KR20240052028A - 면역 제어법, 면역 제어용 핵산 조성물 및 그 용도 - Google Patents

면역 제어법, 면역 제어용 핵산 조성물 및 그 용도 Download PDF

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KR20240052028A
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도모요시 야마노
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도쿠리츠다이가쿠호징 가나자와다이가쿠
닛산 가가쿠 가부시키가이샤
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Abstract

항원 특이적인 T 세포를 만족스럽게 활성화하거나 하는 것이 가능한 세포 또는 세포 외 소포를 제작할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것. (a) 항원 제시 MHC 분자를 포함하고, 해당 항원 제시 MHC 분자를 세포 또는 세포 외 소포의 막 외에 제시 가능한 융합 단백질 (A)를 코딩하는 서열; (b) 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛을 포함하는, 해당 T 세포 자극성 사이토카인을 세포 또는 세포 외 소포의 막 외에 제시 가능한 융합 단백질 (B)를 코딩하는 서열; (c) T 세포 공자극 분자를 포함하는, 해당 T 세포 공자극 분자를 세포 또는 세포 외 소포의 막 외에 제시 가능한 융합 단백질 (C)를 코딩하는 서열; (d) 항원 제시 MHC 분자와, 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛을 포함하고, 해당 항원과 해당 T 세포 자극성 사이토카인을 세포 또는 세포 외 소포의 막 외에 제시 가능한 융합 단백질 (D)를 코딩하는 서열; 및 (e) 항원 제시 MHC 분자와, 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인; 또는 그 서브유닛 및 T 세포 공자극 분자를 포함하고, 해당 항원과 해당 T 세포 자극성 사이토카인과 해당 T 세포 공자극 분자를 세포 또는 세포 외 소포의 막 외에 제시 가능한 융합 단백질 (E)를 코딩하는 서열;로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

Description

면역 제어법, 면역 제어용 핵산 조성물 및 그 용도
<상호 참조>
본 출원은, 2021년 9월 1일 출원의 일본 특허 출원(일본 특허 출원 제2021-142688호)으로부터의 우선권을 향수하고, 선행기술문헌을 포함하는, 그 내용 전체를 인용에 의해 본 명세서에 포함한다.
본 발명은, 면역 제어법, 면역 제어용 핵산 조성물 및 그 용도에 관한 것이다.
생체에 의한 암 세포 등의 배제나, 자기 항원, 알레르기성 물질 등에 대한 응답의 조절 등의 면역 반응에는, 항원 특이적인 T 세포(예를 들어, 세포 상해성 T 세포, 헬퍼 T 세포 등)가 중심적인 작용을 하고 있는 것이 알려져 있다. 항원 특이적인 T 세포는, 수지상 세포나 마크로파지 등의 항원 제시 세포의 세포 표면의 MHC 분자와, 암, 알레르기성 물질 등에서 유래하는 항원과의 결합 복합체를 T 세포 수용체로 인식하여 활성화, 증식, 분화 등 한다. 활성화하거나 한 항원 특이적인 T 세포는, 항원을 제시하고 있는 암 세포 등을 특이적으로 상해하는 것이나, 자기 항원, 알레르기성 물질 등에 대한 응답을 조절한다. 따라서, 항원 특이적인 T 세포를 활성화, 증식, 분화시키거나 하는 것이, 면역 반응에 있어서 특히 중요하다고 생각되고 있다.
항원 특이적인 T 세포를 활성화시키거나 하는 방법으로서는, 이미 실용화되고 있는 T 세포에 키메라 항원 수용체를 발현시키는 방법뿐만 아니라, 기타 방법도 개발되고 있다. 예를 들어, 특허문헌 1은, MHC 분자와 T 세포 공자극 분자를 표면 상에 포함하는 나노 입자가, 항원 특이적인 T 세포를 증식시키는 것을 개시하고 있다. 또한, 비특허문헌 1은, PTGFRN을 통해 IL-12를 막 상에 발현시킨 엑소솜이, 모델 항원 특이적인 CD8 양성 T 세포를 증식시키는 것을 개시하고 있다.
일본 특허 공표 제2016-520518호 공보
Katherine Kirwin, et al., "Exosome Surface Display of IL-12 Results in Tumor-Retained Pharmacology with Superior Potency and Limited Systemic Exposure Compared to Recombinant IL-12", 2019년 11월6일, 34th Annual Meeting of the Society for Immuno-therapy of Cancer Journal of Extracellular Vesicles(2018); 7: 1535750 ONCOIMMUNOLOGY 2020, VOL. 9, NO.1, e1673125
본 발명자들은, 항원 특이적인 T 세포를 활성화하거나 할 수 있는 새로운 방법으로서, MHC 분자와 T 세포 공자극 분자를 막에 포함하는 세포 외 소포를 사용하는 방법을 시도하였다. 그러나, 이 세포 외 소포를 사용하여 항원 특이적인 T 세포의 활성화 등 시도한 바, 항원 특이적인 T 세포를 만족스럽게 활성화하거나 할 수 없는 것을 처음으로 알아내었다.
따라서, 본 발명은, 신규의 면역 제어법, 면역 제어용 핵산 조성물 및 그 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 감안하여, 예의 검토를 거듭한 바, 본 발명자는 의외로, MHC 분자, 및 T 세포 자극성 사이토카인을 막에 포함하는 세포 또는 세포 외 소포를 제작할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 사용함으로써, T 세포를 활성화하거나 할 수 있는 것을 알아내고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명은 이하의 것을 포함한다:
[0] 항원 제시 MHC 분자 및 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시하는 세포 또는 세포 외 소포.
[1] 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포이며, 그 막에 이하:
항원 제시 MHC 분자를 포함하는, 해당 항원을 막 외에 제시 가능한 단백질 (A); 및
T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛을 포함하는, 해당 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 단백질 (B);
를 포함하는, 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포.
[2] 상기 항원 제시 MHC 분자를 포함하는, 해당 항원을 막 외에 제시 가능한 단백질 (A)가,
항원 제시 MHC 분자와, 세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인 혹은 세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 막 결합 도메인을 포함하는, 해당 항원을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질 또는 단백질 복합체
인, [1]에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포.
[3] 상기 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛을 포함하는, 해당 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 단백질 (B)가,
T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛과, 세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인 혹은 세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 막 결합 도메인을 포함하는, 해당 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질
인, [1]에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포.
[4] 상기 항원 제시 MHC 분자를 포함하는, 해당 항원을 막 외에 제시 가능한 단백질 (A)가,
1) 항원 제시 MHC 분자와, 테트라스파닌 혹은 그 막 관통 도메인 또는 MFG-E8 혹은 그 막 결합 도메인을 포함하는, 해당 항원을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질 또는 단백질 복합체;
2) 그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-3) 단쇄 MHC 분자의 아미노산 서열,
(A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 결합 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질;
3) 그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-3) MHC 클래스 Iα쇄, β2 마이크로글로불린, MHC 클래스 IIα쇄, 또는 MHC 클래스 IIβ쇄의 아미노산 서열,
(A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질과,
(A-6) β2 마이크로글로불린, MHC 클래스 Iα쇄, MHC 클래스 IIβ쇄, 또는 MHC 클래스 IIα쇄의 아미노산 서열을 포함하는 단백질
을 포함하는, 단백질 복합체;
4) 그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열의 아미노산 서열,
(A-3) 단쇄 MHC 클래스 I 분자의 아미노산 서열,
(A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질;
5) 그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-3) MHC 클래스 IIβ쇄의 아미노산 서열,
(A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질과,
(A-6) MHC 클래스 IIα쇄의 아미노산 서열을 포함하는 단백질
을 포함하는, 단백질 복합체;
6) 그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-3) MHC 클래스 IIβ쇄의 아미노산 서열,
(A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질과,
(A-6) MHC 클래스 IIα쇄의 아미노산 서열을 포함하는 단백질
을 포함하는, 단백질 복합체;
인, [1]에 기재된 항원 제시 세포 외 소포.
[5] 상기 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛을 포함하는, 해당 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 단백질 (B)가,
1) T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛과, 테트라스파닌의 부분 서열을 포함하는, 해당 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이며, 해당 테트라스파닌의 부분 서열이 2개의 막 관통 도메인을 적어도 갖고, 해당 T 세포 자극성 사이토카인이 해당 2개의 막 관통 도메인의 사이에 배치되어 있는, 융합 단백질;
2) T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛과, MFG-E8 또는 그 도메인을 포함하는, 해당 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질;
3) 그 N 말단측으로부터,
(B-1) N 말단측으로부터, 막 관통 도메인 1, 소형 세포 외 루프, 막 관통 도메인 2, 소형 세포 내 루프 및 막 관통 도메인 3을 포함하는 테트라스파닌의 부분 서열,
(B-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(B-3) T 세포 자극성 사이토카인의 아미노산 서열,
(B-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 그리고
(B-5) 막 관통 도메인 4를 포함하는 테트라스파닌의 부분 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질; 또는
4) 그 N 말단측으로부터,
(B-3) T 세포 자극성 사이토카인의 아미노산 서열,
(B-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(B-5) MFG-E8 또는 그 막 결합 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질;
인, [1]에 기재된 항원 제시 세포 외 소포.
[6] T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛이, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-12의 서브유닛, IL-15 또는 TGF-β인, [1]에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포.
[7] 막에 이하:
T 세포 공자극 분자를 포함하는, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 단백질 (C);
를 추가로 포함하는, [1]에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포.
[8] T 세포 공자극 분자를 포함하는, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 단백질 (C)가,
T 세포 공자극 분자와, 세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인 또는 세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 도메인을 포함하는, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 융합 단백질;
인, [7]에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포.
[9] T 세포 공자극 분자를 포함하는, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 단백질 (C)가,
1) T 세포 공자극 분자와, 테트라스파닌 혹은 그 막 관통 도메인 또는 MFG-E8 혹은 그 도메인을 포함하는, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 융합 단백질;
2) 그 N 말단측으로부터,
(C-1) T 세포 공자극 분자의 아미노산 서열,
(C-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(C-3) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 융합 단백질;
을 포함하는, [7]에 기재된 항원 제시 세포 외 소포.
[10] T 세포 공자극 분자를 포함하는, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 단백질 (C)가,
막관통 도메인을 포함하는 T 세포 공자극 분자를 포함하고, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 융합 단백질;
을 포함하는, [7]에 기재된 항원 제시 세포.
[11] 세포 외 소포가 엑소솜인, [1]에 기재된 항원 제시 세포 외 소포.
[1A]
항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포이며, 그 막에 이하:
항원 제시 MHC 분자와, T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛을 포함하고, 해당 항원과 해당 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질 (D)를 포함하는, 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포.
[2A] 항원 제시 MHC 분자와, T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛을 포함하고, 해당 항원과 해당 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질 (D)가,
상기 항원 제시 MHC 분자와, 상기 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛과, 세포 또는 세포 외 소포의 막에 국재하는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인 혹은 세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 막 결합 도메인을 포함하는, [1A]에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포.
[3A] 상기 세포 외 소포의 막에 국재하는 것이 가능한 막 단백질 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질이, 테트라스파닌 또는 MFG-E8인, [2A]에 기재된 항원 제시 세포 외 소포.
[4A] 상기 세포의 막에 국재하는 것이 가능한 막 단백질 또는 세포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질이, CD8인, [2A]에 기재된 항원 제시 세포.
[5A] 상기 융합 단백질 (D)가
1) 그 N 말단측으로부터,
(D-1) MHC 분자 구속성 항원 펩티드,
(D-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(D-3) 단쇄 MHC 분자,
(D-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(D-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인 혹은 MFG-E8 또는 그 막 관통 도메인과, 상기 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛을 포함하는 융합 펩티드
를 이 순번으로 코딩하는 아미노산 서열;
2) 그 N 말단측으로부터,
(D-1) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인 혹은 MFG-E8 또는 그 막 관통 도메인과, 상기 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛을 포함하는 융합 펩티드
(D-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(D-3) 단쇄 MHC 분자,
(D-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(D-5) MHC 분자 구속성 항원 펩티드를,
이 순으로 코딩하는 아미노산 서열; 또는
3) 그 N 말단측으로부터,
(1) 상기 적어도 1의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛,
(2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(3) MFG-E8
을 이 순번으로 코딩하는 아미노산 서열;
을 포함하는, [3A]에 기재된 항원 제시 세포 외 소포.
[6A] 상기 융합 단백질 (D)가
1) 그 N 말단측으로부터,
(D-1) MHC 분자 구속성 항원 펩티드,
(D-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(D-3) 막 관통 도메인을 포함하는 단쇄 MHC 분자,
(D-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(D-5) CD8 또는 그 막 관통 도메인과, 상기 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛을 포함하는 융합 펩티드
를 이 순번으로 코딩하는 아미노산 서열; 또는
2) 그 N 말단측으로부터,
(D-1) CD8 또는 그 막 관통 도메인과, 상기 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛을 포함하는 융합 펩티드,
(D-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(D-3) 막 관통 도메인을 포함하는 단쇄 MHC 분자,
(D-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(D-5) MHC 분자 구속성 항원 펩티드를,
이 순으로 코딩하는 아미노산 서열;
을 포함하는, [4A]에 기재된 항원 제시 세포.
[8A] 상기 융합 펩티드가, 그 N 말단측으로부터,
(1) 상기 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛,
(2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(3) CD8 또는 그 막 관통 도메인
을 이 순번으로 코딩하는 아미노산 서열을 포함하는, [6A]에 기재된 항원 제시 세포.
[9A]
상기 MHC 분자 구속성 항원 펩티드가 MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드이며, 상기 단쇄 MHC 분자가 MHC 클래스 Iα쇄의 세포 외 영역을 포함하는, [5A]에 기재된 항원 제시 세포 외 소포.
[10A]
상기 MHC 분자 구속성 항원 펩티드가 MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드이며, 상기 단쇄 MHC 분자가 MHC 클래스 IIα쇄의 세포 외 도메인 및/또는 MHC 클래스 IIβ쇄의 세포 외 도메인을 포함하는, [5A]에 기재된 항원 제시 세포 외 소포.
[11A]
상기 MHC 분자 구속성 항원 펩티드가 MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드이며, 상기 막 관통 도메인을 포함하는 단쇄 MHC 분자가, MHC 클래스 Iα쇄를 포함하는, [7A]에 기재된 항원 제시 세포
[12A]
상기 MHC 분자 구속성 항원 펩티드가 MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드이며, 상기 막 관통 도메인을 포함하는 단쇄 MHC 분자가, MHC 클래스 IIα쇄 및/또는 MHC 클래스 IIβ쇄를 포함하는, [7A]에 기재된 항원 제시 세포.
[13A]
T 세포 공자극 분자를 포함하는, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 단백질 (C)를 추가로 그 막에 포함하는, [1A]에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포.
[14A]
상기 단백질 (C)가 상기 T 세포 공자극 분자와, 세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 도메인을 포함하는, [13A]에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포.
[15A]
상기 단백질 (C)가 상기 T 세포 공자극 분자와, 테트라스파닌 혹은 그 막 관통 도메인 또는 MFG-E8 혹은 그 도메인을 포함하는, [14A]에 기재된 항원 제시 세포 외 소포.
[16A]
상기 단백질 (C)가, 막 관통 도메인을 포함하는 T 세포 공자극 분자를 포함하는, [14A]에 기재된 항원 제시 세포.
[17A] 세포 외 소포가 엑소솜인, [1A]에 기재된 항원 제시 세포 외 소포.
[1B]
상기 단백질 (A)와 상기 단백질 (B)가 융합되어 1개의 단백질을 구성하고 있는, [1]에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포.(C)
[2B]
상기 단백질 (A)와 상기 단백질 (C)가 융합되어 1개의 단백질을 구성하고 있는, [8]에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포.
[3B]
상기 단백질 (B)와 상기 단백질 (C)가 융합되어 1개의 단백질을 구성하고 있는, [8]에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포.
[4B]
상기 단백질 (A)와 상기 단백질 (B)와 상기 단백질 (C)가 융합되어 1개의 단백질을 구성하고 있는, [8]에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포.
[5B]
상기 단백질 (D)와 상기 단백질 (C)가 융합되어 1개의 단백질을 구성하고 있는, [13A]에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포
[6B] 세포 외 소포가 엑소솜인, [1B] 내지 [5B] 중 어느 것에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포.
[7B] [1] 내지 [6B] 중 어느 한 항에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포와, 약리학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 의약 조성물.
[1C] 암을 처치 또는 예방하기 위한, [1] 내지 [6B] 중 어느 한 항에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포를 포함하는, 의약 조성물; 여기서, 바람직하게는 상기 항원 펩티드가 암 항원 펩티드를 포함한다.
[2C] 자기 면역 질환을 처치 또는 예방하기 위한, [1] 내지 [6B] 중 어느 한 항에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포를 포함하는, 의약 조성물; 여기서, 바람직하게는 상기 항원 펩티드가 자기 항원 펩티드를 포함한다.
[3C] 알레르기성 질환을 처치 또는 예방하기 위한, [1] 내지 [6B] 중 어느 한 항에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포를 포함하는, 의약 조성물; 여기서, 바람직하게는 상기 항원 펩티드가 알레르겐을 포함한다.
[4C] 면역 체크 포인트 저해제를 포함하는, [1C]에 기재된 의약 조성물.
[5C] 상기 면역 체크 포인트 저해제가 상기 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포의 막 상에 존재하고 있는, [4C]에 기재된 의약 조성물.
[6C] 상기 면역 체크 포인트 저해제가 항PD-1 항체 또는 그 활성 단편; 항CTLA-4 항체 또는 그 활성 단편; 및 PD-L1 항체 또는 그 활성 단편으로 이루어지는 군에서 선택되는, [4C] 또는 [5C]에 기재된 의약 조성물.
[7C] [1] 내지 [6B] 중 어느 한 항에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포와 약리학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 감염증을 처치 또는 예방하기 위한 의약 조성물; 여기서, 바람직하게는 상기 항원 펩티드가 상기 감염증을 야기하는 감염 병원체 유래이다.
[1D] 암의 처치 또는 예방에 있어서의 사용을 위한 [1] 내지 [6B] 중 어느 한 항에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포; 여기서, 바람직하게는 상기 항원 펩티드가 암 항원 펩티드를 포함한다.
[2D] 자기 면역 질환의 처치 또는 예방에 있어서의 사용을 위한, [1] 내지 [6B] 중 어느 한 항에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포; 여기서, 바람직하게는 상기 항원 펩티드가 자기 항원 펩티드를 포함한다.
[3D] 알레르기성 질환의 처치 또는 예방에 있어서의 사용을 위한, [1] 내지 [6B] 중 어느 한 항에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포; 여기서, 바람직하게는 상기 항원 펩티드가 알레르겐을 포함한다.
[4D] 면역 체크 포인트 저해제와 함께 사용되는, [1D]에 기재된 사용을 위한 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포.
[5D] 상기 면역 체크 포인트 저해제가 막 상에 존재하고 있는, [4D]에 기재된 사용을 위한 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포.
[6D] 상기 면역 체크 포인트 저해제가 항PD-1 항체 또는 그 활성 단편; 항CTLA-4 항체 또는 그 활성 단편; 및 PD-L1 항체 또는 그 활성 단편으로 이루어지는 군에서 선택되는, [4D] 또는 [5D]에 기재된 사용을 위한 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포.
[7D] 감염증을 처치 또는 예방에 있어서의 사용을 위한 [1] 내지 [6B] 중 어느 한 항에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포; 여기서, 바람직하게는 상기 항원 펩티드가 상기 감염증을 야기하는 감염 병원체 유래이다.
[1E] 암을 처치 또는 예방하기 위한 의약 제조에 있어서의 [1] 내지 [6B] 중 어느 한 항에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포의 사용; 여기서, 바람직하게는 상기 항원 펩티드가 암 항원 펩티드를 포함한다.
[2E] 자기 면역 질환의 처치 또는 예방하기 위한 의약 제조에 있어서의 [1] 내지 [6B] 중 어느 한 항에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포의 사용; 여기서, 바람직하게는 상기 항원 펩티드가 자기 항원 펩티드를 포함한다.
[3E] 알레르기성 질환의 처치 또는 예방하기 위한 의약 제조에 있어서의 [1] 내지 [6B] 중 어느 한 항에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포의 사용; 여기서, 바람직하게는 상기 항원 펩티드가 알레르겐을 포함한다.
[4E] 상기 의약이 면역 체크 포인트 저해제와 함께 사용되는, [1E]에 기재된 사용.
[5E] 상기 면역 체크 포인트 저해제가 상기 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포 항원 제시 세포 외 소포의 막 상에 존재하고 있는, [4E]에 기재된 사용.
[6E] 상기 면역 체크 포인트 저해제가 항PD-1 항체 또는 그 활성 단편; 항CTLA-4 항체 또는 그 활성 단편; 및 PD-L1 항체 또는 그 활성 단편으로 이루어지는 군에서 선택되는, [4E] 또는 [5E]에 기재된 사용.
[7E] 감염증을 처치 또는 예방하기 위한 의약 제조에 있어서의 [1] 내지 [6B] 중 어느 한 항에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포의 사용; 여기서, 바람직하게는 상기 항원 펩티드가 상기 감염증을 야기하는 감염 병원체 유래이다.
[1F] 대상에 있어서 암을 처치 또는 예방하는 방법이며,
유효량의 [1] 내지 [6B] 중 어느 한 항에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포를 대상에 투여하여, 대상 내의, 암 항원을 인식하는 T 세포를 활성화 및/또는 증식시키고, 해당 활성화 및/또는 증식한 T 세포에 암 세포를 공격시킴으로써, 암을 처치 또는 예방하는 방법; 여기에서, 바람직하게는 상기 해당 활성화 및/또는 증식한 T 세포가 CD8 양성의 세포 상해성 T 세포이며, 바람직하게는 상기 항원 펩티드가 암 항원 펩티드를 포함한다.
[2F] 대상에 있어서 자기 면역 질환을 처치 또는 예방하는 방법이며, 유효량의 [1] 내지 [6B] 중 어느 한 항에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포를 대상에 투여하여, 대상 내의, 자기 항원을 인식하는 T 세포를 활성화 및/또는 증식시키고, 대상 내에서 상기 자기 항원에 대하여 면역 반응을 탈감작시킴으로써, 자기 면역 질환을 처치 또는 예방하는 방법; 여기에서, 바람직하게는 상기 해당 활성화 및/또는 증식한 T 세포가 CD4 양성의 제어성 T 세포(Treg)이며, 바람직하게는 상기 항원 펩티드가 자기 항원 펩티드를 포함한다.
[3F] 대상에 있어서 알레르기성 질환을 처치 또는 예방하는 방법이며, 유효량의 [1] 내지 [6B] 중 어느 한 항에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포를 대상에 투여하여, 대상 내의, 알레르겐을 인식하는 T 세포를 활성화 및/또는 증식시키고, 대상 내에서 상기 자기 항원에 대하여 면역 반응을 탈감작시킴으로써, 자기 면역 질환을 처치 또는 예방하는 방법; 여기에서, 바람직하게는 상기 해당 활성화 및/또는 증식한 T 세포가 CD4 양성의 제어성 T 세포(Treg)이며, 바람직하게는 상기 항원 펩티드가 알레르겐을 포함한다.
[4F] 상기 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포가 면역 체크 포인트 저해제와 함께 투여되는, [1F]에 기재된 방법.
[5F] 상기 면역 체크 포인트 저해제가 상기 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포의 막 상에 존재하고 있는, [4F]에 기재된 방법.
[6F] 상기 면역 체크 포인트 저해제가 항PD-1 항체 또는 그 활성 단편; 항CTLA-4 항체 또는 그 활성 단편; 및 PD-L1 항체 또는 그 활성 단편으로 이루어지는 군에서 선택되는, [4F] 또는 [5F]에 기재된 방법.
[7F] 대상에 있어서 감염증을 처치 또는 예방하는 방법이며, 유효량의 [1] 내지 [6B] 중 어느 한 항에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포를 대상에 투여하고,
1) 염증성 사이토카인을 분비시켜, 대상의 자연 면역을 활성화시키고, 및/또는
2) 상기 감염증을 야기하는 감염 병원체에 대한 획득 면역을 상기 대상에 가지게 하여,
체 내에서의 상기 감염증을 야기하는 감염 병원체를 배제하는 것, 및/또는 그 증식을 억제하는 것을 포함하는, 감염증을 처치 또는 예방하는 방법.
[1G] 특이적인 항원에 대한 T 세포를 활성화 및/또는 증식시키기 위한 방법이며, 유효량의 [1] 내지 [6B] 중 어느 한 항에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포와 T 세포를 시험관 내 또는 생체 외에 있어서 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
[1H] 항원 제시 MHC 분자를 포함하고, 해당 항원 제시 MHC 분자를 세포 또는 세포 외 소포의 막 외에 제시 가능한 융합 단백질 (A).
[2H] 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛을 포함하는, 해당 T 세포 자극성 사이토카인을 세포 또는 세포 외 소포의 막 외에 제시 가능한 융합 단백질 (B).
[3H] T 세포 공자극 분자를 포함하는, 해당 T 세포 공자극 분자를 세포 또는 세포 외 소포의 막 외에 제시 가능한 융합 단백질 (C).
[4H] 항원 제시 MHC 분자와, 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛을 포함하고, 해당 항원과 해당 T 세포 자극성 사이토카인을 세포 또는 세포 외 소포의 막 외에 제시 가능한 융합 단백질 (D).
[5H] 항원 제시 MHC 분자와, 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛 및 T 세포 공자극 분자를 포함하고, 해당 항원과 해당 T 세포 자극성 사이토카인과 해당 T 세포 공자극 분자를 세포 또는 세포 외 소포의 막 외에 제시 가능한 융합 단백질 (E).
[1I](a) 항원 제시 MHC 분자를 포함하고, 해당 항원 제시 MHC 분자를 세포 또는 세포 외 소포의 막 외에 제시 가능한 융합 단백질 (A)를 코딩하는 서열;
(b) 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛을 포함하는, 해당 T 세포 자극성 사이토카인을 세포 또는 세포 외 소포의 막 외에 제시 가능한 융합 단백질 (B)를 코딩하는 서열;
(c) T 세포 공자극 분자를 포함하는, 해당 T 세포 공자극 분자를 세포 또는 세포 외 소포의 막 외에 제시 가능한 융합 단백질 (C)를 코딩하는 서열;
(d) 항원 제시 MHC 분자와, 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛을 포함하고, 해당 항원과 해당 T 세포 자극성 사이토카인을 세포 또는 세포 외 소포의 막 외에 제시 가능한 융합 단백질 (D)를 코딩하는 서열; 및
(e) 항원 제시 MHC 분자와, 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛 및 T 세포 공자극 분자를 포함하고, 해당 항원과 해당 T 세포 자극성 사이토카인과 해당 T 세포 공자극 분자를 세포 또는 세포 외 소포의 막 외에 제시 가능한 융합 단백질 (E)를 코딩하는 서열;
로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
[2I]
상기 (A)에서 규정되는 융합 단백질이, 항원 제시 MHC 분자와, 세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인 혹은 세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 막 결합 도메인을 포함하는, [1I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[3I] 상기 (A)에서 규정되는 융합 단백질이, 항원 제시 MHC 분자와, 테트라스파닌 혹은 그 막 관통 도메인 또는 MFG-E8 혹은 그 막 결합 도메인을 포함하는, [1I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[4I] 상기 (A)에서 규정되는 융합 단백질이, 세포막 관통 도메인을 포함하는 항원 제시 MHC 분자를 포함하는, [1I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[5I] 상기 (A)에서 규정되는 융합 단백질이:
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-3) 단쇄 MHC 분자의 아미노산 서열,
(A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, [1I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[6I] 상기 (A)에서 규정되는 융합 단백질이,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-3) MHC 클래스 Iα쇄, β2 마이크로글로불린, MHC 클래스 IIα쇄, 또는 MHC 클래스 IIβ쇄의 아미노산 서열
(A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, [1I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[7I] 추가로 (A-6) β2 마이크로글로불린, MHC 클래스 Iα쇄, MHC 클래스 IIβ쇄, 또는 MHC 클래스 IIα쇄의 아미노산 서열을 포함하는, [6I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[8I] 상기 (A)에서 규정되는 융합 단백질이,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-3) 단쇄 MHC 클래스 I 분자의 아미노산 서열,
(A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, [1I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[9I] 상기 (A)에서 규정되는 융합 단백질이,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-3) MHC 클래스 IIβ쇄의 아미노산 서열,
(A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, [1I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[10I] 추가로 (A-6) MHC 클래스 IIα쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함하는, [9I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[11I] 상기 (A)에서 규정되는 융합 단백질이:
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-3) 막 관통 도메인을 포함하는 단쇄 MHC 분자의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, [1I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[12I] 상기 (A)에서 규정되는 융합 단백질이,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-3) MHC 클래스 Iα쇄, β2 마이크로글로불린과 MHC 클래스 Iα쇄의 융합 단백질, MHC 클래스 IIα쇄, 또는 MHC 클래스 IIβ쇄의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, [1I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[13I] 추가로 (A-6) β2 마이크로글로불린, MHC 클래스 IIβ쇄, 또는 MHC 클래스 IIα쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함하는, [12I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[14I] 상기 (A)에서 규정되는 융합 단백질이,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-3) 막 관통 도메인을 포함하는 단쇄 MHC 클래스 I 분자의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, [1I]에 기재된 폴리뉴클레오티드
[15I] 상기 (A)에서 규정되는 융합 단백질이,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-3) MHC 클래스 IIβ쇄의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, [1I]에 기재된 폴리뉴클레오티드,
[16I] 추가로 MHC 클래스 IIα쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함하는, [15I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[17I] 상기 (B)에서 규정되는 융합 단백질이, 적어도 1개의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛과, 세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인 혹은 세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 도메인을 포함하는, [1I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[18I] 상기 (B)에서 규정되는 융합 단백질이, 적어도 1개의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛과, 테트라스파닌의 부분 서열을 포함하고, 해당 테트라스파닌의 부분 서열이 2개의 막 관통 도메인을 적어도 갖고, 해당 적어도 1개의 T 세포 자극성 사이토카인이 해당 2개의 막 관통 도메인의 사이에 배치되어 있는, [1I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[19I] 상기 (B)에서 규정되는 융합 단백질이, 적어도 1개의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛과, MFG-E8 또는 그 막 결합 도메인을 포함하는, [1I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[20I] 상기 (B)에서 규정되는 융합 단백질이,
그 N 말단측으로부터,
(B-1) N 말단측으로부터, 막 관통 도메인 1, 소형 세포 외 루프, 막 관통 도메인 2, 소형 세포 내 루프 및 막 관통 도메인 3을 포함하는 테트라스파닌의 부분 서열,
(B-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(B-3) 제1 T 세포 자극성 사이토카인의 아미노산 서열,
(B-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 그리고
(B-5) 막 관통 도메인 4를 포함하는 테트라스파닌의 부분 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, [1I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[21I] 상기 (B)에서 규정되는 융합 단백질이,
그 N 말단측으로부터,
(B-3) 제1 T 세포 자극성 사이토카인의 아미노산 서열,
(B-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(B-5) MFG-E8 또는 그 막 결합 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, [1I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[22I] 상기 (B)에서 규정되는 융합 단백질이, 적어도 1개의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛과, CD8 또는 그 막 관통 도메인을 포함하는, 청구항 1의 기재된 폴리뉴클레오티드.
[23I] 상기 (B)에서 규정되는 융합 단백질이,
그 N 말단측으로부터,
(B-3) 제1 T 세포 자극성 사이토카인의 아미노산 서열,
(B-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(B-5) CD8 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, [1I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[24I] 상기 T 세포 자극성 사이토카인이 IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-12의 서브유닛, IL-15 또는 TGF-β인, [1I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[25I] 상기 (C)에서 규정되는 융합 단백질이, T 세포 공자극 분자와,
세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인, 혹은
세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 막 결합 도메인
을 포함하는, [1I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[26I] 상기 (C)에서 규정되는 융합 단백질이, T 세포 공자극 분자와,
테트라스파닌 혹은 그 막 관통 도메인, 혹은
MFG-E8 혹은 그 막 결합 도메인
을 포함하는, [1I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[27I] 상기 (C)에서 규정되는 융합 단백질이, 막 관통 도메인을 포함하는 T 세포 공자극 분자를 포함하는, [1I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[28I] 상기 (C)에서 규정되는 융합 단백질이,
그 N 말단측으로부터,
(C-1) T 세포 공자극 분자의 아미노산 서열,
(C-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(C-3) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, [1I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[29I] 상기 (D)에서 규정되는 융합 단백질이,
상기 항원 제시 MHC 분자,
상기 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛, 및
세포 또는 세포 외 소포의 막에 국재하는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인, 혹은
세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 막 결합 도메인
을 포함하는, [1I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[30I] 상기 세포 외 소포의 막에 국재하는 것이 가능한 막 단백질 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질이, 테트라스파닌 또는 MFG-E8인, [29I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[31I] 상기 세포의 막에 국재하는 것이 가능한 막 단백질 또는 세포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질이, CD8인, [29I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[32I] 상기 (D)에서 규정되는 융합 단백질이,
그 N 말단측으로부터,
(D-1) MHC 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(D-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(D-3) 단쇄 MHC 분자의 아미노산 서열,
(D-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(D-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인 혹은 MFG-E8 또는 그 막 결합 도메인과, 상기 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛을 포함하는 융합 펩티드의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, [1I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[33I] 상기 (D)에서 규정되는 융합 단백질이,
그 N 말단측으로부터,
(D-1) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인 혹은 MFG-E8 또는 그 막 결합 도메인과, 상기 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛을 포함하는 융합 펩티드의 아미노산 서열
(D-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(D-3) 단쇄 MHC 분자의 아미노산 서열,
(D-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(D-5) MHC 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, [1I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[34I] 상기 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인 혹은 MFG-E8 또는 그 막 결합 도메인과, 상기 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛을 포함하는 융합 펩티드가,
그 N 말단측으로부터,
(1) 막 관통 도메인 1, 소형 세포 외 루프, 막 관통 도메인 2, 소형 세포 내 루프 및 막 관통 도메인 3을 포함하는 테트라스파닌의 부분 서열,
(2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(3) 상기 적어도 1개의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛의 아미노산 서열,
(4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 그리고
(5) 막 관통 도메인 4를 포함하는 테트라스파닌의 부분 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, [32I] 또는 [33I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[35I] 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인 혹은 MFG-E8 또는 그 막 결합 도메인과, 상기 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛을 포함하는, 상기 융합 펩티드가,
그 N 말단측으로부터,
(1) 상기 적어도 1의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛의 아미노산 서열,
(2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(3) MFG-E8 또는 그 막 결합 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, [32I] 또는 [33I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[36I] 상기 (D)에서 규정되는 융합 단백질이,
상기 항원 제시 MHC 분자와, 상기 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛과, 세포의 막에 국재하는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인 또는 세포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 막 결합 도메인을 포함하는, [1I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[37I] 상기 MHC 분자 구속성 항원 펩티드가 MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드이며, 상기 단쇄 MHC 분자가 MHC 클래스 Iα쇄의 세포 외 영역을 포함하는, [32I] 또는 [33I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[38I] 상기 MHC 분자 구속성 항원 펩티드가 MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드이며, 상기 단쇄 MHC 분자가 MHC 클래스 IIα쇄의 세포 외 도메인 및/또는 MHC 클래스 IIβ쇄의 세포 외 도메인을 포함하는, [32I] 또는 [33I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[1J] 상기 (a)에서 규정되는 서열과 상기 (b)에서 규정되는 서열을 포함하는, [1I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[2J] 상기 융합 단백질 (A)와 상기 융합 단백질 (B)가 융합된 아미노산 서열을 코딩하고 있는, [1J]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[3J] 적어도 1개의 2A 펩티드를 통해 융합 단백질 (A)와 융합 단백질 (B)가 융합된 아미노산 서열을 코딩하고 있는, [2J]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[4J] 추가로 상기 (c)에서 규정되는 서열을 포함하는, [1J]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[5J] 상기 융합 단백질 (A), 상기 융합 단백질 (B) 및 상기 융합 단백질 (C)가 융합된 아미노산 서열을 코딩하고 있는, [4J]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[6J] 각각 독립된 적어도 1개의 2A 펩티드를 통해, 상기 융합 단백질 (A), 상기 융합 단백질 (B) 및 상기 융합 단백질 (C)가 융합된 아미노산 서열을 코딩하고 있는, [5J]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[7J] 5'단으로부터,
상기 (a)에서 규정되는 서열;
제1 적어도 1개의 2A 펩티드를 코딩하는 서열;
상기 (b)에서 규정되는 서열;
제2 적어도 1개의 2A 펩티드를 코딩하는 서열; 및
상기 (c)에서 규정되는 서열
을 이 순번으로 포함하는, [6J]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[8J] 상기 (d)에서 규정되는 서열을 포함하는, [1I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[9J] 추가로 상기 (c)에서 규정되는 서열을 포함하는, [8J]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[10J] 상기 융합 단백질 (D)와 상기 융합 단백질 (C)가 융합된 아미노산 서열을 코딩하고 있는, [9J]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[11J] 적어도 1개의 2A 펩티드를 통해 상기 융합 단백질 (D)와 상기 융합 단백질 (C)가 융합된 아미노산 서열을 코딩하고 있는, [10J]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[12J] 상기 (e)에서 규정되는 서열을 포함하는 [1I]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[13J] [1I] 내지 [12J] 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
[14J] [1I] 내지 [12J] 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 [13J]에 기재된 벡터와, 약리학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 의약 조성물.
[1K] [1I] 내지 [12J] 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 [13J]에 기재된 벡터에 의해 형질 전환된 세포.
[2K] [1K]에 기재된 세포를 배양한, 배양 후의 배양 상청.
[3K] [2K]에 기재된 배양 상청으로부터 얻어지는, 항원 제시 세포 외 소포.
[4K] [1]에 기재된 항원 제시 세포 외 소포를 제조하기 위한 방법이며, [1K]에 기재된 세포를 배양하여 얻어지는 배양 상청을 회수하는 공정을 포함하는, 방법.
[5K] [2K]에 기재된 배양 상청을 포함하는, 의약 조성물.
[1L] 암을 처치 또는 예방하기 위한, [1I] 내지 [12J] 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 [13J]에 기재된 벡터를 포함하는, 의약 조성물.
[2L] 자기 면역 질환을 처치 또는 예방하기 위한, [1I] 내지 [12J] 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 [13J]에 기재된 벡터를 포함하는, 의약 조성물; 여기서, 바람직하게는 상기 항원 펩티드가 자기 항원 펩티드를 포함한다.
[3L] 알레르기성 질환을 처치 또는 예방하기 위한, [1I] 내지 [12J] 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 [13J]에 기재된 벡터를 포함하는 의약 조성물; 여기서, 바람직하게는 상기 항원 펩티드가 알레르겐을 포함한다.
[4L] 감염증을 처치 또는 예방하기 위한 [1I] 내지 [12J] 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 [13J]에 기재된 벡터와, 약리학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 의약 조성물; 여기서, 바람직하게는 상기 항원 펩티드가 감염증을 야기하는 감염 병원체 유래이다.
[1M] 암의 처치 또는 예방에 있어서의 사용을 위한 [1I] 내지 [12J] 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 [13J]에 기재된 벡터; 여기서, 바람직하게는 상기 항원 펩티드가 암 항원 펩티드를 포함한다.
[2M] 자기 면역 질환의 처치 또는 예방에 있어서의 사용을 위한, [1I] 내지 [12J] 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 [13J]에 기재된 벡터; 여기서, 바람직하게는 상기 항원 펩티드가 자기 항원 펩티드를 포함한다.
[3M] 알레르기성 질환의 처치 또는 예방에 있어서의 사용을 위한, [1I] 내지 [12J] 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 [13J]에 기재된 벡터; 여기서, 바람직하게는 상기 항원 펩티드가 알레르겐을 포함한다.
[4M] 감염증의 처치 또는 예방에 있어서의 사용을 위한 [1I] 내지 [12J] 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 [13J]에 기재된 벡터; 여기서, 바람직하게는 상기 항원 펩티드가 상기 감염증을 야기하는 감염 병원체 유래이다.
[1N] 암을 처치 또는 예방하기 위한 의약 제조에 있어서의 [1I] 내지 [12J] 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 [13J]에 기재된 벡터의 사용; 여기서, 바람직하게는 상기 항원 펩티드가 암 항원 펩티드를 포함한다.
[2N] 자기 면역 질환을 처치 또는 예방하기 위한 의약 제조에 있어서의 [1I] 내지 [12J] 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 [13J]에 기재된 벡터의 사용; 여기서, 바람직하게는 상기 항원 펩티드가 자기 항원 펩티드를 포함한다.
[3N] 알레르기성 질환을 처치 또는 예방하기 위한 의약 제조에 있어서의 [1I] 내지 [12J] 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 [13J]에 기재된 벡터의 사용; 여기서, 바람직하게는 상기 항원 펩티드가 알레르겐을 포함한다.
[4N] 감염증을 처치 또는 예방하기 위한 의약 제조에 있어서의 [1I] 내지 [12J] 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 [13J]에 기재된 벡터의 사용; 여기서, 바람직하게는 상기 항원 펩티드가 상기 감염증을 야기하는 감염 병원체 유래이다.
[1O] 대상에 있어서 암을 처치 또는 예방하는 방법이며,
유효량의 [1I] 내지 [12J] 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 [13J]에 기재된 벡터를 대상에 투여하여, 대상 내의, 암 항원을 인식하는 T 세포를 활성화 및/또는 증식시키고, 해당 활성화 및/또는 증식한 T 세포에 암 세포를 공격시킴으로써, 암을 처치 또는 예방하는 방법; 여기에서, 바람직하게는 상기 해당 활성화 및/또는 증식한 T 세포가 CD8 양성의 세포 상해성 T 세포이며, 바람직하게는 상기 항원 펩티드가 암 항원 펩티드를 포함한다.
[2O] 대상에 있어서 자기 면역 질환을 처치 또는 예방하는 방법이며, 유효량의 [1I] 내지 [12J] 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 [13J]에 기재된 벡터를 대상에 투여하여, 대상 내의, 자기 항원을 인식하는 T 세포를 활성화 및/또는 증식시키고, 대상 내에서 상기 자기 항원에 대하여 면역 반응을 탈감작시킴으로써, 자기 면역 질환을 처치 또는 예방하는 방법; 여기에서, 바람직하게는 상기 해당 활성화 및/또는 증식한 T 세포가 CD4 양성의 제어성 T 세포(Treg)이며, 바람직하게는 상기 항원 펩티드가 자기 항원 펩티드를 포함한다.
[3O] 대상에 있어서 알레르기성 질환을 처치 또는 예방하는 방법이며, 유효량의 [1I] 내지 [12J] 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 [13J]에 기재된 벡터를 대상에 투여하여, 대상 내의, 알레르겐을 인식하는 T 세포를 활성화 및/또는 증식시키고, 대상 내에서 상기 자기 항원에 대하여 면역 반응을 탈감작시킴으로써, 자기 면역 질환을 처치 또는 예방하는 방법; 여기에서, 바람직하게는 상기 해당 활성화 및/또는 증식한 T 세포가 CD4 양성의 제어성 T 세포(Treg)이며, 바람직하게는 상기 항원 펩티드가 알레르겐을 포함한다.
[4O] 대상에 있어서 감염증을 처치 또는 예방하는 방법이며, 유효량의 [1I] 내지 [12J] 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 [13J]에 기재된 벡터를 대상에 투여하고,
1) 염증성 사이토카인을 분비시켜, 대상의 자연 면역을 활성화시키고, 및/또는
2) 상기 감염증을 야기하는 감염 병원체에 대한 획득 면역을 상기 대상에 가지게 하여,
체 내에서의 상기 병 감염증을 야기하는 감염 병원체를 배제하는 것, 및/또는 그 증식을 억제하는 것을 포함하는, 감염증을 처치 또는 예방하는 방법.
[1P] 특이적인 항원에 대한 T 세포를 활성화 및/또는 증식시키기 위한 방법이며, [1I] 내지 [12J] 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 [13J]에 기재된 벡터를 세포에 시험관 내 또는 생체 외에서 도입하고, 항원 제시 세포 및/또는 항원 제시 세포 외 소포를 생성하고, 생성된 항원 제시 세포 및/또는 항원 제시 세포 외 소포와 T 세포를 시험관 내 또는 생체 외에 있어서 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
본 발명에 따르면, 항원을 제시하는 MHC 분자 및 T 세포 자극성 사이토카인을 막에 포함하는 세포(항원 제시 세포) 및 세포 외 소포(항원 제시 세포 외 소포)를 제작하기 위한 폴리뉴클레오티드를 사용함으로써, T 세포를 활성화하거나 할 수 있다.
도 1a는 항원 펩티드-단쇄 MHC 클래스 I 분자(sc-Trimer)-CD81 융합 단백질의 모델도를 나타낸다.
도 1b는 항원 펩티드-단쇄 MHC 클래스 I 분자(sc-Trimer)-CD81 융합 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 1c는 CD80-CD9 융합 단백질의 모델도를 나타낸다.
도 1d는 CD80-CD9 융합 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 1e는 CD63-IL-2 융합 단백질의 모델도를 나타낸다.
도 1f는 CD63-IL-2 융합 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 1g는 항원 펩티드-MHC 클래스 IIβ쇄(sc-Dimer)-CD81 융합 단백질의 모델도를 나타낸다.
도 1h는 항원 펩티드-MHC 클래스 IIβ쇄(sc-Dimer)-CD81 융합 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 1i는 MHC 클래스 IIα쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 1j는 TGF-β-MFG-E8 융합 단백질의 모델도를 나타낸다.
도 1k는 TGF-β-MFG-E8 융합 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 1l은 CD81-IL-4 융합 단백질의 모델도를 나타낸다.
도 1m은 CD81-IL-4 융합 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 1n은 sc-Trimer-CD81-IL-2 융합 단백질의 핵산 서열을 나타낸다.
도 1o는 CD63-AkaLuc 융합 단백질의 핵산 서열을 나타낸다.
도 1p는 sc-Trimer-T2A-IL-2-CD8-P2A-CD80을 코딩하는 핵산 서열을 나타낸다.
도 2a는 실시예 1의 항원 제시 세포 외 소포의 모델도를 나타낸다.
도 2b는 실시예 2의 항원 제시 세포 외 소포의 모델도를 나타낸다.
도 2c는 실시예 3의 항원 제시 세포 외 소포의 모델도를 나타낸다.
도 2d는 실시예 4의 항원 제시 세포 외 소포의 모델도를 나타낸다.
도 2e는 실시예 5의 항원 제시 세포 외 소포의 모델도를 나타낸다.
도 2f는 실시예 6의 항원 제시 세포 외 소포의 모델도를 나타낸다.
도 2g는 실시예 7의 항원 제시 세포 외 소포의 모델도를 나타낸다.
도 2h는 실시예 8의 항원 제시 세포 외 소포의 모델도를 나타낸다.
도 2i는 실시예 9의 항원 제시 세포 외 소포의 모델도를 나타낸다.
도 2j는 실시예 11의 항원 제시 세포 외 소포의 모델도를 나타낸다.
도 2k는 기타 실시 양태의 항원 제시 세포 외 소포의 모델도를 예시한다.
도 3a는 시험예 1-1에 있어서, 실시예 2의 항원 제시 세포 외 소포의 막에 포함되는 융합 단백질을 플로 사이토메트리로 해석한 결과를 나타낸다.
도 3b는 시험예 1-2에 있어서, 실시예 3의 항원 제시 세포 외 소포의 막에 포함되는 융합 단백질을 플로 사이토메트리로 해석한 결과를 나타낸다.
도 3c는 시험예 1-3에 있어서, 실시예 4의 항원 제시 세포 외 소포의 막에 포함되는 융합 단백질을 플로 사이토메트리로 해석한 결과를 나타낸다.
도 3d는 시험예 1-4에 있어서, 실시예 5의 항원 제시 세포 외 소포의 막에 포함되는 융합 단백질을 플로 사이토메트리로 해석한 결과를 나타낸다.
도 3e는 시험예 1-5에 있어서, 실시예 6의 항원 제시 세포 외 소포의 막에 포함되는 융합 단백질을 플로 사이토메트리로 해석한 결과를 나타낸다.
도 3f는 시험예 1-6에 있어서, 실시예 7의 항원 제시 세포 외 소포의 막에 포함되는 융합 단백질을 플로 사이토메트리로 해석한 결과를 나타낸다.
도 3g는 시험예 1-7에 있어서, 실시예 8의 항원 제시 세포 외 소포의 막에 포함되는 융합 단백질을 플로 사이토메트리로 해석한 결과를 나타낸다.
도 3h는 시험예 1-8에 있어서, 실시예 9의 항원 제시 세포 외 소포의 막에 포함되는 융합 단백질을 플로 사이토메트리로 해석한 결과를 나타낸다.
도 4는 시험예 2에 있어서, 실시예 1, 2의 항원 제시 세포 외 소포가, 항원 특이적 CD8 양성 T 세포(OT-1 T 세포)를 활성화하거나 하는지를, 시험관 내에서 평가한 결과를 나타낸다.
도 5는 시험예 3에 있어서, 실시예 2의 항원 제시 세포 외 소포가, 항원 특이적 CD8 양성 T 세포(OT-1)를 활성화하거나 하는지를, 생체 내에서 평가한 결과를 나타낸다.
도 6은 시험예 4에 있어서, 실시예 3의 항원 제시 세포 외 소포가, 항원 특이적 CD4 양성 T 세포를 활성화하거나 하는지를, 시험관 내에서 평가한 결과를 나타낸다.
도 7은 시험예 5에 있어서, 실시예 4의 항원 제시 세포 외 소포가, 항원 특이적 CD4 양성 T 세포(OT-2 T 세포)를 제어성 T 세포로 분화 유도하는지를, 시험관 내에서 평가한 결과를 나타낸다.
도 8은 시험예 6에 있어서, 실시예 3, 5의 항원 제시 세포 외 소포가, 항원 특이적 CD4 양성 T 세포(OT-2 T 세포)를 Th2T 세포로 분화 유도하는지의 여부를, 시험관 내에서 평가한 결과를 나타낸다.
도 9는 시험예 7에 있어서, 실시예 6의 항원 제시 세포 외 소포가, 항원 특이적 CD4 양성 T 세포를 Th1 세포로 분화 유도하는지의 여부를, 시험관 내에서 평가한 결과를 나타낸다.
도 10은 시험예 8에 있어서, 실시예 7의 항원 제시 세포 외 소포가, 항원 특이적 CD4 양성 T 세포를 Th17 세포로 분화 유도하는지의 여부를, 시험관 내에서 평가한 결과를 나타낸다.
도 11은 시험예 9에 있어서, 실시예 1과 실시예 8의 항원 제시 세포 외 소포가, 항원 특이적 CD8 양성 T 세포를 현저하게 증식시킨 것을 나타낸다.
도 12는 시험예 10에 있어서, 실시예 8의 항원 제시 세포 외 소포가, B16 멜라노마 세포의 증식을 현저하게 억제한 것을 나타낸다.
도 13은 시험예 11에 있어서, 실시예 10의 mRNA가, 항원 특이적 CD8 양성 T 세포(OT-1)를 활성화하거나 하는지를, 생체 내에서 평가한 결과를 나타낸다.
도 14는 시험예 12에 있어서, 실시예 10의 mRNA가, 내재성 항원 특이적 CD8 양성 T 세포를 활성화하거나 하는지를, 생체 내에서 평가한 결과를 나타낸다.
도 15는 시험예 13에 있어서, 실시예 6의 세포 외 소포가, 항원 특이적 CD4 양성 T 세포를 Th1 세포로 분화시키거나, 생체 내에서 평가한 결과를 나타낸다.
도 16은 시험예 14에 있어서, 실시예 6의 항원 제시 세포 외 소포가, 멜라노마 세포의 증식을 억제하거나, 생체 내에서 평가한 결과를 나타낸다.
도 17은 시험예 15에 있어서, 실시예 11의 항원 제시 세포 외 소포의 플로 사이토메트리 결과를 나타낸다.
도 18은 시험예 16에 있어서, 실시예 11의 항원 제시 세포 외 소포가, 항원 특이적 CD4 양성 T 세포를 Th1 세포로 분화시키거나, 시험관 내에서 평가한 결과를 나타낸다.
도 19는 시험예 17에 있어서, 실시예 12의 항원 제시 세포 외 소포가, T 림프 종양 세포의 증식을 억제하거나, 생체 내에서 평가한 결과를 나타낸다.
도 20은 시험예 1A에 있어서, 실시예 1A의 mRNA에 의해, 세포 상에 항원-MHCI 복합체, CD80 및 IL-2를 발현하거나, 시험관 내에서 평가한 결과를 나타낸다.
도 21은 시험예 2A에 있어서, 실시예 1A의 mRNA에 의해 유도된 항원 제시 세포가, 항원 특이적 CD8 양성 T 세포를 증식시키거나, 시험관 내에서 평가한 결과를 나타낸다.
도 22는 시험예 3A에 있어서, 실시예 1A의 mRNA에 의해, 세포 상에 항원-MHCI 복합체, CD80 및 IL-2를 발현하거나, 생체 내에서 평가한 결과를 나타낸다.
도 23은 시험예 4A에 있어서, 실시예 1A의 mRNA에 의해, 내재성의 OVA 반응성 CD8T 세포를 증식시키거나, 생체 내 평가한 결과를 나타낸다.
도 24는 (a) sc-Trimer-T2A-IL-15sa-P2A-CD80 융합 단백질의 핵산 서열을 나타낸다. (b) 네오안티겐을 제시하는 sc-Trimer-T2A-IL-2-CD8-P2A-CD80 융합 단백질의 핵산 서열을 나타낸다. (c) OVAp-MHCIIβ-P2A-MHCIIα-T2A-IL-12sc-CD8-P2A-CD80 융합 단백질의 핵산 서열을 나타낸다. (d) 네오안티겐을 제시하는 sc-Trimer-CD81-IL-2 융합 단백질의 핵산 서열을 나타낸다.
도 25는 시험예 5A에 있어서, 실시예 2A의 mRNA에 의해, 세포 상에 항원-MHCI 복합체, CD80 및 IL-15sa를 발현하거나, 생체 내에서 평가한 결과를 나타낸다.
도 26은 시험예 6A에 있어서, 실시예 2A의 mRNA에 의해, 내재성의 OVA 반응성 CD8T 세포를 증식시키거나, 생체 내 평가한 결과를 나타낸다.
도 27은 시험예 7A에 있어서, 실시예 3A의 mRNA에 의해, 세포 상에 항원-MHCI 복합체, CD80 및 IL-2를 발현하거나, 생체 내에서 평가한 결과를 나타낸다.
도 28은 시험예 8A에 있어서, 실시예 3A의 mRNA에 의해, 내재성의 Gtf2i 반응성 CD8T 세포를 증식시키거나, 생체 내 평가한 결과를 나타낸다.
도 29는 시험예 9A에 있어서, 실시예 4A의 mRNA에 의해, 세포 상에 항원-MHCII 복합체, CD80 및 IL-12를 발현하거나, 생체 내에서 평가한 결과를 나타낸다.
도 30은 시험예 10A에 있어서, 실시예 4A의 mRNA에 의해, 내재성의 OVA 반응성 CD8T 세포를 증식시키거나, 생체 내 평가한 결과를 나타낸다.
도 31은 시험예 11A에 있어서, 실시예 5A의 mRNA에 의해, 내재성의 RPL18 반응성 CD8T 세포를 증식시키거나, 생체 내 평가한 결과를 나타낸다.
정의
포함한다(comprising)
본 명세서에 있어서 「포함한다」(comprising)는, 「실질적으로 포함하는」 양태(substantially comprising), 「필수적으로 포함하는」 양태(essentially comprising), 「본질적으로 … 로 이루어지는」 양태(consiting essentially of) 및 「로 이루어지는」 양태(consisting of)를 포함한다.
세포 외 소포
본 명세서 중에서 사용되는 「세포 외 소포」란, 세포로부터 분비되는 소포인 한 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, Exosomes(엑소솜), Microvesicles(MV; 미소 소포체), Apoptotic Bodies(아포토시스 소체) 등을 들 수 있다.
본 명세서 중에서 사용되는 「엑소솜」이란, 엔도사이토시스·패스웨이에서 유래되는, 약 20 내지 약 500㎚(바람직하게는 약 20 내지 약 200㎚, 보다 바람직하게는 약 25 내지 약 150㎚, 더욱 바람직하게는 약 30 내지 약 100㎚)의 소포를 의미한다. 엑소솜의 구성 성분으로서는, 예를 들어, 단백질, 핵산(mRNA, miRNA, 논·코팅 RNA) 등을 들 수 있다. 엑소솜은, 세포 간 커뮤니케이션을 담당하는 기능을 가질 수 있다. 엑소솜의 마커 분자로서는, 예를 들어, Alix, Tsg101, 테트라스파닌, 플로틸린(flotillin), 포스파티딜세린 등을 들 수 있다.
본 명세서 중에서 사용되는 「미소 소포체」란, 세포질막에서 유래되는, 약 50 내지 약 1000㎚의 소포를 의미한다. 미소 소포체의 구성 성분으로서는, 예를 들어, 단백질, 핵산(mRNA, miRNA, 논·코팅 RNA 등) 등을 들 수 있다. 미소 소포체는, 세포 간 커뮤니케이션을 담당하는 기능 등을 가질 수 있다. 미소 소포체의 마커 분자로서는, 예를 들어, 인테그린, 세레크틴, CD40, CD154 등을 들 수 있다.
본 명세서 중에서 사용되는 「아포토시스 소체」란, 세포질막에서 유래되는, 약 500 내지 약 2000㎚의 소포를 의미한다. 아포토시스 소체의 구성 성분으로서는, 예를 들어, 단편화된 핵, 세포 소기관(오르가넬라) 등을 들 수 있다. 아포토시스 소체는, 파고사이토시스를 유도하는 기능 등을 가질 수 있다. 아포토시스 소체의 마커 분자로서는, 예를 들어, Annexin V, 포스파티딜세린 등을 들 수 있다.
본 명세서 중에서 사용되는 「항원 제시 세포 외 소포」란, 그 막 외에 항원을 제시하는 세포 외 소포를 의미한다.
항원 제시 세포
본 명세서 중에서 사용되는 「항원 제시 세포」란, 그 막 외에 1개 또는 복수종의 항원을 인공적으로 제시하는 세포를 의미한다.
항원 제시 세포에 있어서, 임의의 1개 또는 복수종의 사이토카인(예를 들어 이하에서 정의하는 T 세포 자극성 사이토카인 등)을 그 막 외에 제시하는 것이 바람직하다.
항원 제시 세포에 있어서, 상기 항원은 막 외에 고정, 보다 바람직하게는 이하로 정의하는 주요 조직 적합 유전자 복합체 분자와 융합한 융합 분자의 형에서 막 외에 고정됨으로써(즉, 일시적으로 항원이 외막에 부착되어 있는 것이 아니라), 막 외에 제시되어 있는 것이 바람직하다.
항원 제시 세포에 있어서, 1개 또는 복수종의 항원 펩티드를 코딩하는 서열과, 1개 또는 복수종의 사이토카인을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 도입에 의해 일시적으로 항원 펩티드 및 사이토카인을 발현하고, 동시에 막 외에 제시하고 있는 것이 바람직하다.
또한, 항원 제시 세포에 있어서, 임의의 보조 시그널(예를 들어, 이하에서 정의하는 T 세포 공자극 분자)을 막 외에 제시하고 있는 것이 바람직하다.
주요 조직 적합 유전자 복합체 분자
본 명세서 중에서 사용되는 「주요 조직 적합 유전자 복합체(Major Histocompatibility Complex, 이하, 「MHC」라고도 한다.) 분자」는, 항원 결합 간극을 포함하고, T 세포, T 세포 전구체 등에 제시하는 항원과 결합할 수 있는 것인 한 특별히 한정되는 것은 아니다. MHC 분자로서는, 예를 들어, MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자 등을 들 수 있다. MHC 분자는, 임의의 동물종 유래의 것이어도 된다. 예를 들어, 인간에서는, 인간 백혈구형 항원(HLA), 마우스에서는, H2계를 들 수 있다.
MHC 클래스 I 분자에 상당하는 HLA는, 예를 들어, HLA-A, HLA-B, HLA-Cw, HLA-F, HLA-G 등의 서브타입으로 분류되는 경우가 있다. 이들 서브타입에 대해서는, 다형(대립 유전자)이 알려져 있다. HLA-A의 다형으로서는, 예를 들어, HLA-A1, HLA-A0201, HLA-A24 등을 들 수 있고, HLA-B의 다형으로서는, 예를 들어, HLA-B7, HLA-B40, HLA-B4403 등을 들 수 있고, HLA-Cw의 다형으로서는, 예를 들어, HLA-Cw0301, HLA-Cw0401, HLA-Cw0602 등을 들 수 있다.
MHC 클래스 II 분자에 상당하는 HLA는, 예를 들어, HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP 등의 서브타입으로 분류되는 경우가 있다.
본 명세서 중에 기재된 MHC 분자는, 그 기능을 발휘할 수 있는 것인 한, 그 야생형의 아미노산 서열(예를 들어, MHC 클래스 I 분자의 경우: 예를 들어, 서열 번호 9 등의 MHC 클래스 Iα쇄, 서열 번호 7 등의 β2 마이크로글로불린, 서열 번호 65 등의 단쇄 MHC 클래스 I 분자 등; MHC 클래스 II 분자의 경우: 예를 들어, 서열 번호 71 등의 MHC 클래스 IIα쇄, 서열 번호 37 등의 MHC 클래스 IIβ쇄, 단쇄 MHC 클래스 II 분자 등)에 대하여 아미노산 서열 동일성이, 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것이어도 된다. 혹은, 본 명세서 중에 기재된 MHC 분자는, 그 기능을 발휘할 수 있는 것인 한, 그 야생형의 아미노산 서열에 대하여 1개 또는 복수개의 아미노산의 결실, 삽입, 부가 및/또는 치환 등 된 것이어도 된다.
본 명세서 중에서 사용되는 「항원 제시 MHC 분자」란, 항원을 제시하는 MHC 분자인 한 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 항원 제시 MHC 클래스 I 분자, 항원 제시 MHC 클래스 II 분자 등을 들 수 있다. 「항원 제시 MHC 클래스 I 분자」로서는, 예를 들어, 항원과 MHC 클래스 Iα쇄 또는 그의 세포 외 도메인과 β2 마이크로글로불린의 복합체; 항원과 단쇄 MHC 클래스 I 분자의 복합체; 항원 및 단쇄 MHC 클래스 I 분자가 결합한 융합 단백질; 항원과, MHC 클래스 Iα쇄의 세포 외 도메인과 다른 단백질 또는 그의 도메인 혹은 그 프래그먼트 등의 융합 단백질(예를 들어, MHC 클래스 Iα쇄의 세포 외 도메인과 항체의 Fc 부분의 융합 단백질; MHC 클래스 Iα쇄의 세포 외 도메인과 다른 막 단백질의 막 관통 도메인의 융합 단백질 등)의 복합체; 등을 들 수 있다. 「항원 제시 MHC 클래스 II 분자」로서는, 예를 들어, 항원과 MHC 클래스 IIα쇄 또는 그의 세포 외 도메인과 MHC 클래스 IIβ쇄 또는 그의 세포 외 도메인의 복합체; 항원과 단쇄 MHC 클래스 II 분자의 복합체; 항원 및 MHC 클래스 IIβ쇄가 결합한 융합 단백질과, MHC 클래스 IIα쇄의 복합체; 항원과, MHC 클래스 IIα쇄의 세포 외 도메인과 다른 단백질 또는 그의 도메인 혹은 그 프래그먼트 등의 융합 단백질(예를 들어, MHC 클래스 IIα쇄의 세포 외 도메인과 항체의 Fc 부분의 융합 단백질; MHC 클래스 IIα쇄의 세포 외 도메인과 다른 막 단백질의 막 관통 도메인의 융합 단백질 등)과, MHC 클래스 IIβ쇄의 세포 외 도메인과 다른 단백질 또는 그의 도메인 혹은 그 프래그먼트 등의 융합 단백질(예를 들어, MHC 클래스 IIβ쇄의 세포 외 도메인과 항체의 Fc 부분의 융합 단백질; MHC 클래스 IIβ쇄의 세포 외 도메인과 다른 막 단백질의 막 관통 도메인을 포함하는 아미노산 서열의 융합 단백질 등)의 복합체 등을 들 수 있다.
본 명세서 중에서 사용되는 「단쇄 MHC 분자」, 「단쇄 MHC 클래스 I 분자」 또는 「단쇄 MHC 클래스 II 분자」란, MHC 분자(또는 MHC 클래스 I 분자 혹은 MHC 클래스 II 분자)의 α쇄 혹은 그의 세포 외 도메인과, β쇄 혹은 그의 세포 외 도메인 또는 β2 마이크로글로불린이, 필요에 따라서 스페이서 서열 등을 통하여 연결된 융합 단백질을 의미한다. 「단쇄 MHC 클래스 I 분자」로서는, 예를 들어, MHC 클래스 Iα쇄와 β2 마이크로글로불린이 필요에 따라서 스페이서 서열을 통하여 연결된 융합 단백질 등을 들 수 있다. 「단쇄 MHC 클래스 II 분자」로서는, 예를 들어, MHC 클래스 IIα쇄와 MHC 클래스 IIβ쇄가 필요에 따라서 스페이서 서열을 통하여 연결한 융합 단백질 등을 들 수 있다.
본 명세서 중에서 사용되는 「막관통 도메인을 포함하는 단쇄 MHC 분자」란 MHC 분자 본래의 막 관통 도메인(MHC 클래스 Iα쇄, MHC 클래스 IIα쇄, 또는 MHC 클래스 IIβ쇄의 막 관통 도메인)을 포함하는 「단쇄 MHC 분자」를 의미한다.
본 명세서 중에서 사용되는 「항원 제시 MHC 분자를 포함하는, 해당 항원(혹은 항원 펩티드)을 막 외에 제시 가능한 단백질(혹은 융합 단백질, 단백질 복합체 등)」이란, 항원 제시 MHC 분자를 적어도 포함하고, 또한 항원(혹은 항원 펩티드)을 막 외에 제시함으로써, T 세포 등에 항원을 제시하는 것이 가능한 단백질(혹은 융합 단백질, 단백질 복합체 등)을 의미한다. 「항원 제시 MHC 분자를 포함하는, 항원(혹은 항원 펩티드)을 막 외에 제시 가능한 단백질(혹은 융합 단백질, 단백질 복합체 등)」은, 이것이 세포 외 소포의 막에 발현하도록, 플라스미드 등을 사용하여 융합 단백질, 단백질 복합체 등의 형태로 발현시킨 것이어도 된다. 혹은, 「항원 제시 MHC 분자를 포함하는, 항원(혹은 항원 펩티드)을 막 외에 제시 가능한 단백질(혹은 융합 단백질, 단백질 복합체 등)」은, 가용성의 항원 제시 MHC 분자(이들에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 특허문헌 1에 기재되어 있는, MHC 클래스 Iα쇄 및 면역 글로불린 중쇄를 포함하는 융합 단백질 등; 일본 특허 공개 제2007-161719호 공보에 기재되어 있는, 가용성의 MHC 클래스 I 분자 등)를 사용하는 경우, 가용성의 항원 제시 MHC 분자와 세포 외 소포를, 필요에 따라서 지질 링커, 펩티드 링커 등을 통하여, 세포 외 소포의 막에 결합시킨 것이어도 된다(예를 들어, 일본 특허 공개 제2018-104341호 공보 등에 기재된 방법을 참고로 해도 된다). 혹은, 가용성의 항원 제시 MHC 분자의 N 말단측 또는 C 말단측에 원하는 태그(예를 들어, His 태그, FLAG 태그, PNE 태그(서열 번호 79: NYHLENEVARLKKL) 등)를 부가한 것(해당 태그는, 예를 들어, 다른 구성 요소와 함께 융합 단백질로서 발현시켜도 되고, 별도 준비한 가용성의 항원 제시 MHC 분자에, 필요에 따라서 링커 등을 통하여 결합시켜도 된다)과, 해당 태그에 대한 항체 또는 그의 항원 결합성 프래그먼트(예를 들어, scFv, Fab 혹은 나노바디) 등을 포함하는 단백질(예를 들어, zPNE 태그와 해당 태그에 대한 항체 등을 사용하는 방법을 참고로 해도 된다).
항원
본 명세서 중에서 사용되는 「항원」이란, 항원성을 가질 수 있는 것인 한 특별히 한정되는 것은 아니며, 펩티드 항원뿐만 아니라, 인지질, 복합 탄수화물 등의 비펩티드 항원(예를 들어, 미콜산, 리포아라비노안난 등의 세균성 막 구성 요소 등)도 포함된다.
본 명세서 중에서 사용되는 「항원 펩티드」는, 항원이 될 수 있는 펩티드인 한 특별히 한정되는 것은 아니며, 천연 유래의 것이어도, 합성 유래의 것이어도, 시판되고 있는 것이어도 된다. 항원 펩티드는, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, WT-1, α-태아 단백질, MAGE-1, MAGE-3, 태반 알칼리성 포스파타아제 시알릴-루이스 X, CA-125, CA-19, TAG-72, 상피 당단백질 2, 5T4, α 태아 단백질 수용체, M2A, 티로시나아제, Ras, p53, Her-2/neu, EGF-R, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, myc, BCR-ABL, HPV형 16, 멜라노트랜스페린, MUC1, CD10, CD19, CD20, CD37, CD45R, IL-2 수용체 α쇄, T 세포 수용체, 전립선 산성 포스파타아제, GP100, MelanA/Mart-1, gp75/브라운, BAGE, S-100, 이토케라틴, CYFRA21-1, Ep-CAM, Gtf2i, RPL18 등의 종양 관련 항원 펩티드; 인슐린, 글루탐산디카르복실라아제, ICA512/IA-2 단백질 티로신포스파타아제, ICA12, ICA69, 프리프로인슐린, HSP60, 카르복시펩티다아제 H, 페리페린, GM1-2, 비트로넥틴, β 크리스탈린, 칼레티쿨린, 세로트랜스페린, 케라틴, 피루브산카르복실라아제, C1, 빌린 2, 뉴클레오솜, 리보뉴클레오 단백질, 미엘린 올리고덴드로사이트 당단백질, 미엘린 관련 당단백질, 미엘린/올리고덴드로사이트 염기성 단백질, 올리고덴드로사이트 특이적 단백질, 미엘린 염기성 단백질, 프로테오리피드 아포단백질 등의 자기 항원 펩티드; 원생 동물(예를 들어, 말라리아 원충, 리슈마니아종, 트리파노소마종), 세균(예를 들어, 그람 양성 구균, 그람 양성 간균, 그람 음성 세균, 혐기성균), 진균(예를 들어, 아스퍼질러스, 블라스토미세스, 칸디다, 콕시디오이데스, 크립토코커스, 히스토플라스마, 파라콕시디오이데스, 스포로트릭스), 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 파필로마 바이러스, 호흡 싱크티알 바이러스, 폭스바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, SARS-CoV나 SARS-CoV2와 같은 코로나 바이러스), 세포 내 기생체(예를 들어, 클라미디아과, 마이코플라스마과, 아콜레플라스마과, 리케차과), 연충(예를 들어, 선충, 흡충, 촌충) 등의 감염 병원체에서 유래되는 항원 펩티드; 프리온 등의 기타의 항원 펩티드 등을 들 수 있다.
항원 펩티드는, 알레르기 증상을 야기하는 알레르겐을 포함해도 된다. 알레르겐으로서는, 상기 원생 동물, 세균, 진균, 세포 내 기생체 및 연충에서 유래되는 펩티드 이외에, 외래성의 펩티드, 예를 들어, 집먼지, 진드기, 동물(예를 들어 고양이, 개 등의 컴패니언 애니멀), 및 화분(예를 들어, 삼목이나 노송나무) 유래의 펩티드 등이 예시된다. 보다 상세하게는, Cryj1 등의 삼목 화분에 포함되는 단백질이 예시된다. 혹은, 알레르기 증상을 야기하는 알레르겐은, 음식물 유래의 것이어도 된다. 음식물에 대한 알레르기 증상을 일으키는 알레르겐으로서는, 계란, 우유, 소맥, 메밀, 게, 새우 및 낙화생 유래의 펩티드 등이 예시된다.
본 명세서 중에서 사용되는 「MHC 분자 구속성 항원 펩티드」란, 시험관 내, 생체 내 및/또는 생체 외 등에서, MHC 분자에 결합하는 것이 가능한 항원 펩티드를 의미한다. 「MHC 분자 구속성 항원 펩티드」의 아미노산 잔기수는, 통상적으로, 약 7 내지 약 30이다. 「MHC 분자 구속성 항원 펩티드」로서는, 예를 들어, MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드, MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드 등을 들 수 있다.
본 명세서 중에서 사용되는 「MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드」란, 시험관 내, 생체 내 및/또는 생체 외 등에서, MHC 클래스 I 분자에 결합하는 것이 가능한 항원 펩티드를 의미한다. MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드가 세포 외 소포의 막 외에 제시되면, 예를 들어, 해당 항원 펩티드가 전구체 T 세포 등에 인식되어, 세포 상해성 T 세포 등을 유도할 수 있다. 「MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드」의 아미노산 잔기수는, 통상적으로, 약 7 내지 약 30이며, 바람직하게는 약 7 내지 약 25이며, 보다 바람직하게는 약 7 내지 약 20이며, 더욱 바람직하게는 약 7 내지 약 15이며, 보다 더욱 바람직하게는 약 7 내지 약 12이다.
본 명세서 중에서 사용되는 「MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드」란, 시험관 내, 생체 내 및/또는 생체 외 등에서, MHC 클래스 II 분자에 결합하는 것이 가능한 항원 펩티드를 의미한다. MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드가 세포 외 소포의 막 외에 제시되면, 예를 들어, 해당 항원 펩티드가 전구체 T 세포 등에 인식되어, 헬퍼 T 세포 등을 유도할 수 있다. 「MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드」의 아미노산 잔기수는, 통상적으로, 약 7 내지 약 30이며, 바람직하게는 약 10 내지 약 25이며, 보다 바람직하게는 약 12 내지 약 24이다.
「MHC 분자 구속성 항원 펩티드」, 「MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드」, 또는 「MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드」로서는, MHC 분자, MHC 클래스 I 분자 또는 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 것이 가능한 항원 펩티드인 한, 특별히 한정되는 것은 아니다.
T 세포 자극성 사이토카인
본 명세서 중에서 사용되는 「T 세포 자극성 사이토카인」이란, T 세포의 막 상에 발현하는 수용체 등을 통하여, T 세포를 자극(예를 들어, 활성화, 억제 등)하는 것이 가능한 사이토카인인 한 특별히 한정되는 것은 아니다. T 세포 자극성 사이토카인으로서는, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-15, TGF-β, IFN-α, IFN-γ 등을 들 수 있다. 이들 중, 호모 혹은 헤테로의 서브유닛 다량체를 형성할 수 있는 것(예를 들어, IL-12, TGF-β 등)은 기능적인 한(즉, 원하는 약리 활성을 가질 수 있는 한), 경우에 따라서 펩티드 링커 등을 통하여 연결된, 연속한 아미노산 서열의 것이어도 된다. T 세포를 자극하는 능력을 유지하는 한, 다른 완전 길이 단백질 또는 그 부분 서열 펩티드(예를 들어, IL-15 수용체의 Sushi 도메인)와 결합 또는 융합되어 있어도 된다.
본 명세서 중에 기재된 T 세포 자극성 사이토카인은, 임의의 동물종 유래의 것이어도 된다. 예를 들어, 마우스, 래트 등의 설치류; 토끼 등의 토끼목; 돼지, 소, 염소, 말, 양 등의 유제류; 개, 고양이 등의 식육목; 인간, 원숭이, 붉은털 원숭이, 게잡이 원숭이, 마모셋, 오랑우탄, 침팬지 등의 영장류 등의 포유 동물 등의 동물에서 유래되는 것을 들 수 있다. 본 명세서 중에 기재된 T 세포 자극성 사이토카인은, 바람직하게는, 설치류 또는 포유류 동물에서 유래되는 것이며, 보다 바람직하게는, 마우스 또는 인간에게서 유래하는 것이다.
본 명세서 중에 기재된 T 세포 자극성 사이토카인은, 그 기능을 발휘할 수 있는 것인 한, 그 야생형의 아미노산 서열(예를 들어, IL-2의 경우, 예를 들어 서열 번호 25 등; IL-4의 경우, 예를 들어 서열 번호 53 등)에 대하여 아미노산 서열 동일성이, 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것이어도 된다. 혹은, 본 명세서 중에 기재된 T 세포 자극성 사이토카인은, 그 기능을 발휘할 수 있는 것인 한, 그 야생형의 아미노산 서열에 대하여 1개 또는 복수개의 아미노산의 결실, 삽입, 부가 및/또는 치환 등 된 것이어도 된다.
본 명세서 중에서 사용되는 「(제1, 제2) T 세포 자극성 사이토카인을 포함하는, 해당 (제1, 제2) T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 단백질」이란, T 세포 자극성 사이토카인을 적어도 포함하고, 세포 또는 세포 외 소포의 막 외에 해당 T 세포 자극성 사이토카인을 제시하는 것이 가능한 단백질을 의미한다. 「(제1, 제2) T 세포 자극성 사이토카인을 포함하는, 해당 (제1, 제2) T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 단백질」은, 이것이 세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현하도록, 플라스미드 등을 사용하여, T 세포 자극성 사이토카인과 막 단백질 또는 그 막 관통 도메인을 포함하는 프래그먼트 등을 포함하는 융합 단백질로서 발현시킨 것이어도 된다. 혹은, 「(제1, 제2) T 세포 자극성 사이토카인을 포함하는, 해당 (제1, 제2) T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 단백질」은, 가용성의 T 세포 자극성 사이토카인(이들에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, T 세포 자극성 사이토카인 그 자체; T 세포 자극성 사이토카인과 항체의 Fc 부분의 융합 단백질; T 세포 자극성 사이토카인과, 해당 T 세포 자극성 사이토카인을 인식하는 항체, 또는 그 항원 결합성 프래그먼트(예를 들어, scFv, Fab 혹은 나노바디) 등의 복합체 등)을 사용하는 경우, 가용성의 T 세포 자극성 사이토카인과 세포 또는 세포 외 소포를, 필요에 따라서 지질 링커, 펩티드 링커 등을 통하여, 세포 외 소포의 막에 결합시킨 것이어도 된다(예를 들어, 일본 특허 공개 제2018-104341호 공보 등에 기재된 방법을 참고로 해도 된다). 혹은, 가용성의 T 세포 자극성 사이토카인의 N 말단측 또는 C 말단측에 원하는 태그(예를 들어, His 태그, FLAG 태그, PNE 태그를 부가한 것(해당 태그는, 예를 들어, 다른 구성 요소와 함께 융합 단백질로서 발현시켜도 되고, 별도 준비한 가용성의 T 세포 자극성 사이토카인에, 필요에 따라서 링커 등을 통하여 결합시켜도 된다)과, 해당 태그에 대한 항체 또는 그의 항원 결합성 프래그먼트(예를 들어, scFv, Fab 혹은 나노바디) 등을 포함하는 단백질(예를 들어, 필요에 따라서 링커 등을 통하여 세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합한, 해당 태그에 대한 항체 또는 그의 항원 결합성 프래그먼트(예를 들어, scFv, Fab 혹은 나노바디) 등 자체; 세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현하는 것이 가능한 막 단백질 또는 그 막 관통 도메인의 N 말단측 또는 C 말단측에, 해당 태그에 대한 나노바디가 결합한, 융합 단백질 등)을 막에 포함하는 세포 또는 세포 외 소포를, 원하는 조건에서 혼합한 것이어도 된다(예를 들어, Raj D, et al., Gut., 2019 Jun; 68(6): 1052-1064 등에 기재된, PNE 태그와 해당 태그에 대한 항체 등을 사용하는 방법을 참고로 해도 된다). 또한, 서브유닛의 다량체로 형성되는 T 세포 자극성 사이토카인의 경우, 그 서브유닛의 하나가, 세포 또는 세포 외 소포의 막 외에 제시하는 것이 가능한 단백질이면, 나머지의 서브유닛은 막 외에 제시 가능한 양태일 필요는 없다. 그 서브유닛의 하나가, 세포 외 소포의 막 외에 제시하는 것이 가능한 단백질이면, 다른 서브유닛을 첨가 또는 공발현시킴으로써, 기능적인 T 세포 자극성 사이토카인이 세포 외 소포의 막 외에 구축될 수 있다.
T 세포 공자극 분자
본 명세서 중에서 사용되는 「T 세포 공자극 분자」란, CD28, CD134 등의 T 세포의 막 상에 존재하는 분자와 상호 작용함으로써, T 세포의 활성화 등에 기여할 수 있는 분자를 의미한다. T 세포 공자극 분자로서는, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, CD80, CD86 등의 분자, 또는 이들의 세포 외 도메인 혹은 그의 기능적인 프래그먼트; 항CD28 항체, 항CD134 항체 등의 항체, 또는 이들의 항원 결합성 프래그먼트(예를 들어, scFv, Fab 혹은 나노바디) 등; 이들과, 다른 단백질의 막 관통 도메인 혹은 항체의 Fc 부분 등의 융합 단백질(혹은 복합체, 회합체) 등을 들 수 있다.
본 명세서 중에서 사용되는 「막관통 도메인을 포함하는 T 세포 공자극 분자」란, 추가로 T 세포 공자극 분자 유래의 막 관통 도메인도 포함하는 「T 세포 공자극 분자」를 의미한다.
본 명세서 중에 기재된 T 세포 공자극 분자는, 임의의 동물종 유래의 것이어도 된다. 예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트 등의 설치류; 토끼 등의 토끼목; 돼지, 소, 염소, 말, 양 등의 유제류; 개, 고양이 등의 식육목; 인간, 원숭이, 붉은털 원숭이, 게잡이 원숭이, 마모셋, 오랑우탄, 침팬지 등의 영장류 등의 포유 동물 등의 동물에서 유래되는 것을 들 수 있다. 본 명세서 중에 기재된 T 세포 공자극 분자는, 바람직하게는, 설치류 또는 포유류 동물에서 유래되는 것이며, 보다 바람직하게는, 마우스 또는 인간에게서 유래하는 것이다.
본 명세서 중에 기재된 T 세포 공자극 분자는, 상술한 기능을 발휘할 수 있는 것인 한, 그 야생형의 아미노산 서열(예를 들어, CD80의 경우, 예를 들어 서열 번호 67 등)에 대하여 아미노산 서열 동일성이, 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것이어도 된다. 혹은, 본 명세서 중에 기재된 T 세포 공자극 분자는, 그 기능을 발휘할 수 있는 것인 한, 그 야생형의 아미노산 서열에 대하여 1개 또는 복수개의 아미노산의 결실, 삽입, 부가 및/또는 치환 등 된 것이어도 된다.
본 명세서 중에서 사용되는 「T 세포 공자극 분자를 포함하는, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 단백질」이란, T 세포 공자극 분자를 적어도 포함하고, T 세포의 막 상에 존재하는 분자와 상호 작용 가능한 단백질을 의미한다. 즉, 적어도 T 세포 공자극 분자 중에 존재하는 T 세포와 상호 작용 가능한 부분이, 세포 또는 세포 외 소포의 막 외에 위치하고 있는 것을 의미한다. 「T 세포 공자극 분자를 포함하는, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 단백질」은, 이것이 세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현하도록, 플라스미드 등을 사용하여 발현시킨 것이어도 된다. 혹은, 「T 세포 공자극 분자를 포함하는, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 단백질」은, 가용성의 T 세포 공자극 분자(이들에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, CD80의 세포 외 도메인과 항체의 Fc 부분의 융합 단백질; 항CD28 항체, 또는 그 항원 결합성 프래그먼트(예를 들어, scFv, Fab 혹은 나노바디) 등)를 사용하는 경우, 가용성의 T 세포 공자극 분자와 세포 또는 세포 외 소포를, 필요에 따라서 지질 링커, 스페이서 서열 등을 통하여, 세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합시킨 것이어도 된다(예를 들어, 일본 특허 공개 제2018-104341호 공보 등에 기재된 방법을 참고로 해도 된다). 혹은, 가용성의 T 세포 공자극 분자의 N 말단측 또는 C 말단측에 원하는 태그(예를 들어, His 태그, FLAG 태그, PNE 태그를 부가한 것(해당 태그는, 예를 들어, 다른 구성 요소와 함께 융합 단백질로서 발현시켜도 되고, 별도 준비한 가용성의 T 세포 공자극 분자에, 필요에 따라서 링커 등을 통하여 결합시켜도 된다)과, 해당 태그에 대한 항체 또는 그의 항원 결합성 프래그먼트(예를 들어, scFv, Fab 혹은 나노바디) 등을 포함하는 단백질(예를 들어, 필요에 따라서 링커 등을 통하여 세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합한, 해당 태그에 대한 항체 또는 그의 항원 결합성 프래그먼트(예를 들어, scFv, Fab 혹은 나노바디) 등 자체; 세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현하는 것이 가능한 막 단백질 또는 그 막 관통 도메인의 N 말단측 또는 C 말단측에, 해당 태그에 대한 나노바디가 결합한, 융합 단백질 등)을 막에 포함하는 세포 또는 세포 외 소포를, 원하는 조건에서 혼합한 것이어도 된다(예를 들어, Raj D, et al., Gut., 2019 Jun; 68(6): 1052-1064 등에 기재된, PNE 태그와 해당 태그에 대한 항체 등을 사용하는 방법을 참고로 해도 된다).
본 명세서 중에서 사용되는 「세포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인」으로서는, 세포막에 발현되는 것이 가능한 것인 한, 임의의 막 단백질 또는 그 막 관통 도메인을 선택할 수 있다.
이것에 한정되지 않지만, 막 단백질 또는 그 막 관통 도메인에는, CD8, CD4, CD28, 트랜스페린 수용체 등의 일부 또는 전부, IgG1, IgG2, IgG4 등의 막 결합형 면역 글로불린 분자의 FC 영역의 일부 또는 전부를 포함하는 것이 바람직하다.
본 명세서 중에서 사용되는 「세포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 도메인」으로서는, 세포의 막에 결합되는 것이 가능한 것인 한, 임의의 단백질 또는 그 도메인을 선택할 수 있다.
본 명세서 중에서 사용되는 「세포 외 소포의 막에 발현하는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그의 막 관통 도메인」으로서는, 세포 외 소포의 막에 발현하는 것이 가능한 것인 한, 임의의 막 단백질 또는 그 막 관통 도메인을 선택할 수 있다. 「세포 외 소포의 막에 발현하는 것이 가능한 막 단백질 또는 그 막 관통 도메인」은, 세포 외 소포(예를 들어, 엑소솜 등)에 발현할 수 있는 것이 알려져 있는 막 단백질(예를 들어, 테트라스파닌, CD58, ICAM-1, PTGFRN(예를 들어, 비특허문헌 1, 국제 공개 제2019/183578호 등을 참조) 등), 또는 이들의 막 관통 도메인 등이 바람직하다.
본 명세서 중에서 사용되는 「세포 외 소포의 막에 결합하는 것이 가능한 단백질 혹은 그의 도메인」으로서는, 세포 외 소포의 막에 결합하는 것이 가능한 것인 한, 임의의 단백질 또는 그의 도메인을 선택할 수 있다. 「세포 외 소포의 막에 결합하는 것이 가능한 단백질 혹은 그의 도메인」은, 세포 외 소포(예를 들어, 엑소솜 등)의 막에 결합할 수 있는 것이 알려져 있는 것(예를 들어, MFG-E8, 또는 그의 도메인(예를 들어, Alain Delcayre, et al., Blood Cells, Molecules, and Diseases 35(2005)158-168에 기재된 MFG-E8의 C1, C2 도메인)) 등이 바람직하다.
본 명세서 중에 기재된 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현하는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그의 막 관통 도메인」 또는 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합하는 것이 가능한 단백질 혹은 그의 도메인」은, 임의의 동물종 유래의 것이어도 된다. 예를 들어, 마우스, 래트 등의 설치류; 토끼 등의 토끼목; 돼지, 소, 염소, 말, 양 등의 유제류; 개, 고양이 등의 식육목; 인간, 원숭이, 붉은털 원숭이, 게잡이 원숭이, 마모셋, 오랑우탄, 침팬지 등의 영장류 등의 포유 동물 등의 동물에서 유래되는 것을 들 수 있다. 본 명세서 중에 기재된 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현하는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그의 막 관통 도메인」 또는 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합하는 것이 가능한 단백질 혹은 그의 도메인」은, 바람직하게는, 설치류 또는 포유류 동물에서 유래되는 것이며, 보다 바람직하게는, 마우스 또는 인간에게서 유래하는 것이다.
비특허문헌 2에 의하면, 포유 동물의 세포 외 소포의 마커는 이하와 같이 분류된다.
세포 외 소포의 마커 단백질로서 사용할 수 있는 막 단백질 또는 GPI 앵커 단백질로서는,
1) 조직 비특이적인 것
테트라스파닌(CD63, CD9, CD81, CD82), 다른 복수 막 관통형의 막 단백질 (CD47이나 헤테로 3량체 G 단백질(GNA: Guanine nucleotide-binding proteins) 등)
MHC 클래스 I(HLA-A/B/C, H2-K/D/Q),
인테그린(ITGA/ITGB), 트랜스페린 수용체(TFR2);
LAMP1/2;
헤파란황산프로테오글리칸(신데칸(SDC)을 포함한다);
세포 외 매트릭스 메탈로프로테아제 유도 물질(EMMPRIN)(BSG 또는 CD147이라고도 한다);
ADAM10;
GPI 앵커형의 5' 뉴클레오티다아제인 CD73(NT5E),
GPI 앵커형의 보체 결합 단백질인 CD55 및 CD59;
소닉 헤지호그 단백질(SHH)
2) 세포/조직 특이적인 것
몇 개의 테트라스파닌: TSPAN8(상피 세포 특이적), CD37 및 CD53(백혈구 특이적);
PECAM1(내피 세포 특이적);
ERBB2(유방암 특이적);
EPCAM(상피성 특이적);
CD90(THY1)(간엽계 줄기세포 특이적);
CD45(PTPRC)(면역 세포 특이적), CD41(ITGA2B) 또는 CD42a(GP9)(혈소판 특이적);
글리코포린 A(GYPA)(적혈구 특이적);
CD14(단구 특이적), MHC 클래스 II(HLA-DR/DP/DQ, H2-A);
CD3(T 세포 특이적);
아세틸콜린에스테라제/AChE-S(신경 세포 특이적), AChE-E(적혈구 특이적);
아밀로이드 βA4/APP(신경 세포 특이적);
등을 들 수 있다.
따라서, 이들에 한정하지 않지만, 세포 외 소포의 마커인 단백질을 본 발명에 있어서의 「세포 외 소포의 막에 발현하는 것이 가능한 막 단백질」 또는 「세포 외 소포의 막에 결합하는 것이 가능한 단백질」로서 사용해도 된다.
본 명세서 중에서 사용되는 「테트라스파닌」이란, 테트라스파닌 패밀리에 속하는 단백질(이들에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, CD9, CD53, CD63, CD81, CD82, CD151 등)을 의미한다. 테트라스파닌은, 통상적으로, N 말단측으로부터, 막 관통 도메인 1(이하, 「TM1」이라고도 한다.), 소형 세포 외 루프(이하, 「SEL」이라고도 한다.), 막 관통 도메인 2(이하, 「TM2」이라고도 한다.), 소형 세포 내 루프(이하, 「SIL」이라고도 한다.), 막 관통 도메인 3(이하, 「TM3」이라고도 한다.), 대형 세포 외 루프(이하, 「LEL」이라고도 한다.), 및 막 관통 도메인 4(이하, 「TM4」라고도 한다.)를 갖는 것으로부터, 4회 막 관통형이며, 또한, N 말단측 및 C 말단측의 양쪽이 세포질측에 존재한다. 예를 들어, 테트라스파닌이 마우스 CD63(아미노산 서열1 내지 238: 서열 번호 27)인 경우, 통상적으로, 아미노산 서열 약 1 내지 약 110에 있어서, TM1, SEL, TM2, SIL 및 TM3을 포함하고, 아미노산 서열 약 111 내지 약 200에 있어서, LEL을 포함하고, 아미노산 서열 약 201 내지 약 238에 있어서, TM4를 포함할 수 있다.
본 명세서 중에 기재된 「테트라스파닌」에 있어서의 각 도메인(예를 들어, TM1, SEL, SIL, LTL 등)은 동일한 테트라스파닌 유래의 것이어도 되고, 전부 또는 일부가 다른 테트라스파닌 유래의 것이어도 된다.
본 명세서 중에 기재된 테트라스파닌은, 세포 외 소포의 막에 발현하는 것이 가능한 것인 한, 그 야생형의 아미노산 서열(예를 들어, 전체 길이의 CD9의 경우, 예를 들어 서열 번호 21 등; 전체 길이의 CD63의 경우, 예를 들어 서열 번호 27 등; 전체 길이의 CD81의 경우, 예를 들어 서열 번호 15 등)에 대하여 아미노산 서열 동일성이, 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것이어도 된다. 혹은, 본 명세서 중에 기재된 테트라스파닌은, 세포 외 소포의 막에 발현하는 것이 가능한 것인 한, 그 야생형의 아미노산 서열에 대하여 1개 또는 복수개의 아미노산의 결실, 삽입, 부가 및/또는 치환 등 된 것이어도 된다.
본 명세서 중에 기재된 테트라스파닌의 부분 서열(예를 들어, 각 도메인; TM1, SEL, TM2, SIL 및 TM3을 포함하는 부분 서열(예를 들어, CD63의 경우, 서열 번호 57 등; CD81의 경우, 서열 번호 61 등); TM4를 포함하는 부분 서열(예를 들어, CD63의 경우, 서열 번호 59 등; CD81의 경우, 서열 번호 63 등))은 그 야생형의 아미노산 서열에 대하여 아미노산 서열 동일성이, 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것이어도 된다. 혹은, 본 명세서 중에 기재된 테트라스파닌의 부분 서열은, 그 야생형의 아미노산 서열에 대하여 1개 또는 복수개의 아미노산의 결실, 삽입, 부가 및/또는 치환 등 된 것이어도 된다.
본 명세서 중에 기재된 MFG-E8은, 세포 외 소포의 막에 결합하는 것이 가능한 것인 한, 그 야생형의 아미노산 서열(예를 들어, 서열 번호 49 등)에 대하여 아미노산 서열 동일성이, 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것이어도 된다. 혹은, 본 명세서 중에 기재된 MFG-E8은, 세포 외 소포의 막에 결합하는 것이 가능한 것인 한, 그 야생형의 아미노산 서열에 대하여 1개 또는 복수개의 아미노산의 결실, 삽입, 부가 및/또는 치환 등 된 것이어도 된다.
본 명세서 중에 기재된 CD58, PTGFRN 등은, 세포 외 소포의 막에 발현하는 것이 가능한 것이거나, 또는 세포 외 소포의 막에 결합하는 것이 가능한 것인 한, 그 야생형의 아미노산 서열에 대하여 아미노산 서열 동일성이, 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것이어도 된다. 혹은, 본 명세서 중에 기재된 CD58, PTGFRN 등은, 세포 외 소포의 막에 발현하는 것이 가능한 것이거나, 또는 세포 외 소포의 막에 결합하는 것이 가능한 것인 한, 그 야생형의 아미노산 서열에 대하여 1개 또는 복수개의 아미노산의 결실, 삽입, 부가 및/또는 치환 등 된 것이어도 된다.
스페이서 서열
본 명세서 중에서 사용되는 「스페이서 서열」란, 2 이상의 단백질 또는 그의 부분 서열 혹은 도메인 등의 사이에 존재하는, 적어도 하나의 아미노산 잔기를 갖는 임의의 서열을 의미한다. 스페이서 서열은, 예를 들어, 2 이상의 단백질 또는 그의 부분 서열 혹은 도메인 등을 연결할 때에 사용될 수 있다. 스페이서 서열은, 펩티드 링커를 포함한다. 스페이서 서열은, 아미노산 잔기의 길이로서, 통상적으로, 1 내지 약 50이며, 바람직하게는, 약 2 내지 약 28이며, 보다 바람직하게는, 약 4 내지 약 25이다. 스페이서 서열로서는, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, (GGGXS)nGm(식 중, X는 출현할 때마다 독립적으로, A 또는 G이며, n은, 1 내지 8이며, m은, 0 내지 3임)(예를 들어, 서열 번호 5, 11, 29, 39 등); (GGGS)nGm(식 중, n은, 1 내지 10이며, m은, 0 내지 3임); TaSb(GGX)nGm(식 중, X는 출현할 때마다 독립적으로, S 또는 T이며, n은, 1 내지 8이며, m은, 0 내지 3이며, a는, 0 또는 1이며, b는, 0 또는 1임)(예를 들어, 서열 번호 77 등); 등을 들 수 있다.
본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포
본 발명의 일 실시 형태에서는, 항원 제시 MHC 분자 및 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시하는 세포 외 소포를 제공한다(도 2k의 (1)에 그의 모델을 예시한다).
이러한 세포 외 소포는, 이하의 (A)와 (B)에 규정되는 단백질을 막에 포함함으로써, 항원 제시 MHC 분자 및 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시시켜도 되고, (D)에 규정되는 단백질을 막에 포함함으로써, 항원 제시 MHC 분자 및 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시시켜도 된다.
혹은, 단리한 세포 외 소포에 뒤부터, 그 막 표면에 항원 제시 MHC 분자 및 T 세포 자극성 사이토카인을 부착시켜도 된다. 부착시키는 방법은 특별히 한정하지 않지만, 항원 제시 MHC 분자 및 T 세포 자극성 사이토카인에 각각 인지질을 결합하고, 세포 외 소포의 막에 인지질 부분을 도입시킴으로써, 막 표면에 항원 제시 MHC 분자 및 T 세포 자극성 사이토카인을 부착시켜도 된다. 세포 외 소포에는 포스파티딜세린이 표면에 존재하고 있다. 따라서, 포스파티딜세린과 결합하는 MFG-E8에, 제시시키고자 하는 항원 제시 MHC 분자 또는 T 세포 자극성 사이토카인을 융합시킨 단백질을 각각 합성 정제하고, 그 융합 단백질과 세포 외 소포를 혼합함으로써, 막 표면에 항원 제시 MHC 분자 및 T 세포 자극성 사이토카인을 제시하는 세포 외 소포를 제작할 수 있다. 또한, 펩티드 네오에피토프(PNE) 나노바디를 미리 발현시킨 세포 외 소포에, 나중에 PNEtag을 붙인 항원 제시 MHC 분자 및 T 세포 자극성 사이토카인을 첨가하여 세포 외 소포의 막 표면에 제시시켜도 된다. 스트렙트아비딘을 발현시킨 세포 외 소포에 비오틴화한 항원 제시 MHC 분자 및 T 세포 자극성 사이토카인을 첨가하고, 세포 외 소포의 막 표면에 제시시켜도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 복수 종류(2, 3, 4, 5종)의 항원 제시 MHC 분자 및 복수 종류(2, 3, 4, 5종)의 T 세포 자극성 사이토카인(각각의 T 세포 자극성 사이토카인을 식별하기 위해서, 이하, 제1 T 세포 자극성 사이토카인, 제2 T 세포 자극성 사이토카인, 그 이상의 T 세포 자극성 사이토카인 등과 같이 호칭하는 경우가 있다)을 막 외에 제시하는 세포 외 소포여도 된다. 혹은 1종류의 항원 제시 MHC 분자와 복수 종류의 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시하는 세포 외 소포여도 된다(도 2k의 (3)에 1종류의 항원 제시 MHC 분자와 2종류의 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시하는 세포 외 소포의 모델을 예시한다).
본 발명의 일 실시 형태에서는, 항원 제시 MHC 분자 및 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시하는 세포를 제공한다(도 2k의 (1)의 세포 외 소포의 모델에 대응한다).
이러한 항원 제시 세포는, 이하의 (A)와 (B)에 규정되는 단백질을 막에 포함함으로써, 항원 제시 MHC 분자 및 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시시켜도 되고, (D)에 규정되는 단백질을 막에 포함함으로써, 항원 제시 MHC 분자 및 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시시켜도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 복수 종류(2, 3, 4, 5종)의 항원 제시 MHC 분자 및 복수 종류(2, 3, 4, 5종)의 T 세포 자극성 사이토카인(각각의 T 세포 자극성 사이토카인을 식별하기 위해서, 이하, 제1 T 세포 자극성 사이토카인, 제2 T 세포 자극성 사이토카인, 그 이상의 T 세포 자극성 사이토카인 등이라 호칭하는 경우가 있음)을 막 외에 제시하는 세포여도 된다. 혹은 1종류의 항원 제시 MHC 분자와 복수 종류의 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시하는 세포여도 된다(도 2k의 (3)의 세포 외 소포의 모델에 대응한다).
본 발명의 일 실시 형태에서는, 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포이며, 그 막에 이하:
(A) 항원 제시 MHC 분자를 포함하는, 해당 항원을 막 외에 제시 가능한 단백질; 및
(B) 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 포함하는, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 단백질;
을 포함하는, 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포를 제공한다.
구성 요건 (A)
상기 (A)의 「항원 제시 MHC 분자를 포함하는, 해당 항원을 막 외에 제시 가능한 단백질」은, 항원을 세포 또는 세포 외 소포의 막 외에 제시 가능한 단백질인 한, 항원 제시 MHC 분자 이외에도, 다른 단백질 또는 그 도메인 등을 포함하고 있어도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (A)는 항원 제시 MHC 분자와, 세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인 또는 세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 도메인을 포함하는, 해당 항원을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질 또는 단백질 복합체이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (A)는
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이며, 그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-3) 막 관통 도메인을 포함하는 단쇄 MHC 분자의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질,
또는
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 단백질 복합체이며,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-3) MHC 클래스 Iα쇄, β2 마이크로글로불린이 MHC 클래스 Iα쇄의 융합 단백질, MHC 클래스 IIα쇄, 또는 MHC 클래스 IIβ쇄를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질과,
(A-6) β2 마이크로글로불린, MHC 클래스 Iα쇄, MHC 클래스 IIβ쇄, 또는 MHC 클래스 IIα쇄의 아미노산 서열을 포함하는 단백질
을 포함하는, 단백질 복합체; 여기에서 (A-3)과 (A-6)의 조합으로부터, MHC 클래스 I 분자 또는 MHC 클래스 II 분자를 구성하는
것이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (A)는
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이며, 그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-3) 막 관통 도메인을 포함하는 단쇄 MHC 클래스 I 분자의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이다.
또한, 본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (A)는
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이며, 그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-3)) 막 관통 도메인을 포함하는 단쇄 MHC 클래스 II 분자의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (A)는
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 단백질 복합체이며,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-3) β2 마이크로글로불린과 MHC 클래스 Iα쇄의 융합 단백질의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (A)는
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 단백질 복합체이며,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-3) MHC 클래스 Iα쇄의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질과,
(A-6) β2 마이크로글로불린의 아미노산 서열을 포함하는 단백질
을 포함하는, 단백질 복합체이다.
또한, 본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (A)는
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 단백질 복합체이며,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-3) MHC 클래스 IIβ쇄의 아미노산 서열,
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질과,
(A-6) MHC 클래스 IIα쇄의 아미노산 서열을 포함하는 단백질
을 포함하는, 단백질 복합체이다.
또한, 본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (A)는
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 단백질 복합체이며,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-3) MHC 클래스 IIα쇄의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질과,
(A-6) MHC 클래스 IIβ쇄의 아미노산 서열을 포함하는 단백질
을 포함하는, 단백질 복합체이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (A)는 항원 제시 MHC 분자와, 테트라스파닌 혹은 그 막 관통 도메인 혹은 MFG-E8 혹은 그 도메인을 포함하는, 해당 항원을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질 또는 단백질 복합체이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (A)는
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-3) 단쇄 MHC 분자의 아미노산 서열,
(A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 결합 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질, 또는
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-3) MHC 클래스 Iα쇄의 막외 영역, β2 마이크로글로불린, MHC 클래스 IIα쇄의 막외 영역, 또는 MHC 클래스 IIβ쇄의 막외 영역의 아미노산 서열
(A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질과,
(A-6) β2 마이크로글로불린, MHC 클래스 Iα쇄, MHC 클래스 IIβ쇄, 또는 MHC 클래스 IIα쇄의 아미노산 서열을 포함하는 단백질
을 포함하는, 단백질 복합체
이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (A)는
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-3) 단쇄 MHC 클래스 I 분자의 아미노산 서열,
(A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이다.
또한, 본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (A)는
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-3) 단쇄 MHC 클래스 II 분자의 아미노산 서열,
(A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (A)는
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-3) β2 마이크로글로불린의 아미노산 서열,
(A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질과,
(A-6) MHC 클래스 Iα쇄의 아미노산 서열을 포함하는 단백질
을 포함하는, 단백질 복합체이다.
또한, 본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (A)는
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 단백질 복합체이며,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-3) MHC 클래스 Iα쇄의 막외 영역의 아미노산 서열,
(A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질과,
(A-6) β2 마이크로글로불린의 아미노산 서열을 포함하는 단백질
을 포함하는, 단백질 복합체이다.
또한, 본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (A)는
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 단백질 복합체이며,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-3) MHC 클래스 IIβ쇄의 막외 영역의 아미노산 서열,
(A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질과,
(A-6) MHC 클래스 IIα쇄의 아미노산 서열을 포함하는 단백질
을 포함하는, 단백질 복합체이다.
또한, 본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (A)는
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 단백질 복합체이며,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-3) MHC 클래스 IIα쇄의 막외 영역의 아미노산 서열,
(A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-5) 테트라스파닌
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질과,
(A-6) MHC 클래스 IIβ쇄의 아미노산 서열을 포함하는 단백질
을 포함하는, 단백질 복합체이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 「단쇄 MHC 분자」가 「단쇄 MHC 클래스 I 분자」인 경우, 「단쇄 MHC 클래스 I 분자」는, N 말단측으로부터, β2 마이크로글로불린(예를 들어, 서열 번호 7 등, 또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것), 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열(존재하는 경우, 예를 들어 서열 번호 5, 11, 29, 39, 77 등), 및 MHC 클래스 Iα쇄(예를 들어, 서열 번호 9 등, 또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)를 포함한다. 본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (A-3)이 「단쇄 MHC 클래스 I 분자」인 경우, 「단쇄 MHC 클래스 I 분자」는, 서열 번호 65, 또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 「단쇄 MHC 분자」가 「단쇄 MHC 클래스 II 분자」인 경우, 「단쇄 MHC 클래스 II 분자」는, N 말단측으로부터, MHC 클래스 IIβ쇄, 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열 및 MHC 클래스 IIα쇄를 포함한다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (A-3) 및/또는 (A-6)이 「β2 마이크로글로불린」인 경우, 「β2 마이크로글로불린」은 서열 번호 7, 또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (A-3) 및/또는 (A-6)이 「MHC 클래스 Iα쇄」인 경우, 「MHC 클래스 Iα쇄」는 서열 번호 9, 또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (A-3) 및/또는 (A-6)이 「MHC 클래스 IIβ쇄」인 경우, 「MHC 클래스 IIβ쇄」는 서열 번호 37, 또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (A-3) 및/또는 (A-6)이 「MHC 클래스 IIα쇄」인 경우, 「MHC 클래스 IIα쇄」는 서열 번호 71, 또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것이다.
상기 각 실시 양태에 있어서의 (A-2) 및 (A-4)의 「존재하고 있어도 되는 스페이서 서열」은, 존재하는 경우, 독립적으로 선택될 수 있다. (A-2)는 존재하는 경우, 예를 들어 서열 번호 5, 11, 29, 39, 77 등의 스페이서 서열이어도 된다. (A-4)는 존재하는 경우, 예를 들어 서열 번호 5, 11, 29, 39, 77 등의 스페이서 서열이어도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 각 실시 양태에 있어서의 (A-5)의 테트라스파닌은, CD9, CD63 및 CD81로 이루어지는 군에서 선택된다. 본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 각 실시 양태에 있어서의 (A-5)의 테트라스파닌은, CD81(바람직하게는 서열 번호 15 등, 또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (A)는
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 서열 번호 5의 스페이서 서열,
(A-3) 서열 번호 65(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 단쇄 MHC 클래스 I 분자의 아미노산 서열, 및
(A-5) 서열 번호 15(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (A)는
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 단백질 복합체이며,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 서열 번호 39의 스페이서 서열,
(A-3) 서열 번호 37(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 MHC 클래스 IIβ쇄의 아미노산 서열, 및
(A-5) 서열 번호 15(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질과
(A-6) 서열 번호 71(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 MHC 클래스 IIα쇄의 아미노산 서열
을 포함하는, 단백질 복합체이다.
구성 요건 (B)
상기 (B)의 「제1 T 세포 자극성 사이토카인을 포함하는, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 단백질」은, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 단백질인 한, 제1 T 세포 자극성 사이토카인 이외에도, 다른 단백질 혹은 그 도메인 등을 포함하고 있어도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (B)는 제1 T 세포 자극성 사이토카인과, 세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 도메인을 포함하는, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (B)는 제1 T 세포 자극성 사이토카인과, CD8 또는 그 막 관통 도메인을 포함하는, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (B)는
그 N 말단측으로부터,
(B-3) 제1 T 세포 자극성 사이토카인,
(B-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(B-5) CD8 또는 그 막 관통 도메인
을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (B)는
(B) 제1 T 세포 자극성 사이토카인과, 테트라스파닌의 부분 서열을 포함하는, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이며, 해당 테트라스파닌의 부분 서열이 2개의 막 관통 도메인을 적어도 갖고, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인이 해당 2개의 막 관통 도메인의 사이에 배치되어 있는, 융합 단백질, 또는
(B) 제1 T 세포 자극성 사이토카인과, MFG-E8 또는 그 도메인을 포함하는, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이다.
본 명세서 중에서 사용되는 「테트라스파닌의 부분 서열이, 2개의 막 관통 도메인을 적어도 갖고, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인이 해당 2개의 막 관통 도메인의 사이에 배치되어 있다」란, 예를 들어 테트라스파닌의 부분 서열이 테트라스파닌의 TM1과 TM2를 적어도 포함하며, 또한 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인이 TM1과 TM2 사이에 배치되어 있는 경우, 테트라스파닌의 부분 서열이 테트라스파닌의 TM3과 TM4를 적어도 포함하며, 또한 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인이 TM3과 TM4 사이에 배치되어 있는 경우 등을 들 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (B)는
그 N 말단측으로부터,
(B-1) N 말단측으로부터, 막 관통 도메인 1, 소형 세포 외 루프, 막 관통 도메인 2, 소형 세포 내 루프 및 막 관통 도메인 3을 포함하는 테트라스파닌의 부분 서열,
(B-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(B-3) 제1 T 세포 자극성 사이토카인,
(B-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 그리고
(B-5) 막 관통 도메인 4를 포함하는 테트라스파닌의 부분 서열
을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질, 또는
(B) 그 N 말단측으로부터,
(B-3) 제1 T 세포 자극성 사이토카인,
(B-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(B-5) MFG-E8
을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이다.
국제 공개 제2016/139354호로 개시되어 있는 바와 같이 테트라스파닌은, 그 대형 세포 외 루프(LEL)가 전체적으로 또는 부분적으로 다른 아미노산 서열로 치환되어 있더라도, 막에 발현할 수 있는 것이 보고되어 있다. 따라서, (B-3)의 제1 T 세포 자극성 사이토카인은, 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열을 통하여, 테트라스파닌의 LEL로 바꾸어서 삽입되어 있어도 되고, 테트라스파닌의 LEL 중 또는 그의 부분 서열 중의 임의의 위치에 삽입되어 있어도 된다.
(B-1)의 「막 관통 도메인 1, 소형 세포 외 루프, 막 관통 도메인 2, 소형 세포 내 루프 및 막 관통 도메인 3을 포함하는 테트라스파닌의 부분 서열」은, 통상적으로, 테트라스파닌의 막 관통 도메인 4를 포함하지 않는다. (B-1)의 「막 관통 도메인 1, 소형 세포 외 루프, 막 관통 도메인 2, 소형 세포 내 루프 및 막 관통 도메인 3을 포함하는 테트라스파닌의 부분 서열」은, 대형 세포 외 루프 또는 그의 부분 서열을 포함하고 있어도 된다. (B-1)에 있어서의, 막 관통 도메인 1, 소형 세포 외 루프, 막 관통 도메인 2, 소형 세포 내 루프 및 막 관통 도메인 3의 각 도메인은, 각각 별도의 테트라스파닌 유래의 서열이어도 되고, 모두 동일한 테트라스파닌 유래의 서열이어도 된다. 바람직하게는, (B-1)에 있어서의, 막 관통 도메인 1, 소형 세포 외 루프, 막 관통 도메인 2, 소형 세포 내 루프 및 막 관통 도메인 3의 각 도메인은, 모두 동일한 테트라스파닌 유래의 서열이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, (B-1)에 있어서의, 막 관통 도메인 1, 소형 세포 외 루프, 막 관통 도메인 2, 소형 세포 내 루프 및 막 관통 도메인 3을 포함하는 테트라스파닌의 부분 서열이, 모두, CD9 유래, CD63 유래 또는 CD81 유래의 부분 서열이다. 본 발명의 일 실시 형태에서는, (B-1)의 막 관통 도메인 1, 소형 세포 외 루프, 막 관통 도메인 2, 소형 세포 내 루프 및 막 관통 도메인 3을 포함하는 테트라스파닌의 부분 서열은, 모두 CD63 또는 CD81 유래의 부분 서열(바람직하게는, 서열 번호 57 또는 서열 번호 61 등, 혹은 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)이다.
(B-5)의 「막 관통 도메인 4를 포함하는 테트라스파닌의 부분 서열」은, 통상적으로, 테트라스파닌의 막 관통 도메인 1, 소형 세포 외 루프, 막 관통 도메인 2, 소형 세포 내 루프 및 막 관통 도메인 3을 포함하지 않는다. (B-5)의 「막 관통 도메인 4를 포함하는 테트라스파닌의 부분 서열」은, 대형 세포 외 루프 또는 그의 부분 서열을 포함하고 있어도 된다. (B-5)에 있어서의 막 관통 도메인 4는, (B-1)과는 다른 테트라스파닌 유래의 서열이어도 되고, (B-1)과 동일한 테트라스파닌 유래의 서열이어도 된다. 바람직하게는, (B-5)에 있어서의 막 관통 도메인 4는, (B-1)과 동일한 테트라스파닌 유래의 서열이다. 본 발명의 일 실시 형태에서는, (B-5)에 있어서의, 막 관통 도메인 4를 포함하는 테트라스파닌의 부분 서열이, CD9 유래, CD63 유래 또는 CD81 유래의 부분 서열이다. 본 발명의 일 실시 형태에서는, (B-5)의 막 관통 도메인 4를 포함하는 테트라스파닌의 부분 서열은, CD63 또는 CD81 유래의 부분 서열(바람직하게는, 서열 번호 59 또는 서열 번호 63 등, 혹은 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, (B-1)의 「막 관통 도메인 1, 소형 세포 외 루프, 막 관통 도메인 2, 소형 세포 내 루프 및 막 관통 도메인 3을 포함하는 테트라스파닌의 부분 서열」은, CD63 유래의 부분 서열(바람직하게는, 서열 번호 57 등, 또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)이며, 또한, (B-5)의 「막 관통 도메인 4를 포함하는 테트라스파닌의 부분 서열」이, CD63 유래의 부분 서열(바람직하게는, 서열 번호 59 등, 또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)이다. 본 발명의 일 실시 형태에서는, (B-1)의 「막 관통 도메인 1, 소형 세포 외 루프, 막 관통 도메인 2, 소형 세포 내 루프 및 막 관통 도메인 3을 포함하는 테트라스파닌의 부분 서열」은, CD81 유래의 부분 서열(바람직하게는, 서열 번호 61 등, 또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)이며, 또한, (B-5)의 「막 관통 도메인 4를 포함하는 테트라스파닌의 부분 서열」이, CD81 유래의 부분 서열(바람직하게는, 서열 번호 63 등, 또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)이다.
상기 (B)의 융합 단백질이 테트라스파닌의 부분 서열을 포함하는 융합 단백질이며, 또한 상기 (A) 및 후술하는 경우에 따라서 존재하는 (C) 중 1 이상이 테트라스파닌의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 경우, 상기 (B)의 융합 단백질은, 상기 (A) 및/또는 후술하는 경우에 따라서 존재하는 (C)의 융합 단백질과 별개인 융합 단백질이어도 되고, 상기 (A) 및/또는 후술하는 경우에 따라서 존재하는 (C)의 융합 단백질의 일부를 구성하고 있어도 된다. 상기 (B)의 융합 단백질이 「상기 (A) 및/또는 후술하는 경우에 따라서 존재하는 (C)의 융합 단백질의 일부를 구성」한다란, 예를 들어, (A-5)의 테트라스파닌이 (B)의 융합 단백질을 구성하는 경우, 및/또는 후술하는 경우에 따라서 존재하는 (C-3)의 테트라스파닌이 (B)의 융합 단백질을 구성하는 경우 등을 들 수 있다.
상기 (B-5)의 「MFG-E8」은, 바람직하게는, 서열 번호 49 등, 또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 각 실시 양태의 (B-3)에 있어서의 제1 T 세포 자극성 사이토카인이, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-15, TGF-β이다. 본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 각 실시 양태의 (B-3)에 있어서의 제1 T 세포 자극성 사이토카인이, IL-2(바람직하게는, 서열 번호 25, 또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것), IL-4(바람직하게는, 서열 번호 53, 또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것), 또는 TGF-β(바람직하게는, 서열 번호 73, 또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)이다.
상기 각 실시 양태의 (B-2) 및 (B-4)에 있어서의 「존재하고 있어도 되는 스페이서 서열」은, 존재하는 경우, 독립적으로 선택될 수 있다. (B-2)는 존재하는 경우, 예를 들어, 서열 번호 5, 11, 29, 39, 77 등의 스페이서 서열이어도 된다. (B-4)는 존재하는 경우, 예를 들어, 서열 번호 5, 11, 29, 39, 77 등의 스페이서 서열이어도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (B)는
그 N 말단측으로부터,
(B-1) 서열 번호 57(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌의 부분 서열,
(B-2) 서열 번호 29의 스페이서 서열,
(B-3) 서열 번호 25(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 IL-2인, 제1 T 세포 자극성 사이토카인
(B-4) 서열 번호 29의 스페이서 서열, 그리고
(B-5) 서열 번호 59(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌의 부분 서열
을 포함하는 아미노산 서열인, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (B)는 서열 번호 31(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (B)는
그 N 말단측으로부터,
(B-1) 서열 번호 61(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌의 부분 서열,
(B-2) 서열 번호 29의 스페이서 서열,
(B-3) 서열 번호 53(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 IL-4인, 제1 T 세포 자극성 사이토카인,
(B-4) 서열 번호 29의 스페이서 서열, 그리고
(B-5) 서열 번호 63(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌의 부분 서열
을 포함하는 아미노산 서열인, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (B)는 서열 번호 55(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (B)는
그 N 말단측으로부터,
(B-3) 서열 번호 73(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 TGF-β인, 제1 T 세포 자극성 사이토카인,
(B-4) 서열 번호 29의 스페이서 서열, 및
(B-5) 서열 번호 49(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 MFG-E8
을 포함하는 아미노산 서열인, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (B)는 서열 번호 75(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이다.
제2(또는 그 이상) T 세포 자극성 사이토카인
본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포는, 제1 T 세포 자극성 사이토카인에 더하여, 제2(또는 그 이상) T 세포 자극성 사이토카인을 더 포함하고 있어도 된다. 따라서, 본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포는, 제2 T 세포 자극성 사이토카인을 더 포함한다. 특히, 항원 제시 가능한 MHC 분자가 항원 제시 가능한 MHC 클래스 II 분자인 경우, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포는, 제2 T 세포 자극 사이토카인을 포함하는 것이 바람직하다.
제2(또는 그 이상) T 세포 자극성 사이토카인은, 예를 들어 상기 (B) 중에 삽입되어 있어도 된다(예를 들어, (B-3)의 「제1 T 세포 자극성 사이토카인」의 N 말단측 및/또는 C 말단측에, 필요에 따라서 스페이서 서열 등을 통해, 제2(또는 그 이상) T 세포 자극성 사이토카인이 연결되어 있어도 됨). 혹은, 제2(또는 그 이상) T 세포 자극성 사이토카인은, 본 명세서 중에 기재된 구성 요건 (B)와 마찬가지의 구성을 가짐으로써, 본 명세서 중에 기재된 구성 요건 (B)의 단백질(또는 융합 단백질)과는 별개인 단백질(또는 융합 단백질)로서, 제1 T 세포 자극성 사이토카인과 마찬가지로, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포의 막에 포함되어 있어도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 제2 T 세포 자극성 사이토카인이 IL-2, IL-4, IL-6, IL-12 또는 TGF-β이다. 본 발명의 일 실시 형태에서는, 제2 T 세포 자극성 사이토카인이 TGF-β(바람직하게는 서열 번호 73, 또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 제1 T 세포 자극성 사이토카인이 IL-2 또는 IL-4(바람직하게는 서열 번호 25 또는 서열 번호 53, 혹은 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)이며, 또한 제2 T 세포 자극성 사이토카인이 TGF-β(바람직하게는 서열 번호 73, 또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포이며, 그 막에 이하:
(A) 항원 제시 MHC 분자와, 세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 도메인을 포함하는, 해당 항원을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질 또는 단백질 복합체; 및
(B) 제1 T 세포 자극성 사이토카인과, 세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 도메인을 포함하는, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질;
을 포함하는, 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포이며, 그 막에 이하:
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 단백질 복합체이며,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-3) MHC 클래스 Iα쇄의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질과,
(A-6) β2 마이크로글로불린의 아미노산 서열을 포함하는 단백질
을 포함하는, 단백질 복합체; 그리고
(B) N 말단측으로부터,
(B-3) 제1 T 세포 자극성 사이토카인의 아미노산 서열,
(B-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(B-5) CD8 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질을 포함하는 항원 제시 세포이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포이며, 그 막에 이하:
(A) 항원 제시 MHC 분자와, 테트라스파닌 혹은 그 막 관통 도메인 또는 MFG-E8 혹은 그 도메인을 포함하는, 해당 항원을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질 또는 단백질 복합체; 및
(B) 제1 T 세포 자극성 사이토카인과, 테트라스파닌의 부분 서열을 포함하는, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이며, 해당 테트라스파닌의 부분 서열이 2개의 막 관통 도메인을 적어도 갖고, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인이 해당 2개의 막 관통 도메인의 사이에 배치되어 있는, 융합 단백질, 또는
(B) 제1 T 세포 자극성 사이토카인과, MFG-E8 또는 그 도메인을 포함하는, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질;
을 포함하는, 항원 제시 세포 외 소포이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포이며, 그 막에 이하:
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이며, 그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-3) 단쇄 MHC 분자의 아미노산 서열,
(A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질, 또는
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 단백질 복합체이며,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-3) MHC 클래스 Iα쇄, β2 마이크로글로불린, MHC 클래스 IIα쇄, 또는 MHC 클래스 IIβ쇄의 아미노산 서열
(A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질과,
(A-6) β2 마이크로글로불린, MHC 클래스 Iα쇄, MHC 클래스 IIβ쇄, 또는 MHC 클래스 IIα쇄의 아미노산 서열을 포함하는 단백질
을 포함하는, 단백질 복합체; 그리고
(B) N 말단측으로부터,
(B-1) N 말단측으로부터, 막 관통 도메인 1, 소형 세포 외 루프, 막 관통 도메인 2, 소형 세포 내 루프 및 막 관통 도메인 3을 포함하는 테트라스파닌의 부분 서열,
(B-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(B-3) 제1 T 세포 자극성 사이토카인의 아미노산 서열,
(B-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 그리고
(B-5) 막 관통 도메인 4를 포함하는 테트라스파닌의 부분 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질, 또는
(B) N 말단측으로부터,
(B-3) 제1 T 세포 자극성 사이토카인의 아미노산 서열,
(B-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(B-5) MFG-E8 또는 그 막 결합 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질;
을 포함하는, 항원 제시 세포 외 소포이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포이며, 그 막에 이하:
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이며, 그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-3) 단쇄 MHC 클래스 I 분자의 아미노산 서열,
(A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질
을 포함하는, 항원 제시 세포 외 소포이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포이며, 그 막에 이하:
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 단백질 복합체이며,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-3) MHC 클래스 IIβ쇄의 아미노산 서열,
(A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질과,
(A-6) MHC 클래스 IIα쇄의 아미노산 서열을 포함하는 단백질
을 포함하는, 단백질 복합체;
를 포함하는, 항원 제시 세포 외 소포이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 제1 T 세포 자극성 사이토카인이 IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-15 또는 TGF-β인, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포를 제공한다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 또한 T 세포 공자극 분자를 그 막 외에 제시하는, 본 명세서 중에 기재된 세포 외 소포이다(도 2k의 (2)의 그 모델을 예시한다).
이러한 세포 외 소포는, 이하의 (C)에 규정되는 단백질을 막에 포함함으로써, T 세포 공자극 분자를 막 외에 제시시켜도 된다.
혹은, 단리한 세포 외 소포에 나중에, 그 막 표면에 T 세포 공자극 분자를 부착시켜도 된다. 부착시키는 방법은 특별히 한정되지 않지만, T 세포 공자극 분자에 각각 인지질을 결합하고, 세포 외 소포의 막에 인지질 부분을 도입시킴으로써, 막 표면에 항원 제시 MHC 분자 및 T 세포 자극성 사이토카인을 부착시켜도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포이며, 그 막에 이하:
(C) T 세포 공자극 분자를 포함하는, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 단백질;
을 포함하는, 항원 제시 세포 외 소포이다.
구성 요건 (C)
상기 (C)의 「T 세포 공자극 분자를 포함하는, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 단백질」은, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 단백질인 한, T 세포 공자극 분자 이외에도, 다른 단백질 또는 그 도메인 등을 포함하고 있어도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (C)는 T 세포 공자극 분자와, 세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 도메인을 포함하는, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 융합 단백질이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (C)는 막 관통 도메인을 포함하는 T 세포 공자극 분자를 포함하는, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 단백질이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (C)는 T 세포 공자극 분자와, 테트라스파닌 혹은 그 막 관통 도메인 또는 MFG-E8 혹은 그 도메인을 포함하는, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 융합 단백질이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (C)는
(C) 그 N 말단측으로부터,
(C-1) T 세포 공자극 분자의 아미노산 서열,
(C-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(C-3) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 융합 단백질이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, (C-1)의 T 세포 공자극 분자가 CD80 또는 CD86이다. 본 발명의 일 실시 형태에서는, (C-1)에 있어서의 T 세포 공자극 분자가, CD80(바람직하게는 서열 번호 67 등, 또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)이다.
상기 (C-2)의 「존재하고 있어도 되는 스페이서 서열」은, 존재하는 경우, 예를 들어 서열 번호 5, 11, 29, 39, 77 등의 스페이서 서열이어도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, (C-3)의 테트라스파닌은 CD9, CD63 및 CD81로 이루어지는 군에서 선택된다. 본 발명의 일 실시 형태에서는, (C-3)에 있어서의 테트라스파닌은 CD9(바람직하게는 서열 번호 21 등, 또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (C)는
(C) 그 N 말단측으로부터,
(C-1) 서열 번호 67(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 CD80인, T 세포 공자극 분자의 아미노산 서열, 및
(C-3) 서열 번호 21(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 융합 단백질이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (C)는 서열 번호 69(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 융합 단백질이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포이며, 그 막에 이하:
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이며, 그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 서열 번호 5의 스페이서 서열,
(A-3) 서열 번호 65(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 단쇄 MHC 클래스 I 분자의 아미노산 서열, 및
(A-5) 서열 번호 15(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질; 그리고
(B) N 말단측으로부터,
(B-1) 서열 번호 57(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌의 부분 서열,
(B-2) 서열 번호 29의 스페이서 서열,
(B-3) 서열 번호 25(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 IL-2인, 제1 T 세포 자극성 사이토카인,
(B-4) 서열 번호 29의 스페이서 서열, 및
(B-5) 서열 번호 59(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌의 부분 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질;
을 포함하는, 항원 제시 세포 외 소포이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포이며, 그 막에 이하:
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이며, 그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 서열 번호 5의 스페이서 서열,
(A-3) 서열 번호 65(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 단쇄 MHC 클래스 I 분자의 아미노산 서열, 및
(A-5) 서열 번호 15(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질; 그리고
(B) 서열 번호 31(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질;
을 포함하는, 항원 제시 세포 외 소포이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포이며, 그 막에 이하:
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이며, 그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드,
(A-2) 서열 번호 5의 스페이서 서열,
(A-3) 서열 번호 65(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 단쇄 MHC 클래스 I 분자, 및
(A-5) 서열 번호 15(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌
을 포함하는 아미노산 서열인, 융합 단백질;
(B) N 말단측으로부터,
(B-1) 서열 번호 57(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌의 부분 서열,
(B-2) 서열 번호 29의 스페이서 서열,
(B-3) 서열 번호 25(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 IL-2인, 제1 T 세포 자극성 사이토카인,
(B-4) 서열 번호 29의 스페이서 서열, 및
(B-5) 서열 번호 59(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌의 부분 서열
을 포함하는 아미노산 서열인, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질; 그리고
(C) N 말단측으로부터,
(C-1) 서열 번호 67(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 CD80인, T 세포 공자극 분자, 및
(C-3) 서열 번호 21(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌
을 포함하는 아미노산 서열인, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 융합 단백질;
을 포함하는, 항원 제시 세포 외 소포이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포이며, 그 막에 이하:
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이며, 그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 서열 번호 5의 스페이서 서열,
(A-3) 서열 번호 65(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 단쇄 MHC 클래스 I 분자의 아미노산 서열, 및
(A-5) 서열 번호 15(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질;
(B) 서열 번호 31(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질; 그리고
(C) 서열 번호 69(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 융합 단백질;
을 포함하는, 항원 제시 세포 외 소포이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포이며, 그 막에 이하:
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 단백질 복합체이며,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 서열 번호 39의 스페이서 서열,
(A-3) 서열 번호 37(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 MHC 클래스 IIβ쇄의 아미노산 서열, 및
(A-5) 서열 번호 15(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질과
(A-6) 서열 번호 71(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 MHC 클래스 IIα쇄
를 포함하는, 단백질 복합체;
(B) N 말단측으로부터,
(B-1) 서열 번호 57(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌의 부분 서열,
(B-2) 서열 번호 29의 스페이서 서열,
(B-3) 서열 번호 25(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 IL-2인, 제1 T 세포 자극성 사이토카인의 아미노산 서열
(B-4) 서열 번호 29의 스페이서 서열, 및
(B-5) 서열 번호 59(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌의 부분 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질; 그리고
(C) N 말단측으로부터,
(C-1) 서열 번호 67(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 CD80인, T 세포 공자극 분자의 아미노산 서열, 및
(C-3) 서열 번호 21(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 융합 단백질;
을 포함하는, 항원 제시 세포 외 소포이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포이며, 그 막에 이하:
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 단백질 복합체이며,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 서열 번호 39의 스페이서 서열,
(A-3) 서열 번호 37(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 MHC 클래스 IIβ쇄의 아미노산 서열, 및
(A-5) 서열 번호 15(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질과
(A-6) 서열 번호 71(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 MHC 클래스 IIα쇄
를 포함하는, 단백질 복합체;
(B) 서열 번호 31(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질의 아미노산 서열; 및
(C) 서열 번호 69(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 융합 단백질의 아미노산 서열;
을 포함하는, 항원 제시 세포 외 소포이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포이며, 그 막에 이하:
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 단백질 복합체이며,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 서열 번호 39의 스페이서 서열,
(A-3) 서열 번호 37(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 MHC 클래스 IIβ쇄의 아미노산 서열, 및
(A-5) 서열 번호 15(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질과
(A-6) 서열 번호 71(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 MHC 클래스 IIα쇄
를 포함하는, 단백질 복합체;
(B) N 말단측으로부터,
(B-1) 서열 번호 57(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌의 부분 서열,
(B-2) 서열 번호 29의 스페이서 서열,
(B-3) 서열 번호 25(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 IL-2인, 제1 T 세포 자극성 사이토카인의 아미노산 서열,
(B-4) 서열 번호 29의 스페이서 서열, 및
(B-5) 서열 번호 59(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌의 부분 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질;
(B') N 말단측으로부터,
(B-3) 서열 번호 73(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 TGF-β인, 제2 T 세포 자극성 사이토카인의 아미노산 서열,
(B-4) 서열 번호 29의 스페이서 서열, 및
(B-5) 서열 번호 49(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 MFG-E8 또는 그 막 결합 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 제2 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질; 그리고
(C) N 말단측으로부터,
(C-1) 서열 번호 67(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 CD80인, T 세포 공자극 분자의 아미노산 서열, 및
(C-3) 서열 번호 21(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 융합 단백질;
을 포함하는, 항원 제시 세포 외 소포이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포이며, 그 막에 이하:
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 단백질 복합체이며,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 서열 번호 39의 스페이서 서열,
(A-3) 서열 번호 37(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 MHC 클래스 IIβ쇄의 아미노산 서열, 및
(A-5) 서열 번호 15(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌 또는 그 막 결합 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질과
(A-6) 서열 번호 71(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 MHC 클래스 IIα쇄
를 포함하는, 단백질 복합체;
(B) 서열 번호 31(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질;
(B') 서열 번호 75(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의, 해당 제2 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질; 그리고
(C) 서열 번호 69(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 융합 단백질;
을 포함하는, 항원 제시 세포 외 소포이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포이며, 그 막에 이하:
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 단백질 복합체이며,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 서열 번호 39의 스페이서 서열,
(A-3) 서열 번호 37(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 MHC 클래스 IIβ쇄의 아미노산 서열, 및
(A-5) 서열 번호 15(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질과
(A-6) 서열 번호 71(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 MHC 클래스 IIα쇄
를 포함하는, 단백질 복합체;
(B) N 말단측으로부터,
(B-1) 서열 번호 61(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌의 부분 서열,
(B-2) 서열 번호 29의 스페이서 서열,
(B-3) 서열 번호 53(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 IL-4인, 제1 T 세포 자극성 사이토카인의 아미노산 서열,
(B-4) 서열 번호 29의 스페이서 서열, 및
(B-5) 서열 번호 63(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌의 부분 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질; 그리고
(C) N 말단측으로부터,
(C-1) 서열 번호 67(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 CD80인, T 세포 공자극 분자의 아미노산 서열, 및
(C-3) 서열 번호 21(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 융합 단백질;
을 포함하는, 항원 제시 세포 외 소포이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포이며, 그 막에 이하:
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 단백질 복합체이며,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 서열 번호 39의 스페이서 서열,
(A-3) 서열 번호 37(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 MHC 클래스 IIβ쇄의 아미노산 서열, 및
(A-5) 서열 번호 15(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질과
(A-6) 서열 번호 71(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 MHC 클래스 IIα쇄
를 포함하는, 단백질 복합체;
(B) 서열 번호 55(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질; 및
(C) 서열 번호 69(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 융합 단백질;
을 포함하는, 항원 제시 세포 외 소포이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (A), (B) 및 (C)에 대해서, (A)와 (B)가 융합되어, 1분자로 되어 있어도 되고, (B)와 (C)가 융합되어, 1분자로 되어 있어도 되고, (A), (B) 및 (C)가 융합되어, 1분자로 되어 있어도 된다. 이러한 융합 분자는, (A), (B) 및 (C)간에 스페이서 서열을 포함하는 또는 포함하지 않는 형으로 1개의 단백질 분자로서 번역되어 있어도 되고, (A), (B) 및 (C)의 단백질이 화학적으로 가교되는 것(예를 들어 시스테인 잔기간의 디술피드 결합)에 의해 융합하여 1분자로 되어 있어도 된다.
혹은, 상기 (A), (B) 및 (C)는, 그 단백질이 세포 또는 세포 외 소포에 국재하기 위한 요소, 즉, 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인」 또는 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 도메인」의 부분을 공유함으로써, 기능적으로 융합되어 있어도 된다.
예를 들어 본 발명의 일 실시 형태에 있어서,
(A)와 (B)에서 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인」 또는 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 도메인」 부분을 공유하는 형으로 융합된,
(1) 항원 제시 MHC 분자;
(2) 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인; 및
(3) 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인」 또는 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 도메인」;을 포함하는 융합 단백질 (D)를 포함하고 있어도 되고;
(A)와 (C)에서 「세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인」 또는 「세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 도메인」 부분을 공유하는 형으로 융합된,
(1) 항원 제시 MHC 분자;
(2) T 세포 공자극 분자; 및
(3) 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인」 또는 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 도메인」;을 포함하는 융합 단백질 (F)를 포함하고 있어도 되고;
(B)와 (C)에서 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인」 또는 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 도메인」 부분을 공유하는 형으로 융합된,
(1) 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인;
(2) T 세포 공자극 분자; 및
(3) 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인」 또는 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 도메인」을 포함하는 융합 단백질 (G)를 포함하고 있어도 되고;
혹은
(A) 내지 (C)에서 「세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인」 또는 「세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 도메인」 부분을 공유하는 형으로 융합된,
(1) 항원 제시 MHC 분자;
(2) 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인;
(3) T 세포 공자극 분자; 및
(4) 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인」 또는 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 도메인」을 포함하는 융합 단백질 (E)를 포함하고 있어도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에 있어서, 구성 요건 (A)의 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질」 대신에, 구성 요건 (B)의 「제1 T 세포 자극성 사이토카인을 포함하는, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 단백질」을 사용하여, 구성 요건 (A)와 구성 요건 (B)의 기능을 구비한 융합 단백질 (D)를 포함하는 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포 세포이면 된다.
이러한 구성 요건 (A)와 구성 요건 (B)의 기능을 구비한 융합 단백질 (D)는,
(D) 항원 제시 MHC 분자와 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인을 포함하고, 해당 항원과 해당 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이어도 된다.
상기 융합 단백질은, 상기 항원 제시 MHC 분자와, 상기 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인과, 세포 또는 세포 외 소포의 막에 국재하는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인 혹은 세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 막 결합 도메인을 포함해도 된다.
구성 요건 (A)와 구성 요건 (B)의 기능을 구비한 융합 단백질 (D)에 있어서, 상기 세포의 막에 국재하는 것이 가능한 막 단백질 또는 세포막에 결합되는 것이 가능한 단백질은, CD8이어도 되고, 막 관통 도메인을 포함하는 MHC 분자가 그 기능을 담당해도 된다.
상기 융합 단백질은, 그 N 말단측으로부터,
(D-1) MHC 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(D-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(D-3) 단쇄 MHC 분자의 아미노산 서열,
(D-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(D-5) CD8 또는 그 막 관통 도메인과, 상기 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인을 포함하는 융합 펩티드를,
이 순번으로 코딩하는 아미노산 서열을 포함해도 된다.
상기 융합 단백질은, 그 N 말단측으로부터,
(D-1) MHC 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(D-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(D-3) 막 관통 도메인을 포함하는 단쇄 MHC 분자의 아미노산 서열,
(D-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(D-5) 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인을,
이 순번으로 코딩하는 아미노산 서열을 포함해도 된다.
구성 요건 (A)와 구성 요건 (B)의 기능을 구비한 융합 단백질 (D)에 있어서, 상기 세포 외 소포의 막에 국재하는 것이 가능한 막 단백질 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질은, 테트라스파닌 또는 MFG-E8이어도 된다.
상기 융합 단백질은, 그 N 말단측으로부터,
(D-1) MHC 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(D-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(D-3) 단쇄 MHC 분자의 아미노산 서열,
(D-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(D-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인 혹은 MFG-E8 또는 그 막 관통 도메인과, 상기 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인을 포함하는 융합 펩티드를 이 순번으로 코딩하는 아미노산 서열을 포함해도 된다.
상기 융합 단백질은, 그 N 말단측으로부터,
(D-1) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인 혹은 MFG-E8 또는 그 막 관통 도메인과, 상기 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인을 포함하는 융합 펩티드
(D-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(D-3) 단쇄 MHC 분자의 아미노산 서열,
(D-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(D-5) MHC 분자 구속성 항원 펩티드를,
이 순으로 코딩하는 아미노산 서열을 포함해도 된다.
여기서, 상기 융합 펩티드는, 그 N 말단측으로부터,
(1) 막 관통 도메인 1, 소형 세포 외 루프, 막 관통 도메인 2, 소형 세포 내 루프 및 막 관통 도메인 3을 포함하는 테트라스파닌의 부분 서열,
(2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(3) 상기 적어도 1개의 T 세포 자극성 사이토카인의 아미노산 서열,
(4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 그리고
(5) 막 관통 도메인 4를 포함하는 테트라스파닌의 부분 서열
을 이 순번으로 코딩하는 아미노산 서열을 포함해도 된다.
상기 융합 펩티드는, 그 N 말단측으로부터,
(1) 상기 적어도 1의 T 세포 자극성 사이토카인의 아미노산 서열,
(2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(3) MFG-E8 또는 그 막 결합 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 코딩하는 아미노산 서열을 포함해도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에 있어서, MHC 분자 구속성 항원 펩티드가 MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드이며, 상기 단쇄 MHC 분자가 MHC 클래스 Iα쇄의 세포 외 영역을 포함해도 되고, 상기 MHC 분자 구속성 항원 펩티드가 MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드이며, 상기 단쇄 MHC 분자가 MHC 클래스 IIα쇄의 세포 외 도메인 및/또는 MHC 클래스 IIβ쇄의 세포 외 도메인을 포함해도 된다.
구성 요건 (A)와 구성 요건 (B)의 기능을 구비한 융합 단백질 (D)를 포함하는 양태에 있어서;
(C) 적어도 1개의 T 세포 공자극 분자를 포함하는, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 단백질을 추가로 그 막에 포함해도 되고;
상기 T 세포와 상호 작용 가능한 단백질이, 상기 적어도 1개의 T 세포 공자극 분자와, 세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인 혹은 세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 도메인을 포함해도 되고;
상기 T 세포와 상호 작용 가능한 단백질이, 상기 적어도 1개의 T 세포 공자극 분자와, 테트라스파닌 혹은 그 막 관통 도메인 또는 MFG-E8 혹은 그 도메인을 포함해도 된다.
상기 T 세포와 상호 작용 가능한 단백질이, 막 관통 도메인을 포함하는 1개의 T 세포 공자극 분자를 포함해도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 세포 외 소포가 엑소솜이다.
본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포는, 그 막 내 또는 막 중에, 치료상 유익할 수 있는 물질(예를 들어, 저분자 화합물, 핵산 등)이 포함되어 있어도 되고, 결합되어 있어도 된다. 세포 또는 세포 외 소포의 막 내에 해당 물질을 봉입하는 방법은, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 해당 물질과 본 명세서 중에 기재된 세포 또는 세포 외 소포를 적합한 용매 중에서 혼합하는 방법 등을 들 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포는 임의의 단백 제제를 포함해도 된다. 단백 제제로서는, 특별히 한정되지 않지만, 에리트로포에틴 등의 천연에도 존재할 수 있는 단백질이어도, 이뮤노글로불린-CTLA4 융합 단백과 같이 천연에는 존재하지 않는 합성 단백질이어도 되고, 모노클로날 항체 또는 그 활성 단편이어도 된다. 이들 단백 제제는, 세포 또는 세포 외 소포의 막에 국재하는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인 혹은 세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 막 결합 도메인과의 융합 단백질로서 항원 제시 세포 외 소포의 표면에 국재시켜도 된다. 이러한 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포는, 융합 단백질을 발현시키기 위한 벡터를; 1) 임의의 세포에 형질 감염함으로써 항원 제시 세포를 제작할 수 있다; 2) 세포 외 소포를 산생하는 세포에 형질 감염함으로써 항원 제시 세포 외 소포를 분비시킬 수 있다.
본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포의 막에 포함되는 각 융합 단백질 또는 단백질 복합체 혹은 단백 제제는, 1개 또는 복수의 검출 가능한 표지를 포함하고 있어도 된다. 예를 들어, 융합 단백질 또는 단백질 복합체 혹은 단백 제제는, 종래의 방법으로, 특정한 리포터 분자, 발형광단, 방사성 재료 또는 효소(예를 들어, 퍼옥시다아제, 포스파타아제) 등으로 표지되어 있어도 된다. 이들은, 예를 들어 융합 단백질 또는 단백질 복합체 혹은 단백 제제의 구성 요소로서, 해당 융합 단백질 또는 단백질 복합체 혹은 단백 제제의 N 말단측 또는 C 말단측에 연결되어 있어도 된다.
폴리뉴클레오티드
본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포의 막에 포함되는 (A) 및 (B), 그리고 경우에 따라서 존재하는 (C)에 있어서의 각 융합 단백질 또는 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에서 정의되는 (A) 내지 (G)에 있어서의 각 융합 단백질 또는 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 일 실시 형태에서는,
(a) 항원 제시 MHC 분자를 포함하고, 해당 항원 제시 MHC 분자를 세포 또는 세포 외 소포의 막 외에 제시 가능한 융합 단백질 (A)를 코딩하는 서열;
(b) 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛을 포함하는, 해당 T 세포 자극성 사이토카인을 세포 또는 세포 외 소포의 막 외에 제시 가능한 융합 단백질 (B)를 코딩하는 서열;
(c) T 세포 공자극 분자를 포함하는, 해당 T 세포 공자극 분자를 세포 또는 세포 외 소포의 막 외에 제시 가능한 융합 단백질 (C)를 코딩하는 서열;
(d) 항원 제시 MHC 분자와, 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛을 포함하고, 해당 항원과 해당 T 세포 자극성 사이토카인을 세포 또는 세포 외 소포의 막 외에 제시 가능한 융합 단백질 (D)를 코딩하는 서열; 및
(e) 항원 제시 MHC 분자와, 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛 및 T 세포 공자극 분자를 포함하고, 해당 항원과 해당 T 세포 자극성 사이토카인과 해당 T 세포 공자극 분자를 세포 또는 세포 외 소포의 막 외에 제시 가능한 융합 단백질 (E)를 코딩하는 서열;
로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드
를 제공한다.
상기 서열은 (a) 내지 (e)는 본원 명세서에 구체적 기재된 서열 및 상동성이 높은 서열(바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 상동성)을 포함하지만, 특별히 한정되지 않는다. 동등한 기능을 갖는 것이면 파라로그(유전자 중복에 의해 발생한 유전자 서열)나 오르토로그(다른 생물에 존재하는 상동의 기능을 갖는 유전자군)여도 되고, 서열 정보의 개변(불가, 결실, 치환 등)된 서열도 포함하는 것으로 한다.
본 명세서 중에서 사용되는 「폴리뉴클레오티드」는, 단일쇄 또는 이중쇄 DNA 분자, RNA 분자 또는 DNA-RNA 키메라 분자 등을 의미한다. 폴리뉴클레오티드에는, 게놈 DNA, cDNA, hnRNA, mRNA 등, 및 이들 모든 천연에 존재하거나 또는 인공적으로 수식된 유도체 등이 포함된다. 폴리뉴클레오티드는 쇄상이어도, 환상이어도 된다.
상술한 (A) 내지 (G)에 있어서의 각 융합 단백질 또는 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 당업자라면 상기 융합 단백질 또는 단백질 복합체의 아미노산 서열을 참고로 적절히 결정할 수 있다. 또한, (A) 내지 (G)에 있어서의 각 융합 단백질 또는 단백질 복합체의 아미노산 서열은, 각 융합 단백질 또는 단백질 복합체에 있어서의 각 구성 요소(예를 들어, (A)의 경우라면, (A-1) 내지 (A-5) 및 경우에 따라서 (A-6))의 아미노산 서열을 참고로 적절히 결정할 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 결정할 때에 사용되는 코돈의 종류는, 임의의 것을 선택할 수 있다. 예를 들어, 해당 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 사용하여 형질 전환시키는 세포의 코돈 빈도 등을 고려하여, 폴리뉴클레오티드를 결정해도 된다.
상술한 (A) 내지 (G)에 있어서의 각 융합 단백질 또는 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 N 말단측에는, 필요에 따라서 시그널 펩티드(시그널 시퀀스)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 부가해도 된다.
시그널 펩티드의 아미노산 서열은 임의의 것을 사용할 수 있고, 예를 들어 발현시키고자 하는 융합 단백질의 아미노산 서열 등을 고려하여 결정해도 된다. 시그널 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들어 β2 마이크로글로불린의 시그널 펩티드(예를 들어, 서열 번호 1)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 서열 번호 2), MHC 클래스 Iα쇄의 시그널 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, MHC 클래스 IIα쇄의 시그널 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, MHC 클래스 IIβ쇄의 시그널 펩티드(예를 들어, 서열 번호 33)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 서열 번호 34) 등을 들 수 있다.
상술한 (A) 내지 (G)에 있어서의 각 융합 단백질 또는 단백질 복합체의 각 구성 요소(예를 들어, (A)의 경우라면, (A-1) 내지 (A-5) 및 존재하는 경우(A-6)), 및 시그널 펩티드 등의 아미노산 서열, 그리고 이들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 정보는, 예를 들어 공지된 문헌이나 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/) 등의 데이터베이스를 검색하여 적절히 입수해도 된다. 또한, 테트라스파닌의 부분 서열(예를 들어, (C-1), (C-5)에 있어서의 부분 서열)에 있어서의 아미노산 서열 및 이것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 국제 공개 제2016/139354호를 참고로 해도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, (a)는 이하:
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이며, 그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-3) 막 관통 도메인을 포함하는 단쇄 MHC 분자의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함해도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, (a)는 이하:
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 단백질 복합체이며,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-3) MHC 클래스 Iα쇄, β2 마이크로글로불린이 MHC 클래스 Iα쇄의 융합 단백질, MHC 클래스 IIα쇄, 또는 MHC 클래스 IIβ쇄를 포함하는 아미노산 서열을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질과,
(A-6) β2 마이크로글로불린, MHC 클래스 Iα쇄, MHC 클래스 IIβ쇄, 또는 MHC 클래스 IIα쇄의 아미노산 서열을 포함하는 단백질
을 포함하는, 단백질 복합체를 코딩하는 서열을 포함해도 되고; 여기에서 번역되었을 때, (A-3)과 (A-6)이 쌍으로 되어 MHC 클래스 I 분자 또는 MHC 클래스 II 분자를 형성하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명의 일 실시 형태에서는, (a)는 상기 (A-1) 내지 (A-3)을 포함하는 아미노산 서열과 (A-6)의 서열이
이하에 2A 펩티드 서열:
T2A: (GSG)EGRGSLLTCGDVEENPGP(서열 번호 211)
P2A: (GSG)ATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열 번호 212)
E2A(GSG)QCTNYALLKLAGDVESNPGP(서열 번호 213)
F2A(GSG)VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(서열 번호 214)
중 적어도 1개를 통해, 1개의 융합 단백질을 코딩하는 서열로 된 서열을 포함해도 된다. 2A 펩티드 서열은 리보솜 스킵핑을 일으키고, 융합 단백질을 코딩하는 서열이 실제로 번역되었을 경우, 독립된 (A-1) 내지 (A-3)을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질과, 독립된 (A-6)의 서열을 포함하는 단백질이 번역되고, 번역된 2개의 단백질이 MHC 클래스 I 분자 또는 MHC 클래스 II 분자를 형성하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, (a)는
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이며, 그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-3) 막 관통 도메인을 포함하는 단쇄 MHC 클래스 I 분자의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함해도 되고,
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이며, 그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-3) 막 관통 도메인을 포함하는 단쇄 MHC 클래스 II 분자의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함해도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (a)는
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 단백질 복합체이며,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-3) β2 마이크로글로불린과 MHC 클래스 Iα쇄의 융합 단백질의 아미노산 서열,
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함해도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (a)는
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 단백질 복합체이며,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-3) MHC 클래스 Iα쇄의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질과,
(A-6) β2 마이크로글로불린의 아미노산 서열을 포함하는 단백질
을 포함하는, 단백질 복합체를 코딩하는 서열을 포함해도 되고, (A-1) 내지 (A-3)을 포함하는 아미노산 서열과 (A-6)의 아미노산 서열이 적어도 1개의 2A 펩티드 서열을 통해, 1개의 융합 단백질을 코딩하는 서열로 된 서열을 포함해도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (a)는
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 단백질 복합체이며,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-3) MHC 클래스 IIβ쇄의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질과,
(A-6) MHC 클래스 IIα쇄의 아미노산 서열을 포함하는 단백질
을 포함하는, 단백질 복합체를 코딩하는 서열을 포함해도 되고, (A-1) 내지 (A-3)을 포함하는 아미노산 서열과 (A-6)의 아미노산 서열이 적어도 1개의 2A 펩티드 서열을 통해, 1개의 융합 단백질을 코딩하는 서열로 된 서열을 포함해도 된다.
또한, 본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (a)는
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 단백질 복합체이며,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-3) MHC 클래스 IIα쇄의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질과,
(A-6) MHC 클래스 IIβ쇄의 아미노산 서열을 포함하는 단백질
을 포함하는, 단백질 복합체를 코딩하는 서열을 포함해도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (A)는 항원 제시 MHC 분자와, 테트라스파닌 혹은 그 막 관통 도메인 또는 MFG-E8 혹은 그 도메인을 포함하는, 해당 항원을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질 또는 단백질 복합체이다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (a)는
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이며, 그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-3) 단쇄 MHC 분자의 아미노산 서열,
(A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함해도 되고, 또는
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 단백질 복합체이며,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-3) MHC 클래스 Iα쇄, β2 마이크로글로불린, MHC 클래스 IIα쇄, 또는 MHC 클래스 IIβ쇄의 아미노산 서열
(A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질과,
(A-6) β2 마이크로글로불린, MHC 클래스 Iα쇄, MHC 클래스 IIβ쇄, 또는 MHC 클래스 IIα쇄의 아미노산 서열을 포함하는 단백질
을 포함하는, 단백질 복합체를 코딩하는 서열을 포함해도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (a)는
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이며, 그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-3) 단쇄 MHC 클래스 I 분자의 아미노산 서열,
(A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함해도 된다.
또한, 본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (a)는
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이며, 그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-3) 단쇄 MHC 클래스 II 분자,의 아미노산 서열
(A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함해도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (a)는 이하:
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이며, 그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-3) MHC 클래스 Iα쇄, β2 마이크로글로불린, MHC 클래스 IIα쇄, 또는 MHC 클래스 IIβ쇄의 아미노산 서열
(A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함해도 되고;
또한
(A-6) β2 마이크로글로불린, MHC 클래스 Iα쇄, MHC 클래스 IIβ쇄, 또는 MHC 클래스 IIα쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함해도 된다.
여기서 번역되었을 때, (A-3)과 (A-6)이 쌍으로 되어 MHC 클래스 I 분자 또는 MHC 클래스 II 분자를 형성하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (a)는 상기 (A-1) 내지 (A-5)를 포함하는 아미노산 서열과 (A-6)의 서열이
이하에 2A 펩티드 서열:
T2A: (GSG)EGRGSLLTCGDVEENPGP(서열 번호 211)
P2A: (GSG)ATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열 번호 212)
E2A(GSG)QCTNYALLKLAGDVESNPGP(서열 번호 213)
F2A(GSG)VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(서열 번호 214)
중 적어도 1개를 통해, 1개의 융합 단백질을 코딩하는 서열로 된 서열을 포함해도 된다. 2A 펩티드 서열은 리보솜 스킵핑을 일으키고, 융합 단백질을 코딩하는 서열이 실제로 번역되었을 경우, 독립된 (A-1) 내지 (A-5)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질과, 독립된 (A-6)의 서열을 포함하는 단백질이 번역되고, 번역된 2개의 단백질이 MHC 클래스 I 분자 또는 MHC 클래스 II 분자를 형성하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (a)는 폴리뉴클레오티드이며, 이하:
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이며, 그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-3) MHC 클래스 Iα쇄, β2 마이크로글로불린, MHC 클래스 IIα쇄, 또는 MHC 클래스 IIβ쇄의 아미노산 서열,
(A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 결합 도메인의 아미노산 서열
(A-5.5) 2A 펩티드 서열
(A-6) β2 마이크로글로불린, MHC 클래스 Iα쇄, MHC 클래스 IIβ쇄, 또는 MHC 클래스 IIα쇄의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함해도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, (a)는 폴리뉴클레오티드이며, 이하:
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이며, 그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 분자 구속성 항원 펩티드,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-3) MHC 클래스 IIβ쇄의 아미노산 서열,
(A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
(A-5.5) 2A 펩티드 서열 및
(A-6) MHC 클래스 IIα쇄의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함해도 된다. 이러한 양태로서 실시예의 HLADR-1sc-TPI1-hCD81(아미노산 서열: 서열 번호 165; 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 166)이 예시된다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (a)는
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 단백질 복합체이며,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-3) β2 마이크로글로불린의 아미노산 서열,
(A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질과,
(A-6) MHC 클래스 Iα쇄의 아미노산 서열을 포함하는 단백질
을 포함하는, 단백질 복합체를 코딩하는 서열을 포함해도 된다.
또한, 본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (a)는
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 단백질 복합체이며,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-3) MHC 클래스 Iα쇄의 아미노산 서열,
(A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질과,
(A-6) β2 마이크로글로불린의 아미노산 서열을 포함하는 단백질
을 포함하는, 단백질 복합체를 코딩하는 서열을 포함해도 된다.
또한, 본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (a)는
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 단백질 복합체이며,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-3) MHC 클래스 IIβ쇄의 아미노산 서열,
(A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질과,
(A-6) MHC 클래스 IIα쇄의 아미노산 서열을 포함하는 단백질
을 포함하는, 단백질 복합체를 코딩하는 서열을 포함해도 된다.
또한, 본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (a)는
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 단백질 복합체이며,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(A-3) MHC 클래스 IIα쇄의 아미노산 서열,
(A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질과,
(A-6) MHC 클래스 IIβ쇄의 아미노산 서열을 포함하는 단백질
을 포함하는, 단백질 복합체를 코딩하는 서열을 포함해도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, (a)는 이하:
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이며, 그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 서열 번호 5의 스페이서 서열,
(A-3) 서열 번호 65(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 단쇄 MHC 클래스 I 분자의 아미노산 서열, 및
(A-5) 서열 번호 15(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질을 코딩하는 서열, 혹은
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 단백질 복합체를 구성하는 융합 단백질이며,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 서열 번호 39의 스페이서 서열,
(A-3) 서열 번호 37(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 MHC 클래스 IIβ쇄의 아미노산 서열, 및
(A-5) 서열 번호 15(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함해도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, (a)는 이하:
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이며, 그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 서열 번호 5의 스페이서 서열,
(A-3) 서열 번호 65(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 단쇄 MHC 클래스 I 분자의 아미노산 서열, 및
(A-5) 서열 번호 15(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질을 코딩하는 서열, 혹은
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 단백질 복합체를 구성하는 융합 단백질이며,
그 N 말단측으로부터,
(A-1) MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(A-2) 서열 번호 39의 스페이서 서열,
(A-3) 서열 번호 37(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 MHC 클래스 IIβ쇄의 아미노산 서열, 및
(A-5) 서열 번호 15(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함해도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, (a)는 이하:
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이며, 5'단으로부터
(A-1) MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드를 코딩하는 서열,
(A-2) 서열 번호 6의 스페이서 서열,
(A-3) 서열 번호 66(또는 이에 대해 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 단쇄 MHC 클래스 I 분자를 코딩하는 서열, 및
(A-5) 서열 번호 16(또는 이에 대해 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인을 코딩하는 서열
을 이 순번으로 포함하는 서열, 혹은
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 단백질 복합체를 구성하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이며, 5'단으로부터
(A-1) MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드,
(A-2) 서열 번호 40의 스페이서 서열,
(A-3) 서열 번호 38(또는 이에 대해 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 MHC 클래스 IIβ쇄를 코딩하는 서열, 및
(A-5) 서열 번호 16(또는 이에 대해 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인을 코딩하는 서열
을 이 순번으로 포함하는 서열을 포함해도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (a)는 이하:
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이며, 5'단으로부터
(A-1) MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드,
(A-2) 서열 번호 6의 스페이서 서열,
(A-3) 서열 번호 66(또는 이에 대해 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 단쇄 MHC 클래스 I 분자를 코딩하는 서열, 및
(A-5) 서열 번호 16(또는 이에 대해 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인을 코딩하는 서열
을 이 순번으로 포함하는 서열, 혹은
(A) 항원 펩티드를 막 외에 제시 가능한 단백질 복합체를 구성하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이며,
(A-1) MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드,
(A-2) 서열 번호 40의 스페이서 서열,
(A-3) 서열 번호 38(또는 이에 대해 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 MHC 클래스 IIβ쇄를 코딩하는 서열, 및
(A-5) 서열 번호 16(또는 이에 대해 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인을 코딩하는 서열
을 이 순번으로 포함하는 서열 포함해도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (b)는 (B) 제1 T 세포 자극성 사이토카인과, CD8 또는 그 막 관통 도메인을 포함하는, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함해도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (b)는
(B) N 말단측으로부터,
(B-3) 제1 T 세포 자극성 사이토카인의 아미노산 서열,
(B-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(B-5) CD8 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함해도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (b)는
(B) 제1 T 세포 자극성 사이토카인과, 테트라스파닌의 부분 서열을 포함하는, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이며, 해당 테트라스파닌의 부분 서열이 2개의 막 관통 도메인을 적어도 갖고, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인이 해당 2개의 막 관통 도메인의 사이에 배치되어 있는, 융합 단백질을 코딩하는 서열, 또는
(B) 제1 T 세포 자극성 사이토카인과, MFG-E8 또는 그 도메인을 포함하는, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함해도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (b)는
(B) N 말단측으로부터,
(B-1) N 말단측으로부터, 막 관통 도메인 1, 소형 세포 외 루프, 막 관통 도메인 2, 소형 세포 내 루프 및 막 관통 도메인 3을 포함하는 테트라스파닌의 부분 서열,
(B-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(B-3) 제1 T 세포 자극성 사이토카인의 아미노산 서열,
(B-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 그리고
(B-5) 막 관통 도메인 4를 포함하는 테트라스파닌의 부분 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질을 코딩하는 서열, 또는
(B) N 말단측으로부터,
(B-3) 제1 T 세포 자극성 사이토카인의 아미노산 서열,
(B-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(B-5) MFG-E8 또는 그 막 결합 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함해도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (b)는
(B) N 말단측으로부터,
(B-1) 서열 번호 57(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌의 부분 서열,
(B-2) 서열 번호 29의 스페이서 서열,
(B-3) 서열 번호 25(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 IL-2인, 제1 T 세포 자극성 사이토카인의 아미노산 서열,
(B-4) 서열 번호 29의 스페이서 서열, 및
(B-5) 서열 번호 59(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌의 부분 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질을 코딩하는 서열;
(B) N 말단측으로부터,
(B-1) 서열 번호 61(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌의 부분 서열,
(B-2) 서열 번호 29의 스페이서 서열,
(B-3) 서열 번호 53(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 IL-4인, 제1 T 세포 자극성 사이토카인의 아미노산 서열,
(B-4) 서열 번호 29의 스페이서 서열, 및
(B-5) 서열 번호 63(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌의 부분 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질을 코딩하는 서열, 혹은
(B) N 말단측으로부터,
(B-3) 서열 번호 73(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 TGF-β인, 제2 T 세포 자극성 사이토카인의 아미노산 서열,
(B-4) 서열 번호 29의 스페이서 서열, 및
(B-5) 서열 번호 49(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 MFG-E8 또는 그 막 결합 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 제2(또는 제1) T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질을 코딩하는 서열
을 포함해도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (b)는
(B) 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이며, 5'단으로부터
(B-1) 서열 번호 58(또는 이에 대해 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌의 부분 서열,
(B-2) 서열 번호 30의 스페이서 서열,
(B-3) 서열 번호 26(또는 이에 대해 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 IL-2인, 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 코딩하는 서열,
(B-4) 서열 번호 30의 스페이서 서열, 및
(B-5) 서열 번호 60(또는 이에 대해 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌의 부분 서열
을 이 순번으로 포함하는 서열;
(B) 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이며, 5'단으로부터
(B-1) 서열 번호 62(또는 이에 대해 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌의 부분 서열,
(B-2) 서열 번호 30의 스페이서 서열,
(B-3) 서열 번호 54(또는 이에 대해 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 IL-4인, 제1 T 세포 자극성 사이토카인
(B-4) 서열 번호 30의 스페이서 서열, 및
(B-5) 서열 번호 64(또는 이에 대해 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌의 부분 서열;
을 이 순번으로 포함하는 서열; 혹은
(B) 제2(또는 제1)의 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이며, 5'단으로부터
(B-3) 서열 번호 74(또는 이에 대해 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 TGF-β인, 제2(또는 제1)의 T 세포 자극성 사이토카인,
(B-4) 서열 번호 30의 스페이서 서열, 및
(B-5) 서열 번호 50(또는 이에 대해 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 MFG-E8 또는 그 막 결합 도메인을 코딩하는 서열
을 이 순번으로 포함하는 서열;
(B) 서열 번호 31, 75 혹은 55(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의, 해당 제1(또는 제2) T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질을 코딩하는 서열;
또는
(B) 서열 번호 32, 76 혹은 56(또는 이에 대해 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의, 해당 제1(또는 제2) T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질을 코딩하는 서열을
포함해도 된다.
T 세포 자극성 사이토카인이 헤테로나서브유닛의 조합에 의해, 기능하는 경우에는, 상기 (b)에 있어서, 한쪽 서브유닛의 서열을 상기 (B)에 있어서의 T 세포 자극성 사이토카인의 서열로서 사용하고, 나머지 서브유닛 서열을 별도 (b)에 포함하는 것이 바람직하고, 그 서열이 번역되었을 경우, (B)의 융합 단백질과 나머지 서브유닛에 의해 활성이 있는 T 세포 자극성 사이토카인이 막 외에 형성되는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시 형태에 있어서, T 세포 자극성 사이토카인이 헤테로나서브유닛의 조합에 의해, 기능하는 경우, (b)는 (B)의 융합 단백질과 나머지 서브유닛이 융합된 단백질로서 번역되는 서열을 포함해도 된다.
이러한 (B)의 융합 단백질과 나머지 서브유닛은 스페이서 서열을 통해 융합해도 되고, 2A 펩티드 서열을 통해 융합되어 있어도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에 있어서, (b)는
(B) N 말단측으로부터,
(B-6) IL-12β 서브 니트의 아미노산 서열
(B-7) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열
(B-3) IL-12α 서브 니트의 아미노산 서열,
(B-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(B-5) CD8 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, IL-12를 세포의 막 외에 제시 가능한 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함해도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에 있어서, (b)는
(B) N 말단측으로부터,
(B-6) IL-12β 서브 니트의 아미노산 서열
(B-7) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열
(B-3) IL-12α 서브 니트의 아미노산 서열,
(B-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(B-5) MFG-E8 또는 그 막 결합 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, IL-12를 세포 외 소포의 막 외에 제시 가능한 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함해도 된다.
이러한 양태는 hIL-12sc-MFGe8(아미노산 서열: 서열 번호 177; 폴리뉴클레오티드 서열 178)에 예시된다.
본 발명의 일 실시 형태에 있어서, (c)는
(c) 막 관통 도메인을 포함하는 T 세포 공자극 분자; 또는
T 세포 공자극 분자와, 테트라스파닌 혹은 그 막 관통 도메인 또는 MFG-E8 혹은 그 도메인을 포함하는 융합 단백질
을 코딩하는 서열을 포함해도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에 있어서, (c)는
(C) N 말단측으로부터,
(C-1) T 세포 공자극 분자의 아미노산 서열,
(C-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(C-3) 테트라스파닌 또는 그 막 결합 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함해도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에 있어서, (c)는
(C) N 말단측으로부터,
(C-1) 서열 번호 67(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 CD80인, T 세포 공자극 분자의 아미노산 서열, 및
(C-3) 서열 번호 21(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함해도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에 있어서, (c)는
(C) 서열 번호 23(또는 이에 대해 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함해도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에 있어서, (c)는
(C) 5'단으로부터,
(C-1) 서열 번호 68(또는 이에 대해 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 CD80인, T 세포 공자극 분자를 코딩하는 서열, 및
(C-3) 서열 번호 22(또는 이에 대해 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의 테트라스파닌 또는 그 막 결합 도메인을 코딩하는 서열
을 이 순번으로 포함하는 서열을 포함해도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에 있어서, (c)는
(C) 서열 번호 24(또는 이에 대해 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 98％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99％ 이상의 것)의, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함해도 된다.
본 발명의 일 실시 형태로서, (d)는
(D) 상기 항원 제시 MHC 분자와, 상기 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛과, 세포 또는 세포 외 소포의 막에 국재하는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인 혹은 세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 막 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다.
상기 세포 외 소포의 막에 국재하는 것이 가능한 막 단백질 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질은, 테트라스파닌 또는 MFG-E8이면 된다. 상기 세포의 막에 국재하는 것이 가능한 막 단백질 또는 세포막에 결합되는 것이 가능한 단백질은, CD8이어도 되고, 막 관통 도메인을 포함하는 MHC 분자가 그 기능을 담당해도 된다.
본 발명의 일 실시 형태로서, (d)는
(D) N 말단측으로부터,
(D-1) MHC 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(D-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(D-3) 단쇄 MHC 분자의 아미노산 서열,
(D-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(D-5) CD8 또는 그 막 관통 도메인과, 상기 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인을 포함하는 융합 펩티드의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함해도 된다.
본 발명의 일 실시 형태로서, (d)는
(D) N 말단측으로부터,
(D-1) MHC 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(D-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(D-3) 막 관통 도메인을 포함하는 단쇄 MHC 분자의 아미노산 서열,
(D-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(D-5) 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인을 포함하는 융합 펩티드의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함해도 된다.
본 발명의 일 실시 형태로서, (d)는
(D)
N 말단측으로부터,
(D-1) MHC 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
(D-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(D-3) 단쇄 MHC 분자의 아미노산 서열,
(D-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(D-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인 혹은 MFG-E8 또는 그 막 관통 도메인과, 상기 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛을 포함하는 융합 펩티드의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함해도 된다(여기에서 각 구성 요소 (D-1) 내지 (D-5)는 본 명세서에 기재된 양태를 포함함).
혹은 본 발명의 일 실시 형태로서, (d)는
(D) N 말단측으로부터,
(D-1) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인 혹은 MFG-E8 또는 그 막 관통 도메인과, 상기 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛을 포함하는 융합 펩티드의 아미노산 서열,
(D-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(D-3) 단쇄 MHC 분자의 아미노산 서열,
(D-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(D-5) MHC 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열
을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함해도 된다(여기에서 각 구성 요소 (D-1) 내지 (D-5)는 본 명세서에 기재된 양태를 포함함).
이 양태에 있어서, 상기 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인 혹은 MFG-E8 또는 그 막 관통 도메인과, 상기 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛을 포함하는 융합 펩티드가,
그 N 말단측으로부터,
(1) 막 관통 도메인 1, 소형 세포 외 루프, 막 관통 도메인 2, 소형 세포 내 루프 및 막 관통 도메인 3을 포함하는 테트라스파닌의 부분 서열,
(2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(3) 상기 적어도 1개의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛,
(4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 그리고
(5) 막 관통 도메인 4를 포함하는 테트라스파닌의 부분 서열
을 이 순번으로 코딩하는 아미노산 서열을 포함하고 있어도 되고;
혹은
상기 상기 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인 혹은 MFG-E8 또는 그 막 관통 도메인과, 상기 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛을 포함하는 융합 펩티드가,
그 N 말단측으로부터,
(1) 상기 적어도 1의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛,
(2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(3) MFG-E8 또는 그 막 결합 도메인
을 이 순번으로 코딩하는 아미노산 서열을 포함하고 있어도 된다.
여기서, 상기 MHC 분자 구속성 항원 펩티드가 MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드이며, 상기 단쇄 MHC 분자가 MHC 클래스 Iα쇄의 세포 외 영역을 포함하고 있어도 되고; 상기 MHC 분자 구속성 항원 펩티드가 MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드이며, 상기 단쇄 MHC 분자가 MHC 클래스 IIα쇄의 세포 외 도메인 및/또는 MHC 클래스 IIβ쇄의 세포 외 도메인을 포함하고 있어도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에 있어서, 상기 (a)에서 규정되는 서열과 상기 (b)에서 규정되는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
추가로 상기 (c)에서 규정되는 서열을 포함하고 있어도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에 있어서,
상기 (d)에서 규정되는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
이러한 서열로서는, 서열 번호 135의 아미노산 서열을 코딩하는 서열 번호 136의 핵산 서열이 예시된다.
이러한 양태에 있어서, 상기 (c)에서 규정되는 서열을 포함하고 있어도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에 있어서, 상기 (e)에서 규정되는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 상기 (A), (B) 및 (C)에 대해서, (A)와 (B)가 융합되어, 1분자가 되는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드여도 되고, (B)와 (C)가 융합되어, 1분자가 되는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드여도 되고, (A), (B) 및 (C)가 융합되어, 1분자가 되는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드여도 된다. 이러한 폴리뉴클레오티드는, (A), (B) 및 (C)간에 스페이서 서열을 포함하거나 또는 포함하지 않는 형의 1개의 융합 단백질을 코딩하고 있어도 된다. (A) 내지 (C)의 융합 단백질을 코딩하는 서열은, 이하에 2A 펩티드 서열:
T2A: (GSG)EGRGSLLTCGDVEENPGP(서열 번호 211)
P2A: (GSG)ATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열 번호 212)
E2A (GSG)QCTNYALLKLAGDVESNPGP(서열 번호 213)
F2A (GSG)VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(서열 번호 214)
에서 독립적으로 선택되는 적어도 1개의 서열을 통해 융합된 서열로 되어 있어도 된다. 2A 펩티드 서열은 리보솜 스킵핑을 일으키고, 융합 단백질을 코딩하는 서열이 실제로 번역되었을 경우, 독립된 (A), (B) 및 (C)분자로서 세포 또는 세포 외 소포에 존재할 수 있다.
혹은, 본 발명의 일 실시 형태에 있어서의 폴리뉴클레오티드는, 상기 (A), (B) 및 (C)가, 그 단백질이 세포 또는 세포 외 소포에 국재하기 위한 요소, 즉, 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인」 또는 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 도메인」의 부분을 공유함으로써, 기능적으로 융합한 융합 단백질을 코딩하고 있어도 된다.
예를 들어 본 발명의 일 실시 형태에 있어서,
(A)와 (B)에서 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인」 또는 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 도메인」 부분을 공유하는 형으로 융합된,
(1) 항원 제시 MHC 분자;
(2) 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인; 및
(3) 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인」 또는 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 도메인」;을 포함하는 융합 단백질 (D)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드여도 되고;
(A)와 (C)에서 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인」 또는 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 도메인」 부분을 공유하는 형으로 융합된,
(1) 항원 제시 MHC 분자;
(2) T 세포 공자극 분자; 및
(3) 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인」 또는 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 도메인」;을 포함하는 융합 단백질 (F)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드여도 되고;
(B)와 (C)에서 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인」 또는 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 도메인」 부분을 공유하는 형으로 융합된,
(1) 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인;
(2) T 세포 공자극 분자; 및
(3) 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인」 또는 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 도메인」;을 포함하는 융합 단백질 (G)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드여도 되고;
혹은
(A) 내지 (C)에서 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인」 또는 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 도메인」 부분을 공유하는 형으로 융합된,
(1) 항원 제시 MHC 분자;
(2) 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인;
(2) T 세포 공자극 분자; 및
(4) 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인」 또는 「세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 도메인」;을 포함하는 융합 단백질 (E)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드여도 된다.
본 발명의 일 실시 형태는, 구성 요건 (A)의 세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인 혹은 세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 대신에, 구성 요건 (B)의 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 포함하는, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 단백질을 사용하여, 구성 요건 (A)와 구성 요건 (B)의 기능을 구비한 융합 단백질 (D)인,
항원 제시 MHC 분자와 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인을 포함하고, 해당 항원과 해당 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질
을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이면 된다.
이러한 구성 요건 (A)와 구성 요건 (B)의 기능을 구비한 융합 단백질 (D)는,
항원 제시 MHC 분자와 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인을 포함하고, 해당 항원과 해당 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질이어도 된다.
상기 융합 단백질은, 상기 항원 제시 MHC 분자와, 상기 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인과, 세포 또는 세포 외 소포의 막에 국재하는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인 혹은 세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 막 결합 도메인을 포함해도 된다.
구성 요건 (A)와 구성 요건 (B)의 기능을 구비한 융합 단백질 (D)에 있어서, 상기 세포 외 소포의 막에 국재하는 것이 가능한 막 단백질 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질은, 테트라스파닌 또는 MFG-E8이어도 된다.
구성 요건 (A)와 구성 요건 (B)의 기능을 구비한 융합 단백질 (D)에 있어서, 상기 세포 외 소포의 막에 국재하는 것이 가능한 막 단백질 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질은, 테트라스파닌 또는 MFG-E8이어도 된다.
상기 융합 단백질은, 그 N 말단측으로부터,
(D-1) MHC 분자 구속성 항원 펩티드,
(D-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(D-3) 단쇄 MHC 분자,
(D-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(D-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인 혹은 MFG-E8 또는 그 막 관통 도메인과, 상기 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인을 포함하는 융합 펩티드를 이 순번으로 코딩하는 아미노산 서열을 포함해도 된다.
상기 융합 단백질은, 그 N 말단측으로부터,
(D-1) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인 혹은 MFG-E8 또는 그 막 관통 도메인과, 상기 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인을 포함하는 융합 펩티드
(D-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(D-3) 단쇄 MHC 분자,
(D-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(D-5) MHC 분자 구속성 항원 펩티드를,
이 순번으로 코딩하는 아미노산 서열을 포함해도 된다.
여기서, 상기 융합 펩티드는, 그 N 말단측으로부터,
(1) 막 관통 도메인 1, 소형 세포 외 루프, 막 관통 도메인 2, 소형 세포 내 루프 및 막 관통 도메인 3을 포함하는 테트라스파닌의 부분 서열,
(2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
(3) 상기 적어도 1개의 T 세포 자극성 사이토카인,
(4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 그리고
(5) 막 관통 도메인 4를 포함하는 테트라스파닌의 부분 서열
을 이 순번으로 코딩하는 아미노산 서열을 포함해도 된다.
상기 융합 펩티드는, 그 N 말단측으로부터,
(1) 상기 적어도 1의 T 세포 자극성 사이토카인,
(2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
(3) MFG-E8
을 이 순번으로 코딩하는 아미노산 서열을 포함해도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에 있어서, MHC 분자 구속성 항원 펩티드가 MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드이며, 상기 단쇄 MHC 분자가 MHC 클래스 Iα쇄의 세포 외 영역을 포함해도 되고, 상기 MHC 분자 구속성 항원 펩티드가 MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드이며, 상기 단쇄 MHC 분자가 MHC 클래스 IIα쇄의 세포 외 도메인 및/또는 MHC 클래스 IIβ쇄의 세포 외 도메인을 포함해도 된다.
구성 요건 (A)와 구성 요건 (B)의 기능을 구비한 융합 단백질 (D)를 포함하는 양태에 있어서;
(C) 적어도 1개의 T 세포 공자극 분자를 포함하는, 해당 T 세포 공자극 분자와 T 세포가 상호 작용 가능한 단백질을 추가로 그 막에 포함해도 되고;
상기 T 세포와 상호 작용 가능한 단백질이, 상기 적어도 1개의 T 세포 공자극 분자와, 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 도메인을 포함해도 되고;
상기 T 세포와 상호 작용 가능한 단백질이, 상기 적어도 1개의 T 세포 공자극 분자와, 테트라스파닌 혹은 그 막 관통 도메인 또는 MFG-E8 혹은 그 도메인을 포함해도 된다.
벡터, 키트
본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 폴리뉴클레오티드로부터 선택되는 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터를 제공한다.
본 명세서 중에서 사용되는 「벡터」란, 임의의 벡터(이들에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 파지 등의 파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터 등의 바이러스 벡터, 인공 염색체 벡터 등을 포함한다)를 의미한다. 벡터는, 발현 벡터, 클로닝 벡터 등을 포함한다. 발현 벡터는, 일반적으로, 원하는 코딩 서열, 및 숙주 생물(예를 들어, 식물, 곤충, 동물 등) 또는 시험관 내에서의 발현계에 있어서의 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 적절한 폴리뉴클레오티드를 함유하고 있어도 된다. 클로닝 벡터는, 원하는 폴리뉴클레오티드 단편을 조작 및/또는 증폭시키기 위하여 사용해도 된다. 클로닝 벡터는, 원하는 폴리뉴클레오티드 단편의 발현에 필요하게 되는 기능적인 서열을 결실하고 있어도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 폴리뉴클레오티드는, 이들이 작동 가능하게 삽입될 수 있는 한, 모두 동일한 벡터 내에 삽입되어 있어도 되고, 2 이상의 폴리뉴클레오티드가 별개의 벡터에 삽입되어 있어도 된다. 본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 폴리뉴클레오티드로부터 선택되는 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 2종 이상의 벡터를 조합한 키트를 제공한다.
형질 전환 세포
본 발명의 일 실시 형태에서는, 이하:
(i) 본 명세서 중에 기재된 (A)의 융합 단백질 또는 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드,
(ii) 본 명세서 중에 기재된 (B)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는
(iii) 본 명세서 중에 기재된 (C)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
를 포함하여 이루어지는 벡터에 의해 형질 전환된 세포를 제공한다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 이하:
(i) 본 명세서 중에 기재된 (A)의 융합 단백질 또는 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및
(ii) 본 명세서 중에 기재된 (B)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 그리고 경우에 따라서
(iii) 본 명세서 중에 기재된 (C)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
를 포함하여 이루어지는, 단일의 벡터 또는 2 이상의 벡터의 조합에 의해 형질 전환된 세포를 제공한다.
본 발명의 일 실시 형태 세포에서는, 상기 (A), (B) 및 (C)에 대해서, (A)와 (B)가 융합하여, 1분자로 되는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, (B)와 (C)가 융합하여, 1분자로 되는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 혹은 (A), (B) 및 (C)가 융합하여, 1분자로 되는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질 전환되어 있어도 된다. 이러한 폴리뉴클레오티드는, (A), (B) 및 (C) 사이에 스페이서 서열을 포함하거나 또는 포함하지 않는 형의 하나의 융합 단백질을 코딩하고 있어도 된다.
혹은, 상기 (A), (B) 및 (C)는, 그 단백질이 세포 외 소포에 국재하기 위한 요소, 즉, 「세포 외 소포의 막에 발현하는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그의 막 관통 도메인」 또는 「세포 외 소포의 막에 결합하는 것이 가능한 단백질 혹은 그의 도메인」의 부분을 공유함으로써, 기능적으로 융합한 융합 단백질을 코딩하고 있어도 된다.
예를 들어 본 발명의 일 실시 형태에 있어서,
(A)와 (B)에서 「세포 외 소포의 막에 발현하는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그의 막 관통 도메인」 또는 「세포 외 소포의 막에 결합하는 것이 가능한 단백질 혹은 그의 도메인」 부분을 공유하는 형으로 융합한,
(1) 항원 제시 MHC 분자;
(2) 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인; 및
(3) 「세포 외 소포의 막에 발현하는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그의 막 관통 도메인」 또는 「세포 외 소포의 막에 결합하는 것이 가능한 단백질 혹은 그의 도메인」;을 포함하는 융합 단백질 (D)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터;
(A)와 (C)에서 「세포 외 소포의 막에 발현하는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그의 막 관통 도메인」 또는 「세포 외 소포의 막에 결합하는 것이 가능한 단백질 혹은 그의 도메인」 부분을 공유하는 형으로 융합한,
(1) 항원 제시 MHC 분자;
(2) T 세포 공자극 분자; 및
(3) 「세포 외 소포의 막에 발현하는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그의 막 관통 도메인」 또는 「세포 외 소포의 막에 결합하는 것이 가능한 단백질 혹은 그의 도메인」;을 포함하는 융합 단백질 (F)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터;
(B)와 (C)에서 「세포 외 소포의 막에 발현하는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그의 막 관통 도메인」 또는 「세포 외 소포의 막에 결합하는 것이 가능한 단백질 혹은 그의 도메인」 부분을 공유하는 형으로 융합한,
(1) 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인;
(2) T 세포 공자극 분자; 및
(3) 「세포 외 소포의 막에 발현하는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그의 막 관통 도메인」 또는 「세포 외 소포의 막에 결합하는 것이 가능한 단백질 혹은 그의 도메인」;을 포함하는 융합 단백질 (G)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터;
혹은
(A) 내지 (C)에서 「세포 외 소포의 막에 발현하는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그의 막 관통 도메인」 또는 「세포 외 소포의 막에 결합하는 것이 가능한 단백질 혹은 그의 도메인」 부분을 공유하는 형으로 융합한,
(1) 항원 제시 MHC 분자;
(2) 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인;
(3) T 세포 공자극 분자; 및
(4) 「세포 외 소포의 막에 발현하는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그의 막 관통 도메인」 또는 「세포 외 소포의 막에 결합하는 것이 가능한 단백질 혹은 그의 도메인」;을 포함하는 융합 단백질 (E)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터
로 형질 전환되어 있어도 된다.
혹은, 본 발명의 일 실시 형태에서는,
(iv) 구성 요건 (A)의 세포 외 소포의 막에 발현하는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그의 막 관통 도메인 또는 세포 외 소포의 막에 결합하는 것이 가능한 단백질 대신에 구성 요건 (B)의 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 포함하는, 해당 제1 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 단백질을 사용하여, 구성 요건 (A)와 구성 요건 (B)의 기능을 구비한 융합 단백질인,
본 명세서 중에 기재된 (D)의 항원 제시 MHC 분자와 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인을 포함하고, 해당 항원과 해당 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
를 포함하는 벡터에 의해 형질 전환된 세포를 제공한다.
「단일의 벡터 또는 2 이상의 벡터의 조합에 의해 형질 전환된」이란, 예를 들어, 세포가, 상기 (i) 내지 (iv)의 폴리뉴클레오티드가 모두 동일한 벡터 내에 삽입된 것에 의해 형질 전환되어도 되고, 이들 중 2 이상이 별개의 벡터에 삽입된 2 이상의 벡터의 조합에 의해 형질 전환되어도 되는 것을 의미한다.
「단일의 벡터 또는 2 이상의 벡터가 조합」으로서는, (A)가 융합 단백질일 경우, 예를 들어, 이하의 것을 들 수 있다:
·(A)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (B)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터;
·(A)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터와, (B)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터의 조합;
·(A)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, (B)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (C)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터;
·(A)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (B)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터와, (C)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터의 조합;
·(A)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (C)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터와, (B)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터의 조합;
·(B)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (C)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터와, (A)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터의 조합; 또는
·(A)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터와, (B)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터와, (C)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터의 조합.
혹은, 「단일의 벡터 또는 2 이상의 벡터가 조합」으로서는, (A)가 단백질 복합체일 경우, 예를 들어, 이하의 것을 들 수 있다:
·(A-1) 내지 (A-5)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, (A-6)을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (B)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터;
·(A-1) 내지 (A-5)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (A-6)을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터와, (B)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터의 조합;
·(A-1) 내지 (A-5)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (B)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터와, (A-6)을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터의 조합;
·(A-1) 내지 (A-5)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터와, (A-6)을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (B)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터의 조합;
·(A-1) 내지 (A-5)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터와, (A-6)을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터와, (B)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터의 조합;
·(A-1) 내지 (A-5)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, (A-6)을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, (B)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (C)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터;
·(A-1) 내지 (A-5)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, (A-6)을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (B)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터와, (C)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터의 조합;
·(A-1) 내지 (A-5)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, (B)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (C)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터와, (A-6)을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터의 조합;
·(A-6)을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, (B)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (C)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터와, (A-1) 내지 (A-5)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터의 조합;
·(A-1) 내지 (A-5)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, (A-6)을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (C)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터와, (B)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터의 조합;
·(A-1) 내지 (A-5)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (A-6)을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터와, (B)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (C)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터의 조합;
·(A-1) 내지 (A-5)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (B)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터와, (A-6)을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (C)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터의 조합;
·(A-1) 내지 (A-5)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (C)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터와, (A-6)을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (B)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터의 조합;
·(A-1) 내지 (A-5)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터와, (A-6)을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터와, (B)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (C)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터의 조합;
·(A-1) 내지 (A-5)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터와, (B)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터와, (A-6)을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (C)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터의 조합;
·(A-1) 내지 (A-5)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터와, (C)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터와, (A-6)을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (B)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터의 조합;
·(A-6)을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터와, (B)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터와, (A-1) 내지 (A-5)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (C)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터의 조합;
·(A-6)을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터와, (C)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터와, (A-1) 내지 (A-5)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (B)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터의 조합;
·(B)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터와, (C)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터와, (A-1) 내지 (A-5)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (A-6)을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터의 조합; 또는
·(A-1) 내지 (A-5)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터와, (A-6)을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터와, (B)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터와, (C)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 이루어지는 벡터의 조합.
형질 전환시키는 세포는, 형질 전환시킨 후에 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포를 얻을 수 있는 것인 한 특별히 한정되는 것은 아니며, 초대 배양 세포여도, 계대 세포여도, 주화 세포여도 되고, 이들은 정상 세포여도, 암화 또는 종양화한 세포를 포함하는 병변 세포여도 된다. 또한, 형질 전환시키는 세포의 유래는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트 등의 설치류, 토끼 등의 토끼목, 돼지, 소, 염소, 말, 양 등의 유제류, 개, 고양이 등의 식육목, 인간, 원숭이, 붉은털 원숭이, 게잡이 원숭이, 마모셋, 오랑우탄, 침팬지 등의 영장류 등의 포유 동물 등의 동물 유래의 세포; 식물 유래의 세포; 곤충 유래의 세포 등을 들 수 있다. 형질 전환시키는 세포로서는, 바람직하게는 동물 유래의 세포이다. 동물 유래의 세포로서는, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간 배 신장 세포(HEK293T 세포 등을 포함한다), 인간 FL 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO 세포), COS-7, 베로(Vero), 마우스 L 세포, 래트 GH3 등을 들 수 있다.
세포를 형질 전환시키는 방법은, 세포에 목적으로 하는 폴리뉴클레오티드를 도입할 수 있는 방법이라면 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 일렉트로포레이션법, 미세 주입법, 인산칼슘법, 양이온성 지질법, 리포솜을 사용하는 방법, 폴리에틸렌이민 등의 비리포솜성의 것을 사용하는 방법, 바이러스 감염법 등이어도 된다.
형질 전환된 세포는, (A), (B), (C), (D), (E), (F) 및/또는 (G)의 융합 단백질 또는 단백질 복합체를, 일과성으로 발현하는 형질 전환 세포여도 되고, 안정적으로 발현하는 형질 전환 세포(안정 세포주)여도 된다.
형질 전환된 세포의 배양 조건은, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 형질 전환된 세포가 동물 유래의 세포일 경우, 예를 들어, 세포 배양 등에 일반적으로 사용되고 있는 배지(예를 들어, RPMI1640 배지, Eagle의 MEM 배지, 둘베코 개변 이글 배지(DMEM 배지), Ham F12 배지, 또는 이들의 임의의 조합 등), 또는 이것에 소태아 혈청, 항생 물질, 아미노산 등의 다른 성분을 첨가한 배지 등을 사용하여, 예를 들어, 약 1 내지 약 10％(바람직하게는 약 2 내지 약 5％) CO2의 존재 하, 약 30 내지 약 40℃(바람직하게는 약 37℃)에서, 원하는 시간(예를 들어, 약 0.5시간 내지 약 240시간(바람직하게는, 약 5 내지 약 120시간, 보다 바람직하게는, 약 12 내지 약 72시간)), 배양(예를 들어, 정치 하 또는 진탕 하)해도 된다.
형질 전환된 세포를 배양하여 얻어져서 이루어지는 배양 상청 중에는, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포가 포함될 수 있다. 그 때문에, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포를 얻을 목적으로 형질 전환 세포를 배양할 때, 필요에 따라서, 엑소솜 등의 세포 외 소포를 제거한 배지(예를 들어, 엑소솜을 제거한 약 1 내지 약 5％ 소태아 혈청을 포함하는 둘베코 개변 이글 배지 등)를 사용해도 된다.
배양 상청
본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 형질 전환된 세포를 배양하여 얻어져서 이루어지는 배양 상청을 제공한다.
본 명세서 중에 기재된 배양 상청 중에 포함되는 항원 제시 세포 외 소포는, 예를 들어, 해당 배양 상청을 정제(예를 들어, 원심 분리, 크로마토그래피 등), 농축, 단리 등을 함으로써, 보다 회수할 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 배양 상청으로부터 얻어져서 이루어지는, 항원 제시 세포 외 소포를 제공한다.
본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포를 제조하기 위한 방법
본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포는, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 당업자에게 공지된 유전자 재조합 기술 등의 수단에 의해(예를 들어, 이하에 기재된 방법에 의해, 혹은 실시예에 기재된 방법에 의해, 또는 이들에 유사한 방법에 의해) 얻어도 된다.
통상의 유전자 재조합 기술에 의해, 상술한 (A) 및 (B)(혹은 (A)와 (B) 대신에 (D)), 그리고 경우에 따라서 (C)의 단백질을 각각 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 얻고(혹은 (A) 내지 (a) 내지 (d), 이들을 동일하거나 또는 별개의 벡터에 작동 가능하게 삽입할 수 있다. (A) 및 (B)(혹은 (A)와 (B) 대신에 (D)), 그리고 경우에 따라서 (C)의 단백질을 각각 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 2종 이상을 동일한 벡터에 삽입하는 경우, 각각이 동일하거나 또는 별개의 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있어도 된다.
얻어진 단일의 또는 2 이상의 항원 제시 세포용의 벡터를, 세포에 동시에 또는 축차적으로 형질 전환시켜, 항원 제시 세포(이들 융합 단백질을, 일과성으로 발현하는 형질 전환 세포여도 되고, 안정적으로 발현하는 형질 전환 세포(안정주)여도 됨)를 얻을 수 있다.
얻어진 단일의 또는 2 이상의 항원 제시 세포 외 소포용의 벡터를, 세포에 동시에 또는 축차적으로 형질 전환시켜, 형질 전환 세포(이들 융합 단백질을, 일과성으로 발현하는 형질 전환 세포여도 되고, 안정적으로 발현하는 형질 전환 세포(안정주)여도 됨)를 얻을 수 있다. 얻어진 형질 전환 세포를 원하는 조건 하에서 배양하여 배양 상청을 얻고, 얻어진 배양 상청을 필요에 따라서 정제(예를 들어, 원심 분리, 항체(예를 들어, 세포 외 소포의 막에 포함되는 단백질 등을 인식하는 항체), 크로마토그래피, 플로 사이토메트리 등을 사용한 정제), 농축(예를 들어, 한외 여과 등), 건조시키거나 함으로써, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포를 얻을 수 있다.
혹은, 상술한 (A) 및 (B)(혹은 (A)와 (B) 대신에 (D)), 그리고 경우에 따라서 (C)의 단백질로서, 가용성의 것을 사용하는 경우, 예를 들어 이하의 방법에 의해 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포를 얻어도 된다.
상술한 (A) 및 (B)(혹은 (A)와 (B) 대신에 (D)), 그리고 경우에 따라서 (C)를 가용성의 단백질로서, 통상의 유전자 재조합 기술에 의해 얻거나, 또는 시판되는 것을 사용한다. 이어서, 원하는 세포로부터, 예를 들어 공지된 방법에 의해 혹은 본 명세서 중에 기재된 방법에 의해, 또는 이들에 유사한 방법에 의해, 세포 또는 세포 외 소포를 얻는다. 이어서, 얻어진 세포 또는 세포 외 소포와, 상술한 가용성의 단백질 1종 이상을, 원하는 용매 중, 원하는 조건 하에서 반응시킨다(예를 들어, 일본 특허 공개 제2018-104341호 공보 등에 기재된 방법을 참고로 해도 됨). 이 조작을, (A) 및 (B)(혹은 (A)와 (B) 대신에 (D)), 그리고 경우에 따라서 (C)의 가용성의 단백질이, 세포 외 소포의 막에 포함될 때까지, 조건을 적절히 변경하면서 실시함으로써, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포를 얻을 수 있다.
혹은, 상술한 (A) 및 (B)(혹은 (A)와 (B) 대신에 (D)), 그리고 경우에 따라서 (C)의 단백질로서, 가용성의 것을 사용하는 경우, 예를 들어 이하의 방법에 의해 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포를 얻어도 된다.
상술한 (A) 및 (B)(혹은 (A)와 (B) 대신에 (D)), 그리고 경우에 따라서 (C)의 가용성의 단백질로서, 그들의 N 말단측 또는 C 말단측에 원하는 태그(예를 들어, His 태그, FLAG 태그, 서열 번호 79의 PNE 태그 등을 들 수 있고, 이들은 모두 동일한 태그여도 되고, 모두 다른 종류의 태그여도 됨)를 부가한 것을, 통상의 유전자 재조합 기술에 의해 얻는다. 이어서, 원하는 세포로부터, 예를 들어 공지된 방법에 의해 혹은 본 명세서 중에 기재된 방법에 의해, 또는 이들에 유사한 방법에 의해, 세포 또는 세포 외 소포를 얻고, 이것에 해당 태그에 대한 항체 또는 그 항원 결합성 프래그먼트(예를 들어, scFv, Fab 혹은 나노바디, 예를 들어 서열 번호 83의 항PNE 태그 나노바디) 등을, 필요에 따라서 펩티드 링커 등을 통해 결합시키거나; 혹은, 통상의 유전자 재조합 기술에 의해, 세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 또는 그 막 관통 도메인의 N 말단측 또는 C 말단측에 해당 태그에 대한 항체 또는 그 항원 결합성 프래그먼트(예를 들어, scFv, Fab 혹은 나노바디) 등이 결합된 융합 단백질(예를 들어, 서열 번호 89의, 항PNE 태그 나노바디(서열 번호 83)과 CD8a(서열 번호 85)과 CD81(서열 번호 15)의 융합 단백질 등)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 서열 번호 88, 90 등)를 얻고, 이것을 벡터에 작동 가능하게 삽입한 것을 사용하여 세포에 형질 전환시킴으로써, 형질 전환 세포(융합 단백질을, 일과성으로 발현하는 형질 전환 세포여도 되고, 안정적으로 발현하는 형질 전환 세포(안정주)여도 됨)를 얻고, 얻어진 형질 전환 세포를 배양하거나 하고, 상술한 방법 등에 의해 세포 외 소포를 회수한다. 태그가 부가한 가용성의 (A) 및 (B), 그리고 경우에 따라서 (C)의 단백질과, 해당 태그에 대한 항체 또는 그 항원 결합성 프래그먼트(예를 들어, scFv, Fab 혹은 나노바디) 등을 포함하는 단백질을 막에 포함하는 세포 외 소포를, 원하는 조건에서 혼합함으로써, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포를 얻어도 된다.
혹은, 상술한 (A) 내지 (G)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 조합하여 사용하여 형질 전환을 행하고, 얻어진 형질 전환 세포로부터, 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포를 얻어도 된다.
혹은, 상술한 방법 중 2 이상을 조합한 방법에 의해, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포를 얻어도 된다.
본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포는, 예를 들어 플로 사이토메트리, ELISA, 웨스턴 블로팅 등의 방법에 의해, (A) 및 (B)(혹은 (A)와 (B) 대신에 (D)), 그리고 경우에 따라서 (C)의 단백질이 막에 포함되어 있는 것을 확인해도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포를 제조하기 위한 방법이며, 본 명세서 중에 기재된 형질 전환된 세포를 배양하여 얻어 이루어지는 배양 상청을 회수하는 것을 포함하는, 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포를 제조하기 위한 방법이며,
(i) 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포용의 (A)의 융합 단백질 또는 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및
(ii) 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포용의 (B)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 그리고 경우에 따라서
(iii) 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포용의 (C)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
를 포함하여 이루어지는, 단일의 벡터 또는 2 이상의 벡터의 조합을, 세포에 동시 또는 축차적으로(바람직하게는 동시에) 형질 전환시키는 것과,
얻어진 형질 전환 세포를 배양하여 얻어 이루어지는 배양 상청을 회수하는 것
을 포함하는, 방법을 제공한다.
혹은, 본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포를 제조하기 위한 방법이며,
(iv) 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포용의 (D)의 항원 제시 MHC 분자와 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인을 포함하고, 해당 항원과 해당 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및
경우에 따라서
(iii) 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포용의 (C)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
를 포함하여 이루어지는, 단일의 벡터 또는 2 이상의 벡터의 조합을, 세포에 동시 또는 축차적으로(바람직하게는 동시에) 형질 전환시키는 것과,
얻어진 형질 전환 세포를 배양하여 얻어 이루어지는 배양 상청을 회수하는 것
을 포함하는, 방법을 제공한다.
혹은, 본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포를 제조하기 위한 방법이며,
(v) 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포용의 (E)의 항원 제시 MHC 분자와 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인과 T 세포 공자극 분자를 포함하고, 해당 항원과 해당 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
를 포함하여 이루어지는, 벡터를, 세포에 형질 전환시키는 것과,
얻어진 형질 전환 세포를 배양하여 얻어 이루어지는 배양 상청을 회수하는 것
을 포함하는, 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포를 제조하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포를 제조하기 위한 방법이며,
(i) 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포용의 (A)의 융합 단백질 또는 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및
(ii) 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포용의 (B)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 그리고 경우에 따라서
(iii) 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포용의 (C)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
를 포함하여 이루어지는, 단일의 벡터 또는 2 이상의 벡터의 조합을, 세포에 동시 또는 축차적으로(바람직하게는 동시에) 형질 전환시키는 것
을 포함하는, 방법을 제공한다.
혹은, 본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포를 제조하기 위한 방법이며,
(iv) 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포용의 (D)의 항원 제시 MHC 분자와 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인을 포함하고, 해당 항원과 해당 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및
경우에 따라서
(iii) 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포용의 (C)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
를 포함하여 이루어지는, 단일의 벡터 또는 2 이상의 벡터의 조합을, 세포에 동시 또는 축차적으로(바람직하게는 동시에) 형질 전환시키는 것
을 포함하는, 방법을 제공한다.
혹은, 본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포를 제조하기 위한 방법이며,
(v) 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포용의 (E)의 항원 제시 MHC 분자와 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인과 T 세포 공자극 분자를 포함하고, 해당 항원과 해당 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
를 포함하여 이루어지는, 벡터를, 세포에 형질 전환시키는 것
을 포함하는, 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 배양 상청으로부터 얻어져서 이루어지는 항원 제시 세포 외 소포를 제공한다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 항원 제시 세포 외 소포이며, 이하:
(i) 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포용의 (A)의 융합 단백질 또는 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및
(ii) 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포용의 (B)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 그리고 경우에 따라서
(iii) 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포용의 (C)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
를 포함하여 이루어지는, 단일의 벡터 또는 2 이상의 벡터의 조합을, 세포에 동시 또는 축차적으로(바람직하게는 동시에) 형질 전환시키는 것과,
얻어진 형질 전환 세포를 배양하여 얻어 이루어지는 배양 상청을 회수하는 것
을 포함하는 방법에 의해 얻어지는, 항원 제시 세포 외 소포를 제공한다.
혹은, 본 발명의 일 실시 형태에서는, 항원 제시 세포 외 소포이며, 이하:
(iv) 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포용의 (D)의 항원 제시 MHC 분자와 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인을 포함하고, 해당 항원과 해당 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및
경우에 따라서
(iii) 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포용의 (C)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
를 포함하여 이루어지는, 단일의 벡터 또는 2 이상의 벡터의 조합을, 세포에 동시 또는 축차적으로(바람직하게는 동시에) 형질 전환시키는 것과,
얻어진 형질 전환 세포를 배양하여 얻어 이루어지는 배양 상청을 회수하는 것
을 포함하는 방법에 의해 얻어지는, 항원 제시 세포 외 소포를 제공한다.
혹은, 본 발명의 일 실시 형태에서는, 항원 제시 세포 외 소포이며, 이하:
(v) 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포용의 (E)의 항원 제시 MHC 분자와 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인과 T 세포 공자극 분자를 포함하고, 해당 항원과 해당 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 세포에 형질 전환시키는 것과,
얻어진 형질 전환 세포를 배양하여 얻어 이루어지는 배양 상청을 회수하는 것
을 포함하는 방법에 의해 얻어지는, 항원 제시 세포 외 소포를 제공한다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 항원 제시 세포이며, 이하:
(i) 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포용의 (A)의 융합 단백질 또는 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및
(ii) 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포용의 (B)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 그리고 경우에 따라서
(iii) 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포용의 (C)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
를 포함하여 이루어지는, 단일의 벡터 또는 2 이상의 벡터의 조합을, 세포에 동시 또는 축차적으로(바람직하게는 동시에) 형질 전환시키는 것
을 포함하는 방법에 의해 얻어지는, 항원 제시 세포를 제공한다.
혹은, 본 발명의 일 실시 형태에서는, 항원 제시 세포이며, 이하:
(iv) 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포용의 (D)의 항원 제시 MHC 분자와 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인을 포함하고, 해당 항원과 해당 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및
경우에 따라서
(iii) 본 명세서 중에 기재된 (C)의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
를 포함하여 이루어지는, 단일의 벡터 또는 2 이상의 벡터의 조합을, 세포에 동시 또는 축차적으로(바람직하게는 동시에) 형질 전환시키는 것
을 포함하는 방법에 의해 얻어지는, 항원 제시 세포를 제공한다.
혹은, 본 발명의 일 실시 형태에서는, 항원 제시 세포이며, 이하:
(v) 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포용의 (E)의 항원 제시 MHC 분자와 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인과 T 세포 공자극 분자를 포함하고, 해당 항원과 해당 T 세포 자극성 사이토카인을 막 외에 제시 가능한 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 세포에 형질 전환시키는 것
을 포함하는 방법에 의해 얻어지는, 항원 제시 세포를 제공한다.
조성물, 용도
본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포, 항원 제시 세포 외 소포, 폴리뉴클레오티드 및/또는 이것을 포함하는 벡터, 그리고/또는 형질 전환 세포 및/또는 그 배양 상청을 포함하는 조성물(예를 들어, 의약 조성물)을 제공한다. 본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포, 또는 본 명세서 중에 기재된 배양 상청을 포함하는 의약 조성물을 제공한다.
본 명세서 중에 기재된 조성물(예를 들어, 의약 조성물)은 이들에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 부형제, 활택제, 결합제, 붕괴제, pH 조정제, 용제, 용해 보조제, 현탁화제, 등장화제, 완충제, 무통화제, 방부제, 항산화제, 착색제, 감미제, 계면 활성제 등의 첨가제를 포함할 수 있다. 이들 첨가제의 종류, 그 사용량 등은, 목적에 따라서 당업자가 적절히 선택할 수 있다. 의약 조성물로서 사용하는 경우, 이들 첨가제는 약리학적으로 허용할 수 있는 담체인 것이 바람직하다. 또한, 본 명세서 중에 기재된 조성물이 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우, 필수는 아니지만, 핵산의 DD(드러그 딜리버리)에 적합한 담체를 포함하는 것이 바람직하고, 이들 담체로서 지질 나노 입자(LNP) 및 폴리머(예를 들어 PEI)를 들 수 있다.
본 명세서 중에 기재된 조성물(예를 들어, 의약 조성물)은 상술한 첨가제와 함께, 자체 공지된 방법에 의해, 예를 들어 정제, 피복 정제, 구강내 붕괴정, 츄어블제, 환제, 과립제, 세립제, 산제, 경캡슐제, 연캡슐제, 액제(예를 들어, 시럽제, 주사제, 로션제 등을 포함함), 현탁제, 유제, 젤리제, 첩부제, 연고제, 크림제, 흡입제, 좌제 등에 제제화할 수 있다. 이들은 경구제여도 되고, 비경구제여도 된다. 제제화된 것은, 그 목적에 따라서 유익한 다른 성분(예를 들어, 치료상 유익한 다른 성분)을 더 포함하고 있어도 된다.
본 발명의 일 실시 형태인 조성물은, 시험예가 나타내는 바와 같이, 특정한 항원에 대하여 획득 면역(세포성 면역 및/또는 액성 면역)을 증강시키는 것은 가능하고, 항원으로서 감염 병원체(병원균이나 바이러스 등) 유래의 펩티드를 사용하면, 감염 병원체에 의해 야기되는 감염증을 처치 또는 예방하기 위한 의약 조성물로서 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시 형태인 조성물은, 시험예가 나타내는 바와 같이, 염증성 사이토카인의 유도를 가능하게 하고, 자연 면역을 활성화(호중구, 단구, 마크로파지 등을 동원, 활성화하여 병원균 등을 식균시키는 것을 포함함)함으로써, 감염 병원체를 배제하는 것이 가능하고, 감염 병원체에 의해 야기되는 감염증을 처치 또는 예방하기 위한 의약 조성물로서 사용할 수 있다.
본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포, 항원 제시 세포 외 소포(바람직하게는 막에 MHC 클래스 I 구속성 항원 펩티드 및 MHC 클래스 I 분자를 포함하는 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포 외 소포), 그 폴리뉴클레오티드 및/또는 이것을 포함하는 벡터, 그리고/또는 형질 전환 세포 및/또는 그 배양 상청, 혹은 이들을 포함하는 조성물(예를 들어, 의약 조성물)은 암을 처치 또는 예방하기 위해 유용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 실시 형태에서는, 암을 처치 또는 예방하기 위한, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포, 항원 제시 세포 외 소포, 폴리뉴클레오티드 및/또는 이것을 포함하는 벡터, 그리고/또는 형질 전환 세포 및/또는 그의 배양 상청, 혹은 이들을 포함하는 조성물(예를 들어, 의약 조성물)을 제공한다. 시험예가 나타내는 바와 같이, 본 발명의 일 실시 형태인 항원 제시 세포 외 소포 등은, 사용하는 항원 특이적인 세포 상해성 T 세포의 증식·활성화를 하는 것이 가능하고, 사용하는 항원으로서 종양 관련 항원 펩티드를 사용하면, 증식·활성화한 세포 상해성 T 세포가 암 세포를 인식하여 공격함으로써, 암 세포를 사멸시킬 수 있다.
본 발명의 다른 실시 양태에서는, 암을 처치 또는 예방하기 위한 의약을 제조하기 위한, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포, 폴리뉴클레오티드 및/또는 이것을 포함하는 벡터, 그리고/또는 형질 전환 세포 및/또는 그의 배양 상청, 혹은 이들을 포함하는 조성물(예를 들어, 의약 조성물)의 사용을 제공한다.
본 발명의 다른 실시 양태에서는, 암을 처치 또는 예방하기 위한 방법이며, 이것을 필요로 하는 피검체에, 유효량의 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 외 소포, 폴리뉴클레오티드 및/또는 이것을 포함하는 벡터, 그리고/또는 형질 전환 세포 및/또는 그의 배양 상청, 혹은 이들을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
암으로서는, 어느 고형암 및 혈액암이 포함되고, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 소장암, 대장암, 결장암, 직장암, 췌장암, 전립선암, 골수암, 신장암(신장 세포암 등을 포함한다), 부갑상선암, 부신암, 요관암, 간암, 담관암, 자궁경암, 난소암(예를 들어, 그의 조직형이, 장액 생식선암, 점액 생식선암, 명세포선암 등), 정소암, 방광암, 외음부암, 음경암, 갑상선암, 두경부암, 두개인두암, 인두암, 설암, 피부암, 메르켈 세포암, 흑색종(악성 흑색종 등), 상피암, 편평 상피 세포암, 기저 세포암, 소아암, 원발 불명암, 섬유 육종, 점막 육종, 지방 육종, 연골 육종, 골원생 육종, 척삭종, 혈관 육종, 림프관 육종, 림프관 내피 육종, 카포시 육종, 평활근 육종, 횡문근 육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양, 정상피종, 윌름스 종양, 뇌종양, 신경교종, 교아종, 성상 세포종, 골수 아종, 수막종, 신경 아세포종, 수아종, 망막 아세포종, 척추 종양, 악성 림프종(예를 들어, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종 등), 만성 또는 급성 림프구성 백혈병, 성인 T 세포 백혈병 등을 들 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에 있어서, 암을 처치 또는 예방하기 위해서, 면역 체크포인트 저해약을 병용할 수 있다. 면역 체크포인트 저해약을, 동시 또는 순차 환자에게 투여해도 되고, 본 발명에 관계되는 의약에 포함되어 있어도 된다.
면역 체크포인트 저해약으로서는, PD-1 저해제(예를 들어, 니블루맙, 벰브롤리지맙 등의 항PD-1 항체), CTLA-4 저해제(예를 들어 이필리무맙 등의 항CTLA-4 항체), PD-L1 저해제(예를 들어 두르발루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙 등의 항PD-L1 항체) 등이 예시되지만 이것에 한정되지 않는다. 면역 체크포인트 저해약이 항체 또는 그의 활성 단편인 경우, 그 항체 또는 그의 활성 단편을, 세포 외 소포의 막에 국재하는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그의 막 관통 도메인 또는 세포 외 소포의 막에 결합하는 것이 가능한 단백질 혹은 그 막 결합 도메인과 결합시켜서, 본 발명에 관계되는 세포 외 소포의 막 상에 존재시켜도 된다.
이러한 면역 체크포인트 저해제의 병용은, 암 세포에 대한 세포 상해성을 증강한다.
본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포, 항원 제시 세포 외 소포(바람직하게는, 막 상에 MHC 클래스 II 구속성 항원 펩티드 및 MHC 클래스 II 분자를 포함하는 항원 제시 세포, 항원 제시 세포 외 소포), 그 폴리뉴클레오티드 및/또는 이것을 포함하는 벡터, 그리고/또는 형질 전환 세포 및/또는 그의 배양 상청, 혹은 이들을 포함하는 조성물은, 자기 면역 질환을 처치 또는 예방하기 위하여 유용할 수 있다. 시험예가 예시한 바와 같이, 본 발명의 일 실시 형태인 항원 제시 세포 외 소포는, 사용하는 항원 특이적인 제어성 T 세포(Treg)의 증식·활성화를 하는 것이 가능하고, 사용하는 항원으로서 자기 항원 펩티드를 사용하면, 증식·활성화한 Treg이 자기 항원에 대한 면역 관용을 야기하여, 자기 면역 질환을 처치 또는 예방할 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 실시 형태에서는, 자기 면역 질환을 처치 또는 예방하기 위한, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포, 항원 제시 세포 외 소포, 폴리뉴클레오티드 및/또는 이것을 포함하는 벡터, 그리고/또는 형질 전환 세포 및/또는 그의 배양 상청, 혹은 이들을 포함하는 조성물(예를 들어, 의약 조성물)을 제공한다.
본 발명의 다른 실시 양태에서는, 자기 면역 질환을 처치 또는 예방하기 위한 의약을 제조하기 위한, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포, 항원 제시 세포 외 소포, 폴리뉴클레오티드 및/또는 이것을 포함하는 벡터, 그리고/또는 형질 전환 세포 및/또는 그의 배양 상청, 혹은 이들을 포함하는 조성물(예를 들어, 의약 조성물)의 사용을 제공한다.
본 발명의 다른 실시 양태에서는, 자기 면역 질환을 처치 또는 예방하기 위한 방법이며, 이것을 필요로 하는 피검체에, 유효량의 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포, 항원 제시 세포 외 소포, 폴리뉴클레오티드 및/또는 이것을 포함하는 벡터, 그리고/또는 형질 전환 세포 및/또는 그의 배양 상청, 혹은 이들을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
자기 면역 질환으로서는, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 천식, 건선, 전신성 에리테마토데스, 길랭 바레 증후군, 쇼그렌 중후군, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 악성 빈혈, 바세도우병, 하시모토 갑상선염, I형 당뇨병, 크론병, 염증성 장질환, 관절 류머티즘 등을 들 수 있다.
본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포, 항원 제시 세포 외 소포(바람직하게는, 막 상에 MHC 클래스 II 구속성 항원 펩티드 및 MHC 클래스 II 분자를 포함하는 항원 제시 세포, 항원 제시 세포 외 소포), 그 폴리뉴클레오티드 및/또는 이것을 포함하는 벡터, 그리고/또는 형질 전환 세포 및/또는 그의 배양 상청, 혹은 이들을 포함하는 조성물(예를 들어, 의약 조성물)은 알레르기성 질환을 처치 또는 예방하기 위하여 유용할 수 있다. 시험예가 나타내는 바와 같이, 본 발명의 일 실시 형태인 항원 제시 세포 외 소포 등은, 사용하는 항원 특이적인 제어성 T 세포(Treg)의 증식·활성화를 하는 것이 가능하고, 사용하는 항원으로서 알레르겐을 사용하면, 증식·활성화한 Treg이 알레르겐에 대한 면역 관용을 야기하여, 알레르기 질환을 처치 또는 예방할 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 실시 형태에서는, 알레르기성 질환을 처치 또는 예방하기 위한, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포, 항원 제시 세포 외 소포, 폴리뉴클레오티드 및/또는 이것을 포함하는 벡터, 그리고/또는 형질 전환 세포 및/또는 그의 배양 상청, 혹은 이들을 포함하는 조성물(예를 들어, 의약 조성물)을 제공한다.
본 발명의 다른 실시 양태에서는, 알레르기성 질환을 처치 또는 예방하기 위한 의약을 제조하기 위한, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포, 항원 제시 세포 외 소포, 폴리뉴클레오티드 및/또는 이것을 포함하는 벡터, 그리고/또는 형질 전환 세포 및/또는 그의 배양 상청, 혹은 이들을 포함하는 조성물(예를 들어, 의약 조성물)의 사용을 제공한다.
본 발명의 다른 실시 양태에서는, 알레르기성 질환을 처치 또는 예방하기 위한 방법이며, 이것을 필요로 하는 피검체에, 유효량의 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포, 항원 제시 세포 외 소포, 폴리뉴클레오티드 및/또는 이것을 포함하는 벡터, 그리고/또는 형질 전환 세포 및/또는 그의 배양 상청, 혹은 이들을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
알레르기성 질환으로서는, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 알레르기성 천식, 알레르기성 결막염, 알레르기성 위장염, 음식물 알레르기, 약물 알레르기, 담마진 등을 들 수 있다.
상술한 각종 질환을 처치 또는 예방할 대상으로 되는 피검체는, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트 등의 설치류; 토끼 등의 토끼목; 돼지, 소, 염소, 말, 양 등의 유제류; 개, 고양이 등의 식육목; 인간, 원숭이, 붉은털 원숭이, 게잡이 원숭이, 마모셋, 오랑우탄, 침팬지 등의 영장류; 등의 포유 동물 등의 동물, 혹은 식물을 들 수 있는데, 바람직하게는 동물이며, 보다 바람직하게는 설치류 또는 영장류이며, 더욱 바람직하게는 마우스 또는 인간이다.
본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포, 항원 제시 세포 외 소포, 폴리뉴클레오티드 및/또는 이것을 포함하는 벡터, 그리고/또는 형질 전환 세포 및/또는 그의 배양 상청, 혹은 이들을 포함하는 조성물 또는 이것을 제제화했지만 투여량은, 투여하는 피검체의 성별, 연령, 체중, 건강 상태, 병상의 정도 혹은 식사; 투여 시간; 투여 방법; 다른 약물과의 조합; 기타의 요인을 고려하여 적절히 결정할 수 있다.
특이적인 항원에 대한 T 세포를 활성화, 증식 및/또는 분화 등 시키기 위한 방법
본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포, 항원 제시 세포 외 소포는, 시험관 내, 생체 외, 및/또는 생체 내에서 T 세포(이들에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 말초혈, 비장 등으로부터 얻어진 T 세포 또는 T 세포 집단)와 접촉함으로써, 특이적인 항원에 대한 T 세포를 활성화, 증식, 분화 등 시킬 수 있을 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포, 항원 제시 세포 외 소포와 T 세포를 시험관 내 또는 생체 외에 있어서 접촉시키는 것을 포함하는, 특이적인 항원에 대한 T 세포를 활성화, 증식 및/또는 분화시키기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시 형태에서는, 전술한 방법에 의해 얻어지는, T 세포를 제공한다.
상기한 방법에 의해 얻어진 T 세포를, 질환(예를 들어, 암, 자기 면역 질환, 알레르기성 질환 등)을 처치 및/또는 예방하기 위해서, 피검체에 투여해도 된다.
실시예
이하, 실시예를 사용하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 이들 실시예는, 본 발명의 범위를 전혀 한정하는 것은 아니다.
플라스미드의 조제 1
pCAG-puro 벡터를 사용하여, 항원을 막 외에 제시 가능한 MHC 클래스 I 분자를 세포 외 소포의 막 상에 발현시키기 위한 벡터를 제작하였다.
확립된 클로닝 기술에 의해, β2 마이크로글로불린의 시그널 펩티드(아미노산 1 내지 20; 서열 번호 1)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 2), 모델 항원 펩티드인 OVA 펩티드(서열 번호 3)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 4), 펩티드 링커(아미노산 서열: 서열 번호 5, 폴리뉴클레오티드: 서열 번호 6), 시그널 펩티드를 제외한 β2 마이크로글로불린의 전체 길이 서열(아미노산 21 내지 119; 서열 번호 7)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 8), 펩티드 링커(서열 번호 11)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 12), 및 시그널 펩티드를 제외한 MHC 클래스 Iα쇄의 전체 길이 서열(아미노산 22 내지 369; 서열 번호 9)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 10)를 포함하는, 싱글 체인 트라이머(sc-Trimer)를 제작했다(아미노산 서열: 서열 번호 13; 폴리뉴클레오티드: 서열 번호 14). 이어서, sc-Trimer와 테트라스파닌인 CD81의 전체 길이 서열(아미노산 1 내지 236; 서열 번호 15)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 16)를 연결한 폴리뉴클레오티드(서열 번호 18; 대응하는 아미노산 서열: 서열 번호 17)를 pCAG-puro 벡터에 삽입했다(도 1a, 1b: 이하, sc-Trimer-CD81).
마찬가지의 방법에 의해, T 세포 공자극 분자의 하나인 CD80을 세포 외 소포의 막 상에 발현시키기 위해서, CD80의 전체 길이 서열(아미노산 1 내지 306; 서열 번호 19)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 20)와 테트라스파닌인 CD9의 전체 길이 전체 길이 서열(아미노산 1 내지 306; 서열 번호 21)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 22)를 연결한 폴리뉴클레오티드(서열 번호 24; 대응하는 아미노산 서열: 서열 번호 23)를 pCAG-puro 또는 pMX 벡터에 삽입했다(도 1c, 1d: 이하, CD80-CD9).
마찬가지의 방법에 의해, T 세포 자극성 사이토카인의 하나인 IL-2를 세포 외 소포의 막 상에 발현시키기 위해서, IL-2의 시그널 펩티드를 제외한 전체 길이 서열(아미노산 21 내지 169; 서열 번호 25)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 26)를 테트라스파닌인 마우스 CD63(아미노산 1 내지 238: 서열 번호 27; 폴리뉴클레오티드: 서열 번호 28)의 대형 세포 외 루프 중에 어떤 아미노산 170C와 171I의 사이에 삽입했다(즉, 서열 번호 57의 CD63의 부분 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 58)와, 서열 번호 59의 CD63의 부분 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 60) 사이에, IL-2의 서열을 삽입했다). 또한, IL-2의 N 말단측 및 C 말단측에는 각각, 펩티드 링커(아미노산 서열 GGGGS: 서열 번호 29)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 30)를 부가하였다. 이 폴리뉴클레오티드(서열 번호 32; 대응하는 아미노산 서열: 서열 번호 31)를 pCAG-puro 벡터에 삽입했다(도 1e, 1f: 이하, CD63-IL-2).
플라스미드의 조제 2:
pCAG-puro 벡터를 사용하여, 항원을 막 외에 제시 가능한 MHC 클래스 II 분자를 세포 외 소포의 막 상에 발현시키기 위한 벡터를 제작하였다.
확립된 클로닝 기술에 의해, MHC 클래스 IIβ쇄의 시그널 펩티드(아미노산 1 내지 27; 서열 번호 33)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 34), 모델 항원 펩티드인 OVA 펩티드(서열 번호 35)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 36) 및 시그널 펩티드를 제외한 MHC 클래스 IIβ쇄의 전체 길이 서열(아미노산 28 내지 265; 서열 번호 37)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 38)를 펩티드 링커(서열 번호 39)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 40)로 연결하여, 싱글 체인 다이머(sc-Dimer)를 제작했다(아미노산 서열: 서열 번호 41; 폴리뉴클레오티드: 서열 번호 42). 이어서, sc-Dimer와 테트라스파닌인 CD81의 전체 길이 서열(아미노산 1 내지 236; 서열 번호 15)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 16)를 연결한 폴리뉴클레오티드(서열 번호 44; 대응하는 아미노산 서열: 서열 번호 43)를 pCAG-puro 벡터에 삽입했다(도 1g, 1h: 이하, sc-Dimer-CD81).
MHC 클래스 II 분자의 구성 요소인 MHC 클래스 IIα쇄의 전체 길이 서열(아미노산 1 내지 256; 서열 번호 45)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 46&)를 다른 pCAG-puro 벡터에 삽입했다(도 1i: 이하, MHC 클래스 IIα쇄).
마찬가지의 방법에 의해, T 세포 자극성 사이토카인의 하나인 TGF-β1을 세포 외 소포의 막 상에 발현시키기 위해서, LAP 도메인에 33, 223, 225번째의 3개의 C를 S로 변경한 TGF-β1의 전체 길이 서열(아미노산 1 내지 390; 서열 번호 47)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 48)와, 89번째의 D를 E로 변경한 MFG-E8의 시그널 펩티드를 제외한 전체 길이 서열(아미노산 23 내지 463; 서열 번호 49)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 50)를 펩티드 링커(서열 번호 29)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 30)를 통하여 연결시켰다. 이 폴리뉴클레오티드(서열 번호 52; 대응하는 아미노산 서열: 서열 번호 51)를 pCAG-puro 벡터에 삽입했다(도 1j, 1k: 이하, TGF-β-MFG-E8).
마찬가지의 방법에 의해, T 세포 자극성 사이토카인의 하나인 IL-4를 세포 외 소포의 막 상에 발현시키기 위해서, IL-4의 시그널 펩티드를 제외한 전체 길이 서열(아미노산 21 내지 140; 서열 번호 53)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 54)를 테트라스파닌인 마우스 CD81(아미노산 1 내지 236: 서열 번호 15; 폴리뉴클레오티드: 서열 번호 16)의 대형 세포 외 루프 중에 어떤 아미노산 177S와 178G의 사이에 삽입했다(즉, 서열 번호 61의 CD81의 부분 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 62)와, 서열 번호 63의 CD81의 부분 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 64) 사이에, IL-4의 서열을 삽입했다). 또한, IL-4의 N 말단측 및 C 말단측에는 각각, 펩티드 링커(아미노산 서열 GGGGS; 서열 번호 29)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 30)를 부가하였다. 이 폴리뉴클레오티드(서열 번호 56; 대응하는 아미노산 서열: 서열 번호 55)를 pCAG-puro 벡터에 삽입했다(도 1l, 1m: 이하, CD81-IL-4).
플라스미드의 조제 3:
sc-Dimer-CD81-IL-12p40
상기 sc-Dimer에, CD81과 T 세포 자극성 사이토카인인 IL-12의 서브유닛인 IL-12p40을 융합시킨 단백질(서열 번호 91)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 92)를 pCAG-puro 벡터에 삽입하여, 융합 단백질을 발현하는 벡터를 조제하였다.
IL-12p35
IL-12의 또하나의 서브유닛인 IL-12p35(서열 번호 97)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 98)를 pCAG-puro 또는 pMX 벡터에 삽입하여, 에 삽입하여, IL-12p35를 발현하는 벡터를 조제하였다.
CD81-IL-6
T 세포 자극성 사이토카인의 하나인 IL-6을 세포 외 소포의 막 상에 발현시키기 위해서, IL-6의 시그널 펩티드를 제외한 전체 길이 서열(서열 번호 99)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 100)를 테트라스파닌인 CD81의 세포 외 루프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중에 도입하고, CD81-IL-6 융합 단백질(서열 번호 101)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 102)를 pCAG-puro 또는 pMX 벡터에 삽입하여, 에 삽입하여, 융합 단백질을 발현하는 벡터를 조제하였다.
hCD80-hCD9
T 세포 공자극 분자의 하나인 인간 CD80을 세포 외 소포의 막 상에 발현시키기 위해서, 인간 CD80과, 테트라스파닌인 인간 CD9의 융합 단백질(서열 번호 107)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 108)를 pCAG-puro 또는 pMX 벡터에 삽입하여, 융합 단백질을 발현하는 벡터를 조제하였다.
sc-Trimer-CD81-IL-2
T 세포 자극성 사이토카인의 하나인 IL-2를 세포 외 소포의 막 상에 발현시키기 위해서, 상기 CD81-IL-4와 마찬가지로, CD81-IL2의 융합 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제작하고, 그 폴리뉴클레오티드 서열과 sc-Trimer-을 코딩하는 뉴클레오티드를 결합하고, sc-Trimer-CD81-IL-2(서열 번호 135)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 136)를 제작하고, pCAG-puro 또는 pMX 벡터에 삽입하여, 융합 단백질을 발현하는 벡터를 조제하였다.
hsc-Trimer-hCD81
상기 sc-Trimer-CD81을 인간의 유전자 서열(MHC-I의 서열로서 HLA-A2402를 사용했다)을 사용하여, hsc-Trimer-hCD81(서열 번호 131)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 132)를 제작하고, pCAG-puro 또는 pMX 벡터에 삽입하여, 융합 단백질을 발현하는 벡터를 조제하였다.
SARS-CoV2sc-Trimer-hCD81
SARS-CoV-2 펩티드(아미노산 서열: 서열 번호 141; 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 142)를 항원으로 하고, MHC 분자로서 HLA-A0201을 사용하여, 항원 제시 MHC 분자(SARS-CoV2sc-Trimer; 아미노산 서열: 서열 번호 147)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 148)를 제작하고, 또한 hCD81을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 결합시켜서, SARS-CoV2sc-Trimer-hCD81(서열 번호 149)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 150)를 제작하였다. 제작한 폴리뉴클레오티드를 pCAG-puro 또는 pMX 벡터에 삽입하여, 융합 단백질을 발현하는 벡터를 조제하였다.
hCD63-hIL-2
상기 CD63-IL-2를, 인간 유전자 서열을 사용하여 제작하였다. hCD63-hIL-2(서열 번호 115)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 116)를 제작하고, pCAG-puro 또는 pMX 벡터에 삽입하여, 융합 단백질을 발현하는 벡터를 조제하였다.
CD63-Akaluc
음성 대조로서, CD63과 Akaluc 루시페라아제를 융합시켜, 세포 외 소포에 AlkaLuc 융합 단백질(서열 번호 139)을 국재시키기 위한 폴리뉴클레오티드(서열 번호 140)를 제작하고, pCAG-puro 또는 pMX 벡터에 삽입하여, 융합 단백질을 발현하는 벡터를 조제하였다.
플라스미드의 조제 4:
HLADR-1sc-TPI1-hCD81,
HLA DR1β쇄의 시그널 서열(아미노산 서열: 서열 번호 151; 폴리뉴클레오티드 서열: 번호 152)과 TPI-1 펩티드의 서열(아미노산 서열: 서열 번호 153; 폴리뉴클레오티드 서열: 번호 154)과 HLA DR1β쇄의 서열(아미노산 서열: 서열 번호 155; 폴리뉴클레오티드 서열: 번호 156)을 결합하고, TPI-1 펩티드를 제시하는 HLA DR1β쇄를 코딩하는 서열을 제작하였다. 그 서열에 hCD81의 서열(아미노산 서열: 서열 번호 159; 폴리뉴클레오티드 서열: 번호 160)을 연결시켰다. 또한 P2A 서열(아미노산 서열: 서열 번호 161; 폴리뉴클레오티드 서열: 번호 162)을 통해, HLA DR1α쇄의 서열(아미노산 서열: 서열 번호 163; 폴리뉴클레오티드 서열: 번호 164)을 결합시켜, 세포 외 소포의 막 외에 TPI-1 펩티드를 제시하기 위한 폴리뉴클레오티드를 제작하였다. 제작한 폴리뉴클레오티드를 pCAG-puro 또는 pMX 벡터에 삽입하고, 융합 단백질 HLADR-1sc-TPI1-hCD81(아미노산 서열: 서열 번호 165; 폴리뉴클레오티드 서열: 번호 166)을 발현하는 벡터를 조제하였다. 이러한 서열로부터 전사된 mRNA로부터, 2A 펩티드인 P2A의 작용에 의해, TPI-1 펩티드를 제시하는 HLA DR1β쇄와 hCD81의 융합 단백질과 HLA DR1α쇄가 번역되고, 양자가 결합되어, 세포 외 소포의 막에 TPI-1 펩티드를 제시하는 MHC 분자가 존재하게 된다.
hIL-12sc-MFGe8
IL-12β 서브유닛을 코딩하는 서열(아미노산 서열: 서열 번호 167; 폴리뉴클레오티드 서열: 번호 167)에 링커의 서열(아미노산 서열: 서열 번호 169; 폴리뉴클레오티드 서열: 번호 170)을 통해 IL-12β 서브유닛을 코딩하는 서열(아미노산 서열: 서열 번호 171; 폴리뉴클레오티드 서열: 번호 172)을 연결시켜, IL-12를 코딩하는 서열을 제작하고, 그 서열을 링커의 서열(아미노산 서열: 서열 번호 173; 폴리뉴클레오티드 서열: 번호 174)을 통해 MFGe8의 서열(아미노산 서열: 서열 번호 175; 폴리뉴클레오티드 서열: 번호 176)을 연결하고, IL-12를 세포 외 소포에 발현시키기 위한 폴리뉴클레오티드를 제작하였다. 제작한 폴리뉴클레오티드를 pCAG-puro 또는 pMX 벡터에 삽입하고, 융합 단백질hIL-12sc-MFGe8(아미노산 서열: 서열 번호 177; 폴리뉴클레오티드 서열: 번호 178)을 발현하는 벡터를 조제하였다.
TPI-1 펩티드 특이적 TCR과 Venus의 융합 단백질
TPI 특이적 TCRβ쇄의 서열(아미노산 서열: 서열 번호 179; 폴리뉴클레오티드 서열: 번호 180)을 P2A의 서열(아미노산 서열: 서열 번호 181; 폴리뉴클레오티드 서열: 번호 182)을 통해 TCRα의 서열(아미노산 서열: 서열 번호 183; 폴리뉴클레오티드 서열: 번호 184)에 연결하고, 또한 그 3단측에 P2A의 서열(아미노산 서열: 서열 번호 185; 폴리뉴클레오티드 서열: 번호 186)을 통해 Venus 형광 단백질의 서열(아미노산 서열: 서열 번호 187; 폴리뉴클레오티드 서열: 번호 188)을 연결하여 TPI-1 펩티드 특이적 TCR과 Venus의 융합 단백질(아미노산 서열: 서열 번호 189; 폴리뉴클레오티드 서열: 번호 190)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제작하였다. 제작한 폴리뉴클레오티드를 pCAG-puro 또는 pMX 벡터에 삽입하고, TPI-1 펩티드 특이적 TCR과 Venus의 융합 단백질을 발현하는 벡터를 조제하였다.
플라스미드의 조제 5:
sc-Trimer-T2A-IL-2-CD8-P2A-CD80
pET-15b 벡터를 사용하여, 세포막 상에 항원 제시 MHC 클래스 I 분자, IL-2 및 CD80을 발현시키기 위한 mRNA의 제작용의 벡터를 제작하였다.
상기와 마찬가지의 방법으로 제작한 sc-Trimer의 서열(아미노산 서열: 서열 번호 191; 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 192)과;
T2A의 서열(아미노산 서열: 서열 번호 193, 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 194);
IL-2를 세포막 상에 발현시키기 위한 융합 단백질이며, IL-2(아미노산 서열: 서열 번호 195, 폴리뉴클레오티드: 서열 번호 196)와 링커 서열(아미노산 서열: 서열 번호 197, 폴리뉴클레오티드: 서열 번호 198)과 CD8의 부분 서열(막관통 도메인을 포함한다; 아미노산 서열: 서열 번호 199, 폴리뉴클레오티드: 서열 번호 200)의 융합 단백질을 코딩하는 서열;
P2A의 서열(아미노산 서열: 서열 번호 201, 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 202); 및
CD80을 코딩하는 서열(아미노산 서열: 서열 번호 203, 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 204)
을 연결시켜 sc-Trimer-T2A-IL-2-CD8-P2A-CD80을 코딩하는 서열(아미노산 서열: 서열 번호 205, 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 206)을 제작하였다(도 1p). 이러한 서열로부터 전사된 mRNA로부터, 2A 펩티드인 T2A와 P2A의 작용에 의해, sc-Trimer를 포함하는 막 단백질, IL-2-CD8을 포함하는 막 단백질, 및 CD80을 포함하는 막 단백질이 번역되어, 1개의 세포의 세포막 상에 존재하게 된다.
대조로서, CD81(아미노산 서열: 서열 번호 207, 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 208)을 코딩하는 mRNA를 전사하는 플라스미드; 완전 길이의 OVA의 아미노산 서열: 서열 번호 209, 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 210)만을 코딩하는 mRNA를 전사하는 플라스미드를 제작하였다.
플라스미드의 조제 6:
sc-Trimer-T2A-IL-15sa-P2A-CD80
세포막 상에 항원 제시 MHC 클래스 I 분자, IL-15 슈퍼아고니스트(이하 IL-15sa: IL-15와 IL-15 수용체의 sushi 도메인의 복합체), 및 CD80을 발현시키기 위한 mRNA의 제작용의 발현 벡터를 제작하였다.
상기와 마찬가지의 방법으로, N단으로부터
β2 마이크로글로불린의 시그널 펩티드(아미노산 서열: 서열 번호 215; 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 216);
OVA 펩티드(아미노산 서열: 서열 번호 217; 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 218);
링커(아미노산 서열: 서열 번호 219; 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 220);
시그널 펩티드를 제거한 β2 마이크로글로불린(아미노산 서열: 서열 번호 221; 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 222);
링커(아미노산 서열: 서열 번호 223; 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 224);
MHC 클래스 Iα쇄(시그널 펩티드 제거)(아미노산 서열: 서열 번호 225; 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 226);
T2A의 서열(아미노산 서열: 서열 번호 227; 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 228);
TfR(트랜스페린 수용체 1)의 N단 펩티드(아미노산 서열: 서열 번호 229; 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 230);
링커(아미노산 서열: 서열 번호 231; 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 232);
IL-15Rα sushi 도메인(아미노산 서열: 서열 번호 233; 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 234);
링커(아미노산 서열: 서열 번호 235; 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 236);
IL-15(아미노산 서열: 서열 번호 237; 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 238);
FLAG(아미노산 서열: 서열 번호 239; 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 240);
P2A의 서열(아미노산 서열: 서열 번호 241; 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 242); 및
CD80(아미노산 서열: 서열 번호 243; 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 244)을 이 순번으로 연결하고, sc-Trimer-T2A-IL-15sa-P2A-CD80을 코딩하는 서열(아미노산 서열: 서열 번호 245, 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 246)을 제작하였다(도 24의 (a)). 이러한 서열로부터 전사된 mRNA로부터, 2A 펩티드인 T2A와 P2A의 작용에 의해, sc-Trimer를 포함하는 막 단백질, IL-15sa를 포함하는 막 단백질(2형 막 관통 단백질인 TfR의 작용에 의해, C말측에 융합된 IL-15sa가 세포막 표면에 제시된다), 및 CD80을 포함하는 막 단백질이 번역되어, 1개의 세포의 세포막 상에 존재하게 된다.
플라스미드의 조제 7:
OVA 펩티드 대신에, 네오안티겐(암 항원)인 Gtf2i 펩티드(아미노산 서열: 서열 번호 279, 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 280; 비특허문헌 3)를 제시하는 sc-Trimer(Gtf2i)-T2A-IL-2-CD8-P2A-CD80을 코딩하는 서열을 제작하였다(아미노산 서열: 서열 번호 281, 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 282)(도 24의 (b)).
플라스미드의 조제 8:
OVAp-MHCIIβ-P2A-MHCIIα-T2A-IL-12sc-CD8-P2A-CD80
세포막 상에 항원 제시 MHC 클래스 II 분자, IL-12sc 및 CD80을 발현시키기 위한 mRNA의 제작용의 발현 벡터를 제작하였다.
상기와 마찬가지의 방법으로, N단으로부터
MHC 클래스 IIβ쇄의 시그널 펩티드(아미노산 서열: 서열 번호 247; 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 248);
OVA 펩티드(아미노산 서열: 서열 번호 249; 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 250);
링커(아미노산 서열: 서열 번호 251; 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 252);
MHC 클래스 IIβ쇄(시그널 펩티드 제거)(아미노산 서열: 서열 번호 253; 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 254);
P2A(아미노산 서열: 서열 번호 255; 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 256);
MHC 클래스 IIα쇄(아미노산 서열: 서열 번호 257; 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 258);
T2A(아미노산 서열: 서열 번호 259; 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 260);
IL-12β(아미노산 서열: 서열 번호 261; 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 262);
링커(아미노산 서열: 서열 번호 263; 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 264);
IL-12α(아미노산 서열: 서열 번호 265; 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 266);
링커(아미노산 서열: 서열 번호 267; 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 268);
FLAG(아미노산 서열: 서열 번호 269; 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 270);
CD8의 막 관통 도메인(아미노산 서열: 서열 번호 271; 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 272);
P2A(아미노산 서열: 서열 번호 273; 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 274); 및
CD80(아미노산 서열: 서열 번호 275; 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 276)을 이 순번으로 연결하고, OVAp-MHCIIβ-P2A-MHCIIα-T2A-IL-12sc-CD8-P2A-CD80을 코딩하는 서열(아미노산 서열: 서열 번호 277, 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 278)을 제작하였다(도 24의 (c)). 이러한 서열로부터 전사된 mRNA로부터, 2A 펩티드인 T2A와 P2A의 작용에 의해, OVA 펩티드 항원을 막 외에 제시 가능한 MHC 클래스 II 분자, IL-12를 포함하는 막 단백질, 및 CD80을 포함하는 막 단백질이 번역되어, 1개의 세포의 세포막 상에 존재하게 된다.
플라스미드의 조제 9:
OVA 펩티드 대신에, 네오안티겐(암 항원)인 RPL18 펩티드(아미노산 서열: 서열 번호 283, 폴리뉴클레오티드 서열: 서열 번호 284; 비특허문헌 3)를 도입하여 sc-Trimer(RPL18 펩티드)-CD81-IL-2를 코딩하는 서열을 제작하였다(도 24의 (d)).
실시예에서 사용한 각 서열을, 이하의 표 1 내지 21에 나타낸다. 또한, 각 서열에 있어서의 밑줄 부분은, 시그널 펩티드를 나타낸다.
[표 1-1]
[표 1-2]
[표 1-3]
[표 1-4]
[표 1-5]
[표 1-6]
[표 2-1]
[표 2-2]
[표 2-3]
[표 3-1]
[표 3-2]
[표 3-3]
[표 4-1]
[표 4-2]
[표 4-3]
[표 4-4]
[표 5-1]
[표 5-2]
[표 5-3]
[표 5-4]
[표 6-1]
[표 6-2]
[표 7-1]
[표 7-2]
[표 7-3]
[표 7-4]
[표 8-1]
[표 8-2]
[표 8-3]
[표 9-1]
[표 9-2]
[표 10-1]
[표 10-2]
[표 11-1]
[표 11-2]
[표 12-1]
[표 12-2]
[표 12-3]
[표 12-4]
[표 12-5]
[표 13-1]
[표 13-2]
[표 13-3]
[표 13-4]
[표 13-5]
[표 13-6]
[표 13-7]
[표 13-8]
[표 13-9]
[표 14-1]
Figure pct00050
[표 14-2]
Figure pct00051
[표 14-3]
[표 14-4]
[표 15-1]
Figure pct00054
[표 15-2]
Figure pct00055
[표 15-3]
Figure pct00056
[표 15-4]
Figure pct00057
[표 15-5]
Figure pct00058
[표 15-6]
Figure pct00059
[표 15-7]
Figure pct00060
[표 15-8]
Figure pct00061
[표 15-9]
Figure pct00062
[표 15-10]
Figure pct00063
[표 16-1]
Figure pct00064
[표 16-2]
Figure pct00065
[표 16-3]
Figure pct00066
[표 16-4]
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[표 16-5]
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[표 16-6]
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[표 17-1]
Figure pct00070
[표 17-2]
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[표 17-3]
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[표 17-4]
Figure pct00073
[표 18-1]
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[표 18-2]
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[표 18-3]
Figure pct00076
[표 19-1]
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[표 19-2]
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[표 19-3]
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[표 19-4]
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[표 19-5]
Figure pct00081
[표 20-1]
Figure pct00082
[표 20-2]
Figure pct00083
[표 20-3]
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[표 20-4]
Figure pct00085
[표 21-1]
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[표 21-2]
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[표 21-3]
Figure pct00088
엑소솜을 제거한 소태아 혈청의 조제
10mL의 비동화 처리 FBS와 2mL의 50％ 폴리(에틸렌글리콜)(Poly(ethylene glycol)) 10,000 용액(Sigma-Aldrich사제, #81280)을 4℃, 2시간 교반한 후에, 1500×g, 4℃, 30분간의 원심 조건에서 엑소솜을 침전시키고, 상청을 회수함으로써, 엑소솜을 제거한 소태아 혈청을 얻었다.
[실시예 1] MHC 클래스 I 분자 및 T 세포 자극성 사이토카인을 막에 포함하는 항원 제시 세포 외 소포
HEK293T 세포를 세포 배양 디쉬에 파종하고, 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지에서 배양하였다. 약 50％ 콘플루언스의 세포에, 제조업자의 지시에 따라서, 플라스미드(sc-Trimer-CD81, 및 CD63-IL-2를 각각 코딩하는 pCAG 벡터)를 Polyethylenimine"Max"(Polysciences사제)를 사용하여, 2개 동시에 형질 감염하였다. 형질 감염의 3시간 후에 배지를 교환하고, 형질 감염의 24시간 후에 엑소솜을 제거한 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지로 배지를 교환하였다. 형질 감염의 72시간 후, 상청을 회수하고, 해당 상청을 0.22㎛ 필터에 안내한 후, 300g으로 5분간 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 2,000g, 20분간, 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 10,000g, 30분간, 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 100,000g으로 2시간 원심 분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿을 PBS로 세정하였다. 펠릿에 PBS를 첨가하고, 100,000g으로 2시간, 원심 분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿을 100μL의 PBS로 현탁한 것을, 실시예 1의 항원 제시 세포 외 소포로서 사용했다(도 2a). 세포 외 소포의 농도는, BCA 단백질 정량 키트(Thermo Fisher Scientific사제)를 사용하여, 제조업자의 지시에 따라서 측정하였다.
[실시예 2] MHC 클래스 I 분자, T 세포 공자극 분자, 및 T 세포 자극성 사이토카인을 막에 포함하는 항원 제시 세포 외 소포
HEK293T 세포를 세포 배양 디쉬에 파종하고, 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지에서 배양하였다. 약 50％ 콘플루언스의 세포에, 제조업자의 지시에 따라서, 상기에서 조제한 플라스미드(sc-Trimer-CD81, CD80-CD9, 및 CD63-IL-2를 각각 코딩하는 pCAG 벡터)를 Polyethylenimine"Max"(Polysciences사제)를 사용하여, 3개 동시에 형질 감염하였다. 형질 감염의 3시간 후에 배지를 교환하고, 형질 감염의 24시간 후에 엑소솜을 제거한 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지로 배지를 교환하였다. 형질 감염의 72시간 후, 상청을 회수하고, 해당 상청을 0.22㎛ 필터에 안내한 후, 300g으로 5분간 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 2,000g, 20분간, 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 10,000g, 30분간, 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 100,000g으로 2시간 원심 분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿을 PBS로 세정하였다. 펠릿에 PBS를 첨가하고, 100,000g으로 2시간, 원심 분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿을 100μL의 PBS로 현탁한 것을, 실시예 2의 항원 제시 세포 외 소포로서 사용했다(도 2b). 항원 제시 세포 외 소포의 농도는, BCA 단백질 정량 키트(Thermo Fisher Scientific사제)를 사용하여, 제조업자의 지시에 따라서 측정하였다.
[실시예 3] MHC 클래스 II 분자, T 세포 공자극 분자, 및 T 세포 자극성 사이토카인을 막에 포함하는 항원 제시 세포 외 소포 1
HEK293T 세포를 세포 배양 디쉬에 파종하고, 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지에서 배양하였다. 약 50％ 콘플루언스의 세포에, 제조업자의 지시에 따라서, 상기에서 조제한 플라스미드(sc-Dimer-CD81, MHC 클래스 IIα쇄, CD80-CD9, 및 CD63-IL-2를 각각 코딩하는 pCAG 벡터)를 Polyethylenimine"Max"(Polysciences사제)를 사용하여, 4개 동시에 형질 감염하였다. 형질 감염의 3시간 후에 배지를 교환하고, 형질 감염의 24시간 후에 엑소솜을 제거한 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지로 배지를 교환하였다. 형질 감염의 72시간 후, 상청을 회수하고, 해당 상청을 0.22㎛ 필터에 안내한 후, 300g으로 5분간 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 2,000g, 20분간, 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 10,000g, 30분간, 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 100,000g으로 2시간 원심 분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿을 PBS로 세정하였다. 펠릿에 PBS를 첨가하고, 100,000g으로 2시간, 원심 분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿을 100μL의 PBS로 현탁한 것을, 실시예 3의 항원 제시 세포 외 소포로서 사용했다(도 2c). 항원 제시 세포 외 소포의 농도는, BCA 단백질 정량 키트(Thermo Fisher Scientific사제)를 사용하여, 제조업자의 지시에 따라서 측정하였다.
[실시예 4] MHC 클래스 II 분자, T 세포 공자극 분자, 및 T 세포 자극성 사이토카인을 막에 포함하는 항원 제시 세포 외 소포 2
HEK293T 세포를 세포 배양 디쉬에 파종하고, 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지에서 배양하였다. 약 50％ 콘플루언스의 세포에, 제조업자의 지시에 따라서, 플라스미드(sc-Dimer-CD81, MHC 클래스 IIα쇄, CD80-CD9, TGF-β-MFGE8, 및 CD63-IL-2를 각각 코딩하는 pCAG 벡터)를 Polyethylenimine"Max"(Polysciences사제)를 사용하여, 5개 동시에 형질 감염하였다. 형질 감염의 3시간 후에 배지를 교환하고, 형질 감염의 24시간 후에 엑소솜을 제거한 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지로 배지를 교환하였다. 형질 감염의 72시간 후, 상청을 회수하고, 해당 상청을 0.22㎛ 필터에 안내한 후, 300g으로 5분간 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 2,000g, 20분간, 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 10,000g, 30분간, 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 100,000g으로 2시간 원심 분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿을 PBS로 세정하였다. 펠릿에 PBS를 첨가하고, 100,000g으로 2시간, 원심 분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿을 100μL의 PBS로 현탁한 것을, 실시예 4의 항원 제시 세포 외 소포로서 사용했다(도 2d). 항원 제시 세포 외 소포의 농도는, BCA 단백질 정량 키트(Thermo Fisher Scientific사제)를 사용하여, 제조업자의 지시에 따라서 측정하였다.
[실시예 5] MHC 클래스 II 분자, T 세포 공자극 분자, 및 T 세포 자극성 사이토카인을 막에 포함하는 항원 제시 세포 외 소포 3
HEK293T 세포를 세포 배양 디쉬에 파종하고, 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지에서 배양하였다. 약 50％ 콘플루언스의 세포에, 제조업자의 지시에 따라서, 상기에서 조제한 플라스미드(sc-Dimer-CD81, MHC 클래스 IIα쇄, CD80-CD9, 및 CD81-IL-4를 각각 코딩하는 pCAG 벡터)를 Polyethylenimine"Max"(Polysciences사제)를 사용하여, 4개 동시에 형질 감염하였다. 형질 감염의 3시간 후에 배지를 교환하고, 형질 감염의 24시간 후에 엑소솜을 제거한 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지로 배지를 교환하였다. 형질 감염의 72시간 후, 상청을 회수하고, 해당 상청을 0.22㎛ 필터에 안내한 후, 300g으로 5분간 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 2,000g, 20분간, 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 10,000g, 30분간, 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 100,000g으로 2시간 원심 분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿을 PBS로 세정하였다. 펠릿에 PBS를 첨가하고, 100,000g으로 2시간, 원심 분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿을 100μL의 PBS로 현탁한 것을, 실시예 5의 항원 제시 세포 외 소포로서 사용했다(도 2e). 항원 제시 세포 외 소포의 농도는, BCA 단백질 정량 키트(Thermo Fisher Scientific사제)를 사용하여, 제조업자의 지시에 따라서 측정하였다.
[참고예 1] 컨트롤 세포 외 소포
HEK293T 세포를 세포 배양 디쉬에 파종하고, 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지에서 배양하였다. 약 50％ 콘플루언스의 세포에 배지를 교환하고, 24시간 후에 엑소솜을 제거한 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지로 배지를 교환하였다. 엑소솜을 제거한 해당 배지에 교환한 48시간 후, 상청을 회수하고, 해당 상청을 0.22㎛ 필터에 안내한 후, 300g으로 5분간 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 2,000g, 20분간, 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 10,000g, 30분간, 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 100,000g으로 2시간 원심 분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿을 PBS로 세정하였다. 펠릿에 PBS를 첨가하고, 100,000g으로 2시간, 원심 분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿을 100μL의 PBS로 현탁한 것을, 참고예 1의 세포 외 소포로서 사용하였다. 항원 제시 세포 외 소포의 농도는, BCA 단백질 정량 키트(Thermo Fisher Scientific사제)를 사용하여, 제조업자의 지시에 따라서 측정하였다.
[참고예 2] MHC 클래스 I 분자를 막에 포함하는 세포 외 소포
HEK293T 세포를 세포 배양 디쉬에 파종하고, 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지에서 배양하였다. 약 50％ 콘플루언스의 세포에, 제조업자의 지시에 따라서, 플라스미드(sc-Trimer-CD81을 코딩하는 pCAG 벡터)를 Polyethylenimine"Max"(Polysciences사제)를 사용하여, 형질 감염하였다. 형질 감염의 3시간 후에 배지를 교환하고, 형질 감염의 24시간 후에 엑소솜을 제거한 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지로 배지를 교환하였다. 형질 감염의 72시간 후, 상청을 회수하고, 해당 상청을 0.22㎛ 필터에 안내한 후, 300g으로 5분간 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 2,000g, 20분간, 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 10,000g, 30분간, 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 100,000g으로 2시간 원심 분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿을 PBS로 세정하였다. 펠릿에 PBS를 첨가하고, 100,000g으로 2시간, 원심 분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿을 100μL의 PBS로 현탁한 것을, 참고예 2의 세포 외 소포로서 사용하였다. 세포 외 소포의 농도는, BCA 단백질 정량 키트(Thermo Fisher Scientific사제)를 사용하여, 제조업자의 지시에 따라서 측정하였다.
[참고예 3] T 세포 공자극 분자를 막에 포함하는 세포 외 소포
HEK293T 세포를 세포 배양 디쉬에 파종하고, 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지에서 배양하였다. 약 50％ 콘플루언스의 세포에, 제조업자의 지시에 따라서, 플라스미드(CD80-CD9를 코딩하는 pCAG 벡터)를 Polyethylenimine"Max"(Polysciences사제)를 사용하여, 형질 감염하였다. 형질 감염의 3시간 후에 배지를 교환하고, 형질 감염의 24시간 후에 엑소솜을 제거한 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지로 배지를 교환하였다. 형질 감염의 72시간 후, 상청을 회수하고, 해당 상청을 0.22㎛ 필터에 안내한 후, 300g으로 5분간 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 2,000g, 20분간, 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 10,000g, 30분간, 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 100,000g으로 2시간 원심 분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿을 PBS로 세정하였다. 펠릿에 PBS를 첨가하고, 100,000g으로 2시간, 원심 분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿을 100μL의 PBS로 현탁한 것을, 참고예 3의 세포 외 소포로서 사용하였다. 세포 외 소포의 농도는, BCA 단백질 정량 키트(Thermo Fisher Scientific사제)를 사용하여, 제조업자의 지시에 따라서 측정하였다.
[참고예 4] T 세포 자극성 사이토카인을 막에 포함하는 세포 외 소포
HEK293T 세포를 세포 배양 디쉬에 파종하고, 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지에서 배양하였다. 약 50％ 콘플루언스의 세포에, 제조업자의 지시에 따라서, 플라스미드(CD63-IL-2를 코딩하는 pCAG 벡터)를 Polyethylenimine"Max"(Polysciences사)를 사용하여, 형질 감염하였다. 형질 감염의 3시간 후에 배지를 교환하고, 형질 감염의 24시간 후에 엑소솜을 제거한 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지로 배지를 교환하였다. 형질 감염의 72시간 후, 상청을 회수하고, 해당 상청을 0.22㎛ 필터에 안내한 후, 300g으로 5분간 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 2,000g, 20분간, 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 10,000g, 30분간, 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 100,000g으로 2시간 원심 분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿을 PBS로 세정하였다. 펠릿에 PBS를 첨가하고, 100,000g으로 2시간, 원심 분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿을 100μL의 PBS로 현탁한 것을, 참고예 4의 세포 외 소포로서 사용하였다. 세포 외 소포의 농도는, BCA 단백질 정량 키트(Thermo Fisher Scientific사제)를 사용하여, 제조업자의 지시에 따라서 측정하였다.
[참고예 5] MHC 클래스 I 분자 및 T 세포 공자극 분자를 막에 포함하는 세포 외 소포
HEK293T 세포를 세포 배양 디쉬에 파종하고, 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지에서 배양하였다. 약 50％ 콘플루언스의 세포에, 제조업자의 지시에 따라서, 플라스미드(sc-Trimer-CD81, 및 CD80-CD9를 각각 코딩하는 pCAG 벡터)를 Polyethylenimine"Max"(Polysciences사제)를 사용하여, 2개 동시에 형질 감염하였다. 형질 감염의 3시간 후에 배지를 교환하고, 형질 감염의 24시간 후에 엑소솜을 제거한 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지로 배지를 교환하였다. 형질 감염의 72시간 후, 상청을 회수하고, 해당 상청을 0.22㎛ 필터에 안내한 후, 300g으로 5분간 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 2,000g, 20분간, 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 10,000g, 30분간, 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 100,000g으로 2시간 원심 분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿을 PBS로 세정하였다. 펠릿에 PBS를 첨가하고, 100,000g으로 2시간, 원심 분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿을 100μL의 PBS로 현탁한 것을, 참고예 5의 세포 외 소포로서 사용하였다. 세포 외 소포의 농도는, BCA 단백질 정량 키트(Thermo Fisher Scientific사제)를 사용하여, 제조업자의 지시에 따라서 측정하였다.
시험예 1-1: 세포 외 소포의 막에 포함되는 융합 단백질의 플로 사이토메트리 해석
실시예 2의 항원 제시 세포 외 소포를, PS Capture(상표) 엑소솜 플로 사이토메트리 키트(후지 필름 와코준야쿠 가부시키가이샤제)에 의해, 제조업자의 지시에 따라서 면역 염색을 행하였다. 염색에 사용한 항체는 이하와 같다(염색 시간: 15분, 온도: 4℃). 염색 후, 각 융합 단백질의 발현을, 플로 사이토미터 FACSCantoII(BD 바이오사이언시즈사제)로 검출하였다.
·APC 콘쥬게이트 항마우스 H-2KbOVA 복합체 항체(25-D1.16 Biolegend사제)
·PE 콘쥬게이트 항마우스 CD80 항체(16-10A1 Biolegend사제)
·Brilliant Violet421 콘쥬게이트 항마우스 IL-2 항체(JES6-5H4 Biolegend사제)
결과를 도 3a에 도시하였다.
[결과]
시험예 1-1의 결과로부터, 실시예 2의 항원 제시 세포 외 소포는, 그 막에, OVA 항원을 제시하는 MHC 클래스 I 분자, CD80, 및 IL-2를 포함함을 알 수 있다(도 3a).
시험예 1-2: 세포 외 소포의 막에 포함되는 융합 단백질의 플로 사이토메트리 해석
실시예 3의 항원 제시 세포 외 소포를, PS Capture(상표) 엑소솜 플로 사이토메트리 키트(후지 필름 와코준야쿠 가부시키가이샤제)에 의해, 제조업자의 지시에 따라서 면역 염색을 행하였다. 염색에 사용한 항체는 이하와 같다. 염색 후, 각 융합 단백질의 발현을, 플로 사이토미터 FACSCantoII(BD 바이오사이언시즈사제)로 검출하였다.
·APC 콘쥬게이트 항마우스 IL-2 항체(JES6-5H4 Biolegend사제)
·PE 콘쥬게이트 항마우스 CD80 항체(16-10A1 Biolegend사제)
·APC-Cy7 콘쥬게이트 항마우스 I-A/I-E 항체(M5/114.15.2 Biolegend사제)
결과를 도 3b에 도시하였다.
[결과]
시험예 1-2의 결과로부터, 실시예 3의 항원 제시 세포 외 소포는, 그 막에, OVA 항원을 제시하는 MHC 클래스 II 분자, CD80, 및 IL-2를 포함함을 알 수 있다(도 3b).
시험예 1-3: 세포 외 소포의 막에 포함되는 융합 단백질의 플로 사이토메트리 해석
실시예 4의 항원 제시 세포 외 소포를, PS Capture(상표) 엑소솜 플로 사이토메트리 키트(후지 필름 와코준야쿠 가부시키가이샤제)에 의해, 제조업자의 지시에 따라서 면역 염색을 행하였다. 염색에 사용한 항체는 이하와 같다. 염색 후, 각 융합 단백질의 발현을, 플로 사이토미터 FACSCantoII(BD 바이오사이언시즈사제)로 검출하였다.
·APC 콘쥬게이트 항마우스 IL-2 항체(JES6-5H4 Biolegend사제)
·PE 콘쥬게이트 항마우스 CD80 항체(16-10A1 Biolegend사제)
·APC-Cy7 콘쥬게이트 항마우스 I-A/I-E 항체(M5/114.15.2 Biolegend사제)
·APC 콘쥬게이트 항마우스 LAP(TGF-β1) 항체(TW7-16B4 Biolegend사제)
결과를 도 3c에 도시하였다.
[결과]
시험예 1-3의 결과로부터, 실시예 4의 항원 제시 세포 외 소포는, 그 막에, OVA 항원을 제시하는 MHC 클래스 II 분자, CD80, IL-2, 및 TGF-β1을 포함함을 알 수 있다(도 3c).
시험예 1-4: 세포 외 소포의 막에 포함되는 융합 단백질의 플로 사이토메트리 해석
실시예 5의 항원 제시 세포 외 소포를, PS Capture(상표) 엑소솜 플로 사이토메트리 키트(후지 필름 와코준야쿠 가부시키가이샤제)에 의해, 제조업자의 지시에 따라서 면역 염색을 행하였다. 염색에 사용한 항체는 이하와 같다. 염색 후, 각 융합 단백질의 발현을, 플로 사이토미터 FACSCantoII(BD 바이오사이언시즈사제)로 검출하였다.
·Alexa Fluor 488 콘쥬게이트 항마우스 IL-4 항체(11B11 Biolegend사제)
·PE 콘쥬게이트 항마우스 CD80 항체(16-10A1 Biolegend사제)
·APC-Cy7 콘쥬게이트 항마우스 I-A/I-E 항체(M5/114.15.2 Biolegend사제)
결과를 도 3d에 도시하였다.
[결과]
시험예 1-4의 결과로부터, 실시예 5의 항원 제시 세포 외 소포는, 그 막에, OVA 항원을 제시하는 MHC 클래스 II 분자, CD80, 및 IL-4를 포함함을 알 수 있다(도 3d).
시험예 2: 시험관 내에 있어서의, 항원 제시 세포 외 소포에 의한 OVA 특이적 CD8 양성 T 세포(OT-1 T 세포)의 활성화 실험
항원 제시 세포 외 소포가 항원 특이적 CD8 양성 T 세포를 활성화하거나 하는지의 여부를 조사하기 위해서, 시험관 내에 있어서 이하의 시험을 실시하였다.
OVA 반응성 TCR 트랜스제닉 마우스인 OT-1 마우스로부터 적출한 림프절을 100㎛ 필터 상에서 파쇄하여, 림프절 세포 현탁액을 얻었다. 세포 현탁액을, 세포 증식 어세이 시약인 CellTrace Violet(Thermo Fisher Scientific사제)을 사용하여, 제조업자의 지시에 따라서 염색하였다. 염색한 림프절 세포 2×105개를, 10％ 소태아 혈청, 50μM 2-머캅토에탄올 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 RPMI1640 배지 200μL에 현탁하고, 실시예 1 또는 2의 항원 제시 세포 외 소포(최종 농도 3μg/mL), 혹은 참고예 2 내지 4의 3종류의 세포 외 소포의 혼합물(3종류의 세포 외 소포의 각각의 최종 농도 3μg/mL) 또는 참고예 1, 2 또는 5의 세포 외 소포(최종 농도 3μg/mL)를 첨가하여, 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 3일간 배양한 후, 면역 염색을 행하였다. 염색에 사용한 항체는 이하와 같다(염색 시간: 15분, 온도: 4℃). 염색 후, OT-1 T 세포에 있어서의 세포 증식 어세이 시약인 CellTrace Violet의 발광 강도를 플로 사이토미터 FACSCantoII(BD 바이오사이언시즈사제)로 검출하였다.
·APC 콘쥬게이트 항마우스 CD8 항체(53-6.7 Biolegend사제)
·PE 콘쥬게이트 항마우스 TCR Vb5.1, 5.2 항체(MR9-4 Biolegend사제)
결과를 도 4에 나타낸다.
[결과]
시험예 2의 결과로부터, 실시예 1, 2의 항원 제시 세포 외 소포는, 참고예 2 내지 4의 3종의 세포 외 소포의 혼합물, 또는 참고예 1, 2, 5의 세포 외 소포와 비교하여, 항원 특이적 CD8 양성 T 세포를 현저하게 분화 및/또는 증식시켰다(도 4).
시험예 3: 생체 내에 있어서의, 항원 제시 세포 외 소포에 의한 OVA 특이적 CD8 양성 T 세포(OT-1 T 세포)의 활성화 실험
항원 제시 세포 외 소포가 항원 특이적 CD8 양성 T 세포를 활성화하거나 하는지의 여부를 조사하기 위해서, 생체 내에 있어서 이하의 시험을 실시하였다.
OVA 반응성 TCR 트랜스제닉 마우스인 OT-1 마우스로부터 림프절을 적출하고, 시험예 2와 마찬가지로 림프구 현탁액을 조제하였다. CD45.1 콘제닉 마우스로부터도 마찬가지로 림프절을 적출하여, 림프구 현탁액을 조제하였다. 각각의 림프구 현탁액을 1:1의 비율로 혼합하고, 세포 증식 어세이 시약인 CellTrace Violet를 사용하여 염색하였다. PBS에 현탁한 1×107개의 CellTrace Violet 염색한 혼합 림프구 현탁액을, CD45.1/CD45.2 콘제닉 마우스의 미(尾)정맥으로부터 이입하였다. 다음날, 실시예 2의 항원 제시 세포 외 소포 혹은 참고예 1의 세포 외 소포 50μg, 또는 1.5μg의 IL-2(Biolegend사제)와 50μg의 항 마우스 IL-2 항체(S4B6-1 Bio X Cell사제)의 혼합물(IL-2/항IL-2 항체 복합체)을 CD45.1/CD45.2 콘제닉 마우스에 미정맥으로부터 이입하였다. 세포 이입 4일 후, 레시피언트 마우스로부터 림프절을 적출하여, 림프구 현탁액을 조제하고, 면역 염색을 행하였다. 염색에 사용한 항체는 이하와 같다(염색 시간: 15분, 온도: 4℃). 염색 후, 이입한 OT-1 T 세포 및 야생형 CD8T 세포에 있어서의 세포 증식 어세이 시약인 CellTrace Violet의 발광 강도를 플로 사이토미터 FACSCantoII(BD 바이오사이언시즈사제)로 검출하였다.
·PE-Cy7 콘쥬게이트 항마우스 CD8 항체(53-6.7 Biolegend사제)
·PE 콘쥬게이트 항마우스 TCR Vb5.1, 5.2 항체(MR9-4 Biolegend사제)
·FITC 콘쥬게이트 항마우스 CD45.1 항체(A20 Biolegend사제)
·APC 콘쥬게이트 항마우스 CD45.2 항체(104 Biolegend사제)
결과를 도 5에 나타낸다.
[결과]
시험예 3의 결과로부터, 실시예 2의 항원 제시 세포 외 소포는, 참고예 1의 세포 외 소포와 비교하여, 생체 내에 있어서, 다른 CD8 양성 T 세포(항원 비특이적인 CD8 양성 T 세포)를 거의 활성화하거나 하지 않고, 항원 특이적 CD8 양성 T 세포를 현저하게 분화 및/또는 증식시킨 것을 알 수 있다(도 5). 또한, 실시예 2의 항원 제시 세포 외 소포는, IL-2/항IL-2 항체 복합체와 비교하여, 다른 CD8 양성 T 세포(항원 비특이적인 CD8 양성 T 세포)를 거의 활성화시키지 않은 것으로부터, 사이토카인 스톰 등이 위중한 부작용이 낮을 가능성이 생각된다(도 5).
시험예 4: 시험관 내에 있어서의, 항원 제시 세포 외 소포에 의한 OVA 특이적 CD4 양성 T 세포(OT-2 T 세포)의 활성화 실험
항원 제시 세포 외 소포가 항원 특이적 CD4 양성 T 세포를 활성화하거나 하는지의 여부를 조사하기 위해서, 시험관 내에 있어서 이하의 시험을 실시하였다.
OVA 반응성 CD4TCR 트랜스제닉 마우스인 OT-2 마우스로부터 적출한 림프절을 100㎛ 필터 상에서 파쇄하여, 림프절 세포 현탁액을 얻었다. 세포 현탁액을, 세포 증식 어세이 시약인 CellTrace Violet(Thermo Fisher Scientific사제)을 사용하여, 제조업자의 지시에 따라서 염색하였다. 염색한 림프절 세포 2×105개를, 10％ 소태아 혈청, 50μM 2-머캅토에탄올 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 RPMI1640 배지 200μL에 현탁하고, 최종 농도가 10μg/mL로 되도록 실시예 3의 항원 제시 세포 외 소포 또는 참고예 1의 세포 외 소포를 첨가하여, 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 4일간 배양하였다. 4일 후, 세포를 회수하고, 면역 염색을 행하였다. 염색에 사용한 항체는 이하와 같다(염색 시간: 15분, 온도: 4℃). 염색 후, OT-2 T 세포에 있어서의 세포 증식 어세이 시약인 CellTrace Violet의 발광 강도를 플로 사이토미터 FACSCantoII(BD 바이오사이언시즈사제)로 검출하였다.
·PE-Cy7 콘쥬게이트 항마우스 CD4 항체(RM4-5 Biolegend사제)
·APC 콘쥬게이트 항마우스 TCR Vb5.1, 5.2 항체(MR9-4 Biolegend사제)
결과를 도 6에 나타낸다.
[결과]
시험예 4의 결과로부터, 실시예 3의 항원 제시 세포 외 소포는, 참고예 1의 세포 외 소포와 비교하여, 항원 특이적 CD4T 세포를 현저하게 분화 및/또는 증식시켰다(도 6).
시험예 5: 시험관 내에 있어서의, 항원 제시 세포 외 소포에 의한 OVA 특이적 CD4 양성 T 세포(OT-2 T 세포)의 제어성 T 세포로의 분화 유도 실험
항원 제시 세포 외 소포가 항원 특이적 CD4 양성 T 세포를 제어성 T 세포(Treg)로 분화 유도하는지의 여부를 조사하기 위해서, 시험관 내에 있어서 이하의 시험을 실시하였다.
OVA 반응성 CD4TCR 트랜스제닉 마우스인 OT-2 마우스로부터 적출한 림프절을 100㎛ 필터 상에서 파쇄하여, 림프절 세포 현탁액을 얻었다. 세포 현탁액을, 세포 증식 어세이 시약인 CellTrace Violet(Thermo Fisher Scientific사제)을 사용하여, 제조업자의 지시에 따라서 염색하였다. 염색한 림프절 세포 2×105개를, 10％ 소태아 혈청, 50μM 2-머캅토에탄올 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 RPMI1640 배지 200μL에 현탁하고, 최종 농도가 10μg/mL로 되도록 실시예 4의 항원 제시 세포 외 소포 또는 참고예 1의 세포 외 소포를 첨가하여, 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 4일간 배양하였다. 4일 후, 세포를 회수하고, 세포 외 면역 염색을 행하였다. 염색 사용한 항체는 이하와 같다(염색 시간: 15분, 온도: 4℃). 세포 외 염색 후, True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set(Biolegend사제) 및 항 마우스 FOXP3 항체를 사용하여, 제조업자의 지시에 따라서 세포 내 면역 염색을 행하였다. 세포 내 염색 후, OT-2 T 세포 상의 제어성 T 세포의 마커인 CD25 분자와 FOXP3 분자의 발현을 플로 사이토미터 FACSCantoII(BD 바이오사이언시즈사제)로 검출하였다.
·PE 콘쥬게이트 항마우스 CD25 항체(PC61 Biolegend사제)
·PE-Cy7 콘쥬게이트 항마우스 CD4 항체(RM4-5 Biolegend사제)
·APC 콘쥬게이트 항마우스 TCR Vb5.1, 5.2 항체(MR9-4 Biolegend사제)
·Alexa Fluor 488 콘쥬게이트 항마우스 FOXP3 항체(MF-14 Biolegend사제)
결과를 도 7에 나타낸다.
[결과]
시험예 5의 결과로부터, 실시예 4의 항원 제시 세포 외 소포는, 참고예 1의 세포 외 소포와 비교하여, 항원 특이적 CD4 양성 T 세포를 제어성 T 세포(바람직하게는, Foxp3을 발현하고 있는 제어성 T 세포)로 분화 유도시킨 것을 알 수 있다(도 7).
시험예 6: 시험관 내에 있어서의, 항원 제시 세포 외 소포에 의한 OVA 특이적 CD4 양성 T 세포(OT-2 T 세포)의 Th2T 세포로의 분화 유도 실험
항원 제시 세포 외 소포가 항원 특이적 CD4 양성 T 세포를 Th2T 세포로 분화 유도하는지의 여부를 조사하기 위해서, 시험관 내에 있어서 이하의 시험을 실시하였다.
OVA 반응성 CD4TCR 트랜스제닉 마우스인 OT-2 마우스로부터 적출한 림프절을 100㎛ 필터 상에서 파쇄하여, 림프절 세포 현탁액을 얻었다. 세포 현탁액을, 세포 증식 어세이 시약인 CellTrace Violet(Thermo Fisher Scientific사제)을 사용하여, 제조업자의 지시에 따라서 염색하였다. 염색한 림프절 세포 2×105개를, 10％ 소태아 혈청, 50μM 2-머캅토에탄올 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 RPMI1640 배지 200μL에 현탁하고, 최종 농도가 10μg/mL로 되도록 실시예 3 혹은 5의 항원 제시 세포 외 소포 또는 참고예 1의 세포 외 소포를 첨가하여, 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 4일간 배양하였다. 4일 후, 세포를 회수하고, 세포 외 면역 염색을 행하였다. 염색 사용한 항체는 이하와 같다(염색 시간: 15분, 온도: 4℃). 세포 외 염색 후, True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set(Biolegend사제) 및 항GATA3 항체를 사용하여, 제조업자의 지시에 따라서 세포 내 면역 염색을 행하였다. 세포 내 염색 후, OT-2 T 세포의 세포 증식 어세이 시약인 CellTrace Violet의 발광 강도와 Th2T 세포의 마커인 GATA3의 발현을 플로 사이토미터 FACSCantoII(BD 바이오사이언시즈사제)로 검출하였다.
·PE 콘쥬게이트 항마우스 TCR Vb5.1, 5.2 항체(MR9-4 Biolegend사제)
·PE-Cy7 콘쥬게이트 항마우스 CD4 항체(RM4-5 Biolegend사제)
·APC 콘쥬게이트 항GATA3 항체(16E10A23 Biolegend사제)
결과를 도 8에 나타낸다.
[결과]
시험예 6의 결과로부터, 실시예 3, 5의 항원 제시 세포 외 소포는, 참고예 1의 세포 외 소포와 비교하여, 시험관 내에 있어서, 항원 특이적 CD4 양성 T 세포를 Th2 세포로 분화 유도시킨 것을 알 수 있다(도 8). Th2 세포는, IL-4이나 IL-5 등의 사이토카인을 분비하고, 동일한 항원을 인식하는 나이브 B 세포를 분화 활성화시켜, 항원 특이적 IgE 산생 유도(즉 액성 면역의 활성화)를 촉진한다.
[실시예 6] MHC 클래스 II 분자, T 세포 공자극 분자, 및 T 세포 자극성 사이토카인을 막에 포함하는 항원 제시 세포 외 소포 4
HEK293T 세포를 세포 배양 디쉬에 파종하고, 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지에서 배양하였다. 약 50％ 콘플루언스의 세포에, 제조업자의 지시에 따라서, 상기에서 조제한 플라스미드(sc-Dimer-CD81-IL-12p40, MHC 클래스 IIα쇄, CD80-CD9, 및 IL-12p35를 각각 코딩하는 pCAG 벡터)를 Polyethylenimine"Max"(Polysciences사제)를 사용하여, 4개 동시에 형질 감염하였다. 형질 감염의 3-12시간 후에 배지를 교환하고, 형질 감염의 24시간 후에 엑소솜을 제거한 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지로 배지를 교환하였다. 형질 감염의 72시간 후, 상청을 회수하고, 해당 상청을 0.22㎛ 필터에 안내한 후, 300g으로 5분간 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 2,000g, 20분간, 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 10,000g, 30분간, 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 100,000g으로 2시간 원심 분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿을 PBS로 세정하였다. 펠릿에 PBS를 첨가하고, 100,000g으로 2시간, 원심 분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿을 100μL의 PBS로 현탁한 것을, 실시예 6의 항원 제시 세포 외 소포로서 사용하였다. 항원 제시 세포 외 소포의 농도는, BCA 단백질 정량 키트(Thermo Fisher Scientific사제)를 사용하여, 제조업자의 지시에 따라서 측정하였다.
시험예 1-5: 세포 외 소포의 막에 포함되는 융합 단백질의 플로 사이토메트리 해석
실시예 6의 항원 제시 세포 외 소포를, PS Capture(상표) 엑소솜 플로 사이토메트리 키트(후지 필름 와코준야쿠 가부시키가이샤제)에 의해, 제조업자의 지시에 따라서 면역 염색을 행하였다. 염색에 사용한 항체는 이하와 같다. 염색 후, 각 융합 단백질의 발현을, 플로 사이토미터 FACSCantoII(BD 바이오사이언시즈사제)로 검출하였다.
·Alexa Fluor 488 콘쥬게이트 항마우스 I-A/I-E 항체(M5/114.15.2 Biolegend사제)
·PE 콘쥬게이트 항마우스 IL-12 항체(C15.6 Biolegend사제)
·APC 콘쥬게이트 항마우스 CD80 항체(16-10A1 Biolegend사제) 결과를 도 3e에 도시하였다.
[결과]
시험예 1-5의 결과로부터, 실시예 6의 항원 제시 세포 외 소포는, 그 막에, OVA 항원을 제시하는 MHC 클래스 II 분자, CD80, 및 기능적인 IL-12를 포함함을 알 수 있다(도 3e)
[실시예 7] MHC 클래스 II 분자, T 세포 공자극 분자, 및 T 세포 자극성 사이토카인을 막에 포함하는 항원 제시 세포 외 소포 5
HEK293T 세포를 세포 배양 디쉬에 파종하고, 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지에서 배양하였다. 약 50％ 콘플루언스의 세포에, 제조업자의 지시에 따라서, 상기에서 조제한 플라스미드(sc-Dimer-CD81, MHC 클래스 IIα쇄, CD80-CD9, CD81-IL-6 및 TGF-β-MFGE8을 각각 코딩하는 pCAG 벡터)를 Polyethylenimine"Max"(Polysciences사제)를 사용하여, 5개 동시에 형질 감염하였다. 형질 감염의 3-12시간 후에 배지를 교환하고, 형질 감염의 24시간 후에 엑소솜을 제거한 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지로 배지를 교환하였다. 형질 감염의 72시간 후, 상청을 회수하고, 해당 상청을 0.22㎛ 필터에 안내한 후, 300g으로 5분간 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 2,000g, 20분간, 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 10,000g, 30분간, 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 100,000g으로 2시간 원심 분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿을 PBS로 세정하였다. 펠릿에 PBS를 첨가하고, 100,000g으로 2시간, 원심 분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿을 100μL의 PBS로 현탁한 것을, 실시예 7의 항원 제시 세포 외 소포로서 사용하였다. 항원 제시 세포 외 소포의 농도는, BCA 단백질 정량 키트(Thermo Fisher Scientific사제)를 사용하여, 제조업자의 지시에 따라서 측정하였다.
시험예 1-6: 세포 외 소포의 막에 포함되는 융합 단백질의 플로 사이토메트리 해석
실시예 7의 항원 제시 세포 외 소포를, PS Capture(상표) 엑소솜 플로 사이토메트리 키트(후지 필름 와코준야쿠 가부시키가이샤제)에 의해, 제조업자의 지시에 따라서 면역 염색을 행하였다. 염색에 사용한 항체는 이하와 같다. 염색 후, 각 융합 단백질의 발현을, 플로 사이토미터 FACSCantoII(BD 바이오사이언시즈사제)로 검출하였다.
·FITC 콘쥬게이트 항마우스 CD80 항체(16-10A1 Biolegend사제)
·PE 콘쥬게이트 항마우스 IL-6 항체(MP5-20F3 Biolegend사제)
·APC-Cy7 콘쥬게이트 항마우스 I-A/I-E 항체(M5/114.15.2 Biolegend사제)
·APC 콘쥬게이트 항마우스 LAP(TGF-β1) 항체(TW7-16B4 Biolegend사제)
결과를 도 3f에 도시하였다.
[결과]
시험예 1-6의 결과로부터, 실시예 7의 항원 제시 세포 외 소포는, 그 막에, OVA 항원을 제시하는 MHC 클래스 II 분자, CD80, IL-6, 및 TGFb를 포함함을 알 수 있다(도 3f)
[실시예 8] MHC 클래스 I 분자, T 세포 공자극 분자, 및 T 세포 자극성 사이토카인을 안정적으로 발현하는 세포주의 수립과 항원 제시 세포 외 소포의 조제
PLAT-A 세포를 세포 배양 디쉬에 파종하고, 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지에서 배양하였다. 약 50％ 콘플루언스의 세포에, 제조업자의 지시에 따라서, CD80-CD9 또는 sc-Trimer-CD81-IL-2를 코딩하는 pMX 벡터를 Polyethylenimine"Max"(Polysciences사제)를 사용하여 각각 형질 감염하였다. 형질 감염의 12시간 후에 배지를 교환하고, 형질 감염의 60시간 후, 상청을 회수하고, 300g으로 5분간 원심 분리하였다. 회수한 상청을 바이러스 입자로서 사용하였다. HEK293 세포를 세포 배양 디쉬에 파종하고, 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지에서 배양하였다. 약 50％ 콘플루언스의 세포에, 상기에서 조제한 CD80-CD9를 도입한 바이러스 입자에 DOTAP 형질 감염 시약(Roche)을 제조업자의 지시에 따라서 첨가하고, HEK293 세포에 첨가하였다. 바이러스 입자를 첨가한 세포는 2500rpm으로 3시간, 원심 감염을 행하였다. 감염 24시간 후, 배지를 교환하고 1주일 후, CD80 양성 세포를 FACSMelody(BD 바이오사이언시즈사제)로 소팅하였다. 소팅한 CD80 양성 세포를 1주일 배양한 후, 디쉬에 파종하고, 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지에서 배양하였다. 약 50％ 콘플루언스의 세포에 상기에서 조제한 sc-Trimer-CD81-IL-2를 도입한 바이러스 입자에 DOTAP 형질 감염 시약을 제조업자의 지시에 따라서 첨가하고, CD80 양성 HEK293 세포에 첨가하였다. 바이러스 입자를 첨가한 세포는 2500rpm으로 3시간, 원심 감염을 행하였다. 감염 24시간 후, 배지를 교환하고 1주일 후, CD80 양성, MHCI 양성 세포를 FACSMelody(BD 바이오사이언시즈사제)로 소팅하였다. 소팅한 세포를 안정 발현 세포로서 사용하였다. 안정 발현 세포를 디쉬에 파종하고, 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지에서 배양하였다. 약 50％ 콘플루언스의 세포 상청을 엑소솜을 제거한 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지로 배지를 교환하였다. 배지 교환 72시간 후, 상청을 회수하고, 해당 상청을 0.22㎛ 필터에 안내한 후, 300g으로 5분간 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 2,000g, 20분간, 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 10,000g, 30분간, 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 100,000g으로 2시간 원심 분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿을 PBS로 세정하였다. 펠릿에 PBS를 첨가하고, 100,000g으로 2시간, 원심 분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿을 100μL의 PBS로 현탁한 것을, 실시예 8의 항원 제시 세포 외 소포로서 사용하였다.
시험예 1-7: 세포 외 소포의 막에 포함되는 융합 단백질의 플로 사이토메트리 해석
실시예 8의 항원 제시 세포 외 소포를, PS Capture(상표) 엑소솜 플로 사이토메트리 키트(후지 필름 와코준야쿠 가부시키가이샤제)에 의해, 제조업자의 지시에 따라서 면역 염색을 행하였다. 염색에 사용한 항체는 이하와 같다(염색 시간: 15분, 온도: 4℃). 염색 후, 각 융합 단백질의 발현을, 플로 사이토미터 FACSCantoII(BD 바이오사이언시즈사제)로 검출하였다.
·PE 콘쥬게이트 항마우스 H-2KbOVA 복합체 항체(25-D1.16 Biolegend사제)
·FITC 콘쥬게이트 항마우스 CD80 항체(16-10A1 Biolegend사제)
·APC 콘쥬게이트 항마우스 IL-2 항체(JES6-5H4 Biolegend사제)
결과를 도 3G에 도시하였다.
[결과]
시험예 1-7의 결과로부터, 실시예 8의 항원 제시 세포 외 소포는, 그 막에, OVA 항원을 제시하는 MHC 클래스 I 분자, CD80, 및 IL-2를 포함함을 알 수 있다(도 3G).
[실시예 9] HLA 클래스 I 분자, 인간 T 세포 공자극 분자, 및 인간 T 세포 자극성 사이토카인을 막에 포함하는 항원 제시 세포 외 소포
B2m을 결손시킨 HEK293T 세포를 세포 배양 디쉬에 파종하고, 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지에서 배양하였다. 약 50％ 콘플루언스의 세포에, 제조업자의 지시에 따라서, 상기에서 조제한 플라스미드(HLAsc-Trimer-인간 CD81, 인간 CD80-인간 CD9 및 인간 CD63-IL2를 각각 코딩하는 pCAG 벡터)를 Polyethylenimine"Max"(Polysciences사제)를 사용하여, 2개 동시에 형질 감염하였다. 형질 감염의 3-12시간 후에 배지를 교환하고, 형질 감염의 24시간 후에 엑소솜을 제거한 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지로 배지를 교환하였다. 형질 감염의 72시간 후, 상청을 회수하고, 해당 상청을 0.22㎛ 필터에 안내한 후, 300g으로 5분간 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 2,000g, 20분간, 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 10,000g, 30분간, 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 100,000g으로 2시간 원심 분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿을 PBS로 세정하였다. 펠릿에 PBS를 첨가하고, 100,000g으로 2시간, 원심 분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿을 100μL의 PBS로 현탁한 것을, 실시예 9의 인간화 항원 제시 세포 외 소포로서 사용하였다. 항원 제시 세포 외 소포의 농도는, BCA 단백질 정량 키트(Thermo Fisher Scientific사제)를 사용하여, 제조업자의 지시에 따라서 측정하였다.
hsc-Trimer-hCD81 대신에 SARS-CoV2sc-Trimer-hCD81을 사용함으로써, SARS-CoV2 펩티드를 항원으로서 제시하는 항원 제시 MHC 분자와, hCD80, 및 hIL-2를 그 표면에 제시하는 인간화 항원 제시 세포 외 소포를 제작할 수 있다.
시험예 1-8: 세포 외 소포의 막에 포함되는 융합 단백질의 플로 사이토메트리 해석
실시예 9의 항원 제시 세포 외 소포를, PS Capture(상표) 엑소솜 플로 사이토메트리 키트(후지 필름 와코준야쿠 가부시키가이샤제)에 의해, 제조업자의 지시에 따라서 면역 염색을 행하였다. 염색에 사용한 항체는 이하와 같다(염색 시간: 15분, 온도: 4℃). 염색 후, 각 융합 단백질의 발현을, 플로 사이토미터 FACSCantoII(BD 바이오사이언시즈사제)로 검출하였다.
·APC 콘쥬게이트 항인간 IL-2 항체(MQ1-17H12 Biolegend사제)
·PE 콘쥬게이트 항인간 CD80 항체(2D10 Biolegend사제)
·APC 콘쥬게이트 항인간 β2m 항체(2M2 Biolegend사제)
결과를 도 3h에 도시하였다.
[결과]
시험예 1-8의 결과로부터, 실시예 9의 항원 제시 세포 외 소포는, 그 막에, WT1 항원을 제시하는 MHC 클래스 I 분자, hCD80, 및 hIL-2를 포함함을 알 수 있다(도 3h).
시험예 7: 시험관 내에 있어서의, 항원 제시 세포 외 소포에 의한 OVA 특이적 CD4 양성 T 세포(OT-2 T 세포)의 Th1T 세포로의 분화 유도 실험
항원 제시 세포 외 소포가 항원 특이적 CD4 양성 T 세포를 Th1T 세포로 분화 유도하는지의 여부를 조사하기 위해서, 시험관 내에 있어서 이하의 시험을 실시하였다.
OVA 반응성 CD4TCR 트랜스제닉 마우스인 OT-2 마우스로부터 적출한 림프절을 100㎛ 필터 상에서 파쇄하여, 림프절 세포 현탁액을 얻었다. 세포 현탁액을, 세포 증식 어세이 시약인 CellTrace Violet(Thermo Fisher Scientific사제)을 사용하여, 제조업자의 지시에 따라서 염색하였다. 염색한 림프절 세포 2×105개를, 10％ 소태아 혈청, 50μM 2-머캅토에탄올 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 RPMI1640 배지 200μL에 현탁하고, 최종 농도가 10μg/mL로 되도록 실시예 3 혹은 6의 항원 제시 세포 외 소포 또는 참고예 1의 세포 외 소포를 첨가하여, 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 4일간 배양하였다. 4일 후, 세포를 회수하고, 세포 외 면역 염색을 행하였다. 염색 사용한 항체는 이하와 같다(염색 시간: 15분, 온도: 4℃). 세포 외 염색 후, True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set(Biolegend사제) 및 항T-bet 항체를 사용하여, 제조업자의 지시에 따라서 세포 내 면역 염색을 행하였다. 세포 내 염색 후, OT-2 T 세포의 세포 증식 어세이 시약인 CellTrace Violet의 발광 강도와 Th1T 세포의 마커인 T-bet의 발현을 플로 사이토미터 FACSCantoII(BD 바이오사이언시즈사제)로 검출하였다.
·PerCP/Cy5.5 콘쥬게이트 항마우스 TCRVa2 항체(B20.1 Biolegend사제)
·APC-Cy7 콘쥬게이트 항마우스 CD4 항체(RM4-5 Biolegend사제)
·PE 콘쥬게이트 항T-bet 항체(4B10 Biolegend사제)
결과를 도 9에 나타낸다.
[결과]
시험예 7의 결과로부터, 실시예 6의 항원 제시 세포 외 소포는, 참고예 1의 세포 외 소포와 비교하여, 시험관 내에 있어서, 항원 특이적 CD4 양성 T 세포를 Th1 세포로 분화 유도시켰다(도 9). Th1 세포는 IFN-γ나 IL-2 등을 산생하여, 병원체 세포, 바이러스에 감염된 세포, 암 세포 등의 파괴를 행하는, 마크로파지나 세포 상해성 T 세포의 활성화를 촉진한다(즉 세포성 면역의 활성화).
시험예 8: 시험관 내에 있어서의, 항원 제시 세포 외 소포에 의한 OVA 특이적 CD4 양성 T 세포(OT-2 T 세포)의 Th17T 세포로의 분화 유도 실험
항원 제시 세포 외 소포가 항원 특이적 CD4 양성 T 세포를 Th17T 세포로 분화 유도하는지의 여부를 조사하기 위해서, 시험관 내에 있어서 이하의 시험을 실시하였다.
OVA 반응성 CD4TCR 트랜스제닉 마우스에 RORrt-GFP 마우스를 교배한 마우스로부터 적출한 림프절을 100㎛ 필터 상에서 파쇄하여, 림프절 세포 현탁액을 얻었다. 세포 현탁액을, 세포 증식 어세이 시약인 CellTrace Violet(Thermo Fisher Scientific사제)을 사용하여, 제조업자의 지시에 따라서 염색하였다. 염색한 림프절 세포 2×105개를, 10％ 소태아 혈청, 50μM 2-머캅토에탄올 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 RPMI1640 배지 200μL에 현탁하고, 최종 농도가 10μg/mL로 되도록 실시예 7의 항원 제시 세포 외 소포 혹은 참고예 1의 세포 외 소포를 첨가하여, 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 4일간 배양하였다. 4일 후, 세포를 회수하고, 세포 외 면역 염색을 행하였다. 염색 사용한 항체는 이하와 같다(염색 시간: 15분, 온도: 4℃). 세포 내 염색 후, OT-2 T 세포의 세포 증식 어세이 시약인 CellTrace Violet의 발광 강도와 Th17T 세포의 마커인 RORrt의 발현을 플로 사이토미터 FACSCantoII(BD 바이오사이언시즈사제)로 검출하였다.
·APC 콘쥬게이트 항마우스 TCRVa2 항체(B20.1 Biolegend사제)
·PE-Cy7 콘쥬게이트 항마우스 CD4 항체(RM4-5 Biolegend사제)
·PE 콘쥬게이트 항마우스 TCR Vb5.1, 5.2 항체(MR9-4 Biolegend사제)
결과를 도 10에 나타낸다.
[결과]
시험예 8의 결과로부터, 실시예 7의 항원 제시 세포 외 소포는, 참고예 1의 세포 외 소포와 비교하여, 시험관 내에 있어서, 항원 특이적 CD4 양성 T 세포를 Th17 세포로 분화 유도시킨 것을 알 수 있다(도 1o). Th17 세포는 Th1이나 Th2 세포와는 달리, 염증성 사이토카인인, IL-17, IL-21, IL-22, TNF-α 등을 산생하여, 염증을 유도하고, 호중구나 단구의 동원, 증식을 촉진하고, 진균(칸디타균, 황색 포도 구균, 용련균 등 병원성 진균을 포함한다)의 감염 방어에 기여한다.
시험예 9: 시험관 내에 있어서의, 안정 세포주로부터 정제한 항원 제시 세포 외 소포에 의한 OVA 특이적 CD8 양성 T 세포(OT-1 T 세포)의 활성화 실험
안정 세포주로부터 정제한 항원 제시 세포 외 소포가 항원 특이적 CD8 양성 T 세포를 활성화하거나 하는지의 여부를 조사하기 위해서, 시험관 내에 있어서 이하의 시험을 실시하였다.
OVA 반응성 TCR 트랜스제닉 마우스인 OT-1 마우스로부터 적출한 림프절을 100㎛ 필터 상에서 파쇄하여, 림프절 세포 현탁액을 얻었다. 세포 현탁액을, 세포 증식 어세이 시약인 CellTrace Violet(Thermo Fisher Scientific사제)을 사용하여, 제조업자의 지시에 따라서 염색하였다. 염색한 림프절 세포 2×105개를, 10％ 소태아 혈청, 50μM 2-머캅토에탄올 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 RPMI1640 배지 200μL에 현탁하고, 최종 농도가 9μg/mL로 되도록 실시예 1 혹은 8의 항원 제시 세포 외 소포 또는 참고예 1의 세포 외 소포를 첨가하여, 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 4일간 배양하였다. 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 3일간 배양한 후, 면역 염색을 행하였다. 염색에 사용한 항체는 이하와 같다(염색 시간: 15분, 온도: 4℃). 염색 후, OT-1 T 세포에 있어서의 세포 증식 어세이 시약인 CellTrace Violet의 발광 강도를 플로 사이토미터 FACSCantoII(BD 바이오사이언시즈사제)로 검출하였다.
·APC 콘쥬게이트 항마우스 CD8 항체(53-6.7 Biolegend사제)
·PE 콘쥬게이트 항마우스 TCR Vb5.1, 5.2 항체(MR9-4 Biolegend사제)
결과를 도 11에 나타낸다.
[결과]
시험예 9의 결과로부터, 실시예 1과 실시예 8의 항원 제시 세포 외 소포는, 참고예 1의 세포 외 소포와 비교하여, 항원 특이적 CD8 양성 T 세포를 현저하게 증식시켰다(도 11). 이것은, sc-Trimer-CD81에 예시되는 구성 요건 (A)와 CD81-IL-2에 예시되는 구성 요건 (B)가 따로따로의 단백질로서 존재하는 세포 외 소포뿐만 아니라, sc-Trimer-CD81-IL-2에 예시되는, 양자의 기능을 구비한 융합 단백질이 존재하는 세포 외 소포여도 동등한 효과를 T 세포에 발휘하는 것을 나타낸다.
시험예 10: 항원 제시 세포 외 소포에 의한 항종양 효과의 평가 실험
안정 세포주로부터 정제한 항원 제시 세포 외 소포가 항종양 효과를 가지는지 여부를 조사하기 위하여 CD45.1/CD45.2 콘제닉 마우스에 OVA를 발현하는 B16 멜라노마 세포 1×105개를 피하에 섭취하고, 3일 후 1×105개의 OT-1T 세포를 이입하였다. OT-1T 세포 이입 후, 1일, 4일, 7일 후에 실시예 8의 항원 제시 세포 외 소포 혹은 참고예 1의 세포 외 소포 50μg을 레시피언트 마우스의 미정맥으로부터 이입하여, B16 멜라노마 세포의 크기를 관찰하였다.
[결과]
시험예 10의 결과로부터, 실시예 8의 항원 제시 세포 외 소포는, 참고예 1의 세포 외 소포와 비교하여, B16 멜라노마 세포의 증식을 현저하게 억제했다(도 12). 이것은, sc-Trimer-CD81에 예시되는 구성 요건 (A)와 CD81-IL-2에 예시되는 구성 요건 (B)가 따로따로의 단백질로서 존재하는 세포 외 소포뿐만 아니라, sc-Trimer-CD81-IL-2에 예시되는, 양자의 기능을 구비한 융합 단백질이 존재하는 세포 외 소포여도 동등한 의약 효과를 발휘하는 것을 나타낸다.
[실시예 10] sc-Trimer-CD81-IL-2 융합 단백질을 발현하는 mRNA의 조제
sc-Trimer-CD81-IL-2를 코딩하는 pET-15b 벡터를 EagI를 사용하여 직선화한 것을 FastGene Gel/PCR 익스트랙션 키트(닛폰 제네틱스사)를 사용하여 정제하고, T7 mScript Standard mRNA Production System(CELLSCRIPT사제)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라서, 시험관 내 전사 및 캡화, polyA 부가를 행하였다. 합성한 mRNA를 실시예 10의 항원 제시 세포 및 항원 제시 세포 외 소포를 산출하는 RNA로서 사용했다(도 1n).
[참고예 6] CD63-AkaLuc 융합 단백질을 발현하는 mRNA의 조제
CD63-AkaLuc을 코딩하는 pET-15b 벡터를 EcoRI를 사용하여 직선화한 것을 FastGene Gel/PCR 익스트랙션 키트(닛폰 제네틱스사)를 사용하여 정제하고, T7 mScript Standard mRNA Production System(CELLSCRIPT사제)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라서, 시험관 내 전사 및 캡화, polyA 부가를 행하였다. 합성한 mRNA를 참고예 6의 컨트롤 RNA로서 사용했다(도 1o).
시험예 11: 생체 내에 있어서의, sc-Trimer-CD81-IL-2 융합 단백질을 발현하는 mRNA에 의한 OVA 특이적 CD8 양성 T 세포(OT-1 T 세포)의 활성화 실험
sc-Trimer-CD81-IL-2 융합 단백질을 발현하는 mRNA가 항원 특이적 CD8 양성 T 세포를 활성화하거나 하는지의 여부를 조사하기 위해서, 생체 내에 있어서 이하의 시험을 실시하였다.
OVA 반응성 TCR 트랜스제닉 마우스인 OT-1 마우스로부터 림프절을 적출하고, 100㎛ 필터 상에서 파쇄하여, 림프절 세포 현탁액을 얻었다. CD45.1 콘제닉 마우스로부터도 마찬가지로 림프절을 적출하여, 림프구 현탁액을 조제하였다. 각각의 림프구 현탁액을 1:1의 비율로 혼합하고, 세포 증식 어세이 시약인 CellTrace Violet를 사용하여 염색하였다. PBS에 현탁한 1×107개의 CellTrace Violet 염색한 혼합 림프구 현탁액을, CD45.1/CD45.2 콘제닉 마우스의 미정맥으로부터 이입하였다. 다음날, 실시예 10 혹은 참고예 6의 mRNA를 10μg을 제조업자의 지시에 따라서, 생체 내-jetRNA 형질 감염 시약(Polyplus사)과 혼합하고, CD45.1/CD45.2 콘제닉 마우스에 미정맥으로부터 이입하였다. 세포 이입 4일 후, 레시피언트 마우스로부터 비장을 적출하고, 림프구 현탁액을 조제하고, 면역 염색을 행하였다. 염색에 사용한 항체는 이하와 같다(염색 시간: 15분, 온도: 4℃). 염색 후, 이입한 OT-1 T 세포 및 야생형 CD8T 세포에 있어서의 세포 증식 어세이 시약인 CellTrace Violet의 발광 강도를 플로 사이토미터 FACSCantoII(BD 바이오사이언시즈사제)로 검출하였다.
·PE-Cy7 콘쥬게이트 항마우스 CD8 항체(53-6.7 Biolegend사제)
·PE 콘쥬게이트 항마우스 TCR Vb5.1, 5.2 항체(MR9-4 Biolegend사제)
·FITC 콘쥬게이트 항마우스 CD45.1 항체(A20 Biolegend사제)
·APC 콘쥬게이트 항마우스 CD45.2 항체(104 Biolegend사제)
결과를 도 13에 나타낸다.
[결과]
시험예 11의 결과로부터, 실시예 10의 mRNA는 참고예 6의의 mRNA와 비교하여, 생체 내에 있어서, 다른 CD8 양성 T 세포(항원 비특이적인 CD8 양성 T 세포)를 거의 활성화하거나 하지 않고, 항원 특이적 CD8 양성 T 세포를 현저하게 분화 및/또는 증식시켰다(도 13). 특별히 원리에 구애되는 것은 아니지만, 본 발명에 관계되는 폴리뉴클레오티드가 CD45.1/CD45.2 콘제닉 마우스 체 내의 임의의 세포에 도입되어, 그 세포의 막 표면 및/또는 그 세포로부터 분비되는 세포 외 소포의 막 표면에 sc-Trimer-CD81-IL-2 융합 단백질이 발현하고, 항원 제시 세포 및/또는 항원 제시 세포 외 소포가 생성되고, 그 생성된 항원 제시 세포 및/또는 항원 제시 세포 외 소포와, OT-1 T 세포가 접촉하여, OVA 반응성 CD8T 세포가 증식했다고 풀이된다. 이것은, 상기 시험예 1 내지 10에서 나타낸, 항원 제시 세포 외 소포의 T 세포 활성화의 효과와 동등한 효과가 항원 제시 세포 및/또는 항원 제시 세포 외 소포를 제작하기 위한 폴리뉴클레오티드에서도 생체 내에 있어서 얻어지는 것을 나타내고 있다.
시험예 12: sc-Trimer-CD81-IL-2 융합 단백질을 발현하는 mRNA에 의한 내재성 OVA 반응성 T 세포의 활성화 실험
실시예 10 혹은 참고예 6의 mRNA10μg을 제조업자의 지시에 따라서, 생체 내-jetRNA 형질 감염 시약(Polyplus사)과 혼합하고, C57BL/6 마우스의 미정맥으로부터 이입하였다. 이입 4일 후, 레시피언트 마우스로부터 비장을 적출하고, 림프구 현탁액을 조제하고, OVA 반응성 T 세포를 제조업자의 지시에 따라서, 테트라머로 면역 염색을 행하였다. 염색에 사용한 항체는 이하와 같다. 염색 후, 테트라머 양성 세포를 플로 사이토미터 FACSCantoII(BD 바이오사이언시즈사제)로 검출하였다.
·APC 콘쥬게이트 H-2Kb OVA Tetramer(TETRAMER SHOP사)
·PE 콘쥬게이트 H-2Kb OVA Tetramer(TETRAMER SHOP사)
·Brilliant Violet421 콘쥬게이트 항마우스 CD8 항체(53-6.7 Biolegend사제)
[결과]
시험예 12의 결과로부터, 실시예 10의 mRNA는, 참고예 6의 mRNA와 비교하여, 현저하게 내재성에 존재하는 OVA 반응성 CD8T 세포를 증식시켰다(도 14). 특별히 원리에 구애되는 것은 아니지만, 본 발명에 관계되는 폴리뉴클레오티드가 C57BL/6 마우스 체 내의 임의의 세포에 도입되어, 그 세포의 막 표면 및/또는 그 세포로부터 분비되는 세포 외 소포의 막 표면에 sc-Trimer-CD81-IL-2 융합 단백질이 발현하고, 항원 제시 세포 및/또는 항원 제시 세포 외 소포가 생성되고, 그 생성된 항원 제시 세포 및/또는 항원 제시 세포 외 소포와, 내재성의 T 세포가 접촉하여, OVA 반응성 CD8T 세포가 증식했다고 풀이된다. 이것은 상기 시험예 1 내지 10에서 나타낸, 항원 제시 세포 외 소포의 의약으로서의 효과와 동등한 효과가 항원 제시 세포 및/또는 항원 제시 세포 외 소포를 제작하기 위한 폴리뉴클레오티드에서도 생체 내에 있어서 얻어지는 것을 나타내고 있다.
시험예 13: 생체 내에 있어서의, 항원 제시 세포 외 소포에 의한 OVA 특이적 CD4 양성 T 세포(OT-2 T 세포)의 Th1T 세포로의 분화 유도 실험
OVA 반응성 TCR 트랜스제닉 마우스인 OT-2 마우스로부터 림프절을 적출하여, 100㎛ 필터 상에서 파쇄하고, 림프절 세포 현탁액을 얻는다. CD45.1 콘제닉 마우스로부터도 마찬가지로 림프절을 적출하여, 림프구 현탁액을 조제하였다. 각각의 림프구 현탁액을 1:1의 비율로 혼합하고, 세포 증식 어세이 시약인 CellTrace Violet를 사용하여 염색한다. PBS에 현탁시킨 1×107개의 CellTrace Violet 염색한 혼합 림프구 현탁액을, CD45.1/CD45.2 콘제닉 마우스의 미정맥으로부터 이입한다. 림프구 이입 후, 1일 및 4일 후, 실시예 6 혹은 참고예 1의 세포 외 소포 50μg을, CD45.1/CD45.2 콘제닉 마우스에 피하로부터 이입한다. 세포 이입 7일 후, 레시피언트 마우스로부터 비장을 적출하여, 림프구 현탁액을 조제하고, 면역 염색을 행한다. 염색에는 이하의 항체를 사용한다(염색 시간: 15분, 온도: 4℃). 염색 후, 이입한 OT-2 T 세포 및 야생형 CD4T 세포에 있어서의 세포 증식 어세이 시약인 CellTrace Violet의 발광 강도를 플로 사이토미터 FACSCantoII(BD 바이오사이언시스사제)로 검출한다.
·APC-Cy7 콘쥬게이트 항마우스 CD4 항체(RM4-5 Biolegend사제)
·PerCP/Cy5.5 콘쥬게이트 항마우스 TCRVa2 항체(B20.1 Biolegend사제)
·FITC 콘쥬게이트 항마우스 CD45.1 항체(A20 Biolegend사제)
·PE-Cy7 콘쥬게이트 항마우스 CD45.2 항체(104 Biolegend사제)
·PE 콘쥬게이트 항T-bet 항체(4B10 Biolegend사제)
[결과]
시험예 13의 결과로부터, 실시예 6의 세포 외 소포는 참고예 1의 세포 외 소포와 비교하여, 생체 내에 있어서, 다른 CD4 양성 T 세포(항원 비특이적인 CD4 양성 T 세포)를 거의 활성화하거나 하지 않고, 항원 특이적 CD4 양성 T 세포를 현저하게 Th1에 분화시킬 수 있다(도 15).
시험예 14: 항원 제시 세포 외 소포에 의한 항종양 효과의 평가 실험
실시예 6의 세포 외 소포가 항종양 효과를 갖는지 여부를 조사하기 위해 CD45.1/CD45.2 콘제닉 마우스에 OVA를 발현하는 B16 멜라노마 세포 1×105개를 피하에 섭취하고, 1일 후 5×105개의 OT-2T 세포를 이입하였다. OT-2T 세포 이입 후, 1일, 4일, 7일 후에 실시예 6의 항원 제시 세포 외 소포 혹은 참고예 1의 세포 외 소포 50μg을 레시피언트 마우스의 피하로부터 이입하고, B16 멜라노마 세포의 크기를 관찰하였다.
[결과]
시험예 14의 결과로부터, 실시예 6의 항원 제시 세포 외 소포는, 참고예 1의 세포 외 소포와 비교하여, B16 멜라노마 세포의 증식을 현저하게 억제하였다(도 16).
[실시예 11] HLA클래스 II 분자, 인간 T 세포 공자극 분자 및 인간 T 세포 자극성 사이토카인을 막에 포함하는 항원 제시 세포 외 소포
B2m을 결손시킨 HEK293T 세포를 세포 배양 디쉬에 파종하고, 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지에서 배양하였다. 약 50％ 콘플루언스의 세포에, 제조업자의 지시에 따라서, 상기에서 조제한 플라스미드(HLADR-1sc-TPI1-인간 CD81, 인간 CD80-인간 CD9, 인간 IL-12sc-MFGe8을 각각 코딩하는 pCAG 벡터)를 Polyethylenimine"Max"(Polysciences사제)를 사용하여, 2개 동시에 형질 감염하였다. 형질 감염의 3-12시간 후에 배지를 교환하고, 형질 감염의 24시간 후에 엑소솜을 제거한 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지에 배지를 교환하였다. 형질 감염의 72시간 후, 상청을 회수하고, 해당 상청을 0.22㎛ 필터에 통과시킨 후, 300g으로 5분간 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 2,000g, 20분간, 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 10,000g, 30분간, 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 100,000g으로 2시간 원심 분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿을 PBS로 세정하였다. 펠릿에 PBS를 첨가하고, 100,000g으로 2시간, 원심 분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿을 100μL의 PBS로 현탁시킨 것을, 실시예 11의 인간화 항원 제시 세포 외 소포로서 사용하였다(도 2j). 항원 제시 세포 외 소포의 농도는, BCA단백질 정량 키트(Thermo Fisher Scientific사제)을 사용하고, 제조업자의 지시에 따라서 측정하였다.
시험예 15: 세포 외 소포의 막에 포함되는 융합 단백질의 플로 사이토메트리 해석
실시예 11의 항원 제시 세포 외 소포를, PS Capture(상표) 엑소솜 플로 사이토메트리 키트(후지 필름 와코 쥰야쿠 가부시키가이샤제)에 의해, 제조업자의 지시에 따라서 면역 염색을 행하였다. 염색에 사용한 항체는 이하와 같다. 염색 후, 각 융합 단백질의 발현을, 플로 사이토미터 FACSCantoII(BD 바이오사이언시스사제)로 검출하였다.
·PE 콘쥬게이트 항인간 HLA-DRB1 항체(NFLD.D2 Biolegend사제)
·PE 콘쥬게이트 항인간 CD80 항체(W17149D Biolegend사제)
·APC 콘쥬게이트 항인간 IL-12 항체(C11.5 Biolegend사제)
결과를 도 17에 나타낸다.
[결과]
시험예 15의 결과로부터, 실시예 11의 항원 제시 세포 외 소포는, 그 막에, 네오안티겐인 TPI-1 항원을 제시하는 MHC 클래스 II 분자(즉 HLA-DR), CD80 및 IL-12를 포함하는 것을 알 수 있다(도 17)
시험예 16: 시험관 내에 있어서의, 항원 제시 세포 외 소포에 의한 TPI-1 특이적 인간 CD4 양성 T 세포의 Th1T 세포로의 분화 유도 실험
인간화 항원 제시 세포 외 소포가 항원 특이적 CD4 양성 T 세포를 Th1T 세포로 분화 유도할 지 여부를 조사하기 위해서, 시험관 내에 있어서 이하의 시험을 실시하였다. platA 세포(레트로바이러스 패키지 세포)에 TPI-1 펩티드 특이적인 TCR(T 세포 수령대) 및 형광 단백 Venus를 코딩한 pMXs 벡터를 Polyethylenimine"Max"(Polysciences사제)를 사용하여 형질 감염하였다. 형질 감염의 3-12시간 후에 배지를 교환하고, 형질 감염의 48시간 후, 72시간 후에 상청을 회수하고, 상청을 0.22㎛ 필터에 통과시키고, TPI-1 특이적 TCR을 발현하는 레트로바이러스 상청을 제작하였다. HLA-DR1 양성의 레시피언트로부터 말초혈을 채취하고, Ficol을 사용하여 말초혈 단핵구 세포를 분리하고, 2.0×106개의 말초혈 단핵구 세포를 10％ 소태아 혈청, 50μM 2-머캅토에탄올 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 RPMI1640 배지 200μL에 현탁시키고, 최종 농도가 20ng/mL가 되도록 인간 IL-2 및 25μl의 다이나비즈(dynabeads)를 혼합하고, 6웰 플레이트에서 24시간 자극을 하였다. 상기에서 조제한 바이러스 입자를, 레트로넥틴(TAKARA사)을 사용하여 제조업자의 지시대로 감염시켜, TPI-1 펩티드 특이적인 TCR 및 형광 단백 Venus를 동시에 발현하는 인간 T 세포를 제작하였다. 제작한 인간 T 세포에 실시예 11 혹은 참고예 1의 세포 외 소포를 첨가하여, 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 7일간 배양하였다. 7일 후, 세포를 회수하고, 세포 외 면역 염색을 행하였다. 염색 사용한 항체는 이하와 같다(염색 시간: 15분, 온도: 4℃). 세포 외 염색 후, True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set(Biolegend사제) 및 항T-bet 항체를 사용하여, 제조업자의 지시에 따라서 세포 내 면역 염색을 행하였다. 세포 내 염색 후 Venus 발광 강도와 Th1T 세포의 마커인 T-bet 및 IFN-γ의 발현을 플로 사이토미터 FACSCantoII(BD 바이오사이언시스사제)로 검출한다.
·FITC 콘쥬게이트 항인간 CD4 항체(A161A1 Biolegend사제)
·Brilliant Violet 421 콘쥬게이트 항인간 IFN-r 항체(4S.B3 Biolegend사제)
·PE 콘쥬게이트 항T-bet 항체(4B10 Biolegend사제)
[결과]
시험예 16의 결과로부터, 실시예 11의 항원 제시 세포 외 소포는, 참고예 1의 세포 외 소포와 비교하여, 시험관 내에 있어서, TPI-1 펩티드 항원 특이적 CD4 양성 T 세포를 Th1 세포로 분화 유도시켰다(도 18). Th1 세포는 IFN-γ나 IL-2 등을 산생하고, 병원체 세포, 바이러스에 감염된 세포, 암 세포 등의 파괴를 행하는, 마크로파지나 세포 상해성 T 세포의 활성화를 촉진시킨다(즉 세포성 면역의 활성화).
[실시예 12] MHC 클래스 I 분자, T 세포 공자극 분자 및 T 세포 자극성 사이토카인을 안정적으로 발현하는 세포주의 수립과 항원 제시 세포 외 소포의 조제
PLAT-A 세포를 세포 배양 디쉬에 파종하고, 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지에서 배양하였다. 약 50％ 콘플루언스의 세포에, 제조업자의 지시에 따라서, CD80-MFG-E8 또는 sc-Trimer-CD81-IL-2를 코딩하는 pMX 벡터를 Polyethylenimine"Max"(Polysciences사제)를 사용하여 각각 형질 감염하였다. 형질 감염의 12시간 후에 배지를 교환하고, 형질 감염의 60시간 후, 상청을 회수하고, 300g으로 5분간 원심 분리하였다. 회수한 상청을 바이러스 입자로서 사용하였다. HEK293 세포를 세포 배양 디쉬에 파종하고, 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지에서 배양하였다. 약 50％ 콘플루언스의 세포에, 상기에서 조제한 CD80-MFG-E8을 도입한 바이러스 입자에 DOTAP 형질 감염 시약(Roche)을 제조업자의 지시에 따라서 첨가하고, HEK293 세포에 첨가하였다. 바이러스 입자를 첨가한 세포는 2500rpm으로 3시간, 원심 감염을 행하였다. 감염 24시간 후, 배지를 교환하고 1주일 후, CD80 양성 세포를 FACSMelody(BD 바이오사이언시스사제)로 소팅하였다. 소팅한 CD80 양성 세포를 1주일 배양한 후, 디쉬에 파종하고, 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지에서 배양하였다. 약 50％ 콘플루언스의 세포에 상기에서 조제한 sc-Trimer-CD81-IL-2를 도입한 바이러스 입자에 DOTAP 형질 감염 시약을 제조업자의 지시에 따라서 첨가하고, CD80 양성 HEK293 세포에 첨가하였다. 바이러스 입자를 첨가한 세포는 2500rpm으로 3시간, 원심 감염을 행하였다. 감염 24시간 후, 배지를 교환하고 1주일 후, CD80 양성, MHCI 양성 세포를 FACSMelody(BD 바이오사이언시스사제)로 소팅하였다. 소팅한 세포를 안정 발현 세포로서 사용하였다. 안정 발현 세포를 디쉬에 파종하고, 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지에서 배양하였다. 약 50％ 콘플루언스의 세포 상청을 엑소솜을 제거한 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지에 배지를 교환하였다. 배지 교환 72시간 후, 상청을 회수하고, 해당 상청을 0.22㎛ 필터에 통과시킨 후, 300g으로 5분간 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 2,000g, 20분간, 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 10,000g, 30분간, 원심 분리하였다. 상청을 회수하고, 해당 상청을 100,000g으로 2시간 원심 분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿을 PBS로 세정하였다. 펠릿에 PBS를 첨가하고, 100,000g으로 2시간, 원심 분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿을 100μL의 PBS로 현탁시킨 것을, 실시예 12의 항원 제시 세포 외 소포로서 사용하였다.
시험예 17: 항원 제시 세포 외 소포에 의한 항종양 효과의 평가 실험
안정 세포주로부터 정제한 항원 제시 세포 외 소포가 항종양 효과를 갖는지 여부를 조사하기 위해 C57BL/6 마우스에 OVA를 발현하는 EL-4 세포 1×105개를 피하에 섭취하였다. EL-4 세포 섭취 후, 1일, 4일, 7일 후에 실시예 12의 항원 제시 세포 외 소포 혹은 참고예 1의 세포 외 소포 50μg을 레시피언트 마우스의 미정맥으로부터 이입하고, EL-4 세포의 크기를 관찰하였다.
[결과]
시험예 17의 결과로부터, 실시예 12의 항원 제시 세포 외 소포는, 참고예 1의 세포 외 소포와 비교하여, EL-4 세포의 증식을 현저하게 억제하였다(도 19).
[실시예 1A] sc-Trimer-T2A-IL-2-CD8-P2A-CD80을 코딩하는 mRNA의 조제
sc-Trimer-T2A-IL-2-CD8-P2A-CD80을 코딩하는 pET-15b 벡터를 HindIII을 사용하여 직선화한 것을 FastGene Gel/PCR 익스트랙션 키트(닛폰 제네틱스사)를 사용하여 정제하고, T7 mScript Standard mRNA Production System(CELLSCRIPT사제)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라서, 시험관 내 전사 및 캡화, polyA 부가를 행하였다. 합성한 mRNA를 실시예 1A의 항원 제시 세포를 유도하는 RNA로서 사용하였다(도 1p).
[참고예 1A] 컨트롤 mRNA의 조제
CD81을 코딩하는 pET-15b 벡터를 HindIII을 사용하여 직선화한 것을 FastGene Gel/PCR 익스트랙션 키트(닛폰 제네틱스사)를 사용하여 정제하고, T7 mScript Standard mRNA Production System(CELLSCRIPT사제)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라서, 시험관 내 전사 및 캡화, polyA 부가를 행하였다. 합성한 mRNA를 참고예 1A의 컨트롤 RNA로서 사용하였다(도 1q).
[참고예 2A] OVA를 코딩하는 mRNA의 조제
OVA를 코딩하는 pET-15b 벡터를 HindIII을 사용하여 직선화한 것을 FastGene Gel/PCR 익스트랙션 키트(닛폰 제네틱스사)를 사용하여 정제하고, T7 mScript Standard mRNA Production System(CELLSCRIPT사제)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라서, 시험관 내 전사 및 캡화, polyA 부가를 행하였다. 합성한 mRNA를 참고예 2A의 컨트롤 RNA로서 사용하였다(도 1r).
시험예 1A: mRNA에 의해 유도되는 항원 제시 세포의 플로 사이토메트리 해석
B16 멜라노마 세포를 세포 배양 디쉬에 파종하고, 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지에서 배양하였다. 약 50％ 콘플루언스의 세포에, 제조업자의 지시에 따라서, 실시예 1A의 mRNA 및 참고예 1A의 mRNA를 TransIT-mRNA Transfection Kit(Mirus사제)를 사용하여 각각 형질 감염하였다. 형질 감염의 24시간 후, B16 멜라노마 세포를 회수하고, 제조업자의 지시에 따라서 면역 염색을 행하였다. 염색에 사용한 항체는 이하와 같다(염색 시간: 15분, 온도: 4℃). 염색 후, 각 단백질의 발현을, 플로 사이토미터 FACSCantoII(BD 바이오사이언시스사제)로 검출하였다.
·PE 콘쥬게이트 항마우스 H-2KbOVA 복합체 항체(25-D1.16 Biolegend사제)
·FITC 콘쥬게이트 항마우스 CD80 항체(16-10A1 Biolegend사제)
·APC 콘쥬게이트 항마우스 IL-2 항체(JES6-5H4 Biolegend사제)
[결과]
시험예 1A의 결과로부터, 실시예 1A의 mRNA를 OVA를 발현한 B16 멜라노마 세포(MO4 세포)에 형질 감염함으로써, MO4 세포 상에 항원-MHCI 복합체, CD80 및 IL-2를 발현시켰다(도 20).
시험예 2A: 시험관 내에 있어서의, 항원 제시 세포에 의한 OVA 특이적 CD8 양성 T 세포(OT-1 T 세포)의 활성화 실험
항원 제시 세포가 항원 특이적 CD8 양성 T 세포를 활성화하거나 하는지 여부를 조사하기 위해서, 시험관 내에 있어서 이하의 시험을 실시하였다.
OVA 반응성 TCR 트랜스제닉 마우스인 OT-1 마우스로부터 적출한 림프절을 100㎛ 필터 상에서 파쇄하고, 림프절 세포 현탁액을 얻었다. 세포 현탁액을, 세포 증식 어세이 시약인 CellTrace Violet(Thermo Fisher Scientific사제)를 사용하여, 제조업자의 지시에 따라서 염색하였다. 염색한 림프절 세포 2×105개를, 10％ 소태아 혈청, 50μM 2-머캅토에탄올 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 RPMI1640 배지 200μL에 현탁시키고, 실시예 1A 또는 참고예 1A, 참고예 2A의 mRNA를 형질 감염(transfection)된 MO4 세포 1×104개를 첨가하여, 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 3일간 배양한 후, 면역 염색을 행하였다. 염색에 사용한 항체는 이하와 같다(염색 시간: 15분, 온도: 4℃). 염색 후, OT-1 T 세포에 있어서의 세포 증식 어세이 시약인 CellTrace Violet의 발광 강도를 플로 사이토미터 FACSCantoII(BD 바이오사이언시스사제)로 검출하였다.
·APC 콘쥬게이트 항마우스 CD8 항체(53-6.7 Biolegend사제)
·PE 콘쥬게이트 항마우스 TCR Vb5.1, 5.2 항체(MR9-4 Biolegend사제)
[결과]
시험예 2A의 결과로부터, 실시예 1A의 mRNA에 의해 유도된 항원 제시 세포는, 참고예 1A 내지 2A의 mRNA를 형질 감염된 MO4 세포와 비교하여, 항원 특이적 CD8 양성 T 세포를 현저하게 증식시켰다(도 21).
시험예 3A: 생체 내에서 멜라노마 세포를 항원 제시 세포로 변환하는 실험
OVA를 발현하는 B16 멜라노마 세포 1×105개를 누드 마우스의 피하에 섭취하고, 종양의 체적이 100mm3 정도로 된 후에, mRNA 9μg을 제조업자의 지시에 따라서, 생체 내-jetRNA 형질 감염 시약(Polyplus사)과 혼합하여, 종양 내에 투여하였다. 다음날, 레시피언트 마우스로부터 종양을 적출하여, 종양 현탁액을 조제하고, 제조업자의 지시에 따라서 면역 염색을 행하였다. 염색에 사용한 항체는 이하와 같다(염색 시간: 15분, 온도: 4℃). 염색 후, 각 단백질의 발현을, 플로 사이토미터 FACSCantoII(BD 바이오사이언시스사제)로 검출하였다.
·PE 콘쥬게이트 항마우스 H-2KbOVA 복합체 항체(25-D1.16 Biolegend사제)
·PE-Cy7 콘쥬게이트 항마우스 CD80 항체(16-10A1 Biolegend사제)
·APC 콘쥬게이트 항마우스 IL-2 항체(JES6-5H4 Biolegend사제)
·Pacific Blue 콘쥬게이트 항마우스 CD45 항체(30-F11 Biolegend사제)
·FITC 콘쥬게이트 항H2-Kd 항체(SF1-1.1 Biolegend사제)
[결과]
시험예 3A의 결과로부터, 실시예 1A의 mRNA는 생체 내에 있어서, OVA를 발현하는 B16 멜라노마 세포의 막 표면에 OVAp-MHCI, IL-2-CD8 및 CD80 단백질의 발현을 유도하였다(도 22). 이것은 생체 내에 있어서 멜라노마 세포의 일부를 항원 제시 세포로 변환시킨 것을 나타낸다.
시험예 4A: 생체 내에서 유도한 항원 제시 세포에 의한 내재성 OVA 반응성 T 세포의 활성화 실험
실시예 1A 혹은 참고예 1A 내지 2A의 mRNA 2μg을 제조업자의 지시에 따라서, 생체 내-jetRNA 형질 감염 시약(Polyplus사)과 혼합하고, C57BL/6 마우스의 미정맥으로부터 이입하였다. 이입 7일 후, 레시피언트 마우스로부터 비장을 적출하여, 림프구 현탁액을 조제하고, OVA 반응성 T 세포를 제조업자의 지시에 따라서, 테트라머로 면역 염색을 행하였다. 염색에 사용한 항체는 이하와 같다. 염색 후, 테트라머 양성 세포를 플로 사이토미터 FACSCantoII(BD 바이오사이언시스사제)로 검출하였다.
·APC 콘쥬게이트 H-2Kb OVA Tetramer(TETRAMER SHOP사)
·PE 콘쥬게이트 H-2Kb OVA Tetramer(TETRAMER SHOP사)
·Brilliant Violet421 콘쥬게이트 항마우스 CD8 항체(53-6.7 Biolegend사제)
[결과]
시험예 4A의 결과로부터, 실시예 1A의 mRNA는, 참고예 1A 내지 2A의 mRNA와 비교하여, 현저하게 내재성에 존재하는 OVA 반응성 CD8T 세포를 증식시켰다(도 23). 특히 원리에 구애받지 않지만, 본 발명에 관한 mRNA가 C57BL/6 마우스 체 내의 임의의 세포에 도입되고, 그 세포의 막 표면에 OVAp-MHCI, IL-2-CD8 및 CD80 단백질이 각각 발현된 항원 제시 세포가 유도되고, 내재성의 T 세포가 항원 제시 세포와 접촉하여, OVA 반응성 CD8T 세포가 증식되었다고 해석된다.
[실시예 2A] sc-Trimer-T2A-IL-15sa-P2A-CD80을 코딩하는 mRNA의 조제
sc-Trimer-T2A-TfR-IL-15sa-P2A-CD80을 코딩하고, T7 프로모터, 3'UTR에 인간 α글로불린 서열 및 129 염기의 polyA 서열을 갖는 벡터를 HindIII을 사용하여 직선화한 것을 FastGene Gel/PCR 익스트랙션 키트(닛폰 제네틱스사)를 사용하여 정제하고, HiScribe T7mRNA Kit with CleanCap Reagent AG(New England Biolabs사제)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라서, 시험관 내 전사 및 캡화를 행하였다. 합성한 mRNA를 실시예 2A의 항원 제시 세포를 유도하는 RNA로서 사용하였다(도 24의 (a)).
시험예 5A: mRNA에 의해 유도되는 항원 제시 세포의 플로 사이토메트리 해석
293T 세포를 세포 배양 디쉬에 파종하고, 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지에서 배양하였다. 약 50％ 콘플루언스의 세포에, 제조업자의 지시에 따라서, 실시예 2A의 mRNA를 TransIT-mRNA Transfection Kit(Mirus사제)를 사용하여 형질 감염하였다. 형질 감염의 24시간 후, 293T 세포를 회수하고, 제조업자의 지시에 따라서 면역 염색을 행하였다. 염색에 사용한 항체는 이하와 같다(염색 시간: 15분, 온도: 4℃). 염색 후, 각 단백질의 발현을, 플로 사이토미터 FACSCantoII(BD 바이오사이언시스사제)로 검출하였다.
·PE 콘쥬게이트 항마우스 H-2KbOVA 복합체 항체(25-D1.16 Biolegend사제)
·FITC 콘쥬게이트 항마우스 CD80 항체(16-10A1 Biolegend사제)
·APC 콘쥬게이트 항DYKDDDDK Tag 항체(L5 Biolegend사제)
[결과]
시험예 5A의 결과로부터, 실시예 2A의 mRNA를 293T 세포에 형질 감염함으로써, 293T 세포 상에 항원-MHCI 복합체, CD80 및 IL-15sa를 발현시켰다(도 25).
시험예 6A: 생체 내에서 유도한 항원 제시 세포에 의한 내재성 OVA 반응성 T 세포의 활성화 실험
실시예 2A 혹은 참고예 1A의 mRNA 5μg을 제조업자의 지시에 따라서, 생체 내-jetRNA 형질 감염 시약(Polyplus사)과 혼합하고, C57BL/6 마우스의 미정맥으로부터 이입하였다. 이입 7일 후, 레시피언트 마우스로부터 비장을 적출하여, 림프구 현탁액을 조제하고, OVA 반응성 T 세포를 제조업자의 지시에 따라서, 테트라머로 면역 염색을 행하였다. 염색에 사용한 항체는 이하와 같다. 염색 후, 테트라머 양성 세포를 플로 사이토미터 FACSCantoII(BD 바이오사이언시스사제)로 검출하였다.
·FITC-콘쥬게이트 항마우스 CD62L 항체(MEL14 Biolegend사제)
·APC 콘쥬게이트 H-2Kb OVAp Tetramer(TETRAMER SHOP사)
·PE 콘쥬게이트 H-2Kb OVAp Tetramer(TETRAMER SHOP사)
·PE/Cyanine7 콘쥬게이트 항마우스 CD8 항체(53-6.7 Biolegend사제)
·APC/Cyanine7-콘쥬게이트 항마우스 CD44 항체(IM7 Biolegend사제)
[결과]
시험예 6A의 결과로부터, 실시예 2A의 mRNA는, 참고예 1A의 mRNA와 비교하여, 현저하게 내재성에 존재하는 OVA 반응성 CD8T 세포를 증식시켰다(도 26). 또한 증식된 세포는 CD44hiCD62low의 이펙터 메모리 페노타입이 되었다(즉, 증식된 세포는, 동일 항원에 다시 폭로되었을 때에 빠르게 사이토카인을 산생하고, 면역 응답할 수 있는 것을 의미한다). 특히 원리에 구애받지 않지만, 본 발명에 관한 mRNA가 C57BL/6 마우스 체 내의 임의의 세포에 도입되고, 그 세포의 막 표면에 OVA-MHCI, IL-15sa 및 CD80 단백질이 각각 발현된 항원 제시 세포가 유도되고, 내재성의 T 세포가 항원 제시 세포와 접촉하여, OVA 반응성 CD8T 세포가 증식되었다고 해석된다.
[실시예 3A] 네오안티겐을 제시하는 sc-Trimer-T2A-IL-2-CD8-P2A-CD80을 코딩하는 mRNA의 조제
OVA 펩티드 대신에 MC38 대장암 세포주 유래의 네오안티겐(암 항원)인 변이 Gtf2i 펩티드 제시하는 sc-Trimer-T2A-IL-2-CD8-P2A-CD80을 코딩하는 벡터를 HindIII을 사용하여 직선화한 것을 FastGene Gel/PCR 익스트랙션 키트(닛폰 제네틱스사)를 사용하여 정제하고, T7 mScript Standard mRNA Production System(CELLSCRIPT사제)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라서, 시험관 내 전사 및 캡화, polyA 부가를 행하였다. 합성한 mRNA를 실시예 3A의 항원 제시 세포를 유도하는 RNA로서 사용하였다(도 24의 (b)).
시험예 7A: mRNA에 의해 유도되는 네오안티겐을 제시하는 항원 제시 세포의 플로 사이토메트리 해석
293T 세포를 세포 배양 디쉬에 파종하고, 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지에서 배양하였다. 약 50％ 콘플루언스의 세포에, 제조업자의 지시에 따라서, 실시예 3A의 mRNA를 TransIT-mRNA Transfection Kit(Mirus사제)를 사용하여 각각 형질 감염하였다. 형질 감염의 24시간 후, 293T 세포를 회수하고, 제조업자의 지시에 따라서 면역 염색을 행하였다. 염색에 사용한 항체는 이하와 같다(염색 시간: 15분, 온도: 4℃). 염색 후, 각 단백질의 발현을, 플로 사이토미터 FACSCantoII(BD 바이오사이언시스사제)로 검출하였다.
·PE 콘쥬게이트 항마우스 β2-microglobulin 항체(A16041A Biolegend사제)
·FITC 콘쥬게이트 항마우스 CD80 항체(16-10A1 Biolegend사제)
·APC 콘쥬게이트 항마우스 IL-2 항체(JES6-5H4 Biolegend사제)
[결과]
시험예 7A의 결과로부터, 실시예 3A의 mRNA를 293T 세포에 형질 감염함으로써, 293T 세포 상에 네오안티겐-MHCI 복합체, CD80 및 IL-2를 발현시켰다(도 27).
시험예 8A: 생체 내에서 유도한 항원 제시 세포에 의한 내재성 Gtf2i 반응성 T 세포의 활성화 실험
실시예 3A 혹은 참고예 1A의 mRNA 3μg을 제조업자의 지시에 따라서, 생체 내-jetRNA 형질 감염 시약(Polyplus사)과 혼합하고, C57BL/6 마우스의 미정맥으로부터 이입하였다. 이입 7일 후, 레시피언트 마우스로부터 비장을 적출하여, 림프구 현탁액을 조제하고, Gtf2i 반응성 T 세포를 제조업자의 지시에 따라서, 테트라머로 면역 염색을 행하였다. 염색에 사용한 항체는 이하와 같다. 염색 후, 테트라머 양성 세포를 플로 사이토미터 FACSCantoII(BD 바이오사이언시스사제)로 검출하였다.
·FITC-콘쥬게이트 항마우스 CD62L 항체(MEL14 Biolegend사제)
·APC 콘쥬게이트 H-2Kb Gtf2ip Tetramer(TETRAMER SHOP사)
·PE 콘쥬게이트 H-2Kb Gtf2ip Tetramer(TETRAMER SHOP사)
·PE/Cyanine7 콘쥬게이트 항마우스 CD8 항체(53-6.7 Biolegend사제)
·APC/Cyanine7-콘쥬게이트 항마우스 CD44 항체(IM7 Biolegend사제)
[결과]
시험예 8A의 결과로부터, 실시예 3A의 mRNA는, 참고예 1A의 mRNA와 비교하여, 현저하게 내재성에 존재하는 Gtf2i 반응성 CD8T 세포를 증식시켰다(도 28). 또한 증식된 세포는 CD44hiCD62low의 이펙터 메모리 페노타입이 되었다. 특히 원리에 구애받지 않지만, 본 발명에 관한 mRNA가 C57BL/6 마우스 체 내의 임의의 세포에 도입되고, 그 세포의 막 표면에 네오안티겐-MHCI, IL-2-CD8 및 CD80 단백질이 각각 발현된 항원 제시 세포가 유도되고, 내재성의 T 세포가 항원 제시 세포와 접촉하여, 네오안티겐 반응성 CD8T 세포가 증식되었다고 해석된다.
[실시예 4A] OVAp-MHCIIβ-P2A-MHCIIα-T2A-IL-12sc-CD8-P2A-CD80을 코딩하는 mRNA의 조제
OVAp-MHCIIβ-P2A-MHCIIα-T2A-IL-12sc-CD8-P2A-CD80을 코딩하는 T7 프로모터, 3'UTR에 인간 α글로불린 서열 및 129 염기의 polyA 서열을 갖는 벡터를 HindIII을 사용하여 직선화한 것을 FastGene Gel/PCR 익스트랙션 키트(닛폰 제네틱스사)를 사용하여 정제하고, HiScribe T7mRNA Kit with CleanCap Reagent AG(New England Biolabs사제)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라서, 시험관 내 전사 및 캡화를 행하였다. 합성한 mRNA를 실시예 4A의 항원 제시 세포를 유도하는 RNA로서 사용하였다(도 24의 (c)).
시험예 9A: mRNA에 의해 유도되는 항원 제시 세포의 플로 사이토메트리 해석
293T 세포를 세포 배양 디쉬에 파종하고, 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지에서 배양하였다. 약 50％ 콘플루언스의 세포에, 제조업자의 지시에 따라서, 실시예 4A의 mRNA를 TransIT-mRNA Transfection Kit(Mirus사제)를 사용하여 형질 감염하였다. 형질 감염의 24시간 후, 293T 세포를 회수하고, 제조업자의 지시에 따라서 면역 염색을 행하였다. 염색에 사용한 항체는 이하와 같다(염색 시간: 15분, 온도: 4℃). 염색 후, 각 단백질의 발현을, 플로 사이토미터 FACSCantoII(BD 바이오사이언시스사제)로 검출하였다.
·PE 콘쥬게이트 항마우스 IL-12/IL23 p40 항체(25-D1.16 Biolegend사제)
·FITC 콘쥬게이트 항마우스 CD80 항체(16-10A1 Biolegend사제)
·APC 콘쥬게이트 항MHCII 항체(M5/114.15.2 Biolegend사제)
[결과]
시험예 9A의 결과로부터, 실시예 4A의 mRNA를 293T 세포에 형질 감염함으로써, 293T 세포 상에 OVA-MHCII 복합체, CD80 및 IL-12를 발현시켰다(도 29).
시험예 10A: 생체 내에서 유도한 항원 제시 세포에 의한 내재성 OVA 반응성 T 세포의 활성화 실험
항원 제시 세포가 항원 특이적 CD4 양성 T 세포를 Th1 세포로 분화시키는지 여부를 조사하기 위해서, 생체 내에 있어서 이하의 시험을 실시하였다.
OVA 반응성 TCR 트랜스제닉 마우스인 OT-II 마우스로부터 림프절을 적출하여, 100㎛ 필터 상에서 파쇄하고, 림프절 세포 현탁액을 얻었다. 세포 증식 어세이 시약인 CellTrace Violet를 사용하여 염색한 후, PBS에 현탁시킨 5×106개의 CellTrace Violet 염색한 림프구 현탁액을, CD45.1 콘제닉 마우스의 미정맥으로부터 이입하였다. 다음날, 실시예 4A 혹은 참고예 1A 혹은 참고예 2A의 mRNA 10μg을 제조업자의 지시에 따라서, 생체 내-jetRNA 형질 감염 시약(Polyplus사)과 혼합하고, CD45.1 콘제닉 마우스에 미정맥으로부터 이입하였다. mRNA 이입 7일 후, 레시피언트 마우스로부터 비장을 적출하여, 림프구 현탁액을 조제하고, 면역 염색을 행하였다. 염색에 사용한 항체는 이하와 같다(염색 시간: 15분, 온도: 4℃). 염색 후, 이입한 OVA 반응성 CD4T 세포에 있어서의 세포 증식 어세이 시약인 CellTrace Violet의 발광 강도를 플로 사이토미터 FACSCantoII(BD 바이오사이언시스사제)로 검출하였다.
·PE-Cy7 콘쥬게이트 항T-bet 항체(4B10 Biolegend사제)
·PE 콘쥬게이트 항마우스 TCR Vb5.1, 5.2 항체(MR9-4 Biolegend사제)
·FITC 콘쥬게이트 항마우스 CD45.1 항체(A20 Biolegend사제)
·APC 콘쥬게이트 항마우스 CD45.2 항체(104 Biolegend사제)
·APC-Cy7 콘쥬게이트 항마우스 CD4 항체(RM4-5 Biolegend사제)
결과를 도 30에 나타낸다.
[결과]
시험예 10A의 결과로부터, 실시예 4A의 mRNA는, 참고예 1A 및 참고예 2A의 mRNA와 비교하여, 현저하게 OVA 반응성 CD4T 세포를 증식시켰다(도 30). 또한 증식된 세포의 일부는 T-bet 양성의 Th1 세포로 분화되었다. 특히 원리에 구애받지 않지만, 본 발명에 관한 mRNA가 C57BL/6 마우스 체 내의 임의의 세포에 도입되고, 그 세포의 막 표면에 OVA-MHCII, IL-12 및 CD80 단백질이 각각 발현된 항원 제시 세포가 유도되고, OVA 반응성 CD4T 세포 세포가 항원 제시 세포와 접촉하여, 증식 및 Th1 세포로 분화되었다고 풀이된다.
[실시예 5A] sc-Trimer(RPL18 펩티드)-CD81-IL-2 융합 단백질을 발현하는 mRNA의 조제
OVA 펩티드 대신에 MC38 대장암 세포주 유래의 네오안티겐(암 항원)인 변이 RPL18 펩티드를 제시하는 sc-Trimer(RPL18 펩티드)-CD81-IL-2를 코딩하는 pET-15b 벡터를 EagI를 사용하여 직선화한 것을 FastGene Gel/PCR 익스트랙션 키트(닛폰 제네틱스사)를 사용하여 정제하고, T7 mScript Standard mRNA Production System(CELLSCRIPT사제)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라서, 시험관 내 전사 및 캡화, polyA 부가를 행하였다. 합성한 mRNA를 실시예 5A의 항원 제시 세포 및 항원 제시 세포 외 소포를 산출하는 RNA로서 사용하였다.
시험예 11A: sc-Trimer(RPL18 펩티드)-CD81-IL-2 융합 단백질을 발현하는 mRNA에 의한 내재성 RPL18 펩티드 반응성 T 세포의 활성화 실험
실시예 5A 혹은 참고예 6의 mRNA 10μg을 제조업자의 지시에 따라서, 생체 내-jetRNA 형질 감염 시약(Polyplus사)과 혼합하고, C57BL/6 마우스의 미정맥으로부터 이입하였다. 이입 4일 후, 레시피언트 마우스로부터 비장을 적출하여, 림프구 현탁액을 조제하고, RPL18 펩티드 반응성 T 세포를 제조업자의 지시에 따라서, 테트라머로 면역 염색을 행하였다. 염색에 사용한 항체는 이하와 같다. 염색 후, 테트라머 양성 세포를 플로 사이토미터 FACSCantoII(BD 바이오사이언시스사제)로 검출하였다.
·APC 콘쥬게이트 H-2Kb RPL18 Tetramer(TETRAMER SHOP사)
·PE 콘쥬게이트 H-2Kb RPL18 Tetramer(TETRAMER SHOP사)
·Brilliant Violet421 콘쥬게이트 항마우스 CD8 항체(53-6.7 Biolegend사제)
시험예 11A의 결과로부터, 실시예 5A의 mRNA는, 참고예 6의 mRNA와 비교하여, 현저하게 내재성에 존재하는 RPL18 반응성 CD8T 세포를 증식시켰다(도 31). 특히 원리에 구애받지 않지만, 본 발명에 관한 폴리뉴클레오티드가 C57BL/6 마우스 체 내의 임의의 세포에 도입되고, 그 세포의 막 표면 및/또는 그 세포로부터 분비되는 세포 외 소포의 막 표면에 sc-Trimer-CD81-IL-2 융합 단백질이 발현되고, 항원 제시 세포 및/또는 항원 제시 세포 외 소포가 생성되고, 그 생성된 항원 제시 세포 및/또는 항원 제시 세포 외 소포와, 내재성의 T 세포가 접촉하여, RPL18 반응성 CD8T 세포가 증식되었다고 해석된다. 이것은 상기 시험예 1 내지 10에서 나타낸, 항원 제시 세포 외 소포의 의약으로서의 효과와 동등한 효과가 항원 제시 세포 및/또는 항원 제시 세포 외 소포를 제작하기 위한 폴리뉴클레오티드에서도 생체 내에 있어서 얻어지는 것을 나타내고 있다.
[실시예 1B] MHC 클래스 I 분자 및 T 세포 자극성 사이토카인을 막에 포함하는 항원 제시 세포 외 소포를 제작하기 위한 폴리뉴클레오티드
sc-Trimer-CD81 및 CD63-IL-2를 각각 코딩하는 pET-15b 벡터를 직선화한 것을 FastGene Gel/PCR 익스트랙션 키트(닛폰 제네틱스사)를 사용하여 정제하고, T7 mScript Standard mRNA Production System(CELLSCRIPT사제)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라서, 시험관 내 전사 및 캡화, polyA 부가를 행한다. 합성한 mRNA를 1:1로 혼합 후, 실시예 1B의 항원 제시 세포 외 소포를 산출하기 위한 RNA로서 사용한다.
[실시예 2B] MHC 클래스 I 분자, T 세포 공자극 분자 및 T 세포 자극성 사이토카인을 막에 포함하는 항원 제시 세포 외 소포를 제작하기 위한 폴리뉴클레오티드
sc-Trimer-CD81, CD80-CD9 및 CD63-IL-2를 각각 코딩하는 pET-15b 벡터를 직선화한 것을 FastGene Gel/PCR 익스트랙션 키트(닛폰 제네틱스사)를 사용하여 정제하고, T7 mScript Standard mRNA Production System(CELLSCRIPT사제)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라서, 시험관 내 전사 및 캡화, polyA 부가를 행한다. 합성한 mRNA를 1:1:1로 혼합 후, 실시예 2B의 항원 제시 세포 외 소포를 산출하기 위한 RNA로서 사용한다.
[참고예 2B] MHC 클래스 I 분자를 막에 포함하는 세포 외 소포를 제작하기 위한 폴리뉴클레오티드
sc-Trimer-CD81을 코딩하는 pET-15b 벡터를 직선화한 것을 FastGene Gel/PCR 익스트랙션 키트(닛폰 제네틱스사)를 사용하여 정제하고, T7 mScript Standard mRNA Production System(CELLSCRIPT사제)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라서, 시험관 내 전사 및 캡화, polyA 부가를 행한다. 합성한 mRNA를 참고예 2B의 항원 제시 세포 외 소포를 산출하기 위한 RNA로서 사용한다.
[참고예 3B] T 세포 공자극 분자를 막에 포함하는 세포 외 소포를 제작하기 위한 폴리뉴클레오티드
CD80-CD9를 코딩하는 pET-15b 벡터를 직선화한 것을 FastGene Gel/PCR 익스트랙션 키트(닛폰 제네틱스사)를 사용하여 정제하고, T7 mScript Standard mRNA Production System(CELLSCRIPT사제)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라서, 시험관 내 전사 및 캡화, polyA 부가를 행한다. 합성한 mRNA를 참고예 3B의 항원 제시 세포 외 소포를 산출하기 위한 RNA로서 사용한다.
[참고예 4B] T 세포 자극성 사이토카인을 막에 포함하는 세포 외 소포를 제작하기 위한 폴리뉴클레오티드
CD63-IL-2를 코딩하는 pET-15b 벡터를 직선화한 것을 FastGene Gel/PCR 익스트랙션 키트(닛폰 제네틱스사)를 사용하여 정제하고, T7 mScript Standard mRNA Production System(CELLSCRIPT사제)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라서, 시험관 내 전사 및 캡화, polyA 부가를 행한다. 합성한 mRNA를 참고예 4B의 항원 제시 세포 외 소포를 산출하기 위한 RNA로서 사용한다.
[참고예 5B] MHC 클래스 I 분자 및 T 세포 공자극 분자를 막에 포함하는 세포 외 소포를 제작하기 위한 폴리뉴클레오티드
sc-Trimer-CD81 및 CD80-CD9를 각각 코딩하는 pET-15b 벡터를 직선화한 것을 FastGene Gel/PCR 익스트랙션 키트(닛폰 제네틱스사)를 사용하여 정제하고, T7 mScript Standard mRNA Production System(CELLSCRIPT사제)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라서, 시험관 내 전사 및 캡화, polyA 부가를 행한다. 합성한 mRNA를 1:1로 혼합하고, 참고예 5B의 항원 제시 세포 외 소포를 산출하기 위한 RNA로서 사용한다.
시험예 3B: 생체 내에 있어서의, 항원 제시 세포 외 소포를 제작하기 위한 폴리뉴클레오티드에 의한, OVA 특이적 CD8 양성 T 세포(OT-1 T 세포)의 활성화 실험
OVA 반응성 TCR 트랜스제닉 마우스인 OT-1 마우스로부터 림프절을 적출하여, 시험예 2B와 마찬가지로 림프구 현탁액을 조제한다. CD45.1 콘제닉 마우스로부터도 마찬가지로 림프절을 적출하여, 림프구 현탁액을 조제한다. 각각의 림프구 현탁액을 1:1의 비율로 혼합하고, 세포 증식 어세이 시약인 CellTrace Violet를 사용하여 염색한다. PBS에 현탁시킨 1×107개의 CellTrace Violet 염색한 혼합 림프구 현탁액을, CD45.1/CD45.2 콘제닉 마우스의 미정맥으로부터 이입한다. 다음날, 실시예 1A 내지 5A, 참고예 2A 내지 5A의 mRNA 각각 50μg을 생체 내-jetRNA 형질 감염 시약(Polyplus사)과 혼합하고, CD45.1/CD45.2 콘제닉 마우스에 미정맥으로부터 이입한다. 세포 이입 4일 후, 레시피언트 마우스로부터 림프절을 적출하여, 림프구 현탁액을 조제하고, 면역 염색을 행함으로써, 각종 T 세포를 검출 및 정량한다.
실시예 1B 및 2B의 mRNA는, 생체 내에 있어서, 항원 특이적인 CD8 양성 T 세포를 현저하게 분화 및/또는 증식시킬 수 있다.
[실시예 3B] MHC 클래스 II 분자, T 세포 공자극 분자 및 T 세포 자극성 사이토카인을 막에 포함하는 항원 제시 세포 외 소포 1을 제작하기 위한 폴리뉴클레오티드
sc-Dimer-CD81, MHC 클래스 IIα쇄, CD80-CD9 및 CD63-IL-2를 각각 코딩하는 pET-15b 벡터를 직선화한 것을 FastGene Gel/PCR 익스트랙션 키트(닛폰 제네틱스사)를 사용하여 정제하고, T7 mScript Standard mRNA Production System(CELLSCRIPT사제)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라서, 시험관 내 전사 및 캡화, polyA 부가를 행한다. 합성한 mRNA를 1:1:1:1로 혼합 후, 실시예 3B의 항원 제시 세포 외 소포를 산출하기 위한 RNA로서 사용한다.
시험예 4B: 생체 내에 있어서의, 항원 제시 세포 외 소포를 제작하기 위한 폴리뉴클레오티드에 의한, OVA 특이적 CD4 양성 T 세포(OT-2 T 세포)의 활성화 실험
OVA 반응성 CD4TCR 트랜스제닉 마우스인 OT-2 마우스로부터 림프절을 적출하여, 시험예 2와 마찬가지로 림프구 현탁액을 조제한다. CD45.1 콘제닉 마우스로부터도 마찬가지로 림프절을 적출하여, 림프구 현탁액을 조제한다. 각각의 림프구 현탁액을 1:1의 비율로 혼합하고, 세포 증식 어세이 시약인 CellTrace Violet를 사용하여 염색한다. PBS에 현탁시킨 1×107개의 CellTrace Violet 염색한 혼합 림프구 현탁액을, CD45.1/CD45.2 콘제닉 마우스의 미정맥으로부터 이입한다. 다음날, 실시예 3B의 mRNA 50μg을 생체 내-jetRNA 형질 감염 시약(Polyplus사)과 혼합하고, CD45.1/CD45.2 콘제닉 마우스에 미정맥으로부터 이입한다. 세포 이입 4일 후, 레시피언트 마우스로부터 림프절을 적출하여, 림프구 현탁액을 조제하고, 면역 염색을 행함으로써, 각종 T 세포를 검출 및 정량한다.
실시예 3B의 mRNA는, 생체 내에 있어서, 항원 특이적인 CD4 양성 T 세포를 현저하게 분화 및/또는 증식시킬 수 있다.
[실시예 4B] MHC 클래스 II 분자, T 세포 공자극 분자 및 T 세포 자극성 사이토카인을 막에 포함하는 항원 제시 세포 외 소포 2를 제작하기 위한 폴리뉴클레오티드
sc-Dimer-CD81, MHC 클래스 IIα쇄, CD80-CD9, TGF-β-MFGE8 및 CD63-IL-2를 각각 코딩하는 pET-15b 벡터를 직선화한 것을 FastGene Gel/PCR 익스트랙션 키트(닛폰 제네틱스사)를 사용하여 정제하고, T7 mScript Standard mRNA Production System(CELLSCRIPT사제)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라서, 시험관 내 전사 및 캡화, polyA 부가를 행한다. 합성한 mRNA를 1:1:1:1:1로 혼합 후, 실시예 4B의 항원 제시 세포 외 소포를 제작하기 위한 RNA로서 사용한다.
시험예 5B: 생체 내에 있어서의, 항원 제시 세포 외 소포를 제작하기 위한 폴리뉴클레오티드에 의한, OVA 특이적 CD4 양성 T 세포(OT-2 T 세포)의 활성화 실험
OVA 반응성 CD4TCR 트랜스제닉 마우스인 OT-2 마우스로부터 림프절을 적출하여, 시험예 2B와 마찬가지로 림프구 현탁액을 조제한다. CD45.1 콘제닉 마우스로부터도 마찬가지로 림프절을 적출하여, 림프구 현탁액을 조제한다. 각각의 림프구 현탁액을 1:1의 비율로 혼합하고, 세포 증식 어세이 시약인 CellTrace Violet를 사용하여 염색한다. PBS에 현탁시킨 1×107개의 CellTrace Violet 염색한 혼합 림프구 현탁액을, CD45.1/CD45.2 콘제닉 마우스의 미정맥으로부터 이입한다. 다음날, 실시예 4B의 mRNA 50μg을 생체 내-jetRNA 형질 감염 시약(Polyplus사)과 혼합하고, CD45.1/CD45.2 콘제닉 마우스에 미정맥으로부터 이입한다. 세포 이입 4일 후, 레시피언트 마우스로부터 림프절을 적출하여, 림프구 현탁액을 조제하고, 면역 염색을 행함으로써, 각종 T 세포를 검출 및 정량한다.
실시예 4B의 mRNA는, 생체 내에 있어서, 항원 특이적인 제어성 T 세포를 현저하게 분화 및/또는 증식시킬 수 있다.
[실시예 5B] MHC 클래스 II 분자, T 세포 공자극 분자 및 T 세포 자극성 사이토카인을 막에 포함하는 항원 제시 세포 외 소포 3을 제작하기 위한 폴리뉴클레오티드
sc-Dimer-CD81, MHC 클래스 IIα쇄, CD80-CD9 및 CD81-IL-4를 각각 코딩하는 pET-15b 벡터를 직선화한 것을 FastGene Gel/PCR 익스트랙션 키트(닛폰 제네틱스사)를 사용하여 정제하고, T7 mScript Standard mRNA Production System(CELLSCRIPT사제)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라서, 시험관 내 전사 및 캡화, polyA 부가를 행한다. 합성한 mRNA를 1:1:1:1로 혼합 후, 실시예 5B의 항원 제시 세포 외 소포를 제작하기 위한 RNA로서 사용한다.
시험예 6B: 생체 내에 있어서의, 항원 제시 세포 외 소포를 제작하기 위한 폴리뉴클레오티드에 의한, OVA 특이적 CD4 양성 T 세포(OT-2 T 세포)의 활성화 실험
OVA 반응성 CD4TCR 트랜스제닉 마우스인 OT-2 마우스로부터 림프절을 적출하여, 시험예 2와 마찬가지로 림프구 현탁액을 조제한다. CD45.1 콘제닉 마우스로부터도 마찬가지로 림프절을 적출하여, 림프구 현탁액을 조제한다. 각각의 림프구 현탁액을 1:1의 비율로 혼합하고, 세포 증식 어세이 시약인 CellTrace Violet를 사용하여 염색한다. PBS에 현탁시킨 1×107개의 CellTrace Violet 염색한 혼합 림프구 현탁액을, CD45.1/CD45.2 콘제닉 마우스의 미정맥으로부터 이입한다. 다음날, 실시예 3A 또는 5A의 mRNA 50μg을 생체 내-jetRNA 형질 감염 시약(Polyplus사)과 각각 혼합하고, CD45.1/CD45.2 콘제닉 마우스에 미정맥으로부터 이입한다. 세포 이입 4일 후, 레시피언트 마우스로부터 림프절을 적출하여, 림프구 현탁액을 조제하고, 면역 염색을 행함으로써, 각종 T 세포를 검출 및 정량한다.
실시예 3B 및 5B의 mRNA는, 생체 내에 있어서, 항원 특이적인 Th2 세포를 현저하게 분화 및/또는 증식시킬 수 있다.
[실시예 6B] MHC 클래스 II 분자, T 세포 공자극 분자 및 T 세포 자극성 사이토카인을 막에 포함하는 항원 제시 세포 외 소포 4를 제작하기 위한 폴리뉴클레오티드
sc-Dimer-CD81-IL-12p40, MHC 클래스 IIα쇄, CD80-CD9 및 IL-12p35를 각각 코딩하는 pET-15b 벡터를 직선화한 것을 FastGene Gel/PCR 익스트랙션 키트(닛폰 제네틱스사)를 사용하여 정제하고, T7 mScript Standard mRNA Production System(CELLSCRIPT사제)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라서, 시험관 내 전사 및 캡화, polyA 부가를 행한다. 합성한 mRNA를 1:1:1:1로 혼합 후, 실시예 6B의 항원 제시 세포 외 소포를 제작하기 위한 RNA로서 사용한다.
[실시예 7B] MHC 클래스 II 분자, T 세포 공자극 분자 및 T 세포 자극성 사이토카인을 막에 포함하는 항원 제시 세포 외 소포 5를 제작하기 위한 폴리뉴클레오티드
sc-Dimer-CD81, MHC 클래스 IIα쇄, CD80-CD9, CD81-IL-6 및 TGF-β-MFGE8을 각각 코딩하는 pET-15b 벡터를 직선화한 것을 FastGene Gel/PCR 익스트랙션 키트(닛폰 제네틱스사)를 사용하여 정제하고, T7 mScript Standard mRNA Production System(CELLSCRIPT사제)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라서, 시험관 내 전사 및 캡화, polyA 부가를 행한다. 합성한 mRNA를 1:1:1:1:1로 혼합 후, 실시예 7B의 항원 제시 세포 외 소포를 제작하기 위한 RNA로서 사용한다.
[실시예 8B] MHC 클래스 I 분자, T 세포 공자극 분자 및 T 세포 자극성 사이토카인을 막에 포함하는 항원 제시 세포 외 소포를 제작하기 위한 폴리뉴클레오티드
CD80-CD9, sc-Trimer-CD81-IL-2를 각각 코딩하는 pET-15b 벡터를 직선화한 것을 FastGene Gel/PCR 익스트랙션 키트(닛폰 제네틱스사)를 사용하여 정제하고, T7 mScript Standard mRNA Production System(CELLSCRIPT사제)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라서, 시험관 내 전사 및 캡화, polyA 부가를 행한다. 합성한 mRNA를 1:1로 혼합 후, 실시예 8B의 항원 제시 세포 외 소포를 제작하기 위한 RNA로서 사용한다.
[실시예 9B] HLA 클래스 I 분자, 인간 T 세포 공자극 분자 및 인간 T 세포 자극성 사이토카인을 막에 포함하는 항원 제시 세포 외 소포를 제작하기 위한 폴리뉴클레오티드
hsc-Trimer-hCD81, hCD80-hCD9 및 hCD63-IL2를 각각 코딩하는 pET-15b 벡터를 직선화한 것을 FastGene Gel/PCR 익스트랙션 키트(닛폰 제네틱스사)를 사용하여 정제하고, T7 mScript Standard mRNA Production System(CELLSCRIPT사제)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라서, 시험관 내 전사 및 캡화, polyA 부가를 행한다. 합성한 mRNA를 1:1:1로 혼합 후, 실시예 7A의 항원 제시 세포 외 소포를 산출하기 위한 RNA로서 사용한다.
시험예 7B: 생체 내에 있어서의, 항원 제시 세포 외 소포를 제작하기 위한 폴리뉴클레오티드에 의한, OVA 특이적 CD4 양성 T 세포(OT-2 T 세포)의 활성 분화화 실험
OVA 반응성 CD4TCR 트랜스제닉 마우스인 OT-2 마우스로부터 림프절을 적출하여, 시험예 2와 마찬가지로 림프구 현탁액을 조제한다. CD45.1 콘제닉 마우스로부터도 마찬가지로 림프절을 적출하여, 림프구 현탁액을 조제한다. 각각의 림프구 현탁액을 1:1의 비율로 혼합하고, 세포 증식 어세이 시약인 CellTrace Violet를 사용하여 염색한다. PBS에 현탁시킨 1×107개의 CellTrace Violet 염색한 혼합 림프구 현탁액을, CD45.1/CD45.2 콘제닉 마우스의 미정맥으로부터 이입한다. 다음날, 실시예 3B 또는 6B의 mRNA 50μg을 생체 내-jetRNA 형질 감염 시약(Polyplus사)과 각각 혼합하고, CD45.1/CD45.2 콘제닉 마우스에 미정맥으로부터 이입한다. 세포 이입 4일 후, 레시피언트 마우스로부터 림프절을 적출하여, 림프구 현탁액을 조제하고, 면역 염색을 행함으로써, 각종 T 세포를 검출 및 정량한다.
실시예 3B 및 6B의 mRNA는, 생체 내에 있어서, 항원 특이적인 Th1 세포를 현저하게 분화 및/또는 증식시킬 수 있다.
시험예 8B: 생체 내에 있어서의, 항원 제시 세포 외 소포를 제작하기 위한 폴리뉴클레오티드에 의한, OVA 특이적 CD4 양성 T 세포(OT-2 T 세포)의 활성 분화 실험
OVA 반응성 CD4TCR 트랜스제닉 마우스인 OT-2 마우스로부터 림프절을 적출하여, 시험예 2와 마찬가지로 림프구 현탁액을 조제한다. CD45.1 콘제닉 마우스로부터도 마찬가지로 림프절을 적출하여, 림프구 현탁액을 조제한다. 각각의 림프구 현탁액을 1:1의 비율로 혼합하고, 세포 증식 어세이 시약인 CellTrace Violet를 사용하여 염색한다. PBS에 현탁시킨 1×107개의 CellTrace Violet 염색한 혼합 림프구 현탁액을, CD45.1/CD45.2 콘제닉 마우스의 미정맥으로부터 이입한다. 다음날, 실시예 7B의 mRNA 50μg을 생체 내-jetRNA 형질 감염 시약(Polyplus사)과 혼합하고, CD45.1/CD45.2 콘제닉 마우스에 미정맥으로부터 이입한다. 세포 이입 4일 후, 레시피언트 마우스로부터 림프절을 적출하여, 림프구 현탁액을 조제하고, 면역 염색을 행함으로써, 각종 T 세포를 검출 및 정량한다.
실시예 7B의 mRNA는, 생체 내에 있어서, 항원 특이적인 Th17 세포를 현저하게 분화 및/또는 증식시킬 수 있다.
시험예 9B: 생체 내에 있어서의, 항원 제시 세포 외 소포를 제작하기 위한 폴리뉴클레오티드에 의한, OVA 특이적 CD8 양성 T 세포(OT-1 T 세포)의 활성화 실험
OVA 반응성 TCR 트랜스제닉 마우스인 OT-1 마우스로부터 림프절을 적출하여, 시험예 2B와 마찬가지로 림프구 현탁액을 조제한다. CD45.1 콘제닉 마우스로부터도 마찬가지로 림프절을 적출하여, 림프구 현탁액을 조제한다. 각각의 림프구 현탁액을 1:1의 비율로 혼합하고, 세포 증식 어세이 시약인 CellTrace Violet를 사용하여 염색한다. PBS에 현탁시킨 1×107개의 CellTrace Violet 염색한 혼합 림프구 현탁액을, CD45.1/CD45.2 콘제닉 마우스의 미정맥으로부터 이입한다. 다음날, 실시예 8B의 mRNA 50μg을 생체 내-jetRNA 형질 감염 시약(Polyplus사)과 혼합하고, CD45.1/CD45.2 콘제닉 마우스에 미정맥으로부터 이입한다. 세포 이입 4일 후, 레시피언트 마우스로부터 림프절을 적출하여, 림프구 현탁액을 조제하고, 면역 염색을 행함으로써, 각종 T 세포를 검출 및 정량한다.
실시예 8B의 mRNA는, 생체 내에 있어서, 항원 특이적인 CD8 양성 T 세포를 현저하게 분화 및/또는 증식시킬 수 있다.
시험예 10B: 항원 제시 세포 외 소포를 제작하기 위한 폴리뉴클레오티드에 의한, 항종양 효과의 평가 실험
CD45.1/CD45.2 콘제닉 마우스에 OVA를 발현하는 B16 멜라노마 세포 1×105개를 피하에 섭취하고, 3일 후 1×105개의 OT-1T 세포를 이입한다. OT-1T 세포 이입 후, 1일, 4일, 7일 후에 실시예 8B의 mRNA 50μg을 생체 내-jetRNA 형질 감염 시약(Polyplus사)과 혼합하고, 레시피언트 마우스의 미정맥으로부터 이입하고, B16 멜라노마 세포의 크기를 관찰한다.
실시예 8B의 mRNA는 B16 멜라노마 세포의 증식을 현저하게 억제할 수 있다.
시험예 13B: 생체 내에 있어서의, 항원 제시 세포 외 소포를 제작하기 위한 폴리뉴클레오티드에 의한, OVA 특이적 CD4 양성 T 세포(OT-2 T 세포)의 Th1T 세포로의 분화 유도 실험
OVA 반응성 TCR 트랜스제닉 마우스인 OT-2 마우스로부터 림프절을 적출하여, 100㎛ 필터 상에서 파쇄하고, 림프절 세포 현탁액을 얻는다. CD45.1 콘제닉 마우스로부터도 마찬가지로 림프절을 적출하여, 림프구 현탁액을 조제한다. 각각의 림프구 현탁액을 1:1의 비율로 혼합하고, 세포 증식 어세이 시약인 CellTrace Violet를 사용하여 염색한다. PBS에 현탁시킨 1×107개의 CellTrace Violet 염색한 혼합 림프구 현탁액을, CD45.1/CD45.2 콘제닉 마우스의 미정맥으로부터 이입한다. 림프구 이입 후, 1일 및 4일 후, 실시예 6B 혹은 참고예 1B의 mRNA 50μg을, 생체 내-jetRNA 형질 감염 시약(Polyplus사)과 혼합하고, 레시피언트 마우스의 미정맥으로부터 이입한다. mRNA 이입 7일 후, 레시피언트 마우스로부터 비장을 적출하여, 림프구 현탁액을 조제하고, 면역 염색을 행한다. 염색에는 이하의 항체를 사용한다(염색 시간: 15분, 온도: 4℃). 염색 후, 이입한 OT-2 T 세포 및 야생형 CD4T 세포에 있어서의 세포 증식 어세이 시약인 CellTrace Violet의 발광 강도를 플로 사이토미터 FACSCantoII(BD 바이오사이언시스사제)로 검출한다.
[결과]
실시예 6B의 mRNA는 항원 특이적 CD4 양성 T 세포를 Th1 세포로 분화시킬 수 있다.
시험예 14B: 항원 제시 세포 외 소포를 제작하기 위한 폴리뉴클레오티드에 의한, 항종양 효과의 평가 실험
실시예 6B의 mRNA가, 항종양 효과를 갖는지 여부를 조사하기 위해 CD45.1/CD45.2 콘제닉 마우스에 OVA를 발현하는 B16 멜라노마 세포 1×105개를 피하에 섭취하고, 1일 후 5×105개의 OT-2T 세포를 이입한다. OT-2T 세포 이입 후, 1일, 4일, 7일 후에 실시예 6B의 mRNA 혹은 참고예 1B의 mRNA 50μg을, 생체 내-jetRNA 형질 감염 시약(Polyplus사)과 혼합하고, 레시피언트 마우스의 미정맥으로부터 이입하고, B16 멜라노마 세포의 크기를 관찰한다.
실시예 6B의 mRNA는, B16 멜라노마 세포의 증식을 억제한다.
[실시예 11B] HLA 클래스 II 분자, 인간 T 세포 공자극 분자 및 인간 T 세포 자극성 사이토카인을 막에 포함하는 항원 제시 세포 외 소포를 제작하기 위한 폴리뉴클레오티드
HLADR-1sc-TPI1-hCD81, hCD80-hCD9, hIL-12sc-MFGe8을 각각 코딩하는 pET-15b 벡터를 직선화한 것을 FastGene Gel/PCR 익스트랙션 키트(닛폰 제네틱스사)를 사용하여 정제하고, T7 mScript Standard mRNA Production System(CELLSCRIPT사제)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라서, 시험관 내 전사 및 캡화, polyA 부가를 행한다. 합성한 mRNA를 1:1:1로 혼합 후, 실시예 11B의 항원 제시 세포 외 소포를 제작하기 위한 RNA로서 사용한다.
시험예 16B: 시험관 내에 있어서의, 항원 제시 세포 외 소포를 제작하기 위한 폴리뉴클레오티드에 의한 TPI-1 특이적 인간 CD4 양성 T 세포의 Th1T 세포로의 분화 유도 실험
PlatA 세포에 TPI-1 펩티드 특이적인 TCR 및 형광 단백 Venus를 코딩한 pMXs 벡터를 Polyethylenimine"Max"(Polysciences사제)를 사용하여 형질 감염한다. 형질 감염의 3-12시간 후에 배지를 교환하고, 형질 감염의 48시간 후, 72시간 후에 상청을 회수하고, 상청을 0.22㎛ 필터에 통과시키고, TPI-1 특이적 TCR을 발현하는 레트로바이러스 상청을 제작한다. HLA-DR1 양성의 레시피언트로부터 말초혈을 채취하고, Ficol을 사용하여 말초혈 단핵구 세포를 분리하고, 2.0×106개의 말초혈 단핵구 세포를 10％ 소태아 혈청, 50μM 2-머캅토에탄올 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 RPMI1640 배지 200μL에 현탁시키고, 최종 농도가 20ng/mL가 되도록 인간 IL-2 및 25μl의 다이나비즈를 혼합하고, 6웰 플레이트에서 24시간 자극을 한다. 상기에서 조제한 바이러스 입자를, 레트로넥틴(TAKARA사)을 사용하여 제조업자의 지시대로 감염시켜, TPI-1 펩티드 특이적인 TCR 및 형광 단백 Venus를 동시에 발현하는 인간 T 세포를 제작한다. 제작한 인간 T 세포에, 실시예 11B 혹은 참고예 1B의 mRNA를 생체 내-jetRNA 형질 감염 시약(Polyplus사)과 혼합 후, 첨가하여, 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 7일간 배양한다.
[결과]
실시예 11B의 RNA는, 시험관 내에 있어서, 항원 특이적 CD4 양성 T 세포를 Th1 세포로 분화 유도할 수 있다.
[실시예 12B] MHC 클래스 I 분자, T 세포 공자극 분자 및 T 세포 자극성 사이토카인을 발현하는 폴리뉴클레오티드의 조제
PLAT-A 세포를 세포 배양 디쉬에 파종하고, 2％ 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지에서 배양하였다. 약 50％ 콘플루언스의 세포에, 제조업자의 지시에 따라서, CD80-MFG-E8 및 sc-Trimer-CD81-IL-2를 각각 코딩하는 pET-15b 벡터를 직선화한 것을 FastGene Gel/PCR 익스트랙션 키트(닛폰 제네틱스사)를 사용하여 정제하고, T7 mScript Standard mRNA Production System(CELLSCRIPT사제)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라서, 시험관 내 전사 및 캡화, polyA 부가를 행한다. 합성한 mRNA를 1:1로 혼합 후, 실시예 12B의 항원 제시 세포 외 소포를 제작하기 위한 RNA로서 사용한다.
시험예 17B: 항원 제시 세포 외 소포에 의한 항종양 효과의 평가 실험
안정 세포주로부터 정제한 항원 제시 세포 외 소포가 항종양 효과를 갖는지 여부를 조사하기 위해 C57BL/6 마우스에 OVA를 발현하는 EL-4 세포 1×105개를 피하에 섭취하였다. EL-4 세포 섭취 후, 1일, 4일, 7일 후에 실시예 12B의 RNA 혹은 참고예 1의 RNA 50μg을, 생체 내-jetRNA 형질 감염 시약(Polyplus사)과 혼합하고 나서, 레시피언트 마우스의 미정맥으로부터 이입하고, EL-4 세포의 크기를 관찰하였다.
실시예 12B의 RNA는, EL-4 세포의 증식을 억제할 수 있다.
이상, 실시예에서 나타내진 대로, 본 명세서 중에 기재된 항원 제시 세포 및 항원 제시 세포 외 소포를 제작하기 위한 폴리뉴클레오티드는, 항원 특이적인 T 세포(예를 들어, 항원 특이적 CD8 양성 T 세포, 항원 특이적 CD4 양성 세포 등)를 만족스럽게 활성화, 증식 및/또는 분화시키거나 할 수 있는 것이다.
이하에, 서열표에 포함되는 서열의 개요를 기재한다.
[표 22]
[표 23]
[표 24]
[표 25]
[표 26]
[표 27]
[표 28]
[표 29]
[표 30-1]
[표 30-2]
[표 31]
[표 32]
Figure pct00100
[표 33]
[표 34]
Figure pct00102
[표 35]
Figure pct00103

Claims (57)

  1. (a) 항원 제시 MHC 분자를 포함하고, 해당 항원 제시 MHC 분자를, 세포 또는 세포 외 소포의 막 외에 제시 가능한 융합 단백질 (A)를 코딩하는 서열;
    (b) 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛을 포함하는, 해당 T 세포 자극성 사이토카인을, 세포 또는 세포 외 소포의 막 외에 제시 가능한 융합 단백질 (B)를 코딩하는 서열;
    (c) T 세포 공자극 분자를 포함하는, 해당 T 세포 공자극 분자를, 세포 또는 세포 외 소포의 막 외에 제시 가능한 융합 단백질 (C)를 코딩하는 서열;
    (d) 항원 제시 MHC 분자와, 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛을 포함하고, 해당 항원과 해당 T 세포 자극성 사이토카인을, 세포 또는 세포 외 소포의 막 외에 제시 가능한 융합 단백질 (D)를 코딩하는 서열; 및
    (e) 항원 제시 MHC 분자와, 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛 및 T 세포 공자극 분자를 포함하고, 해당 항원과 해당 T 세포 자극성 사이토카인과 해당 T 세포 공자극 분자를, 세포 또는 세포 외 소포의 막 외에 제시 가능한 융합 단백질 (E)를 코딩하는 서열;
    로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (A)에서 규정되는 융합 단백질이, 항원 제시 MHC 분자와,
    세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인, 혹은
    세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 막 결합 도메인
    을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (A)에서 규정되는 융합 단백질이, 항원 제시 MHC 분자와,
    테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인, 혹은 MFG-E8 또는 그 막 결합 도메인
    을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (A)에서 규정되는 융합 단백질이, 막 관통 도메인을 포함하는 항원 제시 MHC 분자를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (A)에서 규정되는 융합 단백질이:
    그 N 말단측으로부터,
    (A-1) MHC 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
    (A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
    (A-3) 단쇄 MHC 분자의 아미노산 서열,
    (A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
    (A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
    을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (A)에서 규정되는 융합 단백질이,
    그 N 말단측으로부터,
    (A-1) MHC 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
    (A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
    (A-3) MHC 클래스 Iα쇄, β2 마이크로글로불린, MHC 클래스 IIα쇄, 또는 MHC 클래스 IIβ쇄의 아미노산 서열
    (A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
    (A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
    을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  7. 제6항에 있어서, 추가로 (A-6) β2 마이크로글로불린, MHC 클래스 Iα쇄, MHC 클래스 IIβ쇄, 또는 MHC 클래스 IIα쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (A)에서 규정되는 융합 단백질이,
    그 N 말단측으로부터,
    (A-1) MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
    (A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
    (A-3) 단쇄 MHC 클래스 I 분자의 아미노산 서열,
    (A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
    (A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
    을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  9. 제1항에 있어서, 상기 (A)에서 규정되는 융합 단백질이,
    그 N 말단측으로부터,
    (A-1) MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
    (A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
    (A-3) MHC 클래스 IIβ쇄의 아미노산 서열,
    (A-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
    (A-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
    을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  10. 제9항에 있어서, 추가로 (A-6) MHC 클래스 IIα쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  11. 제1항에 있어서, 상기 (A)에서 규정되는 융합 단백질이:
    그 N 말단측으로부터,
    (A-1) MHC 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
    (A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
    (A-3) 막 관통 도메인을 포함하는 단쇄 MHC 분자의 아미노산 서열
    을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  12. 제1항에 있어서, 상기 (A)에서 규정되는 융합 단백질이,
    그 N 말단측으로부터,
    (A-1) MHC 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
    (A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
    (A-3) MHC 클래스 Iα쇄, β2 마이크로글로불린과 MHC 클래스 Iα쇄의 융합 단백질, MHC 클래스 IIα쇄, 또는 MHC 클래스 IIβ쇄의 아미노산 서열
    을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  13. 제12항에 있어서, 추가로 (A-6) β2 마이크로글로불린, MHC 클래스 IIβ쇄, 또는 MHC 클래스 IIα쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  14. 제1항에 있어서, 상기 (A)에서 규정되는 융합 단백질이,
    그 N 말단측으로부터,
    (A-1) MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
    (A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
    (A-3) 막 관통 도메인을 포함하는 단쇄 MHC 클래스 I 분자의 아미노산 서열
    을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  15. 제1항에 있어서, 상기 (A)에서 규정되는 융합 단백질이,
    그 N 말단측으로부터,
    (A-1) MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
    (A-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
    (A-3) MHC 클래스 IIβ쇄의 아미노산 서열
    을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  16. 제15항에 있어서, 추가로 MHC 클래스 IIα쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  17. 제1항에 있어서, 상기 (B)에서 규정되는 융합 단백질이, 적어도 1개의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛과,
    세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인, 혹은
    세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 도메인
    을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  18. 제1항에 있어서, 상기 (B)에서 규정되는 융합 단백질이, 적어도 1개의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛과, 테트라스파닌의 부분 서열을 포함하고, 해당 테트라스파닌의 부분 서열이, 2개의 막 관통 도메인을 적어도 갖고, 해당 적어도 1개의 T 세포 자극성 사이토카인이 해당 2개의 막 관통 도메인의 사이에 배치되어 있는, 폴리뉴클레오티드.
  19. 제1항에 있어서, 상기 (B)에서 규정되는 융합 단백질이, 적어도 1개의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛과, MFG-E8 또는 그 막 결합 도메인을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  20. 제1항에 있어서, 상기 (B)에서 규정되는 융합 단백질이,
    그 N 말단측으로부터,
    (B-1) N 말단측으로부터, 막 관통 도메인 1, 소형 세포 외 루프, 막 관통 도메인 2, 소형 세포 내 루프 및 막 관통 도메인 3을 포함하는 테트라스파닌의 부분 서열,
    (B-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
    (B-3) 제1 T 세포 자극성 사이토카인의 아미노산 서열,
    (B-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 그리고
    (B-5) 막 관통 도메인 4를 포함하는 테트라스파닌의 부분 서열
    을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  21. 제1항에 있어서, 상기 (B)에서 규정되는 융합 단백질이,
    그 N 말단측으로부터,
    (B-3) 제1 T 세포 자극성 사이토카인의 아미노산 서열,
    (B-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
    (B-5) MFG-E8 또는 그 막 결합 도메인의 아미노산 서열
    을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  22. 제1항에 있어서, 상기 (B)에서 규정되는 융합 단백질이, 적어도 1개의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛과, CD8 또는 그 막 관통 도메인을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  23. 제1항에 있어서, 상기 (B)에서 규정되는 융합 단백질이,
    그 N 말단측으로부터,
    (B-3) 제1 T 세포 자극성 사이토카인의 아미노산 서열,
    (B-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
    (B-5) CD8 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
    을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  24. 제1항에 있어서, 상기 T 세포 자극성 사이토카인이 IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-12의 서브유닛, IL-15 또는 TGF-β인, 폴리뉴클레오티드.
  25. 제1항에 있어서, 상기 (C)에서 규정되는 융합 단백질이, T 세포 공자극 분자와,
    세포 또는 세포 외 소포의 막에 발현되는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인, 혹은
    세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 막 결합 도메인
    을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  26. 제1항에 있어서, 상기 (C)에서 규정되는 융합 단백질이, T 세포 공자극 분자와,
    테트라스파닌 혹은 그 막 관통 도메인, 혹은
    MFG-E8 혹은 그 막 결합 도메인
    을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  27. 제1항에 있어서, 상기 (C)에서 규정되는 융합 단백질이, 막 관통 도메인을 포함하는 T 세포 공자극 분자를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  28. 제1항에 있어서, 상기 (C)에서 규정되는 융합 단백질이,
    그 N 말단측으로부터,
    (C-1) T 세포 공자극 분자의 아미노산 서열,
    (C-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
    (C-3) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인의 아미노산 서열
    을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  29. 제1항에 있어서, 상기 (D)에서 규정되는 융합 단백질이,
    상기 항원 제시 MHC 분자,
    상기 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛, 및
    세포 또는 세포 외 소포의 막에 국재하는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인, 혹은
    세포 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 막 결합 도메인
    을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  30. 제29항에 있어서, 상기 세포 외 소포의 막에 국재하는 것이 가능한 막 단백질 또는 세포 외 소포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질이, 테트라스파닌 또는 MFG-E8인, 폴리뉴클레오티드.
  31. 제29항에 있어서, 상기 세포의 막에 국재하는 것이 가능한 막 단백질 또는 세포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질이, CD8인, 폴리뉴클레오티드.
  32. 제1항에 있어서, 상기 (D)에서 규정되는 융합 단백질이,
    그 N 말단측으로부터,
    (D-1) MHC 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열,
    (D-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
    (D-3) 단쇄 MHC 분자의 아미노산 서열,
    (D-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
    (D-5) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인 혹은 MFG-E8 또는 그 막 결합 도메인과, 상기 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛을 포함하는 융합 펩티드의 아미노산 서열
    을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  33. 제1항에 있어서, 상기 (D)에서 규정되는 융합 단백질이,
    그 N 말단측으로부터,
    (D-1) 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인 혹은 MFG-E8 또는 그 막 결합 도메인과, 상기 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛을 포함하는 융합 펩티드의 아미노산 서열
    (D-2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
    (D-3) 단쇄 MHC 분자의 아미노산 서열,
    (D-4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
    (D-5) MHC 분자 구속성 항원 펩티드의 아미노산 서열
    을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 상기 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인 혹은 MFG-E8 또는 그 막 결합 도메인과, 상기 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛을 포함하는 융합 펩티드가,
    그 N 말단측으로부터,
    (1) 막 관통 도메인 1, 소형 세포 외 루프, 막 관통 도메인 2, 소형 세포 내 루프 및 막 관통 도메인 3을 포함하는 테트라스파닌의 부분 서열,
    (2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열,
    (3) 상기 적어도 1개의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛의 아미노산 서열,
    (4) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 그리고
    (5) 막 관통 도메인 4를 포함하는 테트라스파닌의 부분 서열
    을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  35. 제32항 또는 제33항에 있어서, 테트라스파닌 또는 그 막 관통 도메인 혹은 MFG-E8 또는 그 막 결합 도메인과, 상기 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛을 포함하는, 상기 융합 펩티드가,
    그 N 말단측으로부터,
    (1) 상기 적어도 1의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛의 아미노산 서열,
    (2) 존재하고 있어도 되는 스페이서 서열, 및
    (3) MFG-E8 또는 그 막 결합 도메인의 아미노산 서열
    을 이 순번으로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  36. 제1항에 있어서, 상기 (D)에서 규정되는 융합 단백질이,
    상기 항원 제시 MHC 분자와, 상기 적어도 1종의 T 세포 자극성 사이토카인 또는 그 서브유닛과, 세포의 막에 국재하는 것이 가능한 막 단백질 혹은 그 막 관통 도메인 또는 세포의 막에 결합되는 것이 가능한 단백질 혹은 그 막 결합 도메인을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  37. 제32항 또는 제33항에 있어서, 상기 MHC 분자 구속성 항원 펩티드가 MHC 클래스 I 분자 구속성 항원 펩티드이며, 상기 단쇄 MHC 분자가 MHC 클래스 Iα쇄의 세포 외 영역을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  38. 제32항 또는 제33항에 있어서, 상기 MHC 분자 구속성 항원 펩티드가 MHC 클래스 II 분자 구속성 항원 펩티드이며, 상기 단쇄 MHC 분자가 MHC 클래스 IIα쇄의 세포 외 도메인 및/또는 MHC 클래스 IIβ쇄의 세포 외 도메인을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  39. 제1항에 있어서, 상기 (a)에서 규정되는 서열과 상기 (b)에서 규정되는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  40. 제39항에 있어서, 상기 융합 단백질 (A)와 상기 융합 단백질 (B)가 융합된 아미노산 서열을 코딩하고 있는, 폴리뉴클레오티드.
  41. 제40항에 있어서, 적어도 1개의 2A 펩티드를 통해 융합 단백질 (A)와 융합 단백질 (B)가 융합된 아미노산 서열을 코딩하고 있는, 폴리뉴클레오티드.
  42. 제39항에 있어서, 추가로 상기 (c)에서 규정되는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  43. 제42항에 있어서, 상기 융합 단백질 (A), 상기 융합 단백질 (B) 및 상기 융합 단백질 (C)가 융합된 아미노산 서열을 코딩하고 있는, 폴리뉴클레오티드.
  44. 제41항에 있어서, 각각 독립된 적어도 1개의 2A 펩티드를 통해, 상기 융합 단백질 (A), 상기 융합 단백질 (B) 및 상기 융합 단백질 (C)가 융합된 아미노산 서열을 코딩하고 있는, 폴리뉴클레오티드.
  45. 제44항에 있어서, 5'단으로부터,
    상기 (a)에서 규정되는 서열;
    제1 적어도 1개의 2A 펩티드를 코딩하는 서열;
    상기 (b)에서 규정되는 서열;
    제2 적어도 1개의 2A 펩티드를 코딩하는 서열; 및
    상기 (c)에서 규정되는 서열
    을 이 순번으로 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  46. 제1항에 있어서, 상기 (d)에서 규정되는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  47. 제46항에 있어서, 추가로 상기 (c)에서 규정되는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  48. 제47항에 있어서, 상기 융합 단백질 (D)와 상기 융합 단백질 (C)가 융합된 아미노산 서열을 코딩하고 있는, 폴리뉴클레오티드.
  49. 제48항에 있어서, 적어도 1개의 2A 펩티드를 통해 상기 융합 단백질 (D)와 상기 융합 단백질 (C)가 융합된 아미노산 서열을 코딩하고 있는, 폴리뉴클레오티드.
  50. 제1항에 있어서, 상기 (e)에서 규정되는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  52. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 제51항에 기재된 벡터와, 약리학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 의약 조성물.
  53. 감염증을 처치 또는 예방하기 위한, 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 제51항에 기재된 벡터와, 약리학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 의약 조성물.
  54. 암을 처치 또는 예방하기 위한, 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 제51항에 기재된 벡터를 포함하는, 의약 조성물.
  55. 자기 면역 질환을 처치 또는 예방하기 위한, 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 제51항에 기재된 벡터를 포함하는, 의약 조성물.
  56. 알레르기성 질환을 처치 또는 예방하기 위한, 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 제51항에 기재된 벡터를 포함하는 의약 조성물.
  57. 특이적인 항원에 대한 T 세포를 활성화 및/또는 증식시키기 위한 방법이며, 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 제51항에 기재된 벡터를 세포에 시험관 내 또는 생체 외에서 도입하고, 항원 제시 세포 및/또는 항원 제시 세포 외 소포를 생성하고, 생성된 항원 제시 세포 및/또는 항원 제시 세포 외 소포와 T 세포를 시험관 내 또는 생체 외에 있어서 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
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