JP2021511041A - キメラ抗原受容体を発現する制御性ｔ細胞 - Google Patents

Abstract

本発明は、ａ）少なくとも１つの抗原結合ドメイン、ｂ）膜貫通ドメイン、ならびにｃ）少なくとも１つの一次細胞質シグナル伝達ドメインおよび少なくともＣＤ１３７の共刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合ドメインが、標的細胞の表面に発現している抗原、または標的細胞の表面に発現した抗原と結合するタグ付きポリペプチドのタグ、または可溶性抗原に特異的に結合する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞を提供する。前記Ｔｒｅｇ細胞を含む組成物、ならびに前記ＣＡＲを発現する活性化Ｔｒｅｇの濃縮および分析の方法もまた開示されている。

Description

本発明は、免疫細胞に発現した、特に、制御性Ｔ細胞に発現させるキメラ抗原受容体の分野に関する。

通常のＴ細胞（Ｔｃｏｎ）は、病原体または腫瘍の認識および破壊を向上させるように操作することができる。制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、免疫抑制機能を有するＴ細胞のサブセットを含む。Ｔｒｅｇは、自己免疫、移植片拒絶、アレルギー、および慢性炎症性疾患を予防または処置するように操作することができる。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、抗原特異的制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の作製のための有望な選択肢として登場している。ＴＣＲ以外に、ＣＡＲは、ＭＨＣに依存せずに表面抗原に結合することができる抗体型特異性を含有する人工受容体である。ＣＡＲ−Ｔ細胞による特定の抗原の特異的認識は、膜貫通領域を介して細胞内ＴＣＲ由来シグナル伝達ドメインと連結する細胞外スペーサードメインを有する、抗体由来一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）によって媒介される（Ｇｒｏｓｓら、１９８９；Ｋｕｗａｎａら、１９８７）。マウスモデルにおいて、ミエリン塩基性タンパク質に対して反応性の、リダイレクトされたＣＡＲ−Ｔｒｅｇは、ＥＡＥを寛解させることができ（ＭｅｋａｌａおよびＧｅｉｇｅｒ ２００５）、また２，４，６−トリニトロフェノール（ＴＮＰ）または癌胎児抗原（ＣＥＡ）に特異的なＣＡＲ−Ｔｒｅｇは、結腸にリダイレクトすることに成功し、結腸において、結腸炎、および関連した結腸直腸癌の発症を抑制することに非常に強力であった（Ｂｌａｔら ２０１４；Ｅｌｉｎａｖら ２００９；Ｅｌｉｎａｖら ２００８）。最近になって、ヒトＣＡＲ−Ｔｒｅｇは、移植においてミスマッチになりやすい抗原としてのＨＬＡ−Ａ２へリダイレクトされ、異種間ＧｖＨＤを抑制することが示されている（ＭａｃＤｏｎａｌｄら ２０１６；Ｎｏｙａｎら ２０１７；Ｂｏａｒｄｍａｎら ２０１７）。さらに、ＣＡＲ−Ｔｒｅｇがアレルギー性気管支炎を寛解させる可能性（Ｓｋｕｌｊｅｃら ２０１７）、およびマウスにおいて第ＶＩＩＩ因子に対する中和免疫応答を防止する可能性（Ｙｏｏｎら ２０１７）を有することが実証されている。ＭｃＧｏｖｅｒｎら（２０１７、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、８巻、論文１５１７ １〜６ページ）は、ＣＡＲを発現するＴｒｅｇについての当技術分野の現在の状況を概説する。

本発明者らの知る限りでは、これまでＴｒｅｇに用いられているＣＡＲ構築物は、ＣＤ２８共刺激ドメインを有する。

抗原特異的Ｔｒｅｇのインビトロ作製に必須であるものとしての疾患関連標的抗原の同定が、依然として主要な課題のままである。さらに、ＣＡＲ−Ｔｒｅｇ効力の分析のための機能アッセイは、Ｔｒｅｇを特異的に識別し、かつそれらの特異的な活性化要件を試験することを可能にするマーカーの欠如により制限されている。これは、最適なＴｒｅｇ ＣＡＲ構築物の作製および最適化Ｔｒｅｇ移植片の作製のために、すなわち、ＣＡＲ関連Ｔｒｅｇ機能活性を最大にし、エフェクターＴ細胞の混入を最小にするために、重要である。したがって、Ｔｃｏｎとは有意に異なり得るＣＡＲ−Ｔｒｅｇの活性化および増殖のための要件は不十分にしか理解されないままである。

自己免疫、移植片拒絶、アレルギー、または慢性炎症性疾患などの様々な免疫関連障害から保護し、またはそれらを処置する対象の処置に用いられ得るＣＡＲを発現する制御性Ｔ細胞の必要性が当技術分野において存在する。

前記免疫関連障害から保護し、または処置する、対象の処置に用いられ得るＣＡＲを発現する、高度に精製され、かつ機能可能に最適化された制御性Ｔ細胞の作製の必要性もまた当技術分野において存在する。

治療的適用のためにＴｒｅｇ細胞の純粋な集団を有すること、およびＴｃｏｎの必要条件とは異なり得るＴｒｅｇ機能へのＣＡＲ構築物の効果を評価し得ることが極めて重要である。しかしながら、インビトロＴｒｅｇ集団は、一般的に、Ｔｃｏｎ細胞が混入しており、両方の集団は、容易には互いから分離されない。活性化制御性Ｔ細胞および活性化通常Ｔ細胞を含む試料から真の活性化Ｔｒｅｇを同定し、かつ単離することは、インビトロでのＴｒｅｇについての特定のＣＡＲ構築物の効果、およびその後のインビボでのそれらの機能性の分析のための要件である。したがって、Ｔｒｅｇ機能活性の最適なＣＡＲ媒介性活性化のための条件を規定し、最適なＣＡＲ Ｔｒｅｇを作製する課題は、今のところ、解決されていない。

そのような同定および分離は、ＥＰ２３０６１９１Ｂ１に開示されているような方法により実施することができる。

この特許において、本発明者らは、通常のＴ細胞（Ｔｃｏｎ）を活性化することが公知である、様々なシグナル伝達ドメインを比較することにより、驚くべきことに、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）共刺激ドメインの使用が、ヒト制御性Ｔ細胞を刺激し、かつ増殖させるのに選択的優位性を有することを示している。これは、養子Ｔｒｅｇ療法のためにＴｒｅｇ機能を最適化するために重要である。

図４は、ＣＡＲがＣＤ１３７（４−１ＢＢ）共刺激シグナル伝達ドメインを含有する場合（本明細書では「ＣＤ１３７ ＣＡＲ」とも呼ばれる）、インビトロでのＴｒｅｇが、驚くべきことに、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを有するＣＡＲ（本明細書では「ＣＤ２８ ＣＡＲ」とも呼ばれる）と比較して、（ＣＤ１３７のＣＡＲ−リガンド（抗原）誘導性発現および増殖により示されているように）ＣＡＲを介してより良く活性化され、一方、その逆のことが、Ｔｃｏｎにおいて言えることを示している。このように、ＣＤ１３７ ＣＡＲの使用は、Ｔｒｅｇの最適な刺激を可能にし、高度に精製されたＣＡＲ−リガンド（抗原）反応性Ｔｒｅｇを作製するためのＣＡＲ−リガンド（抗原）刺激後の活性化Ｔｒｅｇのインビトロ選択に利用することができる。インビボでのＣＤ１３７ ＣＡＲが、ＣＤ２８ ＣＡＲを有するＴｒｅｇより、ＣＡＲ−リガンド（抗原）によってより良く活性化および増殖されることも期待され、その理由は、インビボでのＴｒｅｇ機能が、ＣＡＲ構築物によって模倣される、機能的抗原−受容体の活性化に厳格に依存するからである。本明細書で開示されているようなＣＡＲ（ＣＤ１３７共刺激ドメインを有するＣＡＲ）を有するＴｒｅｇの形質導入またはトランスフェクションは、前記操作型Ｔｒｅｇ細胞のそのＣＡＲを介しての効率的なインビトロ活性化を可能にし、そのＣＡＲを発現する活性化Ｔｒｅｇのその後のソーティングのための手段を提供する。これは、それを必要としている対象における治療的使用に有益な、純粋かつ機能的なＴｒｅｇ ＣＡＲ集団を作製することを可能にし、その理由は、それが、インビボで、より少ない混入によるより良い安全性、ならびにより良いＣＡＲ−リガンド（抗原）誘導性活性化および増殖による治療的活性の向上を提供するだろうからである。さらに、本発明の特定の実施形態において、ＣＤ１３７ ＣＡＲは、ＣＤ２８ ＣＡＲ、またはそのような外的刺激に反応しない他のシグナル伝達ドメインを有するＣＡＲと比較して、対象に外的刺激として適用されるデキストランなどの可溶性抗原に応答してＴｒｅｇのインビボ活性化の向上を提供し、加えて、移入されたＴｒｅｇのインビボ活性を増強する、その理由は、Ｔｒｅｇの増殖およびＴｒｅｇ活性の増加をもたらすからであり、それがまた、内因性ＴＣＲまたはＴｒｅｇに対する反応性の向上を生じるだろう。このように、ＣＡＲ活性化は、特異的なＴｒｅｇ抗原標的を知る必要性なしに、Ｔｒｅｇの内因性Ｔｒｅｇ抗原に対する天然の制御性または抑制性活性をブーストするために利用することができる。

本明細書に開示されているようなＴｒｅｇは、自己免疫、移植片拒絶、アレルギー、または慢性炎症性疾患などの免疫媒介性疾患を患っている対象の予防または処置によく適している。

本発明の一実施形態において、Ｔｒｅｇに発現したＣＤ１３７ ＣＡＲは、外因性可溶性抗原デキストランに特異的である。処置される必要のある対象への、デキストランに特異的な前記ＣＡＲとのデキストランの投与は、自己免疫、移植片拒絶、アレルギー、または慢性炎症性疾患に対する予防または処置のための、前記ＣＡＲを発現するＴｒｅｇ細胞の調節的かつ持続的な免疫応答を可能にし得る。

異なる細胞内シグナル伝達ドメインを有するデキストラン特異的ＣＡＲ−Ｔｒｅｇの作製。（Ａ）異なるシグナル伝達ドメインを有するＣＡＲ構築物の概略図。（Ｂ）レンチウイルス形質導入後のＣＤ２５濃縮化ＴｒｅｇにおけるＬＮＧＦＲ発現が示されている（３〜６つの異なる実験からｎ＝１０〜１９）。（Ｃ）可溶性ＦＩＴＣデキストランの結合が示されている（２〜７つの独立した実験からｎ＝７〜２１）。 異なる細胞内シグナル伝達ドメインを有するデキストラン特異的ＣＡＲ−Ｔｒｅｇの活性化。（Ａ）ＣＤ１３７発現を、ビーズ結合型デキストランでの６時間の再刺激後、分析し、刺激されていない試料のＣＤ１３７発現を引き算した（ｎ＝７〜２６、２〜８つの異なる実験を実施した）。（Ｂ）ＬＮＧＦＲ^＋およびＬＮＧＦＲ⁻ ＴｒｅｇにおけるＺＡＰ７０のリン酸化を、可溶性デキストランとの５分間のインキュベーション後、分析した（ｎ＝７、２つの独立した実験を実施した）。 異なる細胞内シグナル伝達ドメインを有するデキストラン特異的ＣＡＲ−Ｔｒｅｇの増殖。Ｔｒｅｇを、（Ａ，Ｃ）抗ＣＤ３／ＣＤ２８または（Ｂ，Ｄ）ビーズ結合型デキストランの存在下で増殖させた。（Ａ，Ｂ）１７日目におけるＬＮＧＦＲ^＋細胞の濃縮を、０日目におけるＬＮＧＦＲ⁻／ＬＮＧＦＲ^＋ Ｔｒｅｇの比率×１７日目におけるＬＮＧＦＲ^＋／ＬＮＧＦＲ⁻ Ｔｒｅｇの比率として計算した（４〜６つの独立した実験からｎ＝１３〜１８）。（Ｃ，Ｄ）異なるシグナル伝達ドメインを有するＴｒｅｇをプールし、その異なるシグナル伝達ドメインの相対的発現を、ｑＰＣＲによって定量化した（ｎ＝７、３つの独立した実験を実施した）。 ＴｒｅｇおよびＴｃｏｎにおける異なる細胞内シグナル伝達ドメインの比較。（Ａ）ＣＡＲ−ＴｒｅｇおよびＣＡＲ−Ｔｃｏｎのデキストラン結合が示されている。（Ｂ）ビーズ結合型デキストランでの６時間の刺激後のＣＡＲ−Ｔｒｅｇ（ＣＤ１３７発現）およびＣＡＲ−Ｔｃｏｎ（ＣＤ１５４発現）の活性化の分析；ＬＮＧＦＲ⁻ Ｔｒｅｇにおける発現を、バックグラウンドとして各試料について引き算し、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４発現を、各培養におけるデキストラン^＋細胞のパーセンテージに対して標準化した。 活性化誘導性ＣＤ１３７発現によるＣＡＲ−Ｔｒｅｇの単離。刺激されていないＬＮＧＦＲ^＋ Ｔｒｅｇまたはビーズ結合型デキストランでの６時間の刺激後のＣＤ１３７^＋ ＬＮＧＦＲ^＋ Ｔｒｅｇをソートし、抗ＣＤ３／２８と共に（ソートされたＬＮＧＦＲ^＋）、またはさらなる刺激無しで（ソートされたＣＤ１３７^＋）、１４日間、増殖させ、その後、ビーズ結合型デキストランでの再刺激後、（Ａ）ＬＮＧＦＲ、（Ｂ）デキストラン、および（Ｃ）ＣＤ１３７発現の染色を行った（ｎ＝１２、ソートされたＬＮＧＦＲについての４つの独立した実験；ｎ＝１５、ソートされたＣＤ１３７についての５つの異なる実験）。

第１の態様において、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞であって、
ａ）少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
ｂ）膜貫通ドメイン、
ｃ）少なくとも１つの一次細胞質シグナル伝達ドメインおよび少なくともＣＤ１３７の共刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン
を含み、前記抗原結合ドメインが、標的細胞の表面に発現している抗原、または標的細胞の表面に発現した抗原と結合するタグ付きポリペプチドのタグ、または可溶性抗原に特異的に結合する、Ｔｒｅｇ細胞を提供する。

前記少なくとも１つの一次細胞質シグナル伝達ドメインがＣＤ３ζであり得る、前記ＣＡＲ。

前記抗原結合ドメインが、標的細胞の細胞表面に発現している抗原と直接的に結合し得る、前記ＣＡＲ。前記標的細胞は、疾患関連の自家または同種抗原を発現する疾患状態での細胞であり得る。疾患は、自己免疫疾患、慢性炎症性疾患、アレルギー、移植片拒絶、ＧｖＨＤ、または対象のウイルス、細菌、寄生生物による感染であり得る。

あるいは、前記ＣＡＲの前記抗原結合ドメインは、標的細胞の表面に発現した抗原と結合するタグ付きポリペプチドのタグに結合し得る。その結果、ＣＡＲの前記抗原結合ドメインは、標的細胞の表面に発現している抗原と間接的に結合する。そのようなアダプターＣＡＲアプローチは、例えば、ＵＳ９，２３３，１２５Ｂ２に開示されている。タグは、ビオチンまたはＦＩＴＣなどのハプテンであり得る。細胞の表面に発現した抗原と結合するタグ付きポリペプチドは、抗体またはその抗原結合断片であり得る。

あるいは、および好ましくは、前記ＣＡＲの抗原結合ドメインは、可溶性抗原に特異的であり得、それにより、前記可溶性抗原の前記ＣＡＲの前記抗原結合ドメインとの結合によって、好ましくは前記Ｔｒｅｇ細胞が別の細胞と結合することなく、前記Ｔｒｅｇ細胞の活性化を可能にする。

前記可溶性抗原は、前記ＣＡＲを発現する前記Ｔｒｅｇ細胞が適用される対象、好ましくはヒトの、血液または組織中に天然では存在しない外因性抗原であり得る。より好ましくは、前記ＣＡＲを発現する前記Ｔｒｅｇ細胞が適用される対象の血液または組織中に天然では存在しない前記外因性抗原は、前記ＣＡＲの抗原結合ドメインより、対象内の別の標的と優先的に結合するものではない。

前記外因性可溶性抗原は、対象に適用されたとき、前記対象に害を誘起しない非病因性抗原であり得る。

前記（外因性）可溶性抗原はデキストランであり得る。

前記ＣＡＲの前記抗原結合ドメインは、配列番号１および配列番号２の配列を含み得る。配列番号１は、免疫グロブリンの重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）を表し、配列番号２は、免疫グロブリンの軽鎖の可変領域（ＶＬ）を表す。

あるいは、抗原（一価または多価）は、特異的な付着分子の使用により、細胞の表面などの生物学的表面に、または組織マトリックス化合物に付着し得る。このように、抗原は、インビボで、特定の表面、細胞型、または器官に方向付けることができ、その表面への付着がまた、ＣＡＲの架橋を向上させる。これは、局在化し、かつ向上したＴｒｅｇ活性化をもたらす。

ある態様において、本発明は、以下を含む組成物：
ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞であって、
ａ）少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
ｂ）膜貫通ドメイン、
ｃ）少なくとも１つの一次細胞質シグナル伝達ドメインおよび少なくともＣＤ１３７の共刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン
を含み、前記抗原結合ドメインが、標的細胞の表面に発現した抗原と結合するタグ付きポリペプチドのタグまたは可溶性抗原に特異的に結合する、Ｔｒｅｇ細胞、
ｉｉ）前記タグ付きポリペプチド
を提供する。

さらなる態様において、本発明は、自己免疫疾患、アレルギー、移植片拒絶、移植片対宿主病、炎症性腸疾患などの慢性炎症性疾患、または対象のウイルス、細菌、寄生生物による慢性感染の処置または予防に用いられる、本明細書に開示されているようなＣＡＲを発現するＴｒｅｇ細胞を提供する。

別の態様において、本発明は、本明細書に開示されているようなＣＡＲを発現するＴｒｅｇ細胞の集団を含む組成物を提供する。

本明細書に開示されているようなＣＡＲを発現するＴｒｅｇ細胞の集団の前記組成物は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％のＴｒｅｇ細胞を含み得る。前記Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ２５^＋ ＣＤ１２７⁻ ＦｏｘＰ３^＋ 表現型ならびに／または＞８０％脱メチル化ＴＳＤＲ（Ｔｒｅｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｒｅｇｉｏｎ（Ｔｒｅｇ特異的脱メチル化領域））ならびに／または、例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８分子もしくはＰＭＡ／イオノマイシンなどの薬理学的Ｔ細胞アクチベーターを用いての、５〜７時間のポリクローナル刺激後のＣＤ１３７の発現およびＣＤ１５４発現の欠如により特徴付けられ得る。

本明細書に開示されているようなＣＡＲを発現するＴｒｅｇ細胞の前記集団が、本明細書に開示されているようなＣＡＲを発現する活性化Ｔｒｅｇ細胞の濃縮のための方法により獲得可能な活性化Ｔｒｅｇの集団であり得る、前記組成物。

前記組成物は、任意で薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であり得る。

さらなる態様において、本発明は、医薬組成物の組合せであって：
ａ）薬学的に許容される担体と共に本明細書に開示されているようなＣＡＲを発現するＴｒｅｇ細胞の集団、および
ｂ）本明細書に開示されているような可溶性抗原
を含む医薬組成物の組合せを提供する。

本明細書に開示されているようなＣＡＲを発現するＴｒｅｇ細胞の前記集団は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％のＴｒｅｇ細胞を含み得る。前記Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ２５^＋ ＣＤ１２７⁻ ＦｏｘＰ３^＋表現型ならびに／または＞８０％脱メチル化ＴＳＤＲならびに／または、例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８分子もしくはＰＭＡ／イオノマイシンなどの薬理学的Ｔ細胞アクチベーターを用いての、５〜７時間のポリクローナル刺激後のＣＤ１３７の発現およびＣＤ１５４発現の欠如により特徴付けられ得る。

自己免疫疾患、アレルギー、移植片拒絶、移植片対宿主病、炎症性腸疾患などの慢性炎症性疾患、または対象のウイルス、細菌、寄生生物による慢性感染の処置または予防のための前記医薬組成物の組合せ。

前記可溶性抗原はデキストランであり得る。

本明細書に開示されているようなＣＡＲを発現するＴｒｅｇ細胞の前記集団が、本明細書に開示されているようなＣＡＲを発現する活性化Ｔｒｅｇ細胞の濃縮のための方法により獲得可能な活性化Ｔｒｅｇの集団であり得る、前記医薬組成物の組合せ。

別の態様において、本発明は、ＣＡＲを発現する活性化Ｔｒｅｇ細胞の濃縮のための方法であって、前記ＣＡＲが
ｉ）少なくとも１つの抗原結合ドメイン
ｉｉ）膜貫通ドメイン
ｉｉｉ）少なくとも１つの一次細胞質シグナル伝達ドメインおよび少なくともＣＤ１３７の共刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン
を含み、前記抗原結合ドメインが、標的細胞の表面に発現している抗原、または標的細胞の表面に発現した抗原と結合するタグ付きポリペプチドのタグ、または可溶性抗原に特異的に結合し、
前記方法が、
ａ）制御性Ｔ細胞を含む試料を供給する工程
ｂ）前記試料の前記制御性Ｔ細胞を、前記ＣＡＲを発現するように遺伝子改変する工程
ｃ）前記ＣＡＲの抗原結合ドメインにより結合される抗原と６〜１６時間、接触させることにより、前記遺伝子改変型制御性Ｔ細胞を活性化する工程
ｄ）
α）工程ｃ）の細胞を
Ｉ）ＣＤ１５４に結合する分子と接触させて、ＣＤ１５４^＋ Ｔ細胞を枯渇させる工程；または
ＩＩ）制御性Ｔ細胞もしくは活性化制御性Ｔ細胞のマーカーに結合する分子と接触させて、前記結合分子と結合する細胞をポジティブ選択する工程、および
β）Ｉ）工程α）Ｉ）の細胞を、制御性Ｔ細胞もしくは活性化制御性Ｔ細胞のマーカーに結合する分子と接触させて、前記結合分子と結合する細胞をポジティブ選択する工程であって、それにより、前記ＣＡＲを発現する活性化制御性Ｔ細胞の集団を獲得する工程；または
ＩＩ）工程α）ＩＩ）の細胞を、ＣＤ１５４に結合する分子と接触させて、ＣＤ１５４^＋ Ｔ細胞を枯渇させる工程であって、それにより、前記ＣＡＲを発現する活性化制御性Ｔ細胞の集団を獲得する工程
により工程ｃ）の活性化Ｔｒｅｇ細胞を単離する工程
を含む、方法を提供する。

任意で、前記方法は、工程ｂ）の後でかつ工程ｃ）の前に遺伝子改変型制御性Ｔ細胞を増殖させる工程を含んでもよい。

方法の前記ＣＡＲおよび前記抗原は、すでに上記で記載され、および本明細書に開示されているようなＣＡＲおよび抗原の特徴および特性を有し得る。本明細書に開示されているようなＣＡＲおよび抗原についての上記で開示された全ての変形および実施形態もまた前記方法に適用され得る。

制御性Ｔ細胞のマーカーが、マーカーＣＤ２５およびＧＩＴＲの群から選択され、活性化制御性Ｔ細胞のマーカーが、マーカーＣＤ１３７、潜在型ＴＧＦ−β（ＬＡＰ）、ＧＡＲＰ（ＬＲＲＣ３２）、およびＣＤ１２１ａ／ｂの群から選択される、前記方法。

ＣＤ１５４、または制御性Ｔ細胞もしくは活性化制御性Ｔ細胞のマーカーに結合する分子が、抗体またはその抗原結合断片であり得る、前記方法。

前記遺伝子改変型制御性Ｔ細胞（工程ｃ）が、抗ＣＤ３／ＣＤ２８および／または本明細書に開示されているようなＣＡＲの抗原結合ドメインと結合する抗原およびＩＬ−２などの適切な成長因子の添加の存在下で増殖する、前記方法。

単離（分離）がフローサイトメトリーまたは磁気細胞ソーティングを用いて実施される、前記方法。

ＣＤ１５４に結合する分子、および／または制御性Ｔ細胞もしくは活性化制御性Ｔ細胞のマーカーに結合する分子が、蛍光色素、ハプテン、および／または磁気粒子と連結している、前記方法。

供給される試料（工程ａ）が、全血、ＰＢＭＣ、臍帯血、リンパ節組織、骨髄、または白血球アフェレーシスに由来する、前記方法。

前記ＣＡＲを発現するように前記試料の前記制御性Ｔ細胞の遺伝子改変（工程ｂ）が、当技術分野において周知の方法（例えば、ウイルスに基づいた系、物理的方法、生物学的方法、化学的方法）により実施され得る、前記方法。

前記Ｔｒｅｇ細胞の遺伝子改変は、形質導入、トランスフェクション、またはエレクトロポレーションにより実施され得る。好ましくは、形質導入は、レンチウイルス、γ−、α−レトロウイルス、もしくはアデノウイルスを用いて、または核酸（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル、ＯＤＮ）、タンパク質、部位特異的ヌクレアーゼ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰ／Ｒ）、自己複製ＲＮＡウイルス（例えば、ウマ脳症ウイルス）、もしくは組込み欠損レンチウイルスベクターによるエレクトロポレーションもしくはトランスフェクションを用いて、実施される。より好ましくは、前記Ｔｒｅｇ細胞の遺伝子改変は、レンチウイルスベクターを前記細胞に形質導入することにより実施され得る。

前記ＣＡＲを発現する活性化Ｔｒｅｇ細胞の濃縮された集団が、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％のＴｒｅｇ細胞を含む、前記方法。前記Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ２５^＋ ＣＤ１２７⁻ ＦｏｘＰ３^＋表現型ならびに／または＞８０％脱メチル化ＴＳＤＲならびに／または、例えば、ＣＤ３／ＣＤ２８もしくはＰＭＡ／イオノマイシンなどの薬理学的Ｔ細胞アクチベーターを用いての、５〜７時間のポリクローナル刺激後のＣＤ１３７の発現およびＣＤ１５４発現の欠如により特徴付けられる。

閉鎖系で実施され得る、前記方法。

閉鎖系における自動化方法である、前記方法。

本発明はまた、ＣＤ１３７シグナル伝達ドメイン（ＣＤ１３７ ＣＡＲ）を含むが、ＣＡＲの少なくとも１つの他の成分の点で異なる少なくとも２つのＣＡＲを用いることにより、Ｔｒｅｇの最良の活性化を可能にするＣＡＲを様々なＣＡＲから選択し、例えば、ＣＡＲ発現ＴｒｅｇをＣＡＲリガンド（抗原）と接触させる工程ならびにＣＤ１３７表面発現またはＴｒｅｇ細胞の活性化後に発現することが公知の別のＴｒｅｇ活性化マーカーの誘導の程度を測定および比較する工程により、前記ＣＡＲを発現するＴｒｅｇを活性化するそれらの能力を比較するための、Ｔｒｅｇ細胞に発現するＣＤ１３７ ＣＡＲの使用を提供する。

したがって、さらなる態様において、本発明は、Ｔｒｅｇ細胞の活性化効率を分析するための、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞に発現するＣＡＲの使用であって、前記ＣＡＲが
ａ）少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
ｂ）膜貫通ドメイン、
ｃ）少なくとも１つの一次細胞質シグナル伝達ドメインおよび少なくともＣＤ１３７の共刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン
を含み、前記抗原結合ドメインが、標的細胞の表面に発現している抗原、または標的細胞の表面に発現した抗原と結合するタグ付きポリペプチドのタグ、または可溶性抗原に特異的に結合する、使用を提供する。

さらなる態様において、本発明は、少なくとも２つのＴｒｅｇ細胞の活性化効率を分析する（比較する）ための方法であって、少なくとも第１のＴｒｅｇ細胞が、
ａ）少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
ｂ）膜貫通ドメイン、
ｃ）少なくとも１つの一次細胞質シグナル伝達ドメインおよび少なくともＣＤ１３７の共刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン
を含む第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現し、
少なくとも第２のＴｒｅｇ細胞が、第１のＣＡＲの少なくとも１つのドメインの点で前記第１のＣＡＲと異なるが、ＣＤ１３７の共刺激シグナル伝達ドメインを発現する第２のＣＡＲを発現し、ならびに
前記少なくとも第１のＣＡＲの前記抗原結合ドメインおよび前記少なくとも第２のＣＡＲの前記抗原結合ドメインが、標的細胞の表面に発現している抗原、または標的細胞の表面に発現した抗原と結合するタグ付きポリペプチドのタグ、または可溶性抗原に特異的に結合し、
前記方法が、
ａ）制御性Ｔ細胞を含む試料を供給する工程
ｂ）前記少なくとも第１のＣＡＲを発現するように前記少なくとも第１のＴｒｅｇ細胞を遺伝子改変し、および前記少なくとも第２のＣＡＲを発現するように前記少なくとも第２のＴｒｅｇ細胞を遺伝子改変する工程
ｃ）前記少なくとも第１のＣＡＲおよび前記少なくとも第２のＣＡＲの抗原結合ドメインにより結合される抗原と６〜１６時間、接触させることにより、前記遺伝子改変された少なくとも第１のＴｒｅｇ細胞および少なくとも第２のＴｒｅｇ細胞を活性化する工程
ｄ）前記少なくとも第１のＴｒｅｇ細胞および前記少なくとも第２のＴｒｅｇ細胞のＴｒｅｇ活性化マーカーの発現レベルを測定する工程であって、異なる発現レベルが、Ｔｒｅｇ細胞における前記少なくとも第１のＣＡＲおよび前記少なくとも第２のＣＡＲの異なる活性化効率を示す、工程
を含む、方法を提供する。

ＣＡＲをそれらのリガンド（抗原）と接触させることにより誘導される活性化の強度を比較することが、最強の活性化能力を有するＣＡＲを選択することによる、Ｔｒｅｇに用いられるＣＡＲの最適化を可能にする。

Ｔｒｅｇ細胞における少なくとも２つのＣＡＲの活性化効率を比較することの関連において本明細書に用いられる場合、用語「ＣＡＲのドメイン」とは、機能性ＣＡＲに用いられ得る任意のドメインを指し、そのようなドメインは、例えば、ＣＡＲの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインであり得る。細胞外ドメインは、少なくとも１つの抗原結合ドメイン、（Ｇ_４／Ｓ）_３などのリンカー、および／またはＣＤ８ヒンジなどのスペーサー／ヒンジであり得る。細胞内ドメインは、少なくとも１つの刺激シグナル伝達ドメインおよび／または少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインであり得る。互いに比較される少なくとも２つのＣＡＲの間に存在し得る違いは、ＣＡＲにおいて機能的に、すなわち、影響安定性、発現レベル、抗原結合性、またはリガンド（抗原）誘導性ＣＡＲ媒介性シグナル伝達カスケードに関係し得るドメインの改変を含み得、それは、最終的には、ＣＡＲ媒介性Ｔｒｅｇ活性化に影響する。用語「改変」は、例えば、そのようなドメインの完全なもしくは部分的置換または欠失、ＣＡＲ内のドメインの位置調整、または単に、ドメインのアミノ酸配列の改変、すなわち、そのようなドメインの少なくとも１個のアミノ酸の交換、挿入、除去などを含む。

用語「Ｔｒｅｇ活性化」または「Ｔｒｅｇ細胞における活性化効率」は、抗原受容体トリガーにより誘導されるＴｒｅｇ遺伝子発現パターンの変化または機能的変化を意味する。Ｔｒｅｇ活性化は、Ｔｒｅｇが、それらの生理的機能、例えば、アレルギー、自己免疫、移植片対宿主病および移植片拒絶、ＩＢＤおよび他の慢性炎症性疾患などの不適切または病的免疫反応の抑制を発揮するのを可能にするためにインビボで必要とされる。活性化マーカーの発現などのＴｒｅｇ活性化を測定するための、当分野において公知の様々なパラメータおよび方法がある。前記Ｔｒｅｇ活性化マーカーは、マーカーＣＤ１３７、潜在型ＴＧＦ−β（ＬＡＰ）、ＧＡＲＰ（ＬＲＲＣ３２）、ＣＤ１２１ａ／ｂ、またはＩＬ−１０の群から選択され得る。または、活性化Ｔｒｅｇとの共培養によるレスポンダーＴ細胞増殖の抑制などの機能アッセイ。Ｔｒｅｇ活性化の１つの特定のパラメータは、４〜７時間の刺激後の、ＣＤ１３７の誘導だけでなく、同時にＣＤ１５４の欠如もあり、それは、非常に特異的なＴｒｅｇ活性化サインである。これは、蛍光抗体染色およびフローサイトメトリーなどの当分野における専門家に公知の標準テクノロジーにより測定することができる。Ｔｒｅｇ活性化の定量的差は、単一細胞上に発現したＣＤ１３７の量か、またはそのマーカーを発現するように誘導される細胞の数もしくは割合のいずれかであり得る。

方法の前記第１のＣＡＲおよび前記抗原は、すでに上記で記載され、および本明細書に開示されているようなＣＡＲおよび抗原の特徴および特性を有し得る。本明細書に開示されているようなＣＡＲおよび抗原についての上記で開示された全てのバリアントおよび実施形態もまた、前記方法に適用され得る。

前記第２のＣＡＲは、例えば、前記第１のＣＡＲと比較して、前記第２のＣＡＲのＴｒｅｇ細胞活性化特性の変化を生じる、抗原結合特性および／またはシグナル伝達能力に、影響し得る、前記第１のＣＡＲと比較して少なくとも１つの改変を有する、第１のＣＡＲのバリアントであり得る。

前記第１のＣＡＲと比較しての前記第２のＣＡＲの改変は、例えば、異なるスペーサー、同じ抗原に特異的な異なる抗原結合ドメイン、異なる膜貫通ドメイン、および／または異なるシグナル伝達ドメインであり得る。

供給される試料（工程ａ）が、全血、ＰＢＭＣ、臍帯血、リンパ節組織、骨髄、または白血球アフェレーシスに由来し得る、前記方法。

前記ＣＡＲを発現するように前記試料の前記制御性Ｔ細胞の遺伝子改変（工程ｂ）が、当技術分野において周知の方法（例えば、ウイルスに基づいた系、物理的方法、生物学的方法、化学的方法）により実施され得る、前記方法。

前記Ｔｒｅｇ細胞の遺伝子改変は、形質導入、トランスフェクション、またはエレクトロポレーションにより実施され得る。好ましくは、形質導入は、レンチウイルス、γ−、α−レトロウイルス、もしくはアデノウイルスを用いて、または核酸（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル、ＯＤＮ）、タンパク質、部位特異的ヌクレアーゼ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰ／Ｒ）、自己複製ＲＮＡウイルス（例えば、ウマ脳症ウイルス）、もしくは組込み欠損レンチウイルスベクターによるエレクトロポレーションもしくはトランスフェクションを用いて、実施される。より好ましくは、前記Ｔｒｅｇ細胞の遺伝子改変は、レンチウイルスベクターを前記細胞に形質導入することにより実施され得る。

本発明はまた、Ｔｒｅｇ活性化を誘導するための様々な抗原製剤を、前記抗原をＣＤ１３７ ＣＡＲと接触させることにより試験するための方法を提供する。例えば、抗原試料を、抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現するＴｒｅｇと接触させ、かつ前記様々な抗原試料により誘導されたＴｒｅｇ活性化を比較することによる、第１の抗原試料と異なる少なくとも第２の抗原試料と共に、第１の抗原試料のＣＤ１３７ ＣＡＲ発現Ｔｒｅｇを活性化する能力。

したがって、さらなる態様において、本発明は、第１の抗原試料の、Ｔｒｅｇ細胞に発現したＣＡＲを活性化する活性化効率を、前記第１の抗原試料と異なる第２の抗原試料と共に、分析する（比較する）ための方法であって、前記ＣＡＲが
ａ）少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
ｂ）膜貫通ドメイン、
ｃ）少なくとも１つの一次細胞質シグナル伝達ドメインおよび少なくともＣＤ１３７の共刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン
を含み、前記抗原結合ドメインが、標的細胞の表面に発現している前記第１の抗原試料の抗原、または標的細胞の表面に発現した抗原と結合するタグ付きポリペプチドのタグ、または可溶性抗原に特異的に結合し、
前記方法が、
ａ）制御性Ｔ細胞を含む試料を供給する工程
ｂ）前記Ｔｒｅｇ細胞を、前記ＣＡＲを発現するように遺伝子改変する工程
ｃ）前記ＣＡＲの抗原結合ドメインを前記第１の抗原試料と６〜１６時間、接触させることにより前記遺伝子改変型Ｔｒｅｇ細胞を活性化し、および前記ＣＡＲの抗原結合ドメインを前記第２の抗原試料と６〜１６時間、接触させることにより前記遺伝子改変型Ｔｒｅｇ細胞を活性化する工程
ｄ）前記第１の抗原試料と接触した前記Ｔｒｅｇ細胞、および第２の抗原試料と接触した前記Ｔｒｅｇ細胞のＴｒｅｇ活性化を測定する工程であって、異なる活性化レベルが、前記第１の抗原試料と前記第２の抗原試料の、Ｔｒｅｇ細胞に発現した前記ＣＡＲの機能活性を活性化させる異なる効率を示す、方法を提供する。

前記第１の抗原試料および前記第２の抗原試料は、抗原の製剤、例えば、可溶型、単量体対多量体化抗原、様々な担体に、例えば、培養ディッシュ、可変サイズの、例えば、５０ｎｍ〜５０μｍ（ただし、それに制限されない）のマイクロビーズ、もしくは生体適合性高分子マトリックス、例えば、デキストランもしくは他の多糖に、付着した抗原、またはＣＡＲの同じ抗原結合ドメインにより、ただし、例えば、異なる親和性、もしくはＣＡＲにおいて誘導される異なる立体構造変化を以て、結合され得る異なる抗原などの点で異なり得る。

本明細書に開示されているようなＣＡＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ構築物（核酸分子）は、当技術分野において周知の方法（例えば、レトロウイルスおよびレンチウイルスを含むウイルスに基づいた系、エレクトロポレーションを含む物理的方法、生物学的方法、化学的方法）により宿主細胞へトランスフェクションまたは形質導入され得る。組み込む、好ましくは、安定的に組み込むために用いられる方法、結果としての、宿主細胞における本明細書に開示されているようなＣＡＲをコードするＤＮＡに関わらず、宿主細胞は、本明細書に開示されているようなＣＡＲを発現する。

あるいは、核酸配列は、合成的に作製され得る。

本明細書に開示されているような抗原結合受容体を発現する操作型細胞は、当技術分野において周知の方法、例えば、ＦＡＣＳ（登録商標）などの蛍光に基づいた分離テクノロジー、またはＭＡＣＳ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）などの磁気細胞分離方法により、非トランスフェクション／形質導入化細胞から、そのような操作型細胞を作製するためのトランスフェクション／形質導入プロセス後、単離（濃縮または分離）され得る。

一般的に、本明細書に開示されているような抗原結合受容体を発現する操作型細胞を作製するための、免疫細胞などの細胞、好ましくはＴ細胞は対象から取得され得る。免疫細胞、好ましくはＴ細胞などの細胞は、全血、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、またはＴ細胞を含有する他の組織などの様々な供給源から取得することができる。これらの細胞の濃縮について、当技術分野において周知の方法、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）またはＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離、または蛍光ソーティング（例えば、ＦＡＣＳｓｏｒｔ）もしくは磁気ソーティング（例えば、ＭＡＣＳ（登録商標））などのポジティブ／ネガティブ選択技術を用いることができる。

例示的には、対象の血液または組織試料のＴｒｅｇを、例えば、ＣＤ２５に特異的な抗体に連結した磁気ビーズで、磁気的に標識し、洗浄し、磁気的に濃縮および収集する。その後、これらのＴｒｅｇは、本明細書に開示されているような抗原結合受容体をそれらの細胞表面上に発現するように操作され得る。

本発明の一実施形態において、本明細書に開示されているような抗原結合受容体を発現する、単離／濃縮された操作型細胞、例えば、免疫細胞、好ましくはＴｒｅｇ細胞は遺伝子改変の前または後に活性化され、当技術分野において周知の方法、例えば、ＩＬ−２などの適切な成長因子の存在下でのＣＤ３およびＣＤ２８結合抗体とコンジュゲートされたミクロンサイズの粒子からなるＴｒｅｇ増殖キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）でのＴｒｅｇのポリクローナル刺激を用いて、操作型細胞の数を増加させるように増殖され得る。好ましくは、前記操作型の、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞などの細胞の数は、治療的有効量へ増加され得る。

本明細書に開示されているようなＣＡＲを発現する遺伝子改変型Ｔｒｅｇ細胞は、閉鎖系での自動化プロセスで作製され得る。本発明の一実施形態において、本明細書に開示されているようなＣＡＲを発現する遺伝子改変型Ｔｒｅｇの作製のためのプロセスは、例えば、以下の工程：
ａ）制御性Ｔ細胞を含む試料を供給する工程
ｂ）前記試料の前記制御性Ｔ細胞を、前記ＣＡＲを発現するように遺伝子改変する工程
ｃ）任意で、前記遺伝子改変型制御性Ｔ細胞を増殖させる工程
ｄ）ＣＡＲリガンドと６〜１６時間、接触させることにより、前記増殖した遺伝子改変型制御性Ｔ細胞を活性化する工程
ｅ）
α）工程ｄ）の細胞を
Ｉ）ＣＤ１５４に結合する分子と接触させて、ＣＤ１５４^＋ Ｔ細胞を枯渇させる工程；または
ＩＩ）ＣＤ１３７などの制御性Ｔ細胞もしくは活性化制御性Ｔ細胞のマーカーに結合する分子と接触させて、前記結合分子と結合する細胞をポジティブ選択する工程、ならびに
β）Ｉ）工程α）Ｉ）の細胞を、ＣＤ１３７などの制御性Ｔ細胞もしくは活性化制御性Ｔ細胞のマーカーに結合する分子と接触させて、前記結合分子と結合する細胞をポジティブ選択する工程であって、それにより、前記ＣＡＲを発現する活性化制御性Ｔ細胞の集団を獲得する、工程；または
ＩＩ）工程α）ＩＩ）の細胞を、ＣＤ１５４に結合する分子と接触させて、ＣＤ１５４^＋ Ｔ細胞を枯渇させる工程であって、それにより、前記ＣＡＲを発現する活性化制御性Ｔ細胞の集団を獲得する工程
により、工程ｄ）の活性化Ｔｒｅｇ細胞を単離する工程
を含み得る。

全部のまたは一部のこれらの工程は、閉鎖系、好ましくは閉鎖された無菌系において、自動的に実施され得る。

前記プロセスは、遺伝子改変型Ｔｒｅｇ細胞を調製するために特に適しており、濃縮されたＴｒｅｇ細胞が、ウイルスおよび／または非ウイルスベクターを用いることにより遺伝子改変される。

これらの工程のいずれも、増やされても省略されてもよいし、または異なる順序で実施してもよい。

細胞改変のための閉鎖系として、完全自動化細胞処理装置ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）および関連したチューブセット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が用いられ得る（ＷＯ２００９／０７２００３）。この閉鎖系は、ほとんどいかなる種類の細胞産物のＧＭＰグレードの処理の必要条件をも満たし、クリーンルームの要求を減らし、技術移転を向上させ、かつ細胞製造プロセスの調和を可能にし得る。

本発明の一実施形態において、本明細書に開示されているようなＣＡＲを発現する操作型Ｔｒｅｇは、自己免疫、移植片拒絶、アレルギー、または慢性炎症性疾患などの障害を患っている対象における処置に用いられ得る。

Ｔｒｅｇは、対象、好ましくは、ヒトから単離され得、または樹立免疫細胞系が用いられ得る。対象は、前記障害を患っている場合もあるし、健康な対象である場合もある。これらのＴｒｅｇ細胞は、本明細書に開示されているようなＣＡＲを発現するようにインビトロで遺伝子改変される。これらの操作型Ｔｒｅｇ細胞は、本明細書に開示されているようなＣＡＲを発現する細胞の治療的に有効な集団へインビトロで活性化および増殖され得、それらはさらに、その改変前または後に、本明細書に開示されているような方法により、より高い純度に濃縮され得る。細胞治療において、これらの操作型Ｔｒｅｇ細胞は、医薬組成物（または本明細書に開示されているようなＣＡＲを発現する治療的に有効な細胞集団の製剤）として、第２の医薬組成物、前記Ｔｒｅｇ細胞の外部刺激の機能を有する可溶性抗原に加えて、それを必要としているレシピエントへ注入され得る。レシピエントにおける注入されたＴｒｅｇ細胞は、その対象の炎症性免疫反応を抑制し、または処置中の前記障害の影響および／もしくは症状を少なくとも低下させることができ得る。レシピエントは、その細胞が取得された同じ対象であってもよいし（自家細胞治療）、またはその細胞が、同じ種の別の対象由来であってもよい（同種細胞治療）。

本明細書に開示されているようなＣＡＲを発現するＴｒｅｇ細胞の集団は、当業者に公知の技術を用いて、対象への投与のために製剤化され得る。

本明細書に開示されているようなＣＡＲを発現する治療的に有効なＴｒｅｇ細胞集団を含む製剤は、薬学的に許容される賦形剤（担体または希釈剤）を含み得る。製剤に含まれる賦形剤は、例えば、本明細書に開示されているようなＣＡＲの抗原結合ドメインの性質に依存して、異なる目的をもつ。一般的に用いられる賦形剤の例には、非限定的に、以下：食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、注射用水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せ、安定化剤、可溶化剤および界面活性剤、緩衝剤および保存剤、等張化剤、増量剤、ならびに潤滑剤が挙げられる。

本明細書に開示されているようなＣＡＲを発現する治療的に有効なＴｒｅｇ細胞集団の製剤は、本明細書に開示されているようなＣＡＲを発現する１つのＴｒｅｇ細胞集団、または本明細書に開示されているようなＣＡＲを発現する１つより多い細胞集団を含み得る。本明細書に開示されているようなＣＡＲを発現する異なるＴｒｅｇ細胞集団は、例えば、用いられるＣＡＲの抗原結合ドメインのアイデンティティおよび／または活性化ドメインのアイデンティティに基づいて、異なり得る。

本明細書に開示されているようなＣＡＲを発現する治療的に有効なＴｒｅｇ細胞集団を含む製剤は、当業者に公知の様式および技術を用いて、対象に投与され得る。例示的な様式には、静脈内注射が挙げられるが、それに限定されない。他の様式には、非限定的に、腫瘍内、皮内、皮下（ｓ．ｃ、ｓ．ｑ．、ｓｕｂ−Ｑ、Ｈｙｐｏ）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、動脈内、髄内、心臓内、関節内（関節）、滑液嚢内（関節液区域）、頭蓋内、脊髄内、および髄腔内（髄液）が挙げられる。

対象に投与される、本明細書に開示されているようなＣＡＲを発現する治療的に有効なＴｒｅｇ細胞集団を含む製剤は、特定の適応症または障害の処置に有効である、開示されているようなＣＡＲを発現するいくらかのＴｒｅｇ細胞を含む。

一般的に、本明細書に開示されているようなＣＡＲを発現する約１×１０^４個から約１×１０^１０個の間のＴｒｅｇ細胞を含む製剤が投与され得る。たいていの場合、製剤は、本明細書に開示されているようなＣＡＲを発現する約１×１０^５個から約１×１０^９個の間のＴｒｅｇ細胞、本明細書に開示されているようなＣＡＲを発現する約５×１０^５個から約５×１０^８個までのＴｒｅｇ細胞、または本明細書に開示されているようなＣＡＲを発現する約１×１０^６個から約１×１０^７個までのＴｒｅｇ細胞を含み得る。しかしながら、対象に投与される、本明細書に開示されているようなＣＡＲを発現するＴｒｅｇ細胞の数は、障害の位置、供給源、アイデンティティ、程度、および重症度、処置されることになっている個体の年齢および状態などに依存して、幅広い範囲内で変わり得る。医師は、最終的に、用いられる適切な投薬量を決定し得る。

デキストランなどの可溶性抗原は、当業者に公知の技術を用いて、対象への投与のために製剤化され得る。デキストランなどの可溶性抗原の製剤は、薬学的に許容される賦形剤（担体または希釈剤）を含み得る。製剤に含まれる賦形剤は、例えば、可溶性抗原の性質および投与様式に依存して、異なる目的をもつ。一般的に用いられる賦形剤の例には、非限定的に、以下：食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、注射用水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せ、安定化剤、可溶化剤および界面活性剤、緩衝剤および保存剤、等張化剤、増量剤、ならびに潤滑剤が挙げられる。

可溶性抗原の製剤は、１つの型の可溶性抗原、または１つより多い型の可溶性抗原を含み得る。

デキストランなどの可溶性抗原は、当業者に公知の様式および技術を用いて、対象に投与され得る。例示的な様式には、静脈内、腹腔内、および腫瘍内注射が挙げられるが、それらに限定されない。他の様式には、非限定的に、皮内、皮下（ｓ．ｃ、ｓ．ｑ．、ｓｕｂ−Ｑ、Ｈｙｐｏ）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、動脈内、髄内、心臓内、関節内（関節）、滑液嚢内（関節液区域）、頭蓋内、脊髄内、および髄腔内（髄液）が挙げられる。

デキストランなどの可溶性抗原を含む製剤は、特定の適応症または障害を処置するために有効な量で、対象に投与される。一般的に、デキストランなどの可溶性抗原の少なくとも約１μｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重を含む製剤が、処置を必要としている対象に投与され得る。たいていの場合、投薬量は、投与経路、症状などを考慮して、毎日または毎週または毎月の、デキストランなどの可溶性抗原の約１００μｇ／ｋｇ体重から約１０ｍｇ／ｋｇ体重までであり得る。しかしながら、対象に投与される製剤中のデキストランなどの可溶性抗原の量は、障害の位置、供給源、アイデンティティ、程度、および重症度、処置されることになっている個体の年齢および状態などに依存して、幅広い範囲内で変わり得る。医師は、最終的に、用いられる適切な投薬量を決定し得る。

本発明のある１つの態様、例えば、本発明の第１の態様に関しての、本明細書に定義された全ての定義、特性、および実施形態はまた、本明細書に開示されているような本発明の他の態様の関連において、変更すべき所は変更して、適用される。

定義
他に規定がない限り、本明細書に用いられる技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味をもつ。

一般的に、ＣＡＲは、抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン（細胞外部分）、膜貫通ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメイン（細胞内シグナル伝達ドメイン）を含み得る。細胞外ドメインは、膜貫通ドメインにリンカーにより連結され得る。細胞外ドメインはまた、シグナルペプチドを含み得る。本発明のいくつかの実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ポリペプチドと連結するハプテン（「ハプテン化」または「タグ付き」ポリペプチド）に結合し、そのポリペプチドは、自己抗原などの疾患関連抗原、または無害な外因性物質、例えば、微生物叢、植物の花粉、真菌の胞子などの浮遊微小粒子に由来した抗原と結合し得る。そのようなＣＡＲはまた、例えば、ＵＳ９２３３１２５Ｂ２に開示されているように、「抗タグ」ＣＡＲと名付けられる場合がある。本発明の他の実施形態において、ＣＡＲの細胞外部分は、ＴＣＢＭの一部であるリンカー／標識エピトープ（ＬＬＥ）と結合する抗原結合ドメインとして、リンカー／標識エピトープ（ＬＬＥ）結合ドメインを含み得る。そのようなＣＡＲは、欧州特許出願第ＥＰ１６１９６４８７．９号に開示されているように、抗ＬＬＥ ＣＡＲと名付けられる場合がある。どちらの型のＣＡＲも汎用性および／または適応性のあるＣＡＲである。ハプテンとＬＬＥのどちらも、ポリペプチドと直接的または間接的に連結される「タグ」であり（タグ付きポリペプチド）、そのポリペプチドは、標的細胞の（細胞）表面に発現した自己抗原などの疾患関連抗原、または無害な外因性物質、例えば、微生物叢、植物の花粉、真菌の胞子などの浮遊微小粒子と結合し得る。本発明の他の実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、本明細書に開示されているような可溶性抗原と結合する。

「シグナルペプチド」は、細胞内のタンパク質の、例えば、ある特定の細胞オルガネラ（例えば、小胞体）および／または細胞表面への、輸送および局在化を方向付けるペプチド配列を指す。

一般的に、「抗原結合ドメイン」は、抗原、例えば、可溶性抗原と特異的に結合するＣＡＲの領域を指す。本発明のＣＡＲは、１つまたは複数の抗原結合ドメインを含み得る。一般的に、ＣＡＲ上のターゲティング領域は細胞外である。抗原結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片を含み得る。抗原結合ドメインは、例えば、完全長重鎖、Ｆａｂ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、二価一本鎖抗体、またはダイアボディを含み得る。アフィボディなどの所定の抗原と特異的に結合する任意の分子または天然に存在する受容体由来のリガンド結合ドメインが、抗原結合ドメインとして用いられ得る。しばしば、抗原結合ドメインはｓｃＦｖである。通常、ｓｃＦｖにおいて、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域が可動性リンカーによって融合されて、ｓｃＦｖを形成する。そのようなリンカーは、例えば、「（Ｇ_４／Ｓ）_３リンカー」であり得る。

場合によっては、抗原結合ドメインが、ＣＡＲが用いられる種と同じ種に由来することが、有益である。例えば、それをヒトにおいて治療的に用いることが計画されている場合、ＣＡＲの抗原結合ドメインが、ヒトもしくはヒト化抗体またはその抗原結合断片を含むことが有益であり得る。ヒトもしくはヒト化抗体またはその抗原結合断片は、当技術分野において周知の様々な方法によって作製され得る。

本明細書で用いられる場合、「スペーサー」または「ヒンジ」は、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間にある親水性領域を指す。本発明のＣＡＲは、細胞外スペーサードメインを含み得るが、そのようなスペーサーを除外することも可能である。スペーサーには、例えば、抗体のＦｃ断片もしくはその断片、抗体のヒンジ領域もしくはその断片、抗体のＣＨ２もしくはＣＨ３領域、アクセサリータンパク質、人工スペーサー配列、またはそれらの組合せが挙げられ得る。スペーサーの顕著な例はＣＤ８αヒンジである。ＣＡＲの膜貫通ドメインは、そのようなドメインのための任意の望ましい天然または合成供給源に由来し得る。その供給源が天然である場合、そのドメインは、任意の膜結合型または膜貫通型タンパク質に由来し得る。膜貫通ドメインは、例えばＣＤ８αまたはＣＤ２８に由来し得る。重要なシグナル伝達モジュール（ドメイン）および抗原認識モジュール（ドメイン）は、２つの（またはさらにそれより多い）ポリペプチド上にあり、その結果、ＣＡＲは、２つの（またはそれより多い）膜貫通ドメインを有し得る。その分離している重要なシグナル伝達モジュールと抗原認識モジュールは、ＣＡＲの各ポリペプチドにおける小分子依存性ヘテロ二量体化ドメインによる、ＣＡＲ細胞発現に対する小分子依存性の滴定可能（titratable）で可逆的な調節を可能にする（Ｗｕら、２０１５、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５０：２９３〜３０３）。

ＣＡＲの細胞質シグナル伝達ドメイン（または細胞内シグナル伝達ドメイン）は、ＣＡＲが発現している免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化に関与する。「エフェクター機能」は、細胞の特殊化された機能を意味し、例えば、Ｔｒｅｇにおいて、エフェクター機能は、ＩＬ−１０、ＩＬ−３５、ＴＧＦ−βなどの免疫抑制性サイトカインの分泌、またはＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４などの阻害性分子、ＩＬ−２受容体などの競合性サイトカイン受容体の発現を含む、抑制活性または制御活性であり得る。細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達し、そして、ＣＡＲを発現する細胞に、特殊化された機能を実施するように指示する、タンパク質の部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫細胞エフェクター機能を惹起または遮断するシグナルを伝達するのに十分な所定のタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの任意の完全な、変異型の、または切断型の部分を含み得る。

ＣＡＲに用いられる細胞内シグナル伝達ドメインの顕著な例には、抗原受容体結合後のシグナル伝達を惹起する、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および共受容体の細胞質シグナル伝達配列が挙げられる。

一般的に、Ｔ細胞活性化は、細胞質シグナル伝達配列の２つの異なるクラス、第１に、ＴＣＲを通して抗原依存性一次活性化を惹起するもの（一次細胞質シグナル伝達配列、一次細胞質シグナル伝達ドメイン）、および第２に、二次または共刺激シグナルを提供するように抗原非依存性様式で作用するもの（二次細胞質シグナル伝達配列、共刺激シグナル伝達ドメイン）により、媒介され得る。したがって、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、１つもしくは複数の一次細胞質シグナル伝達ドメインおよび／または１つもしくは複数の二次細胞質シグナル伝達ドメインを含み得る。

刺激性様式で作用する一次細胞質シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭ（免疫受容活性化チロシンモチーフ）を含有し得る。

ＣＡＲに用いられる場合が多い、ＩＴＡＭ含有一次細胞質シグナル伝達ドメインの例は、ＴＣＲζ（ＣＤ３ζ）、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来したものである。ＣＤ３ζに由来した配列が、最も顕著である。

ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを単独で、または任意の他の望ましい細胞質ドメインと組み合わせて、含むようにデザインされ得る。ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ζ鎖部および共刺激シグナル伝達領域（ドメイン）を含み得る。共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的応答に必要とされる、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子についての例は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３である。

ＣＡＲの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質シグナル伝達配列は、ランダムなまたは特定された順序で、リンカー有りまたは無しで、互いに連結し得る。好ましくは２アミノ酸長から１０アミノ酸長の間である、短いオリゴまたはポリペプチドリンカーが連結を形成し得る。顕著なリンカーはグリシン−セリンのダブレットである。

例として、細胞質ドメインは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含み得る。別の例において、細胞質ドメインは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ１３７のシグナル伝達ドメインを含み得る。さらなる例において、細胞質ドメインは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメイン、およびＣＤ１３７のシグナル伝達ドメインを含み得る。

本明細書で用いられる場合、用語「ＣＤ１３７ ＣＡＲ」は、少なくとも一次細胞質シグナル伝達ドメインに加えて、少なくともＣＤ１３７共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で用いられる場合、用語「ＣＤ２８ ＣＡＲ」は、少なくとも一次細胞質シグナル伝達ドメインに加えて、少なくともＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む。前述のように、ＣＡＲの膜貫通ドメインの細胞外部分または細胞質ドメインのいずれかは、ＣＡＲの重要なシグナル伝達モジュールと抗原認識モジュールを分ける目的でヘテロ二量体化ドメインも含み得る。

ＣＡＲは、ＣＡＲをコードする核酸のレベルで、自殺スイッチによってＣＡＲ−Ｔ細胞またはＴｒｅｇ細胞を排除するための１つまたは複数の作動エレメントを含むようにさらに改変され得る。自殺スイッチには、例えば、アポトーシス誘導性シグナル伝達カスケード、または細胞死を誘導する薬物を挙げることができる。一実施形態において、ＣＡＲを発現し、かつコードする核酸は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）またはシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）などの酵素を発現するようにさらに改変することができる。

本発明のＣＡＲは、機能性ＣＡＲ、すなわち、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞の免疫エフェクター応答を媒介するが、少なくともＣＤ１３７共刺激ドメインを含むＣＡＲを生じる、任意の順序および／または組合せで、本明細書に記載されているような上記で言及されたドメインの任意の一部または部分を含むようにデザインされ得る。

本明細書で用いられる場合、用語「抗体」は、最も広い意味で、様々な形の抗体構造を網羅するように用いられ、その抗体構造には、モノクローナルおよびポリクローナル抗体（完全長抗体を含む）、多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、抗体断片、すなわち、抗体の抗原結合断片、標的抗原を特異的に認識する（すなわち、結合する）イムノアドヘシンおよび抗体−イムノアドヘシンキメラが挙げられるが、それらに限定されない。「抗体断片」は、完全長抗体の一部、好ましくはその可変ドメインまたは少なくともその抗原結合部位（「抗体の抗原結合断片」）を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ（ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ（抗原結合性断片））、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｖａｒｉａｂｌｅ（一本鎖可変性断片））、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ’、ダイアボディ、一本鎖抗体分子、および抗体断片から形成された多重特異的抗体が挙げられる。

本明細書で用いられる場合、用語「抗原」は、１つまたは複数の抗体と結合し、またはその産生を誘起する物質を含むことが意図され、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、脂質、デキストランなどの糖質、ハプテン、およびそれらの組合せ、例えば、グリコシル化タンパク質または糖脂質を含み得るが、それらに限定されない。

抗原という用語は、標的細胞の細胞表面上に発現した抗原を指し得る。しかし、その用語はまた、例えば、本明細書に開示されているようなＣＡＲを発現する操作型Ｔｒｅｇで処置され得る対象において、細胞の表面上に発現せず、または存在していない抗原を指し得る。その結果、その抗原は、「可溶性抗原」と本明細書で呼ばれる。本明細書で用いられる場合、用語「可溶性抗原」および「遊離抗原」は、互換的に用いることができ、本明細書に開示されているようなＣＡＲの抗原結合ドメインにより結合され得る可溶性抗原が、前記ＣＡＲを発現するＴｒｅｇが対象に適用される場合、前記対象、好ましくはヒトの細胞の表面上に天然では発現せず、または存在していないことを意味する。好ましくは、可溶性抗原は、前記ＣＡＲを発現する前記Ｔｒｅｇ細胞が適用される対象の血液または組織に存在していない。より好ましくは、それはまた、前記ＣＡＲの抗原結合ドメインとよりも、対象における別の分子と結合するという特異的親和性または優先性をもたない。好ましくは、前記可溶性抗原は、外因性抗原であり得る。前記外因性抗原は、本明細書に開示されているような障害の処置のために前記ＣＡＲを発現するＴｒｅｇをまた受け、または受けた対象に適用され得、それは、本明細書に開示されているようなＣＡＲの抗原結合ドメインと結合し、その後、前記ＣＡＲを発現するＴｒｅｇ細胞を活性化し得る外部刺激物質（外部刺激）である。前記外因性可溶性抗原は、対象に適用されたとき、前記対象に害を誘起しない非病因性抗原であり得る。外因性可溶性抗原は、例えば、本明細書に開示されているように処置され得る対象において、好ましくは天然では存在しないポリペプチドまたは多糖などの高分子であり得る。

可溶性抗原は、好ましくは、タンパク質、多糖、オリゴもしくはポリヌクレオチドなどの高分子、ポリエチレングリコール、またはヒトに適用することができる任意の他の生体適合性ポリマー化合物、または、より大きい高分子と結合した小分子「ハプテン」などの前記分子の誘導体からなる群から選択され得る。可溶性抗原は、典型的には架橋によって達成されるＣＡＲの活性化を可能にする形で適用され得、すなわち、用いられる高分子は、ＣＡＲの抗原結合ドメインにより結合される実際のドメインの１コピーより多く、理想的には数コピーを含有し得る。そのような多価分子は、架橋およびＣＡＲ活性化を誘導し得る。好ましくは、（外因性）可溶性抗原についての唯一の必要条件は、それが、本明細書に開示されているように処置される対象の循環系、例えば、血液系もしくはリンパ系、および／または組織において循環することができ、かつ前記対象の細胞の表面の部分ではないことであり、その結果として、（外因性）可溶性抗原は、前記Ｔｒｅｇ細胞が前記対象に適用されたとき、前記Ｔｒｅｇ細胞により発現している本明細書に開示されているようなＣＡＲの抗原結合ドメインによってのみ結合され得る。したがって、（外因性）可溶性抗原はまた、ビーズ（ナノビーズ、マイクロビーズ）などの構造上に固定化され得、前記対象の循環系、例えば、血液系において、そのような構造上に固定化された抗原の循環が可能になる。これらもまた、本発明の趣旨において（外因性）可溶性抗原であり得る。

好ましい可溶性抗原はデキストラン（デキストラン分子）である。前記デキストランは、前記ＣＡＲを発現する前記Ｔｒｅｇで処置されることを必要としている対象に、遊離デキストラン分子として、またはマイクロビーズもしくはナノビーズなどの粒子に固定化されたデキストラン分子として、適用され得る。

デキストランは、様々な長さ（３キロダルトンから２０００キロダルトンまで）の鎖で構成される、複雑な分岐グルカン（多数のグルコース分子でできた多糖）である。任意の長さ、例えば、３ｋＤａから２０００ｋＤａまでのデキストランが、本明細書に開示された適用に用いられ得る。好ましくは、用いられるデキストランは、５ｋＤａより大きく、１０ｋＤａより大きく、２０ｋＤａより大きく、１００ｋＤａより大きく、または２００ｋＤａより大きくてもよい。本発明のいくつかの実施形態において、用いられるデキストランは、６０ｋＤａから２００ｋＤａまでのデキストランであり得る。本明細書で用いられるような可溶性デキストランは、本明細書に開示されているようなデキストランと結合するＣＡＲに対する多くの抗原を提示し得る。デキストランは、抗デキストランＣＡＲに対するモノ抗原の代わりにポリ抗原であり得る。

前記デキストランは、結合していないデキストラン、すなわち、遊離デキストラン、可溶性デキストラン、またはコロイド性ナノまたはマイクロ粒子とコンジュゲートしたデキストランであり得る。前記デキストランは、調節可能な条件下で前記Ｔｒｅｇ細胞を活性化するために、本明細書に開示されているようなＴｒｅｇ細胞をもつ、それを必要としている患者へ投与され得る。

前記デキストランは、医薬組成物の一部としても対象に適用され得る（例えば、Ｄｅｌｔａｄｅｘ；デキストラン４０ ＮａＣｌ中１０％；例えば、体重１ｋｇあたり１．５ｇまたはそれ未満のデキストランの注入）。あるいは、デキストランは、インビボで細胞もしくは組織マトリックス表面へのデキストランの特異的ターゲティングを可能にする、抗体または別の付着構造、例えば、細胞外マトリックス付着ペプチドとコンジュゲートされ得る。

Ｔｒｅｇ（本明細書で、「制御性Ｔ細胞」または「Ｔｒｅｇ細胞」とも名付けられている）は、典型的には、ＣＤ２５も発現し、かつＣＤ１２７の発現を欠く、Ｆｏｘｐ３^＋ ＣＤ４^＋ Ｔ細胞として本明細書で定義される。Ｔｒｅｇはさらに、活性化によりＣＤ１３７を選択的に発現するが、活性化の４〜８時間の時間枠内での、ＣＤ１５４発現の欠如、加えて、エフェクターサイトカイン発現、例えば、ＩＬ−２−ＩＦＮγ、ＩＬ−１７、ＩＬ−４などの欠如を有することにより特徴付けられる。Ｔｒｅｇはまた、特定のＤＮＡ領域、例えば、ｆｏｘｐ３遺伝子領域内（Ｔｒｅｇ特異的脱メチル化領域、ＴＳＤＲ；Ｈｕｅｈｎ，Ｊ．ら、２００９、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９、８３〜９も参照）の、選択的脱メチル化だけでなく、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ４、ＦＡＮＫ１、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４遺伝子領域などの他の領域における他の特異的メチル化パターンによっても特徴付けられる。それらは、自己抗原および無害な外来抗原に対して寛容を維持するのに必要とされる高免疫抑制機能を有する別個のＴ細胞系列を表す。本明細書で定義されているようなＴｃｏｎ細胞は、Ｔｒｅｇではない、全てのＣＤ４^＋ Ｔ細胞を含む。

本明細書で用いられる場合、用語「標的細胞」は、本明細書に開示されているようなＣＡＲにより直接的に、または（例えば、タグ付きポリペプチドを介して）間接的に認識される（結合される）はずである、その細胞表面上に抗原を発現し得る細胞を指す。

前記標的細胞は、対象において自己免疫、移植片拒絶、アレルギー、および慢性炎症性疾患を引き起こす疾患状態における細胞であり得る。

自己免疫は、自己免疫疾患を引き起こし得る内因性構造に対する免疫反応を生じる、免疫細胞が自己に対して向けられる状態を意味する。移植片拒絶は、宿主の免疫系によって外来として認識される移植組織に対して免疫応答を発生させ、その結果として、移植組織の拒絶を生じることを意味する。

アレルギーは、例えば、環境または食物に由来し得る、無害な外来抗原に対して、例えば、吸入、摂取、または皮膚接触により対象と接触した時の、不適切な免疫応答の発生を意味する。

慢性炎症性疾患は、系に依然として残存する抗原に対する免疫反応の発生を意味する。例としては、例えば、炎症性腸疾患中の細菌に対する免疫反応、慢性感染症中のウイルスに対する免疫反応、または自己免疫反応中の内因性構造に対する免疫反応が挙げられる。例としてはまた、外来抗原に対するアレルギー反応の結果としての慢性炎症も挙げることができる。自己免疫疾患は、複数の異なる器官系に影響し得る病態を生じる自己免疫から起こる状態である。例としては、関節リウマチ、多発性硬化症、視神経脊髄炎、全身性エリテマトーデス、１型糖尿病が挙げられる。対象のウイルス、細菌、寄生生物による慢性感染症は、ウイルス、細菌、または寄生生物などの病原体（disease-causing agent）による対象への侵入、その後のそれらの複製を意味する。

本明細書に開示されているようなＣＡＲ（ポリペプチド）、ＣＡＲをコードする核酸分子、組換え発現ベクター、ＣＡＲを発現する細胞、およびＣＡＲを発現する細胞集団は、単離および／または精製することができる。用語「単離される」とは、天然の状態から変化した、または取り出されたことを意味する。例えば、単離された細胞集団は、そのような細胞の濃縮、およびそれらの天然に存在する状態で通常、前記単離された細胞に付随している他の細胞からの分離を意味する。単離された細胞集団は、天然で見出されるものより、より均一な細胞集団である、実質的に精製された細胞の集団を意味する。好ましくは、濃縮された細胞集団は、少なくとも約９０％の選択された細胞型を含む。特定の態様において、細胞集団は、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはさらに１００％の選択された細胞型を含む。

例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離されて」いないが、その天然状態の共存する物質から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離されて」いる。単離された核酸またはタンパク質はまた、例えば、宿主細胞などの非天然環境に存在することができる。

本明細書で用いられる場合、用語「対象」は、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ヤギ、ニワトリ、イヌ、サル、またはヒトなどの哺乳類を指す。好ましくは、対象はヒトである。対象は、自己免疫疾患、アレルギー、移植片拒絶、または慢性炎症などの障害を患っている対象（患者）であり得るが、対象はまた健康な対象であり得る。

本明細書で用いられる場合、用語「自家の」は、それが後で再導入される同じ対象に由来した任意の材料を指す。

本明細書で用いられる場合、用語「同種の」は、その材料が再導入される対象と同じ種の異なる対象に由来した任意の材料を指す。

用語「治療的有効量」または「治療的に有効な集団」は、対象において治療的利益を提供する細胞集団の量を意味する。

例えば本明細書に開示されているようなＣＡＲにおいて用いられる場合、抗体、その抗原結合断片の、抗原結合ドメインに関する用語「特異的に結合する」または「に特異的な」は、試料において、特定の抗原を認識し、かつそれと結合するが、他の分子を実質的に認識または結合しない、抗原結合ドメインを指す。１つの種由来の抗原と特異的に結合する抗原結合ドメインはまた、別の種由来のその抗原とも結合する場合がある。この種間交差反応性は、多くの抗体にとって典型的なことであり、それゆえに、特異的というその抗原結合ドメインの定義に反することではない。抗原と特異的に結合する抗原結合ドメインは、抗原の異なるアレル型（アレルバリアント、スプライスバリアント、アイソフォームなど）、または同じ遺伝子ファミリー由来のこの抗原の相同性バリアントとも結合し得る。この交差反応性は、多くの抗体にとって典型的なことであり、それゆえに、特異的というその抗原結合ドメインの定義に反することではない。

本明細書で用いられる場合、用語「操作型細胞」および「遺伝子改変型細胞」は、互換的に用いることができる。その用語は、次に細胞またはその子孫の遺伝子型および／または表現型を改変する外来遺伝子または核酸配列を含有および／または発現することを意味する。特に、その用語は、細胞、好ましくは免疫細胞が、天然状態ではこれらの細胞において発現していないペプチドまたはタンパク質を安定的にまたは一過性に発現するように、当技術分野において周知の組換え方法により操作することができるという事実を指す。例えば、免疫細胞は、それらの細胞表面上にキメラ抗原受容体などの人工構築物を発現するように操作される。

用語「障害」は、癌、自己免疫障害、またはウイルス、細菌、寄生生物、もしくは他による感染などの対象における機能的異常または妨害を意味する。

本明細書で用いられる場合、障害「を処置する」（の処置）という用語は、対象により経験された疾患または障害の少なくとも１つの徴候または症状の頻度または重症度を低下させることを意味する。

免疫療法は、「免疫応答を誘導し、増強し、または抑制することによる疾患の処置」として定義される医学用語である。免疫応答を誘発し、または増幅するように設計された免疫療法は、活性化免疫療法として分類され、一方、低下させ、または抑制する免疫療法は抑制免疫療法として分類される。活性化免疫療法としての癌免疫療法は、腫瘍を拒絶し、かつ破壊するように免疫系を刺激しようと試みる。養子細胞移入は、癌細胞を攻撃する、細胞に基づいた細胞毒性応答を用いる。患者の癌に対する天然の、または遺伝子操作された反応性を有するＴ細胞などの免疫細胞が、インビトロで作製され、その後、その癌患者へ移入して戻される。

本明細書で用いられる場合、用語「発現」は、特定のヌクレオチド配列の、細胞におけるそのプロモーターにより駆動される転写および／または翻訳として定義される。

配列列挙プロトコールに示されているような配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列は、本明細書に開示されているようなＣＡＲの部分的配列である。前記配列番号１および配列番号２の配列はまた、本明細書に記載されているような意図された機能をなお保持しながら、いくつかのアミノ酸の欠失、付加、または置換を有する、この配列のバリアントも含み得る。したがって、配列番号１および配列番号２と本質的に類似した、それぞれ、アミノ酸配列レベルにおいて少なくとも７０％、または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列などの、配列番号１および配列番号２におけるアミノ酸配列のバリアントがこの定義に含まれる。一般的に、配列番号１および配列番号２の配列の意図された機能の意図的変化をもたらさない全てのアミノ酸バリエーションがこの定義に含まれる。本発明の関連において、「配列同一性」は、当技術分野に周知のアミノ酸配列についてのアライメントプログラムを用いるペアワイズアライメントを用いて決定され得る。

「循環系」は、血液が、身体において、栄養分（例えば、アミノ酸および電解質）、酸素、二酸化炭素、ホルモン、および血液細胞を細胞へおよび細胞から循環および輸送して、栄養物を供給し、かつ疾患と闘うのを助け、温度およびｐＨを安定化させ、ならびに恒常性を維持することを可能にする、対象の器官系である。循環系は、２つの別々の系：血液を分配する心血管系およびリンパ液を循環させるリンパ系を含む。

本明細書で用いられる場合、用語「自動化方法」または「自動化プロセス」は、さもなければオペレーターにより手作業で実施されるだろう、または実施され得る、デバイスならびに／またはコンピュータおよびコンピュータソフトウェアの使用により自動化されることになる任意のプロセスを指す。自動化されている方法（プロセス）は、人の介入も送達するための人的時間もあまり必要としない。場合によっては、方法は、その方法の少なくとも１つの工程が少しの人の援助も介入もなく実施されるならば、自動化されている。好ましくは、方法は、その方法の全工程が人の援助も介入もなく実施されるならば、自動化されている。

本明細書で用いられる場合、用語「粒子」は、コロイド粒子、マイクロスフェア、ナノ粒子、またはビーズなどの固相を指す。そのような粒子の作製のための方法は、その技術分野において周知である。粒子は磁気粒子であり得る。粒子は、溶液もしくは懸濁液中にあり得、またはそれらは、本発明において使用前に凍結乾燥状態にあり得る。凍結乾燥粒子は、その後、本発明に関して処理されるべき試料と接触させる前に、便利なバッファー中に再構成される。

特に強力なソーティングテクノロジーは、磁気細胞ソーティングである。細胞を磁気的に分離するための方法は、いくつかの供給業者から市販されている。細胞を含む生物学的試料において細胞を、例えば、Ｔｒｅｇ細胞および他の細胞（免疫細胞）について濃縮し、ソーティングし、および／または検出するための好ましい実施形態において、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、例えば、多糖による有機コーティングを有するコロイド超常磁性微粒子と共に用いられる（磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ（登録商標））テクノロジー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ））。

別のソーティングテクノロジーは、フローサイトメトリーを用いる。フローサイトメトリーは、例えば、電子検出装置によって、細胞を流体の流れに懸濁させ、それらを通過させることによる、細胞ソーティングおよびバイオマーカー検出に用いられる、レーザーまたはインピーダンスに基づいた生物物理学的テクノロジーである。フローサイトメトリーは、１秒間あたり最高何千個という粒子の物理的および化学的特性の同時の多パラメータ分析を可能にする。蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）は、フローサイトメトリーの特殊な型である。それは、生物学的細胞の不均一な混合物を、各細胞の特異的な光散乱および蛍光特性に基づいて、１回に１細胞、２つ以上の容器へソートするための方法を提供する。

本明細書で用いられる場合、細胞の単離、精製、または濃縮の関連における用語「枯渇」、「枯渇させる」などは、当技術分野における通常の意味を有し、Ｔｒｅｇおよび他の（免疫）細胞を含む試料から特定化された細胞（例えば、ＣＤ１５４^＋細胞）の除去を指す。枯渇のための方法は、当技術分野において周知であり、および本明細書に記載されており、それには、例えば、集団における特定化された細胞（例えば、ＣＤ１５４^＋細胞）が標識され、その細胞集団から除去され、その結果として、その特定化された細胞が存在せず、または出発集団において、より低い割合で存在する、新しい集団を生じる、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳソーティングが挙げられる。「枯渇」は、特定化された細胞が完全に除去されることも、新しい集団が、特定化された細胞を完全に含まないことも必要としないことは認識されているだろう。典型的には、特定化された細胞を集団から枯渇させることは、そのような細胞の提示（集団における全細胞のパーセンテージとして測定される）を、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、低下させることを意味する。

本明細書で用いられる場合、細胞の単離、精製、または濃縮の関連における用語「ポジティブ選択」は、当技術分野における通常の意味を有し、Ｔｒｅｇおよび任意で他の（免疫）細胞を含む試料から特定化された細胞（例えば、ＣＤ１３７^＋細胞）の濃縮を指す。ポジティブ選択のための方法は、当技術分野において周知であり、および本明細書に記載されており、それには、例えば、集団における特定化された細胞（例えば、ＣＤ１３７^＋細胞）が標識されて、細胞集団から単離され、その単離された細胞が、特定化された細胞が出発集団において、より高い割合で存在する新しい集団を生じる、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳソーティングが挙げられる。

実施形態
本発明の一実施形態において、ＣＤ３ζおよびＣＤ１３７シグナル伝達ドメイン、ならびにデキストランなどの外因性抗原に特異的な抗原結合ドメインを含むＣＡＲを発現するＴｒｅｇが作製される。ＣＡＲをコードするＤＮＡ構築物は、当技術分野において周知の方法（例えば、ウイルスに基づいた系、物理的方法、生物学的方法、化学的方法）により、Ｔｒｅｇ細胞へトランスフェクションまたは形質導入することができる。Ｔｒｅｇ細胞においてＣＡＲをコードする核酸を組み込み、好ましくは安定的に組み込むために用いられる方法に関わらず、結果として、そのＴｒｅｇ細胞はＣＡＲを発現する。これらのＴｒｅｇ細胞は、インビトロおよびインビボにおいて、細胞培養中である細胞、またはそれらが適用された対象の血液中に循環している細胞へのデキストランの添加により、活性化することができる。

本発明の別の実施形態において、本発明のＣＡＲを発現するＴｒｅｇは、それぞれの抗原、例えば、デキストランでの抗原特異的活性化後、磁気または蛍光のいずれかのソーティングにより、ＣＤ１５４と組み合わせて、またはＣＤ１５４無しで、ＣＤ１３７を発現する細胞の単離によって、単離される。

本発明の実施形態において、Ｔｒｅｇは、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、または胸腺組織などの様々な供給源から取得することができる。これらの細胞の濃縮について、当技術分野において周知の方法、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）またはＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離、または蛍光ソーティング（例えば、ＦＡＣＳｓｏｒｔ）もしくは磁気ソーティング（例えば、ＭＡＣＳ（登録商標））などのポジティブ／ネガティブ選択技術を用いることができる。

一実施形態において、対象の所定の供給源のＴｒｅｇが、例えば、ＣＤ４および／またはＣＤ２５および／またはＣＤ１２７および／またはＣＤ１５４および／またはＣＤ１３７に特異的な抗体と連結した磁気ビーズで、磁気的に標識され、洗浄され、磁気的に濃縮され、収集される。その後、これらのＴｒｅｇ細胞は、それらの細胞表面上にＣＤ１３７−ＣＤ３ζ−ＣＡＲを発現するように操作され得る。

本発明の別の実施形態において、本発明のＣＡＲを発現する操作型Ｔｒｅｇが、当技術分野において周知の方法、例えば、ＦＡＣＳ（登録商標）などの蛍光に基づいた分離テクノロジー、またはＭＡＣＳ（登録商標）などの磁気細胞分離方法により、トランスフェクション／形質導入プロセス後、単離される。

本発明の一実施形態において、ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ−ＣＡＲを発現する操作型Ｔｒｅｇは、操作型Ｔｒｅｇの数を増加させるために、およびＣＤ１３７−ＣＤ３ζ−ＣＡＲを発現するＴｒｅｇの純度を高めるために、外因性抗原（例えば、デキストラン）または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８でのポリクローナル刺激の存在下で、増殖される。好ましくは、前記操作型Ｔｒｅｇの量は、治療的有効量へ増加される。

本発明の一実施形態において、高純度のＴｒｅｇ（例えば、＞８０％ ＦｏｘＰ３発現）が、ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ−ＣＡＲを発現するように遺伝子操作される。

本発明の一実施形態において、高純度のＴｒｅｇ（例えば、＞８０％ ＦｏｘＰ３発現）が、他のマーカー、例えば、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ１５４と組み合わせてのＣＤ１３７の発現により単離される。

本発明の一実施形態において、ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ−ＣＡＲが、炎症性疾患または自己免疫疾患、例えば、炎症性腸疾患、関節リウマチ、多発性硬化症、または移植片拒絶もしくは移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を有する対象における処置に用いられる。

本発明の一実施形態において、ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ−ＣＡＲは、可溶型またはビーズに固定化された型での外因性抗原（例えば、デキストラン）の、好ましくは、炎症性疾患または自己免疫疾患、例えば、ＩＢＤ、関節リウマチ、ＭＳ、移植片拒絶、ＧｖＨＤを有する患者における、局所部位においてかまたは全身性のいずれかでの適用により、活性化される。

異なる細胞内シグナル伝達ドメインを有するデキストラン特異的ＣＡＲ−Ｔｒｅｇの作製
ＣＡＲ構築物は、外因性抗原（例えば、デキストラン）に特異的な抗体に由来する特異的結合断片を含有する。ヒンジ領域は、ＩｇＧドメイン、ＣＤ８ａ ＣＤ８ａ、またはＣＤ２８に由来し得、ＣＡＲの検出を可能にするエピトープ／タグを含み得る。例えば、図１Ａに示されているように、膜貫通ドメインは、例えば、ＣＤ８ａまたはＣＤ２８に由来し得、その後、ＣＤ３ζおよびＣＤ１３７を含有する１〜３つのシグナル伝達ドメインが続く。Ｔｒｅｇは、ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ−ＣＡＲを発現するように遺伝子操作され、それは、ＬＮＧＦＲの発現により決定することができる（図１Ｂ）。ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ−ＣＡＲの抗原結合は、図１Ｃにデキストランについて示されているように、（例えば、蛍光で）標識され得るそれぞれの抗原とのインキュベーションにより決定することができる。

異なる細胞内シグナル伝達ドメインを有するＣＡＲ−Ｔｒｅｇの活性化
外因性抗原（例えば、デキストラン）に特異的であるＣＡＲ−Ｔｒｅｇは、それらのそれぞれの抗原により活性化することができ、活性化は、ＣＤ１３７発現により分析することができる。ビーズ結合型デキストランでの刺激後のＣＡＲ−Ｔｒｅｇ活性化は、図２Ａに示されている。ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ−ＣＡＲは、ＣＡＲ−ＴｒｅｇにおいてＣＤ１３７発現を誘導するのに、より強力であった（図２Ａ）。同じ特異性をもつ他の試験されたＣＡＲ構築物の機能性を、ＺＡＰ７０のリン酸化により分析した。リン酸化されたＺＡＰ７０は、例えば、ＣＤ２８−ＣＤ３ζシグナル伝達を有するＣＡＲ−Ｔｒｅｇにおいて検出されたが（図２Ｂ）、ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ−ＣＡＲだけが、Ｔｒｅｇ活性化を誘導した（図２Ａ）。

異なる細胞内シグナル伝達ドメインを有するデキストラン特異的ＣＡＲ−Ｔｒｅｇの増殖
外因性抗原（例えば、デキストラン）に特異的であるＣＡＲ−Ｔｒｅｇは、抗ＣＤ３／ＣＤ２８（図３Ａ、Ｃ）またはそれらのそれぞれの抗原、例えば、ビーズ結合型デキストラン（図３Ｂ、Ｄ）の存在下で増殖することができる。ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ−ＣＡＲを有するＣＡＲ−Ｔｒｅｇだけが増殖し、ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ−ＣＡＲのより優れた機能性を示した。

ＴｒｅｇおよびＴｃｏｎにおける異なる細胞内シグナル伝達ドメインの比較
ＣＤ３ζと組み合わせての異なる共刺激ドメインを有する抗デキストランＣＡＲを発現するＣＡＲ−ＴｒｅｇおよびＣＡＲ−Ｔｃｏｎを、作製した。デキストラン結合性は、構築物間で類似していたが（図４Ａ）、異なるシグナル伝達ドメインは、Ｔｒｅｇ活性化およびＴｃｏｎ活性化の異なる影響を生じた。Ｔｒｅｇ活性化を、ＣＤ１３７発現により分析し、Ｔｃｏｎ活性化をＣＤ１５４発現により分析した。ＣＡＲ−ＴｒｅｇはＣＤ１３７−ＣＤ３ζに関して、ＣＡＲ−ＴｃｏｎはＣＤ２８−ＣＤ３ζに関して、最も効率的に活性化された（図４Ｂ）。

抗原特異的ＣＡＲ−Ｔｒｅｇの単離
ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ ＣＡＲを有するＣＡＲ−Ｔｒｅｇを、６時間のデキストランでの刺激後、ＬＮＧＦＲ発現またはＣＤ１３７発現により単離した。導入遺伝子（図５Ａ）および受容体発現（図５Ｂ）は、どちらのソーティング戦略の間でも類似していたが、抗原特異的再刺激は、ＣＡＲ−ＴｒｅｇがＣＤ１３７発現によりソートされたときに、非常に効率的であった（図５Ｃ）。

方法
ＣＡＲ構築物
全てのＣＡＲ構築物は、ＡＣ１４６由来ｓｃＦｖ、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＸＳ ＩｇＧ４ヒンジ、ならびにトランスフェクションおよび形質導入された細胞の検出のためのＰ２Ａ連結ΔＬＮＧＦＲを含有した。レンチウイルス上清を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の発現ベクターおよびパッケージングプラスミドでの同時トランスフェクションにより作製した。トランスフェクションの１日前、３×１０^６個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０ｃｍ細胞培養ディッシュにおける、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））＋１０％ＦＣＳ＋１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン＋５０μＭ ２−メルカプトエタノールからなる完全ＤＭＥＭ（ｃＤＭＥＭ）（全て、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｃｈｗｅｒｔｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種した。細胞に、２．５Ｍ ＣａＣｌ２を追加したｄｄＨ２Ｏ中に希釈された、０．８４μｇ ｐＭＤＧ−２．ＶＳＶ−Ｇ、５．１６μｇ ｐＣＭＶΔＲ８．７４、および３．３５μｇデキストラン−ＣＡＲプラスミドを一過性にトランスフェクションした。通気しながら、２ｍｌの２×ＨＢＳバッファー（ｄｄＨ２Ｏ中、１３６．８９ｍＭ ＮａＣｌ、４．９６ｍＭ ＫＣｌ、１．７６ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２０．９８ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ＝６．７５〜６．７６）をその溶液にゆっくり加え、そのトランスフェクション溶液の２ｍｌを、細胞へ滴下した。そのトランスフェクション溶液を含有する培地を、４時間後、除去し、細胞を、予熱されたＰＢＳで２回、洗浄し、その後、新鮮なｃＤＭＥＭを加えた。４８時間後、レンチウイルス上清を採取し、濾過し（０．４５μｍ）、すぐに用い、または最長６ヶ月間、−８０℃で保存した。

Ｔｒｅｇ単離および形質導入
健康なドナー由来の白血球アフェレーシス生成物を、Ｃｈａｒｉｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙから、倫理指針に従ってインフォームドコンセントと共に入手した。ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）勾配遠心分離により取得した。ＣＤ２５^＋ Ｔｒｅｇを、ＰＢＭＣから、ＣＤ２５マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、製造会社の推奨に従って単離した。Ｔｒｅｇを、ＴｅｘＭＡＣＳ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）＋５％（ｖ／ｖ）ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）＋１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２＋１００ｎｍｏｌラパマイシン（どちらもＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）および１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｃｈｗｅｒｔｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からなる「Ｔｒｅｇ増殖培地」中、４：１のビーズ対細胞比でのＴｒｅｇ増殖ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の存在下で培養した。ＣＤ４^＋ Ｔｃｏｎを、ＴｅｘＭＡＣＳ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）＋５％（ｖ／ｖ）ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）＋２００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２において、３０ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ３および１μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８の存在下で活性化した。３日目、培地を、４μｇ／ｍｌ硫酸プロタミンを追加したそれぞれのレンチウイルス上清と置き換え、細胞を、レトロネクチンコーティング化９６ウェルプレートにおいて、８００ｇ、３２℃で９０分間、遠心接種を行った（spinoculate）。遠心分離後、ウイルス上清を除去し、新鮮な培地を細胞に加えた。形質導入効率を、形質導入後２日目または３日目に、細胞表面上のＬＮＧＦＲの染色により評価した。ＴｒｅｇおよびＴｃｏｎを１０〜１２日間、増殖させ、培地を２〜３日ごとに交換した。細胞は、Ｔｒｅｇ増殖ビーズ（４：１ ビーズ対細胞比、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、可溶性ＦＩＴＣデキストラン（ＭＷ：２，０００，０００、２μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ビーズ結合型デキストラン（１：１００；ＰＢＳ中デキストランコーティング化マイクロビーズ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、または１０ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡおよび５００ｎｇ／ｍｌイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）での６時間の再刺激前に、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｃｈｗｅｒｔｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）＋５％（ｖ／ｖ）ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）＋１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｃｈｗｅｒｔｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中、刺激無しで２日間、休ませた。

フローサイトメトリー
細胞を、以下の抗体での異なる組合せで、製造会社の推奨に従って染色した：ＣＤ４−ＰＥ−Ｖｉｏ７７０、ＣＤ４−ＡＰＣ−Ｖｉｏ−７７０、ＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＣＤ４−ＶｉｏＢｌｕｅ（ＶＩＴ４）、ＣＤ２５−ＶｉｏＢｒｉｇｈｔ ＦＩＴＣ（４Ｅ３）、ＣＤ１２７−ＦＩＴＣ、ＣＤ１２７−ＰＥ−Ｖｉｏ７７０（ＭＢ１５−１８Ｃ９）、ＣＤ２７１（ＬＮＧＦＲ）−ＰＥ、ＣＤ２７１（ＬＮＧＦＲ）−ＰＥ−Ｖｉｏ７７０（ＭＥ２０．４−１．Ｈ４）、ＣＤ１３７−ＰＥ（４Ｂ４−１）、ＣＤ１５４−ＡＰＣ、ＣＤ１５４−ＶｉｏＢｌｕｅ（５Ｃ８）（全て、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。Ｖｉｏｂｉｌｉｔｙ ４０５／５２０ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｄｙｅ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）またはヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、死細胞を排除するために用いた。ＣＡＲ表面発現の染色について、Ｔｒｅｇを、２μｇ／ｍｌ ＦＩＴＣ標識デキストラン（ＭＷ：２，０００，０００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、及び他の表面分子の標識と共に、４℃で１０分間、インキュベートした。全てのデータは、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ／ＬＳＲＩＩ（ＢＤ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＭＡＣＳ Ｑｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において取得され、ＦＡＣＳソーティングは、Ａｒｉａ Ｉ、Ａｒｉａ ＩＩ、またはＩｎｆｌｕｘ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において実施された。ＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ，Ｉｎｃ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡ）が、データ解析のために用いられた。

遺伝子発現の定量化
異なるシグナル伝達ドメインを有するＤｅｘ−ＣＡＲ構築物の競合的増殖を、定量リアルタイムＰＣＲにより分析した。ＤＮＡを、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｑｕｉｃｋ−ＤＮＡ（商標）Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により製造会社の使用説明書に従って単離し、遺伝子発現を、１×ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｃｈｗｅｒｔｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）ならびに５００ｎＭｏｌフォワードおよびリバースプライマー（ＴＩＢ ＭＯＬＢＩＯＬ、Ｂｅｒｌｉｎ）をそれぞれ、用いて、分析した。遺伝子発現を、ＳｔｅｐＯｎｅ（登録商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｃｈｗｅｒｔｅ）において分析し、ＧＡＰＤＨの発現に対して標準化した。

参照文献
Blat D, Zigmond E, Alteber Z, Waks T, Eshhar Z (2014) Suppression of murine colitis and its associated cancer by carcinoembryonic antigen-specific regulatory T cells. Mol Ther 22 (5):1018-1028. doi:10.1038/mt.2014.41
Boardman DA, Philippeos C, Fruhwirth GO, Ibrahim MA, Hannen RF, Cooper D, Marelli-Berg FM, Watt FM, Lechler RI, Maher J, Smyth LA, Lombardi G (2017) Expression of a Chimeric Antigen Receptor Specific for Donor HLA Class I Enhances the Potency of Human Regulatory T Cells in Preventing Human Skin Transplant Rejection. Am J Transplant 17 (4):931-943. doi:10.1111/ajt.14185
Elinav E, Adam N, Waks T, Eshhar Z (2009) Amelioration of colitis by genetically engineered murine regulatory T cells redirected by antigen-specific chimeric receptor. Gastroenterology 136 (5):1721-1731. doi:10.1053/j.gastro.2009.01.049
Elinav E, Waks T, Eshhar Z (2008) Redirection of regulatory T cells with predetermined specificity for the treatment of experimental colitis in mice. Gastroenterology 134 (7):2014-2024. doi:10.1053/j.gastro.2008.02.060
Golshayan D, Jiang S, Tsang J, Garin MI, Mottet C, Lechler RI (2007) In vitro-expanded donor alloantigen-specific CD4+CD25+ regulatory T cells promote experimental transplantation tolerance. Blood 109 (2):827-835. doi:10.1182/blood-2006-05-025460
Gross G, Waks T, Eshhar Z (1989) Expression of immunoglobulin-T-cell receptor chimeric molecules as functional receptors with antibody-type specificity. Proc Natl Acad Sci U S A 86 (24):10024-10028
Joffre O, Santolaria T, Calise D, Al Saati T, Hudrisier D, Romagnoli P, van Meerwijk JP (2008) Prevention of acute and chronic allograft rejection with CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T lymphocytes. Nat Med 14 (1):88-92. doi:10.1038/nm1688
Kuwana Y, Asakura Y, Utsunomiya N, Nakanishi M, Arata Y, Itoh S, Nagase F, Kurosawa Y (1987) Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V regions and T-cell receptor-derived C regions. Biochem Biophys Res Commun 149 (3):960-968
MacDonald KG, Hoeppli RE, Huang Q, Gillies J, Luciani DS, Orban PC, Broady R, Levings MK (2016) Alloantigen-specific regulatory T cells generated with a chimeric antigen receptor. J Clin Invest 126 (4):1413-1424. doi:10.1172/JCI82771
Masteller EL, Warner MR, Tang Q, Tarbell KV, McDevitt H, Bluestone JA (2005) Expansion of functional endogenous antigen-specific CD4+CD25+ regulatory T cells from nonobese diabetic mice. J Immunol 175 (5):3053-3059
Mekala DJ, Geiger TL (2005) Immunotherapy of autoimmune encephalomyelitis with redirected CD4+CD25+ T lymphocytes. Blood 105 (5):2090-2092. doi:10.1182/blood-2004-09-3579
Nishimura E, Sakihama T, Setoguchi R, Tanaka K, Sakaguchi S (2004) Induction of antigen-specific immunologic tolerance by in vivo and in vitro antigen-specific expansion of naturally arising Foxp3+CD25+CD4+ regulatory T cells. Int Immunol 16 (8):1189-1201. doi:10.1093/intimm/dxh122
Noyan F, Zimmermann K, Hardtke-Wolenski M, Knoefel A, Schulde E, Geffers R, Hust M, Huehn J, Galla M, Morgan M, Jokuszies A, Manns MP, Jaeckel E (2017) Prevention of Allograft Rejection by Use of Regulatory T Cells With an MHC-Specific Chimeric Antigen Receptor. Am J Transplant 17 (4):917-930. doi:10.1111/ajt.14175
Putnam AL, Safinia N, Medvec A, Laszkowska M, Wray M, Mintz MA, Trotta E, Szot GL, Liu W, Lares A, Lee K, Laing A, Lechler RI, Riley JL, Bluestone JA, Lombardi G, Tang Q (2013) Clinical grade manufacturing of human alloantigen-reactive regulatory T cells for use in transplantation. Am J Transplant 13 (11):3010-3020. doi:10.1111/ajt.12433
Sagoo P, Ali N, Garg G, Nestle FO, Lechler RI, Lombardi G (2011) Human regulatory T cells with alloantigen specificity are more potent inhibitors of alloimmune skin graft damage than polyclonal regulatory T cells. Sci Transl Med 3 (83):83ra42. doi:10.1126/scitranslmed.3002076
Skuljec J, Chmielewski M, Happle C, Habener A, Busse M, Abken H, Hansen G (2017) Chimeric Antigen Receptor-Redirected Regulatory T Cells Suppress Experimental Allergic Airway Inflammation, a Model of Asthma. Front Immunol 8:1125. doi:10.3389/fimmu.2017.01125
Taylor PA, Lees CJ, Blazar BR (2002) The infusion of ex vivo activated and expanded CD4(+)CD25(+) immune regulatory cells inhibits graft-versus-host disease lethality. Blood 99 (10):3493-3499
Trenado A, Charlotte F, Fisson S, Yagello M, Klatzmann D, Salomon BL, Cohen JL (2003) Recipient-type specific CD4+CD25+ regulatory T cells favor immune reconstitution and control graft-versus-host disease while maintaining graft-versus-leukemia. J Clin Invest 112 (11):1688-1696. doi:10.1172/JCI17702
Yoon J, Schmidt A, Zhang AH, Konigs C, Kim YC, Scott DW (2017) FVIII-specific human chimeric antigen receptor T-regulatory cells suppress T- and B-cell responses to FVIII. Blood 129 (2):238-245. doi:10.1182/blood-2016-07-727834

Claims (14)

1. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞であって、
   ａ）少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
   ｂ）膜貫通ドメイン、
   ｃ）少なくとも１つの一次細胞質シグナル伝達ドメインおよび少なくともＣＤ１３７の共刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン
   を含み、
   前記抗原結合ドメインが、標的細胞の表面に発現している抗原、または標的細胞の表面に発現した抗原と結合するタグ付きポリペプチドのタグ、または可溶性抗原に特異的に結合する、Ｔｒｅｇ細胞。
2. 前記少なくとも１つの一次細胞質シグナル伝達ドメインがＣＤ３ｚｅｔａである、請求項１に記載のＴｒｅｇ細胞。
3. 前記ＣＡＲの前記抗原結合ドメインが、可溶性抗原に特異的であり、それにより、前記可溶性抗原の前記ＣＡＲの前記抗原結合ドメインとの結合によって、前記Ｔｒｅｇ細胞の活性化を可能にする、請求項１または２に記載のＴｒｅｇ細胞。
4. 前記可溶性抗原が、前記Ｔｒｅｇ細胞を適用される対象の血液または組織中に天然では存在しない外因性抗原である、請求項３に記載のＴｒｅｇ細胞。
5. 前記可溶性抗原がデキストランである、請求項３または４に記載のＴｒｅｇ細胞。
6. 前記ＣＡＲの前記抗原結合ドメインが配列番号１および配列番号２の配列を含む、請求項５に記載のＴｒｅｇ細胞。
7. 自己免疫疾患、アレルギー、移植片拒絶、移植片対宿主病、炎症性腸疾患などの慢性炎症性疾患、または対象のウイルス、細菌、寄生生物による慢性感染の処置または予防における使用のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＣＡＲを発現するＴｒｅｇ細胞。
8. 請求項１〜７のいずれか一項に記載のＣＡＲを発現するＴｒｅｇ細胞の集団を含む組成物。
9. 請求項１〜７のいずれか一項に記載のＣＡＲを発現するＴｒｅｇ細胞の前記集団が、請求項１３または１４に記載の方法により獲得可能な活性化Ｔｒｅｇの集団である、請求項８に記載の組成物。
10. 医薬組成物の組合せであって、
    ａ）薬学的に許容される担体と共に請求項１〜７のいずれか一項に記載のＣＡＲを発現するＴｒｅｇ細胞の集団、および
    ｂ）請求項３〜６のいずれか一項に記載の可溶性抗原
    を含む、医薬組成物の組合せ。
11. 前記可溶性抗原がデキストランである、請求項１０に記載の組成物。
12. 自己免疫疾患、アレルギー、移植片拒絶、移植片対宿主病、炎症性腸疾患などの慢性炎症性疾患、または対象のウイルス、細菌、寄生生物による慢性感染の処置または予防のための、請求項１０または１１に記載の組成物。
13. ＣＡＲを発現する活性化Ｔｒｅｇ細胞の濃縮のための方法であって、前記ＣＡＲが
    ｉ）少なくとも１つの抗原結合ドメイン
    ｉｉ）膜貫通ドメイン
    ｉｉｉ）少なくとも１つの一次細胞質シグナル伝達ドメインおよび少なくともＣＤ１３７の共刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン
    を含み、
    前記抗原結合ドメインが、標的細胞の表面に発現している抗原、または標的細胞の表面に発現した抗原と結合するタグ付きポリペプチドのタグ、または可溶性抗原に特異的に結合し、前記方法が、
    ａ）制御性Ｔ細胞を含む試料を供給する工程
    ｂ）前記試料の前記制御性Ｔ細胞を、前記ＣＡＲを発現するように遺伝子改変する工程
    ｃ）前記ＣＡＲの抗原結合ドメインにより結合される抗原と６〜１６時間、接触させることにより、前記遺伝子改変型制御性Ｔ細胞を活性化する工程
    ｄ）
    α）工程ｃ）の細胞を
    Ｉ）ＣＤ１５４に結合する分子と接触させて、ＣＤ１５４^＋ Ｔ細胞を枯渇させる工程；または
    ＩＩ）制御性Ｔ細胞もしくは活性化制御性Ｔ細胞のマーカーに結合する分子と接触させて、前記結合分子と結合する細胞をポジティブ選択する工程、および
    β）Ｉ）工程α）Ｉ）の細胞を、制御性Ｔ細胞もしくは活性化制御性Ｔ細胞のマーカーに結合する分子と接触させて、前記結合分子と結合する細胞をポジティブ選択する工程であって、それにより、前記ＣＡＲを発現する活性化制御性Ｔ細胞の集団を獲得する、工程；または
    ＩＩ）工程α）ＩＩ）の細胞を、ＣＤ１５４に結合する分子と接触させて、ＣＤ１５４^＋ Ｔ細胞を枯渇させる工程であって、それにより、前記ＣＡＲを発現する活性化制御性Ｔ細胞の集団を獲得する工程
    により、工程ｃ）の活性化Ｔｒｅｇ細胞を単離する工程
    を含む、方法。
14. 前記ＣＡＲの前記抗原結合ドメインが可溶性抗原に特異的であり、かつ前記可溶性抗原がデキストランである、請求項１３に記載の方法。
    

Images