ES2960686T3

ES2960686T3 - Células T reguladoras que expresan un receptor de antígeno quimérico

Info

Publication number: ES2960686T3
Application number: ES19700530T
Authority: ES
Inventors: Anna Nowak; Dominik Lock; Andrew Kaiser; Alexander Scheffold
Original assignee: Miltenyi Biotec GmbH; Charite Universitaetsmedizin Berlin
Current assignee: Miltenyi Biotec GmbH; Charite Universitaetsmedizin Berlin
Priority date: 2018-01-19
Filing date: 2019-01-17
Publication date: 2024-03-06
Anticipated expiration: 2039-01-17
Also published as: US20200353004A1; KR20200113211A; WO2019141774A1; CA3088832A1; CN111684061A; EP3740569A1; EP3740569B1; JP2021511041A

Abstract

La presente invención proporciona una célula T (Treg) reguladora que expresa un receptor quimérico de antígeno (CAR) que comprende a) al menos un dominio de unión a antígeno, b) un dominio transmembrana y c) un dominio de señalización citoplasmático que comprende al menos un dominio de señalización citoplasmático primario. y al menos el dominio de señalización coestimulador de CD137, en el que dicho dominio de unión a antígeno se une específicamente a un antígeno que se expresa en la superficie de una célula diana o una etiqueta de un polipéptido marcado que se une a un antígeno expresado en la superficie de una diana célula o un antígeno soluble. También se divulgan composiciones que comprenden dichas células Treg y métodos de enriquecimiento y análisis de Treg activadas que expresan dicho CAR. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Células T reguladoras que expresan un receptor de antígeno quimérico

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de los receptores de antígenos quiméricos expresados en células inmunes, en particular expresados en células T reguladoras.

Antecedentes de la invención

Las células T convencionales (Tcon) se pueden manipular para mejorar el reconocimiento y la destrucción de patóge nos o tumores. Las células T reguladoras (Tregs) comprenden un subconjunto de células T con función inmunosupresora. Las T reg pueden manipularse para prevenir o tratar la autoinmunidad, el rechazo de trasplantes, la alergia y las enfermedades inflamatorias crónicas.

Los receptores de antígenos quiméricos (CARs) emergen como una alternativa prometedora para la generación de células T reguladoras específicas de antígeno (Tregs). Aparte de los TCRs, los CARs son receptores artificiales que contienen una especificidad de tipo de anticuerpo que puede unirse a antígenos de superficie independientemente del MHC. El reconocimiento específico de antígenos particulares por parte de las células CAR-T está mediado por fragmentos variables monocatenarios (scFv) derivados de anticuerpos con un dominio espaciador extracelular que se acoplan a través de una región transmembrana a un dominio de señalización derivado de TCR intracelular (Gross et al. 1989; Kuwana et al. 1987). En modelos murinos, las CAR-Tregs reactivas redirigidos contra la proteína básica de mielina fueron capaces de mejorar la EAE (Mekala y Geiger 2005) y también las CAR-Tregs específicas para el 2,4,6-trinitrofenol (TNP) o el antígeno carcinoembrionario (CEA) fueron redirigidos con éxito al colon, donde fueron muy potentes para suprimir la colitis y el desarrollo del cáncer colorrectal asociado (Blat et al. 2014; Elinav et al. 2009; Elinav et al. 2008). Más recientemente, las CAR-Tregs humanas se redirigieron hacia HLA-A2 como un antígeno co múnmente no coincidente en el trasplante y se ha demostrado que suprimen la GvHD xenogénica (MacDonald et al.

2016; Noyan et al. 2017; Boardman et al. 2017). Además, se ha demostrado que las CAR-Tregs tienen el potencial de mejorar la inflamación alérgica de las vías respiratorias (Skuljec et al. 2017) y de prevenir la neutralización de las respuestas inmunitarias contra el factor VIII en ratones (Yoon et al. 2017). McGovern et al (2017, Frontiers in Immunology, Vol. 8, Art. 1517 pp: 1-6) reseñan el estado actual de la técnica para las Tregs que expresan CARs.

Hasta donde sabemos, los constructos de CAR que se han usado hasta ahora en las Tregs tienen un dominio coesti mulador CD28.

La identificación de antígenos objetivo relevantes para la enfermedad como requisito previo para la generaciónin vitrode células Tregs específicas de antígeno sigue siendo un desafío importante. Además, los ensayos funcionales para el análisis de la eficacia de CAR-T reg están limitados debido a la falta de marcadores que permitan identificar especí ficamente una Treg y probar sus requisitos de activación específicos. Esto es importante para la generación de cons tructos de CAR de Tregs óptimos y para la generación de trasplantes de Treg optimizados, es decir, la actividad funcional de Treg relacionada con CAR máxima y la contaminación mínima con células T efectoras. Por lo tanto, los requisitos para la activación y expansión de CAR-Tregs, que pueden diferir significativamente de las Tcons, siguen sin comprenderse bien.

Existe una necesidad en la técnica de células T reguladoras que expresen un CAR que puedan usarse en el trata miento de un sujeto para proteger o tratar diversos trastornos relacionados con el sistema inmunitario, tal como autoinmunidad, rechazo de trasplantes, alergia o enfermedades inflamatorias crónicas.

También existe la necesidad en la técnica de generar células T reguladoras altamente purificadas y funcionalmente optimizadas que expresen un CAR que pueda usarse en el tratamiento de un sujeto para proteger o tratar dichos trastornos relacionados con el sistema inmunitario.

Compendio de la invención

Es crucial tener poblaciones puras de células Treg para aplicaciones terapéuticas y poder evaluar los efectos de los constructos de CAR en la función de Treg que pueden diferir del requisito de Tcon. Sin embargo, la poblaciones de Tregin vitroen general están contaminadas con células Tcon y ambas poblaciones no se separan fácilmente entre sí. Identificar y aislar Tregs activadas verdaderas de una muestra que comprende células T reguladoras activadas y células T convencionales activadas es un requisito para el análisis de los efectos de los constructos de CAR específi cos para Tregsin vitroy posteriormente su funcionalidadin vivo.Por lo tanto, la tarea de definir las condiciones para la activación óptima mediada por CAR de la actividad funcional Treg y para generar CAR Treg optimizada no se ha resuelto hasta ahora.

Dicha identificación y separación se puede realizar por el método tal y como se describe en el documento de Patente EP2306191B1.

En la presente memoria mostramos, al comparar diferentes dominios de señalización, que se sabe que activan las células T convencionales (Tcon), que sorprendentemente el uso del dominio coestimulador CD137 (4-1BB) tiene una ventaja selectiva para estimular y expandir las células T reguladoras humanas. Esto es importante para optimizar la función de Treg para las terapias de Treg adoptivas.

La Figura 4 muestra que sorprendentemente las Tregsin vitrose activan mejor a través del CAR (como se muestra por la expresión de CD137 y expansión inducida por el ligando CAR (antígeno)) cuando el CAR contiene un dominio de señalización coestimulador CD137 (4-1 BB) (en la presente memoria también denominado "CD137 CAR" ) en com paración con un CAR con un dominio de señalización coestimulador CD28 (en la presente memoria también denomi nado "CAR CD28"), mientras que lo contrario es cierto en Tcons. Por lo tanto, el uso del CD137 CAR permite una estimulación óptima de Tregs, que puede aprovecharse para la selecciónin vitrode Tregs activadas después de la estimulación con ligando de CAR (antígeno) para generar Treg reactiva con el ligando de CAR (antígeno) altamente purificada. También se espera que los CD137 CARsin vivose activen y expandan mejor por el ligando de CAR (antígeno) que las Tregs con CD28 CARs, ya que la función de Tregin vivodepende estrictamente de la activación del receptor de antígeno funcional, que es imitado por los constructos de CAR. La transducción o transfección de T regs con un CAR como se describe en la presente memoria (un CAR con un dominio coestimulador CD 137) permite la eficiente activaciónin vitrode dicha célula Treg modificada genéticamente mediante el CAR y proporciona un medio para la posterior clasificación de las Treg activadas que expresan el CAR. Esto permite generar una población de CAR-Treg pura y funcional con beneficios para el uso terapéutico en un sujeto que lo necesite porquein vivopropor cionará una mayor seguridad debido a la menor cantidad de contaminantes y una mejor actividad terapéutica debido a una mejor activación y expansión inducidas por el ligando de CAR (antígeno). Además, en una realización específica de la invención, el CD137 CAR proporciona una activación mejoradain vivode Treg en respuesta al antígeno soluble tal como el dextrano que se aplica como estímulo externo al sujeto en comparación con CD28 CAR o CARs con otros dominios de señalización que no reaccionan a dichos estímulos externos, lo que además mejora la actividadin vivode las Tregs transferidas, ya que conduce a la expansión de las Tregs y la actividad aumentada de las Tregs también dará como resultado una mejor reactividad al TCR endógeno o la Treg. De esta forma, la activación de CAR se puede utilizar para potenciar la actividad supresora o reguladora natural de las Tregs frente a los antígenos de Treg endóge nos, sin necesidad de conocer los objetivos específicos de los antígenos de Treg.

Las Tregs, tal y como se describen en la presente memoria, son muy adecuadas para la prevención o el tratamiento de un sujeto que padece enfermedades mediadas por el sistema inmunitario, tales como autoinmunidad, rechazo de trasplantes, alergia o enfermedades inflamatorias crónicas.

En una realización de la invención, el CD137 CAR expresado en la Treg es específico para el antígeno exógeno soluble dextrano. La administración de dextrano a un sujeto que necesita ser tratado con dicho CAR específico para dextrano puede permitir una respuesta inmunitaria controlada y sostenida de las células Tregs que expresan dicho CAR para la prevención o el tratamiento contra autoinmunidad, rechazo de trasplantes, alergia o enfermedades infla matorias crónicas.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Generación de CAR-Tregs específicos de dextrano con diferentes dominios de señalización intracelular. (A) Diagrama esquemático de constructos de CAR con diferentes dominios de señalización. (B) Se muestra la expresión de LNGFR en Treg enriquecida con CD25 después de la transducción lentiviral (n = 10-19 de 3-6 experimentos dife rentes). (C) Se muestra la unión de FITC-dextrano soluble (n = 7-21 de 2-7 experimentos independientes).

Figura 2: Activación de CAR-Treg específico de dextrano con diferentes dominios de señalización intracelular. (A) La expresión de CD137 se analizó después de 6 h de reestimulación con dextrano unido a perlas, se restó la expresión de CD137 de las muestras no estimuladas (n = 7-26, se realizaron 2-8 experimentos diferentes). (B) La fosforilación de ZAP70 en Treg LNGFR+ y LNGFR- se analizó después de 5 min de incubación con dextrano soluble (n = 7, se realizaron 2 experimentos independientes).

Figura 3: Expansión de CAR-Tregs específicos de dextrano con diferentes dominios de señalización intracelular. Las Tregs se expandieron en presencia de (A,C) anti-CD3/-CD28 o (B,D) dextrano unido a perlas. (A,B) El enriquecimiento de células LNGFR+ en d17 se calculó como la relación de las Tregs LNGFR-/LNGFR+ en d0 x la relación de las Tregs LNGFR+/LNGFR- en d17 (n=13-18 de 4-6 experimentos independientes). (C, D) Se combinaron Tregs con diferentes dominios de señalización y se cuantificó la expresión relativa de los diferentes dominios de señalización mediante qPCR (n = 7, se realizaron 3 experimentos diferentes).

Figura 4: Comparación de diferentes dominios de señalización intracelular en Tregs y Tcons. (A) Se muestra la unión de dextrano de CAR-Tregs y CAR-Tcons. (B) Análisis de activación de CAR-Tregs (expresión de CD137) y CAR-Tcons (expresión de CD154) después de 6 h de estimulación con dextrano unido a perlas; la expresión en las Tregs LNGFR-se restó para cada muestra como fondo y la expresión de CD137 y CD154 se normalizó al porcentaje de células dextrano+ en cada cultivo.

Figura 5: Aislamiento de CAR-Tregs por expresión de CD137 inducida por activación. Las Tregs LNGFR+ no estimu ladas o las Tregs CD137+LNGFR+ después de 6 h de estimulación con dextrano unido a perlas se clasificaron y expandieron con anti-CD3/-28 (clasificación LNGFR+) o sin estimulación adicional (clasificación CD137+) durante 14 días antes de la tinción de (A) LNGFR, (B) dextrano y (C) expresión de CD137 después de la reestimulación con dextrano unido a perlas (n = 12, 4 experimentos independientes para la clasificación de LNGFR s; n = 15, 5 experi mentos diferentes para la clasificación CD137).

Descripción detallada de la invención

En un primer aspecto, la presente invención proporciona una célula T reguladora (Treg) que expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende

a) al menos un dominio de unión a antígeno,

b) un dominio transmembrana,

c) un dominio de señalización citoplasmático que comprende al menos un dominio de señalización citoplasmático primario y al menos el dominio de señalización coestimulador de CD137,

en el que dicho dominio de unión a antígeno se une específicamente a un antígeno que se expresa en la superficie de una célula objetivo o una etiqueta de un polipéptido etiquetado que se une a un antígeno expresado en la superficie de una célula objetivo o un antígeno soluble.

Dicho CAR, en el que dicho al menos un dominio de señalización citoplasmático primario puede ser CD3zeta. Dicho CAR, en el que dicho dominio de unión a antígeno puede unirse directamente a un antígeno que se expresa en la superficie celular de una célula objetivo. Dicha célula objetivo puede ser una célula en un estado de enfermedad que expresa un antígeno autólogo o alogénico relevante para la enfermedad. La enfermedad puede ser una enfermedad autoinmune, enfermedad inflamatoria crónica, alergia, rechazo de trasplantes, GvHD o una infección por virus, bacte rias, parásitos de un sujeto.

Alternativamente, dicho dominio de unión a antígeno de dicho CAR puede unirse a una etiqueta de un polipéptido etiquetado que se une a un antígeno expresado en la superficie de una célula objetivo. Después dicho dominio de unión a antígeno del CAR se une indirectamente al antígeno que se expresa en la superficie de la célula objetivo. Dicho enfoque del CAR adaptador se describe, por ejemplo, en el documento de Patente US9,233,125B2. La etiqueta puede ser un hapteno tal como biotina o FITC. El polipéptido etiquetado que se une a un antígeno expresado en la superficie de una célula puede ser un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

Alternativamente, y de manera preferida, el dominio de unión a antígeno de dicho CAR puede ser específico para un antígeno soluble, lo que permite la activación de dicha célula Treg tras la unión de dicho antígeno soluble a dicho dominio de unión a antígeno de dicho CAR, preferiblemente sin la unión de dicha célula Treg a otra célula.

Dicho antígeno soluble puede ser un antígeno exógeno que no está presente de forma natural en la sangre o el tejido de un sujeto, preferiblemente un ser humano al que se aplica dicha célula Treg que expresa dicho CAR. Más preferi blemente, dicho antígeno exógeno que no está presente de forma natural en la sangre o el tejido de un sujeto al que se aplica dicha célula Treg que expresa dicho CAR no tiene preferencia para unirse a otro objetivo en el sujeto que al dominio de unión al antígeno de dicho CAR.

Dicho antígeno soluble exógeno puede ser un antígeno que no provoca enfermedad y que no provoca daño al sujeto cuando se aplica a dicho sujeto.

Dicho antígeno soluble (exógeno) puede ser dextrano.

Dicho dominio de unión a antígeno de dicho CAR puede comprender las secuencias de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO2. SEQ ID NO: 1 representa un dominio variable de la cadena pesada de una inmunoglobulina (VH) y SEQ ID NO: 2 representa una región variable de una cadena ligera de una inmunoglobulina (VL).

Alternativamente, el antígeno (monovalente o polivalente) se puede unir a la superficie biológica, tal como la superficie de una célula o a los compuestos de la matriz tisular mediante el uso de moléculas de unión específicas. De esta manera el antígeno puede ser dirigidoin vivoa una superficie específica, tipo de célula u órgano y la unión a la superficie también mejora la reticulación del CAR. Esto conduce a una activación de Treg localizada y mejorada. En un aspecto, la presente descripción proporciona una composición que comprende

i) una célula T reguladora (T reg) que expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende

a) al menos un dominio de unión a antígeno,

b) un dominio transmembrana,

en el que dicho dominio de unión a antígeno se une específicamente a una etiqueta de un polipéptido etiquetado que se une a un antígeno expresado en la superficie de una célula objetivo o un antígeno soluble,

ii) dicho polipéptido marcador.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula Treg que expresa un CAR como se describe en la presente memoria para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad autoinmune, alergia, rechazo de trasplantes, enfermedad de injerto contra huésped, enfermedades inflamatorias crónicas, tales como enfermedades inflamatorias del intestino o una infección crónica por virus, bacterias, parásitos de un sujeto.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende una población de células Treg que expresan un CAR como se describe en la presente memoria.

Dicha composición de una población de células T reg que expresan un CAR como se describe en la presente memoria puede comprender al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de células Tregs. Dichas células Tregs pueden caracterizarse por un fenotipo CD25+CD127-FoxP3+ y/o un TSDR desmetilado > 80 % (Treg Sespecífico Desmetilado Rregión) y/o la expresión de CD137 y la falta de expresión de CD154 después de 5-7 horas de estimula ción policlonal, por ejemplo, utilizando moléculas anti-CD3/anti-CD28 o activadores farmacológicos de células T, tales como PMA/ionomicina.

Dicha composición, en la que dicha población de células Treg que expresan un CAR como se describe en la presente memoria puede ser una población de Tregs activadas obtenible mediante el método de enriquecimiento de células Treg activadas que expresan un CAR como se describe en la presente memoria.

Dicha composición puede ser una composición farmacéutica que comprende opcionalmente un vehículo farmacéuti camente aceptable.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una combinación de composiciones farmacéuticas que comprenden

a) una población de células Treg que expresan un CAR como se describe en la presente memoria junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, en el que dicho dominio de unión a antígeno de dicho CAR es específico para un antígeno soluble, y

b) un antígeno soluble como se describe en la presente memoria.

Dicha población de células Treg que expresan un CAR como se describe en la presente memoria puede comprender al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de células Tregs. Dichas células Tregs pueden caracterizarse por un fenotipo CD25+CD127-FoxP3+ y/o un TSDR desmetilado > 80 % y/o la expresión de CD137 y la falta de expresión de CD154 después de 5-7 horas de estimulación policlonal, por ejemplo, utilizando moléculas anti-CD3/anti-CD28 o activadores farmacológicos de células T, tales como PMA/ionomicina.

Dicha combinación de composiciones farmacéuticas para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad autoinmune, alergia, rechazo de trasplantes, enfermedad de injerto contra huésped, enfermedades inflamatorias cró nicas, tales como enfermedades inflamatorias del intestino o una infección crónica por virus, bacterias o parásitos de un sujeto.

Dicho antígeno soluble puede ser dextrano.

Dicha combinación de composiciones farmacéuticas, en la que dicha población de células T reg que expresan un CAR como se describe en la presente memoria puede ser una población de Tregs activadas que se pueden obtener me diante el método de enriquecimiento de células Tregs activadas que expresan un CAR como se describe en la presente memoria.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para el enriquecimiento de células Treg activadas que expresan un CAR, en el que dicho CAR comprende

i) al menos un dominio de unión a antígeno

ii) un dominio transmembrana

iii) un dominio de señalización citoplasmático que comprende al menos un dominio de señalización citoplasmático primario y al menos el dominio de señalización coestimulador de CD137, en el que dicho dominio de unión a antígeno se une específicamente a un antígeno que se expresa en la superficie de una célula objetivo o una etiqueta de una polipéptido etiquetado que se une a un antígeno expresado en la superficie de una célula objetivo o un antígeno soluble, comprendiendo el método

a) proporcionar una muestra que comprenda células T reguladoras

b) modificar genéticamente dichas células T reguladoras de dicha muestra para expresar dicho CAR c) activar dichas células T reguladoras modificadas genéticamente mediante el contacto con el antígeno que se une mediante el dominio de unión al antígeno de dicho CAR durante 6-16 horas

d) aislar las células Treg activadas de la etapa c)

(a) poniendo en contacto las células de la etapa c) con

I) una molécula que se une a CD154 y que reduce las células T CD154+; o

II) una molécula que se une a un marcador de células T reguladoras o de células T reguladoras activadas y que realiza la selección positiva de las células que se unen a dicha molécula de unión, y

p) poniendo en contacto

I) las células de la etapa a)I) con una molécula que se une a un marcador de células T reguladoras o de células T reguladoras activadas y que realiza la selección positiva de las células que se unen a dicha molécula de unión, obteniendo así una población de células T reguladoras activadas que expresan dicho CAR; o II) las células de la etapa a)II) con una molécula que se une a CD154 y reduce las células T CD154+, obteniendo así una población de células T reguladoras activadas que expresan dicho CAR.

Opcionalmente, dicho método también puede comprender la etapa de expandir las células T reguladoras genética mente modificadas después de la etapa b) y antes de la etapa c).

Dicho CAR y dicho(s) antígeno(s) del método pueden tener las funciones y características del CAR y el(los) antígeno(s) como ya se describió anteriormente y se describe en la presente memoria. Todas las variantes y realizaciones descri tas anteriormente para el CAR y los antígenos descritos en la presente memoria también pueden aplicarse para dicho método.

Dicho método, en el que el marcador de células T reguladoras se selecciona del grupo de marcadores CD25 y GITR; y en donde el marcador para células T reguladoras activadas se selecciona del grupo de marcadores CD137, TGF-beta latente (LAP), GARP (LRRC32) y CD121 a/b.

Dicho método, en el que las moléculas que se unen a CD154 o a un marcador para células T reguladoras o para células T reguladoras activadas pueden ser anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos de los mismos.

Dicho método, en el que dichas células T reguladoras genéticamente modificadas (etapa c) se expanden en presencia de anti-CD3/-CD28 y/o el antígeno que se une al dominio de unión al antígeno del CAR tal y como se describe en la presente memoria y la adición de factores de crecimiento apropiados, tal como IL-2.

Dicho método, en el que el aislamiento (separación) se realiza mediante citometría de flujo o clasificación celular magnética.

Dicho método, en el que la molécula que se une a CD154 y/o la molécula que se une a un marcador de células T reguladoras o de células T reguladoras activadas se acopla a un colorante fluorescente, un hapteno y/o a una partícula magnética.

Dicho método, en el que la muestra que se proporciona (etapa a) se deriva de sangre completa, PBMC, sangre de cordón umbilical, tejido de ganglio linfático, médula ósea o leucoaféresis.

Dicho método, en el que la modificación genética de dichas células T reguladoras de dicha muestra para expresar dicho CAR (etapa b) puede realizarse mediante métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, sistemas basados en virus, métodos físicos, métodos biológicos, métodos químicos).

Dicha modificación genética de las células Treg puede realizarse por transducción, transfección o electroporación. Preferiblemente, la transducción se realiza con lentivirus, gamma-, alfa-retrovirus o adenovirus o con electroporación o transfección por ácidos nucleicos (DNA, mRNA, miRNA, antagomirs, ODNs), proteínas, nucleasas específicas del sitio (nucleasas con dedos de zinc, TALENs, CRISP /R), virus de RNA autorreplicantes (por ejemplo, virus de la ence falopatía equina) o vectores lentivirales de integración deficiente. Más preferiblemente, dicha modificación genética de las células Treg puede realizarse mediante la transducción de dichas células con vectores lentivirales.

Dicho método, en el que la población enriquecida de células Treg activadas que expresan dicho CAR comprende al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de células Tregs. Dichas células Tregs se caracterizan por un fenotipo CD25+CD127-FoxP3+ y/o un TSDR desmetilado > 80 % y/o la expresión de CD137 y la falta de expresión de CD154 después de 5-7 horas de estimulación policlonal, por ejemplo, utilizando CD3/CD28 o activadores farmacoló gicos de células T, tal como PMA/ionomicina.

Dicho método, en el que el método se puede realizar en un sistema cerrado.

Dicho método, en el que el método es un método automatizado en un sistema cerrado.

La presente descripción también proporciona el uso de un CD137 CAR expresado en una célula T reg para seleccionar a partir de una variedad de CARs (al menos dos) aquellos CARs que permiten la mejor activación de Tregs usando al menos dos CARs que comprenden un dominio de señalización de CD137 (CD137 CAR), pero que difieren en al menos otro componente del CAR y comparan su capacidad para activar una Treg que expresa dicho CAR, por ejemplo, poniendo en contacto la Treg que expresa el CAR con el ligando de CAR (antígeno) y midiendo y comparando el grado de inducción de la expresión superficial de CD137 u otro marcador de activación de Treg que se sabe que se expresa después de la activación de las células Treg.

Por lo tanto, en un aspecto adicional, la presente descripción proporciona el uso de un CAR expresado en una célula T reguladora (Treg) para analizar la eficiencia de activación de una célula Treg, en el que dicho CAR comprende

a) al menos un dominio de unión a antígeno,

b) un dominio transmembrana,

En un aspecto adicional, la presente descripción proporciona un método para analizar (comparar) la eficiencia de la activación de al menos dos células Treg, en el que al menos una primera célula Treg expresa un primer receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende

a) al menos un dominio de unión a antígeno,

b) un dominio transmembrana,

en el que al menos una segunda célula Treg expresa un segundo CAR que es diferente de dicho primer CAR en al menos un dominio del primer CAR pero expresa el dominio de señalización coestimulador de CD137 y,

en el que dichos dominios de unión a antígeno de dicho al menos primer CAR y de dicho al menos segundo CAR se unen específicamente a un antígeno que se expresa en la superficie de una célula objetivo o una etiqueta de un polipéptido etiquetado que se une a un antígeno expresado en la superficie de una célula objetivo o un antígeno soluble, comprendiendo el método

a) proporcionar una muestra que comprenda células T reguladoras

b) modificar genéticamente dicha al menos primera célula T reg para expresar dicho al menos primer CAR y modificar genéticamente dicha al menos segunda célula T reg para expresar dicho al menos segundo CAR

c) activar dicha al menos primera célula T reg modificada genéticamente y al menos segunda célula T reg mediante el contacto con el antígeno que se une mediante los dominios de unión al antígeno de dicho al menos primer CAR y dicho al menos segundo CAR durante 6-16 horas

d) medir el nivel de expresión de un marcador de activación de T reg de dicha al menos primera célula T reg y dicha al menos segunda célula Treg, en el que un nivel de expresión diferente indica una eficiencia de activación diferente de dicho al menos primer CAR y dicho al menos segundo CAR en las células Treg.

La comparación de la fuerza de la activación inducida por el contacto de los CARs con sus ligandos (antígeno) permite la optimización de un CAR para su uso en Treg seleccionando el CAR con la mayor capacidad de activación.

El término "un dominio del CAR" tal y como se usa en la presente memoria en el contexto de comparar la eficiencia de activación de al menos dos CARs en una célula T reg se refiere a cualquier dominio que pueda usarse en un CAR funcional, dichos dominios pueden ser, por ejemplo, el dominio extracelular, el dominio transmembrana y el dominio intracelular de un CAR. Los dominios extracelulares pueden ser al menos un dominio de unión a antígeno, un enlazador tal como (G4/S)3 y/o un espaciador/bisagra tal como la bisagra CD8. El dominio intracelular puede ser al menos un dominio de señalización estimulador y/o al menos un dominio de señalización coestimulador. La diferencia que puede existir entre los al menos dos CARs que se comparan entre sí puede comprender la modificación de un dominio que puede ser funcionalmente relevante en un CAR, es decir, influir en la estabilidad, nivel de expresión, unión al antígeno o cascada de señalización mediada por CAR inducido por el ligando (antígeno), que eventualmente afecta la activación de T reg mediada por CAR. El término "modificación" comprende, por ejemplo, la sustitución total o parcial o la eliminación de dicho dominio, el posicionamiento del dominio dentro del CAR o simplemente la modificación de las secuencias de aminoácidos del dominio, es decir, intercambio, inserción, eliminación, etc. de al menos un aminoá cido de dicho dominio.

Los términos "activación de Treg'' o "eficiencia de activación en células Treg'' significan cambios en el patrón de ex presión del gen de Treg o cambios funcionales inducidos por la activación del receptor de antígeno. Se requiere la activación de Tregin vivopara permitir que las Treg ejerzan su función fisiológica, por ejemplo, supresión de reaccio nes inmunitarias inapropiadas o patológicas, tales como alergia, autoinmunidad, enfermedad de injerto contra huésped y rechazo de trasplantes, IBD y otras enfermedades inflamatorias crónicas. Hay varios parámetros y métodos conoci dos en el campo para medir la activación de Treg, tal como la expresión de marcadores de activación. Dicho marcador de activación de Treg puede seleccionarse del grupo de marcadores CD137, TGF-beta latente (LAP), GARP (LRRC32), CD121 a/b, o IL-10. O ensayos funcionales tales como la supresión de la proliferación de células T respon dedoras mediante cocultivo con Treg activada. Un parámetro particular de la activación de Treg es la inducción de CD137 pero la ausencia simultánea de CD154 después de 4 a 7 horas de estimulación, que es una firma de activación de Treg altamente específica. Esto se puede medir mediante tecnologías estándar conocidas por los expertos en el campo, tales como la tinción de anticuerpos fluorescentes y la citometría de flujo. Las diferencias cuantitativas en la activación de Treg pueden ser o la cantidad de CD137 expresada en una sola célula o el número o proporción de células que se inducen para expresar el marcador.

Dicho primer CAR y dicho(s) antígeno(s) del método pueden tener las funciones y características del CAR y el(los) antígeno(s) como ya se describió anteriormente y se describe en la presente memoria. Todas las variantes y realiza ciones descritas anteriormente para el CAR y los antígenos tal y como se describe en la presente memoria también pueden aplicarse a dicho método.

Dicho segundo CAR puede ser una variante del primer CAR que tiene al menos una modificación en comparación con dicho primer CAR que puede afectar, por ejemplo, las características de unión al antígeno y/o las capacidades de transducción de señales dando como resultado unas características de activación de células Treg alteradas de dicho segundo CAR en comparación con dicho primer CAR.

La modificación de dicho segundo CAR en comparación con dicho primer CAR puede ser, por ejemplo, un espaciador diferente, un dominio de unión a antígeno diferente específico para el mismo antígeno, un dominio transmembrana diferente y/o un dominio de señalización diferente

Dicho método, en el que la muestra que se proporciona (etapa a) puede derivar de sangre completa, PBMC, sangre de cordón umbilical, tejido de ganglio linfático, médula ósea o leucoaféresis.

Dicha modificación genética de las células Treg puede realizarse por transducción, transfección o electroporación. Preferiblemente, la transducción se realiza con lentivirus, gamma-, alfa-retrovirus o adenovirus o con electroporación o transfección por ácidos nucleicos (DNA, mRNA, miRNA, antagomirs, ODNs), proteínas, nucleasas específicas del sitio (nucleasas con dedos de zinc, TALEN, CRISP /R), virus de RNA autorreplicante (por ejemplo, virus de la encefa lopatía equina) o vectores lentivirales de integración deficiente. Más preferiblemente, dicha modificación genética de las células Treg puede realizarse mediante la transducción de dichas células con vectores lentivirales.

La presente descripción también proporciona un método para probar varias formulaciones de antígenos para inducir la activación de la T reg mediante el contacto de dicho antígeno con un CD137 CAR. Por ejemplo, la capacidad de una primera muestra de antígeno para activar una Treg que expresa CD137 CAR con al menos una segunda muestra de antígeno que es diferente de la primera muestra de antígeno, poniendo en contacto la muestra de antígeno con una Treg que expresa un CAR con el dominio de unión al antígeno y comparando la activación de Treg inducida por dichas diversas muestras de antígenos.

Por lo tanto, en un aspecto adicional, la presente descripción proporciona un método para analizar (comparar) la eficiencia de la activación de una primera muestra de antígeno para activar un CAR expresado en una célula T reg con una segunda muestra de antígeno que es diferente de la primera muestra de antígeno, comprendiendo el CAR

a) al menos un dominio de unión a antígeno,

b) un dominio transmembrana,

en el que dicho dominio de unión a antígeno se une específicamente al antígeno de dicha primera muestra de antígeno que se expresa en la superficie de una célula objetivo o una etiqueta de un polipéptido etiquetado que se une a un antígeno expresado en la superficie de una célula objetivo o un antígeno soluble,

comprendiendo el método

a) proporcionar una muestra que comprenda células T reguladoras

b) modificar genéticamente dicha célula T reg para expresar dicho CAR

c) activar dicha célula Treg modificada genéticamente poniendo en contacto el dominio de unión al antígeno de dicho CAR con dicha primera muestra de antígeno durante 6-16 horas, y activar dicha célula T reg modificada genéticamente poniendo en contacto el dominio de unión al antígeno de dicho CAR con dicha segunda muestra de antígeno durante 6-16 horas

d) medir la activación de Treg de dicha célula Treg que se puso en contacto con dicha primera muestra de antígeno y de dicha célula Treg que se puso en contacto con la segunda muestra de antígeno, en donde un nivel de activación diferente indica una eficiencia diferente de dicha primera muestra de antígeno y dicha segunda muestra de antígeno para activar la actividad funcional de dicho CAR expresado en células Treg.

Dicha primera muestra de antígeno y dicha segunda muestra de antígeno pueden diferir, por ejemplo, en la formulación del antígeno, por ejemplo, forma soluble, antígenos monómeros frente a multimerizados, antígeno unido a varios vehículos, por ejemplo, superficie grande tal como placas de cultivo, microperlas de tamaño variable, por ejemplo, 50 nm-50 gm, pero sin limitarse a eso, o matrices macromoleculares biocompatibles, tales como dextrano u otros polisacáridos, o diferentes antígenos que pueden unirse al mismo dominio de unión a antígeno del CAR, pero, por ejemplo, con diferente afinidad o con diferentes cambios conformacionales inducidos en el CAR etc..

Los constructos de DNA o RNA (molécula(s) de ácido nucleico) que codifican el CAR tal y como se describe en la presente memoria pueden transfectarse o transducirse en una célula huésped mediante métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, sistemas basados en virus que incluyen retrovirus y lentivirus, métodos físicos que incluyen electroporación, métodos biológicos, métodos químicos). Independientemente de los métodos utilizados para integrar, preferiblemente integrar de forma estable, el d Na que codifica el CAR tal y como se describe en la presente memoria en la célula huésped, como resultado, la célula huésped expresa el CAR como se describe en la presente memoria.

Alternativamente, las secuencias de ácido nucleico se pueden producir sintéticamente.

Una célula modificada genéticamente que expresa el receptor de unión a antígeno tal y como se describe en la pre sente memoria puede aislarse (enriquecerse o separarse) después del proceso de transfección/transducción para generar dicha célula modificada genéticamente a partir de células no transfectadas/transducidas mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, tecnologías de separación basadas en fluorescencia tal como FACS® o métodos de separación de células magnéticas tal como MACS® (Miltenyi Biotec GmbH).

Generalmente, las células tales como las células inmunitarias, preferiblemente las células T para generar células mo dificadas genéticamente que expresan el receptor de unión a antígeno tal y como se describe en la presente memoria, pueden obtenerse de un sujeto. Las células tales como las células inmunitarias, preferiblemente las células T, pueden obtenerse de una variedad de fuentes, tales como sangre total, células mononucleares de sangre periférica (PBMCs), médula ósea, tejido de ganglio linfático, sangre del cordón umbilical, tejido del timo u otros tejidos que contienen células T. Para el enriquecimiento de estas células se pueden utilizar métodos bien conocidos en la técnica tales como la centrifugación a través de un gradiente Ficoll™ o PERCOLL™ o técnicas de selección positiva/negativa, tal como la clasificación fluorescente (por ejemplo, FACSsort) o la clasificación magnética (por ejemplo, MACS®).

A modo de ejemplo, las T regs de una muestra de sangre o tejido de un sujeto se marcan magnéticamente, por ejemplo con una perla magnética acoplada a anticuerpos específicos para CD25, se lavan, se enriquecen magnéticamente y se recogen. Después, estas Tregs pueden modificarse genéticamente para expresar el receptor de unión a antígeno tal y como se describe en la presente memoria en su superficie celular.

En una realización de la invención, la célula modificada genéticamente aislada/enriquecida, tal como las células inmu nitarias, preferiblemente las células Treg que expresan el receptor de unión al antígeno tal y como se describe en el la presente memoria, puede activarse antes o después de la modificación genética y expandirse para aumentar el número de células modificadas genéticamente utilizando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, la esti mulación policlonal de Tregs con el Treg Expansion Kit (Miltenyi Biotec) que consiste en una partícula del tamaño de una micra conjugada con anticuerpos de unión a CD3 y CD28 en presencia de factores de crecimiento adecuados tales como IL-2. Preferiblemente, dicho número de células modificadas genéticamente tales como células inmunitarias, por ejemplo, las células T pueden incrementarse hasta una cantidad terapéuticamente eficaz.

Las células Treg modificadas genéticamente que expresan el CAR tal y como se describe en la presente memoria pueden generarse en un proceso automatizado en un sistema cerrado. En una realización de la invención, un proceso para la generación de Treg modificadas genéticamente que expresan CAR tal y como se describe en la presente memoria puede comprender, por ejemplo, las etapas de:

a) proporcionar una muestra que comprenda células T reguladoras

b) modificar genéticamente dichas células T reguladoras de dicha muestra para expresar dicho CAR

c) opcionalmente expandir las células T reguladoras genéticamente modificadas

d) activar dichas células T reguladoras modificadas genéticamente expandidas mediante el contacto con el ligando de CAR durante 6-16 horas

e) aislar las células Treg activadas de la etapa d)

a) poniendo en contacto las células de la etapa d) con

I) una molécula que se une a CD154 y reduce las células T CD154+; o

II) una molécula que se une a un marcador de células T reguladoras o de células T reguladoras activadas tal como CD137 y realiza la selección positiva de las células que se unen a dicha molécula de unión, y

p) poniendo en contacto

I) las células de la etapa a)I) con una molécula que se une a un marcador de células T reguladoras o de células T reguladoras activadas tal como CD137 y realiza la selección positiva de las células que se unen a dicha molécula de unión, obteniendo así una población de células T reguladoras activadas que expresan dicho CAR; o

II) las células de la etapa a)II) con una molécula que se une a CD154 y que elimina las células T CD154+, obteniendo así una población de células T reguladoras activadas que expresan dicho CAR.

Todas o algunas de estas etapas pueden realizarse automáticamente en un sistema cerrado, preferiblemente en un sistema cerrado y estéril.

El proceso es especialmente adecuado para preparar células Treg modificadas genéticamente, en el que las células Treg enriquecidas se modifican genéticamente mediante el uso de vectores virales y/o no virales.

Cualquiera de estas etapas puede multiplicarse, omitirse o puede producirse en un orden diferente.

Como un sistema cerrado para la modificación de células, se puede utilizar el dispositivo de procesamiento de células totalmente automatizado CliniMACS Prodigy® y los conjuntos de tubos asociados (Miltenyi Biotec GmbH, Alemania) (documento de Patente WO2009/072003). Este sistema cerrado cumple con los requisitos de procesamiento de grado GMP de casi cualquier tipo de productos celulares y puede permitir reducir los requisitos de sala limpia, mejorar la transferencia de tecnología y armonizar los procesos de fabricación de células.

En una realización de la invención, las Tregs modificadas genéticamente que expresan el CAR tal y como se describe en la presente memoria pueden utilizarse en el tratamiento de un sujeto que padece de un trastorno tal como autoinmunidad, rechazo de trasplantes, alergia o enfermedades inflamatorias crónicas.

Las Tregs se pueden aislar de un sujeto, preferiblemente se pueden usar líneas de células inmunitarias humanas o establecidas. El sujeto puede padecer dicho trastorno o puede ser un sujeto sano. Estas células Treg se modifican genéticamentein vitropara expresar el CAR tal y como se describe en la presente memoria. Estas células Treg mo dificadas genéticamente pueden activarse y expandirsein vitroa una población terapéuticamente eficaz de células que expresan el CAR tal y como se describe en la presente memoria y pueden enriquecerse aún más antes o después de la modificación a una mayor pureza mediante el método tal y como se describe en la presente memoria. En la terapia celular, estas células Treg modificadas genéticamente pueden infundirse a un receptor que las necesite como una composición farmacéutica (o una formulación de una población terapéuticamente eficaz de células que expresan el CAR tal y como se describe en la presente memoria), además de una segunda composición farmacéutica, el antígeno soluble que tiene la función de un estímulo externo de las células Treg. Las células Treg infundidas en el receptor pueden suprimir las reacciones inmunitarias inflamatorias del sujeto o al menos reducir los efectos y/o síntomas de dicho trastorno bajo tratamiento. El receptor puede ser el mismo sujeto del que se obtuvieron las células (terapia de células autólogas) o puede ser de otro sujeto de la misma especie (terapia de células alogénicas).

Las poblaciones de células Treg que expresan el CAR tal y como se describe en la presente memoria pueden formu larse para administrarse a un sujeto utilizando técnicas conocidas por los expertos en la materia.

Las formulaciones que comprenden población(es) terapéuticamente eficaz(es) de células Treg que expresan el CAR tal y como se describe en la presente memoria pueden incluir excipiente(s) farmacéuticamente aceptable(s) (vehículo o diluyentes). Los excipientes incluidos en las formulaciones tendrán diferentes propósitos dependiendo, por ejemplo, de la naturaleza del dominio de unión al antígeno del CAR tal y como se describe en la presente memoria. Ejemplos de excipientes usados generalmente incluyen, sin limitación: solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua para inyección, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos, agentes estabilizadores, agentes solubilizantes y tensioactivos, tampones y conservantes, agentes de tonicidad, agentes de carga y agentes lubricantes

Una formulación de una población terapéuticamente eficaz de células Treg que expresan el CAR tal y como se des cribe en la presente memoria puede incluir una población de células T reg que expresan el CAR tal y como se describe en la presente memoria, o más de una población de células que expresan el CAR tal y como se describe en la presente memoria. Las diferentes poblaciones de células Treg que expresan el CAR tal y como se describe en la presente memoria pueden, por ejemplo, variar en función de la identidad del dominio de unión al antígeno y/o la identidad del dominio de activación del CAR utilizado.

Las formulaciones que comprenden población(es) terapéuticamente eficaz(es) de células Treg que expresan el CAR tal y como se describe en la presente memoria pueden administrarse a un sujeto usando modos y técnicas conocidas por el experto en la materia. Los modos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, inyección intravenosa. Otros modos incluyen, sin limitación, inyección intratumoral, intradérmica, subcutánea (s.c, s.q., sub-Q, Hipo), intramuscular (i.m.), intraperitoneal (i.p.), intraarterial, intramedular, intracardíaca, intraarticular (articulación), intrasinovial (área de líquido articular), intracraneal, intraespinal e intratecal (líquidos espinales).

Las formulaciones que comprenden población(es) terapéuticamente eficaz (es) de células Treg que expresan el CAR tal y como se describe en la presente memoria que se administran a un sujeto comprenden varias células Treg que expresan el CAR tal y como se describe que es eficaz para el tratamiento de la indicación o trastorno específico.

En general, pueden administrarse formulaciones que comprendan entre aproximadamente 1 x 104 y aproximadamente 1 x 1010 células T reg que expresan el CAR tal y como se describe en la presente memoria. En la mayoría de los casos, la formulación puede comprender entre aproximadamente 1 x 105 y aproximadamente 1 x 109 células Treg que ex presan el CAR tal y como se describe en la presente memoria, de aproximadamente 5 x 105 a aproximadamente 5 x 108 células T reg que expresan el CAR tal y como se describe en la presente memoria, o de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 107 células Treg que expresan el CAR tal y como se describe en la presente memoria. Sin embargo, el número de células Treg que expresan el CAR tal y como se describe en la presente memoria administra das a un sujeto puede variar entre amplios límites, según la localización, el origen, la identidad, el alcance y la gravedad del trastorno, la edad y el estado del individuo a tratar etc. En última instancia, un médico puede determinar las dosis apropiadas a utilizar.

El antígeno soluble tal como dextrano se puede formular para administrar a un sujeto usando técnicas conocidas por el experto en la materia. Las formulaciones de antígenos solubles tales como dextrano pueden incluir excipiente(s) farmacéuticamente aceptable(s) (vehículos o diluyentes). Los excipientes incluidos en las formulaciones tendrán dife rentes propósitos dependiendo, por ejemplo, de la naturaleza del antígeno soluble y del modo de administración. Ejemplos de excipientes usados generalmente incluyen, sin limitación: solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua para inyección, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos, agentes estabilizadores, agentes solubilizantes y tensioactivos, tampones y conservantes, agentes de tonicidad, agentes de carga y agentes lubricantes

Una formulación de antígenos solubles puede incluir un tipo de antígeno soluble o más de un tipo de antígeno soluble.

El (los) antígeno(s) soluble(s), tal como dextrano, se puede administrar a un sujeto usando modos y técnicas conocidas por el experto en la materia. Los modos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, inyección intravenosa, intraperitoneal e intratumoral. Otros modos incluyen, sin limitación, intradérmica, subcutánea (s.c, s.q., sub-Q, hipo), intramuscular (i.m.), intraarterial, intramedular, intracardiaca, intraarticular (articulación), intrasinovial (área de líquido articular), intra craneal, intraespinal e intratecal (líquidos espinales).

Las formulaciones que comprenden antígenos solubles tales como dextrano se administran a un sujeto en una canti dad que es eficaz para tratar la indicación o trastorno específico. En general, las formulaciones que comprenden al menos de aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal del antígeno soluble tal como dextrano pueden administrarse a un sujeto que necesita tratamiento. En la mayoría de los casos, la dosificación puede ser de aproximadamente 100 pg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal del antígeno soluble, tal como dextrano, diario o semanal o mensual, teniendo en cuenta las vías de administración, los síntomas, etc. Sin embargo, la cantidad de antígeno(s) soluble(s) tal como dextrano en formulaciones administradas a un sujeto puede variar entre amplios límites, dependiendo de la localización, origen, identidad, extensión y gravedad del trastorno, la edad y el estado del individuo a tratar, etc. En última instancia, un médico puede determinar las dosis apropiadas a utilizar.

Todas las definiciones, características y realizaciones definidas en la presente memoria con respecto a un aspecto de la invención, por ejemplo, el primer aspecto de la invención, también se aplican, mutatis mutandis, en el contexto de los otros aspectos de la invención como se describe en la presente memoria.

Definiciones

A menos que se defina de otro modo, los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención.

En general, un CAR puede comprender un dominio extracelular (parte extracelular) que comprende el dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización citoplasmático (dominio de señalización intracelular). El dominio extracelular puede unirse al dominio transmembrana mediante un enlazador. El dominio ex tracelular también puede comprender un péptido señal. En algunas realizaciones de la invención, el dominio de unión a antígeno de un CAR se une a un hapteno que se acopla a un polipéptido (polipéptido "haptenilado" o "etiquetado"), en donde el polipéptido puede unirse a un antígeno asociado a una enfermedad, tal como un autoantígeno o un antígeno derivado de sustancias exógenas inofensivas, por ejemplo, microbiota, partículas en el aire, tales como polen de plantas, esporas de hongos. Dicho CAR también puede denominarse CAR "anti-etiqueta" tal y como se describe, por ejemplo, en el documento de Patente US9233125B2. En otras realizaciones de la invención, la parte extracelular del CAR puede comprender un dominio de unión a un epítopo enlazador/marcador (LLE) como dominio de unión a antígeno que se une a un epítopo enlazador/marcador (LLE) que forma parte de un TCBM. Dicho CAR puede deno minarse CAR anti-LLE tal y como se describe en la solicitud de patente Europea no. EP16196487.9. Ambos tipos de CARs son CAR universales y/o adaptables. Tanto el(los) hapteno(s) como el LLE son "etiquetas" que se acoplan directa o indirectamente a un polipéptido (el polipéptido etiquetado), en donde el polipéptido puede unirse a un antígeno asociado a una enfermedad, tal como un autoantígeno expresado en la superficie (celular) de una célula objetivo o un antígeno derivado de sustancias exógenas inofensivas, por ejemplo, microbiota, partículas en el aire, tales como polen de plantas, esporas de hongos. En otras realizaciones de la invención, el dominio de unión a antígeno del CAR se une a un antígeno soluble tal y como se describe en la presente memoria.

Un "péptido señal" se refiere a una secuencia peptídica que dirige el transporte y la localización de la proteína dentro de una célula, por ejemplo, a un determinado orgánulo celular (tal como el retículo endoplásmico) y/o la superficie celular.

En general, un "dominio de unión a antígeno" se refiere a la región del CAR que se une específicamente a un antígeno, por ejemplo, a un antígeno soluble. Los CARs de la invención pueden comprender uno o más dominios de unión a antígeno. En general, las regiones objetivo en el CAR son extracelulares. El dominio de unión a antígeno puede com prender un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. El dominio de unión a antígeno puede com prender, por ejemplo, cadena pesada de longitud completa, fragmentos Fab, fragmentos Fv monocatenarios (scFv), anticuerpos divalentes monocatenarios o diacuerpos. Cualquier molécula que se una específicamente a un antígeno dado tal como aficuerpos o dominios de unión a ligandos de receptores naturales puede usarse como un dominio de unión a antígeno. A menudo, el dominio de unión al antígeno es un scFv. Normalmente, en un scFv, las regiones variables de una cadena pesada y una cadena ligera de inmunoglobulina se fusionan mediante un enlazador flexible para formar un scFv. Dicho enlazador puede ser, por ejemplo, el "(G4/S)3-enlazador".

En algunos casos, es beneficioso que el dominio de unión al antígeno se derive de la misma especie en la que se usará el CAR. Por ejemplo, cuando se planea utilizarlo terapéuticamente en humanos, puede ser beneficioso para el dominio de unión al antígeno del CAR comprender un anticuerpo humano o humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Los anticuerpos humanos o humanizados o los fragmentos de unión a antígeno del mismo pueden prepararse mediante una variedad de métodos bien conocidos en la técnica.

"Espaciador" o "bisagra" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a la región hidrófila que está entre el dominio de unión al antígeno y el dominio transmembrana. Los CARs de la invención pueden comprender un dominio de espaciador extracelular pero también es posible omitir dicho espaciador. El espaciador puede incluir, por ejemplo, Fragmentos Fc de anticuerpos o fragmentos de los mismos, regiones bisagra de anticuerpos o fragmentos de las mismas, regiones CH2 o CH3 de anticuerpos, proteínas accesorias, secuencias espaciadoras artificiales o combina ciones de las mismas. Un ejemplo destacado de un espaciador es la bisagra CD8alpha.

El dominio transmembrana del CAR puede derivar de cualquier fuente natural o sintética deseada para dicho dominio. Cuando la fuente es natural, el dominio puede derivar de cualquier proteína unida a la membrana o transmembrana. El dominio transmembrana puede derivar, por ejemplo, de CD8alfa o CD28. Cuando los módulos claves de señaliza ción y reconocimiento de antígenos (dominios) están en dos (o incluso más) polipéptidos, entonces el CAR puede tener dos (o más) dominios transmembrana. Los módulos clave de señalización de división y reconocimiento de antí genos permiten un control reversible, titulable y dependiente de moléculas pequeñas sobre la expresión de células de CAR (Wu et al, 2015, Science 350: 293-303) debido a dominios de heterodimerización dependientes de moléculas pequeñas en cada polipéptido del CAR.

El dominio de señalización citoplásmica (o el dominio de señalización intracelular) del CAR es responsable de la activación de al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmunitaria en la que se expresa el CAR. "Función efectora" significa una función especializada de una célula, por ejemplo, en una Treg, una función efectora puede ser una actividad supresora o una actividad reguladora, incluyendo la secreción de citoquinas inmunosupresoras, tales como IL-10, IL-35, TGF-beta o expresión de moléculas inhibidoras, tales como TIGIT, CTLA4, receptores competitivos de citoquinas tal como el receptor IL-2. El dominio de señalización intracelular se refiere a la parte de una proteína que transduce la señal de función efectora y dirige a la célula que expresa el CAR para que realice una función especializada. El dominio de señalización intracelular puede incluir cualquier parte completa, mutada o trun cada del dominio de señalización intracelular de una proteína dada suficiente para transducir una señal que inicia o bloquea las funciones efectoras de las células inmunitarias.

Los ejemplos destacados de dominios de señalización intracelular para su uso en los CARs incluyen las secuencias de señalización citoplásmica del receptor de células T (TCR) y los correceptores que inician la transducción de señales después de la participación del receptor de antígeno.

En general, la activación de las células T puede estar mediada por dos clases distintas de secuencias de señalización citoplasmática, en primer lugar, aquellas que inician la activación primaria dependiente de antígeno a través del TCR (secuencias de señalización citoplasmáticas primarias, dominio de señalización citoplasmático primario) y, en segundo lugar, aquellas que actúan de manera independiente de antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimu ladora (secuencias de señalización citoplásmica secundaria, dominio de señalización coestimuladora). Por lo tanto, un dominio de señalización intracelular de un CAR puede comprender uno o más dominios de señalización citoplasmáticos primarios y/o uno o más dominios de señalización citoplasmáticos secundarios.

Los dominios de señalización citoplasmáticos primarios que actúan de forma estimulante pueden contener ITAMs (motivos de activación basados en tirosina de inmunorreceptores).

Los ejemplos de dominios de señalización citoplasmáticos primarios que contienen ITAM usados a menudo en CARs son aquellos derivados de TCRZ (CD3Z), FcRgamma, FcRbeta, CD3gamma, CD3delta, CD3epsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. La más destacada es la secuencia derivada de CD3Z.

El dominio citoplasmático de CAR puede diseñarse para comprender el dominio de señalización de CD3Z por sí mismo o combinado con cualquier otro dominio citoplasmático deseado. El dominio citoplasmático del CAR puede compren der una porción de la cadena de CD3Z y una región (dominio) de señalización coestimuladora. La región de señaliza ción coestimuladora se refiere a una parte del CAR que comprende el dominio intracelular de una molécula coestimu ladora. Una molécula coestimuladora es una molécula de superficie celular distinta de un receptor de antígeno o sus ligandos que se requiere para una respuesta eficaz de los linfocitos a un antígeno. Ejemplos de moléculas coestimu ladoras son CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno 1 asociado a la función de los linfocitos (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3.

Las secuencias de señalización citoplasmática dentro de la parte de señalización citoplasmática del CAR se pueden unir entre sí con o sin un enlazador en un orden aleatorio o especificado. Un enlazador oligo o polipeptídico corto, que preferiblemente tiene entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, puede formar el enlace. Un enlazador destacado es el doblete de glicina-serina.

Como un ejemplo, el dominio citoplasmático puede comprender el dominio de señalización de CD3Z y el dominio de señalización de CD28. En otro ejemplo, el dominio citoplasmático puede comprender el dominio de señalización de CD3Z y el dominio de señalización de CD137. En un ejemplo adicional, el dominio citoplasmático puede comprender el dominio de señalización de CD3Z, el dominio de señalización de CD28 y el dominio de señalización de CD137.

El término "CD137 CAR" tal y como se usa en la presente memoria significa que el CAR comprende al menos un dominio de señalización coestimulador de CD137, además de al menos un dominio de señalización citoplasmático primario. El término "CD28 CAR" tal y como se usa en la presente memoria significa que el CAR comprende al menos un dominio de señalización coestimulador de CD28, además de al menos un dominio de señalización citoplasmático primario. Como se mencionó anteriormente, la parte extracelular o el dominio transmembrana o el dominio citoplásmico de un CAR también pueden comprender un dominio de heterodimerización con el objetivo de dividir los módulos clave de señalización y reconocimiento de antígenos del CAR.

El CAR puede modificarse adicionalmente para incluir en el nivel del ácido nucleico que codifica el CAR uno o más elementos operativos para eliminar las células CAR-T o las células T reg en virtud de un interruptor suicida. El interrup tor suicida puede incluir, por ejemplo, una cascada de señalización que induce la apoptosis o un fármaco que induce la muerte celular. En una realización, el ácido nucleico que expresa y codifica el CAR puede modificarse adicional mente para expresar una enzima tal como timidina quinasa (TK) o citosina desaminasa (CD).

Los CARs de la presente invención pueden diseñarse para comprender cualquier porción o parte de los dominios mencionados anteriormente tal y como se describe en la presente memoria en cualquier orden y/o combinación que dé como resultado un CAR funcional, es decir, un CAR que media una respuesta efectora inmunitaria de la célula efectora inmunitaria que expresa el CAR pero comprende al menos un dominio coestimulador de CD137.

El término "anticuerpo", tal y como se usa en la presente memoria, se usa en el sentido más amplio para cubrir las diversas formas de estructuras de anticuerpos, incluyendo, pero no estando limitado a, anticuerpos monoclonales y policlonales (incluyendo los anticuerpos de longitud completa), anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), fragmentos de anticuerpos, es decir, fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo, inmunoadhesinas y quimeras de anticuerpo-inmunoadhesina, que reconocen específicamente (es decir, se unen) un antígeno obje tivo. Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo de longitud completa, preferiblemente el dominio variable del mismo, o al menos el sitio de unión al antígeno del mismo ("un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo"). Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab (fragmento de unión a antígeno), scFv (fragmento monocatenario variable), anticuerpos de dominio único, diacuerpos, dsFv, Fab', diacuerpos, moléculas de anticuerpos monocatenarios y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "antígeno" pretende incluir sustancias que se unen a o provocan la producción de uno o más anticuerpos y pueden comprender, pero no se limita a, proteínas, péptidos, polipéptidos, oligopéptidos, lípidos, carbohidratos tales como dextrano, haptenos y combinaciones de los mismos, por ejemplo, una proteína glicosilada o un glicolípido.

El término antígeno puede referirse a un antígeno expresado en la superficie celular de una célula objetivo. Pero el término también puede referirse a un antígeno que no se expresa o no está presente en la superficie de una célula, por ejemplo, en un sujeto que puede tratarse con Tregs modificadas genéticamente que expresan un CAR tal y como se describe en la presente memoria. Entonces, el antígeno se denomina en la presente memoria "antígeno soluble". Los términos "antígeno soluble" y "antígeno libre" tal y como se utilizan en la presente memoria se pueden usar indis tintamente y significan que el antígeno soluble que puede unirse al dominio de unión al antígeno del CAR tal y como se describe en la presente memoria no se expresa de forma natural ni está presente en la superficie de un célula de un sujeto, preferiblemente un ser humano, cuando se aplica a dicho sujeto una Treg que expresa dicho CAR. Preferi blemente, el antígeno soluble no está presente en la sangre o el tejido de un sujeto al que se aplica dicha célula Treg que expresa dicho CAR. Más preferiblemente, tampoco tiene afinidad o preferencia específica para unirse a otra mo lécula en el sujeto que al dominio de unión al antígeno de dicho CAR. Preferiblemente, dicho antígeno soluble puede ser un antígeno exógeno. Dicho antígeno exógeno se puede aplicar al sujeto que también recibe o recibió las Tregs que expresan dicho CAR para el tratamiento de un trastorno tal y como se describe en la presente memoria, es un estimulante externo (un estímulo externo) que se une al dominio de unión al antígeno del CAR tal y como se describe en la presente memoria y puede activar posteriormente la célula T reg que expresa dicho CAR. Dicho antígeno soluble exógeno puede ser un antígeno que no provoca enfermedad y que no provoca daño al sujeto cuando se aplica a dicho sujeto. El antígeno soluble exógeno puede ser, por ejemplo, una macromolécula tal como un polipéptido o un polisacárido que preferiblemente no se encuentra de forma natural en el sujeto a tratar tal y como se describe en la presente memoria.

El antígeno soluble, preferiblemente el antígeno exógeno soluble, puede seleccionarse del grupo que consiste en macromoléculas, tales como proteínas, polisacáridos, oligo- o polinucleótidos, polietilenglicoles o cualquier otro com puesto polimérico biocompatible que pueda aplicarse a humanos o derivados de dichas moléculas, tales como peque ños "haptenos" moleculares unidos a las macromoléculas más grandes. Los antígenos solubles se pueden aplicar en una forma que permita la activación del CAR, que normalmente se logra a través del entrecruzamiento, es decir, las macromoléculas utilizadas pueden contener más de una copia, idealmente varias copias del dominio real que se une por el dominio de unión al antígeno del CAR. Dichas moléculas multivalentes pueden inducir el entrecruzamiento y la activación del CAR. Preferiblemente, el único requisito para el antígeno soluble (exógeno) es que pueda circular en el sistema circulatorio, por ejemplo, el sistema sanguíneo o sistema linfático y/o el tejido del sujeto, que se trata tal y como se describe en la presente memoria y no es parte de la superficie de una célula de dicho sujeto con la conse cuencia de que el antígeno soluble (exógeno) puede unirse solo por el dominio de unión a antígeno del CAR tal y como se describe en la presente memoria que es expresado por la célula Treg cuando dicha célula Treg se aplica a dicho sujeto. Por lo tanto, los antígenos solubles (exógenos) también pueden inmovilizarse en estructuras tales como perlas (nanoperlas, microperlas) que permiten la circulación del antígeno inmovilizado en dichas estructuras en el sistema circulatorio, por ejemplo el sistema sanguíneo de dicho sujeto. Éstos también pueden ser antígenos solubles (exógenos) en el sentido de la presente invención.

Un antígeno soluble preferido es el dextrano (una molécula de dextrano). Dicho dextrano se puede aplicar al sujeto que necesita ser tratado con dichas Tregs que expresan dicho CAR como una molécula de dextrano libre o inmovili zado en una partícula tal como una microperla o nanoperla.

El dextrano es un glucano ramificado complejo (polisacárido hecho de muchas moléculas de glucosa) compuesto por cadenas de diferentes longitudes (de 3 a 2000 kilodaltons). Dextranos de cualquier longitud, por ejemplo, de 3 a 2000 kDa se pueden usar para las aplicaciones descritas en la presente memorias. Preferiblemente, el dextrano utilizado puede ser superior a 5, 10, 20, 100 o 200 kDa. En algunas realizaciones de la invención, el dextrano utilizado puede ser un dextrano de 60 a 200 kDa. El dextrano soluble tal y como se usa en la presente memoria puede presentar muchos antígenos para el CAR que se une al dextrano tal y como se describe en la presente memoria. El dextrano puede ser un poliantígeno en lugar de un monoantígeno para el CAR anti-dextrano.

Dicho dextrano puede ser dextrano no unido, es decir, dextrano libre, dextrano soluble o dextrano conjugado con nanopartículas o micropartículas coloidales. Dicho dextrano se puede administrar a un paciente que lo necesite que alberga la célula Treg tal y como se describe en la presente memoria para activar dicha célula Treg en condiciones controlables.

Dicho dextrano puede aplicarse también como parte de una composición farmacéutica a un sujeto (por ejemplo, Deltadex; Dextrano 40 al 10 % en NaCl; infusión de, por ejemplo, 1,5 g de dextrano por kg de peso corporal o menos). Alternativamente, el dextrano se puede conjugar con un anticuerpo u otra estructura de unión, lo que permite un direccionamiento específico del dextrano a las superficies de células o de la matriz tisularin vivo,por ejemplo, péptidos de unión a la matriz extracelular.

Treg (también denominada en la presente memoria como "célula T reguladora" o "célula Treg") se definen en la pre sente memoria como células T Foxp3+CD4+ que normalmente también expresan CD25 y carecen de expresión de CD127. Las células T regs se caracterizan además por la expresión selectiva de CD137 tras la activación, pero la falta de expresión de CD154, así como la falta de expresión de citoquinas efectoras, por ejemplo, IL-2-IFN-gamma, IL-17, IL-4, etc. dentro de una ventana de tiempo de 4 - 8 horas de activación. Las Tregs también se caracterizan por la desmetilación selectiva de regiones específicas del DNA, por ejemplo, dentro de la región del gen foxp3 (región desmetilada específica de Treg, TSDR; véase también Huehn, J., et al, 2009, Nat Rev Immunol 9, 83-9) pero también otros patrones de metilación específicos en otras regiones tales como las regiones de los genes CD25, CTLA4, FANK1, CD137, CD154. Representan un linaje de células T separado con funciones altamente inmunosupresoras que se requieren para mantener la tolerancia contra autoantígenos y antígenos extraños inofensivos. Las células Tcon como se definen en la presente memoria comprenden todas las células T CD4+ que no son Treg.

El término "célula objetivo", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una célula que puede expresar un antígeno en su superficie celular que debería ser reconocido (unido) directa o indirectamente (por ejemplo, a través de un polipéptido etiquetado) por el CAR tal y como se describe en la presente memoria.

Dicha célula objetivo puede ser una célula en un estado patológico que provoque autoinmunidad, rechazo de trasplan tes, alergia y enfermedades inflamatorias crónicas en un sujeto.

Autoinmunidad significa un estado en el que las células inmunitarias se dirigen contra sí mismas dando como resultado reacciones inmunitarias contra estructuras endógenas que pueden provocar enfermedades autoinmunes. El rechazo del trasplante significa la generación de respuestas inmunitarias contra el tejido trasplantado que el sistema inmunitario del huésped reconoce como extraño, lo que da como resultado el rechazo del tejido trasplantado.

Alergia significa la generación de una respuesta inmunitaria inapropiada contra antígenos extraños inofensivos, es tando en contacto con el sujeto, por ejemplo, por inhalación, ingestión o contacto con la piel que puede derivarse, por ejemplo, del medio ambiente o de los alimentos.

Las enfermedades inflamatorias crónicas significan la generación de reacciones inmunitarias contra antígenos que permanecen en el sistema. Los ejemplos incluyen reacciones inmunitarias contra bacterias durante, por ejemplo, en fermedad inflamatoria intestinal, virus durante la infección crónica o estructuras endógenas durante las reacciones autoinmunitarias. Los ejemplos también pueden incluir inflamación crónica como un resultado de reacciones alérgicas contra antígenos extraños. Las enfermedades autoinmunes son una afección derivada de la autoinmunidad que resulta en patologías que pueden afectar múltiples sistemas de órganos diferentes. Los ejemplos incluyen artritis reumatoide, esclerosis múltiple, neuromielitis óptica, lupus eritematoso sistémico, diabetes tipo 1 o una infección crónica por virus, bacterias, parásitos de un sujeto significa la invasión de un sujeto por agentes causantes de enfermedades tales como virus, bacterias o parásitos seguidos por su replicación.

Los CARs tal y como se describen en la presente memoria (polipéptido(s)), la(s) molécula(s) de ácido nucleico que codifican los CARs, vectores de expresión recombinantes, células que expresan los CARs y las poblaciones de células que expresan los CARs, pueden aislarse y/o purificarse. El término "aislado" significa alterado o extraído del estado natural. Por ejemplo, una población aislada de células significa un enriquecimiento de dichas células y la separación de otras células que normalmente están asociadas en su estado natural con dichas células aisladas. Una población aislada de células significa una población de células sustancialmente purificadas que son una población de células más homogénea que la que se encuentra en la naturaleza. Preferiblemente, la población de células enriquecida com prende al menos aproximadamente el 90% del tipo de células seleccionado. En aspectos particulares, la población de células comprende al menos aproximadamente el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o incluso el 100 % del tipo de células seleccionado.

Por ejemplo, un ácido nucleico o un péptido presente de forma natural en un animal vivo no está "aislado", pero el mismo ácido nucleico o péptido separado parcial o completamente de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado". Una proteína o ácido nucleico aislado también puede existir en un entorno no nativo tal como, por ejemplo, en una célula huésped.

Como se usa en la presente memoria, el término "sujeto" se refiere a un mamífero tal como un ratón, rata, vaca, cerdo, cabra, pollo, perro, mono o un ser humano. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano. El sujeto puede ser un sujeto que padezca un trastorno tal como una enfermedad autoinmune, alergia, rechazo de trasplante o inflamación crónica (un paciente), pero el sujeto también puede ser un sujeto sano.

El término "autólogo", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier material derivado del mismo sujeto al que se vuelve a introducir posteriormente.

El término "alogénico", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier material derivado de un sujeto diferente de la misma especie que el sujeto al que se le vuelve a introducir el material.

Los términos "cantidad terapéuticamente eficaz" o "población terapéuticamente eficaz" significan una cantidad de una población de células que proporciona un beneficio terapéutico en un sujeto.

Los términos "se une específicamente" o "específico para" con respecto a un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo, de un fragmento de unión a antígeno del mismo, como se usa por ejemplo, en el CAR tal y como se describe en la presente memoria, se refiere a un dominio de unión a antígeno que reconoce y se une a un antígeno específico, pero no reconoce ni se une sustancialmente a otras moléculas en una muestra. Un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno de una especie también puede unirse a ese antígeno de otra especie. Esta reactividad entre especies es típica de muchos anticuerpos y, por lo tanto, no es contraria a la definición de ese dominio de unión a antígeno como específico. Un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno puede unirse también a diferentes formas alélicas del antígeno (variantes alélicas, variantes de empalme, isoformas, etc.) o variantes homólogas de este antígeno de la misma familia de genes. Esta reactividad cruzada es típica de muchos anticuerpos y, por lo tanto, no es contraria a la definición de ese dominio de unión a antígeno como específico.

Los términos "célula modificada por ingeniería" y "célula modificada genéticamente" tal y como se usan en la presente memoria pueden usarse indistintamente. Los términos significan que contienen y/o que expresan un gen extraño o una secuencia de ácido nucleico que a su vez modifica el genotipo y/o el fenotipo de la célula o su progenie. Especial mente, los términos se refieren al hecho de que las células, preferiblemente las células inmunitarias, pueden manipu larse mediante métodos recombinantes bien conocidos en la técnica para expresar de forma estable o transitoria péptidos o proteínas que no se expresan en estas células en el estado natural. Por ejemplo, las células inmunitarias se modifican genéticamente para expresar un constructo artificial tal como un receptor de antígeno quimérico en su superficie celular.

El término "trastorno" significa una anomalía funcional o un trastorno en un sujeto tal como un cáncer, un trastorno autoinmune o una infección por virus, bacterias, parásitos u otros.

El término "tratar" (tratamiento de) un trastorno tal y como se usa en la presente memoria significa reducir la frecuencia o gravedad de al menos un signo o síntoma de una enfermedad o trastorno experimentado por un sujeto. La inmunoterapia es un término médico definido como el "tratamiento de una enfermedad mediante la inducción, mejora o su presión de una respuesta inmunitaria". Las inmunoterapias diseñadas para obtener o amplificar una respuesta inmunitaria se clasifican como inmunoterapias de activación, mientras que las inmunoterapias que reducen o suprimen se clasifican como inmunoterapias de supresión. La inmunoterapia contra el cáncer como inmunoterapia activadora in tenta estimular el sistema inmunitario para que rechace y destruya los tumores. La transferencia de células adoptivas utiliza respuestas citotóxicas basadas en células para atacar las células cancerosas. Se generan células inmunitarias, tales como las células T, que tienen una reactividad natural o modificada genéticamente al cáncer de un pacientein vitroy después se transfiere de nuevo al paciente con cáncer.

El término "expresión", tal y como se usa en la presente memoria, se define como la transcripción y/o traducción de una secuencia de nucleótidos particular impulsada por su promotor en una célula.

Las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 como se proporciona en el protocolo de listado de secuencias son secuencias parciales del CAR tal y como se describe en la presente memoria. Dichas secuencias de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 también pueden comprender variantes de estas secuencias, que tienen algunos ami noácidos eliminados, añadidos o reemplazados mientras aún retienen la función prevista tal y como se describe en la presente memoria. Por lo tanto, en esta definición se incluyen variantes de las secuencias de aminoácidos en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 tales como secuencias de aminoácidos esencialmente similares a SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, que tienen una identidad de secuencia de al menos el 70%, o al menos el 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% a nivel de secuencia de aminoácidos, respectivamente. En general, todas las variaciones de aminoácidos que no conducen a cambios intencionales de la función prevista de la secuencia SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 están incluidas en esta definición. En el contexto de la presente invención, la "identidad de secuencia" puede determinarse usando alineaciones por parejas usando programas de alineaciones para secuencias de aminoácidos bien conocidas en la técnica.

El "sistema circulatorio" es un sistema de órganos de un sujeto que permite que la sangre circule y transporte nutrientes (tales como aminoácidos y electrolitos), oxígeno, dióxido de carbono, hormonas y células sanguíneas hacia y desde las células del cuerpo para proporcionar nutrición y ayudar a combatir enfermedades, estabilizar la temperatura y el pH, y mantener la homeostasis. El sistema circulatorio comprende dos sistemas separados: el sistema cardiovascular, que distribuye la sangre, y el sistema linfático, que hace circular la linfa.

Los términos "método automatizado" o "proceso automatizado", tal y como se utilizan en la presente memoria, se refieren a cualquier proceso que se automatice mediante el uso de dispositivos y/o computadoras y software informá tico que, de lo contrario, un operador realizaría o podría realizar manualmente. Los métodos (procesos) que han sido automatizados requieren menos intervención humana y menos tiempo humano para entregar. En algunos casos, un método se automatiza si al menos una etapa del método se realiza sin ningún apoyo o intervención humana. Preferi blemente, el método está automatizado si todas las etapas del método se realizan sin ayuda o intervención humana.

El término "partícula", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una fase sólida tal como partículas coloidales, microesferas, nanopartículas o perlas. Los métodos para generar dichas partículas son bien conocidos en el campo de la técnica. Las partículas pueden ser partículas magnéticas. Las partículas pueden estar en una solución o suspensión o pueden estar en un estado liofilizado antes de su uso en la presente invención. Después, la partícula liofilizada se reconstituye en un tampón conveniente antes de ponerse en contacto con la muestra que se va a procesar con respecto a la presente invención.

Una tecnología de clasificación especialmente destacada es la clasificación de células magnéticas. Los métodos para separar células magnéticamente están disponibles comercialmente de varios proveedores. En una realización prefe rida para enriquecer, clasificar y/o detectar células en una muestra biológica que comprende células para, por ejemplo, las células Treg y otros anticuerpos monoclonales (células inmunitarias) o fragmentos de unión a antígeno de los mismos se utilizan junto con micropartículas superparamagnéticas coloidales que tienen un recubrimiento orgánico, por ejemplo, polisacáridos (tecnología de clasificación de células activadas magnéticamente (MACS®) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania)).

Otra tecnología de clasificación utiliza citometría de flujo. La citometría de flujo es una tecnología biofísica basada en láser o impedancia empleada, por ejemplo, en la clasificación de células y la detección de biomarcadores suspen diendo, por ejemplo, las células en una corriente de fluido y haciéndolas pasar por un aparato de detección electrónico. Permite el análisis multiparamétrico simultáneo de las características físicas y químicas de hasta miles de partículas por segundo. La clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) es un tipo especializado de citometría de flujo. Proporciona un método para clasificar una mezcla heterogénea de células biológicas en dos o más contenedores, una célula a la vez, en función de las características específicas de dispersión de luz y fluorescencia de cada célula.

Como se usa en la presente memoria, los términos "reducción", "que reduce" y similares, en el contexto del aisla miento, la purificación o el enriquecimiento de células, tienen el significado normal en la técnica y se refieren a la eliminación de células específicas (por ejemplo, células CD154+) de una muestra que comprende Tregs y otras células (inmunes). Los métodos para la reducción son bien conocidos en la técnica y se describen en la presente memoria, e incluyen, por ejemplo, la clasificación FACS o MACS en la que las células específicadas en una población (por ejemplo, células CD154+) se etiquetan y eliminan de la población de células, lo que da como resultado una nueva población en la que las células especificadas están ausentes o presentes en menor proporción que en la población inicial. Se reco nocerá que la "reducción" no requiere que las células especificadas se eliminen por completo o que la nueva población esté completamente libre de las células especificadas. Por lo general, las células especificadas reducidas de una población significa reducir la representación de dichas células (medida como un porcentaje de todas las células de la población) en al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 98%, o al menos aproximadamente un 99%).

Como se usa en la presente memoria, el término "selección positiva", en el contexto del aislamiento, la purificación o el enriquecimiento de células, tiene el significado normal en la técnica y se refiere al enriquecimiento de células específicadas (por ejemplo, células CD137+) a partir de una muestra que comprende Tregs y opcionalmente otras células (inmunes). Los métodos para la selección positiva son bien conocidos en la técnica y se describen en la presente memoria, e incluyen, por ejemplo, la clasificación FACS o MACS en la que las células específicadas en una población (por ejemplo, células CD137+) se etiquetan y aíslan de la población de células en el sentido de que las células aisladas dan como resultado una nueva población en la que las células especificadas están presentes en una proporción mayor que en la población inicial.

Realizaciones

En una realización de la invención, se genera una Treg que expresa el CAR que comprende los dominios de señali zación de CD3zeta y CD137 y un dominio de unión a antígeno específico para un antígeno exógeno tal como dextrano. El constructo de d Na que codifica el CAR puede transfectarse o transducirse en una célula Treg mediante métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, sistemas basados en virus, métodos físicos, métodos biológicos, métodos químicos). Independientemente de los métodos usados para integrar, preferiblemente integrar de manera estable, el ácido nucleico que codifica el CAR en la célula Treg, como resultado, la célula Treg expresa el CAR. Estas células Tregs se pueden activarin vitroein vivomediante la adición de dextrano a las células que están en el cultivo celular o circulando en la sangre de un sujeto al que se han aplicado.

En otra realización de la invención, las Treg que expresan el CAR de la invención se aíslan después de la activación específica de antígeno con el antígeno respectivo, por ejemplo, dextrano por aislamiento de células que expresan CD137 en combinación con o sin CD154 mediante clasificación magnética o fluorescente.

En una realización de la invención, las T regs pueden obtenerse a partir de una variedad de fuentes, tales como células mononucleares de sangre periférica (PMBC), médula ósea, tejido de ganglio linfático, sangre de cordón umbilical o tejido del timo. Para el enriquecimiento de estas células se pueden utilizar métodos bien conocidos en la técnica tal como la centrifugación a través de un gradiente Ficoll™ o PERCOLL TM o técnicas de selección positiva/negativa tales como la clasificación fluorescente (por ejemplo, clasificación FACS) o la clasificación magnética (por ejemplo, MACS®).

En una realización, las Tregs de una fuente dada de un sujeto se etiquetan magnéticamente, por ejemplo, con una perla magnética acoplada a anticuerpos específicos para CD4 y/o CD25 y/o CD127 y/o CD154 y/o CD137, se lavan, se enriquecen magnéticamente y se recolectan. Después, estas células Tregs pueden modificarse genéticamente para expresar el CD137-CD3Z-CAR en su superficie celular.

En otra realización de la invención, una Treg modificada genéticamente que expresa un CAR de la invención se aísla después del proceso de transfección/transducción mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, tec nologías de separación basadas en fluorescencia tal como FACS® o métodos de separación de células magnéticas tal como MACS®.

En una realización de la invención, las Tregs modificadas genéticamente que expresan el CD137-CD3Z-CAR se ex panden en presencia de un antígeno exógeno (por ejemplo, dextrano) o estimulación policlonal con anti-CD3/anti-CD28 para aumentar el número de T regs modificadas genéticamente y aumentar la pureza de las T regs que expresan CD137-CD3Z-CAR. Preferiblemente, dicha cantidad de Tregs modificadas genéticamente se incrementa hasta una cantidad terapéuticamente eficaz.

En una realización de la invención, se modifican genéticamente Tregs con alta pureza (por ejemplo, > 80 % de expre sión de FoxP3) para expresar el CD137-CD3Z-CAR.

En una realización de la invención, se aíslan las Tregs con alta pureza (por ejemplo, > 80 % de expresión de FoxP3) mediante la expresión de CD137 en combinación con otros marcadores, por ejemplo, CD25, CD127, CD154.

En una realización de la invención, el CD137-CD3Z-CAR se usa para el tratamiento en un sujeto que tiene una enfer medad inflamatoria o una enfermedad autoinmune, por ejemplo, enfermedad inflamatoria intestinal, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, rechazo de trasplantes o enfermedad de injerto contra huésped (GvHD).

En una realización de la invención, el CD137-CD3Z-CAR se activa mediante la aplicación de un antígeno exógeno (por ejemplo, dextrano) en forma soluble o inmovilizada en perlas, ya sea en sitios locales o sistémicamente, preferible mente en pacientes que padecen una enfermedad inflamatoria o una enfermedad autoinmune, por ejemplo, IBD, artritis reumatoide, MS, rechazo de trasplantes, GvHD.

Ejemplos

Ejemplo 1: Generación de CAR-Tregs específicas de dextrano con diferentes dominios de señalización intracelular.

Los constructos de CAR contienen un fragmento de unión específico que se deriva de un anticuerpo específico para un antígeno exógeno (por ejemplo, dextrano). La región bisagra puede derivarse, por ejemplo, de dominios IgG, CD8a CD8a o CD28 y puede comprender un epítopo/etiqueta que permite la detección del CAR. El dominio transmembrana puede derivarse, por ejemplo, de CD8a o CD28 seguido de uno a tres dominios de señalización que contienen CD3Z y CD137 como, por ejemplo, se muestra en la Figura 1A. Las Tregs se modifican genéticamente para expresar el CD137-CD3Z-CAR que se puede determinar mediante la expresión de LNGFR (Figura 1B). La unión al antígeno del CD137-CD3Z-CAR se puede determinar mediante incubación con el antígeno respectivo que se puede etiquetar (por ejemplo, de forma fluorescente) como se muestra para el dextrano en la Figura 1C.

Ejemplo 2: Activación de CAR-Tregs con diferentes dominios de señalización intracelular.

Las CAR-Tregs que son específicas para un antígeno exógeno (por ejemplo, dextrano) se pueden activar mediante su respectivo antígeno y la activación puede analizarse mediante la expresión de CD137. La activación de CAR-T regs después de la estimulación con dextrano unido a perlas se muestra en la Figura 2A. El CD137-CD3Z-CAR fue más destacado en la inducción de la expresión de CD137 en CAR-Tregs (Figura 2A). La funcionalidad de otros constructos de CAR probados con la misma especificidad se analizó mediante fosforilación de ZAP70. Se detectó ZAP70 fosforilado en CAR-Tregs con por ejemplo, señalización de CD28-CD3Z (Figura 2B), pero solo CD137-CD3Z-CAR indujo la activación de Treg (Figura 2A).

Ejemplo 3: Expansión de CAR-Tregs específicas de dextrano con diferentes dominios de señalización intracelular.

Las CAR-Tregs que son específicas para un antígeno exógeno (por ejemplo, dextrano) se pueden expandir en pre sencia de anti-CD3/-CD28 (Figura 3A,C) o su antígeno respectivo, por ejemplo, dextrano unido a perlas (Figura 3B,D). Solo las CAR-T regs con el CD137-CD3Z-CAR se expandieron mostrando una funcionalidad superior del CD137-CD3Z-CAR.

Ejemplo 4: Comparación de diferentes dominios de señalización intracelular en Tregs y Tcons.

Se generaron CAR-Tregs y CAR-Tcons que expresan el CAR anti-dextrano con diferentes dominios coestimuladores en combinación con CD3z. La unión a dextrano fue similar entre los constructos (Figura 4A), pero diferentes dominios de señalización tuvieron un impacto diferente en la activación de Treg y Tcon. La activación de Treg se analizó me diante la expresión de CD137 y la activación de Tcon mediante la expresión de CD154. Las CAR-Tregs se activaron más eficientemente con CD137-CD3z y CAR-Tcons con CD28-CD3z (Figura 4B).

Ejemplo 5: Aislamiento de CAR-Tregs específicas de antígeno.

Se aislaron las CAR-Tregs con el CD137-CD3z CAR mediante la expresión de LNGFR o mediante la expresión de CD137 después de 6 h de estimulación con dextrano. La expresión del transgén (Figura 5A) y del receptor (Figura 5B) fue similar entre ambas estrategias de clasificación, pero la reestimulación específica de antígeno fue muy eficiente cuando las CAR-Tregs se clasificaron mediante la expresión de CD137 (Figura 5C).

Métodos

Constructos del CAR

Todos los constructos del CAR contenían un scFv derivado de AC146, un dominio transmembrana CD8, una bisagra XS IgG4 y un ALNGFR unido a P2A para la detección de células transfectadas y transducidas. Los sobrenadantes lentivirales se generaron mediante cotransfección de células HEK293T con el vector de expresión y plásmidos de empaquetamiento. Un día antes de la transfección, 3 x 106 células HEK293T se sembraron en una placa de cultivo celular de 10 cm en DMEM completo (cDMEM) que consiste en DMEM (Gibco®), FCS al 10 % penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 gg/ml 2-mercaptoetanol 50 gM (todo de Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania). Las células se transfectaron de manera transitoria con 0,84 gg de pMDG-2.VSV-G, 5,16 gg de pCMVAR8.74 y 3,35 gg de plásmidos de dextrano-CAR diluidos en ddH2O suplementada con CaCl2 2,5 M. Mientras se aireaba, se añadieron lentamente a la solución 2 ml de tampón 2x HBS (NaCl 136,89 mM, KCl 4,96 mM, Na2HPO4 1,76 mM, HEPES 20,98 mM en ddH2O, pH = 6,75-6,76) y 2 ml de la solución de transfección se añadió gota a gota a las células. El medio que contenía la solución de transfección se eliminó después de 4 h y las células se lavaron dos veces con PBS precalen tado antes de añadir cDMEM nuevo. Después de 48 horas, se recogieron los sobrenadantes lentivirales, se filtraron (0,45 gm) y se usaron directamente o se almacenaron a -80°C durante un máximo de 6 meses.

Aislamiento y transducción de Treg

Los productos de leucaféresis de donantes sanos se obtuvieron del Charité University hospital, Berlín, Alemania, con consentimiento informado según las pautas éticas. Las PBMC se obtuvieron mediante centrifugación en gradiente de Ficoll-Paque (GE Healthcare Life Sciences, Friburgo, Alemania). Se aislaron Treg CD25+ de PBMC según las reco mendaciones del fabricante utilizando microesferas de CD25 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania). Las Tregs se cultivaron en "medio de expansión de Treg" que consiste en medio TexMACS (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) 5 % (v/v) de suero AB humano (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemania) 100 U/ml de IL-2 100 nmol de rapamicina (ambos de Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) y 100 U/ml de penicilina/100 gg/ml de estreptomicina (Gibco®, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania) en presencia de perlas de expansión de Treg (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) en una proporción de perlas a células de 4:1. Las Tcons CD4+ se activaron en medio TexMACS (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) suero AB humano al 5 % (v/v) (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemania) 200 U/ml de IL-2 en presencia de 30 ng/ ml de anti-CD3 y 1 gg/ml de anti-CD28. El día 3, el medio de cultivo se reemplazó con los sobrenadantes lentivirales respectivos suplementados con 4 gg/ml de sulfato de protamina y las células se espinocularon en placas de 96 pocillos recubiertas con retronectina durante 90 min a 800 g y 32°C. Después de la centrifugación, se eliminó el sobrenadante viral y se añadió medio de cultivo nuevo a las células. La eficacia de la transducción se evaluó el día 2 o el día 3 después de la transducción mediante la tinción de LNGFR en la superficie celular. Las Tregs y Tcons se expandieron durante 10-12 días y el medio se reemplazó cada 2-3 días. Las células se dejaron en reposo durante 2 días sin estimulación en RPMI-1640 (Gibco®, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania) suero AB humano al 5 % (v/v) (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemania) 100 U/ml de penicilina/100 gg/ml de estreptomicina (Gibco®, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alema nia) antes de 6 h de reestimulación con perlas de expansión de Treg (proporción de perlas a células 4:1, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania), FITC-dextrano soluble (MW: 2000000, 2 gg/ml, Sigma- Aldrich, Schnelldorf, Alemania), dextrano unido a perlas (1:100; microperlas recubiertas de dextrano en PBS, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) o 10 ng/ml de PMA y 500 ng/ml de ionomicina (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemania)

Citometría de flujo

Las células se tiñeron en diferentes combinaciones con los siguientes anticuerpos según las recomendaciones del fabricante: CD4-PE-Vio770, CD4-APC-Vio-770, CD4-FITC, CD4-VioBlue (VIT4), CD25-VioBright FITC (4E3), CD127-FITC, CD127-PE-Vio770 (MB15-18C9), CD271 (LNGFR)-PE, CD271 (LNGFR)-PE-Vio770 (ME20.4-1.H4), CD137-PE (4B4-1), CD154-APC , CD154-VioBlue (5C8) (todo de Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemania), Viobility 405/520 Fixable Dye (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemania) o yoduro de propidio (Sigma-Aldrich, Schnell dorf, Alemania) se utilizaron para excluir células muertas. Para la tinción de la expresión de la superficie de CAR, se incubaron Treg durante 10 min con 2 gg/ml de dextrano marcado con FITC (MW: 2000000, Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemania) a 4°C junto con el etiquetado de otras moléculas de superficie. Todos los datos se adquirieron en un anali zador FACS Canto/LSRII (BD, Heidelberg, Alemania) o MACS Quant Analyzer (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) y la clasificación FACS se realizó en un Aria I, Aria II o Influx Cell Sorter (BD, Heidelberg, Alemania). Se utilizó FlowJo (TreeStar, Inc, Ashland, OR, EE. UU.) para el análisis de datos.

Cuantificación de la expresión génica.

La expansión competitiva de los constructos de Dex-CAR con diferentes dominios de señalización se analizó mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El DNA se aisló mediante Zymo Research Quick-DNA ™ Miniprep Kit (Zymo Research, Friburgo, Alemania) según las instrucciones del fabricante y la expresión génica se analizó utilizando 1 x SYBR® Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania) y 500 nMol de cebadores directos e inversos (TIB MOLBIOL, Berlín), respectivamente. La expresión génica se analizó en un sistema de PCR en tiempo real StepOneTM (Thermo Fisher Scientific, Schwerte) y se normalizó a la expresión de GAPDH.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una célula T reguladora (T reg) que expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende

a) al menos un dominio de unión a antígeno,

b) un dominio transmembrana,

en el que dicho dominio de unión a antígeno se une específicamente a un antígeno que se expresa en la super ficie de una célula objetivo o una etiqueta de un polipéptido etiquetado que se une a un antígeno expresado en la superficie de una célula objetivo o un antígeno soluble.

2. La célula Treg según la reivindicación 1, en la que dicho al menos un dominio de señalización citoplasmático primario es CD3zeta.

3. La célula Treg según la reivindicación 1 o 2, en la que dicho dominio de unión a antígeno de dicho CAR es específico para un antígeno soluble, lo que permite la activación de dicha célula Treg tras la unión de dicho antígeno soluble a dicho dominio de unión a antígeno de dicho CAR.

4. La célula Treg según la reivindicación 3, en la que dicho antígeno soluble es un antígeno exógeno que no está presente de forma natural en la sangre o el tejido de un sujeto al que se aplica dicha célula Treg.

5. La célula Treg según la reivindicación 3 o 4, en la que dicho antígeno soluble es dextrano.

6. La célula Treg según la reivindicación 5, en la que dicho dominio de unión a antígeno de dicho CAR comprende las secuencias de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.

7. La célula Treg que expresa un CAR según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en el trata miento o prevención de una enfermedad autoinmune, alergia, rechazo de trasplantes, enfermedad de injerto contra huésped, enfermedades inflamatorias crónicas, tales como enfermedades inflamatorias del intestino o una infección crónica por virus, bacterias, parásitos de un sujeto.

8. Una composición que comprende una población de células Treg que expresan un CAR según la reivindicación 1 a 7.

9. Una combinación de composiciones farmacéuticas que comprende

a) una población de células Treg que expresan un CAR según la reivindicación 1 a 7 junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, en el que dicho dominio de unión a antígeno de dicho CAR es específico para un antígeno soluble, y

b) un antígeno soluble.

10. La composición según la reivindicación 9, en la que dicho antígeno soluble es dextrano.

11. La composición según la reivindicación 9 o 10 para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad autoinmune, alergia, rechazo de trasplantes, enfermedad de injerto contra huésped, enfermedades inflamatorias crónicas, tales como enfermedades inflamatorias del intestino o una infección crónica por virus, bacterias, pará sitos de un sujeto.