BR112020005361A2

BR112020005361A2 - anticorpos anti-hla-a2 e métodos de uso dos mesmos

Info

Publication number: BR112020005361A2
Application number: BR112020005361-9A
Authority: BR
Inventors: Megan Levings; Paul ORBAN; Nicholas DAWSON; Caroline LAMARCHE; Jan Peter BERGQVIST
Original assignee: The University Of British Columbia; Cdrd Ventures Inc.
Priority date: 2017-09-19
Filing date: 2018-09-19
Publication date: 2020-09-24
Also published as: JP2023100800A; RU2020112261A3; WO2019056099A1; MX2020003046A; JP2020537537A; CN111448215B; RU2020112261A; EP3684821A1; EP3684821A4; SG11202002520UA; US20200283529A1; CN111448215A; CA3076261A1; KR20200067845A; AU2018338418A1; JP7281774B2; IL273402A

Abstract

São fornecidos anticorpos anti-HLA-A2 humanizados. Em certos aspectos, os anticorpos anti-HLA-A2 humanizados são capazes de constituir um domínio de ligação ao antígeno de um receptor de antígeno quimérico (CAR), onde o CAR é capaz de ser expresso em uma célula humana, de modo que o CAR se ligue especificamente ao HLA-A2. Também são fornecidos CARs que incluem os anticorpos anti-HLA-A2 humanizados. Também são fornecidas células modificadas, incluindo os anticorpos e CARs, bem como métodos de uso dessas células modificadas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “ANTICORPOS ANTI-HLA-A2 E MÉTODOS DE USO DOS MESMOS” Referência cruzada aos pedidos relacionados

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório de Patente dos Estados Unidos No. de série 62/560.574, depositado em 19 de setembro de 2017, e do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos No. de série 62/692.386, depositado em 29 de junho de 2018, cujos pedidos são incorporados aqui por referência na sua totalidade.

Campo da Invenção

[002] A presente invenção se refere em alguns aspectos às moléculas de ligação ao HLA-A2, em particular, aos anticorpos anti-HLA-A2 humanizados. A presente invenção se refere ainda aos receptores recombinantes contendo tais anticorpos, incluindo receptores de antígeno quiméricos (CARs), que contêm esses anticorpos. A divulgação se refere ainda às células geneticamente modificadas que expressam esses receptores e aos anticorpos e ao seu uso em terapia celular.

Fundamentos da Invenção

[003] Os antígenos HLA de classe I são proteínas polimórficas expressas em todas as células nucleadas e são alvos críticos para o reconhecimento imunológico no contexto do transplante. De fato, o desenvolvimento de células T e/ou anticorpos específicos para HLA de classe I são os principais fatores de risco para rejeição aguda e crônica e aloenxerto, e a presença de anticorpos anti-HLA de classe I de doadores pré-formados pode resultar em rejeição hiperaguda (Konvalinka et al., 2015). Assim, encontrar maneiras de controlar a resposta imunológica às proteínas HLA de classe I seria um grande avanço no transplante.

[004] As moléculas clássicas de HLA de classe I são polimórficas e codificadas por muitos alelos diferentes que evoluíram em resposta à pressão evolutiva das infecções.

Existem três loci que codificam as proteínas clássicas do HLA de classe I, denominadas loci A, B e C. Dentro do lócus HLA-A, a família de alelos de HLA-A2 é a maior família e a mais diversificada, com pelo menos 31 alelos diferentes de HLA-A2 conhecidos em humanos. Curiosamente, ao contrário de muitas outras famílias de alelos de HLA, o HLA-A2 é frequente em todos os grupos étnicos e é encontrado em 50% dos caucasianos e 35% dos afro-americanos (Ellis et al., 2000).

Muitos alelos HLA-A2 diferem em apenas 1 a 9 aminoácidos, com a maioria do polimorfismo centralizado em torno do sulco de ligação ao peptídeo (Hilton et al., 2013). Os alelos HLA- A2 são sub-agrupados em dois ramos principais: os derivados através de eventos de conversão de genes paralelos de A*0201 ou A*0205 (Ellis et al., 2000).

[005] A imunoterapia adotiva com células T reguladoras (Treg) como uma maneira de controlar a imunidade indesejada às proteínas HLA e outros antígenos que levam à rejeição do transplante é um tratamento promissor para a rejeição de aloenxertos e doenças do enxerto contra o hospedeiro (GVHD). Foi relatado o uso da transferência policlonal de células Treg na prevenção da doença do enxerto contra o hospedeiro (GVHD) após o transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas (HSCT) (Brunstein et. al, 2011; Di Ianni et. al, 2011; Trzonkowski et al., 2009). O uso de transferência de células Treg na manutenção dos níveis de peptídeo c na diabetes tipo 1 também foi relatado (Bluestone et al. 2015; Marek-Trzonkowska et al. 2012).

Notavelmente, foi relatado que pode haver um risco transitório de imunossupressão generalizada associada ao uso de células Treg policlonais para essa terapia celular (Brunstein et. al, 2013).

[006] Dados de estudos em animais indicam que a potência e a especificidade da terapia celular com células Treg podem ser significativamente aumentadas pelo uso de células específicas para o antígeno. Por exemplo, em modelos de autoimunidade, as células Treg específicas para o antígeno são superiores às células Treg policlonais na redução da doença: as células Treg isoladas dos linfonodos pancreáticos ou pulsadas com antígeno das ilhotas são significativamente melhores na prevenção ou cura do diabetes tipo 1 do que as células Treg policlonais (Green et al., 2002; Masteller et al., 2005; Tang et al., 2004; Tarbell et al., 2007; Tarbell et al., 2004), e as células Treg que expressam um receptor de células T transgênicas específicas para um auto-antígeno (TCR) são superiores às células Treg policlonais na supressão da inflamação do sistema nervoso central em um modelo de encefalomielite autoimune experimental (EAE) (Stephens et al., 2009). Da mesma forma, as células Treg específicas para aloantígenos, enriquecidas pela expansão estimulada por aloantígenos in vitro ou modificadas para expressar um transgene de TCR, são mais eficazes que as células Treg policlonais na prevenção da rejeição de enxertos de órgãos e tecidos (Golshayan et al., 2007; Joffre et al., 2008; Nishimura et al., 2004; Sanchez-Fueyo et al., 2006; Tsang et al., 2008). Existem evidências de que as células Treg expandidas com aloantígenos previnem efetivamente a GVHD (Trenado et al., 2006) e que a indução in vivo de células Treg específicas para o antígeno promove a aceitação de aloenxertos hematopoiéticos sem GVHD (Verginis et al., 2008). Modelos de camundongos humanizados mostraram resultados semelhantes: as células Treg humanas expandidas por aloantígenos são supressoras mais potentes da rejeição de enxertos de pele do que as células Treg policlonais (Putnam et al., 2013; Sagoo et al., 2011).

[007] Uma abordagem alternativa para a sobre- expressão de TCRs transgênicos ou expansão estimulada pelo antígeno para enriquecer para células T específicas para o antígeno é o uso de receptores quiméricos de antígeno (CARs).

Na imunoterapia adotiva baseada em células, as células imunológicas isoladas de um paciente podem ser modificadas para expressar as proteínas sintéticas que permitem que as células desempenhem novas funções terapêuticas após serem subsequentemente transferidas de volta para o paciente. Um exemplo de tal proteína sintética é um CAR. Um exemplo de um CAR atualmente usado é uma fusão de um domínio de reconhecimento extracelular (por exemplo, um domínio de ligação ao antígeno), um domínio transmembranar e um ou mais domínios de sinalização intracelular. Após o acoplamento do antígeno, a porção de sinalização intracelular do CAR pode iniciar uma resposta relacionada à ativação em uma célula imunológica. Por exemplo, as células T podem ser geneticamente modificadas para expressar domínios de ligação para o antígeno extracelular de anticorpo de cadeia única (scFv) fundidos com os domínios de sinalização intracelular (Gill and June, 2015; June et al., 2015). Em particular, foram relatadas células Treg expressando CARs específicas para antígenos modelos (Blat et al., 2014; Elinav et al., 2009; Elinav et al., 2008; Fransson et al., 2012; Hombach et al., 2009, Boardman et al., 2016; MacDonald et al., 2016; Noyan et al., 2016).

SUMÁRIO

[008] Aspectos da presente divulgação incluem anticorpos anti-HLA-A2. Também são fornecidos receptores de antígeno quiméricos (CARs) incluindo um domínio extracelular incluindo qualquer um dos anticorpos anti-HLA-A2 da presente divulgação. Também são fornecidos ácidos nucleicos que codificam os anticorpos anti-HLA-A2 e CARs da presente divulgação, vetores de expressão incluindo os mesmos e células hospedeiras incluindo esses vetores de expressão.

Aspectos da presente divulgação também incluem anticorpos anti-HLA-A2 humanizados. Também são fornecidos receptores de antígeno quiméricos (CARs) incluindo um domínio extracelular incluindo qualquer um dos anticorpos anti-HLA-A2 humanizados da presente divulgação. Também são fornecidos ácidos nucleicos que codificam os anticorpos anti-HLA-A2 humanizados e CARs da presente divulgação, vetores de expressão incluindo os mesmos e células hospedeiras incluindo esses vetores de expressão. Também são fornecidas células imunológicas, por exemplo, as células imunológicas reguladoras, que incluem os CARs e/ou vetores de expressão da presente divulgação, composições e composições farmacêuticas incluindo essas células imunológicas, kits de partes incluindo essas células imunológicas e/ou reagentes (por exemplo, um ácido nucleico ou vetor que codifica um anticorpo anti-HLA-A ou CAR da presente divulgação) para fabricar essas células imunológicas e métodos para fabricar essas células imunológicas. Métodos de uso dos anticorpos anti-HLA-A2, CARs, células imunológicas e composições farmacêuticas da presente divulgação também são fornecidos.

Por exemplo, os anticorpos anti-HLA-A2 em questão, CARs, células imunológicas (por exemplo, células imunológicas reguladoras) e composições farmacêuticas encontram uso, por exemplo, na promoção da tolerância imunológica em um indivíduo, na prevenção ou no tratamento da doença do enxerto contra o hospedeiro (GVHD) em um indivíduo, prevenindo ou tratando a rejeição de transplante de órgão ou tecido em um indivíduo e semelhantes.

[009] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo anti-HLA-A2 humanizado, em que o anticorpo é capaz de constituir um domínio de ligação ao antígeno de um receptor de antígeno quimérico (CAR), onde o CAR é capaz de ser expresso em uma célula humana (por exemplo, uma célula imunológica humana, como uma célula imunológica reguladora humana), de modo que o CAR se ligue especificamente ao HLA- A2. Em certos aspectos, esses anticorpos competem pela ligação ao HLA-A2 com um anticorpo, incluindo: uma região determinante de complementaridade da cadeia pesada 1 (HCDR1) tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 183; uma região determinante de complementariedade de cadeia pesada 2 (HCDR2) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:

185; uma região determinante de complementariedade de cadeia pesada 3 (HCDR3) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 187; uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 1 (LCDR1) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 188; uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 2 (LCDR2) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 189; e uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 3 (LCDR3) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 190.

[010] Em certos aspectos, é fornecido um anticorpo anti-HLA-A2 humanizado, em que o anticorpo compete pela ligação ao HLA-A2 com um anticorpo, incluindo: uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1) tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 183; uma região determinante de complementariedade de cadeia pesada 2 (HCDR2) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 185; uma região determinante de complementariedade de cadeia pesada 3 (HCDR3) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 187; uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 1 (LCDR1) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 188; uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 2 (LCDR2) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 189; e uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 3 (LCDR3) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 190.

[011] De acordo com certas modalidades, um anticorpo anti-HLA-A2 humanizado como estabelecido acima se liga ao mesmo epítopo HLA-A2 que um anticorpo, incluindo: uma região determinante de complementaridade da cadeia pesada 1 (HCDR1) tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 183; uma região determinante de complementariedade de cadeia pesada 2 (HCDR2) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 185; uma região determinante de complementariedade de cadeia pesada 3 (HCDR3) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 187; uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 1 (LCDR1) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 188; uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 2 (LCDR2) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 189; e uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 3 (LCDR3) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 190.

[012] Em algumas modalidades, um anticorpo anti- HLA-A2 humanizado da presente divulgação tem menos reatividade a pelo menos um subtipo HLA-A selecionado de um ou mais de HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 e qualquer combinação dos mesmos, em comparação com um anticorpo BB7.2. Por exemplo, em algumas modalidades, um anticorpo anti-HLA-A2 humanizado da presente divulgação tem menos reatividade a pelo menos um subtipo HLA-A selecionado de um ou mais de HLA-A*25, HLA-

A*29, HLA-A*30, e qualquer combinação dos mesmos, em comparação com um anticorpo BB7.2.

[013] Em certos aspectos, um anticorpo anti-HLA-A2 humanizado da presente divulgação inclui uma região variável da cadeia pesada, incluindo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SYHIQ (SEQ ID NO: 1) e GYTFTSY (SEQ ID NO: 2).

[014] De acordo com certas modalidades, um anticorpo anti-HLA-A2 humanizado da presente divulgação inclui uma região variável da cadeia pesada, incluindo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: YPGDGS (SEQ ID NO: 4) e WIYPGDGSTX10YX12X13KFX16G (SEQ ID NO: 10), onde X10 é Q ou K, X12 é N ou S, X13 é E ou Q e X16 é K ou Q. Esse anticorpo pode incluir, por exemplo, uma região variável da cadeia pesada incluindo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: WIYPGDGSTQYNEKFKG (SEQ ID NO: 3) e YPGDGS (SEQ ID NO: 4).

Também a título de exemplo, esse anticorpo pode incluir, por exemplo, uma região variável da cadeia pesada incluindo a sequência de aminoácidos WIYPGDGSTKYSQKFQG (SEQ ID NO: 5).

Em certos aspectos, um anticorpo humanizado da presente divulgação inclui uma região variável da cadeia pesada, incluindo a sequência de aminoácidos EGTYYAMDY (SEQ ID NO: 6).

[015] Em algumas modalidades, um anticorpo anti- HLA-A2 humanizado da presente divulgação inclui uma região variável da cadeia leve incluindo a sequência de aminoácidos RSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO: 7). Em certos aspectos, um anticorpo humanizado da presente divulgação inclui uma região variável da cadeia leve incluindo a sequência de aminoácidos KVSNRFS (SEQ ID NO: 8). De acordo com algumas modalidades, um anticorpo humanizado da presente divulgação inclui uma região variável da cadeia leve incluindo a sequência de aminoácidos FQGSHVPRT (SEQ ID NO: 9).

[016] Em certos aspectos, um anticorpo anti-HLA- A2 humanizado da presente divulgação inclui uma região variável da cadeia pesada incluindo uma região estrutural 1 (VH FR1) incluindo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS (SEQ ID NO: 11) e QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 12).

[017] De acordo com certas modalidades, um anticorpo anti-HLA-A2 humanizado da presente divulgação inclui uma região variável da cadeia pesada incluindo uma região estrutural 2 (VH FR2) incluindo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: WVRQAPGQX9LEWMGX15 (SEQ ID NO: 13), WVRQAPGQX9LEWMGX15WI (SEQ ID NO: 17) HIQWVRQAPGQX12LEWMGX18WI (SEQ ID NO: 21) e HIQWVRQAPGQX12LEWMGX18 (SEQ ID NO: 25), onde:

X9 é R ou G e X15 é I ou ausente na SEQ ID NO: 13; X9 é R ou G e X15 é I ou ausente na SEQ ID NO: 17; X12 é R ou G e X18 é I ou ausente na SEQ ID NO: 21; e X12 é R ou G e X18 é I ou ausente na SEQ ID NO: 25.

[018] Em algumas modalidades, um anticorpo anti- HLA-A2 humanizado da presente divulgação inclui uma região variável da cadeia pesada incluindo uma região estrutural 3 (VH FR3) incluindo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: X1VTX4TX6DTSX10STAYMX16LSX19LRSX23DX25AVYYCAR(SEQ ID NO: 29), TX2YX4X5KFX8GX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34 AVYYCAR (SEQ ID NO: 35), TQYNEKFKGX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34 AVYYCAR (SEQ ID NO: 36) e TKYSQKFQGX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34AVYYCAR (SEQ ID NO: 37), onde: X1 é R ou ausente, X4 é I ou M, X6 é R ou A, X10 é A, T ou I, X16 é E ou L, X19 é S ou R, X23 é E ou D e X25 é T ou M na SEQ ID NO: 29; X2 é Q ou K, X4 é N ou S, X5 é E ou Q, X8 é K ou Q, X10 é R ou ausente, X13 é I ou M, X15 é R ou A, X19 é A, T ou I, X25 é E ou L, X28 é S ou R, X32 é E ou D e X34 é T ou M na SEQ ID NO: 35;

X10 é R ou ausente, X13 é I ou M, X15 é R ou A, X19 é A, T ou I, X25 é E ou L, X28 é S ou R, X32 é E ou D e X34 é T ou M na SEQ ID NO: 36; e X10 é R ou ausente, X13 é I ou M, X15 é R ou A, X19 é A, T ou I, X25 é E ou L, X28 é S ou R, X32 é E ou D e X34 é T ou M na SEQ ID NO: 37.

[019] Em certos aspectos, um anticorpo anti-HLA-A2 humanizado da presente divulgação inclui uma região variável da cadeia pesada incluindo uma região estrutural 4 (VH FR4) incluindo a sequência de aminoácidos WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 44). De acordo com certas modalidades, um anticorpo anti- HLA-A2 humanizado da presente divulgação inclui uma região variável da cadeia pesada, incluindo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 61-66.

[020] De acordo com certas modalidades, um anticorpo anti-HLA-A2 humanizado da presente divulgação inclui uma região variável da cadeia leve incluindo uma região estrutural 1 (VL FR1) incluindo a sequência de aminoácidos DX2VMTQX7PLSX11X12VTX15GQPASISX23 (SEQ ID NO: 46), onde X2 é V ou I, X7 é S ou T, X11 é L ou S, X12 é P ou S, X15 é L ou P e X23 é C ou F.

[021] Em algumas modalidades, um anticorpo anti- HLA-A2 humanizado da presente divulgação inclui uma região variável da cadeia leve incluindo uma região estrutural 2

(VL FR2) incluindo a sequência de aminoácidos WX2X3QX5PGQX9PX11X12LIY (SEQ ID NO: 51), onde X2 é F ou Y, X3 é Q ou L, X5 é R ou K, X9 é S ou P, X11 é R ou Q e X12 é R ou L.

[022] Em certos aspectos, um anticorpo anti-HLA- A2 humanizado da presente divulgação inclui uma região variável da cadeia leve incluindo uma região estrutural 3 (VL FR3) incluindo a sequência de aminoácidos GVPDRFSGSGX11GTDFTLKISRVEAEDVGVYYC (SEQ ID NO: 56), em que X11 é S ou A. De acordo com certas modalidades, um anticorpo anti-HLA-A2 da presente divulgação humanizado inclui uma região variável de cadeia leve incluindo uma região estrutural 4 (VL FR4) que inclui a sequência de aminoácidos FGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 59). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-HLA-A2 humanizado da presente divulgação inclui uma região variável da cadeia leve incluindo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 67-71. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-HLA-A2 humanizado da presente divulgação é um anticorpo inteiro, um anticorpo de cadeia única, um anticorpo dimérico de cadeia única, um Fv, um scFv, um Fab, um F(ab)’2, um anticorpo desfucosilado, um anticorpo bi-específico, um diacorpo ("diabody"), um triacorpo ("triabody), um tetracorpo ("tetrabody"), um fragmento de anticorpo selecionado do grupo que consiste em um unicorpo ("unibody"), um anticorpo de domínio e um nanocorpo ("nanobody") ou um mimético de anticorpo selecionado do grupo que consiste em um afficorpo ("affibody"), um alfacorpo ("alphabody"), uma estrutura à base de proteínas com repetição armadillo, um knottin, um peptídeo de domínio kunitz, uma afilina, uma afitina, uma adnectina, um atrímero, uma evasina, um DARPin, uma anticalina, um avímero, um finômero, um versacorpo ("versabody") ou uma duocalina.

[023] De acordo com certas modalidades, um anticorpo anti-HLA-A2 humanizado da presente divulgação é um scFv. Por exemplo, um anticorpo anti-HLA-A2 humanizado da presente divulgação pode ser um scFv incluindo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 72-91.

[024] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo anti-HLA-A2 humanizado, conforme estabelecido acima, onde o anticorpo é capaz de constituir um domínio de ligação ao antígeno de um receptor de antígeno quimérico (CAR), onde o CAR é capaz de ser expresso em um sistema de células imunológicas (por exemplo, uma célula T reguladora (Treg)), de modo que o CAR se ligue especificamente ao HLA- A2. Em certos aspectos, é fornecido um anticorpo anti-HLA- A2 humanizado, conforme estabelecido acima, em que o anticorpo é capaz de constituir um domínio de ligação ao antígeno de um receptor de antígeno quimérico (CAR), onde o CAR é capaz de ser expresso em uma célula imunológica (por exemplo, uma célula T reguladora (Treg)), de modo que a célula imunológica seja ativada pelo HLA-A2.

[025] Em certos aspectos, é fornecido um ácido nucleico que codifica qualquer um dos anticorpos anti-HLA- A2 humanizado apresentado acima. Também é fornecido um vetor de expressão e vetores de terapia genética que incluem esse ácido nucleico. Uma célula hospedeira incluindo esse vetor de expressão ou um vetor de terapia genética também são fornecidos.

[026] Aspectos da presente divulgação incluem ainda receptores de antígeno quiméricos (CARs). Por exemplo, é fornecido um CAR, incluindo: (i) um domínio extracelular incluindo qualquer um dos anticorpos anti-HLA-A2 humanizados apresentados acima; (ii) um domínio transmembranar; e (iii) um domínio citoplasmático incluindo um domínio de sinalização intracelular; onde o CAR é capaz de ser expresso em uma célula imunológica, de modo que o CAR se ligue especificamente ao HLA-A2. Esse CAR pode ter menos reatividade a pelo menos um subtipo HLA-A selecionado de um ou mais de HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 e qualquer combinação dos mesmos, em comparação com um CAR incluindo um anticorpo BB7.2. Por exemplo, em algumas modalidades, esse CAR tem menos reatividade a pelo menos um subtipo HLA-A selecionado de um ou mais de HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30 e qualquer combinação dos mesmos, em comparação com um CAR incluindo um anticorpo BB7.2. Um CAR da presente divulgação pode ser capaz de ser expresso em uma célula imunológica (por exemplo, uma célula T reguladora (Treg)), de modo que a célula imunológica seja ativada por HLA-A2. Um CAR da presente divulgação pode incluir uma região de dobradiça. Em certos aspectos, a região de dobradiça inclui uma região de haste de CD8α.

[027] Um CAR da presente divulgação pode incluir um domínio transmembranar que inclui um domínio transmembranar de uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em: CD3 gama, CD3 delta, CD3 épsilon, CD3 zeta, a cadeia alfa do receptor de células T, a cadeia beta do receptor de células T, a cadeia gama do receptor de células T, a cadeia delta do receptor de célula T, CD28, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD86, CD134, CD137 e CD154 e qualquer combinação dos mesmos.

Em algumas modalidades, o domínio transmembranar inclui um domínio transmembranar de CD28.

[028] De acordo com certas modalidades, um CAR da presente divulgação inclui um domínio de sinalização intracelular que inclui um domínio de sinalização funcional de uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em: CD3 gama, CD3 delta, CD3 épsilon, CD3 zeta, FcR gama, FcR alfa, FcR épsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b e CD66d e qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular inclui um domínio de sinalização funcional de CD3 zeta. Em certos aspectos, o domínio de sinalização intracelular inclui ainda um domínio co-estimulatório. Esse domínio co-estimulatório pode incluir um domínio de sinalização funcional de uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em OX40, CD27, CD28, antígeno-1 associado à função de linfócitos (LFA-1) (CD11a/CD18), TNFR1 (CD120a/TNFRSF1A), TNFR2 (CD120b/TNFRSF1B), CTLA-4 (CD152), CD95, ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), CD2, CD30, CD40, PD40, PD-1, CD7, LIGHT, NKG2C, B7- H3, ICAM- 1, um ligante que se liga especificamente a CD83, IL2ra (CD25), IL6Ra (CD126), IL-7Ra (CD127), IL-13RA1, IL- 13RA2, IL-33R (IL1RL1), IL-10RA, IL-10RB, IL-4R, IL-5R (CSF2RB), ARHR, receptor BAFF, IL-21R, TGFbR1, TGFbR2, TGFbR3, cadeia gama comum e qualquer combinação dos mesmos.

De acordo com certas modalidades, o domínio co-estimulatório inclui um domínio de sinalização funcional de uma proteína selecionada a partir de CD28 e 4-1BB. Por exemplo, o domínio co-estimulatório pode incluir um domínio de sinalização funcional de CD28.

[029] Também são fornecidas células imunológicas modificadas, incluindo quaisquer um dos CARs da presente divulgação. Em algumas modalidades, a célula imunológica modificada é uma célula T reguladora (Treg).

[030] A presente divulgação fornece ácidos nucleicos que codificam qualquer um dos CARs da presente divulgação. Também são fornecidos vetores de expressão incluindo esses ácidos nucleicos, assim como células imunológicas (por exemplo, células T reguladoras (Tregs)), incluindo esses vetores de expressão.

[031] Também são fornecidas composições (por exemplo, composições farmacêuticas). Em certos aspectos, é fornecida uma composição farmacêutica que inclui uma pluralidade de células imunológicas ou células imunológicas modificadas da presente divulgação. Também são fornecidos kits de peças. Em algumas modalidades, os referidos kits de peças compreendem em uma primeira parte as células imunológicas da presente divulgação e em uma segunda parte outro agente terapêutico, como, por exemplo, um agente imunossupressor. Em algumas modalidades, os referidos kits de peças compreendem um ou mais reagentes (por exemplo, um ácido nucleico ou vetor de expressão que codifica um anticorpo anti-HLA-A ou CAR da presente divulgação) para produzir as células da presente divulgação. Métodos de produção de células imunológicas modificadas da presente divulgação também são fornecidos. Em algumas modalidades, esses métodos incluem a transdução de uma célula imunológica com um vetor de expressão da presente divulgação, gerando assim a célula imunológica modificada.

[032] Métodos de uso dos anticorpos, CARs, células imunológicas, células imunológicas modificadas e composições farmacêuticas da presente divulgação também são fornecidos.

Em certos aspectos, são fornecidos métodos para promover a tolerância imunológica em um indivíduo, os métodos incluindo a administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica da presente divulgação, por exemplo, uma composição farmacêutica que inclui uma pluralidade de células imunológicas modificadas ou células imunológicas da presente divulgação. Em algumas modalidades, a tolerância imunológica é a tolerância a um órgão ou tecido transplantado. De acordo com certas modalidades, são fornecidos métodos para prevenir ou tratar a doença do enxerto contra o hospedeiro (GVHD) em um indivíduo, os métodos incluindo a administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica da presente divulgação, por exemplo, uma composição farmacêutica incluindo uma pluralidade da células imunológicas modificadas ou células imunológicas da presente divulgação.

Em certos aspectos, o indivíduo está passando ou foi submetido a um transplante de células-tronco hematopoiéticas. Também são fornecidos métodos para prevenir ou tratar a rejeição de transplante de órgão ou tecido em um indivíduo, os métodos incluindo a administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica da presente divulgação, por exemplo, uma composição farmacêutica incluindo uma pluralidade de células imunológicas modificadas ou células imunológicas da presente divulgação. Em algumas modalidades, o indivíduo está ainda recebendo um agente imunossupressor.

De acordo com certas modalidades, são fornecidos métodos para prevenir ou tratar a rejeição de transplante de órgão ou tecido ou doença do enxerto contra hospedeiro (GVHD) em um indivíduo, os métodos incluindo a administração ao indivíduo de uma combinação de uma célula imunológica da presente divulgação com pelo menos um agente imunossupressor para induzir a tolerância imunológica. Em qualquer um dos métodos de utilização dos anticorpos, CARs, células imunológicas, células imunológicas modificadas e composições farmacêuticas da presente divulgação, o indivíduo pode ser humano.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[033] Figura 1. Construção de CARs anti-HLA-A2 humanizados. Representação esquemática dos construtos lentivirais. Superior: construto de controle NGFR truncado (sem CAR); Inferior: construto de CAR anti-HLA-A2 humanizado. “SP”: peptídeo sinal; “GS”: Ligante glicina- serina; “TM”: região transmembranar; “Hs”: humanizado.

[034] Figura 2. Expressão e especificidade da superfície celular de CARs anti-HLA-A2 humanizados. As células 293T foram transfectadas transitoriamente com o construto indicado e após 48 horas a expressão e a especificidade do antígeno foram medidas por coloração citométrica de fluxo com mAbs anti-ΔNGFR e tetrâmeros HLA- A2. A & B mostram gráficos de pontos para construtos que mantêm ou não a capacidade de se ligarem ao HLA-A2, respectivamente. Os dados são representativos de dois experimentos independentes.

[035] Figura 3. Comparação da força de ligação de anti-HLA-A2 CAR humanizado. As células 293T foram transfectadas com os construtos CAR anti-HLA-A2 humanizados indicados e corados com as diluições indicadas do tetrâmero HLA-A2. A, B e C mostram gráficos que representam a intensidade geométrica média de fluorescência da ligação do tetrâmero HLA-A2 dentro de Células ΔNGFR+, com construtos agrupados de acordo com o uso da cadeia leve.

[036] Figura 4. Expressão e especificidade de CARs anti-HLA-A2 humanizados em Tregs. Tregs CD4+CD25hiCD127lo foram ativadas, um dia depois transduzidas com o vírus lenti indicado, e depois deixados para a expansão. Sete dias após a ativação, as células que expressam ΔNGFR foram selecionadas por separação baseada em grânulos magnéticos. A eficiência da transdução e a ligação ao HLA-A2 foram determinadas por citometria de fluxo antes e após a separação das células ΔNGFR + (A, B, C e D). Os números representam a proporção de Células ΔNGFR+tetrâmero+. Os dados são representativos de experimentos independentes. (E) Dados resumidos do percentual ou intensidade média de fluorescência da ligação do tetrâmero A*02:01.

[037] Figura 5. Ativação de Tregs mediada por CAR HLA-A2. Tregs CD4+CD25hiCD127lo foram ativadas, transduzidas com o lentivírus indicado e deixadas para a expansão. Após 7 dias, as Tregs foram repousadas com 100U/mL de IL-2 durante a noite e depois deixadas sem estímulos ou estimuladas pela co-cultura com uma proporção 2:1 (Tregs: Células K562) de células CD64-K562 carregadas com anti-CD3/28 (TCR) ou células HLA-A2-K562 (CAR). Após 24 horas, a expressão de CD69, CD154, CTLA-4 e LAP foi medida por citometria de fluxo em células CD4+ vivas. (A e B) mostram histogramas representativos e (C e D) mostram dados médios de dois experimentos independentes (E) ΔNGFR controle/Tregs CAR foram co-cultivadas com uma proporção 2:1 (Tregs: K562) de células K562 que expressam HLA-A2. Após 16 horas, a expressão de CD69, CD71, CTLA-4 e LAP foi medida por citometria de fluxo. O percentual positivo e o aumento em múltiplos superior à expressão de linha de base (sem K562) de CD69 e CD71. (F) O percentual positivo e o aumento em múltiplos em relação à expressão basal (sem K562) de CTLA-4 e LAP. Os dados são n = 2-4 para cada construto de pelo menos dois experimentos independentes. ANOVA unidirecional e pós-teste de Holm-Sidak comparando todos os construtos com Tregs mA2-

CAR. Média ± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.

[038] Figura 6. Determinação da reatividade cruzada de CARs anti-HLA-A2 humanizados com variantes alélicas comuns de HLA-A e HLA-B. (A) mostra o diagrama esquemático da configuração experimental e da estratégia de identificação ("gating") para o ensaio de células FlowPRT.

Tregs ΔNGFR+ que expressam os CAR humanizados indicados foram incubadas com grânulos de antígeno reativo de painel de fluxo único e um corante de viabilidade fixável por 30 minutos em temperatura ambiente. As amostras foram então lavadas, fixadas e analisadas por citometria de fluxo. (B) Ligação a grânulos revestidos com HLA-A*02: 01 para cada Treg m/hA2- CAR em relação à ligação de uma Treg ΔNGFR de controle. (C e D) Correlação entre a média da ligação HLA-A*02: 01 medida pelo ensaio celular FlowPRT e (C) MFI de HLA-A*02:01- tetrâmero avaliado por citometria de fluxo ou (D) o aumento de proporção de células CD69+ 16h após a co-cultura com células HLA-A*02:01 versus células K562 HLA-A*24:01 de controle negativo. Os dados em E, F, G e H mostram o percentual de ligação em relação às Tregs de controle que expressam apenas NGFR truncado, normalizado para o número de grânulos negativas para HLA coletadas pelo citômetro. Os pontos de dados acima da área cinza sombreada (E, F e G) ou da linha pontilhada horizontal (H) representam valores que foram mais de dois desvios-padrão da média do controle somente de grânulos e, portanto, estatisticamente significativos (p <0,05). Os dados são a média de três experimentos independentes. I) ΔNGFR ou Tregs m/hA2-CAR foram co-cultivadas com as células K562 indicadas transduzidas para expressar alelos HLA-A selecionados. Após 16 horas, a expressão de CD69, CD71, LAP e CTLA-4 foi medida em células T CD4+ vivas. n = 2-6 de pelo menos 2 experimentos independentes. Significância estatística determinada pelo ANOVA de uma via e pós-teste de Holm-Sidak em comparação ao mA2-CAR. média ± SEM, ** p <0,01.

[039] Figura 7. Tregs que expressam um CAR HLA-A2 humanizado suprimem potentemente a proliferação de células T estimulada por células dendríticas HLA-A2+. (A) Diagrama esquemático da configuração do experimento. As células dendríticas HLA-A2+ amadurecidas foram usadas para estimular com células T CD4+ “respodentes” HLA-A2neg marcadas corante de proliferação de célula (CPD) e450. Tregs marcadas com CPD-e660 que não foram transduzidas ou transduzidas com uma codificação de lentivírus de controle ΔNGFR, ou Tregs expressando A2 CAR humanizados. (B, C, D e E) As proporções indicadas de células foram co-cultivadas por seis dias; em seguida, a quantidade de proliferação das células T CD4+ respondentes marcadas com CPD-e450 foi medida por citometria de fluxo. B mostra gráficos de pontos representativos e C,

D e E mostram dados em gráficos para múltiplas proporções de células. C, D e E mostram dados médios para n = 3-7 de pelo menos três experimentos independentes. As estatísticas foram realizadas usando uma ANOVA de duas vias com pós-teste de Holm-Sidak versus Treg ΔNGFR de controle.*p <0,05, média ± SEM.

[040] Figura 8. Tregs que expressam um CAR HLA-A2 humanizado suprimem potentemente a doença xenogênica do enxerto contra o hospedeiro. Camundongos NSG irradiados foram injetados com PBS (n = 3), 8 x 106 PBMCs HLA-A2+ sozinhas (n = 5) ou com 4 x 106 Tregs expressando H1k2 CAR (n = 6). O enxerto de células humanas no sangue foi monitorado a cada 7 dias. (A) Curva de sobrevivência e (B) percentual de alteração de peso em relação ao início do experimento. (C) Proporção do total de células mononucleares (singletos vivos) que expressam CD45 humano no sangue. (D) Estratégia de gating para discriminar o enxerto geral de células Treg CD45+ e CAR humanas (hCD45+hCD4+HLA-A2-). (E) Enxerto celular in vivo após transferência adotiva em um modelo de camundongo GVHD xenogênico, como mostrado pelo número absoluto de enxerto de PBMC e CAR Treg por µL de sangue ao longo do tempo. O número de PBMC foi calculado como hCD45+ menos a contagem total de CAR Treg, como indentificada ("gated") em D.

[041] Figura 9. Expressão de CARs m/hA2 confere às Tregs um retorno rápido e persistente aos aloenxertos de pele HLA-A2:01+. As Tregs foram co-transduzidas com lentivírus que codifica luciferase e um controle HER2-CAR, mA2-CAR ou hA2-CAR (H1k2). As células transduzidas duplas foram classificadas por FACS, expandidas por 5 dias e depois injetadas em camundongos NSG que haviam sido transplantados previamente com transplantes de pele justapostos de camundongos transgênicos NSG e NSG-HLA-A*02:01. (A) Representação esquemática da configuração experimental. (B) Imagem representativa da luciferase de enxertos de pele (esquerda) 72 horas ou (direita) 21 dias após a injeção de Treg. A quantidade de radiação da luciferase foi quantificada usando a quantidade média de fótons/s/cm2/esteradiana e plotada como uma proporção entre (C) os enxertos de pele HLA-A*02:01-NSG e NSG 72 horas após a injeção de Treg ou (D) ao longo do tempo. n = 2-3 por grupo de três experimentos independentes, média ± SEM. Medidas repetidas ANOVA com correção de Bonferroni.

[042] Figura 10. Rastreamento citométrico de fluxo de Tregs CAR m/hA2 com retorno rápido e persistente aos aloenxertos de pele HLA-A2:01+. As Tregs foram co- transduzidas com lentivírus contendo luciferase e os construtos HER2-CAR, mA2-CAR ou hA2-CAR, expandidos e injetados em camundongos NSG transplantados, como mostrado na Figura 9. (A) A pré-identificação para gráficos de citometria de fluxo foi baseado em células do baço do HER2- CAR de controle. (B) perfil de citometria de fluxo hCD4/hCD8 para os construtos indicados. Os gráficos foram pré- identificados ("pre-gated") em FvD-hCD45+ como em (A). (C) Gráficos de citometria de fluxo mostrando coloração para Tregs m/hA2-CAR no baço e drenando linfonodo no desfecho do experimento n = 1 por grupo de um experimento independente.*p < 0,05.

[043] Figura 11. hA2-CAR-Tregs diminuem a rejeição de aloenxerto de pele humana. Os camundongos NSG foram transplantados com pele humana HLA-A*02:01+ e injetados três semanas depois com: PBS (n = 3); PBMCs HLA-A*02:01neg isoladas (n = 4) ou com uma proporção de 2:1 de Tregs H1k2 CAR autólogas (n = 6). As Tregs PBMC/hA2-CAR foram de dois doadores individuais, testados em um experimento. (A) O peso corporal foi monitorado três vezes por semana e (B) a proporção de células CD45+ humanas no sangue (esquerda) e baço (direita) foi medida no desfecho experimental. (C) A pontuação histológica cumulativa das seções de pele transplantadas, conforme determinado pela coloração de H&E.

(D) Os enxertos de pele transplantados foram imunocorados no desfecho do experimento para quantificar a quantidade de expressão de involucrin e a proporção de células Ki-67+ na epiderme. (E) A expressão de mRNA dos genes indicados dentro das seções de pele transplantadas foi determinada por qRT- PCR. (F) Os enxertos de pele transplantados foram imunocorados no desfecho do experimento para quantificar a proporção de células FOXP3+ nas células CD45+ humanas. (G) Enxertos de pele, intestino, pulmão e fígado transplantados foram imunocorados no desfecho do experimento para mostrar a proporção de células FOXP3+ nas células CD45+ humanas em cada tecido. Cada ponto de dados representa um camundongo.

Os gráficos de box-whisker mostram média ± faixa. A significância estatística determinada pelo teste de Mann- Whitney bicaudal comparando PBMC com H1k2. * p < 0,05.

[044] Figura 12: Rastreamento citométrico de fluxo de Tregs CAR hA2 no sangue no modelo de transplante de pele humana. Os camundongos NSG foram transplantados com pele HLA-A*02+ humana e injetados com células, conforme descrito na Figura 11. (A) Estratégia de gating para discriminar o enxerto de células CD45+ (PBMC) e CAR Treg (hCD45+hCD4+NGFR+) global humano. (B) Número absoluto de PBMCs e enxerto CAR Treg por µL de sangue ao longo do tempo. O número de PBMCs foi calculado como hCD45+ menos a contagem total de CAR Treg, conforme indentificados em (A).

[045] Figura 13: Ativação de Tregs hA2 CAR usando células apresentadoras de antígeno artificiais. As Tregs ΔNGFR/CAR de controle foram co-cultivados por 16 horas sem estimulação ou com uma proporção 2: 1 (Tregs: K562) de células K562 que expressam CD64 carregadas com anticorpos monoclonais anti-CD3 e anti-CD28 (estimulação por TCR). (A) Exemplo de estratégia de gating. (B) A expressão de CD69, CD71, CTLA-4 e LAP foi medida por citometria de fluxo (esquerda). O aumento em múltiplos de cada marcador de ativação sobre a linha de base (sem estimulação) foi calculado (à direita). Os dados são n = 2-4 para cada construto de pelo menos dois experimentos independentes.

Média ± SEM. A ANOVA unidirecional e as comparações múltiplas de Holm-Sidak testam a comparação de todos os construtos com os Tregs mA2-CAR. * p < 0,05, ** p < 0,01, **** p < 0,0001.

DESCRIÇÃO DETALHADA I. TÉCNICAS GERAIS

[046] A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado de outra forma, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, que estão dentro do conhecimento da técnica. Tais técnicas são explicadas completamente na literatura, como, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, segunda edição (Sambrook et al., 1989); “Oligonucleotide Synthesis” (M. J. Gait, ed., 1984); “Animal Cell Culture” (R. I. Freshney, ed., 1987); “Methods in Enzymology” (Academic Press, Inc.); “Current Protocols in Molecular Biology” (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, e atualizações periódicas); “PCR: The Polymerase Chain

Reaction”, (Mullis et al., Ed., 1994); “A Practical Guide to Molecular Cloning” (Perbal Bernard V., 1988); “Phage Display: A Laboratory Manual” (Barbas et al., 2001).

[047] Deve ser entendido que esta invenção não está limitada às modalidades particulares descritas, pois tais podem, é claro, variar. Também deve ser entendido que a terminologia aqui utilizada é apenas para descrever modalidades particulares, e não se destina a ser limitativa, uma vez que o escopo da presente invenção será limitado apenas pelas reivindicações anexas.

[048] Salvo se definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como comumente entendo por um técnico especialista no assunto ao qual esta invenção pertence.

Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos também possam ser usados na prática ou no teste da presente invenção, os métodos e materiais preferenciais são agora descritos. Um técnico especialista no assunto reconhecerá muitos métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos, que podem ser usados na prática da presente invenção. De fato, a presente invenção não está de forma alguma limitada aos métodos e materiais descritos. Para os fins da presente invenção, os seguintes termos são definidos abaixo. Todas as publicações mencionadas aqui são incorporadas aqui por referência para divulgar e descrever os métodos e/ou materiais relacionados aos quais as publicações são citadas.

No caso de qualquer definição estabelecida entrar em conflito com qualquer documento aqui incorporado por referência, a definição apresentada abaixo prevalecerá.

II. DEFINIÇÕES

[049] Os termos “um” e “uma” se referem a um ou mais do que um objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, “um elemento” significa um elemento ou mais do que um elemento.

[050] O termo “cerca de” quando se refere a um valor mensurável, como uma quantidade, uma duração temporal e semelhantes, deve abranger variações de ± 20% ou, em alguns casos, ± 10%, ou, em alguns casos, ± 5%, ou em alguns casos ± 1% ou em alguns casos ± 0,1% do valor especificado, pois essas variações são apropriadas para executar os métodos divulgados.

[051] Quando é fornecida uma faixa de valores, entende-se que cada valor intermediário, até o décimo da unidade do limite inferior, a menos que o contexto indique claramente o contrário, entre o limite superior e inferior dessa faixa e qualquer outro valor declarado ou interveniente nessa faixa declarada, está abrangida pela invenção. Os limites superior e inferior dessas faixas menores podem ser incluídos independentemente nas faixas menores e também estão incluídos na invenção, sujeitos a qualquer limite especificamente excluído na faixa indicada. Onde a faixa indicada inclui um ou ambos os limites, as faixas excluindo um ou ambos os limites incluídos também são incluídas na invenção.

[052] Os termos “HLA-A2” e “A2”, conforme usados aqui, se referem às proteínas do antígeno leucocitário humano (HLA), incluindo as proteínas da superfície celular, codificadas pela família de alelos HLA-A*02 no lócus HLA-A do complexo genético HLA. As proteínas HLA englobadas pelos termos “HLA-A2” e “A2” incluem proteínas HLA identificadas como pertencentes ao tipo de antígeno HLA-A*02 por teste sorológico ou genotipagem. Nomes adicionais para o tipo de antígeno HLA-A*02 incluem “HLA-A2”, “HLA-A02” e “HLA-A*2”.

Diferentes sistemas de nomes foram desenvolvidos para identificar proteínas HLA codificadas por essa família de alelos, incluindo o sistema de nomes HLA desenvolvido em 2010 pelo Comitê de Fatores do Sistema HLA da OMS. Os termos “HLA-A2” e “A2” se referem às proteínas HLA codificadas por alelos com designações de acordo com este sistema de nomes que começam com “HLA-A*02:”, incluindo, entre outras, designações que começam com “HLA-A*02:01”, “HLA-A*02: 02”, “HLA-A*02:03”, “HLA-A*02:04”, “HLA-A*02:05”, “HLA-A*02:06”, “HLA-A*02:07”, “HLA-A*02:08”, “HLA-A*02:09”, “HLA-A*02:10” e “HLA-A*02:11”. Além dos dígitos numéricos que seguem “HLA-

A*02:”, as designações de alelos também podem conter uma letra maiúscula, incluindo mas não se limitando às letras maiúsculas “P” e “G” (por exemplo, HLA-A*02:01P ou HLA- A*02:01:01G). As designações de alelos que começam com “HLA- A*02:” seguidas por 2, 3 ou 4 dígitos numéricos adicionais podem constituir a designação completa ou uma parte inicial da designação. As designações de alelos podem estar em itálico. Os termos “HLA-A2” e “A2” também se referem às proteínas HLA identificadas com designações que começam com “HLA-A*02:” de acordo com este sistema de nomes, incluindo, entre outras, as designações “HLA-A*02:01”, “HLA-A*02:02”, “HLA-A*02:03”, “HLA-A*02:04”, “HLA-A*02:05”, “HLA-A*02:06”, “HLA-A*02:07”, “HLA-A*02:08”, “HLA-A*02:09”, “HLA-A*02:10” e “HLA-A*02:11”.

[053] Um “subtipo HLA-A”, conforme usado aqui, se refere a uma proteína codificada por um alelo do gene HLA- A.

[054] O termo “HLA-A*03”, conforme usado aqui, se refere às proteínas HLA, incluindo as proteínas da superfície celular, codificadas pela família de alelos HLA-A*03 no lócus HLA-A do complexo genético HLA. As proteínas HLA abrangidas pelo termo “HLA-A*03” incluem proteínas HLA identificadas como pertencentes ao tipo de antígeno HLA-A*03 por teste sorológico ou genotipagem. Nomes adicionais para o tipo de antígeno HLA-A*03 incluem “HLA-A03” e “HLA-A3”. O termo “HLA-

A*03” se refere às proteínas HLA codificadas por alelos com designações de acordo com o sistema de nomes HLA desenvolvido em 2010 pelo Comitê de Fatores do Sistema HLA da OMS, que começam com “HLA-A*03:”, incluindo mas não limitado a designações que começam com “HLA-A*03:01”, “HLA-A*03:02”, “HLA-A*03:04”, “HLA-A*03:05”, “HLA -A*03:06”, “HLA-A*03:07”, “HLA-A*03:08”, “HLA-A*03:09”, “HLA-A*03:10” e “HLA-A*03:12”.

Além dos dígitos numéricos que seguem “HLA-A*03:”, as designações de alelos também podem conter uma letra maiúscula, incluindo, entre outras, letras maiúsculas “P” e “G” (por exemplo, HLA-A*03:01P ou HLA-A*03:01:01G). As designações de alelos que começam com “HLA-A*03:” seguidas por 2, 3 ou 4 dígitos numéricos adicionais podem constituir a designação completa ou uma parte inicial da designação. As designações de alelos podem estar em itálico. O termo “HLA- A*03” também se refere às proteínas HLA identificadas com designações que começam com “HLA-A*03:” de acordo com este sistema de nomes, incluindo, entre outras, as designações “HLA-A*03:01”, “HLA-A*03:02”, “HLA-A*03:04”, “HLA-A*03:05”, “HLA-A*03:06”, “HLA-A*03:07”, “HLA-A*03:08”, “HLA-A*03:09”, “HLA-A*03:10” e “HLA-A*03:12”.

[055] Os termos “HLA-A*25”, “HLA-A25” e “A25”, conforme aqui usados, se referem às proteínas HLA, incluindo as proteínas da superfície celular, codificadas pela família de alelos HLA-A*25 no lócus HLA-A do Complexo do gene HLA.

As proteínas HLA englobadas pelos termos “HLA-A*25”, “HLA-

A25” e “A25” incluem proteínas HLA identificadas como pertencentes ao tipo de antígeno HLA-A*25 por testes sorológicos ou genotipagem.

Nomes adicionais para o tipo de antígeno HLA-A*25 incluem “HLA-A25”. Os termos “HLA-A*25”,

“HLA-A25” e “A25” se referem às proteínas HLA codificadas por alelos com designações de acordo com o sistema de nomes

HLA desenvolvido em 2010 pelo Comitê de Fatores do Sistema

HLA da OMS, que começam com “HLA-A*25:”, incluindo, entre outros, as designações que começam com “HLA-A*25:01”, “HLA-

A*25:02”, “HLA-A*25:03”, “HLA-A*25:04”, “HLA-A*25:05”, “HLA-

A*25:06”, “HLA-A*25:07”, “HLA-A*25:08”, “HLA-A*25:09”, “HLA-

A*25:10” e “HLA-A*25:11”. Além dos dígitos numéricos que seguem “HLA-A*25:”, as designações de alelos também podem conter uma letra maiúscula, incluindo, entre outras, letras maiúsculas “P” e “G” (por exemplo, HLA-A*25:01P ou HLA-

A*25:01:01G). As designações de alelos que começam com “HLA-

A*25:” seguidas de 2, 3 ou 4 dígitos numéricos adicionais podem constituir a designação completa ou uma parte inicial da designação.

As designações de alelos podem estar em itálico.

Os termos “HLA-A*25”, “HLA-A25” e “A25” também se referem às proteínas HLA identificadas com designações que começam com “HLA-A*25:” de acordo com este sistema de nomes,

incluindo mas não limitado a designações “HLA-A*25:01”,

“HLA-A*25:02”, “HLA-A*25:03”, “HLA-A*25:04”, “HLA-A*25:05”,

“HLA-A*25:06”, “HLA-A*25:07”, “HLA-A*25:08”, “HLA-A*25:09”, “HLA-A*25:10” e “HLA-A*25:11”.

[056] Os termos “HLA-A*29”, “HLA-A29” e “A29”, conforme usados aqui, se referem às proteínas HLA, incluindo as proteínas da superfície celular, codificadas pela família de alelos HLA-A*29 no lócus HLA-A do Complexo do gene HLA.

As proteínas HLA englobadas pelos termos “HLA-A*29”, “HLA- A29” e “A29” incluem proteínas HLA identificadas como pertencentes ao tipo de antígeno HLA-A*29 por teste sorológico ou genotipagem. Nomes adicionais para o tipo de antígeno HLA-A*29 incluem “HLA-A29”. Os termos “HLA-A*29”, “HLA-A29” e “A29” se referem às proteínas HLA codificadas por alelos com designações de acordo com o sistema de nomeação HLA desenvolvido em 2010 pelo Comitê de Fatores do Sistema HLA da OMS, que começam com “HLA-A*29:”, incluindo, entre outras, as designações que começam com “HLA-A*29:01”, “HLA-A*29:02”, “HLA-A*29:03”, “HLA-A*29:04”, “HLA-A*29:05”, “HLA-A*29:06”, “HLA-A*29:07”, HLA-A*29:09”, “HLA-A*29:10” e “HLA-A*29:11”. Além dos dígitos numéricos que seguem “HLA- A*29:”, as designações de alelos também podem conter uma letra maiúscula, incluindo mas não se limitando às letras maiúsculas “P” e “G” (por exemplo, HLA-A*29:02P ou HLA- A*29:02:01G). As designações de alelos que começam com “HLA- A*29:” seguidas de 2, 3 ou 4 dígitos numéricos adicionais podem constituir a designação completa ou uma parte inicial da designação. As designações de alelos podem estar em itálico. Os termos “HLA-A*29”, “HLA-A29” e “A29” também se referem às proteínas HLA identificadas com designações que começam com “HLA-A*29:” de acordo com este sistema de nomes, incluindo mas não limitado às designações “HLA-A*29:01”, “HLA-A*29:02”, “HLA-A*29:03”, “HLA-A*29:04”, “HLA-A*29:05”, “HLA-A*29:06”, “HLA-A*29:07”, “HLA-A*29:09”, “HLA-A*29:10” e “HLA-A*29:11”.

[057] Os termos “HLA-A*30”, “HLA-A30” e “A30”, conforme aqui usados, se referem às proteínas HLA, incluindo as proteínas da superfície celular, codificadas pela família de alelos HLA-A*30 no lócus HLA-A do Complexo do gene HLA.

As proteínas HLA englobadas pelos termos “HLA-A*30”, “HLA- A30” e “A30” incluem proteínas HLA identificadas como pertencentes ao tipo de antígeno HLA-A*30 por testes sorológicos ou genotipagem. Nomes adicionais para o tipo de antígeno HLA-A*30 incluem “HLA-A30”. Os termos “HLA-A*30”, “HLA-A30” e “A30” se referem às proteínas HLA codificadas por alelos com designações de acordo com o sistema de nomes HLA desenvolvido em 2010 pelo Comitê de Fatores do Sistema HLA da OMS, que começam com “HLA-A*30:”, incluindo, entre outros, as designações que começam com “HLA-A*30:01”, “HLA- A*30:02”, “HLA-A*30:03”, “HLA-A*30:04”, “HLA-A*30:06”, “HLA- A*30:07”, “HLA-A*30:08”, “HLA-A*30:09”, “HLA-A*30:10” e “HLA-A*30:11”. Além dos dígitos numéricos que seguem “HLA-

A*30:”, as designações de alelos também podem conter uma letra maiúscula, incluindo mas não se limitando às letras maiúsculas “P” e “G” (por exemplo, HLA-A*30:01P, HLA- A*30:02P, HLA-A*30:04P, HLA-A*30:01:01G, HLA-A*30:02:01G ou HLA-A*30:04:01G). As designações de alelos que começam com “HLA-A*30:”, seguidas por 2, 3 ou 4 dígitos numéricos adicionais, podem constituir a designação completa ou uma parte inicial da designação. As designações de alelos podem estar em itálico. Os termos “HLA-A*30”, “HLA-A30” e “A30” também se referem às proteínas HLA identificadas com designações que começam com “HLA-A*30:” de acordo com este sistema de nomes, incluindo mas não limitado a designações “HLA-A*30:01”, “HLA-A*30:02”, “HLA-A*30:03”, “HLA-A*30:04”, “HLA-A*30:06”, “HLA-A*30:07”, “HLA-A*30:08”, “HLA-A*30:09”, “HLA-A*30:10” e “HLA-A*30:11”.

[058] Os termos “HLA-A*31”, “HLA-A31” e “A31”, conforme usados aqui, se referem às proteínas HLA, incluindo as proteínas da superfície celular, codificadas pela família de alelos HLA-A*31 no lócus HLA-A do Complexo do gene HLA.

As proteínas HLA englobadas pelos termos “HLA-A*31”, “HLA- A31” e “A31” incluem as proteínas HLA identificadas como pertencentes ao tipo de antígeno HLA-A*31 por testes sorológicos ou genotipagem. Nomes adicionais para o tipo de antígeno HLA-A*31 incluem “HLA-A31”. Os termos “HLA-A*31”, “HLA-A31” e “A31” se referem às proteínas HLA codificadas por alelos com designações de acordo com o sistema de nomeação HLA desenvolvido em 2010 pelo Comitê de Fatores do Sistema HLA da OMS, que começam com “HLA-A*31:”, incluindo, entre outros, as designações que começam com “HLA-A*31:01”, “HLA-A*31:02”, “HLA-A*31:03”, “HLA-A*31:04”, “HLA-A*31:05”, “HLA-A*31:06”, “HLA-A*31:07”, “HLA-A*31:08”, “HLA-A*31:09”, “HLA-A*31:10” e “HLA-A*31:11”. Além dos dígitos numéricos que seguem “HLA-A*31:”, as designações de alelos também podem conter uma letra maiúscula, incluindo mas não se limitando às letras maiúsculas “P” e “G” (por exemplo, HLA-A*31:01P ou HLA-A*31:01:02G). As designações de alelos que começam com “HLA-A*31:”, seguidas por 2, 3 ou 4 dígitos numéricos adicionais, podem constituir a designação completa ou uma parte inicial da designação. As designações de alelos podem estar em itálico. Os termos “HLA-A*31”, “HLA-A31” e “A31” também se referem às proteínas HLA identificadas com designações que começam com “HLA-A*31:” de acordo com este sistema de nomes, incluindo, mas não limitado a, designações “HLA-A*31:01”, “HLA-A*31:02”, “HLA-A*31:03”, “HLA-A*31:04”, “HLA-A*31:05”, “HLA-A*31:06”, “HLA-A*31:07”, “HLA-A*31:08”, “HLA-A*31:09”, “HLA-A*31:10” e “HLA-A*31:11”.

[059] Os termos “HLA-A*33”, “HLA-A33” e “A33”, conforme aqui usados, se referem às proteínas HLA, incluindo as proteínas da superfície celular, codificadas pela família de alelos HLA-A*33 no lócus HLA-A do Complexo do gene HLA.

As proteínas HLA englobadas pelos termos “HLA-A*33”, “HLA-

A33” e “A33” incluem as proteínas HLA identificadas como pertencentes ao tipo de antígeno HLA-A*33 por teste sorológico ou genotipagem.

Nomes adicionais para o tipo de antígeno HLA-A*33 incluem “HLA-A33”. Os termos “HLA-A*33”,

“HLA-A33” e “A33” se referem às proteínas HLA codificadas por alelos com designações de acordo com o sistema de nomes

HLA desenvolvido em 2010 pelo Comitê de Fatores do Sistema

HLA da OMS, que começam com “HLA-A*33:”, incluindo, entre outros, as designações que começam com “HLA-A*33:01”, “HLA-

A*33:03”, “HLA-A*33:04”, “HLA-A*33:05”, “HLA-A*33:06”, “HLA-

A*33:07”, “HLA-A*33:08”, “HLA-A*33:09”, “HLA-A*33:10” e

“HLA-A*33:11”. Além dos dígitos numéricos que seguem “HLA-

A*33:”, as designações de alelos também podem conter uma letra maiúscula, incluindo mas não se limitando às letras maiúsculas “P” e “G” (por exemplo, HLA-A*33:01P ou HLA-

A*33:01:01G). As designações de alelos que começam com “HLA-

A*33:”, seguidas por 2, 3 ou 4 dígitos numéricos adicionais,

podem constituir a designação completa ou uma parte inicial da designação.

As designações de alelos podem estar em itálico.

Os termos “HLA-A*33”, “HLA-A33” e “A33” também se referem às proteínas HLA identificadas com designações que começam com “HLA-A*33:” de acordo com este sistema de nomes,

incluindo mas não limitado a designações “HLA-A*33:01”,

“HLA-A*33:03”, “HLA-A*33:04”, “HLA-A*33:05”, “HLA-A*33:06”,

“HLA-A*33:07”, “HLA-A*33:08”, “HLA-A*33:09”, “HLA-A*33:10” e “HLA-A*33:11”.

[060] Os termos “HLA-A*36”, “HLA-A36” e “A36”, conforme aqui usados, se referem às proteínas HLA, incluindo as proteínas da superfície celular, codificadas pela família de alelos HLA-A*36 no lócus HLA-A do Complexo do gene HLA.

As proteínas HLA englobadas pelos termos “HLA-A*36”, “HLA- A36” e “A36” incluem proteínas HLA identificadas como pertencentes ao tipo de antígeno HLA-A*36 por teste sorológico ou genotipagem. Nomes adicionais para o tipo de antígeno HLA-A*36 incluem “HLA-A36”. Os termos “HLA-A*36”, “HLA-A36” e “A36” se referem às proteínas HLA codificadas por alelos com designações de acordo com o sistema de nomeação HLA desenvolvido em 2010 pelo Comitê de Fatores do Sistema HLA da OMS, que começam com “HLA-A*36:”, incluindo, entre outros, as designações que começam com “HLA-A*36:01”, “HLA-A*36:02”, “HLA-A*36:03”, “HLA-A*36:04”e “HLA-A*36:05”.

Além dos dígitos numéricos que seguem “HLA-A*36:”, as designações de alelo também podem conter uma letra maiúscula, incluindo, mas não se limitando às letras maiúsculas “P” e “G”. As designações de alelos que começam com “HLA-A*36:”, seguidas de 2, 3 ou 4 dígitos numéricos adicionais, podem constituir a designação completa ou uma parte inicial da designação. As designações de alelos podem estar em itálico.

Os termos “HLA-A*36”, “HLA-A36” e “A36” também se referem às proteínas HLA identificadas com designações que começam com “HLA-A*36:” de acordo com este sistema de nomes, incluindo, mas não limitado a, designações “HLA-A*36:01”, “HLA- A*36:02”, “HLA-A*36:03”, “HLA-A*36:04”, “HLA-A*36:05” e “HLA-A*36:06”.

[061] Os termos “HLA-A*68”, “HLA-A68” e “A68”, conforme usados aqui, se referem às proteínas HLA, incluindo as proteínas da superfície celular, codificadas pela família de alelos HLA-A*68 no lócus HLA-A do Complexo do gene HLA.

As proteínas HLA englobadas pelos termos “HLA-A*68”, “HLA- A68” e “A68” incluem as proteínas HLA identificadas como pertencentes ao tipo de antígeno HLA-A*68 por teste sorológico ou genotipagem. Nomes adicionais para o tipo de antígeno HLA-A*68 incluem “HLA-A68”. Os termos “HLA-A*68”, “HLA-A68” e “A68” se referem às proteínas HLA codificadas por alelos com designações de acordo com o sistema de nomes HLA desenvolvido em 2010 pelo Comitê de Fatores do Sistema HLA da OMS, que começam com “HLA-A*68:”, incluindo, entre outros, as designações que começam com “HLA-A*68:01”, “HLA- A*68:02”, “HLA-A*68:03”, “HLA-A*68:04”, “HLA-A*68:05”, “HLA- A*68:06”, “HLA-A*68:07”, “HLA-A*68:08”, “HLA-A*68:09”e “HLA- A*68:10” . Além dos dígitos numéricos que seguem “HLA-A*68:”, as designações de alelos também podem conter uma letra maiúscula, incluindo mas não se limitando às letras maiúsculas “P” e “G” (por exemplo, HLA-A*68:01P, HLA-

A*68:01:01G ou HLA-A*68:01:02G). As designações de alelos que começam com “HLA-A*68:” seguidas por 2, 3 ou 4 dígitos numéricos adicionais podem constituir a designação completa ou uma parte inicial da designação. As designações de alelos podem estar em itálico. Os termos “HLA-A*68”, “HLA-A68” e “A68” também se referem às proteínas HLA identificadas com designações que começam com “HLA-A*68:” de acordo com este sistema de nomes, incluindo mas não limitado a designações “HLA-A*68:01”, “HLA-A*68:02”, “HLA-A*68:03”, “HLA-A*68:04”, “HLA-A*68:05”, “HLA-A*68:06”, “HLA-A*68:07”, “HLA-A*68:08”, “HLA-A*68:09” e “HLA-A*68:10”.

[062] As proteínas HLA específicas podem ser referidas aqui usando designações de proteínas de acordo com o sistema de nomeação HLA desenvolvido em 2010 pelo Comitê de Fatores do Sistema HLA da OMS. Por exemplo, o termo “HLA- A*02:01”, conforme usado aqui, se refere a uma proteína HLA com a designação “HLA-A*02:01” de acordo com este sistema de nomeação. Da mesma forma, os termos “HLA-A*03:01”, “HLA- A*25:01”, “HLA-A*29:02”, “HLA-A*30:01”, “HLA-A*31:01”, “HLA- A*33:01”, “HLA-A*36:01” e “HLA-A*68:01” se referem às proteínas HLA com as designações “HLA-A*03:01”, “HLA- A*25:01”, “HLA-A*29:02”, “HLA-A*30:01”, “HLA-A*31:01”, “HLA- A*33:01”, “HLA-A*36:01” e “HLA-A*68:01”, respectivamente.

[063] O termo “anticorpo anti-HLA-A2”, conforme usado aqui, se refere a um anticorpo que preferencialmente ou especificamente se liga ao HLA-A2.

[064] O termo “BB7.2”, conforme usado aqui, se refere a um hibridoma murino identificado como Depósito ATCC HB-82. As células de hibridoma BB7.2 secretam um anticorpo monoclonal murino do isotipo IgG2b capa, que foi caracterizado por Parham, P. et al. e Hilton et al. (Parham, P. et al., 1981; Hilton et al., 2013). As sequências de aminoácidos das seis regiões determinantes da complementaridade (CDRs) do anticorpo monoclonal secretadas por BB7.2 são as seguintes: CDR1 de cadeia pesada (HCDR1): SYHIQ (SEQ ID NO: 183); CDR2 de cadeia pesada (HCDR2): WIYPGDGSTQYNEKFKG (SEQ ID NO: 185); CDR3 de cadeia pesada (HCDR3): EGTYYAMDY (SEQ ID NO: 187); CDR1 de cadeia leve (LCDR1): RSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO: 188); CDR2 de cadeia leve (LCDR2): KVSNRFS (SEQ ID NO: 189); CDR3 de cadeia leve (LCDR3): FQGSHVPRT (SEQ ID NO: 190).

[065] Como usado aqui, um “anticorpo BB7.2” é um anticorpo que possui o VH (SEQ ID NO: 191) e VL (SEQ ID NO: 192) do anticorpo monoclonal secretado por BB7.2. Um anticorpo BB7.2 pode ser um anticorpo completo ou um fragmento do mesmo tendo o VH e VL do anticorpo monoclonal secretado por BB7.2, tal como um scFv possuindo o VH e VL do anticorpo monoclonal secretado por BB7.2.

[066] Os termos “anticorpos” e “imunoglobulina” incluem anticorpos ou imunoglobulinas de qualquer isotipo, fragmentos de anticorpos que retêm ligação específica ao antígeno, incluindo, mas não se limitando a, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, Fd, diacorpos, anticorpos de domínio único (sdAbs), anticorpos lineares, moléculas de anticorpo de cadeia única e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos de cadeia única e proteínas de fusão que compreendem uma porção de uma ligação de antígeno de um anticorpo e uma proteína não anticorpo.

[067] Os anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais, de cadeia múltipla ou única ou imunoglobulinas intactas e podem ser derivados de fontes naturais ou de fontes recombinantes. Os anticorpos podem ser tetrâmeros de moléculas de imunoglobulina. A unidade básica de anticorpos de 4 cadeias é uma glicoproteína heterotetramérica composta por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. No caso de IgGs, a unidade de 4 cadeias é geralmente de cerca de 150.000 daltons. Cada cadeia L está ligada a uma cadeia H por uma ligação dissulfeto covalente, enquanto as duas cadeias H são ligadas uma à outra por uma ou mais ligações dissulfeto, dependendo do isotipo da cadeia

H.

Cada cadeia H e L também possui pontes dissulfeto intracadeias regularmente espaçadas.

Cada cadeia H tem no terminal N, um domínio variável (VH) seguido por três domínios constantes (CH) para cada uma das cadeias α e γ e quatro domínios CH para os isotipos µ e ε.

Cada cadeia L tem no terminal N, um domínio variável (VL) seguido por um domínio constante (CL) na sua outra extremidade.

O VL está alinhado com o VH e o CL está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada (CH1). Acredita-se que resíduos particulares de aminoácidos formam uma interface entre os domínios variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada.

O emparelhamento de um VH e VL juntos forma um único sítio de ligação ao antígeno.

Para a estrutura e as propriedades das diferentes classes de anticorpos, ver, por exemplo, Basic and Clinical Immunology, 8ª edição, Daniel P.

Stites, Abba

I.

Terr e Tristram G.

Parslow (eds.), Appleton & Lange,

Norwalk, CT., 1994, página 71 e capítulo 6. A cadeia L de qualquer espécie de vertebrado pode ser atribuída a um dos dois tipos claramente distintos, chamados capa e lambda, com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes.

Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas (CH), as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes ou isotipos.

As cinco classes de imunoglobulinas: IgA, IgD,

IgE, IgG e IgM têm cadeias pesadas designadas α, δ, ε, γ e µ, respectivamente. As classes γ e α são divididas em subclasses com base em diferenças relativamente pequenas na sequência e na função CH, por exemplo, os seres humanos expressam as seguintes subclasses: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2.

[068] A “região variável” ou “domínio variável” de um anticorpo se refere aos domínios amino-terminais da cadeia pesada ou leve do anticorpo. O domínio variável da cadeia pesada pode ser referido como “VH”, “VH” ou “H”. O domínio variável da cadeia leve pode ser referido como “VL”, “VL” ou “L”. Esses domínios são geralmente as partes mais variáveis de um anticorpo e contêm os sítios de ligação ao antígeno.

[069] O termo “variável” se refere ao fato de que certos segmentos dos domínios variáveis diferem extensivamente em sequência entre os anticorpos. O domínio V media a ligação ao antígeno e define a especificidade de um anticorpo específico para seu antígeno específico. No entanto, a variabilidade não é distribuída uniformemente na faixa de 110 a 130 aminoácidos dos domínios variáveis. Em vez disso, as regiões V consistem em trechos relativamente invariantes chamadas regiões estruturais (FRs) de 15 a 30 aminoácidos separados por regiões mais curtas de extrema variabilidade chamadas “regiões hipervariáveis”, com 9 a 12 aminoácidos. Os domínios variáveis das cadeias pesada e leve nativas compreendem quatro FRs, adotando amplamente uma configuração de folha β, conectada por três regiões hipervariáveis, que formam laços conectando e, em alguns casos, formando parte da estrutura da folha β. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas nas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação ao antígeno dos anticorpos (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)).

[070] Um anticorpo “intacto” é aquele que compreende um sítio de ligação ao antígeno, bem como um CL e pelo menos domínios constantes da cadeia pesada, CH1, CH2 e CH3. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo, domínios constantes de sequência nativa humana) ou as variantes dos mesmos de sequência de aminoácidos. Em uma modalidade, o anticorpo intacto pode ter uma ou mais funções efetoras.

[071] O termo “fragmento de anticorpo” se refere a pelo menos uma porção de um anticorpo intacto, ou variantes recombinantes, e se refere ao domínio de ligação ao antígeno, por exemplo, uma região variável determinante antigênica de um anticorpo intacto, que é suficiente para conferir reconhecimento e ligação específica do fragmento de anticorpo a um alvo, como um antígeno. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, fragmentos scFv; diabetes; diacorpos, anticorpos de domínio único (sdAbs); anticorpos lineares (ver Patente U.S. No.

5.641.870, Exemplo 2; Zapata et al., Protein Eng. 8 (10): 1057-1062 [1995]); moléculas de anticorpo de cadeia única; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo. Em uma modalidade, um fragmento de anticorpo compreende um sítio de ligação ao antígeno do anticorpo intacto e, portanto, retém a capacidade de se ligar ao antígeno. Também estão incluídos entre os fragmentos de anticorpo anti-HLA-A2 frações de anticorpos anti-HLA-A2 (e combinações de frações de anticorpos anti-HLA-A2, por exemplo, scFv) que podem ser usadas como braços de direcionamento, direcionados a um antígeno HLA-A2, em receptores antigênicos quiméricos de células imunológicas modificadas por CAR. Tais fragmentos não são necessariamente fragmentos proteolíticos, mas partes das sequências polipeptídicas que podem conferir afinidade a um alvo. Ainda incluídos entre os fragmentos de anticorpo anti-HLA-A2 estão os anticorpos de domínio único (sdAbs) (ver, por exemplo, Li et al. (2017); Jamnani et al. (2014)). Tais anticorpos de domínio único podem ser usados como braços de direcionamento nas células imunológicas modificadas por CAR da presente invenção.

[072] A digestão de anticorpos por papaína produz dois fragmentos idênticos de ligação ao antígeno, chamados fragmentos “Fab” e um fragmento residual “Fc”, uma designação que reflete a capacidade de cristalizar rapidamente. O fragmento Fab consiste em uma cadeia L inteira, juntamente com o domínio da região variável da cadeia H (VH) e o primeiro domínio constante de uma cadeia pesada (CH1). Cada fragmento Fab é monovalente em relação à ligação ao antígeno, ou seja, possui um único sítio de ligação ao antígeno. O tratamento com pepsina de um anticorpo produz um único fragmento F(ab')2 grande que corresponde aproximadamente a dois fragmentos Fab ligados a dissulfeto tendo atividade de ligação ao antígeno bivalente e ainda é capaz de reticulação de antígeno. Os fragmentos Fab’ diferem dos fragmentos Fab por possuírem poucos resíduos adicionais no terminal carboxi do domínio CH1, incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab'-SH é a designação aqui para Fab’ na qual os resíduos de cisteína dos domínios constantes têm um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F (ab')2 foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab' que possuem cisteínas em dobradiça entre eles. Também são conhecidos outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos.

[073] O fragmento Fc compreende as frações carboxi-terminais de ambas as cadeias H mantidas juntas por dissulfetos. As funções efetoras dos anticorpos são determinadas por sequências na região Fc, região essa que também é a parte reconhecida pelos receptores Fc (FcR) encontrados em certos tipos de células.

[074] “Fv” é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio completo de reconhecimento e ligação de antígeno. Este fragmento consiste em um dímero de um domínio de região variável de cadeia pesada e um domínio de região variável de cadeia leve em associação estreita e não covalente. Em uma espécie de Fv de cadeia única (scFv), um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve podem ser ligados covalentemente por um ligante peptídico flexível, de modo que as cadeias leve e pesada possam se associar em uma estrutura “dimérica” análoga àquela em uma espécie de Fv de duas cadeias. A partir da dobra desses dois domínios emanam seis alças hipervariáveis (3 alças cada uma das cadeia H e L) que contribuem com os resíduos de aminoácidos para a ligação ao antígeno e conferem especificidade à ligação ao antígeno no anticorpo. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três CDRs específicas para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e ligar o antígeno, embora com uma afinidade mais baixa do que todo o sítio de ligação.

[075] “Fv de cadeia única” também abreviado como “sFv” ou “scFv” são fragmentos de anticorpo que compreendem os domínios de anticorpo VH e VL conectados a uma única cadeia polipeptídica. O polipeptídeo scFv pode compreender ainda um ligante de peptídeo entre os domínios VH e VL que permitem que o scFv forme a estrutura desejada para a ligação ao antígeno. A menos que especificado, como usado aqui, um scFv pode ter as regiões variáveis VL e VH em qualquer ordem, por exemplo, com relação às extremidades do terminal N e do terminal C do polipeptídeo, o scFv pode compreender VL- ligante-VH ou pode compreender VH-ligante-VL. Para uma revisão do scFv, ver Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore, Springer-Verlag, Nova Iorque, pp. 269-315 (1994); Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, Oxford University Press, Nova Iorque (1995). Em uma modalidade, um scFv derivado de anticorpo anti-HLA-A2 pode ser usado como o braços de direcionamento de uma célula imunológica modificada por CAR aqui divulgada.

[076] O termo “adnectina”, também conhecido como monobody, é bem conhecido na técnica e se refere às proteínas modificadas para se ligar com alta afinidade e especificidade aos antígenos. Eles pertencem à classe de moléculas coletivamente chamadas “miméticas de anticorpos”.

[077] O termo “alfacorpo”, se refere a Alfabodies que penetram na célula, se refere a um tipo de mimético de anticorpos que consiste em pequenas proteínas de 10 kDa modificadas para se ligar a uma variedade de antígenos. Os alfabodies são capazes de alcançar e se ligar aos alvos de proteínas intracelulares.

[078] O termo “afficorpo” é bem conhecido na técnica e se refere às proteínas de afinidade baseadas em um domínio de proteína de 58 resíduos de aminoácidos, derivado de um dos domínios de ligação à IgG da proteína estafilocócica A.

[079] O termo “anticalina” é bem conhecido na técnica e se refere a uma tecnologia mimética de anticorpos, em que a especificidade de ligação é derivada da lipocalina.

Anticalin também pode ser formatada como proteína de duplo direcionamento, chamada Duocalina.

[080] O termo “estrutura à base de proteína de repetição armadillo” se refere a um tipo de miméticos de anticorpos correspondentes às estruturas de ligação aos peptídeos artificiais baseados em proteínas de repetição armadillo. As proteínas de repetição armadillo são caracterizadas por um domínio armadillo, composto por repetições em tandem de aproximadamente 42 aminoácidos, que medeiam as interações com os peptídeos ou com as proteínas.

[081] O termo “avímeros” é bem conhecido na técnica e se refere a uma tecnologia mimética de anticorpos. O termo “DARPins” (Proteínas de Repetição de Anquirina Modificadas) é bem conhecido na técnica e se refere a uma tecnologia de DRP mimética de anticorpos (proteína de repetição projetada)

desenvolvida para explorar as habilidades de ligação de polipeptídeos que não são anticorpos.

[082] O termo “diacorpos” se refere aos pequenos fragmentos de anticorpos preparados pela construção de fragmentos de scFv com ligantes curtos (cerca de 5 a 10 resíduos) entre os domínios VH e VL, de modo que o emparelhamento inter-cadeia, mas não intra-cadeia, dos domínios V é alcançado, resultando em um fragmento bivalente, isto é, fragmento com dois sítios de ligação ao antígeno.

Diacorpos biespecíficos são heterodímeros de dois fragmentos scFv “cruzados” nos quais os domínios VH e VL dos dois anticorpos estão presentes em diferentes cadeias polipeptídicas. Os diacorpos são descritos mais detalhadamente em, por exemplo, EP 0404097; WO 93/11161; e Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

[083] O termo “evasina” é bem conhecido na técnica e se refere a uma classe de proteínas de ligação à quimiocina.

[084] O termo “finômero” é bem conhecido na técnica e se refere às proteínas que pertencem à classe de miméticos de anticorpos. São moléculas de ligação atraentes devido à sua alta estabilidade térmica e imunogenicidade reduzida.

[085] O termo “knottin” (que também pode ser referido como inibidor de não cistina) se refere a um anticorpo mimético compreendendo um motivo estrutural de proteína contendo três pontes dissulfeto.

[086] O termo “peptídeo do domínio kunitz” se refere a um tipo de miméticos de anticorpos e é baseado nos domínios ativos das proteínas que inibem a função das proteases.

[087] O termo “nanocorpo” é bem conhecido na técnica e se refere a uma proteína terapêutica derivada de anticorpo que contém as propriedades estruturais e funcionais únicas dos anticorpos de cadeia pesada de ocorrência natural. Esses anticorpos da cadeia pesada contêm um único domínio variável (VHH) e dois domínios constantes (CH2 e CH3).

[088] O termo “unicorpo” é bem conhecido na técnica e se refere a um fragmento de anticorpo sem a região de dobradiça dos anticorpos IgG4. A deleção da região de dobradiça resulta em uma molécula que é essencialmente metade do tamanho dos anticorpos IgG4 tradicionais e tem uma região de ligação univalente ao invés da região de ligação bivalente dos anticorpos IgG4.

[089] O termo “versacorpo” é bem conhecido na técnica e se refere a outra tecnologia mimética de anticorpos. São pequenas proteínas de 3-5 kDa com cisteínas > 15%, que formam uma estrutura de alta densidade de dissulfeto, substituindo o núcleo hidrofóbico das proteínas típicas.

[090] O termo “ligante polipeptídico flexível” ou “ligante”, conforme usado no contexto de um scFv, se refere a um ligante peptídico que consiste em aminoácidos, como resíduos de glicina e/ou serina usados isoladamente ou em combinação, para ligar variáveis pesadas e variáveis regiões de cadeia leve variável e pesada variável juntas. Em uma modalidade, o ligante polipeptídico flexível é um ligante Gly/Ser e compreende a sequência de aminoácidos (Gly-Gly- Gly-Ser)n, em que n é um número inteiro positivo igual ou superior a 1. Por exemplo, n = 1, n = 2, n = 3, n = 4, n = 5, n = 6, n = 7, n = 8, n = 9 e n = 10. Em outra modalidade, o ligante polipeptídico flexível é um ligante Gly/Ser e compreende a sequência de aminoácidos (Gly-Gly-Gly-Gly- Ser)n, em que n é um número inteiro positivo igual ou superior a 1. Por exemplo, n = 1, n = 2, n = 3, n = 4, n = 5, n = 6, n = 7, n = 8, n = 9 e n = 10. Em uma modalidade, os ligantes polipeptídicos flexíveis incluem, mas não estão limitados a (Gly4 Ser)4 ou (Gly4 Ser)3. Em outra modalidade, os ligantes incluem várias repetições de (Gly2Ser), (GlySer) ou (Gly3Ser). Também estão incluídos no escopo da invenção os ligantes descritos em WO2012/138475, aqui incorporados por referência).

[091] O termo “cadeia pesada” se refere ao maior dos dois tipos de cadeias polipeptídicas presentes nas moléculas de anticorpo em suas conformações que ocorrem naturalmente e que normalmente determina a classe à qual o anticorpo pertence.

[092] O termo “cadeia leve” se refere ao menor dos dois tipos de cadeias polipeptídicas presentes nas moléculas de anticorpo em suas conformações que ocorrem naturalmente.

As cadeias leves capa (κ) e lambda (λ) se referem aos dois principais isotipos de cadeia leve de anticorpos.

[093] O termo “região hipervariável”, “HVR” ou “HV”, quando usado aqui, se refere às regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis em sequência e/ou formam loops estruturalmente definidos. Geralmente, os anticorpos compreendem seis regiões hipervariáveis; três no VH (H1, H2, H3) e três no VL (L1, L2, L3). Um número de delimitações de regiões hipervariáveis estão em uso e são aqui abrangidas. As regiões determinantes da complementaridade de Kabat (CDRs) são baseadas na variabilidade da sequência e são as mais usadas (Kabat et al., 1991). Chothia se refere, em vez disso, à localização dos loops estruturais (Chothia et al., 1987). O final do loop Chothia CDR-H1 quando numerado usando a convenção de numeração de Kabat varia entre H32 e H34, dependendo do comprimento do loop (isso ocorre porque o esquema de numeração de Kabat coloca as inserções em H35A e H35B; se nem 35A nem 35B estão presentes, o loop termina em 32; se apenas 35A estiver presente, o loop termina em 33; se ambos 35A e 35B estiverem presentes, o loop termina em 34). As regiões hipervariáveis AbM representam um compromisso entre as CDRs Kabat e os loops estruturais de Chothia e são usadas pelo software de modelagem de anticorpos AbM da Oxford Molecular. As regiões hipervariáveis de “contato” são baseadas em uma análise das estruturas cristalinas complexas disponíveis. Os resíduos de cada uma dessas regiões hipervariáveis são anotados abaixo. Os resíduos de cada uma dessas regiões hipervariáveis são anotados abaixo.

Loop Kabat AbM Chothia Contato ------- -------- ------ ----------- ---------- L1 L24-L34 L24-L34 L24-L34 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L56 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L89-L97 L89-L96 H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32..34 H30-H35B (Numeração de Kabat) H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Numeração Chothia) H2 H50-H65 H50-H58 H52-H56 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H95-H102 H93-H101

[094] Os termos “região hipervariável” e “região determinante da complementaridade” e suas respectivas abreviações (HVR, HV, CDR) são usados aqui de forma intercambiável. Além disso, os seguintes pares de termos também são usados indiferentemente aqui: “VH CDR1” e “HCDR1”; “VH CDR2” e “HCDR2”; “VH CDR3” e “HCDR3”; “VL CDR1” e “LCDR1”; “VL CDR2” e “LCDR2”; e “VL CDR3” e “LCDR3”.

[095] As regiões hipervariáveis podem compreender “regiões hipervariáveis estendidas” da seguinte maneira: 24- 36 ou 24-34 (L1), 46-56 ou 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no VL e 26-35B (H1), 50-65, 47-65 ou 49-65 (H2) e 93-102, 94-102 ou 95-102 (H3) no VH. Os resíduos de domínio variável são numerados de acordo com Kabat et al. (Kabat et al., 1991) para cada uma dessas definições.

[096] Os resíduos “estruturais” ou “FR” são aqueles resíduos de domínio variável que não são os resíduos da região hipervariável aqui definidos.

[097] O termo “numeração de resíduos de domínio variável como em Kabat” ou “numeração de posição de aminoácidos como em Kabat”, e as variações dos mesmo, se refere ao sistema de numeração usado para domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve da compilação de anticorpos em Kabat et al., (Kabat et al.,

1991). Utilizando este sistema de numeração, a sequência linear de aminoácidos real pode conter menos ou mais aminoácidos correspondentes a um encurtamento ou inserção em uma FR ou CDR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável da cadeia pesada pode incluir uma única inserção de aminoácido (resíduo 52a, de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de H2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b e 82c, etc., de acordo com Kabat) após o resíduo FR da cadeia pesada 82 A numeração de resíduos Kabat pode ser determinada para um determinado anticorpo por alinhamento em regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada Kabat “padrão”.

[098] O sistema de numeração de Kabat é geralmente usado quando se refere a um resíduo no domínio variável (aproximadamente resíduos 1-107 da cadeia leve e resíduos 1- 113 da cadeia pesada) (por exemplo, Kabat et al., 1991). O “sistema de numeração da EU” ou “índice da EU” é geralmente usado quando se refere a um resíduo em uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina (por exemplo, o índice da EU relatado em Kabat et al., supra). O “índice de EU como em Kabat” se refere à numeração de resíduos do anticorpo humano IgGl EU. Salvo indicação em contrário, as referências aos números de resíduos no domínio variável de anticorpos significam a numeração de resíduos pelo sistema de numeração de Kabat.

[099] O termo “se liga especificamente” se refere a um ligante (por exemplo, um anticorpo anti-HLA-A2 humanizado) que reconhece e se liga a uma proteína parceira de ligação cognata (por exemplo, HLA-A2) presente em uma amostra, mas cujo ligante não reconhece ou se liga substancialmente às outras moléculas na amostra. A ligação não específica se refere à ligação com uma afinidade inferior a 10-7 M, por exemplo, ligação com uma afinidade de 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, etc.

[100] Um anticorpo que “se liga especificamente” a um antígeno ou epítopo de interesse é aquele que se liga ao antígeno ou epítopo com afinidade suficiente que é mensurável diferente de uma interação não específica. A ligação específica pode ser medida, por exemplo, determinando a ligação de uma molécula em comparação com a ligação de uma molécula de controle.

[101] O termo “anticorpo recombinante” se refere a um anticorpo que é gerado usando a tecnologia de DNA recombinante, como, por exemplo, um anticorpo expresso por um sistema de expressão de bacteriófago ou levedura. O termo também deve ser interpretado como um anticorpo que foi gerado pela síntese de uma molécula de DNA que codifica o anticorpo e qual molécula de DNA expressa uma proteína de anticorpo ou uma sequência de aminoácidos que especifica o anticorpo, em que a sequência de DNA ou de aminoácidos foi obtida usando a tecnologia de sequência de aminoácidos ou DNA recombinante que está disponível e é bem conhecida na técnica.

[102] O termo “anticorpo monoclonal” como aqui usado se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em pequenas quantidades.

Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um sítio antigênico único. Além disso, em contraste às preparações de anticorpo policlonal que incluem os diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante sobre o antígeno. Além de sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos, pois podem ser sintetizados não contaminados por outros anticorpos. O modificador “monoclonal” não deve ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais úteis na presente invenção podem ser preparados pela metodologia de hibridoma descrita pela primeira vez por Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), ou podem ser produzidos usando métodos de DNA recombinante em bactérias ou animais eucarióticos ou células vegetais (ver, por exemplo, Patente U.S. No. 4.816.567). Os

“anticorpos monoclonais” podem também ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpos de fagos utilizando as técnicas descritas em Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), por exemplo.

[103] O termo “antígeno” se refere a uma molécula que provoca uma resposta imunológica. Essa resposta imunológica pode envolver a produção de anticorpos ou a ativação de células específicas imunologicamente competentes, ou ambas. O técnico especialista no assunto entenderá que qualquer macromolécula, incluindo praticamente todas as proteínas ou peptídeos, pode servir como um antígeno. Além disso, os antígenos podem ser derivados de DNA recombinante ou genômico. Um técnico especialista no assunto entenderá que qualquer DNA, que compreende uma sequência de nucleotídeos ou uma sequência de nucleotídeos parcial que codifica uma proteína que induz uma resposta imunológica, codifica, portanto, um “antígeno”, como esse termo é usado aqui. Além disso, um técnico especialista no assunto entenderá que um antígeno não precisa ser codificado apenas por uma sequência de nucleotídeos completa de um gene.

É prontamente aparente que a presente invenção inclui, mas não está limitada ao uso de sequências parciais de nucleotídeos de mais de um gene e que essas sequências de nucleotídeos estão dispostas em várias combinações para codificar polipeptídeos que induzem a resposta imunológica desejada. Além disso, um técnico especialista no assunto entenderá que um antígeno não precisa ser codificado por um “gene”. É facilmente aparente que um antígeno pode ser gerado, sintetizado ou derivado de uma amostra biológica, ou pode ser uma macromolécula além de um polipeptídeo. Essa amostra biológica pode incluir, mas não está limitada a uma amostra de tecido, uma amostra de tumor, uma célula ou um fluido com outros componentes biológicos.

[104] Como aqui usado, o termo “afinidade” se refere à constante de equilíbrio para a ligação reversível de dois agentes e é expresso como uma constante de dissociação (Kd).

A afinidade pode ser pelo menos 1 vezes maior, pelo menos 2 vezes maior, pelo menos 3 vezes maior, pelo menos 4 vezes maior, pelo menos 5 vezes maior, pelo menos 6 vezes maior, pelo menos 7 vezes maior, pelo menos 8 vezes maior, pelo menos 9 vezes maior, pelo menos 10 vezes maior, pelo menos 20 vezes maior, pelo menos 30 vezes maior, pelo menos 30 vezes maior, pelo menos 40 vezes maior, pelo menos 50 vezes maior, pelo menos 60 vezes maior, pelo menos 70 vezes maior, pelo menos 80 vezes maior, pelo menos 90 vezes maior, pelo menos 100 vezes maior ou pelo menos 1000 vezes maior ou mais do que a afinidade de um anticorpo para sequências de aminoácidos não relacionadas. A afinidade de um anticorpo para uma proteína alvo pode ser, por exemplo, de cerca de

100 nanomolar (nM) a cerca de 0,1 nM, de cerca de 100 nM a cerca de 1 picomolar (pM) ou de cerca de 100 nM a cerca de 1 fentomolar (fM) ou mais. Como aqui usado, o termo “avidez” se refere à resistência de um complexo de dois ou mais agentes à dissociação após diluição. Os termos “imunorreativo”, “se liga preferencialmente” e “se liga especificamente” são usados de forma intercambiável no que diz respeito aos anticorpos e fragmentos dos mesmos.

Anticorpos anti-HLA-A2 da invenção, incluindo anticorpos humanizados anti-HLA-A2, bem como os fragmentos dos mesmos, como tal termo é usado aqui, se ligam especificamente ao HLA-A2.

[105] O termo “ligação” se refere a uma associação direta entre duas moléculas devido a, por exemplo, interações covalentes, eletrostáticas, hidrofóbicas e iônicas e/ou de ligação de hidrogênio, incluindo interações como pontes de sal e pontes de água. A ligação não específica se refere à ligação com uma afinidade inferior a 10-7 M, por exemplo, ligação com uma afinidade de 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, etc.

[106] O termo “reatividade”, conforme aqui usado, se refere à capacidade de um anticorpo reagir com (isto é, se ligar a) uma molécula (por exemplo, se ligar especificamente à molécula). Um primeiro anticorpo tem “menos reatividade” a uma molécula (por exemplo, uma molécula de HLA) do que um segundo anticorpo quando o primeiro anticorpo exibe ligação reduzida à molécula em comparação com o segundo anticorpo. São conhecidas abordagens para comparar prontamente as reatividades do primeiro e do segundo anticorpos com uma ou mais moléculas HLA particulares. Um exemplo de abordagem é fornecido na seção Exemplos deste documento, em que os grânulos de antígeno único FlowPRA® (One Lambda) foram empregadas para interrogar anticorpos quanto à capacidade de reagir com (ou se ligar a) moléculas HLA específicas. Tais abordagens citométricas de fluxo são passíveis de análises de reatividade de anticorpos de alto rendimento.

[107] Como aqui usado, o termo “região de dobradiça” se refere a uma região de conector de polipeptídeo flexível (também aqui referida como “articulação” ou “espaçador”), proporcionando flexibilidade estrutural e espaçamento para regiões de polipeptídeo de flanqueamento e pode consistir em polipeptídeos de natureza ou sintéticos.

Uma região de dobradiça pode influenciar a potência de uma célula imunológica que expressa um CAR (veja, por exemplo, Watanabe et al. (2016)). Uma “região de dobradiça” derivada de uma imunoglobulina (por exemplo, IgG1) é geralmente definida como alongamento de Glu216 a Pro230 de IgG1 humana (Burton (1985) Molec. Immunol., 22:161-206). As regiões de dobradiça de outros isotipos de IgG podem ser alinhadas com a sequência de IgG1 colocando o primeiro e o último resíduo de cisteína formando ligações dissulfeto de inter-cadeia pesada (S - S) nas mesmas posições. A região de dobradiça pode ser de ocorrência natural ou não natural, incluindo, mas não se limitando a uma região de dobradiça alterada, conforme descrito na Pat. U.S. No. 5.677.425. A região de dobradiça pode incluir a região de dobradiça completa derivada de um anticorpo de uma classe ou subclasse diferente daquela do domínio CH1. O termo “região de dobradiça” também pode incluir regiões derivadas de CD8 e outros receptores que fornecem uma função semelhante ao fornecer flexibilidade e espaçamento para as regiões de flanqueamento.

[108] Como aqui usado, o termo “células imunológicas” geralmente inclui glóbulos brancos (leucócitos) que são derivados de células-tronco hematopoiéticas (HSC) produzidas na medula óssea. “Células imunológicas” inclui, por exemplo, linfócitos (células T, células B, células natural killer (NK)) e células derivadas de mieloides (neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monócitos, macrófagos, células dendríticas).

[109] “Célula T” inclui todos os tipos de células imunológicas que expressam CD3, incluindo células T helper (células CD4+), células T CD8+ (por exemplo, célula T CD8+ citotóxica, célula T CD8+ reguladora), células T reguladoras (Treg), células T gama-delta e células T duplas negativas.

[110] Uma “célula citotóxica” inclui células T CD8+ citotóxicas, células natural killer (NK) e neutrófilos, cujas células são capazes de mediar as respostas de citotoxicidade.

[111] Como usado aqui, o termo “célula imunológica reguladora” se refere a uma célula imunológica que atua de maneira “reguladora” para suprimir a ativação do sistema imunológico e, assim, mantém a homeostase do sistema imunológico e a tolerância a auto-antígenos. “Células imunológicas reguladoras” também podem ter efeitos em células não imunes que resultam em um estado clínico melhorado, como promover reparo ou regeneração tecidual. As células imunológicas reguladoras podem incluir células T reguladoras, células T CD4+ reguladoras, células T CD8+ reguladoras, células T γδ reguladoras, células T DN reguladoras, células B reguladoras, células NK reguladoras, macrófagos reguladores e células dendríticas reguladoras.

[112] “Linfócito T regulador”, “célula T reguladora”, “célula T reguladora”, “célula Treg” ou “Treg”, conforme usado na presente especificação e reivindicações, são sinônimos e se destinam a ter suas definições padrões conforme usada na técnica. As células Treg são uma subpopulação especializada de células T que atuam de maneira “reguladora” para suprimir a ativação do sistema imunológico e, assim, manter a homeostase e a tolerância ao auto-

antígeno.

Às vezes, as Tregs são referidas como células T supressoras.

As células Treg são frequentemente, mas nem sempre, caracterizadas pela expressão do fator de transcrição Foxp3 da família da cabeça da forquilha (caixa da forquilha p3). Estas também podem expressar proteínas de superfície CD4 ou CD8. Estas geralmente também expressam

CD25. Conforme usado na presente especificação e reivindicações, e a menos que especificado de outra forma,

as Tregs incluem Tregs “naturais” que se desenvolvem no timo,

Tregs induzidas/adaptáveis/periféricas que surgem por meio de um processo de diferenciação que ocorre fora do timo (por exemplo, em tecidos ou tecidos secundários, órgãos linfoides ou em ambiente de laboratório, em condições de cultura definidas) e as Tregs criadas usando a tecnologia de DNA recombinante, por exemplo, pela expressão modificada de

FOXP3. As células Treg de ocorrência natural

(CD4+CD25+Foxp3+) surgem como todas as outras células T no timo.

Em contraste, as células Treg induzidas/adaptáveis/periféricas (que incluem Tregs

CD4+CD25+Foxp3+, células Tr1, células Th3 e outras) surgem fora do timo.

Uma maneira de induzir Tregs é pela exposição de células T efetoras a IL-10 ou TGF-β.

As células T também podem ser convertidas em células Treg por transfecção ou transdução do gene Foxp3 em uma população mista de células

T.

Uma célula T que é causada para expressar Foxp3 adota o fenótipo Treg e esses Tregs recombinantes também são aqui definidas como “Tregs”.

[113] Como usado aqui, o termo “célula imunológica efetora” se refere a uma célula do sistema imunológico que está em uma forma que é capaz de montar uma resposta imunológica específica.

[114] Como aqui usado, o termo “resposta imunológica” inclui as respostas imunológicas mediadas por células T e/ou mediadas por células B. Exemplos de respostas imunológicas incluem respostas de células T, por exemplo, produção de citocinas e citotoxicidade celular. Além disso, o termo resposta imunológica inclui respostas imunológicas que são indiretamente afetadas pela ativação de células T, por exemplo, produção de anticorpos (respostas humorais) e ativação de células responsivas a citocinas, por exemplo, macrófagos. As células imunológicas envolvidas na resposta imunológica incluem linfócitos, como células B e células T (CD4+, CD +, células Thl e Th2); células apresentadoras de antígeno (por exemplo, células apresentadoras de antígeno profissionais, como células dendríticas, macrófagos, linfócitos B, células de Langerhans e células apresentadoras de antígenos não profissionais, como queratinócitos, células endoteliais, astrócitos, fibroblastos, oligodendrócitos); células naural killer; células mieloides, como macrófagos, eosinófilos, mastócitos, basófilos e granulócitos.

[115] O termo “rejeição” se refere a um estado em que um órgão ou tecido transplantado não é aceito pelo organismo do destinatário. A rejeição resulta do sistema imunológico a partir do destinatário atacando o órgão ou tecido transplantado. A rejeição pode ocorrer dias a semanas após o transplante (agudo) ou meses a anos após o transplante (crônico).

[116] O termo “doença do enxerto contra o hospedeiro” ou “GVHD”, conforme usado aqui, se refere a uma complicação médica após o recebimento de tecido transplantado de uma pessoa geneticamente diferente. As células imunológicas no tecido doado (o enxerto) reconhecem o receptor (o hospedeiro) como estranho. As células imunológicas transplantadas atacam as células do corpo do hospedeiro. A GVHD é comumente associada ao transplante de células-tronco; no entanto, o termo inclui GVHD decorrente de outras formas de enxerto de tecido. A GVHD também pode ocorrer após uma transfusão de sangue.

[117] Conforme usado aqui, o termo “tolerância imunológica” ou “tolerância imune” se refere aos métodos realizados em uma proporção de indivíduos tratados em comparação com indivíduos não tratados, onde: a) um nível reduzido de uma resposta imunológica específica (que parece ser mediada pelo menos em parte por linfócitos T efetores específicos de antígeno, linfócitos B, anticorpo ou equivalentes dos mesmos); b) um atraso no início ou progressão de uma resposta imunológica específica; ou c) um risco reduzido do início ou progressão de uma resposta imunológica específica. A tolerância imunológica ou imune “específica” ocorre quando a tolerância imunológica ou imune é preferencialmente invocada contra certos antígenos em comparação com outros.

[118] Como aqui usado, o termo “tolerância operacional” se refere a uma situação clínica em que há uma função estável do enxerto sem sinais histológicos de rejeição, incluindo rejeição aguda ou crônica, na ausência de terapias medicamentosas imunossupressoras por pelo menos 1 ano, em um período hospedeiro imunocompetente capaz de responder a outros desafios, incluindo infecções.

[119] Como usado aqui, o termo “acomodação imune” se refere a uma condição de um receptor de transplante no qual um transplante de órgão ou tecido funciona normalmente, apesar da presença de anticorpos no receptor que são específicos para o transplante de órgão ou tecido.

[120] Como aqui usado, o termo “célula tronco” geralmente inclui células tronco pluripotentes ou multipotentes. “Células-tronco” inclui, por exemplo, células-tronco embrionárias (ES); células-tronco mesenquimais (CTM); células-tronco pluripotentes induzidas (iPS); e células progenitoras comprometidas (células-tronco hematopoiéticas (HSC); células derivadas da medula óssea, etc.).

[121] Como aqui usado, os termos “tratamento”, “tratando” e semelhantes, se referem à obtenção do efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. O efeito pode ser terapêutico em termos de uma cura completa ou parcial para uma doença e/ou efeito adverso atribuível a uma doença.

“Tratamento”, como usado aqui, abrange qualquer tratamento de uma doença em um mamífero, por exemplo, em um humano, e inclui o alívio da doença, isto é, causando regressão da doença e/ou melhoria de um ou mais sintomas da doença.

[122] Conforme usado aqui, os termos “prevenção”, “prevenir”, “prevenindo” e semelhantes significam fornecer tratamento profilático ou de proteção para uma doença ou estado de doença. O efeito pode ser profilático em termos de prevenção total ou parcial de uma doença ou sintoma da mesma.

“Prevenção”, como usado aqui, abrange qualquer efeito profilático em uma doença em um mamífero, por exemplo, em um humano, e inclui: (a) impedir que a doença ocorra em um indivíduo que possa estar predisposto à doença, mas ainda não foi diagnosticado como tendo; e (b) inibir a doença, isto é, interromper seu desenvolvimento.

[123] Os termos “paciente”, “indivíduo”, “sujeito”, “hospedeiro” e semelhantes são usados de forma intercambiável aqui e se referem a qualquer animal, ou células do mesmo, seja in vitro ou in situ, passível de aplicação aos métodos aqui descritos. Os termos “paciente”, “indivíduo”, “sujeito”, “hospedeiro” e semelhantes se destinam a incluir organismos vivos nos quais uma resposta imunológica pode ser provocada (por exemplo, mamíferos).

Exemplos de “paciente”, “indivíduo”, “indivíduo”, “hospedeiro” incluem murinos (por exemplo, ratos, camundongos), lagomorfos (por exemplo, coelhos), primatas não humanos, humanos, caninos, felinos, ungulados (por exemplo, equinos, bovinos, ovinos, suínos, caprinos), etc.

e suas espécies transgênicas. Em certas modalidades não limitativas, o paciente, indivíduo, hospedeiro ou sujeito é um humano.

[124] O termo “quantidade eficaz” ou “quantidade terapeuticamente eficaz” é usado aqui de forma intercambiável e se refere à quantidade de um agente terapêutico, ou quantidades combinadas de mais de um agente terapêutico, que provocarão a resposta biológica ou médica de um tecido, sistema ou indivíduo que está sendo procurado pelo pesquisador, veterinário, médico ou outro clínico. O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” inclui a quantidade de um agente terapêutico que, quando administrado, é suficiente para impedir o desenvolvimento ou aliviar, em certa medida, um ou mais dos sinais ou sintomas do distúrbio ou doença a serem tratados. A quantidade terapeuticamente eficaz variará dependendo do agente terapêutico, da doença e sua gravidade e a idade, peso, etc., do indivíduo a ser tratado.

[125] O termo “ativação”, conforme usado aqui, se refere ao estado de uma célula T (por exemplo, uma célula T reguladora) que foi suficientemente estimulada para induzir uma resposta celular detectável. A ativação também pode ser associada a funções efetoras detectáveis, como produção de citocinas ou atividade supressora. O termo células T reguladoras “ativadas” se refere, entre outras coisas, às células T reguladoras que são capazes de suprimir uma resposta imunológica.

[126] O termo “receptor quimérico de antígeno” ou, alternativamente, um “CAR” se refere a um construto de polipeptídeo recombinante compreendendo um domínio extracelular compreendendo um domínio de ligação ao antígeno; um domínio transmembranar; e um domínio citoplasmático compreendendo um domínio de sinalização intracelular. Em uma modalidade, o CAR opcionalmente compreende uma dobradiça. Os termos “receptor quimérico” ou “receptor de antígeno quimérico” ou “CAR” podem, em particular, se referir a um polipeptídeo ou a um conjunto de polipeptídeos, tipicamente dois nas modalidades mais simples, que quando em uma célula imunológica fornecem à célula especificidade para um ligante alvo e com geração de sinal intracelular. Em algumas modalidades, o conjunto de polipeptídeos é contíguo um ao outro. Em algumas modalidades, o receptor quimérico é uma proteína de fusão quimérica compreendendo o conjunto de polipeptídeos. Em algumas modalidades, o conjunto de polipeptídeos inclui um interruptor de dimerização que, na presença de uma molécula de dimerização, pode acoplar os polipeptídeos um ao outro, por exemplo, pode acoplar um domínio de ligação ao ligante a um domínio de sinalização intracelular. Em uma modalidade, o receptor quimérico compreende uma sequência líder opcional no terminal amino (N-ter) da proteína de fusão do receptor quimérico. Em uma modalidade, o receptor quimérico compreende ainda uma sequência líder no terminal N do domínio de ligação ao ligante extracelular, em que a sequência líder é opcionalmente clivada do domínio de ligação ao ligante durante o processamento celular e a localização do receptor quimérico na membrana celular.

[127] O termo “domínio de sinalização” se refere à porção funcional de uma proteína que atua transmitindo informações dentro da célula para regular a atividade celular através de vias de sinalização definidas, gerando segundos mensageiros ou funcionando como efetores, respondendo a esses mensageiros.

[128] O termo “autólogo” se refere a qualquer material derivado do mesmo indivíduo a quem mais tarde será reintroduzido no indivíduo.

[129] O termo “alogênico” se refere a qualquer material derivado de um indivíduo diferente da mesma espécie que o indivíduo ao qual o material é introduzido. Diz-se que dois ou mais indivíduos são alogênicos entre si quando os genes em um ou mais loci não são idênticos. Em alguns aspectos, o material alogênico de indivíduos da mesma espécie pode ser suficientemente diferente geneticamente para interagir antigenicamente. O termo “aloenxerto” se refere a um enxerto derivado de um indivíduo diferente da mesma espécie.

[130] O termo “xenogênico” se refere a qualquer material derivado de um indivíduo de uma espécie diferente.

O termo “xenoenxerto” se refere a um enxerto derivado de um indivíduo de uma espécie diferente.

[131] Como aqui usado, um “material instrucional” inclui uma publicação, uma gravação, um diagrama ou qualquer outro meio de expressão que possa ser usado para comunicar a utilidade das composições e métodos da invenção. O material de instruções do kit da invenção pode, por exemplo, ser afixado em um recipiente que contém o ácido nucleico, peptídeo, célula e/ou composição da invenção ou ser enviado junto com um recipiente que contém o ácido nucleico,

peptídeo, célula e/ou composição. Alternativamente, o material instrucional pode ser enviado separadamente do recipiente com a intenção de que o material instrucional e o ácido nucleico, peptídeo, célula e/ou composição sejam usados cooperativamente pelo receptor.

[132] Uma “modificação” de um resíduo/posição de aminoácido, como aqui usado, se refere a uma alteração de uma sequência de aminoácidos primária em comparação com uma sequência de aminoácidos inicial, em que a alteração resulta de uma alteração de sequência envolvendo os referidos resíduos/posições de aminoácidos. Por exemplo, modificações típicas incluem a substituição do resíduo (ou na referida posição) por outro aminoácido (por exemplo, uma substituição conservadora ou não conservadora), inserção de um ou mais (geralmente menos de 5 ou 3) aminoácidos adjacentes ao referido resíduo/posição e deleção do referido resíduo/posição. Uma “substituição de aminoácido”, ou variação do mesmo, se refere à substituição de um resíduo de aminoácido existente em uma sequência de aminoácidos predeterminada (inicial) por um resíduo de aminoácido diferente. Geralmente e preferencialmente, a modificação resulta em alteração em pelo menos uma atividade físico- química do polipeptídeo variante em comparação com um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos inicial (ou “tipo selvagem”). Por exemplo, no caso de um anticorpo, uma atividade físico-química que é alterada pode ser afinidade de ligação, capacidade de ligação e/ou efeito de ligação sobre uma molécula alvo.

[133] O termo “modificação de sequência conservadora” se refere a uma modificação de aminoácidos que não afeta ou altera significativamente as características de ligação do anticorpo ou fragmento de anticorpo contendo a sequência de aminoácidos. Tais modificações conservadoras incluem substituições, adições e deleções de aminoácidos.

Modificações podem ser introduzidas em um anticorpo ou fragmento de anticorpo da invenção por técnicas padrão conhecidas na técnica, como mutagênese dirigida ao sítio e mutagênese mediada por PCR. As substituições conservadoras de aminoácidos são aquelas em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido possuindo uma cadeia lateral semelhante. Famílias de resíduos de aminoácidos possuindo cadeias laterais semelhantes foram definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais ramificadas beta (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim, um ou mais resíduos de aminoácidos dentro de um CAR da invenção podem ser substituídos por outros resíduos de aminoácidos da mesma família de cadeias laterais e o CAR alterado pode ser testado usando os ensaios funcionais aqui descritos.

[134] O termo “estimulação” se refere a uma resposta primária induzida pela ligação de uma molécula estimuladora (por exemplo, um complexo TCR/CD3) com seu ligante cognato, mediando desse modo um evento de transdução de sinal, como, mas não limitado a, transdução de sinal via o complexo TCR/CD3. A estimulação pode mediar a expressão alterada de certas moléculas, como a regulação positiva ou negativa de citocinas e proteínas da superfície celular e/ou reorganização das estruturas citoesqueléticas e semelhantes.

[135] O termo “molécula estimuladora” se refere a uma molécula expressa por uma célula T que fornece as sequências de sinalização citoplasmática primárias que regulam a ativação primária do complexo TCR de maneira estimulante por pelo menos algum aspecto da via de sinalização da célula T. Em um aspecto, o sinal primário é iniciado por, por exemplo, ligação de um complexo TCR/CD3 a uma molécula de MHC carregada com peptídeo e que leva à mediação de uma resposta de células T, incluindo, mas não limitado a, proliferação, ativação, diferenciação e semelhantes. Uma sequência de sinalização citoplasmática primária (também referida como “domínio de sinalização primário”) que age de maneira estimuladora pode conter um motivo de sinalização que é conhecido como motivo de ativação baseada em tirosina imunorreceptora (ITAM).

[136] O termo “célula apresentadora de antígeno” ou “APC” se refere a uma célula do sistema imunológico, como uma célula acessória (por exemplo, uma célula B, uma célula dendrítica, macrófagos, células de Langerhans e semelhantes) que pode exibir um antígeno complexado com grande complexos de histocompatibilidade (MHCs) em sua superfície para reconhecimento por certos linfócitos, como células T. As células T podem reconhecer esses complexos usando seus receptores de células T (TCRs). As células apresentadoras de antígeno podem processar antígenos para exibição em conjunto com MHCs. O termo “célula apresentadora de antígeno” ou “APC”, conforme usado aqui, inclui estados em que as APCs estão exibindo um antígeno e estados em que as APCs não estão exibindo um antígeno. Em alguns casos, as APCs processam antígenos e os apresentam às células T. Em outros casos, as células T podem reconhecer as APCs na ausência de apresentação de antígeno, onde o TCR se liga diretamente à proteína MHC. Por exemplo, no contexto do transplante, as

APCs podem estimular diretamente as células T através da expressão de proteínas MHC estranhas.

[137] Um “domínio de sinalização intracelular”, como o termo é usado aqui, se refere a uma porção intracelular de um CAR. O domínio de sinalização intracelular gera um sinal que promove uma função efetora imunológica da célula contendo CAR, por exemplo, uma célula Treg CAR.

Exemplos de função efetora imunológica, por exemplo, em uma célula Treg CAR, podem incluir supressão ou regulação negativa da função efetora de outras células imunológicas.

Outras células imunológicas incluem qualquer tipo de leucócito, por exemplo (mas não limitado a), células T, células B, células NK. Além disso, a função efetora imunológica de Tregs pode incluir efeitos em células não imunológicas que resultam em um estado clínico melhorado, como promover reparo ou regeneração tecidual.

[138] O termo “zeta” ou, alternativamente, “cadeia zeta” ou “CD3-zeta” é definido como a proteína fornecida como GenBan Acc. No. BAG36664.1, ou os resíduos equivalentes de uma espécie não humana, por exemplo, camundongo, roedor, macaco, macaco e semelhantes, e um “domínio estimulador zeta” ou “domínio estimulador CD3-zeta” é definido como o resíduos de aminoácidos do domínio citoplasmático da cadeia zeta que são suficientes para transmitir funcionalmente um sinal inicial necessário para a ativação das células T. Em um aspecto, o domínio citoplasmático de zeta compreende os resíduos 52 a 164 do GenBank Acc. No. BAG36664.1 ou resíduos equivalentes de uma espécie não humana, por exemplo, camundongo, roedor, macaco, macaco e semelhantes, que são seus ortólogos funcionais.

[139] “Ligante co-estimulador”, como o termo é usado aqui, inclui uma molécula em uma célula apresentadora de antígeno (por exemplo, um APC, célula dendrítica, célula B e semelhantes) que se liga especificamente a uma molécula co-estimuladora cognata em um T célula, fornecendo assim um sinal que, além do sinal primário fornecido por, por exemplo, a ligação de um complexo TCR/CD3 a uma molécula de MHC carregada com peptídeo, medeia uma resposta de célula T, incluindo, mas não limitado a proliferação, ativação, diferenciação e semelhantes. Um ligante coestimulador pode incluir, mas não se limita a CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ligante costimulador induzível (ICOS- L), molécula de adesão intercelular (ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, receptor beta de linfotoxina, 3/TR6, ILT3, ILT4, HVEM, um agonista ou anticorpo que liga o ligante Toll receptor e um ligante que se liga especificamente a B7-H3. Um ligante co-estimulador também abrange, entre outros, um ligante, incluindo um anticorpo, que se liga especificamente a uma molécula co- estimuladora presente em uma célula T, como, mas não se limitando a uma molécula de MHC de classe I, BTLA, um Receptor de ligante Toll, OX40, CD27, CD28, antígeno-1 associado à função linfocitária (LFA-1) (CD11a/CD18), TNFR1 (CD120a/TNFRSF1A), TNFR2 (CD120b/TNFRSF1B), CTLA-4 (CD152), CD95, ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), CD2, CD30, CD40, PD-1, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ICAM-1, GITR, HVEM, SLAMF7, NKp80, CD160, IL2ra, IL6Ra, IL-7Ra, IL-13RA1/RA2, IL-33R (IL1RL1), IL-10RA/RB, IL-4R, IL-5R (CSF2RB), ARHR, receptor de BAFF, IL-21R, TGFbR1/2/3, cadeia gama comum, um ligante que se liga especificamente a CD83 e qualquer combinação dos mesmos.

[140] O termo “molécula co-estimuladora” se refere ao parceiro de ligação cognato em uma célula T que se liga especificamente a um ligante co-estimulador, mediando assim uma resposta co-estimuladora pela célula T, como, mas não limitado a, proliferação. Moléculas co-estimuladoras são moléculas da superfície celular que não sejam receptores de antígenos ou seus ligantes, necessárias para uma resposta imunológica eficiente. Uma molécula co-estimuladora pode ser representada nas seguintes famílias de proteínas: Proteínas receptoras de TNF, proteínas do tipo imunoglobulina, receptores de citocinas, integrinas, moléculas de ativação linfocítica de sinalização (proteínas SLAM) e ativação de receptores de células NK. Moléculas co-estimuladoras incluem, entre outras, uma molécula de MHC de classe I, BTLA, um receptor de ligante Toll, OX40, CD27, CD28, antígeno-1 associado à função linfocitária (LFA-1) (CD11a/CD18), TNFR1 (CD120a/TNFRSF1A), TNFR2 (CD120b/TNFRSF1B), CTLA-4 (CD152), CD95, ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), CD2, CD30, CD40, PD-1, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ICAM-1, GITR, HVEM, SLAMF7, NKp80, CD160, IL2ra, IL6Ra, IL-7Ra, IL-13RA1/RA2, IL-33R (IL1RL1), IL-10RA/RB, IL-4R, IL-5R (CSF2RB), ARHR, receptor de BAFF, IL-21R, TGFbR1/2/3, cadeia gama comum, um ligante que se liga especificamente a CD83 e qualquer combinação dos mesmos.

[141] Um “domínio de sinalização intracelular co- estimulador” ou “domínio co-estimulador” pode ser a porção intracelular de uma molécula co-estimuladora. Exemplos de tais moléculas incluem uma molécula de MHC classe I, BTLA, um receptor de ligante Toll, OX40, CD27, CD28, antígeno-1 associado à função linfocitária (LFA-1) (CD11a/CD18), TNFR1 (CD120a/TNFRSF1A), TNFR2 (CD120b/TNFRSF1B), CTLA-4 (CD152), CD95, ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), CD2, CD30, CD40, PD-1, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ICAM-1, GITR, HVEM, SLAMF7, NKp80, CD160, IL2ra, IL6Ra, IL-7Ra, IL-13RA1/RA2, IL-33R (IL1RL1), IL-10RA/RB, IL-4R, IL-5R (CSF2RB), ARHR, Receptor de BAFF, IL-21R, TGFbR1/2/3, cadeia gama comum, um ligante que se liga especificamente a CD83 e semelhantes.

[142] Um “sinal co-estimulador”, como aqui usado, se refere a um sinal que, em combinação com um sinal primário, como a ligação TCR/CD3, leva à proliferação de células T e/ou à regulação positiva ou negativa da molécula chave.

[143] O domínio de sinalização intracelular pode compreender a porção intracelular inteira, ou o domínio de sinalização intracelular nativo inteiro, da molécula da qual é derivada, ou um fragmento funcional da mesma.

[144] Uma “doença” é um estado de saúde de um animal em que o animal não pode manter a homeostase e em que se a doença não é melhorada, a saúde do animal continua a deteriorar-se. Por outro lado, um “distúrbio” em um animal é um estado de saúde no qual o animal é capaz de manter a homeostase, mas no qual o estado de saúde do animal é menos favorável do que seria na ausência do distúrbio. Se não for tratado, um distúrbio não causa necessariamente uma diminuição adicional do estado de saúde do animal.

[145] O termo “codificação” se refere à propriedade inerente de sequências específicas de nucleotídeos em um polinucleotídeo, como um gene, um cDNA ou um mRNA, para servir de modelo para a síntese de outros polímeros e macromoléculas em processos biológicos com uma sequência definida de nucleotídeos (por exemplo, rRNA, tRNA e mRNA) ou uma sequência definida de aminoácidos e as propriedades biológicas daí resultantes. Assim, um gene, cDNA ou RNA, codifica uma proteína se a transcrição e tradução do mRNA correspondente a esse gene produzem a proteína em uma célula ou outro sistema biológico. Tanto a cadeia de codificação, cuja sequência de nucleotídeos é idêntica à sequência de mRNA e geralmente é fornecida nas listagens de sequências, quanto a cadeia não codificadora, usada como modelo para a transcrição de um gene ou cDNA, podem ser denominadas codificação de proteína ou outro produto desse gene ou cDNA.

[146] A menos que especificado de outra forma, uma sequência de nucleotídeos ou sequência de ácidos nucleicos que codifica uma sequência de aminoácidos inclui todas as sequências de nucleotídeos ou de ácidos nucleicos que são versões degeneradas uma da outra e que codificam a mesma sequência de aminoácidos. A frase sequência de nucleotídeos ou sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína ou RNA pode também incluir íntrons na medida em que a sequência de nucleotídeos ou de ácido nucleico que codifica a proteína pode, em alguma versão, conter um íntron.

[147] Um “transplante”, como aqui usado, se refere a células, tecidos ou um órgão que é introduzido em um indivíduo. A fonte do material transplantado pode ser células cultivadas, células de outro indivíduo ou células do mesmo indivíduo (por exemplo, após as células serem cultivadas in vitro). Transplantes de órgãos exemplares são rim, fígado, coração, pulmão e pâncreas. Um transplante de tecido exemplar são ilhotas. Um transplante de células exemplar é o transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas.

[148] O termo “exógeno” se refere a qualquer material introduzido ou produzido fora de um organismo, célula, tecido ou sistema.

[149] O termo “expressão” se refere à transcrição e/ou tradução de uma sequência de nucleotídeos específica dirigida por um promotor.

[150] O termo “vetor de expressão” se refere a um vetor compreendendo um polinucleotídeo recombinante compreendendo as sequências de controle de expressão operacionalmente ligadas a uma sequência de nucleotídeos a ser expressa. Um vetor de expressão compreende elementos de ação cis suficientes para expressão; outros elementos para expressão podem ser fornecidos pela célula hospedeira ou em um sistema de expressão in vitro. Os vetores de expressão incluem todos os conhecidos na técnica, incluindo cosmídeos, plasmídeos (por exemplo, nus ou contidos em lipossomos) e vírus (por exemplo, lentivírus, retrovírus, adenovírus e vírus adeno-associados) que incorporam o polinucleotídeo recombinante.

[151] O termo “lentivírus” se refere a um gênero da família Retroviridae. Os lentivírus são únicos entre os retrovírus por serem capazes de infectar as células que não se dividem; eles podem fornecer uma quantidade significativa de informações genéticas no DNA da célula hospedeira, portanto, são um dos métodos mais eficientes de um vetor de liberação de genes. HIV, SIV e FIV são todos exemplos de lentivírus.

[152] O termo “vetor lentiviral” se refere a um vetor derivado de pelo menos uma porção de um genoma de lentivírus, incluindo especialmente um vetor lentiviral auto-inativador, conforme fornecido em Milone et al., Mol.

Ther. 17(8):1453-1464 (2009). Outros exemplos de vetores de lentivírus que podem ser usados na clínica incluem, entre outros, por exemplo, a tecnologia de liberação de genes LENTIVECTOR® da Oxford BioMedica, o sistema de vetores LENTIMAX™ da Lentigen e semelhantes. Tipos não clínicos de vetores lentivirais também estão disponíveis e seriam conhecidos por um técnico especialista no assunto.

[153] O termo “homólogo” ou “identidade” se refere à identidade da sequência da subunidade entre duas moléculas poliméricas, por exemplo, entre duas moléculas de ácido nucleico, como duas moléculas de DNA ou duas moléculas de RNA, ou entre duas moléculas polipeptídicas. Quando uma posição da subunidade em ambas as moléculas é ocupada pela mesma subunidade monomérica; por exemplo, se uma posição em cada uma das duas moléculas de DNA é ocupada por adenina, então elas são homólogas ou idênticas nessa posição. A homologia entre duas sequências é uma função direta do número de posições correspondentes ou homólogas; por exemplo, se metade (por exemplo, cinco posições em um polímero com dez subunidades de comprimento) das posições em duas sequências for homóloga, as duas sequências serão 50% homólogas; se 90% das posições (por exemplo, 9 de 10) forem correspondentes ou homólogas, as duas sequências são 90% homólogas.

[154] As formas “humanizadas” de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulinas ou seus fragmentos (como Fv, scFv, Fab, scFab, sdAb, Fab’, F(ab’)2 ou outra ligação ao antígeno subsequências de anticorpos) que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Na maior parte, os anticorpos humanizados e seus fragmentos de anticorpos são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor ou fragmento de anticorpo) nos quais os resíduos de uma região determinante de complementariedade (CDR) do destinatário são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador) como camundongo, rato ou coelho com a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos da região estrutural Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos pelos resíduos não humanos correspondentes. Além disso, um anticorpo humanizado/fragmento de anticorpo pode compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo receptor nem nas sequências CDR ou estruturais importadas. Essas modificações podem refinar e otimizar ainda mais o desempenho de anticorpos ou fragmentos de anticorpos. Em geral, o anticorpo humanizado ou seu fragmento de anticorpo compreenderá substancialmente todos os pelo menos um e, tipicamente, dois domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e toda ou uma significativa porção das regiões FR são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo também pode compreender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, ver Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593- 596, 1992.

[155] Uma imunoglobulina “humana”, anticorpo ou fragmento de anticorpo se refere a uma imunoglobulina, como um anticorpo ou fragmento de anticorpo, em que toda a molécula é de origem humana ou consiste em uma sequência de aminoácidos idêntica à forma humana do anticorpo ou imunoglobulina.

[156] O termo “isolado” significa alterado ou removido do estado natural. Por exemplo, um ácido nucleico ou um peptídeo naturalmente presente em um animal vivo não é “isolado”, mas o mesmo ácido nucleico ou peptídeo parcial ou completamente separado dos materiais coexistentes de seu estado natural é “isolado”. Um ácido nucleico ou proteína isolado pode existir em forma substancialmente purificada ou pode existir em um ambiente não nativo, como, por exemplo, uma célula hospedeira. Um “anticorpo isolado” é um que foi identificado e separado e/ou recuperado a partir de um componente de seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interferem com os usos terapêuticos do anticorpo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteicos ou não proteicos.

[157] No contexto da presente invenção, são utilizadas as seguintes abreviações para as bases de ácidos nucleicos de ocorrência comum. “A” se refere a adenosina, “C” se refere a citosina, “G” se refere a guanosina, “T” se refere a timidina e “U” se refere a uridina.

[158] O termo “operacionalmente ligado” se refere à ligação funcional entre uma sequência reguladora e uma sequência heteróloga de ácido nucleico, resultando na expressão desta última. Por exemplo, uma primeira sequência de ácido nucleico está operacionalmente ligada a uma segunda sequência de ácido nucleico quando a primeira sequência de ácido nucleico é colocada em um relacionamento funcional com a segunda sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se o promotor afeta a transcrição ou expressão da sequência de codificação. As sequências de DNA operacionalmente ligadas podem ser contíguas entre si e, por exemplo, quando necessário para unir duas regiões de codificação de proteínas, estão na mesma região de leitura.

[159] O termo administração “parenteral” de uma composição imunogênica inclui, por exemplo, técnicas de injeção subcutânea (s.c.), intradérmica, intranodal, intramedular, intraperitoneal, intravenosa (i.v.), intramuscular (i.m.) ou intrasternal, intratumoral ou de infusão.

[160] Os termos “ácido nucleico” ou “polinucleotídeo”, usados aqui de forma intercambiável, se referem a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, sejam ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos. Assim, este termo inclui, mas não se limita a DNA ou RNA de cadeia simples, dupla ou múltipla, DNA genômico, cDNA, híbridos de DNA-RNA ou um polímero que compreende bases de purina e pirimidina ou outras bases naturais, quimicamente ou bases nucleotídicas bioquimicamente modificadas, não naturais ou derivadas.

Assim, a menos que especificamente limitado, o termo abrange ácidos nucleicos contendo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que têm propriedades de ligação semelhantes ao ácido nucleico de referência e são metabolizados de maneira semelhante aos nucleotídeos de ocorrência natural. Salvo indicação em contrário, uma sequência de ácido nucleico específica também inclui implicitamente variantes modificadas de modo conservador (por exemplo, substituições de códons degenerados), alelos, ortólogos, SNPs e sequências complementares, bem como a sequência explicitamente indicada. Especificamente, as substituições de códons degenerados podem ser alcançadas gerando sequências nas quais a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída por resíduos de base mista e/ou desoxininosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol.

Chem. 260:2605-2608 (1985); e Rossolini et al., Mol. Cell.

Probes 8:91-98 (1994)).

[161] Os termos “peptídeo”, “polipeptídeo” e “proteína” são usados de forma intercambiável e se referem a um composto constituído por resíduos de aminoácidos covalentemente ligados por ligações peptídicas. Uma proteína ou peptídeo deve conter pelo menos dois aminoácidos, e nenhuma limitação é colocada no número máximo de aminoácidos que podem compreender a sequência de uma proteína ou peptídeo. Os polipeptídeos incluem qualquer peptídeo ou proteína compreendendo dois ou mais aminoácidos unidos entre si por ligações peptídicas. Como aqui usado, o termo se refere a ambas as cadeias curtas, que também são comumente referidas na técnica como peptídeos, oligopeptídeos e oligômeros, por exemplo, e a cadeias mais longas, que geralmente são referidas na técnica como proteínas, das quais existem muitos tipos. “Polipeptídeos” incluem, por exemplo, fragmentos biologicamente ativos, polipeptídeos substancialmente homólogos, oligopeptídeos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipeptídeos, polipeptídeos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusão, entre outros. Um polipeptídeo inclui um peptídeo natural, um peptídeo recombinante ou uma combinação dos mesmos.

[162] O termo “promotor/sequência reguladora” se refere a uma sequência de ácido nucleico necessária para a expressão de um produto gênico operacionalmente ligado ao promotor regulador/sequência reguladora. Em alguns casos, esta sequência pode ser a sequência do promotor principal e, em outros casos, esta sequência também pode incluir uma sequência intensificadora e outros elementos reguladores que são necessários para a expressão do produto do gene. O promotor regulador/sequência reguladora pode, por exemplo, ser aquele que expressa o produto do gene de uma maneira específica do tecido.

[163] O termo promotor “constitutivo” se refere a uma sequência de nucleotídeos que, quando operacionalmente ligada a um polinucleotídeo que codifica ou especifica um produto genético, faz com que o produto genético seja produzido em uma célula sob a maioria ou todas as condições fisiológicas da célula.

[164] O termo promotor “induzível” se refere a uma sequência de nucleotídeos que, quando operacionalmente ligada a um polinucleotídeo que codifica ou especifica um produto genético, faz com que o produto genético seja produzido em uma célula substancialmente apenas quando um indutor que corresponde ao promotor está presente na célula.

[165] Como usado aqui, “transitório” se refere à expressão de um transgene não integrado por um período de horas, dias ou semanas, em que o período de tempo de expressão é menor que o período de tempo para a expressão do gene se integrado ao genoma ou contido dentro de um replicon plasmídeo estável na célula hospedeira.

[166] O termo, uma célula “substancialmente purificada” se refere a uma célula que é essencialmente livre de outros tipos de células. Uma célula substancialmente purificada também se refere a uma célula que foi separada de outros tipos de células com os quais está normalmente associada em seu estado natural. Em alguns casos, uma população de células substancialmente purificadas se refere a uma população homogênea de células. Em outros casos, esse termo se refere simplesmente às células que foram separadas das células com as quais estão naturalmente associadas em seu estado natural. Em alguns aspectos, as células são cultivadas in vitro. Em outros aspectos, as células não são cultivadas in vitro.

[167] O termo “transfectado” ou “transformado” ou “transduzido” se refere a um processo pelo qual o ácido nucleico exógeno é transferido ou introduzido na célula hospedeira. Uma célula “transfectada” ou “transformada” ou “transduzida” é aquela que foi transfectada, transformada ou transduzida com ácido nucleico exógeno. A célula inclui a célula do indivíduo primário e sua progênie.

[168] Vários aspectos da invenção podem ser apresentados ao longo desta divulgação em um formato de faixa. Deve ser entendido que a descrição no formato de faixa é meramente por conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível no escopo da invenção. Por conseguinte, a descrição de uma faixa deve ser considerada como tendo divulgado especificamente todas as subfaixas possíveis, bem como valores numéricos individuais dentro dessa faixa. Por exemplo, a descrição de uma faixa como 1 a 6 deve ser considerada como tendo subfaixas especificamente divulgadas, como 1 a 3, 1 a 4, 1 a 5, 2 a 4, 2 a 6, 3 a 6 etc., bem como números individuais dentro dessa faixa, por exemplo, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 e 6. Como outro exemplo, um faixa como 95-99% de identidade inclui algo com 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade e inclui subfaixas como 96-99%, 96-98%, 96- 97%, 97-99%, 97-98% e 98-99% de identidade. Isso se aplica independentemente da amplitude da faixa.

III. ANTICORPOS ANTI-HLA-A2

[169] Em um aspecto, a presente invenção fornece anticorpos anti-HLA-A2. Anticorpos exemplares incluem anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos recombinantes, anticorpos quiméricos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados e seus fragmentos de ligação ao antígeno.

[170] Em uma modalidade, a invenção fornece anticorpos anti-HLA-A2 humanizados. Os anticorpos anti-HLA- A2 humanizados aqui fornecidos se ligam especificamente ao HLA-A2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 humanizados aqui fornecidos se ligam especificamente ao HLA- A*02:01. Como seria apreciado por um técnico especialista no assunto, a capacidade de um anticorpo se ligar ao HLA-A2 pode ser detectada através do uso de técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, a ligação de um anticorpo ao HLA-A2 pode ser detectada através do uso de um tetrâmero HLA-A2, como aqui exemplificado. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 humanizados aqui fornecidos competem pela ligação ao HLA-A2 com um anticorpo que compreende: uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1) tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 183; uma região determinante de complementariedade de cadeia pesada

2 (HCDR2) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:

185; uma região determinante de complementariedade de cadeia pesada 3 (HCDR3) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID

NO: 187; uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 1 (LCDR1) tendo a sequência de aminoácidos da

SEQ ID NO: 188; uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 2 (LCDR2) tendo a sequência de aminoácidos da

SEQ ID NO: 189; e uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 3 (LCDR3) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 190. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 humanizados aqui fornecidos se ligam ao mesmo epítopo HLA-A2 que um anticorpo que compreende: uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1

(HCDR1) tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 183;

uma região determinante de complementariedade de cadeia pesada 2 (HCDR2) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID

NO: 185; uma região determinante de complementariedade de cadeia pesada 3 (HCDR3) tendo a sequência de aminoácidos da

SEQ ID NO: 187; uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 1 (LCDR1) tendo a sequência de aminoácidos da

SEQ ID NO: 189; e uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 3 (LCDR3) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 190. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 humanizados aqui fornecidos competem pela ligação ao HLA-A2 com um anticorpo BB7.2.

[171] Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA- A2 humanizados aqui fornecidos se ligam ao mesmo epítopo HLA-A2 que um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 humanizados aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo HLA-A selecionado de um ou mais de HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68, em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 humanizados aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo HLA-A selecionado entre dois ou mais de HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68, em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 humanizados aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo HLA-A selecionado dentre três ou mais de HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68, em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 humanizados aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo HLA-A selecionado dentre quatro ou mais de HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68, em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA- A2 humanizados aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo HLA-A selecionado dentre cinco ou mais de

HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33,

HLA-A*36, HLA-A*68, em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 humanizados aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo

HLA-A selecionado entre seis ou mais de HLA-A*03, HLA-A*25,

HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68,

em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 humanizados aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo HLA-A selecionado dentre sete ou mais de HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-

A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68, em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-

A2 humanizados aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo de HLA-A selecionado de cada um de HLA-

A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-

A*36, HLA-A*68, em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 humanizados aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo

HLA-A selecionado de um ou mais de HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-

A*30, como comparado com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 humanizados aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo

HLA-A selecionado entre dois ou mais de HLA-A*25, HLA-A*29,

HLA-A*30, como comparado com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 humanizados aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo de

HLA-A selecionado de cada um de HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-

A*30, em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 humanizados aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um dos HLA-

A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01,

HLA-A*33:01, HLA-A*36:01 e HLA-A*68:01, em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-

A2 humanizados aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos dois de HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-

A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01 e HLA-

A*68:01, em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 humanizados aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos três de HLA-

A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01,

A2 humanizados aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos quatro de HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-

A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01 e HLA-

A*68:01, em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 humanizados aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos cinco dos HLA-

A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01,

A2 humanizados aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos seis dos HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-

A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01 e HLA-

A*68:01, em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 humanizados aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos sete dos HLA-

A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01,

A2 humanizados aqui fornecidos têm menos reatividade a HLA-

A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01,

A2 humanizados aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um dos HLA-A*25:01, HLA-A*29:02 e HLA-A*30:01, em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 humanizados aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos dois de HLA-A*25:01, HLA-A*29:02 e

HLA-A*30:01, em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 humanizados aqui fornecidos têm menos reatividade a HLA-A*25:01, HLA-A*29:02 e HLA-A*30:01, em comparação com um BB7.2 anticorpo.

Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 humanizados aqui fornecidos têm menos reatividade ao HLA-A*25:01 em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 humanizados aqui fornecidos têm menos reatividade ao HLA-A*29:02 em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 humanizados aqui fornecidos têm menos reatividade ao HLA- A*30:01 em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 humanizados aqui fornecidos têm menos reatividade ao HLA-A*03:01 em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 humanizados aqui fornecidos têm menos reatividade ao HLA-A*31:01 em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 humanizados aqui fornecidos têm menos reatividade ao HLA- A*33:01 em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 humanizados aqui fornecidos têm menos reatividade ao HLA-A*36:01 em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 humanizados aqui fornecidos têm menos reatividade ao HLA-A*68:01 em comparação com um anticorpo BB7.2. O anticorpo BB7.2 pode ser isolado a partir do hibridoma BB7.2 (depósito ATCC No. HB-82).

[172] As técnicas para determinar a reatividade dos anticorpos anti-HLA-A2 humanizados contra os subtipos de HLA-A seriam conhecidas dos técnicos especialistas no assunto. Por exemplo, a reatividade dos anticorpos humanizados anti-HLA-A2 aos subtipos de HLA-A pode ser determinada por um único ensaio de grânulos de antígeno.

Esses ensaios de grânulos de antígeno único estão disponíveis comercialmente (por exemplo, anticorpo de antígeno simples FlowPRA; ONE LAMBDA).

[173] Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA- A2 humanizados aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo HLA-A selecionado de um ou mais de HLA- A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA- A*36, HLA-A*68 e qualquer combinação dos mesmos, em comparação com um anticorpo BB7.2, por exemplo, em comparação com um BB7.2 scFv quando medido nas condições do Teste A.

Por exemplo, em algumas modalidades, os anticorpos anti-HLA- A2 humanizados aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo de HLA-A selecionado de um ou mais de HLA- A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, e qualquer combinação dos mesmos, em comparação com um anticorpo BB7.2, por exemplo, em comparação com um BB7.2 scFv quando medido nas condições do Teste A.

Teste A:

[174] 0,25.106 células T que expressam um CAR compreendendo o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado ou um anticorpo BB7.2, por exemplo, um scFv BB7.2 (mA2 CAR)) são incubados com painel de grânulos de anticorpo de antígeno único FlowPRA (FL1HD01, FL1HD02, FL1HD03, FL1HD04, FL1HD06 e FL1HD08, One Lambda) e corante de viabilidade fixável (FVD, ThermoFisher, 65-0865-14, eBioscience) por 30 minutos em temperatura ambiente. As amostras são lavadas, fixadas com formaldeído a 0,5% e analisadas por citometria de fluxo.

Duzentos grânulos de controle negativo são adquiridos por amostra. Apenas os grânulos foram usados como controle negativo. Para análise, as células mortas são primeiramente eliminadas usando o corante de viabilidade fixável. Os grânulos de antígeno único são então fechados após exclusão de células mortas e dupletos. Então, o número de grânulos por HLA é determinado pelo respectivo pico de intensidade de PE. Os dados são normalizados multiplicando o número de grânulos de interesse em cada pico do HLA por 200, dividido pelo número de grânulos negativas na amostra. Para cada pico de HLA, o percentual de ligação relativa de Tregs CAR comparada ao controle (células que não expressam CAR) é determinado subtraindo o número de grânulos no CAR-Treg do número de grânulos na amostra de controle e dividindo o número médio de grânulos no controle que não expressam CAR, multiplicado por 100.

[175] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado da invenção tem uma reatividade com pelo menos um subtipo HLA-A selecionado do grupo que compreende HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33,

HLA-A*36, HLA-A*68 estatisticamente inferior a um anticorpo BB7.2, por exemplo, quando medido nas condições do teste A.

[176] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 da invenção possui uma reatividade a pelo menos um subtipo HLA-A selecionado do grupo que compreende HLA-A*25, HLA- A*29, HLA-A*30 estatisticamente inferior a um anticorpo BB7.2, por exemplo, quando medido nas condições do Teste A.

[177] Em uma modalidade, o termo “estatisticamente inferior” significa que a reatividade (por exemplo, a ligação relativa nas condições do Teste A) medida para o anticorpo anti-HLA-A2 da invenção é inferior à reatividade medida para um anticorpo BB7.2 com um valor p de no máximo cerca de 0,05, preferencialmente no máximo cerca de 0,01, mais preferencialmente, no máximo cerca de 0,005 e ainda mais preferencialmente no máximo cerca de 0,001, em particular quando analisado por ANOVA de duas vias, pós-teste de Dunnett.

[178] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 da invenção possui uma reatividade para pelo menos um subtipo HLA-A selecionado do grupo que compreende HLA-A*03, HLA- A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA- A*36, HLA-A*68 inferior a um anticorpo BB7.2 Em algumas modalidades, esse anticorpo anti-HLA-A2 tem uma ligação relativa para pelo menos um subtipo HLA-A selecionado do grupo que compreende HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30,

HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 inferior a um anticorpo BB7.2 quando medido nas condições do Teste A.

Em certos aspectos, a ligação relativa medida para esse anticorpo anti-HLA-A2 é no máximo cerca de 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% ou menos da ligação relativa medida para um anticorpo BB7.2.

[179] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 da invenção possui uma reatividade para pelo menos um subtipo HLA-A selecionado do grupo que compreende HLA-A*25, HLA- A*29, HLA-A*30 inferior a um anticorpo BB7.2 Em algumas modalidades, esse anticorpo anti-HLA-A2 tem uma ligação relativa para pelo menos um subtipo HLA-A selecionado do grupo que compreende HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30 inferior a um anticorpo BB7.2 quando medido nas condições do Teste A.

Em certos aspectos, a ligação relativa medida para esse anticorpo anti-HLA-A2 é no máximo cerca de 90%, 80%, 70%, 60%, 50 %, 40%, 30%, 20%, 10% ou menos da ligação relativa medida para um anticorpo BB7.2.

[180] Além disso, os anticorpos anti-HLA-A2 humanizados aqui fornecidos com atividade de ligação ao antígeno são capazes de constituir domínios de ligação ao antígeno dos receptores quiméricos do antígeno (CARs), em que esses CARs são capazes de serem expressos em células humanas, de modo que os CARs se liguem especificamente ao HLA-A2. Em uma modalidade, os CARs se ligam especificamente ao HLA-A*02:01. Como seria apreciado por um técnico especialista no assunto, a capacidade de um CAR se ligar ao HLA-A2 pode ser detectada através do uso de técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, a ligação de um CAR ao HLA-A2 pode ser detectada através do uso de um tetrâmero HLA-A2, como aqui exemplificado. Em uma modalidade, a célula humana é uma célula imunológica. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula imunológica reguladora. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula T reguladora (Treg). Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula T. Em uma modalidade, a célula T é uma Treg. Além disso, os anticorpos anti-HLA-A2 humanizados aqui fornecidos com atividade de ligação ao antígeno são capazes de constituir domínios de ligação ao antígeno dos receptores quiméricos do antígeno (CARs), em que esses CARs são capazes de serem expressos em uma célula T reguladora (Treg), de modo que o Os CARs se ligam especificamente ao HLA-A2. Em uma modalidade, os CARs se ligam especificamente ao HLA-A*02:01.

Em uma modalidade, a Treg é uma Treg humana.

[181] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado é capaz de constituir um domínio de ligação ao antígeno de um CAR, em que esse CAR é capaz de ser expresso em uma célula imunológica, de modo que a célula imunológica seja ativada por HLA-A2. Em uma modalidade, a célula imunológica é ativada por HLA-A*02:01. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula imunológica reguladora. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula T reguladora (Treg). Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula T. Em uma modalidade, a célula T é uma Treg. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula imunológica humana. Em uma modalidade, a célula imunológica reguladora é uma célula imunológica reguladora humana. Em uma modalidade, a célula T é uma célula T humana. Em uma modalidade, a Treg é uma Treg humana.

[182] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SYHIQ (SEQ ID NO: 1) e GYTFTSY (SEQ ID NO: 2).

[183] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região determinante de complementaridade 1 (VH CDR1) selecionada a partir de SEQ ID NOs:1-2. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo um VH CDR1 estabelecido pela SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo um VH CDR1 estabelecido pela SEQ ID NO: 2.

[184] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: YPGDGS (SEQ ID NO: 4) e WIYPGDGSTX10YX12X13KFX16G (SEQ ID NO: 10), em que na SEQ ID NO: 10, o aminoácido na posição 10 (X10) é Q ou K, o aminoácido na posição 12 (X12) é N ou S, o aminoácido na posição 13 (X13) é E ou Q e o amino o ácido na posição 16 (X16) é K ou Q.

[185] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos WIYPGDGSTX10YX12X13KFX16G (SEQ ID NO: 10), em que o aminoácido na posição 10 (X10) é Q ou K, o aminoácido na posição 12 (X12) é N ou S, o aminoácido na posição 13 (X13) é E ou Q, e o aminoácido na posição 16 (X16) é K ou Q.

[186] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região determinante de complementaridade 2 (VH CDR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: YPGDGS (SEQ ID NO: 4) e WIYPGDGSTX10YX12X13KFX16G (SEQ ID NO: 10), em que na SEQ ID NO: 10, o aminoácido na posição 10 (X10) é Q ou K, o aminoácido na posição 12 (X12) é N ou S, o aminoácido na posição 13 (X13) é E ou Q e o aminoácido na posição 16 (X16) é K ou Q. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região determinante de complementaridade

2 (VH CDR2) compreendendo a sequência de aminoácidos

WIYPGDGSTX10YX12X13KFX16G (SEQ ID NO: 10), em que o aminoácido na posição 10 (X10) é Q ou K, o aminoácido na posição 12 (X12)

é N ou S, o aminoácido na posição 13 (X13) é E ou Q, e o aminoácido na posição 16 (X16) é K ou Q.

Em uma modalidade,

a região variável da cadeia pesada compreende um VH CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na

SEQ ID NO: 10, em que o aminoácido na posição 10 é Q ou K,

o aminoácido na posição 12 é S, o aminoácido na posição 13 é Q e o aminoácido na posição 16 é Q.

Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende um VH CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na

SEQ ID NO: 10, em que o aminoácido na posição 10 é K, o aminoácido na posição 12 é N ou S, o aminoácido na posição

13 é Q e o aminoácido na posição 16 é Q.

Em uma modalidade,

a região variável de cadeia pesada compreende um VH CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na

SEQ ID NO: 10, em que o aminoácido na posição 10 é K, o aminoácido na posição 12 é S, o aminoácido na posição 13 é

E ou Q e o aminoácido na posição 16 é Q.

Em uma modalidade,

Q e o aminoácido na posição 16 é K ou Q.

Em uma modalidade,

SEQ ID NO: 10, em que o aminoácido na posição 10 é Q ou K,

o aminoácido na posição 12 é N ou S, o aminoácido na posição

13 é Q e o aminoácido na posição 16 é Q.

Em uma modalidade,

o região variável de cadeia pesada compreende uma VH CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na

SEQ ID NO: 10, em que o aminoácido na posição 10 é Q ou K,

o aminoácido na posição 12 é S, o aminoácido na posição 13 é E ou Q e o aminoácido na posição 16 é Q.

Em uma modalidade,

o a região variável de cadeia pesada compreende uma VH CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na

SEQ ID NO: 10, em que o aminoácido na posição 10 é Q ou K,

o aminoácido na posição 12 é S, o aminoácido na posição 13 é Q e o aminoácido na posição 16 é K ou Q.

Em uma modalidade,

a região variável de cadeia pesada compreende uma VH CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na

13 é E ou Q e o aminoácido na posição 16 é Q.

Em uma modalidade, o a região variável de cadeia pesada compreende uma VH CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 10, em que o aminoácido na posição

10 é K, o aminoácido na posição 12 é N ou S, o aminoácido na posição 13 é Q e o aminoácido na posição 16 é K ou Q. Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende uma VH CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 10, em que o aminoácido na posição 10 é K, o aminoácido na posição 12 é S, o aminoácido na posição 13 é E ou Q e o aminoácido na posição 16 é K ou Q.

Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende uma VH CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 10, em que o aminoácido na posição 10 é Q ou K, o aminoácido na posição 12 é N ou S, o aminoácido na posição 13 é E ou Q e o aminoácido na posição 16 é Q. Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma VH CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 10, em que o aminoácido na posição 10 é Q ou K, o aminoácido na posição 12 é N ou S, o aminoácido na posição 13 é Q e o aminoácido na posição 16 é K ou Q. Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma VH CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 10, em que o aminoácido na posição 10 é Q ou K, o aminoácido na posição 12 é S, o aminoácido na posição 13 é E ou Q e o aminoácido na posição 16 é K ou Q.

Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma VH CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 10, em que o aminoácido na posição 10 é K, o aminoácido na posição 12 é N ou S, o aminoácido na posição 13 é E ou Q e o aminoácido na posição 16 é K ou Q.

[187] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: WIYPGDGSTQYNEKFKG (SEQ ID NO: 3), YPGDGS (SEQ ID NO: 4), and WIYPGDGSTKYSQKFQG (SEQ ID NO: 5). Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: WIYPGDGSTQYNEKFKG (SEQ ID NO: 3) e YPGDGS (SEQ ID NO: 4). Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: YPGDGS (SEQ ID NO: 4) e WIYPGDGSTKYSQKFQG (SEQ ID NO: 5).

[188] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida pela SEQ ID NO: 3. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida pela SEQ ID NO: 4. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida pela SEQ ID NO: 5.

[189] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região determinante de complementaridade 2 (VH CDR2) selecionada a partir de SEQ ID NOs: 3-5. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região determinante de complementaridade 2 (VH CDR2) selecionada a partir de SEQ ID NOs: 3-4. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região determinante de complementaridade 2 (VH CDR2) selecionada a partir de SEQ ID NOs: 4-5. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região determinante de complementaridade 2 (VH CDR2) estabelecida pela SEQ ID NO: 5. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma VH CDR2 estabelecida pela SEQ ID NO: 3. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma VH CDR2 estabelecida pela SEQ ID NO: 4.

[190] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos EGTYYAMDY (SEQ ID NO: 6).

[191] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região determinante de complementaridade 3 (VH CDR3) estabelecida pela SEQ ID NO: 6.

[192] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo pelo menos uma das seguintes CDRs: uma VH CDR1 estabelecida pela SEQ ID NO: 1; ou uma VH CDR2 estabelecida pela SEQ ID NO: 10, em que o aminoácido na posição 10 (X10) é Q ou K, o aminoácido na posição 12 (X12) é N ou S, o aminoácido na posição 13 (X13) é E ou Q, e o aminoácido na posição 16 (X16) é K ou Q; ou uma VH CDR3 estabelecida pela SEQ ID NO: 6.

[193] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo pelo menos uma das seguintes CDRs: uma VH CDR1 estabelecida pela SEQ ID NO: 1; ou uma VH CDR2 estabelecida pela SEQ ID NO: 3; ou um VH CDR3 estabelecida pela SEQ ID NO: 6.

[194] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo pelo menos uma das seguintes CDRs: uma VH CDR1 estabelecida pela SEQ ID NO: 1; ou uma VH CDR2 estabelecida pela SEQ ID NO: 5; ou uma VH CDR3 estabelecida pela SEQ ID NO: 6.

[195] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma VH CDR1 estabelecida pela SEQ ID NO: 1; uma VH CDR2 estabelecida pela SEQ ID NO: 10, em que o aminoácido na posição 10 (X10) é Q ou K, o aminoácido na posição 12 (X12) é N ou S, o aminoácido na posição 13 (X13) é E ou Q, e o aminoácido o ácido na posição 16 (X16) é K ou Q; e uma VH CDR3 estabelecida pela SEQ ID NO: 6.

[196] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma VH CDR1 estabelecida pela SEQ ID NO: 1; uma VH CDR2 estabelecida pela SEQ ID NO: 3; e uma VH CDR3 estabelecida pela SEQ ID NO: 6.

[197] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma VH CDR1 estabelecida pela SEQ ID NO: 1; uma VH CDR2 estabelecida pela SEQ ID NO: 5; e uma VH CDR3 estabelecida pela SEQ ID NO: 6.

[198] De acordo com a presente invenção, qualquer uma das CDRs 1, 2 ou 3 da cadeia pesada pode ser caracterizada como tendo uma sequência de aminoácidos que compartilha pelo menos cerca de 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com os conjuntos específicos de CDRs listados nas SEQ ID NOs correspondentes: 1, 3, 5, 6 e

10.

[199] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo pelo menos uma das seguintes CDRs: uma VH CDR1 estabelecida pela SEQ ID NO: 2; ou uma VH CDR2 estabelecida pela SEQ ID NO: 4; ou uma VH CDR3 estabelecida pela SEQ ID NO: 6

[200] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma VH CDR1 estabelecida pela SEQ ID NO: 2; uma VH CDR2 estabelecida pela SEQ ID NO: 4; e uma VH CDR3 estabelecida pela SEQ ID NO: 6.

[201] De acordo com a presente invenção, qualquer uma das CDRs 1, 2 ou 3 da cadeia pesada pode ser caracterizada como tendo uma sequência de aminoácidos que compartilha pelo menos cerca de 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com os conjuntos específicos das CDRs listadas nas SEQ ID NOs correspondentes: 2, 4 e 6.

[202] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos RSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO: 7).

[203] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo uma região determinante de complementaridade 1 (VL CDR1) estabelecida pela SEQ ID NO: 7.

[204] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos KVSNRFS (SEQ ID NO: 8).

[205] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo uma região determinante de complementaridade 2 (VL CDR2) estabelecida pela SEQ ID NO: 8.

[206] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos FQGSHVPRT (SEQ ID NO: 9).

[207] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo uma região determinante de complementaridade 3 (VL CDR3) estabelecida pela SEQ ID NO: 9.

[208] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo pelo menos uma das seguintes CDRs: uma VL CDR1 estabelecida pela SEQ ID NO: 7; ou uma VL CDR2 estabelecida pela SEQ ID NO: 8; ou uma VL CDR3 estabelecida pela SEQ ID NO: 9.

[209] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo uma VL CDR1 estabelecida pela SEQ ID NO: 7; uma VL CDR2 estabelecida pela SEQ ID NO: 8; e um VL CDR3 estabelecido pela SEQ ID NO: 9.

[210] De acordo com a presente invenção, qualquer uma das CDRs 1, 2 ou 3 da cadeia leve pode ser caracterizada como tendo uma sequência de aminoácidos que compartilha pelo menos cerca de 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com os conjuntos específicos de CDRs listados nas SEQ ID NOs correspondentes: 7, 8 e 9.

[211] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região estrutural 1 (VH FR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS (SEQ ID NO: 11) e QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 12).

[212] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região estrutural 1 (VH FR1) compreendendo a sequência de aminoácidos QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS (SEQ ID NO: 11). Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região estrutural 1 (VH FR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade para SEQ ID NO:

11.

[213] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região estrutural 1 (VH FR1) compreendendo a sequência de aminoácidos QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 12). Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região estrutural 1 (VH FR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade para SEQ ID NO:

12.

[214] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região estrutural 2 (VH FR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em:

WVRQAPGQX9LEWMGX15 (SEQ ID NO: 13), WVRQAPGQX9LEWMGX15WI (SEQ ID NO: 17), HIQWVRQAPGQX12LEWMGX18WI (SEQ ID NO: 21) e HIQWVRQAPGQX12LEWMGX18 (SEQ ID NO: 25), em que: X9 é R ou G e X15 é I ou ausente na SEQ ID NO: 13; X9 é R ou G e X15 é I ou ausente na SEQ ID NO: 17; X12 é R ou G e X18 é I ou ausente na SEQ ID NO: 21; e X12 é R ou G e X18 é I ou ausente na SEQ ID NO: 25.

[215] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região estrutural 2 (VH FR2) compreendendo a sequência de aminoácidos WVRQAPGQX9LEWMGX15 (SEQ ID NO: 13), em que o aminoácido na posição 9 (X9) é R ou G, e o aminoácido na posição 15 (X15) é I ou está ausente.

[216] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 2 (VH FR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 13, em que o aminoácido na posição 9 é R ou G e o aminoácido na posição 15 está ausente.

[217] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 2 (VH FR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 14, 15, ou 16. Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 2 (VH FR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88 %, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 14, 15, ou 16.

[218] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região estrutural 2 (VH FR2) compreendendo a sequência de aminoácidos HIQWVRQAPGQX12LEWMGX18 (SEQ ID NO: 25), em que o aminoácido na posição 12 (X12) é R ou G, e o aminoácido na posição 18 (X18) é I ou está ausente.

[219] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 2 (VH FR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 25, em que o aminoácido na posição 12 é R ou G e o aminoácido na posição 18 está ausente.

[220] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 2 (VH FR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 26, 27, ou 28. Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 2 (VH FR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88 %, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 26, 27, ou 28.

[221] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região estrutural 2 (VH FR2) compreendendo a sequência de aminoácidos WVRQAPGQX9LEWMGX15WI (SEQ ID NO: 17), em que o aminoácido na posição 9 (X9) é R ou G, e o aminoácido na posição 15 (X15) é I ou está ausente.

[222] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 2 (VH FR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 17, em que o aminoácido na posição 9 é R ou G e o aminoácido na posição 15 está ausente.

[223] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 2 (VH FR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 18, 19, ou 20. Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 2 (VH FR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88 %, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 18, 19, ou 20.

[224] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região estrutural 2 (VH FR2) compreendendo a sequência de aminoácidos HIQWVRQAPGQX12LEWMGX18WI (SEQ ID NO: 21), em que o aminoácido na posição 12 (X12) é R ou G, e o aminoácido na posição 18 (X18) é I ou ausente.

[225] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 2 (VH FR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 21, em que o aminoácido na posição 12 é R ou G e o aminoácido na posição 18 está ausente.

[226] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 2 (VH FR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 22, 23, ou 24. Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 2 (VH FR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88 %, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 22, 23, ou 24.

[227] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: X1VTX4TX6DTSX10STAYMX16LSX19LRSX23DX25AVYYCAR (SEQ ID NO: 29), TX2YX4X5KFX8GX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34 AVYYCAR (SEQ ID NO: 35), TQYNEKFKGX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34 AVYYCAR (SEQ ID NO: 36) e

TKYSQKFQGX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34AVYYCAR (SEQ ID NO: 37), em que: X1 é R ou ausente, X4 é I ou M, X6 é R ou A, X10 é A, T ou I, X16 é E ou L, X19 é S ou R, X23 é E ou D e X25 é T ou M na SEQ ID NO: 29; X2 é Q ou K, X4 é N ou S, X5 é E ou Q, X8 é K ou Q, X10 é R ou ausente, X13 é I ou M, X15 é R ou A, X19 é A, T ou I, X25 é E ou L, X28 é S ou R, X32 é E ou D e X34 é T ou M na SEQ ID NO: 35; X10 é R ou ausente, X13 é I ou M, X15 é R ou A, X19 é A, T ou I, X25 é E ou L, X28 é S ou R, X32 é E ou D e X34 é T ou M na SEQ ID NO: 36; e X10 é R ou ausente, X13 é I ou M, X15 é R ou A, X19 é A, T ou I, X25 é E ou L, X28 é S ou R, X32 é E ou D e X34 é T ou M na SEQ ID NO: 37.

[228] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo a sequência de aminoácidos X1VTX4TX6DTSX10STAYMX16LSX19LRSX23DX25AVYYCAR (SEQ ID NO: 29), em que o aminoácido na posição 1 (X1) é R ou ausente, o aminoácido na posição 4 (X4) é I ou M, o aminoácido na posição 6 (X6) é R ou A, o aminoácido na posição 10 (X10) é A, T ou I, o aminoácido na posição 16 (X16) é E ou L, o aminoácido na posição 19 (X19) é S ou R, o aminoácido na posição 23 (X23) é E ou D e o aminoácido na posição 25 (X25) é T ou M.

[229] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 29, em que o aminoácido na posição 1 é R, o aminoácido na posição 4 é I ou M, o aminoácido na posição 6 é R, o aminoácido na posição 10 é A ou I, o aminoácido na posição 16 é E, o aminoácido na posição 19 é S ou R, o aminoácido na posição 23 é E ou D e o aminoácido na posição 25 é T ou M.

[230] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida pela SEQ ID NO: 29, em que o aminoácido na posição 1 é R, o aminoácido na posição 4 é I ou M, o aminoácido na posição 6 é R, o aminoácido na posição 10 é A ou I, o aminoácido na posição 16 é E, o aminoácido na posição 19 é S ou R, o aminoácido na posição 23 é E ou D e o aminoácido na posição 25 é T.

[231] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida pela SEQ ID NO: 29, em que o aminoácido na posição 1 é R, o aminoácido na posição 4 é I, o aminoácido na posição 6 é R,

o aminoácido na posição 10 é A, o aminoácido na posição 16 é E, o amino o ácido na posição 19 é S, o aminoácido na posição 23 é E, e o aminoácido na posição 25 é T ou M.

[232] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 30, 31, 32, 33 ou 34. Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos com cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88 %, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 30, 31, 32, 33 ou 34.

[233] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo a sequência de aminoácidos TX2YX4X5KFX8GX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34AVYYCAR (SEQ ID NO: 35), em que o aminoácido na posição 2 (X2) é Q ou K, o aminoácido na posição 4 (X 4) é N ou S, o aminoácido na posição 5 (X5) é E ou Q, o aminoácido na posição 8 (X8) é K ou Q, o aminoácido na posição 10 (X10) é R ou ausente, o aminoácido na posição 13 (X13) é I ou M, o aminoácido na posição 15 (X15) é R ou A, o aminoácido na posição 19 (X19) é A, T ou I, o aminoácido na posição 25 (X25) é E ou L, o aminoácido na posição 28 (X28) é S ou R, o aminoácido na posição 32 (X32) é E ou D e o aminoácido na posição 34 (X34) é T ou M.

[234] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 35, em que o aminoácido na posição 2 é Q ou K, o aminoácido na posição 4 é N ou S, o aminoácido na posição 5 é E ou Q, o aminoácido na posição 8 é K ou Q, o aminoácido na posição 10 é R, o aminoácido na posição 13 é I ou M, o aminoácido na posição 15 é R, o aminoácido na posição 19 é A ou I, o aminoácido na posição 25 é E, o aminoácido na posição 28 é S ou R, o aminoácido na posição 32 é E ou D e o aminoácido na posição 34 é T ou M.

[235] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 35, em que o aminoácido na posição 2 é Q ou K, o aminoácido na posição 4 é N ou S, o aminoácido na posição 5 é E ou Q, o aminoácido na posição 8 é K ou Q, o aminoácido na posição 10 é R, o aminoácido na posição 13 é I ou M, o aminoácido na posição 15 é R, o aminoácido na posição 19 é A ou I, o aminoácido na posição 25 é E, o aminoácido na posição 28 é S ou R, o aminoácido na posição 32 é E ou D e o aminoácido na posição 34 é T.

[236] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 35, em que o aminoácido na posição 2 é Q ou K, o aminoácido na posição 4 é N ou S, o aminoácido na posição 5 é E ou Q, o aminoácido na posição 8 é K ou Q, o aminoácido na posição 10 é R, o aminoácido na posição 13 é I, o aminoácido na posição 15 é R, o aminoácido na posição 19 é A, o aminoácido na posição 25 é E, o aminoácido na posição 28 é S, o aminoácido na posição 32 é E e o aminoácido na posição 34 é T ou M.

[237] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 35, em que o aminoácido na posição 2 é Q ou K, o aminoácido na posição 4 é N, o aminoácido na posição 5 é E, o aminoácido na posição 8 é K, o aminoácido na posição 8 é R, o aminoácido na posição 13 é I ou M, o aminoácido na posição 15 é R, o aminoácido na posição 19 é A ou I, o aminoácido na posição 25 é E, o aminoácido na posição 28 é S ou R, o aminoácido na posição 32 é E ou D e o aminoácido na posição 34 é T ou M.

[238] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na

SEQ ID NO: 35, em que o aminoácido na posição 2 é Q, o aminoácido na posição 4 é N ou S, o aminoácido na posição 5 é E, o aminoácido na posição 8 é K, o aminoácido na posição 10 é R, o aminoácido na posição 13 é I ou M, o aminoácido na posição 15 é R, o aminoácido na posição 19 é A ou I, o aminoácido na posição 25 é E, o aminoácido na posição 28 é S ou R, o aminoácido na posição 32 é E ou D e o aminoácido na posição 34 é T ou M.

[239] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 35, em que o aminoácido na posição 2 é Q, o aminoácido na posição 4 é N, o aminoácido na posição 5 é E ou Q, o aminoácido na posição 8 é K, o aminoácido na posição 10 é R, o aminoácido na posição 13 é I ou M, o aminoácido na posição 15 é R, o aminoácido na posição 19 é A ou I, o aminoácido na posição 25 é E, o aminoácido na posição 28 é S ou R, o aminoácido na posição 32 é E ou D e o aminoácido na posição 34 é T ou M.

[240] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 35, em que o aminoácido na posição 2 é Q, o aminoácido na posição 4 é N, o aminoácido na posição 5 é E, o aminoácido na posição 8 é K ou Q, o aminoácido na posição

10 é R, o aminoácido na posição 13 é I ou M, o aminoácido na posição 15 é R, o aminoácido na posição 19 é A ou I, o aminoácido na posição 25 é E, o aminoácido na posição 28 é S ou R, o aminoácido na posição 32 é E ou D e o aminoácido na posição 34 é T ou M.

[241] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 35, em que o aminoácido na posição 2 é Q ou K, o aminoácido na posição 4 é N ou S, o aminoácido na posição 5 é E, o aminoácido na posição 8 é K, o aminoácido na posição 10 é R, o aminoácido na posição 13 é I ou M, o aminoácido na posição 15 é R, o aminoácido na posição 19 é A ou I, o aminoácido na posição 25 é E, o aminoácido na posição 28 é S ou R, o aminoácido na posição 32 é E ou D e o aminoácido na posição 34 é T ou M.

[242] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 35, em que o aminoácido na posição 2 é Q ou K, o aminoácido na posição 4 é N, o aminoácido na posição 5 é E ou Q, o aminoácido na posição 8 é K, o aminoácido na posição 10 é R, o aminoácido na posição 13 é I ou M, o aminoácido na posição 15 é R, o aminoácido na posição 19 é A ou I, o aminoácido na posição 25 é E, o aminoácido na posição 28 é

S ou R, o aminoácido na posição 32 é E ou D e o aminoácido na posição 34 é T ou M.

[243] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 35, em que o aminoácido na posição 2 é Q ou K, o aminoácido na posição 4 é N, o aminoácido na posição 5 é E, o aminoácido na posição 8 é K ou Q, o aminoácido na posição 10 é R, o aminoácido na posição 13 é I ou M, o aminoácido na posição 15 é R, o aminoácido na posição 19 é A ou I, o aminoácido na posição 25 é E, o aminoácido na posição 28 é S ou R, o aminoácido na posição 32 é E ou D e o aminoácido na posição 34 é T ou M.

[244] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 35, em que o aminoácido na posição 2 é Q, o aminoácido na posição 4 é N ou S, o aminoácido na posição 5 é E ou Q, o aminoácido na posição 8 é K, o aminoácido na posição 10 é R, o aminoácido na posição 13 é I ou M, o aminoácido na posição 15 é R, o aminoácido na posição 19 é A ou I, o aminoácido na posição 25 é E, o aminoácido na posição 28 é S ou R, o aminoácido na posição 32 é E ou D e o aminoácido na posição 34 é T ou M.

[245] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 35, em que o aminoácido na posição 2 é Q, o aminoácido na posição 4 é N ou S, o aminoácido na posição 5 é E, o aminoácido na posição 8 é K ou Q, o aminoácido na posição 10 é R, o aminoácido na posição 13 é I ou M, o aminoácido na posição 15 é R, o aminoácido na posição 19 é A ou I, o aminoácido na posição 25 é E, o aminoácido na posição 28 é S ou R, o aminoácido na posição 32 é E ou D e o aminoácido na posição 34 é T ou M.

[246] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 35, em que o aminoácido na posição 2 é Q, o aminoácido na posição 4 é N, o aminoácido na posição 5 é E ou Q, o aminoácido na posição 8 é K ou Q, o aminoácido na posição 10 é R, o aminoácido na posição 13 é I ou M, o aminoácido na posição 15 é R, o aminoácido na posição 19 é A ou I, o aminoácido na posição 25 é E, o aminoácido na posição 28 é S ou R, o aminoácido na posição 32 é E ou D e o aminoácido na posição 34 é T ou M.

[247] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na

SEQ ID NO: 35, em que o aminoácido na posição 2 é Q ou K, o aminoácido na posição 4 é N ou S, o aminoácido na posição 5 é E ou Q, o aminoácido na posição 8 é K, o aminoácido na posição 10 é R, o aminoácido na posição 13 é I ou M, o aminoácido na posição 15 é R, o aminoácido na posição 19 é A ou I, o aminoácido na posição 25 é E, o aminoácido na posição 28 é S ou R, o aminoácido na posição 32 é E ou D e o aminoácido na posição 34 é T ou M.

[248] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 35, em que o aminoácido na posição 2 é Q ou K, o aminoácido na posição 4 é N ou S, o aminoácido na posição 5 é E, o aminoácido na posição 8 é K ou Q, o aminoácido na posição 10 é R, o aminoácido na posição 13 é I ou M, o aminoácido na posição 15 é R, o aminoácido na posição 19 é A ou I, o aminoácido na posição 25 é E, o aminoácido na posição 28 é S ou R, o aminoácido na posição 32 é E ou D e o aminoácido na posição 34 é T ou M.

[249] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 35, em que o aminoácido na posição 2 é Q ou K, o aminoácido na posição 4 é N, o aminoácido na posição 5 é E ou Q, o aminoácido na posição 8 é K ou Q, o aminoácido na posição 10 é R, o aminoácido na posição 13 é I ou M, o aminoácido na posição 15 é R, o aminoácido na posição 19 é A ou I, o aminoácido na posição 25 é E, o aminoácido na posição 28 é S ou R, o aminoácido na posição 32 é E ou D e o aminoácido na posição 34 é T ou M.

[250] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 35, em que o aminoácido na posição 2 é Q, o aminoácido na posição 4 é N ou S, o aminoácido na posição 5 é E ou Q, o aminoácido na posição 8 é K ou Q, o aminoácido na posição 10 é R, o aminoácido na posição 13 é I ou M, o aminoácido na posição 15 é R, o aminoácido na posição 19 é A ou I, o aminoácido na posição 25 é E, o aminoácido na posição 28 é S ou R, o aminoácido na posição 32 é E ou D e o aminoácido na posição 34 é T ou M.

[251] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo a sequência de aminoácidos TQYNEKFKGX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34AVYYCAR (SEQ ID NO: 36), em que o aminoácido na posição 10 (X10) é R ou ausente, o aminoácido na posição 13 (X13) é I ou M, o aminoácido na posição 15 (X15) é R ou A, o aminoácido na posição 19 (X19) é A, T ou I, o aminoácido na posição 25 (X25)

é E ou L, o aminoácido na posição 28 (X 28) é S ou R, o aminoácido na posição 32 (X32) é E ou D, e o aminoácido na posição 34 (X34) é T ou M.

[252] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 36, em que o aminoácido na posição 10 é R, o aminoácido na posição 13 é I ou M, o aminoácido na posição 15 é R, o aminoácido na posição 19 é A ou I, o aminoácido na posição 25 é E, o aminoácido na posição 28 é S ou R, o aminoácido na posição 32 é E ou D e o aminoácido na posição 34 é T ou M.

[253] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 36, em que o aminoácido na posição 10 é R, o aminoácido na posição 13 é I ou M, o aminoácido na posição 15 é R, o aminoácido na posição 19 é A ou I, o aminoácido na posição 25 é E, o aminoácido na posição 28 é S ou R, o aminoácido na posição 32 é E ou D e o aminoácido na posição 34 é T.

[254] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 36, em que o aminoácido na posição 10 é R, o aminoácido na posição 13 é I, o aminoácido na posição 15 é R, o aminoácido na posição 19 é A, o aminoácido na posição 25 é E, o aminoácido na posição 28 é S, o aminoácido na posição 32 é E, e o aminoácido na posição 34 é T ou M.

[255] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo a sequência de aminoácidos TKYSQKFQGX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34AVYYCAR (SEQ ID NO: 37), em que o aminoácido na posição 10 (X10) é R ou ausente, o aminoácido na posição 13 (X13) é I ou M, o aminoácido na posição 15 (X15) é R ou A, o aminoácido na posição 19 (X19) é A, T ou I, o aminoácido na posição 25 (X25) é E ou L, o aminoácido na posição 28 (X28) é S ou R, o aminoácido na posição 32 (X32) é E ou D, e o aminoácido na posição 34 (X34) é T ou M.

[256] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 37, em que o aminoácido na posição 10 é R, o aminoácido na posição 13 é I ou M, o aminoácido na posição 15 é R, o aminoácido na posição 19 é A ou I, o aminoácido na posição 25 é E, o aminoácido na posição 28 é S ou R, o aminoácido na posição 32 é E ou D e o aminoácido na posição 34 é T ou M.

[257] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 37, em que o aminoácido na posição 10 é R, o aminoácido na posição 13 é I ou M, o aminoácido na posição 15 é R, o aminoácido na posição 19 é A ou I, o aminoácido na posição 25 é E, o aminoácido na posição 28 é S ou R, o aminoácido na posição 32 é E ou D e o aminoácido na posição 34 é T.

[258] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 37, em que o aminoácido na posição 10 é R, o aminoácido na posição 13 é I, o aminoácido na posição 15 é R, o aminoácido na posição 19 é A, o aminoácido na posição 25 é E, o aminoácido na posição 28 é S, o aminoácido na posição 32 é E, e o aminoácido na posição 34 é T ou M.

[259] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 38, 39, 40, 41, 42 ou 43. Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos com cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88 %, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%

ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 38, 39, 40, 41, 42 ou

43.

[260] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região estrutural 4 (VH FR4) compreendendo a sequência de aminoácidos WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 44). Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região estrutural 4 (VH FR4) compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade para SEQ ID NO:

44.

[261] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende: uma VH CDR1 estabelecida pela SEQ ID NO: 1; uma VH CDR2 estabelecida pela SEQ ID NO: 10, em que o aminoácido na posição 10 (X10) é Q ou K, o aminoácido na posição 12 (X12) é N ou S, o aminoácido na posição 13 (X13) é E ou Q, e o aminoácido na posição 16 (X16) é K ou Q; uma VH CDR3 estabelecida pela SEQ ID NO: 6; uma VH FR1 estabelecida pela SEQ ID NO: 12; uma VH FR2 estabelecida pela SEQ ID NO: 13, em que o aminoácido na posição 9 (X9) é R ou G, e o aminoácido na posição 15 (X15) é I ou está ausente;

uma VH FR3 estabelecida pela SEQ ID NO: 29, em que o aminoácido na posição 1 (X1) é R ou ausente, o aminoácido na posição 4 (X4) é I ou M, o aminoácido na posição 6 (X6) é R ou A, o aminoácido na posição 10 (X10) é A, T ou I, o aminoácido na posição 16 (X16) é E ou L, o aminoácido na posição 19 (X19) é S ou R, o aminoácido na posição 23 (X23) é E ou D, e o aminoácido na posição 25 (X25) é T ou M; e uma VH FR4 estabelecida pela SEQ ID NO: 44.

[262] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende: uma VH CDR1 estabelecida pela SEQ ID NO: 2; uma VH CDR2 estabelecida pela SEQ ID NO: 10, em que o aminoácido na posição 10 (X10) é Q ou K, o aminoácido na posição 12 (X12) é N ou S, o aminoácido na posição 13 (X13) é E ou Q, e o aminoácido na posição 16 (X16) é K ou Q; uma VH CDR3 estabelecida pela SEQ ID NO: 6; uma VH FR1 estabelecida pela SEQ ID NO: 11; uma VH FR2 estabelecida pela SEQ ID NO: 25, em que o aminoácido na posição 12 (X12) é R ou G, e o aminoácido na posição 18 (X18) é I ou ausente; uma VH FR3 estabelecida pela SEQ ID NO: 29, em que o aminoácido na posição 1 (X1) é R ou ausente, o aminoácido na posição 4 (X4) é I ou M, o aminoácido na posição 6 (X6) é R ou A, o aminoácido na posição 10 (X10) é A, T ou I, o aminoácido na posição 16 (X16) é E ou L, o aminoácido na posição 19 (X19) é S ou R, o aminoácido na posição 23 (X23) é E ou D, e o aminoácido na posição 25 (X25) é T ou M; e uma VH FR4 estabelecida pela SEQ ID NO: 44.

[263] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende: uma VH CDR1 estabelecida pela SEQ ID NO: 2; a VH CDR2 estabelecida pela SEQ ID NO: 4; uma VH CDR3 estabelecida pela SEQ ID NO: 6; uma VH FR1 estabelecida pela SEQ ID NO: 11; uma VH FR2 estabelecida pela SEQ ID NO: 21, em que o aminoácido na posição 12 (X12) é R ou G, e o aminoácido na posição 18 (X18) é I ou ausente; uma VH FR3 estabelecida pela SEQ ID NO: 35, em que o aminoácido na posição 2 (X2) é Q ou K, o aminoácido na posição 4 (X 4) é N ou S, o aminoácido na posição 5 (X5) é E ou Q, o aminoácido na posição 8 (X8) é K ou Q, o aminoácido na posição 10 (X10) é R ou ausente, o aminoácido na posição 13 (X13) é I ou M, o aminoácido na posição 15 (X15) é R ou A, o aminoácido na posição 19 (X19) é A, T ou I, o aminoácido na posição 25 (X25) é E ou L, o aminoácido na posição 28 (X28) é S ou R, o aminoácido na posição 32 (X32) é E ou D e o aminoácido na posição 34 (X34) é T ou M; e uma VH FR4 estabelecida pela SEQ ID NO: 44.

[264] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende:

uma VH CDR1 estabelecida pela SEQ ID NO: 1; uma VH CDR2 estabelecida pela SEQ ID NO: 4; uma VH CDR3 estabelecida pela SEQ ID NO: 6; uma VH FR1 estabelecida pela SEQ ID NO: 12; uma VH FR2 estabelecida pela SEQ ID NO: 17, em que o aminoácido na posição 9 (X9) é R ou G e o aminoácido na posição 15 (X15) é I ou está ausente; uma VH FR3 estabelecida pela SEQ ID NO: 35, em que o aminoácido na posição 2 (X2) é Q ou K, o aminoácido na posição 4 (X4) é N ou S, o aminoácido na posição 5 (X5) é E ou Q, o aminoácido na posição 8 (X8) é K ou Q, o aminoácido na posição 10 (X10) é R ou ausente, o aminoácido na posição 13 (X13) é I ou M, o aminoácido na posição 15 (X15) é R ou A, o aminoácido na posição 19 (X19) é A, T ou I, o aminoácido na posição 25 (X25) é E ou L, o aminoácido na posição 28 (X28) é S ou R, o aminoácido na posição 32 (X32) é E ou D e o aminoácido na posição 34 (X34) é T ou M; e uma VH FR4 estabelecida pela SEQ ID NO: 44.

[265] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQX44LEWMGX50WIYPGD GSTX60YX62X63KFX66GX68VTX71TX73DTSX77STAYMX83LSX86LRSX90DX92AVYYCAR EGTYYAMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 45), em que o aminoácido na posição 44 (X44) é R ou G, o aminoácido na posição 50 (X50) é

I ou está ausente, o aminoácido na posição 60 (X60) é Q ou K, o aminoácido na posição 62 (X62) é N ou S, o aminoácido na posição 63 (X63) é E ou Q, o aminoácido na posição 66 (X66) é K ou Q, o aminoácido na posição 68 (X68) é R ou ausente, o aminoácido na posição 71 (X71) é I ou M, o aminoácido na posição 73 (X73) é R ou A, o aminoácido na posição 77 (X77) é A, T ou I, o aminoácido na posição 83 (X83) é E ou L, o aminoácido na posição 86 (X86) é S ou R, o aminoácido na posição 90 (X90) é E ou D, e o aminoácido na posição 92 (X92) é T ou M.

[266] Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 45, em que o aminoácido na posição 44 é R ou G; o aminoácido na posição 50 está ausente; o aminoácido na posição 60 é Q ou K; o aminoácido na posição 62 é N ou S; o aminoácido na posição 63 é E ou Q; o aminoácido na posição 66 é K ou Q; o aminoácido na posição 68 é R; o aminoácido na posição 71 é I ou M; o aminoácido na posição 73 é R; o aminoácido na posição 77 é A ou I; o aminoácido na posição 83 é E; o aminoácido na posição 86 é S ou R; o aminoácido na posição 90 é E ou D; e o aminoácido na posição 92 é T ou M.

[267] Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 45, em que o aminoácido na posição 44 é R ou G, o aminoácido na posição 50 está ausente, o aminoácido na posição 60 é Q ou K; o aminoácido na posição 62 é N ou S; o aminoácido na posição 63 é E ou Q; o aminoácido na posição 66 é K ou Q; o aminoácido na posição 68 é R, o aminoácido na posição 71 é I ou M, o aminoácido na posição 73 é R, o aminoácido na posição 77 é A ou I, o aminoácido na posição 83 é E, o aminoácido na posição 86 é S ou R, o aminoácido na posição 90 é E ou D e o aminoácido na posição 92 é T.

[268] Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 45, em que o aminoácido na posição 44 é R, o aminoácido na posição 50 está ausente, o aminoácido na posição 60 é Q ou K; o aminoácido na posição 62 é N ou S; o aminoácido na posição 63 é E ou Q; o aminoácido na posição 66 é K ou Q; o aminoácido na posição 68 é R, o aminoácido na posição 71 é I, o aminoácido na posição 73 é R, o aminoácido na posição 77 é A, o aminoácido na posição 83 é E, o aminoácido na posição 86 é S, o aminoácido na posição 90 é E, e o aminoácido na posição 92 é T ou M.

[269] Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 45, em que o aminoácido na posição 44 é R ou G, o aminoácido na posição 50 está ausente, o aminoácido na posição 60 é Q; o aminoácido na posição 62 é N; o aminoácido na posição 63 é E; o aminoácido na posição 66 é K; o aminoácido na posição 68 é R, o aminoácido na posição 71 é

I ou M, o aminoácido na posição 73 é R, o aminoácido na posição 77 é A ou I, o aminoácido na posição 83 é E, o aminoácido na posição 86 é S ou R, o aminoácido na posição 90 é E ou D e o aminoácido na posição 92 é T ou M.

[270] Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 45, em que o aminoácido na posição 44 é R ou G, o aminoácido na posição 50 está ausente, o aminoácido na posição 60 é Q; o aminoácido na posição 62 é N; o aminoácido na posição 63 é E; o aminoácido na posição 66 é K; o aminoácido na posição 68 é R, o aminoácido na posição 71 é I ou M, o aminoácido na posição 73 é R, o aminoácido na posição 77 é A ou I, o aminoácido na posição 83 é E, o aminoácido na posição 86 é S ou R, o aminoácido na posição 90 é E ou D e o aminoácido na posição 92 é T.

[271] Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 45, em que o aminoácido na posição 44 é R, o aminoácido na posição 50 está ausente, o aminoácido na posição 60 é Q; o aminoácido na posição 62 é N; o aminoácido na posição 63 é E; o aminoácido na posição 66 é K; o aminoácido na posição 68 é R, o aminoácido na posição 71 é I, o aminoácido na posição 73 é R, o aminoácido na posição 77 é A, o aminoácido na posição 83 é E, o aminoácido na posição 86 é S, o aminoácido na posição 90 é E, e o aminoácido na posição 92 é T ou M.

[272] Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 45, em que o aminoácido na posição 44 é R ou G, o aminoácido na posição 50 está ausente, o aminoácido na posição 60 é K; o aminoácido na posição 62 é S; o aminoácido na posição 63 é Q; o aminoácido na posição 66 é Q; o aminoácido na posição 68 é R, o aminoácido na posição 71 é I ou M, o aminoácido na posição 73 é R, o aminoácido na posição 77 é A ou I, o aminoácido na posição 83 é E, o aminoácido na posição 86 é S ou R, o aminoácido na posição 90 é E ou D e o aminoácido na posição 92 é T ou M.

[273] Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 45, em que o aminoácido na posição 44 é R ou G, o aminoácido na posição 50 está ausente, o aminoácido na posição 60 é K; o aminoácido na posição 62 é S; o aminoácido na posição 63 é Q; o aminoácido na posição 66 é Q; o aminoácido na posição 68 é R, o aminoácido na posição 71 é I ou M, o aminoácido na posição 73 é R, o aminoácido na posição 77 é A ou I, o aminoácido na posição 83 é E, o aminoácido na posição 86 é S ou R, o aminoácido na posição 90 é E ou D e o aminoácido na posição 92 é T.

[274] Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 45, em que o aminoácido na posição 44 é R, o aminoácido na posição 50 está ausente, o aminoácido na posição 60 é K; o aminoácido na posição 62 é S; o aminoácido na posição 63 é Q; o aminoácido na posição 66 é Q; o aminoácido na posição 68 é R, o aminoácido na posição 71 é I, o aminoácido na posição 73 é R, o aminoácido na posição 77 é A, o aminoácido na posição 83 é E, o aminoácido na posição 86 é S, o aminoácido na posição 90 é E, e o aminoácido na posição 92 é T ou M.

[275] Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 45, em que o aminoácido na posição 44 é R ou G, o aminoácido na posição 50 está ausente, o aminoácido na posição 60 é Q ou K; o aminoácido na posição 62 é S; o aminoácido na posição 63 é Q; o aminoácido na posição 66 é Q; o aminoácido na posição 68 é R, o aminoácido na posição 71 é I ou M, o aminoácido na posição 73 é R, o aminoácido na posição 77 é A ou I, o aminoácido na posição 83 é E, o aminoácido na posição 86 é S ou R, o aminoácido na posição 90 é E ou D e o aminoácido na posição 92 é T ou M.

[276] Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 45, em que o aminoácido na posição 44 é R ou

G, o aminoácido na posição 50 está ausente, o aminoácido na posição 60 é K; o aminoácido na posição 62 é N ou S; o aminoácido na posição 63 é Q; o aminoácido na posição 66 é Q; o aminoácido na posição 68 é R, o aminoácido na posição 71 é I ou M, o aminoácido na posição 73 é R, o aminoácido na posição 77 é A ou I, o aminoácido na posição 83 é E, o aminoácido na posição 86 é S ou R, o aminoácido na posição 90 é E ou D e o aminoácido na posição 92 é T ou M.

[277] Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 45, em que o aminoácido na posição 44 é R ou G, o aminoácido na posição 50 está ausente, o aminoácido na posição 60 é K; o aminoácido na posição 62 é S; o aminoácido na posição 63 é E ou Q; o aminoácido na posição 66 é Q; o aminoácido na posição 68 é R, o aminoácido na posição 71 é I ou M, o aminoácido na posição 73 é R, o aminoácido na posição 77 é A ou I, o aminoácido na posição 83 é E, o aminoácido na posição 86 é S ou R, o aminoácido na posição 90 é E ou D e o aminoácido na posição 92 é T ou M.

[278] Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 45, em que o aminoácido na posição 44 é R ou G, o aminoácido na posição 50 está ausente, o aminoácido na posição 60 é K; o aminoácido na posição 62 é S; o aminoácido na posição 63 é Q; o aminoácido na posição 66 é K ou Q; o aminoácido na posição 68 é R, o aminoácido na posição 71 é I ou M, o aminoácido na posição 73 é R, o aminoácido na posição 77 é A ou I, o aminoácido na posição 83 é E, o aminoácido na posição 86 é S ou R, o aminoácido na posição 90 é E ou D e o aminoácido na posição 92 é T ou M.

[279] Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 45, em que o aminoácido na posição 44 é R ou G, o aminoácido na posição 50 está ausente, o aminoácido na posição 60 é Q ou K; o aminoácido na posição 62 é N ou S; o aminoácido na posição 63 é Q; o aminoácido na posição 66 é Q; o aminoácido na posição 68 é R, o aminoácido na posição 71 é I ou M, o aminoácido na posição 73 é R, o aminoácido na posição 77 é A ou I, o aminoácido na posição 83 é E, o aminoácido na posição 86 é S ou R, o aminoácido na posição 90 é E ou D e o aminoácido na posição 92 é T ou M.

[280] Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 45, em que o aminoácido na posição 44 é R ou G, o aminoácido na posição 50 está ausente, o aminoácido na posição 60 é Q ou K; o aminoácido na posição 62 é S; o aminoácido na posição 63 é E ou Q; o aminoácido na posição 66 é Q; o aminoácido na posição 68 é R, o aminoácido na posição 71 é I ou M, o aminoácido na posição 73 é R, o aminoácido na posição 77 é A ou I, o aminoácido na posição

83 é E, o aminoácido na posição 86 é S ou R, o aminoácido na posição 90 é E ou D e o aminoácido na posição 92 é T ou M.

[281] Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 45, em que o aminoácido na posição 44 é R ou G, o aminoácido na posição 50 está ausente, o aminoácido na posição 60 é Q ou K; o aminoácido na posição 62 é S; o aminoácido na posição 63 é Q; o aminoácido na posição 66 é K ou Q; o aminoácido na posição 68 é R, o aminoácido na posição 71 é I ou M, o aminoácido na posição 73 é R, o aminoácido na posição 77 é A ou I, o aminoácido na posição 83 é E, o aminoácido na posição 86 é S ou R, o aminoácido na posição 90 é E ou D e o aminoácido na posição 92 é T ou M.

[282] Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 45, em que o aminoácido na posição 44 é R ou G, o aminoácido na posição 50 está ausente, o aminoácido na posição 60 é K; o aminoácido na posição 62 é N ou S; o aminoácido na posição 63 é E ou Q; o aminoácido na posição 66 é Q; o aminoácido na posição 68 é R, o aminoácido na posição 71 é I ou M, o aminoácido na posição 73 é R, o aminoácido na posição 77 é A ou I, o aminoácido na posição 83 é E, o aminoácido na posição 86 é S ou R, o aminoácido na posição 90 é E ou D e o aminoácido na posição 92 é T ou M.

[283] Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 45, em que o aminoácido na posição 44 é R ou G, o aminoácido na posição 50 está ausente, o aminoácido na posição 60 é K; o aminoácido na posição 62 é N ou S; o aminoácido na posição 63 é Q; o aminoácido na posição 66 é K ou Q; o aminoácido na posição 68 é R, o aminoácido na posição 71 é I ou M, o aminoácido na posição 73 é R, o aminoácido na posição 77 é A ou I, o aminoácido na posição 83 é E, o aminoácido na posição 86 é S ou R, o aminoácido na posição 90 é E ou D e o aminoácido na posição 92 é T ou M.

[284] Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 45, em que o aminoácido na posição 44 é R ou G, o aminoácido na posição 50 está ausente, o aminoácido na posição 60 é K; o aminoácido na posição 62 é S; o aminoácido na posição 63 é E ou Q; o aminoácido na posição 66 é K ou Q; o aminoácido na posição 68 é R, o aminoácido na posição 71 é I ou M, o aminoácido na posição 73 é R, o aminoácido na posição 77 é A ou I, o aminoácido na posição 83 é E, o aminoácido na posição 86 é S ou R, o aminoácido na posição 90 é E ou D e o aminoácido na posição 92 é T ou M.

[285] Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 45, em que o aminoácido na posição 44 é R ou

G, o aminoácido na posição 50 está ausente, o aminoácido na posição 60 é Q ou K; o aminoácido na posição 62 é N ou S; o aminoácido na posição 63 é E ou Q; o aminoácido na posição 66 é Q; o aminoácido na posição 68 é R, o aminoácido na posição 71 é I ou M, o aminoácido na posição 73 é R, o aminoácido na posição 77 é A ou I, o aminoácido na posição 83 é E, o aminoácido na posição 86 é S ou R, o aminoácido na posição 90 é E ou D e o aminoácido na posição 92 é T ou M.

[286] Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 45, em que o aminoácido na posição 44 é R ou G, o aminoácido na posição 50 está ausente, o aminoácido na posição 60 é Q ou K; o aminoácido na posição 62 é N ou S; o aminoácido na posição 63 é Q; o aminoácido na posição 66 é K ou Q; o aminoácido na posição 68 é R, o aminoácido na posição 71 é I ou M, o aminoácido na posição 73 é R, o aminoácido na posição 77 é A ou I, o aminoácido na posição 83 é E, o aminoácido na posição 86 é S ou R, o aminoácido na posição 90 é E ou D e o aminoácido na posição 92 é T ou M.

[287] Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 45, em que o aminoácido na posição 44 é R ou G, o aminoácido na posição 50 está ausente, o aminoácido na posição 60 é Q ou K; o aminoácido na posição 62 é S; o aminoácido na posição 63 é E ou Q; o aminoácido na posição

66 é K ou Q; o aminoácido na posição 68 é R, o aminoácido na posição 71 é I ou M, o aminoácido na posição 73 é R, o aminoácido na posição 77 é A ou I, o aminoácido na posição 83 é E, o aminoácido na posição 86 é S ou R, o aminoácido na posição 90 é E ou D e o aminoácido na posição 92 é T ou M.

[288] Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 45, em que o aminoácido na posição 44 é R ou G, o aminoácido na posição 50 está ausente, o aminoácido na posição 60 é K; o aminoácido na posição 62 é N ou S; o aminoácido na posição 63 é E ou Q; o aminoácido na posição 66 é K ou Q; o aminoácido na posição 68 é R, o aminoácido na posição 71 é I ou M, o aminoácido na posição 73 é R, o aminoácido na posição 77 é A ou I, o aminoácido na posição 83 é E, o aminoácido na posição 86 é S ou R, o aminoácido na posição 90 é E ou D e o aminoácido na posição 92 é T ou M.

[289] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64, 65 ou 66. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88 %, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,

98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64, 65 ou 66.

[290] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo uma região estrutural 1 (VL FR1) compreendendo a sequência de aminoácidos DX2VMTQX7PLSX11X12VTX15GQPASISX23 (SEQ ID NO: 46), em que o aminoácido na posição 2 (X2) é V ou I, o aminoácido na posição 7 (X7) é S ou T, o aminoácido na posição 11 (X11) é G ou S; o aminoácido na posição 12 (X12) é P ou S; o aminoácido na posição 15 (X15) é L ou P e o aminoácido na posição 23 (X23) é C ou F.

[291] Em uma modalidade, a região variável da cadeia leve compreende uma região estrutural 1 (VL FR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 46, em que o aminoácido na posição 2 é V ou I; o aminoácido na posição 7 é S ou T; o aminoácido na posição 11 é L ou S; o aminoácido na posição 12 é P ou S; o aminoácido na posição 15 é L ou P; e o aminoácido na posição 23 é C.

[292] Em uma modalidade, a região variável da cadeia leve compreende uma região estrutural 1 (VL FR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 46, em que o aminoácido na posição 2 é I; o aminoácido na posição 7 é T; o aminoácido na posição 11 é L ou S; o aminoácido na posição 12 é P ou S; o aminoácido na posição 15 é L ou P; e o aminoácido na posição 23 é C.

[293] Em uma modalidade, a região variável da cadeia leve compreende uma região estrutural 1 (VL FR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 46, em que o aminoácido na posição 2 é V ou I; o aminoácido na posição 7 é S ou T; o aminoácido na posição 11 é L; o aminoácido na posição 12 é P ou S; o aminoácido na posição 15 é L ou P; e o aminoácido na posição 23 é C.

[294] Em uma modalidade, a região variável da cadeia leve compreende uma região estrutural 1 (VL FR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 46, em que o aminoácido na posição 2 é V ou I; o aminoácido na posição 7 é S ou T; o aminoácido na posição 11 é L ou S; o aminoácido na posição 12 é P; o aminoácido na posição 15 é L; e o aminoácido na posição 23 é C.

[295] Em uma modalidade, a região variável da cadeia leve compreende uma região estrutural 1 (VL FR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 47, 48, 49 ou 50. Em uma modalidade, a região variável da cadeia leve compreende uma região estrutural 1 (VL FR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88 %, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 47, 48, 49 ou 50.

[296] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo uma região estrutural 2 (VL FR2) compreendendo a sequência de aminoácidos WX2X3QX5PGQX9PX11X12LIY (SEQ ID NO: 51), em que o aminoácido na posição 2 (X2) é F ou Y, o aminoácido na posição 3 (X3) é Q ou G, o aminoácido na posição 5 (X5) é R ou K, o aminoácido na posição 9 (X9) é S ou P, o aminoácido na posição 11 (X11) é R ou Q e o aminoácido na posição 12 (X12) é R ou L.

[297] Em uma modalidade, a região variável da cadeia leve compreende uma região estrutural 2 (VL FR2) compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 51, em que o aminoácido na posição 2 é Y, o aminoácido na posição 3 é Q ou L, o aminoácido na posição 5 é R ou K, o aminoácido na posição 9 é S ou P, o aminoácido na posição 11 é R ou Q, e o aminoácido na posição 12 é L.

[298] Em uma modalidade, a região variável da cadeia leve compreende uma região estrutural 2 (VL FR2) compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 51, em que o aminoácido na posição 2 é Y, o aminoácido na posição 3 é Q ou L, o aminoácido na posição 5 é R ou K, o aminoácido na posição 9 é S, o aminoácido na posição 11 é R ou Q, e o aminoácido na posição 12 é L.

[299] Em uma modalidade, a região variável da cadeia leve compreende uma região estrutural 2 (VL FR2) compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 51, em que o aminoácido na posição 2 é Y, o aminoácido na posição 3 é Q, o aminoácido na posição 5 é R, o aminoácido na posição 9 é S ou P, o aminoácido na posição 11 é R, e o aminoácido na posição 12 é L.

[300] Em uma modalidade, a região variável da cadeia leve compreende uma região estrutural 2 (VL FR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 51, em que o aminoácido na posição 2 é F ou Y, o aminoácido na posição 3 é Q ou L, o aminoácido na posição 5 é R ou K, o aminoácido na posição 9 é S, o aminoácido na posição 11 é R ou Q, e o aminoácido na posição 12 é R ou L.

[301] Em uma modalidade, a região variável da cadeia leve compreende uma região estrutural 2 (VL FR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 51, em que o aminoácido na posição 2 é F ou Y, o aminoácido na posição 3 é Q, o aminoácido na posição 5 é R, o aminoácido na posição 9 é S ou P, o aminoácido na posição 11 é R, e o aminoácido na posição 12 é R ou L.

[302] Em uma modalidade, a região variável da cadeia leve compreende uma região estrutural 2 (VL FR2) compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 52, 53, 54 ou 55. Em uma modalidade, a região variável da cadeia leve compreende uma região estrutural 2 (VL FR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88 %, 89%, 90%,

91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 52, 53, 54 ou 55.

[303] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo uma região estrutural 3 (VL FR3) compreendendo a sequência de aminoácidos GVPDRFSGSGX11GTDFTLKISRVEAEDVGVYYC (SEQ ID NO: 56), em que o aminoácido na posição 11 (X11) é S ou A.

[304] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo uma região estrutural 3 (VL FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57 ou 58. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo uma região estrutural 3 (VL FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade para SEQ ID NO: 57 ou 58.

[305] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo uma região estrutural 4 (VL FR4) compreendendo a sequência de aminoácidos FGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 59). Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo uma região estrutural 4 (VL FR4) compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade para SEQ ID NO: 59.

[306] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos DX2VMTQX7PLSX11X12VTX15GQPASISX23RSSQSIVHSNGNTYLEWX41X42QX44PGQX 48PX50X51LIYKVSNRFSGVPDRFSGSGX72GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPR TFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 60), em que o aminoácido na posição 2 (X2) é V ou I, o aminoácido na posição 7 (X7) é S ou T, o aminoácido na posição 11 (X11) é L ou S, o aminoácido na posição 12 (X12) é P ou S, o aminoácido na posição 15 (X15) é L ou P, o aminoácido na posição 23 (X23) é C ou F, o aminoácido na posição 41 (X41) é F ou Y, o aminoácido na posição 42 (X42) é Q ou L, o aminoácido na posição 44 (X44) é R ou K, o aminoácido na posição 48 (X48) é S ou P, o aminoácido na posição 50 (X50) é R ou Q, o aminoácido na posição 51 (X51) é R ou L e o aminoácido na posição 72 (X72) é S ou A.

[307] Em uma modalidade, a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 60, em que o aminoácido na posição 2 é V ou I, o aminoácido na posição 7 é S ou T, o aminoácido na posição 11 é L ou S, o aminoácido na posição 12 é P ou S, o aminoácido na posição 15 é L ou P, o aminoácido na posição 23 é C, o aminoácido na posição 41 é Y, o aminoácido na posição 42 é

Q ou L, o aminoácido na posição 44 é R ou K, o aminoácido na posição 48 é S ou P, o aminoácido na posição 50 é R ou Q, o aminoácido na posição 51 é L e o aminoácido na posição 72 é S ou A.

[308] Em uma modalidade, a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 60, em que o aminoácido na posição 2 é I, o aminoácido na posição 7 é T, o aminoácido na posição 11 é L ou S, o aminoácido na posição 12 é P ou S, o aminoácido na posição 15 é L ou P, o aminoácido na posição 23 é C, o aminoácido na posição 41 é Y, o aminoácido na posição 42 é Q ou L, o aminoácido na posição 44 é R ou K, o aminoácido na posição 48 é S ou P, o aminoácido na posição 50 é R ou Q, o aminoácido na posição 51 é L e o aminoácido na posição 72 é S ou A.

[309] Em uma modalidade, a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 60, em que o aminoácido na posição 2 é V ou I, o aminoácido na posição 7 é S ou T, o aminoácido na posição 11 é L, o aminoácido na posição 12 é P ou S, o aminoácido na posição 15 é L ou P, o aminoácido na posição 23 é C, o aminoácido na posição 41 é Y, o aminoácido na posição 42 é Q ou L, o aminoácido na posição 44 é R ou K, o aminoácido na posição 48 é S, o aminoácido na posição 50 é R ou Q, o aminoácido na posição 51 é L e o aminoácido na posição 72 é S.

[310] Em uma modalidade, a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 60, em que o aminoácido na posição 2 é V ou I, o aminoácido na posição 7 é S ou T, o aminoácido na posição 11 é L ou S, o aminoácido na posição 12 é P, o aminoácido na posição 15 é L, o aminoácido na posição 23 é C, o aminoácido na posição 41 é Y, o aminoácido na posição 42 é Q, o aminoácido na posição 44 é R, o aminoácido na posição 44 é S ou P, o aminoácido na posição 50 é R, o aminoácido na posição 51 é L e o aminoácido na posição 72 é S ou A.

[311] Em uma modalidade, a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 60, em que o aminoácido na posição 2 é V ou I, o aminoácido na posição 7 é S ou T, o aminoácido na posição 11 é L ou S, o aminoácido na posição 12 é P ou S, o aminoácido na posição 15 é L ou P, o aminoácido na posição 23 é C, o aminoácido na posição 41 é F ou Y, o aminoácido na posição 42 é Q ou L, o aminoácido na posição 44 é R ou K, o aminoácido na posição 48 é S ou P, o aminoácido na posição 50 é R ou Q, o aminoácido na posição 51 é R ou L e o aminoácido na posição 72 é S ou A.

[312] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 67, 68, 69, 70 ou 71. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88 %, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 67, 68, 69, 70 ou

71.

[313] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado é um scFv, scFab ou sdAb. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado é um scFv ou scFab. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado é um sdAb. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado é um scFab. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado é um scFv. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado é um scFv compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 ou

91. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado é um scFv compreendendo uma sequência de aminoácidos com cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 ou 91.

[314] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado compreende uma sequência de aminoácidos possuindo cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade para as SEQ ID NOs mencionadas acima. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado é um scFv ou scFab compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade para as SEQ ID NOs mencionadas acima.

[315] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-HLA compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos WIYPGDGSTKYSQKFQG (SEQ ID NO: 5).

[316] Em uma modalidade, o referido anticorpo é um anticorpo mimético selecionado a partir do grupo que consiste em um afficorpo, um alfacorpo, uma estrutura à base de proteína de repetição do armadillo, um knottin, um peptídeo do domínio kunitz, uma afilina, uma afitina, uma adnectina, um atrímero, uma evasina, um DARPin, uma anticalina, um avímero, um finômero, um versacorpo e uma duocalina.

[317] Os anticorpos anti-HLA-A2 aqui fornecidos se ligam especificamente ao HLA-A2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 aqui fornecidos se ligam especificamente ao HLA-A*02:01. Como seria apreciado por um técnico especialista no assunto, a capacidade de um anticorpo de se ligar ao HLA-A2 pode ser detectada através do uso de técnicas conhecidas na técnica.

Por exemplo, a ligação de um anticorpo ao HLA-A2 pode ser detectada através do uso de um tetrâmero HLA-A2, como aqui exemplificado.

Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 aqui fornecidos competem pela ligação ao HLA-A2 com um anticorpo compreendendo: uma região determinante de complementariedade de cadeia pesada 1 (HCDR1) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 183; uma região determinante de complementariedade de cadeia pesada 2 (HCDR2) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 185; uma região determinante de complementariedade de cadeia pesada 3

(HCDR3) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 187;

uma região determinante de complementariedade de cadeia leve

1 (LCDR1) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:

188; uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 2 (LCDR2) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID

NO: 189; e uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 3 (LCDR3) tendo a sequência de aminoácidos da

SEQ ID NO: 190. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-

A2 aqui fornecidos se ligam ao mesmo epítopo HLA-A2 que um anticorpo que compreende: uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1) tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 183; uma região determinante de complementariedade de cadeia pesada 2 (HCDR2) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 185; uma região determinante de complementariedade de cadeia pesada 3 (HCDR3) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 187; uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 1 (LCDR1) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 188; uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 2 (LCDR2) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 189; e uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 3 (LCDR3) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 190. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 aqui fornecidos competem pela ligação ao HLA-A2 com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 aqui fornecidos se ligam ao mesmo epítopo HLA-A2 que um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região determinante de complementaridade 2 (VH CDR2) estabelecida pela SEQ ID NO:

5. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo de HLA-A selecionado de um ou mais de HLA-A*03, HLA-A*25, HLA- A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68, em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo de HLA-A selecionado entre dois ou mais de HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31,

HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68, em comparação com um anticorpo

BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo de

HLA-A selecionado entre três ou mais de HLA-A*03, HLA-A*25,

HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68,

em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo de HLA-A selecionado dentre quatro ou mais de HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31,

HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68, em comparação com um anticorpo

BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo

HLA-A selecionado dentre cinco ou mais de HLA-A*03, HLA-

A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-

A*68, em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo de HLA-A selecionado dentre seis ou mais de HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-

A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68, em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo de HLA-A selecionado dentre sete ou mais de HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31,

HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68, em comparação com um anticorpo

HLA-A selecionado de cada um de HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-

A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68, em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo de HLA-A selecionado de um ou mais de HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, em comparação a um anticorpo

HLA-A selecionado entre dois ou mais de HLA-A*25, HLA-A*29,

HLA-A*30, em comparação para um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo de HLA-A selecionado de cada um de HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um dos HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02,

HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01 e HLA-

A*68:01, em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos dois de HLA-A*03:01, HLA-

A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01,

HLA-A*36:01 e HLA-A*68:01, em comparação com um anticorpo

BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos três dos HLA-

A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01,

A2 aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos quatro de HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-

A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01 e HLA-A*68:01, em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos cinco dos HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-

A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01 e HLA-A*68:01, em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos seis dos HLA-A*03:01, HLA-

A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01,

HLA-A*36:01 e HLA-A*68:01, em comparação com um anticorpo

BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos sete dos HLA-

A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01,

A2 aqui fornecidos têm menos reatividade a HLA-A*03:01, HLA-

A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01,

HLA-A*36:01 e HLA-A*68:01, em comparação com um anticorpo

BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um dos HLA-

A*25:01, HLA-A*29:02 e HLA-A*30:01, em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-

A2 aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos dois dos HLA-A*25:01, HLA-A*29:02 e HLA-A*30:01, em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 aqui fornecidos têm menos reatividade a HLA-

A2 aqui fornecidos têm menos reatividade ao HLA-A*25:01 em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 aqui fornecidos têm menos reatividade ao HLA-A*29:02 em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 aqui fornecidos têm menos reatividade ao HLA-A*30:01 em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-

A2 aqui fornecidos têm menos reatividade ao HLA-A*03:01 em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 aqui fornecidos têm menos reatividade ao HLA-A*31:01 em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 aqui fornecidos têm menos reatividade ao HLA-A*33:01 em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-

A2 aqui fornecidos têm menos reatividade ao HLA-A*36:01 em comparação com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 aqui fornecidos têm menos reatividade ao HLA-A*68:01 em comparação com um anticorpo BB7.2. O anticorpo BB7.2 pode ser isolado a partir do hibridoma BB7.2 (depósito ATCC No. HB-82). As técnicas para determinar a reatividade dos anticorpos anti-HLA-A2 aos subtipos de HLA- A seriam conhecidas dos técnicos especialistas no assunto.

Por exemplo, a reatividade dos anticorpos anti-HLA-A2 aos subtipos de HLA-A pode ser determinada por um único ensaio de grânulos de antígeno. Esses ensaios de grânulos de antígeno único estão disponíveis comercialmente (por exemplo, anticorpo de antígeno único FlowPRA; ONE LAMBDA).

[318] Em uma modalidade, os anticorpos anti-HLA-A2 aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo de HLA-A selecionado de um ou mais de HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 e qualquer combinação dos mesmos, em comparação com um anticorpo BB7.2 quando medido nas condições do Teste A. Por exemplo, em algumas modalidades, os anticorpos anti-HLA-A2 aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo HLA-A selecionado do grupo que compreende HLA-A*25, HLA- A*29, HLA-A*30 e qualquer combinação dos mesmos, em comparação com um anticorpo BB7.2, quando medido nas condições do Teste A.

Teste A:

[319] 0,25.106 células T que expressam um CAR compreendendo o anticorpo anti-HLA-A2 ou um anticorpo BB7.2 (por exemplo, um BB7.2 scFv (mA2 CAR)) são incubadas com painel de grânulos de anticorpo de antígeno único FlowPRA (FL1HD01, FL1HD02, FL1HD03, FL1HD04, FL1HD06 e FL1HD08, One Lambda) e corante de viabilidade fixável (FVD, ThermoFisher, 65-0865-14, eBioscience) por 30 minutos em temperatura ambiente. As amostras são lavadas, fixadas com formaldeído a 0,5% e analisadas por citometria de fluxo. Duzentos grânulos de controle negativo são adquiridos por amostra.

Apenas os grânulos foram usados como controle negativo. Para análise, as células mortas são primeiro eliminadas usando o corante de viabilidade fixável. Os grânulos de antígeno único são então identificados após exclusão de células mortas e dupletos. Então, o número de grânulos por HLA é determinado pelo respectivo pico de intensidade de PE. Os dados são normalizados multiplicando o número de grânulos de interesse em cada pico do HLA por 200, dividido pelo número de grânulos negativos na amostra. Para cada pico de HLA, o percentual de ligação relativa de Tregs CAR comparada ao controle (células que não expressam CAR) é determinado subtraindo o número de grânulos no CAR-Treg a partir do número de grânulos na amostra de controle e dividindo o número médio de grânulos no controle que não expressam CAR, multiplicado por 100. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 da invenção possui uma reatividade para pelo menos um subtipo HLA-A selecionado do grupo que compreende HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA- A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 estatisticamente inferior a um anticorpo BB7.2, por exemplo, quando medido nas condições do Teste A.

[320] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 da invenção possui uma reatividade a pelo menos um subtipo HLA- A selecionado do grupo que compreende HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30 estatisticamente inferior a um anticorpo BB7.2, por exemplo, quando medido nas condições do Teste A.

[321] Em uma modalidade, o termo “estatisticamente inferior” significa que a reatividade (isto é, por exemplo, a ligação relativa nas condições do Teste A) medida para o anticorpo anti-HLA-A2 da invenção é inferior à reatividade medida para um anticorpo BB7.2 com um valor de p de no máximo cerca de 0,05, preferencialmente no máximo cerca de 0,01, mais preferencialmente, no máximo cerca de 0,005 e ainda mais preferencialmente no máximo cerca de 0,001, em particular quando analisado por ANOVA de duas vias, pós- teste de Dunnett.

[322] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 da invenção possui uma reatividade para pelo menos um subtipo HLA-A selecionado do grupo que compreende HLA-A*03, HLA- A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA- A*68 inferior a um anticorpo BB7.2 Em algumas modalidades,

esse anticorpo anti-HLA-A2 tem uma ligação relativa para pelo menos um subtipo HLA-A selecionado do grupo que compreende HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 inferior a um anticorpo BB7.2 quando medido nas condições do Teste A. Em certos aspectos, a ligação relativa medida para esse anticorpo anti-HLA-A2 é no máximo cerca de 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% ou menos da ligação relativa medida para um anticorpo BB7.2.

[323] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 da invenção possui uma reatividade para pelo menos um subtipo HLA-A selecionado do grupo que compreende HLA-A*25, HLA- A*29, HLA-A*30 inferior a um anticorpo BB7.2. Em algumas modalidades, esse anticorpo anti-HLA-A2 tem uma ligação relativa para pelo menos um subtipo HLA-A selecionado do grupo que compreende HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30 inferior a um anticorpo BB7.2 quando medido nas condições do Teste A.

[324] Além disso, os anticorpos anti-HLA-A2 aqui fornecidos com atividade de ligação ao antígeno, são capazes de constituir domínios de ligação ao antígeno dos CARs, em que esses CARs são capazes de serem expressos em células humanas, de modo que os CARs se liguem especificamente ao HLA-A2. Em uma modalidade, os CARs se ligam especificamente ao HLA-A*02:01. Como seria apreciado por um técnico especialista no assunto, a capacidade de um CAR de se ligar ao HLA-A2 pode ser detectada através do uso de técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, a ligação de um CAR ao HLA-A2 pode ser detectada através do uso de um tetrâmero HLA-A2, como aqui exemplificado. Em uma modalidade, a célula humana é uma célula imunológica. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula imunológica reguladora. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula T reguladora (Treg). Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula T. Em uma modalidade, a célula T é uma Treg.

[325] Além disso, os anticorpos anti-HLA-A2 aqui fornecidos com atividade de ligação ao antígeno são capazes de constituir domínios de ligação ao antígeno dos receptores quiméricos do antígeno (CARs), em que esses CARs são capazes de serem expressos em uma célula T reguladora (Treg), de modo que os CARs se ligam especificamente ao HLA-A2. Em uma modalidade, os CARs se ligam especificamente ao HLA-A*02:01.

Em uma modalidade, a Treg é uma Treg humana.

[326] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 é capaz de constituir um domínio de ligação ao antígeno de um CAR, em que esse CAR é capaz de ser expresso em uma célula imunológica, de modo que a célula imunológica seja ativada por HLA-A2. Em uma modalidade, a célula imunológica é ativada por HLA-A*02:01. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula imunológica reguladora. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula T reguladora (Treg). Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula T. Em uma modalidade, a célula T é uma Treg. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula imunológica humana. Em uma modalidade, a célula imunológica reguladora é uma célula imunológica reguladora humana. Em uma modalidade, a célula T é uma célula T humana. Em uma modalidade, a Treg é uma Treg humana.

[327] Em uma modalidade, esse anticorpo anti-HLA- A2 compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SYHIQ (SEQ ID NO: 1) e GYTFTSY (SEQ ID NO: 2).

[328] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região determinante de complementaridade 1 (VH CDR1) selecionada a partir de SEQ ID NOs:1-2. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma VH CDR1 estabelecida pela SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma VH CDR1 estabelecida pela SEQ ID NO: 2.

[329] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos EGTYYAMDY (SEQ ID NO: 6).

[330] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região determinante de complementaridade 3 (VH CDR3) estabelecida pela SEQ ID NO: 6.

[331] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma VH CDR2 estabelecida pela SEQ ID NO: 5 e pelo menos um dos seguintes CDRs: uma VH CDR1 estabelecida pela SEQ ID NO: 1; ou uma VH CDR3 estabelecida pela SEQ ID NO: 6.

[332] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma VH CDR1 estabelecida pela SEQ ID NO: 1; uma VH CDR2 estabelecida pela SEQ ID NO: 5; e uma VH CDR3 estabelecida pela SEQ ID NO: 6.

[333] De acordo com a presente invenção, qualquer uma das CDRs 1, 2 ou 3 da cadeia pesada pode ser caracterizada como tendo uma sequência de aminoácidos que compartilha pelo menos cerca de 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%,

98% ou 99% de identidade com os conjuntos específicos de CDRs listadas nas correspondentes SEQ ID NOs: 1, 5 e 6.

[334] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma VH CDR2 estabelecida pela SEQ ID NO: 5 e pelo menos uma das seguintes CDRs: uma VH CDR1 estabelecida pela SEQ ID NO: 2; ou uma VH CDR3 estabelecida pela SEQ ID NO: 6.

[335] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma VH CDR1 estabelecida pela SEQ ID NO: 2; uma VH CDR2 estabelecida pela SEQ ID NO: 5; e uma VH CDR3 estabelecida pela SEQ ID NO: 6.

[336] De acordo com a presente invenção, qualquer uma das CDRs 1, 2 ou 3 da cadeia pesada pode ser caracterizada como tendo uma sequência de aminoácidos que compartilha pelo menos cerca de 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com os conjuntos específicos de CDRs listadas nas correspondentes SEQ ID NOs: 2, 5 e 6.

[337] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos RSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO: 7).

[338] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo uma região determinante de complementaridade 1 (VL CDR1) estabelecida pela SEQ ID NO: 7.

[339] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos KVSNRFS (SEQ ID NO: 8).

[340] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo uma região determinante de complementaridade 2 (VL CDR2) estabelecida pela SEQ ID NO: 8.

[341] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos FQGSHVPRT (SEQ ID NO: 9).

[342] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo uma região determinante de complementaridade 3 (VL CDR3) estabelecida pela SEQ ID NO: 9.

[343] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo pelo menos uma das seguintes CDRs: uma VL CDR1 estabelecida pela SEQ ID NO: 7; ou uma VL CDR2 estabelecida pela SEQ ID NO: 8; ou uma VL CDR3 estabelecida pela SEQ ID NO: 9.

[344] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo uma VL CDR1 estabelecida pela SEQ ID NO: 7; uma VL CDR2 estabelecida pela SEQ ID NO: 8; e uma VL CDR3 estabelecida pela SEQ ID NO: 9.

[345] De acordo com a presente invenção, qualquer uma das CDRs 1, 2 ou 3 da cadeia leve pode ser caracterizada como tendo uma sequência de aminoácidos que compartilha pelo menos cerca de 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com os conjuntos específicos de CDRs listados nas correspondentes SEQ ID NOs: 7, 8 e 9.

[346] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região estrutural 1 (VH FR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS (SEQ ID NO: 11) e QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 12).

[347] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região estrutural 1 (VH FR1) compreendendo a sequência de aminoácidos QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS (SEQ ID NO: 11). Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região estrutural 1 (VH FR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade para SEQ ID NO:

11.

[348] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região estrutural 1 (VH FR1) compreendendo a sequência de aminoácidos QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 12). Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região estrutural 1 (VH FR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade para SEQ ID NO:

12.

[349] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região estrutural 2 (VH FR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: WVRQAPGQX9LEWMGX15 (SEQ ID NO: 13) e HIQWVRQAPGQX12LEWMGX18 (SEQ ID NO: 25), em que: X9 é R ou G e X15 é I ou ausente na SEQ ID NO: 13; e X12 é R ou G e X18 é I ou ausente na SEQ ID NO: 25.

[350] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região estrutural 2 (VH FR2) compreendendo a sequência de aminoácidos WVRQAPGQX9LEWMGX15 (SEQ ID NO: 13), em que o aminoácido na posição 9 (X9) é R ou G, e o aminoácido na posição 15 (X15) é I ou está ausente.

[351] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 2 (VH FR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 13, em que o aminoácido na posição 9 é R ou G e o aminoácido na posição 15 está ausente.

[352] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 2 (VH FR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 14, 15, ou 16. Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 2 (VH FR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 14, 15, ou 16.

[353] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região estrutural 2 (VH FR2) compreendendo a sequência de aminoácidos HIQWVRQAPGQX12LEWMGX18 (SEQ ID NO: 25), em que o aminoácido na posição 12 (X12) é R ou G, e o aminoácido na posição 18 (X18) é I ou está ausente.

[354] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 2 (VH FR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 25, em que o aminoácido na posição 12 é R ou G e o aminoácido na posição 18 está ausente.

[355] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 2 (VH FR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 26, 27, ou 28. Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 2 (VH FR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 26, 27, ou 28.

[356] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo a sequência de aminoácidos X1 VTX4TX6DTSX10STAYMX16LSX19LRSX23DX25AVYYCAR (SEQ ID NO: 29), em que o aminoácido na posição 1 (X1) é R ou ausente, o aminoácido na posição 4 (X4) é I ou M, o aminoácido na posição 6 (X6) é R ou A, o aminoácido na posição 10 (X10) é A, T ou I, o aminoácido na posição 16 (X16) é E ou L, o aminoácido na posição 19 (X19) é S ou R, o aminoácido na posição 23 (X23) é E ou D e o aminoácido na posição 25 (X25) é T ou M.

[357] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 29, em que o aminoácido na posição 1 é R, o aminoácido na posição 4 é I ou M, o aminoácido na posição 6 é R, o aminoácido na posição 10 é A ou I, o aminoácido na posição 16 é E, o aminoácido na posição 19 é S ou R, o aminoácido na posição 23 é E ou D e o aminoácido na posição 25 é T ou M.

[358] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida pela SEQ ID NO: 29, em que o aminoácido na posição 1 é R, o aminoácido na posição 4 é I ou M, o aminoácido na posição 6 é R, o aminoácido na posição 10 é A ou I, o aminoácido na posição 16 é E, o aminoácido na posição 19 é S ou R, o aminoácido na posição 23 é E ou D e o aminoácido na posição 25 é T.

[359] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida pela SEQ ID NO: 29, em que o aminoácido na posição 1 é R, o aminoácido na posição 4 é I, o aminoácido na posição 6 é R, o aminoácido na posição 10 é A, o aminoácido na posição 16 é E, o aminoácido na posição 19 é S, o aminoácido na posição 23 é E, e o aminoácido na posição 25 é T ou M.

[360] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 30, 31, 32, 33 ou 34. Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende uma região estrutural 3 (VH FR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos com cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88 %, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 30, 31, 32, 33 ou 34.

[361] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região estrutural 4 (VH FR4) compreendendo a sequência de aminoácidos WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 44). Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma região estrutural 4 (VH FR4) compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade para SEQ ID NO: 44.

[362] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende: uma VH CDR1 estabelecida pela SEQ ID NO: 1; uma VH CDR2 estabelecida pela SEQ ID NO: 5; uma VH CDR3 estabelecida pela SEQ ID NO: 6; uma VH FR1 estabelecida pela SEQ ID NO: 12; uma VH FR2 estabelecida pela SEQ ID NO: 13, em que o aminoácido na posição 9 (X9) é R ou G, e o aminoácido na posição 15 (X15) é I ou está ausente;

[363] Em uma modalidade, a região variável da cadeia pesada compreende: uma VH CDR1 estabelecida pela SEQ ID NO: 2; uma VH CDR2 estabelecida pela SEQ ID NO: 5; uma VH CDR3 estabelecida pela SEQ ID NO: 6; uma VH FR1 estabelecida pela SEQ ID NO: 11; uma VH FR2 estabelecida pela SEQ ID NO: 25, em que o aminoácido na posição 12 (X12) é R ou G, e o aminoácido na posição 18 (X18) é I ou ausente; uma VH FR3 estabelecida pela SEQ ID NO: 29, em que o aminoácido na posição 1 (X1) é R ou ausente, o aminoácido na posição 4 (X4) é I ou M, o aminoácido na posição 6 (X6) é R ou A, o aminoácido na posição 10 (X10) é A, T ou I, o aminoácido na posição 16 (X16) é E ou L, o aminoácido na posição 19 (X19) é S ou R, o aminoácido na posição 23 (X23) é E ou D, e o aminoácido na posição 25 (X25) é T ou M; e uma VH FR4 estabelecida pela SEQ ID NO: 44.

[364] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQX44LEWMGX50WIYPGD GSTKYSQKFQGX68VTX71TX73DTSX77STAYMX83LSX86LRSX90DX92AVYYCAREGTYY AMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 92), em que o aminoácido na posição 44 é R ou G, o aminoácido na posição 50 é I ou ausente, o aminoácido na posição 68 é R ou ausente, o aminoácido na posição 71 é I ou M, o aminoácido na posição 73 é R ou A, o aminoácido na posição 77 é A, T ou I, o aminoácido na posição 83 é E ou L, o aminoácido na posição 86 é S ou R, o aminoácido na posição 90 é E ou D, e o aminoácido na posição 92 é T ou M.

[365] Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 92, em que o aminoácido na posição 44 é R ou G, o aminoácido na posição 50 está ausente, o aminoácido na posição 68 é R, o aminoácido na posição 71 é I ou M, o aminoácido na posição 73 é R, o aminoácido na posição 77 é A ou I, o aminoácido na posição 83 é E, o aminoácido na posição 86 é S ou R, o aminoácido na posição 90 é E ou D e o aminoácido na posição 92 é T ou M.

[366] Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 92, em que o aminoácido na posição 44 é R ou

G, o aminoácido na posição 50 está ausente, o aminoácido na posição 68 é R, o aminoácido na posição 71 é I ou M, o aminoácido na posição 73 é R, o aminoácido na posição 77 é A ou I, o aminoácido na posição 83 é E, o aminoácido na posição 86 é S ou R, o aminoácido na posição 90 é E ou D e o aminoácido na posição 92 é T.

[367] Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 92, em que o aminoácido na posição 44 é R, o aminoácido na posição 50 está ausente, o aminoácido na posição 68 é R, o aminoácido na posição 71 é I, o aminoácido na posição 73 é R, o aminoácido na posição 77 é A, o aminoácido na posição 83 é E, o aminoácido na posição 86 é S, o aminoácido na posição 90 é E e o aminoácido na posição 92 é T ou M.

[368] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 66. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 66.

[369] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 compreende uma região variável da cadeia leve, como aqui definido em qualquer lugar. Por exemplo, em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 pode compreender uma região variável da cadeia leve como aqui definida em outro lugar para o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado.

[370] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 é um scFv, scFab ou sdAb. Em uma modalidade, o anticorpo anti- HLA-A2 é um scFv ou scFab. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 é um sdAb. Em uma modalidade, o anticorpo anti- HLA-A2 é um scFab. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA- A2 é um scFv. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 é um scFv compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 91. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 é um scFv compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 91.

[371] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 é um anticorpo anti-HLA-A2 humanizado. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 é um anticorpo humano. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 é um anticorpo não humanizado. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 é um anticorpo não humano.

[372] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 compreende uma sequência de aminoácidos possuindo cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade para as SEQ ID NOs mencionadas acima. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 é um scFv ou scFab compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% identidade para as SEQ ID NOs mencionadas acima.

[373] Também é fornecida uma composição compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em, pelo menos, um anticorpo anti-HLA-A2 da invenção.

[374] Como aqui usado, “consistindo essencialmente em”, com referência a uma composição, significa que pelo menos um anticorpo anti-HLA-A2 da invenção, como descrito aqui acima, é o único agente ou agente terapêutico com uma atividade biológica dentro da referida composição.

[375] Em outra modalidade, é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um anticorpo anti-HLA-A2 da invenção e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[376] Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 é um anticorpo anti-HLA-A2 humanizado.

[377] Exemplos de carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, meios, solventes, revestimentos, agentes isotônicos e retardadores de absorção, aditivos, estabilizadores, conservantes, surfactantes, substâncias que inibem a degradação enzimática, álcoois, agentes de controle de pH, antioxidantes; agentes quelantes tais como EDTA ou glutationa; adjuvantes (por exemplo, hidróxido de alumínio); conservantes e propulsores.

[378] Exemplos de meios farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, água, solução salina tamponada neutra, solução salina tamponada com fosfato, solução salina normal ou outra solução salina fisiologicamente tamponada ou outro solvente como glicol, glicerol e óleo como azeite ou éster de óleo orgânico injetável. Um meio farmaceuticamente aceitável também pode conter lipossomas ou micelas.

[379] Exemplos de materiais de revestimento incluem, mas não estão limitados a, lecitina.

[380] Exemplos de agentes isotônicos incluem, mas não estão limitados a açúcares, cloreto de sódio e semelhantes.

[381] Exemplos de agentes que retardam a absorção incluem, mas não estão limitados a monoestearato de alumínio e gelatina.

[382] Exemplos de aditivos incluem, mas não estão limitados a manitol, dextrano, carboidratos (como, por exemplo, glicose, manose, sacarose ou dextranos); glicina, lactose ou polivinilpirrolidona ou outros aditivos tais como antioxidantes ou gás inerte, estabilizadores ou proteínas recombinantes (por exemplo, albumina de soro humana) adequados para administração in vivo.

[383] Exemplos de estabilizadores adequados incluem, mas não estão limitados a sacarose, gelatina, peptona, extratos proteicos digeridos, como NZ-amina ou NZ- amina AS.

[384] Carreadores farmaceuticamente aceitáveis que podem ser usados nestas composições incluem ainda, entre outros, trocadores iônicos, alumina, estearato de alumínio, lecitina, proteínas do soro, como albumina de soro humana, substâncias tamponantes como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas de glicerídeo parcial de ácidos graxos vegetais saturados, água, sais de eletrólitos, como sulfato de protamina, fosfato di-hidrogeno dissódico, fosfato hidrogeno de potássio, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coloidal, trissilicato de magnésio, polivinil pirrolidona, substâncias à base de celulose, polietileno glicol, carboximetilcelulose de sódio, poliacrilatos, ceras, polímeros em bloco de polietilenopolioxipropileno, polietileno glicol e gordura de lã.

[385] Também é fornecido um medicamento que compreende, consistindo ou consistindo essencialmente em pelo menos um anticorpo anti-HLA-A2 da invenção, como descrito acima. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 é um anticorpo anti-HLA-A2 humanizado.

IV. RECEPTORES DE ANTÍGENOS QUIMÉRICOS (CARs)

[386] Em um aspecto, a presente invenção fornece receptores de antígeno quiméricos (CARs). Os CARs são moléculas de proteína quiméricas que combinam a especificidade baseada em anticorpos para um antígeno alvo com um domínio intracelular de ativação de receptores de células imunológicas.

[387] Os CARs da invenção compreendem um domínio extracelular que se liga especificamente ao HLA-A2. O domínio extracelular compreende um anticorpo anti-HLA-A2 da invenção. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 é um anticorpo anti-HLA-A2 humanizado. Os CARs da invenção compreendem ainda um domínio transmembranar e um domínio citoplasmático compreendendo um domínio de sinalização intracelular. Em uma modalidade, os CARs da invenção são capazes de serem expressos em uma célula humana, de modo que os CARs se liguem especificamente ao HLA-A2. Em outras modalidades, os CARs da invenção são capazes de serem expressos em uma célula imunológica, de modo que os CARs se liguem especificamente ao HLA-A2. Em uma modalidade, os CARs se ligam especificamente ao HLA-A*02:01. Como seria apreciado por um técnico especialista no assunto, a capacidade de um CAR se ligar ao HLA-A2 pode ser detectada através do uso de técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, a ligação de um CAR ao HLA-A2 pode ser detectada através do uso de um tetrâmero HLA-A2, como aqui exemplificado. Em uma modalidade, os CARs aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo HLA-A selecionado de um ou mais de HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68, em comparação com um CAR compreendendo um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os CARs aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo HLA-A selecionado entre dois ou mais de HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA- A*33, HLA-A*36, HLA-A*68, em comparação com um CAR compreendendo um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os CARs aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo HLA-A selecionado entre três ou mais de HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68, em comparação com um CAR compreendendo um anticorpo BB7.2.

Em uma modalidade, os CARs aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo HLA-A selecionado entre quatro ou mais de HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30,

HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68, em comparação com um CAR compreendendo um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os CARs aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo HLA-A selecionado dentre cinco ou mais de HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68, em comparação com um CAR compreendendo um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os CARs aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo HLA-A selecionado entre seis ou mais de HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA- A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68, em comparação com um CAR compreendendo um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os CARs aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo HLA-A selecionado dentre sete ou mais de HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68, em comparação com um CAR compreendendo um anticorpo BB7.2.

Em uma modalidade, os CARs aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo HLA-A selecionado de cada um dos HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA- A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68, em comparação com um CAR compreendendo um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os CARs aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo HLA-A selecionado de um ou mais de HLA-A*25, HLA-A*29, HLA- A*30, em comparação com um CAR compreendendo um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os CARs aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo HLA-A selecionado entre dois ou mais de HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, em comparação com um CAR compreendendo um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os CARs aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um subtipo HLA-A selecionado de cada um de HLA-

A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, em comparação com um CAR que compreende um BB7. 2 anticorpo.

Em uma modalidade, os CARs aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um dos

HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-

A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01 e HLA-A*68:01, em comparação com um CAR compreendendo um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os CARs aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos dois de HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02,

HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01 e HLA-

A*68:01, em comparação com um CAR compreendendo um anticorpo

BB7.2. Em uma modalidade, os CARs aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos três de HLA-A*03:01, HLA-A*25:01,

HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-

A*36:01 e HLA-A*68:01, em comparação com um CAR compreendendo um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os CARs aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos quatro de HLA-

A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01,

HLA-A*33:01, HLA-A*36:01 e HLA-A*68:01, em comparação com um

CAR compreendendo um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os

CARs aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos cinco dos HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-

A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01 e HLA-A*68:01, em comparação com um CAR compreendendo um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os CARs aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos seis dos HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02,

HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01 e HLA-

A*68:01, em comparação com um CAR compreendendo um anticorpo

BB7.2. Em uma modalidade, os CARs aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos sete dos HLA-A*03:01, HLA-A*25:01,

HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-

A*36:01 e HLA-A*68:01, em comparação com um CAR compreendendo um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os CARs aqui fornecidos têm menos reatividade para HLA-A*03:01, HLA-

A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01,

HLA-A*36:01 e HLA-A*68:01, em comparação com um CAR compreendendo um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os CARs aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos um de

HLA-A*25:01, HLA-A*29:02 e HLA-A*30:01, em comparação com um

CAR que compreende um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os

CARs aqui fornecidos têm menos reatividade a pelo menos dois de HLA-A*25:01, HLA-A*29:02 e HLA-A*30:01, em comparação com um CAR que compreende um BB7. 2 anticorpo.

Em uma modalidade,

os CARs aqui fornecidos têm menos reatividade a HLA-A*25:01,

HLA-A*29:02 e HLA-A*30:01, em comparação com um CAR compreendendo um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os CARs aqui fornecidos têm menos reatividade ao HLA-A*25:01 em comparação com um CAR compreendendo um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os CARs aqui fornecidos têm menos reatividade ao HLA-A*29:02 em comparação com um CAR que compreende um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os CARs aqui fornecidos têm menos reatividade ao HLA-A*30:01 em comparação com um CAR compreendendo um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os CARs aqui fornecidos têm menos reatividade ao HLA-A*03:01 em comparação com um CAR compreendendo um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os CARs aqui fornecidos têm menos reatividade ao HLA-A*31:01 em comparação com um CAR compreendendo um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os CARs aqui fornecidos têm menos reatividade ao HLA-A*33:01 em comparação com um CAR compreendendo um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os CARs aqui fornecidos têm menos reatividade ao HLA-A*36:01 em comparação com um CAR compreendendo um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, os CARs aqui fornecidos têm menos reatividade ao HLA-A*68:01 em comparação com um CAR compreendendo um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, a célula humana é uma célula imunológica. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula imunológica reguladora. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula T reguladora (Treg). Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula T. Em uma modalidade, a célula T é uma Treg.

[388] As técnicas para determinar a reatividade do CAR da invenção aos subtipos de HLA-A seriam conhecidas dos técnicos especialistas no assunto. Por exemplo, a reatividade do CAR da invenção aos subtipos HLA-A pode ser determinada por um único ensaio de grânulos de antígeno.

Esses ensaios de grânulos de antígeno único estão disponíveis comercialmente (por exemplo, anticorpo de antígeno único FlowPRA; ONE LAMBDA).

[389] Em uma modalidade, o CAR da invenção tem menos reatividade a um subtipo HLA-A selecionado do grupo que compreende HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 e qualquer combinação dos mesmos, em comparação com um CAR compreendendo um anticorpo BB7.2, quando medido nas condições do Teste A, como descrito acima.

[390] Em uma modalidade, o CAR da invenção tem menos reatividade a um subtipo HLA-A selecionado do grupo que compreende HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30 e qualquer combinação dos mesmos, em comparação com um CAR compreendendo um anticorpo BB7.2, quando medido nas condições do Teste A, como descrito acima.

[391] Em uma modalidade, o CAR da invenção possui uma reatividade para pelo menos um subtipo HLA-A selecionado do grupo que compreende HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA- A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 estatisticamente inferior ao de um CAR compreendendo um anticorpo BB7.2, por exemplo, quando medido nas condições do Teste A.

[392] Em uma modalidade, o CAR da invenção possui uma reatividade para pelo menos um subtipo HLA-A selecionado do grupo que compreende HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30 estatisticamente inferior ao de um CAR compreendendo um anticorpo BB7.2, por exemplo, quando medido nas condições do Teste A.

[393] Em uma modalidade, o termo “estatisticamente inferior” significa que a reatividade (isto é, por exemplo, a ligação relativa nas condições do Teste A) medida para o CAR da invenção é inferior à reatividade medida para um CAR compreendendo um anticorpo BB7.2, com valor de p de no máximo cerca de 0,05, preferencialmente de no máximo cerca de 0,01, mais preferencialmente de no máximo cerca de 0,005 e mais preferencialmente de no máximo cerca de 0,001, em particular quando analisado por ANOVA de duas vias, pós-teste de Dunnett.

[394] Em uma modalidade, o CAR da invenção possui uma reatividade para pelo menos um subtipo HLA-A selecionado do grupo que compreende HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA- A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 inferior a um CAR compreendendo um anticorpo BB7.2. Em algumas modalidades, esse CAR tem uma ligação relativa para pelo menos um HLA-A subtipo selecionado do grupo que compreende

HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 inferior a um CAR compreendendo um anticorpo BB7.2 quando medido nas condições do Teste A. Em certos aspectos, a ligação relativa a esse CAR é no máximo cerca de 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% ou menos da ligação relativa medida para um CAR compreendendo um anticorpo BB7.2.

[395] Em uma modalidade, o CAR da invenção tem uma reatividade para pelo menos um subtipo HLA-A selecionado do grupo que compreende HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30 inferior a um CAR que compreende um anticorpo BB7.2. Em algumas modalidades, esse CAR tem uma ligação relativa para pelo menos um subtipo HLA-A selecionado do grupo que compreende HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30 inferior a um CAR que compreende um anticorpo BB7.2 quando medido nas condições do Teste A.

Em certos aspectos, a ligação relativa medida para esse CAR é no máximo cerca de 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% ou menos da ligação de um CAR compreendendo um anticorpo BB7.2.

[396] Em uma modalidade, o CAR é capaz de ser expresso em uma célula imunológica, de modo que a célula imunológica seja ativada por HLA-A2. Em uma modalidade, a célula imunológica é ativada por HLA-A*02:01. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula imunológica reguladora. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula T reguladora (Treg). Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula T. Em uma modalidade, a célula T é uma Treg. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula imunológica humana. Em uma modalidade, a célula imunológica reguladora é uma célula imunológica reguladora humana. Em uma modalidade, a célula T é uma célula T humana.

Em uma modalidade, a Treg é uma Treg humana.

[397] Em uma modalidade, o CAR compete pela ligação ao HLA-A2 com um anticorpo que compreende: uma região determinante de complementaridade da cadeia pesada 1 (HCDR1) tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 183; uma região determinante de complementariedade de cadeia pesada 2 (HCDR2) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 185; uma região determinante de complementariedade de cadeia pesada 3 (HCDR3) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 187; uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 1 (LCDR1) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 188; uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 2 (LCDR2) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 189; e uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 3 (LCDR3) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 190. Em uma modalidade, o CAR se liga ao mesmo epítopo HLA-A2 que um anticorpo que compreende: uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1) tendo a sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 183; uma região determinante de complementariedade de cadeia pesada 2 (HCDR2) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 185; uma região determinante de complementariedade de cadeia pesada 3 (HCDR3) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 187; uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 1 (LCDR1) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 188; uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 2 (LCDR2) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 189; e uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 3 (LCDR3) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 190. Em uma modalidade, o CAR compete pela ligação ao HLA-A2 com o anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, o CAR se liga ao mesmo epítopo HLA-A2 que um anticorpo BB7.2. O anticorpo BB7.2 pode ser isolado a partir do hibridoma BB7.2 (depósito ATCC No. HB-82).

[398] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende: um domínio extracelular, compreendendo um anticorpo anti-HLA-A2; um domínio transmembranar; e um domínio citoplasmático compreendendo um domínio de sinalização intracelular. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 é um anticorpo anti-HLA-A2 humanizado.

[399] Em uma modalidade, o receptor quimérico compreende ainda um Tag e/ou uma sequência líder.

[400] Em uma modalidade, o receptor quimérico compreende ainda um tag, tal como, por exemplo, um tag para controle de qualidade, enriquecimento, triagem in vivo e semelhantes. O referido Tag pode estar localizado em N terminal, C terminal e/ou internamente. Exemplos de marcadores que podem ser usados no receptor quimérico da invenção são bem conhecidos pelo técnicos especialistas no assunto. Por exemplo, mas sem limitação, um tag usado na invenção pode ser um tag selecionado do grupo que compreende ou consiste em Tag Hemaglutinina, Tag Poli Arginina, Tag Poli Histidina, Myc Tag, Tag Strep, Tag S, Tag HAT, 3x Tag Flag, Tag do peptídeo de ligação à calmodulina, Tag SBP, Tag do domínio de ligação à quitina, Tag GST, Tag da proteína de ligação à maltose, Tag da proteína fluorescente (por exemplo, eGFP), Tag T7, Tag V5 e Tag Xpress.

[401] O domínio extracelular é um elemento de ligação específico do alvo, também algumas vezes chamado de braço de direcionamento do CAR. O domínio extracelular é escolhido para reconhecer um ligante que atua como um marcador da superfície celular nas células alvo associadas a um estado de doença específico. Um CAR da presente invenção é projetado para atingir uma célula que exibe HLA-A2 através da modificação de um domínio extracelular apropriado que se liga especificamente a um epítopo HLA-A2. O elemento de ligação específico ao alvo ou o domínio de ligação ao antígeno do CAR da presente invenção pode ser aqui referido como um domínio de ligação anti-HLA-A2. Em algumas modalidades, o domínio de ligação anti-HLA-A2 pode ser um domínio de ligação anti-HLA-A2 humanizado.

[402] O domínio transmembranar está ligado ao domínio extracelular e ao domínio citoplasmático do CAR. O domínio transmembranar é capaz de sinalizar para os domínios de sinalização intracelular do domínio citoplasmático sempre que o domínio extracelular do CAR estiver ligado a um alvo.

[403] O domínio citoplasmático que inclui o domínio de sinalização intracelular do CAR é responsável pela ativação de pelo menos uma das funções efetoras fisiológicas da célula imunológica (por exemplo, célula T reguladora) na qual o CAR foi inserido. O termo “função efetora” se refere a uma função especializada de uma célula imunológica. Por exemplo, uma função efetora de uma célula T reguladora pode incluir suprimir ou regular negativamente a indução e/ou proliferação de outras células imunológicas. Além disso, a função efetora de Tregs pode incluir efeitos em células não imunológicas que resultam em um estado clínico melhorado, como promover reparo ou regeneração tecidual. Assim, o termo “domínio de sinalização intracelular” se refere à porção de uma proteína que transduz o sinal da função efetora e direciona a célula imunológica para desempenhar sua função especializada. Embora geralmente todo o domínio de sinalização intracelular possa ser empregado, em muitos casos, não é necessário usar toda a cadeia. Na medida em que uma porção truncada do domínio de sinalização intracelular é usada, essa porção truncada pode ser usada no lugar da cadeia intacta, desde que transduza o sinal da função efetora. O termo domínio de sinalização intracelular pretende assim incluir qualquer porção truncada do domínio de sinalização intracelular suficiente para transduzir o sinal da função efetora.

[404] Em uma modalidade, pode haver um domínio espaçador (ou ligante ou dobradiça) incorporado entre o domínio de ligação ao antígeno e o domínio transmembranar do CAR ou entre o domínio de sinalização intracelular e o domínio transmembranar do CAR. Como definido acima, domínio espaçador, ligante e dobradiça são oligo ou polipeptídeos que funcionam para ligar o domínio transmembranar ao domínio de ligação ao antígeno ou ao domínio de sinalização intracelular na cadeia polipeptídica. Um domínio espaçador pode compreender, por exemplo, até 300 aminoácidos, 10 a 100 aminoácidos, 25 a 75 aminoácidos ou 25 a 50 aminoácidos ou aminoácidos de quaisquer subfaixas ou valores numéricos individuais dentro dessas faixas.

Domínio Extracelular

[405] O domínio extracelular compreende um anticorpo anti-HLA-A2 da presente invenção. Em uma modalidade, o domínio extracelular compreende um anticorpo anti-HLA-A2 humanizado da presente invenção.

[406] Em uma modalidade, o domínio extracelular compreende um anticorpo anti-HLA-A2 da presente invenção que é um scFv, scFab ou sdAb. Em uma modalidade, o domínio extracelular compreende um anticorpo anti-HLA-A2 da presente invenção que é um scFv ou scFab. Em uma modalidade, o domínio extracelular compreende um anticorpo anti-HLA-A2 da presente invenção que é um sdAb. Em uma modalidade, o domínio extracelular compreende um anticorpo anti-HLA-A2 da presente invenção que é um scFv. Em uma modalidade, o domínio extracelular compreende um anticorpo anti-HLA-A2 da presente invenção que é um scFab. Em uma modalidade, o domínio extracelular compreende qualquer anticorpo anti-HLA-A2 humanizado da presente invenção, em que o anticorpo anti- HLA-A2 humanizado é um scFv, scFab ou sdAb. Em uma modalidade, o domínio extracelular compreende qualquer anticorpo anti-HLA-A2 humanizado da presente invenção, em que o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado é um scFv ou scFab.

Em uma modalidade, o domínio extracelular compreende um anticorpo anti-HLA-A2 humanizado da presente invenção que é um sdAb. Em uma modalidade, o domínio extracelular compreende um anticorpo anti-HLA-A2 humanizado da presente invenção que é um scFv. Em uma modalidade, o domínio extracelular compreende um anticorpo anti-HLA-A2 humanizado da presente invenção que é um scFab.

[407] Em algumas modalidades, o domínio extracelular pode compreender uma dobradiça, onde o domínio transmembranar está ligado à região extracelular do CAR, por exemplo, o domínio de ligação ao antígeno do CAR, através da dobradiça. Em uma modalidade, a dobradiça pode ser de uma proteína humana. Por exemplo, em uma modalidade, a dobradiça pode ser uma dobradiça de Ig humana (imunoglobulina), por exemplo, uma dobradiça de IgG4 ou uma dobradiça de CD8α. Em alguns casos, o domínio extracelular do CAR da invenção pode compreender uma dobradiça CD8α. Em uma modalidade, a região de dobradiça compreende uma região de haste de CD8α. Em uma modalidade, a dobradiça CD8 pode ser codificada pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 15 da Patente U.S.

No. 9.102.760. Em uma modalidade, a dobradiça CD8 pode compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21 da Patente US No. 9.102.760. Em outra modalidade, a dobradiça CD8 pode compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21 da Patente US No. 9.102.760. Em uma modalidade, a dobradiça ou espaçador pode compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 115 ou 219 na Tabela 3. Em uma modalidade, a dobradiça ou espaçador pode ser codificada por uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 159 ou 220 na Tabela 4.

Domínio Transmembranar

[408] O domínio transmembranar pode ser derivado de uma fonte natural ou de uma fonte sintética. Em uma modalidade, o domínio transmembranar pode ser derivado de uma fonte natural, por exemplo, de qualquer proteína ligada à membrana ou transmembrana.

[409] Em uma modalidade, o domínio transmembranar do CAR pode ser derivado de um domínio transmembranar que está naturalmente associado a um dos domínios do CAR. Em outras modalidades, o domínio transmembranar pode ser selecionado ou modificado por substituição de aminoácidos para evitar a ligação de tais domínios ao domínio transmembranar da mesma ou de diferentes proteínas da membrana superficial para minimizar as interações com outros membros do complexo receptor.

[410] Em uma modalidade, o domínio transmembranar pode incluir um ou mais aminoácidos adicionais adjacentes à região transmembranar, por exemplo, um ou mais aminoácidos associados à região extracelular da proteína da qual a transmembrana é derivada (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos da região extracelular) e/ou um ou mais aminoácidos adicionais associados à região citoplasmática da proteína da qual a proteína transmembranar é derivada (por exemplo, 1, 2, 3, 4,

5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos da região citoplasmática).

[411] Em uma modalidade, o domínio transmembranar pode compreender um domínio transmembranar de uma proteína selecionada do grupo que consiste em CD3 gama, CD3 delta, CD3 épsilon, CD3 zeta, a cadeia alfa do receptor de células T, a cadeia beta do receptor da célula T, a cadeia gama do receptor de células T, a cadeia delta do receptor de células T, CD28, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, IL2R beta, IL2R gama, IL7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, PD1, ITGAX, CDl1c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (tátil), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CDIOO (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LT BR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D e/ou NKG2C e CD154 e qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o domínio transmembranar pode compreender um domínio transmembranar de CD28. Em uma modalidade, o domínio transmembranar CD28 é codificado pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 160 na Tabela 4. Em uma modalidade,

o domínio transmembranar CD28 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 116 na Tabela 3. Em outra modalidade, o domínio transmembranar de CD28 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 116 na Tabela 3.

[412] Em uma modalidade, o domínio transmembranar pode compreender um domínio transmembranar de CD8. Em uma modalidade, o domínio transmembranar CD8 é codificado pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 16 da Patente U.S.

No. 9.102.760. Em uma modalidade, o domínio transmembranar de CD8 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 da Patente U.S. No. 9.102.760. Em outra modalidade, o domínio transmembranar de CD8 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 da Patente U.S. No. 9.102.760.

[413] Em uma modalidade, o domínio transmembranar CD8 é codificado pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 224 na Tabela 4. Em uma modalidade, o domínio transmembranar de CD8 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 223 na Tabela 3.

[414] Em outras modalidades, o domínio transmembranar pode ser sintético, caso em que pode compreender resíduos predominantemente hidrofóbicos, incluindo leucina e valina. Em uma modalidade, um tripleto de fenilalanina, triptofano e valina pode ser encontrado em cada extremidade de um domínio transmembranar sintético.

[415] Em uma modalidade, um ligante oligo ou polipeptídico curto pode formar uma ligação entre o domínio transmembranar e o domínio citoplasmático do CAR. Em uma modalidade, o ligante pode compreender entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos em comprimento. Em uma modalidade, o ligante pode compreender um dupleto de glicina- serina.

Domínio Citoplasmático

[416] Em uma modalidade, os domínios de sinalização intracelular para uso no CAR da invenção podem incluir as sequências citoplasmáticas do receptor de células T (TCR) e co-receptores que atuam em conjunto para iniciar a transdução de sinal após o envolvimento do receptor de antígeno, bem como qualquer derivado ou variante dessas sequências e qualquer sequência sintética que tenha a mesma capacidade funcional.

[417] Sequências de sinalização citoplasmáticas primárias regulam a ativação primária do complexo TCR de maneira estimuladora ou inibitória. As sequências de sinalização citoplasmáticas primárias que atuam de maneira estimuladora podem conter motivos de sinalização que são conhecidos como motivos de ativação à base de tirosina imunorreceptora ou ITAMs. Exemplos de ITAM contendo sequências de sinalização citoplasmáticas primárias que são de uso particular na invenção incluem aquelas derivadas de

CD3 zeta, FcR gama, CD3 gama, CD3 delta, CD3 épsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b e CD66d. Em uma modalidade, um domínio de sinalização primário compreende um domínio ITAM modificado, por exemplo, um domínio ITAM mutado que alterou (por exemplo, aumentou ou reduziu) a atividade em comparação com o domínio ITΑΜ nativo. Em uma modalidade, um domínio de sinalização primário compreende um domínio de sinalização intracelular primário contendo ITAM modificado, por exemplo, um domínio de sinalização intracelular primário contendo ITAM otimizado e/ou truncado. Em uma modalidade, um domínio de sinalização primário compreende um, dois, três, quatro ou mais motivos ITAM.

[418] Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização funcional de uma proteína selecionada do grupo que consiste em CD3 gama, CD3 delta, CD3 épsilon, CD3 zeta, FcR gama (por exemplo, FCγRI, RCγRIIA, FcγRIIB1, FcγRIIB2, FcγRIIIA ou FcγRIIIB), FcR alfa (por exemplo, FcαRI), FcR épsilon (por exemplo, FcεRI ou FcεRII), CD5, CD22, CD79a, CD79b, DAP10, DAP12 e CD66d e qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular compreende ou consiste em um domínio de sinalização primário de CD3- zeta.

[419] É sabido que os sinais gerados apenas através do TCR podem ser insuficientes para a ativação total da célula T e que um sinal secundário ou co-estimulador também pode ser necessário. Assim, em certas modalidades, a ativação de células T pode ser mediada por duas classes de sequência de sinalização citoplasmática: aquelas que iniciam a ativação primária dependente de antígeno através do TCR (sequências de sinalização citoplasmática primária) e aquelas que agem de maneira independente de antígeno para fornecer um sinal secundário ou co-estimulador (sequências de sinalização citoplasmáticas secundárias). Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular pode ainda compreender um domínio co-estimulador.

[420] Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular do CAR pode compreender o domínio de sinalização CD3-zeta por si só ou pode ser combinado com qualquer outro domínio de sinalização intracelular desejado útil no contexto de um CAR da invenção. Por exemplo, o domínio de sinalização intracelular do CAR pode compreender uma porção da cadeia zeta CD3 e um domínio de sinalização co- estimulador. O domínio de sinalização co-estimulador se refere a uma porção do CAR compreendendo o domínio intracelular de uma molécula co-estimuladora. Uma molécula co-estimuladora é uma molécula da superfície celular que não é um receptor de antígeno ou seus ligantes que é necessária para uma resposta eficiente de linfócitos a um antígeno.

Exemplos de tais moléculas incluem OX40, CD27, CD28,

antígeno-1 associado à função de linfócitos (LFA-1) (CD11a/CD18), TNFR1 (CD120a/TNFRSF1A), TNFR2 (CD120b/TNFRSF1B), CTLA-4 (CD152), CD95, ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), CD2, CD30, CD40, PD-1, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ICAM-1, um ligante que se liga especificamente a CD83, IL2ra (CD25), IL6Ra (CD126), IL-7Ra (CD127), IL-13RA1, IL-13 RA2, IL-33R (IL1RL1), IL-10RA, IL-10 RB, IL-4R, IL-5R (CSF2RB), ARHR, Receptor BAFF, IL-21R, TGFbR1, TGFbR2, TGFbR 3, cadeia gama comum, uma molécula MHC de classe I, BTLA e um receptor de ligante Toll, um ligante que se liga especificamente a CD83, CDS, ICAM-1, GITR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160 (BY55), CD19, CD19a, CD4, CD8alpha, CD8beta, IL2R beta, IL2R gama, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49D, IA4, CD4 ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CitgbD18, ITGB7, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244), 2B4), C D84, CD96 (Tátil), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKG2D e semelhantes.

[421] As sequências de sinalização intracelular dentro da porção citoplasmática do CAR da invenção podem ser ligadas entre si em uma ordem aleatória ou especificada.

Opcionalmente, um ligante oligo ou polipeptídico curto, por exemplo, entre 1 e 10 aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos) de comprimento pode formar a ligação entre as sequências de sinalização intracelular.

Em uma modalidade, um dupleto de glicina-serina pode ser usado como um ligante adequado. Em uma modalidade, um único aminoácido, por exemplo, uma alanina, uma glicina, pode ser usado como um ligante adequado.

[422] Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular é projetado para compreender dois ou mais, por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou mais, domínios de sinalização co- estimuladores. Em uma modalidade, os dois ou mais, por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou mais domínios de sinalização co- estimuladores, são separados por uma molécula de ligação, por exemplo, uma molécula de ligação aqui descrita. Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular compreende dois domínios de sinalização co-estimuladors. Em algumas modalidades, a molécula ligante é um resíduo de glicina. Em algumas modalidades, o ligante é um resíduo de alanina.

[423] Em uma modalidade, o domínio citoplasmático pode compreender o domínio de sinalização de CD3-zeta e o domínio de sinalização de CD28. Em outra modalidade, o domínio citoplasmático pode compreender o domínio de sinalização de CD3-zeta e o domínio de sinalização de 4-IBB.

Em ainda outra modalidade, o domínio citoplasmático pode compreender o domínio de sinalização de CD3-zeta e os domínios de sinalização de CD28 e 4-1BB.

[424] Em uma modalidade, o domínio citoplasmático pode compreender o domínio de sinalização de CD28 e o domínio de sinalização de CD3-zeta, em que o domínio de sinalização de CD28 é codificado pela sequência de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO: 161 na Tabela 4 e o domínio de sinalização de CD3-zeta é codificado pela sequência de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO: 162 na Tabela 4.

[425] Em uma modalidade, o domínio citoplasmático pode compreender o domínio de sinalização de CD28 e o domínio de sinalização de CD3-zeta, em que o domínio de sinalização de CD28 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 117 na Tabela 3 e o domínio de sinalização de CD3-zeta compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 118 na Tabela 3.

[426] Em uma modalidade, o domínio citoplasmático pode compreender o domínio de sinalização de CD28 e o domínio de sinalização de CD3-zeta, em que o domínio de sinalização de CD28 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 117 na Tabela 3 e o domínio de sinalização de CD3-zeta compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 118 na Tabela 3.

[427] Em uma modalidade, o domínio citoplasmático pode compreender o domínio de sinalização de 4-1BB e o domínio de sinalização de CD3-zeta, em que o domínio de sinalização de 4-1BB é codificado pela sequência de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO: 17 da Patente U.S. No.

9.102.760 e o domínio de sinalização de CD3-zeta é codificado pela sequência de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO: 162 na Tabela 4.

[428] Em uma modalidade, o domínio citoplasmático pode compreender o domínio de sinalização de 4-1BB e o domínio de sinalização de CD3-zeta, em que o domínio de sinalização de 4-1BB compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 da Patente U.S. No. 9.102.760 e o domínio de sinalização de CD3-zeta compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 118 na Tabela 3.

[429] Em uma modalidade, o domínio citoplasmático pode compreender o domínio de sinalização de 4-1BB e o domínio de sinalização de CD3-zeta, em que o domínio de sinalização de 4-1BB compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 23 da Patente U.S. No. 9.102.760 e o domínio de sinalização de CD3-zeta compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 118 na Tabela 3.

[430] Em uma modalidade, o CAR compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138 ou 213. Em uma modalidade, o CAR compreende uma sequência de aminoácidos possuindo cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138 ou 213.

V. ÁCIDOS NUCLEICOS E VETORES

[431] Em algumas modalidades, a invenção fornece um ácido nucleico que codifica um anticorpo anti-HLA-A2 da presente invenção. Em algumas modalidades, a invenção fornece um ácido nucleico que codifica um anticorpo anti- HLA-A2 humanizado da presente invenção. Em algumas modalidades, a invenção fornece um ácido nucleico que codifica uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 ou

91. Em algumas modalidades, a invenção fornece um ácido nucleico que codifica uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 ou 112. Em algumas modalidades, a invenção fornece um ácido nucleico que codifica uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos com cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84,

85, 86, 87, 88, 89, 90 ou 91. Em algumas modalidades, a invenção fornece um ácido nucleico que codifica uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos com cerca de

80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%,

92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103,

104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 ou 112. Em algumas modalidades, a invenção fornece um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida na

SEQ ID NO: 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148,

149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157 ou 158. Em algumas modalidades, a invenção fornece um ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácido nucleico com cerca de

80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%,

92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147,

148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157 ou 158. Em algumas modalidades, a invenção fornece uma proteína codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO: 139, 140, 141,

142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153,

154, 155, 156, 157 ou 158. Em algumas modalidades, a invenção fornece uma proteína codificada por um ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácido nucleico possuindo cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%,

90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157 ou 158. Em algumas modalidades, a invenção fornece um ácido nucleico que codifica uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 ou 71. Em algumas modalidades, a invenção fornece um ácido nucleico que codifica uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos com cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 ou 71.

[432] Em algumas modalidades, a invenção fornece um ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) da presente invenção. As sequências de ácido nucleico que codificam CAR da invenção podem codificar CARs que compreendem um domínio extracelular como descrito em outro lugar aqui.

[433] O domínio extracelular pode compreender um anticorpo anti-HLA-A2 da presente invenção. O domínio extracelular pode compreender um anticorpo anti-HLA-A2 humanizado da presente invenção. Em uma modalidade, o domínio extracelular pode ainda compreender uma sequência líder. Em uma modalidade, a sequência líder compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 113. Em uma modalidade, o domínio extracelular compreende uma região de dobradiça, em que o domínio de ligação anti-HLA-A2 está conectado ao domínio transmembranar pela região de dobradiça. Em uma modalidade, a região de dobradiça compreende uma região de haste de CD8α.

[434] As sequências de ácidos nucleicos da invenção podem codificar CARs que compreendem um domínio transmembranar como descrito em outro lugar aqui. Por exemplo, em uma modalidade, o domínio transmembranar compreende um domínio transmembranar de uma proteína selecionada do grupo que consiste em CD3 gama, CD3 delta, CD3 épsilon, CD3 zeta, a cadeia alfa do receptor de célula T, a cadeia beta do receptor de células T, a cadeia gama do receptor de células T, a cadeia delta do receptor de células T, CD28, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD16, CD22, CD33, CD37, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, IL2R beta, IL2R gama, IL7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA- 1, ITGAM, CD11b, PD1, ITGAX, CDl1c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (tátil), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CDIOO (SEMA4D),

SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D e/ou NKG2C e CD154 e qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o domínio transmembranar compreende um domínio transmembranar de CD28.

[435] As sequências de ácidos nucleicos da invenção podem codificar CARs que compreendem um domínio citoplasmático como descrito em outro lugar aqui. Além disso, o domínio citoplasmático pode compreender um domínio de sinalização intracelular como descrito em outro lugar aqui.

Por exemplo, em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização funcional de uma proteína selecionada do grupo que consiste em CD3 gama, CD3 delta, CD3 épsilon, CD3 zeta, FcR gama (por exemplo, FCγRI, RCγRIIA, FcγRIIB1, FcγRIIB2, FcγRIIIA ou FcγRIIIB), FcR alfa (por exemplo, FcαRI), FcR épsilon (por exemplo, FcεRI ou FcεRII), CD5, CD22, CD79a, CD79a, CD79b, DAP10, DAP12 e CD66d e qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização funcional de CD3 zeta.

Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular compreende ainda um domínio co-estimulador. O domínio co- estimulador dos CARs codificados pelas sequências de ácidos nucleicos da invenção pode ser um domínio co-estimulador, como descrito em outro lugar aqui. Por exemplo, em uma modalidade, o domínio coestimulador compreende um domínio de sinalização funcional de uma proteína selecionada do grupo que consiste em OX40, CD27, CD28, antígeno-1 associado à função de linfócitos (LFA-1) (CD11a/CD18), TNFR1

(CD120a/TNFRSF1A), TNFR2 (CD120b/TNFRSF1B), CTLA-4 (CD152),

CD95, ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), CD2, CD30, CD40, PD-1,

CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ICAM-1, um ligante que se liga especificamente a CD83, IL2ra (CD25), IL6Ra (CD126), IL-7Ra

(CD127), IL-13RA1, IL-13 RA2, IL-33R (IL1RL1), IL-10RA, IL-

10 RB, IL-4R, IL-5R (CSF2RB), ARHR, receptor BAFF, IL-21R,

TGFbR1, TGFbR2, TGFbR3, cadeia gama comum, uma cadeia gama comum, uma molécula MHC de classe I, BTLA e um receptor de ligante Toll, um ligante que se liga especificamente a CD83,

CDS, ICAM-1, GITR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1),

NKp44, NKp30, NKp46, CD160 (BY55), CD19, CD19a, CD4,

CD8alpha, CD8beta, IL2R beta, IL2R gama, IL7R alfa, ITGA4,

VLA1, CD49a, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d,

ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, ITG AM, CD11b, ITGAX, CD11c,

ITGB1, CD29, ITGB2, CitgbD18, ITGB7, TRANCE/RANKL, DNAM1

(CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tátil), CEACAM1,

CRTAM, Ly9 (CD229), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-

A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), Culpa (SLAMF8),

SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKG2D e qualquer combinação dos mesmos.

Em uma modalidade, o domínio co-estimulador compreende um domínio de sinalização funcional de uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em CD28, 4-1BB e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o domínio co-estimulador compreende um domínio de sinalização funcional de CD28. Em uma modalidade, o domínio co-estimulador compreende um domínio de sinalização funcional de 4-1BB. Em uma modalidade, as sequências compreendendo o domínio de sinalização intracelular são expressas na mesma estrutura e como uma única cadeia polipeptídica.

[436] As sequências de ácido nucleico da presente invenção podem ser sequências de ácido nucleico isoladas.

[437] Em uma modalidade, o ácido nucleico é fornecido como um transcrito de RNA mensageiro. Em uma modalidade, o ácido nucleico é fornecido como um construto de DNA.

[438] Em uma modalidade, é fornecido um construto de DNA recombinante compreendendo sequências que codificam um CAR, em que o CAR compreende: (i) um domínio extracelular compreendendo um anticorpo anti-HLA-A2; (ii) um domínio transmembranar; e (iii) um domínio citoplasmático compreendendo um domínio de sinalização intracelular, em que o CAR codificado é capaz de ser expresso em uma célula humana, de modo que o CAR seja capaz de se ligar especificamente ao HLA-A2. Em uma modalidade, o CAR é capaz de se ligar especificamente ao HLA-A*02:01. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 é um anticorpo anti-HLA- A2 humanizado. Em uma modalidade, a célula humana é uma célula imunológica. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula imunológica reguladora. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula T reguladora (Treg). Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula T. Em uma modalidade, a célula T é uma Treg.

[439] Em uma modalidade, é fornecida um construto de DNA recombinante compreendendo as sequências que codificam um CAR, em que o CAR compreende: (i) um domínio extracelular compreendendo um anticorpo anti-HLA-A2; (ii) um domínio transmembranar; e (iii) um domínio citoplasmático compreendendo um domínio de sinalização intracelular, em que o CAR codificado é capaz de ser expresso em uma célula T reguladora (Treg), de modo que o CAR seja capaz de se ligar especificamente ao HLA-A2. Em uma modalidade, o CAR é capaz de se ligar especificamente ao HLA-A*02:01. Em uma modalidade, a ligação de um CAR ao HLA-A2 pode ser detectada através do uso de um tetrâmero HLA-A2, como aqui exemplificado. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HLA-A2 é um anticorpo anti-HLA-A2 humanizado. Em uma modalidade, a Treg é uma Treg humana.

[440] Em uma modalidade, o CAR codificado é capaz de ser expresso em uma célula imunológica, de modo que a célula imunológica seja ativada por HLA-A2. Em uma modalidade, a célula imunológica é ativada por HLA-A*02:01.

Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula imunológica reguladora. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula T reguladora (Treg). Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula T. Em uma modalidade, a célula T é uma Treg. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula imunológica humana. Em uma modalidade, a célula imunológica reguladora é uma célula imunológica reguladora humana. Em uma modalidade, a célula T é uma célula T humana. Em uma modalidade, a Treg é uma Treg humana.

[441] Em uma modalidade, o CAR codificado compete pela ligação ao HLA-A2 com um anticorpo compreendendo: uma região determinante de complementaridade da cadeia pesada 1 (HCDR1) tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 183; uma região determinante de complementariedade de cadeia pesada 2 (HCDR2) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 185; uma região determinante de complementariedade de cadeia pesada 3 (HCDR3) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 187; uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 1 (LCDR1) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 188; uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 2 (LCDR2) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 189; e uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 3 (LCDR3) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 190. Em uma modalidade, o CAR codificado se liga ao mesmo epítopo HLA-A2 que um anticorpo que compreende: uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1) tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 183; uma região determinante de complementariedade de cadeia pesada 2 (HCDR2) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 185; uma região determinante de complementariedade de cadeia pesada 3 (HCDR3) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 187; uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 1 (LCDR1) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 188; uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 2 (LCDR2) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 189; e uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 3 (LCDR3) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 190. Em uma modalidade, o CAR codificado compete pela ligação ao HLA-A2 com um anticorpo BB7.2. Em uma modalidade, o CAR codificado se liga ao mesmo epítopo HLA- A2 que um anticorpo BB7.2.

[442] Em algumas modalidades, a invenção fornece um ácido nucleico que codifica uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138 ou 213. Em algumas modalidades, a invenção fornece um ácido nucleico que codifica uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos com cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%,

87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%

ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 119, 120, 121, 122,

123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134,

135, 136, 137, 138 ou 213. Em algumas modalidades, a invenção fornece um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO: 163, 164, 165, 166, 167,

168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179,

180, 181, 182 ou 214. Em algumas modalidades, a invenção fornece um ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácido nucleico com cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%,

86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,

98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 163, 164, 165,

166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177,

178, 179, 180, 181, 182 ou 214. Em algumas modalidades, a invenção fornece uma proteína codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO: 163, 164, 165, 166, 167, 168,

169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180,

181, 182 ou 214. Em algumas modalidades, a invenção fornece uma proteína codificada por um ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácido nucleico possuindo cerca de 80%, 81%,

82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%,

94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID

NO: 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182 ou 214.

[443] As sequências de ácidos nucleicos que codificam as moléculas desejadas podem ser obtidas usando métodos recombinantes conhecidos na técnica, como, por exemplo, pesquisando bibliotecas de células que expressam o gene, derivando o gene de um vetor conhecido por incluir o mesmo ou isolando diretamente de células e tecidos contendo os mesmos, usando técnicas padrão. Alternativamente, o ácido nucleico de interesse pode ser produzido sinteticamente, em vez de clonado.

[444] A presente invenção fornece ainda um vetor que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica anticorpo anti-HLA-A2 ou uma molécula de ácido nucleico que codifica CAR. Em uma modalidade, a invenção fornece um vetor compreendendo uma molécula de ácido nucleico que codifica para anticorpo anti-HLA-A2 humanizado. Em uma modalidade, a invenção fornece vetores nos quais uma molécula de ácido nucleico é inserida.

[445] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico como descrito em outro lugar aqui.

[446] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica qualquer um dos anticorpos anti-HLA-A2 aqui descritos. Em outras modalidades, a presente invenção fornece um vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica qualquer um dos anticorpos anti-HLA-A2 humanizados aqui descritos. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um vetor compreendendo um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO: 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157 ou 158. Em algumas modalidades, a invenção fornece um vetor compreendendo um ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácido nucleico com cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157 ou 158. Em certos aspectos, é fornecida uma célula hospedeira que inclui esse vetor.

[447] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica CAR da invenção. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO: 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182 ou 214. Em algumas modalidades, a invenção fornece um vetor compreendendo um ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácido nucleico com cerca de

80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182 ou

214.

[448] Em uma modalidade, os vetores da invenção podem ser transduzidos em uma célula. Em uma modalidade, os vetores da invenção podem ser transduzidos ou manipulados por métodos de vetores não virais em uma célula humana. Em uma modalidade, os vetores da invenção podem ser transduzidos para uma célula imunológica. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula imunológica reguladora. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula T reguladora (Treg). Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula T. Em uma modalidade, a célula T pode ser um Treg. Em uma modalidade, o vetor é capaz de expressar o CAR em células imunológicas de mamíferos. Em uma modalidade, a célula imunológica de mamífero é uma célula imunológica humana. Em uma modalidade, o vetor é capaz de expressar o CAR nas células imunológicas reguladoras de mamíferos. Em uma modalidade, a célula imunológica reguladora de mamíferos é uma célula imunológica reguladora humana. Em uma modalidade, o vetor é capaz de expressar o CAR em células T de mamífero.

Em uma modalidade, as células T de mamífero são células T reguladoras de mamífero. Em uma modalidade, a célula T de mamífero T é uma célula T humana. Em uma modalidade, a célula T de mamífero é uma célula T reguladora humana.

[449] Em uma modalidade, o vetor é um vetor de clonagem ou expressão, por exemplo, um vetor incluindo, mas não limitado a um ou mais construtos de plasmídeos (por exemplo, plasmídeos de expressão, vetores de clonagem, minicírculos, minivetores, cromossomos de dois minutos), vetor retroviral e lentiviral.

[450] A presente invenção inclui construtos de vetores retrovirais e lentivirais que expressam um CAR que pode ser diretamente transduzido em uma célula. Os vetores derivados de retrovírus, como o lentivírus, são ferramentas adequadas para alcançar a transferência de genes a longo prazo, pois permitem a integração estável a longo prazo de um transgene e sua propagação nas células filhas. Os vetores lentivirais têm a vantagem adicional sobre vetores derivados de onco-retrovírus, como vírus da leucemia murina, na medida em que podem transduzir células não proliferativas, como hepatócitos. Eles também têm a vantagem adicional de baixa imunogenicidade.

[451] Em um breve resumo, a expressão de ácidos nucleicos naturais ou sintéticos que codificam CARs é tipicamente obtida pela ligação operacional de um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo CAR ou frações do mesmo a um promotor e incorporação do construto em um vetor de expressão. Os vetores podem ser adequados para replicação e integração de eucariontes. Os vectores de clonagem típicos contêm terminadores de transcrição e tradução, sequências de iniciação e promotores úteis para a regulação da expressão da sequência de ácidos nucleicos desejada.

[452] Além dos métodos descritos acima, os seguintes métodos podem ser usados.

[453] Os construtos de expressão da presente invenção também podem ser usados para imunização com ácido nucleico e terapia genética, utilizando protocolos de entrega de genes padrão. Métodos para a liberação de genes são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Pat. 5.399.346,

5.580.859, 5.589.466, incorporadas por referência aqui na sua totalidade. Em outra modalidade, a invenção fornece um vetor de terapia gênica. Em outra modalidade, técnicas de edição de genoma, como técnicas baseadas em CRISPR-Cas9 ou TALEN, podem ser usadas para introduzir ácidos nucleicos que codificam CARs da presente invenção no genoma de células imunológicas receptoras (Delhove, JMKM, et al., 2017; Eyquem, J. et al., 2017).

[454] O ácido nucleico pode ser clonado em vários tipos de vetores. Por exemplo, o ácido nucleico pode ser clonado em um vetor incluindo, mas não limitado a, um plasmídeo, um fagoide, um derivado de fago, um vírus animal e um cosmídeo. Vetores de interesse particular incluem vetores de expressão, vetores de replicação, vetores de geração de sonda e vetores de sequenciamento.

[455] Além disso, o vetor de expressão pode ser fornecido a uma célula na forma de um vetor viral. A tecnologia do vetor viral é bem conhecida na técnica e é descrita, por exemplo, em Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova York) e em outros manuais de virologia e biologia molecular. Os vírus, que são úteis como vetores, incluem, entre outros, retrovírus, adenovírus, vírus adeno- associados, vírus do herpes, poxvírus e lentivírus (ver, por exemplo, Pat. 5.350.674 e 5.585.362). Em geral, um vetor adequado contém uma origem de replicação funcional em pelo menos um organismo, uma sequência promotora, locais convenientes de endonucleases de restrição e um ou mais marcadores selecionáveis (por exemplo, WO 01/96584; WO 01/29058; e Pat. U.S. No. 6.326.193).

[456] Vários sistemas baseados em vírus foram desenvolvidos para transferência de genes para células de mamíferos. Por exemplo, os retrovírus fornecem uma plataforma conveniente para sistemas de liberação de genes.

Um gene selecionado pode ser inserido em um vetor e empacotado em partículas retrovirais usando técnicas conhecidas na técnica. O vírus recombinante pode então ser isolado e liberado às células do indivíduo in vivo ou ex vivo. Um número de sistemas retrovirais é conhecido na técnica. Em algumas modalidades, vetores de adenovírus são usados. Um número de vetores de adenovírus é conhecido na técnica. Em uma modalidade, são usados vetores de lentivírus.

[457] Elementos transcricionalmente ativos adicionais, por exemplo, promotores e intensificadores, podem regular a frequência do início da transcrição.

Normalmente, em relação ao promotor principal, eles estão localizados na região 30-110 pb a montante do local de início, embora recentemente tenha sido demonstrado que vários promotores contêm elementos funcionais a jusante do local de início, e os elementos melhoradores geralmente estão localizados 500-2000bp a montante do local inicial. O espaçamento entre os elementos promotores é frequentemente flexível, de modo que a função do promotor é preservada quando os elementos são invertidos ou movidos em relação um ao outro. No promotor da timidina quinase (tk), o espaçamento entre os elementos do promotor pode ser aumentado para 50 pb antes que a atividade comece a declinar. Dependendo do promotor, parece que elementos individuais podem funcionar de forma cooperativa ou independente para ativar a transcrição.

[458] Um exemplo de um promotor adequado é a sequência promotora imediata do citomegalovírus (CMV). Esta sequência promotora é uma sequência promotora constitutiva forte capaz de conduzir altos níveis de expressão de qualquer sequência de polinucleotídeos operacionalmente ligada a ela.

Outro exemplo de um promotor adequado é o Fator de Crescimento de Alongamento-1a (EF-1a). Outro exemplo de um promotor adequado é o promotor de fosfoglicerato quinase (PGK). No entanto, outras sequências promotoras constitutivas também podem ser utilizadas, incluindo, entre outras, o promotor inicial do vírus símio 40 (SV40), o vírus do tumor mamário do camundongo (MMTV), o promotor da repetição longa do terminal (LTR) do vírus da imunodeficiência humana (HIV), promotor MoMuLV, um promotor do vírus da leucemia aviária, um promotor precoce imediato do vírus Epstein-Barr, um promotor do vírus Rous sarcoma, bem como promotores de genes humanos, como, entre outros, o promotor da actina, o promotor da miosina, o promotor da hemoglobina e o promotor da creatina quinase. Além disso, a invenção não deve se limitar ao uso de promotores constitutivos. Promotores induzíveis também são contemplados como parte da invenção. A utilização de um promotor induzível fornece um comutador molecular capaz de ativar a expressão da sequência de polinucleotídeos, a qual está operacionalmente ligada quando tal expressão é desejada, ou desativar a expressão quando a expressão não é desejada.

Exemplos de promotores induzíveis incluem, mas não estão limitados a, um promotor de metalotionina, um promotor de glicocorticoide, um promotor de progesterona e um promotor de tetraciclina.

[459] A fim de avaliar a expressão de um polipeptídeo CAR ou de partes do mesmo, o vetor de expressão a ser introduzido em uma célula também pode conter um gene marcador selecionável ou um gene repórter ou ambos para facilitar a identificação e seleção de células que expressam a população de células que buscou ser transfectado ou infectado através de vetores virais. Em outros aspectos, o marcador selecionável pode ser carregado em um pedaço separado de DNA e usado em um procedimento de co-transfecção.

Tanto os marcadores selecionáveis quanto os genes repórteres podem ser flanqueados com sequências reguladoras apropriadas para permitir a expressão nas células hospedeiras.

Marcadores selecionáveis úteis incluem, por exemplo, genes de resistência a antibióticos, como neo e semelhantes.

[460] Os genes repórter são usados para identificar células potencialmente transfectadas e para avaliar a funcionalidade de sequências reguladoras. Em geral, um gene repórter é um gene que não está presente ou expresso pelo organismo ou tecido receptor e que codifica um polipeptídeo cuja expressão se manifesta por alguma propriedade facilmente detectável, por exemplo, atividade enzimática. A expressão do gene repórter é analisada em um momento adequado após a introdução do DNA nas células receptoras. Os genes repórter adequados podem incluir genes que codificam luciferase, beta-galactosidase, cloranfenicol acetil transferase, fosfatase alcalina secretada ou o gene da proteína fluorescente verde (por exemplo, Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). Os sistemas de expressão adequados são bem conhecidos e podem ser preparados utilizando técnicas conhecidas ou obtidas comercialmente. Em geral, o construto com a região de flanqueamento mínima de 5' mostrando o nível mais alto de expressão do gene repórter é identificado como o promotor. Tais regiões promotoras podem ser ligadas a um gene repórter e usadas para avaliar agentes quanto à capacidade de modular a transcrição orientada a promotores.

[461] Os métodos de introdução e expressão de genes em uma célula são conhecidos na técnica. No contexto de um vetor de expressão, o vetor pode ser facilmente introduzido em uma célula hospedeira, por exemplo, célula de mamífero, bactéria, levedura ou inseto por qualquer método na técnica.

Por exemplo, o vetor de expressão pode ser transferido para uma célula hospedeira por meios físicos, químicos ou biológicos.

[462] Os métodos físicos para a introdução de um polinucleotídeo em uma célula hospedeira incluem precipitação com fosfato de cálcio, lipofecção, bombardeio de partículas, microinjeção, eletroporação e semelhantes. Os métodos para produzir células compreendendo vetores e/ou ácidos nucleicos exógenos são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 2001). Por exemplo, um polinucleotídeo pode ser introduzido em uma célula hospedeira por transfecção com fosfato de cálcio.

Alternativamente, uma célula hospedeira pode ser transfectada com um polinucleotídeo tal como RNA por eletroporação (ver, por exemplo, WO 2007/065957).

[463] Os meios químicos para introduzir um polinucleotídeo em uma célula hospedeira incluem sistemas de dispersão coloidal, como complexos de macromoléculas, nanocápsulas, microgrânulos, grânulos e sistemas à base de lipídeos, incluindo emulsões de óleo em água, micelas, micelas mistas e lipossomas. Um sistema coloidal exemplar para uso como veículo de entrega in vitro e in vivo é um lipossomo (por exemplo, uma vesícula de membrana artificial). Estão disponíveis outros métodos de liberação direcionada de ácidos nucleicos de última geração, como liberação de polinucleotídeos com nanopartículas direcionadas ou outro sistema de liberação de tamanho submícron adequado.

[464] No caso em que é usado um sistema de liberação não viral, um veículo de liberação exemplar é um lipossoma.

A utilização de formulações lipídicas é contemplada para a introdução dos ácidos nucleicos em uma célula hospedeira (in vitro, ex vivo ou in vivo). Em outro aspecto, o ácido nucleico pode estar associado a um lipídeo. O ácido nucleico associado a um lipídeo pode ser encapsulado no interior aquoso de um lipossomo, intercalado na bicamada lipídica de um lipossomo, ligado a um lipossomo por meio de uma molécula de ligação que está associada ao lipossomo e ao oligonucleotídeo, preso em um lipossomo, complexado com um lipossomo, disperso em uma solução contendo um lipídeo, misturado com um lipídeo, combinado com um lipídeo, contido como uma suspensão em um lipídeo, contido ou complexado com uma micela ou associado a um lipídeo. As composições associadas a lipídeos, lipídeos/DNA ou lipídeos/vetor de expressão não estão limitadas a qualquer estrutura particular em solução. Por exemplo, eles podem estar presentes em uma estrutura de duas camadas, como micelas, ou com uma estrutura “colapsada”. Eles também podem simplesmente ser intercalados em uma solução, possivelmente formando agregados que não são uniformes em tamanho ou forma.

Os lipídeos são substâncias gordurosas que podem ser lipídeos naturais ou sintéticos. Por exemplo, lipídeos incluem as gotículas gordurosas que ocorrem naturalmente no citoplasma, bem como a classe de compostos que contêm hidrocarbonetos alifáticos de cadeia longa e seus derivados, como ácidos graxos, álcoois, aminas, aminoálcoois e aldeídos.

[465] Os lipídeos adequados para uso podem ser obtidos de fontes comerciais. Por exemplo, dimiristil fosfatidilcolina (“DMPC”) pode ser obtida em Sigma, St.

Louis, Mo.; dicetil fosfato (“DCP”) pode ser obtido na K&K Laboratories (Plainview, NY); colesterol (“Choi”) pode ser obtido em Calbiochem-Behring; dimiristil fosfatidilglicerol (“DMPG”) e outros lipídeos podem ser obtidos na Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, Ala.). As soluções de estoque de lipídeos em clorofórmio ou clorofórmio/metanol podem ser armazenadas a cerca de -20ºC. O clorofórmio é usado como o único solvente, uma vez que é mais facilmente evaporado que o metanol. “Lipossoma” é um termo genérico que abrange uma variedade de veículos lipídicos únicos e multilamelares formados pela geração de bicamadas ou agregados lipídicos fechados. Os lipossomas podem ser caracterizados como tendo estruturas vesiculares com uma membrana de bicamada fosfolipídica e um meio aquoso interno. Os lipossomas multilamelares têm múltiplas camadas lipídicas separadas por meio aquoso. Eles se formam espontaneamente quando os fosfolipídeos são suspensos em excesso de solução aquosa. Os componentes lipídicos sofrem auto-rearranjo antes da formação de estruturas fechadas e retêm água e solutos dissolvidos entre as bicamadas lipídicas (Ghosh et al., 1991). No entanto, também são abrangidas composições que possuem estruturas em solução diferentes da estrutura vesicular normal. Por exemplo, os lipídeos podem assumir uma estrutura micelar ou simplesmente existir como agregados não uniformes de moléculas lipídicas. Também são contemplados os complexos ácidos lipofectamina-nucleicos.

[466] Independentemente do método usado para introduzir ácidos nucleicos exógenos em uma célula hospedeira, a fim de confirmar a presença da sequência de DNA recombinante na célula hospedeira, uma variedade de ensaios pode ser realizada. Tais ensaios incluem, por exemplo, ensaios de “biologia molecular” bem conhecidos dos técnicos especialistas no assunto, tais como Southern e Northern blotting, RT-PCR e PCR; Ensaios “bioquímicos”, tais como detectar a presença ou ausência de um peptídeo específico, por exemplo, por meios imunológicos (ELISA e Western blots) ou por ensaios aqui descritos para identificar agentes que se enquadram no escopo da invenção.

VI. CÉLULAS IMUNOLÓGICAS MODIFICADAS POR CAR

[467] Os ácidos nucleicos que codificam o CAR da invenção podem ser introduzidos nas células imunológicas para gerar células imunológicas modificadas por CAR que expressam CARs da presente invenção, as quais células imunológicas modificadas encontram uso como aqui divulgado.

As células imunológicas modificadas por CAR também podem ser aqui referidas como “células imunológicas modificadas por CAR”. Em uma modalidade, é fornecida uma célula imunológica modificada compreendendo um CAR como descrito em outro lugar aqui. Em outra modalidade, é fornecida uma célula imunológica compreendendo um vetor de expressão como descrito em outro lugar aqui. A célula imunológica pode ser qualquer célula imunológica adequada para uso em terapia celular. Em uma modalidade, a célula imunológica pode ser uma célula imunológica humana.

[468] Em uma modalidade, a célula imunológica é selecionada do grupo que consiste em um linfócito, uma célula derivada de mieloide e qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o linfócito é selecionado do grupo que consiste em uma célula T, uma célula B, uma célula natural killer (NK) e qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula T. Em uma modalidade, a célula T é selecionada do grupo que consiste em uma célula T CD4+, uma célula T CD8+, uma célula T γδ, uma célula T dupla negativa (DN) e qualquer combinação das mesmas. Em uma modalidade, a célula T CD4+ é selecionada do grupo que consiste em uma célula T auxiliar, uma célula T reguladora e qualquer combinação das mesmas. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula T reguladora.

Em uma modalidade, a Treg é uma Treg derivada do timo ou uma Treg adaptável ou induzida. Em uma modalidade, a Treg CD4+ é uma células T reguladora CD4+FOXP3+ ou uma célula T reguladora CD4+FOXP3- (célula TR1). Em uma modalidade, a Treg é uma célula T reguladora CD4+FOXP3+. Em uma modalidade, a Treg é uma célula T reguladora CD4+FOXP3- (célula TR1). Em uma modalidade, a célula T CD8+ é uma célula T CD8+ citotóxica ou uma célula T reguladora CD8+. Em uma modalidade, a célula T CD8+ é uma célula T reguladora CD8+. Em uma modalidade, a células T reguladora CD8+ é selecionada a partir do grupo que consiste de uma célula T reguladora CD8+CD28-, célula T reguladora CD8+CD103+, célula T reguladora CD8+FoxP3+, célula T reguladora CD8+CD122+ e qualquer combinação das mesmas. Em uma modalidade, a célula T reguladora CD8+ é uma célula T reguladora INFγ+IL10+IL34+CD8+CD45RClow. Em uma modalidade, a célula T γδ é uma célula T reguladora γδ. Em uma modalidade, a célula T DN é uma célula T reguladora DN. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula B. Em uma modalidade, a célula B é uma célula B reguladora. Em uma modalidade, a célula B reguladora é uma célula B CD19+CD24hiCD38hi. Em uma modalidade, a célula NK é uma célula NK reguladora. Em uma modalidade, a célula derivada do mieloide é selecionada do grupo que consiste em um neutrófilo, um eosinófilo, um basófilo, um monócito, um macrófago, uma célula dendrítica ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o macrófago é um macrófago regulador. Em uma modalidade, a célula dendrítica é uma célula dendrítica reguladora.

[469] Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula imunológica reguladora. A célula imunológica pode ser qualquer célula imunológica reguladora adequada para uso em terapia celular (ver, por exemplo, Wood, K.J. et al.,

2012; Papp, G. et al., 2017). Em uma modalidade, a célula imunológica reguladora pode ser uma célula imunológica reguladora humana.

Em uma modalidade, a célula imunológica reguladora é selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula T reguladora, uma célula T reguladora CD4+, uma célula T reguladora CD8+, uma célula T reguladora γδ, uma célula T reguladora DN, uma célula T reguladora DN, uma célula B reguladora, uma célula NK reguladora, um macrófago regulador, uma célula dendrítica reguladora e qualquer combinação dos mesmos.

Em uma modalidade, a célula imunológica reguladora é uma célula T reguladora CD8+ (ver,

por exemplo, Guillonneau, C. et al., 2010). Em uma modalidade, a célula T reguladora CD8+ é selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula T reguladora CD8+CD28-,

uma célula T reguladora CD8+CD103+, uma célula T reguladora

CD8+FoxP3+, uma célula T reguladora CD8+CD122 e qualquer combinação das mesmas.

Em uma modalidade, a célula T reguladora CD8+ é uma célula T reguladora INFγ+IL10+IL34+CD8+

CD45RClow.

Em uma modalidade, a célula imunológica reguladora é uma célula T γδ reguladora (ver, por exemplo, Wesch, D.,

et al., 2014). Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula T DN reguladora (ver, por exemplo, Juvet, S.C., et al., 2012). Em uma modalidade, a célula imunológica reguladora é uma célula B reguladora (ver, por exemplo, Chong, A.S., et al., 2017). Em uma modalidade, a célula B reguladora é uma célula B CD19+CD24hiCD38hi. Em uma modalidade, a célula imunológica reguladora é uma célula NK reguladora (ver, por exemplo, Fu, B. et al., 2013; Crome, S.Q., et al., 2013; Crome, S.Q., et al., 2017). Em uma modalidade, a célula imunológica reguladora é um macrófago regulador (ver, por exemplo, Hutchinson, J.A., et al., 2017).

Em uma modalidade, a célula imunológica reguladora é uma célula dendrítica reguladora. Em uma modalidade, a célula imunológica reguladora é uma célula T reguladora. Em uma modalidade, a Treg é uma Treg derivada do timo ou uma Treg adaptável ou induzida. Em uma modalidade, a Treg é uma célula T reguladora CD4+FOXP3+ ou uma célula T reguladora CD4+FOXP3- (célula TR1). Em uma modalidade, a Treg é uma célula T reguladora CD4+FOXP3+. Em uma modalidade, a Treg é uma célula T reguladora CD4+FOXP3- (célula TR1).

[470] Em uma modalidade, a célula imunológica reguladora tem o seguinte fenótipo: CD4+CD25+, como, por exemplo, CD4+CD25+CD127-, como, por exemplo, CD4+CD25+CD127- CD45RA+. Em outras modalidades, a célula imunológica reguladora tem o seguinte fenótipo: FoxP3+CD4+CD25+, como, por exemplo, FoxP3+CD4+CD25+CD127-, como, por exemplo, FoxP3+ CD4+CD25+CD127-CD45RA+.

[471] Em uma modalidade, a célula imunológica reguladora apresenta pelo menos um dos seguintes fenótipos: CD4+CD25+, FoxP3+, CD127 lo/-, CTLA-4+, CD39+, Helios+, CD62L+/hi, VLA4+, LFA1+, CD49bint, ITGb7int, PSGL-1+, ICOS+, GITR+, PD-1int, Perflo/-, CCR7+. Em uma modalidade, a célula imunológica reguladora não expressa a Granzima A e/ou Granzima B.

[472] Em uma modalidade, a determinação do nível de expressão das moléculas é conduzida por citometria de fluxo, imunofluorescência ou análise de imagem, por exemplo, análise de alto conteúdo. De preferência, a determinação do nível de expressão das moléculas é realizada por citometria de fluxo. Em uma modalidade, antes de realizar a análise por citometria de fluxo, as células são fixadas e permeabilizadas, permitindo assim a detecção de proteínas intracelulares.

[473] Em uma modalidade, a determinação do nível de expressão de uma molécula em uma população de células compreende determinar o percentual de células da população de células que expressam a molécula (isto é, células “+” para a molécula). Preferencialmente, o referido percentual de células que expressam a molécula é medido por FACS.

[474] Os termos “expressando (ou +)” e “não expressando (ou -)” são bem conhecidos na técnica e se referem ao nível de expressão do marcador celular de interesse, em que o nível de expressão do marcador celular correspondente a “+” é alto ou intermediário, também conhecido como “+/-”, e o nível de expressão do marcador de célula correspondente a “-” é nulo.

[475] O termo “baixo” ou “lo” ou “lo/-” é bem conhecido na técnica e se refere ao nível de expressão do marcador celular de interesse, em que o nível de expressão do marcador celular é baixo em comparação com o nível de expressão desse marcador celular na população de células analisadas como um todo. Mais particularmente, o termo “lo” se refere a uma população distinta de células que expressam o marcador celular em um nível mais baixo do que uma ou mais populações distintas de células.

[476] O termo “alto” ou “hi” ou “bright” é bem conhecido na técnica e se refere ao nível de expressão do marcador celular de interesse, em que o nível de expressão do marcador celular é alto em comparação com o nível de expressão desse marcador celular na população de células sendo analisadas como um todo.

[477] Geralmente, as células no topo 2, 3, 4 ou 5% da intensidade de coloração são designadas como “hi”, com as que estão na metade superior da população categorizadas como “+”. As células que caem abaixo de 50%, de intensidade de fluorescência, são designadas como células “lo” e abaixo de 5% como células “-”.

[478] O nível de expressão do marcador celular de interesse é determinado pela comparação da Intensidade Mediana de Fluorescência (MFI) das células da população de células coradas com anticorpo marcado com fluorescência específico para esse marcador com a intensidade de fluorescência (FI) das células da mesma célula população corada com anticorpo marcado com fluorescência com uma especificidade irrelevante, mas com o mesmo isotipo, a mesma sonda fluorescente e originária da mesma espécie (denominada controle de isotipo). As células da população corada com anticorpo marcado com fluorescência específico para este marcador e que mostram MFI equivalente ou uma MFI menor do que as células coradas com os controles de isotipo não estão expressando esse marcador e, em seguida, são designadas (-) ou negativas. As células da população corada com anticorpo marcado com fluorescência específico para este marcador e que mostram um valor de MFI superior às células coradas com os controles de isotipo estão expressando esse marcador e depois são designadas (+) ou positivas.

[479] Em uma modalidade, a célula imunológica da invenção expressa em sua superfície celular um CAR da invenção e outro receptor (aqui referido como “segundo receptor”), que se liga a outro ligante que o HLA-A2. De acordo com a invenção, este segundo receptor compreende um domínio de ligação ao ligante extracelular, opcionalmente uma dobradiça, opcionalmente um domínio transmembranar e um domínio de sinalização intracelular, como descrito anteriormente.

[480] Em uma modalidade, o segundo receptor é endógeno (como, por exemplo, o TCR endógeno). Em outra modalidade, o segundo receptor é exógeno e sua expressão é induzida na célula imunológica da invenção por transformação ou transdução de um ácido nucleico que o codifica. O referido receptor exógeno pode ser um TCR exógeno ou um receptor de antígeno quimérico. Portanto, em uma modalidade, a célula imunológica da invenção expressa dois receptores quiméricos de antígeno, em que o primeiro reconhece o HLA-A2 e o segundo reconhece um ligante distinto.

[481] Em outra modalidade, a célula imunológica da invenção expressa em sua superfície celular um CAR da invenção e outro receptor (aqui referido como “segundo receptor”), que se liga a outro epítopo no HLA-A2. De acordo com a invenção, este segundo receptor compreende um domínio de ligação ao ligante extracelular, opcionalmente uma dobradiça, opcionalmente um domínio transmembranar e um domínio de sinalização intracelular, como descrito anteriormente.

[482] Em outra modalidade, a célula imunológica da invenção expressa dois CARs, em que o primeiro reconhece um primeiro epítopo do HLA-A2 e o segundo reconhece um epítopo distinto no HLA-A2.

[483] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um primeiro domínio de sinalização intracelular e o segundo receptor compreende um segundo domínio de sinalização intracelular distinto. Em uma primeira modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de sinalização primário de célula T (como, por exemplo, CD3zeta) e o segundo receptor compreende um domínio de sinalização co-estimulador (como, por exemplo, 4-1BB, CD28 ou uma combinação do domínio de sinalização co-estimulador de 4-1BB e CD28). Em uma segunda modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de sinalização co-estimulador (como, por exemplo, 4-1BB, CD28 ou uma combinação de domínio de sinalização co-estimulador de 4-1BB e CD28), e o segundo receptor compreende um domínio de sinalização primário da célula T (como, por exemplo, CD3zeta).

[484] Consequentemente, de acordo com essas modalidades, a ativação completa da célula imunológica da invenção requer tanto a ligação do CAR da invenção ao HLA- A2, quanto a ligação do segundo receptor ao ligante ao qual está direcionado.

[485] Em uma modalidade, o ligante reconhecido pelo segundo receptor é expresso ou presente em um tecido ou órgão doente ou em um local de uma resposta autoimune.

[486] Exemplos de ligantes que podem ser reconhecidos pelo segundo receptor incluem, mas não estão limitados a antígenos alimentares da dieta humana comum, auto-antígenos, alérgenos inalados, alérgenos ingeridos ou alérgenos de contato.

[487] O termo “antígeno alimentar da dieta humana comum” se refere a um peptídeo imunogênico, proveniente de alimentos comuns para humanos, como antígenos alimentares da seguinte lista não limitativa: antígenos bovinos, como lipocalina, S100 de ligação ao Ca, alfa-lactalbumina, lactoglobulinas tais como beta-lactoglobulina, albumina de soro bovino, caseínas. Os antígenos alimentares também podem ser antígenos do salmão do atlântico, como a parvalbumina; antígenos de galinha, tais como, por exemplo, ovomucoide, ovalbumina, Ag22, conalbumina, lisozima ou albumina de soro de galinha; antígenos de amendoim; antígenos de camarão como tropomiosina; antígenos de trigo como aglutinina ou gliadina; antígenos de aipo, como profilina de aipo; antígenos de cenoura, tais como profilina de cenoura; antígenos de maçã como taumatina, proteína de transferência de lipídeos de maçã ou profilina de maçã; antígenos de pera como profilina de pera ou isoflavona redutase; antígenos de abacate como endocitinase; antígenos de damasco, tais como proteína de transferência de lipídeos de damasco; antígenos de pêssego, tais como proteína de transferência de lipídeos de pêssego ou profilina de pêssego; antígenos de soja, tais como HPS, profilina de soja ou (SAM22) PR-I0 prot; fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[488] Em uma modalidade, o referido auto-antígeno é um antígeno associado à esclerose múltipla, um antígeno associado à articulação, um antígeno associado aos olhos, um antígeno HSP humano, um antígeno associado à pele ou um antígeno envolvido na rejeição do enxerto ou GVHD.

[489] O termo “antígeno associado à esclerose múltipla” se refere à proteína básica de mielina (MBP). A glicoproteína associada à mielina (MAG), glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG), proteína proteolipídica (PLP), oligoproteína de mielina de oligodendrócitos (OMGP), proteína básica de oligodendrócitos associada à mielina (MOBP), proteína de choque térmico específica de oligodendrócitos (OSP/Claudinl, proteínas de choque térmico de oligodendrócitos) proteínas específicas de oligodendrócitos (OSP), NOGO A, glicoproteína Po, proteína de mielina periférica 22 (PMP22), nucleotídeo 2'3'- cíclico 3'-fosfodiesterase (CNPase), fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[490] O termo “antígeno associado à articulação” se refere a peptídeos de filagrina cíclicos e lineares substituídos por citrulina, peptídeos de colágeno tipo II, peptídeos de glicoproteína 39 da cartilagem humana (HCgp39),

HSP, peptídeos nucleares heterogêneos de ribonucleoproteína nuclear (hnRNP) A2, hnRNP B1, hnRNP D, Ro60/52, HSP60, HSP65, HSP70 e HSP90, BiP, queratina, vimentina, fibrinogênio, peptídeos de colágeno tipo I, III, IV e V, anexina V, glicose 6 fosfato isomerase (GPI), acetil-calpastatina, piruvato desidrogenase (PDH), aldolase, topoisomerase I, snRNP, PARP, Scl-70, Scl-100, antígenos fosfolipídicos, incluindo cardiolipina aniônica e fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina com carga neutra e fosfatidilcolina, matriz metaloproteinase, fibrilina, aggreccano, fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[491] O termo “antígeno associado ao olho” se refere ao colágeno tipo II, arrestina retiniana, S-rrestina, proteínas de ligação ao retinoide inter-fotorreceptor (IRBP1), beta-cristalina B1, proteínas da retina, proteínas e fragmentos coroides, variantes e misturas dos mesmos.

[492] O termo “antígeno HSP humano” se refere a HSP60, HSP70, HSP90 humano, fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[493] Exemplos de antígenos associados à pele incluem, mas não estão limitados a, antígenos queratinócitos, um antígeno presente na derme ou epiderme, um antígeno melanócito (como, por exemplo, melanina ou tirosinase), desmogleína (por exemplo, desmogleína 1 ou 3, que também podem ser referidos como Dsg1/3), BP180, BP230,

plectina, integrinas (por exemplo, integrina α4β6), colágenos (por exemplo, colágeno tipo VII), lamininas (por exemplo, laminina 332 ou laminina γ1), plaquinas (por exemplo, envoplaquina, periplaquina ou desmoplaquinas), queratinas (por exemplo, KRT5, KRT8, KRT15, KRT17 e KRT31), proteínas associadas a filamentos de queratina, filagrina, corneodesmosina e elastina.

[494] Em uma modalidade, o ligante é um antígeno envolvido na rejeição do enxerto ou GVHD. Exemplos de tais antígenos incluem, entre outros, o MHC específico para o tecido transplantado ou para o hospedeiro, β2- microglobulina, antígenos do sistema ABO, antígenos do sistema rhesus (em particular antígenos do C, c, E et e e o sistema D) e iso-hemaglutininas. Outros exemplos de antígenos que podem estar envolvidos na rejeição do enxerto ou GVHD incluem, mas não estão limitados a HLA-DR (em particular durante os primeiros seis meses após o enxerto), HLA-B (em particular durante os primeiros dois anos após o enxerto), antígenos menores de histocompatibilidade (miHA, por exemplo, HLA-E, HLA-F e HLA-G), HLAs correspondentes ao MHC de classe I (B e C), HLAs correspondentes ao MHC de classe II (DP, DM, DOA, DOB, DQ e DR) e HLAs correspondentes ao MHC de classe III (por exemplo, componentes do sistema de complemento).

[495] Outros exemplos de auto-antígenos incluem,

sem limitação, canais de água de aquaporina (como, por exemplo, canal de água de aquaporina-4 (AQP4)), Hu, Ma2,

proteína mediadora de resposta à colapsina 5 (CRMP5) e anfifisina, potássio dependente de canal de voltagem (VGKC),

receptor de N-metil-d-aspartato (NMDAR), ácido α-amino-3-

hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropriônico (AMPAR), peroxidase da tireoide, tireoglobulina, receptor de anti-N-metil-D-

aspartato (subunidade NR1), antígenos do grupo sanguíneo Rh,

antígeno I, desmogleína 1 ou 3 (Dsg1/3), BP180, BP230,

receptores pós-sinápticos nicotínicos de acetilcolina,

receptores de tirotropina, integrina de plaquetas,

GpIIb:IIIa, colágeno (como, por exemplo, exemplo: cadeia alfa-3 do colágeno (IV)), fator reumatoide, calpastatina,

proteínas citrulinadas, proteína básica de mielina (MBP),

peptídeos de glicoproteína oligodendrócita da mielina (MOG),

alfa-beta-cristalina, DNA, histona, ribossomos, RNP, tecido transglutaminase (TG2), fator intrínseco, antígeno de 65 kDa, fosfatidilserina, fosfoproteínas ribossômicas,

anticorpo citoplasmático anti-neutrófilo, Scl-70, U1-RNP,

ANA, SSA, anti-SSB, anticorpos antinucleares (ANA),

anticorpos antinutrofílicos do citoplasma (ANCA), Jo-1,

anticorpos antimitocondriais, gp210, p62, sp100, anticorpos antifosfolipídeos, U1-70 kd snRNP, gangliosídeo GQ1b, GM1,

asialo GM1, GD1b, anticorpos anti-músculo liso (ASMA),

anticorpos anti-microssomo 1 de rim e fígado (ALKM-1), anticorpo anti- citosol de fígado 1 (ALC-1), anticorpos antiendomisial de IgA, proteínas de grânulos de neutrófilos, antígeno estreptocócico da parede celular, fator intrínseco das células parietais gástricas, insulina (IAA), descarboxilase do ácido glutâmico (GAA ou GAD) e proteína tirosina fosfatase (como, por exemplo, IA2 ou ICA512), PLA2R1 e THSD7A1.

[496] Em uma modalidade, o referido ligante é selecionado do grupo que compreende ovalbumina, MOG, fragmentos de colágeno do tipo II, variantes e misturas dos mesmos.

[497] Em uma modalidade, o referido ligante é ovalbumina, fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[498] Em outra modalidade, o referido ligante é MOG, fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[499] Em outra modalidade, o referido ligante é colágeno do tipo II, fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[500] Em outra modalidade, o referido ligante é IL23R, fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[501] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende ainda um domínio de ligação ao ligante extracelular que reconhece um ligante distinto do HLA-A2. Em uma modalidade, o referido domínio de ligação ao ligante é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[502] Em uma modalidade, o domínio de ligação ao ligante de CAR da invenção é um anticorpo multifuncional que reconhece múltiplos epítopos distintos no HLA-A2. Em uma modalidade, o domínio de ligação ao ligante de CAR da invenção é um anticorpo bifuncional que reconhece dois epítopos distintos no HLA-A2.

[503] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação ao ligante extracelular compreendendo um domínio de ligação ao HLA-A2 e outro domínio de ligação ao ligante que reconhece um ligante distinto do HLA-A2. Em uma modalidade, o referido domínio de ligação ao ligante é um anticorpo bifuncional que reconhece o HLA-A2 e o ligante distinto.

[504] Exemplos de ligantes distintos do HLA-A2 que podem ser reconhecidos pelo CAR da invenção estão listados acima.

[505] Em uma modalidade, as células imunológicas modificadas por CAR da invenção podem ser geradas através da introdução de um vetor lentiviral compreendendo um CAR desejado nas células. Em uma modalidade, é fornecido um método para fabricar uma célula imunológica modificada para expressar um CAR, em que o método compreende a transdução de uma célula imunológica com um vetor como descrito em outro lugar aqui, gerando assim a referida célula imunológica modificada.

[506] Em uma modalidade, as células imunológicas geneticamente modificadas da invenção são modificadas através da introdução de RNA. Em uma modalidade, um RNA CAR transcrito in vitro pode ser introduzido em uma célula como uma forma de transfecção transitória. O RNA pode ser produzido por transcrição in vitro usando um modelo gerado por reação em cadeia da polimerase (PCR). O DNA de interesse de qualquer fonte pode ser convertido diretamente por PCR em um modelo para a síntese de mRNA in vitro usando iniciadores apropriados e polimerase de RNA. A fonte do DNA pode ser, por exemplo, DNA genômico, DNA plasmídico, DNA fágico, cDNA, sequência de DNA sintético ou qualquer outra fonte apropriada de DNA. O modelo desejado para transcrição in vitro é o CAR da presente invenção.

[507] Em uma modalidade, o DNA a ser usado para PCR contém uma região de leitura aberta. O DNA pode ser de uma sequência de DNA que ocorre naturalmente a partir do genoma de um organismo. Em uma modalidade, o DNA é um gene de interesse completo ou uma porção de um gene. O gene pode incluir algumas ou todas as regiões não traduzidas 5' e/ou 3' (UTRs). O gene pode incluir éxons e íntrons. Em uma modalidade, o DNA a ser usado para PCR é um gene humano. Em outra modalidade, o DNA a ser usado para PCR é um gene humano incluindo as UTRs 5' e 3'. O DNA pode, alternativamente, ser uma sequência artificial de DNA que normalmente não é expressa em um organismo que ocorre naturalmente. Uma sequência de DNA artificial exemplar é aquela que contém partes de genes que são ligadas entre si para formar uma região de leitura aberta que codifica uma proteína de fusão.

As frações de DNA que estão ligadas podem ser de um único organismo ou de mais de um organismo.

[508] A PCR pode ser usada para gerar um modelo para a transcrição in vitro de mRNA que é usado para transfecção.

Métodos para realizar a PCR são bem conhecidos na técnica.

Os iniciadores para uso na PCR são projetados para ter regiões substancialmente complementares às regiões do DNA a serem usadas como modelo para a PCR. “Substancialmente complementar”, como aqui usado, se refere às sequências de nucleotídeos em que a maioria ou todas as bases na sequência de iniciadores são complementares, ou uma ou mais bases são não complementares ou incompatíveis. Sequências substancialmente complementares são capazes de emparelhar ou hibridizar com o alvo de DNA pretendido sob condições de emparelhamento usadas para PCR. Os iniciadores podem ser projetados para serem substancialmente complementares a qualquer porção do molde de DNA. Por exemplo, os iniciadores podem ser projetados para amplificar a porção de um gene que é normalmente transcrito nas células (a região de leitura aberta), incluindo UTRs 5' e 3'. Os iniciadores também podem ser projetados para amplificar uma porção de um gene que codifica um domínio de interesse particular. Em uma modalidade, os iniciadores são projetados para amplificar a região de codificação de um cDNA humano, incluindo todas ou frações das UTRs 5' e 3'. Os iniciadores úteis para PCR são gerados por métodos sintéticos que são bem conhecidos na técnica.

[509] “Iniciadores diretos” são iniciadores que contêm uma região de nucleotídeos que são substancialmente complementares aos nucleotídeos no modelo de DNA que estão a montante da sequência de DNA que deve ser amplificada. “A montante” é aqui usado para se referir a uma localização 5' à sequência de DNA a ser amplificada em relação à cadeia de codificação. “Iniciadores reversos” são iniciadores que contêm uma região de nucleotídeos que são substancialmente complementares a um modelo de DNA de fita dupla que estão a jusante da sequência de DNA que deve ser amplificada. “A jusante” é aqui usado para se referir a um local 3' para a sequência de DNA a ser amplificada em relação à cadeia de codificação.

[510] Qualquer DNA polimerase útil para PCR pode ser utilizada nos métodos aqui divulgados. Os reagentes e a polimerase estão comercialmente disponíveis em várias fontes.

[511] Estruturas químicas com a capacidade de promover estabilidade e/ou eficiência de tradução também podem ser usadas. O RNA possui preferencialmente UTRs 5' e 3'. Em uma modalidade, a UTR 5’ tem entre zero e 3000 nucleotídeos de comprimento. O comprimento das sequências UTR 5’ e 3' a serem adicionadas à região de codificação pode ser alterado por métodos diferentes, incluindo, mas não limitado a projetar iniciadores para PCR que emparelham com diferentes regiões das UTRs. Utilizando esta abordagem, um técnico especialista no assunto pode modificar os comprimentos de UTR 5’ e 3' necessários para alcançar a eficiência ideal de tradução após a transfecção do RNA transcrito. As UTRs 5’ e 3' podem ser as UTRs 5’ e 3' endógenas de ocorrência natural para o gene de interesse.

Alternativamente, as sequências de UTR que não são endógenas ao gene de interesse podem ser adicionadas incorporando as sequências de UTR nos iniciadores direto e reverso ou por quaisquer outras modificações do modelo. O uso de sequências UTR que não são endógenas ao gene de interesse pode ser útil para modificar a estabilidade e/ou a eficiência da tradução do RNA. Por exemplo, sabe-se que elementos ricos em AU em sequências UTR 3' podem diminuir a estabilidade do mRNA.

Portanto, UTRs 3’ podem ser selecionados ou projetados para aumentar a estabilidade do RNA transcrito com base nas propriedades de UTRs que são bem conhecidas na técnica.

[512] Em uma modalidade, a UTR 5’ pode conter a sequência Kozak do gene endógeno. Alternativamente, quando uma UTR 5’ que não é endógena ao gene de interesse está sendo adicionada por PCR como descrito acima, uma sequência de consenso de Kozak pode ser redesenhada adicionando a sequência UTR 5'. As sequências de Kozak podem aumentar a eficiência da tradução de alguns transcritos de RNA, mas não parece ser necessário para todos os RNAs para permitir a tradução eficiente. O requisito para sequências de Kozak para muitos mRNAs é conhecido na técnica. Em outras modalidades, a UTR 5’ pode ser derivada de um vírus de RNA cujo genoma de RNA é estável nas células. Em outras modalidades, vários análogos de nucleotídeo podem ser usados na UTR 3’ ou 5' para impedir a degradação por exonuclease do mRNA.

[513] Para permitir a síntese de RNA a partir de um modelo de DNA sem a necessidade de clonagem de genes, um promotor de transcrição deve ser anexado ao modelo de DNA a montante da sequência a ser transcrita. Quando uma sequência que funciona como um promotor de uma RNA polimerase é adicionada à extremidade 5’ do iniciador direto, o promotor de RNA polimerase é incorporado no produto de PCR a montante da região de leitura aberta que deve ser transcrita. Em uma modalidade preferencial, o promotor é um promotor da polimerase T7, como aqui descrito em outro local. Outros promotores úteis incluem, mas não estão limitados a, promotores de RNA polimerase T3 e SP6. As sequências de nucleotídeos de consenso para os promotores T7, T3 e SP6 são conhecidas na técnica.

[514] Em uma modalidade preferencial, o mRNA tem uma tampa na extremidade 5’ e uma cauda poli(A) 3' que determina a ligação ao ribossoma, o início da tradução e o mRNA de estabilidade na célula. Em um modelo circular de DNA, por exemplo, o DNA plasmídico, a RNA polimerase produz um produto concatemérico longo, que não é adequado para a expressão em células eucarióticas. A transcrição do DNA do plasmídeo linearizado no final da UTR 3’ resulta em mRNA de tamanho normal que não é eficaz na transfecção eucariótica, mesmo que seja poliadenilada após a transcrição.

[515] Em um modelo de DNA linear, a RNA polimerase do fago T7 pode estender a extremidade 3’ do transcrito além da última base do modelo (Schenborn e Mierendorf, Nuc Acids Res., 13: 6223-36 (1985); Nacheva e Berzal-Herranz, EUR. J.

Biochem., 270:1485-65 (2003).

[516] O método convencional de integração de alongamentos de poliA/T em um molde de DNA é a clonagem molecular. No entanto, a sequência poliA/T integrada ao DNA plasmídico pode causar instabilidade plasmática, razão pela qual os modelos de DNA plasmídico obtidos a partir de células bacterianas são frequentemente altamente contaminados por deleções e outras aberrações. Isso torna os procedimentos de clonagem não apenas trabalhosos e demorados, mas muitas vezes não confiáveis. É por isso que um método que permite o construto de modelos de DNA com alongamento de poliA/T3’ sem clonagem é altamente desejável.

[517] O segmento poliA/T do modelo de DNA transcricional pode ser produzido durante a PCR usando um iniciador reverso contendo uma cauda de poliT, como cauda de 100T (o tamanho pode ser de 50-5000 T) ou após a PCR por qualquer outro método, incluindo, mas não limitado a, ligação de DNA ou recombinação in vitro. As caudas de poli(A) também fornecem estabilidade aos RNAs e reduzem sua degradação.

Geralmente, o comprimento de uma cauda de poli(A) correlaciona-se positivamente com a estabilidade do RNA transcrito. Em uma modalidade, a cauda poli(A) está entre 100 e 5000 adenosinas.

[518] As caudas de poli(A) dos RNAs podem ser estendidas ainda mais após a transcrição in vitro com o uso de uma poli(A) polimerase, como a poliA polimerase de E.

coli (E-PAP). Em uma modalidade, aumentar o comprimento de uma cauda de poli(A) de 100 nucleotídeos para entre 300 e 400 nucleotídeos resulta em um aumento de cerca de duas vezes na eficiência de tradução do RNA. Além disso, a ligação de diferentes grupos químicos à extremidade 3’ pode aumentar a estabilidade do mRNA. Essa ligação pode conter nucleotídeos modificados/artificiais, aptâmeros e outros compostos. Por exemplo, os análogos de ATP podem ser incorporados na cauda de poli(A) usando polimerase (A). Os análogos de ATP podem aumentar ainda mais a estabilidade do RNA.

[519] As tampas 5’ nos RNAs também fornecem estabilidade às moléculas de RNA. Em uma modalidade preferencial, os RNAs produzidos pelos métodos aqui divulgados incluem uma tampa 5’. A tampa 5’ é fornecida utilizando técnicas conhecidas na técnica e aqui descritas (Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci. 29: 436-444 (2001); Stepinski et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330: 958-966 (2005)).

[520] Os RNAs produzidos pelos métodos aqui divulgados também podem conter uma sequência do local interno de entrada do ribossomo (IRES). A sequência IRES pode ser qualquer sequência viral, cromossômica ou artificialmente projetada que inicia a ligação do ribossomo independente da tampa ao mRNA e facilita o início da tradução. Podem ser incluídos quaisquer solutos adequados para a eletroporação celular, que podem conter fatores que facilitam a permeabilidade e a viabilidade celular, como açúcares, peptídeos, lipídeos, proteínas, antioxidantes e surfactantes.

[521] O RNA pode ser introduzido nas células alvo usando qualquer um de vários métodos diferentes, por exemplo,

métodos comercialmente disponíveis que incluem, mas não estão limitados a, eletroporação (Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Colônia, Alemanha)), (ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Massachusetts) ou o Gene Pulser II (BioRad, Denver, Colorado), Multiporator (Eppendort, Hamburgo Alemanha), transfecção mediada por lipossomas catiônicos usando lipofecção, encapsulamento de polímeros, transfecção mediada por peptídeos ou sistemas de liberação de partículas biolísticas como “armas genéticas” (ver, por exemplo, Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12 (8): 861-70 (2001).

[522] Em uma modalidade, as sequências CAR são liberadas nas células usando um vetor retroviral ou lentiviral. Os vetores retrovirais e lentivirais que expressam CAR podem ser liberados em diferentes tipos de células eucarióticas, bem como em tecidos e organismos inteiros, usando células transduzidas como transportadoras ou liberação local ou sistêmica livre de células de vetores encapsulados, ligados ou nus. O método usado pode ser para qualquer finalidade em que a expressão estável seja necessária ou suficiente.

[523] Em outra modalidade, as sequências CAR são liberadas nas células usando mRNA transcrito in vitro. O mRNA transcrito in vitro CAR pode ser liberado em diferentes tipos de células eucarióticas, bem como em tecidos e organismos inteiros, usando células transfectadas como transportadoras ou liberação local ou sistêmica livre de células de mRNA encapsulado, ligado ou nu. O método usado pode ser para qualquer finalidade em que a expressão transitória for necessária ou suficiente.

[524] Em outra modalidade, o CAR desejado pode ser expresso nas células por meio de transposons.

[525] Em uma modalidade, a célula imunológica da invenção é uma célula T. Antes da expansão e modificação genética das células T da invenção, é obtida uma fonte de células T de um indivíduo. As células T podem ser obtidas de várias fontes, incluindo células mononucleares do sangue periférico, medula óssea, tecido linfonodal, sangue do cordão umbilical, tecido do timo, tecido de um local de infecção, ascites, derrame pleural, tecido do baço e tumores.

Em certas modalidades da presente invenção, pode ser usado qualquer número de linhas de células T disponíveis na técnica. Em certas modalidades da presente invenção, as células T podem ser obtidas a partir de uma unidade de sangue coletada de um indivíduo usando qualquer número de técnicas conhecidas pelo técnico especialista no assunto, como separação Ficoll™ ou sistema de separação Sepax. Em uma modalidade preferencial, as células do sangue circulante de um indivíduo são obtidas por aférese. O produto de aférese normalmente contém linfócitos, incluindo células T,

monócitos, granulócitos, células B, outros glóbulos brancos nucleados, glóbulos vermelhos e plaquetas. Em uma modalidade, as células coletadas por aférese podem ser lavadas para remover a fração plasmática e colocar as células em um tampão ou meio apropriado para as etapas de processamento subsequentes. Em uma modalidade da invenção, as células são lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em uma modalidade alternativa, a solução de lavagem é desprovida de cálcio e pode não ter magnésio ou pode faltar muitos, se não todos, os cátions bivalentes.

Após a lavagem, as células podem ser ressuspensas em uma variedade de tampões biocompatíveis, como, por exemplo, livre de Ca2+, PBS livre de Mg2+, PlasmaLyte A ou outra solução salina com ou sem tampão. Alternativamente, os componentes indesejáveis da amostra de aférese podem ser removidos e as células ressuspensas diretamente no meio de cultura.

Fontes, Ativação e Expansão de Células T

[526] Em uma modalidade, a célula imunológica pode ser uma célula T. Antes da expansão e modificação genética das células T da invenção, é obtida de um indivíduo uma fonte de células T ou células progenitoras a partir da qual as células T podem ser produzidas. As células T podem ser obtidas de qualquer fonte em que essas células residam, incluindo células mononucleares do sangue periférico, medula óssea, tecido linfonodal, sangue do cordão umbilical, tecido do timo, centros germinais, tecido de um local de infecção,

ascites, derrame pleural, baço, tumores, e órgãos/tecidos transplantados.

Em certas modalidades da presente invenção,

as células T podem ser obtidas a partir de uma unidade de sangue coletada de um indivíduo usando qualquer número de técnicas conhecidas do especialista, como a separação

Ficoll™. Em uma modalidade, as células do sangue circulante de um indivíduo são obtidas por aférese.

O produto de aférese normalmente contém linfócitos, incluindo células T, Tregs,

monócitos, granulócitos, células B, outros glóbulos brancos nucleados, glóbulos vermelhos e plaquetas.

Em uma modalidade, as células coletadas por aférese podem ser lavadas para remover a fração plasmática e colocar as células em um tampão ou meio apropriado para as etapas de processamento subsequentes.

Em uma modalidade da invenção,

as células podem ser lavadas com uma solução de lavagem (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato (PBS)). Como os técnicos especialistas no assunto apreciariam prontamente, uma etapa de lavagem pode ser realizada por métodos conhecidos dos técnicos especialistas no assunto,

como o uso de uma centrífuga semi-automatizada de “fluxo contínuo” (por exemplo, o processador de células Cobe 2991,

o Baxter CytoMate ou o Haemonetics Cell Saver 5) de acordo com as instruções do fabricante.

Após a lavagem, as células podem ser ressuspensas em uma variedade de tampões biocompatíveis, como, por exemplo, PBS livre de Ca2+, livre de Mg2+, PlasmaLyte A ou outra solução salina com ou sem tampão. Alternativamente, os componentes indesejáveis da amostra de aférese podem ser removidos e as células ressuspensas diretamente no meio de cultura.

[527] Em outra modalidade, as células T são isoladas dos linfócitos do sangue periférico, lisando os glóbulos vermelhos e esgotando os monócitos, por exemplo, por centrifugação através de um gradiente PERCOLL™ ou por elutriação centrífuga de contra-fluxo. Uma subpopulação específica de células T, como CD3+, CD25+, CD127neg, HLA-DR+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ e/ou CD45RO+, pode ser ainda mais isolada por técnicas de seleção positivas ou negativas. O técnico especialista no assunto reconheceria que várias rodadas de seleção também podem ser usadas no contexto desta invenção. Em certas modalidades, pode ser desejável executar o procedimento de seleção e usar as células “não selecionadas” no processo de ativação e expansão. As células “não selecionadas” também podem ser submetidas a outras rodadas de seleção.

[528] O enriquecimento de uma população de células T por seleção negativa pode ser realizado com uma combinação de anticorpos direcionados a marcadores de superfície exclusivos das células negativamente selecionadas. Um método é a triagem e/ou seleção de células via imunoaderência magnética negativa ou citometria de fluxo que utiliza um coquetel de anticorpos monoclonais direcionados aos marcadores da superfície celular presentes nas células selecionadas negativamente. Por exemplo, para enriquecer para células CD4+ por seleção negativa, um coquetel de anticorpos monoclonais normalmente inclui anticorpos para CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR e CD8. Em certas modalidades, pode ser desejável enriquecer para ou selecionar positivamente as células T reguladoras que tipicamente expressam CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ e FoxP3+.

[529] Para o isolamento de uma população desejada de células por seleção positiva ou negativa, a concentração de células e superfície (por exemplo, partículas como grânulos) pode variar. Em certas modalidades, pode ser desejável diminuir significativamente o volume no qual grânulos e células são misturados (isto é, aumentar a concentração de células), para garantir o contato máximo de células e grânulos. Por exemplo, em uma modalidade, é usada uma concentração de 2 bilhões de células/ml. Em uma modalidade, é utilizada uma concentração de 1 bilhão de células/ml. Em uma outra modalidade, é usado mais de 100 milhões de células/ml. Em uma modalidade adicional, é utilizada uma concentração de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 milhões de células/ml. Em ainda outra modalidade, é utilizada uma concentração de células de 75,

80, 85, 90, 95 ou 100 milhões de células/ml. Em outras modalidades, podem ser usadas concentrações de 125 ou 150 milhões de células/ml. O uso de altas concentrações pode resultar em aumento do rendimento celular, ativação e expansão celular. Além disso, o uso de altas concentrações de células permite a captura mais eficiente de células que podem expressar fracamente antígenos-alvo de interesse ou de amostras onde existem muitas células tumorais (por exemplo, sangue leucêmico, tecido tumoral etc.). Tais populações de células podem ter valor terapêutico e seria desejável obter.

[530] Em uma modalidade relacionada, pode ser desejável usar concentrações mais baixas de células. Ao diluir significativamente a mistura de células T e superfície (por exemplo, partículas como grânulos), as interações entre as partículas e as células são minimizadas. Isso seleciona células que expressam grandes quantidades de antígenos desejados para serem ligadas às partículas. Por exemplo, as células T CD4+ expressam níveis mais altos de CD28 e são capturadas com mais eficiência do que as células T CD8+ em concentrações diluídas. Em uma modalidade, a concentração de células utilizada é de 5 x 106/ml. Em outras modalidades, a concentração usada pode ser de cerca de 1 x 105/ml a 1 X 106/ml, e qualquer valor inteiro entre eles.

[531] Em outras modalidades, as células podem ser incubadas em um rotador por períodos variados de tempo em velocidades variáveis a 2-10ºC ou em temperatura ambiente.

[532] As células T para estimulação também podem ser congeladas após uma etapa de lavagem. Desejando não ficar limitado pela teoria, a etapa de congelamento e descongelamento subsequente fornece um produto mais uniforme removendo granulócitos e, em certa medida, monócitos na população celular. Após a etapa de lavagem que remove o plasma e as plaquetas, as células podem ser suspensas em uma solução congelante. Embora muitas soluções e parâmetros de congelamento sejam conhecidos na técnica e sejam úteis nesse contexto, um método envolve o uso de PBS contendo 20% de DMSO e 8% de albumina de soro humana ou meios de cultura contendo 10% de Dextran 40 e 5% de Dextrose, 20% Albumina de soro humana e DMSO a 7,5% ou 31,25% de plasma-A, 31,25% de dextrose 5%, 0,45% de NaCl, 10% de Dextrano 40 e 5% de dextrose, 20% de albumina de soro humano e 7,5% de DMSO ou outro meio de congelamento celular adequado contendo, por exemplo, Hespan e PlasmaLyte A, as células são congeladas a -80ºC a uma taxa de 1º por minuto e armazenadas na fase de vapor de um tanque de armazenamento de nitrogênio líquido.

Outros métodos de congelamento controlado podem ser usados, bem como o congelamento não controlado imediatamente a -20ºC ou em nitrogênio líquido.

[533] Em certas modalidades, as células criopreservadas são descongeladas e lavadas como descrito aqui e deixadas em repouso por uma hora em temperatura ambiente antes da ativação usando os métodos da presente invenção.

[534] Também contemplada no contexto da invenção é a coleta de amostras de sangue ou produto de aférese de um indivíduo em um período de tempo anterior ao momento em que as células expandidas, conforme descrito aqui, podem ser necessárias. Como tal, a fonte das células a serem expandidas pode ser coletada a qualquer momento necessário, e as células desejadas, como células T, isoladas e congeladas para uso posterior na terapia de células T para qualquer número de doenças ou condições que se beneficiariam de terapia de células T, como as aqui descritas. Em certas modalidades, uma amostra de sangue ou uma aférese é retirada de um indivíduo que corre o risco de desenvolver uma doença, mas que ainda não desenvolveu uma doença, e as células de interesse são isoladas e congeladas para uso posterior. Em certas modalidades, as células T podem ser expandidas, congeladas e usadas posteriormente. Em certas modalidades, as amostras são coletadas de um indivíduo logo após o diagnóstico de uma doença específica, como descrito aqui, mas antes de qualquer tratamento. Em uma modalidade adicional, as células são isoladas de uma amostra de sangue ou de uma aférese de um indivíduo antes de qualquer número de modalidades de tratamento relevantes, incluindo mas não se limitando ao tratamento com agentes como natalizumabe,

efalizumabe, agentes antivirais, quimioterapia, radiação,

agentes imunossupressores, como ciclosporina, azatioprina,

metotrexato, micofenolato e FK506, anticorpos ou outros agentes imunoablativos como CAMPATH, anticorpos anti-CD3,

citoxano, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina,

ácido micofenólico, esteroides, FR901228. Esses fármacos inibem a fosfatase calcineurina dependente de cálcio

(ciclosporina e FK506) ou inibem a p70S6 quinase que é importante para a sinalização induzida por fator de crescimento (rapamicina) (Liu et al., Cell 66: 807-815, 1991;

Henderson et al., Immun 73: 316-321, 1991; Bierer et al.,

Curr.

Opin.

Immun 5:763-773, 1993). Em uma modalidade adicional, as células são isoladas para um paciente e congeladas para uso posterior em conjunto com (por exemplo,

antes, simultaneamente ou após) transplante de medula óssea ou de células-tronco, terapia ablativa de células T usando agentes quimioterápicos, como fludarabina, radioterapia externa por feixe de luz (XRT), ciclofosfamida ou anticorpos como OKT3 ou CAMPATH.

Em outra modalidade, as células são isoladas antes e podem ser congeladas para uso posterior para tratamento após terapia ablativa de células B, como agentes que reagem com CD20, por exemplo, Rituxan.

[535] Em uma outra modalidade da presente invenção, as células T são obtidas de um paciente diretamente após o tratamento. Nesse sentido, observou-se que, após certos tratamentos imunossupressores, em particular tratamentos com medicamentos que danificam o sistema imunológico, logo após o tratamento durante o período em que os pacientes normalmente se recuperariam do tratamento, a qualidade das células T obtidas pode ser ideal ou melhorada por sua capacidade de expandir ex vivo. Da mesma forma, após manipulação ex vivo usando os métodos aqui descritos, essas células podem estar em um estado preferencial para enxerto aprimorado e expansão in vivo. Assim, é contemplado dentro do contexto da presente invenção coletar células imunológicas durante esta fase de recuperação. Além disso, em certas modalidades, esquemas de mobilização (por exemplo, mobilização com GM-CSF) e regimes de condicionamento podem ser usados para criar uma condição em um indivíduo em que o repovoamento, recirculação, regeneração e/ou expansão de tipos celulares específicos são favorecidos, especialmente durante uma janela de tempo definida após a terapia.

[536] Seja antes ou depois da modificação genética das células T para expressar um CAR desejável, as células T podem ser ativadas e expandidas geralmente usando métodos como descrito, por exemplo, nas Pat. U.S. 6.352.694;

6.534,055; 6.905.680; 6.692.964; 5.858.358; 6.887.466;

6.905.681; 7.144.575; 7,067.318; 7.172.869; 7.232.566;

7.175.843; 5.883.223; 6.905.874; 6.797.514; 6.867,041; e Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 20060121005.

[537] Geralmente, as células T da invenção são expandidas por contato com uma superfície a ela ligada, um agente que estimula um sinal associado ao complexo CD3/TCR e um ligante que estimula uma molécula co-estimuladora na superfície das células T. Em particular, as populações de células T podem ser estimuladas conforme descrito aqui, como por contato com um anticorpo anti-CD3, ou um fragmento de ligação a antígeno, ou um anticorpo anti-CD2 imobilizado em uma superfície ou por contato com uma proteína quinase C ativador (por exemplo, briostatina) em conjunto com um ionóforo de cálcio. Para co-estimulação de uma molécula acessória na superfície das células T, é usado um ligante que se liga à molécula acessória. Por exemplo, uma população de células T pode ser contatada com um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD28, sob condições apropriadas para estimular a proliferação das células T. Para estimular a proliferação de células T CD4+, um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD28. Exemplos de um anticorpo anti-CD28 incluem 9,3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besancon, França), assim como outros métodos comumente conhecidos na técnica (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190 (9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999).

[538] Em certas modalidades, o sinal estimulador primário e o sinal coestimulador para a célula T podem ser fornecidos por diferentes protocolos. Por exemplo, os agentes que fornecem cada sinal podem estar em solução ou acoplados a uma superfície. Quando acoplados a uma superfície, os agentes podem ser acoplados à mesma superfície (isto é, na formação “cis”) ou a superfícies separadas (isto é, na formação “trans”). Alternativamente, um agente pode ser acoplado a uma superfície e o outro agente em solução.

Em uma modalidade, o agente que fornece o sinal co- estimulador é ligado a uma superfície celular e o agente que fornece o sinal de ativação primário está em solução ou acoplado a uma superfície. Em certas modalidades, ambos os agentes podem estar em solução. Em outra modalidade, os agentes podem estar na forma solúvel e, em seguida, reticulados a uma superfície, como uma célula que expressa receptores Fc ou um anticorpo ou outro agente de ligação que se ligará aos agentes. A este respeito, ver, por exemplo, as Publicações de Pedido de Patente U.S. Nos. 20040101519 e 20060034810 para células apresentadoras de antígeno artificial (aAPCs) que são contempladas para uso na ativação e expansão de células T na presente invenção.

[539] Em uma modalidade, os dois agentes são imobilizados em grânulos, no mesmo grânulo, ou seja, “cis”,

ou para separar grânulos, ou seja, “trans”. A título de exemplo, o agente que fornece o sinal de ativação primário é um anticorpo anti-CD3 ou um fragmento de ligação ao antígeno e o agente que fornece o sinal coestimulador é um anticorpo anti-CD28 ou um fragmento de ligação a antígeno;

e ambos os agentes são co-imobilizados no mesmo grânulo em quantidades moleculares equivalentes.

Em uma modalidade, é utilizada uma proporção de 1:1 de cada anticorpo ligado aos grânulos para expansão de células T CD4+ e crescimento de células T.

Em certos aspectos da presente invenção, é utilizada uma proporção de anticorpos anti CD3: CD28 ligados aos grânulos, de modo que seja observado um aumento na expansão das células T em comparação com a expansão observada usando uma proporção de 1:1. Em uma modalidade particular,

é observado um aumento de cerca de 1 a cerca de 3 vezes, em comparação com a expansão observada utilizando uma proporção de 1:1. Em uma modalidade, a proporção de anticorpo CD3:CD28 ligado aos grânulos varia de 100:1 a 1:100 e todos os valores inteiros entre eles.

Em um aspecto da presente invenção,

mais anticorpo anti-CD28 está ligado às partículas que anticorpo anti-CD3, isto é, a proporção CD3:CD28 é menor que um.

Em certas modalidades da invenção, a proporção de anticorpo anti-CD28 para anticorpo anti-CD3 ligado aos grânulos é maior que 2:1. Em uma modalidade particular, é utilizada uma proporção de 1:100 CD3: CD28 de anticorpo ligado aos grânulos. Em outra modalidade, é utilizada uma proporção de 1:75 CD3:CD28 de anticorpo ligado aos grânulos.

Em uma modalidade adicional, é usada uma proporção 1:50 CD3:CD28 de anticorpo ligado aos grânulos. Em outra modalidade, é utilizada uma proporção de 1:30 CD3:CD28 de anticorpo ligado aos grânulos. Em uma modalidade preferencial, é utilizada uma proporção 1:10 CD3:CD28 de anticorpo ligado aos grânulos. Em outra modalidade, é utilizada uma proporção de 1:3 CD3:CD28 de anticorpo ligado aos grânulos. Em ainda outra modalidade, é usada uma proporção de 3:1 CD3:CD28 de anticorpo ligado aos grânulos.

[540] Proporções de partículas para células de 1:500 a 500:1 e quaisquer valores inteiros entre estes podem ser usados para estimular células T ou outras células alvo.

Como os técnicos especialistas no assunto podem apreciar rapidamente, a proporção de partículas para células pode depender do tamanho da partícula em relação à célula alvo.

Por exemplo, grânulos de tamanho pequeno podem ligar apenas algumas células, enquanto grânulos maiores podem ligar muitas. Em certas modalidades, a proporção de células para partículas varia de 1:100 a 100:1 e qualquer valor inteiro entre e em outras modalidades a proporção compreende 1: 9 a 9:1 e quaisquer valores inteiros no meio também podem ser usados estimular células T.

A proporção de partículas acopladas a anti-CD3 e anti-CD28 e células T que resultam em estimulação de células T pode variar conforme observado acima.

Por exemplo, esses valores podem incluir 1:100, 1:50,

1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3,

1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10 :1,

15:1 e 1:1 partículas por célula T.

Em uma modalidade, é usada uma proporção de partículas para células de 1:1 ou menos.

Em uma modalidade específica, uma proporção partícula: célula pode ser de 1:5. Em outras modalidades, a proporção de partículas para células pode variar dependendo do dia da estimulação.

Por exemplo, em uma modalidade, a proporção de partículas para células é de 1:1 a 10:1 no primeiro dia e partículas adicionais são adicionadas às células todos os dias ou em dias alternados por até 10 dias,

nas proporções finais de 1:1 a 1:10 (com base na contagem de células no dia da adição). Em uma modalidade particular, a proporção de partículas para células é de 1:1 no primeiro dia de estimulação e ajustada para 1:5 no terceiro e quinto dias de estimulação.

Em outra modalidade, as partículas são adicionadas diariamente ou em dias alternados a uma proporção final de 1:1 no primeiro dia e 1:5 no terceiro e quinto dias de estimulação.

Em outra modalidade, a proporção de partículas para células é de 2:1 no primeiro dia de estimulação e ajustada para 1:10 no terceiro e quinto dias de estimulação. Em outra modalidade, as partículas são adicionadas diariamente ou em dias alternados a uma proporção final de 1:1 no primeiro dia e 1:10 no terceiro e quinto dias de estimulação. Um técnico especialista no assunto compreenderá que uma variedade de outras proporções pode ser adequada para uso na presente invenção. Em particular, as proporções variarão dependendo do tamanho das partículas e do tamanho e tipo de célula.

[541] Em outras modalidades da presente invenção, as células, como células T (por exemplo, células Treg), são combinadas com grânulos revestidas por agentes, os grânulos e as células são subsequentemente separadas e, em seguida, as células são cultivadas. Em uma modalidade alternativa, antes da cultura, os grânulos e células revestidas com agente não são separadas, mas são cultivadas em conjunto. Em uma modalidade adicional, as grânulos e as células são primeiro concentradas pela aplicação de uma força, como uma força magnética, resultando no aumento da ligação dos marcadores da superfície celular, induzindo assim a estimulação celular.

[542] A título de exemplo, as proteínas da superfície celular podem ser ligadas ao permitir grânulos paramagnéticos aos quais estão ligados anti-CD3 e anti-CD28 (3X28 grânulos) para contatar as células T. Em uma modalidade, as células (por exemplo, 104 a 109 células T) e grânulos (por exemplo, grânulos paramagnéticos DYNABEADS® M- 450 CD3/CD28 T na proporção de 1:1) são combinados em um tampão, preferencialmente PBS (sem cátions bivalentes, como cálcio e magnésio). Novamente, aqueles técnicos especialistas no assunto podem apreciar facilmente qualquer concentração celular que possa ser usada.

[543] Por exemplo, a célula alvo pode ser muito rara na amostra e compreender apenas 0,01% da amostra ou a amostra inteira (isto é, 100%) pode compreender a célula alvo de interesse. Por conseguinte, qualquer número de células está dentro do contexto da presente invenção. Em certas modalidades, pode ser desejável diminuir significativamente o volume no qual partículas e células são misturadas (isto é, aumentar a concentração de células), para garantir o contato máximo de células e partículas. Por exemplo, em uma modalidade, é usada uma concentração de cerca de 2 bilhões de células/ml. Em outra modalidade, é usado mais de 100 milhões de células/ml. Em uma modalidade adicional, é utilizada uma concentração de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 milhões de células/ml. Em ainda outra modalidade, é utilizada uma concentração de células de 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 milhões de células/ml. Em outras modalidades, podem ser usadas concentrações de 125 ou 150 milhões de células/ml. O uso de altas concentrações pode resultar em aumento do rendimento celular, ativação e expansão celular. Além disso, o uso de altas concentrações de células permite a captura mais eficiente de células que podem expressar fracamente antígenos alvo de interesse. Tais populações de células podem ter valor terapêutico e seria desejável obter em certas modalidades.

[544] Em uma modalidade da presente invenção, a mistura pode ser cultivada por várias horas (cerca de 3 horas) a cerca de 14 dias ou qualquer valor inteiro por hora no meio. Em outra modalidade, a mistura pode ser cultivada por 21 dias. Em uma modalidade da invenção, os grânulos e as células T são cultivados em conjunto durante cerca de oito dias. Em outra modalidade, os grânulos e as células T são cultivados em conjunto por 2-3 dias. Também podem ser desejados vários ciclos de estimulação, de modo que o tempo de cultura das células T possa ser de 60 dias ou mais. As condições apropriadas para a cultura de células T incluem um meio apropriado (por exemplo, meio essencial mínimo ou meio RPMI 1640 ou, X-vivo 15, (Lonza)) que pode conter fatores necessários para a proliferação e viabilidade, incluindo soro (por exemplo, soro fetal bovino ou humano), interleucina-2 (IL-2), insulina, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ e TNF-α ou qualquer outro outros aditivos para o crescimento de células conhecidas pelos técnicos especialistas no assunto. Outros aditivos para o crescimento de células incluem, mas não estão limitados a,

surfactante, plasmanato e agentes redutores, como N-acetil- cisteína e 2-mercaptoetanol. O meio pode incluir RPMI 1640, Immunocult (StemCell), AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15 e X-Vivo 20, Optimizer, com aminoácidos adicionados, piruvato de sódio e vitaminas, isentos de soro ou suplementados com uma quantidade adequada de soro (ou plasma) ou um conjunto definido de hormônios e/ou uma quantidade de citocina suficiente para o crescimento e expansão das células T. Antibióticos, por exemplo, penicilina e estreptomicina, são incluídos apenas em culturas experimentais, não em culturas de células que devem ser infundidas em um indivíduo.

As células alvo são mantidas sob condições necessárias para suportar o crescimento, por exemplo, uma temperatura apropriada (por exemplo, 37ºC) e uma atmosfera (por exemplo, ar mais 5% de CO2).

[545] As células T que foram expostas a tempos de estimulação variados podem exibir características diferentes. Por exemplo, no sangue normal ou produtos de células mononucleares do sangue periférico submetido a aférese tem uma população de células T helper (TH, células CD4+) que é maior do que a população de células T citotóxicas ou supressor (TC, CD8+). A expansão ex vivo das células T, estimulando os receptores CD3 e CD28 produz uma população de células T que antes dos dias 8 a 9 consistem predominantemente em células TH, enquanto, após os dias 8 a

9, a população de células T compreende uma quantidade cada vez maior população de células TC.

[546] Além disso, além dos marcadores CD4 e CD8, outros marcadores fenotípicos variam significativamente, mas em grande parte, reprodutivelmente durante o curso do processo de expansão celular. Assim, essa reprodutibilidade permite a capacidade de adaptar um produto de célula T ativado para fins específicos.

[547] Em uma modalidade, as células T reguladoras podem ser obtidas através do isolamento de células T CD4+ a partir de doadores HLA-A2- através de RosetteSep (Stemcell) e enriquecidas em células CD25+ (Miltenyi) antes da triagem de Tregs CD4+CD127loCD25hi vivas usando um FACSAria II (BD Biosciences). As Tregs classificados podem ser estimuladas com células L e mAb αCD3 (OKT3; 200ng/mL) em 1000U/ml de IL-

2.

[548] Em uma modalidade da invenção, as células T podem ser cultivadas na presença de rapamicina, a fim de obter células T reguladoras, como descrito, por exemplo, no documento WO2007110785 aqui incorporado por referência.

Outro método para gerar células T reguladoras é descrito em US2016024470 aqui incorporado por referência, em que as células T são cultivadas com um ativador de receptor de células T (TCR)/CD3, como por exemplo anticorpos TCR/CD3, um ativador de co-estimulador de TCR, como para exemplo anticorpos CD28, CD137 (4-1 BB), GITR, B7-1/2, CD5, ICOS, OX40, CD40 ou CD137 e rapamicina.

[549] Em uma modalidade da invenção, as células T geneticamente modificadas pela expressão do CAR também podem ter sido geneticamente modificadas pela expressão de pelo menos um fator intracelular, como ROR-C, Foxo1, T-bet ou Gata 3, c-Maf AhR. Em uma modalidade, a célula imunológica geneticamente modificada da invenção expressa Foxo1.

[550] Em uma modalidade, as células geneticamente modificadas da presente invenção podem ser uma célula imunológica alogênica, como, por exemplo, uma célula T ou Treg alogênica. Por exemplo, a célula imunológica alogênica pode ser uma célula imunológica sem expressão de um antígeno leucocitário humano funcional (HLA), por exemplo, HLA de classe I e/ou HLA de classe II, ou sem expressão de um receptor de célula T funcional (TCR).

[551] Em uma modalidade, uma célula T sem um TCR funcional pode ser projetada de modo a não expressar nenhum TCR funcional em sua superfície, projetada de modo a não expressar uma ou mais subunidades que compreendem um TCR funcional ou projetada de modo que produza muito pouco TCR funcional em sua superfície. Alternativamente, a célula T pode expressar um TCR substancialmente prejudicado, por exemplo, pela expressão de formas mutadas ou truncadas de uma ou mais das subunidades do TCR. O termo “TCR substancialmente comprometido” significa que este TCR não provocará uma reação imunológica adversa em um hospedeiro.

[552] Em outra modalidade, as células geneticamente modificadas descritas aqui podem ser manipuladas de modo que não expressem um HLA funcional em sua superfície. Por exemplo, uma célula imunológica aqui descrita pode ser manipulada de modo que a expressão da superfície da célula HLA, por exemplo, moléculas de HLA de classe 1 e/ou HLA de classe II ou HLA não clássica seja regulada negativamente.

[553] Em outra modalidade, a célula T pode não ter um TCR funcional e um HLA funcional, como HLA de classe I e/ou HLA de classe II.

[554] As células imunológicas modificadas (como, por exemplo, células T ou Treg modificadas) que não têm expressão de um TCR e/HLA funcional podem ser obtidas por qualquer meio adequado, incluindo um nocaute ou um nocaute de uma ou mais subunidades do TCR e/ou HLA. Por exemplo, a célula imunológica pode incluir um knock-down do TCR e/ou HLA usando siRNA, shRNA, ativador de transcrição ativador de transcrições repetidas palindrômicas curtas e regularmente espaçadas (CRISPR) como nuclease efetiva (TALEN), endonuclease de dedo de zinco (ZFN), meganuclease (mn, também conhecido como endonuclease de homing) ou megaTAL (combinando um efetor de TAL com um domínio de clivagem de mn) (Osborn et al., “Evaluation of TCR Gene Editing Achieved by TALENs, CRISPR/Cas9, and megaTAL Nucleases” Mol Ther.

2016 Mar; 24(3):570-81).

[555] Em uma modalidade, a expressão de TCR e/ou expressão de HLA pode ser inibida usando siRNA ou shRNA que tem como alvo um ácido nucleico que codifica um TCR e/ou HLA em uma célula T. A expressão de siRNA e shRNAs em células T pode ser alcançada usando qualquer sistema de expressão convencional, por exemplo, como um sistema de expressão lentiviral. Exemplos de siRNA e shRNA que regulam negativamente a expressão de genes HLA de classe I e/ou HLA de classe II são descritos, por exemplo, em US2007/0036773.

Exemplos de shRNAs que regulam negativamente a expressão de componentes do TCR são descritos, por exemplo, em US2012/0321667.

[556] “CRISPR” ou “CRISPR para TCR e/ou HLA” ou “CRISPR para inibir TCR e/ou HLA”, conforme aqui usado, se refere a um conjunto de repetições palindrômicas curtas, inter-espaçadas regularmente, agrupadas ou um sistema que compreende esse conjunto de repetições. “Cas”, como aqui usado, se refere a uma proteína associada a CRISPR. Um sistema “CRISPR/Cas” se refere a um sistema derivado de CRISPR e Cas que pode ser usado para silenciar ou alterar um gene TCR e/ou HLA.

[557] Os sistemas CRISPR/Cas de ocorrência natural são encontrados em aproximadamente 40% dos genomas de eubactérias sequenciados e em 90% das arqueias sequenciadas.

Grissa et al. (2007) BMC Bioinformatics 8:172. Este sistema é um tipo de sistema imunológico procariótico que confere resistência a elementos genéticos estranhos, como plasmídeos e fagos, e fornece uma forma de imunidade adquirida.

Barrangou et al. (2007) Science 315:1709-1712; Marragini et al. (2008) Science 322:1843-1845. O sistema CRISPR/Cas foi modificado para uso em edição de genes (silenciamento, aprimoramento ou alteração de genes específicos) em eucarióticos, como camundongos ou primatas. Wiedenheft et al. (2012) Nature 482: 331-8. Isto é conseguido introduzindo na célula eucariótica um plasmídeo contendo um CRISPR especificamente projetado e um ou mais Cas apropriados. A sequência CRISPR, às vezes chamada de lócus CRISPR, compreende repetições e espaçadores alternados. Em um CRISPR de ocorrência natural, os espaçadores geralmente compreendem sequências estranhas à bactéria, como uma sequência de plasmídeo ou fago; no sistema TCR e/ou HLA CRISPR/Cas, os espaçadores são derivados da sequência do gene TCR ou HLA.

O RNA do lócus CRISPR é constitutivamente expresso e processado pelas proteínas Cas em pequenos RNAs. Estes compreendem um espaçador flanqueado por uma sequência repetida. Os RNAs guiam outras proteínas Cas para silenciar elementos genéticos exógenos no nível de RNA ou DNA. Horvath et al. (2010) Science 327:167-170; Makarova et al. (2006)

Biology Direct 1: 7. Os espaçadores servem assim como modelos para moléculas de RNA, analogamente aos siRNAs. Pennisi (2013) Science 341: 833-836. O sistema CRISPR/Cas pode, assim, ser usado para editar um gene TCR e/ou HLA (adicionar ou excluir um par de bases) ou introduzir uma parada prematura que diminui a expressão de um TCR e/ou HLA. O sistema CRISPR/Cas pode, alternativamente, ser usado como interferência de RNA, desativando o gene HLA de maneira reversível. Em uma célula de mamífero, por exemplo, o RNA pode guiar a proteína Cas para um promotor de TCR e/ou HLA, bloqueando estericamente as RNA polimerases.

[558] Podem ser gerados sistemas CRISPR/Cas artificiais que inibem o TCR e/ou HLA, usando a tecnologia conhecida na técnica, por exemplo, a descrita em US20140068797 e Cong (2013) Science 339: 819-823. Outros sistemas CRISPR/Cas artificiais conhecidos na técnica também podem ser gerados que inibem o TCR e/ou HLA, por exemplo, o descrito em Tsai (2014) Nature Biotechnol., 32: 6 569-576, US 8.871.445; 8.865.406; 8.795.965; 8.771.945; e 8.697.359.

[559] “TALEN” ou “TALEN para TCR e/ou HLA” ou “TALEN para inibir TCR e/ou HLA” se refere a uma nuclease efetora do tipo ativador de transcrição, uma nuclease artificial que pode ser usada para editar o TCR e/ou HLA. Os TALENs são produzidos artificialmente pela fusão de um domínio de ligação ao DNA efetor de TAL a um domínio de clivagem de

DNA. Os efetores do tipo ativador de transcrição (TALEs) podem ser manipulados para ligar qualquer sequência de DNA desejada, incluindo uma porção do gene TCR e/ou HLA. Ao combinar um TALE modificado com um domínio de clivagem de DNA, uma enzima de restrição pode ser produzida que é específica para qualquer sequência de DNA desejada, incluindo uma sequência de TCR e/ou HLA. Estes podem ser introduzidos em uma célula, na qual podem ser usados para edição do genoma. Boch (2011) Nature Biotech. 29:135-6; e Boch et al. (2009) Science 326:1509-12; Moscou et al. (2009) Science 326: 3501.

[560] TALEs são proteínas secretadas pela bactéria Xanthomonas. O domínio de ligação ao DNA contém uma sequência de 33-34 aminoácidos repetida, altamente conservada, com a excepção dos 12º e 13º aminoácidos. Essas duas posições são altamente variáveis, mostrando uma forte correlação com o reconhecimento específico de nucleotídeos. Assim, podem ser projetadas para se ligarem a uma sequência de DNA desejada.

Para produzir um TALEN, uma proteína TALE é fundida a uma nuclease (N), que é uma endonuclease de Fokl do tipo selvagem ou mutada. Várias mutações no Fokl foram feitas para seu uso em TALENs; estes, por exemplo, melhoram a especificidade ou atividade da clivagem. Cermak et al. (2011) Nucl. Acids Res.

39: e82; Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29:143-8; Hockemeyer et al. (2011) Nature Biotech. 29: 731-734; Wood et al. (2011) Science 333: 307; Doyon et al. (2010) Nature

Methods 8: 74-79; Szczepek et al. (2007) Nature Biotech. 25:

786-793; e Guo et al. (2010)/. Mol.

Biol. 200: 96. O domínio

Fokl funciona como um dímero, exigindo dois construtos com domínios de ligação a DNA exclusivos para locais no genoma alvo com orientação e espaçamento adequados.

Tanto o número de resíduos de aminoácidos entre o domínio de ligação do DNA

TALE e o domínio de clivagem de Fokl quanto o número de bases entre os dois locais de ligação individuais do TALEN parecem ser parâmetros importantes para alcançar altos níveis de atividade.

Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29:143-8. Um

TCR e/ou HLA TALEN podem ser usados dentro de uma célula para produzir uma quebra de fita dupla (DSB). Uma mutação pode ser introduzida no local da interrupção se os mecanismos de reparo repararem incorretamente a interrupção por meio de união de extremidade não homóloga.

Por exemplo, reparo inadequado pode introduzir uma mutação no deslocamento de região.

Alternativamente, o DNA estranho pode ser introduzido na célula junto com o TALEN; dependendo das sequências do DNA estranho e da sequência cromossômica, esse processo pode ser usado para corrigir um defeito no gene TCR e/ou HLA ou introduzir esse defeito no gene wt TCR e/ou HLA,

diminuindo assim a expressão do TCR e/ou HLA.

TALENs específicos para sequências em TCR e/ou HLA podem ser construídos usando qualquer método conhecido na técnica,

incluindo vários esquemas usando componentes modulares.

Zhang et al. (2011) Nature Biotech. 29:149-53; Geibler et al. (2011) PLoS ONE 6: el9509.

[561] “ZFN” ou “Nuclease de dedo de zinco” ou “ZFN para TCR e/ou HLA” ou “ZFN para inibir TCR e/ou HLA” se referem a uma nuclease de dedo de zinco, uma nuclease artificial que pode ser usada para editar o TCR e/ou gene HLA. Como um TALEN, um ZFN compreende um domínio de nuclease de Fok1 (ou seu derivado) fundido a um domínio de ligação ao DNA. No caso de um ZFN, o domínio de ligação ao DNA compreende um ou mais dedos de zinco. Carroll et al. (2011) Genetics Society of America 188: 773-782; e Kim et al. (1996) Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 93:1156-1160. Um dedo de zinco é um pequeno motivo estrutural de proteína estabilizado por um ou mais íons de zinco. Um dedo de zinco pode compreender, por exemplo, Cys2His2, e pode reconhecer uma sequência de aproximadamente 3 pb. Vários dedos de zinco de especificidade conhecida podem ser combinados para produzir polipeptídeos de vários dedos que reconhecem sequências de 6, 9, 12, 15 ou 18 pb. Várias técnicas de seleção e montagem modular estão disponíveis para gerar dedos de zinco (e combinações dos mesmos) que reconhecem sequências específicas, incluindo exibição de fagos, sistemas mono-híbridos de levedura, sistemas mono-híbridos de bi-híbridos bacterianos e células de mamíferos.

[562] Como um TALEN, um ZFN deve dimerizar para clivar o DNA. Assim, é necessário um par de ZFNs para atingir locais de DNA não palindrômicos. Os dois ZFNs individuais devem ligar cadeias opostas do DNA com suas nucleases adequadamente espaçadas. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 95:10570-5. Também como um TALEN, um ZFN pode criar uma quebra de fita dupla no DNA, que pode criar uma mutação de deslocamento da região se reparada incorretamente, levando a uma diminuição na expressão e quantidade de TCR e/ou HLA em uma célula. Os ZFNs também podem ser usados com recombinação homóloga para sofrer mutação no gene TCR e/ou HLA. Os ZFNs específicos para sequências em TCR e/ou HLA podem ser construídos usando qualquer método conhecido na técnica. Ver, por exemplo, Provasi (2011) Nature Med. 18: 807-815; Torikai (2013) Blood 122:1341-1349; Cathomen et al. (2008) Mol. Ther. 16:1200-7; Quo et al. (2010)/. Mol. Biol. 400: 96; US 2011/0158957; e US 2012/0060230.

[563] “Meganuclease” ou “meganuclease para TCR e/ou HLA” ou “meganuclease para inibir TCR e/ou HLA” se refere a uma endonuclease monomérica com grandes sítios de reconhecimento (> 14 pares de bases), que pode ser usada para editar o TCR e/ou gene HLA. As meganucleases (mn) são proteínas monoméricas com atividade de nuclease inata que são derivadas de endonucleases bacterianas do homing e modificadas para um local-alvo único. Endonucleases homing são enzimas de clivagem de DNA que podem gerar quebras de fita dupla em loci individuais em seus genomas hospedeiros e, assim, conduzir eventos de conversão de genes específicos do local. (Stoddard, Structure. 2011 Jan 12; 19(1):7-15).

Apesar de seu pequeno tamanho, as endonucleases homing reconhecem longas sequências de DNA (tipicamente 20 a 30 pares de bases). As endonucleases domésticas são extremamente comuns e são encontradas em micróbios, bem como em fagos e vírus. As enzimas LAGLIDADG e His-Cys box (que são as mais específicas da sequência dessas enzimas) dependem de folhas β antiparalelas que se encaixam nas principais ranhuras de seus locais-alvo de DNA (Flick et al., 1998; Jurica et al., 1998). Lá eles estabelecem uma coleção de contatos específicos de sequência e não específicos que são distribuídos de maneira não uniforme entre vários pares de bases consecutivos (Chevalier et al., 2003; Scalley-Kim et al., 2007).

[564] A família LAGLIDADG de endonuclease homing (LHE) é a principal fonte das enzimas manipuladas usadas para aplicações de direcionamento de genes. A família LHE é codificada principalmente dentro das arqueias e nos genomas cloroplastos e mitocondriais de algas e fungos (Chevalier et al., 2005; Dalgaard et al., 1997; Sethuraman et al., 2009).

Meganucleases que possuem um único motivo LAGLIDADG conservado (SEQ ID NO: 85) por cadeia de proteínas formam proteínas homodiméricas que clivam sequências alvo de DNA palindrômicas e quase palindrômicas, enquanto aquelas que contêm dois desses motivos por cadeia de proteínas formam monômeros maiores, pseudo-simétricos que podem atingir sequências de DNA completamente assimétricas.

[565] As meganucleases podem ser modificadas para atingir o TCR e/ou HLA e, assim, criar uma quebra de fita dupla no DNA, que pode criar uma mutação de mudança de quadro se for reparada incorretamente, levando a uma diminuição na expressão e quantidade de TCR e/ou HLA em uma célula.

[566] “MegaTAL” ou “megaTAL para TCR e/ou HLA” ou “megaTAL para inibir TCR e/ou HLA” se refere a uma nuclease artificial, que pode ser usada para editar o gene TCR e/ou HLA. MegaTALs são nucleases monoméricas híbridas obtidas através da fusão de domínios efetores TAL mínimos (do tipo ativador de transcrição) no terminal N de meganucleases derivadas da família de endonucleases de origem LAGLIDADG (Nucleic Acids Res. 2014 Feb; 42 (4): 2591-601; Takeuchi et al., Methods Mol Biol. 2015;1239:105-32. doi:10.1007/978-1- 4939-1862-1_6).

[567] Os MegaTALs consistem, portanto, em uma cabeça de clivagem de meganuclease específica do local, com afinidade e especificidade adicionais fornecidas por um domínio de ligação ao DNA efetor de TAL. Os MegaTALs podem ser projetados para atingir o TCR e/ou HLA e, assim, criar uma quebra de fita dupla no DNA, que pode criar uma mutação de deslocamento de região se reparada incorretamente, levando a uma diminuição na expressão e quantidade de HLA em uma célula. Uma variante da meganuclease I-OnuI (mn) foi usada para projetar um TCRα-megaTAL para nocautear o gene do receptor de células T alfa (TCRα). O TCRα mn foi fundido com uma matriz TALE de 10,5 repetições, projetada para ligar uma sequência de DNA a montante do sítio de ligação do TCRα mn.

Verificou-se que o TCRα de direcionamento megaTAL alcançou rompimento gênico extremamente alto sem clivagem fora do alvo detectável em células T primárias humanas (Boissel et al., Nucleic Acids Res. 2014 Feb;42(4):2591-601).

[568] Embora não deseje estar vinculado a nenhuma teoria em particular, em algumas modalidades, uma célula T terapêutica tem persistência de curto prazo em um paciente, devido a telômeros encurtados na célula T; consequentemente, a transfecção com um gene da telomerase pode prolongar os telômeros da célula T e melhorar a persistência da célula T no paciente. Veja Carl June, “Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic”, Journal of Clinical Investigation, 117:1466-1476 (2007). Assim, em uma modalidade, a célula imunológica geneticamente modificada da invenção expressa ectopicamente uma subunidade de telomerase, por exemplo, a subunidade catalítica de telomerase, por exemplo, TERT, por exemplo, hTERT. Em alguns aspectos, esta divulgação fornece um método para produzir uma célula imunológica que expressa CAR, compreendendo o contato de uma célula imunológica com um ácido nucleico que codifica uma subunidade da telomerase, por exemplo, a subunidade catalítica da telomerase, por exemplo, TERT, por exemplo, hTERT. A célula pode ser contatada com o ácido nucleico antes, simultaneamente ou após ser contatada com um construto que codifica um CAR.

VII. APLICAÇÃO TERAPÊUTICA

[569] A invenção fornece células imunológicas modificadas para expressar um CAR direcionado a um antígeno HLA-A2 como um meio de recrutar as referidas células imunológicas para locais de resposta imunológica ou inflamatória específica e ativar as células imunológicas para suprimir a atividade imunológica das células efetoras imunológicas nesses locais. O recrutamento mediado por CAR e a ativação de células imunológicas fornecem um método para prevenir ou tratar uma série de doenças ou distúrbios imunológicos para os quais essa atividade de supressão imunológica é benéfica.

[570] Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula imunológica reguladora. A célula imunológica pode ser qualquer célula imunológica reguladora adequada para uso em terapia celular (ver, por exemplo, Wood, KJ et al., 2012; Papp, G. et al., 2017). Em uma modalidade, a célula imunológica reguladora é selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula T reguladora, uma célula T reguladora CD4+, uma célula T reguladora CD8+, uma célula T reguladora γδ, uma célula T reguladora DN, uma célula T reguladora DN, uma célula B reguladora, uma célula NK reguladora, um macrófago regulador, uma célula dendrítica reguladora e qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula imunológica humana. Em outra modalidade, a célula imunológica reguladora é uma célula imunológica reguladora humana. Em uma modalidade, a célula imunológica reguladora humana é selecionada do grupo que consiste em uma célula T reguladora, uma célula T reguladora CD4+, uma célula T reguladora CD8+, uma célula T reguladora γδ, uma célula T reguladora γδ, uma célula T reguladora DN, uma célula B reguladora, uma célula NK reguladora, um macrófago regulador, uma célula dendrítica reguladora e qualquer combinação dos mesmos.

[571] Em uma modalidade, a célula imunológica pode ser uma célula T reguladora. Em outra modalidade, a célula T reguladora pode ser uma célula T reguladora humana. Embora a ativação de células T reguladoras seja dependente de antígeno, a ação supressora dessas células é independente de antígeno, TCR e MHC. Consequentemente, a expressão de CARs nas células T reguladoras redireciona essas células e sua ativação para o tecido alvo apropriado, de modo que elas sejam ativadas de maneira específica ao antígeno; no entanto, seus efeitos supressores ocorrem sem a necessidade de reconhecimento adicional de antígenos associados à doença.

Portanto, desde que as células T reguladoras estejam na vizinhança correta de onde as células efetoras imunológicas estão localizadas e mediando seus efeitos indesejados, as células T reguladoras redirecionadas podem ser acionadas ou ativadas nesse local para fornecer seus efeitos supressores.

[572] Em uma modalidade, o antígeno HLA-A2 alvo pode estar presente ou expresso em um local ou tecido alvo de uma resposta imunológica ou inflamatória indesejável mediada por células efetoras imunológicas.

[573] Em uma modalidade, as células imunológicas modificadas por CAR da invenção podem ser usadas na prevenção ou tratamento de uma ou mais doenças, distúrbios, sintomas ou condições associadas ao transplante de órgão ou tecido (por exemplo, rejeição/disfunção de órgão ou tecido, GVHD e/ou condições associadas). A rejeição do transplante envolve a destruição do tecido transplantado do doador pelas células imunológicas do receptor através de uma resposta imunológica. Uma resposta imunológica também está envolvida na GVHD; no entanto, neste caso, os tecidos do receptor são destruídos pelas células imunológicas do doador transferidas para o receptor através do transplante. Por conseguinte, o redirecionamento mediado por CAR e a ativação de células imunológicas fornecem um método para suprimir a rejeição de células e/ou tecidos incompatíveis por células efetoras imunológicas em receptores de transplante ou inibir a ação patogênica de células imunocompetentes transplantadas no caso de GVHD. Em uma modalidade, as células e/ou tecidos incompatíveis compreendem células e/ou tecidos incompatíveis com HLA-A2.

[574] Outra modalidade da presente invenção é, portanto, um método para o tratamento de uma ou mais doenças, distúrbios, sintomas ou condições associadas ao transplante de órgão ou tecido (por exemplo, rejeição/disfunção de órgão ou tecido, GVHD e/ou condições associadas) em um indivíduo, em que o referido método compreende administrar ao indivíduo uma célula imunológica projetada por CAR ou uma composição como aqui descrito.

[575] Em uma modalidade, o método é um método de terapia celular. Em uma modalidade, a terapia celular é autóloga. Em uma modalidade, a terapia celular é heteróloga.

Em uma modalidade, a terapia celular é alogênica. Em uma modalidade, o método é um método de terapia genética.

[576] Outra modalidade da presente invenção é, portanto, uma célula imunológica projetada para CAR ou uma composição conforme descrito aqui para uso no tratamento de uma ou mais doenças, distúrbios, sintomas ou condições associadas ao transplante de órgão ou tecido (por exemplo,

rejeição de órgão ou tecido/disfunção, GVHD e/ou condições associadas a ele) em um indivíduo.

[577] As células imunológicas modificadas por CAR da invenção podem ser usadas para promover tolerância imunológica, tolerância operacional e/ou acomodação imunológica em um indivíduo. As células imunológicas modificadas por CAR da invenção podem ser usadas para promover tolerância imunológica, tolerância operacional e/ou acomodação imunológica em um indivíduo após o transplante de órgão ou tecido. Em uma modalidade, é fornecido um método para promover tolerância imunológica, tolerância operacional e/ou acomodação imunológica em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma célula imunológica modificada por CAR, como descrito em outro lugar aqui. Em outra modalidade, é fornecido um método para promover a tolerância imunológica, tolerância operacional e/ou acomodação imunológica em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica como descrito em outro lugar aqui. Em uma modalidade, o uso pode ser para promover tolerância imunológica, tolerância operacional e/ou acomodação imunológica a um órgão ou tecido transplantado em um indivíduo. Em uma modalidade, a célula imunológica modificada por CAR é administrada ao mesmo tempo que, antes ou após o transplante do órgão ou tecido. Em uma modalidade,

a célula imunológica modificada por CAR é administrada ao mesmo tempo que o transplante do órgão ou tecido.

Em outra modalidade, a célula imunológica modificada por CAR é administrada antes do transplante do órgão ou tecido.

Em uma modalidade, a célula imunológica modificada por CAR é administrada após o transplante do órgão ou tecido.

Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula imunológica reguladora.

Em uma modalidade, a célula imunológica reguladora é selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula T reguladora, uma célula T reguladora CD4+, uma célula T reguladora CD8+, uma célula T reguladora γδ, uma célula T reguladora DN, uma célula T reguladora DN, uma célula B reguladora, uma célula reguladora NK, um macrófago regulador, uma célula dendrítica reguladora e qualquer combinação dos mesmos.

Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula T reguladora.

Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula T reguladora CD4+. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula imunológica humana.

Em outra modalidade, a célula imunológica reguladora é uma célula imunológica reguladora humana.

Em uma modalidade, a célula imunológica reguladora humana é selecionada do grupo que consiste em uma célula T reguladora,

uma célula T reguladora CD4+, uma célula T reguladora CD8+,

uma célula T reguladora γδ, uma célula T reguladora γδ, uma célula T reguladora DN, uma célula B reguladora, uma célula

NK reguladora, um macrófago regulador, uma célula dendrítica reguladora e qualquer combinação dos mesmos. Em outra modalidade, a célula imunológica é uma célula T reguladora humana. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula T reguladora CD4+ humana.

[578] As células imunológicas modificadas por CAR da presente invenção podem ser usadas para prevenir ou tratar a rejeição de um órgão ou tecido transplantado. Em uma modalidade, as células imunológicas modificadas por CAR (por exemplo, as células Treg modificadas por CAR) da presente invenção podem ser usadas para prevenir ou tratar a rejeição hiperaguda de um órgão ou tecido transplantado. Em uma modalidade, as células imunológicas modificadas por CAR (por exemplo, as células Treg modificadas por CAR) da presente invenção podem ser usadas para prevenir ou tratar a rejeição mediada por anticorpos de um órgão ou tecido transplantado.

Em uma modalidade, o método compreende a administração de células imunológicas modificadas por CAR (por exemplo, as células Treg modificadas por CAR) da presente invenção a um indivíduo exposto a um órgão ou tecido transplantado. Em uma modalidade, o órgão ou tecido transplantado pode abranger um transplante de medula óssea, um transplante de órgão, uma transfusão de sangue ou qualquer outro tecido ou célula estranha que seja intencionalmente introduzido em um indivíduo. Em uma modalidade, as células imunológicas modificadas por CAR (por exemplo, as células Treg modificadas por CAR) da presente invenção podem ser usadas como uma terapia para inibir a rejeição de enxerto após o transplante.

Em uma modalidade, a rejeição de enxerto pode ser rejeição de aloenxerto. Em uma modalidade, a rejeição de enxerto pode ser rejeição de xenoenxerto. Em uma modalidade, é fornecido um método para prevenir ou tratar a rejeição de transplante de órgão ou tecido em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma célula imunológica modificada por CAR, conforme descrito em outro lugar aqui.

Em uma modalidade, é fornecido um método para prevenir ou tratar a rejeição de transplante de órgão ou tecido em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica como descrito em outro lugar aqui. Outra modalidade da presente invenção é, portanto, uma célula imunológica modificada para CAR (por exemplo, as células Treg modificadas por CAR) da invenção, ou uma composição farmacêutica compreendendo as referidas células imunológicas, para uso na prevenção ou tratamento de rejeição de transplante de órgão ou tecido em um indivíduo.

Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para aumentar o período de tempo de sobrevivência do enxerto em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma célula imunológica modificada por CAR (por exemplo, as células Treg modificadas por CAR) como descrito em outro lugar aqui. Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para aumentar o período de sobrevivência do enxerto em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica como descrito em outro lugar aqui. Em uma modalidade, o método fornece um período de sobrevivência de enxerto de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 1 ano, 2 anos, 3 anos, 4 anos, 5 anos, 6 anos, 7 anos, 8 anos, 9 anos, 10 anos, 20 anos, 30 anos, 40 anos, 50 anos, 60 anos, 70 anos, 80 anos, 90 anos, 100 anos ou a vida útil do indivíduo. Em uma modalidade, o indivíduo não está passando por nenhuma terapia com agentes imunossupressores.

Em uma modalidade, a administração de uma célula imunológica ou composição da invenção permite reduzir a quantidade de uma terapia com agente imunossupressor recebida pelo indivíduo. Em uma modalidade, o enxerto pode ser um aloenxerto. Em uma modalidade, o transplante pode ser exposto às células imunológicas modificadas por CAR da presente invenção, ao mesmo tempo que, antes ou após o transplante do transplante no receptor. Em uma modalidade, o transplante de órgão ou tecido pode ser um coração, válvula cardíaca, pulmão, rim, fígado, pâncreas, intestino, pele, vasos sanguíneos, medula óssea, células-tronco, células estaminais, ossos ou células de ilhotas. No entanto, a invenção não está limitada a um tipo específico de transplante.

Em uma modalidade, o transplante de doador pode ser “pré-condicionado” ou “pré-tratado” tratando o transplante de órgão ou tecido antes do transplante no receptor com as células imunológicas da invenção modificadas por CAR da invenção, a fim de reduzir a imunogenicidade do transplante contra o receptor, reduzindo ou impedindo a rejeição do enxerto.

Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor de transplante é negativo para HLA-A2. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor de transplante é negativo para HLA-A2 e é positivo para um ou dois subtipos diferentes de HLA-A selecionados de um ou dois de HLA-A*03,

HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36,

HLA-A*68. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor do transplante é negativo para HLA-A2 e é positivo para um subtipo de HLA-A selecionado dentre um de HLA-A*03, HLA-

A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-

A*68. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor do transplante é negativo para HLA-A2 e é positivo para dois subtipos de HLA-A diferentes selecionados entre um ou dois de HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-

A*33, HLA-A*36, HLA-A*68. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor do transplante é negativo para HLA-A2 e é positivo para dois subtipos de HLA-A diferentes selecionados entre um dos HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-

A*33, HLA-A*36, HLA-A*68. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor do transplante é negativo para HLA-A2 e é positivo para dois subtipos de HLA-A diferentes selecionados entre dois de HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31,

HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor do transplante é negativo para HLA-

A2 e é positivo para um ou dois subtipos de HLA-A diferentes selecionados a partir de um ou dois de HLA-A*25, HLA-A*29,

HLA-A*30. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor do transplante é negativo para HLA-A2 e é positivo para um subtipo HLA-A selecionado dentre um de HLA-A*25, HLA-A*29,

HLA-A*30. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor do transplante é negativo para HLA-A2 e é positivo para dois subtipos de HLA-A diferentes selecionados entre um ou dois de HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor do transplante é negativo para HLA-

A2 e é positivo para dois subtipos de HLA-A diferentes selecionados dentre um de HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor do transplante é negativo para HLA-A2 e é positivo para dois subtipos de HLA-

A diferentes selecionados entre dois de HLA-A*25, HLA-A*29,

HLA-A*30. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor de transplante é negativo para HLA-A2 e é positivo para um subtipo HLA-A de HLA-A*03. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor de transplante é negativo para HLA-A2 e é positivo para um subtipo HLA-A de HLA-A*25. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor de transplante é negativo para HLA-A2 e é positivo para um subtipo HLA-A de

HLA-A*29. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor de transplante é negativo para HLA-A2 e é positivo para um subtipo HLA-A de HLA-A*30. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor de transplante é negativo para HLA-A2 e é positivo para um subtipo HLA-A de HLA-A*31. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor de transplante é negativo para HLA-A2 e é positivo para um subtipo HLA-A de

HLA-A*33. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor de transplante é negativo para HLA-A2 e é positivo para um subtipo HLA-A de HLA-A*36. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor de transplante é negativo para HLA-A2 e é positivo para um subtipo HLA-A de HLA-A*68. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor do transplante é negativo para HLA-A2 e é positivo para um ou dois de HLA-

A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01,

HLA-A*33:01, HLA-A*36:01 e HLA-A*68:01. Em uma modalidade,

o hospedeiro ou receptor do transplante é negativo para HLA-

A2 e positivo para um de HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-

A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01 e HLA-A*68:01. Em uma modalidade, o hospedeiro ou destinatário do transplante é negativo para HLA-A2 e positivo para dois de HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-

A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01 e HLA-

A*68:01. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor do transplante é negativo para HLA-A2 e é positivo para um ou dois de HLA-A*25:01, HLA-A*29:02 e HLA-A*30:01. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor de transplante é negativo para HLA-A2 e é positivo para um de HLA-A*25:01,

HLA-A*29:02 e HLA-A*30:01. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor de transplante é negativo para HLA-A2 e é positivo para dois de HLA-A*25:01, HLA-A*29:02 e HLA-

A*30:01. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor de transplante é negativo para HLA-A2 e é positivo para HLA-

A*25:01. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor de transplante é negativo para HLA-A2 e é positivo para HLA-

A*29:02. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor de transplante é negativo para HLA-A2 e é positivo para HLA-

A*03:01. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor de transplante é negativo para HLA-A2 e é positivo para HLA-

A*31:01. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor de transplante é negativo para HLA-A2 e é positivo para HLA-

A*33:01. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor de transplante é negativo para HLA-A2 e é positivo para HLA-

A*36:01. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor de transplante é negativo para HLA-A2 e é positivo para HLA-

A*68:01. Em uma modalidade, o transplante é positivo para HLA-A2.

[579] Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula imunológica reguladora. Em uma modalidade, a célula imunológica reguladora é selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula T reguladora, uma célula T reguladora CD4+, uma célula T reguladora CD8+, uma célula T reguladora γδ, uma célula T reguladora DN, uma célula T reguladora DN, uma célula B reguladora, uma célula NK reguladora, um macrófago regulador, uma célula dendrítica reguladora e qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula T reguladora. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula T reguladora CD4+. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula imunológica humana. Em outra modalidade, a célula imunológica reguladora é uma célula imunológica reguladora humana. Em uma modalidade, a célula imunológica reguladora humana é selecionada do grupo que consiste em uma célula T reguladora, uma célula T reguladora CD4+, uma célula T reguladora CD8+, uma célula T reguladora γδ, uma célula T reguladora γδ, uma célula T reguladora DN, uma célula B reguladora, uma célula NK reguladora, um macrófago regulador, uma célula dendrítica reguladora e qualquer combinação dos mesmos. Em outra modalidade, a célula imunológica é uma célula T reguladora humana. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula T reguladora CD4+ humana.

[580] As células imunológicas modificadas por CAR (por exemplo, as células Treg modificadas por CAR) da presente invenção podem ser usadas para prevenir ou tratar a doença do enxerto contra o hospedeiro (GVHD). Em uma modalidade, o método compreende a administração de uma célula imunológica modificada por CAR (por exemplo, as células Treg modificadas por CAR) da presente invenção a um indivíduo exposto a um órgão ou tecido transplantado. Em uma modalidade, o órgão ou tecido transplantado pode abranger um transplante de medula óssea, um transplante de órgão, uma transfusão de sangue ou qualquer outro tecido ou célula estranha que seja intencionalmente introduzido em um indivíduo. Por exemplo, a GVHD pode ocorrer após o transplante de coração, válvula cardíaca, pulmão, rim, fígado, pâncreas, intestino, pele, vasos sanguíneos, medula óssea, células-tronco, células estaminais ou ossos ou ilhotas. No entanto, a invenção não está limitada a um tipo específico de transplante. Em uma modalidade, a GVHD pode ocorrer após o transplante de células-tronco hematopoiéticas. Em uma modalidade, é fornecido um método para prevenir ou tratar a doença do enxerto contra o hospedeiro (GVHD) em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma célula imunológica modificada por CAR, como descrito em outro lugar aqui. Em uma modalidade, é fornecido um método para prevenir ou tratar a doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD) em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica como descrito em outro lugar aqui.

Em uma modalidade, a invenção fornece um método para contatar um transplante de doador, por exemplo, uma rede biocompatível ou um tecido, órgão ou célula do doador, com células imunológicas modificadas por CAR da presente invenção ao mesmo tempo que, antes ou depois o transplante do transplante em um destinatário. Em uma modalidade, as células imunológicas modificadas por CAR da presente invenção podem ser usadas para melhorar, inibir ou reduzir uma resposta adversa do transplante de doador contra o receptor, prevenindo ou tratando GVHD. Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para prevenir ou retardar o início da GVHD em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma célula imunológica modificada por CAR, conforme descrito em outro lugar aqui.

Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para prevenir ou retardar o início da GVHD em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica como descrito em outro lugar aqui.

Em uma modalidade, o início da GVHD é adiado por 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 1 ano, 2 anos, 3 anos, 4 anos, 5 anos, 6 anos, 7 anos, 8 anos, 9 anos, 10 anos, 20 anos, 30 anos, 40 anos, 50 anos, 60 anos, 70 anos, 80 anos, 90 anos, 100 anos ou a vida útil do indivíduo. Em uma modalidade, o indivíduo não está passando por nenhuma terapia com agentes imunossupressores.

Em uma modalidade, o indivíduo está passando por uma terapia imunossupressora. Em uma modalidade, as células imunológicas da invenção são administradas ao indivíduo com o objetivo de diminuir a quantidade terapeuticamente eficaz da referida terapia imunossupressora. Em uma modalidade, a GVHD pode ser GVHD aguda ou GVHD crônica. Em uma modalidade, o transplante de doador pode ser “pré-condicionado” ou “pré-tratado” tratando o transplante antes do transplante no receptor com células imunológicas modificadas por CAR (por exemplo, as células Treg modificadas por CAR) da invenção, a fim de reduzir a imunogenicidade do transplante contra o receptor, reduzindo ou prevenindo a GVHD. Em uma modalidade, o transplante pode ser contatado com células ou um tecido do receptor antes do transplante, a fim de ativar células T que podem estar associadas ao transplante. Após o tratamento do transplante com células ou tecido do receptor, as células ou tecido podem ser removidos do transplante. O transplante tratado pode então ser posteriormente contatado com células imunológicas modificadas por CAR (por exemplo, as células

Treg modificadas por CAR) da presente invenção para reduzir,

inibir ou eliminar a atividade das células efetoras imunológicas que foram ativadas pelo tratamento das células ou tecido do receptor.

Após este tratamento do transplante com células imunológicas modificadas por CAR da presente invenção, as células imunológicas modificadas por CAR podem ser removidas do transplante antes do transplante no receptor.

No entanto, algumas células imunológicas modificadas por CAR podem aderir ao transplante e, portanto,

podem ser introduzidas no receptor com o transplante.

Nesta situação, as células imunológicas modificadas por CAR introduzidas no receptor podem suprimir uma resposta imunológica contra o receptor causada por uma célula associada ao transplante.

HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36,

A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-

A*33, HLA-A*36, HLA-A*68. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor do transplante é negativo para HLA-A2 e é positivo para dois subtipos de HLA-A diferentes selecionados entre um de HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-

A diferentes selecionados entre dois de HLA-A*25, HLA-A*29,

A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01,

HLA-A*33:01, HLA-A*36:01 e HLA-A*68:01. Em uma modalidade,

o hospedeiro ou receptor do transplante é negativo para HLA-

A2 e positivo para um de HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-

A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01 e HLA-A*68:01. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor do transplante é negativo para HLA-A2 e positivo para dois de HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-

A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01 e HLA-A*68:01. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor do transplante é negativo para HLA-A2 e é positivo para um ou dois de HLA-

A*25:01, HLA-A*29:02 e HLA-A*30:01. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor de transplante é negativo para HLA-

A2 e é positivo para um de HLA-A*25:01, HLA-A*29:02 e HLA-

A*30:01. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor do transplante é negativo para HLA-A2 e é positivo para dois de

HLA-A*25:01, HLA-A*29:02 e HLA-A*30:01. Em uma modalidade,

o hospedeiro ou receptor de transplante é negativo para HLA-

A2 e é positivo para HLA-A*25:01. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor de transplante é negativo para HLA-

A2 e é positivo para HLA-A*29:02. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor de transplante é negativo para HLA-

A2 e é positivo para HLA-A*30:01. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor de transplante é negativo para HLA-

A2 e é positivo para HLA-A*03:01. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor de transplante é negativo para HLA-

A2 e é positivo para HLA-A*31:01. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor de transplante é negativo para HLA-

A2 e é positivo para HLA-A*33:01. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor de transplante é negativo para HLA-

A2 e é positivo para HLA-A*36:01. Em uma modalidade, o hospedeiro ou receptor de transplante é negativo para HLA-

A2 e é positivo para HLA-A*68:01. Em uma modalidade, o transplante é positivo para HLA-A2. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula imunológica reguladora.

Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula T reguladora.

uma célula T reguladora CD4+, uma célula T reguladora CD8+,

uma célula T reguladora γδ, uma célula T reguladora γδ, uma célula T reguladora DN, uma célula B reguladora, uma célula NK reguladora, um macrófago regulador, uma célula dendrítica reguladora e qualquer combinação dos mesmos. Em outra modalidade, a célula imunológica é uma célula T reguladora humana. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula T reguladora CD4+ humana.

[581] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método de expansão de uma população de células imunológicas em um indivíduo em que as células imunológicas são modificadas para expressar um receptor de antígeno quimérico (CAR), o método compreendendo a administração de uma célula imunológica ao indivíduo, como descrito em outro lugar aqui, em que a célula imunológica modificada administrada produz uma população de células imunológicas da progênie no indivíduo. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula imunológica reguladora. Em uma modalidade, a célula imunológica reguladora é selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula T reguladora, uma célula T reguladora CD4+, uma célula T reguladora CD8+, uma célula T reguladora γδ, uma célula T reguladora DN, uma célula T reguladora DN, uma célula B reguladora, uma célula NK reguladora, um macrófago regulador, uma célula dendrítica reguladora e qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, as células imunológicas podem ser células T reguladoras. Em uma modalidade, as células imunológicas podem ser células T reguladoras CD4+. Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula imunológica humana.

Em uma modalidade, a célula imunológica reguladora humana é selecionada do grupo que consiste em uma célula T reguladora, uma célula T reguladora

CD4+, uma célula T reguladora CD8+, uma célula T reguladora γδ, uma célula T reguladora γδ, uma célula T reguladora DN,

uma célula B reguladora, uma célula NK reguladora, um macrófago regulador, uma célula dendrítica reguladora e qualquer combinação dos mesmos.

Em outra modalidade, a célula imunológica é uma célula T reguladora humana.

Em uma modalidade, a célula imunológica é uma célula T reguladora

CD4+ humana.

Em uma modalidade, as células Treg modificadas por CAR da presente invenção são capazes de se replicar in vivo, resultando em persistência a longo prazo que pode levar à supressão sustentada de uma resposta imunológica de uma célula alvo e tolerância imunológica.

Em uma modalidade, é fornecido um método para gerar uma população persistente de células T reguladoras em um indivíduo em que as células T reguladoras são modificadas para expressar um receptor de antígeno quimérico (CAR), o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma célula T reguladora como aqui descrito, em que a população persistente de células T reguladoras modificadas persiste no indivíduo por pelo menos

1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 30 dias, 40 dias, 50 dias, 60 dias, 70 dias, 80 dias, 90 dias, 100 dias, 200 dias, 300 dias, 400 dias, 500 dias, 600 dias, 700 dias, 800 dias, 900 dias ou 1000 dias após a administração. Em uma modalidade, as células CAR-Treg podem ser auto-renováveis e reativadas in vivo para suprimir uma resposta imunológica de uma célula alvo. Em uma modalidade, as células CAR-Treg podem ser células CAR-Treg de memória que podem ser reativadas para suprimir uma resposta imunológica de uma célula alvo.

[582] As células imunológicas podem ser obtidas de qualquer fonte. Por exemplo, em uma modalidade, as células imunológicas podem ser obtidas do doador de tecido, do receptor do transplante ou de uma fonte não relacionada (de outro modo, um indivíduo ou espécie diferente) para geração de células imunológicas modificadas por CAR da presente invenção. Por conseguinte, as células imunológicas modificadas por CAR da presente invenção podem ser autólogas, alogênicas ou xenogênicas para o receptor do transplante ou uma fonte não relacionada de outra forma. Em uma modalidade, as células CAR-Treg da presente invenção podem ser autólogas, alogênicas ou xenogênicas ao receptor de transplante. Em uma modalidade, as células CAR-Treg da presente invenção podem ser autólogas ao receptor de transplante.

[583] Em uma modalidade, o indivíduo pode ser um mamífero. Em uma modalidade, o indivíduo pode ser um ser humano.

[584] Em uma modalidade, pode ser desejável administrar células T ativadas a um indivíduo e, posteriormente, extrair novamente sangue (ou ter uma aférese realizada), ativar células T a partir desta de acordo com a presente invenção e reinfundir o indivíduo com essas células T ativadas e expandidas. Este processo pode ser realizado várias vezes a cada poucas semanas. Em certas modalidades, as células T podem ser ativadas a partir de coleta de sangue de 10 cc a 400 cc. Em certas modalidades, as células T são ativadas a partir de coleta de sangue de 20 cc, 30 cc, 40 cc, 50 cc, 60 cc, 70 cc, 80 cc, 90 cc ou 100 cc. Para não ficar ligado à teoria, o uso desse protocolo de coleta múltipla de sangue/reinfusão múltipla pode servir para selecionar determinadas populações de células T.

[585] As células imunológicas modificadas por CAR da presente invenção podem ser administradas sozinhas ou como uma composição farmacêutica em combinação com diluentes e/ou com outros componentes, como IL-2 ou outras citocinas ou populações de células. Em uma modalidade, a composição farmacêutica pode compreender uma pluralidade de células imunológicas modificadas, como descrito em outro lugar aqui.

Em uma modalidade, as composições farmacêuticas da presente invenção podem compreender uma célula imunológica ou população de células modificadas por CAR, como aqui descrito em qualquer lugar, em combinação com um ou mais veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitáveis. Tais composições podem compreender tampões, tais como solução salina tamponada neutra, solução salina tamponada com fosfato e semelhantes; carboidratos como glicose, manose, sacarose ou dextranos, manitol; proteínas; polipeptídeos ou aminoácidos como glicina; antioxidantes; agentes quelantes tais como EDTA ou glutationa; adjuvantes (por exemplo, hidróxido de alumínio); e conservantes. As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas a um indivíduo de qualquer maneira adequada, inclusive por inalação, injeção, ingestão, transfusão, implantação ou transplante de aerossol. As composições farmacêuticas descritas em outro lugar deste documento podem ser administradas a um indivíduo por administração parenteral. As composições farmacêuticas descritas em outro lugar deste documento podem ser administradas a um indivíduo por via subcutânea, intradérmica, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, intrasterna, por injeção intravenosa (i.v.), por técnicas de infusão ou por via intraperitoneal. Em uma modalidade, as composições de células imunológicas modificadas por CAR da presente invenção podem ser administradas a um indivíduo por injeção intradérmica ou subcutânea. Em outra modalidade, as composições de células imunológicas modificadas por CAR da presente invenção podem ser administradas por injeção i.v. Em uma modalidade, as composições de células imunológicas modificadas por CAR podem ser injetadas diretamente em um linfonodo, local de infecção, local de inflamação ou local de ejeção de tecido ou órgão.

[586] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas de uma maneira apropriada à doença a ser prevenida ou tratada. A quantidade e a frequência da administração serão determinadas por fatores como a condição do indivíduo e o tipo e a gravidade da doença do indivíduo, embora doses apropriadas possam ser determinadas por ensaios clínicos.

[587] Quando uma “quantidade eficaz” ou “quantidade terapêutica” é indicada, a quantidade das composições da presente invenção a ser administrada pode ser determinada considerando as diferenças individuais em idade, peso, título de anticorpo e condição do indivíduo. Geralmente pode afirmar-se que uma composição farmacêutica compreendendo as células do sistema imunológico modificadas por CAR, tal como descrito em outro lugar aqui podem ser administradas a uma dosagem de 1 X 104 a 1 X 109 células/kg de peso corporal. Em uma modalidade, as células do sistema imunológico modificadas por CAR podem ser administradas a uma dosagem de 1 X 105 a 100 X 105 células/kg de peso corporal, incluindo todos os valores inteiros dentro dessas faixas. As composições de células imunológicas modificadas por CAR também podem ser administradas várias vezes nessas dosagens.

As células imunológicas modificadas por CAR podem ser administradas usando técnicas de infusão que são comumente conhecidas em imunoterapia (ver, por exemplo, Rosenberg et al, 1988). O regime ideal de dosagem e tratamento para um indivíduo em particular pode ser facilmente determinado monitorando o indivíduo em busca de sinais de doença e ajustando o tratamento de acordo.

[588] Em uma modalidade, a pelo menos uma célula imunológica modificada por CAR da invenção é administrada ao indivíduo em necessidade da mesma em combinação com outro agente ativo. De acordo com uma modalidade, pelo menos uma população de células imunológicas é administrada antes, ao mesmo tempo ou após a administração de outro agente ativo.

[589] Em uma modalidade, as células imunológicas modificadas por CAR da presente invenção podem ser administradas a um indivíduo em conjunto com (por exemplo, antes, simultaneamente ou após) qualquer número de modalidades de tratamento relevantes, incluindo, mas não limitado ao tratamento com agentes como terapia antiviral, quimioterapia, radiação, agentes imunossupressores, anticorpos, agentes imunoablativos, citocinas e irradiação.

Em uma modalidade, as células imunológicas modificadas por CAR da presente invenção podem ser administradas em conjunto com um agente imunossupressor. Qualquer agente imunossupressor conhecido na técnica pode ser usado. Por exemplo, o agente imunossupressor pode ser inibidores da calcineurina, como ciclosporina, tacrolimus, azatioprina, metotrexato, metoxsaleno, rapamicina, micofenolato de mofetil, ácido micofenólico, micofenolato de sódio, 6- mercaptopurina, 6-tioguanina, rituximabe, inibidores de mTOR como sirolimus, everolimus, basiliximabe, daclizumabe, belatacept, alemtuzumabe, muromonab-CD3, globulina anti- timócitos, glicorticosteroides ou esteroides adrenocorticais como prednisona e prednisolona, ou qualquer combinação dos mesmos. As células imunológicas modificadas por CAR da presente invenção podem ser administradas ao indivíduo antes, depois ou concomitante com o agente imunossupressor.

Por exemplo, as células imunológicas modificadas por CAR da presente invenção podem ser administradas após a administração do agente imunossupressor ao indivíduo ou as células imunológicas modificadas por CAR da invenção podem ser administradas antes da administração do agente imunossupressor ao indivíduo. Alternativamente, ou além disso, as células imunológicas modificadas por CAR da invenção podem ser administradas ao mesmo tempo em que o agente imunossupressor é administrado ao indivíduo. As células imunológicas modificadas por CAR da presente invenção e/ou o agente imunossupressor podem ser administradas ao indivíduo após o transplante.

Alternativamente, ou além disso, as células imunológicas modificadas com CAR da presente invenção e/ou o agente imunossupressor podem ser administradas ao indivíduo antes do transplante. As células imunológicas modificadas por CAR da presente invenção e/ou o agente imunossupressor podem ser administradas ao indivíduo durante a cirurgia de transplante. Em uma modalidade, o método da invenção de administração de células imunológicas modificadas por CAR ao indivíduo é realizado uma vez iniciada a terapia imunossupressora. Em algumas modalidades, o método é realizado mais de uma vez, por exemplo, para monitorar o receptor do transplante ao longo do tempo e, se aplicável, em diferentes regimes de terapia imunossupressora. Em algumas modalidades, a terapia imunossupressora é reduzida se for previsto que o receptor do transplante seja tolerante ao transplante. Em algumas modalidades, nenhuma terapia imunossupressora é prescrita, por exemplo, a terapia imunossupressora é interrompida, se for previsto que o receptor do transplante seja tolerante ao transplante.

[590] Também é fornecido um método para prevenir ou tratar a rejeição de transplante de órgão ou tecido em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo (i) pelo menos um agente imunossupressor e (ii) células imunológicas modificadas por CAR (por exemplo, as células Treg modificadas por CAR)) da invenção, ou uma composição farmacêutica compreendendo as referidas células imunológicas.

[591] Outra modalidade da presente invenção é, portanto, uma combinação de uma célula imunológica modificada por CAR (por exemplo, as células Treg modificadas por CAR) da invenção, ou uma composição farmacêutica compreendendo as referidas células imunológicas e de pelo menos um agente imunossupressor, para uso na prevenção ou tratamento de rejeição de transplante de órgão ou tecido em um indivíduo.

[592] Também é fornecido um método para aumentar o período de tempo de sobrevivência do enxerto em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de pelo menos um agente imunossupressor e células imunológicas modificadas por CAR (por exemplo, as células Treg modificadas por CAR) da presente invenção, ou uma composição farmacêutica compreendendo o mesmo.

[593] Em uma modalidade, uma combinação de pelo menos um agente imunossupressor com células imunológicas manipuladas por CAR (por exemplo, as células Treg modificadas por CAR) da presente invenção é usada para prevenir ou tratar a doença do enxerto contra o hospedeiro (GVHD). Em uma modalidade, a GVHD pode ocorrer após o transplante de células-tronco hematopoiéticas.

[594] Outra modalidade da invenção é, portanto, um método de prevenção ou tratamento da doença do enxerto contra o hospedeiro (GVHD) em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de pelo menos um agente imunossupressor e células imunológicas modificadas pelo CAR (por exemplo, as células Treg modificadas por CAR) ou uma composição farmacêutica como aqui descrito.

[595] Em uma modalidade, a invenção fornece um método para contatar um transplante de doador, por exemplo, uma rede biocompatível ou um tecido, órgão ou célula do doador, com pelo menos um agente imunossupressor e células imunológicas modificadas por CAR (por exemplo, as células Treg modificadas por CAR) da presente invenção ao mesmo tempo que, antes ou após o transplante do transplante para um receptor.

[596] Em uma modalidade, a combinação de pelo menos um agente imunossupressor com células imunológicas modificadas por CAR (por exemplo, as células Treg modificadas por CAR) da presente invenção pode ser usada para melhorar,

inibir ou reduzir uma resposta adversa pelo transplante do doador contra a receptor, prevenindo ou tratando a GVHD.

[597] Outra modalidade da presente invenção é, portanto, um método para prevenir ou retardar o início da GVHD em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de pelo menos um agente imunossupressor e células imunológicas modificadas por CAR (por exemplo, as células Treg modificadas por CAR) ou uma composição farmacêutica como aqui descrito.

[598] Em uma modalidade, as células imunológicas da invenção modificadas por CAR e o pelo menos um agente imunossupressor são administrados simultaneamente ou sequencialmente.

[599] Em uma modalidade, as células imunológicas modificadas por CAR da presente invenção e, opcionalmente, pelo menos um outro agente ativo, por exemplo, agente imunossupressor, são administradas em conjunto com (por exemplo, antes, simultaneamente ou após) o transplante.

[600] As células imunológicas modificadas por CAR da presente invenção podem ser administradas após um diagnóstico de rejeição de órgãos ou tecidos de transplante, seguido de doses das células imunológicas modificadas por CAR da invenção e de um agente imunossupressor até que os sintomas de rejeição de órgãos ou tecidos diminuam. Em uma modalidade adicional, as composições de células imunológicas modificadas por CAR da presente invenção podem ser administradas a um indivíduo em conjunto com (por exemplo, antes, simultaneamente ou após) o transplante de medula óssea. Em outra modalidade, as células imunológicas modificadas por CAR da presente invenção podem ser administradas após terapia ablativa de células B, como agentes que reagem com CD20, por exemplo, Rituximabe. Por exemplo, em uma modalidade, os indivíduos podem sofrer tratamento padrão com quimioterapia em altas doses seguida de transplante de células-tronco do sangue periférico. Em certas modalidades, após o transplante, os indivíduos podem receber uma infusão das células imunológicas modificadas por CAR expandidas da presente invenção. Em uma modalidade adicional, as células imunológicas modificadas por CAR expandidas podem ser administradas antes ou após a cirurgia.

[601] Em uma modalidade, o indivíduo (por exemplo, humano) recebe uma administração inicial de pelo menos uma célula imunológica ou população da invenção e uma ou mais administrações subsequentes, em que as uma ou mais administrações subsequentes são administradas por menos de 15 dias, por exemplo, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2 dias após a administração anterior. Em uma modalidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz de células imunológicas da invenção é administrada ou deve ser administrada ao indivíduo. Em uma modalidade, a quantidade de células imunológicas da pelo menos uma população de células imunológicas da invenção administrada ao indivíduo é pelo menos de 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 ou 109 células. Em uma modalidade, a quantidade de células imunológicas da invenção administrada ao indivíduo varia de cerca de 102 a cerca de 109, de cerca de 103 a cerca de 108, de cerca de 104 a cerca de 107 ou de cerca de 105 a cerca de 106 células. Em outra modalidade, a quantidade de células imunológicas da invenção administrada ao indivíduo varia de cerca de 106 a cerca de 109, de cerca de 106 a 107, de cerca de 106 a 108, de cerca de 107 a 109, de cerca de 107 a 108, de cerca de 108 a 109. Em outra modalidade, a quantidade de células imunológicas da invenção administrada ao indivíduo é de cerca de 106, cerca de 107, cerca de 108 ou é cerca de

109. Em uma modalidade, a quantidade de células imunológicas da pelo menos uma população de células imunológicas da invenção administrada ao indivíduo é pelo menos de 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 ou 109 células/kg de corpo. Em uma modalidade, a quantidade de células imunológicas da invenção administrada ao indivíduo varia de cerca de 104 a 109 células/kg de peso corporal ou 105 a 108 células/kg de peso corporal, incluindo todos os valores inteiros dentro dessas faixas. Em uma modalidade, mais de uma administração da pelo menos uma célula imunológica ou população da invenção é administrada ao indivíduo (por exemplo, humano) por semana,

por exemplo, 2, 3 ou 4 administrações da célula imunológica geneticamente modificada ou população da invenção são administrados por semana.

[602] Em algumas modalidades, pode ser desejável incorporar um gene suicida nas células imunológicas modificadas por CAR da presente invenção, a fim de permitir a destruição seletiva de células imunológicas modificadas por CAR in vivo. Em uma modalidade, as células imunológicas modificadas por CAR da presente invenção podem compreender ainda um sistema genético suicida. Em uma modalidade, as células imunológicas modificadas por CAR da presente invenção podem compreender ainda um ácido nucleico que codifica um sistema de gene suicida. “Terapia gênica suicida”, “gene suicida” e “sistema genético suicida”, conforme descrito aqui, se referem aos métodos para destruir seletivamente uma célula por apoptose. Tais métodos empregam um gene suicida que fará com que uma célula se mate por apoptose. O gene suicida codifica para um produto que causa a morte celular por si só ou na presença de outros compostos.

O gene suicida pode ser de qualquer sistema genético adequado para uso em terapia celular (ver, por exemplo, Jones et al., 2014; Wang et al., 2017; Zhang et al., 2017; Casucci et al., 2011; Gargett et al., 2014; Khaleghi, 2012; Philip et al., 2014).

[603] Em uma modalidade, o sistema de gene suicida pode envolver uma terapia de pró-fármaco enzimática direcionada a genes (GDEPT), em que um medicamento não tóxico (isto é, pró-fármaco de gene suicida) é convertido em um composto tóxico em células modificadas por genes suicidas.

Por exemplo, em uma modalidade, o sistema de gene suicida pode ser um sistema de gene suicida da timidina quinase do vírus da herpes simplex (HSV-TK)/ganciclovir (GCV) que usa o gene da timidina quinase do vírus herpes simplex em combinação com o pró-fármaco ganciclovir. Em outras modalidades, o sistema de gene suicida pode ser um sistema genético da citosina desaminase/5-fluorocitosina. Em algumas alternativas dos métodos aqui fornecidos, em que as células imunológicas modificadas por CAR compreendem um sistema de genes suicidas, os métodos compreendem ainda administrar ao indivíduo um pró-fármaco do gene suicida.

[604] Em outras modalidades, o sistema de genes suicidas pode envolver um mecanismo indutor de dimerização, onde genes apoptóticos, como caspases, destroem células por indução de apoptose. Os sistemas gênicos suicidas indutores de dimerização podem envolver proteínas quiméricas compostas por um domínio de ligação ao fármaco ligado aos componentes da via apoptótica, permitindo a dimerização e apoptose condicionais das células imunológicas modificadas após a administração de um indutor químico de dimerização (CID).

Por exemplo, em uma modalidade, o sistema de gene suicida pode ser um sistema de gene suicida baseado em caspase.

Exemplos não limitativos de sistemas de gene suicida induzíveis por caspase podem incluir o sistema genético induzível por caspase-9 (iCasp9) e o sistema de gene suicida por caspase-8 (iCasp8) em que a caspase é ativada pelo CID, FK506 ou um análogo do mesmo. Em algumas alternativas dos métodos aqui fornecidos, em que as células imunológicas modificadas por CAR compreendem um sistema de genes suicidas, os métodos compreendem ainda a administração ao indivíduo de um indutor químico de dimerização.

[605] Em outras modalidades, o sistema de gene suicida pode ser mediado por um anticorpo monoclonal terapêutico. Os sistemas de gene suicida mediados por mAb terapêuticos envolvem a expressão de proteínas na superfície celular que tornam as células imunológicas modificadas sensíveis aos mAbs terapêuticos. As células imunológicas modificadas podem ser seletivamente destruídas após a administração do mAb terapêutico específico. Exemplos não limitativos de sistemas de gene suicida mediados por mAb terapêuticos podem incluir o sistemas de gene suicida CD20 e o sistemas de gene suicida RQR8 em que o mAb terapêutico é um mAb anti-CD20. Em algumas modalidades, o mAb anti-CD20 pode ser rituximabe. Em algumas alternativas dos métodos aqui fornecidos, em que as células imunológicas modificadas por CAR compreendem um sistema genético suicida, os métodos compreendem ainda a administração ao indivíduo de um anticorpo monoclonal terapêutico.

VIII. ARTIGOS DE FABRICAÇÃO E KITS

[606] Em outra modalidade, a invenção fornece um artigo de fabricação contendo materiais úteis para a prevenção e/ou tratamento de rejeição de transplante ou GVHD.

O artigo de fabricação compreende um recipiente e um tag ou bula ou associada ao recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais, como vidro ou plástico. O recipiente possui uma composição que é eficaz para prevenir e/ou tratar a condição imunológica, como rejeição de transplante ou GVHD, e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco com uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica).

Pelo menos um agente ativo na composição é uma célula imunológica modificada por CAR da presente invenção. Em uma modalidade, a célula imunológica modificada por CAR é uma Treg modificado por CAR. Em uma modalidade, o Treg modificado por CAR é uma Treg humano modificado por CAR. O rótulo ou bula indica que a composição é usada para prevenir ou tratar a rejeição de transplantes ou GVHD. O artigo de fabricação, etiqueta ou folheto informativo pode ainda compreender material instrucional para administrar ao paciente a composição celular imunológica modificada por CAR. Além disso, o artigo de fabricação pode ainda compreender um segundo recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

[607] Também são fornecidos kits que são úteis para diversos fins (por exemplo, para prevenir ou tratar a rejeição de transplantes ou GVHD). Podem ser fornecidos kits que contêm as células imunológicas modificadas pelo CAR.

Como no artigo de fabricação, o kit compreende um recipiente e um tag ou bula ou associada ao recipiente. O recipiente contém uma composição compreendendo pelo menos uma célula imunológica modificada por CAR da presente invenção. Podem ser incluídos recipientes adicionais que contêm, por exemplo, diluentes e tampões. O rótulo ou bula pode fornecer uma descrição da composição, bem como instruções para o uso pretendido. Em uma modalidade, as células imunológicas modificadas por CAR são Tregs modificadas por CAR. Em uma modalidade, os Tregs modificados por CAR são Tregs humanos modificados por CAR.

[608] A presente invenção se refere ainda a um kit de partes compreendendo, em uma primeira parte, uma célula imunológica ou uma população de células imunológicas da presente invenção e, em uma segunda parte, outro agente ativo, incluindo, sem limitações, terapia antiviral, quimioterapia, radiação, agentes imunossupressores, anticorpos, agentes imunoablativos, citocinas e irradiação.

Em algumas modalidades, o kit de partes da presente invenção compreende, em uma primeira parte, uma célula imunológica ou uma população de células imunológicas da presente invenção, e em uma segunda parte, um ou mais agentes imunossupressores.

Exemplos de agentes imunossupressores que podem estar presentes no kit da invenção incluem, mas não estão limitados a, inibidores de calcineurina, como ciclosporina, tacrolimus, azatioprina, metotrexato, metoxsaleno, rapamicina, micofenolato mofetil, ácido micofenólico, micofenolato de sódio, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, rituximabe, inibidores da mTOR, como sirolimus, everolimus, basiliximabe, daclizumabe, belatacept, alemtuzumabe, muromonab-CD3, globulina anti-timócito, glicorticosteroides ou esteroides adrenocorticais, como prednisona e prednisolona, ou qualquer combinação dos mesmos.

Tabela 1 Kabat Chothia

VH CDR1 SYHIQ (SEQ ID NO: 1) GYTFTSY (SEQ ID NO: 2)

VH CDR2 WIYPGDGSTQYNEKFKG (SEQ ID YPGDGS (SEQ ID NO: 4)

NO: 3)

VH CDR2 WIYPGDGSTKYSQKFQG (SEQ ID YPGDGS (SEQ ID NO: 4)

NO: 5)

VH CDR3 EGTYYAMDY (SEQ ID NO: 6) EGTYYAMDY (SEQ ID NO: 6)

Tabela 2

Kabat Chothia

VL CDR1 RSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID RSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID

NO: 7) NO: 7)

VL CDR2 KVSNRFS (SEQ ID NO: 8) KVSNRFS (SEQ ID NO: 8)

VL CDR3 FQGSHVPRT (SEQ ID NO: 9) FQGSHVPRT (SEQ ID NO: 9)

Tabela 3

Nome SEQ SEQ ID AA

VH CDR2 10 WIYPGDGSTX10YX12X13KFX16G

(Kabat)

VH FR1 11 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS

(chothia)

VH FR1 12 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT

(kabat)

VH FR2 13 WVRQAPGQX9LEWMGX15

(kabat/kabat variável)

VH1/2/5/6 FR2 14 WVRQAPGQRLEWMG

(kabat/

kabat)

VH3 FR2 15 WVRQAPGQGLEWMGI

(kabat/

kabat)

VH4 FR2 16 WVRQAPGQGLEWMG

(kabat/

kabat)

VH FR2 17 WVRQAPGQX9LEWMGX15WI

(kabat/chothi a variável)

VH1/2/5/6 FR2 18 WVRQAPGQRLEWMGWI

(kabat/chothi a)

VH3 FR2 19 WVRQAPGQGLEWMGIWI

(kabat/chothi a)

VH4 FR2 20 WVRQAPGQGLEWMGWI

(kabat/chothi a)

VH FR2 21 HIQWVRQAPGQX12LEWMGX18WI

(chothia/chot hia variável)

VH1/2/5/6 FR2 22 HIQWVRQAPGQRLEWMGWI

(chothia/chot hia)

VH3 FR2 23 HIQWVRQAPGQGLEWMGIWI

(chothia/chot hia)

VH4 FR2 24 HIQWVRQAPGQGLEWMGWI

(chothia/chot hia)

VH FR2 25 HIQWVRQAPGQX12LEWMGX18

(chothia/kaba t variável)

VH1/2/5/6 FR2 26 HIQWVRQAPGQRLEWMG

(chothia/kaba t)

VH3 FR2 27 HIQWVRQAPGQGLEWMGI

(chothia/kaba t)

VH4 FR2 28 HIQWVRQAPGQGLEWMG

(chothia/kaba t)

VH FR3 29 X1VTX4TX6DTSX10STAYMX16LSX19LRSX23DX25AVYYC

(variável AR kabat)

VH1/6 FR3 30 RVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR

(kabat)

VH2 FR3 31 RVTITADTSASTAYMLLSSLRSEDTAVYYCAR

(kabat)

VH3 FR3 32 VTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR

(kabat)

VH4 FR3 33 RVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR

(kabat)

VH5 FR3 34 RVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDMAVYYCAR

(kabat)

VH FR3 35 TX2YX4X5KFX8GX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28

(chothia LRSX32DX34AVYYCAR variável)

VH1/2/3/4/5 36 TQYNEKFKGX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRS

FR3 (chothia X32DX34AVYYCAR variável)

VH6 FR3 37 TKYSQKFQGX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRS

(chothia X32DX34AVYYCAR variável)

VH 1 FR3 38 TQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYC

(chothia) AR

VH 2 FR3 39 TQYNEKFKGRVTITADTSASTAYMLLSSLRSEDTAVYYC

(chothia) AR

VH 3 FR3 40 TQYNEKFKGVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCA

(chothia) R

VH 4 FR3 41 TQYNEKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYC

(chothia) AR

VH 5 FR3 42 TQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDMAVYYC

(chothia) AR

VH 6 FR3 43 TKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYC

(chothia) AR

VH FR4 44 WGQGTTVTVSS

VH 45 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ

APGQX44LEWMGX50WIYPGDGSTX60YX62X63KFX66GX68V

TX71TX73DTSX77STAYMX83LSX86LRSX90DX92AVYYTV

VL FR1 46 DX2VMTQX7PLSX11X12VTX15GQPASISX23

VL1/4 47 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISC

VL2 FR1 48 DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISC

VL3 FR1 49 DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISC VL5 FR1 50 DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISF VL FR2 51 WX2X3QX5PGQX9PX11X12LIY VL1 FR2 52 WFQQRPGQSPRRLIY VL2 FR2 53 WYLQKPGQSPQLLIY VL3/5 FR2 54 WYQQRPGQPPRLLIY VL4 FR2 55 WYQQRPGQSPRLLIY VL FR3 56 GVPDRFSGSGX11GTDFTLKISRVEAEDVGVYYC VL1/2/4 FR3 57 GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC VL3/5 FR3 58 GVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC VL FR4 59 FGGGTKVEIK VL 60 DX2VMTQX7PLSX11X12VTX15GQPASISX23RSSQSIVHS NGNTYLEWX41X42QX44PGQX48PX50X51LIYKVSNRFSGV PDRFSGSGX72GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVP

RTFGGT H1 (sem 61 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ líder) APGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSAST

AYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS

S H2 62 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ

APGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITADTSAST (sem líder)

AYMLLSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS

S H3 63 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ

APGQGLEWMGIWIYPGDGSTQYNEKFKGVTMTRDTSTST (sem líder)

VYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS

S H4 (sem 64 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ líder) APGQGLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTMTRDTSIST

AYMELSRLRSDDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS

S H5 (sem 65 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ líder) APGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSAST

AYMELSSLRSEDMAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS

S H6 (sem 66 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ líder) APGQRLEWMGWIYPGDGSTKYSQKFQGRVTITRDTSAST

AYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS

S K1 67 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLE

WFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTL

KISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTTKVEIK K2 68 DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLE

WYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTL KISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTTVEVEK

K3 69 DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLE

WYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTL

KISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK K4 70 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLE

WYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTL

KISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTTVEVEK K5 71 DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISFRSSQSIVHSNGNTYLE

WYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTL

KISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK H1_k1_AA (sem 72 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ líder) APGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSAST

AYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQ PASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ

GSHVPRTFGGGTKVEIK H1_k2_AA 73 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ

APGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSAST (sem líder)

AYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSLSVTPGQ PASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ

GSHVPRTFGGGTKVEIK H1_k3_AA 74 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ

APGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSAST

(sem líder) AYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS

SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQ PASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ

GSHVPRTFGGGTKVEIK H1_k4_AA 75 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ

APGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSAST (sem líder)

AYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQ PASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ

GSHVPRTFGGGTKVEIK H1_k5_AA 76 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ

APGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSAST (sem líder)

AYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQ PASISFRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ

GSHVPRTFGGGTKVEIK H2_k1_AA (sem 77 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ líder) APGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITADTSAST

AYMLLSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQ PASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ

GSHVPRTFGGGTKVEIK H2_k2_AA (sem 78 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ líder) APGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITADTSAST

AYMLLSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSLSVTPGQ PASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ

GSHVPRTFGGGTKVEIK H3_k2_AA (sem 79 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ líder) APGQGLEWMGIWIYPGDGSTQYNEKFKGVTMTRDTSTST

VYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSLSVTPGQ PASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ

GSHVPRTFGGGTKVEIK H3_k3_AA (sem 80 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ líder) APGQGLEWMGIWIYPGDGSTQYNEKFKGVTMTRDTSTST

VYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQ PASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ

GSHVPRTFGGGTKVEIK H3_k4_AA (sem 81 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ líder) APGQGLEWMGIWIYPGDGSTQYNEKFKGVTMTRDTSTST

VYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQ PASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ

GSHVPRTFGGGTKVEIK H3_k5_AA (sem 82 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ líder) APGQGLEWMGIWIYPGDGSTQYNEKFKGVTMTRDTSTST

VYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQ PASISFRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ

GSHVPRTFGGGTKVEIK H4_k2_AA (sem 83 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ líder) APGQGLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTMTRDTSIST

AYMELSRLRSDDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSLSVTPGQ PASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ

GSHVPRTFGGGTKVEIK H4_k3_AA (sem 84 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ líder) APGQGLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTMTRDTSIST

AYMELSRLRSDDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQ PASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ

GSHVPRTFGGGTKVEIK H4_k4_AA (sem 85 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ líder) APGQGLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTMTRDTSIST

AYMELSRLRSDDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQ PASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ

GSHVPRTFGGGTKVEIK H4_k5_AA (sem 86 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ líder) APGQGLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTMTRDTSIST

AYMELSRLRSDDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQ PASISFRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ

GSHVPRTFGGGTKVEIK H5_k2_AA (sem 87 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ líder) APGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSAST

AYMELSSLRSEDMAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSLSVTPGQ PASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ

GSHVPRTFGGGTKVEIK H5_k3_AA (sem 88 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ líder) APGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSAST

AYMELSSLRSEDMAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQ PASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ

GSHVPRTFGGGTKVEIK H5_k4_AA (sem 89 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ líder) APGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSAST

AYMELSSLRSEDMAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQ PASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ

GSHVPRTFGGGTKVEIK H5_k5_AA (sem 90 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ líder) APGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSAST

AYMELSSLRSEDMAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQ PASISFRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ

GSHVPRTFGGGTKVEIK H6_k2_AA (sem 91 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ líder) APGQRLEWMGWIYPGDGSTKYSQKFQGRVTITRDTSAST

GSHVPRTFGGGTKVEIK H6 92 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ APGQX44LEWMGX50WIYPGDGSTKYSQKFQGX68VTX71TX 73DTSX77STAYMX83LSX86LRSX90DX92AVYYCAREGTYY

AMDYWGQ H1_k1_AA (com 93 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGA líder) SVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGD

GSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVY YCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSG GGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSN GNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEI

K H1_k2_AA 94 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGA

SVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGD (com líder)

GSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVY YCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSG GGGSTSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSN GNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEI

K H1_k3_AA 95 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGA

SVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGD (com líder)

GSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVY YCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSG GGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSN GNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGA GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEI

K H1_k4_AA 96 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGA

SVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGD (com líder)

GSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVY YCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSG GGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSN GNTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEI

K H1_k5_AA 97 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGA

SVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGD (com líder)

GSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVY YCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSG GGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQPASISFRSSQSIVHSN GNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGA GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEI

K H2_k1_AA (com 98 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGA líder) SVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGD

GSTQYNEKFKGRVTITADTSASTAYMLLSSLRSEDTAVY YCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSG GGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSN GNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEI

K H2_k2_AA (com 99 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGA líder) SVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGD

GSTQYNEKFKGRVTITADTSASTAYMLLSSLRSEDTAVY YCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSG GGGSTSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSN GNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEI

K H3_k2_AA (com 100 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGA líder) SVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWMGIWIYPG

DGSTQYNEKFKGVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVY YCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSG GGGSTSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSN GNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEI

K H3_k3_AA (com 101 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGA líder) SVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWMGIWIYPG

DGSTQYNEKFKGVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVY YCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSG GGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSN GNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGA GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEI

K H3_k4_AA (com 102 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGA líder) SVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWMGIWIYPG

DGSTQYNEKFKGVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVY YCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSG GGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSN GNTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEI

K H3_k5_AA (com 103 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGA líder) SVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWMGIWIYPG

DGSTQYNEKFKGVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVY YCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSG GGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQPASISFRSSQSIVHSN GNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGA GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEI

K H4_k2_AA (com 104 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGA líder) SVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWMGWIYPGD

GSTQYNEKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVY YCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSG GGGSTSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSN GNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEI

K H4_k3_AA (com 105 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGA líder) SVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWMGWIYPGD

GSTQYNEKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVY YCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSG GGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSN GNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGA GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEI

K H4_k4_AA (com 106 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGA líder) SVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWMGWIYPGD

GSTQYNEKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVY YCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSG GGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSN GNTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEI

K H4_k5_AA (com 107 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGA líder) SVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWMGWIYPGD

GSTQYNEKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVY YCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSG GGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQPASISFRSSQSIVHSN GNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGA GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEI

K H5_k2_AA (com 108 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGA líder) SVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGD

GSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDMAVY YCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSG GGGSTSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSN GNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEI

K H5_k3_AA (com 109 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGA líder) SVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGD

GSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDMAVY YCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSG GGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSN GNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGA GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEI

K H5_k4_AA (com 110 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGA líder) SVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGD

GSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDMAVY YCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSG GGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSN GNTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEI

K H5_k5_AA (com 111 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGA líder) SVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGD

GSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDMAVY YCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSG GGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQPASISFRSSQSIVHSN GNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGA GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEI

K H6_k2_AA (com 112 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGA líder) SVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGD

GSTKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVY YCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSG GGGSTSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSN GNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEI

K líder 113 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRAS ligante 114 VDSSGGGGSGGGGSGGGGSTS Dobradiça CD8 115 SALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIAS

QPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLD CD28 TM 116 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV

CD28 IC 117 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAY

RS CD3z 118 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRR

GRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKG

ERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR CAR_H1_k1_AA 119 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ (sem líder) APGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSAST

AYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQ PASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ GSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHF VPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPA AGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIF WVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFA AYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREE YDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEA YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQAL

PPR CAR_H1_k2_AA 120 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ

APGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSAST (sem líder)

AYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSLSVTPGQ PASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ GSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHF VPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPA AGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIF WVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFA AYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREE YDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEA YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQAL

PPR CAR_H1_k3_AA 121 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ

APGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSAST (sem líder)

AYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQ PASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ GSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHF VPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPA AGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIF WVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFA AYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREE YDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEA YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQAL

PPR CAR_H1_k4_AA 122 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ

APGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSAST (sem líder)

AYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQ PASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ GSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHF VPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPA AGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIF WVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFA AYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREE YDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEA YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQAL

PPR CAR_H1_k5_AA 123 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ

APGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSAST (sem líder)

AYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQ PASISFRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ GSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHF VPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPA AGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIF WVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFA AYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREE YDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEA YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQAL PPR

CAR_H2_k1_AA 124 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ (sem líder) APGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITADTSAST

AYMLLSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQ PASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ GSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHF VPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPA AGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIF WVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFA AYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREE YDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEA YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQAL

PPR CAR_H2_k2_AA 125 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ (sem líder) APGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITADTSAST

AYMLLSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSLSVTPGQ PASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ GSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHF VPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPA AGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIF WVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFA AYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREE YDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEA YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQAL

PPR CAR_H3_k2_AA 126 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ (sem líder) APGQGLEWMGIWIYPGDGSTQYNEKFKGVTMTRDTSTST

VYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSLSVTPGQ PASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ GSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHF VPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPA AGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIF WVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFA AYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREE YDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEA YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQAL

PPR CAR_H3_k3_AA 127 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ (sem líder) APGQGLEWMGIWIYPGDGSTQYNEKFKGVTMTRDTSTST

VYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQ PASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ GSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHF VPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPA AGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIF WVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFA AYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREE YDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEA YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQAL

PPR CAR_H3_k4_AA 128 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ (sem líder) APGQGLEWMGIWIYPGDGSTQYNEKFKGVTMTRDTSTST

VYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQ PASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ GSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHF VPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPA AGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIF WVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFA AYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREE YDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEA YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQAL

PPR CAR_H3_k5_AA 129 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ (sem líder) APGQGLEWMGIWIYPGDGSTQYNEKFKGVTMTRDTSTST

VYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQ PASISFRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ GSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHF VPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPA AGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIF WVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFA AYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREE YDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEA YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQAL

PPR CAR_H4_k2_AA 130 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ (sem líder) APGQGLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTMTRDTSIST

AYMELSRLRSDDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSLSVTPGQ PASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ GSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHF VPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPA AGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIF WVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFA AYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREE YDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEA YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQAL

PPR CAR_H4_k3_AA 131 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ (sem líder) APGQGLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTMTRDTSIST

AYMELSRLRSDDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQ PASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ GSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHF VPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPA AGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIF WVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFA AYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREE YDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEA YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQAL

PPR CAR_H4_k4_AA 132 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ (sem líder) APGQGLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTMTRDTSIST

AYMELSRLRSDDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQ PASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ GSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHF VPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPA AGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIF WVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFA AYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREE YDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEA YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQAL

PPR CAR_H4_k5_AA 133 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ (sem líder) APGQGLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTMTRDTSIST

AYMELSRLRSDDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQ PASISFRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ GSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHF VPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPA AGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIF WVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFA AYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREE YDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEA YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQAL

PPR CAR_H5_k2_AA 134 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ (sem líder) APGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSAST

AYMELSSLRSEDMAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSLSVTPGQ PASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ GSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHF VPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPA AGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIF WVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFA AYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREE YDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEA YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQAL PPR

CAR_H5_k3_AA 135 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ (sem líder) APGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSAST

AYMELSSLRSEDMAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQ PASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ GSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHF VPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPA AGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIF WVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFA AYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREE YDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEA YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQAL

PPR CAR_H5_k4_AA 136 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ (sem líder) APGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSAST

AYMELSSLRSEDMAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQ PASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ GSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHF VPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPA AGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIF WVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFA AYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREE YDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEA YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQAL

PPR CAR_H5_k5_AA 137 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ (sem líder) APGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSAST

AYMELSSLRSEDMAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQ PASISFRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ GSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHF VPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPA AGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIF WVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFA AYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREE YDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEA YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQAL

PPR CAR_H6_k2_AA 138 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ (sem líder) APGQRLEWMGWIYPGDGSTKYSQKFQGRVTITRDTSAST

PPR CAR_H1_k2_AA 213 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQ

APGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSAST AYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVS SGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISC RSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSG VPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPR TFGGGTKVEIKRTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEAC RPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT LYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDF AAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDV LDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSE

IGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 4-1BB_AA 216 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGG

CEL (SEQ ID NO: 23 of US 9,102,760) CD8 dobradiça 218 TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRG AA (SEQ ID LDFACDIY NO: 21 de US

9.102.760)

CD8 Dobradiça 219 TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRG

AA LDFACD CD8 221 IWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC transmembrana _AA (SEQ ID NO: 22 de US

9.102.760) CD8_transmem- 223 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC brana AA Tabela 4 Nome SEQ SEQ ID NT H1_k1_NT 139 ATGGATTTCCAAGTTCAAATCTTCAGTTTCTTGCTTATCAGTG

CTTCTGTTATTATGTCACGAGCAAGTCAAGTTCAACTCGTACA GTCTGGAGCCGAGGTGAAAAAACCGGGAGCGTCCGTGAAAGTG AGTTGCAAGGCGAGTGGATACACCTTCACTTCATACCATATAC AATGGGTTCGGCAGGCGCCTGGTCAACGGCTGGAATGGATGGG CTGGATTTATCCCGGAGATGGTTCCACGCAGTACAATGAGAAA TTCAAAGGGAGAGTGACAATCACCCGAGATACCAGTGCCTCTA CGGCATATATGGAACTGAGTAGTCTGCGGTCTGAAGATACGGC GGTGTATTATTGTGCGAGAGAAGGGACGTACTACGCCATGGAT TATTGGGGACAAGGAACAACAGTCACAGTCTCCAGCGTTGATT CCTCAGGCGGGGGCGGAAGTGGGGGCGGCGGATCTGGCGGCGG CGGGTCTACGTCTGACGTGGTCATGACCCAATCTCCATTGTCT TTGCCAGTTACTCTGGGACAGCCTGCAAGTATCAGTTGCCGAT CCTCCCAATCTATCGTCCATTCAAACGGGAACACTTATTTGGA ATGGTTTCAACAGAGACCTGGGCAAAGTCCGCGCCGACTGATA TATAAGGTCAGTAACCGCTTTTCAGGCGTCCCCGATCGATTCA GTGGATCTGGGTCAGGGACTGACTTCACTCTGAAAATATCAAG AGTCGAAGCTGAAGATGTCGGAGTATATTACTGTTTCCAGGGG TCTCACGTCCCTCGGACGTTTGGAGGCGGAACTAAGGTTGAGA

TAAAA H1_k2_NT 140 ATGGATTTTCAGGTTCAAATCTTTAGCTTTCTCTTGATTTCCG

CCTCCGTAATAATGAGTCGGGCCAGTCAGGTACAGCTCGTTCA ATCTGGGGCTGAAGTAAAAAAGCCTGGAGCGTCTGTAAAGGTA TCTTGCAAAGCGAGCGGCTACACATTCACAAGTTATCACATCC AATGGGTGAGACAGGCCCCAGGACAACGCTTGGAGTGGATGGG GTGGATTTACCCTGGCGACGGCAGCACACAGTACAATGAGAAA TTTAAAGGCCGGGTGACTATCACTCGGGACACCTCCGCCAGCA CGGCTTATATGGAGCTTAGCAGTTTGAGATCCGAAGATACAGC GGTATATTACTGCGCGAGAGAAGGAACGTACTACGCTATGGAC TATTGGGGTCAGGGCACAACCGTTACAGTCTCCTCTGTGGACA GCTCCGGAGGTGGGGGTTCAGGAGGGGGTGGAAGCGGTGGTGG TGGCAGTACAAGCGATATAGTAATGACCCAAACCCCGCTCTCT CTGAGCGTCACGCCAGGACAACCAGCATCAATCTCTTGCCGCA GTAGTCAATCCATCGTTCACTCTAATGGAAACACATACCTTGA GTGGTATCTTCAGAAACCAGGTCAGAGCCCTCAGCTCCTCATC TATAAAGTCTCTAACCGGTTCTCAGGTGTTCCGGACCGGTTCA GTGGTTCCGGCTCAGGAACAGACTTCACCTTGAAGATCAGTCG AGTAGAAGCCGAAGACGTGGGTGTATATTATTGCTTTCAGGGT TCCCACGTTCCGCGCACCTTCGGCGGCGGGACCAAAGTTGAGA

TCAAA H2_k1_NT 141 ATGGACTTTCAAGTCCAAATCTTCTCATTCCTCCTGATCTCTG

CGTCAGTAATCATGTCCAGAGCGTCACAAGTGCAACTCGTTCA ATCCGGAGCTGAGGTAAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAGTC TCCTGCAAAGCGAGCGGCTACACGTTCACCTCATATCACATTC AATGGGTAAGACAAGCACCTGGGCAACGACTCGAGTGGATGGG GTGGATCTACCCTGGGGACGGGAGCACGCAGTATAATGAGAAA TTCAAAGGCAGGGTTACAATTACAGCCGATACCAGTGCATCTA CGGCTTATATGCTCCTCTCCTCACTCCGGTCTGAGGACACAGC GGTTTATTATTGCGCACGGGAGGGAACGTACTACGCGATGGAC TATTGGGGGCAAGGCACCACAGTTACAGTGAGCTCAGTTGACT CATCAGGAGGCGGAGGATCAGGGGGAGGTGGTAGTGGGGGCGG TGGGAGCACATCAGATGTTGTCATGACTCAGAGCCCACTTTCT TTGCCGGTGACGCTGGGGCAGCCCGCTTCAATCTCTTGCCGCT CATCACAGTCTATCGTTCATAGCAATGGTAACACTTACTTGGA ATGGTTCCAACAAAGACCGGGTCAAAGTCCACGGCGCTTGATA TATAAAGTATCAAATAGATTTTCAGGGGTGCCTGATCGGTTCA GCGGTTCTGGATCTGGCACCGACTTCACGCTTAAAATAAGTAG GGTAGAAGCCGAAGACGTGGGAGTGTATTATTGTTTCCAGGGG TCACACGTCCCTCGCACGTTCGGCGGAGGCACTAAAGTGGAGA

TCAAA H2_k2_NT 142 ATGGACTTTCAAGTCCAAATCTTCAGCTTTCTCCTTATATCTG

CGTCTGTCATTATGAGTAGAGCAAGTCAAGTCCAGCTCGTACA AAGTGGAGCTGAGGTGAAAAAGCCGGGCGCGAGTGTGAAAGTC TCATGCAAGGCGAGTGGATACACCTTTACCTCTTACCACATTC AATGGGTGCGGCAGGCGCCTGGGCAGCGCTTGGAATGGATGGG CTGGATATATCCTGGCGACGGAAGTACCCAGTACAACGAAAAA TTCAAAGGTAGGGTTACCATCACTGCTGATACCTCCGCGTCCA CTGCTTATATGCTTCTTAGCTCCTTGCGAAGCGAGGATACAGC CGTGTATTATTGTGCCAGAGAGGGGACTTATTATGCCATGGAC TATTGGGGTCAGGGTACAACGGTCACTGTCTCATCTGTTGACA GTAGCGGGGGAGGGGGGTCTGGAGGAGGGGGTTCCGGGGGGGG AGGTTCCACGAGCGATATAGTTATGACGCAAACGCCCTTGAGC CTCAGTGTTACACCCGGTCAACCTGCCTCTATTAGCTGTCGCT CCTCCCAATCAATTGTGCATAGCAATGGAAATACCTACCTTGA ATGGTATCTCCAAAAGCCCGGGCAGAGTCCTCAACTTCTCATC TACAAAGTATCCAATCGATTCAGTGGCGTTCCTGACAGGTTCA GCGGAAGTGGGTCAGGGACCGATTTTACCCTCAAAATTAGTCG CGTCGAAGCTGAGGATGTTGGGGTGTATTACTGCTTCCAAGGG TCACACGTACCACGCACATTCGGGGGAGGCACGAAGGTTGAAA

TTAAG H1_k3_NT 143 ATGGATTTCCAAGTCCAAATATTCAGTTTCCTTTTGATAAGTG

CTTCAGTTATCATGTCCCGAGCAAGCCAGGTACAGCTTGTGCA AAGCGGGGCGGAAGTTAAGAAACCGGGAGCCTCAGTTAAAGTA TCTTGCAAAGCCAGCGGTTATACATTCACTTCATACCACATAC AGTGGGTGCGCCAAGCACCGGGGCAGAGACTGGAATGGATGGG ATGGATTTATCCCGGTGATGGTAGTACGCAATACAATGAAAAA TTCAAAGGAAGGGTGACTATCACGCGAGACACAAGCGCGTCCA CGGCCTATATGGAACTGAGCAGTCTGAGATCCGAGGACACCGC TGTGTATTATTGCGCCCGAGAGGGGACCTACTACGCCATGGAT TATTGGGGTCAAGGGACCACTGTGACAGTCTCTTCTGTCGATT CCAGCGGCGGAGGAGGGAGTGGAGGGGGTGGGTCCGGGGGGGG AGGGTCTACGAGCGACATTGTCATGACACAGACGCCGCTTAGC TCCCCAGTTACACTCGGACAGCCCGCAAGTATTAGTTGCAGAA GTAGCCAGTCTATCGTACATTCAAATGGAAACACCTATTTGGA ATGGTATCAACAACGGCCTGGACAGCCGCCCAGGCTGCTCATA TACAAAGTCTCCAACCGCTTCAGCGGAGTACCCGACCGCTTTT CCGGCTCCGGAGCAGGAACTGACTTTACCTTGAAAATTAGTAG GGTCGAAGCAGAGGATGTCGGGGTATATTATTGTTTCCAAGGT AGTCATGTCCCACGGACGTTTGGTGGTGGGACGAAGGTTGAGA

TCAAA H1_k4_NT 144 ATGGACTTCCAGGTGCAGATATTTTCCTTTCTTCTCATATCTG

CATCTGTAATAATGTCAAGGGCCAGCCAGGTCCAGCTCGTTCA AAGCGGAGCCGAGGTAAAAAAACCAGGCGCTTCCGTCAAGGTA TCATGCAAAGCGTCCGGCTATACCTTCACAAGTTACCATATCC AATGGGTTCGACAGGCACCCGGACAAAGACTTGAATGGATGGG TTGGATATACCCCGGAGACGGCTCCACTCAGTATAACGAAAAG TTTAAGGGGAGAGTCACGATCACTAGGGACACATCAGCTTCTA CGGCGTATATGGAACTCAGTTCTTTGCGATCCGAGGATACTGC CGTATATTACTGCGCCAGAGAAGGCACGTACTACGCAATGGAT TACTGGGGGCAAGGGACAACTGTTACCGTCTCAAGCGTCGATT CATCAGGAGGCGGAGGGTCCGGAGGTGGGGGATCTGGCGGTGG GGGTTCTACGTCCGATGTTGTGATGACACAGTCCCCACTCTCT CTTCCAGTGACGCTGGGACAGCCCGCGAGCATCTCCTGTCGCA GCTCTCAGTCCATAGTACACAGTAATGGTAACACCTATCTTGA GTGGTATCAGCAACGACCCGGTCAGTCTCCCAGGTTGCTTATT TATAAGGTTAGTAACCGCTTTTCAGGTGTTCCAGACAGATTTA GCGGGAGTGGTTCCGGTACGGATTTCACATTGAAAATCAGCCG CGTCGAAGCCGAGGACGTGGGTGTTTACTACTGCTTCCAGGGA TCTCACGTACCGAGGACCTTCGGCGGAGGAACGAAAGTAGAAA

TTAAG H1_k5_NT 145 ATGGATTTTCAAGTACAAATCTTTTCCTTCCTGCTTATTTCCG

CAAGCGTTATTATGAGTAGAGCCAGCCAAGTACAACTGGTACA GTCCGGCGCGGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCAAGTGTGAAGGTA TCTTGCAAGGCGTCAGGCTATACCTTTACTTCATACCATATAC AGTGGGTGCGACAGGCTCCCGGCCAGCGACTCGAATGGATGGG CTGGATTTATCCCGGAGATGGATCTACGCAGTATAATGAGAAA TTCAAGGGTCGGGTCACGATTACACGAGACACGAGTGCTTCCA CAGCTTATATGGAACTTTCTAGCCTGAGGTCTGAGGATACTGC CGTTTACTATTGTGCACGAGAAGGGACATACTATGCGATGGAT TACTGGGGACAGGGCACCACTGTCACAGTTTCCAGCGTGGACT CAAGTGGAGGCGGTGGATCTGGTGGTGGCGGGTCCGGGGGGGG AGGCAGCACCAGTGACATTGTAATGACTCAAACACCTCTCAGT AGCCCAGTCACTCTCGGTCAGCCGGCGAGTATCTCTTTTAGGT CCTCACAATCTATAGTGCACTCTAACGGCAATACTTATCTTGA ATGGTATCAACAAAGACCGGGGCAGCCACCTCGCCTTCTCATC TACAAAGTAAGCAATCGCTTCTCCGGTGTCCCCGATCGCTTCT CCGGTTCAGGAGCAGGAACTGACTTCACATTGAAGATTTCCAG AGTGGAGGCCGAAGACGTAGGGGTATATTATTGCTTTCAAGGG TCCCATGTGCCCAGAACCTTTGGGGGAGGAACGAAAGTTGAGA

TTAAA H3_k2_NT 146 ATGGATTTCCAAGTGCAGATTTTCTCTTTTCTCCTCATAAGCG

CCTCCGTAATTATGTCTAGAGCTAGTCAAGTCCAATTGGTGCA ATCCGGTGCCGAGGTTAAAAAGCCCGGCGCAAGTGTAAAAGTC TCCTGTAAGGCCAGTGGCTACACTTTCACCAGCTACCATATAC AGTGGGTGCGGCAGGCGCCTGGTCAGGGTCTGGAGTGGATGGG TATTTGGATTTATCCCGGAGATGGAAGTACTCAATACAATGAG AAATTCAAGGGTGTCACTATGACAAGGGATACGAGCACTTCTA CCGTATATATGGAGTTGTCATCTTTGCGATCAGAGGATACCGC TGTATATTATTGCGCACGGGAAGGTACATATTATGCCATGGAC TACTGGGGCCAAGGAACCACCGTGACGGTAAGCTCTGTCGATT CTAGCGGTGGCGGGGGCTCTGGCGGTGGGGGTAGCGGGGGTGG CGGATCTACATCAGATATTGTAATGACACAGACCCCTCTTTCA CTTTCCGTAACGCCAGGACAGCCGGCATCAATAAGTTGCCGAT CAAGCCAGTCTATCGTACACTCCAATGGTAACACATACTTGGA ATGGTATCTTCAAAAGCCCGGCCAGAGCCCGCAGCTTTTGATA TATAAAGTGTCCAACAGATTCAGTGGGGTGCCGGACCGCTTTA GTGGATCTGGTTCAGGAACGGACTTCACATTGAAAATTAGTAG AGTTGAAGCGGAAGACGTGGGAGTCTACTACTGTTTCCAGGGT TCACATGTGCCTCGGACCTTTGGGGGAGGCACCAAGGTTGAGA

TAAAA H3_k3_NT 147 ATGGACTTCCAAGTCCAAATCTTTTCTTTTTTGTTGATAAGCG

CATCAGTTATTATGTCTCGCGCCAGTCAAGTACAACTGGTGCA GTCCGGAGCTGAAGTGAAAAAACCAGGAGCAAGCGTGAAAGTA AGTTGTAAGGCAAGTGGTTACACTTTCACAAGCTACCATATTC AATGGGTCCGACAGGCTCCTGGACAGGGCTTGGAGTGGATGGG CATATGGATTTACCCTGGTGACGGGTCCACCCAGTATAATGAA AAGTTCAAGGGAGTCACGATGACCAGGGACACCTCTACATCTA CCGTGTATATGGAGCTCTCTAGTTTGCGATCCGAAGACACTGC CGTTTATTACTGTGCAAGAGAAGGAACTTATTACGCGATGGAC TACTGGGGTCAGGGGACAACAGTCACCGTTAGCTCCGTCGATT CCAGCGGGGGAGGTGGCTCAGGCGGGGGTGGTTCTGGGGGGGG CGGGAGCACTTCAGATATTGTAATGACCCAAACCCCACTGAGT AGTCCAGTCACGCTTGGTCAACCGGCAAGCATTTCTTGCAGGA GCTCTCAGAGTATTGTCCACTCTAACGGGAATACATATTTGGA GTGGTATCAGCAAAGACCGGGCCAACCACCACGCCTCTTGATT TATAAGGTGAGCAATAGGTTTTCAGGCGTGCCAGATAGGTTCT CAGGCTCCGGAGCGGGAACCGACTTCACCCTCAAGATAAGTCG GGTGGAAGCCGAAGACGTAGGAGTTTACTACTGCTTTCAAGGA TCTCATGTTCCACGAACGTTTGGAGGAGGAACCAAGGTGGAAA

TAAAA H3_k4_NT 148 ATGGACTTTCAGGTCCAAATTTTTTCCTTCTTGCTCATATCCG

CGAGTGTCATCATGTCAAGAGCAAGTCAAGTTCAACTCGTTCA ATCAGGAGCTGAGGTGAAAAAACCAGGGGCGTCTGTCAAAGTA AGCTGCAAAGCATCAGGGTATACGTTCACGAGTTATCATATCC AGTGGGTTAGGCAGGCGCCAGGGCAGGGATTGGAATGGATGGG TATCTGGATTTACCCGGGTGACGGCAGCACTCAATACAATGAG AAATTCAAAGGCGTAACAATGACAAGGGACACGAGCACAAGCA CAGTGTACATGGAGCTTAGCTCTTTGAGGTCAGAGGATACCGC TGTTTACTATTGTGCTCGGGAGGGTACTTACTATGCAATGGAC TACTGGGGGCAAGGCACGACCGTTACAGTGAGTAGCGTAGATT CCTCCGGGGGTGGCGGTTCAGGCGGCGGAGGCTCAGGCGGAGG AGGGTCAACATCCGATGTCGTAATGACTCAGTCCCCTCTGTCA TTGCCGGTGACTTTGGGACAGCCAGCGTCTATATCTTGTAGGT CCTCTCAATCAATAGTGCATTCCAACGGTAACACCTATCTGGA ATGGTATCAGCAAAGGCCAGGACAAAGTCCACGCCTGCTTATA TATAAGGTGTCTAATCGATTCAGTGGGGTTCCCGATAGGTTTT CCGGCTCTGGTAGCGGGACTGATTTCACGTTGAAAATATCACG CGTGGAAGCGGAAGATGTTGGGGTCTATTACTGCTTTCAGGGT AGTCATGTCCCTCGAACTTTTGGCGGTGGTACAAAGGTAGAAA

TCAAA H3_k5_NT 149 ATGGATTTTCAGGTACAGATATTCTCATTTCTCCTTATCTCAG

CTAGTGTCATAATGTCCAGGGCGAGTCAAGTACAACTTGTCCA GTCAGGCGCAGAGGTCAAGAAGCCGGGCGCAAGCGTTAAGGTT TCCTGCAAAGCATCCGGCTATACATTCACGTCCTATCACATCC AATGGGTCAGGCAAGCACCCGGTCAAGGACTTGAGTGGATGGG CATCTGGATTTACCCTGGAGATGGCAGTACTCAGTACAACGAA AAATTCAAAGGTGTAACCATGACCCGCGACACATCTACTTCCA CAGTTTATATGGAACTCAGCAGTTTGCGGAGCGAAGATACCGC TGTTTACTACTGTGCCCGAGAGGGAACTTACTACGCCATGGAC TATTGGGGTCAAGGAACGACAGTAACAGTTAGTTCTGTAGATT CCAGTGGCGGCGGTGGGAGCGGGGGTGGGGGATCTGGCGGAGG CGGAAGTACAAGTGACATCGTTATGACTCAGACACCCCTTAGT AGTCCCGTTACGTTGGGCCAACCCGCGAGCATTTCCTTTCGAT CCTCTCAGTCTATAGTTCACTCAAATGGGAATACTTATTTGGA GTGGTATCAACAGCGCCCCGGACAACCACCAAGGCTCCTGATA TACAAGGTGTCCAATCGATTCTCTGGGGTGCCTGATAGATTTA GCGGAAGTGGAGCCGGTACAGATTTTACCCTGAAAATATCACG GGTAGAAGCCGAAGATGTCGGCGTCTACTACTGTTTCCAGGGT TCCCATGTACCGCGAACGTTCGGGGGCGGAACAAAAGTTGAGA TCAAG

H4_k2_NT 150 ATGGATTTCCAGGTTCAGATATTTAGTTTCCTCTTGATTTCTG

CCAGTGTCATCATGAGCAGGGCTTCCCAAGTTCAGTTGGTGCA AAGTGGCGCTGAAGTCAAAAAACCTGGGGCTTCCGTTAAAGTA TCTTGCAAGGCGTCCGGCTACACTTTCACATCCTACCACATTC AATGGGTCCGGCAAGCGCCCGGTCAGGGGCTCGAATGGATGGG GTGGATATACCCAGGAGATGGATCTACTCAGTACAACGAGAAA TTTAAAGGACGGGTGACGATGACGCGCGACACTTCAATAAGCA CTGCATACATGGAACTGTCCCGGCTTAGGTCAGATGACACCGC GGTCTACTATTGTGCGAGAGAGGGTACTTACTATGCTATGGAC TACTGGGGGCAAGGCACGACGGTTACAGTTTCCTCAGTCGATA GTTCAGGCGGAGGCGGCTCCGGGGGCGGTGGTAGTGGAGGGGG TGGATCTACTTCCGACATTGTCATGACCCAGACCCCGTTGAGC CTTTCAGTGACGCCCGGTCAACCCGCCAGCATAAGTTGTCGAT CAAGCCAGTCTATTGTACACTCCAATGGAAACACATATTTGGA GTGGTATCTCCAAAAACCCGGCCAAAGCCCTCAACTGCTCATC TACAAGGTCTCAAACAGGTTTAGCGGGGTCCCGGATCGCTTCT CAGGGTCAGGATCTGGTACGGACTTTACACTGAAAATTTCCCG AGTCGAAGCGGAAGACGTGGGTGTATATTACTGCTTCCAGGGG AGTCATGTTCCAAGAACCTTTGGGGGAGGTACAAAGGTCGAAA

TAAAA H4_k3_NT 151 ATGGATTTTCAGGTCCAAATTTTTTCCTTCTTGCTTATCAGCG

CAAGTGTAATCATGTCCCGCGCGTCCCAAGTACAACTTGTGCA ATCTGGCGCGGAGGTGAAAAAACCTGGAGCTTCCGTCAAGGTT TCTTGTAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACGTCCTACCACATTC AGTGGGTTCGACAGGCGCCGGGCCAAGGACTGGAGTGGATGGG ATGGATATATCCAGGAGATGGTTCTACTCAGTATAATGAGAAA TTCAAGGGTCGCGTAACAATGACGAGGGATACATCAATCTCCA CCGCGTACATGGAACTTTCAAGACTCCGGTCAGATGACACGGC GGTTTACTACTGTGCTCGGGAGGGCACTTACTATGCTATGGAC TACTGGGGGCAAGGGACAACGGTAACGGTATCTAGTGTGGATT CTAGTGGCGGCGGCGGTTCAGGAGGAGGTGGTTCAGGCGGGGG GGGTAGTACAAGTGATATTGTGATGACCCAAACACCCCTTTCT AGCCCTGTTACTCTGGGTCAACCCGCGTCCATAAGTTGTCGAA GTAGTCAATCCATCGTGCATAGCAACGGCAACACTTACCTTGA ATGGTATCAACAACGACCCGGACAGCCCCCGCGACTGCTTATC TATAAAGTATCAAACAGGTTCAGTGGCGTGCCAGATCGATTCT CCGGCTCTGGGGCAGGCACAGATTTCACGTTGAAAATTTCTCG GGTCGAGGCCGAGGACGTGGGCGTTTATTACTGTTTCCAGGGG AGTCACGTCCCCAGGACGTTCGGAGGAGGAACTAAAGTCGAAA

TAAAG H4_k4_NT 152 ATGGACTTCCAGGTCCAAATATTCAGCTTCCTCCTCATTTCCG

CCAGTGTAATAATGTCCAGAGCCTCACAAGTACAGTTGGTTCA GAGCGGGGCTGAGGTTAAGAAACCAGGCGCGAGCGTCAAGGTA TCCTGCAAGGCGAGTGGTTATACTTTCACTAGTTATCACATTC AGTGGGTCCGACAGGCCCCCGGTCAAGGCCTGGAGTGGATGGG GTGGATATATCCGGGAGATGGTTCTACCCAATATAATGAGAAG TTTAAGGGGAGAGTCACAATGACAAGGGACACCAGTATTAGCA CCGCGTATATGGAGCTTTCCCGCCTGCGATCAGATGACACGGC CGTGTACTACTGTGCTAGGGAGGGAACCTATTATGCGATGGAT TACTGGGGACAGGGTACTACAGTCACGGTCTCTAGCGTGGACA GTTCCGGGGGCGGTGGAAGCGGTGGTGGCGGTTCAGGTGGAGG AGGCTCTACGAGTGATGTTGTGATGACTCAGTCCCCGCTTTCA CTTCCCGTCACCCTTGGGCAACCCGCAAGCATCTCATGCCGAT CCTCCCAGTCTATAGTACATAGTAATGGCAACACATATCTTGA ATGGTATCAGCAGAGGCCGGGTCAGTCTCCCCGACTCCTTATA TATAAAGTGAGCAACAGATTCTCCGGAGTACCGGATAGATTTT CCGGCTCTGGGAGCGGCACCGACTTTACACTGAAAATTTCACG GGTTGAAGCTGAAGATGTTGGGGTATACTATTGTTTCCAGGGT TCTCACGTCCCGAGGACATTCGGGGGAGGAACGAAAGTCGAAA

TAAAG H4_k5_NT 153 ATGGATTTTCAGGTACAAATCTTCAGCTTCCTGCTCATCTCCG

CGAGCGTAATCATGTCTAGGGCGTCCCAGGTGCAGTTGGTGCA ATCAGGTGCAGAGGTGAAGAAGCCTGGTGCATCCGTTAAAGTA AGTTGTAAGGCAAGCGGATATACTTTTACATCCTATCATATTC AATGGGTCAGACAAGCACCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATGGG CTGGATCTATCCAGGCGATGGCTCAACTCAATATAACGAGAAG TTCAAGGGGAGGGTTACTATGACCAGGGATACGTCTATTTCCA CTGCGTACATGGAACTCTCCAGGTTGAGAAGTGATGATACCGC GGTTTACTACTGCGCTAGAGAAGGAACGTACTACGCTATGGAT TACTGGGGGCAGGGTACAACTGTCACCGTCTCAAGTGTGGATT CTTCTGGGGGTGGGGGATCAGGAGGGGGAGGCTCCGGTGGGGG CGGGTCAACCAGCGACATTGTCATGACTCAAACCCCCCTGAGC AGCCCTGTCACCCTGGGTCAGCCTGCCTCAATATCCTTTAGAA GCTCCCAAAGCATCGTCCATTCAAATGGTAATACCTATCTGGA GTGGTATCAGCAAAGGCCTGGTCAACCCCCGCGCCTTCTCATT TACAAGGTGTCAAACAGGTTCTCCGGCGTACCGGATAGGTTTT CCGGAAGCGGTGCTGGAACCGACTTTACTCTCAAAATCTCTAG GGTGGAAGCTGAGGACGTCGGTGTATACTATTGTTTTCAAGGC TCCCATGTTCCCAGGACATTTGGTGGGGGAACGAAGGTAGAAA

TCAAG H5_k2_NT 154 ATGGACTTTCAGGTTCAGATTTTCTCTTTCTTGTTGATCTCCG

CTAGTGTCATAATGTCACGGGCAAGTCAGGTACAACTCGTTCA GAGTGGTGCCGAAGTGAAGAAACCGGGTGCCTCCGTAAAGGTG TCATGTAAAGCTAGTGGCTATACATTCACAAGTTATCATATCC AATGGGTACGACAAGCACCGGGACAGCGACTGGAATGGATGGG ATGGATCTATCCTGGGGACGGATCTACACAGTACAATGAGAAA TTTAAGGGACGGGTCACGATAACCAGGGACACATCTGCTTCCA CGGCTTACATGGAGCTTTCCTCCCTGCGGAGCGAGGACATGGC TGTTTACTATTGCGCTCGCGAAGGGACATACTACGCAATGGAT TATTGGGGCCAAGGCACTACCGTGACGGTCTCTTCTGTCGATA GTTCCGGAGGAGGTGGTTCAGGGGGAGGCGGTTCAGGTGGGGG TGGATCTACCTCAGATATTGTCATGACACAGACACCTTTGTCC TTGAGTGTGACACCGGGTCAACCGGCGAGTATAAGCTGTCGCA GCTCACAATCTATTGTGCATAGCAACGGGAATACATATCTCGA ATGGTATCTCCAAAAGCCGGGCCAATCCCCCCAACTTCTCATT TACAAAGTTTCTAATCGATTTTCAGGTGTACCAGATCGGTTTT CCGGGTCTGGCTCAGGTACTGACTTCACCTTGAAAATATCAAG GGTTGAAGCTGAGGATGTAGGTGTGTACTATTGCTTCCAGGGG TCTCACGTTCCTCGGACTTTTGGGGGGGGCACAAAAGTAGAGA

TTAAA H5_k3_NT 155 ATGGATTTCCAGGTGCAAATCTTCTCATTTCTTTTGATAAGTG

CGTCAGTGATAATGTCTCGGGCCAGTCAAGTACAGCTTGTCCA AAGTGGCGCTGAAGTCAAGAAGCCGGGAGCCTCAGTTAAGGTT AGCTGCAAGGCCTCAGGGTATACTTTTACCTCCTATCATATAC AGTGGGTACGACAAGCACCGGGACAGCGACTGGAGTGGATGGG TTGGATATATCCGGGAGATGGTTCAACCCAGTATAATGAGAAG TTCAAGGGGCGAGTTACGATAACCCGCGATACGAGTGCATCAA CAGCGTACATGGAGTTGAGTTCCCTCCGCAGCGAGGACATGGC GGTATACTATTGTGCCAGGGAGGGGACTTATTATGCCATGGAC TACTGGGGGCAGGGCACAACCGTAACAGTCTCTTCTGTAGACA GTTCAGGAGGGGGCGGAAGTGGAGGTGGCGGATCTGGTGGAGG TGGATCTACTTCCGACATCGTTATGACCCAAACACCACTTTCA TCTCCCGTTACTCTCGGGCAACCTGCTAGTATTTCCTGTAGAT CCTCACAATCTATAGTACATAGCAATGGCAATACCTACCTGGA GTGGTATCAACAACGCCCAGGCCAACCACCTCGCCTGCTTATC TATAAAGTAAGCAATAGATTCAGTGGTGTACCGGATAGGTTCT CTGGTTCCGGAGCAGGAACTGACTTTACACTCAAAATCAGTAG GGTGGAGGCGGAAGACGTGGGAGTATATTATTGCTTTCAAGGT TCACATGTACCTCGAACATTTGGCGGAGGAACTAAGGTTGAGA

TTAAA H5_k4_NT 156 ATGGATTTCCAAGTCCAGATATTCAGTTTTCTTTTGATAAGCG

CTTCTGTAATCATGTCTCGGGCGTCCCAAGTACAACTGGTGCA ATCAGGGGCAGAAGTGAAAAAACCAGGTGCATCCGTTAAGGTG AGTTGCAAGGCTTCCGGCTATACCTTTACATCATATCATATTC AATGGGTCAGGCAAGCACCTGGTCAGCGATTGGAATGGATGGG TTGGATATATCCTGGTGATGGGTCTACACAATATAACGAAAAA TTCAAGGGGCGAGTGACCATCACAAGAGATACATCAGCGTCAA CAGCGTATATGGAACTGTCATCCCTTAGATCAGAGGACATGGC GGTCTATTACTGTGCCAGAGAAGGCACTTATTATGCAATGGAT TATTGGGGACAAGGAACCACTGTCACTGTTTCCAGCGTAGACT CCTCCGGTGGTGGTGGAAGTGGCGGCGGTGGGTCAGGAGGGGG TGGGTCAACTTCTGATGTAGTGATGACACAGAGCCCTCTGAGC TTGCCTGTGACCTTGGGTCAGCCGGCCTCAATAAGTTGTCGAT CTAGTCAGTCAATCGTCCATAGTAATGGGAACACATACCTTGA ATGGTATCAGCAAAGACCTGGACAATCTCCACGACTCCTTATA TACAAAGTTAGCAACCGATTTAGCGGAGTGCCAGACCGCTTTT CTGGTTCCGGGTCTGGCACAGATTTTACCCTTAAGATCTCCCG CGTGGAGGCGGAAGACGTTGGTGTTTACTATTGCTTCCAGGGG TCACACGTTCCACGCACCTTTGGAGGAGGTACGAAGGTCGAGA

TTAAG H5_k5_NT 157 ATGGATTTTCAAGTACAGATCTTCTCTTTCTTGCTTATTTCAG

CGAGCGTAATCATGAGTAGGGCATCTCAAGTTCAACTCGTTCA GTCAGGTGCTGAGGTAAAAAAACCAGGGGCTTCCGTTAAAGTT AGCTGTAAGGCATCTGGGTACACATTTACTAGCTACCATATCC AGTGGGTGCGACAAGCCCCGGGGCAGCGCTTGGAATGGATGGG CTGGATTTACCCAGGTGACGGCTCCACGCAATATAATGAGAAA TTTAAGGGTAGAGTTACTATTACCAGGGACACAAGTGCTTCAA CTGCCTATATGGAACTGAGCAGCCTTCGGAGTGAAGATATGGC CGTATATTACTGCGCAAGGGAGGGGACTTACTATGCAATGGAC TACTGGGGTCAGGGAACGACTGTGACCGTGTCCTCAGTTGACT CCAGCGGTGGTGGCGGCTCTGGAGGTGGGGGTTCCGGCGGAGG CGGAAGCACATCTGATATAGTGATGACGCAAACGCCTCTTTCT TCCCCGGTAACTCTGGGACAGCCAGCGTCAATTTCATTTAGGT CCTCCCAGTCAATCGTACATAGTAATGGAAATACTTACCTGGA ATGGTATCAACAACGACCAGGGCAACCGCCCCGATTGTTGATC TATAAAGTGAGCAATCGCTTTTCTGGCGTGCCCGATCGGTTCT CAGGGTCTGGAGCTGGGACTGACTTCACATTGAAAATTTCCAG GGTTGAGGCCGAGGATGTGGGGGTTTATTACTGCTTCCAAGGC TCCCACGTCCCCCGCACCTTCGGAGGGGGAACCAAAGTCGAAA

TAAAG H6_k2_NT 158 ATGGATTTTCAAGTTCAGATATTCTCATTTTTGCTTATATCAG

CCTCCGTAATTATGTCACGGGCAAGTCAAGTTCAGTTGGTGCA GTCCGGAGCAGAAGTTAAGAAGCCCGGTGCTTCTGTGAAAGTC TCCTGCAAAGCGTCTGGGTACACCTTCACGAGCTACCATATAC AGTGGGTCCGGCAAGCGCCTGGGCAGAGGCTGGAGTGGATGGG CTGGATTTACCCAGGAGATGGGAGTACAAAGTATAGTCAGAAG TTTCAAGGGCGAGTGACGATAACCAGAGATACGAGTGCAAGTA CTGCATACATGGAACTGAGCTCCTTGAGGTCCGAGGATACAGC GGTGTACTATTGCGCTCGGGAAGGGACATATTATGCTATGGAC TATTGGGGACAAGGGACAACGGTAACGGTGAGTTCCGTCGATT CCTCAGGTGGCGGAGGCAGTGGGGGCGGGGGTTCCGGCGGTGG CGGGTCCACGAGTGATATAGTTATGACACAGACCCCCCTCAGC CTTTCTGTGACCCCAGGACAACCCGCTAGTATCTCTTGCCGCA GTTCTCAGTCCATAGTACACAGTAACGGAAATACCTATCTTGA GTGGTATCTTCAAAAGCCCGGCCAGAGCCCTCAACTCTTGATA TATAAAGTGTCAAATCGATTTTCAGGTGTGCCTGATCGATTCT CAGGGTCTGGTTCAGGGACAGATTTCACGCTTAAGATAAGCAG AGTAGAGGCTGAAGACGTGGGAGTCTACTATTGTTTTCAGGGG TCACACGTTCCCCGCACTTTTGGTGGGGGAACCAAGGTGGAAA TCAAA

Dobradiça 159 TCTTCAGCGCTGAGCAACTCCATCATGTACTTCAGCCACTGGC CD8 TGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCC

GCGACCACCAACACCGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG

GGGGGGGGGGGGGGGGG CD28 TM 160 TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATA

GCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG CD28 IC 161 AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACA

TGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCC

CTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC CD3z 162 AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGC

AGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAG AGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCT GAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCC TGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAG TGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCAC GATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCT

ACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC CAR_H1_k1 163 ATGGATTTCCAAGTTCAAATCTTCAGTTTCTTGCTTATCAGTG _NT CTTCTGTTATTATGTCACGAGCAAGTCAAGTTCAACTCGTACA

GTCTGGAGCCGAGGTGAAAAAACCGGGAGCGTCCGTGAAAGTG AGTTGCAAGGCGAGTGGATACACCTTCACTTCATACCATATAC AATGGGTTCGGCAGGCGCCTGGTCAACGGCTGGAATGGATGGG CTGGATTTATCCCGGAGATGGTTCCACGCAGTACAATGAGAAA TTCAAAGGGAGAGTGACAATCACCCGAGATACCAGTGCCTCTA CGGCATATATGGAACTGAGTAGTCTGCGGTCTGAAGATACGGC GGTGTATTATTGTGCGAGAGAAGGGACGTACTACGCCATGGAT TATTGGGGACAAGGAACAACAGTCACAGTCTCCAGCGTTGATT CCTCAGGCGGGGGCGGAAGTGGGGGCGGCGGATCTGGCGGCGG CGGGTCTACGTCTGACGTGGTCATGACCCAATCTCCATTGTCT TTGCCAGTTACTCTGGGACAGCCTGCAAGTATCAGTTGCCGAT CCTCCCAATCTATCGTCCATTCAAACGGGAACACTTATTTGGA ATGGTTTCAACAGAGACCTGGGCAAAGTCCGCGCCGACTGATA TATAAGGTCAGTAACCGCTTTTCAGGCGTCCCCGATCGATTCA GTGGATCTGGGTCAGGGACTGACTTCACTCTGAAAATATCAAG AGTCGAAGCTGAAGATGTCGGAGTATATTACTGTTTCCAGGGG TCTCACGTCCCTCGGACGTTTGGAGGCGGAACTAAGGTTGAGA TAAAAAACCGGATCCGTGGGGTCACCGTCTCTTCAGCGCTGAG CAACTCCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCGGTCTTCCTG CCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACAC CGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGA GGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGG CTGGACCCCTTTGGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAG TCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTAT TTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGAC TACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGC ATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCG CTCCCTCGAGAGAGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGAC GCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGC TCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAG ACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAG AACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGA TGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCG GAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACA GCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGC

CCCCTCGC CAR_H1_k2 164 ATGGATTTTCAGGTTCAAATCTTTAGCTTTCTCTTGATTTCCG _NT CCTCCGTAATAATGAGTCGGGCCAGTCAGGTACAGCTCGTTCA

ATCTGGGGCTGAAGTAAAAAAGCCTGGAGCGTCTGTAAAGGTA TCTTGCAAAGCGAGCGGCTACACATTCACAAGTTATCACATCC AATGGGTGAGACAGGCCCCAGGACAACGCTTGGAGTGGATGGG GTGGATTTACCCTGGCGACGGCAGCACACAGTACAATGAGAAA TTTAAAGGCCGGGTGACTATCACTCGGGACACCTCCGCCAGCA CGGCTTATATGGAGCTTAGCAGTTTGAGATCCGAAGATACAGC GGTATATTACTGCGCGAGAGAAGGAACGTACTACGCTATGGAC TATTGGGGTCAGGGCACAACCGTTACAGTCTCCTCTGTGGACA GCTCCGGAGGTGGGGGTTCAGGAGGGGGTGGAAGCGGTGGTGG TGGCAGTACAAGCGATATAGTAATGACCCAAACCCCGCTCTCT CTGAGCGTCACGCCAGGACAACCAGCATCAATCTCTTGCCGCA GTAGTCAATCCATCGTTCACTCTAATGGAAACACATACCTTGA GTGGTATCTTCAGAAACCAGGTCAGAGCCCTCAGCTCCTCATC TATAAAGTCTCTAACCGGTTCTCAGGTGTTCCGGACCGGTTCA GTGGTTCCGGCTCAGGAACAGACTTCACCTTGAAGATCAGTCG AGTAGAAGCCGAAGACGTGGGTGTATATTATTGCTTTCAGGGT TCCCACGTTCCGCGCACCTTCGGCGGCGGGACCAAAGTTGAGA TCAAAAACCGGATCCGTGGGGTCACCGTCTCTTCAGCGCTGAG CAACTCCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCGGTCTTCCTG CCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACAC CGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGA GGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGG CTGGACCCCTTTGGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAG TCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTAT TTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGAC TACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGC ATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCG CTCCCTCGAGAGAGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGAC GCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGC TCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAG ACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAG AACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGA TGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCG GAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACA GCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGC

CCCCTCGC CAR_H2_k1 165 ATGGACTTTCAAGTCCAAATCTTCTCATTCCTCCTGATCTCTG _NT CGTCAGTAATCATGTCCAGAGCGTCACAAGTGCAACTCGTTCA

ATCCGGAGCTGAGGTAAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAGTC TCCTGCAAAGCGAGCGGCTACACGTTCACCTCATATCACATTC AATGGGTAAGACAAGCACCTGGGCAACGACTCGAGTGGATGGG GTGGATCTACCCTGGGGACGGGAGCACGCAGTATAATGAGAAA TTCAAAGGCAGGGTTACAATTACAGCCGATACCAGTGCATCTA CGGCTTATATGCTCCTCTCCTCACTCCGGTCTGAGGACACAGC GGTTTATTATTGCGCACGGGAGGGAACGTACTACGCGATGGAC TATTGGGGGCAAGGCACCACAGTTACAGTGAGCTCAGTTGACT CATCAGGAGGCGGAGGATCAGGGGGAGGTGGTAGTGGGGGCGG TGGGAGCACATCAGATGTTGTCATGACTCAGAGCCCACTTTCT TTGCCGGTGACGCTGGGGCAGCCCGCTTCAATCTCTTGCCGCT CATCACAGTCTATCGTTCATAGCAATGGTAACACTTACTTGGA ATGGTTCCAACAAAGACCGGGTCAAAGTCCACGGCGCTTGATA TATAAAGTATCAAATAGATTTTCAGGGGTGCCTGATCGGTTCA GCGGTTCTGGATCTGGCACCGACTTCACGCTTAAAATAAGTAG GGTAGAAGCCGAAGACGTGGGAGTGTATTATTGTTTCCAGGGG TCACACGTCCCTCGCACGTTCGGCGGAGGCACTAAAGTGGAGA TCAAAAACCGGATCCGTGGGGTCACCGTCTCTTCAGCGCTGAG CAACTCCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCGGTCTTCCTG CCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACAC CGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGA GGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGG CTGGACCCCTTTGGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAG TCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTAT TTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGAC TACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGC ATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCG CTCCCTCGAGAGAGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGAC GCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGC TCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAG ACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAG AACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGA TGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCG GAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACA GCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGC

CCCCTCGC CAR_H2_k2 166 ATGGACTTTCAAGTCCAAATCTTCAGCTTTCTCCTTATATCTG _NT CGTCTGTCATTATGAGTAGAGCAAGTCAAGTCCAGCTCGTACA

AAGTGGAGCTGAGGTGAAAAAGCCGGGCGCGAGTGTGAAAGTC TCATGCAAGGCGAGTGGATACACCTTTACCTCTTACCACATTC AATGGGTGCGGCAGGCGCCTGGGCAGCGCTTGGAATGGATGGG CTGGATATATCCTGGCGACGGAAGTACCCAGTACAACGAAAAA TTCAAAGGTAGGGTTACCATCACTGCTGATACCTCCGCGTCCA CTGCTTATATGCTTCTTAGCTCCTTGCGAAGCGAGGATACAGC CGTGTATTATTGTGCCAGAGAGGGGACTTATTATGCCATGGAC TATTGGGGTCAGGGTACAACGGTCACTGTCTCATCTGTTGACA GTAGCGGGGGAGGGGGGTCTGGAGGAGGGGGTTCCGGGGGGGG AGGTTCCACGAGCGATATAGTTATGACGCAAACGCCCTTGAGC CTCAGTGTTACACCCGGTCAACCTGCCTCTATTAGCTGTCGCT CCTCCCAATCAATTGTGCATAGCAATGGAAATACCTACCTTGA ATGGTATCTCCAAAAGCCCGGGCAGAGTCCTCAACTTCTCATC TACAAAGTATCCAATCGATTCAGTGGCGTTCCTGACAGGTTCA GCGGAAGTGGGTCAGGGACCGATTTTACCCTCAAAATTAGTCG CGTCGAAGCTGAGGATGTTGGGGTGTATTACTGCTTCCAAGGG TCACACGTACCACGCACATTCGGGGGAGGCACGAAGGTTGAAA TTAAGAACCGGATCCGTGGGGTCACCGTCTCTTCAGCGCTGAG CAACTCCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCGGTCTTCCTG CCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACAC CGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGA GGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGG CTGGACCCCTTTGGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAG TCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTAT TTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGAC TACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGC ATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCG CTCCCTCGAGAGAGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGAC GCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGC TCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAG ACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAG AACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGA TGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCG GAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACA GCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGC

CCCCTCGC CAR_H1_k3 167 ATGGATTTCCAAGTCCAAATATTCAGTTTCCTTTTGATAAGTG _NT CTTCAGTTATCATGTCCCGAGCAAGCCAGGTACAGCTTGTGCA

AAGCGGGGCGGAAGTTAAGAAACCGGGAGCCTCAGTTAAAGTA TCTTGCAAAGCCAGCGGTTATACATTCACTTCATACCACATAC AGTGGGTGCGCCAAGCACCGGGGCAGAGACTGGAATGGATGGG ATGGATTTATCCCGGTGATGGTAGTACGCAATACAATGAAAAA TTCAAAGGAAGGGTGACTATCACGCGAGACACAAGCGCGTCCA CGGCCTATATGGAACTGAGCAGTCTGAGATCCGAGGACACCGC TGTGTATTATTGCGCCCGAGAGGGGACCTACTACGCCATGGAT TATTGGGGTCAAGGGACCACTGTGACAGTCTCTTCTGTCGATT CCAGCGGCGGAGGAGGGAGTGGAGGGGGTGGGTCCGGGGGGGG AGGGTCTACGAGCGACATTGTCATGACACAGACGCCGCTTAGC TCCCCAGTTACACTCGGACAGCCCGCAAGTATTAGTTGCAGAA GTAGCCAGTCTATCGTACATTCAAATGGAAACACCTATTTGGA ATGGTATCAACAACGGCCTGGACAGCCGCCCAGGCTGCTCATA TACAAAGTCTCCAACCGCTTCAGCGGAGTACCCGACCGCTTTT CCGGCTCCGGAGCAGGAACTGACTTTACCTTGAAAATTAGTAG GGTCGAAGCAGAGGATGTCGGGGTATATTATTGTTTCCAAGGT AGTCATGTCCCACGGACGTTTGGTGGTGGGACGAAGGTTGAGA TCAAAAACCGGATCCGTGGGGTCACCGTCTCTTCAGCGCTGAG CAACTCCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCGGTCTTCCTG CCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACAC CGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGA GGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGG CTGGACCCCTTTGGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAG TCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTAT TTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGAC TACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGC ATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCG CTCCCTCGAGAGAGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGAC GCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGC TCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAG ACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAG AACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGA TGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCG GAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACA GCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGC CCCCTCGC

CAR_H1_k4 168 ATGGACTTCCAGGTGCAGATATTTTCCTTTCTTCTCATATCTG _NT CATCTGTAATAATGTCAAGGGCCAGCCAGGTCCAGCTCGTTCA

AAGCGGAGCCGAGGTAAAAAAACCAGGCGCTTCCGTCAAGGTA TCATGCAAAGCGTCCGGCTATACCTTCACAAGTTACCATATCC AATGGGTTCGACAGGCACCCGGACAAAGACTTGAATGGATGGG TTGGATATACCCCGGAGACGGCTCCACTCAGTATAACGAAAAG TTTAAGGGGAGAGTCACGATCACTAGGGACACATCAGCTTCTA CGGCGTATATGGAACTCAGTTCTTTGCGATCCGAGGATACTGC CGTATATTACTGCGCCAGAGAAGGCACGTACTACGCAATGGAT TACTGGGGGCAAGGGACAACTGTTACCGTCTCAAGCGTCGATT CATCAGGAGGCGGAGGGTCCGGAGGTGGGGGATCTGGCGGTGG GGGTTCTACGTCCGATGTTGTGATGACACAGTCCCCACTCTCT CTTCCAGTGACGCTGGGACAGCCCGCGAGCATCTCCTGTCGCA GCTCTCAGTCCATAGTACACAGTAATGGTAACACCTATCTTGA GTGGTATCAGCAACGACCCGGTCAGTCTCCCAGGTTGCTTATT TATAAGGTTAGTAACCGCTTTTCAGGTGTTCCAGACAGATTTA GCGGGAGTGGTTCCGGTACGGATTTCACATTGAAAATCAGCCG CGTCGAAGCCGAGGACGTGGGTGTTTACTACTGCTTCCAGGGA TCTCACGTACCGAGGACCTTCGGCGGAGGAACGAAAGTAGAAA TTAAGAACCGGATCCGTGGGGTCACCGTCTCTTCAGCGCTGAG CAACTCCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCGGTCTTCCTG CCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACAC CGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGA GGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGG CTGGACCCCTTTGGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAG TCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTAT TTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGAC TACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGC ATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCG CTCCCTCGAGAGAGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGAC GCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGC TCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAG ACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAG AACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGA TGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCG GAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACA GCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGC

CCCCTCGC CAR_H1_k5 169 ATGGATTTTCAAGTACAAATCTTTTCCTTCCTGCTTATTTCCG _NT CAAGCGTTATTATGAGTAGAGCCAGCCAAGTACAACTGGTACA

GTCCGGCGCGGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCAAGTGTGAAGGTA TCTTGCAAGGCGTCAGGCTATACCTTTACTTCATACCATATAC AGTGGGTGCGACAGGCTCCCGGCCAGCGACTCGAATGGATGGG CTGGATTTATCCCGGAGATGGATCTACGCAGTATAATGAGAAA TTCAAGGGTCGGGTCACGATTACACGAGACACGAGTGCTTCCA CAGCTTATATGGAACTTTCTAGCCTGAGGTCTGAGGATACTGC CGTTTACTATTGTGCACGAGAAGGGACATACTATGCGATGGAT TACTGGGGACAGGGCACCACTGTCACAGTTTCCAGCGTGGACT CAAGTGGAGGCGGTGGATCTGGTGGTGGCGGGTCCGGGGGGGG AGGCAGCACCAGTGACATTGTAATGACTCAAACACCTCTCAGT AGCCCAGTCACTCTCGGTCAGCCGGCGAGTATCTCTTTTAGGT CCTCACAATCTATAGTGCACTCTAACGGCAATACTTATCTTGA ATGGTATCAACAAAGACCGGGGCAGCCACCTCGCCTTCTCATC TACAAAGTAAGCAATCGCTTCTCCGGTGTCCCCGATCGCTTCT CCGGTTCAGGAGCAGGAACTGACTTCACATTGAAGATTTCCAG AGTGGAGGCCGAAGACGTAGGGGTATATTATTGCTTTCAAGGG TCCCATGTGCCCAGAACCTTTGGGGGAGGAACGAAAGTTGAGA TTAAAAACCGGATCCGTGGGGTCACCGTCTCTTCAGCGCTGAG CAACTCCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCGGTCTTCCTG CCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACAC CGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGA GGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGG CTGGACCCCTTTGGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAG TCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTAT TTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGAC TACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGC ATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCG CTCCCTCGAGAGAGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGAC GCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGC TCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAG ACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAG AACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGA TGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCG GAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACA GCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGC

CCCCTCGC CAR_H3_k2 170 ATGGATTTCCAAGTGCAGATTTTCTCTTTTCTCCTCATAAGCG _NT CCTCCGTAATTATGTCTAGAGCTAGTCAAGTCCAATTGGTGCA

ATCCGGTGCCGAGGTTAAAAAGCCCGGCGCAAGTGTAAAAGTC TCCTGTAAGGCCAGTGGCTACACTTTCACCAGCTACCATATAC AGTGGGTGCGGCAGGCGCCTGGTCAGGGTCTGGAGTGGATGGG TATTTGGATTTATCCCGGAGATGGAAGTACTCAATACAATGAG AAATTCAAGGGTGTCACTATGACAAGGGATACGAGCACTTCTA CCGTATATATGGAGTTGTCATCTTTGCGATCAGAGGATACCGC TGTATATTATTGCGCACGGGAAGGTACATATTATGCCATGGAC TACTGGGGCCAAGGAACCACCGTGACGGTAAGCTCTGTCGATT CTAGCGGTGGCGGGGGCTCTGGCGGTGGGGGTAGCGGGGGTGG CGGATCTACATCAGATATTGTAATGACACAGACCCCTCTTTCA CTTTCCGTAACGCCAGGACAGCCGGCATCAATAAGTTGCCGAT CAAGCCAGTCTATCGTACACTCCAATGGTAACACATACTTGGA ATGGTATCTTCAAAAGCCCGGCCAGAGCCCGCAGCTTTTGATA TATAAAGTGTCCAACAGATTCAGTGGGGTGCCGGACCGCTTTA GTGGATCTGGTTCAGGAACGGACTTCACATTGAAAATTAGTAG AGTTGAAGCGGAAGACGTGGGAGTCTACTACTGTTTCCAGGGT TCACATGTGCCTCGGACCTTTGGGGGAGGCACCAAGGTTGAGA TAAAAAACCGGATCCGTGGGGTCACCGTCTCTTCAGCGCTGAG CAACTCCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCGGTCTTCCTG CCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACAC CGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGA GGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGG CTGGACCCCTTTGGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAG TCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTAT TTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGAC TACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGC ATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCG CTCCCTCGAGAGAGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGAC GCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGC TCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAG ACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAG AACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGA TGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCG GAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACA GCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGC

CCCCTCGC CAR_H3_k3 171 ATGGACTTCCAAGTCCAAATCTTTTCTTTTTTGTTGATAAGCG _NT CATCAGTTATTATGTCTCGCGCCAGTCAAGTACAACTGGTGCA

GTCCGGAGCTGAAGTGAAAAAACCAGGAGCAAGCGTGAAAGTA AGTTGTAAGGCAAGTGGTTACACTTTCACAAGCTACCATATTC AATGGGTCCGACAGGCTCCTGGACAGGGCTTGGAGTGGATGGG CATATGGATTTACCCTGGTGACGGGTCCACCCAGTATAATGAA AAGTTCAAGGGAGTCACGATGACCAGGGACACCTCTACATCTA CCGTGTATATGGAGCTCTCTAGTTTGCGATCCGAAGACACTGC CGTTTATTACTGTGCAAGAGAAGGAACTTATTACGCGATGGAC TACTGGGGTCAGGGGACAACAGTCACCGTTAGCTCCGTCGATT CCAGCGGGGGAGGTGGCTCAGGCGGGGGTGGTTCTGGGGGGGG CGGGAGCACTTCAGATATTGTAATGACCCAAACCCCACTGAGT AGTCCAGTCACGCTTGGTCAACCGGCAAGCATTTCTTGCAGGA GCTCTCAGAGTATTGTCCACTCTAACGGGAATACATATTTGGA GTGGTATCAGCAAAGACCGGGCCAACCACCACGCCTCTTGATT TATAAGGTGAGCAATAGGTTTTCAGGCGTGCCAGATAGGTTCT CAGGCTCCGGAGCGGGAACCGACTTCACCCTCAAGATAAGTCG GGTGGAAGCCGAAGACGTAGGAGTTTACTACTGCTTTCAAGGA TCTCATGTTCCACGAACGTTTGGAGGAGGAACCAAGGTGGAAA TAAAAAACCGGATCCGTGGGGTCACCGTCTCTTCAGCGCTGAG CAACTCCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCGGTCTTCCTG CCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACAC CGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGA GGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGG CTGGACCCCTTTGGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAG TCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTAT TTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGAC TACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGC ATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCG CTCCCTCGAGAGAGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGAC GCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGC TCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAG ACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAG AACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGA TGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCG GAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACA GCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGC

CCCCTCGC CAR_H3_k4 172 ATGGACTTTCAGGTCCAAATTTTTTCCTTCTTGCTCATATCCG _NT CGAGTGTCATCATGTCAAGAGCAAGTCAAGTTCAACTCGTTCA

ATCAGGAGCTGAGGTGAAAAAACCAGGGGCGTCTGTCAAAGTA AGCTGCAAAGCATCAGGGTATACGTTCACGAGTTATCATATCC AGTGGGTTAGGCAGGCGCCAGGGCAGGGATTGGAATGGATGGG TATCTGGATTTACCCGGGTGACGGCAGCACTCAATACAATGAG AAATTCAAAGGCGTAACAATGACAAGGGACACGAGCACAAGCA CAGTGTACATGGAGCTTAGCTCTTTGAGGTCAGAGGATACCGC TGTTTACTATTGTGCTCGGGAGGGTACTTACTATGCAATGGAC TACTGGGGGCAAGGCACGACCGTTACAGTGAGTAGCGTAGATT CCTCCGGGGGTGGCGGTTCAGGCGGCGGAGGCTCAGGCGGAGG AGGGTCAACATCCGATGTCGTAATGACTCAGTCCCCTCTGTCA TTGCCGGTGACTTTGGGACAGCCAGCGTCTATATCTTGTAGGT CCTCTCAATCAATAGTGCATTCCAACGGTAACACCTATCTGGA ATGGTATCAGCAAAGGCCAGGACAAAGTCCACGCCTGCTTATA TATAAGGTGTCTAATCGATTCAGTGGGGTTCCCGATAGGTTTT CCGGCTCTGGTAGCGGGACTGATTTCACGTTGAAAATATCACG CGTGGAAGCGGAAGATGTTGGGGTCTATTACTGCTTTCAGGGT AGTCATGTCCCTCGAACTTTTGGCGGTGGTACAAAGGTAGAAA TCAAAAACCGGATCCGTGGGGTCACCGTCTCTTCAGCGCTGAG CAACTCCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCGGTCTTCCTG CCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACAC CGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGA GGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGG CTGGACCCCTTTGGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAG TCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTAT TTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGAC TACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGC ATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCG CTCCCTCGAGAGAGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGAC GCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGC TCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAG ACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAG AACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGA TGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCG GAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACA GCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGC

CCCCTCGC CAR_H3_k5 173 ATGGATTTTCAGGTACAGATATTCTCATTTCTCCTTATCTCAG _NT CTAGTGTCATAATGTCCAGGGCGAGTCAAGTACAACTTGTCCA

GTCAGGCGCAGAGGTCAAGAAGCCGGGCGCAAGCGTTAAGGTT TCCTGCAAAGCATCCGGCTATACATTCACGTCCTATCACATCC AATGGGTCAGGCAAGCACCCGGTCAAGGACTTGAGTGGATGGG CATCTGGATTTACCCTGGAGATGGCAGTACTCAGTACAACGAA AAATTCAAAGGTGTAACCATGACCCGCGACACATCTACTTCCA CAGTTTATATGGAACTCAGCAGTTTGCGGAGCGAAGATACCGC TGTTTACTACTGTGCCCGAGAGGGAACTTACTACGCCATGGAC TATTGGGGTCAAGGAACGACAGTAACAGTTAGTTCTGTAGATT CCAGTGGCGGCGGTGGGAGCGGGGGTGGGGGATCTGGCGGAGG CGGAAGTACAAGTGACATCGTTATGACTCAGACACCCCTTAGT AGTCCCGTTACGTTGGGCCAACCCGCGAGCATTTCCTTTCGAT CCTCTCAGTCTATAGTTCACTCAAATGGGAATACTTATTTGGA GTGGTATCAACAGCGCCCCGGACAACCACCAAGGCTCCTGATA TACAAGGTGTCCAATCGATTCTCTGGGGTGCCTGATAGATTTA GCGGAAGTGGAGCCGGTACAGATTTTACCCTGAAAATATCACG GGTAGAAGCCGAAGATGTCGGCGTCTACTACTGTTTCCAGGGT TCCCATGTACCGCGAACGTTCGGGGGCGGAACAAAAGTTGAGA TCAAGAACCGGATCCGTGGGGTCACCGTCTCTTCAGCGCTGAG CAACTCCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCGGTCTTCCTG CCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACAC CGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGA GGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGG CTGGACCCCTTTGGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAG TCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTAT TTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGAC TACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGC ATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCG CTCCCTCGAGAGAGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGAC GCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGC TCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAG ACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAG AACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGA TGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCG GAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACA GCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGC

CCCCTCGC CAR_H4_k2 174 ATGGATTTCCAGGTTCAGATATTTAGTTTCCTCTTGATTTCTG _NT CCAGTGTCATCATGAGCAGGGCTTCCCAAGTTCAGTTGGTGCA

AAGTGGCGCTGAAGTCAAAAAACCTGGGGCTTCCGTTAAAGTA TCTTGCAAGGCGTCCGGCTACACTTTCACATCCTACCACATTC AATGGGTCCGGCAAGCGCCCGGTCAGGGGCTCGAATGGATGGG GTGGATATACCCAGGAGATGGATCTACTCAGTACAACGAGAAA TTTAAAGGACGGGTGACGATGACGCGCGACACTTCAATAAGCA CTGCATACATGGAACTGTCCCGGCTTAGGTCAGATGACACCGC GGTCTACTATTGTGCGAGAGAGGGTACTTACTATGCTATGGAC TACTGGGGGCAAGGCACGACGGTTACAGTTTCCTCAGTCGATA GTTCAGGCGGAGGCGGCTCCGGGGGCGGTGGTAGTGGAGGGGG TGGATCTACTTCCGACATTGTCATGACCCAGACCCCGTTGAGC CTTTCAGTGACGCCCGGTCAACCCGCCAGCATAAGTTGTCGAT CAAGCCAGTCTATTGTACACTCCAATGGAAACACATATTTGGA GTGGTATCTCCAAAAACCCGGCCAAAGCCCTCAACTGCTCATC TACAAGGTCTCAAACAGGTTTAGCGGGGTCCCGGATCGCTTCT CAGGGTCAGGATCTGGTACGGACTTTACACTGAAAATTTCCCG AGTCGAAGCGGAAGACGTGGGTGTATATTACTGCTTCCAGGGG AGTCATGTTCCAAGAACCTTTGGGGGAGGTACAAAGGTCGAAA TAAAAAACCGGATCCGTGGGGTCACCGTCTCTTCAGCGCTGAG CAACTCCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCGGTCTTCCTG CCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACAC CGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGA GGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGG CTGGACCCCTTTGGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAG TCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTAT TTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGAC TACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGC ATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCG CTCCCTCGAGAGAGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGAC GCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGC TCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAG ACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAG AACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGA TGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCG GAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACA GCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGC

CCCCTCGC CAR_H4_k3 175 ATGGATTTTCAGGTCCAAATTTTTTCCTTCTTGCTTATCAGCG _NT CAAGTGTAATCATGTCCCGCGCGTCCCAAGTACAACTTGTGCA

ATCTGGCGCGGAGGTGAAAAAACCTGGAGCTTCCGTCAAGGTT TCTTGTAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACGTCCTACCACATTC AGTGGGTTCGACAGGCGCCGGGCCAAGGACTGGAGTGGATGGG ATGGATATATCCAGGAGATGGTTCTACTCAGTATAATGAGAAA TTCAAGGGTCGCGTAACAATGACGAGGGATACATCAATCTCCA CCGCGTACATGGAACTTTCAAGACTCCGGTCAGATGACACGGC GGTTTACTACTGTGCTCGGGAGGGCACTTACTATGCTATGGAC TACTGGGGGCAAGGGACAACGGTAACGGTATCTAGTGTGGATT CTAGTGGCGGCGGCGGTTCAGGAGGAGGTGGTTCAGGCGGGGG GGGTAGTACAAGTGATATTGTGATGACCCAAACACCCCTTTCT AGCCCTGTTACTCTGGGTCAACCCGCGTCCATAAGTTGTCGAA GTAGTCAATCCATCGTGCATAGCAACGGCAACACTTACCTTGA ATGGTATCAACAACGACCCGGACAGCCCCCGCGACTGCTTATC TATAAAGTATCAAACAGGTTCAGTGGCGTGCCAGATCGATTCT CCGGCTCTGGGGCAGGCACAGATTTCACGTTGAAAATTTCTCG GGTCGAGGCCGAGGACGTGGGCGTTTATTACTGTTTCCAGGGG AGTCACGTCCCCAGGACGTTCGGAGGAGGAACTAAAGTCGAAA TAAAGAACCGGATCCGTGGGGTCACCGTCTCTTCAGCGCTGAG CAACTCCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCGGTCTTCCTG CCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACAC CGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGA GGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGG CTGGACCCCTTTGGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAG TCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTAT TTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGAC TACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGC ATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCG CTCCCTCGAGAGAGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGAC GCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGC TCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAG ACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAG AACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGA TGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCG GAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACA GCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGC

CCCCTCGC CAR_H4_k4 176 ATGGACTTCCAGGTCCAAATATTCAGCTTCCTCCTCATTTCCG _NT CCAGTGTAATAATGTCCAGAGCCTCACAAGTACAGTTGGTTCA

GAGCGGGGCTGAGGTTAAGAAACCAGGCGCGAGCGTCAAGGTA TCCTGCAAGGCGAGTGGTTATACTTTCACTAGTTATCACATTC AGTGGGTCCGACAGGCCCCCGGTCAAGGCCTGGAGTGGATGGG GTGGATATATCCGGGAGATGGTTCTACCCAATATAATGAGAAG TTTAAGGGGAGAGTCACAATGACAAGGGACACCAGTATTAGCA CCGCGTATATGGAGCTTTCCCGCCTGCGATCAGATGACACGGC CGTGTACTACTGTGCTAGGGAGGGAACCTATTATGCGATGGAT TACTGGGGACAGGGTACTACAGTCACGGTCTCTAGCGTGGACA GTTCCGGGGGCGGTGGAAGCGGTGGTGGCGGTTCAGGTGGAGG AGGCTCTACGAGTGATGTTGTGATGACTCAGTCCCCGCTTTCA CTTCCCGTCACCCTTGGGCAACCCGCAAGCATCTCATGCCGAT CCTCCCAGTCTATAGTACATAGTAATGGCAACACATATCTTGA ATGGTATCAGCAGAGGCCGGGTCAGTCTCCCCGACTCCTTATA TATAAAGTGAGCAACAGATTCTCCGGAGTACCGGATAGATTTT CCGGCTCTGGGAGCGGCACCGACTTTACACTGAAAATTTCACG GGTTGAAGCTGAAGATGTTGGGGTATACTATTGTTTCCAGGGT TCTCACGTCCCGAGGACATTCGGGGGAGGAACGAAAGTCGAAA TAAAGAACCGGATCCGTGGGGTCACCGTCTCTTCAGCGCTGAG CAACTCCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCGGTCTTCCTG CCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACAC CGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGA GGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGG CTGGACCCCTTTGGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAG TCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTAT TTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGAC TACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGC ATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCG CTCCCTCGAGAGAGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGAC GCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGC TCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAG ACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAG AACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGA TGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCG GAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACA GCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGC

CCCCTCGC CAR_H4_k5 177 ATGGATTTTCAGGTACAAATCTTCAGCTTCCTGCTCATCTCCG _NT CGAGCGTAATCATGTCTAGGGCGTCCCAGGTGCAGTTGGTGCA

ATCAGGTGCAGAGGTGAAGAAGCCTGGTGCATCCGTTAAAGTA AGTTGTAAGGCAAGCGGATATACTTTTACATCCTATCATATTC AATGGGTCAGACAAGCACCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATGGG CTGGATCTATCCAGGCGATGGCTCAACTCAATATAACGAGAAG TTCAAGGGGAGGGTTACTATGACCAGGGATACGTCTATTTCCA CTGCGTACATGGAACTCTCCAGGTTGAGAAGTGATGATACCGC GGTTTACTACTGCGCTAGAGAAGGAACGTACTACGCTATGGAT TACTGGGGGCAGGGTACAACTGTCACCGTCTCAAGTGTGGATT CTTCTGGGGGTGGGGGATCAGGAGGGGGAGGCTCCGGTGGGGG CGGGTCAACCAGCGACATTGTCATGACTCAAACCCCCCTGAGC AGCCCTGTCACCCTGGGTCAGCCTGCCTCAATATCCTTTAGAA GCTCCCAAAGCATCGTCCATTCAAATGGTAATACCTATCTGGA GTGGTATCAGCAAAGGCCTGGTCAACCCCCGCGCCTTCTCATT TACAAGGTGTCAAACAGGTTCTCCGGCGTACCGGATAGGTTTT CCGGAAGCGGTGCTGGAACCGACTTTACTCTCAAAATCTCTAG GGTGGAAGCTGAGGACGTCGGTGTATACTATTGTTTTCAAGGC TCCCATGTTCCCAGGACATTTGGTGGGGGAACGAAGGTAGAAA TCAAGAACCGGATCCGTGGGGTCACCGTCTCTTCAGCGCTGAG CAACTCCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCGGTCTTCCTG CCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACAC CGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGA GGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGG CTGGACCCCTTTGGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAG TCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTAT TTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGAC TACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGC ATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCG CTCCCTCGAGAGAGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGAC GCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGC TCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAG ACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAG AACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGA TGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCG GAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACA GCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGC

CCCCTCGC CAR_H5_k2 178 ATGGACTTTCAGGTTCAGATTTTCTCTTTCTTGTTGATCTCCG _NT CTAGTGTCATAATGTCACGGGCAAGTCAGGTACAACTCGTTCA

GAGTGGTGCCGAAGTGAAGAAACCGGGTGCCTCCGTAAAGGTG TCATGTAAAGCTAGTGGCTATACATTCACAAGTTATCATATCC AATGGGTACGACAAGCACCGGGACAGCGACTGGAATGGATGGG ATGGATCTATCCTGGGGACGGATCTACACAGTACAATGAGAAA TTTAAGGGACGGGTCACGATAACCAGGGACACATCTGCTTCCA CGGCTTACATGGAGCTTTCCTCCCTGCGGAGCGAGGACATGGC TGTTTACTATTGCGCTCGCGAAGGGACATACTACGCAATGGAT TATTGGGGCCAAGGCACTACCGTGACGGTCTCTTCTGTCGATA GTTCCGGAGGAGGTGGTTCAGGGGGAGGCGGTTCAGGTGGGGG TGGATCTACCTCAGATATTGTCATGACACAGACACCTTTGTCC TTGAGTGTGACACCGGGTCAACCGGCGAGTATAAGCTGTCGCA GCTCACAATCTATTGTGCATAGCAACGGGAATACATATCTCGA ATGGTATCTCCAAAAGCCGGGCCAATCCCCCCAACTTCTCATT TACAAAGTTTCTAATCGATTTTCAGGTGTACCAGATCGGTTTT CCGGGTCTGGCTCAGGTACTGACTTCACCTTGAAAATATCAAG GGTTGAAGCTGAGGATGTAGGTGTGTACTATTGCTTCCAGGGG TCTCACGTTCCTCGGACTTTTGGGGGGGGCACAAAAGTAGAGA TTAAAAACCGGATCCGTGGGGTCACCGTCTCTTCAGCGCTGAG CAACTCCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCGGTCTTCCTG CCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACAC CGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGA GGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGG CTGGACCCCTTTGGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAG TCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTAT TTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGAC TACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGC ATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCG CTCCCTCGAGAGAGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGAC GCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGC TCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAG ACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAG AACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGA TGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCG GAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACA GCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGC

CCCCTCGC CAR_H5_k3 179 ATGGATTTCCAGGTGCAAATCTTCTCATTTCTTTTGATAAGTG _NT CGTCAGTGATAATGTCTCGGGCCAGTCAAGTACAGCTTGTCCA

AAGTGGCGCTGAAGTCAAGAAGCCGGGAGCCTCAGTTAAGGTT AGCTGCAAGGCCTCAGGGTATACTTTTACCTCCTATCATATAC AGTGGGTACGACAAGCACCGGGACAGCGACTGGAGTGGATGGG TTGGATATATCCGGGAGATGGTTCAACCCAGTATAATGAGAAG TTCAAGGGGCGAGTTACGATAACCCGCGATACGAGTGCATCAA CAGCGTACATGGAGTTGAGTTCCCTCCGCAGCGAGGACATGGC GGTATACTATTGTGCCAGGGAGGGGACTTATTATGCCATGGAC TACTGGGGGCAGGGCACAACCGTAACAGTCTCTTCTGTAGACA GTTCAGGAGGGGGCGGAAGTGGAGGTGGCGGATCTGGTGGAGG TGGATCTACTTCCGACATCGTTATGACCCAAACACCACTTTCA TCTCCCGTTACTCTCGGGCAACCTGCTAGTATTTCCTGTAGAT CCTCACAATCTATAGTACATAGCAATGGCAATACCTACCTGGA GTGGTATCAACAACGCCCAGGCCAACCACCTCGCCTGCTTATC TATAAAGTAAGCAATAGATTCAGTGGTGTACCGGATAGGTTCT CTGGTTCCGGAGCAGGAACTGACTTTACACTCAAAATCAGTAG GGTGGAGGCGGAAGACGTGGGAGTATATTATTGCTTTCAAGGT TCACATGTACCTCGAACATTTGGCGGAGGAACTAAGGTTGAGA TTAAAAACCGGATCCGTGGGGTCACCGTCTCTTCAGCGCTGAG CAACTCCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCGGTCTTCCTG CCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACAC CGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGA GGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGG CTGGACCCCTTTGGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAG TCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTAT TTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGAC TACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGC ATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCG CTCCCTCGAGAGAGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGAC GCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGC TCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAG ACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAG AACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGA TGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCG GAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACA GCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGC

CCCCTCGC CAR_H5_k4 180 ATGGATTTCCAAGTCCAGATATTCAGTTTTCTTTTGATAAGCG _NT CTTCTGTAATCATGTCTCGGGCGTCCCAAGTACAACTGGTGCA

ATCAGGGGCAGAAGTGAAAAAACCAGGTGCATCCGTTAAGGTG AGTTGCAAGGCTTCCGGCTATACCTTTACATCATATCATATTC AATGGGTCAGGCAAGCACCTGGTCAGCGATTGGAATGGATGGG TTGGATATATCCTGGTGATGGGTCTACACAATATAACGAAAAA TTCAAGGGGCGAGTGACCATCACAAGAGATACATCAGCGTCAA CAGCGTATATGGAACTGTCATCCCTTAGATCAGAGGACATGGC GGTCTATTACTGTGCCAGAGAAGGCACTTATTATGCAATGGAT TATTGGGGACAAGGAACCACTGTCACTGTTTCCAGCGTAGACT CCTCCGGTGGTGGTGGAAGTGGCGGCGGTGGGTCAGGAGGGGG TGGGTCAACTTCTGATGTAGTGATGACACAGAGCCCTCTGAGC TTGCCTGTGACCTTGGGTCAGCCGGCCTCAATAAGTTGTCGAT CTAGTCAGTCAATCGTCCATAGTAATGGGAACACATACCTTGA ATGGTATCAGCAAAGACCTGGACAATCTCCACGACTCCTTATA TACAAAGTTAGCAACCGATTTAGCGGAGTGCCAGACCGCTTTT CTGGTTCCGGGTCTGGCACAGATTTTACCCTTAAGATCTCCCG CGTGGAGGCGGAAGACGTTGGTGTTTACTATTGCTTCCAGGGG TCACACGTTCCACGCACCTTTGGAGGAGGTACGAAGGTCGAGA TTAAGAACCGGATCCGTGGGGTCACCGTCTCTTCAGCGCTGAG CAACTCCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCGGTCTTCCTG CCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACAC CGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGA GGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGG CTGGACCCCTTTGGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAG TCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTAT TTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGAC TACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGC ATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCG CTCCCTCGAGAGAGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGAC GCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGC TCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAG ACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAG AACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGA TGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCG GAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACA GCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGC CCCCTCGC

CAR_H5_k5 181 ATGGATTTTCAAGTACAGATCTTCTCTTTCTTGCTTATTTCAG _NT CGAGCGTAATCATGAGTAGGGCATCTCAAGTTCAACTCGTTCA

GTCAGGTGCTGAGGTAAAAAAACCAGGGGCTTCCGTTAAAGTT AGCTGTAAGGCATCTGGGTACACATTTACTAGCTACCATATCC AGTGGGTGCGACAAGCCCCGGGGCAGCGCTTGGAATGGATGGG CTGGATTTACCCAGGTGACGGCTCCACGCAATATAATGAGAAA TTTAAGGGTAGAGTTACTATTACCAGGGACACAAGTGCTTCAA CTGCCTATATGGAACTGAGCAGCCTTCGGAGTGAAGATATGGC CGTATATTACTGCGCAAGGGAGGGGACTTACTATGCAATGGAC TACTGGGGTCAGGGAACGACTGTGACCGTGTCCTCAGTTGACT CCAGCGGTGGTGGCGGCTCTGGAGGTGGGGGTTCCGGCGGAGG CGGAAGCACATCTGATATAGTGATGACGCAAACGCCTCTTTCT TCCCCGGTAACTCTGGGACAGCCAGCGTCAATTTCATTTAGGT CCTCCCAGTCAATCGTACATAGTAATGGAAATACTTACCTGGA ATGGTATCAACAACGACCAGGGCAACCGCCCCGATTGTTGATC TATAAAGTGAGCAATCGCTTTTCTGGCGTGCCCGATCGGTTCT CAGGGTCTGGAGCTGGGACTGACTTCACATTGAAAATTTCCAG GGTTGAGGCCGAGGATGTGGGGGTTTATTACTGCTTCCAAGGC TCCCACGTCCCCCGCACCTTCGGAGGGGGAACCAAAGTCGAAA TAAAGAACCGGATCCGTGGGGTCACCGTCTCTTCAGCGCTGAG CAACTCCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCGGTCTTCCTG CCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACAC CGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGA GGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGG CTGGACCCCTTTGGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAG TCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTAT TTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGAC TACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGC ATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCG CTCCCTCGAGAGAGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGAC GCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGC TCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAG ACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAG AACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGA TGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCG GAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACA GCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGC

CCCCTCGC CAR_H6_k2 182 ATGGATTTTCAAGTTCAGATATTCTCATTTTTGCTTATATCAG _NT CCTCCGTAATTATGTCACGGGCAAGTCAAGTTCAGTTGGTGCA

GTCCGGAGCAGAAGTTAAGAAGCCCGGTGCTTCTGTGAAAGTC TCCTGCAAAGCGTCTGGGTACACCTTCACGAGCTACCATATAC AGTGGGTCCGGCAAGCGCCTGGGCAGAGGCTGGAGTGGATGGG CTGGATTTACCCAGGAGATGGGAGTACAAAGTATAGTCAGAAG TTTCAAGGGCGAGTGACGATAACCAGAGATACGAGTGCAAGTA CTGCATACATGGAACTGAGCTCCTTGAGGTCCGAGGATACAGC GGTGTACTATTGCGCTCGGGAAGGGACATATTATGCTATGGAC TATTGGGGACAAGGGACAACGGTAACGGTGAGTTCCGTCGATT CCTCAGGTGGCGGAGGCAGTGGGGGCGGGGGTTCCGGCGGTGG CGGGTCCACGAGTGATATAGTTATGACACAGACCCCCCTCAGC CTTTCTGTGACCCCAGGACAACCCGCTAGTATCTCTTGCCGCA GTTCTCAGTCCATAGTACACAGTAACGGAAATACCTATCTTGA GTGGTATCTTCAAAAGCCCGGCCAGAGCCCTCAACTCTTGATA TATAAAGTGTCAAATCGATTTTCAGGTGTGCCTGATCGATTCT CAGGGTCTGGTTCAGGGACAGATTTCACGCTTAAGATAAGCAG AGTAGAGGCTGAAGACGTGGGAGTCTACTATTGTTTTCAGGGG TCACACGTTCCCCGCACTTTTGGTGGGGGAACCAAGGTGGAAA TCAAAAACCGGATCCGTGGGGTCACCGTCTCTTCAGCGCTGAG CAACTCCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCGGTCTTCCTG CCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACAC CGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGA GGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGG CTGGACCCCTTTGGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAG TCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTAT TTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGAC TACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGC ATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCG CTCCCTCGAGAGAGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGAC GCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGC TCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAG ACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAG AACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGA TGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCG GAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACA GCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGC

CCCCTCGC CAR_H1_K2 214 ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGC _NT TTCTTCATGCCGCCAGACCATCTCAGGTCCAGCTAGTACAAAG

CGGCGCCGAAGTAAAGAAACCTGGTGCCTCTGTGAAGGTGAGC TGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACCACATCCAGT GGGTTCGACAGGCCCCTGGACAGAGACTAGAGTGGATGGGCTG GATCTATCCTGGCGACGGCAGCACCCAGTACAACGAGAAGTTC AAGGGCAGAGTTACCATCACCCGAGACACCAGCGCCAGCACAG CCTATATGGAGCTGAGCAGCCTGCGAAGCGAGGACACAGCTGT TTACTATTGTGCCAGAGAGGGCACCTACTACGCAATGGATTAT TGGGGCCAGGGGACCACCGTGACCGTTTCTTCTGGAGGCGGAG GTTCTGGCGGCGGAGGAAGTGGTGGCGGAGGCTCAGATATTGT AATGACCCAGACACCTCTGTCCCTGTCTGTGACACCTGGACAG CCTGCAAGCATCAGCTGTCGGAGCAGCCAGAGCATCGTTCACA GCAACGGCAACACCTACCTGGAATGGTATCTGCAGAAGCCCGG ACAGTCCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCCAACCGCTTC AGTGGAGTACCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCG ACTTCACCCTGAAGATCTCCAGAGTAGAAGCAGAGGACGTTGG AGTGTACTACTGCTTCCAAGGCAGCCATGTGCCAAGAACCTTT GGTGGAGGCACAAAGGTGGAAATCAAGCGGACAACAACACCTG CTCCTCGGCCTCCTACACCAGCTCCTACAATTGCCAGCCAGCC ACTGTCTCTGAGGCCCGAAGCTTGCAGGCCTGCTGCTGGCGGA GCCGTGCATACAAGAGGACTGGATTTCGCCTGCGACATCTACA TCTGGGCACCTCTGGCTGGAACCTGTGGCGTGCTGCTGCTGAG CCTGGTCATCACCCTGTATTGCCGGAGCAAGAGAAGCAGACTG CTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGAC CTACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGACTT CGCCGCCTACAGATCCAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGAC GCTCCTGCCTATCAGCAGGGCCAAAACCAGCTCTACAACGAGC TGAACCTGGGGAGAAGAGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCG GAGAGGCAGAGATCCTGAAATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAG AATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTACAGAAAGACAAGA TGGCAGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAG AAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACC GCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGC

CTCCAAGA 4-1BB NT 215 AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCAT

TTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAG (SEQ ID

CTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG NO: 17 de US

9.102.

760) CD8 217 ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCA dobradiça TCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCC NT (SEQ AGCGGCGGGGGGGGCGGAGGGGGGGGGGGGGTC ID NO: 15 de US

9.102.

760) CD8_dobra 220 ACAACAACACCTGCTCCTCGGCCTCCTACACCAGCTCCTACAA -diça NT TTGCCAGCCAGCCACTGTCTCTGAGGCCCGAAGCTTGCAGGCC

TGCTGCTGGCGGAGCCGTGCATACAAGAGGACTGGATTTCGCC TGCGAC

CD8 222 ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTC transmem- TCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC brana _NT (SEQ ID NO: 16 de US

9.102.

760) CD8 224 ATCTACATCTGGGCACCTCTGGCTGGAACCTGTGGCGTGCTGC transmem- TGCTGAGCCTGGTCATCACCCTGTATTGC brana_NT Tabela 5 Kabat Chothia BB7.2 SYHIQ (SEQ ID NO: 183) GYTFTSY (SEQ ID NO: 184) VH CDR1 BB7.2 WIYPGDGSTQYNEKFKG (SEQ ID YPGDGS (SEQ ID NO: 186) NO: 185) VH CDR2 BB7.2 EGTYYAMDY (SEQ ID NO: 187) EGTYYAMDY (SEQ ID NO: 187) VH CDR3

Tabela 6 Kabat Chothia BB7.2 RSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID RSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO: 188) NO: 188) VL CDR1 BB7.2 KVSNRFS (SEQ ID NO: 189) KVSNRFS (SEQ ID NO: 189) VL CDR2 BB7.2 FQGSHVPRT (SEQ ID NO: FQGSHVPRT (SEQ ID NO: 190) 190) VL CDR3 Tabela 7 Nome SEQ SEQ ID AA BB7.2_AA 191 QVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYHIQWVKQRPGQ

GLEWIGWIYPGDGSTQYNEKFKGKTTLTADKSSSTAYMLLSSL VH

TSEDSAIYFCAREGTYYAMDYWGQGTSVTVSS BB7.2_AA 192 DVLMTQTPLSLPVSLGDQVSISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQ

KPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAE VL

DLGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKLEIK BB7.2_AA 193 QVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYHIQWVKQRPGQ

GLEWIGWIYPGDGSTQYNEKFKGKTTLTADKSSSTAYMLLSSL scFv

TSEDSAIYFCAREGTYYAMDYWGQGTSVTVSSVDSSGGGGSGG (sem

GGSGGGGSTSDVLMTQTPLSLPVSLGDQVSISCRSSQSIVHSN líder)

GNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDF

TLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKLEIK BB7.2CAR 194 QVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYHIQWVKQRPGQ

GLEWIGWIYPGDGSTQYNEKFKGKTTLTADKSSSTAYMLLSSL (sem

TSEDSAIYFCAREGTYYAMDYWGQGTSVTVSSVDSSGGGGSGG líder)

GGSGGGGSTSDVLMTQTPLSLPVSLGDQVSISCRSSQSIVHSN GNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDF TLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKLEIKLEQKLIS EEDLNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRP PTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDPFGFWVLVVV GGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPT RKHYQPYAPPRDFAAYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLY NELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQK DKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ

ALPPR BB7.2CAR 195 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLQQSGPELVKPGASVKM

SCKASGYTFTSYHIQWVKQRPGQGLEWIGWIYPGDGSTQYNEK (com

FKGKTTLTADKSSSTAYMLLSSLTSEDSAIYFCAREGTYYAMD líder)

YWGQGTSVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDVLMTQTPLS LPVSLGDQVSISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLI YKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQG SHVPRTFGGGTKLEIKLEQKLISEEDLNRIRGVTVSSALSNSI MYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACR PAAGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSLE RVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGR DPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGK

GHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR Nome SEQ SEQ ID NT BB7.2CAR 196 ATGGACTTCCAGGTGCAGATCTTCAGCTTCCTGCTGATCAGCG

CCAGCGTGATCATGAGCCGCGCTAGCCAGGTGCAGCTGCAGCA (com

GAGCGGCCCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATG líder)

AGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACCACATCC AGTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGG CTGGATCTACCCCGGCGACGGCAGCACCCAGTACAACGAGAAG TTCAAGGGCAAGACCACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCAGCA CCGCCTACATGCTGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGC CATCTACTTCTGCGCCCGCGAGGGCACCTACTACGCCATGGAC TACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCAGCGTCGACA GCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGG CGGCAGCACTAGTGACGTGCTGATGACCCAGACCCCCCTGAGC CTGCCCGTGAGCCTGGGCGACCAGGTGAGCATCAGCTGCCGCA GCAGCCAGAGCATCGTGCACAGCAACGGCAACACCTACCTGGA GTGGTACCTGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCAAGCTGCTGATC TACAAGGTGAGCAACCGCTTCAGCGGCGTGCCCGACCGCTTCA GCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCG CGTGGAGGCCGAGGACCTGGGCGTGTACTACTGCTTCCAGGGC AGCCACGTGCCCCGCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGA TCAAGCTCGAGCAGAAGCTGATCAGCGAGGAGGACCTGAACCG GATCCGTGGGGTCACCGTCTCTTCAGCGCTGAGCAACTCCATC ATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGC CCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCAC CATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGG CCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACCCCT TTGGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTG CTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACA TGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCC CTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCCTCGAG AGAGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGT ACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGG ACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGG GACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGG AAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGC CTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAG GGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGG ACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTA A

EXEMPLOS Métodos

[609] Geração de scFv específicos para HLA-A*02 humanizados. Os genes humanizados foram otimizados por códon usando o otimizador de códon do serviço Invitrogen GeneArt Gene Synthesis usando as configurações para Homo sapiens. Os fragmentos de gene gBlocks® foram encomendados da Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) de modo que a região 5’ do receptor de antígeno quimérico contivesse uma sequência

Kozak e uma sobreposição de 36 NT com um plasmídeo pcDNA3.

A extremidade 3’ contém um local BamHI e uma sobreposição com uma sequência de dobradiça CD8 para facilitar a montagem de Gibson no plasmídeo em estrutura com a dobradiça CD8 e os domínios de sinalização intracelular do receptor de antígeno quimérico.

[610] Geração de hA2-CARs. As variantes de scFv foram fundidas a uma região de haste de CD8α humano, os domínios transmembranar e intracelular de CD28 humano e CD3ζ humano, conforme descrito (Sadelain et al., 2013). Os cDNAs resultantes foram clonados em um vetor lentiviral que codifica a expressão na superfície celular de um receptor de fator de crescimento do nervo truncado (TrkA) (ΔNGFR) como marcador (Figura 1). A expressão da superfície foi determinada por citometria de fluxo com células HEK 293T transientemente transfectadas (jetPRIME®, Polyplus Transfection). Partículas virais foram produzidas como descrito (Allan et al., 2008).

[611] Geração de linhagens celulares K562 que expressam HLA. As células K562 expressando CD64 (K562.64) foram um presente de James Riley, Universidade da Pensilvânia, Filadélfia, EUA. O cDNA para HLA-A*02:01 e A*24:02 foi isolado a partir do mRNA de células mononucleares do sangue periférico de um doador homozigoto para A*02:01 ou A*24:02, respectivamente, no lócus HLA-A usando as sequências iniciadoras: 5’- TTTTCTAGACGCGTGCCACCATGGCCGTCATGGCGCC-3’ (direta) (SEQ ID NO: 197) e 5’-AAGTCGACGCTAGCTCACACTTTACAAGCTGTGAGAGACA-3’ (inversa) (SEQ ID NO: 198). A sequência resultante foi confirmada pelo sequenciamento de Sanger, alinhada às sequências esperadas dos bancos de dados IPD e IMGT/HLA (Robinson et al., 2015) e transduzida em células K562, respectivamente, usando um vetor de expressão lentiviral.

Para gerar células A25 e A68-K562, as sequências HLA para A*25:01, A*68:01 foram extraídas do banco de dados IPD e IMGT/HLA (Robinson et al., 2015), otimizadas por códon usando a ferramenta de otimização de códon (definido como Homo sapiens) do serviço ThermoFisher Invitrogen GeneArt Gene Synthesis, depois clonado em um vetor de expressão lentiviral e transduzido em células K562. As linhagens celulares K562 resultantes foram então classificadas em um FACSAria II (BD Biosciences) usando anti-HLA-ABC (ThermoFisher, 12-9983-41) para garantir expressão superficial equivalente do HLA transduzido e anti-HLA-A2 (BB7.2) (ThermoFisher, 17-9876-42) para garantir a pureza.

[612] Classificação, transdução e expansão de Treg.

As células T CD4+ foram isoladas a partir de doadores HLA- A2- através de RosetteSep (Stemcell) e enriquecidas em células CD25+ (Miltenyi) antes da classificação de Tregs CD4+CD25hiCD127lo vivas (para experimentos in vitro e de luciferase) ou Tregs CD4+hiCD127loCD25hiCD45RA+ (para experimentos xenogênicos de GvHD e transplante de pele) usando um MoFlo® Astrios (Beckman Coulter) ou FACSAria II (BD Biosciences), respectivamente. As Tregs classificadas foram estimuladas com células L e mAb αCD3 (OKT3; 100ng/mL) em meio de expansão de células T imunocult-XF (STEMCELL Technologies) com 1000U/ml de IL-2 (Proleukin). Um dia depois, as células foram transduzidas com lentivírus a uma multiplicidade de infecção de 10 partículas virais:1 célula.

No dia 7, as células ΔNGFR+ foram purificadas com seleção magnética (Miltenyi) e depois usadas em ensaios ou re- estimuladas com células L como acima e expandidas por 5 dias para experimentos in vivo. Para testar os efeitos da estimulação mediada por HLA-A2, as Tregs foram cultivadas com IL-2 limitante (100U/mL) por 24 horas, depois recontadas e co-cultivadas com células K562.64 carregadas com anti- CD3/anti-CD28 irradiadas ou células K562.64 que expressam HLA-A*02:01, A*24:02, A*25:01 ou A*68:01 na proporção de 1:2 (célula K562: T) por 24 horas.

[613] Citometria de fluxo. Para análise fenotípica, as células foram coradas com corante de viabilidade fixável (FVD, 65-0865-14, ThermoFisher; 423102, Biolegend) e para marcadores de superfície antes da fixação e permeabilização com eBioscience FOXP3/Conjunto de tampões de coloração para fator de transcrição (ThermoFisher) e coloração para proteínas intracelulares. As amostras foram lidas em um Cytoflex (Beckman-Coulter) e os resultados analisados usando o Software FlowJo versão 9.9.4 e 10.3 (Tree Star).

[614] A coloração da superfície foi realizada para ΔNGFR (130-091-885, Miltenyi), CD3 (564465, BD Biosciences), CD4 (317410, Biolegend), CD25 (130-091-024, Miltenyi), LAP (25-9829-42, ThermoFisher), CD69 (310946, Biolegend), CD154 (555702, BD Biosciences), CD71 (BD Biosciences, 563768) e CD127 (48-1278-42, ThermoFisher). A coloração do tetrâmero foi realizada com monômeros HLA-A*02:01 transformados em tetrâmeros com estreptavidina aloficocianina (PJ27S, Prozyme). A coloração intracelular foi realizada para CTLA- 4 (369606, Biolegend).

[615] Para experimentos in vivo, 50 µL de sangue foram coletados semanalmente e nos pontos finais. O cloreto de amônio foi usado para a lise dos glóbulos vermelhos. As células foram ressuspensas em PBS com anti-CD16/32 de camundongo (ThermoFisher, 14-0161-82) e coradas para marcadores extracelulares usando corante de viabilidade fixável (FVD; ThermoFisher, 65-0865-14), anti-CD45 de camundongo (ThermoFisher, 25 -0451-82) e anti-CD45 humano (BD Biosciences, 560777), CD4 (Biolegend, 300554, 317434), CD8 (ThermoFisher, 48-0087-42), anti-CD271 humano (NGFR; BD Biosciences, 557196) HLA-A2 (BD Biosciences, 551285). A coloração intracelular para FOXP3 (ThermoFisher, 12-4777-42)

foi realizada com o conjunto de tampões de coloração de fator FOXP3/fator de transcrição de eBioscience (ThermoFisher, 00- 5523-00). 10.000 grânulos de contagem foram adicionados a cada amostra (ThermoFisher, 01-1234-42). As estratégias de gating para os experimentos xenogênicos de GvHD, luciferase e transplante de pele são ilustradas nas Figuras 8D, 10A e 12A, respectivamente.

[616] Ensaio de reatividade cruzada do alelo HLA.

0,25 X 106 Tregs CAR (preparadas como acima, após 7 dias de cultura) foram incubadas com painéis de grânulos de anticorpo de antígeno único FlowPRA (FL1HD01, FL1HD02, FL1HD03, FL1HD04, FL1HD06 e FL1HD08, One Lambda) e corante de viabilidade fixável (FVD, 65 -0865-14, ThermoFisher) por 30 minutos em temperatura ambiente, depois lavadas, fixadas com formaldeído a 0,5% e analisadas por citometria de fluxo.

Duzentos grânulos de controle negativo foram adquiridos por amostra. Para análise, as células mortas foram primeiro eliminadas usando o corante de viabilidade fixável. Os grânulos simples foram então identificados após exclusão de células mortas e dupletos. Em seguida, o número de grânulos para cada antígeno HLA foi determinado pela respectiva intensidade de PE. Os dados foram normalizados dividindo-se o número de grânulos negativos na amostra pelo número de grânulos negativos na amostra Treg-NGFR, multiplicado pelo número de grânulos negativos na amostra Treg-NGFR. O percentual de ligação relativa é o número de grânulos na amostra NGFR para um HLA específico menos o número normalizado de grânulos na amostra para esse HLA, dividido pelo número de grânulos na amostra NGFR multiplicado por

100.

[617] Supressão de reações linfocitárias mistas. As células aderentes de PBMCs de doadores saudáveis HLA-A2+ foram diferenciadas em células dendríticas derivadas de monócitos, conforme descrito (Dijke et al., 2015). Para as reações de linfócitos mistas, células respondentes a HLA-A2- PBMC foram marcadas com corante de proliferação celular eF450 (65-0842-85, ThermoFisher), em seguida, revestida com 5X104 células dendríticas derivadas de monócitos HLA-A2+ e proporções crescentes de Tregs expandidas expressando ΔNGFR- ou hA2-CAR marcados com corante de proliferação celular e670 (65-0840-90, ThermoFisher). Após 6 dias, a divisão das células T respondentes a HLA-A2-CD4+ foi medida por citometria de fluxo. A supressão percentual foi calculada com base no índice de proliferação de uma dada combinação de células e na proporção versus controle positivo (células dendríticas derivadas de monócitos HLA-A2+ com células T com células T respondentes HLA-A2-CD4+ apenas) conforme descrito (McMurchy and Levings, 2012). Os dados foram normalizados calculando primeiro o percentual de supressão da seguinte maneira:

í01234 14 56782946:çã7(:=7>?6:) % 𝑠𝑢𝑝𝑟𝑒𝑠𝑠ã𝑜 = 100 − 100 × í01234 14 56782946:çã7 (ABCDEFGHEIJ HJKLEFMJFGJ), normalizando os valores resultantes de 0 a 100%, de acordo com a fórmula para cada experimento independente: % MJ >[564>>ã7 (:=7>?6:) % de supressão normalizada = 100 × % 14 >[564>>ã7 (ABCDEFGHEIJ HJKLEFMJFGJ).

[618] Supressão da doença do enxerto contra hospedeiro xenogênica in vivo. Camundongos NSG fêmeas de 8 a 12 semanas de idade (The Jackson Laboratory, criados em casa) receberam irradiação de corpo inteiro (150 cGy, RS- 2000 Pro Biological System) 1 dia antes da injeção de 8 X 106 PBMCs HLA-A2+ com ou sem 4 X 106 Tregs HA2-car intravenosamente na veia da cauda. Camundongos injetados com solução salina serviram como controle. Tregs hA2-CAR foram gerados a partir de quatro doadores saudáveis diferentes. A GVHD foi pontuada com base no peso, textura da pele, postura, nível de atividade e integridade da pele, com 0 a 2 pontos por categoria, conforme descrito (Cooke, et al. 1996; Hill et al. 1997). A pontuação de GVHD foi realizada por dois investigadores de modo cego. O sangue periférico da veia safena foi centrifugado; depois os eritrócitos foram lisados e os leucócitos foram medidos por citometria de fluxo.

[619] Aprovação do estudo. Para PBMCs humanos, voluntários saudáveis deram por escrito consentimento informado de acordo com os protocolos aprovados pelo Conselho de Ética em Pesquisa Clínica da Universidade da Colúmbia

Britânica e pelo Canadian Blood Services. Amostras de pele humana descartadas da cirurgia plástica foram obtidas no Harvard Skin Resource Center, Skin Works ou Cambie Surgery Clinic de acordo com os protocolos aprovados pelo Conselho de Ética em Pesquisa Clínica da Universidade da Colúmbia Britânica. Os protocolos animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais da UBC.

[620] Transplante de pele. Para avaliar as Treg A2- CAR homing e a capacidade de inibir a rejeição da pele, camundongos fêmeas NSG de 8 a 12 semanas de idade (The Jackson Laboratory, criados in house) foram transplantados com pele de camundongos transgênicos NSG HLA-A2+ (The Jackson Laboratory, produzido in house) e pele NSG (negativo para HLA-A2). Para transplantes de pele de camundongo, a pele foi cortada em pedaços circulares utilizando punção de biópsia de 8 mm e a pele foi colocada em placas frescas com PBS e mantidas em baixa temperatura (4-8ºC) até ser transplantado (~ 1 a 4 horas). A expressão de HLA-A2 da pele humana foi avaliada por citometria de fluxo e qPCR. Explantes de espessura dividida foram gerados pela remoção de gordura da amostra. Os explantes foram lavados com PBS estéril e armazenados em RPMI. Explantes de pele de qualidade foram cortados em pedaços de 1 cm2, colocado em placas frescas com PBS e mantido a baixa temperatura (4-8ºC) até transplantado (~ 1-4 h). Para os transplantes de pele de camundongo e humano, os camundongos previamente raspados foram anestesiados, a pele dorsal foi cortada perto do ombro e a pele de tamanho semelhante foi removida; em seguida, os enxertos foram colocados na área exposta e estabilizados com steri-trips (3M, Nexcare). Os enxertos foram cobertos com uma gaze de vaselina e enrolados com uma bandagem CoFlex de 2 cm de largura (3M, Nexcare) para garantir o enxerto por até 14 dias antes da injeção celular.

Histologia

[621] O enxerto de pele humana e a pele do camundongo circundante foram colhidos 27 dias após a injeção celular, fixados durante a noite a 4ºC em formalina a 10% (proporção 1:10 v/v de tecido para formalina) e armazenados em etanol a 70% antes da inclusão em parafina. Seções de parafina (espessura de 5 µm) e coloração de H&E foram preparadas pelos BC Children's Hospital Research Institute Histology Services (Vancouver, British Columbia, Canadá).

Para a imunocoloração, as seções foram desparafinizadas e reidratadas usando uma série de lavagens com xileno (× 3), soluções de álcool graduadas (2 × 100% de etanol, 1 × 95% de etanol e 1 × 70% de etanol) e 1 × PBS. A recuperação do epítopo induzido pelo calor (HIER) foi realizada em lâminas usando um micro-ondas para atingir 93-95ºC (5 min, alta potência seguida de 20 min, baixa potência) em tampão de citrato de sódio 10 mM (0,5% Tween-20, pH 6,0). Após HIER,

as lâminas foram lavadas com água corrente da torneira, água deionizada e PBS. As seções foram incubadas com DAKO® Protein Block, sem soro (Dako, Burlington, Canadá, X0909) para limitar a coloração de anticorpo não específica. As seções foram então incubadas a 4ºC durante a noite com os seguintes anticorpos primários: FOXP3 (Invitrogen, clone PCH101, 14- 4776-82), CD45 (eBioscience, clone H130, 17-0459), Ki67 (eBioscience, clone 20Raji, 17-5699), Involucrina (Abcam, ab53112). No dia seguinte, as seções foram lavadas suavemente com PBS várias vezes e depois coradas por 1 hora RT com os seguintes anticorpos secundários: anti-488 de rato de burro (Life Tech, A11006), anti-APC de camundongo de cabra (Invitrogen, 1834696), anti-488 de coelho de burro (Life Tech, A21206). Finalmente, as seções foram contrastadas com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para identificar núcleos celulares e montadas usando o meio de montagem VECTASHIELD® com DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, Califórnia, EUA, H-1200). Todos os anticorpos foram diluídos no Diluente de Anticorpo (Dako, Burlington, Canadá, S3022). As imagens foram capturadas usando o microscópio de fluorescência Olympus BX61 e vertical automatizado de campo claro com câmera QImaging Retiga Exi e câmera colorida Olympus DP71.

Análise quantitativa de imagens de fluorescência realizada usando Fiji com o visualizador Olympus Plugin (Schneider et al., 2012; Eliceiri et al., 2012).

[622] As lâminas coradas com H&E foram avaliadas por um patologista clínico de modo cego usando um sistema de pontuação definido por 8 fatores, cada um com uma classificação de 0 a 3-4; Grau de Lerner (0, 1 - degeneração vacuolar focal ou difusa, 2 - disqueratose, 3 - fendas em camadas basais ou superficiais, 4 - perda franca de epiderme), espongiose (0, 1 - apenas camada basal, 2 - até a metade, 3 - espessura total), queratinócitos necróticos (0, 1 - raros (1/hpf), 2 - ocasionais (2-3/hpf), 3 - muitos (> 4/hpf)), localização de queratinócitos necróticos (0, 1 - apenas basal, 2 - até a metade superior, 3 - espessura total), satelitetose (apenas 0 - 1 - 1, 2 - 2-3/hpf, 3 -> 4/hpf), exocitose (0, 1 - focal, 2 - <50% biópsia, 3 -> 50% biópsia), envolvimento anexial (0, 1 - envolvimento menor de qualquer anexo, 2 - envolvimento marcado de <50% anexo, 3 - envolvimento marcado de > 50% anexo) e manguitos linfoide na derme (0, 1 - leve, 2 - abundante, com 3 bandas) (Massi et al., 1999; Fischer et al., 2015, Kanitakis et al., 2008).

[623] qPCR. O RNA foi coletado de amostras de pele humana de acordo com as instruções do fabricante (RNeasy Plus Mini Kit; Qiagen) e convertido em DNA complementar (cDNA). O qPCR foi realizado usando SYBR-verde (Biorad) e iniciadores para IL17, IL6, IL1B, DEFB4, IFNg, TNFa, RNA ribossômico 18S (Tabela 8). Dados de curva de fusão e emissão de SYBR-verde foram coletados. As concentrações relativas foram calculadas usando uma curva padrão e os valores foram normalizados para produtos de amplificação do RNA ribossômico 18S. Os valores do Log2 (RQ) para cada amostra foram obtidos usando o delta duplo Ct (∆∆Ct) (Schmittgen et al., 2008). O valor de ∆Ct de cada amostra foi obtido calculando-se a média de Ct (gene de interesse) - Ct (gene housekeeping). Para obter ∆∆Ct, o ∆Ct da amostra de controle foi subtraído do ∆Ct da amostra tratada. A expressão do múltiplo de gene foi então calculada por 2-(∆∆Ct).

Tabela 8: Iniciadores usados na análise qPCR Nome Oligo Direção Sequência de oligo (5’ a 3') Direto (FWD) ou Reverso (RVS) IL17 humana FWD TCA ACC CGA TTG TCC ACC EM (SEQ ID NO: 199) IL17 humana RVS GAG TTT AGT CCG AAA TGA GGC TG (SEQ ID NO: 200) IL6 humana FWD TCC AAA GAT GTA GCC GCC CCA (SEQ ID NO: 201) IL6 humana RVS CCA GTG CCT CTT TGC TGC TTT CA (SEQ ID NO: 202) IL1B humana FWD CTG AGC TCG CCA GTG AAA TGA TG (SEQ ID NO: 203)

IL1B humana RVS TGC TGT AGT GGT GGT CGG AGA (SEQ ID NO: 204) DEFB4humana FWD ACC TGC CTT AAG AGT GGA GCC A (SEQ ID NO: 205) DEFB4 humana RVS ACA TGT CGC ACG TCT CTG ATG A (SEQ ID NO: 206) IFNG humano FWD TGC CCA GAG CAT CCA AAA GA (SEQ ID NO: 207) IFNG humano RVS TGT ATT GCT TTG CGT TGG AC (SEQ ID NO: 208) TNFA humano FWD AGG CGC TCC CCA AGA AGA CA (SEQ ID NO: 209) TNFA humano RVS GGG CTG ATT AGA GAG AGG TCC CT (SEQ ID NO: 210) RNA ribossômico FWD CAA GAC GGA CCA GAG CGA AA 18S (SEQ ID NO: 211) RNA ribossômico RVS GGC GGG TCA TGG GAA TAA C 18S (SEQ ID NO: 212)

[624] Luciferase. Para avaliar Treg homing na direção de enxertos de pele de camundongo que expressam HLA- A2 in vivo, Tregs classificadas (CD4+CD25hiCD127lo) foram estimuladas com células L como descrito acima. No dia seguinte, as células foram transduzidas com lentivírus HER2- CAR, mA2-CAR ou H1k2 hA2-CAR em uma MOI de 10 e 8h mais tarde com luciferase-GFP-lentivírus em uma MOI de 5. O plasmídeo lentiviral que codifica uma proteína de fusão luciferase-GFP de besouro (pELNS.CBG-T2A-GFP (CBR)) foi usado como descrito anteriormente (Barrett et al., 2014). Após 7 dias de cultura, as Tregs GFP+GNGFR+ com transdução dupla que expressam o CAR e a luciferase foram classificadas antes da re-estimulação com células L, como descrito acima. No dia 12 da cultura, 1- 3 X 106 Tregs luciferase-CAR e 6 X 106 PBMCs HLA-A2 alogênicas humanas foram injetadas intravenosamente em camundongos NSG com pele transplantada. Para imagens bioluminescentes, o sal de potássio D-luciferina (150 mg/kg, Gold Bio) foi injetado i.p. imediatamente antes da anestesia com isoflurano e as imagens foram adquiridas dentro de 15 a 20 minutos em Ami-X (Spectral Instruments Imaging). Os dados foram analisados com o software AmiView (Spectral Instruments Imaging, versão

1.7.06) e o sinal luminescente foi quantificado como a proporção de fótons/s/cm2/estadieno no enxerto de pele HLA- A2+ em relação ao HLA-A2-. No desfecho experimental, foram colhidos linfonodos axilares de drenagem de pele baço, colocados em um filtro de célula de 70 µm (BD Falcon), depois fragmentados e filtrados através do êmbolo de uma seringa de 1cc. As células foram então coradas para citometria de fluxo.

[625] Análise estatística. Todas as estatísticas foram feitas usando o Prism 7.0b. O IBM*SPSS Statistics Versão 24.0.0.0 foi usado para a Figura 9.

Resultados Construção de CARs humanizados específicos para HLA-A2

[626] A sequência de aminoácidos das regiões variáveis das cadeias pesada e leve dos mAbs BB7.2 de camundongo foi alinhada às sequências de imunoglobulina humana obtidas no banco de dados internacional ImMunoGeneTics information system® (IMGT®) usando a ferramenta IgBLAST disponível no National Center for Biotechnology Information (NCBI). O sistema de delimitação do gene V foi ajustado para as sequências de Kabat para obter as CDRs definidas por Kabat (Kabat et al., 1991). Além disso, a definição de Chothia (Chothia et al., 1987) foi identificada.

[627] Vários genes diferentes da linhagem germinativa humana foram testados como sequências estruturais para o enxerto de CDR. Além de identificar as sequências da linhagem germinativa humana que eram mais comparáveis à sequência do camundongo, os comprimentos de CDR também foram considerados para manter a estrutura o máximo possível. As CDRs humanas (numeração de Kabat) foram substituídas pelas CDRs de camundongos do anticorpo BB7.2.

Além disso, aminoácidos de CDR adicionais da cadeia pesada foram substituídos pela combinação da numeração de Chothia e Kabat. Por fim, foram geradas 6 cadeias pesadas humanizadas diferentes e 5 cadeias leves humanizadas diferentes, e um total de 20 receptores de antígeno quimérico diferentes foram gerados combinando as cadeias pesada e leve humanizadas.

Expressão e especificidade de antígenos de CARs específicos para HLA-A2 humanizados

[628] Para testar a especificidade do antígeno, os vários construtos de hA2-CAR foram transitoriamente transfectados para células 293T, coradas com tetrâmeros HLA- A*02:01 e analisadas por citometria de fluxo. Onze construtos de hA2-CAR foram expressos e ligados ao tetrâmero A*02:01 (Figura 2).

[629] Em seguida, comparamos a força de ligação dos vários construtos de hA2-CAR. As células 293T transfectadas transitoriamente foram coradas com diluições crescentes de tetrâmero A*02:01, depois analisadas por citometria de fluxo. Como mostrado na Figura 3 (A, B e C), onze construtos de hA2-CAR ligam o tetrâmero A*02:01 a um alto grau, de maneira dependente da concentração do tetrâmero.

Estimulação mediada por hA2-CAR ativa Tregs

[630] Para testar a função de A2-CAR em Tregs, as células CD4+CD25hiCD127lo foram separadas do sangue periférico. Como mostrado na Figura 4 (A, B e C), as Tregs foram estimuladas, transduzidas e cultivadas por mais 6-7 dias. No final de 7-8 dias de cultura, as células foram purificadas como células NGFR+ e a expressão da superfície celular da variante hA2-CAR foi testada com citometria de fluxo. Como mostrado na Figura 4, Tregs transduzidas com construtos de hA2-CAR mostraram coloração positiva pelo tetrâmero HLA-A2 em comparação com as Tregs transduzidas com o construto de controle ΔNGFR, indicando uma preservação da especificidade do antígeno para Tregs que expressam a hA2- CAR. Foram encontradas dificuldades técnicas na produção de lentivírus de alto título para (H1k3) e este CAR não foi testado em Tregs neste experimento. A expressão e a especificidade da superfície celular de CAR foram testadas por coloração com um tetrâmero A*02:01, revelando que H2k2, H4k4 e H5k4 tinham um padrão bimodal de expressão em Tregs, com menor intensidade média de fluorescência (MFI) de células com A2-tetrâmero+ (Figura 4D e 4E).

[631] Em seguida, investigamos se a estimulação via Tregs ativadas por hA2-CAR (Tregs hA2-CAR) em comparação com Tregs expressando apenas o marcador de transdução NGFR truncado (Tregs NGFR). As Tregs NGFR e hA2-CAR foram deixadas sem estímulos, estimuladas via CAR com células K562 expressando HLA-A*02:01 ou estimuladas via TCR com células K562 expressando CD64, um receptor Fc de alta afinidade, pré-carregado com anticorpos anti-CD3/anti-CD28. A comparação entre Tregs NGFR e Tregs hA2-CAR mostrou uma expressão muito maior de CD69 e CD71 estimulada por CAR na maioria das Tregs hA2-CAR em vários pontos no tempo. Por outro lado, quando estimuladas por meio do TCR, tanto as Tregs NGFR quanto as hA2-CAR foram capazes de regular positivamente o CD69, indicando que estas mantêm sua capacidade de sinalizar através do TCR após a transdução do DNA do CAR (como mostrado na Figura 13). A estimulação de Tregs mediada por hA2-CAR também causou uma regulação positiva significativamente maior de proteínas associadas à função Treg, demonstrando que a estimulação através do hA2- CAR preserva a alta expressão esperada de CTLA-4 e LAP (Figuras 5A-F).

Reatividade cruzada de construtos hA2-CAR em outros alelos HLA de classe I

[632] Existem muitos alelos diferentes do HLA que evoluíram ao longo do tempo a partir de um número menor de alelos ancestrais. Consequentemente, existem famílias de alelos que podem diferir em apenas alguns aminoácidos e um único anticorpo anti-HLA pode reconhecer vários alelos dentro de uma família relacionada à evolução. Sabe-se que o anticorpo monoclonal de camundongo (BB7.2) possui reatividade cruzada com alelos HLA-A adicionais (Hilton & Parham, 2013.). Especificamente, quando testado em um ensaio de fase sólida, o anticorpo BB7.2 reconheceu cinco subtipos de HLA-A2 (*02:01,*02:02,*02:03,*02:05,*02:06) e para ter reatividade cruzada com o HLA-A*69:01 e, quando testado em altas concentrações, também com o HLA-A*23:01, A*24:02, A*24:03, A*68:01 e A*68:02 (Hilton & Parham, 2013.). No contexto do transplante, é necessário o conhecimento da especificidade de aloAg para garantir um direcionamento específico para células, tecidos e/ou órgãos alogênicos. A maneira tradicional de medir a alorreatividade das células T é imprecisa e não quantitativa, pois envolve MLRs funcionais com grandes bancos de PBMCs haplotipadas. Para avaliar a reatividade cruzada de anticorpos anti-HLA-A2 humanizados da invenção e comparado ao anticorpo BB7.2, adaptamos o ensaio de fase sólida ONE Lambda, projetado para medir anticorpos anti-HLA no soro, para medir o grânulo revestido com HLA aos CARs humanizados de interesse. O CAR BB7.2 foi gerado como descrito em MacDonald, K.G. (2016).

Tregs NGFR+ que expressam os CAR humanizados indicados foram incubados com grânulos de antígeno reativo único do painel de fluxo, com ligação a uma única classe de grânulos quantificada como a perda de sinal no gate de grânulos no gráfico de dispersão para frente/lado (consulte os métodos para obter detalhes). Os dados foram normalizados para o número de grânulos de controle negativo na amostra e a quantidade de ligação relativa às Tregs que expressam hCAR foi calculada em relação à quantidade de ligação pelas Tregs de controle NGFR pelo número de grânulos negativos na amostra de NGFR multiplicado pelo número de grânulos negativos na amostra NGFR. Para validar a metodologia, a ligação relativa de cada construto m/hA2-CAR para HLA-A*02:01, conforme determinado pelo ensaio de células FlowPRT (Figura 6B), foi comparada à MFI da ligação ao tetrâmero (Figura 6C). Esta análise revelou uma forte correlação direta entre os dois métodos de detecção da ligação A*02:01. Perguntamos ainda se a quantidade de ligação A*02:01, conforme determinada pelo ensaio celular FlowPRT, se correlacionava com o efeito biológico da exposição a A*02:01. De fato, descobrimos que havia uma correlação direta entre a quantidade de ligação A*02:01 quantificada pelo teste de células FlowPRT e a estimulação da ativação de Treg, conforme julgado pela regulação positiva de CD69 após a exposição a APCs que expressam A*02:01 (Figura 6D). Estes dados demonstram a utilidade do método celular FlowPRT para medir a capacidade de CARs específicos de aloAg se ligarem a diferentes alelos HLA.

[633] Como mostrado na Figura 6 e Tabela 9, todos os construtos hA2-CAR significativamente se ligação a HLA- A*02:01, confirmando os ensaios de ligação ao tetrâmero.

Quando testamos a ligação do anticorpo BB7.2 no ensaio de antígeno único FlowPRA, confirmamos a ligação alta a A*69:01, mas não foi possível confirmar a reatividade cruzada com A*23:01 ou A*24:02 (Figura 6). Ao testar a capacidade relativa das Tregs m/hA2-CAR de se ligarem a vários alelos HLA-A, encontramos que mA2-CAR-Tregs ligados significativamente a HLA-A*03:01, A*25:01, A*29:02, A*30:01, A*31:01, A*33:01, A*36:01, A*68:01 e A*69:01 (Figura 6, Tabela 9). Por outro lado, todas as variantes de Tregs de hA2-CAR exibiram surpreendentemente reatividade cruzada reduzida em comparação com Tregs mA2-CAR (Figura 6, Tabela 9). Como esperado, todos os construtos CAR se ligaram ao HLA-A*69:01, uma variante de A*02:01 diferente de apenas 6 aminoácidos. Nenhum dos construtos CAR exibiu qualquer ligação significativa ao HLA-B (Figura 6).

[634] A relação entre o grau de ligação ao Ag de CAR-Treg e a atividade biológica é desconhecida. Para definir o significado biológico da reatividade cruzada do HLA, geramos APCs expressando HLA-A*24:02, A*25:01 ou A*68:01; todas as células tinham níveis comparáveis de expressão de HLA-A (dados não mostrados). Descobrimos que apenas a co- cultura com células que expressam HLA-A*02:01 resultou em ativação significativa de m/hCAR-Tregs, a julgar pela expressão regulada positivamente de CD69, CD71, LAP, CTLA-4 (Figura 6I) ou CD40L (dados não mostrados). Esses dados sugerem que a ativação eficaz de Tregs mediada por CAR requer interações de alta afinidade e/ou avidez. Consequentemente, enquanto alguns hA2-CARs mostram ligação A*25:01 e A*68:01 no ensaio FlowPRT, a força da ligação é insuficiente para a ativação celular.

Tabela 9. Interações de ligação entre m/hA2-CARs e a proteína HLA-A/B foram estatisticamente significativas (ANOVA de duas vias, pós-teste de Dunnett).

Alelo HLA CAR Valor p mA2-CAR 0,0001 H1k2 0,0001 H2K2 0,0001 H4k2 0,0001 H5k2 0,0001 A*02:01 H6k2 0,0001 H4k3 0,0001 H5k3 0,0001 H3k4 0,0001 H4k4 0,0006 H5k4 0,0001 A*25:01 mA2-CAR 0,0001 H1K2 0,0061 A*69:01 mA2-CAR 0,0001 H4k2 0,0001 H5k2 0,0001 H1k2 0,0001 H3k4 0,0013 H2k2 0,0084 H5k3 0,0001 H4k3 0,0001 H6k2 0,0060 A*03:01 mA2-CAR 0,0315

A*29:02 mA2-CAR 0,0001 A*30:01 mA2-CAR 0,0001 A*31:01 mA2-CAR 0,0001 H1k2 0,0077 A*33:01 mA2-CAR 0,0019 A*36:01 mA2-CAR 0,0035 H1k2 0,0082 A*68:01 mA2-CAR 0,0001 H1k2 0,0001 H5k2 0,0337 H6k2 0,0009

[635] Desenvolvemos uma nova maneira de testar sistematicamente a especificidade de CARs para aloantígenos, criando uma nova plataforma com a qual se identificam, de forma abrangente, construtos com especificidade de alelo definida. Surpreendentemente, descobrimos que, em comparação com o mA2-CAR, a humanização do CAR diminuiu a reatividade cruzada com várias variantes alélicas do HLA-A.

Tregs hA2-CAR medeiam a supressão específica de HLA-A2 in vitro

[636] Para testar a capacidade de um hA2-CAR para estimular a atividade supressora específica de antígeno em Tregs, usamos reações mistas de linfócitos (MLRs) de acordo com o desenho experimental mostrado na Figura 7A.

Especificamente, a proliferação de células T negativas para HLA-A*02:01 foi estimulada por co-cultura com células dendríticas positivas para HLA-A*02:01 positivas na ausência ou presença de proporções crescentes de Tregs que não foram traduzidas ou transduzidas com o lentivírus NGFR de controle ou o lentivírus que codifica o H1k2 hA2-CAR. Como mostrado nas Figuras 7B-E, as Tregs que expressam hA2-CAR foram significativamente mais capazes de suprimir a proliferação de células T CD4+ estimuladas por aloantígeno em comparação com as Tregs de controle transduzidas com o construto lentiviral de controle NGFR.

Tregs hA2-CAR medeiam a supressão específica de HLA-A2 da GVHD xenogênica in vivo

[637] Para testar a capacidade funcional de Tregs hA2-CAR in vivo, usamos um modelo de camundongo no qual PBMCs humanas enxertadas em camundongos NSG imunodeficientes causavam GVHD xenogênica. 8 X 106 PBMCs a partir de um doador HLA-A2+ foram injetadas em camundongos NSG irradiados com ou sem Tregs expressando o H1k2 hA2-CAR. A proporção de PBMC para Tregs hA2-CAR testada foi de 1: 2 (ou seja, 8 X 106 PBMCs a 4 X 106 Tregs). Os camundongos foram monitorados durante 7 semanas pela pontuação clínica, conforme descrito nos Métodos. Em alinhamento com os dados in vitro da Figura 7, os camundongos que receberam Tregs que expressam hA2-CAR tiveram melhora na sobrevida, redução da perda de peso e atraso no início da xenoGVHD em comparação com camundongos que não receberam Tregs heg2-CAR (linha cinza sólida)

(Figuras 8A, B e C). Enquanto o efeito biológico das Tregs foi observado, não detectamos Tregs m/hA2-CAR circulantes, medidas 14 dias após a injeção (Figura 8D e 8E).

Tráfego de Tregs hA2-CAR para enxertos de pele HLA-A2+ in vivo

[638] Para testar como a especificidade direcionada ao CAR afetou o tráfego de Treg, realizamos transplantes de pele lado a lado de camundongos transgênicos NSG ou NSG- A*02:01 em camundongos NSG (Figura 9A). Após a recuperação do enxerto, as PBMCs foram injetadas na ausência ou presença de Tregs m/hA2-CAR ou com Tregs HER2-CAR como Treg policlonal inespecífica de controle (MacDonald et al., 2016). Além do CAR, as Tregs foram co-transduzidas com um lentivírus que codifica uma proteína de fusão luciferase-GFP. A imagem bioluminescente foi realizada após a injeção de D-luciferina até 21 dias após a injeção de Treg (Barrett et al., 2014).

As Tregs policlonais HER2-CAR mostraram um padrão direcionado de tráfego para os aloenxertos, mas foram igualmente distribuídos entre os enxertos positivos e negativos para A2. Essas Tregs policlonais podem estar migrando em resposta aos sinais inflamatórios que emanam da pele pós-operatória, porque em camundongos imunodeficientes não manipulados, as células T humanas tipicamente trafegam para o pulmão (Nervi et al. 2007). Em contraste com as Tregs policlonais HER2-CAR que trafegavam igualmente para a pele negativa e positiva para A2, ambas as Tregs m/hA2-CAR trafegavam rapidamente para a pele que expressa A2. Além disso, as Tregs m/hA2-CAR persistiram mais tempo do que as Tregs HER2-CAR não específicas. Enquanto as Tregs HER2-CAR eram indetectáveis no dia 21, um forte sinal de Tregs m/hA2- CAR permaneceu (Figura 9B). A quantificação da proporção de luminescência no enxerto A2 positivo versus A2 negativo revelou tráfego significativo direcionado por Ag das Tregs H1k2 e mA2-CAR para o enxerto que expressa A2 (Figura 9C e 9D).

[639] Além das Tregs m/hA2-CAR localizadas no enxerto, no dia 21, notamos um sinal adjacente consistente com a localização de um linfonodo local de drenagem. No sacrifício, os linfonodos de drenagem do enxerto foram coletados e a análise citométrica de fluxo revelou uma proporção significativa de Tregs CAR hCD4+FOXP3+ΔNGFR+A2- tetrâmero+. Por outro lado, muito poucas dessas células foram detectadas no baço (Figura 10B e C). Esse processo migratório em duas etapas do enxerto para o linfonodo, já havia sido relatado anteriormente como necessário para a indução de tolerância (Zhang et al. 2009). É importante ressaltar que as Tregs CAR de linfonodo-homing mantiveram a expressão de FOXP3 e CAR, ilustrando seu fenótipo estável.

Tregs hA2-CAR evitam a rejeição de aloenxertos de pele humana

[640] Para avaliar o potencial imunorregulador de Tregs hA2-CAR em um modelo de transplante de órgão sólido, utilizamos um modelo humanizado de transplante de pele no qual camundongos NSG foram transplantados com enxertos de pele humanos HLA-A2pos. Após 6 semanas, os camundongos foram injetados com PBMCs HLA-A2neg com ou sem Tregs H1k2 hA2-CAR autólogos. Quatro semanas após a injeção celular, os camundongos foram sacrificados e o enxerto de pele foi coletado para avaliação da patologia e expressão de citocinas inflamatórias. Todos os camundongos mantiveram um peso corporal estável, indicando uma falta de GvHD xenogênica (Figura 11A), com níveis semelhantes de enxerto de leucócitos humanos no sangue e baço (Figura 11B). As seções de H&E foram avaliadas usando uma escala de 25 pontos, revelando uma diminuição significativa na pontuação cumulativa de rejeição patológica em camundongos que receberam Tregs H1k2 hA2-CAR versus PBMC (Figura 11C). A imunocoloração revelou que, em comparação aos camundongos que receberam PBMCs isoladamente, os camundongos que receberam PBMCs e Tregs H1k2 hA2-CAR tiveram uma redução significativa nos queratinócitos Ki67+ e diminuição da destruição de involucrina (Figura 11D). A quantificação de qPCR também mostrou uma redução geral nas citocinas inflamatórias no enxerto de camundongos tratados com Treg H1k2 hA2-CAR (Figura 11E).

[641] Quanto ao modelo xenogênico de GVHD, enquanto PBMCs eram detectáveis no sangue, as Tregs CAR não eram (Figura 12). No entanto, a imunocoloração revelou que, em comparação com os camundongos que receberam PBMCs isoladamente, os camundongos que receberam PBMCs e Tregs H1k2 hA2-CAR apresentaram uma proporção significativamente maior de células FOXP3+ no enxerto (Figura 11F). A presença de células FOXP3+ era exclusiva para o enxerto de pele transplantado, pois eram indetectáveis no intestino, fígado ou pulmão (Figura 11G). Esses dados mostram que, como no modelo com pele de NSG transgênico para A2, as Tregs H1k2 hA2-CAR trafegam especificamente para o aloenxerto de pele humano A2+, onde persistem indefinidamente.

[642] Este pedido contém uma listagem de sequência em formato eletrônico como um arquivo de texto, “CDRD- 003WO_SEQ LISTING_ST25”, criado em 18 de setembro de 2018 e com um tamanho de 320 KB. O conteúdo do arquivo de texto é incorporado por referência aqui na sua totalidade.

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[723] Embora a invenção anterior tenha sido descrita em alguns detalhes para fins de clareza e compreensão, será claro para um técnico especialista no assunto, a partir da leitura desta divulgação, que várias alterações na forma e nos detalhes podem ser feitas sem se afastar do verdadeiro escopo da invenção. Por exemplo, todas as técnicas e aparelhos descritos acima podem ser usados em várias combinações.

Todas as publicações, patentes, pedidos de patentes e/ou outros documentos citados neste pedido são incorporados por referência na íntegra para todos os fins,

na mesma medida em que cada publicação, patente, pedido de patente e/ou outro documento foram indicados individualmente a ser incorporado por referência para todos os fins.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo anti-HLA-A2 humanizado caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo compete pela ligação ao HLA-A2 com um anticorpo compreendendo: uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1) possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 183; uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 2 (HCDR2) possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 185; uma região determinante de complementaridade da cadeia pesada 3 (HCDR3) possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 187; uma região determinante de complementaridade da cadeia leve 1 (LCDR1) possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 188; uma região determinante de complementaridade da cadeia leve 2 (LCDR2) possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 189; e uma região determinante de complementaridade da cadeia leve 3 (LCDR3) possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 190.

em que o referido anticorpo tem menos reatividade a pelo menos um subtipo HLA-A selecionado de um ou mais de HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, em comparação com um anticorpo

BB7.2, preferencialmente em comparação com um BB7.2 scFv.

2. Anticorpo anti-HLA-A2 humanizado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo se liga ao mesmo epítopo HLA-A2 que um anticorpo compreendendo: uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1) possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 183; uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 2 (HCDR2) possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 185; uma região determinante de complementaridade da cadeia pesada 3 (HCDR3) possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 187; uma região determinante de complementaridade da cadeia leve 1 (LCDR1) possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 188; uma região determinante de complementaridade da cadeia leve 2 (LCDR2) possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 189; e uma região determinante de complementaridade da cadeia leve 3 (LCDR3) possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 190.

3. Anticorpo anti-HLA-A2 humanizado, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: - SYHIQ (SEQ ID NO: 1) e GYTFTSY (SEQ ID NO: 2), - YPGDGS (SEQ ID NO: 4), WIYPGDGSTQYNEKFKG (SEQ ID NO: 3), WIYPGDGSTKYSQKFQG (SEQ ID NO: 5) e WIYPGDGSTX10YX12X13KFX16G (SEQ ID NO: 10), em que X10 é Q ou K, X12 é N ou S, X13 é E ou Q e X16 é K ou Q, e - EGTYYAMDY (SEQ ID NO: 6); e/ou em que o referido anticorpo compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: - RSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO: 7) - KVSNRFS (SEQ ID NO: 8) - FQGSHVPRT (SEQ ID NO: 9).

4. Anticorpo anti-HLA-A2 humanizado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo: - uma região estrutural 1 (VH FR1) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS (SEQ ID NO: 11) e QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 12) e/ou

- uma região estrutural 2 (VH FR2) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em:

WVRQAPGQX9LEWMGX15 (SEQ ID NO: 13),

WVRQAPGQX9LEWMGX15WI (SEQ ID NO: 17),

HIQWVRQAPGQX12LEWMGX18WI (SEQ ID NO: 21) e

HIQWVRQAPGQX12LEWMGX18 (SEQ ID NO: 25), em que:

X9 é R ou G e X15 é I ou ausente na SEQ ID NO: 13;

X9 é R ou G e X15 é I ou está ausente na SEQ ID NO: 17;

X12 é R ou G e X18 é I ou ausente na SEQ ID NO: 21; e

X12 é R ou G e X18 é I ou ausente na SEQ ID NO: 25 e/ou

- uma região estrutural 3 (VH FR3) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em:

X1VTX4TX6DTSX10STAYMX16LSX19LRSX23DX25AVYYCAR (SEQ ID NO:

29),

TX2YX4X5KFX8GX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34AVYYCA

R (SEQ ID NO: 35),

TQYNEKFKGX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34AVYYCAR

(SEQ ID NO: 36) e

TKYSQKFQGX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34AVYYCAR

(SEQ ID NO: 37), em que:

X1 é R ou ausente, X4 é I ou M, X6 é R ou A, X10 é A, T ou I, X16 é E ou L, X19 é S ou R, X23 é E ou D e X25 é T ou M na SEQ ID NO: 29;

X2 é Q ou K, X4 é N ou S, X5 é E ou Q, X8 é K ou Q, X10 é R ou ausente, X13 é I ou M, X15 é R ou A, X19 é A, T ou I,

X25 é E ou L, X28 é S ou R, X32 é E ou D e X34 é T ou M na SEQ

ID NO: 35;

X10 é R ou ausente, X13 é I ou M, X15 é R ou A, X19 é A,

T ou I, X25 é E ou L, X28 é S ou R, X32 é E ou D e X34 é T ou

M na SEQ ID NO: 36; e

X10 é R ou ausente, X13 é I ou M, X15 é R ou A, X19 é A,

T ou I, X25 é E ou L, X28 é S ou R, X32 é E ou D e X34 é T ou

M na SEQ ID NO: 37 e/ou

- uma região estrutural 4 (VH FR4) que compreende a sequência de aminoácidos WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 44), e/ou em que o referido anticorpo compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo:

- uma região estrutural 1 (VL FR1) que compreende a sequência de aminoácidos DX2VMTQX7PLSX11X12VTX15GQPASISX23 (SEQ

ID NO: 46), em que X2 é V ou I, X7 é S ou T, X11 é L ou S, X12 é P ou S, X15 é L ou P e X23 é C ou F, e/ou

- uma região estrutural 2 (VL FR2) que compreende a sequência de aminoácidos WX2X3QX5PGQX9PX11X12LIY (SEQ ID NO:

51), em que X2 é F ou Y, X3 é Q ou L, X5 é R ou K, X9 é S ou

P, X11 é R ou Q e X12 é R ou L e/ou

- uma região estrutural 3 (VL FR3) que compreende a sequência de aminoácidos GVPDRFSGSGX11GTDFTLKISRVEAEDVGVYYC

(SEQ ID NO: 56), em que X11 é S ou A, e/ou

- uma região estrutural 4 (VL FR4) que compreende a sequência de aminoácidos FGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 59).

5. Anticorpo anti-HLA-A2 humanizado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 61-66, e/ou em que o referido anticorpo compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 67-71.

6. Anticorpo anti-HLA-A2 humanizado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é um scFv, preferencialmente em que o referido scFv compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 72-91.

7. Receptor de antígeno quimérico (CAR) caracterizado pelo fato de que compreende: (i) um domínio extracelular compreendendo o anticorpo anti-HLA-A2 humanizado conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6; (ii) um domínio transmembranar; e (iii) um domínio citoplasmático compreendendo um domínio de sinalização intracelular;

em que o referido CAR é capaz de ser expresso em uma célula imune, de modo que o referido CAR se liga especificamente ao HLA-A2.

8. CAR, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma região de articulação, preferencialmente em que a referida região de articulação compreende uma região de haste de CD8a.

9. CAR, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que o referido domínio transmembranar compreende um domínio transmembranar de uma proteína selecionada do grupo que consiste em: CD3 gama, CD3 delta, CD3 epsilon, CD3 zeta, a cadeia alfa do receptor de célula T, a cadeia beta do receptor de célula T, a cadeia gama do receptor de célula T, a cadeia delta do receptor de células T, CD28, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD 137 e CD 154, e qualquer combinação das mesmas.

10. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que o referido domínio de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização funcional de uma proteína selecionada do grupo que consiste em: CD3 gama, CD3 delta, CD3 epsilon, CD3 zeta, FcR gama, FcR alfa, FcR epsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b e CD66d, e qualquer combinação das mesmas, preferencialmente em que o referido domínio de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização funcional de CD3 zeta.

11. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizado pelo fato de que o referido domínio de sinalização intracelular compreende ainda um domínio co- estimulador, preferencialmente em que o referido domínio co- estimulador compreende um domínio de sinalização funcional de uma proteína selecionada do grupo consistindo em OX40, CD27, CD28, antígeno-1 associado à função de linfócitos (LFA- 1)(CD11a/CD18), TNFR1 (CD120a/TNFRSF1A), TNFR2 (CD120b/TNFRSF1B), CTLA-4 (CD152), CD95, ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), CD2, CD30, CD40, PD-1, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ICAM-1, um ligante que se liga especificamente com CD83, IL2ra (CD25), IL6Ra (CD126), IL-7Ra (CD127), IL-13RA1, IL- 13RA2, IL-33R(IL1RL1), IL-10RA, IL-10RB, IL-4R, IL-5R (CSF2RB), ARHR, receptor BAFF, IL-21R, TGFbR1, TGFbR2, TGFbR3, cadeia gama comum, e qualquer combinação das mesmas, mais preferencialmente em que o referido domínio co- estimulador compreende um domínio de sinalização funcional de uma proteína selecionada entre CD28 e 4-1BB.

12. Célula imune modificada caracterizada pelo fato de que compreende o CAR conforme definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 11, preferencialmente em que a referida célula imune modificada é uma célula T reguladora (Treg).

13. Ácido nucleico caracterizado pelo fato de que codifica o CAR conforme definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 11.

14. Vetor de expressão caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico conforme definido na reivindicação 13.

15. Célula imune caracterizada pelo fato de que compreende o vetor de expressão conforme definido na reivindicação 14, preferencialmente em que a referida célula imune é uma célula T reguladora (Treg).

16. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende uma pluralidade de células imunes modificadas conforme definidas na reivindicação 12.

17. Célula imune modificada, de acordo com a reivindicação 12, ou composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que é para promover tolerância imune em um indivíduo, preferencialmente em que a referida tolerância imune é tolerância a um órgão ou tecido transplantado, e/ou para prevenir ou tratar doença de enxerto versus hospedeiro (GVHD) em um indivíduo, em que preferencialmente o referido indivíduo está sofrendo ou sofreu um transplante de células tronco hematopoiéticas e/ou para prevenir ou tratar a rejeição de transplante de órgão ou tecido em um indivíduo.