⁇ 2 microglobulin, MHC class II ⁇ chain, or MHC class II ⁇ chain amino acid sequence (A-4) optionally present spacer sequence, and (A-5) tetraspanin or may include a sequence encoding a fusion protein comprising an amino acid sequence comprising the amino acid sequence of its transmembrane domain, in that order; moreover (A-6) It may also include a sequence encoding an amino acid sequence of ⁇ 2 microglobulin, MHC class I ⁇ chain, MHC class II ⁇ chain, or MHC class II ⁇ chain.
  • (A-3) and (A-6) preferably pair to form an MHC class I molecule or an MHC class II molecule.
  • (a) is the amino acid sequence consisting of (A-1) to (A-5) and (A-6) is the following 2A peptide sequence: T2A: (GSG)EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 211)
  • P2A: (GSG)ATNFSLLKQAGDVEENPGP SEQ ID NO: 212)
  • F2A (GSG) VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 214) may also include a sequence that has become a fusion protein-encoding sequence through at least one of the .
  • the 2A peptide sequence undergoes ribosome skipping, and fusion proteins containing amino acid sequences consisting of independent (A-1) to (A-5) and independent (A -6) is translated, and the two translated proteins form an MHC class I molecule or an MHC class II molecule.
  • (a) above is a polynucleotide comprising: (A) A fusion protein capable of extramembrane presentation of an antigenic peptide, from its N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence that may be present, (A-3) amino acid sequence of MHC class I ⁇ chain, ⁇ 2 microglobulin, MHC class II ⁇ chain, or MHC class II ⁇ chain; (A-4) optionally present spacer sequence, and (A-5) amino acid sequence of tetraspanin or its membrane-binding domain (A-5.5) 2A peptide sequence (A-6) ⁇ 2 microglobulin, MHC the amino acid sequence of a class I alpha chain, MHC class II beta chain, or MHC class II alpha chain; and in that order, a sequence encoding a fusion protein.
  • a fusion protein capable of extramembrane presentation of an antigenic peptide, from
  • (a) is a polynucleotide comprising: (A) A fusion protein capable of extramembrane presentation of an antigenic peptide, from its N-terminal side, (A-1) MHC molecule-restricted antigenic peptide, (A-2) a spacer sequence that may be present, (A-3) amino acid sequence of MHC class II ⁇ chain, (A-4) a spacer sequence that may be present, (A-5) amino acid sequence of tetraspanin or its transmembrane domain (A-5.5) 2A peptide sequence, and (A-6) amino acid sequence of MHC class II ⁇ chain, A sequence encoding a fusion protein comprising, in that order, an amino acid sequence comprising: HLADR-1sc-TPI1-hCD81 (amino acid sequence: SEQ ID NO: 165; polynucleotide sequence: SEQ ID NO: 166) of Examples is exemplified as such an embodiment.
  • (a) above is (A) A protein complex capable of presenting an antigenic peptide outside the membrane, From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class I molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence that may be present, (A-3) amino acid sequence of ⁇ 2 microglobulin, (A-4) an optionally present spacer sequence, and (A-5) an amino acid sequence comprising, in that order, the amino acid sequence of a tetraspanin or transmembrane domain thereof; and (A-6) may include a sequence encoding a protein complex, including a protein, including an amino acid sequence of an MHC class I ⁇ chain.
  • the above (a) is (A) A protein complex capable of presenting an antigenic peptide outside the membrane, From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class I molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence that may be present, (A-3) amino acid sequence of MHC class I ⁇ chain, (A-4) an optionally present spacer sequence, and (A-5) an amino acid sequence comprising, in that order, the amino acid sequence of a tetraspanin or transmembrane domain thereof; a fusion protein; (A-6) may include a sequence encoding a protein complex, including a protein, including the amino acid sequence of ⁇ 2 - microglobulin.
  • the above (a) is (A) A protein complex capable of presenting an antigenic peptide outside the membrane, From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class II molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence that may be present, (A-3) amino acid sequence of MHC class II ⁇ chain, (A-4) an optionally present spacer sequence, and (A-5) an amino acid sequence comprising, in that order, the amino acid sequence of a tetraspanin or transmembrane domain thereof; and (A-6) may include a sequence encoding a protein complex, including a protein, including an amino acid sequence of an MHC class II ⁇ chain.
  • the above (a) is (A) A protein complex capable of presenting an antigenic peptide outside the membrane, From the N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class II molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence that may be present, (A-3) amino acid sequence of MHC class II ⁇ chain, (A-4) an optionally present spacer sequence, and (A-5) an amino acid sequence comprising, in that order, the amino acid sequence of a tetraspanin or transmembrane domain thereof; a fusion protein; (A-6) may include a sequence encoding a protein complex, including a protein, including an amino acid sequence of an MHC class II ⁇ chain.
  • (a) comprises: (A) A fusion protein capable of extramembrane presentation of an antigenic peptide, from its N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class I molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence of SEQ ID NO: 5, (A-3) SEQ ID NO: 65 (or amino acid sequence identity to 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more) and (A-5) SEQ ID NO: 15 (or 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more amino acid sequence identity to it) , more preferably 98% or more, even more preferably 99% or more) of tetraspanin or its transmembrane domain in that order, or (A) an antigen A fusion protein that constitutes a protein complex capable of presenting a peptide outside the membrane, From the N-terminal side, (A) an antigen A
  • (a) comprises: (A) A fusion protein capable of extramembrane presentation of an antigenic peptide, from its N-terminal side, (A-1) amino acid sequence of MHC class I molecule-restricted antigen peptide, (A-2) a spacer sequence of SEQ ID NO: 5, (A-3) SEQ ID NO: 65 (or amino acid sequence identity to it of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more and (A-5) SEQ ID NO: 15 (or 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more amino acid sequence identity to it) , more preferably 98% or more, even more preferably 99% or more) of a tetraspanin or its transmembrane domain in that order, or (A) an antigen A fusion protein that constitutes a protein complex capable of presenting a peptide outside the membrane, From the N-terminal
  • (a) comprises: (A) a polynucleotide encoding a fusion protein capable of extramembranely presenting an antigenic peptide, from the 5' end of (A-1) a sequence encoding an MHC class I molecule-restricted antigenic peptide; (A-2) a spacer sequence of SEQ ID NO: 6, (A-3) SEQ ID NO: 66 (or sequence identity to it of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more and (A-5) SEQ ID NO: 16 (or sequence identity to 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, (More preferably 98% or more, still more preferably 99% or more) of tetraspanin or a sequence encoding a transmembrane domain thereof in this order, or (A) a protein complex capable of extramembranely presenting an
  • (a) above comprises: (A) a polynucleotide encoding a fusion protein capable of extramembranely presenting an antigenic peptide, from the 5' end (A-1) a polynucleotide encoding an MHC class I molecule-restricted antigenic peptide; (A-2) a spacer sequence of SEQ ID NO: 6, (A-3) SEQ ID NO: 66 (or sequence identity to it of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more and (A-5) SEQ ID NO: 16 (or sequence identity to 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, (More preferably 98% or more, still more preferably 99% or more) of tetraspanin or a sequence encoding a transmembrane domain thereof in this order, or (A) a protein complex capable of extrame
  • (b) above comprises (B) a first T cell stimulating cytokine and extramembrane presentation of the first T cell stimulating cytokine comprising CD8 or a transmembrane domain thereof. Sequences encoding possible fusion proteins may also be included.
  • (b) above is (B) from the N-terminal side, (B-3) the amino acid sequence of the first T cell-stimulating cytokine; (B-4) a spacer sequence that may be present, and (B-5) an amino acid sequence comprising the amino acid sequence of CD8 or its transmembrane domain in this order, A sequence encoding an externally displayable fusion protein may also be included.
  • (b) above is (B) a fusion protein capable of extramembranally presenting the first T cell-stimulating cytokine, comprising a first T cell-stimulating cytokine and a partial sequence of tetraspanin, wherein the partial sequence of tetraspanin is a sequence encoding a fusion protein having at least two transmembrane domains, wherein said first T cell-stimulating cytokine is disposed between said two transmembrane domains; or (B) a first T A sequence encoding a fusion protein capable of extramembranely presenting said first T cell stimulatory cytokine comprising a cell stimulatory cytokine and MFG-E8 or a domain thereof may also be included.
  • (b) above is (B) from the N-terminal side, (B-1) a partial sequence of tetraspanin containing, from the N-terminal side, transmembrane domain 1, small extracellular loop, transmembrane domain 2, small intracellular loop and transmembrane domain 3; (B-2) a spacer sequence that may be present, (B-3) the amino acid sequence of the first T cell-stimulating cytokine; (B-4) a spacer sequence that may be present, and (B-5) the first T cell-stimulating cytokine comprising an amino acid sequence comprising, in this order, a partial sequence of tetraspanin containing transmembrane domain 4 A sequence encoding a fusion protein that can be displayed outside the membrane, or (B) from the N-terminal side, (B-3) the amino acid sequence of the first T cell-stimulating cytokine; (B-4) an optionally present spacer sequence; and (B-5) an amino
  • (b) above is (B) from the N-terminal side, (B-1) SEQ ID NO: 57 (or amino acid sequence identity to it of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more partial sequence of tetraspanins of (B-2) a spacer sequence of SEQ ID NO: 29; (B-3) SEQ ID NO: 25 (or amino acid sequence identity to it of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more Amino acid sequence of a first T-cell stimulatory cytokine, which is IL-2 of (B-4) a spacer sequence of SEQ ID NO: 29, and (B-5) SEQ ID NO: 59 (or amino acid sequence identity to it of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and further (preferably 98% or more, more
  • (b) above is (B) a polynucleotide encoding a fusion protein capable of extramembranely presenting a first T cell stimulating cytokine, from the 5' end of (B-1) SEQ ID NO: 58 (or sequence identity to is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more).
  • (B-2) a spacer sequence of SEQ ID NO: 30; (B-3) SEQ ID NO: 26 (or sequence identity to it of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more a sequence encoding a first T cell stimulatory cytokine that is IL-2 of (B-4) a spacer sequence of SEQ ID NO: 30, and (B-5) SEQ ID NO: 60 (or a sequence identity of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 95% or more, more preferably is 98% or more, even more preferably 99% or more) of tetraspanin partial sequences in this order; (B) a polynucleotide encoding a fusion protein capable of extramembranely presenting a first T cell stimulating cytokine, from the 5' end of (B-1) SEQ ID NO: 62 (or sequence identity to is 80% or
  • (B-2) a spacer sequence of SEQ ID NO: 30; (B-3) SEQ ID NO: 54 (or sequence identity to it of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more
  • (B-4) a spacer sequence of SEQ ID NO: 30, and (B-5) SEQ ID NO: 64 (or 80% sequence identity thereto), which is IL-4 of above, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more, even more preferably 99% or more) of the partial sequence of tetraspanin; or (B) a polynucleotide encoding a fusion protein capable of extramembranely presenting a second (or first) T cell-stimulating cytokine, from the 5′ end (B-3 ) TGF of SEQ ID NO: 74 (or having a sequence identity of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95%
  • fusion protein capable of extramembranely presenting said first (or second) T cell-stimulating cytokine; or (B) SEQ. %) of the fusion protein capable of extramembranely presenting said first (or second) T cell stimulating cytokine.
  • the sequence of one subunit is used as the sequence of the T cell-stimulating cytokine in (B) above, and the remaining subunits
  • the sequence of the unit is separately included in (b), and when that sequence is translated, the fusion protein of (B) and the remaining subunits form an active T cell-stimulating cytokine extramembrane. is preferred.
  • (b) when the T cell-stimulating cytokine functions by a heterogeneous subunit combination, (b) is translated as a protein in which the fusion protein of (B) and the remaining subunits are fused. May contain sequences.
  • the fusion protein of (B) and the remaining subunits may be fused via a spacer sequence or via a 2A peptide sequence.
  • (b) is (B) from the N-terminal side, (B-6) amino acid sequence of IL-12 ⁇ subunit (B-7) optionally present spacer sequence (B-3) amino acid sequence of IL-12 ⁇ subunit, (B-4) a spacer sequence that may be present, and (B-5) an amino acid sequence comprising the amino acid sequence of CD8 or its transmembrane domain in this order, capable of presenting IL-12 outside the cell membrane a sequence encoding a fusion protein.
  • (b) is (B) from the N-terminal side, (B-6) amino acid sequence of IL-12 ⁇ subunit (B-7) optionally present spacer sequence (B-3) amino acid sequence of IL-12 ⁇ subunit, (B-4) a spacer sequence that may be present, and (B-5) an amino acid sequence comprising an amino acid sequence of MFG-E8 or a membrane-binding domain thereof in this order, IL-12 of extracellular vesicles A sequence encoding a fusion protein that can be displayed outside the membrane may be included.
  • hIL-12sc-MFGe8 amino acid sequence: SEQ ID NO: 177; polynucleotide sequence 178.
  • (c) is (c) a T cell co-stimulatory molecule comprising a transmembrane domain; or a fusion protein comprising a T cell co-stimulatory molecule and a tetraspanin or transmembrane domain thereof or MFG-E8 or a domain thereof.
  • (c) is (C) from the N-terminal side, (C-1) the amino acid sequence of the T cell co-stimulatory molecule, (C-2) a spacer sequence that may be present; and (C-3) an amino acid sequence comprising an amino acid sequence of tetraspanin or its membrane-binding domain, in that order, the T cell costimulatory molecule and the T cell.
  • a sequence encoding an interactable fusion protein may be included.
  • (c) is (C) from the N-terminal side, (C-1) SEQ ID NO: 67 (or amino acid sequence identity to it of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more and (C-3) SEQ ID NO: 21 (or 80% or more, preferably 90% or more amino acid sequence identity to it, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, even more preferably 99% or more of the T cell co-stimulatory molecule and the T cell comprising the amino acid sequence of tetraspanin or its transmembrane domain in that order.
  • (c) is (C) SEQ ID NO: 23 (or 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more amino acid sequence identity to SEQ ID NO: 23) ), which encodes a fusion protein capable of interacting with said T cell co-stimulatory molecule and T cells.
  • (c) is (C) from the 5' end, (C-1) SEQ ID NO: 68 (or a sequence identity of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more) (C-3) a sequence encoding a T-cell co-stimulatory molecule that is CD80 of SEQ. %, more preferably 98% or more, even more preferably 99% or more) of sequences encoding tetraspanins or membrane-binding domains thereof, in that order.
  • (c) is (C) SEQ ID NO: 24 (or 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more sequence identity to it) which encodes a fusion protein capable of interacting with said T cell co-stimulatory molecule and T cells.
  • (d) is (D) said antigen-presenting MHC molecule, said at least one T cell-stimulating cytokine or subunit thereof, and a membrane protein or transmembrane domain thereof capable of localizing in the membrane of a cell or extracellular vesicle;
  • a sequence encoding a fusion protein comprising a protein or membrane-binding domain thereof capable of binding to the membrane of a cell or extracellular vesicle is included.
  • the membrane protein capable of localizing to the membrane of the extracellular vesicle or the protein capable of binding to the membrane of the extracellular vesicle may be tetraspanin or MFG-E8.
  • the membrane protein capable of localizing to the membrane of the cell or the protein capable of binding to the cell membrane may be CD8, or an MHC molecule containing a transmembrane domain may serve that function.
  • (d) is (D) from the N-terminal side, (D-1) amino acid sequence of MHC molecule-restricted antigen peptide, (D-2) a spacer sequence that may be present, (D-3) the amino acid sequence of a single-chain MHC molecule; (D-4) an optionally present spacer sequence; and (D-5) an amino acid sequence of a fusion peptide comprising CD8 or a transmembrane domain thereof and said at least one T cell-stimulating cytokine; and in that order, a sequence encoding a fusion protein.
  • (d) is (D) from the N-terminal side, (D-1) amino acid sequence of MHC molecule-restricted antigen peptide, (D-2) a spacer sequence that may be present, (D-3) an amino acid sequence of a single-chain MHC molecule containing a transmembrane domain; (D-4) an optionally present spacer sequence, and (D-5) an amino acid sequence of a fusion peptide comprising at least one T cell-stimulating cytokine, and in that order, a sequence encoding a fusion protein.
  • (d) is (D) From the N-terminal side, (D-1) amino acid sequence of MHC molecule-restricted antigen peptide, (D-2) a spacer sequence that may be present, (D-3) the amino acid sequence of a single-chain MHC molecule; (D-4) a spacer sequence that may be present; and (D-5) tetraspanin or its transmembrane domain or MFG-E8 or its transmembrane domain and said at least one T-cell stimulating cytokine or sub-sequence thereof the amino acid sequence of the fusion peptide comprising the unit; (where each component (D-1) to (D-5) comprises the aspects described herein) comprising an amino acid sequence comprising, in that order, a sequence encoding a fusion protein.
  • (d) is (D) from the N-terminal side, (D-1) an amino acid sequence of a fusion peptide comprising a tetraspanin or its transmembrane domain or MFG-E8 or its transmembrane domain and said at least one T cell-stimulating cytokine or subunit thereof; (D-2) a spacer sequence that may be present, (D-3) the amino acid sequence of a single-chain MHC molecule; (D-4) an optionally present spacer sequence, and (D-5) the amino acid sequence of the MHC molecule-restricted antigen peptide, (where each component (D-1) to (D-5) comprises the aspects described herein) comprising an amino acid sequence comprising, in that order, a sequence encoding a fusion protein.
  • a fusion peptide comprising said tetraspanin or its transmembrane domain or MFG-E8 or its transmembrane domain and said at least one T cell stimulatory cytokine or subunit thereof, From the N-terminal side, (1) a partial sequence of tetraspanin containing transmembrane domain 1, small extracellular loop, transmembrane domain 2, small intracellular loop and transmembrane domain 3; (2) an optional spacer sequence; (3) said at least one T cell stimulatory cytokine or subunit thereof; (4) an optional spacer sequence, and (5) an amino acid sequence encoding a partial sequence of tetraspanin containing transmembrane domain 4, in that order; or a fusion peptide comprising said tetraspanin or its transmembrane domain or MFG-E8 or its transmembrane domain and said at least one T cell-stimulating cytokine or subunit thereof, From the N-terminal side, (1) said at
  • the MHC molecule-restricted antigen peptide may be an MHC class I molecule-restricted antigen peptide, and the single-chain MHC molecule may contain an extracellular domain of an MHC class I ⁇ chain;
  • the antigenic peptide may be an MHC class II molecule-restricted antigenic peptide, and the single-chain MHC molecule may comprise an extracellular domain of MHC class II ⁇ chain and/or an extracellular domain of MHC class II ⁇ chain.
  • a polynucleotide comprising the sequence defined in (a) above and the sequence defined in (b) above. Furthermore, the sequence defined in (c) above may be included.
  • a polynucleotide comprising the sequence defined in (d) above is provided. Such sequences are exemplified by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO:136 which encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO:135. In such embodiments, the sequence defined in (c) above may be included.
  • a polynucleotide comprising the sequence defined in (e) above is provided.
  • the above (A), (B) and (C) may be a polynucleotide encoding a fusion protein that becomes one molecule by fusing (A) and (B). Then, (B) and (C) are fused to form a polynucleotide that encodes a fusion protein that becomes one molecule, or (A), (B) and (C) are fused to form one molecule. It may be a polynucleotide encoding a fusion protein that becomes Such polynucleotides may encode one fusion protein with or without a spacer sequence between (A), (B) and (C).
  • sequences encoding the fusion proteins of (A)-(C) are the following 2A peptide sequences: T2A: (GSG)EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 211) P2A: (GSG)ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 212) E2A (GSG)QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 213) F2A (GSG) VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 214)
  • the fused sequences may be via at least one sequence independently selected from.
  • the 2A peptide sequence undergoes ribosome skipping and can exist in cells or extracellular vesicles as independent (A), (B) and (C) molecules when the sequence encoding the fusion protein is indeed translated.
  • the polynucleotide in one embodiment of the present invention is an element for localizing the protein in cells or extracellular vesicles in (A), (B) and (C) above, that is, "cells or cells By sharing a portion of a membrane protein or a transmembrane domain thereof capable of being expressed in the membrane of the ectovesicle, or a protein capable of binding to the membrane of a cell or ectovesicle or a domain thereof, It may encode a fusion protein that is functionally fused.
  • a membrane protein capable of being expressed in the membrane of a cell or extracellular vesicle or its transmembrane domain or "a protein capable of binding to the membrane of a cell or extracellular vesicle” Or fused in a way that shares the "domain” part, (1) an antigen-presenting MHC molecule; (2) at least one T cell-stimulating cytokine; and (3) "membrane protein or transmembrane domain thereof capable of being expressed on the membrane of a cell or extracellular vesicle” or "of a cell or extracellular vesicle.
  • a membrane protein capable of being expressed in the membrane of a cell or extracellular vesicle or its transmembrane domain or "a protein capable of binding to the membrane of a cell or extracellular vesicle” Or fused in a way that shares the "domain” part, (1) an antigen-presenting MHC molecule; (2) a T cell co-stimulatory molecule; and (3) a "membrane protein or transmembrane domain thereof capable of being expressed in the membrane of a cell or extracellular vesicle” or “binding to the membrane of a cell or extracellular vesicle.” or a polynucleotide encoding a fusion protein (F) comprising a protein or domain thereof"; In (B) and (C), "a membrane protein capable of being expressed in the membrane of a cell or
  • One embodiment of the present invention is a membrane protein capable of being expressed in the membrane of the cell or extracellular vesicle of component (A) or its transmembrane domain, or capable of binding to the membrane of the cell or extracellular vesicle using a protein capable of extramembranely presenting the first T cell-stimulating cytokine containing the first T cell-stimulating cytokine of the component (B) instead of the protein capable of constructing the component (A) and a fusion protein (D) having the function of the component (B), It may be a polynucleotide encoding a fusion protein comprising an antigen-presenting MHC molecule and at least one T cell-stimulating cytokine and capable of extramembranely presenting the antigen and the T cell-stimulating cytokine.
  • a fusion protein (D) having the functions of the component (A) and the component (B) is It may be a fusion protein comprising an antigen-presenting MHC molecule and at least one T cell-stimulating cytokine and capable of extramembranely presenting the antigen and the T cell-stimulating cytokine.
  • Said fusion protein comprises said antigen-presenting MHC molecule, said at least one T-cell stimulating cytokine, and a membrane protein or transmembrane domain thereof capable of localizing in the membrane of a cell or extracellular vesicle or a cell or It may also include a protein or membrane-binding domain thereof capable of binding to the membrane of extracellular vesicles.
  • a membrane protein capable of localizing on the membrane of the extracellular vesicle or binds to the membrane of the extracellular vesicle may be tetraspanin or MFG-E8.
  • a membrane protein capable of localizing on the membrane of the extracellular vesicle or binds to the membrane of the extracellular vesicle may be tetraspanin or MFG-E8.
  • a fusion peptide comprising a tetraspanin or its transmembrane domain or MFG-E8 or its transmembrane domain and said at least one T cell-stimulating cytokine
  • D-2 an optionally present spacer sequence
  • D-3 a single-chain MHC molecule
  • D-4) an optionally present spacer sequence
  • D-5) an MHC molecule-restricted antigen peptide
  • said at least one T cell-stimulating cytokine (2) an optional spacer sequence, and (3) MFG-E8 in that order.
  • the MHC molecule-restricted antigenic peptide is an MHC class I molecule-restricted antigenic peptide
  • the single-chain MHC molecule may comprise an extracellular region of an MHC class I ⁇ chain
  • the antigenic peptide may be an MHC class II molecule-restricted antigenic peptide
  • the single-chain MHC molecule may comprise an extracellular domain of MHC class II ⁇ chain and/or an extracellular domain of MHC class II ⁇ chain.
  • the membrane may further comprise a protein capable of interacting with said T cell co-stimulatory molecule and the T cell; wherein said protein capable of interacting with T cells comprises said at least one T cell co-stimulatory molecule and a membrane protein or transmembrane domain thereof capable of being expressed on the membrane of extracellular vesicles or on the membrane of extracellular vesicles may include a protein or domain thereof capable of binding; Said protein capable of interacting with T cells may comprise said at least one T cell co-stimulatory molecule and a tetraspanin or transmembrane domain thereof or MFG-E8 or a domain thereof.
  • a vector comprising at least one polynucleotide selected from the polynucleotides described herein.
  • vector refers to any vector (including, but not limited to, plasmid vectors, cosmid vectors, phage vectors such as phage, adenovirus vectors, baculovirus vectors, etc.). virus vectors, artificial chromosome vectors, etc.).
  • Vectors include expression vectors, cloning vectors and the like.
  • Expression vectors generally comprise a desired coding sequence and appropriate polynucleotides necessary for expression of the desired coding sequences and operably linked coding sequences in a host organism (e.g., plant, insect, animal, etc.) or in vitro expression system. may contain.
  • Cloning vectors may be used to manipulate and/or amplify desired polynucleotide fragments.
  • a cloning vector may lack functional sequences required for expression of the desired polynucleotide fragment.
  • the polynucleotides described herein may all be inserted in the same vector, as long as they can be operably inserted, or two or more polynucleotides may be separated from each other. It may be inserted into a vector.
  • kits are provided that combine two or more vectors comprising at least one polynucleotide selected from the polynucleotides described herein.
  • (A) and (B) are fused to form a vector containing a polynucleotide encoding a fusion protein that becomes one molecule
  • (B) and (C) are fused to form a single molecule vector containing a polynucleotide encoding a fusion protein
  • (A), (B) and (C) are fused to form a single molecule. It may be transformed with a vector containing a polynucleotide encoding the protein.
  • Such polynucleotides may encode one fusion protein with or without a spacer sequence between (A), (B) and (C).
  • the above (A), (B) and (C) are elements for localizing the protein in extracellular vesicles, that is, "membrane proteins capable of being expressed on the membrane of extracellular vesicles or It may encode a fusion protein that is functionally fused by sharing a portion of "a transmembrane domain thereof” or "a protein or domain thereof capable of binding to the membrane of an extracellular vesicle".
  • a membrane protein capable of being expressed on the membrane of an extracellular vesicle or a transmembrane domain thereof or "a protein capable of binding to the membrane of an extracellular vesicle or a domain thereof” fused in a form that shares parts, (1) an antigen-presenting MHC molecule; (2) at least one T cell-stimulating cytokine; and (3) "a membrane protein or transmembrane domain thereof capable of being expressed in the membrane of an extracellular vesicle” or "binding to the membrane of an extracellular vesicle.”
  • a vector comprising a polynucleotide encoding a fusion protein (D) comprising a protein or a domain thereof";
  • a membrane protein capable of being expressed on the membrane of an extracellular vesicle or a transmembrane domain thereof or "a protein capable of binding to the membrane of an extracellular vesicle or a
  • (iv) instead of the membrane protein or transmembrane domain thereof capable of being expressed on the membrane of the extracellular vesicle of component (A) or the protein capable of binding to the membrane of the extracellular vesicle, Using a protein that contains the first T cell-stimulating cytokine of (B) and is capable of presenting the first T cell-stimulating cytokine outside the membrane, the function of the component (A) and the component (B) A fusion protein equipped with A poly encoding a fusion protein comprising the antigen-presenting MHC molecule of (D) described herein and at least one T cell-stimulating cytokine, and capable of extramembranely presenting the antigen and the T cell-stimulating cytokine A cell transformed with a vector containing the nucleotide is provided.
  • Transformed with a single vector or a combination of two or more vectors means that, for example, a cell is transformed with all of the above polynucleotides (i) to (iv) inserted into the same vector. It means that they may be transformed or transformed by a combination of two or more vectors, two or more of which are inserted into separate vectors.
  • a single vector or a combination of two or more vectors when (A) is a fusion protein, includes, for example: - a vector comprising a polynucleotide encoding the fusion protein of (A) and a polynucleotide encoding the fusion protein of (B); - a combination of a vector comprising a polynucleotide encoding the fusion protein of (A) and a vector comprising a polynucleotide encoding the fusion protein of (B); - a vector comprising a polynucleotide encoding the fusion protein of (A), a polynucleotide encoding the fusion protein of (B), and a polynucleotide encoding the fusion protein of (C); - A vector comprising a polynucleotide encoding the fusion protein of (A) and a polynucleotide encoding the fusion protein of (B), and a vector
  • a single vector or a combination of two or more vectors when (A) is a protein complex, includes, for example: - A polynucleotide encoding a fusion protein comprising an amino acid sequence consisting of (A-1) to (A-5), a polynucleotide encoding a protein comprising (A-6), and a fusion protein encoding (B) a vector comprising a polynucleotide; A vector comprising a polynucleotide encoding a fusion protein comprising an amino acid sequence consisting of (A-1) to (A-5) and a polynucleotide encoding a protein comprising (A-6); and (B) in combination with a vector comprising a polynucleotide encoding a fusion protein of A vector comprising a polynucleotide encoding a fusion protein comprising an amino acid sequence consisting of (A-1) to (A-5) and a polynucleotide
  • Cells to be transformed are not particularly limited as long as the antigen-presenting extracellular vesicles described herein can be obtained after transformation. They may be progenitor cells or established cell lines, and they may be normal cells or diseased cells including cancerous or tumorigenic cells.
  • the origin of cells to be transformed is not particularly limited, but examples include rodents such as mice, rats, hamsters and guinea pigs, lagomorphs such as rabbits, pigs, bovines, goats, horses, and sheep.
  • animal-derived cells such as ungulates, carnivores such as dogs and cats, mammals such as humans, monkeys, rhesus monkeys, cynomolgus monkeys, marmosets, orangutans, and primates such as chimpanzees; plant-derived cells; insect-derived cells etc.
  • Cells to be transformed are preferably animal-derived cells. Examples of animal-derived cells include, but are not limited to, human embryonic kidney cells (including HEK293T cells, etc.), human FL cells, Chinese hamster ovary cells (CHO cells), COS-7, Vero, mouse L cells, rat GH3, and the like.
  • the method of transforming cells is not particularly limited as long as it can introduce the polynucleotide of interest into cells.
  • an electroporation method for example, an electroporation method, a microinjection method, a calcium phosphate method, a cationic lipid method, a method using a liposome, a method using a non-liposomal substance such as polyethyleneimine, a virus infection method, and the like may be used.
  • Transformed cells transiently express fusion proteins or protein complexes of (A), (B), (C), (D), (E), (F) and/or (G) It may be a transformed cell that expresses the gene, or a transformed cell that stably expresses it (stable cell line).
  • Culture conditions for transformed cells are not particularly limited.
  • media commonly used for cell culture e.g., RPMI1640 medium, Eagle's MEM medium, Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM medium), Ham F12 medium, or any combination thereof
  • a medium added with other components such as fetal bovine serum, antibiotics, amino acids, etc., for example, about 1 to about 10% (preferably about 2 to about 5%) in the presence of CO 2 at about 30 to about 40° C. (preferably about 37° C.) for a desired time (for example, about 0.5 hours to about 240 hours (preferably about 5 to about 120 hours). , more preferably about 12 to about 72 hours)) and cultured (for example, under static or shaking conditions).
  • the culture supernatant obtained by culturing transformed cells may contain the antigen-presenting extracellular vesicles described herein. Therefore, when culturing transformed cells for the purpose of obtaining antigen-presenting extracellular vesicles described herein, if necessary, a medium from which extracellular vesicles such as exosomes are removed (e.g., exosomes are removed) Dulbecco's Modified Eagle's Medium containing about 1 to about 5% fetal bovine serum) may also be used.
  • a medium from which extracellular vesicles such as exosomes are removed e.g., exosomes are removed
  • Dulbecco's Modified Eagle's Medium containing about 1 to about 5% fetal bovine serum
  • One embodiment of the present invention provides a culture supernatant obtained by culturing the transformed cells described herein.
  • Antigen-presenting extracellular vesicles contained in the culture supernatant described herein can be obtained, for example, by purifying the culture supernatant (e.g., centrifugation, chromatography, etc.), concentrating, isolating, etc. , can be recovered more.
  • antigen-presenting extracellular vesicles obtained from the culture supernatant described herein are provided.
  • Antigen-presenting cells or antigen-presenting extracellular vesicles described herein are not limited to these, but are, for example, by means of genetic recombination techniques known to those skilled in the art (e.g., method, or by the method described in the examples, or by methods analogous thereto).
  • Polynucleotides encoding the above-described proteins (A) and (B) (or (D) instead of (A) and (B)) and optionally (C) are obtained by conventional genetic recombination techniques ( Alternatively, (A)-(a)-(d) can be operably inserted into the same or separate vectors.(A) and (B) (or instead of (A) and (B) (D)), and optionally two or more of the polynucleotides encoding the respective proteins of (C), when inserted into the same vector, each being operably linked to the same or separate promoter good too.
  • Cells are simultaneously or sequentially transformed with the obtained vectors for antigen-presenting cells, and antigen-presenting cells (transformed cells that transiently express these fusion proteins, or a transformed cell (stable strain) that stably expresses it) can be obtained.
  • Cells are simultaneously or sequentially transformed with the obtained vectors for antigen-presenting extracellular vesicles, and transformed cells (transformed cells that transiently express these fusion proteins or a transformed cell (stable strain) that stably expresses it) can be obtained.
  • the resulting transformed cells are cultured under desired conditions to obtain a culture supernatant, and the obtained culture supernatant is optionally purified (e.g., by centrifugation, antibody (Antibodies that recognize the contained proteins, etc.), purification using chromatography, flow cytometry, etc.), concentration (e.g., ultrafiltration, etc.), drying, etc., can be performed as described herein. vesicles can be obtained.
  • Antigen-presenting cells or antigen-presenting extracellular vesicles described herein may be obtained by. (A) and (B) above (or (D) instead of (A) and (B)) and optionally (C) obtained as soluble proteins by conventional genetic recombination techniques, or A commercially available product is used. Cells or extracellular vesicles are then obtained from the desired cells, for example, by known methods, by methods described herein, or by methods similar thereto.
  • the obtained cells or extracellular vesicles and one or more of the above-described soluble proteins are reacted in a desired solvent under desired conditions (for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2018-104341, etc. You may refer to the method described).
  • This procedure is repeated until the soluble proteins of (A) and (B) (or (D) instead of (A) and (B)), and optionally (C), are included in the extracellular vesicle membrane.
  • the antigen-presenting cells or antigen-presenting extracellular vesicles described herein can be obtained by performing the procedure while appropriately changing the conditions.
  • soluble proteins as the above-mentioned (A) and (B) (or (D) instead of (A) and (B)) and optionally (C)
  • the following method Antigen-presenting extracellular vesicles described herein may be obtained by.
  • a soluble protein of (A) and (B) (or (D) instead of (A) and (B)) and optionally (C) described above the desired N-terminal side or C-terminal side thereof
  • a tag e.g., His tag, FLAG tag, PNE tag of SEQ ID NO: 79, etc., which may be the same tag or may be different types of tags
  • cells or extracellular vesicles are obtained from the desired cells, for example, by known methods, by methods described herein, or by methods similar thereto, and antibodies against the tag or antibodies thereof
  • An antigen-binding fragment e.g., scFv, Fab or nanobody, e.g., anti-PNE tag nanobody of SEQ ID NO: 83
  • an antibody against the tag or an antigen-binding fragment thereof e.g., scFv, Fab or nanobody
  • a fusion protein of SEQ ID NO: 89, anti-PNE tag nanobody (SEQ ID NO: 83), CD8a (SEQ ID NO: 85) and CD81 (SEQ ID NO: 15) for example, a fusion protein of SEQ ID NO: 89, anti-PNE tag nanobody (SEQ ID NO: 83), CD8a (SEQ ID NO: 85) and CD81 (SEQ ID NO: 15)
  • transforming cells with this operably inserted vector to transform cells transformation that transiently expresses the fusion protein
  • It may be a cell or a transformed cell that stably expresses (stable strain)), the obtained transformed cell is cultured, etc., and extracellular vesicles are produced by the method described above. to recover.
  • Tag-added soluble proteins (A) and (B), and optionally (C) proteins, antibodies against the tags or antigen-binding fragments thereof (e.g., scFv, Fab or nanobody), etc. are applied to the membrane.
  • Antigen-presenting extracellular vesicles described herein may be obtained by mixing with extracellular vesicles containing the antigen under desired conditions.
  • a combination of the polynucleotides encoding the fusion proteins (A) to (G) described above is used for transformation, and from the resulting transformed cells, the antigen-presenting cell or the antigen-presenting cell described in the specification Outer vesicles may be obtained.
  • the antigen-presenting extracellular vesicles described herein may be obtained by a method combining two or more of the above methods.
  • Antigen-presenting extracellular vesicles described herein can be obtained by methods such as flow cytometry, ELISA, Western blotting, etc. (A) and (B) (or instead of (A) and (B) ( D)), and optionally the proteins of (C), may be confirmed to be included in the membrane.
  • a method for producing an antigen-presenting extracellular vesicle as described herein obtained by culturing a transformed cell as described herein. and collecting the culture supernatant.
  • a method for producing antigen-presenting extracellular vesicles as described herein comprising: (i) a polynucleotide encoding the fusion protein or protein complex of (A) for an antigen-presenting extracellular vesicle as described herein; and (ii) an antigen-presenting extracellular vesicle as described herein. (B) for a vesicle, and optionally (iii) a polynucleotide encoding a (C) fusion protein for an antigen-presenting extracellular vesicle as described herein.
  • a method for producing antigen-presenting extracellular vesicles as described herein comprising: (iv) the antigen-presenting MHC molecule of (D) for the antigen-presenting extracellular vesicles described herein and at least one T cell-stimulating cytokine; a polynucleotide encoding an externally-presentable fusion protein, and optionally (iii) a polynucleotide encoding the fusion protein of (C) for an antigen-presenting extracellular vesicle as described herein; simultaneously or sequentially (preferably simultaneously) transforming a cell with a single vector or a combination of two or more vectors; and recovering the culture supernatant obtained by culturing the obtained transformed cells.
  • a method for producing antigen-presenting extracellular vesicles as described herein comprising: (v) the antigen-presenting MHC molecule of (E) for antigen-presenting extracellular vesicles as described herein and at least one T-cell stimulatory cytokine and T-cell co-stimulatory molecule, wherein said antigen and said T transforming a cell with a vector comprising a polynucleotide encoding a fusion protein capable of extramembranally displaying a cell-stimulating cytokine; and recovering the culture supernatant obtained by culturing the obtained transformed cells.
  • methods are provided for producing the antigen-presenting cells described herein.
  • a method for producing an antigen-presenting cell as described herein comprising: (i) a polynucleotide encoding the fusion protein or protein complex of (A) for an antigen-presenting cell as described herein; and (ii) (B) for an antigen-presenting cell as described herein. and optionally (iii) a polynucleotide encoding the fusion protein of (C) for an antigen-presenting cell as described herein.
  • a method is provided comprising simultaneously or sequentially (preferably simultaneously) transforming a cell with a combination of the above vectors.
  • a method for producing an antigen-presenting cell as described herein comprising: (iv) comprising the antigen-presenting MHC molecule of (D) for the antigen-presenting cell described herein and at least one T cell-stimulating cytokine, and presenting the antigen and the T cell-stimulating cytokine extramembranely
  • a single vector or two comprising a polynucleotide encoding a possible fusion protein and optionally (iii) a polynucleotide encoding the fusion protein of (C) for an antigen-presenting cell as described herein
  • a method comprising simultaneously or sequentially (preferably simultaneously) transforming a cell with a combination of the above vectors.
  • a method for producing antigen-presenting extracellular vesicles as described herein comprising: (v) the antigen-presenting MHC molecule of (E) and at least one T-cell stimulatory cytokine and T-cell co-stimulatory molecule for an antigen-presenting cell as described herein, wherein said antigen and said T-cell stimulatory
  • a method comprising transforming a cell with a vector comprising a polynucleotide encoding a fusion protein capable of extramembrane display of a cytokine.
  • antigen-presenting extracellular vesicles obtained from the culture supernatant described herein are provided.
  • an antigen-presenting extracellular vesicle comprising: (i) a polynucleotide encoding the fusion protein or protein complex of (A) for an antigen-presenting extracellular vesicle as described herein; and (ii) an antigen-presenting extracellular vesicle as described herein. (B) for a vesicle, and optionally (iii) a polynucleotide encoding a (C) fusion protein for an antigen-presenting extracellular vesicle as described herein.
  • an antigen-presenting extracellular vesicle comprising: (iv) the antigen-presenting MHC molecule of (D) for the antigen-presenting extracellular vesicles described herein and at least one T cell-stimulating cytokine; a polynucleotide encoding an externally-presentable fusion protein, and optionally (iii) a polynucleotide encoding the fusion protein of (C) for an antigen-presenting extracellular vesicle as described herein; simultaneously or sequentially (preferably simultaneously) transforming a cell with a single vector or a combination of two or more vectors; and recovering the culture supernatant obtained by culturing the obtained transformed cells.
  • an antigen-presenting extracellular vesicle comprising: (v) the antigen-presenting MHC molecule of (E) for antigen-presenting extracellular vesicles as described herein and at least one T-cell stimulatory cytokine and T-cell co-stimulatory molecule, wherein said antigen and said T transforming a cell with a polynucleotide encoding a fusion protein capable of extramembranely presenting a cell-stimulating cytokine; and recovering the culture supernatant obtained by culturing the obtained transformed cells.
  • an antigen-presenting cell comprising: (i) a polynucleotide encoding the fusion protein or protein complex of (A) for an antigen-presenting cell as described herein; and (ii) (B) for an antigen-presenting cell as described herein. and optionally (iii) a polynucleotide encoding the fusion protein of (C) for an antigen-presenting cell as described herein.
  • an antigen-presenting cell obtained by a method comprising Alternatively, in one embodiment of the invention, an antigen-presenting cell comprising: (iv) comprising the antigen-presenting MHC molecule of (D) for the antigen-presenting cell described herein and at least one T cell-stimulating cytokine, and presenting the antigen and the T cell-stimulating cytokine extramembranely
  • an antigen-presenting cell comprising: (iv) comprising the antigen-presenting MHC molecule of (D) for the antigen-presenting cell described herein and at least one T cell-stimulating cytokine, and presenting the antigen and the T cell-stimulating cytokine extramembranely
  • a single vector or a combination of two or more vectors comprising a polynucleotide encoding a possible fusion protein, and optionally (iii) a polynucleotide encoding the fusion protein of (C) described herein.
  • an antigen-presenting cell comprising: (v) the antigen-presenting MHC molecule of (E) and at least one T-cell stimulatory cytokine and T-cell co-stimulatory molecule for an antigen-presenting cell as described herein, wherein said antigen and said T-cell stimulatory
  • An antigen-presenting cell obtained by a method comprising transforming the cell with a polynucleotide encoding a fusion protein capable of extramembranely presenting a cytokine is provided.
  • antigen-presenting cells comprising the same, and/or transformed cells and/or culture supernatants thereof, as described herein
  • a composition comprising:
  • a pharmaceutical composition comprising an antigen-presenting cell or antigen-presenting extracellular vesicles as described herein or a culture supernatant as described herein.
  • compositions e.g., pharmaceutical compositions
  • additives such as solubilizing agents, suspending agents, tonicity agents, buffering agents, soothing agents, preservatives, antioxidants, coloring agents, sweetening agents and surfactants can be included.
  • these additives are preferably pharmacologically acceptable carriers.
  • compositions described herein contain polynucleotides, it is preferred, but not essential, to contain carriers suitable for DD (drug delivery) of nucleic acids, these carriers being lipid nanoparticles (LNPs). and polymers (eg PEI).
  • LNPs lipid nanoparticles
  • PEI polymers
  • compositions e.g., pharmaceutical compositions
  • the compositions can be prepared, together with the additives described above, by methods known per se, such as tablets, coated tablets, orally disintegrating tablets, chewable tablets, pills, and granules. , fine granules, powders, hard capsules, soft capsules, liquids (including syrups, injections, lotions, etc.), suspensions, emulsions, jellies, patches, ointments, creams, It can be formulated into inhalants, suppositories, and the like. These may be oral agents or parenteral agents.
  • the formulation may further contain other beneficial ingredients (eg, other therapeutically beneficial ingredients) depending on its purpose.
  • the composition of one embodiment of the present invention is capable of enhancing acquired immunity (cellular immunity and/or humoral immunity) against specific antigens.
  • Peptides derived from pathogens can be used as pharmaceutical compositions for treating or preventing infections caused by infectious pathogens.
  • the composition of one embodiment of the present invention enables induction of inflammatory cytokines and activates innate immunity (recruiting and activating neutrophils, monocytes, macrophages, etc.). By phagocytosing pathogens, etc., it is possible to eliminate infectious agents, and it can be used as a pharmaceutical composition to treat or prevent infections caused by infectious agents.
  • Antigen-presenting cells preferably antigen-presenting cells or antigen-presenting extracellular vesicles comprising MHC class I-restricted antigenic peptides and MHC class I molecules in their membranes
  • Polynucleotides and/or vectors containing the same, and/or transformed cells and/or culture supernatants thereof, or compositions containing these are useful for treating or preventing cancer. sell.
  • antigen-presenting cells comprising the same, and/or for treating or preventing cancer, as described herein.
  • Transformed cells and/or their culture supernatants, or compositions containing these (eg, pharmaceutical compositions) are provided.
  • antigen-presenting extracellular vesicles, etc. which are one embodiment of the present invention, can proliferate and activate antigen-specific cytotoxic T cells to be used. Using tumor-associated antigen peptides, proliferated and activated cytotoxic T cells can recognize and attack cancer cells, thereby killing cancer cells.
  • antigen-presenting extracellular vesicles, polynucleotides and/or vectors comprising the same as described herein for the manufacture of a medicament for treating or preventing cancer, and/or Alternatively, the use of transformed cells and/or their culture supernatants, or compositions containing these (eg, pharmaceutical compositions) is provided.
  • a method for treating or preventing cancer comprises administering to a subject in need thereof an effective amount of antigen-presenting extracellular vesicles, polynucleotides as described herein. and/or a vector comprising the same, and/or a transformed cell and/or its culture supernatant, or a composition comprising these.
  • Cancers include, but are not limited to, any solid cancer and blood cancer, such as small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, breast cancer, esophageal cancer, gastric cancer, small bowel cancer, colon cancer. cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, bone marrow cancer, kidney cancer (including renal cell cancer, etc.), parathyroid cancer, adrenal cancer, ureter cancer, liver cancer, bile duct cancer, cervical cancer, ovary Cancer (e.g., histology is serous adenocarcinoma, mucinous adenocarcinoma, clear cell adenocarcinoma, etc.), testicular cancer, bladder cancer, vulvar cancer, penile cancer, thyroid cancer, head and neck cancer, craniopharyngeal cancer, pharyngeal cancer , tongue cancer, skin cancer, Merkel cell carcinoma, melanoma (malignant melanoma, etc.), epithelial cancer, squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma
  • immune checkpoint inhibitors can be used in combination to treat or prevent cancer.
  • the immune checkpoint inhibitors may be administered to the patient simultaneously or sequentially, and may be included in the medicament of the present invention.
  • Immune checkpoint inhibitors include PD-1 inhibitors (e.g. anti-PD-1 antibodies such as nivlumab and pembrolidimab), CTLA-4 inhibitors (e.g. anti-CTLA-4 antibodies such as ipilimumab), PD-L1 inhibitors Examples include, but are not limited to, agents (eg, anti-PD-L1 antibodies such as durvalumab, atezolizumab, and avelumab).
  • the immune checkpoint inhibitor is an antibody or an active fragment thereof
  • the antibody or active fragment thereof is a membrane protein capable of localizing in the membrane of extracellular vesicles or its transmembrane domain or the membrane of extracellular vesicles may be present on the membrane of the extracellular vesicle according to the present invention by binding to a protein capable of binding to or a membrane-binding domain thereof. Combinations of such immune checkpoint inhibitors enhance cytotoxicity against cancer cells.
  • antigen-presenting cells antigen-presenting extracellular vesicles (preferably antigen-presenting cells or antigen-presenting extracellular vesicles comprising MHC class II-restricted antigenic peptides and MHC class II molecules on their membranes) as described herein;
  • the polynucleotide and/or the vector containing the same, and/or the transformed cell and/or the culture supernatant thereof, or the composition containing these may be useful for treating or preventing autoimmune diseases.
  • the antigen-presenting extracellular vesicles which are one embodiment of the present invention, are capable of proliferation and activation of antigen-specific regulatory T cells (Treg) to be used.
  • Treg antigen-specific regulatory T cells
  • antigen-presenting cells comprising the same for treating or preventing an autoimmune disease as described herein, and Provided/or transformed cells and/or their culture supernatants, or compositions containing these (eg, pharmaceutical compositions).
  • antigen-presenting cells In another embodiment of the invention, antigen-presenting cells, antigen-presenting extracellular vesicles, polynucleotides and/or thereof as described herein for the manufacture of a medicament for treating or preventing an autoimmune disease. and/or transformed cells and/or culture supernatants thereof, or compositions (eg, pharmaceutical compositions) containing these.
  • a method for treating or preventing an autoimmune disease comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of an antigen presenting cell, antigen presenting cells as described herein.
  • a method comprising administering an outer vesicle, a polynucleotide and/or a vector comprising the same, and/or a transformed cell and/or a culture supernatant thereof, or a composition comprising these.
  • autoimmune diseases include, but are not limited to, asthma, psoriasis, systemic lupus erythematosus, Guillain-Barre syndrome, Sjögren's syndrome, multiple sclerosis, myasthenia gravis, pernicious anemia, Graves' disease, Hashimoto Thyroiditis, type I diabetes, Crohn's disease, inflammatory bowel disease, rheumatoid arthritis, and the like.
  • antigen-presenting cells antigen-presenting extracellular vesicles (preferably antigen-presenting cells or antigen-presenting extracellular vesicles comprising MHC class II-restricted antigenic peptides and MHC class II molecules on their membranes) as described herein;
  • the polynucleotide and/or vector containing the same, and/or transformed cells and/or the culture supernatant thereof, or compositions containing these (e.g., pharmaceutical compositions) are used for treating or preventing allergic diseases. can be useful.
  • antigen-presenting extracellular vesicles and the like which are one embodiment of the present invention, can proliferate and activate antigen-specific regulatory T cells (Treg) to be used.
  • Treg antigen-specific regulatory T cells
  • antigen-presenting cells comprising the same for treating or preventing allergic diseases, as described herein, and Provided/or transformed cells and/or their culture supernatants, or compositions containing these (eg, pharmaceutical compositions).
  • antigen-presenting cells In another embodiment of the invention, antigen-presenting cells, antigen-presenting extracellular vesicles, polynucleotides and/or thereof as described herein for the manufacture of a medicament for treating or preventing an allergic disease. and/or transformed cells and/or culture supernatants thereof, or compositions (eg, pharmaceutical compositions) containing these.
  • a method for treating or preventing an allergic disease comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of an antigen-presenting cell, antigen-presenting cells as described herein.
  • a method comprising administering an outer vesicle, a polynucleotide and/or a vector comprising the same, and/or a transformed cell and/or a culture supernatant thereof, or a composition comprising these.
  • allergic diseases include, but are not limited to, allergic rhinitis, atopic dermatitis, allergic asthma, allergic conjunctivitis, allergic gastroenteritis, food allergy, drug allergy, and urticaria. mentioned.
  • Subjects to be treated or prevented for the various diseases described above include, but are not limited to, rodents such as mice, rats, hamsters and guinea pigs; Lagomorphs such as rabbits; ungulates such as goats, horses, and sheep; carnivora such as dogs and cats; primates such as humans, monkeys, rhesus monkeys, cynomolgus monkeys, marmosets, orangutans, and chimpanzees; preferably animals, more preferably rodents or primates, and even more preferably mice or humans.
  • rodents such as mice, rats, hamsters and guinea pigs
  • Lagomorphs such as rabbits
  • ungulates such as goats, horses, and sheep
  • carnivora such as dogs and cats
  • primates such as humans, monkeys, rhesus monkeys, cynomolgus monkeys, marmosets, orangutans, and chimpanzee
  • Antigen-presenting cells antigen-presenting extracellular vesicles, polynucleotides and/or vectors containing them, and/or transformed cells and/or culture supernatants thereof, or compositions containing these or these
  • the dosage of the formulation is determined according to the sex, age, weight, health condition, degree of disease or diet of the subject to be administered; administration time; administration method; combination with other drugs; can decide.
  • the antigen-presenting cells or antigen-presenting extracellular vesicles described herein can activating T cells against specific antigens by contact with T cells in vivo (including, but not limited to, T cells or T cell populations obtained from peripheral blood, spleen, etc.); It can be allowed to proliferate, differentiate, and the like.
  • treating T cells against a specific antigen comprises contacting the antigen-presenting cells or antigen-presenting extracellular vesicles described herein with the T cells in vitro or ex vivo. Methods are provided for activation, proliferation and/or differentiation.
  • T cells obtained by the method described above are provided.
  • the T cells obtained by the above method may be administered to a subject in order to treat and/or prevent diseases (eg, cancer, autoimmune diseases, allergic diseases, etc.).
  • diseases eg, cancer, autoimmune diseases, allergic diseases, etc.
  • Plasmid preparation 1 Using the pCAG-puro vector, a vector was constructed for expressing an MHC class I molecule capable of extra-membrane presentation of an antigen on the membrane of extracellular vesicles.
  • Polynucleotide (SEQ ID NO: 2) encoding the signal peptide of ⁇ 2 microglobulin (amino acids 1-20; SEQ ID NO: 1), encoding the model antigenic peptide OVA peptide (SEQ ID NO: 3) by established cloning techniques.
  • a polynucleotide (SEQ ID NO: 4), a peptide linker (amino acid sequence: SEQ ID NO: 5, polynucleotide: SEQ ID NO: 6), the full-length sequence of ⁇ 2 microglobulin excluding the signal peptide (amino acids 21-119; SEQ ID NO: 7) (SEQ ID NO: 8), a polynucleotide (SEQ ID NO: 12) encoding a peptide linker (SEQ ID NO: 11), and the full-length sequence of the MHC class I ⁇ chain excluding the signal peptide (amino acids 22-369; SEQ ID NO: 9)
  • a single-chain trimer (sc-Trimer) was constructed consisting of a polynucleotide (SEQ ID NO: 10) encoding (amino acid sequence: SEQ ID NO: 13; polynucleotide: SEQ ID NO: 14).
  • a polynucleotide (SEQ ID NO: 18; corresponding amino acid sequence: SEQ ID NO: 17) was inserted into the pCAG-puro vector (Figs. 1A and 1B: hereinafter sc-Trimer-CD81).
  • a polynucleotide (sequence No. 20) and a polynucleotide (SEQ ID NO: 22) that encodes the full-length sequence (amino acids 1 to 306; SEQ ID NO: 21) of CD9, which is a tetraspanin (SEQ ID NO: 24; corresponding amino acid sequence: sequence No. 23) was inserted into the pCAG-puro or pMX vector (FIGS.
  • CD80-CD9 1C, 1D: hereinafter CD80-CD9.
  • IL-2 which is one of T cell-stimulating cytokines
  • the full-length sequence was inserted between amino acids 170C and 171I in the large extracellular loop of the tetraspanin mouse CD63 (amino acids 1-238: SEQ ID NO:27; polynucleotide: SEQ ID NO:28).
  • IL -2 sequences were inserted.
  • a polynucleotide (SEQ ID NO: 30) encoding a peptide linker (amino acid sequence GGGGS: SEQ ID NO: 29) was added to each of the N-terminal and C-terminal sides of IL-2.
  • This polynucleotide (SEQ ID NO: 32; corresponding amino acid sequence: SEQ ID NO: 31) was inserted into the pCAG-puro vector (FIGS. 1E, 1F: hereinafter CD63-IL-2).
  • Plasmid preparation 2 Using the pCAG-puro vector, a vector was constructed for expressing an MHC class II molecule capable of extra-membrane presentation of an antigen on the membrane of extracellular vesicles.
  • a single chain dimer (sc-Dimer) was produced by connecting with a polynucleotide (SEQ ID NO: 40) (amino acid sequence: SEQ ID NO: 41; polynucleotide: SEQ ID NO: 42).
  • a polynucleotide (SEQ ID NO: 44; corresponding amino acid sequence: SEQ ID NO: 43) was inserted into the pCAG-puro vector (FIGS. 1G, 1H: hereinafter sc-Dimer-CD81).
  • TGF- ⁇ 1 which is one of T cell-stimulating cytokines
  • SEQ ID NO: 48 a polynucleotide encoding the full-length sequence of ⁇ 1 (amino acids 1 to 390; SEQ ID NO: 47), and the full-length sequence (amino acid 23 ⁇ 463; SEQ ID NO:49) was ligated via a polynucleotide (SEQ ID NO:30) encoding a peptide linker (SEQ ID NO:29).
  • This polynucleotide (SEQ ID NO: 52; corresponding amino acid sequence: SEQ ID NO: 51) was inserted into the pCAG-puro vector (Figs. 1J, 1K: hereinafter TGF- ⁇ -MFG-E8).
  • TGF- ⁇ -MFG-E8 pCAG-puro vector
  • the full-length sequence (amino acids 21 to 140; SEQ ID NO: 53) was inserted between amino acids 177S and 178G in the large extracellular loop of the tetraspanin mouse CD81 (amino acids 1-236: SEQ ID NO: 15; polynucleotide: SEQ ID NO: 16).
  • polynucleotide (SEQ ID NO: 62) encoding the CD81 partial sequence of SEQ ID NO: 61 and the polynucleotide (SEQ ID NO: 64) encoding the CD81 partial sequence of SEQ ID NO: 63, IL -4 sequences were inserted).
  • Polynucleotides (SEQ ID NO: 30) encoding peptide linkers (amino acid sequence GGGGS; SEQ ID NO: 29) were added to the N-terminal and C-terminal sides of IL-4, respectively.
  • This polynucleotide (SEQ ID NO: 56; corresponding amino acid sequence: SEQ ID NO: 55) was inserted into the pCAG-puro vector (FIGS. 1L, 1M: hereinafter CD81-IL-4).
  • Plasmid preparation 3 sc-Dimer-CD81-IL-12p40
  • a polynucleotide (SEQ ID NO: 92) encoding a protein (SEQ ID NO: 91) in which CD81 and IL-12p40, which is a subunit of IL-12, a T cell-stimulating cytokine, is fused to the above sc-Dimer is pCAG-puro.
  • a vector was prepared that expressed the fusion protein by inserting it into a vector.
  • IL-12p35 A polynucleotide (SEQ ID NO: 98) encoding another subunit of IL-12, IL-12p35 (SEQ ID NO: 97), is inserted into the pCAG-puro or pMX vector to generate IL-12p35. An expression vector was prepared.
  • CD81-IL-6 In order to express IL-6, which is one of T cell stimulating cytokines, on the membrane of extracellular vesicles, a polynucleotide (SEQ ID NO: 100) was introduced into the polynucleotide encoding the extracellular loop of CD81, a tetraspanin, and the polynucleotide (SEQ ID NO: 102) encoding the CD81-IL-6 fusion protein (SEQ ID NO: 101) was transformed into pCAG-puro or A vector was prepared to express the fusion protein by inserting into a pMX vector.
  • SEQ ID NO: 100 was introduced into the polynucleotide encoding the extracellular loop of CD81, a tetraspanin, and the polynucleotide (SEQ ID NO: 102) encoding the CD81-IL-6 fusion protein (SEQ ID NO: 101) was transformed into pCAG-puro or A vector was prepared to express the fusion protein
  • hCD80-hCD9 A polynucleotide (sequence No. 108) was inserted into the pCAG-puro or pMX vector to prepare a vector expressing the fusion protein.
  • sc-Trimer-CD81-IL-2 In order to express IL-2, which is one of T cell-stimulating cytokines, on the membrane of extracellular vesicles, a polynucleotide encoding a CD81-IL2 fusion peptide was prepared in the same manner as for CD81-IL-4 above.
  • a vector expressing the fusion protein was prepared by inserting it into a pMX vector.
  • hsc-Trimer-hCD81 A polynucleotide (SEQ ID NO: 132) encoding hsc-Trimer-hCD81 (SEQ ID NO: 131) was obtained using the human gene sequence (HLA-A2402 was used as the MHC-I sequence) for the above sc-Trimer-CD81. and inserted into a pCAG-puro or pMX vector to prepare a vector expressing the fusion protein.
  • SARS-CoV2sc-Trimer-hCD81 SARS-CoV-2 peptide (amino acid sequence: SEQ ID NO: 141; polynucleotide sequence: SEQ ID NO: 142)) as an antigen, using HLA-A0201 as the MHC molecule, an antigen-presenting MHC molecule (SARS-CoV2sc-Trimer; amino acid sequence : SEQ ID NO: 147) to create a polynucleotide (SEQ ID NO: 148) that encodes SARS-CoV2sc-Trimer-hCD81 (SEQ ID NO: 149) by binding it to a polynucleotide that encodes hCD81 (SEQ ID NO: 149). No. 150) was prepared.
  • a vector expressing a fusion protein was prepared by inserting the prepared polynucleotide into a pCAG-puro or pMX vector.
  • hCD63-hIL-2 The CD63-IL-2 was generated using a human gene sequence.
  • a polynucleotide (SEQ ID NO: 116) encoding hCD63-hIL-2 (SEQ ID NO: 115) was prepared and inserted into a pCAG-puro or pMX vector to prepare a vector expressing the fusion protein.
  • CD63-Akaluc As a negative control, CD63 and Akaluc luciferase were fused to create a polynucleotide (SEQ ID NO: 140) for localizing the AlkaLuc fusion protein (SEQ ID NO: 139) to extracellular vesicles, and inserted into the pCAG-puro or pMX vector. to prepare a vector expressing the fusion protein.
  • Plasmid preparation 4 HLADR-1sc-TPI1-hCD81 , HLA DR1 ⁇ chain signal sequence (amino acid sequence: SEQ ID NO: 151; polynucleotide sequence: 152), TPI-1 peptide sequence (amino acid sequence: SEQ ID NO: 153; polynucleotide sequence: 154) and HLA DR1 ⁇ chain sequence ( Amino acid sequence: SEQ ID NO: 155; polynucleotide sequence: 156) were ligated to generate a sequence encoding the HLA DR1 ⁇ chain presenting the TPI-1 peptide.
  • hCD81 amino acid sequence: SEQ ID NO: 159; polynucleotide sequence: NO: 160
  • P2A sequence amino acid sequence: SEQ ID NO: 161; polynucleotide sequence: No. 162
  • HLA DR1 ⁇ chain sequence amino acid sequence: SEQ ID NO: 163; polynucleotide sequence: No. 164
  • Polynucleotides were generated to present TPI-1 peptides on the extramembrane of .
  • a vector expressing the fusion protein HLADR-1sc-TPI1-hCD81 (amino acid sequence: SEQ ID NO: 165; polynucleotide sequence: 166) was prepared by inserting the prepared polynucleotide into a pCAG-puro or pMX vector. From the mRNA transcribed from such a sequence, a fusion protein of HLA DR1 ⁇ chain presenting TPI-1 peptide and hCD81 and HLA DR1 ⁇ chain are translated by the action of P2A, which is a 2A peptide, and the two bind to form an extracellular small molecule. There will be MHC molecules presenting TPI-1 peptides on the membrane of the vesicle.
  • IL-12 ⁇ subunit was attached to the IL-12 ⁇ subunit-encoding sequence (amino acid sequence: SEQ ID NO: 167; polynucleotide sequence: 167) via a linker sequence (amino acid sequence: SEQ ID NO: 169; polynucleotide sequence: 170).
  • sequences encoding the units were ligated to create a sequence encoding IL-12, and that sequence was used as a linker sequence (amino acid sequence: SEQ ID NO: 173; poly
  • sequence of MFGe8 amino acid sequence: SEQ ID NO: 175; polynucleotide sequence: 176 was linked via nucleotide sequence: No. 174 to prepare a polynucleotide for expressing IL-12 in extracellular vesicles.
  • a vector expressing the fusion protein hIL-12sc-MFGe8 (amino acid sequence: SEQ ID NO: 177; polynucleotide sequence: 178) was prepared by inserting the prepared polynucleotide into a pCAG-puro or pMX vector.
  • the sequence of TPI-1 peptide-specific TCR and Venus fusion protein TPI-specific TCR ⁇ chain (amino acid sequence: SEQ ID NO: 179; polynucleotide sequence: No. 180) was replaced with the sequence of P2A (amino acid sequence: SEQ ID NO: 181; polynucleotide sequence: No.
  • TCR ⁇ amino acid sequence: SEQ ID NO: 183; polynucleotide sequence: No. 184
  • P2A sequence amino acid sequence: SEQ ID NO: 185; polynucleotide sequence: no. 186
  • the prepared polynucleotide was inserted into a pCAG-puro or pMX vector to prepare a vector expressing a TPI-1 peptide-specific TCR-Venus fusion protein.
  • Plasmid preparation 5 sc-Trimer-T2A-IL-2-CD8-P2A-CD80 A pET-15b vector was used to generate vectors for the production of mRNA for expressing antigen-presenting MHC class I molecules, IL-2, and CD80 on the cell membrane.
  • sc-Trimer sequence (amino acid sequence: SEQ ID NO: 191; polynucleotide sequence: SEQ ID NO: 192) produced in the same manner as above; the sequence of T2A (amino acid sequence: SEQ ID NO: 193, polynucleotide sequence: SEQ ID NO: 194); A fusion protein for expressing IL-2 on the cell membrane, IL-2 (amino acid sequence: SEQ ID NO: 195, polynucleotide: SEQ ID NO: 196) and a linker sequence (amino acid sequence: SEQ ID NO: 197, polynucleotide: SEQ ID NO: 198) and a partial sequence of CD8 (including transmembrane domain; amino acid sequence: SEQ ID NO: 199, polynucleotide: SEQ ID NO: 200) that encodes a fusion protein; Sequence of P2A (amino acid sequence: SEQ ID NO: 201, polynucleotide sequence: SEQ ID
  • a plasmid that transcribes mRNA encoding CD81 (amino acid sequence: SEQ ID NO: 207, polynucleotide sequence: SEQ ID NO: 208; amino acid sequence of full-length OVA: SEQ ID NO: 209, polynucleotide sequence: SEQ ID NO: 210).
  • a plasmid that transcribes the mRNA encoding the was constructed.
  • Plasmid preparation 6 sc-Trimer-T2A-IL-15sa-P2A-CD80 For production of mRNA for expressing antigen-presenting MHC class I molecules, IL-15 super agonist (hereinafter IL-15sa: complex of IL-15 and sushi domain of IL-15 receptor), and CD80 on the cell membrane was constructed.
  • IL-15 super agonist hereinafter IL-15sa: complex of IL-15 and sushi domain of IL-15 receptor
  • the signal peptide of ⁇ 2-microglobulin (amino acid sequence: SEQ ID NO: 215; polynucleotide sequence: SEQ ID NO: 216) from the N-terminus in the same manner as above; OVA peptide (amino acid sequence: SEQ ID NO: 217; polynucleotide sequence: SEQ ID NO: 218); linker (amino acid sequence: SEQ ID NO: 219; polynucleotide sequence: SEQ ID NO: 220); ⁇ 2 microglobulin with the signal peptide removed (amino acid sequence: SEQ ID NO: 221; polynucleotide sequence: SEQ ID NO: 222); linker (amino acid sequence: SEQ ID NO: 223; polynucleotide sequence: SEQ ID NO: 224); MHC class I ⁇ chain (signal peptide removed) (amino acid sequence: SEQ ID NO:225; polynucleotide sequence: SEQ ID NO:226);
  • Plasmid preparation 7 sc-Trimer (Gtf2i)-T2A-IL-2 presenting a neoantigen (cancer antigen) Gtf2i peptide (amino acid sequence: SEQ ID NO: 279, polynucleotide sequence: SEQ ID NO: 280; Non-Patent Document 3) instead of the OVA peptide
  • a sequence encoding -CD8-P2A-CD80 was generated (amino acid sequence: SEQ ID NO: 281, polynucleotide sequence: SEQ ID NO: 282) (Fig. 24(b)).
  • Plasmid preparation 8 OVAp-MHCII ⁇ -P2A-MHCII ⁇ -T2A-IL-12sc-CD8-P2A-CD80 Expression vectors were constructed for the production of mRNA to express antigen-presenting MHC class II molecules, IL-12sc, and CD80 on the cell membrane.
  • MHC class II ⁇ -chain signal peptide (amino acid sequence: SEQ ID NO: 247; polynucleotide sequence: SEQ ID NO: 248) from the N-terminus in the same manner as above; OVA peptide (amino acid sequence: SEQ ID NO: 249; polynucleotide sequence: SEQ ID NO: 250); linker (amino acid sequence: SEQ ID NO: 251; polynucleotide sequence: SEQ ID NO: 252); MHC class II beta chain (signal peptide removed) (amino acid sequence: SEQ ID NO:253; polynucleotide sequence: SEQ ID NO:254); P2A (amino acid sequence: SEQ ID NO: 255; polynucleotide sequence: SEQ ID NO: 256); MHC class II alpha chain (amino acid sequence: SEQ ID NO:257; polynucleotide sequence: SEQ ID NO:258); T2A (amino acid
  • MHC class II molecules capable of extramembrane presentation of OVA peptide antigens, membrane proteins including IL-12, and membrane proteins including CD80 are produced by the action of 2A peptides T2A and P2A. It will be translated and present on the cell membrane of one cell.
  • Plasmid preparation 9 sc-Trimer (RPL18 peptide)-CD81-IL by introducing RPL18 peptide (amino acid sequence: SEQ ID NO: 283, polynucleotide sequence: SEQ ID NO: 284; Non-Patent Document 3), which is a neoantigen (cancer antigen) instead of OVA peptide -2 was generated (Fig. 24(d)).
  • Example 1 Antigen-presenting extracellular vesicles HEK293T cells containing MHC class I molecules and T cell-stimulating cytokines in their membranes were seeded in a cell culture dish, and 2% fetal bovine serum and penicillin/streptomycin were added to Dulbecco's modified Eagle. cultured in medium. Plasmids (pCAG vectors encoding sc-Trimer-CD81 and CD63-IL-2, respectively) were added to cells at approximately 50% confluence using Polyethyleneimine "Max" (manufactured by Polysciences) according to the manufacturer's instructions. The two were transfected simultaneously.
  • PBS was added to the pellet, and the pellet was centrifuged at 100,000 g for 2 hours. 2A).
  • concentration of extracellular vesicles was measured using a BCA protein assay kit (manufactured by Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's instructions.
  • Example 2 Antigen-presenting extracellular vesicles HEK293T cells containing MHC class I molecules, T cell co-stimulatory molecules, and T cell-stimulatory cytokines in their membranes were seeded in a cell culture dish and treated with 2% fetal bovine serum and penicillin/ Cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with streptomycin. Cells at approximately 50% confluence were loaded with the plasmids prepared above (pCAG vectors encoding sc-Trimer-CD81, CD80-CD9, and CD63-IL-2, respectively) to Polyethyleneimine "Max" ( Polysciences) were used to transfect triplicate at the same time.
  • PBS was added to the pellet, and the pellet was centrifuged at 100,000 g for 2 hours. 2B).
  • concentration of antigen-presenting extracellular vesicles was measured using a BCA protein assay kit (manufactured by Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's instructions.
  • Example 3 Antigen-presenting extracellular vesicles 1 containing MHC class II molecules, T cell co-stimulatory molecules, and T cell-stimulating cytokines in the membrane HEK293T cells were seeded in cell culture dishes and cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 2% fetal bovine serum and penicillin/streptomycin. Cells at approximately 50% confluence were loaded with the plasmids prepared above (pCAG vectors encoding sc-Dimer-CD81, MHC class II ⁇ chain, CD80-CD9, and CD63-IL-2, respectively) according to the manufacturer's instructions. Four were simultaneously transfected using Polyethyleneimine "Max" (Polysciences).
  • PBS was added to the pellet, and the pellet was centrifuged at 100,000 g for 2 hours. 2C).
  • concentration of antigen-presenting extracellular vesicles was measured using a BCA protein assay kit (manufactured by Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's instructions.
  • Antigen-presenting extracellular vesicles 2 containing MHC class II molecules, T-cell co-stimulatory molecules, and T-cell-stimulating cytokines in their membranes HEK293T cells were seeded in cell culture dishes and cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 2% fetal bovine serum and penicillin/streptomycin. Cells at approximately 50% confluence were injected with plasmids (sc-Dimer-CD81, MHC class II ⁇ -chain, CD80-CD9, TGF- ⁇ -MFGE8, and CD63-IL-2 encoding pCAG vectors, respectively) according to the manufacturer's instructions.
  • plasmids sc-Dimer-CD81, MHC class II ⁇ -chain, CD80-CD9, TGF- ⁇ -MFGE8, and CD63-IL-2 encoding pCAG vectors, respectively
  • Example 4 After collecting the supernatant and centrifuging the supernatant at 100,000 g for 2 hours, the supernatant was removed and the pellet was washed with PBS. PBS was added to the pellet, and after centrifugation at 100,000 g for 2 hours, the supernatant was removed, and the pellet was suspended in 100 ⁇ L of PBS and used as antigen-presenting extracellular vesicles in Example 4 (Fig. 2D). The concentration of antigen-presenting extracellular vesicles was measured using a BCA protein assay kit (manufactured by Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's instructions.
  • Antigen-presenting extracellular vesicles 3 containing MHC class II molecules, T cell co-stimulatory molecules, and T cell-stimulating cytokines in their membranes HEK293T cells were seeded in cell culture dishes and cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 2% fetal bovine serum and penicillin/streptomycin. Cells at approximately 50% confluence were loaded with the plasmids prepared above (pCAG vectors encoding sc-Dimer-CD81, MHC class II ⁇ chain, CD80-CD9, and CD81-IL-4, respectively) according to the manufacturer's instructions.
  • Example 5 After collecting the supernatant and centrifuging the supernatant at 100,000 g for 2 hours, the supernatant was removed and the pellet was washed with PBS. After adding PBS to the pellet and centrifuging at 100,000 g for 2 hours, the supernatant was removed, and the pellet was suspended in 100 ⁇ L of PBS and used as antigen-presenting extracellular vesicles in Example 5 (Fig. 2E). The concentration of antigen-presenting extracellular vesicles was measured using a BCA protein assay kit (manufactured by Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's instructions.
  • Control extracellular vesicle HEK293T cells were seeded in a cell culture dish and cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 2% fetal bovine serum and penicillin/streptomycin. The medium was changed to approximately 50% confluent cells, and 24 hours later the medium was changed to Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 2% exosome-depleted fetal bovine serum and penicillin/streptomycin. 48 hours after exosome-removed medium was replaced, the supernatant was recovered, passed through a 0.22 ⁇ m filter, and centrifuged at 300 g for 5 minutes.
  • the supernatant was recovered and centrifuged at 2,000 g for 20 minutes. The supernatant was recovered and centrifuged at 10,000 g for 30 minutes. After collecting the supernatant and centrifuging the supernatant at 100,000 g for 2 hours, the supernatant was removed and the pellet was washed with PBS. PBS was added to the pellet, and the mixture was centrifuged at 100,000 g for 2 hours. The concentration of antigen-presenting extracellular vesicles was measured using a BCA protein assay kit (manufactured by Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's instructions.
  • Extracellular vesicle HEK293T cells containing MHC class I molecules in their membranes were seeded in a cell culture dish and cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 2% fetal bovine serum and penicillin/streptomycin. Cells at approximately 50% confluence were transfected with a plasmid (pCAG vector encoding sc-Trimer-CD81) using Polyethyleneimine "Max" (Polysciences) according to the manufacturer's instructions.
  • PBS was added to the pellet, and the mixture was centrifuged at 100,000 g for 2 hours.
  • concentration of extracellular vesicles was measured using a BCA protein assay kit (manufactured by Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's instructions.
  • Extracellular vesicle HEK293T cells containing T cell co-stimulatory molecules in their membranes were seeded in a cell culture dish and cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 2% fetal bovine serum and penicillin/streptomycin. Cells at approximately 50% confluence were transfected with a plasmid (pCAG vector encoding CD80-CD9) using Polyethyleneimine "Max" (manufactured by Polysciences) according to the manufacturer's instructions.
  • Extracellular vesicle HEK293T cells containing T cell-stimulating cytokines in their membranes were seeded in a cell culture dish and cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 2% fetal bovine serum and penicillin/streptomycin.
  • Cells at approximately 50% confluence were transfected with a plasmid (pCAG vector encoding CD63-IL-2) using Polyethyleneimine "Max" (Polysciences) according to the manufacturer's instructions.
  • Medium was changed 3 hours post-transfection and 24 hours post-transfection to Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 2% exosome-depleted fetal bovine serum and penicillin/streptomycin.
  • 72 hours after transfection the supernatant was harvested and passed through a 0.22 ⁇ m filter followed by centrifugation at 300 g for 5 minutes. The supernatant was recovered and centrifuged at 2,000 g for 20 minutes. The supernatant was recovered and centrifuged at 10,000 g for 30 minutes.
  • PBS was added to the pellet, and the mixture was centrifuged at 100,000 g for 2 hours.
  • concentration of extracellular vesicles was measured using a BCA protein assay kit (manufactured by Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's instructions.
  • Test Example 1-1 Flow cytometric analysis of fusion proteins contained in extracellular vesicle membranes
  • the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 2 were analyzed using PS Capture (trademark) exosome flow cytometry kit (Fujifilm Wako Jun Yaku Co., Ltd.), immunostaining was performed according to the manufacturer's instructions.
  • Antibodies used for staining are as follows (staining time: 15 minutes, temperature: 4°C). After staining, the expression of each fusion protein was detected with a flow cytometer FACSCantoII (manufactured by BD Biosciences).
  • Test Example 1-1 show that the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 2 contain MHC class I molecules presenting the OVA antigen, CD80, and IL-2 in their membranes (Fig. 3A). .
  • Test Example 1-2 Flow cytometric analysis of fusion proteins contained in extracellular vesicle membranes
  • the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 3 were analyzed using PS Capture (trademark) exosome flow cytometry kit (Fujifilm Wako Jun Yaku Co., Ltd.), immunostaining was performed according to the manufacturer's instructions.
  • Antibodies used for staining are as follows. After staining, the expression of each fusion protein was detected with a flow cytometer FACSCantoII (manufactured by BD Biosciences).
  • Test Example 1-2 show that the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 3 contain MHC class II molecules presenting the OVA antigen, CD80, and IL-2 in their membranes (Fig. 3B). .
  • Test Example 1-3 Flow cytometric analysis of fusion proteins contained in extracellular vesicle membranes
  • the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 4 were analyzed using PS Capture (trademark) exosome flow cytometry kit (Fujifilm Wako Pure Yaku Co., Ltd.), immunostaining was performed according to the manufacturer's instructions.
  • Antibodies used for staining are as follows. After staining, the expression of each fusion protein was detected with a flow cytometer FACSCantoII (manufactured by BD Biosciences).
  • Test Example 1-3 show that the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 4 contain MHC class II molecules presenting OVA antigens, CD80, IL-2, and TGF- ⁇ 1 in their membranes. (Fig. 3C).
  • Test Example 1-4 Flow cytometric analysis of fusion proteins contained in extracellular vesicle membranes
  • the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 5 were analyzed using PS Capture (trademark) exosome flow cytometry kit (Fujifilm Wako Pure Yaku Co., Ltd.), immunostaining was performed according to the manufacturer's instructions.
  • Antibodies used for staining are as follows. After staining, the expression of each fusion protein was detected with a flow cytometer FACSCantoII (manufactured by BD Biosciences).
  • Test Example 1-4 show that the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 5 contain MHC class II molecules presenting the OVA antigen, CD80, and IL-4 in their membranes (Fig. 3D). .
  • Test Example 2 Activation experiment of OVA-specific CD8-positive T cells (OT-1 T cells) by antigen-presenting extracellular vesicles in vitro Antigen-presenting extracellular vesicles activate antigen-specific CD8-positive T cells The following tests were performed in vitro to see if they are equivalent. Lymph nodes excised from OT-1 mice, which are OVA-reactive TCR transgenic mice, were crushed on a 100 ⁇ m filter to obtain a lymph node cell suspension. The cell suspension was stained with the cell proliferation assay reagent CellTrace Violet (Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's instructions.
  • 2 ⁇ 10 5 stained lymph node cells were suspended in 200 ⁇ L of RPMI1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 50 ⁇ M 2-mercaptoethanol and penicillin/streptomycin, and antigen-presenting extracellular vesicles of Example 1 or 2 ( final concentration 3 ⁇ g / mL), or a mixture of three types of extracellular vesicles of Reference Examples 2 to 4 (final concentration of each of the three types of extracellular vesicles 3 ⁇ g / mL) or cells of Reference Examples 1, 2 or 5 After adding ectovesicles (final concentration 3 ⁇ g/mL) and culturing for 3 days in a 96-well round-bottom plate, immunostaining was performed.
  • Antibodies used for staining are as follows (staining time: 15 minutes, temperature: 4°C). After staining, the luminescence intensity of CellTrace Violet, a cell proliferation assay reagent for OT-1 T cells, was detected with a flow cytometer FACSCanto II (manufactured by BD Biosciences). ⁇ APC conjugated anti-mouse CD8 antibody (53-6.7 Biolegend) ⁇ PE conjugated anti-mouse TCR Vb5.1, 5.2 antibody (MR9-4 Biolegend) The results are shown in FIG.
  • the antigen-presenting extracellular vesicles of Examples 1 and 2 are a mixture of the three types of extracellular vesicles of Reference Examples 2 to 4, or the extracellular vesicles of Reference Examples 1, 2, and 5.
  • antigen-specific CD8-positive T cells were significantly differentiated and/or expanded (Fig. 4).
  • Test Example 3 Activation experiment of OVA-specific CD8-positive T cells (OT-1 T cells) by antigen-presenting extracellular vesicles in vivo Antigen-presenting extracellular vesicles activate antigen-specific CD8-positive T cells
  • Lymph nodes were excised from OT-1 mice, which are OVA-reactive TCR transgenic mice, and a lymphocyte suspension was prepared in the same manner as in Test Example 2. Lymph nodes were similarly excised from CD45.1 congenic mice, and lymphocyte suspensions were prepared. Each lymphocyte suspension was mixed at a ratio of 1:1 and stained with CellTrace Violet, a cell proliferation assay reagent.
  • Antibodies used for staining are as follows (staining time: 15 minutes, temperature: 4°C). After staining, the luminescence intensity of CellTrace Violet, a cell proliferation assay reagent, in the transfected OT-1 T cells and wild-type CD8 T cells was detected with a flow cytometer FACSCanto II (manufactured by BD Biosciences).
  • Test Example 4 Activation experiment of OVA-specific CD4-positive T cells (OT-2 T cells) by antigen-presenting extracellular vesicles in vitro Antigen-presenting extracellular vesicles activate antigen-specific CD4-positive T cells The following tests were performed in vitro to see if they are equivalent. Lymph nodes excised from OT-2 mice, which are OVA-reactive CD4TCR transgenic mice, were crushed on a 100 ⁇ m filter to obtain a lymph node cell suspension. The cell suspension was stained with the cell proliferation assay reagent CellTrace Violet (Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's instructions.
  • 2 ⁇ 10 5 stained lymph node cells were suspended in 200 ⁇ L of RPMI1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 50 ⁇ M 2-mercaptoethanol and penicillin/streptomycin to a final concentration of 10 ⁇ g/mL. or the extracellular vesicles of Reference Example 1 were added and cultured in a 96-well round-bottom plate for 4 days. After 4 days, cells were harvested and immunostained. Antibodies used for staining are as follows (staining time: 15 minutes, temperature: 4°C).
  • Example 3 From the results of Test Example 4, the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 3 significantly differentiated and/or proliferated antigen-specific CD4 T cells compared to the extracellular vesicles of Reference Example 1 (Fig. 6 ).
  • Test Example 5 In vitro differentiation induction experiment of OVA-specific CD4-positive T cells (OT-2 T cells) into regulatory T cells by antigen-presenting extracellular vesicles Antigen-presenting extracellular vesicles are antigen-specific CD4
  • Lymph nodes excised from OT-2 mice, which are OVA-reactive CD4TCR transgenic mice were crushed on a 100 ⁇ m filter to obtain a lymph node cell suspension.
  • the cell suspension was stained with the cell proliferation assay reagent CellTrace Violet (Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's instructions.
  • 2 ⁇ 10 5 stained lymph node cells were suspended in 200 ⁇ L of RPMI1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 50 ⁇ M 2-mercaptoethanol and penicillin/streptomycin to a final concentration of 10 ⁇ g/mL. or the extracellular vesicles of Reference Example 1 were added and cultured in a 96-well round-bottom plate for 4 days. After 4 days, cells were harvested and extracellular immunostaining was performed. The following antibodies were used for staining (staining time: 15 minutes, temperature: 4°C).
  • intracellular immunostaining was performed using True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (manufactured by Biolegend) and anti-mouse FOXP3 antibody according to the manufacturer's instructions. After intracellular staining, expression of regulatory T cell markers CD25 and FOXP3 on OT-2 T cells was detected with a flow cytometer FACSCanto II (manufactured by BD Biosciences).
  • Test Example 6 In vitro differentiation induction experiment of OVA-specific CD4-positive T cells (OT-2 T cells) into Th2 T cells by antigen-presenting extracellular vesicles Antigen-presenting extracellular vesicles are antigen-specific CD4-positive T cells The following tests were performed in vitro to examine whether the cells were induced to differentiate into Th2 T cells. Lymph nodes excised from OT-2 mice, which are OVA-reactive CD4TCR transgenic mice, were crushed on a 100 ⁇ m filter to obtain a lymph node cell suspension. The cell suspension was stained with the cell proliferation assay reagent CellTrace Violet (Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's instructions.
  • 2 ⁇ 10 5 stained lymph node cells were suspended in 200 ⁇ L of RPMI1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 50 ⁇ M 2-mercaptoethanol and penicillin/streptomycin to a final concentration of 10 ⁇ g/mL.
  • the antigen-presenting extracellular vesicles of 5 or the extracellular vesicles of Reference Example 1 were added and cultured in a 96-well round-bottom plate for 4 days. After 4 days, cells were harvested and extracellular immunostaining was performed. The following antibodies were used for staining (staining time: 15 minutes, temperature: 4°C).
  • Antigen-presenting extracellular vesicles 4 containing MHC class II molecules, T cell co-stimulatory molecules, and T cell-stimulating cytokines in their membranes HEK293T cells were seeded in cell culture dishes and cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 2% fetal bovine serum and penicillin/streptomycin. Cells at approximately 50% confluence were loaded with the plasmids prepared above (sc-Dimer-CD81-IL-12p40, MHC class II ⁇ chain, CD80-CD9, and IL-12p35 encoding pCAG vectors, respectively) according to the manufacturer's instructions.
  • Test Example 1-5 Flow cytometric analysis of fusion proteins contained in extracellular vesicle membranes
  • the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 6 were analyzed using PS Capture (trademark) exosome flow cytometry kit (Fujifilm Wako Jun Yaku Co., Ltd.), immunostaining was performed according to the manufacturer's instructions.
  • Antibodies used for staining are as follows. After staining, the expression of each fusion protein was detected with a flow cytometer FACSCantoII (manufactured by BD Biosciences).
  • Test Example 1-5 show that the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 6 contain MHC class II molecules presenting the OVA antigen, CD80, and functional IL-12 in the membrane ( Figure 3E)
  • Example 7 Antigen-presenting extracellular vesicles 5 containing MHC class II molecules, T cell co-stimulatory molecules, and T cell-stimulating cytokines in their membranes HEK293T cells were seeded in cell culture dishes and cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 2% fetal bovine serum and penicillin/streptomycin. Cells at approximately 50% confluence were loaded with the plasmids prepared above (sc-Dimer-CD81, encoding MHC class II ⁇ chain, CD80-CD9, CD81-IL-6 and TGF- ⁇ -MFGE8, respectively) according to the manufacturer's instructions.
  • pCAG vector was transfected at the same time using Polyethyleneimine "Max" (manufactured by Polysciences). The medium was changed 3-12 hours after transfection and 24 hours after transfection to Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 2% exosome-depleted fetal bovine serum and penicillin/streptomycin. 72 hours after transfection, the supernatant was harvested and passed through a 0.22 ⁇ m filter followed by centrifugation at 300 g for 5 minutes. The supernatant was recovered and centrifuged at 2,000 g for 20 minutes. The supernatant was recovered and centrifuged at 10,000 g for 30 minutes.
  • Test Example 1-6 Flow cytometric analysis of fusion proteins contained in extracellular vesicle membranes
  • the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 7 were analyzed using PS Capture (trademark) exosome flow cytometry kit (Fujifilm Wako Pure Yaku Co., Ltd.), immunostaining was performed according to the manufacturer's instructions.
  • Antibodies used for staining are as follows. After staining, the expression of each fusion protein was detected with a flow cytometer FACSCantoII (manufactured by BD Biosciences).
  • Test Example 1-6 show that the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 7 contain MHC class II molecules presenting the OVA antigen, CD80, IL-6, and TGFb in the membrane (Fig. 3F)
  • Example 8 Establishment of cell lines stably expressing MHC class I molecules, T cell co-stimulatory molecules, and T cell stimulatory cytokines and preparation of antigen-presenting extracellular vesicles
  • PLAT-A cells are seeded in a cell culture dish and cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 2% fetal bovine serum and penicillin/streptomycin.
  • Cells at approximately 50% confluence were transfected with pMX vectors encoding CD80-CD9 or sc-Trimer-CD81-IL-2 using Polyethyleneimine "Max" (Polysciences), respectively, according to the manufacturer's instructions. .
  • HEK293 cells were seeded in cell culture dishes and cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 2% fetal bovine serum and penicillin/streptomycin.
  • DOTAP transfection reagent (Roche) was added to CD80-CD9-incorporated viral particles prepared above in cells at about 50% confluence according to the manufacturer's instructions, and added to HEK293 cells. The virus particles-added cells were infected by centrifugation at 2500 rpm for 3 hours.
  • CD80-positive cells were sorted by FACSMelody (manufactured by BD Biosciences). After culturing the sorted CD80-positive cells for 1 week, they were seeded in a dish and cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 2% fetal bovine serum and penicillin/streptomycin.
  • DOTAP transfection reagent was added according to the manufacturer's instructions to the viral particles incorporating sc-Trimer-CD81-IL-2 prepared above in cells at about 50% confluence, and added to CD80-positive HEK293 cells.
  • the virus particles-added cells were infected by centrifugation at 2500 rpm for 3 hours. Twenty-four hours after infection, the medium was replaced, and one week later, CD80-positive and MHCI-positive cells were sorted by FACSMelody (manufactured by BD Biosciences). Sorted cells were used as stably expressing cells. Stably expressing cells were seeded in dishes and cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 2% fetal bovine serum and penicillin/streptomycin.
  • the supernatant of approximately 50% confluent cells was exchanged to Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 2% exosome-depleted fetal bovine serum and penicillin/streptomycin. After 72 hours of medium exchange, the supernatant was recovered, passed through a 0.22 ⁇ m filter, and centrifuged at 300 g for 5 minutes. The supernatant was recovered and centrifuged at 2,000 g for 20 minutes. The supernatant was recovered and centrifuged at 10,000 g for 30 minutes. After collecting the supernatant and centrifuging the supernatant at 100,000 g for 2 hours, the supernatant was removed and the pellet was washed with PBS. PBS was added to the pellet, and the mixture was centrifuged at 100,000 g for 2 hours.
  • Test Example 1-7 Flow cytometric analysis of fusion proteins contained in extracellular vesicle membranes
  • the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 8 were analyzed using PS Capture (trademark) exosome flow cytometry kit (Fujifilm Wako Jun Yaku Co., Ltd.), immunostaining was performed according to the manufacturer's instructions.
  • Antibodies used for staining are as follows (staining time: 15 minutes, temperature: 4°C). After staining, the expression of each fusion protein was detected with a flow cytometer FACSCantoII (manufactured by BD Biosciences).
  • Test Example 1-7 show that the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 8 contain MHC class I molecules presenting the OVA antigen, CD80, and IL-2 in their membranes (Fig. 3G). .
  • HEK293T cells deficient in antigen-presenting extracellular vesicles B2m containing HLA class I molecules, human T cell co-stimulatory molecules, and human T cell-stimulating cytokines in their membranes were seeded in a cell culture dish, Cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with % fetal bovine serum and penicillin/streptomycin. Cells at about 50% confluence were loaded with Polyethyleneimine "Max" plasmids prepared above (HLAsc-Trimer-pCAG vectors encoding human CD81, human CD80-human CD9 and human CD63-IL2, respectively) according to the manufacturer's instructions.
  • the medium was changed 3-12 hours after transfection and 24 hours after transfection to Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 2% exosome-depleted fetal bovine serum and penicillin/streptomycin. 72 hours after transfection, the supernatant was harvested and passed through a 0.22 ⁇ m filter followed by centrifugation at 300 g for 5 minutes. The supernatant was recovered and centrifuged at 2,000 g for 20 minutes. The supernatant was recovered and centrifuged at 10,000 g for 30 minutes.
  • the supernatant was removed and the pellet was washed with PBS.
  • PBS was added to the pellet, and the pellet was centrifuged at 100,000 g for 2 hours. After removing the supernatant, the pellet was suspended in 100 ⁇ L of PBS and used as humanized antigen-presenting extracellular vesicles in Example 9. .
  • the concentration of antigen-presenting extracellular vesicles was measured using a BCA protein assay kit (manufactured by Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's instructions.
  • SARS-CoV2sc-Trimer-hCD81 instead of hsc-Trimer-hCD81, an antigen-presenting MHC molecule that presents the SARS-CoV2 peptide as an antigen, hCD80, and a humanized antigen that presents hIL-2 on its surface Displaying extracellular vesicles can be made.
  • Test Example 1-8 Flow cytometric analysis of fusion proteins contained in extracellular vesicle membranes
  • the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 9 were analyzed using PS Capture (trademark) exosome flow cytometry kit (Fujifilm Wako Jun Yaku Co., Ltd.), immunostaining was performed according to the manufacturer's instructions.
  • Antibodies used for staining are as follows (staining time: 15 minutes, temperature: 4°C). After staining, the expression of each fusion protein was detected with a flow cytometer FACSCantoII (manufactured by BD Biosciences).
  • Test Example 1-8 show that the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 9 contain MHC class I molecules presenting WT1 antigen, hCD80, and hIL-2 in their membranes (Fig. 3H). .
  • Test Example 7 In vitro differentiation induction experiment of OVA-specific CD4-positive T cells (OT-2 T cells) into Th1 T cells by antigen-presenting extracellular vesicles Antigen-presenting extracellular vesicles are antigen-specific CD4-positive T cells
  • Lymph nodes excised from OT-2 mice, which are OVA-reactive CD4TCR transgenic mice were crushed on a 100 ⁇ m filter to obtain a lymph node cell suspension. The cell suspension was stained with the cell proliferation assay reagent CellTrace Violet (Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's instructions.
  • 2 ⁇ 10 5 stained lymph node cells were suspended in 200 ⁇ L of RPMI1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 50 ⁇ M 2-mercaptoethanol and penicillin/streptomycin to a final concentration of 10 ⁇ g/mL.
  • the antigen-presenting extracellular vesicles of 6 or the extracellular vesicles of Reference Example 1 were added and cultured in a 96-well round-bottom plate for 4 days. After 4 days, cells were harvested and extracellular immunostaining was performed. The following antibodies were used for staining (staining time: 15 minutes, temperature: 4°C).
  • intracellular immunostaining was performed using True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (manufactured by Biolegend) and anti-T-bet antibody according to the manufacturer's instructions. After intracellular staining, the luminescence intensity of CellTrace Violet, a cell proliferation assay reagent for OT-2 T cells, and the expression of T-bet, a marker for Th1 T cells, were detected using a flow cytometer FACSCanto II (manufactured by BD Biosciences). .
  • the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 6 induce differentiation of antigen-specific CD4-positive T cells into Th1 cells in vitro as compared with the extracellular vesicles of Reference Example 1.
  • Th1 cells produce IFN- ⁇ , IL-2, etc., destroy pathogen cells, virus-infected cells, cancer cells, etc., and promote the activation of macrophages and cytotoxic T cells (i.e., cell-mediated immunity activation).
  • Test Example 8 In vitro differentiation induction experiment of OVA-specific CD4-positive T cells (OT-2 T cells) into Th17 T cells by antigen-presenting extracellular vesicles Antigen-presenting extracellular vesicles are antigen-specific CD4-positive T cells The following tests were performed in vitro to examine whether the cells were induced to differentiate into Th17T cells. Lymph nodes excised from OVA-reactive CD4TCR transgenic mice crossed with RORrt-GFP mice were crushed on a 100 ⁇ m filter to obtain a lymph node cell suspension. The cell suspension was stained with the cell proliferation assay reagent CellTrace Violet (Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's instructions.
  • 2 ⁇ 10 5 stained lymph node cells were suspended in 200 ⁇ L of RPMI1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 50 ⁇ M 2-mercaptoethanol and penicillin/streptomycin to a final concentration of 10 ⁇ g/mL. or the extracellular vesicles of Reference Example 1 were added and cultured in a 96-well round-bottom plate for 4 days. After 4 days, cells were harvested and extracellular immunostaining was performed. The following antibodies were used for staining (staining time: 15 minutes, temperature: 4°C).
  • the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 7 induce the differentiation of antigen-specific CD4-positive T cells into Th17 cells in vitro as compared with the extracellular vesicles of Reference Example 1.
  • Th17 cells produce inflammatory cytokines such as IL-17, IL-21, IL-22, and TNF- ⁇ , induce inflammation, and produce neutrophils and monocytes. It promotes mobilization and proliferation, and contributes to defense against infection with fungi (including pathogenic fungi such as Candida, Staphylococcus aureus, and Streptococcus).
  • Test Example 9 In vitro activation of OVA-specific CD8-positive T cells (OT-1 T cells) by antigen-presenting extracellular vesicles purified from stable cell lines Antigen-presenting extracellular vesicles purified from stable cell lines In order to examine whether cells can activate antigen-specific CD8-positive T cells, the following tests were performed in vitro. Lymph nodes excised from OT-1 mice, which are OVA-reactive TCR transgenic mice, were crushed on a 100 ⁇ m filter to obtain a lymph node cell suspension. The cell suspension was stained with the cell proliferation assay reagent CellTrace Violet (Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's instructions.
  • OT-1 T cells OVA-reactive TCR transgenic mice
  • 2 ⁇ 10 5 stained lymph node cells were suspended in 200 ⁇ L of RPMI1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 50 ⁇ M 2-mercaptoethanol and penicillin/streptomycin to a final concentration of 9 ⁇ g/mL.
  • the antigen-presenting extracellular vesicles of No. 8 or the extracellular vesicles of Reference Example 1 were added and cultured in a 96-well round-bottom plate for 4 days. Immunostaining was performed after 3 days of culture in a 96-well round-bottom plate.
  • Antibodies used for staining are as follows (staining time: 15 minutes, temperature: 4°C).
  • Test Example 10 Evaluation experiment of antitumor effect by antigen-presenting extracellular vesicles CD45.1/CD45.2 congenic to examine whether antigen-presenting extracellular vesicles purified from a stable cell line have antitumor effect
  • Mice were inoculated subcutaneously with 1 ⁇ 10 5 OVA-expressing B16 melanoma cells and three days later were transferred with 1 ⁇ 10 5 OT-1 T cells. 1 day, 4 days, and 7 days after the transfer of OT-1 T cells, 50 ⁇ g of the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 8 or the extracellular vesicles of Reference Example 1 were transferred from the tail vein of the recipient mouse, and B16 melanoma cells were obtained. observed the size of
  • Example 10 Preparation of mRNA expressing sc-Trimer-CD81-IL-2 fusion protein pET-15b vector encoding sc-Trimer-CD81-IL-2 was linearized using EagI and prepared into FastGene Gel. /PCR extraction kit (Nippon Genetics) was used to purify, and in vitro transcription, capping, and polyA addition were performed using T7 mScript Standard mRNA Production System (CELLSCRIPT) according to the manufacturer's instructions. . The synthesized mRNA was used as RNA that produces antigen-presenting cells and antigen-presenting extracellular vesicles in Example 10 (Fig. 1N).
  • Test Example 11 In vivo activation experiment of OVA-specific CD8-positive T cells (OT-1 T cells) by mRNA expressing sc-Trimer-CD81-IL-2 fusion protein sc-Trimer-CD81-IL- In order to investigate whether mRNA expressing the 2 fusion protein activates antigen-specific CD8-positive T cells, the following test was performed in vivo. Lymph nodes were excised from OT-1 mice, which are OVA-reactive TCR transgenic mice, and crushed on a 100 ⁇ m filter to obtain a lymph node cell suspension. Lymph nodes were similarly excised from CD45.1 congenic mice, and lymphocyte suspensions were prepared.
  • Each lymphocyte suspension was mixed at a ratio of 1:1 and stained with CellTrace Violet, a cell proliferation assay reagent.
  • 1 ⁇ 10 7 CellTrace Violet-stained mixed lymphocyte suspensions in PBS were transferred via the tail vein of CD45.1/CD45.2 congenic mice.
  • 10 ⁇ g of mRNA of Example 10 or Reference Example 6 was mixed with an in vivo-jet RNA transfection reagent (Polyplus) according to the manufacturer's instructions, and transfected into CD45.1/CD45.2 congenic mice via the tail vein.
  • the spleen was excised from the recipient mouse, a lymphocyte suspension was prepared, and immunostaining was performed.
  • Antibodies used for staining are as follows (staining time: 15 minutes, temperature: 4°C). After staining, the luminescence intensity of CellTrace Violet, a cell proliferation assay reagent, in the transfected OT-1 T cells and wild-type CD8 T cells was detected with a flow cytometer FACSCanto II (manufactured by BD Biosciences).
  • Antigen-specific CD8-positive T cells were remarkably differentiated and/or proliferated (Fig. 13).
  • the polynucleotide according to the present invention is introduced into any cell in the body of a CD45.1/CD45.2 congenic mouse, and the membrane surface of the cell and/or the extracellular small molecule secreted from the cell.
  • the sc-Trimer-CD81-IL-2 fusion protein is expressed on the membrane surface of the vesicle to generate antigen-presenting cells and/or antigen-presenting extracellular vesicles, and the generated antigen-presenting cells and/or antigen-presenting cells It is believed that OVA-reactive CD8 T cells proliferated due to contact between the outer vesicles and OT-1 T cells. This is equivalent to the T cell activation effect of antigen-presenting extracellular vesicles shown in Test Examples 1 to 10 above. However, it has been shown to be obtained in vivo.
  • Test Example 12 Activation of endogenous OVA-reactive T cells by mRNA expressing sc-Trimer-CD81-IL-2 fusion protein
  • Experiment Example 10 or Reference Example 6 10 ⁇ g of the mRNA according to the manufacturer's instructions, in vivo- It was mixed with jetRNA transfection reagent (Polyplus) and transferred from the tail vein of C57BL/6 mice. Four days after the transfer, the spleen was removed from the recipient mouse, a lymphocyte suspension was prepared, and OVA-reactive T cells were immunostained with a tetramer according to the manufacturer's instructions. Antibodies used for staining are as follows.
  • the polynucleotide according to the present invention is introduced into any cell in the body of a C57BL/6 mouse, and sc on the membrane surface of the cell and/or the membrane surface of extracellular vesicles secreted from the cell.
  • the Trimer-CD81-IL-2 fusion protein is expressed to generate antigen-presenting cells and/or antigen-presenting extracellular vesicles, and the generated antigen-presenting cells and/or antigen-presenting extracellular vesicles and endogenous It is understood that the OVA-reactive CD8 T cells proliferated upon contact with the male T cells. This is shown in Test Examples 1 to 10 above, and the effect equivalent to the pharmaceutical effect of antigen-presenting extracellular vesicles can be obtained in vivo even with polynucleotides for producing antigen-presenting cells and/or antigen-presenting extracellular vesicles. is obtained in
  • Test Example 13 In vivo differentiation induction experiment of OVA-specific CD4-positive T cells (OT-2 T cells) into Th1 T cells by antigen-presenting extracellular vesicles OT-2 mice, which are OVA-reactive TCR transgenic mice Lymph nodes are removed from the cells and crushed on a 100 ⁇ m filter to obtain a lymph node cell suspension. Lymph nodes were similarly excised from CD45.1 congenic mice, and lymphocyte suspensions were prepared. The respective lymphocyte suspensions are mixed in a 1:1 ratio and stained with CellTrace Violet, a cell proliferation assay reagent. 1 ⁇ 10 7 CellTrace Violet-stained mixed lymphocyte suspensions in PBS are transferred via the tail vein of CD45.1/CD45.2 congenic mice.
  • Example 6 or Reference Example 1 One day and four days after lymphocyte transfer, 50 ⁇ g of the extracellular vesicles of Example 6 or Reference Example 1 are subcutaneously transferred into CD45.1/CD45.2 congenic mice. Seven days after cell transfer, the spleen is removed from the recipient mouse, a lymphocyte suspension is prepared, and immunostaining is performed. The following antibodies are used for staining (staining time: 15 minutes, temperature: 4°C). After staining, the luminescence intensity of CellTrace Violet, a cell proliferation assay reagent, in the transfected OT-2 T cells and wild-type CD4 T cells is detected with a flow cytometer FACSCanto II (manufactured by BD Biosciences).
  • APC-Cy7 conjugated anti-mouse CD4 antibody (RM4-5 Biolegend) ⁇ PerCP/Cy5.5 conjugated anti-mouse TCRVa2 antibody (B20.1 Biolegend) ⁇ FITC-conjugated anti-mouse CD45.1 antibody (manufactured by A20 Biolegend) ⁇ PE-Cy7 conjugated anti-mouse CD45.2 antibody (manufactured by 104 Biolegend) ⁇ PE conjugated anti-T-bet antibody (manufactured by 4B10 Biolegend)
  • Test Example 14 Evaluation of Antitumor Effect of Antigen-presenting Extracellular Vesicles Test
  • OVA was administered to CD45.1/CD45.2 congenic mice.
  • 1 ⁇ 10 5 expressing B16 melanoma cells were inoculated subcutaneously and one day later 5 ⁇ 10 5 OT-2 T cells were transferred.
  • 1 day, 4 days, and 7 days after the transfer of OT-2 T cells 50 ⁇ g of the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 6 or the extracellular vesicles of Reference Example 1 were subcutaneously transferred to recipient mice, and B16 melanoma cells were obtained. observed the size.
  • the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 6 significantly suppressed the proliferation of B16 melanoma cells compared to the extracellular vesicles of Reference Example 1 (Fig. 16).
  • HEK293T cells deficient in antigen-presenting extracellular vesicles B2m containing HLA class II molecules, human T cell co-stimulatory molecules, and human T cell-stimulating cytokines in their membranes were seeded in a cell culture dish, Cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with % fetal bovine serum and penicillin/streptomycin. Cells at approximately 50% confluence were loaded with the plasmids prepared above (pCAG vectors encoding HLADR-1sc-TPI1-human CD81, human CD80-human CD9, human IL-12sc-MFGe8, respectively) according to the manufacturer's instructions.
  • Duplicates were transfected simultaneously using Polyethyleneimine "Max" (Polysciences). Medium was changed 3-12 hours post-transfection and 24 hours post-transfection to Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 2% exosome-depleted fetal bovine serum and penicillin/streptomycin. 72 hours after transfection, the supernatant was harvested and passed through a 0.22 ⁇ m filter followed by centrifugation at 300 g for 5 minutes. The supernatant was recovered and centrifuged at 2,000 g for 20 minutes. The supernatant was recovered and centrifuged at 10,000 g for 30 minutes.
  • Test Example 15 Flow cytometric analysis of fusion proteins contained in extracellular vesicle membranes
  • the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 11 were analyzed using PS Capture (trademark) exosome flow cytometry kit (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) company), and immunostaining was performed according to the manufacturer's instructions.
  • Antibodies used for staining are as follows. After staining, the expression of each fusion protein was detected with a flow cytometer FACSCantoII (manufactured by BD Biosciences).
  • the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 11 have MHC class II molecules (that is, HLA-DR) that present the neoantigen TPI-1 antigen on the membrane, CD80, and IL-12. (Fig. 17)
  • Test Example 16 In vitro differentiation induction experiment of TPI-1-specific human CD4-positive T cells into Th1 T cells by antigen-presenting extracellular vesicles Humanized antigen-presenting extracellular vesicles induce antigen-specific CD4-positive T cells The following tests were performed in vitro to examine whether differentiation into Th1 T cells is induced.
  • PlatA cells retroviral packaging cells
  • TPI-1 peptide-specific TCR T cell recipient
  • pMXs vector encoding the fluorescent protein Venus using Polyethyleneimine "Max” (manufactured by Polysciences).
  • the medium was changed 3-12 hours after transfection, the supernatant was harvested 48 hours and 72 hours after transfection, the supernatant was passed through a 0.22 ⁇ m filter, and the retrovirus expressing TPI-1 specific TCR was detected. A supernatant was prepared.
  • Peripheral blood was collected from HLA-DR1-positive recipients, peripheral blood mononuclear cells were separated using Ficol, and 2.0 ⁇ 10 6 peripheral blood mononuclear cells were added to 10% fetal bovine serum and 50 ⁇ M.
  • Virus particles prepared above were infected with RetroNectin (TAKARA) according to the manufacturer's instructions to generate human T cells that co-express the TPI-1 peptide-specific TCR and the fluorescent protein Venus.
  • Extracellular vesicles of Example 11 or Reference Example 1 were added to the prepared human T cells and cultured in a 96-well round-bottom plate for 7 days. After 7 days, cells were harvested and extracellular immunostaining was performed.
  • the following antibodies were used for staining (staining time: 15 minutes, temperature: 4°C). After extracellular staining, intracellular immunostaining was performed using True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (manufactured by Biolegend) and anti-T-bet antibody according to the manufacturer's instructions. After intracellular staining, the intensity of Venus luminescence and the expression of T-bet and IFN- ⁇ , which are Th1 T cell markers, are detected with a flow cytometer FACSCanto II (manufactured by BD Biosciences).
  • Th1 cells were induced to differentiate into (Fig. 18). Th1 cells produce IFN- ⁇ , IL-2, etc., destroy pathogen cells, virus-infected cells, cancer cells, etc., and promote the activation of macrophages and cytotoxic T cells (i.e., cell-mediated immunity activation).
  • Example 12 Establishment of cell lines stably expressing MHC class I molecules, T cell co-stimulatory molecules, and T cell-stimulating cytokines, and preparation of antigen-presenting extracellular vesicles PLAT-A cells were seeded in a cell culture dish and cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 2% fetal bovine serum and penicillin/streptomycin. Cells at about 50% confluence were transfected with a pMX vector encoding CD80-MFG-E8 or sc-Trimer-CD81-IL-2 using Polyethyleneimine "Max" (Polysciences) according to the manufacturer's instructions. effected.
  • HEK293 cells were seeded in cell culture dishes and cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 2% fetal bovine serum and penicillin/streptomycin.
  • DOTAP transfection reagent (Roche) was added to CD80-MFG-E8-loaded viral particles prepared above in cells at approximately 50% confluence, according to the manufacturer's instructions, and added to HEK293 cells. The virus particles-added cells were infected by centrifugation at 2500 rpm for 3 hours.
  • CD80-positive cells were sorted by FACSMelody (manufactured by BD Biosciences). After culturing the sorted CD80-positive cells for 1 week, they were seeded in a dish and cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 2% fetal bovine serum and penicillin/streptomycin.
  • DOTAP transfection reagent was added according to the manufacturer's instructions to the viral particles incorporating sc-Trimer-CD81-IL-2 prepared above in cells at about 50% confluence, and added to CD80-positive HEK293 cells.
  • the virus particles-added cells were infected by centrifugation at 2500 rpm for 3 hours. Twenty-four hours after infection, the medium was replaced, and one week later, CD80-positive and MHCI-positive cells were sorted by FACSMelody (manufactured by BD Biosciences). Sorted cells were used as stably expressing cells. Stably expressing cells were seeded in dishes and cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 2% fetal bovine serum and penicillin/streptomycin.
  • the supernatant of approximately 50% confluent cells was exchanged to Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 2% exosome-depleted fetal bovine serum and penicillin/streptomycin. After 72 hours of medium exchange, the supernatant was recovered, passed through a 0.22 ⁇ m filter, and centrifuged at 300 g for 5 minutes. The supernatant was recovered and centrifuged at 2,000 g for 20 minutes. The supernatant was recovered and centrifuged at 10,000 g for 30 minutes. After collecting the supernatant and centrifuging the supernatant at 100,000 g for 2 hours, the supernatant was removed and the pellet was washed with PBS. PBS was added to the pellet, and the mixture was centrifuged at 100,000 g for 2 hours.
  • Test Example 17 Evaluation experiment of antitumor effect of antigen-presenting extracellular vesicles To investigate whether antigen-presenting extracellular vesicles purified from a stable cell line have antitumor effect, OVA is expressed in C57BL/6 mice. 1 ⁇ 10 5 EL-4 cells were inoculated subcutaneously. 1 day, 4 days, and 7 days after ingestion of EL-4 cells, 50 ⁇ g of the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 12 or the extracellular vesicles of Reference Example 1 were transferred from the tail vein of the recipient mouse, and EL-4 cells were fed. Cell size was observed.
  • Example 1A Preparation of mRNA encoding sc-Trimer-T2A-IL-2-CD8-P2A-CD80 pET- 15b vector encoding sc-Trimer-T2A-IL-2-CD8-P2A-CD80 was purified using FastGene Gel/PCR Extraction Kit (Nippon Genetics), and in vitro using T7 mScript Standard mRNA Production System (manufactured by CELLSCRIPT) according to the manufacturer's instructions. Transcription and capping, polyA addition was performed. The synthesized mRNA was used as RNA for inducing antigen-presenting cells in Example 1A (Fig. 1P).
  • Test Example 1A Flow Cytometry Analysis of Antigen Presenting Cells Induced by mRNA B16 melanoma cells were seeded in cell culture dishes and cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 2% fetal bovine serum and penicillin/streptomycin. Cells at approximately 50% confluence were transfected with the mRNA of Example 1A and the mRNA of Reference Example 1A using TransIT-mRNA Transfection Kit (Mirus) according to the manufacturer's instructions. Twenty-four hours after transfection, B16 melanoma cells were harvested and immunostained according to the manufacturer's instructions. Antibodies used for staining are as follows (staining time: 15 minutes, temperature: 4°C).
  • Test Example 2A Activation experiment of OVA-specific CD8-positive T cells (OT-1 T cells) by antigen-presenting cells in vitro Examining whether antigen-presenting cells activate antigen-specific CD8-positive T cells Therefore, the following tests were performed in vitro. Lymph nodes excised from OT-1 mice, which are OVA-reactive TCR transgenic mice, were crushed on a 100 ⁇ m filter to obtain a lymph node cell suspension. The cell suspension was stained with the cell proliferation assay reagent CellTrace Violet (Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's instructions.
  • 2 ⁇ 10 5 stained lymph node cells were suspended in 200 ⁇ L of RPMI1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 50 ⁇ M 2-mercaptoethanol and penicillin/streptomycin, and the mRNA of Example 1A or Reference Example 1A and Reference Example 2A.
  • 1 ⁇ 10 4 MO4 cells transfected with were added, cultured in a 96-well round-bottom plate for 3 days, and then immunostained.
  • Antibodies used for staining are as follows (staining time: 15 minutes, temperature: 4°C).
  • Test Example 3A Experiment for converting melanoma cells into antigen-presenting cells in vivo 1 ⁇ 10 5 B16 melanoma cells expressing OVA were subcutaneously ingested in nude mice, and after the tumor volume reached about 100 mm 3 , 9 ⁇ g of mRNA was obtained. was mixed with in vivo-jet RNA transfection reagent (Polyplus) according to the manufacturer's instructions and administered intratumorally. The following day, tumors were excised from recipient mice, tumor suspensions were prepared, and immunostaining was performed according to the manufacturer's instructions. Antibodies used for staining are as follows (staining time: 15 minutes, temperature: 4°C).
  • Example 3A From the results of Test Example 3A, the mRNA of Example 1A induced the expression of OVAp-MHCI, IL-2-CD8 and CD80 proteins on the membrane surface of OVA-expressing B16 melanoma cells in vivo (FIG. 22). This indicates that some melanoma cells were converted to antigen-presenting cells in vivo.
  • Test Example 4A Activation experiment of endogenous OVA-reactive T cells by in vivo-induced antigen-presenting cells 2 ⁇ g of mRNA of Example 1A or Reference Examples 1A to 2A was subjected to an in vivo-jet RNA transfection reagent (Polyplus) according to the manufacturer's instructions. company) and transferred from the tail vein of C57BL/6 mice. Seven days after the transfer, spleens were excised from the recipient mice, lymphocyte suspensions were prepared, and OVA-reactive T cells were immunostained with tetramer according to the manufacturer's instructions. Antibodies used for staining are as follows.
  • Example 1A remarkably proliferated endogenously present OVA-reactive CD8 T cells compared to the mRNAs of Reference Examples 1A to 2A (Fig. 23).
  • antigen presentation in which the mRNA according to the present invention is introduced into any cell in the body of a C57BL/6 mouse, and OVAp-MHCI, IL-2-CD8, and CD80 proteins are expressed on the membrane surface of the cell, respectively. It is believed that the cells were induced, endogenous T cells contacted antigen-presenting cells, and OVA-reactive CD8 T cells proliferated.
  • Example 2A Preparation of mRNA encoding sc-Trimer-T2A-IL-15sa-P2A-CD80
  • a vector having a human ⁇ -globulin sequence and a 129-base polyA sequence was linearized using HindIII, purified using FastGene Gel/PCR extraction kit (Nippon Genetics), and purified using HiScribe T7 mRNA Kit with CleanCap Reagent AG. (New England Biolabs) according to the manufacturer's instructions.
  • the synthesized mRNA was used as RNA for inducing antigen-presenting cells in Example 2A (Fig. 24(a)).
  • Test Example 5A Flow Cytometry Analysis of Antigen Presenting Cells Induced by mRNA 293T cells were seeded in cell culture dishes and cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 2% fetal bovine serum and penicillin/streptomycin. Cells at approximately 50% confluence were transfected with the mRNA of Example 2A using the TransIT-mRNA Transfection Kit (Mirus) according to the manufacturer's instructions. Twenty-four hours after transfection, 293T cells were harvested and immunostained according to the manufacturer's instructions. Antibodies used for staining are as follows (staining time: 15 minutes, temperature: 4°C).
  • Test Example 6A Activation experiment of endogenous OVA-reactive T cells by in vivo-induced antigen-presenting cells 5 ⁇ g of mRNA of Example 2A or Reference Example 1A was treated with an in vivo-jet RNA transfection reagent (Polyplus Inc.) according to the manufacturer's instructions. ) and transferred via the tail vein of C57BL/6 mice. Seven days after the transfer, spleens were excised from the recipient mice, lymphocyte suspensions were prepared, and OVA-reactive T cells were immunostained with tetramer according to the manufacturer's instructions. Antibodies used for staining are as follows.
  • the mRNA of Example 2A remarkably proliferated endogenously present OVA-reactive CD8 T cells compared to the mRNA of Reference Example 1A (Fig. 26).
  • the proliferated cells also assumed the CD44hiCD62low effector memory phenotype (meaning that the proliferated cells were able to rapidly produce cytokines and respond to an immune response when re-exposed to the same antigen).
  • the mRNA according to the present invention is introduced into arbitrary cells in the body of C57BL/6 mice, and antigen-presenting cells expressing OVA-MHCI, IL-15sa and CD80 proteins on the membrane surface of the cells are generated. It is believed that the induced endogenous T cells contacted the antigen-presenting cells and proliferated the OVA-reactive CD8 T cells.
  • Example 3A Preparation of mRNA encoding sc-Trimer-T2A-IL-2-CD8-P2A-CD80 presenting neoantigen Neoantigen (cancer antigen) derived from MC38 colon cancer cell line instead of OVA peptide
  • a vector encoding sc-Trimer-T2A-IL-2-CD8-P2A-CD80 displaying a mutated Gtf2i peptide was linearized using HindIII using FastGene Gel/PCR extraction kit (Nippon Genetics). After purification, in vitro transcription, capping, and polyA addition were performed using T7 mScript Standard mRNA Production System (manufactured by CELLSCRIPT) according to the manufacturer's instructions. The synthesized mRNA was used as RNA for inducing antigen-presenting cells in Example 3A (Fig. 24(b)).
  • Test Example 7A Flow Cytometry Analysis of Antigen Presenting Cells Presenting Neoantigens Induced by mRNA 293T cells were seeded in cell culture dishes and cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 2% fetal bovine serum and penicillin/streptomycin. . Cells at approximately 50% confluence were transfected with the mRNA of Example 3A using the TransIT-mRNA Transfection Kit (Mirus) according to the manufacturer's instructions. Twenty-four hours after transfection, 293T cells were harvested and immunostained according to the manufacturer's instructions. Antibodies used for staining are as follows (staining time: 15 minutes, temperature: 4°C).
  • Test Example 8A Activation of endogenous Gtf2i-reactive T cells by antigen-presenting cells induced in vivo Test Example 3A or 3 ⁇ g of the mRNA of Reference Example 1A was subjected to an in vivo-jet RNA transfection reagent (Polyplus) according to the manufacturer's instructions. and transferred via the tail vein of C57BL/6 mice. Seven days after the transfer, spleens were excised from the recipient mice, lymphocyte suspensions were prepared, and Gtf2i-reactive T cells were immunostained with tetramer according to the manufacturer's instructions. Antibodies used for staining are as follows.
  • Example 3A remarkably proliferated endogenously present Gtf2i-reactive CD8 T cells compared to the mRNA of Reference Example 1A (Fig. 28).
  • the proliferated cells became the effector memory phenotype of CD44hiCD62low.
  • antigen presentation in which the mRNA according to the present invention is introduced into any cell in the body of a C57BL/6 mouse, and neoantigen-MHCI, IL-2-CD8 and CD80 proteins are expressed on the membrane surface of the cell, respectively. It is believed that the cells were induced, endogenous T cells contacted antigen presenting cells, and neoantigen-reactive CD8 T cells proliferated.
  • Example 4A Preparation of mRNA encoding OVAp-MHCII ⁇ -P2A-MHCII ⁇ -T2A-IL-12sc-CD8-P2A-CD80
  • a vector having a coding T7 promoter, a human ⁇ -globulin sequence in the 3′UTR and a 129-base polyA sequence was linearized using HindIII and purified using FastGene Gel/PCR extraction kit (Nippon Genetics). , HiScribe T7 mRNA Kit with CleanCap Reagent AG (New England Biolabs) according to the manufacturer's instructions.
  • the synthesized mRNA was used as RNA for inducing antigen-presenting cells in Example 4A (Fig. 24(c)).
  • Test Example 9A Flow Cytometry Analysis of Antigen Presenting Cells Induced by mRNA 293T cells were seeded in cell culture dishes and cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 2% fetal bovine serum and penicillin/streptomycin. Cells at approximately 50% confluence were transfected with the mRNA of Example 4A using the TransIT-mRNA Transfection Kit (Mirus) according to the manufacturer's instructions. Twenty-four hours after transfection, 293T cells were harvested and immunostained according to the manufacturer's instructions. Antibodies used for staining are as follows (staining time: 15 minutes, temperature: 4°C).
  • Test Example 10A Activation experiment of endogenous OVA-reactive T cells by antigen-presenting cells induced in vivo
  • Lymph nodes were excised from OT-II mice, which are OVA-reactive TCR transgenic mice, and crushed on a 100 ⁇ m filter to obtain a lymph node cell suspension.
  • OT-II mice which are OVA-reactive TCR transgenic mice
  • cell proliferation assay reagent CellTrace Violet 5 ⁇ 10 6 CellTrace Violet-stained lymphocyte suspensions in PBS were transferred via the tail vein of CD45.1 congenic mice.
  • Example 4A or Reference Example 1A or Reference Example 2A was mixed with an in vivo-jet RNA transfection reagent (Polyplus) according to the manufacturer's instructions, and transferred into CD45.1 congenic mice via the tail vein. .
  • RNA transfection reagent Polyplus
  • the spleen was excised from the recipient mouse, a lymphocyte suspension was prepared, and immunostaining was performed.
  • Antibodies used for staining are as follows (staining time: 15 minutes, temperature: 4°C).
  • the mRNA of Example 4A significantly proliferated OVA-reactive CD4 T cells compared to the mRNAs of Reference Examples 1A and 2A (Fig. 30). Some of the proliferated cells differentiated into T-bet-positive Th1 cells.
  • the mRNA according to the present invention is introduced into any cell in the body of a C57BL/6 mouse, and an antigen-presenting cell expressing OVA-MHCII, IL-12 and CD80 proteins on the membrane surface of the cell is generated. It is believed that the induced, OVA-reactive CD4 T cell cells contacted antigen presenting cells, proliferated and differentiated into Th1 cells.
  • Example 5A Preparation of mRNA expressing sc-Trimer (RPL18 peptide)-CD81-IL-2 fusion protein
  • RPL18 peptide a mutant RPL18 peptide that is a neoantigen (cancer antigen) derived from MC38 colon cancer cell line was used.
  • the pET-15b vector encoding the presenting sc-Trimer (RPL18 peptide)-CD81-IL-2 was linearized using EagI and purified using FastGene Gel/PCR extraction kit (Nippon Genetics).
  • Example 5A T7 mScript Standard mRNA Production System (manufactured by CELLSCRIPT) according to the manufacturer's instructions, followed by in vitro transcription, capping, and polyA addition.
  • the synthesized mRNA was used as RNA for producing antigen-presenting cells and antigen-presenting extracellular vesicles in Example 5A.
  • Test Example 11A Activation of endogenous RPL18 peptide-reactive T cells by mRNA expressing sc-Trimer (RPL18 peptide)-CD81-IL-2 fusion protein It was mixed with an in vivo-jet RNA transfection reagent (Polyplus) and transferred from the tail vein of C57BL/6 mice according to. Four days after transfer, the spleen was removed from the recipient mouse, a lymphocyte suspension was prepared, and RPL18 peptide-reactive T cells were immunostained with a tetramer according to the manufacturer's instructions. Antibodies used for staining are as follows.
  • the mRNA of Example 5A remarkably proliferated endogenously present RPL18-reactive CD8 T cells compared to the mRNA of Reference Example 6 (Fig. 31).
  • the polynucleotide according to the present invention is introduced into any cell in the body of a C57BL/6 mouse, and sc on the membrane surface of the cell and/or the membrane surface of extracellular vesicles secreted from the cell.
  • the Trimer-CD81-IL-2 fusion protein is expressed to generate antigen-presenting cells and/or antigen-presenting extracellular vesicles, and the generated antigen-presenting cells and/or antigen-presenting extracellular vesicles and endogenous It is understood that the RPL18-reactive CD8 T cells were proliferated upon contact with sexual T cells. This is shown in Test Examples 1 to 10 above, and an effect equivalent to the pharmaceutical effect of antigen-presenting extracellular vesicles can be obtained in vivo even in the case of polynucleotides for producing antigen-presenting cells and/or antigen-presenting extracellular vesicles. is obtained in
  • Example 1B pET-15b encoding polynucleotides sc-Trimer-CD81 and CD63-IL-2, respectively, for producing antigen-presenting extracellular vesicles containing MHC class I molecules and T cell-stimulating cytokines in their membranes
  • the linearized vector was purified using FastGene Gel/PCR Extraction Kit (Nippon Genetics) and in vitro transcribed using T7 mScript Standard mRNA Production System (CELLSCRIPT) according to the manufacturer's instructions. and capping, polyA addition. After mixing the synthesized mRNA at 1:1, it is used as RNA for producing the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 1B.
  • Example 2B Polynucleotides sc-Trimer-CD81, CD80-CD9, and for producing antigen-presenting extracellular vesicles containing MHC class I molecules, T cell co-stimulatory molecules, and T cell stimulatory cytokines in their membranes Linearized pET-15b vectors encoding CD63-IL-2, respectively, were purified using FastGene Gel/PCR Extraction Kit (Nippon Genetics), and T7 mScript Standard mRNA Production System (CELLSCRIPT) was used. In vitro transcription and capping, polyA addition is performed using the manufacturer's instructions. After mixing the synthesized mRNA at 1:1:1, it is used as RNA for producing the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 2B.
  • Reference Example 5B A pET-15b vector encoding polynucleotides sc-Trimer-CD81 and CD80-CD9 for producing extracellular vesicles containing MHC class I molecules and T cell co-stimulatory molecules in their membranes was linearized. The resulting product was purified using FastGene Gel/PCR Extraction Kit (Nippon Genetics), followed by in vitro transcription and capping using T7 mScript Standard mRNA Production System (manufactured by CELLSCRIPT) according to the manufacturer's instructions. , polyA addition. The synthesized mRNAs are mixed at a ratio of 1:1 and used as RNA for producing antigen-presenting extracellular vesicles of Reference Example 5B.
  • Test Example 3B In vivo activation experiment of OVA-specific CD8-positive T cells (OT-1 T cells) by polynucleotides for producing antigen-presenting extracellular vesicles OVA-reactive TCR transgenic mice Lymph nodes are removed from OT-1 mice, and lymphocyte suspensions are prepared in the same manner as in Test Example 2B. Lymph nodes are similarly excised from CD45.1 congenic mice, and lymphocyte suspensions are prepared. Each lymphocyte suspension is mixed in a 1:1 ratio and stained with CellTrace Violet, a cell proliferation assay reagent. 1 ⁇ 10 7 CellTrace Violet-stained mixed lymphocyte suspensions in PBS are transferred via the tail vein of CD45.1/CD45.2 congenic mice.
  • each of the mRNAs of Examples 1A to 5A and Reference Examples 2A to 5A are mixed with an in vivo-jet RNA transfection reagent (Polyplus) and transfected into CD45.1/CD45.2 congenic mice via the tail vein.
  • an in vivo-jet RNA transfection reagent Polyplus
  • the lymph nodes are excised from the recipient mice, lymphocyte suspensions are prepared, and immunostaining is performed to detect and quantify various T cells.
  • the mRNAs of Examples 1B and 2B can significantly differentiate and/or proliferate antigen-specific CD8-positive T cells in vivo.
  • Example 3B Polynucleotide sc-Dimer-CD81, MHC class II ⁇ chain for producing antigen-presenting extracellular vesicles 1 containing MHC class II molecules, T cell co-stimulatory molecules, and T cell stimulatory cytokines in their membranes , CD80-CD9, and CD63-IL-2 were linearized pET-15b vectors encoding each, FastGene Gel / PCR extraction kit (Nippon Genetics Co., Ltd.) was used to purify, T7 mScript Standard mRNA Production System (CELLSCRIPT) according to the manufacturer's instructions for in vitro transcription and capping, polyA addition. After mixing the synthesized mRNA at 1:1:1:1, it is used as RNA for producing the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 3B.
  • Test Example 4B In vivo activation experiment of OVA-specific CD4-positive T cells (OT-2 T cells) by polynucleotides for producing antigen-presenting extracellular vesicles OVA-reactive CD4TCR transgenic mice Lymph nodes are removed from OT-2 mice, and a lymphocyte suspension is prepared in the same manner as in Test Example 2. Lymph nodes are similarly excised from CD45.1 congenic mice, and lymphocyte suspensions are prepared. The respective lymphocyte suspensions are mixed in a 1:1 ratio and stained with CellTrace Violet, a cell proliferation assay reagent. 1 ⁇ 10 7 CellTrace Violet-stained mixed lymphocyte suspensions in PBS are transferred via the tail vein of CD45.1/CD45.2 congenic mice.
  • Example 3B 50 ⁇ g of mRNA of Example 3B is mixed with in vivo-jet RNA transfection reagent (Polyplus) and transferred into CD45.1/CD45.2 congenic mice via the tail vein.
  • in vivo-jet RNA transfection reagent Polyplus
  • the lymph nodes are excised from the recipient mice, lymphocyte suspensions are prepared, and immunostaining is performed to detect and quantify various T cells.
  • the mRNA of Example 3B can significantly differentiate and/or proliferate antigen-specific CD4-positive T cells in vivo.
  • Example 4B Polynucleotide sc-Dimer-CD81, MHC class II ⁇ chain for producing antigen-presenting extracellular vesicles 2 containing MHC class II molecules, T cell co-stimulatory molecules, and T cell stimulatory cytokines in their membranes , CD80-CD9, TGF- ⁇ -MFGE8, and CD63-IL-2 were linearized pET-15b vectors encoding each, FastGene Gel / PCR extraction kit (Nippon Genetics Co., Ltd.) was used to purify, In vitro transcription, capping, and polyA addition are performed using the T7 mScript Standard mRNA Production System (manufactured by CELLSCRIPT) according to the manufacturer's instructions. After mixing the synthesized mRNA at a ratio of 1:1:1:1:1, it is used as RNA for preparing the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 4B.
  • Test Example 5B In vivo activation experiment of OVA-specific CD4-positive T cells (OT-2 T cells) by polynucleotides for producing antigen-presenting extracellular vesicles OVA-reactive CD4TCR transgenic mice Lymph nodes are removed from OT-2 mice, and lymphocyte suspensions are prepared in the same manner as in Test Example 2B. Lymph nodes are similarly excised from CD45.1 congenic mice, and lymphocyte suspensions are prepared. The respective lymphocyte suspensions are mixed in a 1:1 ratio and stained with CellTrace Violet, a cell proliferation assay reagent. 1 ⁇ 10 7 CellTrace Violet-stained mixed lymphocyte suspensions in PBS are transferred via the tail vein of CD45.1/CD45.2 congenic mice.
  • Example 4B 50 ⁇ g of mRNA of Example 4B is mixed with in vivo-jet RNA transfection reagent (Polyplus) and transferred into CD45.1/CD45.2 congenic mice via the tail vein.
  • in vivo-jet RNA transfection reagent Polyplus
  • the lymph nodes are excised from the recipient mice, lymphocyte suspensions are prepared, and immunostaining is performed to detect and quantify various T cells.
  • the mRNA of Example 4B can significantly differentiate and/or proliferate antigen-specific regulatory T cells in vivo.
  • Example 5B Polynucleotide sc-Dimer-CD81, MHC class II ⁇ chain for producing antigen-presenting extracellular vesicles 3 containing MHC class II molecules, T cell co-stimulatory molecules, and T cell stimulatory cytokines in their membranes , CD80-CD9, and CD81-IL-4 were linearized using the FastGene Gel/PCR extraction kit (Nippon Genetics) and purified using the T7 mScript Standard mRNA Production System. (CELLSCRIPT) according to the manufacturer's instructions for in vitro transcription and capping, polyA addition. After mixing the synthesized mRNA at a ratio of 1:1:1:1, it is used as RNA for producing the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 5B.
  • Test Example 6B In vivo activation experiment of OVA-specific CD4-positive T cells (OT-2 T cells) by polynucleotides for producing antigen-presenting extracellular vesicles OVA-reactive CD4TCR transgenic mice Lymph nodes are removed from OT-2 mice, and a lymphocyte suspension is prepared in the same manner as in Test Example 2. Lymph nodes are similarly excised from CD45.1 congenic mice, and lymphocyte suspensions are prepared. Each lymphocyte suspension is mixed in a 1:1 ratio and stained with CellTrace Violet, a cell proliferation assay reagent. 1 ⁇ 10 7 CellTrace Violet-stained mixed lymphocyte suspensions in PBS are transferred via the tail vein of CD45.1/CD45.2 congenic mice.
  • Example 3A or 5A 50 ⁇ g of mRNA of Example 3A or 5A are each mixed with an in vivo-jet RNA transfection reagent (Polyplus) and transfected into CD45.1/CD45.2 congenic mice via the tail vein.
  • an in vivo-jet RNA transfection reagent Polyplus
  • the lymph nodes are excised from the recipient mice, lymphocyte suspensions are prepared, and immunostaining is performed to detect and quantify various T cells.
  • the mRNAs of Examples 3B and 5B can significantly differentiate and/or proliferate antigen-specific Th2 cells in vivo.
  • Example 6B Polynucleotide sc-Dimer-CD81-IL-12p40 for making antigen-presenting extracellular vesicles 4 containing MHC class II molecules, T cell co-stimulatory molecules, and T cell stimulatory cytokines in their membranes, Linearized pET-15b vectors encoding MHC class II ⁇ chain, CD80-CD9, and IL-12p35, respectively, were purified using FastGene Gel/PCR extraction kit (Nippon Genetics), and T7 mScript Standard mRNA was extracted. In vitro transcription, capping, and polyA addition are performed using Production System (manufactured by CELLSCRIPT) according to the manufacturer's instructions. After mixing the synthesized mRNA at a ratio of 1:1:1:1, it is used as RNA for producing the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 6B.
  • Production System manufactured by CELLSCRIPT
  • Example 7B Polynucleotide sc-Dimer-CD81, MHC class II ⁇ chain for producing antigen-presenting extracellular vesicles 5 containing MHC class II molecules, T cell co-stimulatory molecules, and T cell stimulatory cytokines in their membranes , CD80-CD9, CD81-IL-6 and TGF- ⁇ -MFGE8, respectively.
  • In vitro transcription, capping, and polyA addition are performed using mScript Standard mRNA Production System (manufactured by CELLSCRIPT) according to the manufacturer's instructions. After mixing the synthesized mRNA at a ratio of 1:1:1:1:1, it is used as RNA for producing the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 7B.
  • Example 8B Polynucleotides CD80-CD9, sc-Trimer-CD81-IL for producing antigen-presenting extracellular vesicles containing MHC class I molecules, T cell co-stimulatory molecules, and T cell stimulatory cytokines in their membranes -2 were purified using FastGene Gel/PCR Extraction Kit (Nippon Genetics) and produced using T7 mScript Standard mRNA Production System (CELLSCRIPT). In vitro transcription and capping, polyA addition is performed according to the manufacturer's instructions. After mixing the synthesized mRNA at a ratio of 1:1, it is used as RNA for producing the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 8B.
  • Example 9B Polynucleotides hsc-Trimer-hCD81, hCD80-hCD9 for producing antigen-presenting extracellular vesicles containing HLA class I molecules, human T cell co-stimulatory molecules, and human T cell stimulatory cytokines in their membranes and pET-15b vector encoding hCD63-IL2, respectively, was purified using FastGene Gel/PCR extraction kit (Nippon Genetics), and purified using T7 mScript Standard mRNA Production System (manufactured by CELLSCRIPT). Perform in vitro transcription and capping, polyA addition according to the manufacturer's instructions. After mixing the synthesized mRNA at 1:1:1, it is used as RNA for producing the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 7A.
  • Test Example 7B In vivo activity differentiation experiment of OVA-specific CD4-positive T cells (OT-2 T cells) by polynucleotides for producing antigen-presenting extracellular vesicles OVA-reactive CD4TCR transgenic mice
  • OT-2 T cells OVA-specific CD4-positive T cells
  • Lymph nodes are similarly excised from CD45.1 congenic mice, and lymphocyte suspensions are prepared.
  • Each lymphocyte suspension is mixed in a 1:1 ratio and stained with CellTrace Violet, a cell proliferation assay reagent. 1 ⁇ 10 7 CellTrace Violet-stained mixed lymphocyte suspensions in PBS are transferred via the tail vein of CD45.1/CD45.2 congenic mice.
  • Example 3B or 6B are each mixed with an in vivo-jet RNA transfection reagent (Polyplus) and transfected into CD45.1/CD45.2 congenic mice via the tail vein.
  • an in vivo-jet RNA transfection reagent Polyplus
  • the lymph nodes are excised from the recipient mice, lymphocyte suspensions are prepared, and immunostaining is performed to detect and quantify various T cells.
  • the mRNAs of Examples 3B and 6B can significantly differentiate and/or proliferate antigen-specific Th1 cells in vivo.
  • Test Example 8B In vivo activity differentiation experiment of OVA-specific CD4-positive T cells (OT-2 T cells) by polynucleotides for producing antigen-presenting extracellular vesicles OVA-reactive CD4TCR transgenic mice Lymph nodes are removed from OT-2 mice, and a lymphocyte suspension is prepared in the same manner as in Test Example 2. Lymph nodes are similarly excised from CD45.1 congenic mice, and lymphocyte suspensions are prepared. The respective lymphocyte suspensions are mixed in a 1:1 ratio and stained with CellTrace Violet, a cell proliferation assay reagent. 1 ⁇ 10 7 CellTrace Violet-stained mixed lymphocyte suspensions in PBS are transferred via the tail vein of CD45.1/CD45.2 congenic mice.
  • Example 7B mRNA is mixed with in vivo-jet RNA transfection reagent (Polyplus) and transferred into CD45.1/CD45.2 congenic mice via the tail vein.
  • in vivo-jet RNA transfection reagent Polyplus
  • the lymph nodes are excised from the recipient mice, lymphocyte suspensions are prepared, and immunostaining is performed to detect and quantify various T cells.
  • the mRNA of Example 7B can significantly differentiate and/or proliferate antigen-specific Th17 cells in vivo.
  • Test Example 9B In vivo activation experiment of OVA-specific CD8-positive T cells (OT-1 T cells) by polynucleotides for producing antigen-presenting extracellular vesicles OVA-reactive TCR transgenic mice Lymph nodes are removed from OT-1 mice, and lymphocyte suspensions are prepared in the same manner as in Test Example 2B. Lymph nodes are similarly excised from CD45.1 congenic mice, and lymphocyte suspensions are prepared. The respective lymphocyte suspensions are mixed in a 1:1 ratio and stained with CellTrace Violet, a cell proliferation assay reagent. 1 ⁇ 10 7 CellTrace Violet-stained mixed lymphocyte suspensions in PBS are transferred via the tail vein of CD45.1/CD45.2 congenic mice.
  • Example 8B 50 ⁇ g of mRNA of Example 8B is mixed with in vivo-jet RNA transfection reagent (Polyplus) and transferred into CD45.1/CD45.2 congenic mice via the tail vein.
  • in vivo-jet RNA transfection reagent Polyplus
  • the lymph nodes are excised from the recipient mice, lymphocyte suspensions are prepared, and immunostaining is performed to detect and quantify various T cells.
  • the mRNA of Example 8B can significantly differentiate and/or proliferate antigen-specific CD8-positive T cells in vivo.
  • Test Example 10B Antitumor Effect Evaluation Test by Polynucleotides for Producing Antigen-Presenting Extracellular Vesicles CD45.1/ CD45.2 congenic mice were subcutaneously injected with 1 ⁇ 10 5 B16 melanoma cells expressing OVA. 3 days later, 1 ⁇ 10 5 OT-1 T cells are transferred. 1 day, 4 days, and 7 days after transfer of OT-1 T cells, 50 ⁇ g of mRNA of Example 8B was mixed with an in vivo-jet RNA transfection reagent (Polyplus), transferred from the tail vein of recipient mice, and transferred to B16 melanoma cells. Observe the size of
  • the mRNA of Example 8B can significantly suppress the proliferation of B16 melanoma cells.
  • Test Example 13B In vivo differentiation induction experiment of OVA-specific CD4-positive T cells (OT-2 T cells) into Th1 T cells by polynucleotides for producing antigen-presenting extracellular vesicles OVA-reactive TCR trans Lymph nodes are excised from OT-2 mice, which are genetic mice, and crushed on a 100 ⁇ m filter to obtain a lymph node cell suspension. Lymph nodes are similarly excised from CD45.1 congenic mice, and lymphocyte suspensions are prepared. Each lymphocyte suspension is mixed in a 1:1 ratio and stained with CellTrace Violet, a cell proliferation assay reagent. 1 ⁇ 10 7 CellTrace Violet-stained mixed lymphocyte suspensions in PBS are transferred via the tail vein of CD45.1/CD45.2 congenic mice.
  • RNA transfection reagent Polyplus
  • mRNA of Example 6B or Reference Example 1B is mixed with an in vivo-jet RNA transfection reagent (Polyplus) and transferred from the tail vein of recipient mice.
  • the spleen is removed from the recipient mouse, a lymphocyte suspension is prepared, and immunostaining is performed.
  • the following antibodies are used for staining (staining time: 15 minutes, temperature: 4°C).
  • the luminescence intensity of CellTrace Violet, a cell proliferation assay reagent, in the transfected OT-2 T cells and wild-type CD4 T cells is detected with a flow cytometer FACSCanto II (manufactured by BD Biosciences).
  • the mRNA of Example 6B can differentiate antigen-specific CD4-positive T cells into Th1 cells.
  • Test Example 14B Evaluation of Antitumor Effect by Polynucleotide for Producing Antigen-Presenting Extracellular Vesicles CD45.1 /CD45.2 to examine whether the mRNA of Experimental Example 6B has an antitumor effect
  • Congenic mice are inoculated subcutaneously with 1 ⁇ 10 5 OVA-expressing B16 melanoma cells, and one day later are transferred with 5 ⁇ 10 5 OT-2 T cells. 1 day, 4 days, and 7 days after the transfer of OT-2 T cells, 50 ⁇ g of the mRNA of Example 6B or the mRNA of Reference Example 1B was mixed with an in vivo-jet RNA transfection reagent (Polyplus) and injected into the tail vein of the recipient mouse. to observe the size of B16 melanoma cells.
  • Polyplus in vivo-jet RNA transfection reagent
  • the mRNA of Example 6B suppresses the proliferation of B16 melanoma cells.
  • Example 11B Polynucleotides HLADR-1sc-TPI1-hCD81, hCD80 for producing antigen-presenting extracellular vesicles containing HLA class II molecules, human T-cell co-stimulatory molecules, and human T-cell stimulatory cytokines in their membranes - Linearized pET-15b vectors encoding hCD9 and hIL-12sc-MFGe8, respectively, were purified using FastGene Gel/PCR extraction kit (Nippon Genetics), and subjected to T7 mScript Standard mRNA Production System (CELLSCRIPT) (manufacturer) is used to perform in vitro transcription and capping, polyA addition according to the manufacturer's instructions. After mixing the synthesized mRNA at a ratio of 1:1:1, it is used as RNA for producing the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 11B.
  • CELLSCRIPT T7 mScript Standard mRNA Production System
  • Test Example 16B In vitro differentiation induction experiment of TPI-1-specific human CD4-positive T cells into Th1T cells by polynucleotides for preparing antigen-presenting extracellular vesicles
  • the pMXs vector encoding the TCR and the fluorescent protein Venus is transfected using Polyethyleneimine "Max" (Polysciences).
  • the medium was changed 3-12 hours after transfection, the supernatant was harvested 48 hours and 72 hours after transfection, the supernatant was passed through a 0.22 ⁇ m filter, and the retrovirus expressing TPI-1 specific TCR was detected. Make supernatant.
  • Peripheral blood was collected from an HLA-DR1-positive recipient, peripheral blood mononuclear cells were separated using Ficol, and 2.0 ⁇ 10 6 peripheral blood mononuclear cells were added to 10% fetal bovine serum and 50 ⁇ M.
  • the virus particles prepared above are infected with RetroNectin (TAKARA) according to the manufacturer's instructions to generate human T cells that simultaneously express the TPI-1 peptide-specific TCR and the fluorescent protein Venus.
  • TAKARA RetroNectin
  • the prepared human T cells are added and cultured in a 96-well round-bottom plate for 7 days.
  • RNA of Example 11B can induce differentiation of antigen-specific CD4-positive T cells into Th1 cells in vitro.
  • Example 12B Preparation of Polynucleotides Expressing MHC Class I Molecules, T Cell Costimulatory Molecules, and T Cell Stimulatory Cytokines
  • PLAT-A cells are plated in cell culture dishes and treated with 2% fetal bovine serum and penicillin/streptomycin. was cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with Cells at approximately 50% confluence were subjected to FastGene Gel/PCR extraction of linearized pET-15b vectors encoding CD80-MFG-E8 and sc-Trimer-CD81-IL-2, respectively, according to the manufacturer's instructions.
  • RNA is used as RNA for preparing the antigen-presenting extracellular vesicles of Example 12B.
  • Test Example 17B Evaluation of antitumor effect by antigen-presenting extracellular vesicles OVA is expressed in C57BL/6 mice to investigate whether antigen-presenting extracellular vesicles purified from stable cell lines have antitumor effects.
  • 1 ⁇ 10 5 EL-4 cells were inoculated subcutaneously. 1 day, 4 days, 7 days after ingestion of EL-4 cells, 50 ⁇ g of the RNA of Example 12B or the RNA of Reference Example 1 was mixed with an in vivo-jet RNA transfection reagent (Polyplus), and the recipient mice were The size of EL-4 cells was observed after transferring from the tail vein.
  • the RNA of Example 12B can suppress the proliferation of EL-4 cells.
  • the polynucleotides for producing the antigen-presenting cells and antigen-presenting extracellular vesicles described herein are antigen-specific T cells (e.g., antigen-specific CD8-positive T cells, antigen-specific CD4-positive cells, etc.) can be satisfactorily activated, proliferated and/or differentiated.
  • antigen-specific T cells e.g., antigen-specific CD8-positive T cells, antigen-specific CD4-positive cells, etc.

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Abstract

抗原特異的なＴ細胞を満足に活性化等することが可能な細胞又は細胞外小胞を作製できるポリヌクレオチドを提供すること。　（ａ）抗原提示ＭＨＣ分子を含み、該抗原提示ＭＨＣ分子を細胞又は細胞外小胞の膜外に提示可能な融合タンパク質（Ａ）をコードする配列；　（ｂ）すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む、該Ｔ細胞刺激性サイトカインを細胞又は細胞外小胞の膜外に提示可能な融合タンパク質（Ｂ）をコードする配列；　（ｃ）Ｔ細胞共刺激分子を含む、該Ｔ細胞共刺激分子を細胞又は細胞外小胞の膜外に提示可能な融合タンパク質（Ｃ）をコードする配列；　（ｄ）抗原提示ＭＨＣ分子と、すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカインまたはそのサブユニットを含み、該抗原と該Ｔ細胞刺激性サイトカインを細胞又は細胞外小胞の膜外に提示可能な融合タンパク質（Ｄ）をコードする配列；及び　（ｅ）抗原提示ＭＨＣ分子と、すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカインｐ；おまたはそのサブユニット、及びＴ細胞共刺激分子を含み、該抗原と該Ｔ細胞刺激性サイトカインと該Ｔ細胞共刺激分子を細胞又は細胞外小胞の膜外に提示可能な融合タンパク質（Ｅ）をコードする配列； からなる群から選択されるすくなくとも１つの配列を含むポリヌクレオチドを提供する。

Description

免疫制御法、免疫制御用核酸組成物およびその用途
＜Cross Reference＞
　本出願は、２０２１年９月１日出願の日本特許出願（特願２０２１－１４２６８８）からの優先権を享受し、先行技術文献を含む、その内容全体を引用により本明細書に含める。
　本発明は、免疫制御法、免疫制御用核酸組成物およびその用途に関する。
　生体によるガン細胞等の排除や、自己抗原、アレルギー性物質等に対する応答の調節等の免疫反応には、抗原特異的なＴ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞等）が中心的な働きをしていることが知られている。抗原特異的なＴ細胞は、樹状細胞やマクロファージ等の抗原提示細胞の細胞表面のＭＨＣ分子と、ガン、アレルギー性物質等に由来する抗原との結合複合体をＴ細胞受容体で認識して活性化、増殖、分化等する。活性化等した抗原特異的なＴ細胞は、抗原を提示しているガン細胞等を特異的に傷害することや、自己抗原、アレルギー性物質等に対する応答を調節する。したがって、抗原特異的なＴ細胞を活性化、増殖、分化等させることが、免疫反応において特に重要であると考えられている。
　抗原特異的なＴ細胞を活性化等させる方法としては、既に実用化されているＴ細胞にキメラ抗原受容体を発現させる方法だけでなく、その他の方法も開発されている。例えば、特許文献１は、ＭＨＣ分子とＴ細胞共刺激分子とを表面上に含むナノ粒子が、抗原特異的なＴ細胞を増殖させることを開示している。また、非特許文献１は、ＰＴＧＦＲＮを介してＩＬ－１２を膜上に発現させたエクソソームが、モデル抗原特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞を増殖させることを開示している。
特表２０１６－５２０５１８号公報
Katherine Kirwin, et al., "Exosome Surface Display of IL-12 Results in Tumor-Retained Pharmacology with Superior Potency and Limited Systemic Exposure Compared to Recombinant IL-12", 令和１年１１月６日, 34th Annual Meeting of the Society for Immuno-therapy of Cancer Journal of Extracellular Vesicles(2018);7:1535750 ONCOIMMUNOLOGY　2020, VOL. 9, NO. 1, e1673125
　本発明者らは、抗原特異的なＴ細胞を活性化等しうる新たな方法として、ＭＨＣ分子とＴ細胞共刺激分子とを膜に含む細胞外小胞を使用する方法を試みた。しかし、この細胞外小胞を用いて抗原特異的なＴ細胞の活性化等を試みたところ、抗原特異的なＴ細胞を満足に活性化等することができないことを初めて見出した。
　したがって、本発明は、新規な免疫制御法、免疫制御用核酸組成物およびその用途を提供することを目的とする。
　上記課題に鑑み、鋭意検討を重ねたところ、本発明者は、意外にも、ＭＨＣ分子、及びＴ細胞刺激性サイトカインを膜に含む細胞又は細胞外小胞を作製できるポリヌクレオチドを用いることで、Ｔ細胞を活性化等することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
　したがって、本発明は、以下のものを含む：
〔０〕　抗原提示ＭＨＣ分子及びＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示する細胞又は細胞外小胞。
〔１〕　抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞であって、その膜に以下：
　抗原提示ＭＨＣ分子を含む、該抗原を膜外に提示可能なタンパク質（Ａ）；及び
　Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む、該Ｔ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能なタンパク質（Ｂ）；
を含む、抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞。
〔２〕　前記抗原提示ＭＨＣ分子を含む、該抗原を膜外に提示可能なタンパク質（Ａ）が、
　抗原提示ＭＨＣ分子と、細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメインあるいは細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはその膜結合ドメインとを含む、該抗原を膜外に提示可能な融合タンパク質又はタンパク質複合体
である、〔１〕に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞。
〔３〕　前記Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む、該Ｔ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能なタンパク質（Ｂ）が、　
　Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットと、細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメインあるいは細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはその膜結合ドメインとを含む、該Ｔ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質
である、〔１〕に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞。
〔４〕　前記抗原提示ＭＨＣ分子を含む、該抗原を膜外に提示可能なタンパク質（Ａ）が、
１）抗原提示ＭＨＣ分子と、テトラスパニン若しくはその膜貫通ドメイン又はＭＦＧ－Ｅ８若しくはその膜結合ドメインとを含む、該抗原を膜外に提示可能な融合タンパク質又はタンパク質複合体；
２）そのＮ末端側から、
　（Ａ－１）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ａ－３）単鎖ＭＨＣ分子のアミノ酸配列、
　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜結合ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質；
３）そのＮ末端側から、
　（Ａ－１）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ａ－３）ＭＨＣクラスＩα鎖、β２ミクログロブリン、ＭＨＣクラスＩＩα鎖、又はＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ酸配列、
　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質と、
　（Ａ－６）β２ミクログロブリン、ＭＨＣクラスＩα鎖、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖、又はＭＨＣクラスＩＩα鎖のアミノ酸配列を含む、タンパク質と
を含む、タンパク質複合体；
４）そのＮ末端側から、
　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチド、
　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列のアミノ酸配列、
　（Ａ－３）単鎖ＭＨＣクラスＩ分子のアミノ酸配列、
　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質；
５）そのＮ末端側から、
　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ａ－３）ＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ酸配列、
　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質と、
　（Ａ－６）ＭＨＣクラスＩＩα鎖のアミノ酸配列を含む、タンパク質と
を含む、タンパク質複合体；
６）そのＮ末端側から、
　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ａ－３）ＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ酸配列、
　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質と、
　（Ａ－６）ＭＨＣクラスＩＩα鎖のアミノ酸配列を含む、タンパク質と
を含む、タンパク質複合体；
である、〔１〕に記載の抗原提示細胞外小胞。
〔５〕　前記Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む、該Ｔ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能なタンパク質（Ｂ）が、
１）Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットと、テトラスパニンの部分配列とを含む、該Ｔ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質であって、該テトラスパニンの部分配列が、２つの膜貫通ドメインを少なくとも有し、該Ｔ細胞刺激性サイトカインが、該２つの膜貫通ドメインの間に配置されている、融合タンパク質；
２）Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットと、ＭＦＧ－Ｅ８又はそのドメインとを含む、該Ｔ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質；
３）そのＮ末端側から、
　（Ｂ－１）Ｎ末端側から、膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列、
　（Ｂ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ｂ－３）Ｔ細胞刺激性サイトカインのアミノ酸配列、
　（Ｂ－４）存在していてもよいスペーサー配列、並びに
　（Ｂ－５）膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質；又は
４）そのＮ末端側から、
　（Ｂ－３）Ｔ細胞刺激性サイトカインのアミノ酸配列、
　（Ｂ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ｂ－５）ＭＦＧ－Ｅ８又はその膜結合ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質；
である、〔１〕に記載の抗原提示細胞外小胞。
〔６〕　Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットが、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２のサブユニット、ＩＬ－１５又はＴＧＦ－βである、〔１〕に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞。
〔７〕　膜に以下：
Ｔ細胞共刺激分子を含む、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能なタンパク質（Ｃ）；
をさらに含む、〔１〕に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞。
〔８〕　Ｔ細胞共刺激分子を含む、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能なタンパク質（Ｃ）が、
　Ｔ細胞共刺激分子と、細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン又は細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメインとを含む、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能な融合タンパク質；
である、〔７〕に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞。
〔９〕　Ｔ細胞共刺激分子を含む、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能なタンパク質（Ｃ）が、
１）Ｔ細胞共刺激分子と、テトラスパニン若しくはその膜貫通ドメイン又はＭＦＧ－Ｅ８若しくはそのドメインとを含む、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能な融合タンパク質；
２）そのＮ末端側から、
　（Ｃ－１）Ｔ細胞共刺激分子のアミノ酸配列、
　（Ｃ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ｃ－３）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能な融合タンパク質；
を含む、〔７〕に記載の抗原提示細胞外小胞。
〔１０〕　Ｔ細胞共刺激分子を含む、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能なタンパク質（Ｃ）が、
　膜貫通ドメインを含むＴ細胞共刺激分子を含み、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能な融合タンパク質；
を含む、〔７〕に記載の抗原提示細胞。
〔１１〕　細胞外小胞が、エクソソームである、〔１〕に記載の抗原提示細胞外小胞。
〔１Ａ〕
　抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞であって、その膜に以下：
抗原提示ＭＨＣ分子と、Ｔ細胞刺激性サイトカインまたはそのサブユニットを含み、該抗原と該Ｔ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質（Ｄ）を含む、抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞。
〔２Ａ〕　抗原提示ＭＨＣ分子と、Ｔ細胞刺激性サイトカインまたはそのサブユニットを含み、該抗原と該Ｔ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質（Ｄ）が、
　前記抗原提示ＭＨＣ分子と、前記Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットと、細胞又は細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメインあるいは細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはその膜結合ドメインとを含む、〔１Ａ〕に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞。
〔３Ａ〕　前記細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質が、テトラスパニン又はＭＦＧ－Ｅ８である、〔２Ａ〕に記載の抗原提示細胞外小胞。
〔４Ａ〕前記細胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞の膜に結合することが可能なタンパク質が、ＣＤ８である、〔２Ａ〕に記載の抗原提示細胞。
〔５Ａ〕　前記融合タンパク質（Ｄ）が、
１）そのＮ末端側から、
　（Ｄ－１）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチド、
　（Ｄ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ｄ－３）単鎖ＭＨＣ分子、
　（Ｄ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ｄ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインあるいはＭＦＧ－Ｅ８又はその膜貫通ドメインと、前記Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む融合ペプチド、
を、この順番でコードするアミノ酸配列； 
２）そのＮ末端側から、
　（Ｄ－１）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインあるいはＭＦＧ－Ｅ８又はその膜貫通ドメインと、前記Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む融合ペプチド
　（Ｄ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ｄ－３）単鎖ＭＨＣ分子、
　（Ｄ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ｄ－５）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドを、
この順にコードするアミノ酸配列；又は
３）そのＮ末端側から、
　（１）前記すくなくとも１のＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニット、
　（２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（３）ＭＦＧ－Ｅ８
をこの順番でコードするアミノ酸配列；
を含む、〔３Ａ〕に記載の抗原提示細胞外小胞。
〔６Ａ〕前記融合タンパク質（Ｄ）が、
１）そのＮ末端側から、
　（Ｄ－１）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチド、
　（Ｄ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ｄ－３）膜貫通ドメインを含む単鎖ＭＨＣ分子、
　（Ｄ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ｄ－５）ＣＤ８又はその膜貫通ドメインと、前記Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む融合ペプチド、
を、この順番でコードするアミノ酸配列；又は
２）そのＮ末端側から、
　（Ｄ－１）ＣＤ８又はその膜貫通ドメインと、前記Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む融合ペプチド、
　（Ｄ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ｄ－３）膜貫通ドメインを含む単鎖ＭＨＣ分子、
　（Ｄ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ｄ－５）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドを、
この順にコードするアミノ酸配列；
を含む、〔４Ａ〕に記載の抗原提示細胞。
〔８Ａ〕前記融合ペプチドが、そのＮ末端側から、
　（１）前記Ｔ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニット、
　（２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（３）ＣＤ８又はその膜貫通ドメイン
をこの順番でコードするアミノ酸配列を含む、〔６Ａ〕に記載の抗原提示細胞。
〔９Ａ〕
　前記ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドであり、前記単鎖ＭＨＣ分子が、ＭＨＣクラスＩα鎖の細胞外領域を含む、〔５Ａ〕に記載の抗原提示細胞外小胞。
〔１０Ａ〕
　前記ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチドであり、前記単鎖ＭＨＣ分子が、ＭＨＣクラスＩＩα鎖の細胞外ドメイン及び／又はＭＨＣクラスＩIβ鎖の細胞外ドメインを含む、〔５Ａ〕に記載の抗原提示細胞外小胞。
〔１１Ａ〕
　前記ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドであり、前記膜貫通ドメインを含む単鎖ＭＨＣ分子が、ＭＨＣクラスＩα鎖を含む、〔７Ａ〕に記載の抗原提示細胞
〔１２Ａ〕
　前記ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチドであり、前記膜貫通ドメインを含む単鎖ＭＨＣ分子が、ＭＨＣクラスＩＩα鎖及び／又はＭＨＣクラスＩIβ鎖を含む、〔７Ａ〕に記載の抗原提示細胞。
〔１３Ａ〕
　Ｔ細胞共刺激分子を含む、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能なタンパク質（Ｃ）をさらにその膜に含む、〔１Ａ〕に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞。
〔１４Ａ〕
　前記タンパク質（Ｃ）が、前記Ｔ細胞共刺激分子と、細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメインとを含む、〔１３Ａ〕に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞。
〔１５Ａ〕
　前記タンパク質（Ｃ）が、前記Ｔ細胞共刺激分子と、テトラスパニン若しくはその膜貫通ドメイン又はＭＦＧ－Ｅ８若しくはそのドメインとを含む、〔１４Ａ〕に記載の抗原提示細胞外小胞。
〔１６Ａ〕
　前記タンパク質（Ｃ）が、膜貫通ドメインを含むＴ細胞共刺激分子を含む、〔１４Ａ〕に記載の抗原提示細胞。
〔１７Ａ〕　細胞外小胞が、エクソソームである、〔１Ａ〕に記載の抗原提示細胞外小胞。
〔１Ｂ〕
　前記タンパク質（Ａ）と前記タンパク質（Ｂ）が融合して１つのタンパク質を構成している、〔１〕に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞。（Ｃ）
〔２Ｂ〕
　前記タンパク質（Ａ）と前記タンパク質（Ｃ）が融合して１つのタンパク質を構成している、〔８〕に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞。
〔３Ｂ〕
　前記タンパク質（Ｂ）と前記タンパク質（Ｃ）が融合して１つのタンパク質を構成している、〔８〕に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞。
〔４Ｂ〕
　前記タンパク質（Ａ）と前記タンパク質（Ｂ）と前記タンパク質（Ｃ）が融合して１つのタンパク質を構成している、〔８〕に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞。
〔５Ｂ〕
　前記タンパク質（Ｄ）と前記タンパク質（Ｃ）が融合して１つのタンパク質を構成している、〔１３Ａ〕に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞
〔６Ｂ〕　細胞外小胞が、エクソソームである、〔１Ｂ〕～〔５Ｂ〕のいずれかに記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞。
〔７Ｂ〕　〔１〕～［６Ｂ］のいずれか一項に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞と、薬理学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
〔１Ｃ〕　ガンを処置又は予防するための、〔１〕～［６Ｂ］のいずれか一項に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞を含む、医薬組成物；ここで、好ましくは前記抗原ペプチドがガン抗原ペプチドを含む。
〔２Ｃ〕　自己免疫疾患を処置又は予防するための、〔１〕～［６Ｂ］のいずれか一項に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞を含む、医薬組成物；ここで、好ましくは前記抗原ペプチドが自己抗原ペプチドを含む。
〔３Ｃ〕　アレルギー性疾患を処置又は予防するための、〔１〕～［６Ｂ］のいずれか一項に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞を含む、医薬組成物；ここで、好ましくは前記抗原ペプチドがアレルゲンを含む。
〔４Ｃ〕　免疫チェックポイント阻害剤を含む、〔１Ｃ〕に記載の医薬組成物。
〔５Ｃ〕　前記免疫チェックポイント阻害剤が、前記抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞の膜上に存在している、〔４Ｃ〕に記載の医薬組成物。
〔６Ｃ〕　前記免疫チェックポイント阻害剤が抗ＰＤ－１抗体又はその活性断片；抗ＣＴＬＡ－４抗体又はその活性断片；及びＰＤ－Ｌ１抗体又はその活性断片からなる群から選択される、〔４Ｃ〕又は〔５Ｃ〕に記載の医薬組成物。
〔７Ｃ〕　〔１〕～［６Ｂ］のいずれか一項に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞と薬理学的に許容される担体を含む、感染症を処置又は予防するための医薬組成物；ここで、好ましくは前記抗原ペプチドが前記感染症を引きおこす感染病原体由来である。
〔１Ｄ〕　ガンの処置又は予防における使用のための〔１〕～［６Ｂ］のいずれか一項に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞；ここで、好ましくは前記抗原ペプチドがガン抗原ペプチドを含む。
〔２Ｄ〕　自己免疫疾患の処置又は予防における使用のための、〔１〕～［６Ｂ］のいずれか一項に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞；ここで、好ましくは前記抗原ペプチドが自己抗原ペプチドを含む。
〔３Ｄ〕　アレルギー性疾患の処置又は予防における使用のための、〔１〕～［６Ｂ］のいずれか一項に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞；ここで、好ましくは前記抗原ペプチドがアレルゲンを含む。
〔４Ｄ〕　免疫チェックポイント阻害剤とともに使用される、〔１Ｄ〕に記載の使用のための抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞。
〔５Ｄ〕　前記免疫チェックポイント阻害剤が、膜上に存在している、〔４Ｄ〕に記載の使用のための抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞。
〔６Ｄ〕　前記免疫チェックポイント阻害剤が抗ＰＤ－１抗体又はその活性断片；抗ＣＴＬＡ－４抗体又はその活性断片；及びＰＤ－Ｌ１抗体又はその活性断片からなる群から選択される、〔４Ｄ〕又は〔５Ｄ〕に記載の使用のための抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞。
〔７Ｄ〕　感染症を処置又は予防における使用のための〔１〕～［６Ｂ］のいずれか一項に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞；ここで、好ましくは前記抗原ペプチドが前記感染症を引きおこす感染病原体由来である。
〔１Ｅ〕　ガンを処置又は予防するための医薬の製造における〔１〕～［６Ｂ］のいずれか一項に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞の使用；ここで、好ましくは前記抗原ペプチドがガン抗原ペプチドを含む。
〔２Ｅ〕　自己免疫疾患の処置又は予防するための医薬の製造における〔１〕～［６Ｂ］のいずれか一項に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞の使用；ここで、好ましくは前記抗原ペプチドが自己抗原ペプチドを含む。
〔３Ｅ〕　アレルギー性疾患の処置又は予防するための医薬の製造における〔１〕～［６Ｂ］のいずれか一項に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞の使用；ここで、好ましくは前記抗原ペプチドがアレルゲンを含む。
〔４Ｅ〕　前記医薬が、免疫チェックポイント阻害剤とともに使用される、〔１Ｅ〕に記載の使用。
〔５Ｅ〕　前記免疫チェックポイント阻害剤が、前記抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞抗原提示細胞外小胞の膜上に存在している、〔４Ｅ〕に記載の使用。
〔６Ｅ〕　前記免疫チェックポイント阻害剤が抗ＰＤ－１抗体又はその活性断片；抗ＣＴＬＡ－４抗体又はその活性断片；及びＰＤ－Ｌ１抗体又はその活性断片からなる群から選択される、〔４Ｅ〕又は〔５Ｅ〕に記載の使用。
〔７Ｅ〕　感染症を処置又は予防するための医薬の製造における〔１〕～［６Ｂ］のいずれか一項に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞の使用；ここで、好ましくは前記抗原ペプチドが前記感染症を引きおこす感染病原体由来である。
〔１Ｆ〕　対象においてガンを処置又は予防する方法であって、
　有効量の〔１〕～［６Ｂ］のいずれか一項に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞を対象に投与して、対象内の、ガン抗原を認識するＴ細胞を活性化及び／又は増殖させ、該活性化及び／又は増殖したＴ細胞にガン細胞を攻撃させることにより、ガンを処置又は予防する、方法；ここで、好ましくは、前記該活性化及び／又は増殖したＴ細胞がＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔ細胞であり、好ましくは前記抗原ペプチドがガン抗原ペプチドを含む。
〔２Ｆ〕　対象において自己免疫疾患を処置又は予防する方法であって、有効量の〔１〕～［６Ｂ］のいずれか一項に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞を対象に投与して、対象内の、自己抗原を認識するＴ細胞を活性化及び／又は増殖させ、対象内で前記自己抗原に対して免疫反応を脱感作させることにより、自己免疫疾患を処置又は予防する方法；ここで、好ましくは、前記該活性化及び／又は増殖したＴ細胞がＣＤ４陽性の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）であり、好ましくは前記抗原ペプチドが自己抗原ペプチドを含む。
〔３Ｆ〕　対象においてアレルギー性疾患を処置又は予防する方法であって、有効量の〔１〕～［６Ｂ］のいずれか一項に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞を対象に投与して、対象内の、アレルゲンを認識するＴ細胞を活性化及び／又は増殖させ、対象内で前記自己抗原に対して免疫反応を脱感作させることにより、自己免疫疾患を処置又は予防する方法；ここで、好ましくは、前記該活性化及び／又は増殖したＴ細胞がＣＤ４陽性の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）であり、好ましくは前記抗原ペプチドがアレルゲンを含む。
〔４Ｆ〕　前記抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞が免疫チェックポイント阻害剤とともに投与される、〔１Ｆ〕に記載の方法。
〔５Ｆ〕　前記免疫チェックポイント阻害剤が、前記抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞の膜上に存在している、〔４Ｆ〕に記載の方法。
〔６Ｆ〕　前記免疫チェックポイント阻害剤が抗ＰＤ－１抗体又はその活性断片；抗ＣＴＬＡ－４抗体又はその活性断片；及びＰＤ－Ｌ１抗体又はその活性断片からなる群から選択される、〔４Ｆ〕又は〔５Ｆ〕に記載の方法。
〔７Ｆ〕　対象において感染症を処置又は予防する方法であって、有効量の〔１〕～［６Ｂ］のいずれか一項に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞を対象に投与して、
１）炎症性サイトカインを分泌させ、対象の自然免疫を活性化させて、及び/又は
２）前記感染症を引きおこす感染病原体に対する獲得免疫を前記対象にもたせて、
体内での前記感染症を引きおこす感染病原体を排除すること、及び／又はその増殖を抑えることを含む、感染症を処置又は予防する方法。
〔１Ｇ〕　特異的な抗原に対するＴ細胞を活性化及び／又は増殖させるための方法であって、有効量の〔１〕～［６Ｂ］のいずれか一項に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞とＴ細胞とをｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏにおいて接触させることを含む、方法。
〔１Ｈ〕　抗原提示ＭＨＣ分子を含み、該抗原提示ＭＨＣ分子を細胞又は細胞外小胞の膜外に提示可能な融合タンパク質（Ａ）。
〔２Ｈ〕　すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む、該Ｔ細胞刺激性サイトカインを細胞又は細胞外小胞の膜外に提示可能な融合タンパク質（Ｂ）。
〔３Ｈ〕　Ｔ細胞共刺激分子を含む、該Ｔ細胞共刺激分子を細胞又は細胞外小胞の膜外に提示可能な融合タンパク質（Ｃ）。
〔４Ｈ〕　抗原提示ＭＨＣ分子と、すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカインまたはそのサブユニットを含み、該抗原と該Ｔ細胞刺激性サイトカインを細胞又は細胞外小胞の膜外に提示可能な融合タンパク質（Ｄ）。
〔５Ｈ〕　抗原提示ＭＨＣ分子と、すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカインまたはそのサブユニット及びＴ細胞共刺激分子を含み、該抗原と該Ｔ細胞刺激性サイトカインと該Ｔ細胞共刺激分子を細胞又は細胞外小胞の膜外に提示可能な融合タンパク質（Ｅ）。
〔１Ｉ〕　（ａ）　抗原提示ＭＨＣ分子を含み、該抗原提示ＭＨＣ分子を細胞又は細胞外小胞の膜外に提示可能な融合タンパク質（Ａ）をコードする配列；
　　　　　（ｂ）　すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む、該Ｔ細胞刺激性サイトカインを細胞又は細胞外小胞の膜外に提示可能な融合タンパク質（Ｂ）をコードする配列；
　　　　　（ｃ）Ｔ細胞共刺激分子を含む、該Ｔ細胞共刺激分子を細胞又は細胞外小胞の膜外に提示可能な融合タンパク質（Ｃ）をコードする配列；
　　　　　（ｄ）抗原提示ＭＨＣ分子と、すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカインまたはそのサブユニットを含み、該抗原と該Ｔ細胞刺激性サイトカインを細胞又は細胞外小胞の膜外に提示可能な融合タンパク質（Ｄ）をコードする配列；及び
　　　　　（ｅ）抗原提示ＭＨＣ分子と、すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカインまたはそのサブユニット及びＴ細胞共刺激分子を含み、該抗原と該Ｔ細胞刺激性サイトカインと該Ｔ細胞共刺激分子を細胞又は細胞外小胞の膜外に提示可能な融合タンパク質（Ｅ）をコードする配列；
からなる群から選択されるすくなくとも１つの配列を含むポリヌクレオチド。
〔２Ｉ〕
　前記（Ａ）で規定される融合タンパク質が、抗原提示ＭＨＣ分子と、細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメインあるいは細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはその膜結合ドメインとを含む、〔１Ｉ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔３Ｉ〕　前記（Ａ）で規定される融合タンパク質が、抗原提示ＭＨＣ分子と、テトラスパニン若しくはその膜貫通ドメイン又はＭＦＧ－Ｅ８若しくはその膜結合ドメインとを含む、〔１Ｉ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔４Ｉ〕　前記（Ａ）で規定される融合タンパク質が、細胞膜貫通ドメインを含む抗原提示ＭＨＣ分子を含む、〔１Ｉ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔５Ｉ〕　前記（Ａ）で規定される融合タンパク質が：
　そのＮ末端側から、
　（Ａ－１）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ａ－３）単鎖ＭＨＣ分子のアミノ酸配列、
　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、［１Ｉ］に記載のポリヌクレオチド。
〔６Ｉ〕　前記（Ａ）で規定される融合タンパク質が
　そのＮ末端側から、
　（Ａ－１）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ａ－３）ＭＨＣクラスＩα鎖、β２ミクログロブリン、ＭＨＣクラスＩＩα鎖、又はＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ酸配列
　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、［１Ｉ］に記載のポリヌクレオチド。
〔７Ｉ〕　さらに、（Ａ－６）β２ミクログロブリン、ＭＨＣクラスＩα鎖、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖、又はＭＨＣクラスＩＩα鎖のアミノ酸配列を含む、［６Ｉ］に記載のポリヌクレオチド。
〔８Ｉ〕　前記（Ａ）で規定される融合タンパク質が、
　そのＮ末端側から、
　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ａ－３）単鎖ＭＨＣクラスＩ分子のアミノ酸配列、
　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、［１Ｉ］の記載のポリヌクレオチド。
〔９Ｉ〕　前記（Ａ）で規定される融合タンパク質が、
　そのＮ末端側から、
　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ａ－３）ＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ酸配列、
　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、［１Ｉ］に記載のポリヌクレオチド。
〔１０Ｉ〕　さらに（Ａ－６）ＭＨＣクラスＩＩα鎖のアミノ酸配列をコードする配列を含む、〔９Ｉ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔１１Ｉ〕　前記（Ａ）で規定される融合タンパク質が：
　そのＮ末端側から、
　（Ａ－１）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ａ－３）膜貫通ドメインを含む単鎖ＭＨＣ分子のアミノ酸配列、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、［１Ｉ］に記載のポリヌクレオチド。
〔１２Ｉ〕　前記（Ａ）で規定される融合タンパク質が
　そのＮ末端側から、
　（Ａ－１）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ａ－３）ＭＨＣクラスＩα鎖、β２ミクログロブリンとＭＨＣクラスＩα鎖の融合タンパク質、ＭＨＣクラスＩＩα鎖、又はＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、［１Ｉ］に記載のポリヌクレオチド。
〔１３Ｉ〕　さらに、（Ａ－６）β２ミクログロブリン、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖、又はＭＨＣクラスＩＩα鎖のアミノ酸配列をコードする配列を含む、〔１２Ｉ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔１４Ｉ〕　前記（Ａ）で規定される融合タンパク質が、
　そのＮ末端側から、
　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ａ－３）膜貫通ドメインを含む単鎖ＭＨＣクラスＩ分子のアミノ酸配列、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、［１Ｉ］の記載のポリヌクレオチド
〔１５Ｉ〕　前記（Ａ）で規定される融合タンパク質が、
　そのＮ末端側から、
　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ａ－３）ＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ酸配列、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、［１Ｉ］に記載のポリヌクレオチド、
〔１６Ｉ〕　さらにＭＨＣクラスＩＩα鎖のアミノ酸配列をコードする配列を含む、〔１５Ｉ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔１７Ｉ〕　前記（Ｂ）で規定される融合タンパク質が、すくなくとも１つのＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットと、細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメインあるいは細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメインとを含む、〔１Ｉ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔１８Ｉ〕　前記（Ｂ）で規定される融合タンパク質が、すくなくとも１つのＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットと、テトラスパニンの部分配列とを含み、該テトラスパニンの部分配列が、２つの膜貫通ドメインを少なくとも有し、該すくなくとも１つのＴ細胞刺激性サイトカインが、該２つの膜貫通ドメインの間に配置されている、〔１Ｉ〕の記載のポリヌクレオチド。
〔１９Ｉ〕　前記（Ｂ）で規定される融合タンパク質が、すくなくとも１つのＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットと、ＭＦＧ－Ｅ８又はその膜結合ドメインとを含む、〔１Ｉ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔２０Ｉ〕　前記（Ｂ）で規定される融合タンパク質が
　そのＮ末端側から、
　（Ｂ－１）Ｎ末端側から、膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列、
　（Ｂ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ｂ－３）第１のＴ細胞刺激性サイトカインのアミノ酸配列、
　（Ｂ－４）存在していてもよいスペーサー配列、並びに
　（Ｂ－５）膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、〔１Ｉ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔２１Ｉ〕　前記（Ｂ）で規定される融合タンパク質が
　そのＮ末端側から、
　（Ｂ－３）第１のＴ細胞刺激性サイトカインのアミノ酸配列、
　（Ｂ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ｂ－５）ＭＦＧ－Ｅ８又はその膜結合ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、〔１Ｉ〕に記載のポリヌクレチド。
〔２２Ｉ〕　前記（Ｂ）で規定される融合タンパク質が、すくなくとも１つのＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットと、ＣＤ８又はその膜貫通ドメインを含む、請求項１の記載のポリヌクレオチド。
〔２３Ｉ〕　前記（Ｂ）で規定される融合タンパク質が
　そのＮ末端側から、
　（Ｂ－３）第１のＴ細胞刺激性サイトカインのアミノ酸配列、
　（Ｂ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ｂ－５）ＣＤ８又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、〔１Ｉ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔２４Ｉ〕　前記Ｔ細胞刺激性サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２のサブユニット、ＩＬ－１５又はＴＧＦ－βである、〔１Ｉ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔２５Ｉ〕　前記（Ｃ）で規定される融合タンパク質が、Ｔ細胞共刺激分子と、
　　細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン、あるいは
　　細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはその膜結合ドメイン
とを含む、〔１Ｉ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔２６Ｉ〕　前記（Ｃ）で規定される融合タンパク質が、Ｔ細胞共刺激分子と、
　　テトラスパニン若しくはその膜貫通ドメイン、あるいは
　　ＭＦＧ－Ｅ８若しくはその膜結合ドメイン
とを含む、〔１Ｉ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔２７Ｉ〕　前記（Ｃ）で規定される融合タンパク質が、膜貫通ドメインを含むＴ細胞共刺激分子を含む、〔１Ｉ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔２８Ｉ〕　前記（Ｃ）で規定される融合タンパク質が
そのＮ末端側から、
　（Ｃ－１）Ｔ細胞共刺激分子のアミノ酸配列、
　（Ｃ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ｃ－３）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、〔１Ｉ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔２９Ｉ〕　前記（Ｄ）で規定される融合タンパク質が、
　前記抗原提示ＭＨＣ分子、
　前記すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニット、及び
　　細胞又は細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメインあるいは、
　　細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはその膜結合ドメイン
とを含む、〔１Ｉ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔３０Ｉ〕　前記細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質が、テトラスパニン又はＭＦＧ－Ｅ８である、〔２９Ｉ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔３１Ｉ〕　前記細胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞の膜に結合することが可能なタンパク質が、ＣＤ８である、〔２９Ｉ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔３２Ｉ〕　前記（Ｄ）で規定される融合タンパク質が、
そのＮ末端側から、
　（Ｄ－１）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ｄ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ｄ－３）単鎖ＭＨＣ分子のアミノ酸配列、
　（Ｄ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ｄ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインあるいはＭＦＧ－Ｅ８又はその膜結合ドメインと、前記すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む融合ペプチドのアミノ酸配列、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、〔１Ｉ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔３３Ｉ〕　前記（Ｄ）で規定される融合タンパク質が、
そのＮ末端側から、
　（Ｄ－１）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインあるいはＭＦＧ－Ｅ８又はその膜結合ドメインと、前記すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む融合ペプチドのアミノ酸配列
　（Ｄ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ｄ－３）単鎖ＭＨＣ分子のアミノ酸配列、
　（Ｄ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ｄ－５）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列を、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、〔１Ｉ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔３４Ｉ〕　前記テトラスパニン又はその膜貫通ドメインあるいはＭＦＧ－Ｅ８又はその膜結合ドメインと、前記すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む融合ペプチドが、
そのＮ末端側から、
　（１）膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列、
　（２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（３）前記すくなくとも１つのＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットのアミノ酸配列、
　（４）存在していてもよいスペーサー配列、並びに
　（５）膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、〔３２Ｉ〕又は〔３３Ｉ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔３５Ｉ〕　テトラスパニン又はその膜貫通ドメインあるいはＭＦＧ－Ｅ８又はその膜結合ドメインと、前記すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む、前記融合ペプチドが、
そのＮ末端側から、
　（１）前記すくなくとも１のＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットのアミノ酸配列、
　（２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（３）ＭＦＧ－Ｅ８又はその膜結合ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、〔３２Ｉ〕又は〔３３Ｉ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔３６Ｉ〕　前記（Ｄ）で規定される融合タンパク質が、
　前記抗原提示ＭＨＣ分子と、前記すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットと、細胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン又は細胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはその膜結合ドメインとを含む、〔１Ｉ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔３７Ｉ〕　前記ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドであり、前記単鎖ＭＨＣ分子が、ＭＨＣクラスＩα鎖の細胞外領域を含む、〔３２Ｉ〕又は〔３３Ｉ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔３８Ｉ〕　前記ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドがＭＨＣクラスＩI分子拘束性抗原ペプチドであり、前記単鎖ＭＨＣ分子が、ＭＨＣクラスＩIα鎖の細胞外ドメイン及び／又はＭＨＣクラスＩIβ鎖の細胞外ドメインを含む、〔３２Ｉ〕又は〔３３Ｉ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔１Ｊ〕　前記（ａ）で規定される配列と前記（ｂ）で規定される配列を含む、〔１Ｉ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔２Ｊ〕　前記融合タンパク質（Ａ）と前記融合タンパク質（Ｂ）が融合したアミノ酸配列をコードしている、〔１Ｊ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔３Ｊ〕　すくなくとも１つの２Ａペプチドを介して　融合タンパク質（Ａ）と融合タンパク質（Ｂ）が融合したアミノ酸配列をコードしている、〔２Ｊ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔４Ｊ〕　さらに前記（ｃ）で規定される配列を含む、〔１Ｊ〕の記載のポリヌクレオチド。
〔５Ｊ〕　前記融合タンパク質（Ａ）、前記融合タンパク質（Ｂ）及び前記融合タンパク質（Ｃ）が融合したアミノ酸配列をコードしている、〔４Ｊ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔６Ｊ〕　各々独立したすくなくとも１つの２Ａペプチドを介して、前記融合タンパク質（Ａ）、前記融合タンパク質（Ｂ）、及び前記融合タンパク質（Ｃ）が融合したアミノ酸配列をコードしている、〔５Ｊ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔７Ｊ〕　５’端より、
　　前記（ａ）で規定される配列；
　　第一のすくなくとも１つの２Ａペプチドをコードする配列；
　　前記（ｂ）で規定される配列；
　　第二のすくなくとも１つの２Ａペプチドをコードする配列；及び
　　前記（ｃ）で規定される配列を
をこの順番で含む、〔６Ｊ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔８Ｊ〕　前記（ｄ）で規定される配列を含む、〔１Ｉ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔９Ｊ〕　さらに前記（ｃ）で規定される配列を含む、〔８Ｊ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔１０Ｊ〕　前記融合タンパク質（Ｄ）と前記融合タンパク質（Ｃ）が融合したアミノ酸配列をコードしている、〔９Ｊ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔１１Ｊ〕　すくなくとも１つの２Ａペプチドを介して　前記融合タンパク質（Ｄ）と前記融合タンパク質（Ｃ）が融合したアミノ酸配列をコードしている、〔１０Ｊ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔１２Ｊ〕　　前記（ｅ）で規定される配列を含む〔１Ｉ〕に記載のポリヌクレオチド。
〔１３Ｊ〕〔１Ｉ〕～〔１２Ｊ〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔１４Ｊ〕　〔１Ｉ〕～〔１２Ｊ〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は〔１３Ｊ〕に記載のベクターと、薬理学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
〔１Ｋ〕　〔１Ｉ〕～〔１２Ｊ〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は〔１３Ｊ〕に記載のベクターにより形質転換された細胞。
〔２Ｋ〕　〔１Ｋ〕に記載の細胞を培養した、培養後の培養上清。
〔３Ｋ〕　〔２Ｋ〕に記載の培養上清から得られる、抗原提示細胞外小胞。
〔４Ｋ〕　〔１〕に記載の抗原提示細胞外小胞を製造するための方法であって、〔１Ｋ〕に記載の細胞を培養して得られる培養上清を回収する工程を含む、方法。
〔５Ｋ〕　〔２Ｋ〕に記載の培養上清を含む、医薬組成物。
〔１Ｌ〕　ガンを処置又は予防するための、〔１Ｉ〕～〔１２Ｊ〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は〔１３Ｊ〕に記載のベクターを含む、医薬組成物。
〔２Ｌ〕　自己免疫疾患を処置又は予防するための、〔１Ｉ〕～〔１２Ｊ〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は〔１３Ｊ〕に記載のベクターを含む、医薬組成物；ここで、好ましくは前記抗原ペプチドが自己抗原ペプチドを含む。
〔３Ｌ〕　アレルギー性疾患を処置又は予防するための、〔１Ｉ〕～〔１２Ｊ〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は〔１３Ｊ〕に記載のベクターを含む医薬組成物；ここで、好ましくは前記抗原ペプチドがアレルゲンを含む。
〔４Ｌ〕　感染症を処置又は予防するための〔１Ｉ〕～〔１２Ｊ〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は〔１３Ｊ〕に記載のベクターと、薬理学的に許容される担体を含む、医薬組成物；ここで、好ましくは前記抗原ペプチドが感染症を引きおこす感染病原体由来である。
〔１Ｍ〕　ガンの処置又は予防における使用のための〔１Ｉ〕～〔１２Ｊ〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は〔１３Ｊ〕に記載のベクター；ここで、好ましくは前記抗原ペプチドがガン抗原ペプチドを含む。
〔２Ｍ〕　自己免疫疾患の処置又は予防における使用のための、〔１Ｉ〕～〔１２Ｊ〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は〔１３Ｊ〕に記載のベクター；ここで、好ましくは前記抗原ペプチドが自己抗原ペプチドを含む。
〔３Ｍ〕　アレルギー性疾患の処置又は予防における使用のための、〔１Ｉ〕～〔１２Ｊ〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は〔１３Ｊ〕に記載のベクター；ここで、好ましくは前記抗原ペプチドがアレルゲンを含む。
〔４Ｍ〕　感染症の処置又は予防における使用のための〔１Ｉ〕～〔１２Ｊ〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は〔１３Ｊ〕に記載のベクター；ここで、好ましくは前記抗原ペプチドが前記感染症を引きおこす感染病原体由来である。
〔１Ｎ〕　ガンを処置又は予防するための医薬の製造における〔１Ｉ〕～〔１２Ｊ〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は〔１３Ｊ〕に記載のベクターの使用；ここで、好ましくは前記抗原ペプチドがガン抗原ペプチドを含む。
〔２Ｎ〕　自己免疫疾患を処置又は予防するための医薬の製造における〔１Ｉ〕～〔１２Ｊ〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は〔１３Ｊ〕に記載のベクターの使用；ここで、好ましくは前記抗原ペプチドが自己抗原ペプチドを含む。
〔３Ｎ〕　アレルギー性疾患を処置又は予防するための医薬の製造における〔１Ｉ〕～〔１２Ｊ〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は〔１３Ｊ〕に記載のベクターの使用；ここで、好ましくは前記抗原ペプチドがアレルゲンを含む。
〔４Ｎ〕　感染症を処置又は予防するための医薬の製造における〔１Ｉ〕～〔１２Ｊ〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は〔１３Ｊ〕に記載のベクターの使用；ここで、好ましくは前記抗原ペプチドが前記感染症を引きおこす感染病原体由来である。
〔１Ｏ〕　対象においてガンを処置又は予防する方法であって、
　有効量の〔１Ｉ〕～〔１２Ｊ〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は〔１３Ｊ〕に記載のベクターを対象に投与して、対象内の、ガン抗原を認識するＴ細胞を活性化及び／又は増殖させ、該活性化及び／又は増殖したＴ細胞にガン細胞を攻撃させることにより、ガンを処置又は予防する、方法；ここで、好ましくは、前記該活性化及び／又は増殖したＴ細胞がＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔ細胞であり、好ましくは前記抗原ペプチドがガン抗原ペプチドを含む。
〔２Ｏ〕　対象において自己免疫疾患を処置又は予防する方法であって、有効量の〔１Ｉ〕～〔１２Ｊ〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は〔１３Ｊ〕に記載のベクターを対象に投与して、対象内の、自己抗原を認識するＴ細胞を活性化及び／又は増殖させ、対象内で前記自己抗原に対して免疫反応を脱感作させることにより、自己免疫疾患を処置又は予防する方法；ここで、好ましくは、前記該活性化及び／又は増殖したＴ細胞がＣＤ４陽性の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）であり、好ましくは前記抗原ペプチドが自己抗原ペプチドを含む。
〔３Ｏ〕　対象においてアレルギー性疾患を処置又は予防する方法であって、有効量の〔１Ｉ〕～〔１２Ｊ〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は〔１３Ｊ〕に記載のベクターを対象に投与して、対象内の、アレルゲンを認識するＴ細胞を活性化及び／又は増殖させ、対象内で前記自己抗原に対して免疫反応を脱感作させることにより、自己免疫疾患を処置又は予防する方法；ここで、好ましくは、前記該活性化及び／又は増殖したＴ細胞がＣＤ４陽性の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）であり、好ましくは前記抗原ペプチドがアレルゲンを含む。
〔４Ｏ〕　対象において感染症を処置又は予防する方法であって、有効量の〔１Ｉ〕～〔１２Ｊ〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は〔１３Ｊ〕に記載のベクターを対象に投与して、
１）炎症性サイトカインを分泌させ、対象の自然免疫を活性化させて、及び/又は
２）前記感染症を引きおこす感染病原体に対する獲得免疫を前記対象にもたせて、
体内での前記病感染症を引きおこす感染病原体を排除すること、及び／又はその増殖を抑えることを含む、感染症を処置又は予防する方法。
〔１Ｐ〕　特異的な抗原に対するＴ細胞を活性化及び／又は増殖させるための方法であって、〔１Ｉ〕～〔１２Ｊ〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は〔１３Ｊ〕に記載のベクターを細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで導入し、抗原提示細胞及び／又は抗原提示細胞外小胞を生成し、生成された抗原提示細胞及び／又は抗原提示細胞外小胞とＴ細胞とをｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏにおいて接触させることを含む、方法。
　本発明によれば、抗原を提示するＭＨＣ分子、及びＴ細胞刺激性サイトカインを膜に含む細胞（抗原提示細胞）及び細胞外小胞（抗原提示細胞外小胞）を作製するためのポリヌクレオチドを用いることで、Ｔ細胞を活性化等することができる。
抗原ペプチド－単鎖ＭＨＣクラスＩ分子（ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ）－ＣＤ８１融合タンパク質のモデル図を示す。 抗原ペプチド－単鎖ＭＨＣクラスＩ分子（ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ）－ＣＤ８１融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。 ＣＤ８０－ＣＤ９融合タンパク質のモデル図を示す。 ＣＤ８０－ＣＤ９融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。 ＣＤ６３－ＩＬ－２融合タンパク質のモデル図を示す。 ＣＤ６３－ＩＬ－２融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。 抗原ペプチド－ＭＨＣクラスＩＩβ鎖（ｓｃ－Ｄｉｍｅｒ）－ＣＤ８１融合タンパク質のモデル図を示す。 抗原ペプチド－ＭＨＣクラスＩＩβ鎖（ｓｃ－Ｄｉｍｅｒ）－ＣＤ８１融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。 ＭＨＣクラスＩＩα鎖のアミノ酸配列を示す。 ＴＧＦ－β－ＭＦＧ－Ｅ８融合タンパク質のモデル図を示す。 ＴＧＦ－β－ＭＦＧ－Ｅ８融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。 ＣＤ８１－ＩＬ－４融合タンパク質のモデル図を示す。 ＣＤ８１－ＩＬ－４融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。 ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ＣＤ８１―IL―２融合タンパク質の核酸配列を示す。 ＣＤ６３－ＡｋａＬｕｃ融合タンパク質の核酸配列を示す。 ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－Ｔ２Ａ－ＩＬ－２－ＣＤ８－Ｐ２Ａ－ＣＤ８０をコードする核酸配列を示す。 実施例１の抗原提示細胞外小胞のモデル図を示す。 実施例２の抗原提示細胞外小胞のモデル図を示す。 実施例３の抗原提示細胞外小胞のモデル図を示す。 実施例４の抗原提示細胞外小胞のモデル図を示す。 実施例５の抗原提示細胞外小胞のモデル図を示す。 実施例６の抗原提示細胞外小胞のモデル図を示す。 実施例７の抗原提示細胞外小胞のモデル図を示す。 実施例８の抗原提示細胞外小胞のモデル図を示す。 実施例９の抗原提示細胞外小胞のモデル図を示す。 実施例１１の抗原提示細胞外小胞のモデル図を示す。 その他の実施態様の抗原提示細胞外小胞のモデル図を例示する。 試験例１－１において、実施例２の抗原提示細胞外小胞の膜に含まれる融合タンパク質をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。 試験例１－２において、実施例３の抗原提示細胞外小胞の膜に含まれる融合タンパク質をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。 試験例１－３において、実施例４の抗原提示細胞外小胞の膜に含まれる融合タンパク質をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。 試験例１－４において、実施例５の抗原提示細胞外小胞の膜に含まれる融合タンパク質をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。 試験例１－５において、実施例６の抗原提示細胞外小胞の膜に含まれる融合タンパク質をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。 試験例１－６において、実施例７の抗原提示細胞外小胞の膜に含まれる融合タンパク質をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。 試験例１－７において、実施例８の抗原提示細胞外小胞の膜に含まれる融合タンパク質をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。 試験例１－８において、実施例９の抗原提示細胞外小胞の膜に含まれる融合タンパク質をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。 試験例２において、実施例１，２の抗原提示細胞外小胞が、抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ＯＴ－１ Ｔ細胞）を活性化等するかを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した結果を示す。 試験例３において、実施例２の抗原提示細胞外小胞が、抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ＯＴ－１）を活性化等するかを、ｉｎ ｖｉｖｏで評価した結果を示す。 試験例４において、実施例３の抗原提示細胞外小胞が、抗原特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化等するかを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した結果を示す。 試験例５において、実施例４の抗原提示細胞外小胞が、抗原特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞（ＯＴ－２ Ｔ細胞）を制御性Ｔ細胞へと分化誘導するかを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した結果を示す。 試験例６において、実施例３，５の抗原提示細胞外小胞が、抗原特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞（ＯＴ－２ Ｔ細胞）をＴｈ２Ｔ細胞へと分化誘導するかどうかを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した結果を示す。 試験例７において、実施例６の抗原提示細胞外小胞が、抗原特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＴｈ１細胞へと分化誘導するかどうかを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した結果を示す。 試験例８において、実施例７の抗原提示細胞外小胞が、抗原特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＴｈ１７細胞へと分化誘導するかどうかを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した結果を示す。 試験例９において、実施例１と実施例８の抗原提示細胞外小胞が、抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を顕著に増殖させたことを示す。 試験例１０において、実施例８の抗原提示細胞外小胞が、Ｂ１６メラノーマ細胞の増殖を顕著に抑制したことを示す。 試験例１１において、実施例１０のｍＲＮＡが、抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ＯＴ－１）を活性化等するかを、ｉｎ ｖｉｖｏで評価した結果を示す。 試験例１２において、実施例１０のｍＲＮＡが、内在性抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化等するかを、ｉｎ ｖｉｖｏで評価した結果を示す。 試験例１３において、実施例６の細胞外小胞が、抗原特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＴｈ１細胞へ分化させるか、ｉｎ ｖｉｖｏで評価した結果を示す。 試験例１４において、実施例６の抗原提示細胞外小胞が、メラノーマ細胞の増殖を抑制するか、ｉｎ ｖｉｖｏで評価した結果を示す。 試験例１５において、実施例１１の抗原提示細胞外小胞のフローサイトメトリーの結果を示す。 試験例１６において、実施例１１の抗原提示細胞外小胞が、抗原特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＴｈ１細胞へ分化させるか、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで評価した結果を示す。 試験例１７において、実施例１２の抗原提示細胞外小胞が、Ｔリンパ腫瘍細胞の増殖を抑制するか、ｉｎ　ｖｉｖｏで評価した結果を示す。 試験例１Ａにおいて、実施例１ＡのｍＲＮＡにより、細胞上に抗原―ＭＨＣＩ複合体、ＣＤ８０およびＩＬ－２を発現するか、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで評価した結果を示す。 試験例２Ａにおいて、実施例１ＡのｍＲＮＡにより誘導された抗原提示細胞が、抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を増殖させるか、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで評価した結果を示す。 試験例３Ａにおいて、実施例１ＡのｍＲＮＡにより、細胞上に抗原―ＭＨＣＩ複合体、ＣＤ８０およびＩＬ－２を発現するか、ｉｎ　ｖｉｖｏで評価した結果を示す。 試験例４Ａにおいて、実施例１ＡのｍＲＮＡにより、内在性のＯＶＡ反応性ＣＤ８Ｔ細胞を増殖させるか、ｉｎ　ｖｉｖｏ評価した結果を示す。 （ａ）ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－Ｔ２Ａ－ＩＬ－１５ｓａ－Ｐ２Ａ－ＣＤ８０融合タンパク質の核酸配列を示す。（ｂ）ネオアンチゲンを提示するｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－Ｔ２Ａ－ＩＬ－２－ＣＤ８－Ｐ２Ａ－ＣＤ８０融合タンパク質の核酸配列を示す。（ｃ）ＯＶＡｐ－ＭＨＣＩＩβ－Ｐ２Ａ－ＭＨＣＩＩα－Ｔ２Ａ－ＩＬ－１２ｓｃ－ＣＤ８－Ｐ２Ａ－ＣＤ８０融合タンパク質の核酸配列を示す。（ｄ）ネオアンチゲンを提示するｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ＣＤ８１―ＩＬ―２融合タンパク質の核酸配列を示す。 試験例５Ａにおいて、実施例２ＡのｍＲＮＡにより、細胞上に抗原―ＭＨＣＩ複合体、ＣＤ８０およびＩＬ－１５ｓａを発現するか、ｉｎ　ｖｉｖｏで評価した結果を示す。 試験例６Ａにおいて、実施例２ＡのｍＲＮＡにより、内在性のＯＶＡ反応性ＣＤ８Ｔ細胞を増殖させるか、ｉｎ　ｖｉｖｏ評価した結果を示す。 試験例７Ａにおいて、実施例３ＡのｍＲＮＡにより、細胞上に抗原―ＭＨＣＩ複合体、ＣＤ８０およびＩＬ－２を発現するか、ｉｎ　ｖｉｖｏで評価した結果を示す。 試験例８Ａにおいて、実施例３ＡのｍＲＮＡにより、内在性のＧｔｆ２ｉ反応性ＣＤ８Ｔ細胞を増殖させるか、ｉｎ　ｖｉｖｏ評価した結果を示す。 試験例９Ａにおいて、実施例４ＡのｍＲＮＡにより、細胞上に抗原―ＭＨＣＩＩ複合体、ＣＤ８０およびＩＬ－１２を発現するか、ｉｎ　ｖｉｖｏで評価した結果を示す。 試験例１０Ａにおいて、実施例４ＡのｍＲＮＡにより、内在性のＯＶＡ反応性ＣＤ８Ｔ細胞を増殖させるか、ｉｎ　ｖｉｖｏ評価した結果を示す。 試験例１１Ａにおいて、実施例５ＡのｍＲＮＡにより、内在性のＲＰＬ１８反応性ＣＤ８Ｔ細胞を増殖させるか、ｉｎ　ｖｉｖｏ評価した結果を示す。
定義
含む（comprising）
　本明細書において「含む」（comprising）は、「実質的に含む」態様（substantially comprising）、「必須に含む」態様(essentially comprising)、「本質的に…からなる」態様（consiting essentially of）、及び「からなる」態様（consisting of）を包含する。
細胞外小胞
　本明細書中で用いられる「細胞外小胞」とは、細胞から分泌される小胞である限り特段限定されるものではないが、例えば、Ｅｘｏｓｏｍｅｓ（エクソソーム）、Ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ（ＭＶ；微小小胞体）、Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ Ｂｏｄｉｅｓ（アポトーシス小体）等が挙げられる。
　本明細書中で用いられる「エクソソーム」とは、エンドサイト－シス・パスウエイに由来する、約２０～約５００ｎｍ（好ましくは約２０～約２００ｎｍ、より好ましくは約２５～約１５０ｎｍ、更に好ましくは約３０～約１００ｎｍ）の小胞を意味する。エクソソームの構成成分としては、例えば、タンパク質、核酸（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ノン・コーティングＲＮＡ）等が挙げられる。エクソソームは、細胞間コミュニケーションを司る機能を有しうる。エクソソームのマーカー分子としては、例えば、Ａｌｉｘ、Ｔｓｇ１０１、テトラスパニン、ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ、フォスファチジルセリン等が挙げられる。
　本明細書中で用いられる「微小小胞体」とは、細胞質膜に由来する、約５０～約１０００ｎｍの小胞を意味する。微小小胞体の構成成分としては、例えば、タンパク質、核酸（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ノン・コーティングＲＮＡ等）等が挙げられる。微小小胞体は、細胞間コミュニケーションを司る機能等を有しうる。微小小胞体のマーカー分子としては、例えば、インテグリン、セレクチン、ＣＤ４０、ＣＤ１５４等が挙げられる。
　本明細書中で用いられる「アポトーシス小体」とは、細胞質膜に由来する、約５００～約２０００ｎｍの小胞を意味する。アポトーシス小体の構成成分としては、例えば、断片化された核、細胞小器官（オルガネラ）等が挙げられる。アポトーシス小体は、ファゴサイトーシスを誘導する機能等を有しうる。アポトーシス小体のマーカー分子としては、例えば、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ、フォスファチジルセリン等が挙げられる。
　本明細書中で用いられる「抗原提示細胞外小胞」とは、その膜外に抗原を提示する細胞外小胞を意味する。
抗原提示細胞
　本明細書中で用いられる「抗原提示細胞」とは、その膜外に１つ又は複数種の抗原を人工的に提示する細胞を意味する。
　抗原提示細胞において、任意の１つ又は複数種のサイトカイン（たとえば以下で定義するＴ細胞刺激性サイトカイン等）をその膜外に提示することが好ましい。
　抗原提示細胞において、前記抗原は膜外に固定、より好ましくは以下で定義する主要組織適合遺伝子複合体分子と融合した融合分子の形で膜外に固定されることにより（すなわち、一時的に抗原が外膜に付着しているのでなく）、膜外に提示されていることが好ましい。
　抗原提示細胞において、１つ又は複数種の抗原ペプチドをコードする配列と、１つ又は複数種のサイトカインをコードする配列を含むポリヌクレオチドの導入によって一時的に抗原ぺプチド及びサイトカインを発現し、同時に膜外に提示していることが好ましい。
　さらに、抗原提示細胞において、任意の補助シグナル（たとえば、以下で定義するＴ細胞共刺激分子）を膜外に提示していることが好ましい。
主要組織適合遺伝子複合体分子
　本明細書中で用いられる「主要組織適合遺伝子複合体（Major Histocompatibility Complex、以下、「ＭＨＣ」ともいう。）分子」は、抗原結合間隙を含み、Ｔ細胞、Ｔ細胞前駆体等へ提示する抗原と結合することができるものである限り特段限定されるものではない。ＭＨＣ分子としては、例えば、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子等が挙げられる。ＭＨＣ分子は、任意の動物種由来のものであってもよい。例えば、ヒトでは、ヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）、マウスでは、Ｈ２系が挙げられる。
　ＭＨＣクラスＩ分子に相当するＨＬＡは、例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃｗ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ等のサブタイプに分類されることがある。これらサブタイプについては、多型（対立遺伝子）が知られている。ＨＬＡ－Ａの多型としては、例えば、ＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ０２０１、ＨＬＡ－Ａ２４等が挙げられ、ＨＬＡ－Ｂの多型としては、例えば、ＨＬＡ－Ｂ７、ＨＬＡ－Ｂ４０、ＨＬＡ－Ｂ４４０３等が挙げられ、ＨＬＡ－Ｃｗの多型としては、例えば、ＨＬＡ－Ｃｗ０３０１、ＨＬＡ－Ｃｗ０４０１、ＨＬＡ－Ｃｗ０６０２等が挙げられる。
　ＭＨＣクラスＩＩ分子に相当するＨＬＡは、例えば、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰ等のサブタイプに分類されることがある。
　本明細書中に記載のＭＨＣ分子は、その機能を発揮することができるものである限り、その野生型のアミノ酸配列（例えば、ＭＨＣクラスＩ分子の場合：例えば、配列番号９等のＭＨＣクラスＩα鎖、配列番号７等のβ２ミクログロブリン、配列番号６５等の単鎖ＭＨＣクラスＩ分子等；ＭＨＣクラスＩＩ分子の場合：例えば、配列番号７１等のＭＨＣクラスＩＩα鎖、配列番号３７等のＭＨＣクラスＩＩβ鎖、単鎖ＭＨＣクラスＩＩ分子等）に対して、アミノ酸配列同一性が、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のものであってもよい。或いは、本明細書中に記載のＭＨＣ分子は、その機能を発揮することができるものである限り、その野生型のアミノ酸配列に対して、１個又は複数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加及び／又は置換等されたものであってもよい。
　本明細書中で用いられる「抗原提示ＭＨＣ分子」とは、抗原を提示するＭＨＣ分子である限り特段限定されるものではないが、例えば、抗原提示ＭＨＣクラスＩ分子、抗原提示ＭＨＣクラスＩＩ分子等が挙げられる。「抗原提示ＭＨＣクラスＩ分子」としては、例えば、抗原とＭＨＣクラスＩα鎖又はその細胞外ドメインとβ２ミクログロブリンとの複合体；抗原と単鎖ＭＨＣクラスＩ分子との複合体；抗原及び単鎖ＭＨＣクラスＩ分子が結合した融合タンパク質；抗原と、ＭＨＣクラスＩα鎖の細胞外ドメインと他のタンパク質又はそのドメイン若しくはそのフラグメント等との融合タンパク質（例えば、ＭＨＣクラスＩα鎖の細胞外ドメインと抗体のＦｃ部分との融合タンパク質；ＭＨＣクラスＩα鎖の細胞外ドメインと他の膜タンパク質の膜貫通ドメインとの融合タンパク質等）と、の複合体；等が挙げられる。「抗原提示ＭＨＣクラスＩＩ分子」としては、例えば、抗原とＭＨＣクラスＩＩα鎖又はその細胞外ドメインとＭＨＣクラスＩＩβ鎖又はその細胞外ドメインとの複合体；抗原と単鎖ＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体；抗原及びＭＨＣクラスＩＩβ鎖が結合した融合タンパク質と、ＭＨＣクラスＩＩα鎖との複合体；抗原と、ＭＨＣクラスＩＩα鎖の細胞外ドメインと他のタンパク質又はそのドメイン若しくはそのフラグメント等との融合タンパク質（例えば、ＭＨＣクラスＩＩα鎖の細胞外ドメインと抗体のＦｃ部分との融合タンパク質；ＭＨＣクラスＩＩα鎖の細胞外ドメインと他の膜タンパク質の膜貫通ドメインとの融合タンパク質等）と、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖の細胞外ドメインと他のタンパク質又はそのドメイン若しくはそのフラグメント等との融合タンパク質（例えば、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖の細胞外ドメインと抗体のＦｃ部分との融合タンパク質；ＭＨＣクラスＩＩβ鎖の細胞外ドメインと他の膜タンパク質の膜貫通ドメインを含むアミノ酸配列との融合タンパク質等）と、の複合体等が挙げられる。
　本明細書中で用いられる「単鎖ＭＨＣ分子」、「単鎖ＭＨＣクラスＩ分子」又は「単鎖ＭＨＣクラスＩＩ分子」とは、ＭＨＣ分子（又はＭＨＣクラスＩ分子若しくはＭＨＣクラスＩＩ分子）のα鎖若しくはその細胞外ドメインと、β鎖若しくはその細胞外ドメイン又はβ２ミクログロブリンとが、必要に応じてスペーサー配列等を介して連結した融合タンパク質を意味する。「単鎖ＭＨＣクラスＩ分子」としては、例えば、ＭＨＣクラスＩα鎖とβ２ミクログロブリンとが必要に応じてスペーサー配列を介して連結した融合タンパク質等が挙げられる。「単鎖ＭＨＣクラスＩＩ分子」としては、例えば、ＭＨＣクラスＩＩα鎖とＭＨＣクラスＩＩβ鎖とが必要に応じてスペーサー配列を介して連結した融合タンパク質等が挙げられる。
　本明細書中で用いられる「膜貫通ドメインを含む単鎖ＭＨＣ分子」とはＭＨＣ分子本来の膜貫通ドメイン（ＭＨＣクラスＩα鎖、ＭＨＣクラスＩＩα鎖、又はＭＨＣクラスＩＩβ鎖の膜貫通ドメイン）を含む「単鎖ＭＨＣ分子」を意味する。
　本明細書中で用いられる「抗原提示ＭＨＣ分子を含む、該抗原（若しくは抗原ペプチド）を膜外に提示可能なタンパク質（若しくは融合タンパク質、タンパク質複合体等）」とは、抗原提示ＭＨＣ分子を少なくとも含み、かつ抗原（若しくは抗原ペプチド）を膜外に提示することで、Ｔ細胞等に抗原を提示することが可能なタンパク質（若しくは融合タンパク質、タンパク質複合体等）を意味する。「抗原提示ＭＨＣ分子を含む、抗原（若しくは抗原ペプチド）を膜外に提示可能なタンパク質（若しくは融合タンパク質、タンパク質複合体等）」は、これが細胞外小胞の膜に発現するように、プラスミド等を用いて融合タンパク質、タンパク質複合体等の形態で発現させたものであってもよい。或いは、「抗原提示ＭＨＣ分子を含む、抗原（若しくは抗原ペプチド）を膜外に提示可能なタンパク質（若しくは融合タンパク質、タンパク質複合体等）」は、可溶性の抗原提示ＭＨＣ分子（これらに限定されるものではないが、例えば、特許文献１に記載されている、ＭＨＣクラスＩα鎖及び免疫グロブリン重鎖を含む融合タンパク質等；特開２００７－１６１７１９号公報に記載されている、可溶性のＭＨＣクラスＩ分子等）を用いる場合、可溶性の抗原提示ＭＨＣ分子と細胞外小胞とを、必要に応じて脂質リンカー、ペプチドリンカー等を介して、細胞外小胞の膜に結合させたものであってもよい（例えば、特開２０１８－１０４３４１号公報等に記載の方法を参考にしてもよい）。或いは、可溶性の抗原提示ＭＨＣ分子のＮ末端側又はＣ末端側に所望のタグ（例えば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＰＮＥタグ（配列番号７９：ＮＹＨＬＥＮＥＶＡＲＬＫＫＬ）等）を付加したもの（該タグは、例えば、他の構成要素とともに融合タンパク質として発現させてもよいし、別途用意した可溶性の抗原提示ＭＨＣ分子に、必要に応じてリンカー等を介して結合させてもよい）と、該タグに対する抗体又はその抗原結合性フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ若しくはナノボディ）等を含むタンパク質（例えば、zＰＮＥタグと該タグに対する抗体等とを用いる方法を参考にしてもよい）。
抗原
　本明細書中で用いられる「抗原」とは、抗原性を有しうるものである限り特段限定されるものではなく、ペプチド抗原だけでなく、リン脂質、複合炭水化物等の非ペプチド抗原（例えば、ミコール酸、リポアラビノアンナン等の細菌性膜構成要素等）も包含される。
　本明細書中で用いられる「抗原ペプチド」は、抗原となりうるペプチドである限り特段限定されるものではなく、天然由来のものであっても、合成由来のものであっても、市販されているものであってもよい。抗原ペプチドは、これらに限定されるものではないが、例えば、ＷＴ－１、α－胎児タンパク質、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、胎盤アルカリ性ホスファターゼシアリル－ルイスＸ、ＣＡ－１２５、ＣＡ－１９、ＴＡＧ－７２、上皮糖タンパク質２、５Ｔ４、α胎児タンパク質受容体、Ｍ２Ａ、チロシナーゼ、Ｒａｓ、ｐ５３、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、ＥＧＦ－Ｒ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、ｍｙｃ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、ＨＰＶ型１６、メラノトランスフェリン、ＭＵＣ１、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３７、ＣＤ４５Ｒ、ＩＬ－２受容体α鎖、Ｔ細胞受容体、前立腺酸性ホスファターゼ、ＧＰ１００、ＭｅｌａｎＡ／Ｍａｒｔ－１、ｇｐ７５／ブラウン、ＢＡＧＥ、Ｓ－１００、イトケラチン、ＣＹＦＲＡ２１－１、Ｅｐ－ＣＡＭ、Ｇｔｆ２i、ＲＰＬ１８等の腫瘍関連抗原ペプチド；インスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ＩＣＡ５１２／ＩＡ－２タンパク質チロシンホスファターゼ、ＩＣＡ１２、ＩＣＡ６９、プレプロインスリン、ＨＳＰ６０、カルボキシペプチダーゼＨ、ペリフェリン、ＧＭ１－２、ビトロネクチン、βクリスタリン、カルレティキュリン、セロトランスフェリン、ケラチン、ピルビン酸カルボキシラーゼ、Ｃ１、ビリン２、ヌクレオソーム、リボヌクレオタンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質、ミエリン関連糖タンパク質、ミエリン／オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドアポタンパク質等の自己抗原ペプチド；原生動物（例えば、マラリア原虫、リーシュマニア種、トリパノソーマ種）、細菌（例えば、グラム陽性球菌、グラム陽性桿菌、グラム陰性細菌、嫌気性菌）、真菌（例えば、アスペルギルス、ブラストミセス、カンジダ、コクシジオイデス、クリプトコッカス、ヒストプラスマ、パラコクシジオイデス、スポロスリックス）、ウイルス（例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、呼吸シンシチアウイルス、ポックスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶやＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のようなコロナウイルス）、細胞内寄生体（例えば、クラミジア科、マイコプラズマ科、アコレプラスマ科、リケッチア科）、蠕虫（例えば、線虫、吸虫、条虫）等の感染病原体に由来する抗原ペプチド；プリオン等のその他の抗原ペプチド等が挙げられる。
　抗原ペプチドは、アレルギー症状を引き起こすアレルゲンを含んでもよい。アレルゲンとしては、上記原生動物、細菌、真菌、細胞内寄生体及び蠕虫に由来するペプチド以外に、外来性のペプチド、たとえば、ハウスダスト、ダニ、動物（たとえばネコ、イヌなどのコンパニオンアニマル）、及び花粉（たとえば、スギやヒノキ）由来のペプチド等が例示される。より詳細には、 Ｃｒｙｊ１などのスギ花粉に含まれるタンパク質が例示される。あるいは、アレルギー症状を引き起こすアレルゲンは、食物由来のものであってよい。食物に対するアレルギー症状を引き超すアレルゲンとしては、鶏卵、牛乳、小麦、そば、かに、えび及び落花生由来のペプチド等が例示される。
　本明細書中で用いられる「ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチド」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｅｘ ｖｉｖｏ等で、ＭＨＣ分子に結合することが可能な抗原ペプチドを意味する。「ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチド」のアミノ酸残基数は、通常、約７～約３０である。「ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチド」としては、例えば、ＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチド、ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチド等が挙げられる。
　本明細書中で用いられる「ＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチド」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｅｘ ｖｉｖｏ等で、ＭＨＣクラスＩ分子に結合することが可能な抗原ペプチドを意味する。ＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドが細胞外小胞の膜外に提示されると、例えば、該抗原ペプチドが前駆体Ｔ細胞等に認識され、細胞傷害性Ｔ細胞等を誘導しうる。「ＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチド」のアミノ酸残基数は、通常、約７～約３０であり、好ましくは約７～約２５であり、より好ましくは約７～約２０であり、更に好ましくは約７～約１５であり、より更に好ましくは約７～約１２である。
　本明細書中で用いられる「ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチド」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｅｘ ｖｉｖｏ等で、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することが可能な抗原ペプチドを意味する。ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチドが細胞外小胞の膜外に提示されると、例えば、該抗原ペプチドが前駆体Ｔ細胞等に認識され、ヘルパーＴ細胞等を誘導しうる。「ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチド」のアミノ酸残基数は、通常、約７～約３０であり、好ましくは約１０～約２５であり、より好ましくは約１２～約２４である。
　「ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチド」、「ＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチド」、又は「ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチド」としては、ＭＨＣ分子、ＭＨＣクラスＩ分子又はＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することが可能な抗原ペプチドである限り、特段限定されるものではない。
Ｔ細胞刺激性サイトカイン
　本明細書中で用いられる「Ｔ細胞刺激性サイトカイン」とは、Ｔ細胞の膜上に発現する受容体等を介して、Ｔ細胞を刺激（例えば、活性化、抑制等）することが可能なサイトカインである限り特段限定されるものではない。Ｔ細胞刺激性サイトカインとしては、これらに限定されるものではないが、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦ－β、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ等が挙げられる。これらのうち、ホモ若しくはヘテロのサブユニットの多量体を形成しうるもの（例えば、ＩＬ－１２、ＴＧＦ－β等）は、機能的である限り（即ち、所望の薬理活性を有しうる限り）、場合によりペプチドリンカー等を介して連結された、連続したアミノ酸配列のものであってもよい。Ｔ細胞を刺激する能力を維持する限り、他の完全長タンパク質又はその部分配列ペプチド（たとえば、ＩＬ－１５受容体のＳｕｓｈｉドメイン）と結合又は融合していてもよい。
　本明細書中に記載のＴ細胞刺激性サイトカインは、任意の動物種由来のものであってもよい。例えば、マウス、ラット等のげっ歯類；ウサギ等のウサギ目；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄類；イヌ、ネコ等の食肉目；ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類等の哺乳動物等の動物に由来するものが挙げられる。本明細書中に記載のＴ細胞刺激性サイトカインは、好ましくは、げっ歯類又は哺乳類動物に由来するものであり、より好ましくは、マウス又はヒトに由来するものである。
　本明細書中に記載のＴ細胞刺激性サイトカインは、その機能を発揮することができるものである限り、その野生型のアミノ酸配列（例えば、ＩＬ－２の場合、例えば配列番号２５等；ＩＬ－４の場合、例えば配列番号５３等）に対して、アミノ酸配列同一性が、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のものであってもよい。或いは、本明細書中に記載のＴ細胞刺激性サイトカインは、その機能を発揮することができるものである限り、その野生型のアミノ酸配列に対して、１個又は複数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加及び／又は置換等されたものであってもよい。
　本明細書中で用いられる「（第１の、第２の）Ｔ細胞刺激性サイトカインを含む、該（第１の、第２の）Ｔ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能なタンパク質」とは、Ｔ細胞刺激性サイトカインを少なくとも含み、細胞又は細胞外小胞の膜外に該Ｔ細胞刺激性サイトカインを提示することが可能なタンパク質を意味する。「（第１の、第２の）Ｔ細胞刺激性サイトカインを含む、該（第１の、第２の）Ｔ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能なタンパク質」は、これが細胞又は細胞外小胞の膜に発現するように、プラスミド等を用いて、Ｔ細胞刺激性サイトカインと膜タンパク質又はその膜貫通ドメインを含むフラグメント等とを含む融合タンパク質として発現させたものであってもよい。或いは、「（第１の、第２の）Ｔ細胞刺激性サイトカインを含む、該（第１の、第２の）Ｔ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能なタンパク質」は、可溶性のＴ細胞刺激性サイトカイン（これらに限定されるものではないが、例えば、Ｔ細胞刺激性サイトカインそのもの；Ｔ細胞刺激性サイトカインと抗体のＦｃ部分との融合タンパク質；Ｔ細胞刺激性サイトカインと、該Ｔ細胞刺激性サイトカインを認識する抗体、又はその抗原結合性フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ若しくはナノボディ）等と、の複合体等）を用いる場合、可溶性のＴ細胞刺激性サイトカインと細胞又は細胞外小胞とを、必要に応じて脂質リンカー、ペプチドリンカー等を介して、細胞外小胞の膜に結合させたものであってもよい（例えば、特開２０１８－１０４３４１号公報等に記載の方法を参考にしてもよい）。或いは、可溶性のＴ細胞刺激性サイトカインのＮ末端側又はＣ末端側に所望のタグ（例えば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＰＮＥタグを付加したもの（該タグは、例えば、他の構成要素とともに融合タンパク質として発現させてもよいし、別途用意した可溶性のＴ細胞刺激性サイトカインに、必要に応じてリンカー等を介して結合させてもよい）と、該タグに対する抗体又はその抗原結合性フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ若しくはナノボディ）等を含むタンパク質（例えば、必要に応じてリンカー等を介して細胞又は細胞外小胞の膜に結合した、該タグに対する抗体又はその抗原結合性フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ若しくはナノボディ）等自体；細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質又はその膜貫通ドメインのＮ末端側又はＣ末端側に、該タグに対するナノボディが結合した、融合タンパク質等）を膜に含む細胞又は細胞外小胞とを、所望の条件で混合したものであってもよい（例えば、Raj D, et al., Gut., 2019 Jun;68(6):1052-1064等に記載の、ＰＮＥタグと該タグに対する抗体等とを用いる方法を参考にしてもよい）。なお、サブユニットの多量体で形成されるＴ細胞刺激性サイトカインの場合、そのサブユニットの１つが、細胞又は細胞外小胞の膜外に提示することが可能なタンパク質であれば、残りのサブユニットは膜外に提示可能な態様である必要はない。そのサブユニットの１つが、細胞外小胞の膜外に提示することが可能なタンパク質であれば、他のサブユニットを添加又は共発現させることにより、機能的なＴ細胞刺激性サイトカインが細胞外小胞の膜外に構築されうる。
Ｔ細胞共刺激分子
　本明細書中で用いられる「Ｔ細胞共刺激分子」とは、ＣＤ２８、ＣＤ１３４等のＴ細胞の膜上に存在する分子と相互作用することで、Ｔ細胞の活性化等に寄与しうる分子を意味する。Ｔ細胞共刺激分子としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６等の分子、又はこれらの細胞外ドメイン若しくはその機能的なフラグメント；抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ１３４抗体等の抗体、又はこれらの抗原結合性フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ若しくはナノボディ）等；これらと、他のタンパク質の膜貫通ドメイン若しくは抗体のＦｃ部分等との融合タンパク質（若しくは複合体、会合体）等が挙げられる。
　本明細書中で用いられる「膜貫通ドメインを含むＴ細胞共刺激分子」とはさらにＴ細胞共刺激分子由来の膜貫通ドメインも含む「Ｔ細胞共刺激分子」を意味する。
　本明細書中に記載のＴ細胞共刺激分子は、任意の動物種由来のものであってもよい。例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類；ウサギ等のウサギ目；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄類；イヌ、ネコ等の食肉目；ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類等の哺乳動物等の動物に由来するものが挙げられる。本明細書中に記載のＴ細胞共刺激分子は、好ましくは、げっ歯類又は哺乳類動物に由来するものであり、より好ましくは、マウス又はヒトに由来するものである。
　本明細書中に記載のＴ細胞共刺激分子は、上述した機能を発揮することができるものである限り、その野生型のアミノ酸配列（例えば、ＣＤ８０の場合、例えば配列番号６７等）に対して、アミノ酸配列同一性が、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のものであってもよい。或いは、本明細書中に記載のＴ細胞共刺激分子は、その機能を発揮することができるものである限り、その野生型のアミノ酸配列に対して、１個又は複数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加及び／又は置換等されたものであってもよい。
　本明細書中で用いられる「Ｔ細胞共刺激分子を含む、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能なタンパク質」とは、Ｔ細胞共刺激分子を少なくとも含み、Ｔ細胞の膜上に存在する分子と相互作用可能なタンパク質を意味する。即ち、少なくともＴ細胞共刺激分子中に存在するＴ細胞と相互作用可能な部分が、細胞又は細胞外小胞の膜外に位置していることを意味する。「Ｔ細胞共刺激分子を含む、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能なタンパク質」は、これが細胞又は細胞外小胞の膜に発現するように、プラスミド等を用いて発現させたものであってもよい。或いは、「Ｔ細胞共刺激分子を含む、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能なタンパク質」は、可溶性のＴ細胞共刺激分子（これらに限定されるものではないが、例えば、ＣＤ８０の細胞外ドメインと抗体のＦｃ部分との融合タンパク質；抗ＣＤ２８抗体、又はその抗原結合性フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ若しくはナノボディ）等）を用いる場合、可溶性のＴ細胞共刺激分子と細胞又は細胞外小胞とを、必要に応じて脂質リンカー、スペーサー配列等を介して、細胞又は細胞外小胞の膜に結合させたものであってもよい（例えば、特開２０１８－１０４３４１号公報等に記載の方法を参考にしてもよい）。或いは、可溶性のＴ細胞共刺激分子のＮ末端側又はＣ末端側に所望のタグ（例えば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＰＮＥタグを付加したもの（該タグは、例えば、他の構成要素とともに融合タンパク質として発現させてもよいし、別途用意した可溶性のＴ細胞共刺激分子に、必要に応じてリンカー等を介して結合させてもよい）と、該タグに対する抗体又はその抗原結合性フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ若しくはナノボディ）等を含むタンパク質（例えば、必要に応じてリンカー等を介して細胞又は細胞外小胞の膜に結合した、該タグに対する抗体又はその抗原結合性フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ若しくはナノボディ）等自体；細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質又はその膜貫通ドメインのＮ末端側又はＣ末端側に、該タグに対するナノボディが結合した、融合タンパク質等）を膜に含む細胞又は細胞外小胞とを、所望の条件で混合したものであってもよい（例えば、Raj D, et al., Gut., 2019 Jun;68(6):1052-1064等に記載の、ＰＮＥタグと該タグに対する抗体等とを用いる方法を参考にしてもよい）。
　本明細書中で用いられる「細胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」としては、細胞膜に発現することが可能なものである限り、任意の膜タンパク質又はその膜貫通ドメインを選択することができる。
　これに限定しないが、膜タンパク質又はその膜貫通ドメインには、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２８、トランスフェリン受容体等の一部または全部、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４等の膜結合型免疫グロブリン分子のＦＣ領域の一部または全部を含むものが好ましい。
　本明細書中で用いられる「細胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」としては、細胞の膜に結合することが可能なものである限り、任意のタンパク質又はそのドメインを選択することができる。
　本明細書中で用いられる「細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」としては、細胞外小胞の膜に発現することが可能なものである限り、任意の膜タンパク質又はその膜貫通ドメインを選択することができる。「細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質又はその膜貫通ドメイン」は、細胞外小胞（例えば、エクソソーム等）に発現しうることが知られている膜タンパク質（例えば、テトラスパニン、ＣＤ５８、ＩＣＡＭ－１、ＰＴＧＦＲＮ（例えば、非特許文献１、国際公開第２０１９／１８３５７８号等を参照）等）、又はこれらの膜貫通ドメイン等が好ましい。
　本明細書中で用いられる「細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」としては、細胞外小胞の膜に結合することが可能なものである限り、任意のタンパク質又はそのドメインを選択することができる。「細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」は、細胞外小胞（例えば、エクソソーム等）の膜に結合しうることが知られているもの（例えば、ＭＦＧ－Ｅ８、又はそのドメイン（例えば、Alain Delcayre, et al., Blood Cells, Molecules, and Diseases 35 (2005) 158-168に記載のＭＦＧ－Ｅ８のＣ１、Ｃ２ドメイン））等が好ましい。
　本明細書中に記載の「細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」又は「細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」は、任意の動物種由来のものであってもよい。例えば、マウス、ラット等のげっ歯類；ウサギ等のウサギ目；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄類；イヌ、ネコ等の食肉目；ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類等の哺乳動物等の動物に由来するものが挙げられる。本明細書中に記載の「細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」又は「細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」は、好ましくは、げっ歯類又は哺乳類動物に由来するものであり、より好ましくは、マウス又はヒトに由来するものである。
　非特許文献２によると、哺乳動物の細胞外小胞のマーカーは以下のように分類される。
　細胞外小胞のマーカータンパク質として用いることのできる膜タンパク質又はＧＰＩアンカータンパク質としては、
１）組織非特異的なもの
　テトラスパニン（ＣＤ６３，ＣＤ９，ＣＤ８１，ＣＤ８２），他の複数膜貫通型の膜タンパク質（ＣＤ４７やヘテロ３量体Ｇタンパク質（ＧＮＡ：Ｇｕａｎｉｎｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）など）
　ＭＨＣ　クラスＩ（ＨＬＡ－Ａ／Ｂ／Ｃ，Ｈ２－Ｋ／Ｄ／Ｑ），
インテグリン（ＩＴＧＡ／ＩＴＧＢ）、トランスフェリン受容体（ＴＦＲ２）；
　ＬＡＭＰ１／２；
　ヘパラン硫酸プロテオグリカン（シンデカン（ＳＤＣ）を含む）；
　細胞外マトリックスメタロプロテアーゼ誘導物質（ＥＭＭＰＲＩＮ）（ＢＳＧ又はＣＤ１４７ともいう）；
　ＡＤＡＭ１０；
　ＧＰＩアンカー型の５’ヌクレオチダーゼであるＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ），
　ＧＰＩアンカー型の補体結合タンパク質であるＣＤ５５及びＣＤ５９；　
　ソニックヘッジホッグタンパク質（ＳＨＨ）
２）細胞／組織特異的なもの
　いくつかのテトラスパニン：ＴＳＰＡＮ８（上皮細胞特異的）、ＣＤ３７及びＣＤ５３（白血球特異的）；
　ＰＥＣＡＭ１（内皮細胞特異的）；
　ＥＲＢＢ２（乳癌特異的）；
　ＥＰＣＡＭ（上皮性特異的）；
　ＣＤ９０（ＴＨＹ１）（間葉系幹細胞特異的）；
　ＣＤ４５（ＰＴＰＲＣ）（免疫細胞特異的）、ＣＤ４１（ＩＴＧＡ２Ｂ）又はＣＤ４２ａ（ＧＰ９）（血小板特異的）；
　グリコホリンＡ（ＧＹＰＡ）（赤血球特異的）；
　ＣＤ１４（単球特異的），ＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ－ＤＲ／ＤＰ／ＤＱ，Ｈ２－Ａ）；
　ＣＤ３（Ｔ細胞特異的）；
　アセチルコリンエステラーゼ／ＡＣｈＥ－Ｓ（神経細胞特異的）、ＡＣｈＥ－Ｅ（赤血球特異的）；
　アミロイドβＡ４／ＡＰＰ（神経細胞特異的）；
などが挙げられる。
　従って、これらに限定しないが、細胞外小胞のマーカーであるタンパク質を本発明における「細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質」又は「細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質」として用いてもよい。
　本明細書中で用いられる「テトラスパニン」とは、テトラスパニンファミリーに属するタンパク質（これらに限定されるものではないが、例えば、ＣＤ９、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ１５１等）を意味する。テトラスパニンは、通常、Ｎ末端側から、膜貫通ドメイン１（以下、「ＴＭ１」ともいう。）、小型細胞外ループ（以下、「ＳＥＬ」ともいう。）、膜貫通ドメイン２（以下、「ＴＭ２」ともいう。）、小型細胞内ループ（以下、「ＳＩＬ」ともいう。）、膜貫通ドメイン３（以下、「ＴＭ３」ともいう。）、大型細胞外ループ（以下、「ＬＥＬ」ともいう。）、及び膜貫通ドメイン４（以下、「ＴＭ４」ともいう。）を有することから、４回膜貫通型であり、かつ、Ｎ末端側及びＣ末端側の両方が細胞質側に存在する。例えば、テトラスパニンがマウスＣＤ６３（アミノ酸配列 １～２３８：配列番号２７）の場合、通常、アミノ酸配列 約１～約１１０において、ＴＭ１、ＳＥＬ、ＴＭ２、ＳＩＬ及びＴＭ３を含み、アミノ酸配列 約１１１～約２００において、ＬＥＬを含み、アミノ酸配列 約２０１～約２３８において、ＴＭ４を含みうる。
　本明細書中に記載の「テトラスパニン」における各ドメイン（例えば、ＴＭ１、ＳＥＬ、ＳＩＬ、ＬＴＬ等）は、同一のテトラスパニン由来のものであってもよいし、全部又は一部が異なるテトラスパニン由来のものであってもよい。
　本明細書中に記載のテトラスパニンは、細胞外小胞の膜に発現することが可能なものである限り、その野生型のアミノ酸配列（例えば、全長のＣＤ９の場合、例えば配列番号２１等；全長のＣＤ６３の場合、例えば配列番号２７等；全長のＣＤ８１の場合、例えば配列番号１５等）に対して、アミノ酸配列同一性が、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のものであってもよい。或いは、本明細書中に記載のテトラスパニンは、細胞外小胞の膜に発現することが可能なものである限り、その野生型のアミノ酸配列に対して、１個又は複数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加及び／又は置換等されたものであってもよい。
　本明細書中に記載のテトラスパニンの部分配列（例えば、各ドメイン；ＴＭ１、ＳＥＬ、ＴＭ２、ＳＩＬ及びＴＭ３を含む部分配列（例えば、ＣＤ６３の場合、配列番号５７等；ＣＤ８１の場合、配列番号６１等）；ＴＭ４を含む部分配列（例えば、ＣＤ６３の場合、配列番号５９等；ＣＤ８１の場合、配列番号６３等））は、その野生型のアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列同一性が、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のものであってもよい。或いは、本明細書中に記載のテトラスパニンの部分配列は、その野生型のアミノ酸配列に対して、１個又は複数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加及び／又は置換等されたものであってもよい。
　本明細書中に記載のＭＦＧ－Ｅ８は、細胞外小胞の膜に結合することが可能なものである限り、その野生型のアミノ酸配列（例えば、配列番号４９等）に対して、アミノ酸配列同一性が、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のものであってもよい。或いは、本明細書中に記載のＭＦＧ－Ｅ８は、細胞外小胞の膜に結合することが可能なものである限り、その野生型のアミノ酸配列に対して、１個又は複数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加及び／又は置換等されたものであってもよい。
　本明細書中に記載のＣＤ５８、ＰＴＧＦＲＮ等は、細胞外小胞の膜に発現することが可能なものであるか、又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なものである限り、その野生型のアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列同一性が、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のものであってもよい。或いは、本明細書中に記載のＣＤ５８、ＰＴＧＦＲＮ等は、細胞外小胞の膜に発現することが可能なものであるか、又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なものである限り、その野生型のアミノ酸配列に対して、１個又は複数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加及び／又は置換等されたものであってもよい。
スペーサー配列
　本明細書中で用いられる「スペーサー配列」とは、２以上のタンパク質又はその部分配列若しくはドメイン等の間に存在する、少なくとも１つのアミノ酸残基を有する任意の配列を意味する。スペーサー配列は、例えば、２以上のタンパク質又はその部分配列若しくはドメイン等を連結する際に使用されうる。スペーサー配列は、ペプチドリンカーを包含する。スペーサー配列は、アミノ酸残基の長さとして、通常、１～約５０であり、好ましくは、約２～約２８であり、より好ましくは、約４～約２５である。スペーサー配列としては、これらに限定されるものではないが、例えば、（ＧＧＧＸＳ）ｎＧｍ（式中、Ｘは出現するごとに独立して、Ａ又はＧであり、ｎは、１～８であり、ｍは、０～３である）（例えば、配列番号５、１１、２９、３９等）；（ＧＧＧＳ）ｎＧｍ（式中、ｎは、１～１０であり、ｍは、０～３である）；ＴａＳｂ（ＧＧＸ）ｎＧｍ（式中、Ｘは出現するごとに独立して、Ｓ又はＴであり、ｎは、１～８であり、ｍは、０～３であり、ａは、０又は１であり、ｂは、０又は１である）（例えば、配列番号７７等）；等が挙げられる。
本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞
　本発明の一実施態様では、抗原提示ＭＨＣ分子及びＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示する細胞外小胞を提供する（図２Ｋ（１）にそのモデルを例示する）。
　かかる細胞外小胞は、以下の（Ａ）と（Ｂ）に規定されるタンパク質を膜に含むことによって、抗原提示ＭＨＣ分子及びＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示させてもよいし、（Ｄ）に規定されるタンパク質を膜に含むことによって、抗原提示ＭＨＣ分子及びＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示させてもよい。
　あるいは、単離した細胞外小胞にあとから、その膜表面に抗原提示ＭＨＣ分子及びＴ細胞刺激性サイトカインを付着させてもよい。付着させる方法は特に限定しないが、抗原提示ＭＨＣ分子及びＴ細胞刺激性サイトカインに各々リン脂質を結合し、細胞外小胞の膜にリン脂質部分を取り込ませることにより、膜表面に抗原提示ＭＨＣ分子及びＴ細胞刺激性サイトカインを付着させてもよい。細胞外小胞にはフォスファチジルセリンが表面に存在している。従って、フォスファチジルセリンと結合するＭＦＧ－Ｅ８に、提示させたい抗原提示ＭＨＣ分子又はＴ細胞刺激性サイトカインを融合させたタンパク質を各々合成精製して、その融合タンパク質と細胞外小胞を混合することにより、膜表面に抗原提示ＭＨＣ分子及びＴ細胞刺激性サイトカインを提示する細胞外小胞を作製することができる。また、ペプチドネオエピトープ（ＰＮＥ）ナノボディをあらかじめ発現させた細胞外小胞に、後からＰＮＥｔａｇを付けた抗原提示ＭＨＣ分子及びＴ細胞刺激性サイトカインを加えて細胞外小胞の膜表面に提示させてもよい。ストレプトアビジンを発現させた細胞外小胞にビオチン化した抗原提示ＭＨＣ分子及びＴ細胞刺激性サイトカインを加えて、細胞外小胞の膜表面に提示させてもよい。
　本発明の一実施態様では、複数種類（２、３、４、５種）の抗原提示ＭＨＣ分子及び複数種類（２、３、４、５種）のＴ細胞刺激性サイトカイン（各々のＴ細胞刺激性サイトカインを識別するために、以下、第一のＴ細胞刺激性サイトカイン、第二のＴ細胞刺激性サイトカイン、それ以上のＴ細胞刺激性サイトカイン等と呼称する場合がある）を膜外に提示する細胞外小胞であってもよい。あるいは１種類の抗原提示ＭＨＣ分子と複数種類の細胞刺激性サイトカインを膜外に提示する細胞外小胞であってもよい（図２Ｋ（３）に１種類の抗原提示ＭＨＣ分子と２種類のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示する細胞外小胞のモデルを例示する）。
　本発明の一実施態様では、抗原提示ＭＨＣ分子及びＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示する細胞を提供する（図２Ｋ（１）の細胞外小胞のモデルに対応する）。
　かかる抗原提示細胞は、以下の（Ａ）と（Ｂ）に規定されるタンパク質を膜に含むことによって、抗原提示ＭＨＣ分子及びＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示させてもよいし、（Ｄ）に規定されるタンパク質を膜に含むことによって、抗原提示ＭＨＣ分子及びＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示させてもよい。
　本発明の一実施態様では、複数種類（２、３、４、５種）の抗原提示ＭＨＣ分子及び複数種類（２、３、４、５種）のＴ細胞刺激性サイトカイン（各々のＴ細胞刺激性サイトカインを識別するために、以下、第一のＴ細胞刺激性サイトカイン、第二のＴ細胞刺激性サイトカイン、それ以上のＴ細胞刺激性サイトカイン等と呼称する場合がある）を膜外に提示する細胞であってもよい。あるいは１種類の抗原提示ＭＨＣ分子と複数種類の細胞刺激性サイトカインを膜外に提示する細胞であってもよい（図２Ｋ（３）の細胞外小胞のモデルに対応する）。
　本発明の一実施態様では、抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ａ）抗原提示ＭＨＣ分子を含む、該抗原を膜外に提示可能なタンパク質；及び
（Ｂ）第１のＴ細胞刺激性サイトカインを含む、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能なタンパク質；
を含む、抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞を提供する。
構成要件（Ａ）
　上記（Ａ）の「抗原提示ＭＨＣ分子を含む、該抗原を膜外に提示可能なタンパク質」は、抗原を細胞又は細胞外小胞の膜外に提示可能なタンパク質である限り、抗原提示ＭＨＣ分子の他に、他のタンパク質又はそのドメイン等を含んでいてもよい。
　本発明の一実施態様では、上記（Ａ）は、抗原提示ＭＨＣ分子と、細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン又は細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメインを含む、該抗原を膜外に提示可能な融合タンパク質又はタンパク質複合体である。
　本発明の一実施態様では、上記（Ａ）は、
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能な融合タンパク質であって、そのＮ末端側から、
　（Ａ－１）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ａ－３）膜貫通ドメインを含む単鎖ＭＨＣ分子のアミノ酸配列、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質、
又は
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能なタンパク質複合体であって、
　そのＮ末端側から、
　　（Ａ－１）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　　（Ａ－３）ＭＨＣクラスＩα鎖、β２ミクログロブリンとＭＨＣクラスＩα鎖の融合タンパク質、ＭＨＣクラスＩＩα鎖、又はＭＨＣクラスＩＩβ鎖からなるアミノ酸配列を含む、融合タンパク質と、
　　（Ａ－６）β２ミクログロブリン、ＭＨＣクラスＩα鎖、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖、又はＭＨＣクラスＩＩα鎖のアミノ酸配列を含む、タンパク質と
を含む、タンパク質複合体；ここで（Ａ－３）と（Ａ－６）の組み合わせより、ＭＨＣクラスＩ分子又はＭＨＣクラスＩＩ分子を構成する、
である。
　本発明の一実施態様では、上記（Ａ）は、
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能な融合タンパク質であって、そのＮ末端側から、
　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ａ－３）膜貫通ドメインを含む単鎖ＭＨＣクラスＩ分子のアミノ酸配列、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、該抗原ペプチドを膜外に提示可能な融合タンパク質である。
　また、本発明の一実施態様では、上記（Ａ）は、
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能な融合タンパク質であって、そのＮ末端側から、
　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ａ－３））膜貫通ドメインを含む単鎖ＭＨＣクラスＩＩ分子のアミノ酸配列、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、該抗原ペプチドを膜外に提示可能な融合タンパク質である。
　本発明の一実施態様では、上記（Ａ）は、
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能なタンパク質複合体であって、
　そのＮ末端側から、
　　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　　（Ａ－３）β２ミクログロブリンとＭＨＣクラスＩα鎖の融合タンパク質のアミノ酸配列、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む。
また、本発明の一実施態様では、上記（Ａ）は、
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能なタンパク質複合体であって、
　そのＮ末端側から、
　　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　　（Ａ－３）ＭＨＣクラスＩα鎖のアミノ酸配列、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質と、
　　（Ａ－６）β２ミクログロブリンのアミノ酸配列を含む、タンパク質と
を含む、タンパク質複合体である。
　また、本発明の一実施態様では、上記（Ａ）は、
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能なタンパク質複合体であって、
　そのＮ末端側から、
　　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　　（Ａ－３）ＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ酸配列、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質と、
　（Ａ－６）ＭＨＣクラスＩＩα鎖のアミノ酸配列を含む、タンパク質と
を含む、タンパク質複合体である。
　また、本発明の一実施態様では、上記（Ａ）は、
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能なタンパク質複合体であって、
　そのＮ末端側から、
　　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　　（Ａ－３）ＭＨＣクラスＩＩα鎖のアミノ酸配列、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質と、
　（Ａ－６）ＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ酸配列を含む、タンパク質と
を含む、タンパク質複合体である。
　本発明の一実施態様では、上記（Ａ）は、抗原提示ＭＨＣ分子と、テトラスパニン若しくはその膜貫通ドメインあるいはＭＦＧ－Ｅ８若しくはそのドメインとを含む、該抗原を膜外に提示可能な融合タンパク質又はタンパク質複合体である。
　本発明の一実施態様では、上記（Ａ）は、
そのＮ末端側から、
　（Ａ－１）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ａ－３）単鎖ＭＨＣ分子のアミノ酸配列、
　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜結合ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質、又は
　そのＮ末端側から、
　　（Ａ－１）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　　（Ａ－３）ＭＨＣクラスＩα鎖の膜外領域、β２ミクログロブリン、ＭＨＣクラスＩＩα鎖の膜外領域、又はＭＨＣクラスＩＩβ鎖の膜外領域のアミノ酸配列
　　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質と、
　（Ａ－６）β２ミクログロブリン、ＭＨＣクラスＩα鎖、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖、又はＭＨＣクラスＩＩα鎖のアミノ酸配列を含む、タンパク質と
を含む、タンパク質複合体
である。
　本発明の一実施態様では、上記（Ａ）は、
そのＮ末端側から、
　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ａ－３）単鎖ＭＨＣクラスＩ分子のアミノ酸配列、
　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、該抗原ペプチドを膜外に提示可能な融合タンパク質である。
　また、本発明の一実施態様では、上記（Ａ）は、
そのＮ末端側から、
　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ａ－３）単鎖ＭＨＣクラスＩＩ分子のアミノ酸配列、
　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、該抗原ペプチドを膜外に提示可能な融合タンパク質である。
　本発明の一実施態様では、上記（Ａ）は、
そのＮ末端側から、
　　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　　（Ａ－３）β２ミクログロブリンのアミノ酸配列、
　　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質と、
　（Ａ－６）ＭＨＣクラスＩα鎖のアミノ酸配列を含む、タンパク質と
を含む、タンパク質複合体である。
　また、本発明の一実施態様では、上記（Ａ）は、
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能なタンパク質複合体であって、
　そのＮ末端側から、
　　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　　（Ａ－３）ＭＨＣクラスＩα鎖の膜外領域のアミノ酸配列、
　　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質と、
　（Ａ－６）β２ミクログロブリンのアミノ酸配列を含む、タンパク質と
を含む、タンパク質複合体である。
　また、本発明の一実施態様では、上記（Ａ）は、
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能なタンパク質複合体であって、
　そのＮ末端側から、
　　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　　（Ａ－３）ＭＨＣクラスＩＩβ鎖の膜外領域のアミノ酸配列、
　　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質と、
　（Ａ－６）ＭＨＣクラスＩＩα鎖のアミノ酸配列を含む、タンパク質と
を含む、タンパク質複合体である。
　また、本発明の一実施態様では、上記（Ａ）は、
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能なタンパク質複合体であって、
　そのＮ末端側から、
　　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　　（Ａ－３）ＭＨＣクラスＩＩα鎖の膜外領域のアミノ酸配列、
　　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　　（Ａ－５）テトラスパニン
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質と、
　（Ａ－６）ＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ酸配列を含む、タンパク質と
を含む、タンパク質複合体である。
　本発明の一実施態様では、「単鎖ＭＨＣ分子」が「単鎖ＭＨＣクラスＩ分子」の場合、「単鎖ＭＨＣクラスＩ分子」は、Ｎ末端側から、β２ミクログロブリン（例えば、配列番号７等、又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）、存在していてもよいスペーサー配列（存在する場合、例えば、配列番号５、１１、２９、３９、７７等）、及びＭＨＣクラスＩα鎖（例えば、配列番号９等、又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）からなる。本発明の一実施態様では、上記（Ａ－３）が「単鎖ＭＨＣクラスＩ分子」の場合、「単鎖ＭＨＣクラスＩ分子」は、配列番号６５、又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のものである。
　本発明の一実施態様では、「単鎖ＭＨＣ分子」が「単鎖ＭＨＣクラスＩＩ分子」の場合、「単鎖ＭＨＣクラスＩＩ分子」は、Ｎ末端側から、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖、存在していてもよいスペーサー配列、及びＭＨＣクラスＩＩα鎖からなる。
　本発明の一実施態様では、上記（Ａ－３）及び／又は（Ａ－６）が「β２ミクログロブリン」の場合、「β２ミクログロブリン」は、配列番号７、又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のものである。
　本発明の一実施態様では、上記（Ａ－３）及び／又は（Ａ－６）が「ＭＨＣクラスＩα鎖」の場合、「ＭＨＣクラスＩα鎖」は、配列番号９、又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のものである。
　本発明の一実施態様では、上記（Ａ－３）及び／又は（Ａ－６）が「ＭＨＣクラスＩＩβ鎖」の場合、「ＭＨＣクラスＩＩβ鎖」は、配列番号３７、又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のものである。
　本発明の一実施態様では、上記（Ａ－３）及び／又は（Ａ－６）が「ＭＨＣクラスＩＩα鎖」の場合、「ＭＨＣクラスＩＩα鎖」は、配列番号７１、又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のものである。
　上記各実施態様における（Ａ－２）及び（Ａ－４）の「存在していてもよいスペーサー配列」は、存在する場合、独立して選択されうる。（Ａ－２）は、存在する場合、例えば、配列番号５、１１、２９、３９、７７等のスペーサー配列であってもよい。（Ａ－４）は、存在する場合、例えば、配列番号５、１１、２９、３９、７７等のスペーサー配列であってもよい。
　本発明の一実施態様では、上記各実施態様における（Ａ－５）のテトラスパニンは、ＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１からなる群より選択される。本発明の一実施態様では、上記各実施態様における（Ａ－５）のテトラスパニンは、ＣＤ８１（好ましくは、配列番号１５等、又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）である。
　本発明の一実施態様では、上記（Ａ）は、
そのＮ末端側から、
　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ａ－２）配列番号５のスペーサー配列、
　（Ａ－３）配列番号６５（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）の単鎖ＭＨＣクラスＩ分子のアミノ酸配列、及び
　（Ａ－５）配列番号１５（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質である。
　本発明の一実施態様では、上記（Ａ）は、
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能なタンパク質複合体であって、
　そのＮ末端側から、
　　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　　（Ａ－２）配列番号３９のスペーサー配列、
　　（Ａ－３）配列番号３７（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ酸配列、及び
　　（Ａ－５）配列番号１５（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質と
　（Ａ－６）配列番号７１（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＭＨＣクラスＩＩα鎖のアミノ酸配列
を含む、タンパク質複合体である。
構成要件（Ｂ）
　上記（Ｂ）の「第１のＴ細胞刺激性サイトカインを含む、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能なタンパク質」は、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能なタンパク質である限り、第１のＴ細胞刺激性サイトカインの他に、他のタンパク質若しくはそのドメイン等を含んでいてもよい。
　本発明の一実施態様では、上記（Ｂ）は、第１のＴ細胞刺激性サイトカインと、細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメインを含む、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質である。
　本発明の一実施態様では、上記（Ｂ）は、第１のＴ細胞刺激性サイトカインと、ＣＤ８又はその膜貫通ドメインを含む、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質である。
本発明の一実施態様では、上記（Ｂ）は、
そのＮ末端側から、
　（Ｂ－３）第１のＴ細胞刺激性サイトカイン、
　（Ｂ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ｂ－５）ＣＤ８又はその膜貫通ドメイン
からなるアミノ酸配列を含む、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質である。
　本発明の一実施態様では、上記（Ｂ）は、
（Ｂ）第１のＴ細胞刺激性サイトカインと、テトラスパニンの部分配列とを含む、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質であって、該テトラスパニンの部分配列が、２つの膜貫通ドメインを少なくとも有し、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインが、該２つの膜貫通ドメインの間に配置されている、融合タンパク質、又は
（Ｂ）第１のＴ細胞刺激性サイトカインと、ＭＦＧ－Ｅ８又はそのドメインとを含む、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質である。
　本明細書中で用いられる「テトラスパニンの部分配列が、２つの膜貫通ドメインを少なくとも有し、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインが、該２つの膜貫通ドメインの間に配置されている」とは、例えば、テトラスパニンの部分配列がテトラスパニンのＴＭ１とＴＭ２とを少なくとも含み、かつ該第１のＴ細胞刺激性サイトカインがＴＭ１とＴＭ２との間に配置されている場合、テトラスパニンの部分配列がテトラスパニンのＴＭ３とＴＭ４とを少なくとも含み、かつ該第１のＴ細胞刺激性サイトカインがＴＭ３とＴＭ４との間に配置されている場合等が挙げられる。
　本発明の一実施態様では、上記（Ｂ）は、
そのＮ末端側から、
　（Ｂ－１）Ｎ末端側から、膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列、
　（Ｂ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ｂ－３）第１のＴ細胞刺激性サイトカイン、
　（Ｂ－４）存在していてもよいスペーサー配列、並びに
　（Ｂ－５）膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列
からなるアミノ酸配列を含む、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質、又は
（Ｂ）そのＮ末端側から、
　（Ｂ－３）第１のＴ細胞刺激性サイトカイン、
　（Ｂ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ｂ－５）ＭＦＧ－Ｅ８
からなるアミノ酸配列を含む、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質である。
　国際公開第２０１６／１３９３５４号で開示されているとおり、テトラスパニンは、その大型細胞外ループ（ＬＥＬ）が全体的に又は部分的に異なるアミノ酸配列に置き換えられていても、膜に発現しうることが報告されている。したがって、（Ｂ－３）の第１のＴ細胞刺激性サイトカインは、存在していてもよいスペーサー配列を介して、テトラスパニンのＬＥＬに替えて挿入されていてもよいし、テトラスパニンのＬＥＬ中又はその部分配列中の任意の位置に挿入されていてもよい。
　（Ｂ－１）の「膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列」は、通常、テトラスパニンの膜貫通ドメイン４を含まない。（Ｂ－１）の「膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列」は、大型細胞外ループ又はその部分配列を含んでいてもよい。（Ｂ－１）における、膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３の各ドメインは、それぞれ別のテトラスパニン由来の配列であってもよいし、全て同じテトラスパニン由来の配列であってもよい。好ましくは、（Ｂ－１）における、膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３の各ドメインは、全て同じテトラスパニン由来の配列である。
　本発明の一実施態様では、（Ｂ－１）における、膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列が、全て、ＣＤ９由来、ＣＤ６３由来又はＣＤ８１由来の部分配列である。本発明の一実施態様では、（Ｂ－１）の膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列は、全てＣＤ６３又はＣＤ８１由来の部分配列（好ましくは、配列番号５７又は配列番号６１等、或いはこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）である。
　（Ｂ－５）の「膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列」は、通常、テトラスパニンの膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含まない。（Ｂ－５）の「膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列」は、大型細胞外ループ又はその部分配列を含んでいてもよい。（Ｂ－５）における膜貫通ドメイン４は、（Ｂ－１）とは別のテトラスパニン由来の配列であってもよいし、（Ｂ－１）と同じテトラスパニン由来の配列であってもよい。好ましくは、（Ｂ－５）における膜貫通ドメイン４は、（Ｂ－１）と同じテトラスパニン由来の配列である。本発明の一実施態様では、（Ｂ－５）における、膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列が、ＣＤ９由来、ＣＤ６３由来又はＣＤ８１由来の部分配列である。本発明の一実施態様では、（Ｂ－５）の膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列は、ＣＤ６３又はＣＤ８１由来の部分配列（好ましくは、配列番号５９又は配列番号６３等、或いはこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）である。
　本発明の一実施態様では、（Ｂ－１）の「膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列」は、ＣＤ６３由来の部分配列（好ましくは、配列番号５７等、又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）であり、かつ、（Ｂ－５）の「膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列」が、ＣＤ６３由来の部分配列（好ましくは、配列番号５９等、又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）である。本発明の一実施態様では、（Ｂ－１）の「膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列」は、ＣＤ８１由来の部分配列（好ましくは、配列番号６１等、又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）であり、かつ、（Ｂ－５）の「膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列」が、ＣＤ８１由来の部分配列（好ましくは、配列番号６３等、又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）である。
　上記（Ｂ）の融合タンパク質がテトラスパニンの部分配列を含む融合タンパク質であり、かつ上記（Ａ）及び後述の場合により存在する（Ｃ）のうちの１以上がテトラスパニンのアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む場合、上記（Ｂ）の融合タンパク質は、上記（Ａ）及び／又は後述の場合により存在する（Ｃ）の融合タンパク質と別個の融合タンパク質であってもよいし、上記（Ａ）及び／又は後述の場合により存在する（Ｃ）の融合タンパク質の一部を構成していてもよい。上記（Ｂ）の融合タンパク質が「上記（Ａ）及び／又は後述の場合により存在する（Ｃ）の融合タンパク質の一部を構成」するとは、例えば、（Ａ－５）のテトラスパニンが（Ｂ）の融合タンパク質を構成する場合、及び／又は後述の場合により存在する（Ｃ－３）のテトラスパニンが（Ｂ）の融合タンパク質を構成する場合等が挙げられる。
　上記（Ｂ－５）の「ＭＦＧ－Ｅ８」は、好ましくは、配列番号４９等、又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のものである。
　本発明の一実施態様では、上記各実施態様の（Ｂ－３）における第１のＴ細胞刺激性サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５又はＴＧＦ－βである。本発明の一実施態様では、上記各実施態様の（Ｂ－３）における第１のＴ細胞刺激性サイトカインが、ＩＬ－２（好ましくは、配列番号２５、又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）、ＩＬ－４（好ましくは、配列番号５３、又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）、又はＴＧＦ－β（好ましくは、配列番号７３、又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）である。
　上記各実施態様の（Ｂ－２）及び（Ｂ－４）における「存在していてもよいスペーサー配列」は、存在する場合、独立して選択されうる。（Ｂ－２）は、存在する場合、例えば、配列番号５、１１、２９、３９、７７等のスペーサー配列であってもよい。（Ｂ－４）は、存在する場合、例えば、配列番号５、１１、２９、３９、７７等のスペーサー配列であってもよい。
本発明の一実施態様では、上記（Ｂ）は、
そのＮ末端側から、
　（Ｂ－１）配列番号５７（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニンの部分配列、
　（Ｂ－２）配列番号２９のスペーサー配列、
　（Ｂ－３）配列番号２５（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＩＬ－２である、第１のＴ細胞刺激性サイトカイン
　（Ｂ－４）配列番号２９のスペーサー配列、並びに
　（Ｂ－５）配列番号５９（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニンの部分配列
からなるアミノ酸配列である、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質である。
　本発明の一実施態様では、上記（Ｂ）は、配列番号３１（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）の、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質である。
本発明の一実施態様では、上記（Ｂ）は、
そのＮ末端側から、
　（Ｂ－１）配列番号６１（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニンの部分配列、
　（Ｂ－２）配列番号２９のスペーサー配列、
　（Ｂ－３）配列番号５３（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＩＬ－４である、第１のＴ細胞刺激性サイトカイン、
　（Ｂ－４）配列番号２９のスペーサー配列、並びに
　（Ｂ－５）配列番号６３（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニンの部分配列
からなるアミノ酸配列である、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質である。
　本発明の一実施態様では、上記（Ｂ）は、配列番号５５（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）の、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質である。
本発明の一実施態様では、上記（Ｂ）は、
そのＮ末端側から、
　（Ｂ－３）配列番号７３（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＴＧＦ－βである、第１のＴ細胞刺激性サイトカイン、
　（Ｂ－４）配列番号２９のスペーサー配列、及び
　（Ｂ－５）配列番号４９（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＭＦＧ－Ｅ８
からなるアミノ酸配列である、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質である。
　本発明の一実施態様では、上記（Ｂ）は、配列番号７５（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）の、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質である。
第２（又はそれ以上）のＴ細胞刺激性サイトカイン
　本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞は、第１のＴ細胞刺激性サイトカインに加えて、第２（又はそれ以上）のＴ細胞刺激性サイトカインを更に含んでいてもよい。したがって、本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞は、第２のＴ細胞刺激性サイトカインを更に含む。特に、抗原提示可能なＭＨＣ分子が抗原提示可能なＭＨＣクラスＩＩ分子である場合、本明細書中に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞は、第２のＴ細胞刺激サイトカインを含むことが好ましい。
　第２（又はそれ以上）のＴ細胞刺激性サイトカインは、例えば、上記（Ｂ）中に挿入されていてもよい（例えば、（Ｂ－３）の「第１のＴ細胞刺激性サイトカイン」のＮ末端側及び／又はＣ末端側に、必要に応じてスペーサー配列等を介して、第２（又はそれ以上）のＴ細胞刺激性サイトカインが連結されていてもよい）。或いは、第２（又はそれ以上）のＴ細胞刺激性サイトカインは、本明細書中に記載の構成要件（Ｂ）と同様の構成を有することにより、本明細書中に記載の構成要件（Ｂ）のタンパク質（又は融合タンパク質）とは別個のタンパク質（又は融合タンパク質）として、第１のＴ細胞刺激性サイトカインと同様に、本明細書中に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞の膜に含まれていてもよい。
　本発明の一実施態様では、第２のＴ細胞刺激性サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１２又はＴＧＦ－βである。本発明の一実施態様では、第２のＴ細胞刺激性サイトカインが、ＴＧＦ－β（好ましくは、配列番号７３、又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）である。
　本発明の一実施態様では、第１のＴ細胞刺激性サイトカインが、ＩＬ－２又はＩＬ－４（好ましくは、配列番号２５又は配列番号５３、或いはこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）であり、かつ第２のＴ細胞刺激性サイトカインが、ＴＧＦ－β（好ましくは、配列番号７３、又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）である。
　本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ａ）抗原提示ＭＨＣ分子と、細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメインとを含む、該抗原を膜外に提示可能な融合タンパク質又はタンパク質複合体；及び
（Ｂ）第１のＴ細胞刺激性サイトカインと、細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメインとを含む、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質；
を含む、抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞である。
　本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の抗原提示細胞であって、その膜に以下：
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能なタンパク質複合体であって、
　そのＮ末端側から、
　　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　　（Ａ－３）ＭＨＣクラスＩα鎖のアミノ酸配列、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質と、
　　（Ａ－６）β２ミクログロブリンのアミノ酸配列を含む、タンパク質と
を含む、タンパク質複合体；ならびに
（Ｂ）Ｎ末端側から、
　（Ｂ－３）第１のＴ細胞刺激性サイトカインのアミノ酸配列、
　（Ｂ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ｂ－５）ＣＤ８又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質を含む抗原提示細胞である。
　本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ａ）抗原提示ＭＨＣ分子と、テトラスパニン若しくはその膜貫通ドメイン又はＭＦＧ－Ｅ８若しくはそのドメインとを含む、該抗原を膜外に提示可能な融合タンパク質又はタンパク質複合体；及び
（Ｂ）第１のＴ細胞刺激性サイトカインと、テトラスパニンの部分配列とを含む、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質であって、該テトラスパニンの部分配列が、２つの膜貫通ドメインを少なくとも有し、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインが、該２つの膜貫通ドメインの間に配置されている、融合タンパク質、又は
（Ｂ）第１のＴ細胞刺激性サイトカインと、ＭＦＧ－Ｅ８又はそのドメインとを含む、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質；
を含む、抗原提示細胞外小胞である。
　本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能な融合タンパク質であって、そのＮ末端側から、
　（Ａ－１）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ａ－３）単鎖ＭＨＣ分子のアミノ酸配列、
　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質、又は
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能なタンパク質複合体であって、
　そのＮ末端側から、
　　（Ａ－１）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　　（Ａ－３）ＭＨＣクラスＩα鎖、β２ミクログロブリン、ＭＨＣクラスＩＩα鎖、又はＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ酸配列
　　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質と、
　（Ａ－６）β２ミクログロブリン、ＭＨＣクラスＩα鎖、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖、又はＭＨＣクラスＩＩα鎖のアミノ酸配列を含む、タンパク質と
を含む、タンパク質複合体；並びに
（Ｂ）Ｎ末端側から、
　（Ｂ－１）Ｎ末端側から、膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列、
　（Ｂ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ｂ－３）第１のＴ細胞刺激性サイトカインのアミノ酸配列、
　（Ｂ－４）存在していてもよいスペーサー配列、並びに
　（Ｂ－５）膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質、又は
（Ｂ）Ｎ末端側から、
　（Ｂ－３）第１のＴ細胞刺激性サイトカインのアミノ酸配列、
　（Ｂ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ｂ－５）ＭＦＧ－Ｅ８又はその膜結合ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質；
を含む、抗原提示細胞外小胞である。
　本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能な融合タンパク質であって、そのＮ末端側から、
　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ａ－３）単鎖ＭＨＣクラスＩ分子のアミノ酸配列、
　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質
を含む、抗原提示細胞外小胞である。
　本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能なタンパク質複合体であって、
　そのＮ末端側から、
　　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　　（Ａ－３）ＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ酸配列、
　　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質と、
　（Ａ－６）ＭＨＣクラスＩＩα鎖のアミノ酸配列を含む、タンパク質と
を含む、タンパク質複合体；
を含む、抗原提示細胞外小胞である。
　本発明の一実施態様では、第１のＴ細胞刺激性サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５又はＴＧＦ－βである、本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞を提供する。
　本発明の一実施態様では、さらにＴ細胞共刺激分子をその膜外に提示する、本明細書中に記載の細胞外小胞である（図２Ｋ（２）のそのモデルを例示する）。
　　かかる細胞外小胞は、以下の（Ｃ）に規定されるタンパク質を膜に含むことによって、Ｔ細胞共刺激分子を膜外に提示させてもよい。
　あるいは、単離した細胞外小胞にあとから、その膜表面にＴ細胞共刺激分子を付着させてもよい。付着させる方法は特に限定しないが、Ｔ細胞共刺激分子に各々リン脂質を結合し、細胞外小胞の膜にリン脂質部分を取り込ませることにより、膜表面に抗原提示ＭＨＣ分子及びＴ細胞刺激性サイトカインを付着させてもよい。
　本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ｃ）Ｔ細胞共刺激分子を含む、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能なタンパク質；
を含む、抗原提示細胞外小胞である。
構成要件（Ｃ）
　上記（Ｃ）の「Ｔ細胞共刺激分子を含む、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能なタンパク質」は、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能なタンパク質である限り、Ｔ細胞共刺激分子の他に、他のタンパク質又はそのドメイン等を含んでいてもよい。
　本発明の一実施態様では、上記（Ｃ）は、Ｔ細胞共刺激分子と、細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメインとを含む、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能な融合タンパク質である。
　本発明の一実施態様では、上記（Ｃ）は、膜貫通ドメインを含むＴ細胞共刺激分子を含む、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能なタンパク質である。　
　本発明の一実施態様では、上記（Ｃ）は、Ｔ細胞共刺激分子と、テトラスパニン若しくはその膜貫通ドメイン又はＭＦＧ－Ｅ８若しくはそのドメインとを含む、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能な融合タンパク質である。
　本発明の一実施態様では、上記（Ｃ）は、
（Ｃ）そのＮ末端側から、
　（Ｃ－１）Ｔ細胞共刺激分子のアミノ酸配列、
　（Ｃ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ｃ－３）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能な融合タンパク質である。
　本発明の一実施態様では、（Ｃ－１）のＴ細胞共刺激分子が、ＣＤ８０又はＣＤ８６である。本発明の一実施態様では、（Ｃ－１）におけるＴ細胞共刺激分子が、ＣＤ８０（好ましくは、配列番号６７等、又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）である。
　上記（Ｃ－２）の「存在していてもよいスペーサー配列」は、存在する場合、例えば、配列番号５、１１、２９、３９、７７等のスペーサー配列であってもよい。
　本発明の一実施態様では、（Ｃ－３）のテトラスパニンは、ＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１からなる群より選択される。本発明の一実施態様では、（Ｃ－３）におけるテトラスパニンは、ＣＤ９（好ましくは、配列番号２１等、又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）である。
　本発明の一実施態様では、上記（Ｃ）は、
（Ｃ）そのＮ末端側から、
　（Ｃ－１）配列番号６７（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＣＤ８０である、Ｔ細胞共刺激分子のアミノ酸配列、及び
　（Ｃ－３）配列番号２１（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能な融合タンパク質である。
　本発明の一実施態様では、上記（Ｃ）は、配列番号６９（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）の、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能な融合タンパク質である。
　本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能な融合タンパク質であって、そのＮ末端側から、
　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ａ－２）配列番号５のスペーサー配列、
　（Ａ－３）配列番号６５（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）の単鎖ＭＨＣクラスＩ分子のアミノ酸配列、及び
　（Ａ－５）配列番号１５（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質；並びに
（Ｂ）Ｎ末端側から、
　（Ｂ－１）配列番号５７（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニンの部分配列、
　（Ｂ－２）配列番号２９のスペーサー配列、
　（Ｂ－３）配列番号２５（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＩＬ－２である、第１のＴ細胞刺激性サイトカイン、
　（Ｂ－４）配列番号２９のスペーサー配列、及び
　（Ｂ－５）配列番号５９（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニンの部分配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質；
を含む、抗原提示細胞外小胞である。
　本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能な融合タンパク質であって、そのＮ末端側から、
　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ａ－２）配列番号５のスペーサー配列、
　（Ａ－３）配列番号６５（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）の単鎖ＭＨＣクラスＩ分子のアミノ酸配列、及び
　（Ａ－５）配列番号１５（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質；並びに
（Ｂ）配列番号３１（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）の、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質；
を含む、抗原提示細胞外小胞である。
　本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能な融合タンパク質であって、そのＮ末端側から、
　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチド、
　（Ａ－２）配列番号５のスペーサー配列、
　（Ａ－３）配列番号６５（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）の単鎖ＭＨＣクラスＩ分子、及び
　（Ａ－５）配列番号１５（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニン
からなるアミノ酸配列である、融合タンパク質；
（Ｂ）Ｎ末端側から、
　（Ｂ－１）配列番号５７（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニンの部分配列、
　（Ｂ－２）配列番号２９のスペーサー配列、
　（Ｂ－３）配列番号２５（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＩＬ－２である、第１のＴ細胞刺激性サイトカイン、
　（Ｂ－４）配列番号２９のスペーサー配列、及び
　（Ｂ－５）配列番号５９（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニンの部分配列
からなるアミノ酸配列である、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質；並びに
（Ｃ）Ｎ末端側から、
　（Ｃ－１）配列番号６７（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＣＤ８０である、Ｔ細胞共刺激分子、及び
　（Ｃ－３）配列番号２１（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニン
からなるアミノ酸配列である、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能な融合タンパク質；
を含む、抗原提示細胞外小胞である。
　本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能な融合タンパク質であって、そのＮ末端側から、
　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ａ－２）配列番号５のスペーサー配列、
　（Ａ－３）配列番号６５（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）の単鎖ＭＨＣクラスＩ分子のアミノ酸配列、及び
　（Ａ－５）配列番号１５（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質；
（Ｂ）配列番号３１（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）の、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質；並びに
（Ｃ）配列番号６９（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）の、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能な融合タンパク質；
を含む、抗原提示細胞外小胞である。
　本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能なタンパク質複合体であって、
　そのＮ末端側から、
　　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　　（Ａ－２）配列番号３９のスペーサー配列、
　　（Ａ－３）配列番号３７（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ酸配列、及び
　　（Ａ－５）配列番号１５（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質と
　（Ａ－６）配列番号７１（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＭＨＣクラスＩＩα鎖と
からなる、タンパク質複合体；
（Ｂ）Ｎ末端側から、
　（Ｂ－１）配列番号５７（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニンの部分配列、
　（Ｂ－２）配列番号２９のスペーサー配列、
　（Ｂ－３）配列番号２５（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＩＬ－２である、第１のＴ細胞刺激性サイトカインのアミノ酸配列
　（Ｂ－４）配列番号２９のスペーサー配列、及び
　（Ｂ－５）配列番号５９（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニンの部分配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質；並びに
（Ｃ）Ｎ末端側から、
　（Ｃ－１）配列番号６７（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＣＤ８０である、Ｔ細胞共刺激分子のアミノ酸配列、及び
　（Ｃ－３）配列番号２１（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能な融合タンパク質；
を含む、抗原提示細胞外小胞である。
　本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能なタンパク質複合体であって、
　そのＮ末端側から、
　　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　　（Ａ－２）配列番号３９のスペーサー配列、
　　（Ａ－３）配列番号３７（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ酸配列、及び
　　（Ａ－５）配列番号１５（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質と
　（Ａ－６）配列番号７１（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＭＨＣクラスＩＩα鎖と
からなる、タンパク質複合体；
（Ｂ）配列番号３１（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）の、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質のアミノ酸配列；及び
（Ｃ）配列番号６９（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）の、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能な融合タンパク質のアミノ酸配列；
を含む、抗原提示細胞外小胞である。
　本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能なタンパク質複合体であって、
　そのＮ末端側から、
　　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　　（Ａ－２）配列番号３９のスペーサー配列、
　　（Ａ－３）配列番号３７（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ酸配列、及び
　　（Ａ－５）配列番号１５（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質と
　（Ａ－６）配列番号７１（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＭＨＣクラスＩＩα鎖と
からなる、タンパク質複合体；
（Ｂ）Ｎ末端側から、
　（Ｂ－１）配列番号５７（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニンの部分配列、
　（Ｂ－２）配列番号２９のスペーサー配列、
　（Ｂ－３）配列番号２５（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＩＬ－２である、第１のＴ細胞刺激性サイトカインのアミノ酸配列、
　（Ｂ－４）配列番号２９のスペーサー配列、及び
　（Ｂ－５）配列番号５９（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニンの部分配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質；
（Ｂ’）Ｎ末端側から、
　（Ｂ－３）配列番号７３（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＴＧＦ－βである、第２のＴ細胞刺激性サイトカインのアミノ酸配列、
　（Ｂ－４）配列番号２９のスペーサー配列、及び
　（Ｂ－５）配列番号４９（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＭＦＧ－Ｅ８又はその膜結合ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、該第２のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質；並びに
（Ｃ）Ｎ末端側から、
　（Ｃ－１）配列番号６７（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＣＤ８０である、Ｔ細胞共刺激分子のアミノ酸配列、及び
　（Ｃ－３）配列番号２１（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能な融合タンパク質；
を含む、抗原提示細胞外小胞である。
　本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能なタンパク質複合体であって、
　そのＮ末端側から、
　　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　　（Ａ－２）配列番号３９のスペーサー配列、
　　（Ａ－３）配列番号３７（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ酸配列、及び
　　（Ａ－５）配列番号１５（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニン又はその膜結合ドメインのアミノ酸配列、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質と
　（Ａ－６）配列番号７１（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＭＨＣクラスＩＩα鎖と
からなる、タンパク質複合体；
（Ｂ）配列番号３１（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）の、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質；
（Ｂ’）配列番号７５（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）の、該第２のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質；並びに
（Ｃ）配列番号６９（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）の、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能な融合タンパク質；
を含む、抗原提示細胞外小胞である。
　本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能なタンパク質複合体であって、
　そのＮ末端側から、
　　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　　（Ａ－２）配列番号３９のスペーサー配列、
　　（Ａ－３）配列番号３７（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ酸配列、及び
　　（Ａ－５）配列番号１５（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質と
　（Ａ－６）配列番号７１（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＭＨＣクラスＩＩα鎖と
からなる、タンパク質複合体；
（Ｂ）Ｎ末端側から、
　（Ｂ－１）配列番号６１（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニンの部分配列、
　（Ｂ－２）配列番号２９のスペーサー配列、
　（Ｂ－３）配列番号５３（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＩＬ－４である、第１のＴ細胞刺激性サイトカインのアミノ酸配列
　（Ｂ－４）配列番号２９のスペーサー配列、及び
　（Ｂ－５）配列番号６３（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニンの部分配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質；並びに
（Ｃ）Ｎ末端側から、
　（Ｃ－１）配列番号６７（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＣＤ８０である、Ｔ細胞共刺激分子のアミノ酸配列、及び
　（Ｃ－３）配列番号２１（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能な融合タンパク質；
を含む、抗原提示細胞外小胞である。
　本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞であって、その膜に以下：
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能なタンパク質複合体であって、
　そのＮ末端側から、
　　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　　（Ａ－２）配列番号３９のスペーサー配列、
　　（Ａ－３）配列番号３７（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ酸配列、及び
　　（Ａ－５）配列番号１５（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質と
　（Ａ－６）配列番号７１（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＭＨＣクラスＩＩα鎖と
からなる、タンパク質複合体；
（Ｂ）配列番号５５（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）の、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質；及び
（Ｃ）配列番号６９（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）の、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能な融合タンパク質；
を含む、抗原提示細胞外小胞である。
　本発明の一実施態様では、上記（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）について、（Ａ）と（Ｂ）が融合して、１分子となっていてもよいし、（Ｂ）と（Ｃ）が融合して、１分子となっていてもよいし、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）が融合して、１分子となっていてもよい。かかる融合分子は、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）間にスペーサー配列を含む又は含まない形で１つのタンパク質分子として翻訳されていてもよいし、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）のタンパク質が化学的に架橋されること（たとえばシステイン残基間のジスルフィド結合）によって融合して１分子となっていてもよい。
　あるいは、上記（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、そのタンパク質が細胞又は細胞外小胞に局在するための要素、すなわち、「細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」又は「細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」の部分を共有することにより、機能的に融合していてもよい。
　たとえば本発明の一実施態様において、
（Ａ）と（Ｂ）で「細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」又は「細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」部分を共有する形で融合した、
　（１）抗原提示ＭＨＣ分子；
　（２）すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカイン；及び
　（３）「細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」又は「細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」；を含む融合タンパク質（Ｄ）を含んでいてもよいし；
（Ａ）と（Ｃ）で「細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」又は「細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」部分を共有する形で融合した、
　（１）抗原提示ＭＨＣ分子；
　（２）Ｔ細胞共刺激分子；及び
　（３）「細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」又は「細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」；を含む融合タンパク質（Ｆ）を含んでいてもよいし；
（Ｂ）と（Ｃ）で「細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」又は「細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」部分を共有する形で融合した、
　（１）すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカイン；
　（２）Ｔ細胞共刺激分子；及び
　（３）「細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」又は「細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」を含む融合タンパク質（Ｇ）を含んでいてもよいし；
あるいは
（Ａ）～（Ｃ）で「細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」又は「細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」部分を共有する形で融合した、
　（１）抗原提示ＭＨＣ分子；
　（２）すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカイン； 
　（３）Ｔ細胞共刺激分子；及び
　（４）「細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」又は「細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」を含む融合タンパク質（Ｅ）を含んでいてもよい。
　本発明の一実施態様において、構成要件（Ａ）の「細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質」の代わりに、構成要件（Ｂ）の「第１のＴ細胞刺激性サイトカインを含む、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能なタンパク質」を用いて、構成要件（Ａ）と構成要件（Ｂ）の機能を具備した融合タンパク質（Ｄ）を含む細胞又は抗原提示細胞外小胞細胞であってよい。
　かかる構成要件（Ａ）と構成要件（Ｂ）の機能を具備した融合タンパク質（Ｄ）は、
（Ｄ）抗原提示ＭＨＣ分子とすくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカインを含み、該抗原と該Ｔ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質であってもよい。
　前記融合タンパク質は、前記抗原提示ＭＨＣ分子と、前記すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカインと、細胞又は細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメインあるいは細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはその膜結合ドメインとを含んでもよい。
　構成要件（Ａ）と構成要件（Ｂ）の機能を具備した融合タンパク質（Ｄ）において、前記細胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞膜に結合することが可能なタンパク質は、ＣＤ８であってもよいし、膜貫通ドメインを含むＭＨＣ分子がその機能を担ってもよい。
　前記融合タンパク質は、そのＮ末端側から、
　（Ｄ－１）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ｄ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ｄ－３）単鎖ＭＨＣ分子のアミノ酸配列、
　（Ｄ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ｄ－５）ＣＤ８又はその膜貫通ドメインと、前記すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカインを含む融合ペプチドを、
この順番でコードするアミノ酸配列を含んでもよい。
　前記融合タンパク質は、そのＮ末端側から、
　（Ｄ－１）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ｄ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ｄ－３）膜貫通ドメインを含む単鎖ＭＨＣ分子のアミノ酸配列、
　（Ｄ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ｄ－５）すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカインを、
この順番でコードするアミノ酸配列を含んでもよい。
　構成要件（Ａ）と構成要件（Ｂ）の機能を具備した融合タンパク質（Ｄ）において、前記細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質は、テトラスパニン又はＭＦＧ－Ｅ８であってもよい。
　前記融合タンパク質は、そのＮ末端側から、
　（Ｄ－１）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ｄ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ｄ－３）単鎖ＭＨＣ分子のアミノ酸配列、
　（Ｄ－４）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ｄ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインあるいはＭＦＧ－Ｅ８又はその膜貫通ドメインと、前記すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカインを含む融合ペプチドを、この順番でコードするアミノ酸配列を含んでもよい。
　前記融合タンパク質は、そのＮ末端側から、
　（Ｄ－１）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインあるいはＭＦＧ－Ｅ８又はその膜貫通ドメインと、前記すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカインを含む融合ペプチド
　（Ｄ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ｄ－３）単鎖ＭＨＣ分子のアミノ酸配列、
　（Ｄ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ｄ－５）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドを、
この順にコードするアミノ酸配列を含んでもよい。
　ここで、前記融合ペプチドは、そのＮ末端側から、
　　（１）膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列、
　　（２）存在していてもよいスペーサー配列、
　　（３）前記すくなくとも１つのＴ細胞刺激性サイトカインのアミノ酸配列、
　　（４）存在していてもよいスペーサー配列、並びに
　　（５）膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列
をこの順番でコードするアミノ酸配列を含んでもよい。
　前記融合ペプチドは、そのＮ末端側から、
　（１）前記すくなくとも１のＴ細胞刺激性サイトカインのアミノ酸配列、
　（２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（３）ＭＦＧ－Ｅ８又はその膜結合ドメインのアミノ酸配列
をこの順番でコードするアミノ酸配列を含んでもよい。
　本発明の一実施態様において、ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドであり、前記単鎖ＭＨＣ分子が、ＭＨＣクラスＩα鎖の細胞外領域を含んでもよく、前記ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドがＭＨＣクラスＩI分子拘束性抗原ペプチドであり、前記単鎖ＭＨＣ分子が、ＭＨＣクラスＩIα鎖の細胞外ドメイン及び／又はＭＨＣクラスＩIβ鎖の細胞外ドメインを含んでもよい。
　構成要件（Ａ）と構成要件（Ｂ）の機能を具備した融合タンパク質（Ｄ）を含む態様において；
　（Ｃ）すくなくとも１つのＴ細胞共刺激分子を含む、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能なタンパク質をさらにその膜に含んでもよく；
　前記Ｔ細胞と相互作用可能なタンパク質が、前記すくなくとも１つのＴ細胞共刺激分子と、細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメインあるいは細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメインとを含んでもよく；
　前記Ｔ細胞と相互作用可能なタンパク質が、前記すくなくとも１つのＴ細胞共刺激分子と、テトラスパニン若しくはその膜貫通ドメイン又はＭＦＧ－Ｅ８若しくはそのドメインとを含んでもよい。
　前記Ｔ細胞と相互作用可能なタンパク質が、膜貫通ドメインを含む１つのＴ細胞共刺激分子を含んでもよい。
　本発明の一実施態様では、細胞外小胞が、エクソソームである。
　本明細書中に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞は、その膜内又は膜中に、治療上有益でありうる物質（例えば、低分子化合物、核酸等）が包含されていてもよいし、結合されていてもよい。細胞又は細胞外小胞の膜内に該物質を封入する方法は、これらに限定されるものではないが、例えば、該物質と本明細書中に記載の細胞又は細胞外小胞とを好適な溶媒中で混合する方法等が挙げられる。
　本発明の一実施態様では、抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞は、任意のタンパク製剤を含んでもよい。タンパク製剤としては、特に限定しないが、エリスロポエチンなどの天然にも存在しうるタンパク質でも、イムノグロブリン－ＣＴＬＡ４融合タンパクのように天然には存在しない合成タンパク質であってもよく、モノクローナル抗体またはその活性断片でもよい。これらのタンパク製剤は、細胞又は細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメインあるいは細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはその膜結合ドメインとの融合タンパク質として抗原提示細胞外小胞の表面に局在させてもよい。かかる抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞は、融合タンパク質を発現させるためのベクターを；１）任意の細胞にトランスフェクションすることにより抗原提示細胞を作製でき；２）細胞外小胞を産生する細胞にトランスフェクションすることにより抗原提示細胞外小胞を分泌させることができる。
　本明細書中に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞の膜に含まれる各融合タンパク質又はタンパク質複合体あるいはタンパク製剤は、１つ又は複数の検出可能な標識を含んでいてもよい。例えば、融合タンパク質又はタンパク質複合体あるいはタンパク製剤は、従来の方法で、特定のリポータ分子、発蛍光団、放射性材料、又は酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ）等で標識されていてもよい。これらは、例えば、融合タンパク質又はタンパク質複合体あるいはタンパク製剤の構成要素として、該融合タンパク質又はタンパク質複合体あるいはタンパク製剤のＮ末端側又はＣ末端側に連結されていてもよい。
ポリヌクレオチド
　本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞の膜に含まれる（Ａ）及び（Ｂ）、並びに場合により存在する（Ｃ）における各融合タンパク質又はタンパク質複合体をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明の一実施態様では、本明細書中で定義される（Ａ）～（Ｇ）における各融合タンパク質又はタンパク質複合体をコードするポリヌクレオチドを提供する。
　本発明の一実施態様では、
（ａ）　　抗原提示ＭＨＣ分子を含み、該抗原提示ＭＨＣ分子を細胞又は細胞外小胞の膜外に提示可能な融合タンパク質（Ａ）をコードする配列；
（ｂ）　すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む、該Ｔ細胞刺激性サイトカインを細胞又は細胞外小胞の膜外に提示可能な融合タンパク質（Ｂ）をコードする配列；
（ｃ）Ｔ細胞共刺激分子を含む、該Ｔ細胞共刺激分子を細胞又は細胞外小胞の膜外に提示可能な融合タンパク質（Ｃ）をコードする配列；
（ｄ）抗原提示ＭＨＣ分子と、すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカインまたはそのサブユニットを含み、該抗原と該Ｔ細胞刺激性サイトカインを細胞又は細胞外小胞の膜外に提示可能な融合タンパク質（Ｄ）をコードする配列；及び
（ｅ）抗原提示ＭＨＣ分子と、すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカインまたはそのサブユニット及びＴ細胞共刺激分子を含み、該抗原と該Ｔ細胞刺激性サイトカインと該Ｔ細胞共刺激分子を細胞又は細胞外小胞の膜外に提示可能な融合タンパク質（Ｅ）をコードする配列；
からなる群から選択されるすくなくとも１つの配列を含むポリヌクレオチド
を提供する。
　上記配列は（ａ）～（ｅ）は本願明細書に具体的記載された配列及び相同性の高い配列（好ましくは、９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性）を含むが、特に限定しない。同等の機能を有するものであればパラログ（遺伝子重複によって生じた遺伝子配列）やオーソログ（異なる生物に存在する相同な機能を持った遺伝子群）であってもよく、配列情報の改変（不可、欠失、置換など）された配列も含むものとする。
　本明細書中で用いられる「ポリヌクレオチド」は、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子又はＤＮＡ－ＲＮＡキメラ分子等を意味する。ポリヌクレオチドには、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ等、及びこれらの全ての天然に存在するか又は人工的に修飾された誘導体等が含まれる。ポリヌクレオチドは、鎖状であっても、環状であってもよい。
　上述した（Ａ）～（Ｇ）における各融合タンパク質又はタンパク質複合体をコードするポリヌクレオチドは、当業者であれば、上記融合タンパク質又はタンパク質複合体のアミノ酸配列を参考に適宜決定しうる。なお、（Ａ）～（Ｇ）における各融合タンパク質又はタンパク質複合体のアミノ酸配列は、各融合タンパク質又はタンパク質複合体における各構成要素（例えば、（Ａ）の場合であれば、（Ａ－１）～（Ａ－５）、及び場合により（Ａ－６））のアミノ酸配列を参考に適宜決定しうる。ポリヌクレオチドを決定する際に使用されるコドンの種類は、任意のものを選択することができる。例えば、該ポリヌクレオチドを含むベクターを使用して形質転換させる細胞のコドンの頻度等を考慮して、ポリヌクレオチドを決定してもよい。
　上述した（Ａ）～（Ｇ）における各融合タンパク質又はタンパク質複合体をコードするポリヌクレオチドのＮ末端側には、必要に応じてシグナルペプチド（シグナルシークエンス）をコードするポリヌクレオチドを付加してもよい。
　シグナルペプチドのアミノ酸配列は、任意のものを使用することができ、例えば、発現させようとする融合タンパク質のアミノ酸配列等を考慮して決定してもよい。シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、β２ミクログロブリンのシグナルペプチド（例えば、配列番号１）をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号２）、ＭＨＣクラスＩα鎖のシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＭＨＣクラスＩＩα鎖のシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖のシグナルペプチド（例えば、配列番号３３）をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号３４）等が挙げられる。
　上述した（Ａ）～（Ｇ）における各融合タンパク質又はタンパク質複合体の各構成要素（例えば、（Ａ）の場合であれば、（Ａ－１）～（Ａ－５）、及び存在する場合（Ａ－６））、及びシグナルペプチド等のアミノ酸配列、並びにこれらをコードするポリヌクレオチドの情報は、例えば、公知の文献やＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）等のデータベースを検索して適宜入手してもよい。また、テトラスパニンの部分配列（例えば、（Ｃ－１）、（Ｃ－５）における部分配列）におけるアミノ酸配列及びこれをコードするポリヌクレオチドは、国際公開第２０１６／１３９３５４号を参考にしてもよい。
　本発明の一実施態様では、（ａ）は、以下：
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能な融合タンパク質であって、そのＮ末端側から、
　（Ａ－１）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ａ－３）膜貫通ドメインを含む単鎖ＭＨＣ分子のアミノ酸配列、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質をコードする配列を含んでよい。
　本発明の一実施態様では、（ａ）は、以下：
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能なタンパク質複合体であって、
　そのＮ末端側から、
　　（Ａ－１）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　　（Ａ－３）ＭＨＣクラスＩα鎖、β２ミクログロブリンとＭＨＣクラスＩα鎖の融合タンパク質、ＭＨＣクラスＩＩα鎖、又はＭＨＣクラスＩＩβ鎖からなるアミノ酸配列をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質と、
　（Ａ－６）β２ミクログロブリン、ＭＨＣクラスＩα鎖、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖、又はＭＨＣクラスＩＩα鎖のアミノ酸配列を含む、タンパク質と
を含む、タンパク質複合体をコードする配列を含んでよく；ここで翻訳された際、（Ａ－３）と（Ａ－６）が対になってＭＨＣクラスＩ分子又はＭＨＣクラスＩI分子を形成することが好ましい。
　また本発明の一実施態様では、（ａ）は、上記（Ａ－１）～（Ａ―３）からなるアミノ酸配列と（Ａ－６）の配列が
以下の２Ａペプチド配列：
Ｔ２Ａ　：（ＧＳＧ）ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２１１）
Ｐ２Ａ　：（ＧＳＧ）ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２１２）
Ｅ２Ａ　　（ＧＳＧ）ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２１３）
Ｆ２Ａ　　（ＧＳＧ）ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２１４）
のすくなくとも１つを介して、１つの融合タンパク質をコードする配列となった配列を含んでもよい。２Ａペプチド配列はリボソームスキッピングを起こし、融合タンパク質をコードする配列が実際に翻訳された場合、独立した（Ａ－１）～（Ａ―３）からなるアミノ酸配列を含む融合タンパク質と、独立した（Ａ―６）の配列を含むタンパク質が翻訳され、翻訳された２つのタンパク質がＭＨＣクラスＩ分子又はＭＨＣクラスＩI分子を形成することが好ましい。
　本発明の一実施態様では、（ａ）は、
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能な融合タンパク質であって、そのＮ末端側から、
　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ａ－３）膜貫通ドメインを含む単鎖ＭＨＣクラスＩ分子のアミノ酸配列、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、該抗原ペプチドを膜外に提示可能な融合タンパク質をコードする配列を含んでもよく、
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能な融合タンパク質であって、そのＮ末端側から、
　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ａ－３）膜貫通ドメインを含む単鎖ＭＨＣクラスＩＩ分子のアミノ酸配列、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、該抗原ペプチドを膜外に提示可能な融合タンパク質をコードする配列を含んでもよい。
　本発明の一実施態様では、上記（ａ）は、
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能なタンパク質複合体であって、
　そのＮ末端側から、
　　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　　（Ａ－３）β２ミクログロブリンとＭＨＣクラスＩα鎖の融合タンパク質のアミノ酸配列、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含んでもよい。
　本発明の一実施態様では、上記（ａ）は、
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能なタンパク質複合体であって、
　そのＮ末端側から、
　　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　　（Ａ－３）ＭＨＣクラスＩα鎖のアミノ酸配列、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質と、
　（Ａ－６）β２ミクログロブリンのアミノ酸配列を含むタンパク質と
を含む、タンパク質複合体をコードする配列を含んでもよく、（Ａ－１）～（Ａ－３）からなるアミノ酸配列と（Ａ－６）のアミノ酸配列がすくなくとも１つの２Ａペプチド配列を介して、１つの融合タンパク質をコードする配列となった配列を含んでもよい。
　本発明の一実施態様では、上記（ａ）は、
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能なタンパク質複合体であって、
　そのＮ末端側から、
　　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　　（Ａ－３）ＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ酸配列、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質と、
　（Ａ－６）ＭＨＣクラスＩＩα鎖のアミノ酸配列を含む、タンパク質と
を含む、タンパク質複合体をコードする配列を含んでもよく、（Ａ－１）～（Ａ－３）からなるアミノ酸配列と（Ａ－６）のアミノ酸配列がすくなくとも１つの２Ａペプチド配列を介して、１つの融合タンパク質をコードする配列となった配列を含んでもよい。
　また、本発明の一実施態様では、上記（ａ）は、
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能なタンパク質複合体であって、
　そのＮ末端側から、
　　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　　（Ａ－３）ＭＨＣクラスＩＩα鎖のアミノ酸配列、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質と、
　（Ａ－６）ＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ酸配列を含む、タンパク質と
を含む、タンパク質複合体をコードする配列を含んでもよい。
　本発明の一実施態様では、上記（Ａ）は、抗原提示ＭＨＣ分子と、テトラスパニン若しくはその膜貫通ドメイン又はＭＦＧ－Ｅ８若しくはそのドメインとを含む、該抗原を膜外に提示可能な融合タンパク質又はタンパク質複合体である。
　本発明の一実施態様では、上記（ａ）は、
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能な融合タンパク質であって、そのＮ末端側から、
　（Ａ－１）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ａ－３）単鎖ＭＨＣ分子のアミノ酸配列、
　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質をコードする配列を含んでよく、又は
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能なタンパク質複合体であって、
　そのＮ末端側から、
　　（Ａ－１）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　　（Ａ－３）ＭＨＣクラスＩα鎖、β２ミクログロブリン、ＭＨＣクラスＩＩα鎖、又はＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ酸配列
　　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質と、
　（Ａ－６）β２ミクログロブリン、ＭＨＣクラスＩα鎖、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖、又はＭＨＣクラスＩＩα鎖のアミノ酸配列を含む、タンパク質と
を含む、タンパク質複合体をコードする配列を含んでよい。
　本発明の一実施態様では、上記（ａ）は、
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能な融合タンパク質であって、そのＮ末端側から、
　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ａ－３）単鎖ＭＨＣクラスＩ分子のアミノ酸配列、
　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、該抗原ペプチドを膜外に提示可能な融合タンパク質をコードする配列を含んでよい。
　また、本発明の一実施態様では、上記（ａ）は、
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能な融合タンパク質であって、そのＮ末端側から、
　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ａ－３）単鎖ＭＨＣクラスＩＩ分子、のアミノ酸配列
　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
からなるアミノ酸配列を含む、該抗原ペプチドを膜外に提示可能な融合タンパク質をコードする配列を含んでよい。
　本発明の一実施態様では、上記（ａ）は、以下：
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能な融合タンパク質であって、そのＮ末端側から、
　　（Ａ－１）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　　（Ａ－３）ＭＨＣクラスＩα鎖、β２ミクログロブリン、ＭＨＣクラスＩＩα鎖、又はＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ酸配列
　　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質をコードする配列を含んでもよく；
　さらに　
　（Ａ－６）β２ミクログロブリン、ＭＨＣクラスＩα鎖、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖、又はＭＨＣクラスＩＩα鎖のアミノ酸配列をコードする配列を含んでもよい。
　ここで翻訳された際、（Ａ－３）と（Ａ－６）が対になってＭＨＣクラスＩ分子又はＭＨＣクラスＩI分子を形成することが好ましい。
　また本発明の一実施態様では、上記（ａ）は、上記（Ａ－１）～（Ａ―５）からなるアミノ酸配列と（Ａ－６）の配列が
以下の２Ａペプチド配列：
Ｔ２Ａ　：（ＧＳＧ）ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２１１）
Ｐ２Ａ　：（ＧＳＧ）ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２１２）
Ｅ２Ａ　　（ＧＳＧ）ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２１３）
Ｆ２Ａ　　（ＧＳＧ）ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２１４）
のすくなくとも１つを介して、１つの融合タンパク質をコードする配列となった配列を含んでもよい。２Ａペプチド配列はリボソームスキッピングを起こし、融合タンパク質をコードする配列が実際に翻訳された場合、独立した（Ａ－１）～（Ａ―５）からなるアミノ酸配列を含む融合タンパク質と、独立した（Ａ―６）の配列を含むタンパク質が翻訳され、翻訳された２つのタンパク質がＭＨＣクラスＩ分子又はＭＨＣクラスＩI分子を形成することが好ましい。
　本発明の一実施態様では、上記（ａ）はポリヌクレオチドであって、以下：
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能な融合タンパク質であって、そのＮ末端側から、
（Ａ－１）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　　（Ａ－３）ＭＨＣクラスＩα鎖、β２ミクログロブリン、ＭＨＣクラスＩＩα鎖、又はＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ酸配列、
　　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜結合ドメインのアミノ酸配列
　　（Ａ－５．５）２Ａペプチド配列
　　（Ａ－６）β２ミクログロブリン、ＭＨＣクラスＩα鎖、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖、又はＭＨＣクラスＩＩα鎖のアミノ酸配列、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質をコードする配列を含んでもよい。
　本発明の一実施態様では、（ａ）はポリヌクレオチドであって、以下：
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能な融合タンパク質であって、そのＮ末端側から、
　　（Ａ－１）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチド、
　　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　　（Ａ－３）ＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ酸配列、
　　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、
　　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
　　（Ａ－５．５）２Ａペプチド配列、及び
　　（Ａ－６）ＭＨＣクラスＩＩα鎖のアミノ酸配列、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、、融合タンパク質をコードする配列を含んでもよい。かかる態様として実施例のＨＬＡＤＲ－１ｓｃ－ＴＰＩ１－ｈＣＤ８１（アミノ酸配列：配列番号１６５；ポリヌクレオチド配列：配列番号１６６）が例示される。
　本発明の一実施態様では、上記（ａ）は、
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能なタンパク質複合体であって、
　そのＮ末端側から、
　　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　　（Ａ－３）β２ミクログロブリンのアミノ酸配列、
　　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質と、
　（Ａ－６）ＭＨＣクラスＩα鎖のアミノ酸配列を含む、タンパク質と
を含む、タンパク質複合体をコードする配列を含んでもよい。
　また、本発明の一実施態様では、上記（ａ）は、
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能なタンパク質複合体であって、
　そのＮ末端側から、
　　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　　（Ａ－３）ＭＨＣクラスＩα鎖のアミノ酸配列、
　　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、、融合タンパク質と、
　（Ａ－６）β２ミクログロブリンのアミノ酸配列を含む、タンパク質と
を含む、タンパク質複合体をコードする配列を含んでもよい。
　また、本発明の一実施態様では、上記（ａ）は、
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能なタンパク質複合体であって、
　そのＮ末端側から、
　　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　　（Ａ－３）ＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ酸配列、
　　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質と、
　（Ａ－６）ＭＨＣクラスＩＩα鎖のアミノ酸配列を含む、タンパク質と
を含む、タンパク質複合体をコードする配列を含んでもよい。
　また、本発明の一実施態様では、上記（ａ）は、
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能なタンパク質複合体であって、
　そのＮ末端側から、
　　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　　（Ａ－３）ＭＨＣクラスＩＩα鎖のアミノ酸配列、
　　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、、融合タンパク質と、
　（Ａ－６）ＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ酸配列を含む、タンパク質と
を含む、タンパク質複合体をコードする配列を含んでもよい。
　本発明の一実施態様では、（ａ）は、以下：
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能な融合タンパク質であって、そのＮ末端側から、
　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ａ－２）配列番号５のスペーサー配列、
　（Ａ－３）配列番号６５（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）の単鎖ＭＨＣクラスＩ分子のアミノ酸配列、及び
　（Ａ－５）配列番号１５（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質をコードする配列、若しくは
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能なタンパク質複合体を構成する融合タンパク質であって、
　そのＮ末端側から、
　　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　　（Ａ－２）配列番号３９のスペーサー配列、
　　（Ａ－３）配列番号３７（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ酸配列、及び
　　（Ａ－５）配列番号１５（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質をコードする配列を含んでもよい。
　本発明の一実施態様では、（ａ）は、以下：
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能な融合タンパク質であって、そのＮ末端側から、
　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ａ－２）配列番号５のスペーサー配列、
　（Ａ－３）配列番号６５（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）の単鎖ＭＨＣクラスＩ分子のアミノ酸配列、及び
　（Ａ－５）配列番号１５（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質をコードする配列、若しくは
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能なタンパク質複合体を構成する融合タンパク質であって、
　そのＮ末端側から、
　　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　　（Ａ－２）配列番号３９のスペーサー配列、
　　（Ａ－３）配列番号３７（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ酸配列、及び
　　（Ａ－５）配列番号１５（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質をコードする配列を含んでもよい。
　本発明の一実施態様では、（ａ）は、以下：
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能な融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、５’端から
　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドをコードする配列、
　（Ａ－２）配列番号６のスペーサー配列、
　（Ａ－３）配列番号６６（又はこれに対して配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）の単鎖ＭＨＣクラスＩ分子をコードする配列、及び
　（Ａ－５）配列番号１６（又はこれに対して配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニン又はその膜貫通ドメインをコードする配列
をこの順番で含む配列、若しくは
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能なタンパク質複合体を構成する融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、５’端から
　　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチド、
　　（Ａ－２）配列番号４０のスペーサー配列、
　　（Ａ－３）配列番号３８（又はこれに対して配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＭＨＣクラスＩＩβ鎖をコードする配列、及び
　　（Ａ－５）配列番号１６（又はこれに対して配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニン又はその膜貫通ドメインをコードする配列、
をこの順番で含む配列を含んでもよい。
　本発明の一実施態様では、上記（ａ）は、以下：
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能な融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、５’端から
　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチド、
　（Ａ－２）配列番号６のスペーサー配列、
　（Ａ－３）配列番号６６（又はこれに対して配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）の単鎖ＭＨＣクラスＩ分子をコードする配列、及び
　（Ａ－５）配列番号１６（又はこれに対して配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニン又はその膜貫通ドメインをコードする配列
をこの順番で含む配列、若しくは
（Ａ）抗原ペプチドを膜外に提示可能なタンパク質複合体を構成する融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、
　　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチド、
　　（Ａ－２）配列番号４０のスペーサー配列、
　　（Ａ－３）配列番号３８（又はこれに対して配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＭＨＣクラスＩＩβ鎖をコードする配列、及び
　　（Ａ－５）配列番号１６（又はこれに対して配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニン又はその膜貫通ドメインをコードする配列、
をこの順番で含む配列含んでもよい。
　本発明の一実施態様では、上記（ｂ）は、（Ｂ）第１のＴ細胞刺激性サイトカインと、ＣＤ８又はその膜貫通ドメインを含む、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質をコードする配列を含んでもよい。
　本発明の一実施態様では、上記（ｂ）は、
（Ｂ）Ｎ末端側から、
　（Ｂ－３）第１のＴ細胞刺激性サイトカインのアミノ酸配列、
　（Ｂ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ｂ－５）ＣＤ８又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質をコードする配列を含んでもよい。　
　本発明の一実施態様では、上記（ｂ）は、
（Ｂ）第１のＴ細胞刺激性サイトカインと、テトラスパニンの部分配列とを含む、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質であって、該テトラスパニンの部分配列が、２つの膜貫通ドメインを少なくとも有し、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインが、該２つの膜貫通ドメインの間に配置されている、融合タンパク質をコードする配列、又は
（Ｂ）第１のＴ細胞刺激性サイトカインと、ＭＦＧ－Ｅ８又はそのドメインとを含む、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質をコードする配列を含んでもよい。
　本発明の一実施態様では、上記（ｂ）は、
（Ｂ）Ｎ末端側から、
　（Ｂ－１）Ｎ末端側から、膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列、
　（Ｂ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ｂ－３）第１のＴ細胞刺激性サイトカインのアミノ酸配列、
　（Ｂ－４）存在していてもよいスペーサー配列、並びに
　（Ｂ－５）膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質をコードする配列、又は
（Ｂ）Ｎ末端側から、
　（Ｂ－３）第１のＴ細胞刺激性サイトカインのアミノ酸配列、
　（Ｂ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ｂ－５）ＭＦＧ－Ｅ８又はその膜結合ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質をコードする配列を含んでよい。
　本発明の一実施態様では、上記（ｂ）は、
（Ｂ）Ｎ末端側から、
　（Ｂ－１）配列番号５７（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニンの部分配列、
　（Ｂ－２）配列番号２９のスペーサー配列、
　（Ｂ－３）配列番号２５（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＩＬ－２である、第１のＴ細胞刺激性サイトカインのアミノ酸配列、
　（Ｂ－４）配列番号２９のスペーサー配列、及び
　（Ｂ－５）配列番号５９（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニンの部分配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質をコードする配列；
（Ｂ）Ｎ末端側から、
　（Ｂ－１）配列番号６１（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニンの部分配列、
　（Ｂ－２）配列番号２９のスペーサー配列、
　（Ｂ－３）配列番号５３（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＩＬ－４である、第１のＴ細胞刺激性サイトカインのアミノ酸配列、
　（Ｂ－４）配列番号２９のスペーサー配列、及び
　（Ｂ－５）配列番号６３（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニンの部分配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質をコードする配列、若しくは
（Ｂ）Ｎ末端側から、
　（Ｂ－３）配列番号７３（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＴＧＦ－βである、第２のＴ細胞刺激性サイトカインのアミノ酸配列、
　（Ｂ－４）配列番号２９のスペーサー配列、及び
　（Ｂ－５）配列番号４９（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＭＦＧ－Ｅ８又はその膜結合ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、該第２（又は第１）のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質をコードする配列
を含んでよい。
本発明の一実施態様では、上記（ｂ）は、
（Ｂ）第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、５’端から
　（Ｂ－１）配列番号５８（又はこれに対して配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニンの部分配列、
　（Ｂ－２）配列番号３０のスペーサー配列、
　（Ｂ－３）配列番号２６（又はこれに対して配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＩＬ－２である、第１のＴ細胞刺激性サイトカインをコードする配列、
　（Ｂ－４）配列番号３０のスペーサー配列、及び
　（Ｂ－５）配列番号６０（又はこれに対して配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニンの部分配列
をこの順番で含む配列；
（Ｂ）第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、５’端から
　（Ｂ－１）配列番号６２（又はこれに対して配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニンの部分配列、
　（Ｂ－２）配列番号３０のスペーサー配列、
　（Ｂ－３）配列番号５４（又はこれに対して配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＩＬ－４である、第１のＴ細胞刺激性サイトカイン
　（Ｂ－４）配列番号３０のスペーサー配列、及び
　（Ｂ－５）配列番号６４（又はこれに対して配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニンの部分配列；
をこの順番で含む配列；若しくは
（Ｂ）第２（又は第１）のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、５’端から
　（Ｂ－３）配列番号７４（又はこれに対し配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＴＧＦ－βである、第２（又は第１）のＴ細胞刺激性サイトカイン、
　（Ｂ－４）配列番号３０のスペーサー配列、及び
　（Ｂ－５）配列番号５０（又はこれに対して配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＭＦＧ－Ｅ８又はその膜結合ドメインをコードする配列
をこの順番で含む配列；
（Ｂ）配列番号３１、７５若しくは５５（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）の、該第１（又は第２）のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質をコードする配列；
又は
（Ｂ）配列番号３２、７６若しくは５６（又はこれに対して配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）の、該第１（又は第２）のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質をコードする配列を
含んでもよい。
　Ｔ細胞刺激性サイトカインがヘテロなサブユニットの組み合わせにより、機能する場合は、上記（ｂ）において、一方のサブユニットの配列を上記（Ｂ）におけるＴ細胞刺激性サイトカインの配列として用い、残りのサブユニットの配列を別途（ｂ）に含むことが好ましく、その配列が翻訳された場合、（Ｂ）の融合タンパク質と残りのサブユニットにより活性のあるＴ細胞刺激性サイトカインが膜外に形成されることが好ましい。
　本発明の一実施態様において、Ｔ細胞刺激性サイトカインがヘテロなサブユニットの組み合わせにより、機能する場合、（ｂ）は、（Ｂ）の融合タンパク質と残りのサブユニットが融合したタンパク質として翻訳される配列を含んでもよい。
　かかる（Ｂ）の融合タンパク質と残りのサブユニットはスペーサー配列を介して融合してもよいし、２Ａペプチド配列を介して融合していてもよい。
本発明の一実施態様において、（ｂ）は、
（Ｂ）Ｎ末端側から、
　（Ｂ－６）ＩＬ－１２βサブニットのアミノ酸配列
　（Ｂ－７）存在していてもよいスペーサー配列
　（Ｂ－３）ＩＬ－１２αサブニットのアミノ酸配列、
　（Ｂ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ｂ－５）ＣＤ８又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、ＩＬ－１２を細胞の膜外に提示可能な融合タンパク質をコードする配列を含んでよい。
本発明の一実施態様において、（ｂ）は、
（Ｂ）Ｎ末端側から、
　（Ｂ－６）ＩＬ－１２βサブニットのアミノ酸配列
　（Ｂ－７）存在していてもよいスペーサー配列
　（Ｂ－３）ＩＬ－１２αサブニットのアミノ酸配列、
　（Ｂ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ｂ－５）ＭＦＧ－Ｅ８又はその膜結合ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、ＩＬ－１２を細胞外小胞の膜外に提示可能な融合タンパク質をコードする配列を含んでよい。
　かかる態様はｈＩＬ－１２ｓｃ－ＭＦＧｅ８（アミノ酸配列：配列番号１７７；ポリヌクレオチド配列１７８）に例示される。
本発明の一実施態様において、（ｃ）は、
（ｃ）膜貫通ドメインを含むＴ細胞共刺激分子；又は
Ｔ細胞共刺激分子と、テトラスパニン若しくはその膜貫通ドメイン又はＭＦＧ－Ｅ８若しくはそのドメインとを含む融合タンパク質
をコードする配列を含んでよい。
本発明の一実施態様において、（ｃ）は
（Ｃ）Ｎ末端側から、
　（Ｃ－１）Ｔ細胞共刺激分子のアミノ酸配列、
　（Ｃ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ｃ－３）テトラスパニン又はその膜結合ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能な融合タンパク質をコードする配列を含んでよい。
本発明の一実施態様において、（ｃ）は、
（Ｃ）Ｎ末端側から、
　（Ｃ－１）配列番号６７（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＣＤ８０である、Ｔ細胞共刺激分子のアミノ酸配列、及び
　（Ｃ－３）配列番号２１（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能な融合タンパク質をコードする配列を含んでもよい。
　本発明の一実施態様において、（ｃ）は、
（Ｃ）配列番号２３（又はこれに対してアミノ酸配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）の、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能な融合タンパク質をコードする配列を含んでもよい。
　本発明の一実施態様において、（ｃ）は、
（Ｃ）５’端から、
　（Ｃ－１）配列番号６８（又はこれに対して配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のＣＤ８０である、Ｔ細胞共刺激分子をコードする配列、及び
　（Ｃ－３）配列番号２２（又はこれに対して配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）のテトラスパニン又はその膜結合ドメインをコードする配列
をこの順番で含む配列を含んでもよい。
本発明の一実施態様において、（ｃ）は、
（Ｃ）配列番号２４（又はこれに対して配列同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、より更に好ましくは９９％以上のもの）の、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能な融合タンパク質をコードする配列を含んでもよい。
　本発明の一実施態様として、（ｄ）は、
　（Ｄ）前記抗原提示ＭＨＣ分子と、前記すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットと、細胞又は細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメインあるいは細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはその膜結合ドメインとを含む融合タンパク質をコードする配列を含む。
　前記細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質は、テトラスパニン又はＭＦＧ－Ｅ８であってよい。前記細胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞膜に結合することが可能なタンパク質は、ＣＤ８であってもよいし、膜貫通ドメインを含むＭＨＣ分子がその機能を担ってもよい。
　本発明の一実施態様として、（ｄ）は、
（Ｄ）Ｎ末端側から、
　（Ｄ－１）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ｄ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ｄ－３）単鎖ＭＨＣ分子のアミノ酸配列、
　（Ｄ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ｄ－５）ＣＤ８又はその膜貫通ドメインと、前記すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカインを含む融合ペプチドのアミノ酸配列、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質をコードする配列を含んでもよい。
　本発明の一実施態様として、（ｄ）は、
（Ｄ）Ｎ末端側から、
　（Ｄ－１）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ｄ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ｄ－３）膜貫通ドメインを含む単鎖ＭＨＣ分子のアミノ酸配列、
　（Ｄ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ｄ－５）すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカインを含む融合ペプチドのアミノ酸配列、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質をコードする配列を含んでもよい。
　本発明の一実施態様として、（ｄ）は、
　（Ｄ）
Ｎ末端側から、
　（Ｄ－１）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ｄ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ｄ－３）単鎖ＭＨＣ分子のアミノ酸配列、
　（Ｄ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ｄ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインあるいはＭＦＧ－Ｅ８又はその膜貫通ドメインと、前記すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む融合ペプチドのアミノ酸配列、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質をコードする配列を含んでもよい（ここで各構成要素（Ｄ－１）～（Ｄ－５）は本明細書に記載の態様を含む）。
あるいは　本発明の一実施態様として、（ｄ）は、
（Ｄ）Ｎ末端側から、
　（Ｄ－１）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインあるいはＭＦＧ－Ｅ８又はその膜貫通ドメインと、前記すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む融合ペプチドのアミノ酸配列、
　（Ｄ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ｄ－３）単鎖ＭＨＣ分子のアミノ酸配列、
　（Ｄ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ｄ－５）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、融合タンパク質をコードする配列を含んでもよい（ここで各構成要素（Ｄ－１）～（Ｄ－５）は本明細書に記載の態様を含む）。
　この態様において、前記テトラスパニン又はその膜貫通ドメインあるいはＭＦＧ－Ｅ８又はその膜貫通ドメインと、前記すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む融合ペプチドが、
そのＮ末端側から、
　　（１）膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列、
　　（２）存在していてもよいスペーサー配列、
　　（３）前記すくなくとも１つのＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニット、
　　（４）存在していてもよいスペーサー配列、並びに
　　（５）膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列
をこの順番でコードするアミノ酸配列を含んでいてもよく；
あるいは
　前記前記テトラスパニン又はその膜貫通ドメインあるいはＭＦＧ－Ｅ８又はその膜貫通ドメインと、前記すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む融合ペプチドが、
そのＮ末端側から、
　（１）前記すくなくとも１のＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニット、
　（２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（３）ＭＦＧ－Ｅ８又はその膜結合ドメイン
をこの順番でコードするアミノ酸配列を含んでいてもよい。
　ここで、前記ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドであり、前記単鎖ＭＨＣ分子が、ＭＨＣクラスＩα鎖の細胞外領域を含んでいてもよいし；前記ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドがＭＨＣクラスＩI分子拘束性抗原ペプチドであり、前記単鎖ＭＨＣ分子が、ＭＨＣクラスＩIα鎖の細胞外ドメイン及び／又はＭＨＣクラスＩIβ鎖の細胞外ドメインを含んでいてもよい。
　本発明の一実施態様において、前記（ａ）で規定される配列と前記（ｂ）で規定される配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
　さらに前記（ｃ）で規定される配列を含んでいてもよい。
　本発明の一実施態様において、
前記（ｄ）で規定される配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
　かかる配列としては、配列番号１３５のアミノ酸配列をコードする配列番号１３６の核酸配列が例示される。
　かかる態様において、前記（ｃ）で規定される配列を含んでいてもよい。
　本発明の一実施態様において、前記（ｅ）で規定される配列を含むポリヌクレオチドが提供される。
　本発明の一実施態様では、上記（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）について、（Ａ）と（Ｂ）が融合して、1分子となる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであってもよいし、（Ｂ）と（Ｃ）が融合して、1分子となる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであってもよいし、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）が融合して、1分子となる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであってもよい。かかるポリヌクレオチドは、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）間にスペーサー配列を含む又は含まない形の１つの融合タンパク質をコードしていてよい。（Ａ）～（Ｃ）の融合タンパク質をコードする配列は、以下の２Ａペプチド配列：
Ｔ２Ａ　：（ＧＳＧ）ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２１１）
Ｐ２Ａ　：（ＧＳＧ）ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２１２）
Ｅ２Ａ　　（ＧＳＧ）ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２１３）
Ｆ２Ａ　　（ＧＳＧ）ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２１４）
から独立して選択されるすくなくとも１つの配列を介して融合した配列となっていてもよい。２Ａペプチド配列はリボソームスキッピングを起こし、融合タンパク質をコードする配列が実際に翻訳された場合、独立した（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）分子として細胞又は細胞外小胞に存在しうる。
　あるいは、本発明の一実施態様におけるポリヌクレオチドは、上記（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）が、そのタンパク質が細胞又は細胞外小胞に局在するための要素、すなわち、「細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」又は「細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」の部分を共有することにより、機能的に融合した融合タンパク質をコードしていてもよい。
　たとえば本発明の一実施態様において、
（Ａ）と（Ｂ）で「細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」又は「細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」部分を共有する形で融合した、
　（１）抗原提示ＭＨＣ分子；
　（２）すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカイン；及び
　（３）「細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」又は「細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」；を含む融合タンパク質（Ｄ）をコードするポリヌクレオチドであってもよいし；
（Ａ）と（Ｃ）で「細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」又は「細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」部分を共有する形で融合した、
　（１）抗原提示ＭＨＣ分子；
　（２）Ｔ細胞共刺激分子；及び
　（３）「細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」又は「細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」；を含む融合タンパク質（Ｆ）をコードするポリヌクレオチドであってもよいし；
（Ｂ）と（Ｃ）で「細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」又は「細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」部分を共有する形で融合した、
　（１）すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカイン；
　（２）Ｔ細胞共刺激分子；及び
　（３）「細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」又は「細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」；を含む融合タンパク質（Ｇ）をコードするポリヌクレオチドであってもよいし；
あるいは
（Ａ）～（Ｃ）で「細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」又は「細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」部分を共有する形で融合した、
　（１）抗原提示ＭＨＣ分子；
　（２）すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカイン； 
　（２）Ｔ細胞共刺激分子；及び
　（４）「細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」又は「細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」；を含む融合タンパク質（Ｅ）をコードするポリヌクレオチドであってもよい。
　本発明の一実施態様は、構成要件（Ａ）の細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメインあるいは細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質の代わりに、構成要件（Ｂ）の第１のＴ細胞刺激性サイトカインを含む、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能なタンパク質を用いて、構成要件（Ａ）と構成要件（Ｂ）の機能を具備した融合タンパク質（Ｄ）である、
抗原提示ＭＨＣ分子とすくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカインを含み、該抗原と該Ｔ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質
をコードするポリヌクレオチドであってよい。
　かかる構成要件（Ａ）と構成要件（Ｂ）の機能を具備した融合タンパク質（Ｄ）は、
抗原提示ＭＨＣ分子とすくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカインを含み、該抗原と該Ｔ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質であってもよい。
　前記融合タンパク質は、前記抗原提示ＭＨＣ分子と、前記すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカインと、細胞又は細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメインあるいは細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはその膜結合ドメインとを含んでもよい。
　構成要件（Ａ）と構成要件（Ｂ）の機能を具備した融合タンパク質（Ｄ）において、　前記細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質は、テトラスパニン又はＭＦＧ－Ｅ８であってもよい。　
　構成要件（Ａ）と構成要件（Ｂ）の機能を具備した融合タンパク質（Ｄ）において、　前記細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質は、テトラスパニン又はＭＦＧ－Ｅ８であってもよい。
　前記融合タンパク質は、そのＮ末端側から、
　（Ｄ－１）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチド、
　（Ｄ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ｄ－３）単鎖ＭＨＣ分子、
　（Ｄ－４）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ｄ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインあるいはＭＦＧ－Ｅ８又はその膜貫通ドメインと、前記すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカインを含む融合ペプチドを、この順番でコードするアミノ酸配列を含んでもよい。
　前記融合タンパク質は、そのＮ末端側から、
　（Ｄ－１）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインあるいはＭＦＧ－Ｅ８又はその膜貫通ドメインと、前記すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカインを含む融合ペプチド
　（Ｄ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
　（Ｄ－３）単鎖ＭＨＣ分子、
　（Ｄ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（Ｄ－５）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドを、
この順番でコードするアミノ酸配列を含んでもよい。
　ここで、前記融合ペプチドは、そのＮ末端側から、
　　（１）膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列、
　　（２）存在していてもよいスペーサー配列、
　　（３）前記すくなくとも１つのＴ細胞刺激性サイトカイン、
　　（４）存在していてもよいスペーサー配列、並びに
　　（５）膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列
をこの順番でコードするアミノ酸配列を含んでもよい。
　前記融合ペプチドは、そのＮ末端側から、
　（１）前記すくなくとも１のＴ細胞刺激性サイトカイン、
　（２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
　（３）ＭＦＧ－Ｅ８
をこの順番でコードするアミノ酸配列を含んでもよい。
　本発明の一実施態様において、ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドであり、前記単鎖ＭＨＣ分子が、ＭＨＣクラスＩα鎖の細胞外領域を含んでもよく、前記ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドがＭＨＣクラスＩI分子拘束性抗原ペプチドであり、前記単鎖ＭＨＣ分子が、ＭＨＣクラスＩIα鎖の細胞外ドメイン及び／又はＭＨＣクラスＩIβ鎖の細胞外ドメインを含んでもよい。
　構成要件（Ａ）と構成要件（Ｂ）の機能を具備した融合タンパク質（Ｄ）を含む態様において；
　（Ｃ）すくなくとも１つのＴ細胞共刺激分子を含む、該Ｔ細胞共刺激分子とＴ細胞とが相互作用可能なタンパク質をさらにその膜に含んでもよく；
　前記Ｔ細胞と相互作用可能なタンパク質が、前記すくなくとも１つのＴ細胞共刺激分子と、細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメインとを含んでもよく；
　前記Ｔ細胞と相互作用可能なタンパク質が、前記すくなくとも１つのＴ細胞共刺激分子と、テトラスパニン若しくはその膜貫通ドメイン又はＭＦＧ－Ｅ８若しくはそのドメインとを含んでもよい。
ベクター、キット
　本発明の一実施態様では、本明細書中に記載のポリヌクレオチドから選択される少なくとも１種のポリヌクレオチドを含んでなるベクターを提供する。
　本明細書中で用いられる「ベクター」とは、任意のベクター（これらに限定されるものではないが、例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージ等のファージベクター、アデノウイルスベクター、バキュロウイルスベクター等のウイルスベクター、人工染色体ベクター等を含む）を意味する。ベクターは、発現ベクター、クローニングベクター等を含む。発現ベクターは、一般的に、所望のコード配列、及び宿主生物（例えば、植物、昆虫、動物等）又はインビトロでの発現系における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要な適切なポリヌクレオチドを含有していてもよい。クローニングベクターは、所望のポリヌクレオチド断片を操作及び／又は増幅させるために使用してもよい。クローニングベクターは、所望のポリヌクレオチド断片の発現に必要とされる機能的な配列を欠失していてもよい。
　本発明の一実施態様では、本明細書中に記載のポリヌクレオチドは、これらが作動可能に挿入されうる限り、全て同一のベクター内に挿入されていてもよし、２以上のポリヌクレオチドが別個のベクターに挿入されていてもよい。本発明の一実施態様では、本明細書中に記載のポリヌクレオチドから選択される少なくとも１種のポリヌクレオチドを含んでなる２種以上のベクターを組み合わせたキットを提供する。
形質転換細胞
　本発明の一実施態様では、以下：
　（ｉ）本明細書中に記載の（Ａ）の融合タンパク質又はタンパク質複合体をコードするポリヌクレオチド、
　（ｉｉ）本明細書中に記載の（Ｂ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は
　（ｉｉｉ）本明細書中に記載の（Ｃ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含んでなるベクターにより形質転換された細胞を提供する。
　本発明の一実施態様では、以下：
　（ｉ）本明細書中に記載の（Ａ）の融合タンパク質又はタンパク質複合体をコードするポリヌクレオチド、及び
　（ｉｉ）本明細書中に記載の（Ｂ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、並びに、場合により
　（ｉｉｉ）本明細書中に記載の（Ｃ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含んでなる、単一のベクター又は２以上のベクターの組み合わせにより形質転換された細胞を提供する。
　本発明の一実施態様の細胞では、上記（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）について、（Ａ）と（Ｂ）が融合して、1分子となる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、（Ｂ）と（Ｃ）が融合して、1分子となる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、あるいは（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）が融合して、1分子となる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換されていてもよい。かかるポリヌクレオチドは、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）間にスペーサー配列を含む又は含まない形の１つの融合タンパク質をコードしていてよい。
　あるいは、上記（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、そのタンパク質が細胞外小胞に局在するための要素、すなわち、「細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」又は「細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」の部分を共有することにより、機能的に融合した融合タンパク質をコードしていてもよい。
　たとえば本発明の一実施態様において、
（Ａ）と（Ｂ）で「細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」又は「細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」部分を共有する形で融合した、
　（１）抗原提示ＭＨＣ分子；
　（２）すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカイン；及び
　（３）「細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」又は「細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」；を含む融合タンパク質（Ｄ）をコードするポリヌクレオチドを含むベクター；
（Ａ）と（Ｃ）で「細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」又は「細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」部分を共有する形で融合した、
　（１）抗原提示ＭＨＣ分子；
　（２）Ｔ細胞共刺激分子；及び
　（３）「細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」又は「細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」；を含む融合タンパク質（Ｆ）をコードするポリヌクレオチドを含むベクター；
（Ｂ）と（Ｃ）で「細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」又は「細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」部分を共有する形で融合した、
　（１）すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカイン；
　（２）Ｔ細胞共刺激分子；及び
　（３）「細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」又は「細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」；を含む融合タンパク質（Ｇ）をコードするポリヌクレオチドを含むベクター；
あるいは
（Ａ）～（Ｃ）で「細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」又は「細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」部分を共有する形で融合した、
　（１）抗原提示ＭＨＣ分子；
　（２）すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカイン； 
　（３）Ｔ細胞共刺激分子；及び
　（４）「細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン」又は「細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン」；を含む融合タンパク質（Ｅ）をコードするポリヌクレオチドを含むベクター
で形質転換されていてもよい。
　あるいは、本発明の一実施態様では、
　（ｉｖ）構成要件（Ａ）の細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質の代わりに、構成要件（Ｂ）の第１のＴ細胞刺激性サイトカインを含む、該第１のＴ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能なタンパク質を用いて、構成要件（Ａ）と構成要件（Ｂ）の機能を具備した融合タンパク質である、
本明細書中に記載の（Ｄ）の抗原提示ＭＨＣ分子とすくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカインを含み、該抗原と該Ｔ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含むベクターにより形質転換された細胞を提供する。
　「単一のベクター又は２以上のベクターの組み合わせにより形質転換された」とは、例えば、細胞が、上記（ｉ）～（ｉｖ）のポリヌクレオチドが全て同一のベクター内に挿入されたものにより形質転換されてもよいし、これらのうち２以上が別個のベクターに挿入された２以上のベクターの組み合わせにより形質転換されてもよいことを意味する。
　「単一のベクター又は２以上のベクターの組み合わせ」としては、（Ａ）が融合タンパク質である場合、例えば、以下のものが挙げられる：
　・（Ａ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（Ｂ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクター；
　・（Ａ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターと、（Ｂ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターとの組み合わせ；
　・（Ａ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、（Ｂ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（Ｃ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクター；
　・（Ａ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（Ｂ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターと、（Ｃ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターとの組み合わせ；
　・（Ａ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（Ｃ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターと、（Ｂ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターとの組み合わせ；
　・（Ｂ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（Ｃ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターと、（Ａ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターとの組み合わせ；又は
　・（Ａ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターと、（Ｂ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターと、（Ｃ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターとの組み合わせ。
　或いは、「単一のベクター又は２以上のベクターの組み合わせ」としては、（Ａ）がタンパク質複合体である場合、例えば、以下のものが挙げられる：
　・（Ａ－１）～（Ａ－５）からなるアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、（Ａ－６）を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（Ｂ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクター；
　・（Ａ－１）～（Ａ－５）からなるアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（Ａ－６）を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターと、（Ｂ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターとの組み合わせ；
　・（Ａ－１）～（Ａ－５）からなるアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（Ｂ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターと、（Ａ－６）を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターとの組み合わせ；
　・（Ａ－１）～（Ａ－５）からなるアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターと、（Ａ－６）を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（Ｂ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターとの組み合わせ；
　・（Ａ－１）～（Ａ－５）からなるアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターと、（Ａ－６）を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターと、（Ｂ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターとの組み合わせ；
　・（Ａ－１）～（Ａ－５）からなるアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、（Ａ－６）を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド、（Ｂ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（Ｃ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクター；
　・（Ａ－１）～（Ａ－５）からなるアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、（Ａ－６）を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（Ｂ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターと、（Ｃ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターとの組み合わせ；
　・（Ａ－１）～（Ａ－５）からなるアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、（Ｂ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（Ｃ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターと、（Ａ－６）を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターとの組み合わせ；
　・（Ａ－６）を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド、（Ｂ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（Ｃ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターと、（Ａ－１）～（Ａ－５）からなるアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターとの組み合わせ；
　・（Ａ－１）～（Ａ－５）からなるアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、（Ａ－６）を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（Ｃ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターと、（Ｂ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターとの組み合わせ；
　・（Ａ－１）～（Ａ－５）からなるアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（Ａ－６）を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターと、（Ｂ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（Ｃ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターとの組み合わせ；
　・（Ａ－１）～（Ａ－５）からなるアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（Ｂ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターと、（Ａ－６）を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（Ｃ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターとの組み合わせ；
　・（Ａ－１）～（Ａ－５）からなるアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（Ｃ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターと、（Ａ－６）を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（Ｂ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターとの組み合わせ；
　・（Ａ－１）～（Ａ－５）からなるアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターと、（Ａ－６）を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターと、（Ｂ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（Ｃ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターとの組み合わせ；
　・（Ａ－１）～（Ａ－５）からなるアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターと、（Ｂ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターと、（Ａ－６）を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（Ｃ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターとの組み合わせ；
　・（Ａ－１）～（Ａ－５）からなるアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターと、（Ｃ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターと、（Ａ－６）を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（Ｂ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターとの組み合わせ；
　・（Ａ－６）を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターと、（Ｂ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターと、（Ａ－１）～（Ａ－５）からなるアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（Ｃ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターとの組み合わせ；
　・（Ａ－６）を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターと、（Ｃ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターと、（Ａ－１）～（Ａ－５）からなるアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（Ｂ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターとの組み合わせ；
　・（Ｂ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターと、（Ｃ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターと、（Ａ－１）～（Ａ－５）からなるアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（Ａ－６）を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターとの組み合わせ；又は
　・（Ａ－１）～（Ａ－５）からなるアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターと、（Ａ－６）を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターと、（Ｂ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターと、（Ｃ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターとの組み合わせ。
　形質転換させる細胞は、形質転換させた後に本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞を得ることができるものである限り特段限定されるものではなく、初代培養細胞であっても、継代細胞であっても、株化細胞であってもよく、これらは正常細胞であっても、ガン化又は腫瘍化した細胞を含む病変細胞であってもよい。また、形質転換させる細胞の由来は、特段限定されるものではないが、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄類、イヌ、ネコ等の食肉目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類等の哺乳動物等の動物由来の細胞；植物由来の細胞；昆虫由来の細胞等が挙げられる。形質転換させる細胞としては、好ましくは動物由来の細胞である。動物由来の細胞としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞等を含む）、ヒトＦＬ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＣＯＳ－７、Ｖｅｒｏ、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３等が挙げられる。
　細胞を形質転換させる方法は、細胞に目的のポリヌクレオチドを導入しうる方法であれば特に限定されるものではない。例えば、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、カチオン性脂質法、リポソームを使用する方法、ポリエチレンイミン等の非リポソーム性のものを使用する方法、ウイルス感染法等であってもよい。
　形質転換された細胞は、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）及び／又は（Ｇ）の融合タンパク質又はタンパク質複合体を、一過性に発現する形質転換細胞であってもよいし、安定的に発現する形質転換細胞（安定細胞株）であってもよい。
　形質転換された細胞の培養条件は、特段限定されるものではない。例えば、形質転換された細胞が動物由来の細胞である場合、例えば、細胞培養等に一般に使用されている培地（例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）、Ｈａｍ Ｆ１２培地、又はこれらの任意の組み合わせ等）、又はこれにウシ胎児血清、抗生物質、アミノ酸等の他の成分を添加した培地等を使用し、例えば、約１～約１０％（好ましくは約２～約５％）ＣＯ２の存在下、約３０～約４０℃（好ましくは約３７℃）で、所望の時間（例えば、約０．５時間～約２４０時間（好ましくは、約５～約１２０時間、より好ましくは、約１２～約７２時間））、培養（例えば、静置下又は振盪下）してもよい。
　形質転換された細胞を培養して得られてなる培養上清中には、本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞が含まれうる。そのため、本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞を得る目的で形質転換細胞を培養する際、必要に応じて、エクソソーム等の細胞外小胞を除去した培地（例えば、エクソソームを除去した約１～約５％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地等）を用いてもよい。
培養上清
　本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の形質転換された細胞を培養して得られてなる、培養上清を提供する。
　本明細書中に記載の培養上清中に含まれる抗原提示細胞外小胞は、例えば、該培養上清を精製（例えば、遠心分離、クロマトグラフィー等）、濃縮、単離等をすることにより、より回収することができる。
　本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の培養上清から得られてなる、抗原提示細胞外小胞を提供する。
本明細書中に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞を製造するための方法
　本明細書中に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞は、これらに限定されるものではないが、例えば、当業者に公知の遺伝子組み換え技術等の手段により（例えば、以下に記載の方法により、若しくは実施例に記載の方法により、又はこれらに類似する方法により）、得てもよい。
　通常の遺伝子組み換え技術により、上述した（Ａ）及び（Ｂ）（あるいは（Ａ）と（Ｂ）の代わりに（Ｄ））、並びに場合により（Ｃ）のタンパク質をそれぞれコードするポリヌクレオチドを得（あるいは（Ａ）～（ａ）～（ｄ）、これらを同一の又は別個のベクターに作動可能に挿入することができる。（Ａ）及び（Ｂ）（あるいは（Ａ）と（Ｂ）の代わりに（Ｄ））、並びに場合により（Ｃ）のタンパク質をそれぞれコードするポリヌクレオチドのうちの２種以上を同一のベクターに挿入する場合、それぞれが同一の又は別個のプロモーターに作動可能に連結されていてもよい。
　得られた単一の又は２以上の抗原提示細胞用のベクターを、細胞に同時に又は逐次的に形質転換させ、抗原提示細胞（これら融合タンパク質を、一過性に発現する形質転換細胞であってもよいし、安定的に発現する形質転換細胞（安定株）であってもよい）を得ることができる。
　得られた単一の又は２以上の抗原提示細胞外小胞用のベクターを、細胞に同時に又は逐次的に形質転換させ、形質転換細胞（これら融合タンパク質を、一過性に発現する形質転換細胞であってもよいし、安定的に発現する形質転換細胞（安定株）であってもよい）を得ることができる。得られた形質転換細胞を所望の条件下で培養して培養上清を得、得られた培養上清を必要に応じて精製（例えば、遠心分離、抗体（例えば、細胞外小胞の膜に含まれるタンパク質等を認識する抗体）、クロマトグラフィー、フローサイトメトリー等を用いた精製）、濃縮（例えば、限外濾過等）、乾燥等することで、本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞を得ることができる。
　或いは、上述した（Ａ）及び（Ｂ）（あるいは（Ａ）と（Ｂ）の代わりに（Ｄ））、並びに場合により（Ｃ）のタンパク質として、可溶性のものを用いる場合、例えば、以下の方法により本明細書中に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞を得てもよい。
　上述した（Ａ）及び（Ｂ）（あるいは（Ａ）と（Ｂ）の代わりに（Ｄ））、並びに場合により（Ｃ）を可溶性のタンパク質として、通常の遺伝子組み換え技術によって得たものか、又は市販のものを用いる。次に、所望の細胞から、例えば、公知の方法により若しくは本明細書中に記載の方法により、又はこれらに類似する方法により、細胞又は細胞外小胞を得る。次に、得られた細胞又は細胞外小胞と、上述の可溶性のタンパク質の１種以上とを、所望の溶媒中、所望の条件下で反応させる（例えば、特開２０１８－１０４３４１号公報等に記載の方法を参考にしてもよい）。この操作を、（Ａ）及び（Ｂ）（あるいは（Ａ）と（Ｂ）の代わりに（Ｄ））、並びに場合により（Ｃ）の可溶性のタンパク質が、細胞外小胞の膜に含まれるまで、条件を適宜変更しながら実施することで、本明細書中に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞を得ることができる。
　或いは、上述した（Ａ）及び（Ｂ）（あるいは（Ａ）と（Ｂ）の代わりに（Ｄ））、並びに場合により（Ｃ）のタンパク質として、可溶性のものを用いる場合、例えば、以下の方法により本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞を得てもよい。
　上述した（Ａ）及び（Ｂ）（あるいは（Ａ）と（Ｂ）の代わりに（Ｄ））、並びに場合により（Ｃ）の可溶性のタンパク質として、それらのＮ末端側又はＣ末端側に所望のタグ（例えば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、配列番号７９のＰＮＥタグ等が挙げられ、これらは全て同じタグであってもよいし、全て異なる種類のタグであってもよい）を付加したものを、通常の遺伝子組み換え技術によって得る。次に、所望の細胞から、例えば、公知の方法により若しくは本明細書中に記載の方法により、又はこれらに類似する方法により、細胞又は細胞外小胞を得、これに該タグに対する抗体又はその抗原結合性フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ若しくはナノボディ、例えば、配列番号８３の抗ＰＮＥタグナノボディ）等を、必要に応じてペプチドリンカー等を介して結合させるか；或いは、通常の遺伝子組み換え技術によって、細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質又はその膜貫通ドメインのＮ末端側又はＣ末端側に該タグに対する抗体又はその抗原結合性フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ若しくはナノボディ）等が結合した融合タンパク質（例えば、配列番号８９の、抗ＰＮＥタグナノボディ（配列番号８３）とＣＤ８ａ（配列番号８５）とＣＤ８１（配列番号１５）との融合タンパク質等）をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号８８、９０等）を得、これをベクターに作動可能に挿入したものを用いて細胞に形質転換させることで、形質転換細胞（融合タンパク質を、一過性に発現する形質転換細胞であってもよいし、安定的に発現する形質転換細胞（安定株）であってもよい）を得、得られた形質転換細胞を培養等し、上述した方法等により細胞外小胞を回収する。タグが付加した可溶性の（Ａ）及び（Ｂ）、並びに場合により（Ｃ）のタンパク質と、該タグに対する抗体又はその抗原結合性フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ若しくはナノボディ）等を含むタンパク質を膜に含む細胞外小胞とを、所望の条件で混合することで、本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞を得てもよい。
　あるいは、上述した（Ａ）～（Ｇ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを組み合わせて用いて形質転換を行い、得られた形質転換細胞から、明細書中に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞を得てもよい。
　あるいは、上述した方法のうちの２以上を組み合わせた方法により、本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞を得てもよい。
　本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞は、例えば、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング等の手法により、（Ａ）及び（Ｂ）（あるいは（Ａ）と（Ｂ）の代わりに（Ｄ））、並びに場合により（Ｃ）のタンパク質が膜に含まれていることを確認してもよい。
　本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞を製造するための方法であって、本明細書中に記載の形質転換された細胞を培養して得られてなる培養上清を回収することを含む、方法を提供する。
　本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞を製造するための方法であって、
　（ｉ）本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞用の（Ａ）の融合タンパク質又はタンパク質複合体をコードするポリヌクレオチド、及び
　（ｉｉ）本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞用の（Ｂ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、並びに、場合により
　（ｉｉｉ）本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞用の（Ｃ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含んでなる、単一のベクター又は２以上のベクターの組み合わせを、細胞に同時又は逐次的に（好ましくは、同時に）形質転換させることと、
　得られた形質転換細胞を培養して得られてなる培養上清を回収することと
を含む、方法を提供する。
　あるいは、本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞を製造するための方法であって、
　（ｉｖ）本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞用の（Ｄ）の抗原提示ＭＨＣ分子とすくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカインを含み、該抗原と該Ｔ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
場合により
　（ｉｉｉ）本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞用の（Ｃ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含んでなる、単一のベクター又は２以上のベクターの組み合わせを、細胞に同時又は逐次的に（好ましくは、同時に）形質転換させることと、
　得られた形質転換細胞を培養して得られてなる培養上清を回収することと
を含む、方法を提供する。
　あるいは、本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞を製造するための方法であって、
　（ｖ）本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞用の（Ｅ）の抗原提示ＭＨＣ分子とすくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカインとＴ細胞共刺激分子を含み、該抗原と該Ｔ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含んでなる、ベクターを、細胞に形質転換させることと、
　得られた形質転換細胞を培養して得られてなる培養上清を回収することと
を含む、方法を提供する。
　本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の抗原提示細胞を製造するための方法を提供する。
　本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の抗原提示細胞を製造するための方法であって、
　（ｉ）本明細書中に記載の抗原提示細胞用の（Ａ）の融合タンパク質又はタンパク質複合体をコードするポリヌクレオチド、及び
　（ｉｉ）本明細書中に記載の抗原提示細胞用の（Ｂ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、並びに、場合により
　（ｉｉｉ）本明細書中に記載の抗原提示細胞用の（Ｃ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含んでなる、単一のベクター又は２以上のベクターの組み合わせを、細胞に同時又は逐次的に（好ましくは、同時に）形質転換させること
を含む、方法を提供する。
　あるいは、本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の抗原提示細胞を製造するための方法であって、
　（ｉｖ）本明細書中に記載の抗原提示細胞用の（Ｄ）の抗原提示ＭＨＣ分子とすくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカインを含み、該抗原と該Ｔ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
場合により
　（ｉｉｉ）本明細書中に記載の抗原提示細胞用の（Ｃ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含んでなる、単一のベクター又は２以上のベクターの組み合わせを、細胞に同時又は逐次的に（好ましくは、同時に）形質転換させること
を含む、方法を提供する。
　あるいは、本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞を製造するための方法であって、
　（ｖ）本明細書中に記載の抗原提示細胞用の（Ｅ）の抗原提示ＭＨＣ分子とすくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカインとＴ細胞共刺激分子を含み、該抗原と該Ｔ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含んでなる、ベクターを、細胞に形質転換させること
を含む、方法を提供する。
　本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の培養上清から得られてなる抗原提示細胞外小胞を提供する。
　本発明の一実施態様では、抗原提示細胞外小胞であって、以下：
　（ｉ）本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞用の（Ａ）の融合タンパク質又はタンパク質複合体をコードするポリヌクレオチド、及び
　（ｉｉ）本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞用の（Ｂ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、並びに、場合により
　（ｉｉｉ）本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞用の（Ｃ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含んでなる、単一のベクター又は２以上のベクターの組み合わせを、細胞に同時又は逐次的に（好ましくは、同時に）形質転換させることと、
　得られた形質転換細胞を培養して得られてなる培養上清を回収することと
を含む方法により得られる、抗原提示細胞外小胞を提供する。
　あるいは、本発明の一実施態様では、抗原提示細胞外小胞であって、以下：
　（ｉｖ）本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞用の（Ｄ）の抗原提示ＭＨＣ分子とすくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカインを含み、該抗原と該Ｔ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
場合により
　（ｉｉｉ）本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞用の（Ｃ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含んでなる、単一のベクター又は２以上のベクターの組み合わせを、細胞に同時又は逐次的に（好ましくは、同時に）形質転換させることと、
　得られた形質転換細胞を培養して得られてなる培養上清を回収することと
を含む方法により得られる、抗原提示細胞外小胞を提供する。
　あるいは、本発明の一実施態様では、抗原提示細胞外小胞であって、以下：
　（ｖ）本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞用の（Ｅ）の抗原提示ＭＨＣ分子とすくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカインとＴ細胞共刺激分子を含み、該抗原と該Ｔ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、細胞に形質転換させることと、
　得られた形質転換細胞を培養して得られてなる培養上清を回収することと
を含む方法により得られる、抗原提示細胞外小胞を提供する。
　本発明の一実施態様では、抗原提示細胞であって、以下：
　（ｉ）本明細書中に記載の抗原提示細胞用の（Ａ）の融合タンパク質又はタンパク質複合体をコードするポリヌクレオチド、及び
　（ｉｉ）本明細書中に記載の抗原提示細胞用の（Ｂ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、並びに、場合により
　（ｉｉｉ）本明細書中に記載の抗原提示細胞用の（Ｃ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含んでなる、単一のベクター又は２以上のベクターの組み合わせを、細胞に同時又は逐次的に（好ましくは、同時に）形質転換させること、
を含む方法により得られる、抗原提示細胞を提供する。
　あるいは、本発明の一実施態様では、抗原提示細胞であって、以下：
　（ｉｖ）本明細書中に記載の抗原提示細胞用の（Ｄ）の抗原提示ＭＨＣ分子とすくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカインを含み、該抗原と該Ｔ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
場合により
　（ｉｉｉ）本明細書中に記載の（Ｃ）の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含んでなる、単一のベクター又は２以上のベクターの組み合わせを、細胞に同時又は逐次的に（好ましくは、同時に）形質転換させること
を含む方法により得られる、抗原提示細胞を提供する。
　あるいは、本発明の一実施態様では、抗原提示細胞であって、以下：
　（ｖ）本明細書中に記載の抗原提示細胞用の（Ｅ）の抗原提示ＭＨＣ分子とすくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカインとＴ細胞共刺激分子を含み、該抗原と該Ｔ細胞刺激性サイトカインを膜外に提示可能な融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、細胞に形質転換させること
を含む方法により得られる、抗原提示細胞を提供する。
組成物、用途
　本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の抗原提示細胞、抗原提示細胞外小胞、ポリヌクレオチド及び／又はこれを含むベクター、並びに／又は形質転換細胞及び／又はその培養上清、を含む組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞、又は本明細書中に記載の培養上清を含む医薬組成物を提供する。
　本明細書中に記載の組成物（例えば、医薬組成物）は、これらに限定されるものではないが、例えば、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、ｐＨ調整剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、界面活性剤等の添加剤を含むことができる。これら添加剤の種類、その使用量等は、目的に応じて当業者が適宜選択しうる。医薬組成物として用いる場合、これらの添加剤は薬理学的に許容できる担体であることが好ましい。さらに、本明細書中に記載の組成物がポリヌクレオチドを含む場合、必須ではないが、核酸のＤＤ（ドラッグデリバリー）に適した担体を含むことが好ましく、これらの担体として脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）及びポリマー（たとえばＰＥＩ）が挙げられる。
　本明細書中に記載の組成物（例えば、医薬組成物）は、上述した添加剤と共に、自体公知の方法により、例えば、錠剤、被覆錠剤、口腔内崩壊錠、チュアブル剤、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、液剤（例えば、シロップ剤、注射剤、ローション剤等を含む）、懸濁剤、乳剤、ゼリー剤、貼付剤、軟膏剤、クリーム剤、吸入剤、坐剤等に製剤化することができる。これらは、経口剤であってもよいし、非経口剤であってもよい。製剤化されたものは、その目的に応じて、有益な他の成分（例えば、治療上有益な他の成分）を更に含んでいてもよい。
　本発明の一実施態様である組成物は、試験例が示すように、特定の抗原に対して獲得免疫（細胞性免疫及び/又は液性免疫）を増強することは可能であり、抗原として感染病原体（病原菌やウイルス等）由来のペプチドを用いれば、感染病原体によって引き起こされる感染症を処置又は予防するための医薬組成物として使用できる。 
　また、本発明の一実施態様である組成物は、試験例が示すように、炎症性サイトカインの誘導を可能にし、自然免疫を活性化（好中球、単球、マクロファージなどを動員、活性化して病原菌などを食菌させることを含む）することにより、感染病原体を排除することが可能であり、感染病原体によって引き起こされる感染症を処置又は予防するための医薬組成物として使用できる。
　本明細書中に記載の抗原提示細胞、抗原提示細胞外小胞（好ましくは、膜にＭＨＣクラスＩ拘束性抗原ペプチド及びＭＨＣクラスＩ分子を含む抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞）、そのポリヌクレオチド及び／又はこれを含むベクター、並びに／又は形質転換細胞及び／又はその培養上清、或いはこれらを含む組成物（例えば、医薬組成物）は、ガンを処置又は予防するために有用でありうる。
　したがって、本発明の一実施態様では、ガンを処置又は予防するための、本明細書中に記載の抗原提示細胞、抗原提示細胞外小胞、ポリヌクレオチド及び／又はこれを含むベクター、並びに／又は形質転換細胞及び／又はその培養上清、或いはこれらを含む組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。試験例が示すように、本発明の一実施態様である抗原提示細胞外小胞等は、用いる抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の増殖・活性化をすることが可能であり、用いる抗原として腫瘍関連抗原ペプチドを用いれば、増殖・活性化した細胞傷害性Ｔ細胞がガン細胞を認識して攻撃することにより、ガン細胞を死滅させることができる。
　本発明の別の実施態様では、ガンを処置又は予防するための医薬を製造するための、本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞、ポリヌクレオチド及び／又はこれを含むベクター、並びに／又は形質転換細胞及び／又はその培養上清、或いはこれらを含む組成物（例えば、医薬組成物）の使用を提供する。
　本発明の別の実施態様では、ガンを処置又は予防するための方法であって、これを必要とする被験体に、有効量の本明細書中に記載の抗原提示細胞外小胞、ポリヌクレオチド及び／又はこれを含むベクター、並びに／又は形質転換細胞及び／又はその培養上清、或いはこれらを含む組成物を投与することを含む、方法を提供する。
　ガンとしては、何れの固形ガン及び血液ガンが含まれ、これらに限定されるものではないが、例えば、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、乳ガン、食道ガン、胃ガン、小腸ガン、大腸ガン、結腸ガン、直腸ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、骨髄ガン、腎臓ガン（腎細胞ガン等を含む）、副甲状腺ガン、副腎ガン、尿管ガン、肝ガン、胆管ガン、子宮頸ガン、卵巣ガン（例えば、その組織型が、漿液性腺ガン、粘液性腺ガン、明細胞腺ガン等）、精巣ガン、膀胱ガン、外陰部ガン、陰茎ガン、甲状腺ガン、頭頸部ガン、頭蓋咽頭ガン、咽頭ガン、舌ガン、皮膚ガン、メルケル細胞ガン、黒色腫（悪性黒色腫等）、上皮ガン、扁平上皮細胞ガン、基底細胞ガン、小児ガン、原発不明ガン、繊維肉腫、粘膜肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原生肉腫、脊索腫、血管肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、精上皮腫、ウィルムス腫瘍、脳腫瘍、神経膠腫、膠芽腫、星状細胞腫、骨髄芽腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、髄芽腫、網膜芽細胞腫、脊椎腫瘍、悪性リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫等）、慢性又は急性リンパ球性白血病、成人Ｔ細胞白血病等が挙げられる。
　本発明の一実施態様において、ガンを処置又は予防するために、免疫チェックポイント阻害薬を併用することができる。免疫チェックポイント阻害薬を、同時又は順次患者に投与してもよいし、本発明に係る医薬に含まれていてもよい。
　免疫チェックポイント阻害薬としては、ＰＤ－１阻害剤（たとえば、ニブルマブ、ぺムブロリジマブなどの抗ＰＤ－１抗体）、ＣＴＬＡ－４阻害剤（たとえばイピリムマブなどの抗ＣＴＬＡ－４抗体）、ＰＤ－Ｌ１阻害剤（たとえばデュルバルマブ、アテゾリズマブ、アベルマブなどの抗ＰＤ－Ｌ１抗体）などが例示されるがこれに限定されない。免疫チェックポイント阻害薬が抗体又はその活性断片の場合、その抗体又はその活性断片を、細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはその膜結合ドメインと結合させて、本発明に係る細胞外小胞の膜上に存在させてもよい。
　かかる免疫チェックポイント阻害剤の併用は、ガン細胞に対する細胞傷害性を増強する。
　本明細書中に記載の抗原提示細胞、抗原提示細胞外小胞（好ましくは、膜上にＭＨＣクラスＩＩ拘束性抗原ペプチド及びＭＨＣクラスＩＩ分子を含む抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞）、そのポリヌクレオチド及び／又はこれを含むベクター、並びに／又は形質転換細胞及び／又はその培養上清、或いはこれらを含む組成物は、自己免疫疾患を処置又は予防するために有用でありうる。試験例が例示するように、本発明の一実施態様である抗原提示細胞外小胞は、用いる抗原特異的な制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖・活性化をすることが可能であり、用いる抗原として自己抗原ペプチドを用いれば、増殖・活性化したＴｒｅｇが自己抗原に対する免疫寛容を引き起こし、自己免疫疾患を処置又は予防できる。
　したがって、本発明の一実施態様では、自己免疫疾患を処置又は予防するための、本明細書中に記載の抗原提示細胞、抗原提示細胞外小胞、ポリヌクレオチド及び／又はこれを含むベクター、並びに／又は形質転換細胞及び／又はその培養上清、或いはこれらを含む組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。
　本発明の別の実施態様では、自己免疫疾患を処置又は予防するための医薬を製造するための、本明細書中に記載の抗原提示細胞、抗原提示細胞外小胞、ポリヌクレオチド及び／又はこれを含むベクター、並びに／又は形質転換細胞及び／又はその培養上清、或いはこれらを含む組成物（例えば、医薬組成物）の使用を提供する。
　本発明の別の実施態様では、自己免疫疾患を処置又は予防するための方法であって、これを必要とする被験体に、有効量の本明細書中に記載の抗原提示細胞、抗原提示細胞外小胞、ポリヌクレオチド及び／又はこれを含むベクター、並びに／又は形質転換細胞及び／又はその培養上清、或いはこれらを含む組成物を投与することを含む、方法を提供する。
　自己免疫疾患としては、これらに限定されるものではないが、例えば、喘息、乾癬、全身性エリテマトーデス、ギランバレー症候群、シェーグレン症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、バセドウ病、橋本甲状腺炎、Ｉ型糖尿病、クローン病、炎症性腸疾患、関節リウマチ等が挙げられる。
　本明細書中に記載の抗原提示細胞、抗原提示細胞外小胞（好ましくは、膜上にＭＨＣクラスＩＩ拘束性抗原ペプチド及びＭＨＣクラスＩＩ分子を含む抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞）、そのポリヌクレオチド及び／又はこれを含むベクター、並びに／又は形質転換細胞及び／又はその培養上清、或いはこれらを含む組成物（例えば、医薬組成物）は、アレルギー性疾患を処置又は予防するために有用でありうる。試験例が示すように、本発明の一実施態様である抗原提示細胞外小胞等は、用いる抗原特異的な制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖・活性化をすることが可能であり、用いる抗原としてアレルゲンを用いれば、増殖・活性化したＴｒｅｇがアレルゲンに対する免疫寛容を引き起こし、アレルギー疾患を処置又は予防できる。
　したがって、本発明の一実施態様では、アレルギー性疾患を処置又は予防するための、本明細書中に記載の抗原提示細胞、抗原提示細胞外小胞、ポリヌクレオチド及び／又はこれを含むベクター、並びに／又は形質転換細胞及び／又はその培養上清、或いはこれらを含む組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。
　本発明の別の実施態様では、アレルギー性疾患を処置又は予防するための医薬を製造するための、本明細書中に記載の抗原提示細胞、抗原提示細胞外小胞、ポリヌクレオチド及び／又はこれを含むベクター、並びに／又は形質転換細胞及び／又はその培養上清、或いはこれらを含む組成物（例えば、医薬組成物）の使用を提供する。
　本発明の別の実施態様では、アレルギー性疾患を処置又は予防するための方法であって、これを必要とする被験体に、有効量の本明細書中に記載の抗原提示細胞、抗原提示細胞外小胞、ポリヌクレオチド及び／又はこれを含むベクター、並びに／又は形質転換細胞及び／又はその培養上清、或いはこれらを含む組成物を投与することを含む、方法を提供する。
　アレルギー性疾患としては、これらに限定されるものではないが、例えば、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性喘息、アレルギー性結膜炎、アレルギー性胃腸炎、食物アレルギー、薬物アレルギー、蕁麻疹等が挙げられる。
　上述した各種疾患を処置又は予防する対象となる被験体は、これらに限定されるものではないが、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類；ウサギ等のウサギ目；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄類；イヌ、ネコ等の食肉目；ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類；等の哺乳動物等の動物、或いは植物が挙げられるが、好ましくは動物であり、より好ましくはげっ歯類又は霊長類であり、更に好ましくはマウス又はヒトである。
　本明細書中に記載の抗原提示細胞、抗原提示細胞外小胞、ポリヌクレオチド及び／又はこれを含むベクター、並びに／又は形質転換細胞及び／又はその培養上清、或いはこれらを含む組成物又はこれを製剤化したものの投与量は、投与する被験体の性別、年齢、体重、健康状態、病状の程度若しくは食事；投与時間；投与方法；他の薬物との組み合わせ；その他の要因を考慮して適宜決定することができる。
特異的な抗原に対するＴ細胞を活性化、増殖及び／又は分化等させるための方法
　本明細書中に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでＴ細胞（これらに限定されるものではないが、例えば、末梢血、脾臓等から得られたＴ細胞又はＴ細胞集団）と接触することで、特異的な抗原に対するＴ細胞を活性化、増殖、分化等させることができうる。
　本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の抗原提示細胞又は抗原提示細胞外小胞とＴ細胞とをｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏにおいて接触させることを含む、特異的な抗原に対するＴ細胞を活性化、増殖及び／又は分化させるための方法を提供する。
　本発明の一実施態様では、前述した方法によって得られる、Ｔ細胞を提供する。
　上記した方法により得られたＴ細胞を、疾患（例えば、ガン、自己免疫疾患、アレルギー性疾患等）を処置及び／又は予防するために、被験体に投与してもよい。
　以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、これら実施例は、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
プラスミドの調製１
　ｐＣＡＧ－ｐｕｒｏベクターを使用し、抗原を膜外に提示可能なＭＨＣクラスＩ分子を細胞外小胞の膜上に発現させるためのベクターを作製した。
　確立されたクローニング技術によって、β２ミクログロブリンのシグナルペプチド（アミノ酸 １～２０；配列番号１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２）、モデル抗原ペプチドであるＯＶＡペプチド（配列番号３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４）、ペプチドリンカー（アミノ酸配列：配列番号５、ポリヌクレオチド：配列番号６）、シグナルペプチドを除いたβ２ミクログロブリンの全長配列（アミノ酸 ２１～１１９；配列番号７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号８）、ペプチドリンカー（配列番号１１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１２）、及びシグナルペプチドを除いたＭＨＣクラスＩα鎖の全長配列（アミノ酸 ２２～３６９；配列番号９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１０）からなる、シングルチェーントライマー（ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ）を作製した（アミノ酸配列：配列番号１３；ポリヌクレオチド：配列番号１４）。次に、ｓｃ－ＴｒｉｍｅｒとテトラスパニンであるＣＤ８１の全長配列（アミノ酸 １～２３６；配列番号１５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１６）とを連結したポリヌクレオチド（配列番号１８；対応するアミノ酸配列：配列番号１７）をｐＣＡＧ－ｐｕｒｏベクターに挿入した（図１Ａ、１Ｂ：以下、ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ＣＤ８１）。
　同様の方法により、Ｔ細胞共刺激分子の一つであるＣＤ８０を細胞外小胞の膜上に発現させるため、ＣＤ８０の全長配列（アミノ酸 １～３０６；配列番号１９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２０）とテトラスパニンであるＣＤ９の全長の全長配列（アミノ酸 １～３０６；配列番号２１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２２）とを連結したポリヌクレオチド（配列番号２４；対応するアミノ酸配列：配列番号２３）をｐＣＡＧ－ｐｕｒｏ又はｐＭＸベクターに挿入した（図１Ｃ、１Ｄ：以下、ＣＤ８０－ＣＤ９）。
　同様の方法により、Ｔ細胞刺激性サイトカインの一つであるＩＬ－２を細胞外小胞の膜上に発現させるため、ＩＬ－２のシグナルペプチドを除いた全長配列（アミノ酸 ２１～１６９；配列番号２５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２６）を、テトラスパニンであるマウスＣＤ６３（アミノ酸 １～２３８：配列番号２７；ポリヌクレオチド：配列番号２８）の大型細胞外ループ中にあるアミノ酸１７０Ｃと１７１Ｉの間に挿入した（即ち、配列番号５７のＣＤ６３の部分配列をコードするポリヌクレオチド（配列番号５８）と、配列番号５９のＣＤ６３の部分配列をコードするポリヌクレオチド（配列番号６０）との間に、ＩＬ－２の配列を挿入した）。なお、ＩＬ－２のＮ末端側及びＣ末端側にはそれぞれ、ペプチドリンカー（アミノ酸配列 ＧＧＧＧＳ：配列番号２９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３０）を付加した。このポリヌクレオチド（配列番号３２；対応するアミノ酸配列：配列番号３１）をｐＣＡＧ－ｐｕｒｏベクターに挿入した（図１Ｅ、１Ｆ：以下、ＣＤ６３－ＩＬ－２）。
プラスミドの調製２：
　ｐＣＡＧ－ｐｕｒｏベクターを使用し、抗原を膜外に提示可能なＭＨＣクラスＩＩ分子を細胞外小胞の膜上に発現させるためのベクターを作製した。
　確立されたクローニング技術によって、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖のシグナルペプチド（アミノ酸 １～２７；配列番号３３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３４）、モデル抗原ペプチドであるＯＶＡペプチド（配列番号３５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３６）及びシグナルペプチドを除いたＭＨＣクラスＩＩβ鎖の全長配列（アミノ酸 ２８～２６５；配列番号３７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３８）をペプチドリンカー（配列番号３９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４０）で繋ぎ、シングルチェーンダイマー（ｓｃ－Ｄｉｍｅｒ）を作製した（アミノ酸配列：配列番号４１；ポリヌクレオチド：配列番号４２）。次に、ｓｃ－ＤｉｍｅｒとテトラスパニンであるＣＤ８１の全長配列（アミノ酸 １～２３６；配列番号１５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１６）とを連結したポリヌクレオチド（配列番号４４；対応するアミノ酸配列：配列番号４３）をｐＣＡＧ－ｐｕｒｏベクターに挿入した（図１Ｇ、１Ｈ：以下、ｓｃ－Ｄｉｍｅｒ－ＣＤ８１）。
　ＭＨＣクラスＩＩ分子の構成要素であるＭＨＣクラスＩＩα鎖の全長配列（アミノ酸 １～２５６；配列番号４５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４６）を別のｐＣＡＧ－ｐｕｒｏベクターに挿入した（図１Ｉ：以下、ＭＨＣクラスＩＩα鎖）。
　同様の方法により、Ｔ細胞刺激性サイトカインの一つであるＴＧＦ－β１を細胞外小胞の膜上に発現させるため、ＬＡＰドメインの３３、２２３、２２５番目の３つのＣをＳに変更したＴＧＦ－β１の全長配列（アミノ酸 １～３９０；配列番号４７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４８）と、８９番目のＤをＥに変更したＭＦＧ－Ｅ８のシグナルペプチドを除いた全長配列（アミノ酸 ２３～４６３；配列番号４９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号５０）とを、ペプチドリンカー（配列番号２９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３０）を介して連結させた。このポリヌクレオチド（配列番号５２；対応するアミノ酸配列：配列番号５１）をｐＣＡＧ－ｐｕｒｏベクターに挿入した（図１Ｊ、１Ｋ：以下、ＴＧＦ－β－ＭＦＧ－Ｅ８）。
　同様の方法により、Ｔ細胞刺激性サイトカインの一つであるＩＬ－４を細胞外小胞の膜上に発現させるため、ＩＬ－４のシグナルペプチドを除いた全長配列（アミノ酸 ２１～１４０；配列番号５３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号５４）を、テトラスパニンであるマウスＣＤ８１（アミノ酸 １～２３６：配列番号１５；ポリヌクレオチド：配列番号１６）の大型細胞外ループ中にあるアミノ酸１７７Ｓと１７８Ｇの間に挿入した（即ち、配列番号６１のＣＤ８１の部分配列をコードするポリヌクレオチド（配列番号６２）と、配列番号６３のＣＤ８１の部分配列をコードするポリヌクレオチド（配列番号６４）との間に、ＩＬ－４の配列を挿入した）。なお、ＩＬ－４のＮ末端側及びＣ末端側にはそれぞれ、ペプチドリンカー（アミノ酸配列 ＧＧＧＧＳ；配列番号２９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３０）を付加した。このポリヌクレオチド（配列番号５６；対応するアミノ酸配列：配列番号５５）をｐＣＡＧ－ｐｕｒｏベクターに挿入した（図１Ｌ、１Ｍ：以下、ＣＤ８１－ＩＬ－４）。
プラスミドの調製３：
ｓｃ－Ｄｉｍｅｒ－ＣＤ８１―ＩＬ―１２ｐ４０
　上記ｓｃ－Ｄｉｍｅｒに、ＣＤ８１とＴ細胞刺激性サイトカインであるＩＬ－１２のサブユニットであるＩＬ－１２ｐ４０を融合させたタンパク質（配列番号９１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号９２）をｐＣＡＧ－ｐｕｒｏベクターに挿入して、融合タンパク質を発現するベクターを調製した。
ＩＬ―１２ｐ３５
　ＩＬ－１２のもう１つのサブユニットであるＩＬ―１２ｐ３５（配列番号９７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号９８）をｐＣＡＧ－ｐｕｒｏ又はｐＭＸベクターに挿入して、に挿入して、ＩＬ―１２ｐ３５を発現するベクターを調製した。
ＣＤ８１―ＩＬ―６
　　Ｔ細胞刺激性サイトカインの一つであるＩＬ－６を細胞外小胞の膜上に発現させるため、ＩＬ－６のシグナルペプチドを除いた全長配列（配列番号９９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１００）を、テトラスパニンであるＣＤ８１の細胞外ループをコードするポリヌクレオチド中に導入して、ＣＤ８１－ＩＬ－６融合タンパク質（配列番号１０１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１０２）をｐＣＡＧ－ｐｕｒｏ又はｐＭＸベクターに挿入して、に挿入して、融合タンパク質を発現するベクターを調製した。
ｈＣＤ８０－ｈＣＤ９
　Ｔ細胞共刺激分子の一つであるヒトＣＤ８０を細胞外小胞の膜上に発現させるため、ヒトＣＤ８０と、テトラスパニンであるヒトＣＤ９との融合タンパク質（配列番号１０７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１０８）をｐＣＡＧ－ｐｕｒｏ又はｐＭＸベクターに挿入して、融合タンパク質を発現するベクターを調製した。
ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ＣＤ８１―ＩＬ―２
　Ｔ細胞刺激性サイトカインの一つであるＩＬ－２を細胞外小胞の膜上に発現させるため、上記ＣＤ８１―ＩＬ―４と同様に、ＣＤ８１－ＩＬ２の融合ペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製し、そのポリヌクレオチド配列とｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－をコードするヌクレオチドを結合して、ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ＣＤ８１―ＩＬ―２（配列番号１３５）をコードするポリヌクレオチドを（配列番号１３６）作製し、ｐＣＡＧ－ｐｕｒｏ又はｐＭＸベクターに挿入して、融合タンパク質を発現するベクターを調製した。
ｈｓｃ―Ｔｒｉｍｅｒ―ｈＣＤ８１
　上記ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ＣＤ８１をヒトの遺伝子配列（ＭＨＣ－Ｉの配列としてＨＬＡ－Ａ２４０２を用いた）を用いて、ｈｓｃ―Ｔｒｉｍｅｒ―ｈＣＤ８１（配列番号１３１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１３２）を作製し、ｐＣＡＧ－ｐｕｒｏ又はｐＭＸベクターに挿入して、融合タンパク質を発現するベクターを調製した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ｈＣＤ８１
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチド(アミノ酸配列：配列番号１４１；ポリヌクレオチド配列：配列番号１４２))を抗原とし、ＭＨＣ分子としてＨＬＡ－Ａ０２０１を用いて、抗原提示ＭＨＣ分子（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ;アミノ酸配列：配列番号１４７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１４８）を作製し、さらにｈＣＤ８１をコードするポリヌクレオチドと結合させて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ｈＣＤ８１（配列番号１４９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１５０）を作製した。作製したポリヌクレオチドをｐＣＡＧ－ｐｕｒｏ又はｐＭＸベクターに挿入して、融合タンパク質を発現するベクターを調製した。
ｈＣＤ６３－ｈＩＬ－２
　上記ＣＤ６３－ＩＬ－２を、ヒト遺伝子配列を用いて作製した。ｈＣＤ６３－ｈＩＬ－２（配列番号１１５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１１６）を作製し、ｐＣＡＧ－ｐｕｒｏ又はｐＭＸベクターに挿入して、融合タンパク質を発現するベクターを調製した。
ＣＤ６３―Ａｋａｌｕｃ
　陰性対照として、ＣＤ６３とＡｋａｌｕｃルシフェラーゼを融合させ、細胞外小胞にAlkaLuc融合タンパク質（配列番号１３９）を局在させるためのポリヌクレオチド（配列番号１４０）を作製し、ｐＣＡＧ－ｐｕｒｏ又はｐＭＸベクターに挿入して、融合タンパク質を発現するベクターを調製した。
プラスミドの調製４：
ＨＬＡＤＲ－１ｓｃ－ＴＰＩ１－ｈＣＤ８１、
　ＨＬＡ　ＤＲ１β鎖のシグナル配列（アミノ酸配列：配列番号１５１；ポリヌクレオチド配列：番号１５２）とＴＰＩ－１ペプチドの配列（アミノ酸配列：配列番号１５３；ポリヌクレオチド配列：番号１５４）とＨＬＡ　ＤＲ１β鎖の配列（アミノ酸配列：配列番号１５５；ポリヌクレオチド配列：番号１５６）を結合し、ＴＰＩ－１ペプチドを提示するＨＬＡ　ＤＲ１β鎖をコードする配列を作製した。その配列にｈＣＤ８１の配列（アミノ酸配列：配列番号１５９；ポリヌクレオチド配列：番号１６０）をつなげた。さらにＰ２Ａ配列（アミノ酸配列：配列番号１６１；ポリヌクレオチド配列：番号１６２）を介して、ＨＬＡ　ＤＲ１α鎖の配列（アミノ酸配列：配列番号１６３；ポリヌクレオチド配列：番号１６４）を結合させ、細胞外小胞の膜外にＴＰＩ－１ペプチドを提示するためのポリヌクレオチドを作製した。作製したポリヌクレオチドをｐＣＡＧ－ｐｕｒｏ又はｐＭＸベクターに挿入して、融合タンパク質ＨＬＡＤＲ－１ｓｃ－ＴＰＩ１－ｈＣＤ８１（アミノ酸配列：配列番号１６５；ポリヌクレオチド配列：番号１６６）を発現するベクターを調製した。かかる配列から転写されたｍＲＮＡから、２ＡペプチドであるＰ２Ａの働きにより、ＴＰＩ－１ペプチドを提示するＨＬＡ　ＤＲ１β鎖とｈＣＤ８１の融合タンパク質とＨＬＡ　ＤＲ１α鎖が翻訳され、両者が結合して、細胞外小胞の膜にＴＰＩ－１ペプチドを提示するＭＨＣ分子が存在することになる。
ｈＩＬ－１２ｓｃ－ＭＦＧｅ８
　ＩＬ－１２βサブユニットをコードする配列（アミノ酸配列：配列番号１６７；ポリヌクレオチド配列：番号１６７）にリンカーの配列（アミノ酸配列：配列番号１６９；ポリヌクレオチド配列：番号１７０）を介してＩＬ－１２βサブユニットをコードする配列（アミノ酸配列：配列番号１７１；ポリヌクレオチド配列：番号１７２）を連結させ、ＩＬ－１２をコードする配列を作製し、その配列をリンカーの配列（アミノ酸配列：配列番号１７３；ポリヌクレオチド配列：番号１７４）を介してＭＦＧｅ８の配列（アミノ酸配列：配列番号１７５；ポリヌクレオチド配列：番号１７６）を連結し、ＩＬ－１２を細胞外小胞に発現させるためのポリヌクレオチドを作製した。作製したポリヌクレオチドをｐＣＡＧ－ｐｕｒｏ又はｐＭＸベクターに挿入して、融合タンパク質ｈＩＬ－１２ｓｃ－ＭＦＧｅ８（アミノ酸配列：配列番号１７７；ポリヌクレオチド配列：番号１７８）を発現するベクターを調製した。
ＴＰＩ－１ペプチド特異的ＴＣＲとＶｅｎｕｓの融合タンパク質
　ＴＰＩ特異的ＴＣＲβ鎖の配列（アミノ酸配列：配列番号１７９；ポリヌクレオチド配列：番号１８０）をＰ２Ａの配列（アミノ酸配列：配列番号１８１；ポリヌクレオチド配列：番号１８２）を介してＴＣＲαの配列（アミノ酸配列：配列番号１８３；ポリヌクレオチド配列：番号１８４）に連結し、さらにその３端側にＰ２Ａの配列（アミノ酸配列：配列番号１８５；ポリヌクレオチド配列：番号１８６）を介してＶｅｎｕｓ蛍光タンパク質の配列（アミノ酸配列：配列番号１８７；ポリヌクレオチド配列：番号１８８）を連結してＴＰＩ－１ペプチド特異的ＴＣＲとＶｅｎｕｓの融合タンパク質（アミノ酸配列：配列番号１８９；ポリヌクレオチド配列：番号１９０）をコードするポリヌクレオチドを作製した。作製したポリヌクレオチドをｐＣＡＧ－ｐｕｒｏ又はｐＭＸベクターに挿入して、ＴＰＩ－１ペプチド特異的ＴＣＲとＶｅｎｕｓの融合タンパク質を発現するベクターを調製した。
プラスミドの調製５：
ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－Ｔ２Ａ－ＩＬ－２－ＣＤ８－Ｐ２Ａ－ＣＤ８０
　ｐＥＴ―１５ｂベクターを使用し、細胞膜上に、抗原提示ＭＨＣクラスＩ分子、ＩＬ－２、及びＣＤ８０を発現させるためのｍＲＮＡの作製用のベクターを作製した。
　上記と同様の方法で作製したｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒの配列（アミノ酸配列：配列番号１９１；ポリヌクレオチド配列：配列番号１９２）と；
　Ｔ２Ａの配列（アミノ酸配列：配列番号１９３、ポリヌクレオチド配列：配列番号１９４）；
　ＩＬ―２を細胞膜上に発現させるための融合タンパク質であり、ＩＬ－２（アミノ酸配列：配列番号１９５、ポリヌクレオチド：配列番号１９６）とリンカー配列（アミノ酸配列：配列番号１９７、ポリヌクレオチド：配列番号１９８）とＣＤ８の部分配列（膜貫通ドメインを含む；アミノ酸配列：配列番号１９９、ポリヌクレオチド：配列番号２００）の融合タンパク質をコードする配列；
　Ｐ２Ａの配列（アミノ酸配列：配列番号２０１、ポリヌクレオチド配列：配列番号２０２）；及び
　ＣＤ８０をコードする配列（アミノ酸配列：配列番号２０３、ポリヌクレオチド配列：配列番号２０４）
　を連結させてｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－Ｔ２Ａ－ＩＬ－２－ＣＤ８－Ｐ２Ａ－ＣＤ８０をコードする配列（アミノ酸配列：配列番号２０５、ポリヌクレオチド配列：配列番号２０６）を作製した（図１Ｐ）。かかる配列から転写されたｍＲＮＡから、２ＡペプチドであるＴ２ＡとＰ２Ａの働きにより、ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒを含む膜タンパク質、ＩＬ－２－ＣＤ８を含む膜タンパク質、及びＣＤ８０を含む膜タンパク質が翻訳され、１つの細胞の細胞膜上の存在することになる。
　対照として、ＣＤ８１（アミノ酸配列：配列番号２０７、ポリヌクレオチド配列：配列番号２０８）をコードするｍＲＮＡを転写するプラスミド；完全長のＯＶＡのアミノ酸配列：配列番号２０９、ポリヌクレオチド配列：配列番号２１０）みをコードするｍＲＮＡを転写するプラスミドを作製した。
プラスミドの調製６：
ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－Ｔ２Ａ－ＩＬ－１５ｓａ－Ｐ２Ａ－ＣＤ８０
　細胞膜上に、抗原提示ＭＨＣクラスＩ分子、ＩＬ－１５スーパーアゴニスト（以下ＩＬ－１５ｓａ：ＩＬ－１５とＩＬ－１５受容体のｓｕｓｈｉドメインの複合体）、及びＣＤ８０を発現させるためのｍＲＮＡの作製用の発現ベクターを作製した。
　上記と同様の方法で、Ｎ端から
　β２ミクログロブリンのシグナルペプチド（アミノ酸配列：配列番号２１５；ポリヌクレオチド配列：配列番号２１６）；
　ＯＶＡペプチド（アミノ酸配列：配列番号２１７；ポリヌクレオチド配列：配列番号２１８）；
　リンカー（アミノ酸配列：配列番号２１９；ポリヌクレオチド配列：配列番号２２０）；
　シグナルペプチドを除去したβ２ミクログロブリン（アミノ酸配列：配列番号２２１；ポリヌクレオチド配列：配列番号２２２）；
　リンカー（アミノ酸配列：配列番号２２３；ポリヌクレオチド配列：配列番号２２４）；
　ＭＨＣクラスＩα鎖（シグナルペプチド除去）（アミノ酸配列：配列番号２２５；ポリヌクレオチド配列：配列番号２２６）；
　Ｔ２Ａの配列（アミノ酸配列：配列番号２２７；ポリヌクレオチド配列：配列番号２２８）；
　ＴｆＲ（トランスフェリン受容体１）のＮ端ペプチド（アミノ酸配列：配列番号２２９；ポリヌクレオチド配列：配列番号２３０）；
　リンカー（アミノ酸配列：配列番号２３１；ポリヌクレオチド配列：配列番号２３２）；
　ＩＬ－１５Ｒα　ｓｕｓｈｉドメイン（アミノ酸配列：配列番号２３３；ポリヌクレオチド配列：配列番号２３４）；
 リンカー（アミノ酸配列：配列番号２３５；ポリヌクレオチド配列：配列番号２３６）；
　ＩＬ－１５（アミノ酸配列：配列番号２３７；ポリヌクレオチド配列：配列番号２３８）；
　ＦＬＡＧ（アミノ酸配列：配列番号２３９；ポリヌクレオチド配列：配列番号２４０）；
　Ｐ２Ａの配列（アミノ酸配列：配列番号２４１；ポリヌクレオチド配列：配列番号２４２）；及び
　ＣＤ８０（アミノ酸配列：配列番号２４３；ポリヌクレオチド配列：配列番号２４４）をこの順番で連結して、ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－Ｔ２Ａ－ＩＬ－１５ｓａ－Ｐ２Ａ－ＣＤ８０をコードする配列（アミノ酸配列：配列番号２４５、ポリヌクレオチド配列：配列番号２４６）を作製した（図２４（ａ））。かかる配列から転写されたｍＲＮＡから、２ＡペプチドであるＴ２ＡとＰ２Ａの働きにより、ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒを含む膜タンパク質、ＩＬ－１５ｓａを含む膜タンパク質（２型膜貫通タンパク質であるＴｆＲの働きにより、Ｃ末側に融合したＩＬ－１５ｓａが細胞膜表面に提示される）、及びＣＤ８０を含む膜タンパク質が翻訳され、１つの細胞の細胞膜上の存在することになる。
プラスミドの調製７：
　ＯＶＡペプチドの代わりにネオアンチゲン（ガン抗原）であるＧｔｆ２iペプチド（アミノ酸配列：配列番号２７９、ポリヌクレオチド配列：配列番号２８０；非特許文献３）を提示するｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ（Ｇｔｆ２ｉ）－Ｔ２Ａ－ＩＬ－２－ＣＤ８－Ｐ２Ａ－ＣＤ８０をコードする配列を作製した（アミノ酸配列：配列番号２８１、ポリヌクレオチド配列：配列番号２８２）（図２４（ｂ））。
プラスミドの調製８：
ＯＶＡｐ－ＭＨＣＩＩβ－Ｐ２Ａ－ＭＨＣＩＩα－Ｔ２Ａ－ＩＬ－１２ｓｃ－ＣＤ８－Ｐ２Ａ－ＣＤ８０
　細胞膜上に、抗原提示ＭＨＣクラスＩＩ分子、ＩＬ－１２ｓｃ、及びＣＤ８０を発現させるためのｍＲＮＡの作製用の発現ベクターを作製した。
　上記と同様の方法で、Ｎ端から
　ＭＨＣクラスＩＩβ鎖のシグナルペプチド（アミノ酸配列：配列番号２４７；ポリヌクレオチド配列：配列番号２４８）；
　ＯＶＡペプチド（アミノ酸配列：配列番号２４９；ポリヌクレオチド配列：配列番号２５０）；
　リンカー（アミノ酸配列：配列番号２５１；ポリヌクレオチド配列：配列番号２５２）；
　ＭＨＣクラスＩＩβ鎖（シグナルペプチド除去）（アミノ酸配列：配列番号２５３；ポリヌクレオチド配列：配列番号２５４）；
　Ｐ２Ａ（アミノ酸配列：配列番号２５５；ポリヌクレオチド配列：配列番号２５６）；
　ＭＨＣクラスＩＩα鎖（アミノ酸配列：配列番号２５７；ポリヌクレオチド配列：配列番号２５８）；
　Ｔ２Ａ（アミノ酸配列：配列番号２５９；ポリヌクレオチド配列：配列番号２６０）；
　ＩＬ－１２β（アミノ酸配列：配列番号２６１；ポリヌクレオチド配列：配列番号２６２）；
　リンカー（アミノ酸配列：配列番号２６３；ポリヌクレオチド配列：配列番号２６４）；
　ＩＬ－１２α（アミノ酸配列：配列番号２６５；ポリヌクレオチド配列：配列番号２６６）；
　リンカー（アミノ酸配列：配列番号２６７；ポリヌクレオチド配列：配列番号２６８）；
　ＦＬＡＧ（アミノ酸配列：配列番号２６９；ポリヌクレオチド配列：配列番号２７０）；
　ＣＤ８の膜貫通ドメイン（アミノ酸配列：配列番号２７１；ポリヌクレオチド配列：配列番号２７２）；
　Ｐ２Ａ（アミノ酸配列：配列番号２７３；ポリヌクレオチド配列：配列番号２７４）；及び
　ＣＤ８０（アミノ酸配列：配列番号２７５；ポリヌクレオチド配列：配列番号２７６）をこの順番で連結して、ＯＶＡｐ－ＭＨＣＩＩβ－Ｐ２Ａ－ＭＨＣＩＩα－Ｔ２Ａ－ＩＬ－１２ｓｃ－ＣＤ８－Ｐ２Ａ－ＣＤ８０をコードする配列（アミノ酸配列：配列番号２７７、ポリヌクレオチド配列：配列番号２７８）を作製した（図２４（ｃ））。かかる配列から転写されたｍＲＮＡから、２ＡペプチドであるＴ２ＡとＰ２Ａの働きにより、ＯＶＡペプチド抗原を膜外に提示可能なＭＨＣクラスＩＩ分子、ＩＬ－１２を含む膜タンパク質、及びＣＤ８０を含む膜タンパク質が翻訳され、１つの細胞の細胞膜上の存在することになる。
プラスミドの調製９：
　ＯＶＡペプチドの代わりにネオアンチゲン（ガン抗原）であるＲＰＬ１８ペプチド（アミノ酸配列：配列番号２８３、ポリヌクレオチド配列：配列番号２８４；非特許文献３）を導入してｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ（ＲＰＬ１８ペプチド）－ＣＤ８１―ＩＬ―２をコードする配列を作製した（図２４（ｄ））。
　実施例で使用した各配列を、以下の表１～２１に示す。なお、各配列における下線部分は、シグナルペプチドを示す。
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エクソソームを除去したウシ胎児血清の調製
　１０ｍＬの非働化処理ＦＢＳと２ｍＬの５０％ Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）１０，０００溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、＃８１２８０）を４℃、２時間撹拌した後に、１５００×ｇ、４℃、３０分間の遠心条件でエクソソームを沈殿させ、上清を回収することで、エクソソームを除去したウシ胎児血清を得た。
［実施例１］ＭＨＣクラスＩ分子及びＴ細胞刺激性サイトカインを膜に含む抗原提示細胞外小胞
　ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を細胞培養ディッシュに播種し、２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地で培養した。約５０％コンフルエンスの細胞に、製造業者の指示にしたがって、プラスミド（ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ＣＤ８１、及びＣＤ６３－ＩＬ－２をそれぞれコードするｐＣＡＧベクター）をＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ“Ｍａｘ”（Polysciences社製）を用いて、２つ同時にトランスフェクトした。トランスフェクションの３時間後に培地を交換し、トランスフェクションの２４時間後にエクソソームを除去した２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地に培地を交換した。トランスフェクションの７２時間後、上清を回収し、該上清を０．２２μｍフィルターに通した後、３００ｇで５分間遠心分離した。上清を回収し、該上清を２，０００ｇ、２０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１０，０００ｇ、３０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１００，０００ｇで２時間遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットをＰＢＳで洗浄した。ペレットにＰＢＳを加え、１００，０００ｇで２時間、遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットを１００μＬのＰＢＳで懸濁したものを、実施例１の抗原提示細胞外小胞として用いた（図２Ａ）。細胞外小胞の濃度は、ＢＣＡタンパクアッセイキット（Thermo Fisher Scientific社製）を用い、製造業者の指示にしたがって測定した。
［実施例２］ＭＨＣクラスＩ分子、Ｔ細胞共刺激分子、及びＴ細胞刺激性サイトカインを膜に含む抗原提示細胞外小胞
　ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を細胞培養ディッシュに播種し、２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地で培養した。約５０％コンフルエンスの細胞に、製造業者の指示にしたがって、上記で調製したプラスミド（ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ＣＤ８１、ＣＤ８０－ＣＤ９、及びＣＤ６３－ＩＬ－２をそれぞれコードするｐＣＡＧベクター）をＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ“Ｍａｘ”（Polysciences社製）を用いて、３つ同時にトランスフェクトした。トランスフェクションの３時間後に培地を交換し、トランスフェクションの２４時間後にエクソソームを除去した２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地に培地を交換した。トランスフェクションの７２時間後、上清を回収し、該上清を０．２２μｍフィルターに通した後、３００ｇで５分間遠心分離した。上清を回収し、該上清を２，０００ｇ、２０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１０，０００ｇ、３０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１００，０００ｇで２時間遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットをＰＢＳで洗浄した。ペレットにＰＢＳを加え、１００，０００ｇで２時間、遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットを１００μＬのＰＢＳで懸濁したものを、実施例２の抗原提示細胞外小胞として用いた（図２Ｂ）。抗原提示細胞外小胞の濃度は、ＢＣＡタンパクアッセイキット（Thermo Fisher Scientific社製）を用い、製造業者の指示にしたがって測定した。
［実施例３］ＭＨＣクラスＩＩ分子、Ｔ細胞共刺激分子、及びＴ細胞刺激性サイトカインを膜に含む抗原提示細胞外小胞１
　ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を細胞培養ディッシュに播種し、２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地で培養した。約５０％コンフルエンスの細胞に、製造業者の指示にしたがって、上記で調製したプラスミド（ｓｃ－Ｄｉｍｅｒ－ＣＤ８１、ＭＨＣクラスＩＩα鎖、ＣＤ８０－ＣＤ９、及びＣＤ６３－ＩＬ－２をそれぞれコードするｐＣＡＧベクター）をＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ“Ｍａｘ”（Polysciences社製）を用いて、４つ同時にトランスフェクトした。トランスフェクションの３時間後に培地を交換し、トランスフェクションの２４時間後にエクソソームを除去した２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地に培地を交換した。トランスフェクションの７２時間後、上清を回収し、該上清を０．２２μｍフィルターに通した後、３００ｇで５分間遠心分離した。上清を回収し、該上清を２，０００ｇ、２０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１０，０００ｇ、３０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１００，０００ｇで２時間遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットをＰＢＳで洗浄した。ペレットにＰＢＳを加え、１００，０００ｇで２時間、遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットを１００μＬのＰＢＳで懸濁したものを、実施例３の抗原提示細胞外小胞として用いた（図２Ｃ）。抗原提示細胞外小胞の濃度は、ＢＣＡタンパクアッセイキット（Thermo Fisher Scientific社製）を用い、製造業者の指示にしたがって測定した。
［実施例４］ＭＨＣクラスＩＩ分子、Ｔ細胞共刺激分子、及びＴ細胞刺激性サイトカインを膜に含む抗原提示細胞外小胞２
　ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を細胞培養ディッシュに播種し、２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地で培養した。約５０％コンフルエンスの細胞に、製造業者の指示にしたがって、プラスミド（ｓｃ－Ｄｉｍｅｒ－ＣＤ８１、ＭＨＣクラスＩＩα鎖、ＣＤ８０－ＣＤ９、ＴＧＦ－β－ＭＦＧＥ８、及びＣＤ６３－ＩＬ－２をそれぞれコードするｐＣＡＧベクター）をＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ“Ｍａｘ”（Polysciences社製）を用いて、５つ同時にトランスフェクトした。トランスフェクションの３時間後に培地を交換し、トランスフェクションの２４時間後にエクソソームを除去した２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地に培地を交換した。トランスフェクションの７２時間後、上清を回収し、該上清を０．２２μｍフィルターに通した後、３００ｇで５分間遠心分離した。上清を回収し、該上清を２，０００ｇ、２０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１０，０００ｇ、３０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１００，０００ｇで２時間遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットをＰＢＳで洗浄した。ペレットにＰＢＳを加え、１００，０００ｇで２時間、遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットを１００μＬのＰＢＳで懸濁したものを、実施例４の抗原提示細胞外小胞として用いた（図２Ｄ）。抗原提示細胞外小胞の濃度は、ＢＣＡタンパクアッセイキット（Thermo Fisher Scientific社製）を用い、製造業者の指示にしたがって測定した。
［実施例５］ＭＨＣクラスＩＩ分子、Ｔ細胞共刺激分子、及びＴ細胞刺激性サイトカインを膜に含む抗原提示細胞外小胞３
　ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を細胞培養ディッシュに播種し、２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地で培養した。約５０％コンフルエンスの細胞に、製造業者の指示にしたがって、上記で調製したプラスミド（ｓｃ－Ｄｉｍｅｒ－ＣＤ８１、ＭＨＣクラスＩＩα鎖、ＣＤ８０－ＣＤ９、及びＣＤ８１－ＩＬ－４をそれぞれコードするｐＣＡＧベクター）をＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ“Ｍａｘ”（Polysciences社製）を用いて、４つ同時にトランスフェクトした。トランスフェクションの３時間後に培地を交換し、トランスフェクションの２４時間後にエクソソームを除去した２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地に培地を交換した。トランスフェクションの７２時間後、上清を回収し、該上清を０．２２μｍフィルターに通した後、３００ｇで５分間遠心分離した。上清を回収し、該上清を２，０００ｇ、２０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１０，０００ｇ、３０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１００，０００ｇで２時間遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットをＰＢＳで洗浄した。ペレットにＰＢＳを加え、１００，０００ｇで２時間、遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットを１００μＬのＰＢＳで懸濁したものを、実施例５の抗原提示細胞外小胞として用いた（図２Ｅ）。抗原提示細胞外小胞の濃度は、ＢＣＡタンパクアッセイキット（Thermo Fisher Scientific社製）を用い、製造業者の指示にしたがって測定した。
［参考例１］コントロール細胞外小胞
　ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を細胞培養ディッシュに播種し、２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地で培養した。約５０％コンフルエンスの細胞に培地を交換し、２４時間後にエクソソームを除去した２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地に培地を交換した。エクソソームを除去した該培地に交換した４８時間後、上清を回収し、該上清を０．２２μｍフィルターに通した後、３００ｇで５分間遠心分離した。上清を回収し、該上清を２，０００ｇ、２０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１０，０００ｇ、３０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１００，０００ｇで２時間遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットをＰＢＳで洗浄した。ペレットにＰＢＳを加え、１００，０００ｇで２時間、遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットを１００μＬのＰＢＳで懸濁したものを、参考例１の細胞外小胞として用いた。抗原提示細胞外小胞の濃度は、ＢＣＡタンパクアッセイキット（Thermo Fisher Scientific社製）を用い、製造業者の指示にしたがって測定した。
［参考例２］ＭＨＣクラスＩ分子を膜に含む細胞外小胞
　ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を細胞培養ディッシュに播種し、２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地で培養した。約５０％コンフルエンスの細胞に、製造業者の指示にしたがって、プラスミド（ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ＣＤ８１をコードするｐＣＡＧベクター）をＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ“Ｍａｘ”（Polysciences社製）を用いて、トランスフェクトした。トランスフェクションの３時間後に培地を交換し、トランスフェクションの２４時間後にエクソソームを除去した２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地に培地を交換した。トランスフェクションの７２時間後、上清を回収し、該上清を０．２２μｍフィルターに通した後、３００ｇで５分間遠心分離した。上清を回収し、該上清を２，０００ｇ、２０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１０，０００ｇ、３０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１００，０００ｇで２時間遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットをＰＢＳで洗浄した。ペレットにＰＢＳを加え、１００，０００ｇで２時間、遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットを１００μＬのＰＢＳで懸濁したものを、参考例２の細胞外小胞として用いた。細胞外小胞の濃度は、ＢＣＡタンパクアッセイキット（Thermo Fisher Scientific社製）を用い、製造業者の指示にしたがって測定した。
［参考例３］Ｔ細胞共刺激分子を膜に含む細胞外小胞
　ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を細胞培養ディッシュに播種し、２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地で培養した。約５０％コンフルエンスの細胞に、製造業者の指示にしたがって、プラスミド（ＣＤ８０－ＣＤ９をコードするｐＣＡＧベクター）をＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ“Ｍａｘ”（Polysciences社製）を用いて、トランスフェクトした。トランスフェクションの３時間後に培地を交換し、トランスフェクションの２４時間後にエクソソームを除去した２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地に培地を交換した。トランスフェクションの７２時間後、上清を回収し、該上清を０．２２μｍフィルターに通した後、３００ｇで５分間遠心分離した。上清を回収し、該上清を２，０００ｇ、２０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１０，０００ｇ、３０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１００，０００ｇで２時間遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットをＰＢＳで洗浄した。ペレットにＰＢＳを加え、１００，０００ｇで２時間、遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットを１００μＬのＰＢＳで懸濁したものを、参考例３の細胞外小胞として用いた。細胞外小胞の濃度は、ＢＣＡタンパクアッセイキット（Thermo Fisher Scientific社製）を用い、製造業者の指示にしたがって測定した。
［参考例４］Ｔ細胞刺激性サイトカインを膜に含む細胞外小胞
　ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を細胞培養ディッシュに播種し、２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地で培養した。約５０％コンフルエンスの細胞に、製造業者の指示にしたがって、プラスミド（ＣＤ６３－ＩＬ－２をコードするｐＣＡＧベクター）をＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ“Ｍａｘ”（Polysciences社）を用いて、トランスフェクトした。トランスフェクションの３時間後に培地を交換し、トランスフェクションの２４時間後にエクソソームを除去した２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地に培地を交換した。トランスフェクションの７２時間後、上清を回収し、該上清を０．２２μｍフィルターに通した後、３００ｇで５分間遠心分離した。上清を回収し、該上清を２，０００ｇ、２０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１０，０００ｇ、３０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１００，０００ｇで２時間遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットをＰＢＳで洗浄した。ペレットにＰＢＳを加え、１００，０００ｇで２時間、遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットを１００μＬのＰＢＳで懸濁したものを、参考例４の細胞外小胞として用いた。細胞外小胞の濃度は、ＢＣＡタンパクアッセイキット（Thermo Fisher Scientific社製）を用い、製造業者の指示にしたがって測定した。
［参考例５］ＭＨＣクラスＩ分子及びＴ細胞共刺激分子を膜に含む細胞外小胞
　ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を細胞培養ディッシュに播種し、２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地で培養した。約５０％コンフルエンスの細胞に、製造業者の指示にしたがって、プラスミド（ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ＣＤ８１、及びＣＤ８０－ＣＤ９をそれぞれコードするｐＣＡＧベクター）をＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ“Ｍａｘ”（Polysciences社製）を用いて、２つ同時にトランスフェクトした。トランスフェクションの３時間後に培地を交換し、トランスフェクションの２４時間後にエクソソームを除去した２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地に培地を交換した。トランスフェクションの７２時間後、上清を回収し、該上清を０．２２μｍフィルターに通した後、３００ｇで５分間遠心分離した。上清を回収し、該上清を２，０００ｇ、２０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１０，０００ｇ、３０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１００，０００ｇで２時間遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットをＰＢＳで洗浄した。ペレットにＰＢＳを加え、１００，０００ｇで２時間、遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットを１００μＬのＰＢＳで懸濁したものを、参考例５の細胞外小胞として用いた。細胞外小胞の濃度は、ＢＣＡタンパクアッセイキット（Thermo Fisher Scientific社製）を用い、製造業者の指示にしたがって測定した。
試験例１－１：細胞外小胞の膜に含まれる融合タンパク質のフローサイトメトリー解析
　実施例２の抗原提示細胞外小胞を、ＰＳ Ｃａｐｔｕｒｅ（商標） エクソソームフローサイトメトリーキット（富士フイルム和光純薬株式会社製）によって、製造業者の指示にしたがって免疫染色を行った。染色に使用した抗体は以下のとおりである（染色時間：１５分、温度：４℃）。染色後、各融合タンパク質の発現を、フローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
　・ＡＰＣコンジュゲート抗マウスＨ－２ＫｂＯＶＡ複合体抗体（２５－Ｄ１．１６ Biolegend社製）
　・ＰＥコンジュゲート抗マウスＣＤ８０抗体（１６－１０Ａ１ Biolegend社製）
　・Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ４２１コンジュゲート抗マウスＩＬ－２抗体（ＪＥＳ６－５Ｈ４ Biolegend社製）
　結果を図３Ａに示す。
［結果］
　試験例１－１の結果より、実施例２の抗原提示細胞外小胞は、その膜に、ＯＶＡ抗原を提示するＭＨＣクラスＩ分子、ＣＤ８０、及びＩＬ－２を含むことが分かる（図３Ａ）。
試験例１－２：細胞外小胞の膜に含まれる融合タンパク質のフローサイトメトリー解析
　実施例３の抗原提示細胞外小胞を、ＰＳ Ｃａｐｔｕｒｅ（商標） エクソソームフローサイトメトリーキット（富士フイルム和光純薬株式会社製）によって、製造業者の指示にしたがって免疫染色を行った。染色に使用した抗体は以下のとおりである。染色後、各融合タンパク質の発現を、フローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
　・ＡＰＣコンジュゲート抗マウスＩＬ－２抗体（ＪＥＳ６－５Ｈ４ Biolegend社製）
　・ＰＥコンジュゲート抗マウスＣＤ８０抗体（１６－１０Ａ１ Biolegend社製）
　・ＡＰＣ―Ｃｙ７コンジュゲート抗マウスＩ－Ａ／Ｉ－Ｅ抗体（Ｍ５／１１４．１５．２ Biolegend社製）
　結果を図３Ｂに示す。
［結果］
　試験例１－２の結果より、実施例３の抗原提示細胞外小胞は、その膜に、ＯＶＡ抗原を提示するＭＨＣクラスＩＩ分子、ＣＤ８０、及びＩＬ－２を含むことが分かる（図３Ｂ）。
試験例１－３：細胞外小胞の膜に含まれる融合タンパク質のフローサイトメトリー解析
　実施例４の抗原提示細胞外小胞を、ＰＳ Ｃａｐｔｕｒｅ（商標） エクソソームフローサイトメトリーキット（富士フイルム和光純薬株式会社製）によって、製造業者の指示にしたがって免疫染色を行った。染色に使用した抗体は以下のとおりである。染色後、各融合タンパク質の発現を、フローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
　・ＡＰＣコンジュゲート抗マウスＩＬ－２抗体（ＪＥＳ６－５Ｈ４ Biolegend社製）
　・ＰＥコンジュゲート抗マウスＣＤ８０抗体（１６－１０Ａ１ Biolegend社製）
　・ＡＰＣ―Ｃｙ７コンジュゲート抗マウスＩ－Ａ／Ｉ－Ｅ抗体（Ｍ５／１１４．１５．２ Biolegend社製）
　・ＡＰＣコンジュゲート抗マウスＬＡＰ（ＴＧＦ－β１）抗体（ＴＷ７－１６Ｂ４ Biolegend社製）
　結果を図３Ｃに示す。
［結果］
　試験例１－３の結果より、実施例４の抗原提示細胞外小胞は、その膜に、ＯＶＡ抗原を提示するＭＨＣクラスＩＩ分子、ＣＤ８０、ＩＬ－２、及びＴＧＦ－β１を含むことが分かる（図３Ｃ）。
試験例１－４：細胞外小胞の膜に含まれる融合タンパク質のフローサイトメトリー解析
　実施例５の抗原提示細胞外小胞を、ＰＳ Ｃａｐｔｕｒｅ（商標） エクソソームフローサイトメトリーキット（富士フイルム和光純薬株式会社製）によって、製造業者の指示にしたがって免疫染色を行った。染色に使用した抗体は以下のとおりである。染色後、各融合タンパク質の発現を、フローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
　・Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲート抗マウスＩＬ－４抗体（１１Ｂ１１ Biolegend社製）
　・ＰＥコンジュゲート抗マウスＣＤ８０抗体（１６－１０Ａ１ Biolegend社製）
　・ＡＰＣ―Ｃｙ７コンジュゲート抗マウスＩ－Ａ／Ｉ－Ｅ抗体（Ｍ５／１１４．１５．２ Biolegend社製）
　結果を図３Ｄに示す。
［結果］
　試験例１－４の結果より、実施例５の抗原提示細胞外小胞は、その膜に、ＯＶＡ抗原を提示するＭＨＣクラスＩＩ分子、ＣＤ８０、及びＩＬ－４を含むことが分かる（図３Ｄ）。
試験例２：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、抗原提示細胞外小胞によるＯＶＡ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ＯＴ－１ Ｔ細胞）の活性化実験
　抗原提示細胞外小胞が抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化等するかどうかを調べるために、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて以下の試験を実施した。
　ＯＶＡ反応性ＴＣＲトランスジェニックマウスであるＯＴ－１マウスから摘出したリンパ節を１００μｍフィルター上で破砕し、リンパ節細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液を、細胞増殖アッセイ試薬であるＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて、製造業者の指示にしたがって染色した。染色したリンパ節細胞 ２×１０５個を、１０％ウシ胎児血清、５０μＭ ２－メルカプトエタノール及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地 ２００μＬに懸濁し、実施例１又は２の抗原提示細胞外小胞（最終濃度３μｇ／ｍＬ）、或いは参考例２～４の３種類の細胞外小胞の混合物（３種類の細胞外小胞の各々の最終濃度 ３μｇ／ｍＬ）又は参考例１、２又は５の細胞外小胞（最終濃度 ３μｇ／ｍＬ）を加え、９６穴丸底プレートで３日間培養した後、免疫染色を行った。染色に使用した抗体は以下のとおりである（染色時間：１５分、温度：４℃）。染色後、ＯＴ－１ Ｔ細胞における細胞増殖アッセイ試薬であるＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔの発光強度をフローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
　・ＡＰＣコンジュゲート抗マウスＣＤ８抗体（５３－６．７ Biolegend社製）
　・ＰＥコンジュゲート抗マウスＴＣＲ Ｖｂ５．１，５．２抗体（ＭＲ９－４ Biolegend社製）
　結果を図４に示す。
［結果］
　試験例２の結果より、実施例１，２の抗原提示細胞外小胞は、参考例２～４の３種の細胞外小胞の混合物、又は参考例１，２，５の細胞外小胞と比較して、抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を顕著に分化及び／又は増殖させた（図４）。
試験例３：ｉｎ ｖｉｖｏにおける、抗原提示細胞外小胞によるＯＶＡ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ＯＴ－１ Ｔ細胞）の活性化実験
　抗原提示細胞外小胞が抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化等するかどうかを調べるために、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて以下の試験を実施した。
　ＯＶＡ反応性ＴＣＲトランスジェニックマウスであるＯＴ－１マウスからリンパ節を摘出し、試験例２と同様にリンパ球懸濁液を調製した。ＣＤ４５．１コンジェニックマウスからも同様にリンパ節を摘出し、リンパ球懸濁液を調製した。それぞれのリンパ球懸濁液を１：１の割合で混合し、細胞増殖アッセイ試薬であるＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔを用いて染色した。ＰＢＳに懸濁した１×１０７個のＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ染色した混合リンパ球懸濁液を、ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２コンジェニックマウスの尾静脈から移入した。翌日、実施例２の抗原提示細胞外小胞若しくは参考例１の細胞外小胞 ５０μｇ、又は１．５μｇのＩＬ－２（Biolegend社製）と５０μｇの抗マウスＩＬ－２抗体（Ｓ４Ｂ６－１ Bio X Cell社製）との混合物（ＩＬ－２／抗ＩＬ－２抗体複合体）をＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２コンジェニックマウスに尾静脈から移入した。細胞移入４日後、レシピエントマウスからリンパ節を摘出し、リンパ球懸濁液を調製し、免疫染色を行った。染色に使用した抗体は以下のとおりである（染色時間：１５分、温度：４℃）。染色後、移入したＯＴ－１ Ｔ細胞及び野生型ＣＤ８Ｔ細胞における細胞増殖アッセイ試薬であるＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔの発光強度をフローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
　・ＰＥ－Ｃｙ７コンジュゲート抗マウスＣＤ８抗体（５３－６．７ Biolegend社製）
　・ＰＥコンジュゲート抗マウスＴＣＲ Ｖｂ５．１，５．２抗体（ＭＲ９－４ Biolegend社製）
　・ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＣＤ４５．１抗体（Ａ２０ Biolegend社製）
　・ＡＰＣコンジュゲート抗マウスＣＤ４５．２抗体（１０４ Biolegend社製）
　結果を図５に示す。
［結果］
　試験例３の結果より、実施例２の抗原提示細胞外小胞は、参考例１の細胞外小胞と比較して、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、他のＣＤ８陽性Ｔ細胞（抗原非特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞）をほとんど活性化等することなく、抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を顕著に分化及び／又は増殖させたことが分かる（図５）。また、実施例２の抗原提示細胞外小胞は、ＩＬ－２／抗ＩＬ－２抗体複合体と比較して、他のＣＤ８陽性Ｔ細胞（抗原非特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞）をほとんど活性化させなかったことから、サイトカインストーム等の重篤な副作用が低い可能性が考えられる（図５）。
試験例４：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、抗原提示細胞外小胞によるＯＶＡ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞（ＯＴ－２ Ｔ細胞）の活性化実験
　抗原提示細胞外小胞が抗原特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化等するかどうかを調べるために、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて以下の試験を実施した。
　ＯＶＡ反応性ＣＤ４ＴＣＲトランスジェニックマウスであるＯＴ－２マウスから摘出したリンパ節を１００μｍフィルター上で破砕し、リンパ節細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液を、細胞増殖アッセイ試薬であるＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて、製造業者の指示にしたがって染色した。染色したリンパ節細胞 ２×１０５個を、１０％ウシ胎児血清、５０μＭ ２－メルカプトエタノール及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地 ２００μＬに懸濁し、最終濃度が１０μｇ／ｍＬになるように実施例３の抗原提示細胞外小胞又は参考例１の細胞外小胞を加え、９６穴丸底プレートで４日間培養した。４日後、細胞を回収し、免疫染色を行った。染色に使用した抗体は以下のとおりである（染色時間：１５分、温度：４℃）。染色後、ＯＴ－２ Ｔ細胞における細胞増殖アッセイ試薬であるＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔの発光強度をフローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
　・ＰＥ－Ｃｙ７コンジュゲート抗マウスＣＤ４抗体（ＲＭ４－５ Biolegend社製）
　・ＡＰＣコンジュゲート抗マウスＴＣＲ Ｖｂ５．１，５．２抗体（ＭＲ９－４ Biolegend社製）
　結果を図６に示す。
［結果］
　試験例４の結果より、実施例３の抗原提示細胞外小胞は、参考例１の細胞外小胞と比較して、抗原特異的ＣＤ４Ｔ細胞を顕著に分化及び／又は増殖させた（図６）。
試験例５：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、抗原提示細胞外小胞によるＯＶＡ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞（ＯＴ－２ Ｔ細胞）の制御性Ｔ細胞への分化誘導実験
　抗原提示細胞外小胞が抗原特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞を制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）へと分化誘導するかどうかを調べるために、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて以下の試験を実施した。
　ＯＶＡ反応性ＣＤ４ＴＣＲトランスジェニックマウスであるＯＴ－２マウスから摘出したリンパ節を１００μｍフィルター上で破砕し、リンパ節細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液を、細胞増殖アッセイ試薬であるＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて、製造業者の指示にしたがって染色した。染色したリンパ節細胞 ２×１０５個を、１０％ウシ胎児血清、５０μＭ ２－メルカプトエタノール及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地 ２００μＬに懸濁し、最終濃度が１０μｇ／ｍＬになるように実施例４の抗原提示細胞外小胞又は参考例１の細胞外小胞を加え、９６穴丸底プレートで４日間培養した。４日後、細胞を回収し、細胞外免疫染色を行った。染色使用した抗体は以下のとおりである（染色時間：１５分、温度：４℃）。細胞外染色後、Ｔｒｕｅ－Ｎｕｃｌｅａｒ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ （Biolegend社製）及び抗マウスＦＯＸＰ３抗体を用いて、製造業者の指示にしたがって細胞内免疫染色を行った。細胞内染色後、ＯＴ－２ Ｔ細胞上の制御性Ｔ細胞のマーカーであるＣＤ２５分子とＦＯＸＰ３分子の発現をフローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
　・ＰＥコンジュゲート抗マウスＣＤ２５抗体（ＰＣ６１ Biolegend社製）
　・ＰＥ－Ｃｙ７コンジュゲート抗マウスＣＤ４抗体（ＲＭ４－５ Biolegend社製）
　・ＡＰＣコンジュゲート抗マウスＴＣＲ Ｖｂ５．１，５．２抗体（ＭＲ９－４ Biolegend社製）
　・Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲート抗マウスＦＯＸＰ３抗体（ＭＦ－１４ Biolegend社製）
　結果を図７に示す。
［結果］
　試験例５の結果より、実施例４の抗原提示細胞外小胞は、参考例１の細胞外小胞と比較して、抗原特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞を制御性Ｔ細胞（好ましくは、Ｆｏｘｐ３を発現している制御性Ｔ細胞）へと分化誘導させたことが分かる（図７）。
試験例６：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、抗原提示細胞外小胞によるＯＶＡ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞（ＯＴ－２ Ｔ細胞）のＴｈ２Ｔ細胞への分化誘導実験
　抗原提示細胞外小胞が抗原特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＴｈ２Ｔ細胞へと分化誘導するかどうかを調べるために、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて以下の試験を実施した。
　ＯＶＡ反応性ＣＤ４ＴＣＲトランスジェニックマウスであるＯＴ－２マウスから摘出したリンパ節を１００μｍフィルター上で破砕し、リンパ節細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液を、細胞増殖アッセイ試薬であるＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて、製造業者の指示にしたがって染色した。染色したリンパ節細胞 ２×１０５個を、１０％ウシ胎児血清、５０μＭ ２－メルカプトエタノール及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地 ２００μＬに懸濁し、最終濃度が１０μｇ／ｍＬになるように実施例３若しくは５の抗原提示細胞外小胞又は参考例１の細胞外小胞を加え、９６穴丸底プレートで４日間培養した。４日後、細胞を回収し、細胞外免疫染色を行った。染色使用した抗体は以下のとおりである（染色時間：１５分、温度：４℃）。細胞外染色後、Ｔｒｕｅ－Ｎｕｃｌｅａｒ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（Biolegend社製）及び抗ＧＡＴＡ３抗体を用いて、製造業者の指示にしたがって細胞内免疫染色を行った。細胞内染色後、ＯＴ－２ Ｔ細胞の細胞増殖アッセイ試薬であるＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔの発光強度とＴｈ２Ｔ細胞のマーカーであるＧＡＴＡ３の発現をフローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
　・ＰＥコンジュゲート抗マウスＴＣＲ Ｖｂ５．１，５．２抗体（ＭＲ９－４ Biolegend社製）
　・ＰＥ－Ｃｙ７コンジュゲート抗マウスＣＤ４抗体（ＲＭ４－５ Biolegend社製）
　・ＡＰＣコンジュゲート抗ＧＡＴＡ３抗体（１６Ｅ１０Ａ２３ Biolegend社製）
　結果を図８に示す。
［結果］
　試験例６の結果より、実施例３，５の抗原提示細胞外小胞は、参考例１の細胞外小胞と比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、抗原特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＴｈ２細胞へと分化誘導させたことが分かる（図８）。Ｔｈ２細胞は、ＩＬ－４やＩＬ－５などのサイトカインを分泌し、同じ抗原を認識するナイーブＢ細胞を分化活性化させ、抗原特異的ＩｇＥ産生誘導（すなわち液性免疫の活性化）を促す。
［実施例６］ＭＨＣクラスＩＩ分子、Ｔ細胞共刺激分子、及びＴ細胞刺激性サイトカインを膜に含む抗原提示細胞外小胞４
　ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を細胞培養ディッシュに播種し、２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地で培養した。約５０％コンフルエンスの細胞に、製造業者の指示にしたがって、上記で調製したプラスミド（ｓｃ－Ｄｉｍｅｒ－ＣＤ８１―IL―１２ｐ４０、ＭＨＣクラスＩＩα鎖、ＣＤ８０－ＣＤ９、及びIL―１２ｐ３５をそれぞれコードするｐＣＡＧベクター）をＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ“Ｍａｘ”（Polysciences社製）を用いて、４つ同時にトランスフェクトした。トランスフェクションの３－１２時間後に培地を交換し、トランスフェクションの２４時間後にエクソソームを除去した２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地に培地を交換した。トランスフェクションの７２時間後、上清を回収し、該上清を０．２２μｍフィルターに通した後、３００ｇで５分間遠心分離した。上清を回収し、該上清を２，０００ｇ、２０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１０，０００ｇ、３０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１００，０００ｇで２時間遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットをＰＢＳで洗浄した。ペレットにＰＢＳを加え、１００，０００ｇで２時間、遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットを１００μＬのＰＢＳで懸濁したものを、実施例６の抗原提示細胞外小胞として用いた。抗原提示細胞外小胞の濃度は、ＢＣＡタンパクアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用い、製造業者の指示にしたがって測定した。
試験例１－５：細胞外小胞の膜に含まれる融合タンパク質のフローサイトメトリー解析
　実施例６の抗原提示細胞外小胞を、ＰＳ　Ｃａｐｔｕｒｅ（商標）　エクソソームフローサイトメトリーキット（富士フイルム和光純薬株式会社製）によって、製造業者の指示にしたがって免疫染色を行った。染色に使用した抗体は以下のとおりである。染色後、各融合タンパク質の発現を、フローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
　・Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８コンジュゲート抗マウスＩ－Ａ／Ｉ－Ｅ抗体（Ｍ５／１１４．１５．２　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＰＥコンジュゲート抗マウスＩＬ－１２抗体（Ｃ１５．６　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＡＰＣコンジュゲート抗マウスＣＤ８０抗体（１６－１０Ａ１　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）　結果を図３Ｅに示す。
［結果］
　試験例１－５の結果より、実施例６の抗原提示細胞外小胞は、その膜に、ＯＶＡ抗原を提示するＭＨＣクラスＩＩ分子、ＣＤ８０、及び機能的なＩＬ－１２を含むことが分かる（図３Ｅ）
［実施例７］ＭＨＣクラスＩＩ分子、Ｔ細胞共刺激分子、及びＴ細胞刺激性サイトカインを膜に含む抗原提示細胞外小胞５
　ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を細胞培養ディッシュに播種し、２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地で培養した。約５０％コンフルエンスの細胞に、製造業者の指示にしたがって、上記で調製したプラスミド（ｓｃ－Ｄｉｍｅｒ－ＣＤ８１、ＭＨＣクラスＩＩα鎖、ＣＤ８０－ＣＤ９、ＣＤ８１―IL―６及びＴＧＦ－β－ＭＦＧＥ８をそれぞれコードするｐＣＡＧベクター）をＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ“Ｍａｘ”（Polysciences社製）を用いて、５つ同時にトランスフェクトした。トランスフェクションの３-12時間後に培地を交換し、トランスフェクションの２４時間後にエクソソームを除去した２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地に培地を交換した。トランスフェクションの７２時間後、上清を回収し、該上清を０．２２μｍフィルターに通した後、３００ｇで５分間遠心分離した。上清を回収し、該上清を２，０００ｇ、２０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１０，０００ｇ、３０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１００，０００ｇで２時間遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットをＰＢＳで洗浄した。ペレットにＰＢＳを加え、１００，０００ｇで２時間、遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットを１００μＬのＰＢＳで懸濁したものを、実施例７の抗原提示細胞外小胞として用いた。抗原提示細胞外小胞の濃度は、ＢＣＡタンパクアッセイキット（Thermo Fisher Scientific社製）を用い、製造業者の指示にしたがって測定した。
試験例１－６：細胞外小胞の膜に含まれる融合タンパク質のフローサイトメトリー解析
　実施例７の抗原提示細胞外小胞を、ＰＳ　Ｃａｐｔｕｒｅ（商標）　エクソソームフローサイトメトリーキット（富士フイルム和光純薬株式会社製）によって、製造業者の指示にしたがって免疫染色を行った。染色に使用した抗体は以下のとおりである。染色後、各融合タンパク質の発現を、フローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
　・ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＣＤ８０抗体（１６－１０Ａ１　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＰＥコンジュゲート抗マウスＩＬ－６抗体（ＭＰ５－２０Ｆ３　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＡＰＣ―Ｃｙ７コンジュゲート抗マウスＩ－Ａ／Ｉ－Ｅ抗体（Ｍ５／１１４．１５．２　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＡＰＣコンジュゲート抗マウスＬＡＰ（ＴＧＦ－β１）抗体（ＴＷ７－１６Ｂ４　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　結果を図３Ｆに示す。
［結果］
　試験例１－６の結果より、実施例７の抗原提示細胞外小胞は、その膜に、ＯＶＡ抗原を提示するＭＨＣクラスＩＩ分子、ＣＤ８０、ＩＬ－６、及びＴＧＦｂを含むことが分かる（図３Ｆ）
［実施例８］ＭＨＣクラスＩ分子、Ｔ細胞共刺激分子、及びＴ細胞刺激性サイトカインを安定に発現する細胞株の樹立と抗原提示細胞外小胞の調製
　ＰＬＡＴ―Ａ細胞を細胞培養ディッシュに播種し、２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地で培養した。約５０％コンフルエンスの細胞に、製造業者の指示にしたがって、ＣＤ８０－ＣＤ９またはｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ＣＤ８１―ＩＬ―２をコードするｐＭＸベクターをＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ“Ｍａｘ”（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてそれぞれトランスフェクトした。トランスフェクションの１２時間後に培地を交換し、トランスフェクションの６０時間後、上清を回収し、３００ｇで５分間遠心分離した。回収した上清をウイルス粒子として用いた。　ＨＥＫ２９３細胞を細胞培養ディッシュに播種し、２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地で培養した。約５０％コンフルエンスの細胞に、上記で調製したＣＤ８０－ＣＤ９を組み込んだウイルス粒子にＤＯＴＡＰトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を製造業者の指示にしたがって加え、ＨＥＫ２９３細胞に添加した。ウイルス粒子を加えた細胞は２５００ｒｐｍで３時間、遠心感染を行った。感染２４時間後、培地を交換し１週間後、ＣＤ８０陽性細胞をＦＡＣＳＭｅｌｏｄｙ（ＢＤバイオサイエンシス社製）でソーティングした。ソーティングしたＣＤ８０陽性細胞を１週間培養した後、ディッシュに播種し、２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地で培養した。約５０％コンフルエンスの細胞に上記で調製したｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ＣＤ８１―ＩＬ―２を組み込んだウイルス粒子にＤＯＴＡＰトランスフェクション試薬を製造業者の指示にしたがって加え、ＣＤ８０陽性ＨＥＫ２９３細胞に添加した。ウイルス粒子を加えた細胞は２５００ｒｐｍで３時間、遠心感染を行った。感染２４時間後、培地を交換し１週間後、ＣＤ８０陽性、ＭＨＣＩ陽性細胞をＦＡＣＳＭｅｌｏｄｙ（ＢＤバイオサイエンシス社製）でソーティングした。ソーティングした細胞を安定発現細胞として用いた。安定発現細胞をディッシュに播種し、２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地で培養した。約５０％コンフルエンスの細胞の上清をエクソソームを除去した２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地に培地を交換した。培地交換７２時間後、上清を回収し、該上清を０．２２μｍフィルターに通した後、３００ｇで５分間遠心分離した。上清を回収し、該上清を２，０００ｇ、２０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１０，０００ｇ、３０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１００，０００ｇで２時間遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットをＰＢＳで洗浄した。ペレットにＰＢＳを加え、１００，０００ｇで２時間、遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットを１００μＬのＰＢＳで懸濁したものを、実施例８の抗原提示細胞外小胞として用いた。
試験例１－７：細胞外小胞の膜に含まれる融合タンパク質のフローサイトメトリー解析
　実施例８の抗原提示細胞外小胞を、ＰＳ　Ｃａｐｔｕｒｅ（商標）　エクソソームフローサイトメトリーキット（富士フイルム和光純薬株式会社製）によって、製造業者の指示にしたがって免疫染色を行った。染色に使用した抗体は以下のとおりである（染色時間：１５分、温度：４℃）。染色後、各融合タンパク質の発現を、フローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
　・ＰＥコンジュゲート抗マウスＨ－２ＫｂＯＶＡ複合体抗体（２５－Ｄ１．１６　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＣＤ８０抗体（１６－１０Ａ１　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＡＰＣコンジュゲート抗マウスＩＬ－２抗体（ＪＥＳ６－５Ｈ４　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　結果を図３Ｇに示す。
［結果］
　試験例１－７の結果より、実施例８の抗原提示細胞外小胞は、その膜に、ＯＶＡ抗原を提示するＭＨＣクラスＩ分子、ＣＤ８０、及びＩＬ－２を含むことが分かる（図３Ｇ）。
［実施例９］HLAクラスＩ分子、ヒトＴ細胞共刺激分子、及びヒトＴ細胞刺激性サイトカインを膜に含む抗原提示細胞外小胞
　B2mを欠損させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を細胞培養ディッシュに播種し、２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地で培養した。約５０％コンフルエンスの細胞に、製造業者の指示にしたがって、上記で調製したプラスミド（ＨＬＡｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ヒトＣＤ８１、ヒトＣＤ８０－ヒトＣＤ９およびヒトＣＤ６３－ＩＬ２をそれぞれコードするｐＣＡＧベクター）をＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ“Ｍａｘ”（Polysciences社製）を用いて、２つ同時にトランスフェクトした。トランスフェクションの３-12時間後に培地を交換し、トランスフェクションの２４時間後にエクソソームを除去した２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地に培地を交換した。トランスフェクションの７２時間後、上清を回収し、該上清を０．２２μｍフィルターに通した後、３００ｇで５分間遠心分離した。上清を回収し、該上清を２，０００ｇ、２０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１０，０００ｇ、３０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１００，０００ｇで２時間遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットをＰＢＳで洗浄した。ペレットにＰＢＳを加え、１００，０００ｇで２時間、遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットを１００μＬのＰＢＳで懸濁したものを、実施例９のヒト化抗原提示細胞外小胞として用いた。抗原提示細胞外小胞の濃度は、ＢＣＡタンパクアッセイキット（Thermo Fisher Scientific社製）を用い、製造業者の指示にしたがって測定した。
　ｈｓｃ―Ｔｒｉｍｅｒ―ｈＣＤ８１の代わりにＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ｈＣＤ８１を用いることにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ペプチドを抗原として提示する抗原提示ＭＨＣ分子と、ｈＣＤ８０、及びｈＩＬ－２をその表面に提示するヒト化抗原提示細胞外小胞を作製することができる。
試験例１－８：細胞外小胞の膜に含まれる融合タンパク質のフローサイトメトリー解析
　実施例９の抗原提示細胞外小胞を、ＰＳ　Ｃａｐｔｕｒｅ（商標）　エクソソームフローサイトメトリーキット（富士フイルム和光純薬株式会社製）によって、製造業者の指示にしたがって免疫染色を行った。染色に使用した抗体は以下のとおりである（染色時間：１５分、温度：４℃）。染色後、各融合タンパク質の発現を、フローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
　・ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＩＬ－２抗体（ＭＱ１－１７Ｈ１２　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＰＥコンジュゲート抗ヒトＣＤ８０抗体（２Ｄ１０　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトβ２ｍ抗体（２Ｍ２　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　結果を図３Ｈに示す。
［結果］
　試験例１－８の結果より、実施例９の抗原提示細胞外小胞は、その膜に、ＷＴ１抗原を提示するＭＨＣクラスＩ分子、ｈＣＤ８０、及びｈＩＬ－２を含むことが分かる（図３Ｈ）。
試験例７：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、抗原提示細胞外小胞によるＯＶＡ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞（ＯＴ－２ Ｔ細胞）のＴｈ１Ｔ細胞への分化誘導実験
　抗原提示細胞外小胞が抗原特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＴｈ１Ｔ細胞へと分化誘導するかどうかを調べるために、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて以下の試験を実施した。
　ＯＶＡ反応性ＣＤ４ＴＣＲトランスジェニックマウスであるＯＴ－２マウスから摘出したリンパ節を１００μｍフィルター上で破砕し、リンパ節細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液を、細胞増殖アッセイ試薬であるＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて、製造業者の指示にしたがって染色した。染色したリンパ節細胞 ２×１０５個を、１０％ウシ胎児血清、５０μＭ ２－メルカプトエタノール及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地 ２００μＬに懸濁し、最終濃度が１０μｇ／ｍＬになるように実施例３若しくは６の抗原提示細胞外小胞又は参考例１の細胞外小胞を加え、９６穴丸底プレートで４日間培養した。４日後、細胞を回収し、細胞外免疫染色を行った。染色使用した抗体は以下のとおりである（染色時間：１５分、温度：４℃）。細胞外染色後、Ｔｒｕｅ－Ｎｕｃｌｅａｒ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（Biolegend社製）及び抗Ｔ－ｂｅｔ抗体を用いて、製造業者の指示にしたがって細胞内免疫染色を行った。細胞内染色後、ＯＴ－２ Ｔ細胞の細胞増殖アッセイ試薬であるＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔの発光強度とＴｈ１Ｔ細胞のマーカーであるＴ－ｂｅｔの発現をフローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
　・ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５コンジュゲート抗マウスＴＣＲＶａ２抗体（Ｂ２０．１　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＡＰＣ－Ｃｙ７コンジュゲート抗マウスＣＤ４抗体（ＲＭ４－５　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＰＥコンジュゲート抗Ｔ－ｂｅｔ抗体（４Ｂ１０　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　結果を図９に示す。
［結果］
　試験例７の結果より、実施例６の抗原提示細胞外小胞は、参考例１の細胞外小胞と比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、抗原特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＴｈ１細胞へと分化誘導させた（図９）。Ｔｈ１細胞はＩＦＮ－γやＩＬ－２等を産生し、病原体細胞、ウイルスに感染した細胞、がん細胞等の破壊を行う、マクロファージや細胞傷害性Ｔ細胞の活性化を促す（すなわち細胞性免疫の活性化）。
試験例８：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、抗原提示細胞外小胞によるＯＶＡ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞（ＯＴ－２ Ｔ細胞）のＴｈ１７Ｔ細胞への分化誘導実験
　抗原提示細胞外小胞が抗原特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＴｈ１７Ｔ細胞へと分化誘導するかどうかを調べるために、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて以下の試験を実施した。
　ＯＶＡ反応性ＣＤ４ＴＣＲトランスジェニックマウスにＲＯＲｒｔ－ＧＦＰマウスを掛け合わせたマウスから摘出したリンパ節を１００μｍフィルター上で破砕し、リンパ節細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液を、細胞増殖アッセイ試薬であるＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて、製造業者の指示にしたがって染色した。染色したリンパ節細胞 ２×１０５個を、１０％ウシ胎児血清、５０μＭ ２－メルカプトエタノール及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地 ２００μＬに懸濁し、最終濃度が１０μｇ／ｍＬになるように実施例７の抗原提示細胞外小胞若しくは参考例１の細胞外小胞を加え、９６穴丸底プレートで４日間培養した。４日後、細胞を回収し、細胞外免疫染色を行った。染色使用した抗体は以下のとおりである（染色時間：１５分、温度：４℃）。細胞内染色後、ＯＴ－２ Ｔ細胞の細胞増殖アッセイ試薬であるＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔの発光強度とＴｈ１７Ｔ細胞のマーカーであるＲＯＲｒｔの発現をフローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
　・ＡＰＣコンジュゲート抗マウスＴＣＲＶａ２抗体（Ｂ２０．１　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＰＥ－Ｃｙ７コンジュゲート抗マウスＣＤ４抗体（ＲＭ４－５　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＰＥコンジュゲート抗マウスＴＣＲ Ｖｂ５．１，５．２抗体（ＭＲ９－４ Biolegend社製）
結果を図１０に示す。
［結果］
　試験例８の結果より、実施例７の抗原提示細胞外小胞は、参考例１の細胞外小胞と比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、抗原特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＴｈ１７細胞へと分化誘導させたことが分かる（図１０）。Ｔｈ１７細胞はＴｈ１やＴｈ２細胞とは異なり、炎症性サイトカインである、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＴＮＦ－αなどを産生して、炎症を誘導し、好中球や単球の動員、増殖を促し、真菌（カンジタ菌、黄色ブドウ球菌、溶連菌など病原性真菌を含む）の感染防御に寄与する。
試験例９：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、安定細胞株から精製した抗原提示細胞外小胞によるＯＶＡ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ＯＴ－１ Ｔ細胞）の活性化実験
　安定細胞株から精製した抗原提示細胞外小胞が抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化等するかどうかを調べるために、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて以下の試験を実施した。
　ＯＶＡ反応性ＴＣＲトランスジェニックマウスであるＯＴ－１マウスから摘出したリンパ節を１００μｍフィルター上で破砕し、リンパ節細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液を、細胞増殖アッセイ試薬であるＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて、製造業者の指示にしたがって染色した。染色したリンパ節細胞 ２×１０５個を、１０％ウシ胎児血清、５０μＭ ２－メルカプトエタノール及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地 ２００μＬに懸濁し、最終濃度が９μｇ／ｍＬになるように実施例１若しくは８の抗原提示細胞外小胞又は参考例１の細胞外小胞を加え、９６穴丸底プレートで４日間培養した。９６穴丸底プレートで３日間培養した後、免疫染色を行った。染色に使用した抗体は以下のとおりである（染色時間：１５分、温度：４℃）。染色後、ＯＴ－１ Ｔ細胞における細胞増殖アッセイ試薬であるＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔの発光強度をフローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
　・ＡＰＣコンジュゲート抗マウスＣＤ８抗体（５３－６．７ Biolegend社製）
　・ＰＥコンジュゲート抗マウスＴＣＲ Ｖｂ５．１，５．２抗体（ＭＲ９－４ Biolegend社製）
　結果を図１１に示す。
［結果］
　試験例９の結果より、実施例１と実施例８の抗原提示細胞外小胞は、参考例１の細胞外小胞と比較して、抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を顕著に増殖させた（図１１）。これは、ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ＣＤ８１に例示される構成要件（Ａ）とＣＤ８１―ＩＬ―２に例示される構成要件（Ｂ）が別々のタンパク質として存在する細胞外小胞だけでなく、ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ＣＤ８１―ＩＬ―２に例示される、両者の機能を具備した融合タンパク質が存在する細胞外小胞であっても同等の効果をＴ細胞に奏することを示す。
試験例１０：抗原提示細胞外小胞による抗腫瘍効果の評価実験
　安定細胞株から精製した抗原提示細胞外小胞が抗腫瘍効果を持つかどうかを調べるためにＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２コンジェニックマウスにＯＶＡを発現するＢ１６メラノーマ細胞１×１０５個を皮下に摂取し、３日後１×１０５個のＯＴ－１Ｔ細胞を移入した。ＯＴ－１Ｔ細胞移入後、１日、４日、７日後に実施例８の抗原提示細胞外小胞若しくは参考例１の細胞外小胞　５０μｇをレシピエントマウスの尾静脈から移入し、Ｂ１６メラノーマ細胞の大きさを観察した。
［結果］
　試験例１０の結果より、実施例８の抗原提示細胞外小胞は、参考例１の細胞外小胞と比較して、Ｂ１６メラノーマ細胞の増殖を顕著に抑制した（図１２）。これは、ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ＣＤ８１に例示される構成要件（Ａ）とＣＤ８１―ＩＬ―２に例示される構成要件（Ｂ）が別々のタンパク質として存在する細胞外小胞だけでなく、ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ＣＤ８１―ＩＬ―２に例示される、両者の機能を具備した融合タンパク質が存在する細胞外小胞であっても同等の医薬効果を奏することを示す。
［実施例１０］ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ＣＤ８１―IL―２融合タンパク質を発現するｍＲＮＡの調製
ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ＣＤ８１―IL―２をコードするｐＥＴ―１５ｂベクターをＥａｇＩを用いて直線化したものをＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｇｅｌ／ＰＣＲエクストラクションキット（日本ジェネティックス社）を用いて精製し、Ｔ７　ｍＳｃｒｉｐｔ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｍＲＮＡ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ社製）を用いて製造業者の指示にしたがって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写およびキャップ化、ｐｏｌｙＡ付加を行った。合成したｍＲＮＡを実施例１０の抗原提示細胞及び抗原提示細胞外小胞を産出するＲＮＡとして用いた（図１Ｎ）。
［参考例６］ＣＤ６３－ＡｋａＬｕｃ融合タンパク質を発現するｍＲＮＡの調製
　ＣＤ６３－ＡｋａＬｕｃをコードするｐＥＴ―１５ｂベクターをＥｃｏＲＩを用いて直線化したものをＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｇｅｌ／ＰＣＲエクストラクションキット（日本ジェネティックス社）を用いて精製し、Ｔ７　ｍＳｃｒｉｐｔ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｍＲＮＡ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ社製）を用いて製造業者の指示にしたがって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写およびキャップ化、ｐｏｌｙＡ付加を行った。合成したｍＲＮＡを参考例６のコントロールＲＮＡとして用いた（図１Ｏ）。
試験例１１：ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ＣＤ８１―ＩＬ―２融合タンパク質を発現するｍＲＮＡによるＯＶＡ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ＯＴ－１ Ｔ細胞）の活性化実験
　ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ＣＤ８１―ＩＬ―２融合タンパク質を発現するｍＲＮＡが抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化等するかどうかを調べるために、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて以下の試験を実施した。
　ＯＶＡ反応性ＴＣＲトランスジェニックマウスであるＯＴ－１マウスからリンパ節を摘出し、１００μｍフィルター上で破砕し、リンパ節細胞懸濁液を得た。ＣＤ４５．１コンジェニックマウスからも同様にリンパ節を摘出し、リンパ球懸濁液を調製した。それぞれのリンパ球懸濁液を１：１の割合で混合し、細胞増殖アッセイ試薬であるＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔを用いて染色した。ＰＢＳに懸濁した１×１０７個のＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ染色した混合リンパ球懸濁液を、ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２コンジェニックマウスの尾静脈から移入した。翌日、実施例１０若しくは参考例６のｍＲＮＡ　１０μｇを製造業者の指示にしたがって、ｉｎｖｉｖｏ－ｊｅｔＲＮＡトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社）と混合し、ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２コンジェニックマウスに尾静脈から移入した。細胞移入４日後、レシピエントマウスから脾臓を摘出し、リンパ球懸濁液を調製し、免疫染色を行った。染色に使用した抗体は以下のとおりである（染色時間：１５分、温度：４℃）。染色後、移入したＯＴ－１ Ｔ細胞及び野生型ＣＤ８Ｔ細胞における細胞増殖アッセイ試薬であるＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔの発光強度をフローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
　・ＰＥ－Ｃｙ７コンジュゲート抗マウスＣＤ８抗体（５３－６．７ Biolegend社製）
　・ＰＥコンジュゲート抗マウスＴＣＲ Ｖｂ５．１，５．２抗体（ＭＲ９－４ Biolegend社製）
　・ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＣＤ４５．１抗体（Ａ２０ Biolegend社製）
　・ＡＰＣコンジュゲート抗マウスＣＤ４５．２抗体（１０４ Biolegend社製）
　結果を図１３に示す。
［結果］
　試験例１１の結果より、実施例１０のｍＲＮＡは参考例６ののｍＲＮＡと比較して、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、他のＣＤ８陽性Ｔ細胞（抗原非特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞）をほとんど活性化等することなく、抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を顕著に分化及び／又は増殖させた（図１３）。特に原理にこだわらないが、本発明に係るポリヌクレオチドがＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２コンジェニックマウス体内の任意の細胞に導入され、その細胞の膜表面及び/又はその細胞から分泌される細胞外小胞の膜表面にｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ＣＤ８１―ＩＬ―２融合タンパク質が発現して、抗原提示細胞及び/又は抗原提示細胞外小胞が生成され、その生成された抗原提示細胞及び/又は抗原提示細胞外小胞と、ＯＴ－１ Ｔ細胞が接触して、ＯＶＡ反応性ＣＤ８Ｔ細胞が増殖したと解される。これは、上記試験例１～１０で示した、抗原提示細胞外小胞のT細胞活性化の効果と同等の効果が抗原提示細胞及び/又は抗原提示細胞外小胞を作製するためのポリヌクレオチドでもｉｎ ｖｉｖｏにおいて得られることを示している。
試験例１２：ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ＣＤ８１―ＩＬ―２融合タンパク質を発現するｍＲＮＡによる内在性ＯＶＡ反応性Ｔ細胞の活性化実験
　実施例１０若しくは参考例６のｍＲＮＡ１０μｇを製造業者の指示にしたがって、ｉｎｖｉｖｏ－ｊｅｔＲＮＡトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社）と混合し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈から移入した。移入４日後、レシピエントマウスから脾臓を摘出し、リンパ球懸濁液を調製し、ＯＶＡ反応性Ｔ細胞を製造業者の指示にしたがって、テトラマーで免疫染色を行った。染色に使用した抗体は以下のとおりである。染色後、テトラマー陽性細胞をフローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
・ＡＰＣコンジュゲートＨ－２Ｋｂ　ＯＶＡ　Ｔｅｔｒａｍｅｒ（ＴＥＴＲＡＭＥＲ　ＳＨＯＰ社）
　・ＰＥコンジュゲートＨ－２Ｋｂ　ＯＶＡ　Ｔｅｔｒａｍｅｒ（ＴＥＴＲＡＭＥＲ　ＳＨＯＰ社）
　・Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ４２１コンジュゲート抗マウスＣＤ８抗体（５３－６．７　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
［結果］
　試験例１２の結果より、実施例１０のｍＲＮＡは、参考例６のｍＲＮＡと比較して、顕著に内在性に存在するＯＶＡ反応性ＣＤ８Ｔ細胞を増殖させた（図１４）。特に原理にこだわらないが、本発明に係るポリヌクレオチドがＣ５７ＢＬ／６マウス体内の任意の細胞に導入され、その細胞の膜表面及び/又はその細胞から分泌される細胞外小胞の膜表面にｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ＣＤ８１―ＩＬ―２融合タンパク質が発現して、抗原提示細胞及び/又は抗原提示細胞外小胞が生成され、その生成された抗原提示細胞及び/又は抗原提示細胞外小胞と、内在性のＴ細胞が接触して、ＯＶＡ反応性ＣＤ８Ｔ細胞が増殖したと解される。これは上記試験例１～１０で示した、抗原提示細胞外小胞の医薬としての効果と同等の効果が抗原提示細胞及び/又は抗原提示細胞外小胞を作製するためのポリヌクレオチドでもｉｎ ｖｉｖｏにおいて得られることを示している。
試験例１３：ｉｎ　ｖｉｖｏにおける、抗原提示細胞外小胞によるＯＶＡ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞（ＯＴ－２　Ｔ細胞）のＴｈ１Ｔ細胞への分化誘導実験
　ＯＶＡ反応性ＴＣＲトランスジェニックマウスであるＯＴ－２マウスからリンパ節を摘出し、１００μｍフィルター上で破砕し、リンパ節細胞懸濁液を得る。ＣＤ４５．１コンジェニックマウスからも同様にリンパ節を摘出し、リンパ球懸濁液を調製した。それぞれのリンパ球懸濁液を１：１の割合で混合し、細胞増殖アッセイ試薬であるＣｅｌｌＴｒａｃｅ　Ｖｉｏｌｅｔを用いて染色する。ＰＢＳに懸濁した１×１０７個のＣｅｌｌＴｒａｃｅ　Ｖｉｏｌｅｔ染色した混合リンパ球懸濁液を、ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２コンジェニックマウスの尾静脈から移入する。リンパ球移入後、１日および４日後、実施例６若しくは参考例１の細胞外小胞５０μｇを、ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２コンジェニックマウスに皮下から移入する。細胞移入７日後、レシピエントマウスから脾臓を摘出し、リンパ球懸濁液を調製し、免疫染色を行う。染色には以下の抗体を用いる（染色時間：１５分、温度：４℃）。染色後、移入したＯＴ－２　Ｔ細胞及び野生型ＣＤ４Ｔ細胞における細胞増殖アッセイ試薬であるＣｅｌｌＴｒａｃｅ　Ｖｉｏｌｅｔの発光強度をフローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出する。
　・ＡＰＣ－Ｃｙ７コンジュゲート抗マウスＣＤ４抗体（ＲＭ４－５　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５コンジュゲート抗マウスＴＣＲＶａ２抗体（Ｂ２０．１　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＣＤ４５．１抗体（Ａ２０　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＰＥ－Ｃｙ７コンジュゲート抗マウスＣＤ４５．２抗体（１０４　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
・ＰＥコンジュゲート抗Ｔ－ｂｅｔ抗体（４Ｂ１０　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　［結果］
　試験例１３の結果より、実施例６の細胞外小胞は参考例１の細胞外小胞と比較して、ｉｎ－ｖｉｖｏにおいて、他のＣＤ４陽性Ｔ細胞（抗原非特異的なＣＤ４陽性Ｔ細胞）をほとんど活性化等することなく、抗原特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞を顕著にＴｈ１へと分化させることができる（図１５）。
試験例１４：抗原提示細胞外小胞による抗腫瘍効果の評価実験
　実施例６の細胞外小胞が抗腫瘍効果を持つかどうかを調べるためにＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２コンジェニックマウスにＯＶＡを発現するＢ１６メラノーマ細胞１×１０５個を皮下に摂取し、１日後５×１０５個のＯＴ－２Ｔ細胞を移入した。ＯＴ－２Ｔ細胞移入後、１日、４日、７日後に実施例６の抗原提示細胞外小胞若しくは参考例１の細胞外小胞　５０μｇをレシピエントマウスの皮下から移入し、Ｂ１６メラノーマ細胞の大きさを観察した。
［結果］
　試験例１４の結果より、実施例６の抗原提示細胞外小胞は、参考例１の細胞外小胞と比較して、Ｂ１６メラノーマ細胞の増殖を顕著に抑制した（図１６）。
［実施例１１］ＨＬＡクラスＩＩ分子、ヒトＴ細胞共刺激分子、及びヒトＴ細胞刺激性サイトカインを膜に含む抗原提示細胞外小胞
　Ｂ２ｍを欠損させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を細胞培養ディッシュに播種し、２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地で培養した。約５０％コンフルエンスの細胞に、製造業者の指示にしたがって、上記で調製したプラスミド（ＨＬＡＤＲ－１ｓｃ－ＴＰＩ１－ヒトＣＤ８１、ヒトＣＤ８０－ヒトＣＤ９、ヒトＩＬ－１２ｓｃ－ＭＦＧｅ８をそれぞれコードするｐＣＡＧベクター）をＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ“Ｍａｘ”（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、２つ同時にトランスフェクトした。トランスフェクションの３－１２時間後に培地を交換し、トランスフェクションの２４時間後にエクソソームを除去した２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地に培地を交換した。トランスフェクションの７２時間後、上清を回収し、該上清を０．２２μｍフィルターに通した後、３００ｇで５分間遠心分離した。上清を回収し、該上清を２，０００ｇ、２０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１０，０００ｇ、３０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１００，０００ｇで２時間遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットをＰＢＳで洗浄した。ペレットにＰＢＳを加え、１００，０００ｇで２時間、遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットを１００μＬのＰＢＳで懸濁したものを、実施例１１のヒト化抗原提示細胞外小胞として用いた（図２J）。抗原提示細胞外小胞の濃度は、ＢＣＡタンパクアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用い、製造業者の指示にしたがって測定した。
試験例１５：細胞外小胞の膜に含まれる融合タンパク質のフローサイトメトリー解析
　実施例１１の抗原提示細胞外小胞を、ＰＳ　Ｃａｐｔｕｒｅ（商標）　エクソソームフローサイトメトリーキット（富士フイルム和光純薬株式会社製）によって、製造業者の指示にしたがって免疫染色を行った。染色に使用した抗体は以下のとおりである。染色後、各融合タンパク質の発現を、フローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
　・ＰＥ　コンジュゲート抗ヒトＨＬＡ－ＤＲＢ１抗体（ＮＦＬＤ．Ｄ２　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＰＥコンジュゲート抗ヒトＣＤ８０抗体（Ｗ１７１４９Ｄ　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＩＬ－１２抗体（Ｃ１１．５　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　結果を図１７に示す。
［結果］
　試験例１５の結果より、実施例１１の抗原提示細胞外小胞は、その膜に、ネオアンチゲンであるＴＰＩ―１抗原を提示するＭＨＣクラスＩＩ分子（すなわちＨＬＡ－ＤＲ）、ＣＤ８０、及びＩＬ－１２を含むことが分かる（図１７）
試験例１６：ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける、抗原提示細胞外小胞によるＴＰＩ―１特異的ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞のＴｈ１Ｔ細胞への分化誘導実験
　ヒト化抗原提示細胞外小胞が抗原特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＴｈ１Ｔ細胞へと分化誘導するかどうかを調べるために、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて以下の試験を実施した。　ｐｌａｔＡ細胞（レトロウイルスパッケージ細胞）にＴＰＩ―１ペプチド特異的なＴＣＲ（Ｔ細胞受領隊）および蛍光タンパクＶｅｎｕｓをコードしたｐＭＸｓベクターをＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ“Ｍａｘ”（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの３－１２時間後に培地を交換し、トランスフェクションの４８時間後、７２時間後に上清を回収し、上清を０．２２μｍフィルターに通し、ＴＰＩ－１特異的ＴＣＲを発現するレトロウイルス上清を作成した。ＨＬＡ―ＤＲ１陽性のレシピエントから末梢血を採取し、Ｆｉｃｏｌを用いて末梢血単核球細胞を分離し、２．０×１０６個の末梢血単核球細胞を１０％ウシ胎児血清、５０μＭ　２－メルカプトエタノール及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地　２００μＬに懸濁し、最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬになるようにヒトＩＬ－２、および２５μｌのｄｙｎａｂｅａｄｓを混合し、６穴プレートで２４時間刺激をした。上記で調製したウイルス粒子を、レトロネクチン（ＴＡＫＡＲＡ社）を用い製造業者の指示通りに感染させ、ＴＰＩ－１ペプチド特異的なＴＣＲおよび蛍光タンパクＶｅｎｕｓを同時に発現するヒトＴ細胞を作成した。作製したヒトＴ細胞に実施例１１若しくは参考例１の細胞外小胞を加え、９６穴丸底プレートで７日間培養した。７日後、細胞を回収し、細胞外免疫染色を行った。染色使用した抗体は以下のとおりである（染色時間：１５分、温度：４℃）。細胞外染色後、Ｔｒｕｅ－Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｅｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）及び抗Ｔ－ｂｅｔ抗体を用いて、製造業者の指示にしたがって細胞内免疫染色を行った。細胞内染色後Ｖｅｎｕｓ発光強度とＴｈ１Ｔ細胞のマーカーであるＴ－ｂｅｔおよびＩＦＮ―γの発現をフローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出する。
　・ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＣＤ４抗体（Ａ１６１Ａ１　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ　４２１コンジュゲート抗ヒトＩＦＮ－ｒ抗体（４Ｓ．Ｂ３　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
・ＰＥコンジュゲート抗Ｔ－ｂｅｔ抗体（４Ｂ１０　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　［結果］
　試験例１６の結果より、実施例１１の抗原提示細胞外小胞は、参考例１の細胞外小胞と比較して、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、ＴＰＩ―１ペプチド抗原特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＴｈ１細胞へと分化誘導させた（図１８）。Ｔｈ１細胞はＩＦＮ－γやＩＬ－２等を産生し、病原体細胞、ウイルスに感染した細胞、がん細胞等の破壊を行う、マクロファージや細胞傷害性Ｔ細胞の活性化を促す（すなわち細胞性免疫の活性化）。
［実施例１２］ＭＨＣクラスＩ分子、Ｔ細胞共刺激分子、及びＴ細胞刺激性サイトカインを安定に発現する細胞株の樹立と抗原提示細胞外小胞の調製
　ＰＬＡＴ―Ａ細胞を細胞培養ディッシュに播種し、２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地で培養した。約５０％コンフルエンスの細胞に、製造業者の指示にしたがって、ＣＤ８０－ＭＦＧ－Ｅ８またはｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ＣＤ８１―ＩＬ―２をコードするｐＭＸベクターをＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ“Ｍａｘ”（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてそれぞれトランスフェクトした。トランスフェクションの１２時間後に培地を交換し、トランスフェクションの６０時間後、上清を回収し、３００ｇで５分間遠心分離した。回収した上清をウイルス粒子として用いた。　ＨＥＫ２９３細胞を細胞培養ディッシュに播種し、２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地で培養した。約５０％コンフルエンスの細胞に、上記で調製したＣＤ８０－ＭＦＧ－Ｅ８を組み込んだウイルス粒子にＤＯＴＡＰトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を製造業者の指示にしたがって加え、ＨＥＫ２９３細胞に添加した。ウイルス粒子を加えた細胞は２５００ｒｐｍで３時間、遠心感染を行った。感染２４時間後、培地を交換し１週間後、ＣＤ８０陽性細胞をＦＡＣＳＭｅｌｏｄｙ（ＢＤバイオサイエンシス社製）でソーティングした。ソーティングしたＣＤ８０陽性細胞を１週間培養した後、ディッシュに播種し、２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地で培養した。約５０％コンフルエンスの細胞に上記で調製したｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ＣＤ８１―ＩＬ―２を組み込んだウイルス粒子にＤＯＴＡＰトランスフェクション試薬を製造業者の指示にしたがって加え、ＣＤ８０陽性ＨＥＫ２９３細胞に添加した。ウイルス粒子を加えた細胞は２５００ｒｐｍで３時間、遠心感染を行った。感染２４時間後、培地を交換し１週間後、ＣＤ８０陽性、ＭＨＣＩ陽性細胞をＦＡＣＳＭｅｌｏｄｙ（ＢＤバイオサイエンシス社製）でソーティングした。ソーティングした細胞を安定発現細胞として用いた。安定発現細胞をディッシュに播種し、２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地で培養した。約５０％コンフルエンスの細胞の上清をエクソソームを除去した２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地に培地を交換した。培地交換７２時間後、上清を回収し、該上清を０．２２μｍフィルターに通した後、３００ｇで５分間遠心分離した。上清を回収し、該上清を２，０００ｇ、２０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１０，０００ｇ、３０分間、遠心分離した。上清を回収し、該上清を１００，０００ｇで２時間遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットをＰＢＳで洗浄した。ペレットにＰＢＳを加え、１００，０００ｇで２時間、遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットを１００μＬのＰＢＳで懸濁したものを、実施例１２の抗原提示細胞外小胞として用いた。
試験例１７：抗原提示細胞外小胞による抗腫瘍効果の評価実験
　安定細胞株から精製した抗原提示細胞外小胞が抗腫瘍効果を持つかどうかを調べるためにＣ５７ＢＬ／６マウスにＯＶＡを発現するＥＬ－４細胞１×１０５個を皮下に摂取した。ＥＬ－４細胞摂取後、１日、４日、７日後に実施例１２の抗原提示細胞外小胞若しくは参考例１の細胞外小胞　５０μｇをレシピエントマウスの尾静脈から移入し、ＥＬ－４細胞の大きさを観察した。
［結果］
　試験例１７の結果より、実施例１２の抗原提示細胞外小胞は、参考例１の細胞外小胞と比較して、ＥＬ－４細胞の増殖を顕著に抑制した（図１９）。
［実施例１Ａ］ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－Ｔ２Ａ－ＩＬ－２－ＣＤ８－Ｐ２Ａ－ＣＤ８０をコードするｍＲＮＡの調製
　ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－Ｔ２Ａ－ＩＬ－２－ＣＤ８－Ｐ２Ａ－ＣＤ８０をコードするｐＥＴ―１５ｂベクターをＨｉｎｄＩＩＩを用いて直線化したものをＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｇｅｌ／ＰＣＲエクストラクションキット（日本ジェネティックス社）を用いて精製し、Ｔ７　ｍＳｃｒｉｐｔ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｍＲＮＡ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ社製）を用いて製造業者の指示にしたがって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写およびキャップ化、ｐｏｌｙＡ付加を行った。合成したｍＲＮＡを実施例１Ａの抗原提示細胞を誘導するＲＮＡとして用いた（図１Ｐ）。
［参考例１Ａ］コントロールｍＲＮＡの調製
　ＣＤ８１をコードするｐＥＴ―１５ｂベクターをＨｉｎｄＩＩＩを用いて直線化したものをＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｇｅｌ／ＰＣＲエクストラクションキット（日本ジェネティックス社）を用いて精製し、Ｔ７　ｍＳｃｒｉｐｔ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｍＲＮＡ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ社製）を用いて製造業者の指示にしたがって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写およびキャップ化、ｐｏｌｙＡ付加を行った。合成したｍＲＮＡを参考例１ＡのコントロールＲＮＡとして用いた（図１Ｑ）。
［参考例２Ａ］ＯＶＡをコードするｍＲＮＡの調製
　ＯＶＡをコードするｐＥＴ―１５ｂベクターをＨｉｎｄＩＩＩを用いて直線化したものをＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｇｅｌ／ＰＣＲエクストラクションキット（日本ジェネティックス社）を用いて精製し、Ｔ７　ｍＳｃｒｉｐｔ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｍＲＮＡ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ社製）を用いて製造業者の指示にしたがって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写およびキャップ化、ｐｏｌｙＡ付加を行った。合成したｍＲＮＡを参考例２ＡのコントロールＲＮＡとして用いた（図１Ｒ）。
試験例１Ａ：ｍＲＮＡによって誘導される抗原提示細胞のフローサイトメトリー解析
　Ｂ１６メラノーマ細胞を細胞培養ディッシュに播種し、２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地で培養した。約５０％コンフルエンスの細胞に、製造業者の指示にしたがって、実施例１ＡのｍＲＮＡおよび参考例１ＡのｍＲＮＡをＴｒａｎｓＩＴ－ｍＲＮＡ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｍｉｒｕｓ社製）を用いてそれぞれトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、Ｂ１６メラノーマ細胞を回収し、製造業者の指示にしたがって免疫染色を行った。染色に使用した抗体は以下のとおりである（染色時間：１５分、温度：４℃）。染色後、各タンパク質の発現を、フローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
　・ＰＥコンジュゲート抗マウスＨ－２ＫｂＯＶＡ複合体抗体（２５－Ｄ１．１６　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＣＤ８０抗体（１６－１０Ａ１　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＡＰＣコンジュゲート抗マウスＩＬ－２抗体（ＪＥＳ６－５Ｈ４　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
［結果］
　試験例１Ａの結果より、実施例１ＡのｍＲＮＡをＯＶＡを発現したＢ１６メラノーマ細胞（ＭＯ４細胞）にトランスフェクションすることで、ＭＯ４細胞上に抗原―ＭＨＣＩ複合体、ＣＤ８０およびＩＬ－２を発現させた（図２０）。
試験例２Ａ：ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける、抗原提示細胞によるＯＶＡ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ＯＴ－１　Ｔ細胞）の活性化実験
　抗原提示細胞が抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化等するかどうかを調べるために、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて以下の試験を実施した。
　ＯＶＡ反応性ＴＣＲトランスジェニックマウスであるＯＴ－１マウスから摘出したリンパ節を１００μｍフィルター上で破砕し、リンパ節細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液を、細胞増殖アッセイ試薬であるＣｅｌｌＴｒａｃｅ　Ｖｉｏｌｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、製造業者の指示にしたがって染色した。染色したリンパ節細胞　２×１０５個を、１０％ウシ胎児血清、５０μＭ　２－メルカプトエタノール及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地　２００μＬに懸濁し、実施例１Ａ又は参考例１Ａ、参考例２ＡのｍＲＮＡをｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎしたＭＯ４細胞１×１０４個を加え、９６穴丸底プレートで３日間培養した後、免疫染色を行った。染色に使用した抗体は以下のとおりである（染色時間：１５分、温度：４℃）。染色後、ＯＴ－１　Ｔ細胞における細胞増殖アッセイ試薬であるＣｅｌｌＴｒａｃｅ　Ｖｉｏｌｅｔの発光強度をフローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
　・ＡＰＣコンジュゲート抗マウスＣＤ８抗体（５３－６．７　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＰＥコンジュゲート抗マウスＴＣＲ　Ｖｂ５．１，５．２抗体（ＭＲ９－４　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
［結果］
　試験例２Ａの結果より、実施例１ＡのｍＲＮＡによって誘導された抗原提示細胞は、参考例１Ａ～２ＡのｍＲＮＡをｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎしたＭＯ４細胞と比較して、抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を顕著に増殖させた（図２１）。
試験例３Ａ：ｉｎｖｉｖｏでメラノーマ細胞を抗原提示細胞に変換する実験
　ＯＶＡを発現するＢ１６メラノーマ細胞１×１０５個をヌードマウスの皮下に摂取し、腫瘍の体積が１００ｍｍ３程度になった後に、ｍＲＮＡ９μｇを製造業者の指示にしたがって、ｉｎｖｉｖｏ－ｊｅｔＲＮＡトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社）と混合し、腫瘍内に投与した。翌日、レシピエントマウスから腫瘍を摘出し、腫瘍懸濁液を調製し、製造業者の指示にしたがって免疫染色を行った。染色に使用した抗体は以下のとおりである（染色時間：１５分、温度：４℃）。染色後、各タンパク質の発現を、フローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
　・ＰＥコンジュゲート抗マウスＨ－２ＫｂＯＶＡ複合体抗体（２５－Ｄ１．１６　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＰＥ－Ｃｙ７コンジュゲート抗マウスＣＤ８０抗体（１６－１０Ａ１　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＡＰＣコンジュゲート抗マウスＩＬ－２抗体（ＪＥＳ６－５Ｈ４　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
・Ｐａｃｉｆｉｃ　Ｂｌｕｅコンジュゲート抗マウスＣＤ４５抗体（３０－Ｆ１１　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
・ＦＩＴＣコンジュゲート抗Ｈ２－Ｋｄ抗体（ＳＦ１－１．１　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　［結果］
　試験例３Ａの結果より、実施例１ＡのｍＲＮＡは生体内において、ＯＶＡを発現するＢ１６メラノーマ細胞の膜表面にＯＶＡｐ－ＭＨＣＩ、ＩＬ－２－ＣＤ８およびＣＤ８０タンパク質の発現を誘導した（図２２）。これは生体内においてメラノーマ細胞の一部を抗原提示細胞へと変換させたことを示す。
試験例４Ａ：ｉｎｖｉｖｏで誘導した抗原提示細胞による内在性ＯＶＡ反応性Ｔ細胞の活性化実験
　実施例１Ａ若しくは参考例１Ａ～２ＡのｍＲＮＡ２μｇを製造業者の指示にしたがって、ｉｎｖｉｖｏ－ｊｅｔＲＮＡトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社）と混合し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈から移入した。移入７日後、レシピエントマウスから脾臓を摘出し、リンパ球懸濁液を調製し、ＯＶＡ反応性Ｔ細胞を製造業者の指示にしたがって、テトラマーで免疫染色を行った。染色に使用した抗体は以下のとおりである。染色後、テトラマー陽性細胞をフローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
・ＡＰＣコンジュゲートＨ－２Ｋｂ　ＯＶＡ　Ｔｅｔｒａｍｅｒ（ＴＥＴＲＡＭＥＲ　ＳＨＯＰ社）
　・ＰＥコンジュゲートＨ－２Ｋｂ　ＯＶＡ　Ｔｅｔｒａｍｅｒ（ＴＥＴＲＡＭＥＲ　ＳＨＯＰ社）
　・Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ４２１コンジュゲート抗マウスＣＤ８抗体（５３－６．７　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
［結果］
　試験例４Ａの結果より、実施例１ＡのｍＲＮＡは、参考例１Ａ～２ＡのｍＲＮＡと比較して、顕著に内在性に存在するＯＶＡ反応性ＣＤ８Ｔ細胞を増殖させた（図２３）。特に原理にこだわらないが、本発明に係るｍＲＮＡがＣ５７ＢＬ／６マウス体内の任意の細胞に導入され、その細胞の膜表面にＯＶＡｐ－ＭＨＣＩ、ＩＬ－２－ＣＤ８およびＣＤ８０タンパク質がそれぞれ発現した抗原提示細胞が誘導され、内在性のＴ細胞が抗原提示細胞と接触して、ＯＶＡ反応性ＣＤ８Ｔ細胞が増殖したと解される。
［実施例２Ａ］ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－Ｔ２Ａ－ＩＬ－１５ｓａ－Ｐ２Ａ－ＣＤ８０をコードするｍＲＮＡの調製
　ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－Ｔ２Ａ－ＴｆＲ－ＩＬ－１５ｓａ－Ｐ２Ａ－ＣＤ８０をコードし、Ｔ７プロモーター、３‘ＵＴＲにヒトαグロブリン配列および１２９塩基のｐｏｌｙＡ配列をもつベクターをＨｉｎｄＩＩＩを用いて直線化したものをＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｇｅｌ／ＰＣＲエクストラクションキット（日本ジェネティックス社）を用いて精製し、ＨｉＳｃｒｉｂｅ　Ｔ７　ｍＲＮＡ　Ｋｉｔ　ｗｉｔｈ　ＣｌｅａｎＣａｐ　Ｒｅａｇｅｎｔ　ＡＧ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて製造業者の指示にしたがって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写およびキャップ化を行った。合成したｍＲＮＡを実施例２Ａの抗原提示細胞を誘導するＲＮＡとして用いた（図２４（ａ））。
試験例５Ａ：ｍＲＮＡによって誘導される抗原提示細胞のフローサイトメトリー解析
　２９３Ｔ細胞を細胞培養ディッシュに播種し、２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地で培養した。約５０％コンフルエンスの細胞に、製造業者の指示にしたがって、実施例２ＡのｍＲＮＡをＴｒａｎｓＩＴ－ｍＲＮＡ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｍｉｒｕｓ社製）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、２９３Ｔ細胞を回収し、製造業者の指示にしたがって免疫染色を行った。染色に使用した抗体は以下のとおりである（染色時間：１５分、温度：４℃）。染色後、各タンパク質の発現を、フローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
　・ＰＥコンジュゲート抗マウスＨ－２ＫｂＯＶＡ複合体抗体（２５－Ｄ１．１６　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＣＤ８０抗体（１６－１０Ａ１　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＡＰＣコンジュゲート抗ＤＹＫＤＤＤＤＫ　Ｔａｇ抗体（Ｌ５　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
［結果］
　試験例５Ａの結果より、実施例２ＡのｍＲＮＡを２９３Ｔ細胞にトランスフェクションすることで、２９３Ｔ細胞上に抗原―ＭＨＣＩ複合体、ＣＤ８０およびＩＬ－１５ｓａを発現させた（図２５）。
試験例６Ａ：ｉｎｖｉｖｏで誘導した抗原提示細胞による内在性ＯＶＡ反応性Ｔ細胞の活性化実験
　実施例２Ａ若しくは参考例１ＡのｍＲＮＡ　５μｇを製造業者の指示にしたがって、ｉｎｖｉｖｏ－ｊｅｔＲＮＡトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社）と混合し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈から移入した。移入７日後、レシピエントマウスから脾臓を摘出し、リンパ球懸濁液を調製し、ＯＶＡ反応性Ｔ細胞を製造業者の指示にしたがって、テトラマーで免疫染色を行った。染色に使用した抗体は以下のとおりである。染色後、テトラマー陽性細胞をフローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
・ＦＩＴＣ－コンジュゲート抗マウスＣＤ６２Ｌ抗体（ＭＥＬ１４　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
・ＡＰＣコンジュゲートＨ－２Ｋｂ　ＯＶＡｐ　Ｔｅｔｒａｍｅｒ（ＴＥＴＲＡＭＥＲ　ＳＨＯＰ社）
　・ＰＥコンジュゲートＨ－２Ｋｂ　ＯＶＡｐ　Ｔｅｔｒａｍｅｒ（ＴＥＴＲＡＭＥＲ　ＳＨＯＰ社）
・ＰＥ／Ｃｙａｎｉｎｅ７コンジュゲート抗マウスＣＤ８抗体（５３－６．７　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＡＰＣ／Ｃｙａｎｉｎｅ７－コンジュゲート抗マウスＣＤ４４抗体（ＩＭ７　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
［結果］
　試験例６Ａの結果より、実施例２ＡのｍＲＮＡは、参考例１ＡのｍＲＮＡと比較して、顕著に内在性に存在するＯＶＡ反応性ＣＤ８Ｔ細胞を増殖させた（図２６）。また増殖した細胞はＣＤ４４ｈｉＣＤ６２ｌｏｗのエフェクターメモリーフェノタイプとなった（すなわち、増殖した細胞は、同一抗原に再度暴露した際に速やかにサイトカインを産生し、免疫応答できることを意味する）。特に原理にこだわらないが、本発明に係るｍＲＮＡがＣ５７ＢＬ／６マウス体内の任意の細胞に導入され、その細胞の膜表面にＯＶＡ－ＭＨＣＩ、ＩＬ－１５ｓａおよびＣＤ８０タンパク質がそれぞれ発現した抗原提示細胞が誘導され、内在性のＴ細胞が抗原提示細胞と接触して、ＯＶＡ反応性ＣＤ８Ｔ細胞が増殖したと解される。
［実施例３Ａ］ネオアンチゲンを提示するｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－Ｔ２Ａ－ＩＬ－２－ＣＤ８－Ｐ２Ａ－ＣＤ８０をコードするｍＲＮＡの調製
　ＯＶＡペプチドの代わりにＭＣ３８大腸がん細胞株由来のネオアンチゲン（ガン抗原）である変異Ｇｔｆ２iペプチド提示するｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－Ｔ２Ａ－ＩＬ－２－ＣＤ８－Ｐ２Ａ－ＣＤ８０をコードするベクターをＨｉｎｄＩＩＩを用いて直線化したものをＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｇｅｌ／ＰＣＲエクストラクションキット（日本ジェネティックス社）を用いて精製し、Ｔ７　ｍＳｃｒｉｐｔ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｍＲＮＡ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ社製）を用いて製造業者の指示にしたがって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写およびキャップ化、ｐｏｌｙＡ付加を行った。合成したｍＲＮＡを実施例３Ａの抗原提示細胞を誘導するＲＮＡとして用いた（図２４（ｂ））。
試験例７Ａ：ｍＲＮＡによって誘導されるネオアンチゲンを提示する抗原提示細胞のフローサイトメトリー解析
　２９３Ｔ細胞を細胞培養ディッシュに播種し、２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地で培養した。約５０％コンフルエンスの細胞に、製造業者の指示にしたがって、実施例３ＡのｍＲＮＡをＴｒａｎｓＩＴ－ｍＲＮＡ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｍｉｒｕｓ社製）を用いてそれぞれトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、２９３Ｔ細胞を回収し、製造業者の指示にしたがって免疫染色を行った。染色に使用した抗体は以下のとおりである（染色時間：１５分、温度：４℃）。染色後、各タンパク質の発現を、フローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
　・ＰＥコンジュゲート抗マウスβ２－ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ抗体（Ａ１６０４１Ａ　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＣＤ８０抗体（１６－１０Ａ１　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＡＰＣコンジュゲート抗マウスＩＬ－２抗体（ＪＥＳ６－５Ｈ４　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
［結果］
　試験例７Ａの結果より、実施例３ＡのｍＲＮＡを２９３Ｔ細胞にトランスフェクションすることで、２９３Ｔ細胞上にネオアンチゲン―ＭＨＣＩ複合体、ＣＤ８０およびＩＬ－２を発現させた（図２７）。
試験例８Ａ：ｉｎｖｉｖｏで誘導した抗原提示細胞による内在性Ｇｔｆ２ｉ反応性Ｔ細胞の活性化実験
　実施例３Ａ若しくは参考例１ＡのｍＲＮＡ３μｇを製造業者の指示にしたがって、ｉｎｖｉｖｏ－ｊｅｔＲＮＡトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社）と混合し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈から移入した。移入７日後、レシピエントマウスから脾臓を摘出し、リンパ球懸濁液を調製し、Ｇｔｆ２ｉ　反応性Ｔ細胞を製造業者の指示にしたがって、テトラマーで免疫染色を行った。染色に使用した抗体は以下のとおりである。染色後、テトラマー陽性細胞をフローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
・ＦＩＴＣ－コンジュゲート抗マウスＣＤ６２Ｌ抗体（ＭＥＬ１４　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
・ＡＰＣコンジュゲートＨ－２Ｋｂ　Ｇｔｆ２ｉｐ　Ｔｅｔｒａｍｅｒ（ＴＥＴＲＡＭＥＲ　ＳＨＯＰ社）
　・ＰＥコンジュゲートＨ－２Ｋｂ　Ｇｔｆ２ｉｐ　Ｔｅｔｒａｍｅｒ（ＴＥＴＲＡＭＥＲ　ＳＨＯＰ社）
　・ＰＥ／Ｃｙａｎｉｎｅ７コンジュゲート抗マウスＣＤ８抗体（５３－６．７　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＡＰＣ／Ｃｙａｎｉｎｅ７－コンジュゲート抗マウスＣＤ４４抗体（ＩＭ７　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
［結果］
　試験例８Ａの結果より、実施例３ＡのｍＲＮＡは、参考例１ＡのｍＲＮＡと比較して、顕著に内在性に存在するＧｔｆ２ｉ反応性ＣＤ８Ｔ細胞を増殖させた（図２８）。また増殖した細胞はＣＤ４４ｈｉＣＤ６２ｌｏｗのエフェクターメモリーフェノタイプとなった。特に原理にこだわらないが、本発明に係るｍＲＮＡがＣ５７ＢＬ／６マウス体内の任意の細胞に導入され、その細胞の膜表面にネオアンチゲン－ＭＨＣＩ、ＩＬ－２－ＣＤ８およびＣＤ８０タンパク質がそれぞれ発現した抗原提示細胞が誘導され、内在性のＴ細胞が抗原提示細胞と接触して、ネオアンチゲン反応性ＣＤ８Ｔ細胞が増殖したと解される。
［実施例４Ａ］ＯＶＡｐ－ＭＨＣＩＩβ－Ｐ２Ａ－ＭＨＣＩＩα－Ｔ２Ａ－ＩＬ－１２ｓｃ－ＣＤ８－Ｐ２Ａ－ＣＤ８０をコードするｍＲＮＡの調製
　ＯＶＡｐ－ＭＨＣＩＩβ－Ｐ２Ａ－ＭＨＣＩＩα－Ｔ２Ａ－ＩＬ－１２ｓｃ－ＣＤ８－Ｐ２Ａ－ＣＤ８０をコードするＴ７プロモーター、３‘ＵＴＲにヒトαグロブリン配列および１２９塩基のｐｏｌｙＡ配列をもつベクターをＨｉｎｄＩＩＩを用いて直線化したものをＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｇｅｌ／ＰＣＲエクストラクションキット（日本ジェネティックス社）を用いて精製し、ＨｉＳｃｒｉｂｅ　Ｔ７　ｍＲＮＡ　Ｋｉｔ　ｗｉｔｈ　ＣｌｅａｎＣａｐ　Ｒｅａｇｅｎｔ　ＡＧ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて製造業者の指示にしたがって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写およびキャップ化を行った。合成したｍＲＮＡを実施例４Ａの抗原提示細胞を誘導するＲＮＡとして用いた（図２４（ｃ））。
試験例９Ａ：ｍＲＮＡによって誘導される抗原提示細胞のフローサイトメトリー解析
　２９３Ｔ細胞を細胞培養ディッシュに播種し、２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地で培養した。約５０％コンフルエンスの細胞に、製造業者の指示にしたがって、実施例４ＡのｍＲＮＡをＴｒａｎｓＩＴ－ｍＲＮＡ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｍｉｒｕｓ社製）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、２９３Ｔ細胞を回収し、製造業者の指示にしたがって免疫染色を行った。染色に使用した抗体は以下のとおりである（染色時間：１５分、温度：４℃）。染色後、各タンパク質の発現を、フローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
　・ＰＥコンジュゲート抗マウスＩＬ－１２／ＩＬ２３　ｐ４０抗体（２５－Ｄ１．１６　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＣＤ８０抗体（１６－１０Ａ１　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＡＰＣコンジュゲート抗ＭＨＣＩＩ抗体（Ｍ５／１１４．１５．２　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
［結果］
　試験例９Ａの結果より、実施例４ＡのｍＲＮＡを２９３Ｔ細胞にトランスフェクションすることで、２９３Ｔ細胞上にＯＶＡ―ＭＨＣＩＩ複合体、ＣＤ８０およびＩＬ－１２を発現させた（図２９）。
試験例１０Ａ：ｉｎｖｉｖｏで誘導した抗原提示細胞による内在性ＯＶＡ反応性Ｔ細胞の活性化実験
　抗原提示細胞が抗原特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＴｈ１細胞に分化させるかどうかを調べるために、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて以下の試験を実施した。
　ＯＶＡ反応性ＴＣＲトランスジェニックマウスであるＯＴ－ＩＩマウスからリンパ節を摘出し、１００μｍフィルター上で破砕し、リンパ節細胞懸濁液を得た。細胞増殖アッセイ試薬であるＣｅｌｌＴｒａｃｅ　Ｖｉｏｌｅｔを用いて染色した後、ＰＢＳに懸濁した５×１０６個のＣｅｌｌＴｒａｃｅ　Ｖｉｏｌｅｔ染色したリンパ球懸濁液を、ＣＤ４５．１コンジェニックマウスの尾静脈から移入した。翌日、実施例４Ａ若しくは参考例１Ａ若しくは参考例２ＡのｍＲＮＡ　１０μｇを製造業者の指示にしたがって、ｉｎｖｉｖｏ－ｊｅｔＲＮＡトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社）と混合し、ＣＤ４５．１コンジェニックマウスに尾静脈から移入した。ｍＲＮＡ移入７日後、レシピエントマウスから脾臓を摘出し、リンパ球懸濁液を調製し、免疫染色を行った。染色に使用した抗体は以下のとおりである（染色時間：１５分、温度：４℃）。染色後、移入したＯＶＡ反応性ＣＤ４Ｔ細胞における細胞増殖アッセイ試薬であるＣｅｌｌＴｒａｃｅ　Ｖｉｏｌｅｔの発光強度をフローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出した。
　・ＰＥ－Ｃｙ７コンジュゲート抗Ｔ－ｂｅｔ抗体（４Ｂ１０　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＰＥコンジュゲート抗マウスＴＣＲ　Ｖｂ５．１，５．２抗体（ＭＲ９－４　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＣＤ４５．１抗体（Ａ２０　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＡＰＣコンジュゲート抗マウスＣＤ４５．２抗体（１０４　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　・ＡＰＣ－Ｃｙ７コンジュゲート抗マウスＣＤ４抗体（ＲＭ４－５　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　結果を図３０に示す。
［結果］
　試験例１０Ａの結果より、実施例４ＡのｍＲＮＡは、参考例１Ａおよび参考例２ＡのｍＲＮＡと比較して、顕著にＯＶＡ反応性ＣＤ４Ｔ細胞を増殖させた（図３０）。また増殖した細胞の一部はＴ－ｂｅｔ陽性のＴｈ１細胞へと分化した。特に原理にこだわらないが、本発明に係るｍＲＮＡがＣ５７ＢＬ／６マウス体内の任意の細胞に導入され、その細胞の膜表面にＯＶＡ－ＭＨＣＩＩ、ＩＬ－１２およびＣＤ８０タンパク質がそれぞれ発現した抗原提示細胞が誘導され、ＯＶＡ反応性ＣＤ４Ｔ細胞細胞が抗原提示細胞と接触し、増殖およびＴｈ１細胞へと分化したと解される。
［実施例５Ａ］ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ（ＲＰＬ１８ペプチド）－ＣＤ８１―ＩＬ―２融合タンパク質を発現するｍＲＮＡの調製
　ＯＶＡペプチドの代わりにＭＣ３８大腸がん細胞株由来のネオアンチゲン（ガン抗原）である変異ＲＰＬ１８ペプチドを提示するｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ（ＲＰＬ１８ペプチド）－ＣＤ８１―ＩＬ―２をコードするｐＥＴ―１５ｂベクターをＥａｇＩを用いて直線化したものをＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｇｅｌ／ＰＣＲエクストラクションキット（日本ジェネティックス社）を用いて精製し、Ｔ７　ｍＳｃｒｉｐｔ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｍＲＮＡ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ社製）を用いて製造業者の指示にしたがって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写およびキャップ化、ｐｏｌｙＡ付加を行った。合成したｍＲＮＡを実施例５Ａの抗原提示細胞及び抗原提示細胞外小胞を産出するＲＮＡとして用いた。
試験例１１Ａ：ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ（ＲＰＬ１８ペプチド）－ＣＤ８１―ＩＬ―２融合タンパク質を発現するｍＲＮＡによる内在性ＲＰＬ１８ペプチド反応性Ｔ細胞の活性化実験
　実施例５Ａ若しくは参考例６のｍＲＮＡ１０μｇを製造業者の指示にしたがって、ｉｎｖｉｖｏ－ｊｅｔＲＮＡトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社）と混合し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈から移入した。移入４日後、レシピエントマウスから脾臓を摘出し、リンパ球懸濁液を調製し、ＲＰＬ１８ペプチド反応性Ｔ細胞を製造業者の指示にしたがって、テトラマーで免疫染色を行った。染色に使用した抗体は以下のとおりである。染色後、テトラマー陽性細胞をフローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエン
シス社製）で検出した。
・ＡＰＣコンジュゲートＨ－２Ｋｂ　ＲＰＬ１８　Ｔｅｔｒａｍｅｒ（ＴＥＴＲＡＭＥＲ　ＳＨＯＰ社）
　・ＰＥコンジュゲートＨ－２Ｋｂ　ＲＰＬ１８　Ｔｅｔｒａｍｅｒ（ＴＥＴＲＡＭＥＲ　ＳＨＯＰ社）
　・Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ４２１コンジュゲート抗マウスＣＤ８抗体（５３－６．７　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）
　試験例１１Ａの結果より、実施例５ＡのｍＲＮＡは、参考例６のｍＲＮＡと比較して、顕著に内在性に存在するＲＰＬ１８反応性ＣＤ８Ｔ細胞を増殖させた（図３１）。特に原理にこだわらないが、本発明に係るポリヌクレオチドがＣ５７ＢＬ／６マウス体内の任意の細胞に導入され、その細胞の膜表面及び／又はその細胞から分泌される細胞外小胞の膜表面にｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ＣＤ８１―ＩＬ―２融合タンパク質が発現して、抗原提示細胞及び／又は抗原提示細胞外小胞が生成され、その生成された抗原提示細胞及び／又は抗原提示細胞外小胞と、内在性のＴ細胞が接触して、ＲＰＬ１８反応性ＣＤ８Ｔ細胞が増殖したと解される。これは上記試験例１～１０で示した、抗原提示細胞外小胞の医薬としての効果と同等の効果が抗原提示細胞及び／又は抗原提示細胞外小胞を作製するためのポリヌクレオチドでもｉｎ　ｖｉｖｏにおいて得られることを示している。
［実施例１Ｂ］ＭＨＣクラスＩ分子及びＴ細胞刺激性サイトカインを膜に含む抗原提示細胞外小胞を作製するためのポリヌクレオチド
　ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ＣＤ８１及びＣＤ６３－ＩＬ－２をそれぞれコードするｐＥＴ―１５ｂベクターを直線化したものをＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｇｅｌ／ＰＣＲエクストラクションキット（日本ジェネティックス社）を用いて精製し、Ｔ７　ｍＳｃｒｉｐｔ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｍＲＮＡ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ社製）を用いて製造業者の指示にしたがって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写およびキャップ化、ｐｏｌｙＡ付加を行う。合成したｍＲＮＡを１：１で混合後、実施例１Ｂの抗原提示細胞外小胞を産出するためのＲＮＡとして用いる。
［実施例２Ｂ］ＭＨＣクラスＩ分子、Ｔ細胞共刺激分子、及びＴ細胞刺激性サイトカインを膜に含む抗原提示細胞外小胞を作製するためのポリヌクレオチド
　ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ＣＤ８１、ＣＤ８０－ＣＤ９、及びＣＤ６３－ＩＬ－２をそれぞれコードするｐＥＴ―１５ｂベクターを直線化したものをＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｇｅｌ／ＰＣＲエクストラクションキット（日本ジェネティックス社）を用いて精製し、Ｔ７　ｍＳｃｒｉｐｔ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｍＲＮＡ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ社製）を用いて製造業者の指示にしたがって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写およびキャップ化、ｐｏｌｙＡ付加を行う。合成したｍＲＮＡを１：１：１で混合後、実施例２Ｂの抗原提示細胞外小胞を産出するためのＲＮＡとして用いる。
［参考例２Ｂ］ＭＨＣクラスＩ分子を膜に含む細胞外小胞を作製するためのポリヌクレオチド
　ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ＣＤ８１をコードするｐＥＴ―１５ｂベクターを直線化したものをＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｇｅｌ／ＰＣＲエクストラクションキット（日本ジェネティックス社）を用いて精製し、Ｔ７　ｍＳｃｒｉｐｔ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｍＲＮＡ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ社製）を用いて製造業者の指示にしたがって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写およびキャップ化、ｐｏｌｙＡ付加を行う。合成したｍＲＮＡを参考例２Ｂの抗原提示細胞外小胞を産出するためのＲＮＡとして用いる。
［参考例３Ｂ］Ｔ細胞共刺激分子を膜に含む細胞外小胞を作製するためのポリヌクレオチド
　ＣＤ８０－ＣＤ９をコードするｐＥＴ―１５ｂベクターを直線化したものをＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｇｅｌ／ＰＣＲエクストラクションキット（日本ジェネティックス社）を用いて精製し、Ｔ７　ｍＳｃｒｉｐｔ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｍＲＮＡ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ社製）を用いて製造業者の指示にしたがって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写およびキャップ化、ｐｏｌｙＡ付加を行う。合成したｍＲＮＡを参考例３Ｂの抗原提示細胞外小胞を産出するためのＲＮＡとして用いる。
［参考例４Ｂ］Ｔ細胞刺激性サイトカインを膜に含む細胞外小胞を作製するためのポリヌクレオチド
　ＣＤ６３－ＩＬ－２をコードするｐＥＴ―１５ｂベクターを直線化したものをＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｇｅｌ／ＰＣＲエクストラクションキット（日本ジェネティックス社）を用いて精製し、Ｔ７　ｍＳｃｒｉｐｔ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｍＲＮＡ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ社製）を用いて製造業者の指示にしたがって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写およびキャップ化、ｐｏｌｙＡ付加を行う。合成したｍＲＮＡを参考例４Ｂの抗原提示細胞外小胞を産出するためのＲＮＡとして用いる。
［参考例５Ｂ］ＭＨＣクラスＩ分子及びＴ細胞共刺激分子を膜に含む細胞外小胞を作製するためのポリヌクレオチド
ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ＣＤ８１、及びＣＤ８０－ＣＤ９をそれぞれコードするｐＥＴ―１５ｂベクターを直線化したものをＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｇｅｌ／ＰＣＲエクストラクションキット（日本ジェネティックス社）を用いて精製し、Ｔ７　ｍＳｃｒｉｐｔ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｍＲＮＡ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ社製）を用いて製造業者の指示にしたがって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写およびキャップ化、ｐｏｌｙＡ付加を行う。合成したｍＲＮＡを１：１で混合し、参考例５Ｂの抗原提示細胞外小胞を産出するためのＲＮＡとして用いる。
試験例３Ｂ：ｉｎ ｖｉｖｏにおける、抗原提示細胞外小胞を作製するためのポリヌクレオチドによる、ＯＶＡ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ＯＴ－１ Ｔ細胞）の活性化実験
　ＯＶＡ反応性ＴＣＲトランスジェニックマウスであるＯＴ－１マウスからリンパ節を摘出し、試験例２Ｂと同様にリンパ球懸濁液を調製する。ＣＤ４５．１コンジェニックマウスからも同様にリンパ節を摘出し、リンパ球懸濁液を調製する。それぞれのリンパ球懸濁液を１：１の割合で混合し、細胞増殖アッセイ試薬であるＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔを用いて染色する。ＰＢＳに懸濁した１×１０７個のＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ染色した混合リンパ球懸濁液を、ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２コンジェニックマウスの尾静脈から移入する。翌日、実施例１Ａ～５Ａ，参考例２Ａ～５ＡのｍＲＮＡ 各々５０μｇをｉｎｖｉｖｏ－ｊｅｔＲＮＡトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社）と混合し、ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２コンジェニックマウスに尾静脈から移入する。細胞移入４日後、レシピエントマウスからリンパ節を摘出し、リンパ球懸濁液を調製し、免疫染色を行うことにより、各種Ｔ細胞を検出及び定量する。
　実施例１Ｂ及び２ＢのｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、抗原特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞を顕著に分化及び／又は増殖させることができる。
［実施例３Ｂ］ＭＨＣクラスＩＩ分子、Ｔ細胞共刺激分子、及びＴ細胞刺激性サイトカインを膜に含む抗原提示細胞外小胞１を作製するためのポリヌクレオチド
　ｓｃ－Ｄｉｍｅｒ－ＣＤ８１、ＭＨＣクラスＩＩα鎖、ＣＤ８０－ＣＤ９、及びＣＤ６３－ＩＬ－２をそれぞれコードするｐＥＴ―１５ｂベクターを直線化したものをＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｇｅｌ／ＰＣＲエクストラクションキット（日本ジェネティックス社）を用いて精製し、Ｔ７　ｍＳｃｒｉｐｔ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｍＲＮＡ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ社製）を用いて製造業者の指示にしたがって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写およびキャップ化、ｐｏｌｙＡ付加を行う。合成したｍＲＮＡを１：１：１：１で混合後、実施例３Ｂの抗原提示細胞外小胞を産出するためのＲＮＡとして用いる。
試験例４Ｂ：ｉｎ ｖｉｖｏにおける、抗原提示細胞外小胞を作製するためのポリヌクレオチドによる、ＯＶＡ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞（ＯＴ－２ Ｔ細胞）の活性化実験
　ＯＶＡ反応性ＣＤ４ＴＣＲトランスジェニックマウスであるＯＴ－２マウスからリンパ節を摘出し、試験例２と同様にリンパ球懸濁液を調製する。ＣＤ４５．１コンジェニックマウスからも同様にリンパ節を摘出し、リンパ球懸濁液を調製する。それぞれのリンパ球懸濁液を１：１の割合で混合し、細胞増殖アッセイ試薬であるＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔを用いて染色する。ＰＢＳに懸濁した１×１０７個のＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ染色した混合リンパ球懸濁液を、ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２コンジェニックマウスの尾静脈から移入する。翌日、実施例３ＢのｍＲＮＡ ５０μｇをｉｎｖｉｖｏ－ｊｅｔＲＮＡトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社）と混合し、ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２コンジェニックマウスに尾静脈から移入する。細胞移入４日後、レシピエントマウスからリンパ節を摘出し、リンパ球懸濁液を調製し、免疫染色を行うことにより、各種Ｔ細胞を検出及び定量する。
　実施例３ＢのｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、抗原特異的なＣＤ４陽性Ｔ細胞を顕著に分化及び／又は増殖させることができる。
［実施例４Ｂ］ＭＨＣクラスＩＩ分子、Ｔ細胞共刺激分子、及びＴ細胞刺激性サイトカインを膜に含む抗原提示細胞外小胞２を作製するためのポリヌクレオチド
　ｓｃ－Ｄｉｍｅｒ－ＣＤ８１、ＭＨＣクラスＩＩα鎖、ＣＤ８０－ＣＤ９、ＴＧＦ－β－ＭＦＧＥ８、及びＣＤ６３－ＩＬ－２をそれぞれコードするｐＥＴ―１５ｂベクターを直線化したものをＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｇｅｌ／ＰＣＲエクストラクションキット（日本ジェネティックス社）を用いて精製し、Ｔ７　ｍＳｃｒｉｐｔ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｍＲＮＡ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ社製）を用いて製造業者の指示にしたがって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写およびキャップ化、ｐｏｌｙＡ付加を行う。合成したｍＲＮＡを１：１：１：１：１で混合後、実施例４Ｂの抗原提示細胞外小胞を作製するためのＲＮＡとして用いる。
試験例５Ｂ：ｉｎ ｖｉｖｏにおける、抗原提示細胞外小胞を作製するためのポリヌクレオチドによる、ＯＶＡ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞（ＯＴ－２ Ｔ細胞）の活性化実験
　ＯＶＡ反応性ＣＤ４ＴＣＲトランスジェニックマウスであるＯＴ－２マウスからリンパ節を摘出し、試験例２Ｂと同様にリンパ球懸濁液を調製する。ＣＤ４５．１コンジェニックマウスからも同様にリンパ節を摘出し、リンパ球懸濁液を調製する。それぞれのリンパ球懸濁液を１：１の割合で混合し、細胞増殖アッセイ試薬であるＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔを用いて染色する。ＰＢＳに懸濁した１×１０７個のＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ染色した混合リンパ球懸濁液を、ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２コンジェニックマウスの尾静脈から移入する。翌日、実施例４ＢのｍＲＮＡ ５０μｇをｉｎｖｉｖｏ－ｊｅｔＲＮＡトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社）と混合し、ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２コンジェニックマウスに尾静脈から移入する。細胞移入４日後、レシピエントマウスからリンパ節を摘出し、リンパ球懸濁液を調製し、免疫染色を行うことにより、各種Ｔ細胞を検出及び定量する。
　実施例４ＢのｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、抗原特異的な制御性Ｔ細胞を顕著に分化及び／又は増殖させることができる。
［実施例５Ｂ］ＭＨＣクラスＩＩ分子、Ｔ細胞共刺激分子、及びＴ細胞刺激性サイトカインを膜に含む抗原提示細胞外小胞３を作製するためのポリヌクレオチド
　ｓｃ－Ｄｉｍｅｒ－ＣＤ８１、ＭＨＣクラスＩＩα鎖、ＣＤ８０－ＣＤ９、及びＣＤ８１－ＩＬ－４をそれぞれコードするｐＥＴ―１５ｂベクターを直線化したものをＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｇｅｌ／ＰＣＲエクストラクションキット（日本ジェネティックス社）を用いて精製し、Ｔ７　ｍＳｃｒｉｐｔ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｍＲＮＡ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ社製）を用いて製造業者の指示にしたがって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写およびキャップ化、ｐｏｌｙＡ付加を行う。合成したｍＲＮＡを１：１：１：１で混合後、実施例５Ｂの抗原提示細胞外小胞を作製するためのＲＮＡとして用いる。
試験例６Ｂ：ｉｎ ｖｉｖｏにおける、抗原提示細胞外小胞を作製するためのポリヌクレオチドによる、ＯＶＡ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞（ＯＴ－２ Ｔ細胞）の活性化実験
　ＯＶＡ反応性ＣＤ４ＴＣＲトランスジェニックマウスであるＯＴ－２マウスからリンパ節を摘出し、試験例２と同様にリンパ球懸濁液を調製する。ＣＤ４５．１コンジェニックマウスからも同様にリンパ節を摘出し、リンパ球懸濁液を調製する。それぞれのリンパ球懸濁液を１：１の割合で混合し、細胞増殖アッセイ試薬であるＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔを用いて染色する。ＰＢＳに懸濁した１×１０７個のＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ染色した混合リンパ球懸濁液を、ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２コンジェニックマウスの尾静脈から移入する。翌日、実施例３Ａ又は５ＡのｍＲＮＡ ５０μｇをｉｎｖｉｖｏ－ｊｅｔＲＮＡトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社）と各々混合し、ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２コンジェニックマウスに尾静脈から移入する。細胞移入４日後、レシピエントマウスからリンパ節を摘出し、リンパ球懸濁液を調製し、免疫染色を行うことにより、各種Ｔ細胞を検出及び定量する。
　実施例３Ｂ及び５ＢのｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、抗原特異的なＴｈ２細胞を顕著に分化及び／又は増殖させることができる。
［実施例６Ｂ］ＭＨＣクラスＩＩ分子、Ｔ細胞共刺激分子、及びＴ細胞刺激性サイトカインを膜に含む抗原提示細胞外小胞４を作製するためのポリヌクレオチド
　ｓｃ－Ｄｉｍｅｒ－ＣＤ８１―ＩＬ―１２ｐ４０、ＭＨＣクラスＩＩα鎖、ＣＤ８０－ＣＤ９、及びＩＬ―１２ｐ３５をそれぞれコードするｐＥＴ―１５ｂベクターを直線化したものをＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｇｅｌ／ＰＣＲエクストラクションキット（日本ジェネティックス社）を用いて精製し、Ｔ７　ｍＳｃｒｉｐｔ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｍＲＮＡ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ社製）を用いて製造業者の指示にしたがって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写およびキャップ化、ｐｏｌｙＡ付加を行う。合成したｍＲＮＡを１：１：１：１で混合後、実施例６Ｂの抗原提示細胞外小胞を作製するためのＲＮＡとして用いる。
［実施例７Ｂ］ＭＨＣクラスＩＩ分子、Ｔ細胞共刺激分子、及びＴ細胞刺激性サイトカインを膜に含む抗原提示細胞外小胞５を作製するためのポリヌクレオチド
　ｓｃ－Ｄｉｍｅｒ－ＣＤ８１、ＭＨＣクラスＩＩα鎖、ＣＤ８０－ＣＤ９、ＣＤ８１―IL―６及びＴＧＦ－β－ＭＦＧＥ８をそれぞれコードするｐＥＴ―１５ｂベクターを直線化したものをＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｇｅｌ／ＰＣＲエクストラクションキット（日本ジェネティックス社）を用いて精製し、Ｔ７　ｍＳｃｒｉｐｔ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｍＲＮＡ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ社製）を用いて製造業者の指示にしたがって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写およびキャップ化、ｐｏｌｙＡ付加を行う。合成したｍＲＮＡを１：１：１：１：１で混合後、実施例７Ｂの抗原提示細胞外小胞を作製するためのＲＮＡとして用いる。
［実施例８Ｂ］ＭＨＣクラスＩ分子、Ｔ細胞共刺激分子、及びＴ細胞刺激性サイトカインを膜に含む抗原提示細胞外小胞を作製するためのポリヌクレオチド
　ＣＤ８０－ＣＤ９、ｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ＣＤ８１―ＩＬ―２をそれぞれコードするｐＥＴ―１５ｂベクターを直線化したものをＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｇｅｌ／ＰＣＲエクストラクションキット（日本ジェネティックス社）を用いて精製し、Ｔ７　ｍＳｃｒｉｐｔ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｍＲＮＡ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ社製）を用いて製造業者の指示にしたがって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写およびキャップ化、ｐｏｌｙＡ付加を行う。合成したｍＲＮＡを１：１で混合後、実施例８Ｂの抗原提示細胞外小胞を作製するためのＲＮＡとして用いる。
［実施例９Ｂ］HLAクラスＩ分子、ヒトＴ細胞共刺激分子、及びヒトＴ細胞刺激性サイトカインを膜に含む抗原提示細胞外小胞を作製するためのポリヌクレオチド
　ｈｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ｈＣＤ８１、ｈＣＤ８０－ｈＣＤ９およびｈＣＤ６３－ＩＬ２をそれぞれコードするｐＥＴ―１５ｂベクターを直線化したものをＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｇｅｌ／ＰＣＲエクストラクションキット（日本ジェネティックス社）を用いて精製し、Ｔ７　ｍＳｃｒｉｐｔ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｍＲＮＡ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ社製）を用いて製造業者の指示にしたがって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写およびキャップ化、ｐｏｌｙＡ付加を行う。合成したｍＲＮＡを１：１：１で混合後、実施例７Ａの抗原提示細胞外小胞を産出するためのＲＮＡとして用いる。
試験例７Ｂ：ｉｎ ｖｉｖｏにおける、抗原提示細胞外小胞を作製するためのポリヌクレオチドによる、ＯＶＡ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞（ＯＴ－２ Ｔ細胞）の活性分化化実験
　ＯＶＡ反応性ＣＤ４ＴＣＲトランスジェニックマウスであるＯＴ－２マウスからリンパ節を摘出し、試験例２と同様にリンパ球懸濁液を調製する。ＣＤ４５．１コンジェニックマウスからも同様にリンパ節を摘出し、リンパ球懸濁液を調製する。それぞれのリンパ球懸濁液を１：１の割合で混合し、細胞増殖アッセイ試薬であるＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔを用いて染色する。ＰＢＳに懸濁した１×１０７個のＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ染色した混合リンパ球懸濁液を、ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２コンジェニックマウスの尾静脈から移入する。翌日、実施例３Ｂ又は６ＢのｍＲＮＡ ５０μｇをｉｎｖｉｖｏ－ｊｅｔＲＮＡトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社）と各々混合し、ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２コンジェニックマウスに尾静脈から移入する。細胞移入４日後、レシピエントマウスからリンパ節を摘出し、リンパ球懸濁液を調製し、免疫染色を行うことにより、各種Ｔ細胞を検出及び定量する。
　実施例３Ｂ及び６ＢのｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、抗原特異的なＴｈ１細胞を顕著に分化及び／又は増殖させることができる。
試験例８Ｂ：ｉｎ ｖｉｖｏにおける、抗原提示細胞外小胞を作製するためのポリヌクレオチドによる、ＯＶＡ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞（ＯＴ－２ Ｔ細胞）の活性分化実験
　ＯＶＡ反応性ＣＤ４ＴＣＲトランスジェニックマウスであるＯＴ－２マウスからリンパ節を摘出し、試験例２と同様にリンパ球懸濁液を調製する。ＣＤ４５．１コンジェニックマウスからも同様にリンパ節を摘出し、リンパ球懸濁液を調製する。それぞれのリンパ球懸濁液を１：１の割合で混合し、細胞増殖アッセイ試薬であるＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔを用いて染色する。ＰＢＳに懸濁した１×１０７個のＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ染色した混合リンパ球懸濁液を、ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２コンジェニックマウスの尾静脈から移入する。翌日、実施例７ＢのｍＲＮＡ ５０μｇをｉｎｖｉｖｏ－ｊｅｔＲＮＡトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社）と混合し、ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２コンジェニックマウスに尾静脈から移入する。細胞移入４日後、レシピエントマウスからリンパ節を摘出し、リンパ球懸濁液を調製し、免疫染色を行うことにより、各種Ｔ細胞を検出及び定量する。
　実施例７ＢのｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、抗原特異的なＴｈ１７細胞を顕著に分化及び／又は増殖させることができる。
試験例９Ｂ：ｉｎ ｖｉｖｏにおける、抗原提示細胞外小胞を作製するためのポリヌクレオチドによる、ＯＶＡ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ＯＴ－１ Ｔ細胞）の活性化実験
　ＯＶＡ反応性ＴＣＲトランスジェニックマウスであるＯＴ－１マウスからリンパ節を摘出し、試験例２Ｂと同様にリンパ球懸濁液を調製する。ＣＤ４５．１コンジェニックマウスからも同様にリンパ節を摘出し、リンパ球懸濁液を調製する。それぞれのリンパ球懸濁液を１：１の割合で混合し、細胞増殖アッセイ試薬であるＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔを用いて染色する。ＰＢＳに懸濁した１×１０７個のＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ染色した混合リンパ球懸濁液を、ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２コンジェニックマウスの尾静脈から移入する。翌日、実施例８ＢのｍＲＮＡ ５０μｇをｉｎｖｉｖｏ－ｊｅｔＲＮＡトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社）と混合し、ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２コンジェニックマウスに尾静脈から移入する。細胞移入４日後、レシピエントマウスからリンパ節を摘出し、リンパ球懸濁液を調製し、免疫染色を行うことにより、各種Ｔ細胞を検出及び定量する。
　実施例８ＢのｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、抗原特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞を顕著に分化及び／又は増殖させることができる。
試験例１０Ｂ：抗原提示細胞外小胞を作製するためのポリヌクレオチドによる、抗腫瘍効果の評価実験
　ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２コンジェニックマウスにＯＶＡを発現するＢ１６メラノーマ細胞１×１０５個を皮下に摂取し、３日後１×１０５個のＯＴ－１Ｔ細胞を移入する。ＯＴ－１Ｔ細胞移入後、１日、４日、７日後に実施例８ＢのｍＲＮＡ ５０μｇをｉｎｖｉｖｏ－ｊｅｔＲＮＡトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社）と混合し、レシピエントマウスの尾静脈から移入し、Ｂ１６メラノーマ細胞の大きさを観察する。
　実施例８ＢのｍＲＮＡはＢ１６メラノーマ細胞の増殖を顕著に抑制できる。
試験例１３Ｂ：ｉｎ　ｖｉｖｏにおける、抗原提示細胞外小胞を作製するためのポリヌクレオチドによる、ＯＶＡ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞（ＯＴ－２　Ｔ細胞）のＴｈ１Ｔ細胞への分化誘導実験
　ＯＶＡ反応性ＴＣＲトランスジェニックマウスであるＯＴ－２マウスからリンパ節を摘出し、１００μｍフィルター上で破砕し、リンパ節細胞懸濁液を得る。ＣＤ４５．１コンジェニックマウスからも同様にリンパ節を摘出し、リンパ球懸濁液を調製する。それぞれのリンパ球懸濁液を１：１の割合で混合し、細胞増殖アッセイ試薬であるＣｅｌｌＴｒａｃｅ　Ｖｉｏｌｅｔを用いて染色する。ＰＢＳに懸濁した１×１０７個のＣｅｌｌＴｒａｃｅ　Ｖｉｏｌｅｔ染色した混合リンパ球懸濁液を、ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２コンジェニックマウスの尾静脈から移入する。リンパ球移入後、１日および４日後、実施例６Ｂ若しくは参考例１ＢのｍＲＮＡ　５０μｇを、ｉｎｖｉｖｏ－ｊｅｔＲＮＡトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社）と混合し、レシピエントマウスの尾静脈から移入する。ｍＲＮＡ移入７日後、レシピエントマウスから脾臓を摘出し、リンパ球懸濁液を調製し、免疫染色を行う。染色には以下の抗体を用いる（染色時間：１５分、温度：４℃）。染色後、移入したＯＴ－２　Ｔ細胞及び野生型ＣＤ４Ｔ細胞における細胞増殖アッセイ試薬であるＣｅｌｌＴｒａｃｅ　Ｖｉｏｌｅｔの発光強度をフローサイトメーターＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンシス社製）で検出する。
　［結果］
　実施例６ＢのｍＲＮＡは抗原特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＴｈ１細胞へと分化させることができる。
試験例１４Ｂ：抗原提示細胞外小胞を作製するためのポリヌクレオチドによる、抗腫瘍効果の評価実験
　実施例６ＢのｍＲＮＡが、抗腫瘍効果を持つかどうかを調べるためにＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２コンジェニックマウスにＯＶＡを発現するＢ１６メラノーマ細胞１×１０５個を皮下に摂取し、１日後５×１０５個のＯＴ－２Ｔ細胞を移入する。ＯＴ－２Ｔ細胞移入後、１日、４日、７日後に実施例６ＢのｍＲＮＡ若しくは参考例１ＢのｍＲＮＡ　５０μｇを、ｉｎｖｉｖｏ－ｊｅｔＲＮＡトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社）と混合し、レシピエントマウスの尾静脈から移入し、Ｂ１６メラノーマ細胞の大きさを観察する。
　実施例６ＢのｍＲＮＡは、Ｂ１６メラノーマ細胞の増殖を抑制する。
［実施例１１Ｂ］ＨＬＡクラスＩＩ分子、ヒトＴ細胞共刺激分子、及びヒトＴ細胞刺激性サイトカインを膜に含む抗原提示細胞外小胞を作製するためのポリヌクレオチド
　　ＨＬＡＤＲ－１ｓｃ－ＴＰＩ１－ｈＣＤ８１、ｈＣＤ８０－ｈＣＤ９、ｈＩＬ－１２ｓｃ－ＭＦＧｅ８をそれぞれコードするｐＥＴ―１５ｂベクターを直線化したものをＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｇｅｌ／ＰＣＲエクストラクションキット（日本ジェネティックス社）を用いて精製し、Ｔ７　ｍＳｃｒｉｐｔ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｍＲＮＡ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ社製）を用いて製造業者の指示にしたがって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写およびキャップ化、ｐｏｌｙＡ付加を行う。合成したｍＲＮＡを１：１：１で混合後、実施例１１Ｂの抗原提示細胞外小胞を作製するためのＲＮＡとして用いる。
試験例１６Ｂ：ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける、抗原提示細胞外小胞を作製するためのポリヌクレオチドによるＴＰＩ―１特異的ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞のＴｈ１Ｔ細胞への分化誘導実験
　PｌａｔＡ細胞にＴＰＩ―１ペプチド特異的なＴＣＲおよび蛍光タンパクＶｅｎｕｓをコードしたｐＭＸｓベクターをＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ“Ｍａｘ”（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてトランスフェクトする。トランスフェクションの３－１２時間後に培地を交換し、トランスフェクションの４８時間後、７２時間後に上清を回収し、上清を０．２２μｍフィルターに通し、ＴＰＩ－１特異的ＴＣＲを発現するレトロウイルス上清を作成する。ＨＬＡ―ＤＲ１陽性のレシピエントから末梢血を採取し、Ｆｉｃｏｌを用いて末梢血単核球細胞を分離し、２．０×１０６個の末梢血単核球細胞を１０％ウシ胎児血清、５０μＭ　２－メルカプトエタノール及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地　２００μＬに懸濁し、最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬになるようにヒトＩＬ－２、および２５μｌのｄｙｎａｂｅａｄｓを混合し、６穴プレートで２４時間刺激をする。上記で調製したウイルス粒子を、レトロネクチン（ＴＡＫＡＲＡ社）を用い製造業者の指示通りに感染させ、ＴＰＩ－１ペプチド特異的なＴＣＲおよび蛍光タンパクＶｅｎｕｓを同時に発現するヒトＴ細胞を作製する。作製したヒトＴ細胞に、実施例１１Ｂ若しくは参考例１ＢのｍＲＮＡをｉｎｖｉｖｏ－ｊｅｔＲＮＡトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社）と混合後、添加し、９６穴丸底プレートで７日間培養する。
　［結果］
　実施例１１ＢのＲＮＡは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、抗原特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＴｈ１細胞へと分化誘導することができる。
［実施例１２Ｂ］ＭＨＣクラスＩ分子、Ｔ細胞共刺激分子、及びＴ細胞刺激性サイトカインを発現するポリヌクレオチドの調製
　ＰＬＡＴ―Ａ細胞を細胞培養ディッシュに播種し、２％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地で培養した。約５０％コンフルエンスの細胞に、製造業者の指示にしたがって、ＣＤ８０－ＭＦＧ－Ｅ８及びｓｃ－Ｔｒｉｍｅｒ－ＣＤ８１―ＩＬ―２をそれぞれコードするｐＥＴ―１５ｂベクターを直線化したものをＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｇｅｌ／ＰＣＲエクストラクションキット（日本ジェネティックス社）を用いて精製し、Ｔ７　ｍＳｃｒｉｐｔ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｍＲＮＡ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ社製）を用いて製造業者の指示にしたがって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写およびキャップ化、ｐｏｌｙＡ付加を行う。合成したｍＲＮＡを１：１で混合後、実施例１２Ｂの抗原提示細胞外小胞を作製するためのＲＮＡとして用いる。
試験例１７Ｂ：抗原提示細胞外小胞による抗腫瘍効果の評価実験
　安定細胞株から精製した抗原提示細胞外小胞が抗腫瘍効果を持つかどうかを調べるためにＣ５７ＢＬ／６マウスにＯＶＡを発現するＥＬ－４細胞１×１０５個を皮下に摂取した。ＥＬ－４細胞摂取後、１日、４日、７日後に実施例１２ＢのＲＮＡ若しくは参考例１のＲＮＡ　５０μｇを、ｉｎｖｉｖｏ－ｊｅｔＲＮＡトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社）と混合してから、レシピエントマウスの尾静脈から移入し、ＥＬ－４細胞の大きさを観察した。
　　実施例１２ＢのＲＮＡは、ＥＬ－４細胞の増殖を抑制できる。　
　以上、実施例で示されたとおり、本明細書中に記載の抗原提示細胞及び抗原提示細胞外小胞を作製するためのポリヌクレオチドは、抗原特異的なＴ細胞（例えば、抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞、抗原特異的ＣＤ４陽性細胞等）を満足に活性化、増殖及び／又は分化等することができるものである。
　以下に、配列表に含まれる配列の概要を記載する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000089
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000090
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000091
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000092
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000093
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000094
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000095
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000096
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000097
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000098
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000099
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000100
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000101
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000102
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000103

Claims (57)

  1. 　（ａ）抗原提示ＭＨＣ分子を含み、該抗原提示ＭＨＣ分子を、細胞又は細胞外小胞の膜外に提示可能な融合タンパク質（Ａ）をコードする配列；
    　（ｂ）すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む、該Ｔ細胞刺激性サイトカインを、細胞又は細胞外小胞の膜外に提示可能な融合タンパク質（Ｂ）をコードする配列；
    　（ｃ）Ｔ細胞共刺激分子を含む、該Ｔ細胞共刺激分子を、細胞又は細胞外小胞の膜外に提示可能な融合タンパク質（Ｃ）をコードする配列；
    　（ｄ）抗原提示ＭＨＣ分子と、すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカインまたはそのサブユニットを含み、該抗原と該Ｔ細胞刺激性サイトカインを、細胞又は細胞外小胞の膜外に提示可能な融合タンパク質（Ｄ）をコードする配列；及び
    　（ｅ）抗原提示ＭＨＣ分子と、すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカインまたはそのサブユニット、及びＴ細胞共刺激分子を含み、該抗原と該Ｔ細胞刺激性サイトカインと該Ｔ細胞共刺激分子を、細胞又は細胞外小胞の膜外に提示可能な融合タンパク質（Ｅ）をコードする配列；
    からなる群から選択されるすくなくとも１つの配列を含むポリヌクレオチド。
  2. 　前記（Ａ）で規定される融合タンパク質が、抗原提示ＭＨＣ分子と、
    　　細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン、あるいは
    　　細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはその膜結合ドメイン
    とを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 　前記（Ａ）で規定される融合タンパク質が、抗原提示ＭＨＣ分子と、
    　　テトラスパニン又はその膜貫通ドメイン、あるいはＭＦＧ－Ｅ８又はその膜結合ドメイン
    を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  4. 　前記（Ａ）で規定される融合タンパク質が、膜貫通ドメインを含む抗原提示ＭＨＣ分子を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  5. 　前記（Ａ）で規定される融合タンパク質が：
    　そのＮ末端側から、
    　（Ａ－１）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
    　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
    　（Ａ－３）単鎖ＭＨＣ分子のアミノ酸配列、
    　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
    　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
    をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  6. 　前記（Ａ）で規定される融合タンパク質が
    　そのＮ末端側から、
    　（Ａ－１）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
    　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
    　（Ａ－３）ＭＨＣクラスＩα鎖、β２ミクログロブリン、ＭＨＣクラスＩＩα鎖、又はＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ酸配列
    　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
    　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
    をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  7. 　さらに、（Ａ－６）β２ミクログロブリン、ＭＨＣクラスＩα鎖、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖、又はＭＨＣクラスＩＩα鎖のアミノ酸配列をコードする配列を含む、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
  8. 　前記（Ａ）で規定される融合タンパク質が、
    　そのＮ末端側から、
    　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
    　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
    　（Ａ－３）単鎖ＭＨＣクラスＩ分子のアミノ酸配列、
    　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
    　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
    をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、請求項１の記載のポリヌクレオチド。
  9. 　前記（Ａ）で規定される融合タンパク質が、
    　そのＮ末端側から、
    　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
    　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
    　（Ａ－３）ＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ酸配列、
    　（Ａ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
    　（Ａ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
    をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  10. 　さらに（Ａ－６）ＭＨＣクラスＩＩα鎖のアミノ酸配列をコードする配列を含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
  11. 　前記（Ａ）で規定される融合タンパク質が：
    　そのＮ末端側から、
    　（Ａ－１）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
    　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
    　（Ａ－３）膜貫通ドメインを含む単鎖ＭＨＣ分子のアミノ酸配列、
    をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  12. 　前記（Ａ）で規定される融合タンパク質が
    　そのＮ末端側から、
    　（Ａ－１）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
    　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
    　（Ａ－３）ＭＨＣクラスＩα鎖、β２ミクログロブリンとＭＨＣクラスＩα鎖の融合タンパク質、ＭＨＣクラスＩＩα鎖、又はＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ酸配列
    をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  13. 　さらに、（Ａ－６）β２ミクログロブリン、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖、又はＭＨＣクラスＩＩα鎖のアミノ酸配列をコードする配列を含む、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
  14. 　前記（Ａ）で規定される融合タンパク質が、
    　そのＮ末端側から、
    　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
    　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
    　（Ａ－３）膜貫通ドメインを含む単鎖ＭＨＣクラスＩ分子のアミノ酸配列、
    をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、請求項１の記載のポリヌクレオチド。
  15. 　前記（Ａ）で規定される融合タンパク質が、
    　そのＮ末端側から、
    　（Ａ－１）ＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
    　（Ａ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
    　（Ａ－３）ＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ酸配列、
    をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  16. 　さらにＭＨＣクラスＩＩα鎖のアミノ酸配列をコードする配列を含む、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
  17. 　前記（Ｂ）で規定される融合タンパク質が、すくなくとも１つのＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットと、
    　　細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン、あるいは
    　　細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはそのドメイン
    とを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  18. 　前記（Ｂ）で規定される融合タンパク質が、すくなくとも１つのＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットと、テトラスパニンの部分配列とを含み、該テトラスパニンの部分配列が、２つの膜貫通ドメインを少なくとも有し、該すくなくとも１つのＴ細胞刺激性サイトカインが、該２つの膜貫通ドメインの間に配置されている、請求項１の記載のポリヌクレオチド。
  19. 　前記（Ｂ）で規定される融合タンパク質が、すくなくとも１つのＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットと、ＭＦＧ－Ｅ８又はその膜結合ドメインとを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  20. 　前記（Ｂ）で規定される融合タンパク質が
    　そのＮ末端側から、
    　（Ｂ－１）Ｎ末端側から、膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列、
    　（Ｂ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
    　（Ｂ－３）第１のＴ細胞刺激性サイトカインのアミノ酸配列、
    　（Ｂ－４）存在していてもよいスペーサー配列、並びに
    　（Ｂ－５）膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列
    をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  21. 　前記（Ｂ）で規定される融合タンパク質が
    　そのＮ末端側から、
    　（Ｂ－３）第１のＴ細胞刺激性サイトカインのアミノ酸配列、
    　（Ｂ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
    　（Ｂ－５）ＭＦＧ－Ｅ８又はその膜結合ドメインのアミノ酸配列
    をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  22. 　前記（Ｂ）で規定される融合タンパク質が、すくなくとも１つのＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットと、ＣＤ８又はその膜貫通ドメインを含む、請求項１の記載のポリヌクレオチド。
  23. 　前記（Ｂ）で規定される融合タンパク質が
    　そのＮ末端側から、
    　（Ｂ－３）第１のＴ細胞刺激性サイトカインのアミノ酸配列、
    　（Ｂ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
    　（Ｂ－５）ＣＤ８又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
    をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  24. 　前記Ｔ細胞刺激性サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２のサブユニット、ＩＬ－１５又はＴＧＦ－βである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  25. 　前記（Ｃ）で規定される融合タンパク質が、Ｔ細胞共刺激分子と、
    　　細胞又は細胞外小胞の膜に発現することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン、あるいは
    　　細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはその膜結合ドメイン
    とを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  26. 　前記（Ｃ）で規定される融合タンパク質が、Ｔ細胞共刺激分子と、
    　　テトラスパニン若しくはその膜貫通ドメイン、あるいは
    　　ＭＦＧ－Ｅ８若しくはその膜結合ドメイン
    とを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  27. 　前記（Ｃ）で規定される融合タンパク質が、膜貫通ドメインを含むＴ細胞共刺激分子を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  28. 　前記（Ｃ）で規定される融合タンパク質が
    そのＮ末端側から、
    　（Ｃ－１）Ｔ細胞共刺激分子のアミノ酸配列、
    　（Ｃ－２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
    　（Ｃ－３）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインのアミノ酸配列
    をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  29. 　前記（Ｄ）で規定される融合タンパク質が、
    　前記抗原提示ＭＨＣ分子、
    　前記すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニット、及び
    　　細胞又は細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメインあるいは、
    　　細胞又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはその膜結合ドメイン
    とを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  30. 　前記細胞外小胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞外小胞の膜に結合することが可能なタンパク質が、テトラスパニン又はＭＦＧ－Ｅ８である、請求項２９に記載のポリヌクレオチド。
  31. 　前記細胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質又は細胞の膜に結合することが可能なタンパク質が、ＣＤ８である、請求項２９に記載のポリヌクレオチド。
  32. 　前記（Ｄ）で規定される融合タンパク質が、
    そのＮ末端側から、
    　（Ｄ－１）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列、
    　（Ｄ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
    　（Ｄ－３）単鎖ＭＨＣ分子のアミノ酸配列、
    　（Ｄ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
    　（Ｄ－５）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインあるいはＭＦＧ－Ｅ８又はその膜結合ドメインと、前記すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む融合ペプチドのアミノ酸配列、
    をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  33. 　前記（Ｄ）で規定される融合タンパク質が、
    そのＮ末端側から、
    　（Ｄ－１）テトラスパニン又はその膜貫通ドメインあるいはＭＦＧ－Ｅ８又はその膜結合ドメインと、前記すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む融合ペプチドのアミノ酸配列
    　（Ｄ－２）存在していてもよいスペーサー配列、
    　（Ｄ－３）単鎖ＭＨＣ分子のアミノ酸配列、
    　（Ｄ－４）存在していてもよいスペーサー配列、及び
    　（Ｄ－５）ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドのアミノ酸配列を、
    をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  34. 　前記テトラスパニン又はその膜貫通ドメインあるいはＭＦＧ－Ｅ８又はその膜結合ドメインと、前記すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む融合ペプチドが、
    そのＮ末端側から、
    　（１）膜貫通ドメイン１、小型細胞外ループ、膜貫通ドメイン２、小型細胞内ループ及び膜貫通ドメイン３を含むテトラスパニンの部分配列、
    　（２）存在していてもよいスペーサー配列、
    　（３）前記すくなくとも１つのＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットのアミノ酸配列、
    　（４）存在していてもよいスペーサー配列、並びに
    　（５）膜貫通ドメイン４を含むテトラスパニンの部分配列
    をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、請求項３２又は３３に記載のポリヌクレオチド。
  35. 　テトラスパニン又はその膜貫通ドメインあるいはＭＦＧ－Ｅ８又はその膜結合ドメインと、前記すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットを含む、前記融合ペプチドが、
    そのＮ末端側から、
    　（１）前記すくなくとも１のＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットのアミノ酸配列、
    　（２）存在していてもよいスペーサー配列、及び
    　（３）ＭＦＧ－Ｅ８又はその膜結合ドメインのアミノ酸配列
    をこの順番で含むアミノ酸配列を含む、請求項３２又は３３に記載のポリヌクレオチド。
  36. 　前記（Ｄ）で規定される融合タンパク質が、
    　前記抗原提示ＭＨＣ分子と、前記すくなくとも１種のＴ細胞刺激性サイトカイン又はそのサブユニットと、細胞の膜に局在することが可能な膜タンパク質若しくはその膜貫通ドメイン又は細胞の膜に結合することが可能なタンパク質若しくはその膜結合ドメインとを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  37. 　前記ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子拘束性抗原ペプチドであり、前記単鎖ＭＨＣ分子が、ＭＨＣクラスＩα鎖の細胞外領域を含む、請求項３２又は３３に記載のポリヌクレオチド。
  38. 　前記ＭＨＣ分子拘束性抗原ペプチドがＭＨＣクラスＩI分子拘束性抗原ペプチドであり、前記単鎖ＭＨＣ分子が、ＭＨＣクラスＩIα鎖の細胞外ドメイン及び／又はＭＨＣクラスＩIβ鎖の細胞外ドメインを含む、請求項３２又は３３に記載のポリヌクレオチド。
  39. 　前記（ａ）で規定される配列と前記（ｂ）で規定される配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  40. 　前記融合タンパク質（Ａ）と前記融合タンパク質（Ｂ）が融合したアミノ酸配列をコードしている、請求項３９に記載のポリヌクレオチド。
  41. 　すくなくとも１つの２Ａペプチドを介して　融合タンパク質（Ａ）と融合タンパク質（Ｂ）が融合したアミノ酸配列をコードしている、請求項４０に記載のポリヌクレオチド。
  42. 　さらに前記（ｃ）で規定される配列を含む、請求項３９に記載のポリヌクレオチド。
  43. 　前記融合タンパク質（Ａ）、前記融合タンパク質（Ｂ）及び前記融合タンパク質（Ｃ）が融合したアミノ酸配列をコードしている、請求項４２に記載のポリヌクレオチド。
  44. 　各々独立したすくなくとも１つの２Ａペプチドを介して、前記融合タンパク質（Ａ）、前記融合タンパク質（Ｂ）、及び前記融合タンパク質（Ｃ）が融合したアミノ酸配列をコードしている、請求項４１に記載のポリヌクレオチド。
  45. 　５’端より、
    　　前記（ａ）で規定される配列；
    　　第一のすくなくとも１つの２Ａペプチドをコードする配列；
    　　前記（ｂ）で規定される配列；
    　　第二のすくなくとも１つの２Ａペプチドをコードする配列；及び
    　　前記（ｃ）で規定される配列を
    をこの順番で含む、請求項４４に記載のポリヌクレオチド。
  46. 　前記（ｄ）で規定される配列を含む請求項１の記載のポリヌクレオチド。
  47. 　さらに前記（ｃ）で規定される配列を含む、請求項４６の記載のポリヌクレオチド。
  48. 　前記融合タンパク質（Ｄ）と前記融合タンパク質（Ｃ）が融合したアミノ酸配列をコードしている、請求項４７に記載のポリヌクレオチド。
  49. 　すくなくとも１つの２Ａペプチドを介して　前記融合タンパク質（Ｄ）と前記融合タンパク質（Ｃ）が融合したアミノ酸配列をコードしている、請求項４８に記載のポリヌクレオチド。
  50. 　前記（ｅ）で規定される配列を含む請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  51. 　請求項１～５０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  52. 　請求項１～５０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は請求項５１に記載のベクターと、薬理学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  53. 　感染症を処置又は予防するための、請求項１～５０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は請求項５１に記載のベクターと、薬理学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  54. 　ガンを処置又は予防するための、請求項１～５０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は請求項５１に記載のベクターを含む、医薬組成物。
  55. 　自己免疫疾患を処置又は予防するための、請求項１～５０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は請求項５１に記載のベクターを含む、医薬組成物。
  56. 　アレルギー性疾患を処置又は予防するための、請求項１～５０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は請求項５１に記載のベクターを含む医薬組成物。
  57. 　特異的な抗原に対するＴ細胞を活性化及び／又は増殖させるための方法であって、請求項１～５０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は請求項５１に記載のベクターを細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで導入し、抗原提示細胞及び／又は抗原提示細胞外小胞を生成し、生成された抗原提示細胞及び／又は抗原提示細胞外小胞とＴ細胞とをｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏにおいて接触させることを含む、方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023210661A1 (ja) * 2022-04-25 2023-11-02 国立大学法人金沢大学 ＣＡＲ－Ｔ細胞活性化、造血幹細胞増殖、ｉＰＳ細胞分化を制御する組成物およびその用途

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016520518A (ja) * 2013-03-14 2016-07-14 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー ナノスケール人工抗原提示細胞
US20200071668A1 (en) * 2016-12-02 2020-03-05 The Catholic University Of Korea Industry-Academic Cooperation Foundation Exosome for stimulating t cell and pharmaceutical use thereof
JP2020534809A (ja) * 2017-09-06 2020-12-03 カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー シグナリング及び抗原提示の２機能性レセプター（ｓａｂｒ）
JP2020534864A (ja) * 2017-08-17 2020-12-03 イリアス バイオロジクス インコーポレイテッドＩｌｉａｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｉｎｃ． 標的特異的伝達のためのエクソソーム及びこれを製造及び伝達する方法
JP2021502122A (ja) * 2017-11-10 2021-01-28 ジュラ バイオ，インコーポレイテッド 主要組織適合複合体ベースのキメラ受容体および自己免疫疾患を治療するためのその使用
JP2021506304A (ja) * 2017-12-23 2021-02-22 ルビウス セラピューティクス， インコーポレイテッド 人工抗原提示細胞および使用方法
JP2021507682A (ja) * 2017-11-08 2021-02-25 エヴォックス・セラピューティクス・リミテッド Ｒｎａ治療薬を含むエクソソーム
WO2021172595A1 (ja) * 2020-02-28 2021-09-02 国立大学法人金沢大学 抗原提示細胞外小胞、それを含む組成物、及びそれらを製造するための方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016520518A (ja) * 2013-03-14 2016-07-14 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー ナノスケール人工抗原提示細胞
US20200071668A1 (en) * 2016-12-02 2020-03-05 The Catholic University Of Korea Industry-Academic Cooperation Foundation Exosome for stimulating t cell and pharmaceutical use thereof
JP2020534864A (ja) * 2017-08-17 2020-12-03 イリアス バイオロジクス インコーポレイテッドＩｌｉａｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｉｎｃ． 標的特異的伝達のためのエクソソーム及びこれを製造及び伝達する方法
JP2020534809A (ja) * 2017-09-06 2020-12-03 カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー シグナリング及び抗原提示の２機能性レセプター（ｓａｂｒ）
JP2021507682A (ja) * 2017-11-08 2021-02-25 エヴォックス・セラピューティクス・リミテッド Ｒｎａ治療薬を含むエクソソーム
JP2021502122A (ja) * 2017-11-10 2021-01-28 ジュラ バイオ，インコーポレイテッド 主要組織適合複合体ベースのキメラ受容体および自己免疫疾患を治療するためのその使用
JP2021506304A (ja) * 2017-12-23 2021-02-22 ルビウス セラピューティクス， インコーポレイテッド 人工抗原提示細胞および使用方法
WO2021172595A1 (ja) * 2020-02-28 2021-09-02 国立大学法人金沢大学 抗原提示細胞外小胞、それを含む組成物、及びそれらを製造するための方法
WO2021172596A1 (ja) * 2020-02-28 2021-09-02 国立大学法人金沢大学 免疫制御法、免疫制御用核酸組成物およびその用途

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023210661A1 (ja) * 2022-04-25 2023-11-02 国立大学法人金沢大学 ＣＡＲ－Ｔ細胞活性化、造血幹細胞増殖、ｉＰＳ細胞分化を制御する組成物およびその用途

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