CN112888481A - 包含tnfr2结构域的新型car构建体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含人TNFR2跨膜结构域(TM)或其片段或变体和/或人TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体的嵌合抗原受体(CAR)，以及表达上述CAR的免疫细胞。本发明进一步涉及包括施用表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞的治疗方法，所述嵌合抗原受体(CAR)包含人TNFR2跨膜结构域(TM)或其片段或变体和/或人TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体。

Description

包含TNFR2结构域的新型CAR构建体
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年8月10日提交的美国临时专利申请62/717,234的优先权，此申请的公开内容通过引用以其全文并入本文。
序列表
本申请含有已以ASCII格式电子提交的序列表，且其通过引用以其全文并入本文。序列表的电子拷贝创建于2019年8月9日，命名为025297_WO003_SL.txt，且大小为195,578个字节。
发明领域
本发明涉及免疫疗法领域。特别地，本发明涉及包含TNFR2跨膜结构域(TM)或其片段或变体和/或TNFR2细胞内结构域或其片段或变体的嵌合抗原受体(CAR)。本发明还涉及表达所述CAR的细胞群体及其在治疗疾病或病症中的用途。
发明背景
嵌合抗原受体(CAR)技术近来已经彻底革新了癌症疗法，尤其是对于B细胞淋巴瘤和白血病而言。尽管对CAR工程化的促炎性T细胞进行了广泛研究，并且显示出其在早期临床试验中对血液恶性肿瘤治疗中的有效性，但对CAR工程化的调节性T细胞(Treg)的评估较少。
人Treg在维持免疫稳态中发挥关键作用，并因此可以在多种临床条件下用作治疗手段。它们还具有强力的免疫抑制特性，可在治疗环境中利用这些特性产生抗原特异性免疫调节作用。由于这些原因，已经开发出Treg细胞疗法，其目的在于治疗例如慢性炎性疾病、自身免疫疾病、过敏性疾病以及器官移植病况例如移植排斥或移植物抗宿主病(GvHD)。
在本领域中，已在提出了使用CAR构建体来转导Treg细胞，例如在PCT专利公开WO2008/095141中。
已经开发出在细胞外、跨膜和胞质结构域不同的多种分子形式的CAR。在T效应细胞领域，嵌合抗原受体(CAR)的细胞内组件通常由CD28、ICOS或4-1BB结构域与CD3ζ串联组成。然而，使用这些典型组件来设计CAR Treg细胞通常会导致不受控的组成型信号传导，从而导致不受控的组成型激活。这种递补信号传导(tonic signaling)(对应于不依赖抗原的激活背景)能导致CAR Treg细胞过早耗尽，从而限制其治疗用途。
因此，需要在免疫细胞，尤其是Treg细胞中表达时具有较低的递补信号传导的新型CAR构建体。
发明概述
本发明提供了包含TNFR2跨膜结构域或其片段或变体和/或TNFR2细胞内结构域或其片段或变体的新型CAR构建体。如本文所述，表达所述CAR构建体的工程化T细胞和工程化Treg细胞，相比于表达传统CAR的所述细胞，显现递补信号转导的大幅降低。在CAR参与后，工程化Treg细胞对T效应细胞的增殖显示出高效的抑制活性，从而证明了这些Treg细胞在细胞疗法中的优势。
在一些实施方案中，人Treg细胞显示以下特征中的一个或多个：a)与表达具有人CD8跨膜结构域和4-1BB共刺激性细胞内信号传导结构域的CAR的Treg相比，本发明的Treg细胞在细胞表面上表达的CAR水平较低，但仍显示相当水平的CAR特异性激活；b)，本发明的Treg细胞在超过一周(例如培养九天)后仍保持其Treg表型(例如，FoxP3、Helios和CD62L的高水平表达，以及CD127的低水平表达)；和c)本发明的Treg细胞能够在体内(例如在小鼠GvHD模型中)控制GvHD。
在一些实施方案中，本发明提供了包含细胞外结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域的CAR，其中
-跨膜结构域包含人肿瘤坏死因子受体2(TNFR2)跨膜结构域或其片段或变体，或
-细胞内结构域包含人TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体，或
-(i)和(ii)两者。
在某些实施方案中，本文所述的CAR进一步包含细胞外铰链结构域，例如人CD8或CD28的铰链区。在具体的实施方案中，铰链结构域包含SEQ ID NO：14的序列或与SEQ IDNO：14具有至少约70％同一性的序列。
在某些实施方案中，本文所述的CAR的细胞内结构域包含免疫细胞第一细胞内信号传导结构域(primary intracellular signaling domain)，例如人CD3的T细胞第一细胞内信号传导结构域。在具体的实施方案中，细胞内结构域包含人CD3ζ的第一细胞内信号传导结构域，其任选包含SEQ ID NO：28、29、30或31的序列或与SEQ ID NO：28、29、30或31具有至少约70％同一性的序列。
在某些实施方案中，CAR包含：
-细胞外结合结构域，
-包含人CD8或CD28的铰链区的细胞外铰链结构域，
-包含人TNFR2跨膜结构域或其片段或变体的跨膜结构域，和
-包含人CD3ζ的第一细胞内信号传导结构域的细胞内结构域。
在某些实施方案中，CAR包含：
-细胞外结合结构域，
-包含人CD8或CD28的铰链区的细胞外铰链结构域，
跨膜结构域，和
-包含人TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体，以及人CD3ζ的第一细胞内信号传导结构域的细胞内结构域。
在某些实施方案中，CAR包含：
-细胞外结合结构域，
-包含人CD8或CD28的铰链区的细胞外铰链结构域，
-包含人TNFR2跨膜结构域或其片段或变体的跨膜结构域，和
-包含人TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体，以及人CD3ζ的第一细胞内信号传导结构域的细胞内结构域。
在某些实施方案中，本文所述的CAR的跨膜结构域包含SEQ ID NO：22或与SEQ IDNO：22具有至少约70％同一性的序列的至少八个连续氨基酸。在某些实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO：22的至少八个连续氨基酸残基与来自非TNFR2的蛋白的跨膜结构域的氨基酸残基的组合。在某些实施方案中，跨膜结构域包含VNCVIMTQV(SEQ ID NO：63)的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本文所述的CAR的细胞内结构域包含SEQ ID NO：34或与SEQID NO：34具有至少约70％同一性的序列的至少30个连续氨基酸残基。在某些实施方案中，细胞内结构域包含SEQ ID NO：34的至少30个连续氨基酸残基与来自非TNFR2的蛋白的共刺激性细胞内信号传导结构域的氨基酸残基的组合。在某些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO：34的第1至第70个、第1至第115个或第1至第156个残基。
在某些实施方案中，CAR包含：
-细胞外结合结构域，
-包含SEQ ID NO：14的CD8铰链区的细胞外铰链结构域，
-包含SEQ ID NO：22的TNFR2跨膜结构域的跨膜结构域，和
-包含以下的细胞内结构域：
-SEQ ID NO：28、29、30或31的第一人CD3ζ细胞内信号传导结构域，和
-SEQ ID NO：34的TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域。
在某些实施方案中，本文所述的CAR的细胞外结合结构域是抗体或其抗原结合片段。在具体的实施方案中，细胞外结合结构域是单链可变片段(scFv)。细胞外结合结构域可与以下特异性结合，例如，
-自身抗原，其中自身抗原任选是IL-23受体(IL-23R)；
-B细胞抗原，任选选自CD19和CD20；或
-同种异体的HLA I类或II类分子，其中I类分子任选是HLA-A2。
本发明还提供了编码本文所述的CAR的核酸序列，以及包含所述核酸序列的载体和包含所述核酸序列或所述载体的宿主细胞。
本发明还提供了表达本文所述的CAR的免疫细胞的群体。在一些实施方案中，免疫细胞选自由以下组成的组：T细胞、自然杀伤(NK)细胞、αβT细胞、γδT细胞、双阴性(DN)细胞、调节性免疫细胞、调节性T(Treg)细胞、效应免疫细胞、效应T细胞、B细胞和髓系来源(myeloid-derived)的细胞，以及它们的任意组合，其中免疫细胞任选是人细胞。在具体的实施方案中，所述群体包含Treg细胞，其中Treg细胞任选是人细胞。
在某些实施方案中，免疫细胞群体包含表达CAR的人Treg细胞，所述CAR包含：
-细胞外结合结构域，
-包含人CD8的铰链区的铰链结构域，
-人TNFR2跨膜结构域，和
-包含人TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域和人CD3ζ的第一细胞内信号传导结构域的细胞内结构域。
本发明还提供了药物组合物，其包含表达本文所述的CAR的免疫细胞、宿主细胞或免疫细胞群体，以及药学上可接受的赋形剂。还提供了一种用于治疗有此需要的人受试者中的疾病或病症的方法，包括向受试者施用药物组合物。
本发明还提供了本文所述的嵌合抗原受体或免疫细胞群体，用于治疗有此需要的人受试者中的疾病或病症。
本发明还提供了本文所述的嵌合抗原受体或免疫细胞群体在制备用于治疗有此需要的人受试者中的疾病或病症的药物中的用途。
在一些实施方案中，所述疾病或病症选自由以下组成的组：炎性疾病、自身免疫疾病、过敏性疾病、器官移植病况、癌症和感染性疾病。
在一些实施方案中，人受试者需要免疫抑制，并且CAR在人受试者的Treg细胞中表达。
在一些实施方案中，所述疾病或病症是炎性疾病、自身免疫疾病、过敏性疾病或器官移植病况(例如移植排斥或移植物抗宿主病)。
本发明还提供了本文所述的嵌合抗原受体或免疫细胞群体，用作药物。
附图简要说明
图1是CD19-CAR、CD20-CAR和IL-23R-CAR构建体的示意图。CAR包含人CD8前导序列(CD8)，任选血凝素标签(HA)，scFv序列(抗CD19、抗CD20或抗IL-23R)，任选链霉亲和素标签(Tag)，铰链结构域(接头)，跨膜结构域(TNFR2或CD8)，共刺激性细胞内信号传导结构域(4-IBB或TNFR2)和CD3 zeta(CD3ζ)。CAR构建体与P2A-GFP编码序列符合读框。
图2是显示Treg细胞表面上的转导效率和CAR表达的流式细胞术点图。转导效率通过GFP表达来评估，并且CD19-CAR(CD8TM/4-1BB或TNFR2)的CAR表达通过HA表达来评估，或CD20-CAR(CD8TM/4-1BB或TNFR2)的CAR表达通过蛋白L染色评估。MFI：平均荧光强度。
图3显示了用CD20-CAR(CD8TM/4-1BB或TNFR2)转导或非转导(“空白”)的人Treg中CAR表达的蛋白质印迹分析。用CD3ζ特异性抗体染色显现了16kD处的内源性CD3ζ，约62kD处的CD20-CAR(CD8TM/4-1BB)和82kD处的CD20-CAR(TNFR2)(图A，左上)。然后洗膜，并用β-肌动蛋白抗体再次探测(reprobe)作为上样对照(图A，左下)。使用Image J对条带强度进行定量，且在图B中显示了来自两个不同供体的结果。
图4是显示了衍生自TNFR2的CAR维持CAR特异性激活的直方图。在第9天，将转导的FoxP3 Treg单独接种，或在抗CD3/抗CD28包被的珠子存在下接种，或在刚解冻的自体B细胞存在下接种。24小时后，对CD19-CAR(左上)、CD20-CAR(右上)和IL-23R-CAR(下)进行染色以检测CD4和CD69细胞表面表达。误差条代表平均值±SEM。CTRL：未用CAR转导的Treg细胞。
图5显示了衍生自TNFR2的CAR表现出有效的CAR介导的抑制活性。通过使用流式细胞术测量常规T细胞(Tconv)的增殖，来评估在不存在任何激活(虚线)或在B细胞诱导的CAR激活后(实线)由CD19-CAR Treg(图A)、CD20-CAR Treg(图B)或IL-23R-CAR Treg(图C)介导的接触依赖性抑制。圆圈线代表CD8TM/4-1BB CAR构建体，正方形线代表TNFR2 CAR构建体。误差条代表平均值±SEM。
图6是本发明的CD19-CAR构建体的示意图。所述CAR包含人CD8前导序列(CD8)、scFv序列(抗CD19)、链霉亲和素标签(Tag)、铰链结构域(接头)、跨膜结构域(CD8、TNFR2或融合的CD8/TNFR2)、共刺激性细胞内信号传导结构域(4-IBB、TNFR2或TNFR2片段)和CD3ζ(CD3z)。所述CAR构建体与P2A-GFP编码序列符合读框。
图7的一对图显示了TNFR2-C-末端缺失构建体表现出不同的表面表达水平并且在Jurkat-NFAT细胞中的CD3z信号传导中起作用。用所示构建体转导Jurkat-NFAT细胞。培养一周后，通过蛋白染色(图A)确定CAR表面表达，并细胞以1：1的比例使用表达CD19的Daudi细胞激活。24小时后，使用Glowmax光度计测定依赖NFAT的荧光素酶分泌(图B)。
图8是显示在细胞表面的转导效率和CAR表达(左上和左下)的一组点图，以及显示了转导的CAR-Treg细胞活力的图(右下)。使用GFP表达水平评估第8天的转导效率(％)，并使用蛋白-L标记来评估CAR密度(MFI)。使用碘化丙啶排除法来评估细胞活力。误差条代表平均值±SD。
图9的图显示了抗CD20 CAR的配体非依赖性递补信号传导和激活能力。在第9天，将转导的FoxP3 Treg单独接种(“无”)，或在抗CD3/抗CD28包被的珠子存在下接种，或在刚解冻的自体B细胞存在下接种(“B细胞”)。24小时后，对细胞进行染色以检测CD4和CD69细胞表面表达。误差条代表平均值±SD。对于条件“无”，已使用条件GFP作为对照进行了统计学分析(*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001，配对T-检验)。
图10的组图显示衍生自TNFR2的CD20 CAR表现出有效的CAR介导的抑制活性，而4-1BB和衍生自TNFR1的CD20 CAR则没有。通过测量常规T细胞(Tconv)的增殖，来评估在不存在任何激活下(“无”)或在B细胞诱导的CAR激活后(“B细胞”)由CAR Treg细胞介导的接触依赖性抑制。
图11是显示CAR介导的抑制活性的效力的组图。在B细胞诱导的CAR激活后使用衍生自TNFR2(顶部)或衍生自TNFR1(底部)的CAR引起的接触依赖性抑制(％)表示为测定中的CAR-Treg细胞数量的函数。这个表示可以计算引发50％抑制所需的CAR-Treg数量。
图12是实施例5中使用的HLA-A2-CAR构建体的示意图。所述CAR包含人CD8前导序列(CD8)、抗HLA-A2 scFv序列、铰链结构域(接头)、跨膜结构域(TNFR2或CD8 TM)、共信号传导结构域(cosignaling domain)(CD28或TNFR2或TNFR2+4-1BB)和CD3ζ(CD3Z)。这些CAR构建体与P2A-GFP编码序列符合读框。
图13是显示转导效率和Treg细胞表面的CAR表达的流式细胞术点图。通过GFP表达评估转导效率，通过
Figure BDA0003013334950000071
表达评估细胞表面的CAR表达。
图14是显示HLA*A2 CAR-Treg上Treg表型标志物的存在的流式细胞术点图。
图15的组图显示了注射有包含TNFR2、CD28或TNFR2+4-1BB结构域的HLA*A2-CAR-Treg的NSG小鼠随时间的体重变化(左上)、GvHD得分(右上)和无病存活率(下)。
发明详述
定义
在本发明中，以下术语具有以下含义：
术语“a”和“an”是指本文的语法对象的一个或多个(即至少一个)。举例来说，“anelement(原件)”意指一个元件或多于一个元件。
当涉及如数量、持续时间之类的可测量值时，术语“约”旨在涵盖偏离指定值的±20％的变化，或在一些情况下±10％，或在一些情况下±5％，或在一些情况下±1％，或在一些情况下±0.1％，因为这样的变化适合于实施所公开的方法。
本文所用的术语“激活”是指已经被充分刺激以诱导可检测的细胞应答的T细胞(例如，调节性T细胞)的状态。激活也可以与诸如细胞因子的产生或抑制活性的可检测的效应子功能相关。术语“激活的”调节性T细胞尤其指能够抑制免疫应答的调节性T细胞。
术语“亲和体(affibody)”是本领域公知的，并且是指基于衍生自葡萄球菌蛋白A的IgG结合结构域之一的58个氨基酸残基的蛋白结构域的亲和蛋白。
术语“同种异体的(allogeneic)”是指衍生自与向其引入物质的个体同一物种的不同个体的任何物质。当一个或多个基因座上的基因不相同时，两个或更多个个体被认为是彼此的同种异体。在一些方面，来自同一物种的个体的同种异体物质可在遗传上充分不同以抗原性地相互作用。
本文所用的术语“抗体”或“免疫球蛋白”是指衍生自与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子的蛋白或多肽序列。抗体可以是多克隆或单克隆的，多链或单链的，或完整的免疫球蛋白，且可以衍生自天然来源或重组来源。术语“抗体”还包括多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物学活性。抗体可以是免疫球蛋白分子的多聚体，例如免疫球蛋白分子的四聚体。
基本的四链抗体单元是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。基于它们恒定域(CL)的氨基酸序列，可以将来自任何脊椎动物物种的L链分为两种明显不同的类型之一，称为kappa(κ)和lambda(λ)。根据它们重链(CH)的恒定域的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分为不同的种类或同种型。免疫球蛋白有五个种类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，具有分别命名为alpha(α)、delta(δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)和mu(μ)的重链。基于CH序列和功能上的相对小的差异，将γ和α种类进一步分成亚类，例如，人表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。每条L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两条H链依据H链同种型通过一个或多个二硫键彼此连接。每条H和L链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条H链在N端具有一个可变域(VH)，随后对于每个α和γ链是三个恒定域(CH)，对于μ和ε同种型是四个CH结构域。每条L链在N端均具有可变域(VL)，随后在其另一端具有恒定域(CL)。VL与VH对齐，CL与重链的第一个恒定域(CH1)对齐。特定的氨基酸残基被认为形成了轻链和重链可变域之间的界面。VH和VL一起配对形成了单个抗原结合位点。IgM抗体由五个基本的异四聚体单元以及被称为J链的额外多肽组成，并因此含有十个抗原结合位点，而分泌的IgA抗体可以聚合形成包含2-5个基本4链单元以及J链的多价集聚物(assemblage)。就IgG而言，4链单元通常为约150,000道尔顿。有关不同种类的抗体的结构和性质，参见例如Basic and Clinical Immunology,第8版,Daniel P.Stites,Abba I.Terr和TristramG.Parslow(eds.),Appleton&Lange,Norwalk,Conn.,1994,第71页,和第6章。
本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即，群体中包含的各个抗体是相同的，除了可少量存在的可能的天然突变。单克隆抗体是高度特异的，针对单个抗原位点。此外，与包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们可以被合成而不受其他抗体污染。修饰语“单克隆”不应解释为要求通过任何特定方法产生抗体。例如，单克隆抗体可以通过由Kohler et al.,Nature,256：495(1975)首先描述的杂交瘤方法来制备，或可以使用重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中制备(参见，例如，美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”还可以使用例如在Clackson etal.,Nature,352：624-628(1991)和Marks et al.,J.Mol.Biol.,222：581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。本文所述的单克隆抗体包括“嵌合”抗体，其包含来自一个抗体的一个或多个区域(例如非人可变域)和来自一个或多个其他抗体的一个或多个区域(例如人恒定区)。
术语“抗体片段”是指完整抗体的至少一部分，例如完整抗体的抗原结合区或可变区，其保留与抗原的表位特异地相互作用(例如通过结合，位阻，稳定/失稳，和/或空间分布)的能力。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、由VH和CHI结构域组成的Fd片段、线性抗体、单域抗体(single domainantibody)如sdAb(VL或VH)、骆驼VHH结构域、由抗体片段(例如包含通过铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段)形成的多特异性抗体以及分离的CDR或抗体的其他表位结合片段。也可以将抗原结合片段引入单域抗体、巨抗体(maxibody)、微抗体(minibody)、纳米抗体(nanobody)、细胞内抗体(intrabody)、双抗体(diabody)、三抗体(triabody)、四抗体(tetrabody)、v-NAR和bis-scFv(参见，例如，Hollinger和Hudson,Nature Biotechnology23:1126-1136(2005))。也可以基于诸如III型纤连蛋白的多肽将抗原结合片段移植到支架中(参见美国专利号6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽微抗体)。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，以及残留的“Fc”片段，该名称反映了容易结晶的能力。Fab片段由完整的L链以及H链的可变区结构域(VH)和一个重链的第一恒定域(CH1)组成。每个Fab片段在抗原结合方面是单价的，即，它具有单个抗原结合位点。抗体的胃蛋白酶处理产生单个大F(ab’)2片段，其大致对应于具有二价抗原结合活性的两个二硫键连接的Fab片段且仍能够交联抗原。Fab’片段与Fab片段的区别在于，其在CH1结构域的羧基末端具有包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸的额外几个残基。Fab’-SH是本文中Fab′的名称，其中恒定域的半胱氨酸残基携带有游离硫醇基。F(ab’)2抗体片段最初以之间具有铰链半胱氨酸的成对的Fab’片段产生。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
“完整抗体”是包含抗原结合位点以及CL和至少重链恒定域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定域可以是天然序列恒定域(例如人天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。“天然序列”多核苷酸是具有与源于自然的多核苷酸相同的核苷酸序列的多核苷酸。“天然序列”多肽是具有与源于自然(例如，来自任何物种)的多肽(例如，抗体)相同的氨基酸序列的多肽。这样的天然序列多核苷酸和多肽可以从自然界中分离出来，或者可以通过重组或合成方法产生。
如本文所用，“抗体的功能性片段或类似物”是具有与全长抗体相同定性的生物学活性的化合物。例如，抗IgE抗体的功能性片段或类似物是结合IgE免疫球蛋白的方式可以抑制或显著降低此类分子与高亲和力受体FcεRI结合的能力的功能性片段或类似物。
术语“抗体重链”是指天然存在的构型的抗体分子中存在的两种多肽链类型中的较大者，且其通常决定了抗体所属的种类。
术语“抗体轻链”是指天然存在的构型的抗体分子中存在的两种多肽链类型中的较小者。Kappa(κ)和lambda(λ)轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
“Anticalin”是本领域公知的，且是指抗体模拟物技术，其中结合特异性衍生自脂质运载蛋白(lipocalin)。Anticalin也可被设计为双靶向蛋白的形式，称为Duocalin。
术语“抗原”或“Ag”是指引起免疫应答的分子。这个免疫应答可涉及抗体产生，特定的具有免疫能力的细胞的激活，或两者。技术人员将理解，任何大分子，包括几乎所有的蛋白或肽，都可以作为抗原。此外，抗原可以衍生自重组DNA或基因组DNA。技术人员将理解，包含编码引发免疫应答的蛋白的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此均编码本文所用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解，抗原不必仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见地，本发明包括但不限于使用一个以上基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以编码引发所需免疫应答的多肽。此外，技术人员将理解，抗原根本不必由“基因”编码。显而易见地，抗原可以被合成或衍生自生物样品，或者可以是多肽以外的大分子。这样的生物样品可以包括但不限于例如组织样品、细胞或具有其他生物成分的流体。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指在其表面展示与主要组织相容性复合物(MHC)复合的外源抗原的免疫系统细胞，如辅助细胞(例如B细胞、树突细胞等)。T细胞可以使用其T细胞受体(TCR)来识别这些复合物。APC处理抗原并将它们呈递给T细胞。
术语“自体的”是指衍生自随后向其重新引入的同一个体的任何物质。
术语“高亲和性多聚体(avimer)”是本领域公知的，且指抗体模拟物技术。
术语“嵌合受体”或“嵌合抗原受体”或“CR”或“CAR”是指一个多肽或一组多肽，在最简单的实施方案中通常是两个，当在免疫细胞中时，其为细胞提供针对靶配体的特异性和细胞内信号产生。在一些实施方案中，这组多肽彼此邻接。在一些实施方案中，嵌合受体是包含这组多肽的嵌合融合蛋白。在一些实施方案中，这组多肽包括二聚化开关，其在存在二聚化分子时可以使多肽彼此偶联，例如可以使配体结合结构域与细胞内信号传导结构域偶联。在一些实施方案中，嵌合受体在嵌合受体融合蛋白的氨基末端(N-末端)包含任选的前导序列。在一些实施方案中，嵌合受体在细胞外配体结合结构域的N-末端包含前导序列，其中所述前导序列在嵌合受体的细胞加工和定位于细胞膜的过程中任选地从配体结合结构域切离。
术语“保守序列修饰”是指不显著影响或改变含有氨基酸序列的蛋白的生物学功能的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变将修饰引入蛋白中。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似性质的氨基酸残基所取代的氨基酸取代，这样肽化学领域的技术人员将会预期多肽的二级结构和亲水性质基本不变。因此，氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑了各种上述特征的示例性取代是本领域技术人员公知的，并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；和缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进一步进行氨基酸取代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水值的不带电荷的极性头基的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。其他可代表保守变化的氨基酸组包括：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。本领域中已经定义了具有相似侧链的其他氨基酸残基家族。这些家族包括具有以下的氨基酸：碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本发明的嵌合受体内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基所取代，并且可以使用本文所述的功能测定法来检测改变的嵌合受体。
术语“组成型启动子”是指当其与编码或指向基因产物的多核苷酸有效地连接时，导致基因产物在细胞的大多数或全部生理条件下在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“共刺激分子”是指T细胞上与共刺激配体特异性结合的关联(cognate)结合配偶体，从而通过T细胞介导共刺激应答(例如但不限于增殖)。共刺激分子是有助于有效免疫应答的细胞表面分子，而不是抗原受体或其配体。共刺激性信号传导结构域可以是共刺激分子的细胞内部分。共刺激分子的代表有以下蛋白家族：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导性淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)和激活NK细胞受体。
“细胞毒性细胞”包括能够介导细胞毒性应答的任何细胞。
如本文所用，术语“衍生自”指示第一和第二分子之间的关系。它通常是指第一分子和第二分子之间的结构相似性，而不意味着或包括对衍生自第二分子的第一分子的过程或来源的限制。例如，对衍生自CD3ζ分子的细胞内信号传导结构域而言，所述细胞内信号传导结构域保留足够的CD3ζ结构，从而具有所需的功能，即在合适条件下产生信号的能力。它不意味着或包括对产生细胞内信号传导结构域的特定过程的限制，例如，这不意味着，为了提供细胞内信号传导结构域，必须从CD3ζ序列开始并删除不想要的序列，或施加突变以获得细胞内信号传导结构域。
术语“双抗体(diabody)”是指通过在VH和VL结构域之间用短接头(约5-10个残基)构建scFv片段从而获得V结构域的链间配对而非链内配对而制备的小抗体片段，这产生二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是两个“交叉”scFv片段的异二聚体，其中两个抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。双抗体在例如EP 0404097；WO93/11161；和Holliger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中有更充分的描述。
“域抗体(domain antibody)”是本领域公知的，并且是指抗体的最小功能性结合单位，其对应于抗体的重链或轻链的可变区。
术语“编码”是指多核苷酸(例如基因、cDNA或mRNA)中核苷酸的特定序列的固有性质，以充当模板合成生物过程中具有指定核苷酸序列(例如rRNA、tRNA和mRNA)或指定氨基酸序列的其他聚合物和大分子，以及由此产生的生物学性质。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白，则基因、cDNA或RNA编码该蛋白。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同且通常在序列表中提供)以及非编码链(用作基因或cDNA转录模板)都可称作编码基因或cDNA的蛋白或其他产物。除非另有说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括所有互为简并形式(degenerate version)并且编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。短语“编码蛋白或RNA的核苷酸序列”也可以包括内含子，其达到某种程度以至编码该蛋白的核苷酸序列在一些形式下可含有一个或多个内含子。
术语“内源的”是指来自生物体、细胞、组织或系统或在其内部产生的任何物质。
术语“工程化的”或“修饰的”是指已被转染、转化或转导的细胞。
术语“外源的”是指引入生物体、细胞、组织或系统或在其外部产生的任何物质。
术语“表达”是指由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，其包含有效地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含用于表达的足够的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有那些表达载体，包括引入所述重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如裸的或包含在脂质体中的)、转座子(例如sleeping beauty)和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
本文所用的术语多核苷酸“片段”是通常与本文具体公开的多核苷酸的区别在于一个或多个缺失的多核苷酸。这样的片段可以是天然存在的，或者可以是合成产生的，例如，通过对本发明的多核苷酸序列中的一个或多个进行修饰并对本文所述的编码片段的一种或多种生物学活性进行评估，和/或通过使用本领域公知的多种技术中的任何一种。因此，本文所用的术语多肽“片段”是通常与本文具体公开的多肽的区别在于一个或多个缺失的多肽。这样的片段可以是天然存在的或可以是合成产生的，例如，通过对本发明的多肽序列中的一个或多个进行修饰并对本文所述的多肽的一种或多种生物学活性进行评估，和/或通过使用本领域公知的多种技术中的任何一种。可以对本发明的多核苷酸和多肽的结构进行修饰，并且仍然产生这样的功能性分子，其是具有或编码具有期望特性并且没有明显丧失生物学效用或活性的片段多肽。在一些实施方案中，多肽片段与天然序列不同在少于50个、40个、30个、20个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸的缺失。片段还可以(或可选地)通过例如对多肽的免疫原性、二级结构和亲水性质具有最小影响的氨基酸的缺失来修饰。
抗体的“Fc”片段包含通过二硫键保持在一起的两条H链的羧基末端部分。抗体的效应子功能由Fc区中的序列决定，所述Fc区也是在某些类型的细胞上发现的Fc受体(FcR)所识别的部分。
“Fv”是含有完整的抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。这个片段由紧密地非共价结合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中产生了六个高度可变环(三个环来自H链，三个环来自L链)，其贡献了用于抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或仅包含三个对抗原特异的CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整的结合位点。
“骨架”或“FR”残基是除本文所定义的高度可变区残基以外的那些可变域残基。
本文所用的术语“移植物抗宿主病”或“GVHD”是指接受来自在遗传上不同的人的移植组织后的医学并发症。供体组织(移植物)中的免疫细胞将接受者(宿主)识别为异物。移植的免疫细胞随后攻击宿主的身体细胞。GVHD通常与干细胞移植有关；然而，术语包括由其他形式的组织移植物引起的GVHD。在输血后也可能发生GVHD。
术语“同源性”或“同一性”是指两个聚合分子之间，例如两个核酸分子(例如两个DNA分子或两个RNA分子)之间或两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当两个分子中的亚基位置都被相同的单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子中每个分子的位置都被腺嘌呤占据，那么它们在那个位置是同源或同一的。两个序列之间的同源性是匹配或同源位置的数目的直接函数；例如，如果两个序列中一半的位置(例如，长度为十个亚基的聚合物中的五个位置)是同源的，则两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如10个中的9个)是匹配或同源的，则两个序列是90％同源的。因此，当用于两个或两个以上多肽的序列或两个或两个以上核酸分子的序列之间的关系时，术语“同源的”或“同一的”是指由两个或多个氨基酸或核苷酸残基的片段之间的匹配数确定的多肽或核酸分子之间的序列相关程度。“同一性”测量由特定数学模型或计算机程序(即“算法”)所解决的具有空位比对(如果有的话)的两个或两个以上序列中的较小者之间相同匹配的百分比。通过已知方法可以容易地计算相关多肽的同一性。这样的方法包括但不限于描述于以下中的：Computational MolecularBiology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,第1部分,Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,vonHeinje,G.,Academic Press,1987；Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.,eds.,M.Stockton Press,New York,1991；和Carillo et al.,SIAM J.AppliedMath.48,1073(1988)。设计用于确定同一性的优选方法以在所测试的序列之间给出最大的匹配。确定同一性的方法描述于公开可得的计算机程序中。用于确定两个序列之间的同一性的示例性计算机程序方法包括GCG程序包，其包括GAP(Devereux et al.,Nucl.Acid.Res.12,387(1984)；Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,Wis.)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul et al.,J.MoI.Biol.215,403-410(1990))。BLASTX程序可公开获得自国家生物技术信息中心(NCBI)和其他来源(BLASTManual,Altschul et al.NCB/NLM/NIH Bethesda,Md.20894；Altschul et al.,如上所述)。也可以使用公知的史密斯沃特曼算法(Smith Waterman algorithm)确定同一性。
涉及非人(例如鼠)抗体形式的术语“人源化”是指含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗体的其他抗原结合子序列)。在大多数情况下，人源化抗体及其抗体片段是这样的人免疫球蛋白(接受者抗体或抗体片段)，其中来自接受者的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔子的具有所需特异性、亲和力和能力的CDR的残基所取代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv骨架区(FR)残基被相应的非人残基所取代。此外，人源化抗体/抗体片段可包含在接受者抗体或导入的CDR或骨架序列中均未发现的残基。这些修饰可以进一步改善和优化抗体或抗体片段的性能。通常，人源化抗体或其抗体片段将包含基本上所有的至少一个且通常两个可变域，其中所有或基本上所有的CDR区均对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有的或重要部分的FR区都是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体或抗体片段还可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的。对于进一步的细节，参见Jones et al.,Nature,321:522-525,1986；Reichmann et al.,Nature,332:323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596,1992。
如本文所用，术语“免疫细胞”通常包括源自骨髓中产生的造血干细胞(HSC)的白细胞(白血球)。免疫细胞的实例包括但不限于淋巴细胞(T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞)和髓系来源的细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞)。
如本文所用，术语“免疫效应细胞”是指能够进行特异性免疫应答的形式的免疫系统的细胞。
如本文所用，术语“免疫调节性细胞”是指以“调节性”方式起作用以抑制免疫系统激活并由此维持免疫系统稳态和对自身抗原的耐受性的免疫细胞。“调节性免疫细胞”也可以对非免疫细胞起作用，导致例如促进组织修复或再生的临床状态的改善。调节性免疫细胞可包括但不限于调节性T细胞(例如CD4+调节性T细胞、CD8+调节性T细胞、调节性γδT细胞和/或调节性DN T细胞)、调节性B细胞、调节性NK细胞、调节性巨噬细胞以及调节性树突细胞。
如本文所用，术语“免疫应答”包括T细胞介导的和/或B细胞介导的免疫应答。示例性免疫应答包括T细胞应答，例如增殖、细胞因子产生和细胞毒性。另外，术语免疫应答包括受T细胞激活间接影响的免疫应答，例如抗体产生(体液应答)和细胞因子响应性细胞例如巨噬细胞激活。参与免疫应答的免疫细胞包括淋巴细胞，例如B细胞和T细胞(CD4+、CD8+、Th1和Th2细胞)；抗原呈递细胞(例如专职抗原呈递细胞，如树突细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞、朗格汉斯细胞(Langerhans cell)，以及非专职抗原呈递细胞，例如角质形成细胞、内皮细胞、星形胶质细胞、成纤维细胞，少突胶质细胞)；自然杀伤细胞；和髓细胞，如巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。
如本文所用，术语“免疫适应(immune accommodation)”是指尽管接受者中存在对器官或组织移植物特异的抗体，但器官或组织移植物仍正常起作用的移植接受者的情况。
如本文所用，术语“免疫耐受”是指与其他受试者群体(例如尚未接受治疗的受试者)相比，在一个受试者群体(例如已经接受治疗，如本文所述的治疗的受试者)中a)特异性免疫应答(认为至少部分由抗原特异性效应T淋巴细胞、B淋巴细胞、抗体或其等价物介导)的水平降低；b)特异性免疫应答的发生或进展的延迟；或c)特异性免疫应答的发生或进展的风险降低。当与其他抗原相比优先针对某些抗原产生免疫耐受时，就会发生“特异性”免疫耐受。
如本文所用，“体外转录的RNA”是指已经在体外合成的RNA，例如mRNA。通常，体外转录的RNA由体外转录载体产生。体外转录载体包含用于产生体外转录的RNA的模板。
术语“可诱导的”启动子是指，当其有效地连接至编码或指向基因产物的多核苷酸时，基本上仅当细胞中存在对应于启动子的诱导剂时才引起细胞中基因产物的产生的核苷酸序列。
如本文所用，“5’帽”(也称为RNA帽、RNA 7-甲基鸟苷帽或RNA m7G帽)是在转录开始后不久已被添加至真核信使RNA的“前面”或5’末端的修饰的鸟嘌呤核苷酸。5’帽由与第一个转录的核苷酸连接的末端基团组成。它的存在对于核糖体的识别以及来自RNase的保护至关重要。帽添加与转录偶联，并且共转录地发生，从而彼此影响。转录开始后不久，正在被合成的mRNA的5’末端被与RNA聚合酶结合的帽合成复合物结合。这个酶复合物催化mRNA加帽所需的化学反应。合成以多步生化反应进行。可以修饰加帽部分以调节mRNA的功能性，例如其稳定性或翻译效率。
在本发明的上下文中，对于常见的核酸碱基使用以下缩写。“A”指腺嘌呤，“C”指胞嘧啶，“G”指鸟嘌呤，“T”指胸腺嘧啶，且“U”指尿嘧啶。
术语“说明材料”包括可用于传达本发明组合物和方法的有用性或用途的出版物、记录、图表或任何其他表达媒介。例如，本发明的试剂盒的说明材料可以附在含有本发明的核酸、载体、细胞群体或组合物的容器上，或者与含有本发明的核酸、载体、细胞群体或组合物的容器一起运输。或者，说明材料可以与容器单独运输，以使接收者可以协同使用说明材料和细胞。
如本文所用的术语“细胞内信号传导结构域”是指分子的细胞内部分。细胞内信号传导结构域产生促进含有嵌合受体的细胞的免疫效应子功能的信号。嵌合受体-T细胞中免疫效应子功能的实例可以包括溶细胞活性、抑制活性、调控活性和辅助活性，包括细胞因子的分泌。
术语“分离的”意指从天然状态改变或移出。例如，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，而从其天然状态的共存物中部分或完全分离的相同的核酸或肽则是“分离的”。分离的核酸或肽可以以基本上纯化的形式存在，或可以存在于非天然环境例如宿主细胞中。通常，分离的核酸或肽的制备物含有的所述核酸或肽为至少约80％纯、至少约85％纯、至少约90％纯、至少约95％纯、大于95％纯、大于约96％纯、大于约97％纯、大于约98％纯或大于约99％纯。“分离的多肽”是已经经过鉴定并从其天然环境的组分中分离和/或回收的多肽。
“分离的核酸”或“分离的核酸序列”是基本上从天然伴随天然序列的其他基因组DNA序列以及如核糖体和聚合酶的蛋白或复合物中分离出的核酸。术语包括已经从其天然存在的环境中移出的核酸序列，并且包括重组或克隆的DNA分离物和化学合成的类似物或由异源系统生物合成的类似物。基本上纯的核酸包括核酸的分离形式。当然，这是指最初分离的核酸，并且不排除随后人为添加到所述分离的核酸中的基因或序列。在一些实施方案中，分离的核酸或分离的核酸序列不是天然存在的。
“分离的多肽”是已经经过鉴定并从其天然环境的组分中分离和/或回收的多肽。在某些实施方案中，将分离的多肽纯化至以下程度：(1)通过劳里法(Lowry method)测定，按多肽重量计为大于95％，并且在特定的实施方案中至按重量计大于99％，(2)通过使用旋杯式测序仪足以获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)均质化，通过使用考马斯蓝或在某些实施方案中使用银染，在还原或非还原条件下使用SDS-PAGE来测定。分离的多肽包括重组细胞内的原位多肽，这是由于多肽天然环境的至少一种组分不会存在。在某些实施方案中，将通过至少一个纯化步骤来制备分离的多肽。在一些实施方案中，分离的多肽不是天然存在的。
术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中的独特之处在于能够感染非分裂细胞；因为它们可以将大量遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，故它们是最有效的基因递送载体之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。
术语“慢病毒载体”是指衍生自至少一部分慢病毒基因组的载体，包括例如Miloneet al.,Mol.Ther,17(8):1453-1464(2009)中提供的自灭活慢病毒载体。可用于临床的慢病毒载体的其他实例包括但不限于，来自Oxford BioMedica的
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基因递送技术和来自Lentigen的LENTIMAXTM载体系统。慢病毒载体的非临床类型也是可获得的，并且对于本领域技术人员是已知的。
术语“配体”是指配体/受体配对物的成员，并与配对物的另一个成员结合。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指通过磷酸二酯键共价连接的核苷酸的聚合物，例如单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。除非特别限定，否则术语涵盖含有已知的天然核苷酸类似物的核酸，其具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式被代谢。除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)、等位基因、同源体、SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，简并密码子取代可通过产生其中一个或多个选定的(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer et al.,Nucleic AcidRes.19:5081(1991)；Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Rossoliniet al.,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
“纳米抗体(nanobody)”是本领域公知的，并且是指衍生自抗体的含有天然存在的重链抗体的独特的结构和功能特性的治疗性蛋白。这些重链抗体含有单个可变域(VHH)和两个恒定域(CH2和CH3)。
“天然序列”多核苷酸是具有与来自天然的多核苷酸相同的核苷酸序列的多核苷酸。“天然序列”多肽是具有与来自自然(例如来自任何物种)的多肽(例如抗体)相同的氨基酸序列的多肽。这样的天然序列多核苷酸和多肽可以从自然界中分离出来，或者可以通过重组或合成手段产生。
术语“有效地连接”或“转录控制”是指调控序列和异源核酸序列之间的导致后者表达的功能性连接。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列有效地连接至第二核酸序列。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子有效地连接至编码序列。有效地连接的DNA序列可以彼此连续，例如在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，在同一阅读框中。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白”可互换使用，且指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对蛋白或肽的序列能包含的最大氨基酸数没有限制。多肽包括任何包含两个或更多个通过肽键相互连接的氨基酸的肽或蛋白。如本文所用，术语指短链(在本领域中通常也被称为例如肽、寡肽和寡聚物)以及长链(有许多类型的在本领域中通常被称为蛋白)这二者。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重组肽或其组合。
术语“药学上可接受的赋形剂”或“药学上可接受的载体(carrier)”是指当施用给动物，例如人时，不产生不利、过敏或其他不良反应的赋形剂。它包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。对于人的施用，制剂应符合监管局(例如FDA局或EMA)所要求的无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。
术语“poly(A)”是指结合在mRNA上的一段单磷酸腺苷。在用于瞬时表达的构建体的一些实施方案中，polyA是50至5000个腺苷单磷酸，例如，大于或等于64个，大于或等于100个，或大于或等于300或400个腺苷单磷酸。可以对poly(A)序列进行化学或酶促修饰以调节例如定位、稳定性或翻译效率的mRNA功能性。
术语“聚腺苷酸化”是指聚腺苷酸基部分或其修饰的变体与信使RNA分子的共价连接。在真核生物中，大多数信使RNA(mRNA)分子在3’末端被聚腺苷酸化。3’poly(A)尾是通过聚腺苷酸聚合酶的作用添加到pre-mRNA中的腺嘌呤核苷酸的长序列(通常数百个)。在高等真核生物中，poly(A)尾被添加到含有特定序列即聚腺苷酸化信号的转录物上。poly(A)尾和与其结合的蛋白有助于保护mRNA免受核酸外切酶的降解。聚腺苷酸化对于转录终止、mRNA从细胞核的输出以及翻译也很重要。聚腺苷酸化在DNA转录为RNA后立即在细胞核中发生，但之后也可以在细胞质中发生。转录终止后，mRNA链通过与RNA聚合酶结合的核酸内切酶复合物的作用被切割。切割位点的特征通常在于切割位点附近存在碱基序列AAUAAA。mRNA被切割后，腺苷残基被添加到位于切割位点的游离3’末端。
术语“启动子”是指被细胞的合成机制或引入的合成机制识别的，启动多核苷酸序列的特异性转录所需的DNA序列。
术语“启动子/调控序列”是指表达与启动子/调控序列有效连接的基因产物所需的核酸序列。在一些情况下，这个序列可以是核心启动子序列，而在其他情况下，这个序列也可以包括表达基因产物所需的增强子序列和其他调控元件。例如，启动子/调节序列可以是以组织特异性方式表达基因产物的启动子/调节序列。
术语“重组蛋白或肽”是指使用重组DNA技术产生的蛋白或肽(例如抗体)，例如由噬菌体或酵母表达系统表达的蛋白或肽(例如抗体)。该术语还应解释为意指通过合成编码蛋白或肽(例如抗体)的DNA分子产生的蛋白或肽(例如抗体)，其中DNA分子表达蛋白或肽(例如抗体)或指向蛋白或肽(例如抗体)的氨基酸序列，其中已使用可用的并且本领域公知的重组DNA或氨基酸序列技术来获得DNA或氨基酸序列。
本发明中使用的术语“调节性T淋巴细胞”、“调节性T细胞”、“T调节性细胞”、“Treg细胞”和“Treg”是同义的，并且旨在具有本领域中使用的标准定义。Treg细胞是T细胞的一个专门亚群，其以“调节性”方式起作用，以抑制免疫系统的激活，并从而维持免疫系统的稳态和对自身抗原的耐受性。Treg有时被称为抑制性T细胞(suppressor T cell)。Treg细胞通常(但不总是)以叉头家族转录因子FoxP3(叉头盒P3)的表达为特征。它们还可以表达CD4或CD8表面蛋白。它们通常还表达CD25。Treg通常以CD4+CD25+CD127loFoxP3+的表型为标志。在一些实施方案中，Treg也是CD45RA+、CD62Lhi和/或GITR+。在具体的实施方案中，Treg以CD4+CD25+CD127loCD62L+或CD4+CD45RA+CD25hiCD127lo为标志。如本发明中所用，且除非另有说明，Treg包括在胸腺中发育的“天然”Treg，通过在胸腺外(例如，在组织或次级淋巴器官中，或在规定培养条件下的实验室环境中)发生的分化过程产生的诱导性/适应性/外周Treg，以及使用重组DNA技术创造出的Treg。天然存在的Treg细胞(CD4+CD25+FoxP3+)像所有其他T细胞一样在胸腺中产生。相反，诱导性/适应性/外周Treg细胞(包括CD4+CD25+FoxP3+、Tr1细胞、Th3细胞等)产生于胸腺外。一种诱导Treg的方法是将T效应细胞暴露于IL-10或TGF-β。还可以通过将FoxP3基因转染或转导至T细胞的混合群体中来将T细胞转化为Treg细胞。被诱导表达FoxP3的T细胞采用Treg表型，并且这样的重组Treg在本文中也定义为“Treg”。
术语“排斥”是指其中移植器官或组织未被接受者的身体所接受的状态。排斥是由接受者的免疫系统攻击移植器官或组织造成的。排斥可以在移植后数天至数周(急性)或在移植后数月至数年(慢性)发生。
如本文所用，如果抗体或CAR以可检测的水平与抗原反应，例如以以下的亲和常数Ka反应：大于或等于约104M-1，大于或等于约105M-1，大于或等于约106M-1，大于或等于约107M-1，大于或等于108M-1，大于或等于109M-1，或大于或等于1010M-1，则抗体或CAR被称为对抗原“免疫特异的”、“特异的”或与抗原“特异性结合”。抗体对其关联抗原的亲和力还通常表示为解离常数Kd，且在某些实施方案中，如果抗体结合抗原的Kd小于或等于10-4M，小于或等于约10-5M，小于或等于约10-6M，小于或等于10-7M，小于或等于10-8M，小于或等于5x10-9 M，或小于或等于10-9M，或小于或等于5x10-10 M，或小于或等于10-10M，则抗体与抗原特异性结合。可以使用常规技术容易地确定抗体或CAR的亲和力，例如Scatchard et al.，(Ann.N.Y.Acad.Sci.USA 51:660(1949))中描述的那些。通常可以使用免疫检测方法来测定和评估抗体对抗原、其细胞或组织的结合特性，所述免疫检测方法包括例如基于免疫荧光的测定，例如免疫组织化学(IHC)和/或荧光激活的细胞分选(FACS)。在一些实施方案中，术语“特异性结合”是指识别并结合样品中存在的结合伴侣但基本上不识别或结合样品中其他分子的抗体、CAR或配体。
术语“信号转导途径”是指在信号从细胞的一部分传输到细胞的另一部分中起作用的多种信号转导分子之间的生化关系。
术语“信号传导结构域”是指蛋白的功能部分，其通过在细胞内传递信息起作用，以经由通过产生第二信使或通过应答这些信使的效应子的功能的指定信号传导途径来调控细胞活性。
如本文所用，术语“干细胞”通常包括多潜能(pluripotent)干细胞或多能(multipotent)干细胞。“干细胞”包括但不限于胚胎干细胞(ES)；间充质干细胞(MSC)；诱导性多潜能干细胞(iPS)；和定向性祖细胞(committed progenitor cell)(造血干细胞(HSC)、骨髓来源的细胞等)。
术语“刺激”是指通过刺激性分子(例如，TCR/CD3复合物或嵌合受体)与其关联配体结合从而介导信号转导事件来诱导的第一应答(primary response)，例如但不限于，经由TCR/CD3复合物的信号转导或经由嵌合受体的信号传导结构域的信号转导。刺激能介导某些分子的表达改变。
术语“刺激性分子”是指由免疫细胞(例如T细胞、NK细胞、B细胞)表达的分子，其提供了在免疫细胞信号传导途径的至少一些方面中以刺激性方式调控免疫细胞激活的细胞质信号传导序列。在一个方面，信号是第一信号(primary signal)，其由例如TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子的结合而启动，这导致T细胞应答的介导，包括但不限于增殖、激活、分化、抑制等。以刺激性方式起作用的第一细胞质信号传导序列(也称为“第一信号传导结构域”)可含有被认为是免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM的信号传导基序。
术语“受试者”旨在包括可在其中引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物如人类)。在一些实施方案中，受试者可以是“患者”，即温血动物如人类，其正在等待接受或正在接受医疗护理，或者曾经/正在/将要成为医疗程序的客体，或在监控其目标疾病或病况(例如炎性或自身免疫病况)的发展。在一些实施方案中，受试者是成人(例如18岁以上的受试者)。在一些实施方案中，受试者是儿童(例如18岁以下的受试者)。在一些实施方案中，受试者是男性。在一些实施方案中，受试者是女性。在一些实施方案中，受试者受累于(例如被诊断有)自身免疫疾病，例如自身抗体介导的自身免疫疾病。在一些实施方案中，受试者处于发展自身免疫疾病，例如自身抗体介导的自身免疫疾病的风险中。风险因素的实例包括但不限于自身抗体介导的自身免疫疾病的遗传易感性或家族史。
术语“基本上纯化的细胞”是指基本上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞还指已经从通常在其天然存在的状态下与其关联的其他细胞类型中分离的细胞。在一些实施方案中，基本上纯化的细胞是指至少约75％不含、80％不含或85％不含，或约90％、95％、96％、97％、98％或99％不含通常在其天然存在的状态下与其关联的其他细胞类型的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群体是指同质的细胞群体。在一些实施方案中，基本上纯化的细胞群体是指至少约75％同质、80％同质或85％同质，且在具体的实施方案中约90％、95％、96％、97％、98％或99％同质的细胞群体。在一些情况下，基本上纯化的细胞简单地指已经从在其天然状态下与它们天然关联的细胞中分离的细胞。在一些方面，在体外培养细胞。在其他方面，不在体外培养细胞。在某些实施方案中，本文所述的细胞不能用于产生多细胞生物。
术语“T细胞”包括表达CD3的所有类型的免疫细胞，包括CD4+细胞(例如T辅助细胞)、CD8+T细胞(例如细胞毒性CD8+T细胞和调节性CD8+T细胞)、T调节性细胞(Treg)、γ-δT细胞和双阴性T细胞。
术语“治疗有效量”是指有效地实现特定的生物学结果的试剂(例如，表达本文所述的CAR的细胞)的量。因此，术语“治疗有效量”意指目的在于以下的试剂的水平或量：在不对靶标造成显著的负面或不利的副作用下，(1)延迟或预防目标疾病或病况的发作；(2)减慢或停止目标疾病或病况的一种或多种症状的进展、加重或恶化；(3)引起目标疾病或病况的症状减轻；(4)降低目标疾病或病况的严重性或发生率；或(5)治愈目标疾病或病况。在一些实施方案中，为了预防(prophylactic)或防止(preventive)作用，可以在目标疾病或病况发作之前施用治疗有效量。可选地或另外地，为了治疗作用，可以在目标疾病或病况开始后施用治疗有效量。
术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经转染、转化或转导有外源核酸的细胞。细胞包括原代受试细胞及其后代。
术语“转移载体”是指包含分离的核酸并且可以用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质组合。许多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物结合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应解释为包括促进核酸转移进细胞的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
如本文所用，“瞬时的”是指非整合转基因在数小时、数天或数周的时间内表达，其中如果被整合到基因组中或被包含在宿主细胞中的稳定质粒复制子中，则表达时间少于基因的表达时间。
如本文所用，“移植物”是指被引入个体中的细胞、组织或器官。移植材料的来源可以是培养的细胞、来自另一个个体的细胞或来自同一个体的细胞(例如，在体外培养细胞并任选地进行改变后)。示例性的器官移植物是肾脏、肝脏、心脏、肺和胰腺。示例性的组织移植物是胰岛。示例性的细胞移植物是同种异体的造血干细胞移植物。
如本文所用，术语“治疗”是指减少或改善目标疾病或病况(例如自身免疫病况)的进展、严重程度和/或持续时间，或改善目标疾病或病况(例如自身免疫病况)的一种或多种症状(例如一种或多种可辨别的症状)，其中所述改善是由于一种或多种疗法(例如一种或多种如本发明的Treg细胞的治疗剂)的施用。在具体的实施方案中，术语“治疗”是指改善目标疾病或病况(例如自身免疫病况)的至少一个可测量的身体参数。在一些实施方案中，术语“治疗”是指通过例如稳定化可辨别的症状在身体上或通过例如稳定化身体参数在生理上或通过两者抑制目标疾病或病症(例如自身免疫病况)的进展。在一些实施方案中，术语“治疗”是指减少或改善目标疾病或病况(例如自身免疫疾病)的进展、严重程度和/或持续时间，或改善目标疾病或病况(例如自身免疫疾病)的一种或多种症状。“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防止性措施；其中目的是预防或减慢(减轻)目标疾病或病况。需要治疗的那些包括已经具有病况的那些以及易于患病况的那些或需要预防病况的那些。如果在接受治疗量的试剂(例如包含本发明的嵌合受体的细胞群体)后，受试者表现出以下一种或多种可观察和/或可测量的改善，则成功地“治疗”了受试者的疾病或病况：致病细胞的数量减少；细胞总数中致病细胞的百分比减少；在一定程度上缓解了与特定病况相关的一种或多种症状；发病率和死亡率降低，和/或生活问题质量的改善。用于评估成功治疗和改善病况的上述参数可通过医师熟悉的常规程序容易地测量。
术语“Treg细胞”是指能够阻抑(suppress)、抑制(inhibit)或预防(prevent)过度或不想要的炎症反应，例如自身免疫或过敏反应的细胞。在一些实施方案中，本发明的Treg细胞群体能具有阻抑(或抑制)活性。在一些实施方案中，所述阻抑活性是非接触依赖性的。在一些实施方案中，所述抑制活性是接触依赖性的。在一些实施方案中，本发明的Treg细胞群体对效应T细胞表现出阻抑作用；在某些实施方案中，所述阻抑作用取决于TCR表达和/或激活。
术语“unibody”是本领域公知的，指的是缺少IgG4抗体的铰链区的抗体片段。铰链区的缺失所产生的分子基本上是传统IgG4抗体大小的一半，并具有IgG4抗体的单价结合区而不是二价结合区。
术语“可变的”是指可变(V)域的某些片段在抗体之间序列差异很大的事实。V域介导抗原结合并决定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性并不在可变域的110至130个氨基酸范围内均匀分布。相反，V区由被称为构架区(FR)的相对不变的15至30个氨基酸的片段组成，这些构架区被称为“高度可变区”或“CDR”的9至12个氨基酸长度的各高度可变的较短区域隔开。天然重链和轻链的可变域各包含四个FR，主要采用β-折叠构型，并通过三个高度可变区连接，其形成连接β-折叠结构且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分的环。每条链中的高度可变区通过FR紧密结合在一起，并且与来自另一条链的高度可变区一起促成抗体的抗原结合位点(参见Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，而是表现出多种效应子功能，例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。
本文所用的术语多核苷酸“变体”是通常与本文具体公开的多核苷酸不同之处在于一个或多个取代、缺失、添加和/或插入的多核苷酸。这样的变体可以是天然存在的，或者可以是合成产生的，例如，通过修饰一个或多个本发明的多核苷酸序列并评估如本文所述的编码的多肽的一个或多个生物学活性和/或通过使用多种本领域公知的技术的任何一种。因此，本文所用的术语“多肽变体”是通常与本文具体公开的多肽不同之处在于一个或多个取代、缺失、添加和/或插入的多肽。这样的变体可以是天然存在的或可以是合成产生的，例如，通过修饰一个或多个本发明的多肽序列并评估如本文所述的多肽的一个或多个生物学活性和/或通过使用多种本领域公知的技术的任何一种。可以对本发明的多核苷酸和多肽的结构进行修饰，并且仍然得到编码或是具有所需特征的变体或衍生多肽的功能性分子。当期望改变多肽的氨基酸序列以产生等同的或甚至改进的本发明的多肽的变体或部分时，本领域技术人员通常将改变编码DNA序列的一个或多个密码子。例如，在蛋白结构中的某些氨基酸可以被其他氨基酸取代，而不会明显丧失其功能(结合其他多肽(例如抗原)或细胞的能力)。由于定义蛋白的生物学功能活性的是蛋白的结合能力和性质，因此可以在蛋白序列中并且当然也可以在其基础DNA编码序列中进行某些氨基酸序列的取代，并且仍然得到具有类似性质的蛋白。因此，预期可以对本发明的肽序列或编码所述肽的相应DNA序列进行各种改变，而不会明显丧失其生物学功用或活性。在许多情况下，多肽变体将含有一个或多个保守取代。变体也可以或可选地含有非保守改变。在一些实施方案中，变体多肽与天然序列的不同之处在于六个、五个、四个、三个、两个或一个氨基酸的取代、缺失或添加。变体还可以(或可选地)通过例如缺失或添加对多肽的免疫原性、二级结构和亲水性质影响最小的氨基酸来修饰。
“versabody”是本领域公知的，指的是另一种抗体模拟物技术。它们是具有＞15％的半胱氨酸的3-5kDa的小蛋白，其形成高二硫键密度的骨架，取代了典型蛋白的疏水核心。
术语“异种的(xenogeneic)”是指来自不同物种的个体的任何材料。术语“异种移植物”是指来自不同物种的个体的移植物。
术语“ζ”或者“ζ链”、“CD3ζ”或“TCR-ζ”定义为如GenBank登录号BAG36664.1提供的蛋白，或来自非人物种例如小鼠、啮齿动物、猴子、猿等的等同残基，“ζ刺激性结构域”或者“CD3ζ刺激性结构域”或“TCR-ζ刺激性结构域”定义为来自ζ链的细胞质结构域的氨基酸残基或其功能性衍生物，其足以在功能上传递T细胞激活所需的初始信号。在一些实施方案中，ζ的细胞质结构域包含GenBank登录号BAG36664.1的残基52至164，或来自非人物种例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等的等同残基(是其功能性直向同源物(ortholog))。
嵌合抗原受体(CAR)
本发明提供了嵌合受体，其包含：
-至少一个细胞外结合结构域，
-任选至少一个细胞外铰链结构域，
-至少一个跨膜结构域(例如，人TNFR2跨膜结构域或其片段或变体，任意跨膜结构域或其片段或变体，或其任意组合)，和
-至少一个细胞内结构域(包含至少一个第一细胞内信号传导结构域，并且任选包含至少一个共刺激性细胞内信号传导结构域，其中所述至少一个共刺激性细胞内信号传导结构域是人TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体，任意共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体，或其任意组合)，其中跨膜结构域是TNFR2跨膜结构域或其片段或变体，和/或共刺激性细胞内信号传导结构域是TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体。
在一些实施方案中，嵌合受体包含一个或多个多肽。
在一些实施方案中，细胞外结合结构域是抗原结合结构域，且嵌合受体因此也可以被称为嵌合抗原受体(或CAR)。
I.细胞外结合结构域
在一些实施方案中，细胞外结构域包含抗原结合结构域，例如抗体或其抗原结合片段。本发明的包含抗体或其抗原结合片段的嵌合抗体的部分可以以多种形式存在，其中配体结合结构域以连续多肽链的一部分被表达，包括例如单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)、人源化抗体或双特异性抗体(Harlow et al.,1999,In:Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow et al.,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；Bird et al.,Science 242:423-426(1988))。在一些方面，本文所述的嵌合受体的抗原结合结构域包含抗体片段。在一些方面，嵌合受体包含含有scFv的抗体片段。
在一些实施方案中，所述抗体是选自由以下组成的组的抗体分子：完整抗体、人源化抗体、单链抗体、二聚体单链抗体、Fv、scFv、Fab、F(ab)’2、去岩藻糖化抗体、双特异性抗体、双抗体、三抗体和四抗体。
在一些实施方案中，所述抗体是选自由unibody、单结构域抗体和纳米抗体组成的组的抗体片段。
在一些实施方案中，所述抗体是选自由以下组成的组的抗体模拟物：affibody、affilin、affitin、adnectin、atrimer、evasin、DARPin、anticalin、avimer、fynomer、versabody和duocalin。
DARPin(Designed Ankyrin Repeat Protein，经设计的锚蛋白重复蛋白)是本领域公知的，指的是为探求非抗体多肽的结合能力而开发的抗体模拟物DRP(designedrepeat protein，经设计的重复蛋白)技术。
可以通过本领域已知的技术来生产本发明的抗体的片段和衍生物(其涵盖在本申请中所用的术语“抗体”中，除非另外说明或与上下文明显矛盾)。“片段”包含完整抗体的一部分，通常是抗原结合位点或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；任何抗体片段，其是具有由连续氨基酸残基的一个不间断序列组成的一级结构的多肽(本文中称为“单链抗体片段”或“单链多肽”)，包括但不限于(1)单链Fv分子，(2)仅含有一个轻链可变域的单链多肽，或含有轻链可变域的三个CDR的其片段，而没有相关的重链部分，以及(3)仅含有一个重链可变区的单链多肽，或含有重链可变区的三个CDR的其片段，而没有相关的轻链部分；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。可以使用标准方法获得本发明的抗体的片段。给定CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知方案中的任何一种来确定，包括由Kabat et al.(1991),“Sequences of Proteins ofImmunological Interest,”5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案)、Al-Lazikani et al.,JMB 273:927-948(1997)(“Chothia”编号方案)描述的那些，或其组合。
在一些实施方案中，本发明的CAR的抗原结合结构域包含抗体片段例如scFv，或由其组成。在具体的实施方案中，抗原结合结构域是scFv。
在一些实施方案中，本发明的CAR的抗原结合结构域识别特异性抗原或其片段(例如，与靶细胞结合)。因此，CAR的抗原结合结构域可以识别靶细胞，例如经感染的细胞、受损的细胞或功能失调的细胞。这样的靶细胞的实例可包括参与功能失调的免疫反应的细胞(例如，参与自身免疫疾病或过敏反应的细胞)、功能失调性激活的炎症细胞(dysfunctionally activated inflammatory cell)(例如，炎症性内皮细胞)、癌细胞和感染的(例如病毒、细菌或寄生虫感染的)细胞。
如本文所用，术语抗原的“片段”是指抗原的任何子集，为较短的肽。在一些实施方案中，抗原的片段是长度为至少6个氨基酸的肽。在一些实施方案中，抗原的片段是长度为6至50个氨基酸，长度为6至30个氨基酸或长度为6至20个氨基酸的肽。
术语抗原的“变体”在本文中是指与天然抗原几乎相同并且具有相同的生物学活性的抗原。天然抗原与其变体之间的最小差异可以在于例如氨基酸取代、缺失和/或添加。这样的变体可以含有例如保守氨基酸取代。在一些实施方案中，抗原的变体与天然抗原的序列具有至少或约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
在一些实施方案中，抗原是自身抗原。自身抗原的实例包括但不限于与炎性神经系统病况相关的抗原(例如多发性硬化相关抗原)、关节相关抗原、眼相关抗原、人HSP抗原、皮肤相关抗原或参与移植排斥或GVHD的抗原。
多发性硬化相关抗原的实例包括但不限于髓磷脂碱性蛋白(MBP)、髓磷脂相关糖蛋白(MAG)、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、蛋白脂蛋白(PLP)、少突胶质细胞髓磷脂寡蛋白(OMGP)、髓磷脂相关少突胶质细胞碱性蛋白(MOBP)、少突胶质细胞特异性蛋白(OSP/Claudin-11)、热休克蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白(OSP)、NOGO A、糖蛋白Po、外周髓磷脂蛋白22(PMP22)、2’3’-环核苷酸3’-磷酸二酯酶(CNPase)，或任何其片段、变体或混合物。
关节相关抗原的实例包括但不限于瓜氨酸取代的环状和线性丝聚蛋白肽，II型胶原蛋白肽，瓜氨酸化波形蛋白，瓜氨酸化II型胶原蛋白，瓜氨酸化纤维蛋白原，人软骨糖蛋白39(HCgp39)肽，HSP，异源核糖核酸蛋白(hnRNP)A2肽，hnRNP B1，hnRNP D，Ro60/52，HSP60、HSP65、HSP70和HSP90，BiP，角蛋白，波形蛋白，纤维蛋白原，I、III、IV和V型胶原蛋白肽，膜联蛋白V，葡萄糖6磷酸异构酶(GPI)，乙酰基-钙蛋白酶抑素，丙酮酸脱氢酶(PDH)，醛缩酶，拓扑异构酶I，snRNP，PARP，Scl-70，Scl-100，包括阴离子心磷脂和磷脂酰丝氨酸的磷脂抗原，带中性电荷的脑磷脂和卵磷脂，基质金属蛋白酶，原纤蛋白，软骨蛋白聚糖(aggrecan)，及其片段、变体和混合物。
眼相关抗原的实例包括但不限于II型胶原蛋白、瓜氨酸化波形蛋白、瓜氨酸化II型胶原蛋白、瓜氨酸化纤维蛋白原、视网膜抑制蛋白、S-抑制蛋白、光受体间类视黄醇结合蛋白(IRBP1)、β-晶状体蛋白B1、视网膜蛋白、脉络膜蛋白及其片段、变体和混合物。
人HSP抗原的实例包括但不限于人HSP60、HSP70、HSP90及其片段、变体和混合物。
在一些实施方案中，抗原是炎性神经系统病况相关抗原，例如多发性硬化相关抗原。炎性神经系统病况相关抗原(例如多发性硬化相关抗原)的实例包括但不限于髓磷脂碱性蛋白(MBP)、髓磷脂相关糖蛋白(MAG)、髓磷脂少突胶质细胞蛋白(MOG)、蛋白脂蛋白(PLP)、少突胶质细胞髓磷脂寡蛋白(OMGP)、髓磷脂相关少突胶质细胞碱性蛋白(MOBP)、少突胶质细胞特异性蛋白(OSP/Claudin-11)、热休克蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白(OSP)、NOGO A、糖蛋白Po、外周髓磷脂蛋白22(PMP22)、2’3’-环核苷酸3’-磷酸二酯酶(CNPase)，及其片段、变体和混合物。
在一些实施方案中，抗原是关节相关抗原。关节相关抗原的实例包括但不限于瓜氨酸取代的环状和线性丝聚蛋白肽，II型胶原蛋白肽，人软骨糖蛋白39(HCgp39)肽，HSP，异源核糖核酸蛋白(hnRNP)A2肽，hnRNP B1，hnRNP D，Ro60/52，HSP60、HSP65、HSP70和HSP90，BiP，角蛋白，波形蛋白，纤维蛋白原，I、III、IV和V型胶原蛋白肽，膜联蛋白V，葡萄糖6磷酸异构酶(GPI)，乙酰基-钙蛋白酶抑素，丙酮酸脱氢酶(PDH)，醛缩酶，拓扑异构酶I，snRNP，PARP，Scl-70，Scl-100，包括阴离子心磷脂和磷脂酰丝氨酸的磷脂抗原，带中性电荷的脑磷脂和卵磷脂，基质金属蛋白酶，原纤蛋白，软骨蛋白聚糖，及其片段、变体和混合物。
在一些实施方案中，抗原是眼相关抗原。眼相关抗原的实例包括但不限于II型胶原蛋白、视网膜抑制蛋白、S-抑制蛋白、光受体间类视黄醇结合蛋白(IRBP1)、β-晶体蛋白B1、视网膜蛋白、脉络膜蛋白及其片段、变体和混合物。
在一些实施方案中，抗原是人HSP抗原。人HSP抗原的实例包括但不限于人HSP60、HSP70、HSP90及其片段、变体和混合物。
在一些实施方案中，抗原是皮肤相关抗原。皮肤相关抗原的实例包括但不限于角质形成细胞抗原、存在于真皮或表皮中的抗原、黑色素细胞抗原(例如黑色素或酪氨酸酶)、桥粒芯糖蛋白(例如桥粒芯糖蛋白1或3，也可以称为Dsg1/3)、BP180、BP230、网蛋白(plectin)、整联蛋白(例如整联蛋白α4β6)、胶原蛋白(例如VII型胶原蛋白)、层粘连蛋白(例如层粘连蛋白332或层粘连蛋白γ1)、血小板溶素(例如包斑蛋白(envoplakin)、周斑蛋白(periplakin)或桥粒斑蛋白(desmoplakin))、角蛋白(例如KRT5、KRT8、KRT15、KRT17和KRT31)、角蛋白丝相关蛋白、丝聚蛋白、角化粒素(corneodesmosin)和弹性蛋白。
在一些实施方案中，抗原是参与移植排斥或GVHD的抗原。此类抗原的实例包括但不限于对移植组织或宿主特异的MHC、β2-微球蛋白、来自ABO系统的抗原、来自恒河猴系统的抗原(例如抗原C、c、E、e和D)和异血细胞凝集素。可参与移植排斥或GVHD的抗原的其他实例包括但不限于HLA-DR(尤其是在移植后的前六个月)、HLA-B(尤其是在移植后的前两年)、HLA-A、次要组织相容性抗原(miHA，例如HLA-E、HLA-F和HLA-G)、对应于I类MHC的HLA(A、B和C)、对应于II类MHC的HLA(DP、DM、DOA、DOB、DQ和DR)以及对应于III类MHC的HLA(例如补体系统的组分)。
在一些实施方案中，抗原是HLA-A2细胞表面蛋白。在一些实施方案中，细胞外结合结构域包含针对HLA-A2的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，HLA-A2结合结构域包含针对HLA-A2的scFv。
如本文所用的术语“HLA-A2”是指由HLA基因复合物的HLA-A基因座处的HLA-A*02等位基因家族编码的包括细胞表面蛋白的人白细胞抗原(HLA)蛋白。术语“HLA-A2”涵盖的HLA蛋白包括通过血清学测试或基因分型法确定为属于HLA-A*02抗原类型的HLA蛋白。HLA-A*02抗原类型的其他名称包括“HLA-A2”、“HLA-A02”和“HLA-A*2”。已经开发出标示由这个等位基因家族编码的HLA蛋白的不同命名系统，包括由WHO HLA系统因子委员会(WHOCommittee for Factors of the HLA System)于2010年开发的HLA命名系统。术语“HLA-A2”是指等位基因编码的具有根据这个命名系统命名的以“HLA-A*02”开头的HLA蛋白，包括但不限于以“HLA-A*02：01”、“HLA-A*02：02”、“HLA-A*02：03”、“HLA-A*02：04”、“HLA-A*02：05”、“HLA-A*02：06”、“HLA-A*02：07”、“HLA-A*02：08”、“HLA-A*02：09”、“HLA-A*02：10”和“HLA-A*02：11”开头的名称。等位基因名称可以用斜体表示。以“HLA-A*02：”开头，后接2或3个额外数字的等位基因名称可以构成完整名称或名称的开始部分。术语“HLA-A2”还指根据这个命名系统以“HLA-A*02”开头的名称标识的HLA蛋白，包括但不限于名称“HLA-A*02：01”、“HLA-A*02：02”、“HLA-A*02：03”、“HLA-A*02：04”、“HLA-A*02：05”、“HLA-A*02：06”、“HLA-A*02：07”、“HLA-A*02：08”、“HLA-A*02：09”、“HLA-A*02：10”和“HLA-A*02：11”。
在一些实施方案中，HLA-A2结合结构域包含针对HLA-A2的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，HLA-A2结合结构域包含针对HLA-A2的scFv。针对HLA-A2的scFv的实例包括但不限于包含选自由以下组成的组的序列或由其组成的scFv：SEQ ID NO：68、SEQID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86、SEQID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107及其片段或变体；和PCT专利公开WO2018/183293和WO 2019/056099中所公开的抗HLA-A2 scFv。例如，用于本文所述的CAR中的抗HLA-A2 scFv可以包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列或由其组成。在另一个实例中，用于本文所述的CAR中的抗HLA-A2 scFv可以包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列或由其组成。在另一个实例中，用于本文所述的CAR中的抗HLA-A2 scFv可以包含SEQ ID NO：92的氨基酸序列或由其组成。在另一个实例中，用于本文所述的CAR中的抗HLA-A2 scFv可以包含SEQ ID NO：103的氨基酸序列或由其组成。在另一个实例中，用于本文所述的CAR中的抗HLA-A2 scFv可以包含SEQ ID NO：107的氨基酸序列或由其组成。
自身抗原的其他实例包括但不限于水通道蛋白水通道(例如水通道蛋白-4水通道(AQP4))、Hu、Ma2、坍塌蛋白反应介质蛋白5(collapsin response-mediator protein 5，CRMP5)、双载蛋白(amphiphysin)、电压门控钾通道(VGKC)、N-甲基-d-天冬氨酸受体(NMDAR)、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPAR)、甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白、抗N-甲基-D-天冬氨酸受体(NR1亚基)、Rh血型抗原、I抗原、桥粒芯糖蛋白1或3(Dsg1/3)、BP180、BP230、乙酰胆碱烟碱突触后受体、促甲状腺素受体、血小板整联蛋白、GpIIb:IIIa、胶原蛋白(例如胶原蛋白α-3(IV)链)、类风湿因子、钙蛋白酶抑素、瓜氨酸化蛋白、髓磷脂碱性蛋白(MBP)、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)肽、α-β-晶状体蛋白、DNA、组蛋白、核糖体、RNP、组织转谷氨酰胺酶(TG2)、内在因子、65-kDa抗原、磷脂酰丝氨酸、核糖体磷蛋白、抗中性粒细胞细胞质抗体、Scl-70、U1-RNP、ANA、SSA、抗SSB、抗核抗体(ANA)、抗中性粒细胞细胞质抗体(ANCA)、Jo-1、抗线粒体抗体、gp210、p62、sp100、抗磷脂抗体、U1-70 kdsnRNP、GQ1b神经节苷脂、GM1、缺乏唾液酸基的GM1(asialo GM1)、GD1b、抗平滑肌抗体(ASMA)、抗肝-肾微粒体1抗体(ALKM-1)、抗肝胞质溶胶抗体1(ALC-1)、IgA抗内胚层抗体、中性粒细胞颗粒蛋白、链球菌细胞壁抗原、胃壁细胞内在因子、胰岛素(IAA)、谷氨酸脱羧酶(GAA或GAD)、蛋白酪氨酸磷酸酶(例如IA2或ICA512)、PLA2R1和THSD7A1。
在一些实施方案中，抗原是在细胞表面表达的IL-23受体(IL-23R)。在一些实施方案中，细胞外结合结构域是针对IL-23R的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，抗原是可溶性IL-23R。在一些实施方案中，细胞外结合结构域是针对可溶性IL-23R的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，抗原是IL-23R的变体。在一些实施方案中，细胞外结合结构域是针对IL-23R的变体的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，IL-23R的变体肽是修饰的IL-23R肽，其中与原始肽相比，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸被缺失、添加或取代。
在一些实施方案中，抗原是IL-23R的剪接变体。在一些实施方案中，细胞外结合结构域是针对IL-23R的剪接变体的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本发明的CAR识别并能够结合人IL-23R。在一些实施方案中，本发明的CAR识别并能够结合鼠IL-23R。
在一些实施方案中，IL-23R结合结构域包含针对IL-23R的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，IL-23R结合结构域包含针对IL-23R的scFv。针对IL-23R的scFv的实例包括但不限于包含选自由以下组成的组的序列或由其组成的scFv：SEQ ID NO：65、SEQID NO：66、SEQ ID NO：67及其片段或变体。
在一些实施方案中，抗原是吸入性过敏原、摄入性过敏原或接触性过敏原。
在一些实施方案中，抗原是来自普通人类饮食的食物抗原。
术语“来自普通人类饮食的食物抗原”是指来自人类常见食物的免疫原性肽，例如以下非限制性列表的食物抗原：卵白蛋白、牛抗原如脂质运载蛋白、钙结合S100、α-乳清蛋白、乳球蛋白如β-乳球蛋白、牛血清白蛋白和酪蛋白。食物抗原也可以是大西洋鲑鱼抗原如小白蛋白、鸡抗原如类卵粘蛋白、Ag22、伴清蛋白、溶菌酶或鸡血清白蛋白、花生、虾抗原如原肌球蛋白、小麦抗原如凝集素或麦醇溶蛋白、芹菜抗原如芹菜抑制蛋白、胡萝卜抗原如胡萝卜抑制蛋白、苹果抗原如索马甜、苹果脂质转移蛋白、苹果抑制蛋白、梨抗原如梨抑制蛋白、异黄酮还原酶、鳄梨抗原如内切几丁质酶、杏抗原如杏脂质转移蛋白、桃子抗原如桃子脂质转移蛋白或桃子抑制蛋白、大豆抗原如HPS、大豆抑制蛋白或(SAM22)PR-I0 prot，及其片段、变体和混合物。
在一些实施方案中，抗原是组织特异性蛋白。组织特异性蛋白的实例包括但不限于其表达限于特定的组织或器官的整联蛋白和选择蛋白(selectin)。
在一些实施方案中，抗原是在B细胞表面表达的B细胞表面标志物。B细胞(例如人B细胞)的表面标志物的实例包括但不限于CD19、CD20、BCMA、IgM、IgA、IgG、IgE、IgD、CD1、CD5、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD30、CD38、CD40、CD78、CD80、CD138、CD319、PDL-2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、Notch2、TLR4、IL-6、IL-10和TGFβ。在某些实施方案中，B细胞表面标志物选自CD19、CD20、BCMA、IgM、IgA、IgG、IgE、IgD、CD1、CD21、CD22、CD138。在具体的实施方案中，B细胞表面标志物选自CD19和CD20。
在一些实施方案中，抗原是在祖B细胞(proB cell)表面表达的祖B细胞表面标志物。祖B细胞(例如人祖B细胞)的表面标志物的实例包括但不限于CD10、CD19、CD24、CD34和CD38。
在一些实施方案中，抗原是在前B细胞(preB cell)表面表达的前B细胞表面标志物。前B细胞(例如人前B细胞)的表面标志物的实例包括但不限于CD5、CD10、CD19、CD20和CD34、CD38。
在一些实施方案中，抗原是在B细胞表面表达的未成熟(或过渡性)B细胞表面标志物。未成熟(或过渡性)B细胞(例如人未成熟B细胞)的表面标志物的实例包括但不限于CD5、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD38和IgG。
在一些实施方案中，抗原是在B细胞表面表达的边缘区B细胞表面标志物。边缘区B细胞(例如人边缘区B细胞)的表面标志物的实例包括但不限于CD1、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD27、IgG和Notch2。
在一些实施方案中，抗原是在B细胞表面表达的浆细胞表面标志物。浆细胞(例如人浆细胞)的表面标志物的实例包括但不限于CD19、CD27、CD38、CD138、IgG、MHCII和IL-6。
在一些实施方案中，抗原是在B细胞表面表达的浆母细胞(plasmablast cell)表面标志物。浆母细胞(例如人浆母细胞)的表面标志物的实例包括但不限于CD19、CD20、CD27、CD38、IgG和MHCII。
在一些实施方案中，抗原是在B细胞表面表达的记忆B细胞表面标志物。记忆B细胞(例如人记忆B细胞)的表面标志物的实例包括但不限于CD19、CD20、CD22、CD24、CD27、CD38、CD40、CD80、PD-L2、IgG、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、IgA、IgG和IgE。
在一些实施方案中，抗原是在B细胞表面表达的生发中心B细胞表面标志物。生发中心B细胞(例如人生发中心B细胞)的表面标志物的实例包括但不限于CD10、CD19、CD20、CD22、CD38和IgG。
在一些实施方案中，抗原是在B细胞表面表达的活化B细胞表面标志物。活化B细胞(例如人活化B细胞)的表面标志物的实例包括但不限于CD19、CD25和CD30。
在一些实施方案中，抗原是在B细胞表面表达的调节性B细胞表面标志物。调节性B细胞(Breg细胞)的表面标志物的实例包括但不限于CD1、CD1d、CD5、CD19、CD21、CD23、CD24、CD40、Fas配体、IL-10、TLR4、TGFβ、IgD、IgM、PD-L1、PD-L2、TIM-1、TNFSF18和TRAIL。在具体的实施方案中，人Breg细胞的表面标志物的实例包括但不限于CD1、CD1d、CD5、CD19、CD21、CD24、CD40、IL-10、TLR4、TGFβ、IgD和IgM。
在一些实施方案中，抗原是在B细胞表面表达的具有非分泌型Ig(non-secretedIg)的B细胞表面标志物。具有非分泌型Ig的B细胞(例如人B细胞)表面标志物的实例包括但不限于CD138和Notch2。
在一些实施方案中，B细胞表面标志物是CD19。在一些实施方案中，CD19结合结构域包含针对CD19的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，CD19结合结构域包含针对CD19的scFv。针对CD19的scFv的实例包括但不限于SEQ ID NO：1和FMC63(SEQ ID NO：2)。
在一些实施方案中，B细胞表面标志物是CD20。在一些实施方案中，CD20结合结构域包含针对CD20的抗体或其抗原结合片段。CD20抗体的实例包括但不限于利妥昔单抗或其片段或变体(例如，SEQ ID NO：3或其片段或变体)。针对CD20的scFv的实例包括但不限于包含选自由以下组成的组的序列或由其组成的scFv：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6及其片段或变体。
在一个实施方案中，抗原是癌抗原。
如本文所用，术语“癌抗原”是指由癌细胞差异表达，且因此可以被利用以靶向癌细胞的抗原。癌抗原是可以潜在刺激明显的肿瘤特异性免疫应答的抗原。这些抗原中的一些由正常细胞编码，尽管不是必须要表达；这些抗原可以被表征为在正常细胞中通常沉默(即不表达)的那些、仅在分化的某些阶段表达的那些以及按时间表达的那些，例如胚胎抗原和胎儿抗原。其他癌抗原由突变的细胞基因编码，例如癌基因(例如，激活的ras癌基因)、阻抑基因(例如，突变的p53)和由内部缺失或染色体易位产生的融合蛋白。其他癌抗原也可以由病毒基因编码，例如那些被携带在RNA和DNA肿瘤病毒上的基因。已经依据多种实体瘤定义了许多肿瘤抗原：MAGE 1、2和3(通过免疫定义)；MART-1/Melan-A、gp100、癌胚抗原(CEA)、HER2、粘蛋白(即MUC-1)、前列腺特异性抗原(PSA)和前列腺酸性磷酸酶(PAP)。此外，已显示病毒蛋白，例如由乙型肝炎(HBV)、爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr，EBV)和人乳头瘤(HPV)编码的一些，分别对于肝细胞癌、淋巴瘤和宫颈癌的发展是重要的。
其他癌抗原包括但不限于707-AP(707丙氨酸脯氨酸)，AFP(α(a)-甲胎蛋白)，ART-4(T4细胞识别的腺癌抗原)，BAGE(B抗原；b-连环蛋白/m，b-连环蛋白/突变的)，BCMA(B细胞成熟抗原)，Bcr-abl(断点簇区域-Abelson)，CAIX(碳酸酐酶IX)，CD19(分化簇19)，CD20(分化簇20)，CD22(分化簇22)，CD30(分化簇30)，CD33(分化簇33)，CD44v7/8(分化簇44，外显子7/8)，CAMEL(黑色素瘤上CTL识别的抗原)，CAP-1(癌胚抗原肽-1)，CASP-8(半胱天冬酶-8)，CDC27m(细胞分裂周期27，突变的)，CDK4/m(环化素依赖性激酶4，突变的)，CEA(癌胚抗原)，CT(癌症/睾丸(抗原))，Cyp-B(亲环素B)，DAM(分化抗原黑色素瘤)，EGFR(表皮生长因子受体)，EGFRvIII(表皮生长因子受体，变体III)，EGP-2(上皮糖蛋白2)，EGP-40(上皮糖蛋白40)，Erbb2、3、4(成红细胞白血病病毒癌基因同源物-2、-3、4)，ELF2M(延伸因子2，突变的)，ETV6-AML1(Ets变体基因6/急性髓细胞白血病1基因ETS)，FBP(叶酸结合蛋白)，fAchR(胎儿乙酰胆碱受体)，G250(糖蛋白250)，GAGE(G抗原)，GD2(二唾液酸神经节苷脂2)，GD3(二唾液酸神经节苷脂3)，GnT-V(N-乙酰葡糖氨基转移酶V)，Gp100(糖蛋白100kD)，HAGE(helicose抗原)，HER-2/neu(人表皮受体-2/神经性；也称为EGFR2)，HLA-A(人白细胞抗原-A)，HPV(人乳头瘤病毒)，HSP70-2M(热休克蛋白70-2，突变的)，HST-2(人印戒肿瘤-2)，hTERT或hTRT(人端粒酶逆转录酶)，iCE(肠羧基酯酶)，IL-13R-a2(白介素-13受体亚基α-2)，KIAA0205，KDR(激酶插入结构域受体)，κ-轻链，LAGE(L抗原)，LDLR/FUT(低密度脂质受体/GDP-L-岩藻糖：b-D-半乳糖苷酶2-a-L岩藻糖基转移酶)，LeY(Lewis-Y抗体)，L1 CAM(L1细胞粘附分子)，MAGE(黑色素瘤抗原)，MAGE-A1(黑色素瘤相关抗原1)，间皮素，鼠CMV感染的细胞，MART-1/Melan-A(T细胞识别的黑色素瘤抗原-I/黑色素瘤抗原A)，MC1 R(黑皮质素1受体)，yosin/m(肌球蛋白，突变的)，MUC1(粘蛋白1)，MUM-1、-2、-3(黑色素瘤普遍存在的突变的-1、-2、-3)，NA88-A(患者M88的NA cDNA克隆)，NKG2D(自然杀伤组2，成员D)配体，NY-BR-1(纽约乳分化抗原1)，NY-ESO-1(纽约食管鳞状细胞癌-1)，癌胚抗原(h5T4)，P15(蛋白15)，p190次要bcr-abl(190KD bcr-abl的蛋白)，Pml/RARa(早幼粒细胞白血病/视黄酸受体a)，PRAME(黑色素瘤的优先表达抗原)，PSA(前列腺特异性抗原)，PSCA(前列腺干细胞抗原)，PSMA(前列腺特异性膜抗原)，RAGE(肾脏抗原)，RU1或RU2(肾脏普遍存在的1或2)，SAGE(肉瘤抗原)，SART-1或SART-3(排斥肿瘤的鳞状抗原1或3)，滑膜肉瘤X1、-2、-3、-4(SSX1、-2、-3、4)，TAA(肿瘤相关抗原)，TAG-72(肿瘤相关糖蛋白72)，TEL/AML1(易位Ets-家族性白血病/急性髓细胞白血病1)，TPI/m(磷酸丙糖异构酶，突变的)，TRP-1(酪氨酸酶相关蛋白1，或gp75)，TRP-2(酪氨酸酶相关蛋白2)，TRP-2/INT2(TRP-2/内含子2)，VEGF-R2(血管内皮生长因子受体2)，或WT1(维尔姆斯瘤(Wilms’s tumor)基因)。
在一些实施方案中，抗原与感染的细胞有关。
如本文所用，术语“感染的细胞”是指被一些不利地影响其质量、特征或状况的物质污染的细胞。
在一些实施方案中，抗原与病毒感染的细胞有关。在一些实施方案中，抗原与细菌感染的细胞有关。在一些实施方案中，抗原与真菌感染的细胞有关。在一些实施方案中，抗原与寄生虫感染的细胞有关。
在一些实施方案中，细胞外结合结构域是蛋白或其片段或变体。
在一些实施方案中，细胞外结合结构域识别B细胞上的自身抗体。
在一些实施方案中，细胞外结合结构域是自身抗原。
在一些实施方案中，嵌合受体包含自身抗原(也可以称为自体抗原(self-antigen))或其片段或变体，并因此可以识别针对所述自身抗原的抗体。如本文所用，术语“自身抗原”或“自体抗原”是指刺激自身抗体产生的内源性抗原。在一些实施方案中，自身抗原与自身免疫疾病有关。在一些实施方案中，本发明的免疫细胞对于产生针对所述自身抗原的抗体的B细胞具有细胞毒性。
术语“自身抗原的变体”在本文中是指与天然自身抗原几乎相同并且具有相同的生物学活性的自身抗原。天然自身抗原与其变体之间的最小差异可以在于例如氨基酸取代、缺失和/或添加。这样的变体可含有例如保守氨基酸取代，其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸和谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸)、β支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸)。在一些实施方案中，自身抗原的变体与天然自身抗原的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
自身抗原的实例包括但不限于水通道蛋白水通道(例如水通道蛋白-4水通道(AQP4))、Hu、Ma2、坍塌蛋白反应介质蛋白5(CRMP5)、双载蛋白、电压门控钾通道(VGKC)、N-甲基-d-天冬氨酸受体(NMDAR)、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPAR)、甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白、抗N-甲基-D-天冬氨酸受体(NR1亚基)、Rh血型抗原、I抗原、桥粒芯糖蛋白1或3(Dsg1/3)、BP180、BP230、乙酰胆碱烟碱突触后受体、促甲状腺素受体、血小板整联蛋白、GpIIb:IIIa、胶原蛋白(例如胶原蛋白α-3(IV)链)、类风湿因子、钙蛋白酶抑素、瓜氨酸化蛋白、髓磷脂碱性蛋白(MBP)、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)肽、α-β-晶状体蛋白、DNA、组蛋白、核糖体、RNP、组织转谷氨酰胺酶(TG2)、内在因子、65-kDa抗原、磷脂酰丝氨酸、核糖体磷蛋白、抗中性粒细胞细胞质抗体、Scl-70、U1-RNP、ANA、SSA、抗SSB、抗核抗体(ANA)、抗中性粒细胞细胞质抗体(ANCA)、Jo-1、抗线粒体抗体、gp210、p62、sp100、抗磷脂抗体、U1-70 kd snRNP、GQ1b神经节苷脂、GM1、缺乏唾液酸基的GM1、GD1b、抗平滑肌抗体(ASMA)、抗肝-肾微粒体1抗体(ALKM-1)、抗肝胞质溶胶抗体1(ALC-1)、IgA抗内胚层抗体、中性粒细胞颗粒蛋白、链球菌细胞壁抗原、胃壁细胞内在因子、胰岛素(IAA)、谷氨酸脱羧酶(GAA或GAD)、蛋白酪氨酸磷酸酶(例如IA2或ICA512)、PLA2R1和THSD7A1。
自身抗原的其他实例在本文中列出，且包括但不限于多发性硬化相关抗原(例如，髓磷脂碱性蛋白(MBP)、髓磷脂相关糖蛋白(MAG)、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、蛋白脂蛋白(PLP)、少突胶质细胞髓磷脂寡蛋白(OMGP)、髓磷脂相关少突胶质细胞碱性蛋白(MOBP)、少突胶质细胞特异性蛋白(OSP/Claudin-11)、热休克蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白(OSP)、NOGO A、糖蛋白Po、外周髓磷脂蛋白22(PMP22)、2’3’-环核苷酸3’-磷酸二酯酶(CNPase)，及其片段、变体和混合物)；关节相关抗原(例如，瓜氨酸取代的环状和线性丝聚蛋白肽，II型胶原蛋白肽，人软骨糖蛋白39(HCgp39)肽，HSP，异源核糖核酸蛋白(hnRNP)A2肽，hnRNP B1，hnRNP D，Ro60/52，HSP60、HSP65、HSP70和HSP90，BiP，角蛋白，波形蛋白，纤维蛋白原，I、III、IV和V型胶原蛋白肽，膜联蛋白V，葡萄糖6磷酸异构酶(GPI)，乙酰基-钙蛋白酶抑素，丙酮酸脱氢酶(PDH)，醛缩酶，拓扑异构酶I，snRNP，PARP，Scl-70，Scl-100，包括阴离子心磷脂和磷脂酰丝氨酸的磷脂抗原，带中性电荷的脑磷脂和卵磷脂，基质金属蛋白酶，原纤蛋白，软骨蛋白聚糖，瓜氨酸化波形蛋白，瓜氨酸化II型胶原蛋白，瓜氨酸化纤维蛋白原，及其片段、变体和混合物)；眼相关抗原(例如，II型胶原蛋白、视网膜抑制蛋白、S-抑制蛋白、光受体间类视黄醇结合蛋白(IRBP1)、β-晶状体蛋白B1、视网膜蛋白、脉络膜蛋白、瓜氨酸化波形蛋白、瓜氨酸化II型胶原蛋白、瓜氨酸化纤维蛋白原，及其片段、变体和混合物)；和人HSP抗原(例如，人HSP60、HSP70、HSP90及其片段、变体和混合物)。
在一些实施方案中，自身抗原是桥粒芯蛋白1或桥粒芯蛋白3或其变体或片段，例如桥粒芯蛋白1或3的细胞外结构域。在一些实施方案中，嵌合受体包含桥粒芯蛋白3的细胞外结构域1至4，例如包含SEQ ID NO：7或由其组成的序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含针对第一抗原的细胞外结合结构域和针对另一抗原的至少一个其他细胞外结合结构域。这样的CAR能够结合至少2个不同的抗原。在某些实施方案中，所述至少一个其他细胞外结合结构域是针对特定抗原的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述至少一个其他细胞外结合结构域包含抗体片段(例如scFv)或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的CAR中包含的抗体是多特异性抗体分子，例如，其包含多个免疫球蛋白可变域序列，其中多个中的第一免疫球蛋白可变域序列对第一表位(first epitope)具有结合特异性，且多个中的第二免疫球蛋白可变域序列对第二表位(second epitope)具有结合特异性。在一些实施方案中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对两个抗原具有特异性，并表征为对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变域序列。
II.间隔区和铰链结构域
在一些实施方案中，细胞外结合结构域通过间隔结构域或铰链结构域与跨膜结构域连接。接头的实例包括但不限于本文所述的GS接头。在某些实施方案中，接头可以包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：111)或由其组成。
在一些实施方案中，长度为例如2至10个氨基酸的短的寡肽接头或多肽接头可以形成铰链结构域。在一些实施方案中，术语“接头”是指柔性多肽接头。
例如，甘氨酸-丝氨酸双联体可提供合适的铰链结构域(GS接头)。在一些实施方案中，铰链结构域是Gly/Ser接头。Gly/Ser接头的实例包括但不限于GS接头、G2S接头、G3S接头和G4S接头。
G2S接头的实例包括但不限于GGS。
G3S接头包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n，也称为(GGGS)n或(SEQ ID NO:112)n，其中n是等于或大于1的正整数(例如n＝1、n＝2、n＝3、n＝4、n＝5、n＝6、n＝7、n＝8、n＝9或n＝10)。G3S接头的实例包括但不限于GGGSGGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO：113)。
G4S接头的实例包括但不限于对应于GGGGS(SEQ ID NO：114)的(Gly4 Ser)；对应于GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：115)的(Gly4 Ser)2；对应于GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：116)的(Gly4 Ser)3；和对应于GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：117)的(Gly4 Ser)4。
在一些实施方案中，间隔结构域的长度可高达300个氨基酸，例如，10至100个氨基酸、25至50个氨基酸或2至10个氨基酸。
在一些实施方案中，如本文所述，铰链结构域是短的寡肽接头或多肽接头，例如其长度范围为2至10个氨基酸。可用于本发明的铰链结构域的实例描述于PCT专利公开WO2012/138475中，其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，铰链结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：氨基酸序列AGSSSSGGSTTGGSTT(SEQ ID NO：8)、氨基酸序列GTTAASGSSGGSSSGA(SEQ ID NO：9)、氨基酸序列SSATATAGTGSSTGST(SEQ ID NO：10)和氨基酸序列TSGSTGTAASSTSTST(SEQ ID NO：11)。
在一些实施方案中，铰链结构域由GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(SEQ IDNO：12)的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，铰链结构域是对应于KIRRDSS(SEQ ID NO：13)的KIR2DS2铰链。
在一些实施方案中，铰链结构域包含以下或由其组成：CD8铰链的氨基酸序列(例如包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或由其组成)，或与SEQ ID NO：14具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链结构域是由SEQ ID NO：15的核酸序列或与SEQ ID NO：15具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码的CD8铰链。
在一些实施方案中，铰链结构域包含以下或由其组成：IgG4铰链的氨基酸序列(例如包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列或由其组成)，或与SEQ ID NO：16具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链结构域是由SEQ ID NO：17的核酸序列或与SEQ ID NO：17具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码的IgG4铰链。
在一些实施方案中，铰链结构域包含以下或由其组成：IgD铰链的氨基酸序列(例如包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列或由其组成)，或与SEQ ID NO：18具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链结构域是由SEQ ID NO：19的核酸序列或与SEQ ID NO：19具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码的IgD铰链。
在一些实施方案中，铰链结构域包含以下或由其组成：CD28铰链的氨基酸序列(例如包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列或由其组成)，或与SEQ ID NO：20具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链结构域是由SEQ ID NO：21的核酸序列或与SEQ ID NO：21具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码的CD28铰链。
III.跨膜结构域
可用于本发明的嵌合受体的跨膜结构域的实例包括但不限于以下的跨膜结构域：TNFR2、CD28、CD8，或T细胞受体的α、β或ζ链，或CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、PD1、ITGAX、CDl1c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CDIOO(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和/或NKG2C。
在一些实施方案中，跨膜结构域可以包含其来源分子的完整跨膜结构域，或它可以包含其功能性片段或变体。
在一些实施方案中，嵌合受体包含选自以下的至少一个跨膜结构域：TNFR2的跨膜结构域、CD8的跨膜结构域和CD28的跨膜结构域。
在一些实施方案中，跨膜结构域包含TNFR2跨膜结构域的氨基酸序列(例如包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列或由其组成)，或与SEQ ID NO：22具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。在一些实施方案中，跨膜结构域包含与SEQ ID NO：22的氨基酸序列或与SEQ IDNO：22具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列相比，具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20个、10个或5个修饰的氨基酸序列，或由其组成。
在一些实施方案中，TNFR2跨膜结构域由SEQ ID NO：23的核酸序列，或与SEQ IDNO：23具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码。
在一些实施方案中，TNFR2跨膜结构域包含来自SEQ ID NO：22的序列或来自与SEQID NO：22具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个氨基酸，例如来自SEQ ID NO：22的序列的至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个连续氨基酸。在某些实施方案中，TNFR2跨膜结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：CVIMTQV(SEQ ID NO：62)、VNCVIMTQV(SEQID NO：63)或TALGLLIIGVVNCVIMTQV(SEQ ID NO：64)。在具体的实施方案中，TNFR2跨膜结构域包含VNCVIMTQV(SEQ ID NO：63)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，TNFR2跨膜结构域由以下的核苷酸序列编码：来自SEQ ID NO：23的序列或来自与SEQ ID NO：23具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的至少6个、9个、12个、15个、18个、21个、24个、27个、30个、33个、36个、39个、42个、45个、48个、51个、54个、57个、60个、63个、66个、69个、72个、75个、78个、81个、84个或87个核苷酸，例如来自SEQ ID NO：23的序列的至少6个、9个、12个、15个、18个、21个、24个、27个、30个、33个、36个、39个、42个、45个、48个、51个、54个、57个、60个、63个、66个、69个、72个、75个、78个、81个、84个或87个连续核苷酸。
在一些实施方案中，跨膜结构域包含CD8跨膜结构域的氨基酸序列(例如包含SEQID NO：24的氨基酸序列或由其组成)，或与SEQ ID NO：24具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。在一些实施方案中，跨膜结构域包含与SEQ ID NO：24的氨基酸序列或与SEQ IDNO：24具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列相比，具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20个、10个或5个修饰的氨基酸序列，或由其组成。
在一些实施方案中，CD8跨膜结构域由SEQ ID NO：25的核苷酸序列或与SEQ IDNO：25具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，CD8跨膜结构域包含来自序列SEQ ID NO：24或来自与SEQ IDNO：24具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个或24个氨基酸，例如来自SEQID NO：24的序列的至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个或24个连续氨基酸。
在一些实施方案中，CD8跨膜结构域由以下的核苷酸序列编码：来自SEQ ID NO：25的序列或来自与SEQ ID NO：25具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的至少6个、9个、12个、15个、18个、21个、24个、27个、30个、33个、36个、39个、42个、45个、48个、51个、54个、57个、60个、63个、66个、69个或72个核苷酸，例如来自SEQ ID NO：25的序列的至少6个、9个、12个、15个、18个、21个、24个、27个、30个、33个、36个、39个、42个、45个、48个、51个、54个、57个、60个、63个、66个、69个或72个连续核苷酸。
在一些实施方案中，跨膜结构域包含CD28跨膜结构域的氨基酸序列(例如包含SEQID NO：26的氨基酸序列或由其组成)，或与SEQ ID NO：26具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。在一些实施方案中，跨膜结构域包含与SEQ ID NO：26的氨基酸序列或与SEQ IDNO：26具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列相比，具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20个、10个或5个修饰的氨基酸序列，或由其组成。
在一些实施方案中，跨膜结构域是由SEQ ID NO：27的核酸序列或与SEQ ID NO：27具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码的CD28跨膜结构域。在一些实施方案中，CD28跨膜结构域包含来自SEQ ID NO：26的序列或来自与SEQ ID NO：26具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个或27个氨基酸，例如来自SEQ ID NO：26的序列的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个或27个连续氨基酸。
在一些实施方案中，CD28跨膜结构域由以下的核苷酸序列编码：来自SEQ ID NO：27的序列或来自与SEQ ID NO：27具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的至少6个、9个、12个、15个、18个、21个、24个、27个、30个、33个、36个、39个、42个、45个、48个、51个、54个、57个、60个、63个、66个、69个、72个、75个、78个或81个核苷酸，例如来自SEQ ID NO：27的序列的至少6个、9个、12个、15个、18个、21个、24个、27个、30个、33个、36个、39个、42个、45个、48个、51个、54个、57个、60个、63个、66个、69个、72个、75个、78个或81个连续核苷酸。
在本发明的一些实施方案中，嵌合受体可以包含至少两个跨膜结构域的组合，所述至少两个跨膜结构域例如选自TNFR2的跨膜结构域、CD8的跨膜结构域和CD28的跨膜结构域。所述跨膜结构域可以是完整跨膜结构域或其片段或变体，并且可以以随机或特定的顺序彼此连接。在某些实施方案中，至少两个跨膜结构域或其片段或变体的组合包含至少15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个氨基酸。
在一些实施方案中，嵌合受体包含TNFR2跨膜结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQID NO：22的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体，以及CD8跨膜结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体。在某些实施方案中，嵌合受体包含融合跨膜结构域，其包含SEQ ID NO：59和62、SEQ ID NO：60和63或SEQ IDNO：61和64的氨基酸序列。
在一些实施方案中，嵌合受体包含TNFR2跨膜结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQID NO：22的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体，以及CD28跨膜结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体。
在一些实施方案中，嵌合受体包含CD8跨膜结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQID NO：24的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体，以及CD28跨膜结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体。
在本发明的一些实施方案中，嵌合受体可以包含至少三个跨膜结构域的组合，所述至少三个跨膜结构域例如选自TNFR2的跨膜结构域、CD8的跨膜结构域和CD28的跨膜结构域。所述跨膜结构域可以是完整跨膜结构域或其片段或变体。在某些实施方案中，至少三个跨膜结构域或其片段或变体的组合包含至少15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个氨基酸。
在一些实施方案中，嵌合受体包含TNFR2跨膜结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQID NO：22的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体，CD8跨膜结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体，以及CD28跨膜结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体。
因此，在一些实施方案中，编码本发明的CAR的跨膜结构域的核酸序列包含TNFR2跨膜结构域(例如，包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体的核酸序列，和/或CD8跨膜结构域(例如，包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体的核酸序列，和/或CD28跨膜结构域(例如，包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体的核酸序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR的跨膜结构域包含TNFR2跨膜结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体，和/或CD8跨膜结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体，和/或CD28跨膜结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体；其中跨膜结构域中包含的序列在同一框架中并以单条多肽链表达。
在一些实施方案中，本发明的CAR的跨膜结构域包含至少两个不同的结构域(例如TNFR2结构域或其片段或变体)和至少一个其他跨膜结构域(例如CD8或CD28跨膜结构域或其片段或变体)，其可以以随机或特定的顺序彼此连接。
任选地，例如长度在2至10个氨基酸之间(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸)的短的寡肽接头或多肽接头可以形成不同跨膜结构域之间的连接。
在一些实施方案中，跨膜结构域可以是重组的。在某些实施方案中，重组跨膜结构域主要包含疏水性氨基酸，例如缬氨酸或亮氨酸。
IV.细胞内结构域
在一些实施方案中，本发明的CAR的细胞内结构域包含T细胞第一信号传导结构域(或衍生自其的序列)和任选T细胞共刺激分子的一个或多个细胞内结构域(或衍生自其的序列)。
在一些实施方案中，细胞内结构域可以包含其所衍生的分子的完整细胞内部分或完整天然细胞内信号传导结构域或其功能性片段或变体。
在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域由至少一个第一信号传导结构域(例如，T细胞第一信号传导结构域)或其片段或变体组成。
在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域由至少一个共刺激性信号传导结构域(例如，T细胞共刺激性分子细胞内结构域)或其片段或变体组成。
在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含T细胞共刺激分子的一个或多个细胞内结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域由T细胞共刺激分子的一个或多个细胞内结构域或其片段或变体组成。
在另一个实施方案中，本发明的CAR的细胞内信号传导结构域包含至少一个共刺激性结构域或其片段或变体，以及至少一个第一信号传导结构域或其片段或变体。
在另一个实施方案中，本发明的CAR的细胞内信号传导结构域由一个共刺激性结构域或其片段或变体以及一个第一信号传导结构域或其片段或变体组成。
在一些实施方案中，本发明的CAR的细胞内信号传导结构域包含至少一个、两个、三个或四个共刺激性结构域或其片段或变体，以及至少一个第一信号传导结构域或其片段或变体。在某些实施方案中，共刺激性结构域的一个或多个是T细胞共刺激分子的细胞内结构域。在某些实施方案中，至少一个第一信号传导结构域是T细胞第一信号传导结构域。
在本发明的一些实施方案中，第一信号传导结构域包含选自由以下组成的组的蛋白的信号传导结构域：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、常见(common)FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεRib)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10和DAP1以及衍生自其的序列。
在一些实施方案中，第一信号传导结构域是包含至少一个CD3ζ的功能性信号传导结构域或其片段或变体或由其组成的T细胞第一信号传导结构域。
在一些实施方案中，T细胞第一信号传导结构域包含SEQ ID NO：28、29、30或31的CD3ζ氨基酸序列或与SEQ ID NO：28、29、30或31具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。
在一些实施方案中，CD3ζ第一信号传导结构域包含与SEQ ID NO：28、29、30或31的氨基酸序列或与SEQ ID NO：28、29、30或31具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列相比，具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20个、10个或5个修饰的氨基酸序列，或由其组成。
因此，在一些实施方案中，编码T细胞第一信号传导结构域的核酸序列包含SEQ IDNO：32或SEQ ID NO：33的CD3ζ结构域核酸序列，或与SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列，或由其组成。
在一些实施方案中，CD3ζ第一信号传导结构域包含来自SEQ ID NO：28、29、30或31的序列，或来自与SEQ ID NO：28、29、30或31具有至少约70％同一性的序列的至少2个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个或112个氨基酸，例如，来自SEQ ID NO：28、29、30或31的至少2个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个或112个连续氨基酸。
在一些实施方案中，CD3ζ第一信号传导结构域由以下的核苷酸序列编码：来自SEQID NO：32或SEQ ID NO：33的序列或来自与SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的至少6个、30个、60个、90个、120个、150个、180个、210个、240个、270个、300个、330个或336个核苷酸，例如来自SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33的至少6个、30个、60个、90个、120个、150个、180个、210个、240个、270个、300个、330个或336个连续核苷酸。
在一些实施方案中，以刺激性方式起作用的T细胞第一信号传导结构域可以包含被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导基序。在本发明中有特定用途的含有ITAM的T细胞第一细胞内信号传导结构域的实例包括但不限于CD3ζ、常见FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD66b、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12的那些(或由其衍生)。
在一些实施方案中，T细胞第一信号传导结构域包含修饰的ITAM域，例如与天然ITAM结构域相比活性改变(例如增加或减少)的突变的ITAM结构域。在一些实施方案中，第一信号传导结构域包括含有修饰的ITAM的第一细胞内信号传导结构域，例如含有优化的和/或截短的ITAM的第一细胞内信号传导结构域。在某些实施方案中，第一信号传导结构域可以包含一个、两个、三个、四个或更多个ITAM基序。
在一些实施方案中，本发明的CAR的细胞内信号传导结构域包含与一个或多个共刺激性信号传导结构域组合的T细胞第一信号传导结构域(例如，CD3ζ信号传导结构域或其片段或变体)，其中所述共刺激性信号传导结构域是完整共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体。
T细胞共刺激分子的细胞内结构域的实例包括但不限于选自由以下组成的组的蛋白的信号传导结构域：TNFR2(CD120b/TNFRSF1B)、4-1BB(CD137)、ICOS(CD278)、CD27、CD28、CTLA-4(CD152)、PD-1、MHC I类分子、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD30、CD40、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体、CDS、ICAM-1、GITR、ARHR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160(BY55)、CD19、CD19a、CD4、CD8α、CD8β、IL2ra、IL6Ra、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、IL-13RA1/RA2、IL-33R(IL1RL1)、IL-10RA/RB、IL-4R、IL-5R(CSF2RB)、IL-21R、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a/CD18、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、CD95、TNFR1(CD120a/TNFRSF1A)、TGFbR1/2/3、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、常见(common)γ链、与CD83特异性结合的配体、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D及其任意组合。
在一些实施方案中，嵌合受体包含至少一个T细胞共刺激分子的细胞内结构域，所述T细胞共刺激分子选自由以下组成的组：TNFR2、4-1BB、ICOS、CD27、OX40、CD28、CTLA4和PD-1。
在一些实施方案中，嵌合受体包含至少一个共刺激性信号传导结构域，其中所述共刺激性信号传导结构域是完整共刺激性信号传导结构域或其片段或变体。
在一些实施方案中，T细胞共刺激性信号传导结构域包含以下或由其组成：TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列或由其组成)或与SEQ ID NO：34具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，共刺激性信号传导结构域包含与SEQ ID NO：34的氨基酸序列相比具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20个、10个或5个修饰的氨基酸序列，或由其组成。
在一些实施方案中，T细胞共刺激性信号传导结构域由以下编码：TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域(例如，包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列或由其组成)的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：35具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，TNFR2细胞内共刺激性信号传导结构域包含来自SEQ ID NO：34的序列或来自与SEQ ID NO：34具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的至少2个、6个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个或174个氨基酸，例如，来自SEQ ID NO：34的至少2个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个或174个连续氨基酸。
在一些实施方案中，TNFR2细胞内共刺激性信号传导结构域由以下的核苷酸序列编码：来自SEQ ID NO：35的序列或来自与SEQ ID NO：35具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的至少6个、18个、30个、60个、90个、120个、150个、180个、210个、240个、260个、270个、300个、330个、360个、390个、420个、450个、480个、510个或522个核苷酸，例如来自SEQ ID NO：35的至少6个、18个、30个、60个、90个、120个、150个、180个、210个、240个、260个、270个、300个、330个、360个、390个、420个、450个、480个、510个或522个连续核苷酸。
在一些实施方案中，细胞内共刺激性信号传导结构域包含TNFR2细胞内共刺激性信号传导结构域(例如，SEQ ID NO：34)的结构域I和II、结构域I-III、结构域I-IV或结构域I-V。在某些实施方案中，细胞内共刺激性信号传导结构域包含TNFR2细胞内共刺激性结构域的结构域I和II。
在一些实施方案中，细胞内共刺激性信号传导结构域包含SEQ ID NO：34的残基1-20(Δ151)、1-70(Δ104)、1-115(Δ59)或1-156(Δ18)。
在一些实施方案中，T细胞共刺激性信号传导结构域包含以下或由其组成：4-1BB共刺激性细胞内信号传导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列或由其组成)或与SEQ ID NO：36具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，T细胞共刺激性信号传导结构域包含与SEQ ID NO：36的氨基酸序列相比具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20个、10个或5个修饰的氨基酸序列，或由其组成。
在一些实施方案中，T细胞共刺激性信号传导结构域由以下编码：4-1BB共刺激性细胞内信号传导结构域核苷酸序列(例如，包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列或由其组成)，或与SEQ ID NO：37具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，4-1BB共刺激性细胞内信号传导结构域包含来自SEQ ID NO：36的序列或来自与SEQ ID NO：36具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的至少2个、3个、6个、9个、12个、15个、18个、21个、24个、27个、30个、33个、36个、39个或42个氨基酸，例如，来自SEQ ID NO：36的至少2个、3个、6个、9个、12个、15个、18个、21个、24个、27个、30个、33个、36个、39个或42个连续氨基酸。
在一些实施方案中，4-1BB共刺激性细胞内信号传导结构域由以下的核苷酸序列编码：来自SEQ ID NO：37的序列或来自与SEQ ID NO：37具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的至少6个、18个、27个、36个、45个、54个、63个、72个、81个、96个、99个、108个、117个或126个核苷酸，例如，来自SEQ ID NO：37的至少6个、18个、27个、36个、45个、54个、63个、72个、81个、96个、99个、108个、117个或126个连续核苷酸。
在一些实施方案中，T细胞共刺激性信号传导结构域包含以下或由其组成：CD27共刺激性细胞内信号传导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列或由其组成)或与SEQ ID NO：38具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，T细胞共刺激性信号传导结构域包含与SEQ ID NO：38的氨基酸序列相比具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20个、10个或5个修饰的氨基酸序列，或由其组成。
在一些实施方案中，T细胞共刺激性信号传导结构域由以下编码：CD27共刺激性细胞内信号传导结构域核苷酸序列(例如，包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列或由其组成)，或与SEQ ID NO：39具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，CD27共刺激性细胞内信号传导结构域包含来自SEQ ID NO：38的序列或来自与SEQ ID NO：38具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的至少2个、3个、6个、9个、12个、15个、18个、21个、24个、27个、30个、33个、36个、39个、42个、45个或48个氨基酸，例如，来自SEQ IDNO：38的至少2个、3个、6个、9个、12个、15个、18个、21个、24个、27个、30个、33个、36个、39个、42个、45个或48个连续氨基酸。
在一些实施方案中，CD27共刺激性细胞内信号传导结构域由以下的核苷酸序列编码：来自SEQ ID NO：39的序列或与SEQ ID NO：39具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的至少6个、18个、27个、36个、45个、54个、63个、72个、81个、96个、99个、108个、117个、126个、135个或144个核苷酸，例如，来自SEQ ID NO：39的至少6个、18个、27个、36个、45个、54个、63个、72个、81个、96个、99个、108个、117个、126个、135个或144个连续核苷酸。
在一些实施方案中，T细胞共刺激性信号传导结构域包含以下或由其组成：CD28共刺激性细胞内信号传导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列或由其组成)或与SEQ ID NO：40具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，T细胞共刺激性信号传导结构域包含与SEQ ID NO：40的氨基酸序列相比具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20个、10个或5个修饰的氨基酸序列，或由其组成。
在一些实施方案中，T细胞共刺激性信号传导结构域由以下编码：CD28共刺激性细胞内信号传导结构域核苷酸序列(例如，包含SEQ ID NO：41或由其组成)，或与SEQ ID NO：41具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，CD28共刺激性细胞内信号传导结构域包含来自SEQ ID NO：40的序列或来自与SEQ ID NO：40具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的至少2个、3个、6个、9个、12个、15个、18个、21个、24个、27个、30个、33个、36个、39个或41个氨基酸，例如，来自SEQ ID NO：40的至少2个、3个、6个、9个、12个、15个、18个、21个、24个、27个、30个、33个、36个、39个或41个连续氨基酸。
在一些实施方案中，CD28共刺激性细胞内信号传导结构域由以下的核苷酸序列编码：来自SEQ ID NO：41的序列或来自与SEQ ID NO：41具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的至少6个、18个、27个、36个、45个、54个、63个、72个、81个、96个、99个、108个、117个或123个核苷酸，例如，来自SEQ ID NO：41的至少6个、18个、27个、36个、45个、54个、63个、72个、81个、96个、99个、108个、117个或123个连续核苷酸。
在本发明的一些实施方案中，嵌合受体包含至少两个T细胞共刺激分子的细胞内结构域的组合。在某些实施方案中，至少两个细胞内结构域可以选自TNFR2的细胞内结构域、4-1BB的细胞内结构域、CD27的细胞内结构域和CD28的细胞内结构域。在具体的实施方案中，所述共刺激性细胞内信号传导结构域是完整共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体。
在一些实施方案中，嵌合受体包含TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体，以及4-1BB共刺激性细胞内信号传导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体。
在一些实施方案中，嵌合受体包含TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体，以及CD27共刺激性细胞内信号传导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体。
在一些实施方案中，嵌合受体包含TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体，以及CD28共刺激性细胞内信号传导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体。
在一些实施方案中，嵌合受体包含4-1BB共刺激性细胞内信号传导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体，以及CD27共刺激性细胞内信号传导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体。
在一些实施方案中，嵌合受体包含4-1BB共刺激性细胞内信号传导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体，以及CD28共刺激性细胞内信号传导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体。
在一些实施方案中，嵌合受体包含CD27共刺激性细胞内信号传导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体，以及CD28共刺激性细胞内信号传导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体。
在本发明的一些实施方案中，嵌合受体包含至少三个T细胞共刺激分子的细胞内结构域的组合，例如选自TNFR2的细胞内结构域、4-1BB的细胞内结构域、CD27的细胞内结构域和CD28的细胞内结构域。
在本发明的一些实施方案中，嵌合受体可包含至少三个共刺激性细胞内信号传导结构域，其中所述结构域是完整共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体。
在一些实施方案中，嵌合受体包含TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体，和4-1BB共刺激性细胞内信号传导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体，以及CD27共刺激性细胞内信号传导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体。
在一些实施方案中，嵌合受体包含TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体，和4-1BB共刺激性细胞内信号传导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体，以及CD28共刺激性细胞内信号传导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体。
在一些实施方案中，嵌合受体包含TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体，和CD27共刺激性细胞内信号传导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体，以及CD28共刺激性细胞内信号传导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体。
在一些实施方案中，嵌合受体包含4-1BB共刺激性细胞内信号传导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体，和CD27共刺激性细胞内信号传导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体，以及CD28共刺激性细胞内信号传导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体。
在本发明的一些实施方案中，嵌合受体包含至少四个T细胞共刺激分子的细胞内结构域的组合，例如选自TNFR2的细胞内结构域、4-1BB的细胞内结构域、CD27的细胞内结构域和CD28的细胞内结构域。
在本发明的一些实施方案中，嵌合受体可以包含至少四个T细胞共刺激分子的细胞内结构域的组合，其中所述共刺激性细胞内信号传导结构域是完整共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体。
在一些实施方案中，嵌合受体包含TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体，和4-1BB共刺激性细胞内信号传导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体，和CD27共刺激性细胞内信号传导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体，以及CD28共刺激性细胞内信号传导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体。
因此，在一些实施方案中，编码T细胞共刺激性信号传导结构域的核酸序列包含TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域(例如，包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体的核酸序列，和/或4-1BB共刺激性细胞内信号传导结构域(例如，包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体的核酸序列，和/或CD27共刺激性细胞内信号传导结构域(例如，包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体的核酸序列，和/或CD28共刺激性细胞内信号传导结构域(例如，包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体的核酸序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR的细胞内信号传导结构域包含：
-具有SEQ ID NO：34的氨基酸序列的TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体，和/或具有SEQ ID NO：36的氨基酸序列的4-1BB共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体，和/或具有SEQ ID NO：38的氨基酸序列的CD27共刺激性细胞内信号传导结构域，和/或具有SEQ ID NO：40的氨基酸序列的CD28共刺激性细胞内信号传导结构域；和/或
-具有SEQ ID NO：28、29、30或31的氨基酸序列的CD3ζ第一细胞内信号传导结构域或其片段或变体；
其中细胞内结构域中包含的序列在同一框架中并以单条多肽链表达。
因此，在一些实施方案中，编码本发明的CAR的细胞内信号传导结构域的核酸序列包含：
-SEQ ID NO：35的TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体的核酸序列，和/或SEQ ID NO：37的4-1BB共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体的核酸序列，和/或SEQ ID NO：39的CD27共刺激性细胞内信号传导结构域核酸序列或其片段或变体，和/或SEQ ID NO：41的CD28共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体的核酸序列；和/或
-SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33的CD3ζ第一细胞内信号传导结构域或其片段或变体。
在一些实施方案中，本发明的CAR的细胞内信号传导结构域包含以随机或特定的顺序彼此连接的至少两个不同的结构域(例如，第一信号传导结构域或其片段或变体，以及至少一个T细胞共刺激分子的细胞内结构域或其片段或变体)。
任选地，例如长度在2至10个氨基酸之间(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸)的短的寡肽接头或多肽接头可以形成不同信号传导结构域之间的连接。在一些实施方案中，将甘氨酸-丝氨酸双联体(GS)用作合适的接头。在一些实施方案中，将单个氨基酸例如丙氨酸(A)、甘氨酸(G)用作合适的接头。本文描述了接头的其他实例。
在一些实施方案中，本发明的CAR的细胞内信号传导结构域包含两个或更多个(例如2个、3个、4个、5个或更多个)共刺激性细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，两个或更多个(例如2个、3个、4个、5个或更多个)共刺激性信号传导结构域的任意或全部都由接头分子如本文所述的接头分子分隔开。
在一些实施方案中，本发明的嵌合受体的细胞内信号传导结构域包含CD3ζ的第一细胞内信号传导结构域(例如，SEQ ID NO：28、29、30或31)和TNFR2的共刺激性细胞内信号传导结构域(例如，SEQ ID NO：34)。
在一些实施方案中，本发明的嵌合受体的细胞内信号传导结构域包含CD3ζ的第一细胞内信号传导结构域(例如，SEQ ID NO：28、29、30或31)和4-1BB的共刺激性细胞内信号传导结构域(例如，SEQ ID NO：36)。
在一些实施方案中，本发明的嵌合受体的细胞内信号传导结构域包含CD3ζ的第一细胞内信号传导结构域(例如，SEQ ID NO：28、29、30或31)和CD27的共刺激性细胞内信号传导结构域(例如，SEQ ID NO：38)。
在一些实施方案中，本发明的嵌合受体的细胞内信号传导结构域包含CD3ζ的第一细胞内信号传导结构域(例如，SEQ ID NO：28、29、30或31)和CD28的共刺激性细胞内信号传导结构域(例如，SEQ ID NO：40)。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含以下的任意组合：如本文所述的细胞外结合结构域、如本文所述的跨膜结构域、如本文所述的细胞内信号传导结构域以及任选地如本文所述的间隔区或铰链结构域。
在一些实施方案中，本发明的CAR进一步包含位于自特定细胞外结合结构域N-末端的前导序列。非限制性实例是CD8的前导序列，其可以包含SEQ ID NO：42的序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的CAR进一步包含标签，例如用于质量控制、富集、体内追踪等的标签。所述标签可以位于N-末端、C-末端和/或内部。可以用于本发明的CAR中的标签的实例是技术人员公知的。例如但不限于，本发明中使用的标签可以是选自由以下组成的组的标签：链霉亲和素标签(SEQ ID NO：47)、血凝素标签、聚精氨酸标签、聚组氨酸标签、Myc标签、strep标签、S-标签、HAT标签、3x Flag标签、钙调蛋白结合肽标签、SBP标签、壳多糖结合结构域标签、GST标签、麦芽糖结合蛋白标签、荧光蛋白标签、T7标签、V5标签和Xpress标签。标签的其他实例包括但不限于NWSHPQFEK(SEQ ID NO：43)或SAWSHPQFEK(SEQID NO：44)。
在一些实施方案中，本发明的CAR进一步包含P2A(SEQ ID NO：45)和/或GFP(SEQID NO：46)序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含：
-至少一个细胞外结合结构域，
-任选细胞外铰链结构域，
-至少一个TNFR2跨膜结构域或其片段或变体，和
-至少一个细胞内第一信号传导结构域或其片段或变体。
-在一些实施方案中，本发明的CAR包含：
-至少一个细胞外结合结构域；
-至少一个TNFR2跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：22)或其片段或变体；和
-至少一个CD3ζ第一细胞内信号传导结构域(例如SEQ ID NO：28、29、30或31)或其片段或变体。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含：
-至少一个细胞外结合结构域；
-选自由以下组成的组的至少一个铰链结构域：CD8(例如SEQ ID NO：14)或其片段或变体，CD28(例如SEQ ID NO：20)或其片段或变体，IgG4(例如，SEQ ID NO：16)或其片段或变体，以及IgD(例如SEQ ID NO：18)或其片段或变体；
-至少一个TNFR2的跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：22)或其片段或变体；和
-至少一个CD3ζ第一细胞内信号传导结构域(例如SEQ ID NO：28、29、30或31)或其片段或变体。在具体的实施方案中，至少一个铰链结构域是CD8铰链结构域(例如，SEQ IDNO：14)。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含：
-至少一个细胞外结合结构域，
-任选至少一个细胞外铰链结构域，
-至少一个跨膜结构域或其片段或变体，和
-至少一个共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体，
其中跨膜结构域和共刺激性细胞内信号传导结构域中的至少一个是TNFR2跨膜或TNFR2共刺激性细胞内结构域或其片段或变体。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含：
-至少一个细胞外结合结构域；
-选自由以下组成的组的至少一个跨膜结构域：TNFR2跨膜结构域(例如，SEQ IDNO：22)或其片段或变体，CD8跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：24)或其片段或变体，以及CD28跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：26)或其片段或变体；和
-选自由以下组成的组的至少一个共刺激性细胞内信号传导结构域：TNFR2细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：34)或其片段或变体，4-1BB细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：36)或其片段或变体，CD27细胞内结构域(例如SEQ ID NO：38)或其片段或变体，以及CD28细胞内结构域(例如SEQ ID NO：40)或其片段或变体，
其中跨膜结构域和共刺激性细胞内信号传导结构域中的至少一个是TNFR2跨膜或TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含：
-至少一个细胞外结合结构域；
-选自由以下组成的组的至少一个铰链结构域：CD8(例如，SEQ ID NO：14)或其片段或变体，CD28(例如，SEQ ID NO：20)或其片段或变体，IgG4(例如，SEQ ID NO：16)或其片段或变体，以及IgD(例如，SEQ ID NO：18)或其片段或变体；
-选自由以下组成的组的至少一个跨膜结构域：TNFR2跨膜结构域(例如，SEQ IDNO：22)或其片段或变体，CD8跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：24)或其片段或变体，以及CD28跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：26)或其片段或变体；和
-选自由以下组成的组的至少一个共刺激性细胞内信号传导结构域：TNFR2细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：34)或其片段或变体，4-1BB细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：36)或其片段或变体，CD27细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：38)或其片段或变体，以及CD28细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：40)或其片段或变体，
其中跨膜结构域和共刺激性细胞内信号传导结构域中的至少一个是TNFR2跨膜或TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体。在具体的实施方案中，至少一个铰链结构域是CD8铰链结构域(例如，SEQ ID NO：14)。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含：
-至少一个细胞外结合结构域，
-任选至少一个细胞外铰链结构域，
-至少一个跨膜结构域或其片段或变体，
-至少一个细胞内共刺激性信号传导结构域或其片段或变体，和
-至少一个T细胞第一信号传导细胞内结构域或其片段或变体，
其中跨膜结构域和共刺激性细胞内信号传导结构域中的至少一个是TNFR2跨膜或TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含：
-至少一个细胞外结合结构域；
-选自由以下组成的组的至少一个跨膜结构域：TNFR2跨膜结构域(例如，SEQ IDNO：22)或其片段或变体，CD8跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：24)或其片段或变体，以及CD28跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：26)或其片段或变体；
-选自由以下组成的组的至少一个共刺激性细胞内信号传导结构域：TNFR2细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：34)或其片段或变体，4-1BB细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：36)或其片段或变体，CD27细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：38)或其片段或变体，以及CD28细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：40)或其片段或变体；和
-至少一个CD3ζ第一细胞内信号传导结构域(例如，SEQ ID NO：28、29、30或31)或其片段或变体；
其中跨膜结构域和共刺激性细胞内信号传导结构域中的至少一个是TNFR2跨膜或TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含：
-至少一个细胞外结合结构域；
-选自由以下组成的组的至少一个铰链结构域：CD8(例如，SEQ ID NO：14)或其片段或变体，CD28(例如，SEQ ID NO：20)或其片段或变体，IgG4(例如，SEQ ID NO：16)或其片段或变体，以及IgD(例如，SEQ ID NO：18)或其片段或变体；
-选自由以下组成的组的至少一个跨膜结构域：TNFR2(例如，SEQ ID NO：22)或其片段或变体，CD8跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：24)或其片段或变体，以及CD28跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：26)或其片段或变体；
-选自由以下组成的组的至少一个共刺激性细胞内信号传导结构域：TNFR2细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：34)或其片段或变体，4-1BB细胞内结构域(例如，SEQ ID NO 36)或其片段或变体，CD27细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：38)或其片段或变体，以及CD28细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：40)或其片段或变体；和
-至少一个CD3ζ第一细胞内信号传导结构域(例如SEQ ID NO：28、29、30或31)或其片段或变体；
其中跨膜结构域和共刺激性细胞内信号传导结构域中的至少一个是TNFR2跨膜或TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体。在具体的实施方案中，至少一个铰链结构域是CD8铰链结构域(例如，SEQ ID NO：14)。
根据一些实施方案，本发明的CAR包含：
-至少一个细胞外结合结构域，
-任选至少一个细胞外铰链结构域，
-至少一个跨膜结构域或其片段或变体，
-至少两个细胞内共刺激性信号传导结构域或其片段或变体，和
-任选至少一个T细胞第一信号传导结构域或其片段或变体，其中跨膜结构域和/或共刺激性细胞内信号传导结构域中的至少一个是TNFR2跨膜或TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含：
-至少一个细胞外结合结构域；
-选自由以下组成的组的至少一个跨膜结构域：TNFR2(例如，SEQ ID NO：22)或其片段或变体，CD8跨膜结构域(例如SEQ ID NO：24)或其片段或变体，以及CD28跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：26)或其片段或变体；
-选自由以下组成的组的至少两个共刺激性细胞内信号传导结构域：TNFR2细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：34)或其片段或变体，4-1BB细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：36)或其片段或变体，CD27细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：38)或其片段或变体，以及CD28细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：40)或其片段或变体；和
-任选至少一个CD3ζ第一细胞内信号传导结构域(例如，SEQ ID NO：28、29、30或31)或其片段或变体；
其中跨膜结构域和/或共刺激性细胞内信号传导结构域中的至少一个是TNFR2跨膜或TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含：
-至少一个细胞外结合结构域；
-选自由以下组成的组的至少一个铰链结构域：CD8(例如，SEQ ID NO：14)或其片段或变体，CD28(例如，SEQ ID NO：20)或其片段或变体，IgG4(例如，SEQ ID NO：16)或其片段或变体，以及IgD(例如，SEQ ID NO：18)或其片段或变体；
-选自由以下组成的组的至少一个跨膜结构域：TNFR2(例如，SEQ ID NO：22)或其片段或变体，CD8跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：24)或其片段或变体，以及CD28跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：26)或其片段或变体；
-选自由以下组成的组的至少两个共刺激性细胞内信号传导结构域：TNFR2细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：34)或其片段或变体，4-1BB细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：36)或其片段或变体，CD27细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：38)或其片段或变体，以及CD28细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：40)或其片段或变体；和
-任选至少一个CD3ζ第一细胞内信号传导结构域(例如，SEQ ID NO：28、29、30或31)或其片段或变体；
其中跨膜结构域和/或共刺激性细胞内信号传导结构域中的至少一个是TNFR2跨膜或TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体。在具体的实施方案中，至少一个铰链结构域是CD8铰链结构域(例如，SEQ ID NO：14)。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含：
-至少一个细胞外结合结构域，
-任选至少一个细胞外铰链结构域，
-至少一个跨膜结构域或其片段或变体，
-至少三个共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体，和
-任选至少一个T细胞第一细胞内信号传导结构域或其片段或变体，
其中跨膜结构域和/或共刺激性细胞内信号传导结构域中的至少一个是TNFR2跨膜或TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含：
-至少一个细胞外结合结构域；
-选自由以下组成的组的至少一个跨膜结构域：TNFR2(例如，SEQ ID NO：22)或其片段或变体，CD8跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：24)或其片段或变体，以及CD28跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：26)或其片段或变体；
-选自由以下组成的组的至少三个共刺激性细胞内信号传导结构域：TNFR2细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：34)或其片段或变体，4-1BB细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：36)或其片段或变体，CD27细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：38)或其片段或变体，以及CD28细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：40)或其片段或变体；和
-任选至少一个CD3ζ第一细胞内信号传导结构域(例如，SEQ ID NO：28、29、30或31)或其片段或变体；
其中跨膜结构域和/或共刺激性细胞内信号传导结构域中的至少一个是TNFR2跨膜或共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含：
-至少一个细胞外结合结构域；
-选自由以下组成的组的至少一个铰链结构域：CD8(例如，SEQ ID NO：14)或其片段或变体，CD28(例如，SEQ ID NO：20)或其片段或变体，IgG4(例如，SEQ ID NO：16)或其片段或变体，以及IgD(例如，SEQ ID NO：18)或其片段或变体；
-选自由以下组成的组的至少一个跨膜结构域：TNFR2(例如，SEQ ID NO：22)或其片段或变体，CD8跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：24)或其片段或变体，以及CD28跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：26)或其片段或变体；
-选自由以下组成的组的至少三个共刺激性细胞内信号传导结构域：TNFR2细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：34)或其片段或变体，4-1BB细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：36)或其片段或变体，CD27细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：38)或其片段或变体，以及CD28细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：40)或其片段或变体；和
-任选至少一个CD3ζ第一细胞内信号传导结构域(例如，SEQ ID NO：28、29、30或31)或其片段或变体；
其中跨膜结构域和/或共刺激性细胞内信号传导结构域中的至少一个是TNFR2跨膜或共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体。在具体的实施方案中，至少一个铰链结构域是CD8铰链结构域(例如，SEQ ID NO：14)。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含：
-至少一个细胞外结合结构域，
-任选至少一个细胞外铰链结构域，
-至少一个跨膜结构域或其片段或变体，
-至少四个共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体，和
-任选至少一个T细胞第一细胞内信号传导结构域或其片段或变体，
其中跨膜结构域和/或共刺激性细胞内信号传导结构域中的至少一个是TNFR2跨膜或TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含：
-至少一个细胞外结合结构域；
-选自由以下组成的组的至少一个跨膜结构域：TNFR2(例如，SEQ ID NO：22)或其片段或变体，CD8跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：24)或其片段或变体，以及CD28跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：26)或其片段或变体；
-选自由以下组成的组的至少四个共刺激性细胞内信号传导结构域：TNFR2细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：34)或其片段或变体，4-1BB细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：36)或其片段或变体，CD27细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：38)或其片段或变体，以及CD28细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：40)或其片段或变体；和
-任选至少一个CD3ζ第一细胞内信号传导结构域(例如，SEQ ID NO：28、29、30或31)或其片段或变体；
其中跨膜结构域和/或共刺激性细胞内信号传导结构域中的至少一个是TNFR2跨膜或共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含：
-至少一个细胞外结合结构域；
-选自由以下组成的组的至少一个铰链结构域：CD8(例如，SEQ ID NO：14)或其片段或变体，CD28(例如，SEQ ID NO：20)或其片段或变体，IgG4(SEQ ID NO：16)或其片段或变体，以及IgD(例如，SEQ ID NO：18)或其片段或变体；
-选自由以下组成的组的至少一个跨膜结构域：TNFR2跨膜结构域(例如，SEQ IDNO：22)或其片段或变体，CD8跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：24)或其片段或变体，以及CD28跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：26)或其片段或变体；
-选自由以下组成的组的至少四个共刺激性细胞内信号传导结构域：TNFR2细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：34)或其片段或变体，4-1BB细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：36)或其片段或变体，CD27细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：38)或其片段或变体，以及CD28细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：40)或其片段或变体；和
-任选至少一个CD3ζ第一细胞内信号传导结构域(例如，SEQ ID NO：28、29、30或31)或其片段或变体；
其中跨膜结构域和/或共刺激性细胞内信号传导结构域中的至少一个是TNFR2跨膜或TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体。在具体的实施方案中，至少一个铰链结构域是CD8铰链结构域(例如，SEQ ID NO：14)。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含：
-至少一个细胞外结合结构域，
-任选至少一个细胞外铰链结构域，
-至少1个、2个或3个跨膜结构域或其片段或变体，和
-任选至少一个T细胞第一细胞内信号传导结构域或其片段或变体，
其中跨膜结构域的至少一个是TNFR2跨膜结构域或其片段或变体。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含：
-至少一个细胞外结合结构域；
-选自由以下组成的组的至少1个、2个或3个跨膜结构域：TNFR2跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：22)或其片段或变体，CD8跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：24)或其片段或变体，以及CD28跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：26)或其片段或变体；和
-任选至少一个CD3ζ第一信号传导域(例如SEQ ID NO：28、29、30或31)或其片段或变体；
其中跨膜结构域的至少一个是TNFR2跨膜结构域或其片段或变体。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含：
-至少一个细胞外结合结构域；
-选自由以下组成的组的至少一个铰链结构域：CD8(例如，SEQ ID NO：14)或其片段或变体，CD28(例如，SEQ ID NO：20)或其片段或变体，IgG4(例如，SEQ ID NO：16)或其片段或变体，以及IgD(例如，SEQ ID NO：18)或其片段或变体；
-选自由以下组成的组的至少1个、2个或3个跨膜结构域：TNFR2(例如，SEQ ID NO：22)或其片段或变体，CD8跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：24)或其片段或变体，以及CD28跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：26)或其片段或变体；和
-任选至少一个CD3ζ第一细胞内信号传导结构域(例如，SEQ ID NO：28、29、30或31)或其片段或变体；
其中跨膜结构域的至少一个是TNFR2跨膜结构域或其片段或变体。在具体的实施方案中，至少一个铰链结构域是CD8铰链结构域(例如，SEQ ID NO：14)。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含：
--至少一个细胞外结合结构域，
-任选至少一个细胞外铰链结构域，
-至少1个、2个或3个跨膜结构域或其片段或变体，
-至少1个、2个、3个或4个细胞内共刺激性信号传导结构域或其片段或变体，和
-任选至少一个T细胞第一信号传导结构域或其片段或变体，
其中跨膜结构域和/或共刺激性细胞内信号传导结构域中的至少一个是TNFR2跨膜或TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含：
-至少一个细胞外结合结构域；
-选自由以下组成的组的至少1个、2个或3个跨膜结构域：TNFR2跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：22)或其片段或变体，CD8跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：24)或其片段或变体，以及CD28跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：26)或其片段或变体；
-选自由以下组成的组的至少1个、2个、3个或4个共刺激性细胞内信号传导结构域：TNFR2细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：34)或其片段或变体，4-1BB细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：36)或其片段或变体，CD27细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：38)或其片段或变体，以及CD28细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：40)或其片段或变体；和
-任选至少一个CD3ζ第一信号传导结构域(例如，SEQ ID NO：28、29、30或31)或其片段或变体；
其中跨膜结构域和/或共刺激性细胞内信号传导结构域中的至少一个是TNFR2跨膜或TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含：
-至少一个细胞外结合结构域；
-选自由以下组成的组的至少一个铰链结构域：CD8(例如，SEQ ID NO：14)或其片段或变体，CD28(例如，SEQ ID NO：20)或其片段或变体，IgG4(例如，SEQ ID NO：16)或其片段或变体，以及IgD(例如，SEQ ID NO：18)或其片段或变体；
-选自由以下组成的组的至少1个、2个或3个跨膜结构域：TNFR2跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：22)或其片段或变体，CD8跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：24)或其片段或变体，或CD28跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：26)或其片段或变体；
-选自由以下组成的组的至少1个、2个、3个或4个共刺激性细胞内信号传导结构域：TNFR2细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：34)或其片段或变体，4-1BB细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：36)或其片段或变体，CD27细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：38)或其片段或变体，以及CD28细胞内结构域(例如，SEQ ID NO：40)或其片段或变体；和
-任选至少一个CD3ζ第一信号传导结构域(例如SEQ ID NO：28、29、30或31)或其片段或变体；
其中跨膜结构域和/或共刺激性细胞内信号传导结构域中的至少一个是TNFR2跨膜或TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体。在具体的实施方案中，至少一个铰链结构域是CD8铰链结构域(例如，SEQ ID NO：14)。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含：
-至少一个细胞外结合结构域，
-任选至少一个细胞外铰链结构域，
-至少一个跨膜结构域，
-至少一个细胞内结构域，其中至少一个细胞内结构域包含至少一个第一细胞内信号传导结构域和任选至少一个共刺激性细胞内信号传导结构域，
且其中至少一个跨膜结构域是人TNFR2跨膜结构域或其片段或变体或任意跨膜结构域或其片段或变体或其组合，和/或至少一个共刺激性细胞内信号传导结构域是人TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体或任意共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体或其组合，且其中跨膜结构域和共刺激性细胞内信号传导结构域中的至少一个是TNFR2跨膜结构域或其片段或变体或TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含含有以下的序列：人CD8的铰链区、人TNFR2的跨膜结构域、人TNFR2的共刺激性细胞内信号传导结构域和人CD3ζ链的第一细胞内信号传导结构域，其中所述序列对应于SEQ ID NO：48的氨基酸序列或与SEQ ID NO：48具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含抗HLA-A2 scFv(例如，包含SEQ ID NO：68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106或107的结合结构域序列或由其组成)，其连接至SEQ ID NO：48的氨基酸序列或与SEQ ID NO：48具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含抗IL-23R scFv(例如，包含SEQ ID NO：65、66或67的结合结构域序列或由其组成)，其连接至SEQ ID NO：48的氨基酸序列或与SEQ IDNO：48具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含抗CD19 scFv(例如，包含SEQ ID NO：1或2的结合结构域序列或由其组成)，其连接至SEQ ID NO：48的氨基酸序列或与SEQ ID NO：48具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含抗CD20 scFv(例如，包含SEQ ID NO：4、5或6的结合结构域序列或由其组成)，其连接至SEQ ID NO：48的氨基酸序列或与SEQ ID NO：48具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列或氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含含有以下的序列：人CD8的铰链区、人TNFR2的跨膜结构域、人TNFR2的共刺激性细胞内信号传导结构域和人CD3ζ链的第一细胞内信号传导结构域，其中所述序列对应于SEQ ID NO：49、50、51或110的氨基酸序列或与SEQ IDNO：49、50、51或110具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含抗HLA-A2 scFv(例如，包含SEQ ID NO：68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106或107的结合结构域序列或由其组成)，其连接至SEQ ID NO：49、50、51或110的氨基酸序列或与SEQ ID NO：49、50、51或110具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含抗IL-23R scFv(例如，包含SEQ ID NO：65、66或67的结合结构域序列或由其组成)，其连接至SEQ ID NO：49、50、51或110的氨基酸序列或与SEQ ID NO：49、50、51或110具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含抗CD19 scFv(例如，包含SEQ ID NO：1或2的结合结构域序列或由其组成)，其连接至SEQ ID NO：49、50、51或110的氨基酸序列或与SEQID NO：49、50、51或110具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含抗CD20 scFv(例如，包含SEQ ID NO：4、5或6的结合结构域序列或由其组成)，其连接至SEQ ID NO：49、50、51或110的氨基酸序列或与SEQ ID NO：49、50、51或110具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含含有以下的序列：人CD8的铰链区、人TNFR2的跨膜结构域和人CD3ζ链的第一细胞内信号传导结构域，其中所述序列对应于SEQ ID NO：52的氨基酸序列或与SEQ ID NO：52具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含抗HLA-A2 scFv(例如，包含SEQ ID NO：68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106或107的结合结构域序列或由其组成)，其连接至SEQ ID NO：52的氨基酸序列或与SEQ ID NO：52具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含抗IL-23R scFv(例如，包含SEQ ID NO：65、66或67的结合结构域序列或由其组成)，其连接至SEQ ID NO：52的氨基酸序列或与SEQ IDNO：52具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含抗CD19 scFv(例如，包含SEQ ID NO：1或2的结合结构域序列或由其组成)，其连接至SEQ ID NO：52的氨基酸序列或与SEQ ID NO：52具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含抗CD20 scFv(例如，包含SEQ ID NO：4、5或6的结合结构域序列或由其组成)，其连接至SEQ ID NO：52的氨基酸序列或与SEQ ID NO：52具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含含有以下的序列：人CD8的铰链区、人CD8的跨膜结构域、人CD3ζ链的第一细胞内信号传导结构域和人TNFR2的共刺激性细胞内信号传导结构域，其中所述序列对应于SEQ ID NO：53的氨基酸序列或与SEQ ID NO：53具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含抗HLA-A2 scFv(例如，包含SEQ ID NO：68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106或107的结合结构域序列或由其组成)，其连接至SEQ ID NO：53的氨基酸序列或与SEQ ID NO：53具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含抗IL-23R scFv(例如，包含SEQ ID NO：65、66或67的结合结构域序列或由其组成)，其连接至SEQ ID NO：53的氨基酸序列或与SEQ IDNO：53具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含抗CD19 scFv(例如，包含SEQ ID NO：1或2的结合结构域序列或由其组成)，其连接至SEQ ID NO：53的氨基酸序列或与SEQ ID NO：53具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含抗CD20 scFv(例如，包含SEQ ID NO：4、5或6的结合结构域序列或由其组成)，其连接至SEQ ID NO：53的氨基酸序列或与SEQ ID NO：53具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含含有以下的序列：人CD8的铰链区、人CD8的跨膜结构域、人TNFR2的共刺激性细胞内信号传导结构域和人CD3ζ链的第一细胞内信号传导结构域，其中所述序列对应于SEQ ID NO：54的氨基酸序列或与SEQ ID NO：54具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含抗HLA-A2 scFv(例如，包含SEQ ID NO：68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106或107的结合结构域序列或由其组成)，其连接至SEQ ID NO：54的氨基酸序列或与SEQ ID NO：54具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含抗IL-23R scFv(例如，包含SEQ ID NO：65、66或67的结合结构域序列或由其组成)，其连接至SEQ ID NO：54的氨基酸序列或与SEQ IDNO：54具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含抗CD19 scFv(例如，包含SEQ ID NO：1或2的结合结构域序列或由其组成)，其连接至SEQ ID NO：54的氨基酸序列或与SEQ ID NO：54具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含抗CD20 scFv(例如，包含SEQ ID NO：4、5或6的结合结构域序列或由其组成)，其连接至SEQ ID NO：54的氨基酸序列或与SEQ ID NO：54具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含含有以下的序列：人CD8的铰链区、人CD8跨膜结构域和人TNFR2跨膜结构域的组合、人TNFR2的共刺激性细胞内信号传导结构域和人CD3ζ链的第一细胞内信号传导结构域，其中所述序列对应于SEQ ID NO：55、56或57的氨基酸序列或与SEQ ID NO：55、56或57具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含抗HLA-A2 scFv(例如，包含SEQ ID NO：68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106或107的结合结构域序列或由其组成)，其连接至SEQ ID NO：55、56或57的氨基酸序列或与SEQ ID NO：55、56或57具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含抗IL-23R scFv(例如，包含SEQ ID NO：65、66或67的结合结构域序列或由其组成)，其连接至SEQ ID NO：55、56或57的氨基酸序列或与SEQ ID NO：55、56或57具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含抗CD19 scFv(例如，包含SEQ ID NO：1或2的结合结构域序列或由其组成)，其连接至SEQ ID NO：55、56或57的氨基酸序列或与SEQ IDNO：55、56或57具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含抗CD20 scFv(例如，包含SEQ ID NO：4、5或6的结合结构域序列或由其组成)，其连接至SEQ ID NO：55、56或57的氨基酸序列或与SEQ IDNO：55、56或57具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，本发明的CAR(例如，本文所述的包含TNFR2跨膜结构域或其片段或变体和/或包含TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体的细胞内结构域的任意CAR)具有至少一个以下性质：
a)显示与除了跨膜结构域是CD8跨膜结构域并且共刺激性细胞内信号传导结构域是4-1BB共刺激性细胞内信号传导结构域之外具有相同序列的CAR相比，在细胞表面上的表达较少；
b)显示与除了跨膜结构域是CD8跨膜结构域并且共刺激性细胞内信号传导结构域是4-1BB共刺激性细胞内信号传导结构域之外具有相同序列的CAR相比，CAR特异性激活的水平相当；
c)在至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或更多天的培养后，调节性T细胞标志物例如FoxP3、Helios和CD62L中的任意一个或多个(例如全部)的细胞表面水平不降低；和
d)在至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或更多天的培养后，非调节性T细胞标志物例如CD127的细胞表面水平不增加。
免疫细胞
本发明进一步涉及表达本文所述的CAR的免疫细胞，以及这样的免疫细胞的群体。
在一些实施方案中，将编码本发明的CAR的核酸引入免疫细胞中，从而产生在细胞表面表达CAR的工程化细胞。
如本文所用，术语“免疫细胞”通常包括源自骨髓中产生的造血干细胞(HSC)的白细胞(白血球)。免疫细胞的实例包括但不限于淋巴细胞(T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞)和髓系来源的细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞)。
在一些实施方案中，本发明的免疫细胞经遗传修饰以表达包含TNFR2跨膜结构域或其片段或变体和/或TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体的嵌合受体。
在一些实施方案中，本发明的免疫细胞是哺乳动物免疫细胞，例如人免疫细胞，来自家畜(例如牛、猪或马)的免疫细胞或来自宠物(例如猫或狗)的免疫细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞选自由以下组成的组：淋巴细胞、髓系来源的细胞及其任意组合。在某些实施方案中，免疫细胞是淋巴细胞，例如选自由以下组成的组：T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞及其任意组合。在具体的实施方案中，免疫细胞是T细胞，其在某些实施方案中选自由以下组成的组：CD4+T细胞、CD8+T细胞、γδT细胞、双阴性(DN)T细胞及其任意组合。在某些实施方案中，免疫细胞是CD4+T细胞，例如T辅助细胞、调节性T细胞、效应T细胞及其任意组合。在一些实施方案中，免疫细胞是CD8+T细胞，例如细胞毒性CD8+T细胞或CD8+调节性T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是γδT细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是经工程化以表达指定的γδTCR(TEGγδ)细胞的T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是DNT细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是B细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是NK细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞是髓系来源的细胞，例如选自由以下组成的组：嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或其任意组合。在某些实施方案中，免疫细胞是巨噬细胞。在某些实施方案中，免疫细胞是树突细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞是调节性免疫细胞，例如适合用于细胞疗法中的任何调节性免疫细胞。在某些实施方案中，调节性免疫细胞选自由以下组成的组：调节性T细胞、CD4+调节性T细胞、CD8+调节性T细胞、调节性γδT细胞、调节性DN T细胞、调节性B细胞、调节性NK细胞、调节性巨噬细胞、调节性树突细胞及其任意组合。
在一些实施方案中，调节性免疫细胞是调节性T细胞(Treg)，尤其是胸腺来源的Treg或适应性或诱导性Treg。在某些实施方案中，免疫细胞是CD4+调节性T细胞(Treg)。在某些实施方案中，Treg是胸腺来源的Treg或适应性或诱导性Treg。在某些实施方案中，Treg是CD4+FoxP3+调节性T细胞或CD4+FoxP3-调节性T细胞(Tr1细胞)。在具体的实施方案中，免疫细胞是CD4+FoxP3+调节性T细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞是CD8+调节性T细胞。CD8+调节性T细胞的实例包括但不限于CD8+CD28-调节性T细胞、CD8+CD103+调节性T细胞、CD8+FoxP3+调节性T细胞、CD8+CD122+调节性T细胞及其任意组合。
在一些实施方案中，调节性免疫细胞是调节性γδT细胞。
在一些实施方案中，调节性免疫细胞是调节性DN T细胞。
在一些实施方案中，调节性免疫细胞是调节性B细胞。调节性B细胞的实例包括但不限于CD19+CD24hiCD38hi B细胞。
在一些实施方案中，调节性免疫细胞是调节性NK细胞。
在一些实施方案中，调节性免疫细胞是调节性巨噬细胞。
在一些实施方案中，调节性免疫细胞是调节性树突细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞是效应免疫细胞，例如适合用于细胞疗法的任何效应免疫细胞。在某些实施方案中，效应免疫细胞选自由以下组成的组：效应T细胞、CD4+效应T细胞、CD8+效应T细胞、效应γδT细胞、效应DN T细胞、效应B细胞、效应NK细胞、效应巨噬细胞、效应树突细胞及其任意组合。
在一些实施方案中，免疫细胞是效应T细胞。在某些实施方案中，效应免疫细胞是CD4+效应T细胞。CD4+效应T细胞的实例包括但不限于Th1细胞、Th2细胞、Th9细胞、Th17细胞、Th22细胞、CD4+滤泡辅助T(Tfh)细胞及其任意组合。在一些实施方案中，效应免疫细胞是CD8+效应T细胞。CD8+效应T细胞的实例包括但不限于CD8+CD45RO+CCR7-CD62L-效应T细胞、CD8+CD45RA+CCR7-CD62L-效应T细胞及其任意组合。
在一个实施方案中，免疫细胞是效应γδT细胞。
在一个实施方案中，免疫细胞是效应DN T细胞。
在一个实施方案中，免疫细胞是效应B细胞。效应B细胞的实例包括但不限于CD19+CD25hi B细胞、活化B细胞和浆细胞及其任意组合。
在一些实施方案中，免疫细胞是效应NK细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞是效应巨噬细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞是效应树突细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞选自由以下组成的组：T细胞、自然杀伤(NK)细胞、γδT细胞、双阴性(DN)细胞、调节性免疫细胞、调节性T细胞、效应免疫细胞、效应T细胞、B细胞和髓系来源的细胞，及其任意组合。
在一些实施方案中，将编码本发明的CAR的核酸引入多潜能干细胞(PSC)中，其随后可分化为T细胞。PSC是能够在体内产生任何细胞类型的细胞，包括例如胚胎干细胞(ESC)、源自体细胞核转移的PSC以及诱导的PSC(iPSC)。如本文所用，术语“胚胎干细胞”是指获自早期胚胎的多潜能干细胞；在一些实施方案中，这个术语是指获自先前建立的胚胎干细胞系的ESC，并且不包括通过当下破坏人类胚胎而获得的干细胞。
在一些实施方案中，将编码本发明的CAR的核酸引入多能细胞(multipotentcell)，例如造血干细胞(HSC，例如分离自骨髓或脐带血的那些)、造血祖细胞(例如淋巴祖细胞(lymphoid progenitor cell))或间充质干细胞(MSC)。多能细胞能够发育成多于一种细胞类型，但与多潜能细胞相比细胞类型的潜力更受限制。多能细胞可以衍生自已建立的细胞系或分离自人骨髓或脐带。举例来说，HSC可以在G-CSF诱导的动员、普乐沙福(plerixafor)诱导的动员或其组合后分离自患者或健康供体。为了从血液或骨髓中分离HSC，可以通过与不想要的细胞结合的抗体，例如针对CD4和CD8(T细胞)、CD45(B细胞)、GR-1(粒细胞)和Iad(分化的抗原呈递细胞)的抗体，来淘选(pan)血液或骨髓中的细胞。然后可以通过针对CD34的抗体正选择(positively select)HSC。
在一些实施方案中，将编码本发明的CAR的核酸引入非Treg淋巴系细胞(non-Treglymphoid cell)中，其在基因组编辑后分化成Treg细胞。如上所述，可以使编辑的非Treg细胞在植入患者体内之前分化成Treg细胞。或者，可以诱导编辑的非Treg细胞在植入患者体内之后分化成Treg细胞。
在一些实施方案中，分子的表达水平通过流式细胞术、免疫荧光或图像分析，例如高含量分析来确定。在某些实施方案中，分子的表达水平通过流式细胞术确定。在具体的实施方案中，在进行流式细胞术分析之前，将细胞固定并透化，从而允许检测细胞内蛋白。
在一些实施方案中，确定细胞群体中分子的表达水平包括确定细胞群体中表达该分子的细胞(即，对该分子为“+”的细胞)的百分比。在某些实施方案中，通过FACS测量表达该分子的所述细胞的百分比。
术语“表达”、“阳性”或“+”和“不表达”、“阴性”或“-”是本领域公知的，并且是指感兴趣的细胞标志物的表达水平，其中对应于“+”的细胞标志物的表达水平为高或中等的(也称为“+/-”)，对应于“-”的细胞标志物的表达水平为无效的(null)。
术语“低”或“lo”或“lo/-”是本领域公知的，并且是指感兴趣的细胞标志物的表达水平，其中细胞标志物的表达水平与作为整体分析的细胞群体中此细胞标志物的表达水平相比是低的。更具体地，术语“lo”是指以比一个或多个其他特定的细胞群体更低的水平表达细胞标志物的特定的细胞群体。
术语“高”或“hi”或“亮(bright)”是本领域中公知的，并且是指感兴趣的细胞标志物的表达水平，其中细胞标志物的表达水平与作为整体分析的细胞群体中此细胞标志物的表达水平相比是高的。
通常，将染色强度前2％、3％、4％或5％的细胞称为“hi”，且将处于群体前一半的那些细胞归为“+”。将低于荧光强度的50％的那些细胞称为“lo”细胞，且将低于5％的称为“-”细胞。
通过将用对这个标志物特异的荧光标记的抗体染色的细胞群体中的细胞的中值荧光强度(Median Fluorescence Intensity)或平均荧光强度(Mean FluorescenceIntensity，MFI)与用具有无关特异性但具有相同的同种型、相同的荧光探针并且来源于相同物种(称为同种型对照)的荧光标记的抗体染色的相同细胞群体中的细胞的荧光强度(fluorescence intensity，FI)进行比较，来确定感兴趣的细胞标志物的表达水平。认为来自用对这个标志物特异的荧光标记的抗体染色的群体并显示出与用同种型对照染色的细胞相比等同的MFI或更低的MFI的细胞不表达这个标志物，并称其为(-)或阴性。认为来自用对这个标志物特异的荧光标记的抗体染色的群体并显示出与用同种型对照染色的细胞相比更优的MFI值的细胞表达这个标志物，并称其为(+)或阳性。
本发明还涉及如本文所定义的分离的和/或基本上纯化的免疫细胞群体。
因此，本发明提供了分离的和/或基本上纯化的免疫细胞群体，其中群体中的细胞包含本文所述的CAR，例如包含TNFR2跨膜结构域或其片段或变体和/或TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体的CAR。
如本文所用，“分离的群体”是指从其天然环境(例如外周血)中移出并进行分离、纯化或分隔的细胞群体，并且至少约75％地不含(free)、80％地不含、85％地不含且在某些实施方案中约90％、95％、96％、97％、98％、99％地不含其天然一起存在但缺少细胞表面标志物(基于此标志物进行分离)的其他细胞。
本发明进一步涉及如本文所定义的富集的免疫细胞群体。
在一些实施方案中，已将本发明的分离的、纯化的和/或富集的免疫细胞群体冷冻并解冻。
在一些实施方案中，本发明的免疫细胞群体的T细胞表达如本文所述的嵌合受体(CAR)，并且因此可以被定义为CAR-单特异性的(即，所有Treg细胞用它们表达的CAR识别相同的抗原)。在一些实施方案中，Treg细胞群体是TCR-单特异性的(即，所有Treg细胞用它们的TCR识别相同的抗原)。在一些实施方案中，Treg细胞群体是TCR-多特异性的(即，Treg细胞可以用它们的TCR识别不同的抗原)。
在一些实施方案中，T细胞群体是TCR-单特异性的，并且TCR识别抗原、抗原的片段、抗原的变体或其混合物。
在一些实施方案中，T细胞群体是TCR-单特异性的，并且TCR对来自普通人类饮食的食物抗原特异。
在一些实施方案中，T细胞群体是TCR-单特异性的，并且TCR对以下特异：自身抗原，例如多发性硬化相关抗原、关节相关抗原、眼相关抗原、人HSP抗原、皮肤相关抗原或参与移植排斥或GVHD的抗原。本文中给出了这样的自身抗原的实例。
在一些实施方案中，T细胞群体是TCR-单特异性的，并且TCR对吸入性过敏原、摄入性过敏原或接触性过敏原特异。
在一些实施方案中，T细胞群体是TCR-单特异性的，并且TCR对选自由以下组成的组的抗原特异：卵白蛋白、MOG、II型胶原蛋白、瓜氨酸化波形蛋白、瓜氨酸化II型胶原蛋白、瓜氨酸化纤维蛋白原及其片段、变体和混合物。
在一些实施方案中，T细胞群体是TCR-单特异性的，并且TCR对卵白蛋白或其片段、变体或混合物特异。
在一些实施方案中，T细胞群体是TCR-单特异性的，并且TCR对MOG或其片段、变体或混合物特异。
在一些实施方案中，T细胞群体是TCR-单特异性的，并且TCR对II型胶原蛋白或其片段、变体或混合物特异。
在一些实施方案中，T细胞群体是TCR-单特异性的，并且TCR对瓜氨酸化波形蛋白、瓜氨酸化II型胶原蛋白、瓜氨酸化纤维蛋白原或其片段、变体或混合物特异。
在一些实施方案中，T细胞群体是TCR-单特异性的，并且TCR对HLA-A2或其片段、变体或混合物特异(例如，如本文所述)。
在一些实施方案中，T细胞群体是TCR-单特异性的，并且TCR对IL-23R或其片段、变体或混合物特异(例如，如本文所述)。
在一些实施方案中，T细胞群体是TCR-单特异性的，并且TCR对B细胞表面标志物例如CD19或CD20或其片段、变体或混合物特异(例如，如本文所述)。
在一些实施方案中，T细胞群体是TCR-单特异性的，并且TCR对癌抗原或其片段、变体或混合物特异，如本文所述。
在一些实施方案中，T细胞群体是TCR-单特异性的，并且TCR识别感染的细胞。在一些实施方案中，T细胞群体是TCR-单特异性的，并且TCR对细菌抗原或其片段、变体或混合物特异。在一些实施方案中，T细胞群体是TCR-单特异性的，并且TCR对病毒抗原或其片段、变体或混合物特异。在一些实施方案中，T细胞群体是TCR-单特异性的，并且TCR对真菌抗原或其片段、变体或混合物特异。在一些实施方案中，T细胞群体是TCR-单特异性的，并且TCR对寄生虫抗原或其片段、变体或混合物特异。
在一些实施方案中，本发明的表达CAR的免疫细胞对由CAR识别的细胞具有阻抑性。在某些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在具体的实施方案中，免疫细胞是Treg细胞。在一些实施方案中，通过幼稚T细胞的体外分化来获得Treg细胞。
在一些实施方案中，本发明的免疫细胞不是细胞毒性的。在某些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在具体的实施方案中，免疫细胞是Treg细胞。
在一些实施方案中，本发明的调节性免疫细胞可以选自由以下组成的组：CD4+CD25+FoxP3+Treg、Tr1细胞、分泌TGF-β的Th3细胞、调节性NK T细胞、调节性γδT细胞、调节性CD8+T细胞和双阴性调节性T细胞。
在一些实施方案中，本发明的免疫细胞是细胞毒性的。在某些实施方案中，免疫细胞对表达癌抗原或其片段或变体的细胞具有细胞毒性，如本文所述。在具体的实施方案中，本发明的免疫细胞对癌细胞具有细胞毒性。在具体的实施方案中，本发明的免疫细胞对感染的细胞具有细胞毒性。
在一些实施方案中，本发明的免疫细胞是细胞毒性免疫细胞。细胞毒性免疫细胞包括例如细胞毒性T细胞、CD8+T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性B细胞、巨噬细胞和单核细胞。一旦被激活，这些细胞毒性免疫细胞中的每个都会引发靶细胞的破坏。例如，细胞毒性免疫细胞通过以下任一种或两种方式引发靶癌细胞的破坏。第一，一旦被激活，免疫细胞会释放细胞毒素，例如穿孔素(perforin)、颗粒酶(granzyme)和颗粒溶素(granulysin)。穿孔素和颗粒溶素在靶细胞中产生孔洞，颗粒酶进入细胞并引起细胞质中诱导细胞凋亡(程序性细胞死亡)的半胱天冬酶级联反应。第二，可以通过免疫细胞和靶肿瘤细胞之间的FAS-FAS配体相互作用来诱导凋亡。
在一些实施方案中，细胞毒性免疫细胞是自体细胞。
在一些实施方案中，细胞毒性免疫细胞是异源细胞。
在一些实施方案中，细胞毒性免疫细胞是同种异体的细胞。
在一些实施方案中，本发明的免疫细胞对以下具有细胞毒性：proB细胞、preB细胞、未成熟(或过渡性)B细胞、成熟的幼稚B细胞、活化B细胞、记忆B细胞、浆细胞、淋巴母细胞(lymphoblast)、边缘区B细胞、生发中心B细胞、浆母细胞和/或调节性B细胞(Breg细胞)。
在一些实施方案中，本发明的免疫细胞对Breg细胞没有细胞毒性。
在一些实施方案中，本发明的单特异性Treg细胞群体对在其表面表达和呈递免疫球蛋白的B细胞具有细胞毒性。在其表面表达和呈递免疫球蛋白的B细胞的实例包括但不限于preB细胞、未成熟(或过渡性)B细胞、成熟的幼稚B细胞、活化B细胞、记忆B细胞、边缘区B细胞、生发中心B细胞和调节性B细胞(Breg细胞)。
在一些实施方案中，本发明的单特异性Treg细胞群体对成熟B细胞例如成熟的活化B细胞具有细胞毒性。在某些实施方案中，本发明的单特异性Treg细胞群体对在其表面表达由单特异性Treg细胞群体的细胞表达的嵌合受体识别的B细胞表面标志物的成熟B细胞(例如，成熟的活化B细胞)具有细胞毒性。
在一些实施方案中，本发明的单特异性Treg细胞群体对选自以下的至少一种细胞类型具有细胞毒性：proB细胞、preB细胞、未成熟(或过渡性)B细胞、成熟的幼稚B细胞、活化B细胞、记忆B细胞、浆细胞、淋巴母细胞、边缘区B细胞、生发中心B细胞、浆母细胞和调节性B细胞(Breg细胞)。在具体的实施方案中，单特异性Treg细胞群体对选自以下的至少一种细胞类型具有细胞毒性：preB细胞、未成熟(或过渡性)B细胞、成熟的幼稚B细胞、活化B细胞、记忆B细胞、边缘区B细胞、生发中心B细胞和调节性B细胞(Breg细胞)。
在一些实施方案中，本发明的单特异性Treg细胞群体对选自以下的至少一种细胞类型具有细胞毒性：proB细胞、preB细胞、未成熟(或过渡性)B细胞、成熟的幼稚B细胞、活化B细胞、记忆B细胞、浆细胞、淋巴母细胞、边缘区B细胞、生发中心B细胞和浆母细胞。在具体的实施方案中，单特异性Treg细胞群体对选自以下的至少一种细胞类型具有细胞毒性：preB细胞、未成熟(或过渡性)B细胞、成熟的幼稚B细胞、活化B细胞、记忆B细胞、边缘区B细胞和生发中心B细胞。
在一些实施方案中，本发明的免疫细胞群体在其细胞表面表达本发明的CAR(本文中称为“第一受体(first receptor)”)和与另一不同配体结合的另一受体(本文中称为“第二受体(second receptor)”)。在某些实施方案中，第二受体包含细胞外配体结合结构域，任选铰链结构域，至少一个跨膜结构域和至少一个细胞内信号传导结构域，例如，如本文所述。
在一些实施方案中，第二受体是内源的(例如，内源TCR)。在一些实施方案中，第二受体是外源的，并且其表达通过编码其的核酸的转化或转导在本发明的免疫细胞群体中被诱导。所述外源受体可以是外源TCR或CAR。因此，在一些实施方案中，本发明的免疫细胞群体表达两个CAR，其中第一个和第二个各自识别不同的配体。在一些实施方案中，本发明的免疫细胞群体表达两个CAR，其中第一个识别抗原上的第一表位，第二个识别相同抗原上的另一不同表位。在一些实施方案中，本发明的免疫细胞群体表达两个CAR，其中第一个识别一个抗原，且第二个识别不同的第二抗原(例如，抗原变体)。
在一些实施方案中，本发明的CAR和第二受体(例如，第二CAR(second CAR))中的至少一个是可诱导的，即，其在细胞表面上的表达可以被诱导。
在一些实施方案中，通过激活另一受体来诱导本发明的CAR和第二受体(例如，第二CAR)中的至少一个的表达。在某些实施方案中，通过激活第二受体来诱导本发明的CAR的表达。在某些实施方案中，通过激活本发明的CAR来诱导第二受体的表达。诱导性CAR在本领域已有描述，例如Roybal et al(Cell 167(2):419-432(2016))。
在一些实施方案中，第二受体(例如，第二CAR)对抗原、抗原的片段、抗原的变体或其混合物特异。
在一些实施方案中，第二受体(例如，第二CAR)对来自普通人类饮食的食物抗原特异。
在一些实施方案中，第二受体(例如，第二CAR)对以下特异：自身抗原(例如，本文所述的自身抗原)，例如多发性硬化相关抗原、关节相关抗原、眼相关抗原、人HSP抗原、皮肤相关抗原或参与移植排斥或GVHD的抗原。在某些实施方案中，抗原是皮肤相关抗原。在某些实施方案中，抗原是参与移植排斥或GVHD的抗原。
在一些实施方案中，第二受体(例如，第二CAR)对吸入性过敏原、摄入性过敏原或接触性过敏原特异。
在一些实施方案中，第二受体(例如，第二CAR)对选自由以下组成的组的抗原特异：卵白蛋白、MOG、II型胶原片段、瓜氨酸化波形蛋白、瓜氨酸化II型胶原蛋白、瓜氨酸化纤维蛋白原及其片段、变体和混合物。
在一些实施方案中，第二受体(例如，第二CAR)对卵白蛋白或其片段、变体或混合物特异。
在一些实施方案中，第二受体(例如，第二CAR)对MOG或其片段、变体或混合物特异。
在一些实施方案中，第二受体(例如，第二CAR)对II型胶原蛋白或其片段、变体或混合物特异。
在一些实施方案中，第二受体(例如，第二CAR)对瓜氨酸化波形蛋白、瓜氨酸化II型胶原蛋白、瓜氨酸化纤维蛋白原或其片段、变体或混合物特异。
在一些实施方案中，第二受体(例如，第二CAR)对HLA-A2或其片段、变体或混合物特异。
在一些实施方案中，第二受体(例如，第二CAR)对IL-23R或其片段、变体或混合物特异。
在一些实施方案中，第二受体(例如，第二CAR)对B细胞表面标志物例如CD19或CD20，或其片段、变体或混合物特异。
在一些实施方案中，第二受体(例如，第二CAR)对癌抗原或其片段、变体或混合物特异，如本文所述。
在一些实施方案中，第二受体(例如，第二CAR)识别感染的细胞。在一些实施方案中，第二受体(例如，第二CAR)对细菌抗原或其片段、变体或混合物特异。在一些实施方案中，第二受体(例如，第二CAR)对病毒抗原或其片段、变体或混合物特异。在一些实施方案中，第二受体(例如，第二CAR)对真菌抗原或其片段、变体或混合物特异。
在一些实施方案中，第二受体的细胞外结合结构域是蛋白或其片段或变体，例如自身抗原或其片段或变体。
在一些实施方案中，第二受体(例如，第二CAR)对自身抗体，例如在B细胞上表达的自身抗体或其片段、变体或混合物特异。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含第一细胞内信号传导结构域，第二受体包含不同的第二细胞内信号传导结构域。在某些实施方案中，本发明的CAR包含T细胞第一信号传导结构域(例如，CD3ζ)，第二受体包含共刺激性信号传导结构域(例如，TNFR2或CD8的共刺激性结构域，或TNFR2和CD8的组合共刺激性信号传导结构域)。在某些实施方案中，本发明的CAR包含共刺激性细胞内信号传导结构域(例如，TNFR2、4-1BB、CD27或CD28的共刺激性细胞内信号传导结构域，或TNFR2和4-1BB的组合共刺激性细胞内信号传导结构域)，第二受体包含T细胞第一细胞内信号传导结构域(例如，CD3ζ)。根据这些实施方案，完全激活本发明的免疫细胞群体既需要本发明的CAR与它所针对的配体结合，又需要第二受体与它所针对的配体结合。
在一些实施方案中，由第二受体识别的配体在患病组织或器官或自身免疫应答的部位表达或存在。因此，当所述配体存在并由免疫细胞(例如Treg)群体的细胞上的第二受体识别时，表达本发明的第一CAR(first CAR)的配体的细胞的阻抑活性将仅在患病组织或器官或自身免疫应答的部位被诱导。
在一些实施方案中，第二嵌合受体进一步包含细胞外配体结合结构域，其识别的配体与由本发明的第一嵌合受体识别的配体不同。在一些实施方案中，所述配体结合结构域是抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，第二嵌合受体进一步包含细胞外配体结合结构域，其识别的表位与由第一嵌合受体识别的同一抗原的表位不同。
在一些实施方案中，本发明的嵌合受体包含细胞外配体结合结构域，其包含与第一配体(first ligand)结合的第一配体结合结构域和与不同于所述第一配体的第二配体(second ligand)结合的第二配体结合结构域。在一些实施方案中，所述配体结合结构域是识别第一和第二配体两者的双功能抗体。在一些实施方案中，所述配体结合结构域是识别相同抗原的两个不同表位的双功能抗体。
核酸、载体和CAR的制备
本发明还涉及编码如本文所述的CAR的核酸序列，其中所述核酸序列包含：
-细胞外结合结构域的至少一个核酸序列，
-任选地，细胞外铰链结构域的至少一个核酸序列，跨膜结构域的至少一个核酸序列，
-细胞内结构域的至少一个核酸序列，其中细胞内结构域的至少一个核酸序列包含第一细胞内信号传导结构域的至少一个核酸序列和任选地共刺激性细胞内信号传导结构域的至少一个核酸序列，
其中跨膜结构域的核酸序列是人TNFR2跨膜结构域或其片段或变体的核酸序列，或任何跨膜结构域或其片段或变体的核酸序列，或其组合，和/或共刺激性细胞内信号传导结构域的核酸序列是人TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体的核酸序列，或任何共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体的核酸序列，或其组合，其中跨膜结构域的核酸序列是TNFR2跨膜结构域或其片段或变体的核酸序列，和/或共刺激性细胞内信号传导结构域的核酸序列是TNFR2共刺激性细胞内信号转导结构域或其片段或变体。
本发明还提供了包含如本文所述的编码CAR的核酸序列的载体。可用于本发明的载体的实例包括但不限于DNA载体、RNA载体、质粒、噬菌粒(phagemid)、噬菌体衍生物、病毒和粘粒。
病毒载体技术是本领域公知的，并描述于例如Sambrook et al.(2001,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)以及其他病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。
通常，合适的载体含有在至少一种生物中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性核酸内切酶位点和一个或多个可选择的标志物，(参见，例如，PCT专利公开WO 01/96584和WO01/29058，以及美国专利US6,326,193，其通过引用并入本文)。
已经开发了许多基于病毒的系统，用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技术将选定的基因插入载体并包装在逆转录病毒颗粒中。然后，可以分离重组病毒并将其体内或离体递送至受试者的细胞。本领域已知许多逆转录病毒系统。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。而且，本领域已知许多腺病毒载体。在一些实施方案中，使用慢病毒载体。
其他的转录活性元件，例如启动子和增强子，调控转录起始的频率。通常，核心启动子位于起始位点上游的30-110bp区域，尽管最近已显示许多启动子也含有起始位点下游的功能性元件，且增强子元件通常位于起始站点上游的500-2000bp。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，因此当元件相对于彼此反转或移动时，启动子功能得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可在活性开始下降之前增加到50bp。根据启动子，单独元件可以协同或独立地起作用以激活转录。
合适的启动子的一个实例是即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。这个启动子序列是能够驱动任何与其有效连接的多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个实例是延伸生长因子-la(EF-la)。合适的启动子的另一个实例是磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。然而，也可以使用其他的组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒即早期启动子和劳斯肉瘤病毒启动子，以及人基因启动子，例如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被认为是本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在需要这样的表达时开启与之有效连接的多核苷酸序列的表达，或在不需要表达时关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白(metallothionine)启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。另外，允许两个或更多个基因的有效和协调表达的双向启动子也可以是本发明感兴趣的。双向启动子的实例包括但不限于由Luigi Naldini在美国专利公开2006/200869(通过引用并入本文)中描述的启动子，该专利公开了包含以下的双向启动子：i)衍生自巨细胞病毒(CMV)或小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)基因组的第一最小启动子序列和ii)衍生自动物基因的完整有效启动子序列。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，待引入T细胞的表达载体还可以含有可选择的标志物基因，例如CD34、CD271或报告基因或两者，以促进对从通过病毒载体转染或感染的细胞群体中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标志物可以在单独的DNA片段上携带并用于共转染程序。可选择的标志物和报告基因侧翼都可以具有合适的调控序列，以使其能够在宿主细胞中表达。有用的可选择的标志物包括例如抗生素抗性基因，例如新霉素(neomycin)等。
在本发明的一些实施方案中，可以使用自杀基因技术。本领域中描述了根据其作用机理而不同的自杀基因技术(参见例如Jones et al.,Frontiers in Pharmacology 5:254(2014))。将无毒药物转换为有毒药物的基因定向酶前药疗法(GDEPT)的实例包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)和胞嘧啶脱氨酶(CD)。其他实例是含有与细胞凋亡组分如诱导型Fas(iFas)或诱导型半胱天冬酶9(iCasp9)系统连接的药物结合结构域的嵌合蛋白。其他实例包括由治疗性抗体介导的系统，例如通过施用抗c-myc抗体诱导c-myc在工程化细胞表面过表达以诱导其缺失。EGFR的使用被描述为与c-myc系统相比类似的系统。
报告基因用于鉴定潜在转染的细胞和评估调控序列的功能性。通常，报告基因是在受体生物体或组织中不存在或不表达，并编码通过一些易于检测的性质例如酶活性来显示其表达的多肽的基因。在将DNA引入受体细胞后的合适时间，测定报告基因的表达。合适的报告基因可以包括编码以下的基因：荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因(参见例如Ui-Tei et al.,FEBS Letters 479:79-82(2000))。合适的表达系统是公知的，并且可以使用已知技术制备或从商业上获得。通常，将具有最小5’侧翼区并显示最高的报告基因表达水平的构建体确定为启动子。这样的启动子区域可以与报告基因连接，并用于评估试剂调节启动子驱动的转录的能力。
将基因引入细胞并在细胞中表达的方法是本领域已知的。对表达载体而言，可以通过本领域中任何方法将载体容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞中。例如，可以通过物理、化学或生物学手段将表达载体转移到宿主细胞中。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂转染、粒子轰击、微注射、电穿孔等。产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域公知的。参见，例如，Sambrook et al.(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。在本发明的一些实施方案中，使用磷酸钙转染法将多核苷酸引入宿主细胞中。
用于将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，且尤其是逆转录病毒载体，已成为用于将基因插入哺乳动物例如人细胞的最广泛使用的方法。其他病毒载体可以衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见例如美国专利5,350,674和5,585,362。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，例如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠子和基于脂质的系统，其包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送载体的示例性胶体系统是脂质体(例如人造膜囊泡)。“脂质体”是涵盖通过产生封闭的脂质双层或聚集体而形成的各种单层和多层脂质载体的上位术语。脂质体的特征可以是具有磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构。多层脂质体具有被水性介质分隔开的多个脂质层。它们在当磷脂悬浮在过量的水溶液中时自发形成。脂质组分在形成闭合结构之前经历了自我重排，并且在脂质双层之间纳入水和溶解的溶质(Ghosh etal.,Glycobiology 5:505-10(1991))。然而，也涵盖了在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可以采取胶束结构或仅以脂质分子的不均匀聚集体存在。还涵盖了脂质转染胺(lipofectamine)-核酸复合物。
考虑使用脂质制剂将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。在另一个方面，核酸可以与脂质结合。可以将与脂质结合的核酸封装在脂质体的水性内部中、散布在脂质体的脂质双层中、经由与脂质体和寡核苷酸两者结合的连接分子结合在脂质体上、纳入脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质组合、作为悬浮液包含在脂质中、包含在胶束中或与胶束复合，或与脂质结合。与脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构存在，作为胶束或具有“塌陷”(“collapsed”)结构。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均的聚集体。脂质是可天然存在的脂肪物质(fatty substance)或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴，以及包含长链脂肪族烃及其衍生物(例如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛)的一类化合物。
可以从商业来源获得适于使用的脂质。例如，二肉豆蔻磷脂酰胆碱(dimyristylphosphatidylcholine，“DMPC”)可以从Sigma，St.Louis，MO获得；磷酸鲸蜡酯(dicetylphosphate，“DCP”)可以从K&K Laboratories(Plainview，NY)获得；胆固醇(“Choi”)可以从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻磷脂酰甘油(dimyristyl phophatidylglycerol，“DMPG”)和其他脂质可以从Avanti Polar Lipids，Inc.(Birmingham，AL)获得。氯仿或氯仿/甲醇中的脂质储备溶液可储存在约-20℃下。氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。
不论使用何种方法将外源核酸引入宿主细胞，为了确认宿主细胞中重组DNA序列的存在，可以进行多种测定。这样的测定包括例如本领域技术人员公知的“分子生物学”测定，例如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；“生化”测定，例如通过免疫学方法(ELISA和Western印迹)或通过本文所述的测定法来检测特定肽的存在或不存在，以鉴定落入本发明范围内的试剂。
在一些实施方案中，通过引入RNA来修饰本发明的免疫细胞。在一些实施方案中，可以将体外转录的RNA CAR以瞬时转染的形式引入细胞中。使用聚合酶链反应(PCR)生成的模板通过体外转录产生RNA。可以使用合适的引物和RNA聚合酶，通过PCR将任何来源的感兴趣的DNA直接转化成模板。DNA的来源可以是例如基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其他合适的DNA来源。在某些实施方案中，体外转录的模板是本发明的CAR。
在一些实施方案中，用于PCR的DNA含有开放阅读框。DNA可以例如来自生物体基因组中天然存在的DNA序列。在一些实施方案中，DNA是全长的感兴趣的基因或基因的一部分。基因可以包括5’和/或3’非翻译区(UTR)的一些或全部。基因可以包括外显子和内含子。在一些实施方案中，用于PCR的DNA是人基因。在一些实施方案中，用于PCR的DNA是包括5’和3’UTR的人基因。或者，DNA可以是通常不在自然存在的生物中表达的人工DNA序列。示例性人工DNA序列是含有连接在一起以形成编码融合蛋白的开放阅读框的多个基因部分的序列。连接在一起的多个DNA部分可以来自单个生物或多个生物。
PCR可用于产生模板，用于mRNA的体外转录，以用于转染。实施PCR的方法是本领域公知的。将用于PCR的引物设计为具有与要用作PCR模板的DNA的区域基本上互补的区域。如本文所用，“基本上互补”是指其中引物序列中的大部分或全部的碱基是互补的，或一个或多个碱基是不互补的或错配的核苷酸序列。基本上互补的序列能够在用于PCR的退火条件下与预期的DNA靶标退火或杂交。可以将引物设计为与DNA模板的任何部分基本上互补。例如，可以将引物设计为扩增在细胞中被正常转录的(开放阅读框)可包括5’和3’UTR的基因部分。也可以将引物设计为扩增编码特定的感兴趣结构域的基因部分。在一些实施方案中，将引物设计为扩增包括5’和3’UTR的全部或部分的人cDNA的编码区。通过本领域公知的合成方法生成用于PCR的引物。
“正向引物”是含有与待扩增DNA序列上游的DNA模板上的核苷酸基本上互补的核苷酸区域的引物。本文所用的“上游”是指相对于编码链要扩增的DNA序列的5’位置。“反向引物”是含有与待扩增DNA序列下游的双链DNA模板基本上互补的核苷酸区域的引物。本文所用的“下游”是指相对于编码链要扩增的DNA序列的3’位置。
任何可用于PCR的DNA聚合酶均可用于本文所公开的方法。试剂和聚合酶可从多种来源商购获得。
还可以使用具有促进稳定性和/或翻译效率的能力的化学结构。在一些实施方案中，RNA可以具有5’和3’UTR。在一些实施方案中，5’UTR的长度为0至3000个核苷酸。可以通过不同的方法改变要添加至编码区的5’和3’UTR序列的长度，包括但不限于设计用于退火至UTR的不同区域的PCR的引物。通过使用这种方法，本领域普通技术人员可以修饰在所转录RNA的转染后达到最佳翻译效率所需的5’和3’UTR长度。5’和3’UTR可以是感兴趣的基因的天然存在的内源5’和3’UTR。或者，可以通过将UTR序列引入正向和反向引物中或通过对模板进行任何其他修饰来添加对感兴趣的基因而言非内源的UTR序列。对感兴趣的基因而言非内源的UTR序列的使用可用于修饰RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3’UTR序列中富含AU的元件能降低mRNA的稳定性。因此，可以基于本领域公知的UTR性质来选择或设计3’UTR，以增加转录RNA的稳定性。
在一些实施方案中，5’UTR可以包含内源基因的Kozak序列。或者，当如上所述通过PCR添加对感兴趣的基因而言非内源的5’UTR时，可以通过添加5’UTR序列来重新设计共有Kozak序列。Kozak序列可以提高一些RNA转录物的翻译效率，但似乎并非是所有RNA进行有效翻译所需的。本领域已知许多mRNA对Kozak序列的需求。在其他实施方案中，5’UTR可以衍生自其RNA基因组在细胞中稳定的RNA病毒。在其他实施方案中，各种核苷酸模拟物可以用于3’或5’UTR中，以阻止mRNA的核酸外切酶降解。
为了能够无需基因克隆即可从DNA模板中合成RNA，应将转录启动子连接到待转录序列上游的DNA模板上。当将作为RNA聚合酶启动子的序列添加到正向引物的5’末端时，RNA聚合酶启动子被整合到待转录的开放阅读框上游的PCR产物中。在一些实施方案中，启动子是T7聚合酶启动子，如本文别处所述。其他有用的启动子包括但不限于T3和SP6 RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列是本领域已知的。
在一些实施方案中，mRNA在5’末端和3’poly(A)尾处均具有决定细胞中核糖体结合、翻译起始和mRNA稳定性的帽。在环状DNA模板如质粒DNA上，RNA聚合酶产生不适合在真核细胞中表达的长连环产物。在3’UTR末端线性化的质粒DNA的转录产生正常大小的mRNA，其即使在转录后被聚腺苷酸化，也不在真核转染中起作用。
在线性DNA模板上，噬菌体T7 RNA聚合酶可以将转录物的3’末端延伸至模板的最后一个碱基之外(Schenborn and Mierendorf,Nuc Acids Res.,13:6223-36(1985)；Nacheva and Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270:1485-65(2003)。
将polyA/T延伸段整合到DNA模板中的传统方法是分子克隆。然而，整合到质粒DNA中的polyA/T序列可以导致质粒的不稳定，这就是从细菌细胞获得的质粒DNA模板经常高度污染有缺失和其他畸变的原因。这使得克隆程序不仅费时费力，而且常常不可靠。因此，迫切需要一种无需克隆即可允许构建具有polyA/T 3’延伸段的DNA模板的方法。
转录DNA模板的polyA/T片段可以通过以下产生：在PCR期间通过使用含有polyT尾如100T尾(大小可以是50-5000T)的反向引物，或在PCR后通过任何其他方法，包括但不限于DNA连接或体外重组。poly(A)尾还为RNA提供稳定性并减少其降解。通常，poly(A)尾的长度与所转录RNA的稳定性呈正相关。在一些实施方案中，poly(A)尾为100至5000个腺苷。
在体外转录后，可以使用poly(A)聚合酶如大肠杆菌polyA聚合酶(E-PAP)进一步延长RNA的poly(A)尾。在一些实施方案中，将poly(A)尾的长度从100个核苷酸增加到300至400个核苷酸之间会导致RNA的翻译效率提高约两倍。另外，将不同的化学基团连接到3’末端能提高mRNA的稳定性。这样的连接可以包含修饰的/人工的核苷酸、适体和其他化合物。例如，可以使用poly(A)聚合酶将ATP模拟物引入poly(A)尾中。ATP模拟物可以进一步提高RNA的稳定性。
RNA上的5’帽也为RNA分子提供了稳定性。在一些实施方案中，通过本文所公开的方法产生的RNA包括5’帽。使用本领域已知的和本文所述的技术提供5’帽(Cougot et al.,Trends in Biochem.Sci.29:436-444(2001)；Stepinski et al.,RNA 7:1468-95(2001)；Elango,et al.,Biochim.Biophys.Res.Commun.330:958-966(2005))。
通过本文所公开的方法产生的RNA还可以包含内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列可以是启动不依赖帽的核糖体与mRNA的结合并促进翻译开始的任何病毒的、染色体的或人工设计的序列。可以包括任何适用于细胞电穿孔的溶质，其可以含有促进细胞渗透性和存活力的因子，例如糖、肽、脂质、蛋白、抗氧化剂和表面活性剂。
可以使用多种不同方法中的任何一种将RNA引入靶细胞，例如可商购获得的方法，其包括但不限于电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems，Cologne，德国)、ECM830(BTX)(Harvard Instruments，Boston，Mass.)、Gene Pulser II(BioRad，Denver，Colo.)或Multiporator(Eppendort，Hamburg德国))、使用脂转染的阳离子脂质体介导的转染、聚合物封装(polymer encapsulation)、肽介导的转染或例如“基因枪”的生物弹道颗粒递送系统(参见，例如Nishikawa et al.Hum Gene Ther.12(8):861-70(2001))。
在一些实施方案中，使用逆转录病毒或慢病毒载体将本文所述的CAR序列递送到本发明的免疫细胞中。可以使用所转导的细胞作为载体或使用封装的、结合的或裸露的载体的无细胞局部或全身递送，将表达CAR的逆转录病毒和慢病毒载体递送到不同类型的真核细胞以及组织和整个生物体中。所使用的方法可以用于需要稳定表达或稳定表达足以的任何目的。
在一些实施方案中，使用体外转录的mRNA将CAR序列递送到本发明的免疫细胞中。可以使用所转染的细胞作为载体或使用封装的、结合的或裸露的mRNA的无细胞局部或全身递送，将体外转录的mRNA CAR递送到不同类型的真核细胞以及组织和整个生物体中。所使用的方法可以用于需要瞬时表达或瞬时表达足以的任何目的。
在一些实施方案中，可以通过转座子的方式在细胞中表达所需CAR。
在一些实施方案中，本发明的免疫细胞是例如T细胞。在如本文所述扩增和遗传修饰T细胞(例如Treg细胞)前，从受试者获得细胞。T细胞可以获得自多种来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本发明的某些实施方案中，可以使用本领域可获得的任何数量的T细胞系。在本发明的某些实施方案中，可以通过使用本领域技术人员已知的许多技术，例如FicollTM分离、在红细胞裂解和单核细胞清除后通过PERCOLLTM梯度离心、逆流离心淘析(counterflowcentrifugal elutriation)、白细胞单采术(leukapheresis)以及随后的基于细胞表面标志物的磁性或流式细胞仪分离，从自受试者收集的血单位(unit of blood)中获得T细胞。在一些实施方案中，通过单采术(apheresis)获得来自个体循环血液的细胞。单采术产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一些实施方案中，通过白细胞单采术获得来自个体循环血液的细胞。
在一些实施方案中，可以洗涤通过白细胞单采术收集的细胞以移除血浆部分，并将细胞置于合适的缓冲液或培养基中用于随后的处理步骤。在本发明的一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施方案中，洗涤溶液缺少钙，并且可以缺少镁，或者可以缺少许多(如果不是全部的话)二价阳离子。洗涤后，可将细胞重悬于多种生物相容的缓冲液的任一种中，例如，不含Ca2+、不含Mg2+的PBS，PlyamaLyte A，或具有或不具有缓冲剂的其他盐水溶液。或者，可以移除白细胞单采术样品中不想要的组分，并将细胞直接重悬于培养基中。
可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离T细胞的特定亚群。例如，在一些实施方案中，通过与抗CD3/抗CD28(即3x28)-偶联的珠子如
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M-450CD3/CD28T一起孵育足以进行目标T细胞的阳性选择的一段时间，来分离T细胞。在一些实施方案中，时间是约30分钟。在另一个实施方案中，时间的范围是30分钟至36小时或更长，以及其间的所有整数值。在另一个实施方案中，时间是至少1、2、3、4、5或6小时。在一些实施方案中，时间是10至24小时。在某些实施方案中，孵育的时间是24小时。在T细胞与其他细胞类型相比很少的任何情况下，可以使用更长的孵育时间来分离T细胞。因此，通过简单地缩短或延长允许T细胞结合抗CD3/抗CD28珠子的时间，和/或通过增加或降低珠子对T细胞的比例(如本文进一步所述)，可以在培养启动时或在过程中其他时间点优先选择或反选T细胞的亚群。此外，通过增加或降低珠子或其他表面上抗CD3和/或抗CD28抗体的比例，可以在培养启动时或在其他所需时间点优先选择或反选T细胞的亚群。技术人员将认识到，在本发明中也可以使用多轮选择。
在一些实施方案中，可能期望在激活和扩增过程中进行选择程序和使用“未选择”的细胞。也可以将“未选择”的细胞进行进一步的多轮选择。可以用针对阴性选择的细胞特有的表面标志物的抗体组合，通过阴性选择富集T细胞群。一种方法是通过阴性磁性免疫粘附或流式细胞术，使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物，进行的细胞分选和/或选择。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施方案中，通过抗CD25-偶联的珠子或其他类似的选择方法，清除调节性T细胞。
为了通过阳性或阴性选择分离目标细胞群体，可以改变细胞的浓度和表面(例如颗粒如珠子)。在某些实施方案中，可能期望显著减小珠子和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠子的最大接触。例如，在一些实施方案中，使用20亿个细胞/mL的浓度。在一些实施方案中，使用10亿个细胞/mL的浓度。在另一个实施方案中，使用大于1亿个细胞/mL。在另一个实施方案中，使用1000万个细胞/mL、1500万个细胞/mL、2000万个细胞/mL、2500万个细胞/mL、3000万个细胞/mL、3500万个细胞/mL、4000万个细胞/mL、4500万个细胞/mL或5000万个细胞/mL的细胞浓度。在一些实施方案中，使用7500万个细胞/mL、8000万个细胞/mL、8500万个细胞/mL、9000万个细胞/mL、9500万个细胞/mL或1亿个细胞/mL的细胞浓度。在进一步的实施方案中，可以使用1.25亿个细胞/mL或1.5亿个细胞/mL的浓度。使用高浓度能导致细胞产量、细胞激活和细胞扩增的增加。此外，使用高细胞浓度可以更有效地捕获可能弱表达感兴趣的靶抗原的细胞如CD28阴性T细胞，或存在许多肿瘤细胞的样品(例如白血病血液、肿瘤组织等)中的细胞。这样的细胞群体可具有治疗价值并且将是期望获得的。
待刺激的T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。不希望受到理论的束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过移除细胞群体中的粒细胞和一定程度上的单核细胞而提供了更均一的产物。在移除血浆和血小板的洗涤步骤后，可以将细胞悬浮于冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的且在此情况下将是有用的，一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％右旋糖酐40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO，或31.25％Plasmalyte-A、31.25％右旋糖5％、0.45％NaCl、10％右旋糖酐40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或其他合适的例如含有Hespan和PlasmaLyte A的细胞冷冻培养基，然后将细胞以每分钟1°的速度冷冻至-80℃，并储存在液氮储罐的气相中。可以使用在-20℃或在液氮中立即进行受控冷冻以及非受控冷冻的其他方法。
在某些实施方案中，如本文所述将冷冻保存的细胞解冻并洗涤，并在激活前使其在室温下静置一小时。
在本发明的上下文中还包括在可能需要如本文所述的扩增的细胞之前的一段时间，从受试者收集血液样品或白细胞单采术产物。这样，可以在任何必要的时间点收集待扩增细胞的来源，并将目标细胞如T细胞分离并冷冻，以随后用于T细胞疗法，用于可受益于T细胞疗法的多种疾病或病况，如本文所述的那些。在一些实施方案中，血液样品或白细胞单采术产物取自整体健康的受试者。在某些实施方案中，血液样品或白细胞单采术产物取自具有发展疾病的风险但尚未发展疾病的整体健康的受试者，并且将感兴趣的细胞分离和冷冻以供之后使用。在某些实施方案中，可以将T细胞扩增、冷冻并在之后使用。
无论是在对Treg细胞进行基因修饰以表达目的CAR之前还是之后，通常可以使用例如以下中所述的方法来激活和扩增T细胞：美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；和6,867,041；和美国专利公开2006/0121005，其通过引用并入本文。
通常，本发明的T细胞(例如Treg细胞)通过与附着有刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激细胞表面上的共刺激分子的配体的表面，进行接触而扩增。具体而言，可以如本文所述地刺激T细胞(例如Treg细胞)，例如通过与固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段或抗CD2抗体接触，或通过与结合有钙离子载体(calcium ionophore)的蛋白激酶C激活因子(例如苔藓抑素)接触。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用与辅助分子结合的配体。例如，可以在适于刺激T细胞增殖的条件下，使T细胞群体与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞的增殖，可以使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括但不限于9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone，Besancon，法国)。可以使用本领域公知的其他扩增方法(Berg et al.,Transplant Proc.30(8):3975-3977(1998)；Haanen et al.,J.Exp.Med.190(9):1319-1328(1999)；Garland et al.,J.Immunol Meth.227(l-2):53-63(1999))。
在某些实施方案中，可以通过不同的方法提供本发明的T细胞(例如Treg细胞)的第一刺激信号和共刺激信号。例如，提供每个信号的试剂可以在溶液中和/或偶联至表面。当偶联至表面时，试剂可以偶联至相同表面(即，以“顺式”形式)或至单独的表面(即，以“反式”形式)。或者，一种试剂可以偶联至表面，另一种试剂可以在溶液中。在一些实施方案中，提供共刺激信号的试剂与细胞表面结合，且提供第一激活信号的试剂在溶液中或偶联至表面。在某些实施方案中，两种试剂都可以在溶液中。在一些实施方案中，试剂可以是可溶形式，然后交联至表面，例如表达Fc受体的细胞或将要与所述试剂结合的抗体或其他结合剂。就此而言，可参见例如美国专利公开2004/0101519和2006/0034810，其通过引用并入本文，涉及人工抗原呈递细胞(aAPC)，用于激活和扩增本发明中的T细胞。
在一些实施方案中，将两种试剂固定在珠子上，要么在同一珠子上，即“顺式”，或者在单独的珠子上，即“反式”。例如，提供第一激活信号的试剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，提供共刺激信号的试剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并将两种试剂以相等的分子数量共固定在同一珠子上。在一些实施方案中，针对CD4+T细胞扩增和T细胞生长，使用与所结合的珠子的每种抗体比例是1:1。在本发明的某些方面，所使用的与珠子结合的抗CD3:抗CD28抗体的比例使得观察到的T细胞扩增与使用1:1的比例观察到的扩增相比增加。在一些实施方案中，观察到与使用1:1的比例观察到的扩增相比，约1至约3倍的增加。在一些实施方案中，与珠子结合的抗CD3:抗CD28抗体的比例范围在100:1至1:100，以及其之间的所有整数值。在一些实施方案中，与抗CD3抗体相比，与颗粒结合的抗CD28抗体更多，即CD3:CD28的比例小于1。在本发明的某些实施方案中，与珠子结合的抗CD28抗体对抗CD3抗体的比例大于2:1。在一个具体的实施方案中，使用与珠子结合的CD3:CD28抗体比例是1:100。在一些实施方案中，使用与珠子结合的CD3:CD28抗体比例是1:75。在另一个实施方案中，使用与珠子结合的CD3:CD28抗体比例是1:50。在一些实施方案中，使用与珠子结合的CD3:CD28抗体比例是1:30。在某些实施方案中，使用与珠子结合的CD3:CD28抗体比例是1:10。在一些实施方案中，使用与珠子结合的CD3:CD28抗体比例是1:3。在一些实施方案中，使用与珠子结合的CD3:CD28抗体比例是3:1。
可以使用1:500至500:1以及介于之间的任何整数值的颗粒对细胞的比例，以刺激T细胞或其他靶细胞。如本领域普通技术人员可以容易理解地，颗粒对细胞的比例可以取决于颗粒相对于靶细胞的大小。例如，小尺寸的珠子可能只能结合少量细胞，而更大的珠子可能结合许多细胞。在某些实施方案中，还可以使用1:100至100:1以及介于之间的任何整数值的细胞对颗粒的比例。在具体的实施方案中，比例包含1:9至9:1以及介于之间的任何整数值。如上所述，引起T细胞刺激的抗CD3-和抗CD28-偶联颗粒对T细胞的比例可以变化；然而数值的某些实施方案包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1和15:1，其中一个具体的比例是每个T细胞至少有1:1的颗粒。在一些实施方案中，使用1:1或更小的颗粒对细胞的比例。在某些实施方案中，颗粒:细胞的比例是1:5。在进一步的实施方案中，颗粒对细胞的比例可以根据刺激日而变化。例如，在一些实施方案中，第一天的颗粒对细胞的比例是1:1至10:1，并且在之后的多达10天，每天或每隔一天将额外的颗粒添加到细胞中，最终比例为1:1至1:10(基于添加当天的细胞计数)。在一个具体的实施方案中，刺激第一天的颗粒对细胞的比例是1:1，并且在刺激第三和第五天将其调整为1:5。在一些实施方案中，以每天或每隔一天的基础添加颗粒，至最终比例在刺激第一天是1:1，第三和第五天是1:5。在一些实施方案中，刺激第一天的颗粒对细胞的比例是2:1，并且在刺激第三和第五天将其调整为1:10。在一些实施方案中，以每天或每隔一天的基础添加颗粒，至最终比例在第一天是1:1，在刺激第三和第五天是1:10。本领域技术人员将理解，多种其他的比例也可以适用于本发明。具体而言，比例将根据颗粒大小以及细胞大小和类型而变化。
在本发明的进一步的实施方案中，将免疫细胞与包被有试剂的珠子混合，随后将珠子和细胞分离并然后培养细胞。在替代的实施方案中，在培养之前，不分离包被有试剂的珠子和细胞而是一起培养。在一些实施方案中，首先通过施加力例如磁力来浓缩珠子和细胞，导致细胞表面标志物的连接增加，从而诱导细胞刺激。
举例来说，可以通过使结合有抗CD3和抗CD28抗体的顺磁珠(3x28珠)接触本发明的Treg细胞，来连接细胞表面蛋白。在一些实施方案中，将细胞(例如，104至109个T细胞)和珠子(例如，1：1比例的
Figure BDA0003013334950001031
M-450CD3/CD28 T顺磁性珠子)在缓冲液如PBS(不含二价阳离子如钙和镁)中合并。同样，本领域普通技术人员能够容易地理解，可以根据情况使用任何细胞浓度。例如，靶细胞在样品中可以非常稀少且仅占样品的0.01％，或整个样品(即100％)可以包含感兴趣的靶细胞。因此，任何细胞数都在本发明的范围内。在某些实施方案中，可能期望显著减少在其中将颗粒和细胞混合在一起的体积(即增加细胞的浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用约20亿个细胞/mL的浓度。在另一个实施方案中，使用大于1亿个细胞/mL。在进一步的实施方案中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万个细胞/mL的细胞浓度。在另一个实施方案中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/mL的细胞浓度。在进一步的实施方案中，可以使用1.25亿或1.5亿个细胞/mL的浓度。使用高浓度可导致细胞产量、细胞激活和细胞扩增的增加。此外，使用高细胞浓度可以更有效地捕获可能弱表达感兴趣的靶抗原的细胞如CD28阴性T细胞。在某些实施方案中，这样的细胞群体可具有治疗价值并且可是期望获得的。
在本发明的一些实施方案中，可将混合物培养数小时(例如约3小时)至约14天或介于之间的任何整数小时。在一些实施方案中，可以将混合物培养21天。在本发明的一些实施方案中，将珠子和T细胞一起培养约8天。在一些实施方案中，将珠子和T细胞一起培养2至3天。可能还需要几个刺激周期，使得T细胞的培养时间可以是60天或更长。适用于T细胞培养的条件包括合适的培养基(例如，最低基础培养基(Minimal Essential Media)或RPMI培养基1640或X-vivo 15，(Lonza))，其可以包含增殖和存活力所需的因子，包括血清(例如胎牛或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉(Plasmanate)和还原剂，例如N-乙酰基半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20，Optimizer，其添加有氨基酸、丙酮酸钠和维生素，不含血清或补充了适量血清(或血浆)或一组指定激素，和/或对T细胞的生长和扩增足够量的细胞因子。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅包括在实验培养物中，而不包括在要被输注到受试者的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如合适的温度(例如37℃)和大气(例如空气加5％CO2)。
暴露于不同刺激时间的T细胞可表现出不同的特征。例如，典型的血液或单采的(apheresed)外周血单核细胞产物具有的辅助T细胞群体(Th，CD4+)多于细胞毒性或抑制性T细胞群体(Tc，CD8+)。通过刺激CD3和CD28受体进行T细胞的离体扩增产生的T细胞群体在约8-9天之前主要由Th细胞组成，而在约8-9天后T细胞群体包含越来越多的Tc细胞群体。根据治疗目的，在一些实施方案中，向受试者输注主要包含Th细胞的T细胞群体可以是有利的。在一些实施方案中，如果已经分离了Tc细胞的抗原特异性亚组，则将这个亚组扩增至更大程度可以是有益的。
此外，除了CD4和CD8标志物外，其他表型标志物也有显著变化，但大部分在细胞扩增过程中可重现。这样的可重现性使得能够为了特定目的定制激活的T细胞产物。
在本发明的一些实施方案中，可在雷帕霉素(rapamycin)的存在下培养T细胞以获得调节性T细胞，如例如在PCT专利公开WO 2007/110785(其通过引用并入本文)中所描述的。另一种产生调节性T细胞的方法描述于美国专利公开2016/024470(其通过引用并入本文)中，其中将T细胞与以下一起培养：T细胞受体(TCR)/CD3激活剂如TCR/CD3抗体、TCR共刺激剂激活剂如CD28、CD137(4-1BB)、GITR、B7-1/2、CD5、ICOS、OX40、CD40或CD137抗体以及雷帕霉素。
在本发明的一些实施方案中，通过表达本文所述的CAR而被遗传修饰的T细胞也可以通过表达例如以下的至少一种细胞内因子而被遗传修饰：ROR-C、FoxP3、Foxo1、T-bet或Gata 3、c-Maf、AhR。在一些实施方案中，本发明的遗传修饰的免疫细胞表达FoxP3。在一些实施方案中，本发明的遗传修饰的免疫细胞表达Foxo1。
在一些实施方案中，本发明的遗传修饰的免疫细胞可以是同种异体免疫细胞。在此类情况下，可以对细胞进行工程化，以减少宿主对细胞的排斥(移植排斥)和/或细胞对宿主的潜在攻击(移植物抗宿主病)。举例来说，可以对细胞进行工程化以使其具有以下一个或多个的无效基因型(null genotype)：(i)T细胞受体(TCRα链或β链)；(ii)I或II类多态主要组织相容性复合物(MHC)分子(例如HLA-A、HLA-B或HLA-C；HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ或HLA-DR；或β2-微球蛋白(B2M))；(iii)与抗原加工有关的转运子(例如TAP-1或TAP-2)；(iv)II类MHC反式激活因子(CIITA)；(v)次要组织相容性抗原(MiHA；例如HA-1/A2、HA-2、HA-3、HA-8、HB-1H或HB-1Y)；和(vi)以上的任意组合。同种异体工程化细胞还可以表达不变的HLA或CD47，以保护工程化Treg细胞免受宿主排斥。这些进一步的遗传修饰可以通过本领域已知的基因编辑技术和本文所述的那些来进行。
经进一步编辑的同种异体细胞尤其有用，因为它们可以用于多个患者中且不会出现兼容性问题。因此可以将同种异体细胞称为“通用的(universal)”，并且可以“现成地(off the shelf)”使用。使用“通用的”细胞大幅提高了效率并降低了采用的细胞疗法的成本。
在某些实施方案中，可以对同种异体免疫细胞进行工程化使得它在其表面上不表达任何功能性TCR，进行工程化使得它不表达包含功能性TCR的一个或多个亚基，或进行工程化使得它在其表面上产生极少的功能性TCR。例如，可以对本文所述的免疫细胞进行工程化，使得TCR分子的细胞表面表达下调。或者，T细胞可以表达基本上受损的TCR，例如通过表达TCR的一个或多个亚基的突变或截短形式。术语“基本上受损的TCR”意指这个TCR将不会在宿主中引起不利的免疫反应。
在某些实施方案中，可以对同种异体免疫细胞进行工程化，使得它在其表面上不表达功能性HLA。例如，可以对本文所述的免疫细胞进行工程化，使得HLA如1类HLA和/或II类HLA和/或非经典HLA分子的细胞表面表达下调。
在某些实施方案中，T细胞可以缺乏功能性TCR和功能性HLA如I类HLA和/或II类HLA。
缺乏功能性TCR和/或HLA的表达的修饰的免疫细胞可以通过任何合适的手段获得，包括敲除或敲低TCR和/或HLA的一个或多个亚基。例如，Treg细胞可以包括使用以下敲低的TCR和/或HLA：siRNA、shRNA、成簇的规则间隔的短回文重复(CRISPR)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸内切酶(ZFN)、大范围核酸酶(mn，也称为归巢核酸内切酶)或megaTAL(结合TAL效应子和mn切割结构域)。
在一些实施方案中，将编码本文所述的CAR的核酸插入免疫细胞基因组中的特定基因座处，例如待删除的基因的基因座处。在一些实施方案中，将编码本文所述的CAR的核酸插入TCR和/或HLA基因座内，从而导致TCR和/或HLA的表达被抑制。
在一些实施方案中，可使用靶向T细胞中编码TCR和/或HLA的核酸的siRNA或shRNA来抑制TCR和/或HLA的表达。siRNA和shRNA在T细胞中的表达可以使用任何常规表达系统，例如慢病毒表达系统来实现。下调I类HLA和/或II类HLA基因的表达的示例性siRNA和shRNA描述于例如美国专利公开2007/0036773中。下调TCR组分的表达的示例性shRNA描述于例如美国专利公开2012/0321667中。
如本文所用，“CRISPR”或“针对TCR和/或HLA的CRISPR”或“抑制TCR和/或HLA的CRISPR”是指一组成簇的规则间隔的短回文重复序列，或包含这组重复序列的系统。如本文所用，“Cas”是指CRISPR相关蛋白。“CRISPR/Cas”系统是指衍生自可用于沉默或突变TCR和/或HLA基因的CRISPR和Cas的系统。
在约40％经测序的真细菌基因组和90％经测序的古细菌中发现了天然存在的CRISPR/Cas系统。参见例如Grissa et al.(BMC Bioinformatics 8:172(2007))。这个系统是赋予对外源遗传成分如质粒和噬菌体的抗性并提供获得性免疫的形式的一种原核免疫系统。参见例如Barrangou et al.,Science 315:1709-1712(2007)；Marragini et al.,Science 322:1843-1845(2008)。CRISPR/Cas系统已经过改良用于真核生物如小鼠或灵长类动物中的基因编辑(沉默、增强或改变特定基因)。参见例如Wiedenheft et al.,Nature482:331-8(2012)。这是通过将含有特定设计的CRISPR和一个或多个合适的Cas编码序列的质粒引入真核细胞来实现的。CRISPR序列，有时称为CRISPR基因座，包含交替的重复序列和间隔区。在天然存在的CRISPR中，间隔区通常包含与细菌异源的序列，例如质粒或噬菌体序列；在TCR和/或HLA CRISPR/Cas系统中，间隔区衍生自TCR和/或HLA基因序列。来自CRISPR基因座的RNA是组成性表达的，并由Cas蛋白加工成小RNA。这些包含侧接有重复序列的间隔区。RNA指导其他Cas蛋白以在RNA或DNA水平上沉默外源遗传元件。参见例如Horvath etal.,Science 327:167-170(2010)；Makarova et al.,Biology Direct 1:7(2006)。间隔区因此作为RNA分子的模板，类似于siRNA。参见例如Pennisi,Science 341:833-836(2013)。CRISPR/Cas系统因此可用于编辑TCR和/或HLA基因(添加或删除碱基对)，或引入过早的终止，从而降低TCR和/或HLA的表达。或者或另外，可以像RNA干扰那样使用CRISPR/Cas系统，以可逆方式关闭TCR和/或HLA基因。例如，在哺乳动物细胞中，RNA可以将Cas蛋白引导至TCR和/或HLA启动子，在空间上阻止RNA聚合酶。
可以使用本领域已知的技术，例如在美国专利公开2014/0068797和Cong,Science339:819-823(2013)中描述的技术，来产生抑制TCR和/或HLA的人工CRISPR/Cas系统。还可以产生抑制TCR和/或HLA的本领域已知的其他人工CRISPR/Cas系统，例如描述于Tsai,Nature Biotechnol.32:6569-576(2014)和美国专利8,871,445；8,865,406；8,795,965；8,771,945；和8,697,359中的那些。
应当理解，上述程序也可以通过利用除Cas之外的核酸内切酶如Cpf1和C2c1/2/3的CRISPR系统来进行。
“TALEN”或“针对TCR和/或HLA的TALEN”或“抑制TCR和/或HLA的TALEN”是指转录激活因子样效应物核酸酶，一种可用于编辑TCR和/或HLA基因的人工核酸酶。TALEN通过将TAL效应子DNA结合结构域与DNA切割结构域融合来人工产生。转录激活因子样效应物(TALE)可以经工程化以结合任何目标DNA序列，包括TCR和/或HLA基因的一部分。通过将工程化的TALE与DNA切割结构域结合，可以产生对任何目标DNA序列(包括TCR和/或HLA序列)均特异的限制酶。然后可以将这些引入细胞中，其中它们可以用于基因组编辑。参见，例如Boch(2011)Nature Biotech.29:135-6；Boch et al.Science 326:1509-12(2009)；和Moscouet al.Science 326:3501(2009)。
TALE是由黄单胞菌细菌分泌的蛋白。DNA结合结构域含有除第12个和13个氨基酸之外高度保守的33-34个氨基酸的重复序列。这两个位置是高度可变的，显示出与特异核苷酸识别的强相关性。因此可以对它们进行工程化以使其结合目标DNA序列。为了产生TALEN，将TALE蛋白与核酸酶(N)融合，该核酸酶是野生型或突变的Fok1核酸内切酶。已经产生了用于TALEN中的几个Fokl突变；这些例如会改善切割特异性或活性。参见例如Cermak et al.,Nucl.Acids Res.39:e82(2011)；Miller et al.,Nature Biotech.29:143-8(2011)；Hockemeyer et al.,Nature Biotech.29:731-734(2011)；Wood et al.,Science 333:307(2011)；Doyon et al.,Nature Methods 8:74-79(2010)；Szczepek et al.,NatureBiotech.25:786-793(2007)；和Guo et al.,J.Mol.Biol.200:96(2010)。Fokl结构域作为二聚体起作用，其需要针对靶基因组中位点的具有合适的方向和间距的独特DNA结合结构域的两个构建体。TALE DNA结合结构域和Fok1切割结构域之间的氨基酸残基数目以及两个单独的TALEN结合位点之间的碱基数目似乎都是实现高活性水平的重要参数(Miller etal.,Nature Biotech.29:143-8(2011))。TCR和/或HLA TALEN可在细胞内使用，以产生双链断裂(DSB)。如果修复机制经由非同源末端连接不恰当地修复了断裂，则能在断裂位点处引入突变。例如，不恰当的修复可引入移码突变。或者，可以将外源DNA与TALEN一起引入细胞中；根据外源DNA的序列和染色体序列，这个过程可用于校正TCR和/或HLA基因中的缺陷或将这样的缺陷引入wt HLA基因中，从而降低TCR和/或HLA的表达。可以使用本领域已知的任何方法，包括使用模块化组件的各种方案，来构建对TCR和/或HLA中的序列特异的TALEN(Zhang et al.,Nature Biotech.29:149-53(2011)；Geibler et al.,PLoS ONE 6:el9509(2011))。
“ZFN”或“锌指核酸酶”或“针对TCR和/或HLA的ZFN”或“抑制TCR和/或HLA的ZFN”是指锌指核酸酶，一种可用于编辑TCR和/或HLA基因的人工核酸酶。像TALEN一样，ZFN包含与DNA结合结构域融合的Fok1核酸酶结构域(或其衍生物)。就ZFN而言，DNA结合结构域包含一个或多个锌指。参见例如Carroll et al.,Genetics Society of America 188:773-782(2011)；和Kim et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:1156-1160(1996)。锌指是通过一个或多个锌离子来稳定的小蛋白结构基序。锌指可以包含例如Cys2His2，并且能识别约3bp的序列。可以将各种特异性已知的锌指进行组合，以产生识别约6bp、9bp、12bp、15bp或18bp序列的多指多肽。各种选择和模块化组装技术可用于产生识别特定序列的锌指(及其组合)，包括噬菌体展示、酵母单杂交系统、细菌单杂交系统和双杂交系统以及哺乳动物细胞。
像TALEN一样，ZFN必须二聚化以切割DNA。因此，需要一对ZFN来靶向非回文DNA位点。两个单独的ZFN必须结合DNA的相对链，被其核酸酶恰当地分隔开(Bitinaite et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:10570-5(1998))。还像TALEN一样，ZFN可以在DNA中产生双链断裂，其在修复不当时能产生移码突变，导致细胞中TCR和/或HLA的表达和数量降低。ZFN也可以与同源重组一起使用，以使TCR和/或HLA基因突变。可以使用任何本领域的已知方法来构建对TCR和/或HLA中的序列特异的ZFN。参见例如Provasi,Nature Med.18:807-815(2011)；Torikai,Blood 122:1341-1349(2013)；Cathomen et al.,Mol.Ther.16:1200-7(2008)；Quo et al.,J.Mol.Biol.400:96(2010)；和美国专利公开2011/0158957和2012/0060230。
“大范围核酸酶(Meganuclease)”或“针对TCR和/或HLA的大范围核酸酶”或“抑制TCR和/或HLA的大范围核酸酶”是指具有大(>14个碱基对)识别位点的单体核酸内切酶，其可用于编辑TCR和//或HLA基因。大范围核酸酶(mn)是具有先天核酸酶活性的单体蛋白，其衍生自细菌归巢核酸内切酶，并经工程化以针对独特的靶位点。归巢核酸内切酶是能在其宿主基因组的单独基因座处产生双链断裂从而驱动位点特异性基因转化事件的DNA切割酶(Stoddard,Structure 19(1):7-15(2011))。尽管归巢核酸内切酶尺寸小，但它们能识别长的DNA序列(通常20至30个碱基对)。归巢核酸内切酶极为普遍，并发现于微生物以及噬菌体和病毒中。LAGLIDADG和His-Cys框酶(His-Cys box enzyme)(其在这些酶中具有最高的序列特异性)依赖于靠入(dock into)其DNA靶位点的大沟的反平行β-折叠(Flick et al.,Nature 394(6688):96-101(1998)；Jurica et al.,Mol.Cell.2(4):469-76(1998))。在那里，它们建立了非均匀地分布在多个连续碱基对之间的序列特异性和非特异性接触的集合(Chevalier et al.,J Mol Biol 329(2):253-269(2003)；Scalley-Kim et al.,J MolBiol.372(5):1305-19(2007))。
LAGLIDADG归巢核酸内切酶(LHE)家族是用于基因靶向应用的工程化酶的主要来源。LHE家族主要在古细菌内以及藻类和真菌的叶绿体和线粒体基因组中编码(Chevalieret al.,in Homing Endonucleases and Inteins.Nucleic Acids and MolecularBiology,vol.16(2005)；Dalgaard et al.,Nucleic Acids Res.25(22):4626-38(1997)；Sethuraman et al.,Mol Biol Evol.26(10):2299-315(2009))。每条蛋白链均具有单个保守LAGLIDADG基序(SEQ ID NO:58)的大范围核酸酶形成了切割回文和近回文DNA靶序列的同二聚体蛋白，而每条蛋白链含有两个这样的基序的那些则形成能靶向完全不对称的DNA序列的更大的伪对称单体。
可以将大范围核酸酶工程化以靶向TCR和/或HLA，从而在DNA中产生双链断裂，其在修复不当时能产生移码突变，导致细胞中TCR和/或HLA的表达和数量降低。
“MegaTAL”或“针对TCR和/或HLA的megaTAL”或“抑制TCR和/或HLA的megaTAL”是指可用于编辑TCR和/或HLA基因的人工核酸酶。MegaTAL是通过最小TAL(转录激活因子样)效应物结构域与衍生自LAGLIDADG归巢核酸内切酶家族的大范围核酸酶的N-末端融合而得到的杂交单体核酸酶(Boissel et al.,Nucleic Acids Res.42(4):2591-601(2014)；Takeuchi et al,Methods Mol Biol.1239:105-32(2015))。MegaTAL因此由具有由TAL效应物DNA结合结构域提供的额外的亲和力和特异性的位点特异性大范围核酸酶切割头组成。
可以对MegaTAL进行工程化以使其靶向TCR和/或HLA，从而在DNA中产生双链断裂，其在修复不当时能产生移码突变，导致细胞中TCR和/或HLA的表达和数量降低。使用I-OnuI大范围核酸酶(mn)的变体来设计TCRα-megaTAL，以敲除T细胞受体α(TCRα)基因。将TCRαmn与设计为结合TCRαmn结合位点上游的DNA序列的10.5重复的TALE阵列融合。已发现，靶向TCRα的megaTAL在人原代T细胞中实现了不具有可检测的脱靶切割的极高的基因破坏(Boissel et al,Nucleic Acids Res 42(4):2591-601(2014))。
在一些实施方案中，表达本发明的CAR的T细胞群体是缺乏内源T细胞受体(TCR)或已被改变以减少或消除内源TCR的表达或活性的T细胞群体。应当理解，本文所述的用于抑制或消除HLA表达的任何方法也可以用于靶向内源TCR的一个或多个组分。
在一些实施方案中，用端粒酶基因转染能够延长T细胞的端粒并改善患者体内T细胞的持久性。参见例如June,Journal of Clinical Investigation 117:1466-1476(2007)。因此，在一些实施方案中，本发明的遗传修饰的Treg细胞异位表达端粒酶亚基，例如端粒酶的催化亚基，例如TERT，例如hTERT。在一些方面，本公开提供了一种生产本发明的表达嵌合受体的细胞的方法，包括使细胞与编码端粒酶亚基(例如端粒酶的催化亚基，例如TERT，例如hTERT)的核酸接触。可以使细胞在与编码嵌合受体(例如本文所述的CAR)的构建体接触之前、同时或之后与核酸接触。
本发明进一步涉及一种获得本发明的免疫细胞的方法，其中所述方法包括用编码本文所述的CAR的核酸转导至少一个免疫细胞，并任选地扩增所转导的细胞。在一些实施方案中，方法是离体方法。
在一些实施方案中，获得本发明的免疫细胞的方法包括：
-从PBMC群体中分离/富集免疫细胞的步骤(例如，通过白细胞单采术回收)，
-任选地，激活步骤，
-使用包含编码本文所述的CAR的核酸序列的载体的转导步骤，
-任选地，扩增步骤，
-任选地，洗涤步骤，和，
-任选地，冷冻步骤。
在一些实施方案中，可以在含有雷帕霉素和/或高浓度IL-2的组织培养基中培养本发明的工程化Treg细胞，以维持Treg表型和/或增加FoxP3和转基因的表达。
组合物
本发明的另一个目的是包含至少一种本文所述的本发明的免疫细胞或免疫细胞群体或由其组成或基本上由其组成的组合物。在一些实施方案中，所述本发明的免疫细胞或免疫细胞群体选自由以下组成的组：T细胞、自然杀伤(NK)细胞、γδT细胞、双阴性(DN)细胞、调节性免疫细胞、调节性T细胞、效应免疫细胞、效应T细胞、B细胞和髓系来源的细胞，以及它们的任意组合。
如本文所用，关于药物组合物或药物，术语“基本上由...组成”意指至少一种本发明的免疫细胞或细胞群体是所述药物组合物或药物中唯一具有生物活性的治疗剂或试剂。
在一些实施方案中，所述组合物包含至少一种本文所述的本发明的分离的和/或基本上纯化的免疫细胞群体或由其组成或基本上由其组成。
在一些实施方案中，所述组合物包含至少一种本文所述的本发明的免疫细胞群体或由其组成或基本上由其组成，其经工程化以在细胞表面表达本文所述的CAR(例如，包含以下的CAR：至少一个细胞外结合结构域、任选至少一个细胞外铰链结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个细胞内结构域，其中至少一个细胞内结构域包含至少一个第一细胞内信号传导结构域和任选至少一个共刺激性细胞内信号传导结构域)，其中至少一个跨膜结构域是人TNFR2跨膜结构域或其片段或变体，或任何跨膜结构域或其片段或变体，或其组合，和/或至少一个共刺激性细胞内信号传导结构域是人TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体，或任何共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体，或其组合，其中跨膜结构域和共刺激性细胞内信号传导结构域中的至少一个是TNFR2跨膜结构域或其片段或变体或TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体。
在一些实施方案中，所述组合物已被冷冻和解冻。
本发明的另一个目的是包含至少一种本文所述的免疫细胞或群体和至少一种药学上可接受的赋形剂或由其组成或基本上由其组成的药物组合物。
本发明的另一个目的是包含至少一种本文所述的免疫细胞群体或由其组成或基本上由其组成的药物。
在一些实施方案中，药物组合物或药物包含至少一种本文所述的本发明的分离的和/或基本上纯化的免疫细胞群体。
在一些实施方案中，药物组合物或药物包含本文所述的免疫细胞群体的组合(即，至少两种不同的本发明的免疫细胞群体)。
在一些实施方案中，本发明的组合物、药物组合物或药物进一步包含至少一种不同的第二免疫细胞群体，其中所述第二免疫细胞群体的细胞在细胞表面上表达对抗原、抗原片段、抗原变体或其混合物特异的不同的第二CAR。在一些实施方案中，第二CAR对来自普通人类饮食的食物抗原特异。在一些实施方案中，第二CAR对以下特异：自身抗原，例如多发性硬化相关抗原、关节相关抗原、眼相关抗原、人HSP抗原、皮肤相关抗原或参与移植排斥或GVHD的抗原。在一些实施方案中，第二CAR对吸入性过敏原、摄入性过敏原或接触性过敏原特异。在一些实施方案中，第二CAR对选自由以下组成的组的抗原特异：卵白蛋白、MOG、II型胶原蛋白、瓜氨酸化波形蛋白、瓜氨酸化II型胶原蛋白、瓜氨酸化纤维蛋白原，及其片段、变体和混合物。
在一些实施方案中，第二CAR对卵白蛋白或其片段、变体或混合物特异。在一些实施方案中，第二CAR对MOG或其片段、变体或混合物特异。在一些实施方案中，第二CAR对II型胶原蛋白或其片段、变体或混合物特异。在一些实施方案中，第二CAR对瓜氨酸化波形蛋白、瓜氨酸化II型胶原蛋白或瓜氨酸化纤维蛋白原或其片段、变体和混合物特异。在一些实施方案中，第二CAR对HLA-A2或其片段、变体或混合物特异。在一些实施方案中，第二CAR对IL-23R或其片段、变体或混合物特异。在一些实施方案中，第二CAR对B细胞表面标志物如CD19、CD20或其片段、变体和混合物特异。在一些实施方案中，第二CAR对本文所述的癌抗原或其片段、变体或混合物特异。
在一些实施方案中，第二CAR识别感染的细胞。在一些实施方案中，第二CAR对以下特异：病毒抗原或其片段、变体或混合物；细菌抗原或其片段、变体或混合物；或真菌抗原或其片段、变体或混合物。
在一些实施方案中，所述第二免疫细胞群体的细胞在细胞表面表达CAR，其中所述CAR的细胞外结合结构域是蛋白或其片段或变体，例如自身抗原或其片段或变体。
在一些实施方案中，所述其他免疫细胞群体的细胞在细胞表面上表达对自身抗体例如在B细胞上表达的自身抗体特异的CAR。
本文所述的组合物和药物可包含例如缓冲剂，例如无菌水、生理盐水、中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；盐类；抗生素；等渗剂；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、葡聚糖和甘露醇；蛋白，例如人血清白蛋白；多肽；氨基酸，例如甘氨酸和精氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。组合物和药物可另外包含支持Treg表型和生长的因子(例如，IL-2和雷帕霉素或其衍生物)、抗炎细胞因子(例如，IL-10、TGF-β和IL-35)以及其他用于细胞疗法的细胞(例如，用于癌症治疗的CAR T效应细胞或用于再生疗法的细胞)。为了存储和运输，可任选地将细胞冷冻保存。在使用之前，可以将细胞解冻并稀释于药学上可接受的载体中。
在一些实施方案中，本发明的组合物被配制用于静脉内施用。
在一些实施方案中，与表达不具有TNFR2跨膜结构域或其片段或变体和/或不具有TNFR2细胞内共刺激性信号传导结构域或其片段或变体的CAR的细胞相比，表达本发明CAR的细胞表现出降低的递补信号传导(tonic signaling)。
如本文所用，术语“递补信号传导(tonic signaling)”是指不依赖抗原的激活背景。
测量递补信号传导的方法是本领域技术人员公知的，包括但不限于测量表达CAR的细胞的代谢活性，通过由受体识别的抗原测量在不存在刺激下的一种或多种细胞激活指示物，测量与细胞衰老或细胞老化有关的一种或多种表型变化，测定不存在抗原刺激下的细胞周期进程；以及测量与未修饰细胞的大小相比，表达受体的细胞的大小。
在一些实施方案中，当在TEST A的条件下测量时，与不表达TNFR2跨膜结构域或其片段或变体和/或TNFR2细胞内共刺激性结构域或其片段或变体的CAR工程化的免疫细胞相比，表达TNFR2跨膜结构域或其片段或变体和/或TNFR2细胞内共刺激性信号传导结构域或其片段或变体的CAR工程化的免疫细胞具有降低的递补信号传导。
TEST A：
使用T细胞激活的指示物以测量递补信号传导。在TEST A的条件下，在本发明的CAR激活之前和之后，测量细胞群体中CD69阳性细胞的水平。在免疫细胞培养的第9天进行激活测定。简言之，将0.05x 106个免疫细胞单独接种在96U底板中，或在抗CD28/抗CD3包被的珠子(以1：1的免疫细胞对珠子的比例)存在下接种，或在新鲜解冻的自体B细胞(以1：1的免疫细胞对B细胞的比例)存在下接种，最终体积为200μl。在37℃、5％CO2下24小时后，对细胞进行CD69和与特定免疫细胞群体相关的标志物(例如，对于B细胞为CD19，对于T细胞为CD4或CD8)的染色，然后使用流式细胞术进行分析。监测与非转导的细胞相比，表达本文所述的CAR(例如，包含TNFR2跨膜结构域或其片段或变体和/或TNFR2细胞内共刺激性信号传导结构域或其片段或变体)的细胞的CD69自发表达(意指没有任何抗原性刺激)，能够确定递补信号传导的强度。使用以不包含TNFR2跨膜或TNFR2细胞内共刺激性信号传导结构域的CAR转导的细胞作为对照。
在一些实施方案中，本发明的CAR构建体可用于生产具有降低的递补信号传导的工程化免疫细胞。在一些实施方案中，本发明提供了一种生产具有降低的递补信号传导的工程化免疫细胞(即，表达CAR的细胞)的方法。当前可用的CAR构建体，尤其是在CAR效应物领域中使用的那些，通常与高递补信号传导有关，限制了CAR工程化细胞的效力。实际上，这样的递补信号传导与CAR工程化的细胞的组成型激活有关，导致它们过早耗竭或甚至死亡。本发明的CAR构建体(包含TNFR2跨膜结构域或其片段或变体和/或TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体)提供了减弱的递补信号传导和细胞的组成型激活。
治疗用途
本发明提供了一种治疗有此需要的受试者中的一种或多种疾病、病症、症状或病况的方法，其中所述方法包括向受试者施用本文所述的CAR工程化的免疫细胞或组合物。本发明还提供了至少一种本文所述的免疫细胞群体(例如，在本文所述的组合物、药物组合物或药物中)，用作药物。本发明还提供了至少一种本文所述的免疫细胞群体(例如，在本文所述的组合物、药物组合物或药物中)，用于制备药物。可以用本发明的工程化免疫细胞治疗的疾病包括但不限于炎性疾病、自身免疫疾病、过敏性疾病、器官移植病况、癌症和感染性疾病。
在一些实施方案中，用于治疗有此需要的受试者中的疾病或病症的方法包括向受试者施用至少一种本文所述的免疫细胞群体，例如工程化的调节性免疫细胞群体(例如Treg细胞群体)，其中所述疾病或病症是炎性疾病、自身免疫疾病、过敏性疾病或器官移植病况。在某些实施方案中，疾病或病症是移植排斥或移植物抗宿主病。
在一些实施方案中，用于治疗有此需要的受试者中的疾病或病症的方法包括向受试者施用至少一种本文所述的免疫细胞群体，例如工程化的效应免疫细胞群体(例如Treg细胞群体)，其中所述疾病或病症是癌症或感染性疾病。
在一些实施方案中，用于治疗有此需要的受试者中的疾病或病症的方法包括向受试者施用至少一种本文所述的免疫细胞群体，例如工程化的效应免疫细胞群体(例如Treg细胞群体)，其中所述受试者需要针对所述疾病或病症的基因疗法(例如，基于AAV的基因疗法)。
在一些实施方案中，方法是细胞治疗方法。
在一些实施方案中，细胞疗法是自体的。
在一些实施方案中，细胞疗法是异源的。
在一些实施方案中，细胞疗法是同种异体的。
在一些实施方案中，方法是基因治疗方法，并且涉及施用本文所述的核酸或载体。
1.炎性疾病
在一些实施方案中，本发明的CAR工程化的免疫细胞可以用于治疗有此需要的受试者中的一种或多种炎性疾病、病症、症状或病况。在某些实施方案中，本发明的CAR工程化的免疫细胞在这种情况下可以用于促进免疫耐受。本发明提供了一种治疗有此需要的受试者中的炎性疾病或病症的方法，其中所述方法包括施用治疗有效量的至少一种本文所述的免疫细胞群体。本发明还涉及至少一种本文所述的免疫细胞群体(例如，在本文所述的组合物、药物组合物或药物中)，用于治疗炎性疾病或病症。本发明还提供了至少一种本文所述的免疫细胞群体(例如，在本文所述的组合物、药物组合物或药物中)，用于制备治疗炎性疾病或病症的药物。
术语“炎性病症”或“炎性疾病”互换使用，并且如本文所用是指与炎症相关的任何异常。
在一些实施方案中，炎性病况包括与感染有关或与癌症有关的炎性疾病或炎症。
在一些实施方案中，炎性病况包括与自身免疫疾病有关的炎性疾病或炎症。
示例性炎性疾病、病症或病况包括但不限于关节炎、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、骨关节炎、银屑病关节炎、青少年特发性关节炎、青少年类风湿性关节炎、痛风性关节炎(arthritis uratica)、痛风、慢性多关节炎、肩周炎、颈椎关节炎、腰骶关节炎、肠病性关节炎和强直性脊柱炎、哮喘、皮炎、银屑病、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、青少年性皮肌炎、原发性胆汁性肝硬化、纤维化、囊性纤维化、肺纤维化、肝硬化、心内膜心肌纤维化(endomyocardial fibrosis)、纵膈纤维化(dediastinal fibrosis)、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、肾原性纤维化(nephrogenic fibrosis)、瘢痕疙瘩(keloids)、硬皮病、关节纤维化、移植后晚期和慢性实体器官排斥、多发性硬化病、系统性红斑狼疮、狼疮肾炎、天疱疮、寻常性天疱疮(pemphigus vulgaris)、疱疹样天疱疮(pemphigus herpetiformis)、增殖性天疱疮(pemphigus vegetans)、IgA天疱疮、红斑性天疱疮(pemphigus erythematosus)、大疱性类天疱疮(bullous pemphigoid)、妊娠性类天疱疮(pemphigoid gestationis)、粘膜性皮肤病、结节性类天疱疮(pemphigoid nodularis)、线性IgA大疱性皮肤病、大疱性扁平苔藓、获得性大疱性表皮松解症(epidermolysis bullosa acquisita)、自身免疫性糖尿病、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性肾病、糖尿病性血管病、眼部炎症、葡萄膜炎、鼻炎、缺血再灌注损伤、心血管成形术后再狭窄(post-angioplasty restenosis)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肾小球肾炎、格雷夫斯病、胃肠道过敏、结膜炎、动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、心绞痛(angina)、小动脉疾病、急性播散性脑脊髓炎、特发性血小板减少性紫癜、多发性硬化病、系统性硬化病、抗磷脂综合征、干燥综合征、自身免疫性溶血性贫血、结肠炎、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、炎性肠疾病(IBD)、栓塞、肺栓塞、动脉栓塞、静脉栓塞、过敏性炎症、心血管疾病、移植物相关疾病(graft-related disease)、移植物抗宿主病(GVHD)、与移植物移植排斥相关的病症、慢性排斥以及组织或细胞同种异体移植或异种移植、自身免疫疾病、创伤后退化、卒中、移植排斥、过敏性病况和超敏反应例如过敏性鼻炎、过敏性湿疹等、皮肤病、皮肤炎性疾病，及其任意组合。
皮肤病的实例包括但不限于痤疮；光化性角化病；特应性皮炎；接触性皮炎；褥疮性溃疡(褥疮)；湿疹；红皮病；血管瘤，例如儿童期血管瘤(hemangioma of childhood)；肥厚性瘢痕(hypertrophic scarring)；扁平苔藓；苔藓样病症；淋巴管生成；银屑病；化脓性肉芽肿；接触感染性软疣(molluscum contagious)；神经纤维瘤病；红斑痤疮(rosacea)；隐性营养不良性大疱性表皮松解(recessive dystrophic epidermolysis bullosa)；疤痕(瘢痕疙瘩)；硬皮病；脂溢性角化病；皮肤癌例如血管肉瘤、基底细胞癌、血管内皮瘤、卡波济氏肉瘤(Karposi’s sarcoma)、恶性黑色素瘤、黑色素瘤、鳞状细胞癌；皮肤溃疡；例如自体移植和同种异体移植的皮肤移植后的皮肤损害；史蒂文-强森综合征(Steven-Johnsonsyndrome)和中毒性表皮坏死松解症；斯特格-韦伯综合征(Sturge-Weber syndrome)；结节性硬化；静脉溃疡；寻常疣；疣(warts)，例如病毒性疣；伤口；等等。
皮肤炎性病症的实例包括但不限于银屑病、滴状银屑病(guttate psoriasis)、反转型银屑病(inverse psoriasis)、脓疱型银屑病、银屑病型红皮病、急性发热性嗜中性皮肤病(acute febrile neutrophilic dermatosis)、湿疹、多发性湿疹、汗疱湿疹(dyshidrotic eczema)、水疱样掌跖湿疹(vesicular palmoplanar eczema)、寻常痤疮、特应性皮炎、接触性皮炎、过敏性接触性皮炎、皮肌炎、剥脱性皮炎、手湿疹、汗疱疹、红斑痤疮、结节病引起的红斑痤疮、硬皮病引起的红斑痤疮、斯威特氏综合征(Sweet’s syndrome)引起的红斑痤疮、系统性红斑狼疮引起的红斑痤疮、荨麻疹引起的红斑痤疮、带状疱疹相关性疼痛引起的红斑痤疮、斯威特氏病、嗜中性汗腺炎(neutrophilic hidradenitis)、无菌性脓疱病(sterile pustulosis)、药疹、脂溢性皮炎、玫瑰糠疹、皮肤性菊池病(cutaneouskikuchi disease)、瘙痒性荨麻疹丘疹和妊娠斑、史蒂文-强森综合征和中毒性表皮坏死松解症、纹身反应、韦尔斯综合征(Wells syndrome)(嗜酸性蜂窝织炎)、反应性关节炎(莱特尔氏综合征(Reiter’s syndrome))、肠相关性皮肤病-关节炎综合征、类风湿性嗜中性皮肤病、嗜中性外分泌腺汗腺炎、背手的嗜中性皮肤病(neutrophilic dermatosis of thedorsal hands)、浆细胞性局限性龟头炎(balanitis circumscripta plasmacellularis)、龟头包皮炎(balanoposthitis)、贝切特病(Behcet’s disease)、离心性环形红斑(erythema annulare centrifugum)、持久性色素异常性红斑(erythema dyschromicumperstan)、多形性红斑(erythema multiforme)、环状肉芽肿(granuloma annulare)、手部皮炎、光泽苔藓(lichen nitidus)、扁平苔藓、硬化性萎缩性苔藓(lichen sclerosus etatrophicus)、慢性单纯性苔藓、小棘苔癣、钱币状皮炎(nummular dermatitis)、坏疽性脓皮病、结节病、角层下脓疱性皮肤病、荨麻疹和短暂性棘皮松解皮肤病。
2.自身免疫疾病
在一些实施方案中，本发明的CAR工程化免疫细胞可以用于治疗有此需要的受试者中的一种或多种自身免疫疾病、病症、症状或病况。在某些实施方案中，本发明的CAR修饰的免疫细胞在这种情况下可以用于促进免疫耐受。本发明因此提供了一种治疗有此需要的受试者中的自身免疫疾病的方法，其中所述方法包括施用治疗有效量的至少一种本文所述的免疫细胞群体。本发明还提供了至少一种本文所述的免疫细胞群体(例如，在本文所述的组合物、药物组合物或药物中)，用于治疗自身免疫疾病。本发明还提供了至少一种本文所述的免疫细胞群体(例如，在本文所述的组合物、药物组合物或药物中)，用于制造治疗自身免疫疾病的药物。
自身免疫性疾病的实例包括但不限于狼疮(例如红斑狼疮、狼疮肾炎等)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、原发性粘液性水肿、格雷夫斯病、恶性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、阿狄森氏病(Addison’s disease)、糖尿病(例如胰岛素依赖性糖尿病、I型糖尿病、II型糖尿病等)、古德帕斯彻氏综合征(good pasture’s syndrome)、重症肌无力、天疱疮、克罗恩氏病、交感性眼炎、自身免疫性葡萄膜炎、多发性硬化病、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少症、原发性胆汁性肝硬化、慢性活动性肝炎(chronic actionhepatitis)、溃疡性结肠炎、干燥综合征、风湿性疾病(例如类风湿性关节炎)、多发性肌炎、硬皮病、银屑病、混合性结缔组织病等。
3.过敏性疾病
在一些实施方案中，本发明的CAR工程化免疫细胞可以用于治疗有此需要的受试者中的一种或多种过敏性疾病、病症、症状或病况。在某些实施方案中，本发明的CAR修饰的免疫细胞在这种情况下可以用于促进免疫耐受。本发明因此提供了一种治疗有此需要的受试者中的过敏性疾病、病症、症状或病况的方法，其中所述方法包括施用治疗有效量的至少一种本文所述的免疫细胞群体。本发明还提供了至少一种本文所述的免疫细胞群体(例如，在本文所述的组合物、药物组合物或药物中)，用于治疗过敏性疾病、病症、症状或病况。本发明还提供了至少一种本文所述的免疫细胞群体(例如，在本文所述的组合物、药物组合物或药物中)，用于制造治疗过敏性疾病、病症、症状或病况的药物。
过敏性疾病的实例包括但不限于针对吸入性过敏原、摄入性过敏原或接触性过敏原的过敏性疾病。过敏性疾病的其他实例包括但不限于过敏性哮喘、过敏性肺病、食物过敏、特应性皮炎、过敏性鼻炎、过敏性鼻结膜炎、慢性荨麻疹、迟发型超敏性病症和系统性过敏反应。
4.移植
在一些实施方案中，本发明的CAR工程化免疫细胞可以用于治疗与器官或组织移植相关的一种或多种疾病、病症、症状或病况(例如，器官或组织排斥/功能障碍，GVHD，和/或与此相关的病况)。移植排斥涉及接受者的免疫细胞通过免疫应答破坏供体的移植组织。GVHD也涉及免疫应答；但是，在这种情况下，接受者的组织会被通过移植转移到接受者的供体的免疫细胞破坏。因此，CAR介导的免疫细胞的重定向和激活提供了一种抑制移植接受者中免疫效应细胞对错配细胞和/或组织的排斥，或在GVHD的情况下抑制移植的免疫活性细胞的致病作用的方法。在一些实施方案中，错配的细胞和/或组织包括HLA-A2错配的细胞和/或组织。本发明的CAR修饰的免疫细胞可以用于促进受试者中的免疫耐受、操作耐受(operational tolerance)和/或免疫适应(immune accommodation)，尤其是在器官或组织移植之后。本发明因此提供了一种促进受试者中免疫耐受、操作耐受和/或免疫适应的方法，所述方法包括向受试者施用CAR工程化免疫细胞或药物组合物，如本文所述。在一些实施方案中，所述方法可以用于促进对受试者中移植器官或组织的免疫耐受、操作耐受和/或免疫适应。本发明还提供了至少一种本文所述的免疫细胞群体(例如，在本文所述的组合物、药物组合物或药物中)，用于促进对受试者中移植器官或组织或对受试者中移植器官或组织的免疫耐受、操作耐受和/或免疫适应。本发明还提供了至少一种本文所述的免疫细胞群体(例如，在本文所述的组合物、药物组合物或药物中)，用于制造用于促进对受试者中移植器官或组织或对受试者中移植器官或组织的免疫耐受、操作耐受和/或免疫适应的药物。
在一些实施方案中，本发明的CAR工程化的免疫细胞(例如，CAR工程化的Treg细胞)在器官或组织移植的同时、之前或之后施用。
在一些实施方案中，本发明的CAR工程化的免疫细胞(例如，CAR工程化的Treg细胞)可用于预防或治疗对移植器官或组织的排斥。移植器官或组织的排斥的实例包括但不限于对移植器官或组织的超急性排斥和对移植器官或组织的抗体介导的排斥。
在一些实施方案中，本发明的方法包括向暴露于移植器官或组织的受试者施用本发明的CAR工程化的免疫细胞(例如，CAR工程化的Treg细胞)。
在一些实施方案中，移植器官或组织可包括骨髓移植、器官移植、输血或有意引入受试者的任何其他外源组织或细胞。
在一些实施方案中，本发明的CAR工程化的免疫细胞(例如，CAR工程化的Treg细胞)可以用作抑制移植后的移植排斥(包括但不限于同种异体移植排斥或异种移植排斥)的疗法。
本发明的另一个目的是预防或治疗受试者中器官或组织移植排斥的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的CAR工程化的免疫细胞(例如，CAR工程化的Treg细胞)，或包含所述免疫细胞的药物组合物。
本发明的另一个目的是增加受试者中移植物存活时间的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的CAR工程化的免疫细胞(例如，CAR工程化的Treg细胞)，或包含所述免疫细胞的药物组合物。
在一些实施方案中，所述方法产生了以下移植物存活时间：1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、20年、30年、40年、50年、60年、70年、80年、90年、100年或受试者的寿命。
在一些实施方案中，本发明的免疫细胞或组合物的施用减少了受试者接受的免疫抑制剂治疗的量。在一些实施方案中，受试者不需要和/或未经历任何免疫抑制剂治疗。
在一些实施方案中，移植物是同种异体移植物。在一些实施方案中，可以在将移植物移植到接受者中的同时、之前或之后使移植物暴露于本发明的CAR工程化的免疫细胞(例如，CAR工程化的Treg细胞)。在一些实施方案中，器官或组织移植物可以是心脏、心脏瓣膜、肺、肾、肝、胰腺、肠、皮肤、血管、骨髓、干细胞、骨或胰岛细胞。然而，本发明不限于特定的移植类型。
在一些实施方案中，可以在将本发明的CAR工程化的免疫细胞移植到接受者之前通过处理器官或组织移植物来“预先准备”或“预处理”供体移植物，以降低移植物对接受者的免疫原性，从而减少或防止移植物排斥。
在一些实施方案中，移植宿主或接受者是HLA-A2阴性的。在一些实施方案中，移植宿主或接受者是HLA-A2阴性的，并且对于选自由HLA-A25、HLA-A29和HLA-A30组成的组的HLA-A亚型是阳性的。
在一些实施方案中，移植物是HLA-A2阳性的。
在一些实施方案中，本发明的CAR工程化的免疫细胞(例如，CAR工程化的Treg细胞)可以用于预防或治疗移植物抗宿主病(GVHD)。在某些实施方案中，GVHD可在造血干细胞移植后发生。在一些实施方案中，所述方法包括向暴露于移植器官或组织的受试者施用本发明的CAR工程化的免疫细胞(例如，CAR工程化的Treg细胞)。在一些实施方案中，移植器官或组织可包括骨髓移植、器官移植、输血或有意引入受试者的任何其他外源组织或细胞。例如，GVHD可发生在心脏、心脏瓣膜、肺、肾、肝、胰腺、肠、皮肤、血管、骨髓、干细胞、骨或胰岛细胞移植之后。然而，本发明不限于特定的移植类型。
本发明的另一个目的是预防或治疗受试者中移植物抗宿主病(GVHD)的方法，所述方法包括向受试者施用CAR工程化的免疫细胞(例如，CAR工程化的Treg细胞)或本文所述的药物组合物。
在一些实施方案中，本发明提供了将移植物移植到接受者中的同时、之前或之后使供体移植物例如生物相容性晶格(biocompatible lattice)或供体组织、器官或细胞与本发明的CAR工程化的免疫细胞(例如，CAR工程化的Treg细胞)接触的方法。
在一些实施方案中，本发明的CAR工程化的免疫细胞(例如，CAR工程化的Treg细胞)可用于改善、抑制或减少供体移植物对接受者的不良反应，从而预防或治疗GVHD。
本发明的另一个目的是预防或延迟受试者中GVHD发作的方法，所述方法包括向受试者施用本文所述的CAR工程化的免疫细胞(例如，CAR工程化的Treg细胞)或药物组合物。
在一些实施方案中，GVHD的发作被延迟1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、20年、30年、40年、50年、60年、70年、80年、90年、100年或受试者的寿命。
在一些实施方案中，本发明的免疫细胞或组合物的施用减少了受试者接受的免疫抑制剂治疗的量。在一些实施方案中，受试者不需要和/或未经历任何免疫抑制剂治疗。
在一些实施方案中，GVHD可以是急性GVHD或慢性GVHD。
在一些实施方案中，可以在移植到接受者之前通过用本发明的CAR工程化的免疫细胞(例如，CAR工程化的Treg细胞)处理移植物，来“预先准备”或“预处理”供体移植物，以降低移植物对接受者的免疫原性，从而减少或防止GVHD。在一些实施方案中，可在移植之前使移植物与来自接受者的细胞或组织接触，以激活可能与移植物相关的T细胞。用来自接受者的细胞或组织处理移植物后，可将细胞或组织从移植物中去除。然后可以使经处理的移植物与本发明的CAR工程化的免疫细胞(例如，CAR工程化的Treg细胞)接触，以减少、抑制或消除通过用来自接受者的细胞或组织处理而激活的免疫效应细胞的活性。在这种处理之后，可以在移植到接受者之前从移植物中去除CAR工程化的免疫细胞。然而，一些CAR工程化的免疫细胞可能会附着在移植物上，可能会随移植物被引入接受者。在这种情况下，被引入接受者的CAR工程化的免疫细胞可能会抑制由与移植相关的细胞引起的针对接受者的免疫应答。
在一些实施方案中，移植宿主或接受者是HLA-A2阴性的。在一些实施方案中，移植宿主或接受者是HLA-A2阴性的，并且对于选自由HLA-A25、HLA-A29和HLA-A30组成的组的HLA-A亚型是阳性的。
在一些实施方案中，移植物是HLA-A2阳性的。
免疫细胞可以获得自任何来源。例如，在一些实施方案中，免疫细胞可以获得自组织供体、移植接受者或其他无关来源(例如，完全不同的个体或物种)以产生本发明的CAR修饰的免疫细胞。因此，本发明的CAR修饰的免疫细胞对于移植接受者可以是自体的、同种异体的或异种的，或来自其他无关来源。在一些实施方案中，CAR修饰的免疫细胞是对于移植接受者可以是自体的、同种异体的或异种的CAR-Treg细胞。在一些实施方案中，CAR-Treg细胞对于移植接受者可以是自体的。
5.癌症
在一些实施方案中，本发明的CAR工程化的免疫细胞可以用于治疗有此需要的受试者中的一种或多种癌症。在某些实施方案中，本发明的CAR工程化的免疫细胞可以用于促进针对癌细胞的特异性免疫应答。本发明因此提供了一种治疗有此需要的受试者中的癌症的方法，其中所述方法包括施用治疗有效量的至少一种本文所述的免疫细胞群体。本发明还提供了至少一种本文所述的免疫细胞群体(例如，在本文所述的组合物、药物组合物或药物中)，用于治疗癌症。本发明还提供了至少一种本文所述的免疫细胞群体(例如，在本文所述的组合物、药物组合物或药物中)，用于制造治疗癌症的药物。
如本文所用，“癌症”可以是与表面抗原或癌症标志物相关的任何癌症。
癌症的实例包括但不限于急性成淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓样白血病(AML)、腺样囊性癌、肾上腺皮质癌、与AIDS相关的癌症、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型类畸胎样/杆状瘤(atypical teratoid/rhabdoid tumor)、B细胞白血病、淋巴瘤或其他B细胞恶性肿瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、脑干胶质瘤、脑瘤、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、中枢神经系统癌、宫颈癌、脊索瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性骨髓增生性病症、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、胚胎肿瘤、子宫内膜癌、室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、食道癌、鼻腔神经胶质瘤(esthesioneuroblastoma)、尤文氏肉瘤家族瘤(Ewing sarcoma family oftumor)、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌、骨纤维组织细胞瘤(fibrous histiocytoma of bone)和骨肉瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌瘤(gastrointestinal carcinoid tumor)、胃肠道间质瘤(GIST)、软组织肉瘤、生殖细胞瘤、妊娠滋养细胞瘤、胶质瘤、多毛细胞白血病、头颈癌、心脏肿瘤、肝细胞(肝)癌、组织细胞增多症、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞瘤(内分泌胰腺)、卡波济肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症(Langerhans cell histiocytosis)、喉癌、白血病、唇和口腔癌、肝癌(原发性)、原位小叶癌(LCIS)、肺癌、淋巴瘤、巨球蛋白血症、男性乳腺癌、骨的恶性纤维组织细胞瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、黑色素瘤、梅克尔细胞癌(Merkel cellcarcinoma)、间皮瘤、具有涉及NUT基因的隐匿性原发性中线癌的转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、蕈样肉芽肿(mycosis fungoides)、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性肿瘤、慢性髓性白血病(CML)、骨髓性白血病、急性髓样白血病(AML)、多发性骨髓瘤、骨髓增生性病症、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状瘤病、副神经节瘤、鼻旁窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、中分化松果体实质细胞瘤(pineal parenchymal tumor of intermediate differentiation)、成松果体细胞瘤和幕上原始神经外胚叶肿瘤(supratentorial primitive neuroectodermaltumors)、垂体瘤、浆细胞瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤和乳腺癌、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾盂和输尿管的肾细胞(肾)癌、移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、塞扎里综合征(Sezary syndrome)、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚叶肿瘤、T细胞淋巴瘤、皮肤癌、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、滋养细胞瘤、输尿管和肾盂癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)和维尔姆斯瘤(Wilms tumor)。
在一些方面，癌症是B细胞恶性肿瘤。B细胞恶性肿瘤的实例包括但不限于非霍奇金淋巴瘤(NHL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL/CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、结节外(例如MALT)淋巴瘤、结节(例如，单核细胞样B细胞)淋巴瘤、脾脏淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病/淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)和淋巴母细胞淋巴瘤。
6.感染性疾病
在一些实施方案中，本发明的CAR工程化的免疫细胞可以用于治疗有此需要的受试者中的一种或多种感染性疾病、病症、症状或病况。在某些实施方案中，在这种情况下，本发明的CAR修饰的免疫细胞可以用于促进免疫耐受。在一些实施方案中，本发明提供了治疗有此需要的受试者中的感染性疾病的方法，其中所述方法包括施用治疗有效量的至少一种本文所述的免疫细胞群体。本发明还提供了至少一种本文所述的免疫细胞群体(例如，在本文所述的组合物、药物组合物或药物中)，用于治疗感染性疾病。本发明还提供了至少一种本文所述的免疫细胞群体(例如，在本文所述的组合物、药物组合物或药物中)，用于制造治疗感染性疾病的药物。
在一些实施方案中，感染性疾病是病毒感染性疾病。如本文所用，“病毒感染性疾病”可以是由引起宿主中疾病或病理性病况的任何病毒引起的感染。
病毒感染性疾病的实例包括但不限于由爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)引起的病毒性感染；由甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒引起的病毒性感染；由1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒或8型单纯疱疹病毒引起的病毒性感染；由巨细胞病毒(CMV)引起的病毒性感染；由人免疫缺陷病毒(HIV)引起的病毒性感染；由流感病毒引起的病毒性感染；由麻疹或腮腺炎病毒引起的病毒性感染；由人乳头瘤病毒(HPV)引起的病毒性感染；由副流感病毒引起的病毒性感染；由风疹病毒引起的病毒性感染；由呼吸道合胞病毒(RSV)引起的病毒性感染；或由水痘带状疱疹病毒引起的病毒性感染。在一些方面，病毒性感染可能引起或导致患有病毒性感染的受试者中癌症的发展(例如，HPV感染可以导致多种癌症的发展或与之相关，这些癌症包括宫颈癌、外阴癌、阴道癌、阴茎癌、肛门癌和口咽癌，HIV感染可以导致卡波济肉瘤的发展)。
在一些实施方案中，感染性疾病是细菌感染性疾病。如本文所用，“细菌感染性疾病”可以是由引起宿主中疾病或病理性病况的任何细菌引起的感染。
细菌感染性疾病的实例包括但不限于与肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、金黄色葡萄球菌或消化链球菌属的感染有关的肺炎、中耳炎、鼻窦炎、支气管炎、扁桃体炎和乳突炎；由化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、C和G组链球菌、白喉梭状芽胞杆菌(Clostridium diptheriae)或溶血放线杆菌(Actinobacillus haemolyticum)的感染引起的咽炎、风湿热和肾小球肾炎；与肺炎支原体、嗜肺军团菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌或肺炎衣原体的感染相关的气道感染；与金黄色葡萄球菌、凝固酶阳性葡萄球菌(例如表皮葡萄球菌、溶血性葡萄球菌等)、化脓性链球菌、无乳链球菌、C-F组链球菌(小菌落链球菌)、草绿色链球菌(Viridans streptococcus)、微小棒状杆菌、梭状芽孢杆菌属或汉赛巴尔通体(Bartonella henselae)的感染相关的非复杂性皮肤和软组织感染、生疖(boils)、骨髓炎和产褥热；单纯性急性尿路感染；与腐生葡萄球菌或肠球菌属的感染相关的尿道炎和宫颈炎；和与沙眼衣原体、杜氏嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、梅毒螺旋体、解脲支原体或淋病奈瑟氏菌(Neiserriagonorrheae)的感染相关的性传播疾病；与金黄色葡萄球菌(食物中毒和中毒性休克综合征)，A、B和C组链球菌的感染相关的中毒性疾病；与幽门螺杆菌的感染相关的溃疡；与回归热疏螺旋体(Borrelia recurrentis)的感染相关的全身性发热综合征；与伯氏疏螺旋体的感染相关的莱姆病(Lyme disease)；与沙眼衣原体、淋病奈瑟氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、流感嗜血杆菌或李斯特菌属(genus Listeria)的感染相关的结膜炎、角膜炎和泪囊炎；与鸟型结核分枝杆菌(Mycobacterium avium)、细胞内分枝杆菌的感染相关的弥散性鸟型分枝杆菌综合征(MAC)疾病；与空肠弯曲菌的感染相关的肠胃炎；与草绿色链球菌的感染相关的牙齿感染；与百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的感染相关的持续咳嗽；与产气荚膜梭菌(Clostridium perfringen)或拟杆菌属的感染相关的气性坏疽；和伴有幽门螺杆菌或肺炎衣原体的感染的动脉粥样硬化。在某些实施方案中，细菌性感染可以由例如埃希氏菌属(Escherichia genus)、李斯特菌属(Listeria genus)、沙门菌属或葡萄球菌属的细菌引起。
在一些实施方案中，感染性疾病是真菌感染性疾病。如本文所用，“真菌感染性疾病”可以是由引起宿主中的疾病或病理性病况的任何真菌引起的感染。
由真菌引起的感染性疾病的实例包括但不限于由例如白色念珠菌、新型隐球菌、黄曲霉、烟曲霉、球孢子菌、副球孢子菌、组织胞浆菌或芽生菌引起的局部、粘膜和/或全身性真菌感染。其他示例性的与真菌相关的病症包括动物(例如人类)中的鹅口疮、阴道念珠菌病、曲霉病、念珠菌病、着色真菌病、球孢子菌病、隐球菌病、虫霉病(entomophthoromycosis)、流行性淋巴管炎、地霉病(geotrichosis)、组织胞浆菌病、毛霉菌病、足分枝菌病、北美芽生菌病、oomycosis、paecilimycosis、青霉病(penicilliosis)、鼻孢子菌病(rhinosporidiosis)和孢子丝菌病。
在一些实施方案中，感染性疾病是寄生虫感染性疾病。如本文所用，“寄生虫感染性疾病”可以是由引起宿主中的疾病或病理性病况的任何原生动物，蠕虫(helminth)或体表寄生虫引起的感染。
可对人类具有感染性的原生动物的实例包括但不限于内阿米巴虫(Entamoeba)；贾第虫(Giardia)、利什曼原虫肠袋虫属(Leishmania balantidium)、疟原虫和隐孢子虫。
可对人类具有感染性的蠕虫的实例包括但不限于丝虫病、盘尾丝虫病、蛔虫病、鞭虫病、板口线虫病(Necatoriasis)、毛圆线虫病(Trichostrongyliasis)、麦地那龙线虫病(Dracunculiasis)、贝利斯蛔虫(Baylisascaris)、棘球蚴病(Echinococcosis)、膜壳绦虫病(Hymenolepiasis)、绦虫病、囊虫病、多头蚴病(Coenurosis)、双口吸虫病(Amphistomiasis)、支睾吸虫病(Clonorchiasis)、肝片吸虫病(Fascioliasis)、姜片虫病(Fasciolopsiasis)、后睾吸虫病(Opisthorchiasis)、肺吸虫病、血吸虫病和裂体吸虫病(Bilharziasis)。
可对人类具有感染性的体表寄生虫的实例包括但不限于昆虫(六足节肢动物)和蜘蛛纲(八足节肢动物)。
CAR的施用
本发明的CAR工程化的免疫细胞可以单独施用或作为本文所述的药物组合物施用(例如，与稀释剂和/或与其他组分组合，其他组分包括但不限于IL-2或其他细胞因子或细胞群体)。
本发明的药物组合物可以以任何合适的方式施用给受试者，包括通过气雾剂吸入、注射、摄取、输注、植入或移植。在一些实施方案中，本文所述的药物组合物可以通过肠胃外施用施用给受试者。在某些实施方案中，本文所述的药物组合物可以通过皮下、皮内、肿瘤内、结节内、髓内、肌内、胸骨内、静脉内(i.v.)注射、输注技术或腹膜内施用给受试者。在具体的实施方案中，本发明的CAR修饰的免疫细胞组合物可以通过皮内或皮下注射施用给受试者。在一些实施方案中，本发明的CAR修饰的免疫细胞组合物可以通过i.v.注射施用。在一些实施方案中，CAR修饰的免疫细胞的组合物可以直接注射到淋巴结、感染部位、炎症部位或组织或器官排斥部位。在一些实施方案中，CAR修饰的免疫细胞的组合物可以直接注射到自身免疫和/或炎性疾病部位。
在一些实施方案中，向受试者施用(或将要施用)自体细胞。
在一些实施方案中，向受试者施用(或将要施用)同种异体细胞。
在一些实施方案中，受试者可以是哺乳动物。在具体的实施方案中，受试者可以是人。
本发明的药物组合物可以以适合于待预防或治疗的疾病的方式施用。施用的量和频率将通过诸如受试者的状况以及受试者疾病的类型和严重性等因素决定，尽管适当的剂量可以通过临床试验来确定。
当指示"有效量"或"治疗量"时，待施用的本发明组合物的准确量可考虑受试者的年龄、体重、抗体滴度和状况的个体差异来确定。通常可以说，包含本文所述的CAR工程化的免疫细胞的药物组合物可以以至少1x102、1x103、1x104、1x105、1x106、1x107、1x108或1x109个细胞/kg体重或1x105至100x105个细胞/kg体重的剂量施用，包括范围内的所有整数值。CAR工程化的免疫细胞组合物也可以以任意的这些剂量或其任意组合施用多次。CAR工程化的免疫细胞可以通过使用免疫疗法中通常已知的输注技术施用。通过监测受试者的疾病征象并相应地调整治疗，可以容易地确定用于具体受试者的最佳剂量和治疗方案。
在一些实施方案中，本发明的CAR工程化的免疫细胞可与任意数量的相关治疗方式联合(例如，之前、同时或之后)施用给受试者，所述治疗方式包括但不限于用例如以下的试剂治疗：抗病毒疗法、化学疗法(即化学治疗剂)、烷化剂、放射、免疫抑制剂、抗体、免疫清除剂、细胞因子、辐射和抗感染剂。
在一些实施方案中，本发明的CAR工程化的免疫细胞可与化学治疗剂联合施用。可以使用本领域已知的任何化学治疗剂。化学治疗剂的实例包括但不限于蒽环类(例如多柔比星(例如脂质体多柔比星))、长春花生物碱(例如长春碱、长春新碱、长春地辛或长春瑞滨)、烷化剂(例如环磷酰胺、鸨烯咪胺(decarbazine)、美法仑(melphalan)、异环磷酰胺或替莫唑胺(temozolomide))、免疫细胞抗体(例如alemtuzamab、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、利妥昔单抗(rituximab)、奥法木单抗(ofatumumab)、托西莫单抗(tositumomab)或本妥昔单抗(brentuximab))、抗代谢物(包括例如叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂(例如氟达拉滨))、mTOR抑制剂、TNFR糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂、蛋白酶体抑制剂(例如阿克拉霉素A、胶霉霉素(gliotoxin)或硼替佐米(bortezomib))、免疫调节剂例如沙利度胺(thalidomide)或沙利度胺衍生物(例如来那度胺(lenalidomide))。
考虑用于本发明的联合疗法的其他化学治疗剂包括但不限于阿那曲唑(anastrozole，
Figure BDA0003013334950001301
)、比卡鲁胺(bicalutamide，
Figure BDA0003013334950001302
)、硫酸博来霉素(
Figure BDA0003013334950001303
)、白消安(busulfan，
Figure BDA0003013334950001304
)、白消安注射液(
Figure BDA0003013334950001305
)、卡培他滨(capecitabine，
Figure BDA0003013334950001311
)、N4-戊氧羰基-5-脱氧-5-氟胞苷(N4-pentoxycarbonyl-5-deoxy-5-fluorocytidine)、卡铂(carboplatin，
Figure BDA0003013334950001312
)、卡莫司汀(carmustine，
Figure BDA0003013334950001313
)、苯丁酸氮芥(
Figure BDA0003013334950001314
)、顺铂(cisplatin，
Figure BDA0003013334950001315
)、克拉屈滨(cladribine，
Figure BDA0003013334950001316
)、环磷酰胺(
Figure BDA0003013334950001317
或
Figure BDA0003013334950001318
)、阿糖胞苷(cytarabine)、胞嘧啶阿拉伯糖(cytosine arabinoside，
Figure BDA0003013334950001319
)、阿糖胞苷脂质体注射剂(
Figure BDA00030133349500013110
)、达卡巴嗪(dacarbazine，
Figure BDA00030133349500013111
)、放线菌素(放线菌素D，Cosmegan)、盐酸柔红霉素(
Figure BDA00030133349500013112
)、柠檬酸柔红霉素脂质体注射液(
Figure BDA00030133349500013113
)、地塞米松、多西他赛(docetaxel，
Figure BDA00030133349500013114
)、盐酸多柔比星(
Figure BDA00030133349500013115
)、依托泊苷(etoposide，
Figure BDA00030133349500013116
)、磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate，
Figure BDA00030133349500013117
)、5-氟尿嘧啶(
Figure BDA00030133349500013118
)、氟他米特(flutamide，
Figure BDA00030133349500013119
)、替扎西他滨(tezacitibine)、吉西他滨(Gemcitabine，二氟脱氧胞苷)、羟基脲(hydroxyurea，
Figure BDA00030133349500013120
)、依达比星(Idarubicin，
Figure BDA00030133349500013121
)、异环磷酰胺(
Figure BDA00030133349500013122
)、伊立替康(irinotecan，
Figure BDA00030133349500013123
)、L-天冬酰胺酶(
Figure BDA00030133349500013124
)、亚叶酸钙、美法仑(
Figure BDA00030133349500013125
)、6-巯嘌呤(
Figure BDA00030133349500013142
)、甲氨蝶呤(
Figure BDA00030133349500013126
)、米托蒽醌(
Figure BDA00030133349500013127
)、麦罗塔(mylotarg)、紫杉醇(
Figure BDA00030133349500013128
)、phoenix(钇90/MX-DTPA)、喷司他丁(pentostatin)、带有卡莫司汀植入物的聚苯丙生20(polifeprosan 20 withcarmustine implant，
Figure BDA00030133349500013129
)、柠檬酸他莫昔芬(tamoxifen citrate，
Figure BDA00030133349500013130
)、替尼泊苷(teniposide，
Figure BDA00030133349500013131
)、6-硫鸟嘌呤、噻替哌(thiotepa)、替拉扎明(tirapazamine，
Figure BDA00030133349500013132
)、注射用盐酸拓扑替康(topotecan hydrochloride forinjection，
Figure BDA00030133349500013133
)、长春碱(
Figure BDA00030133349500013134
)、长春新碱(
Figure BDA00030133349500013135
)和长春瑞滨(
Figure BDA00030133349500013136
)。
本发明的CAR工程化的免疫细胞可以在化学治疗剂之前、之后或伴随化学治疗剂施用给受试者。
在一些实施方案中，本发明的CAR工程化的免疫细胞可以与烷化剂联合施用。可以使用本领域已知的任何烷化剂。烷化剂的实例包括但不限于氮芥、乙基亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯、尿嘧啶氮芥(Aminouracil
Figure BDA00030133349500013137
Figure BDA00030133349500013138
Uracil nitrogen
Figure BDA00030133349500013139
Figure BDA00030133349500013140
和
Figure BDA00030133349500013141
)、盐酸氮芥(chlormethine，
Figure BDA0003013334950001321
)、环磷酰胺(
Figure BDA0003013334950001322
Figure BDA0003013334950001323
和RevimmuneTM)、异环磷酰胺(
Figure BDA0003013334950001324
)、美法仑(
Figure BDA0003013334950001325
)、苯丁酸氮芥(
Figure BDA0003013334950001326
)、哌泊溴烷(pipobroman，
Figure BDA0003013334950001327
Figure BDA0003013334950001328
)、三乙撑密胺(triethylenemelamine，
Figure BDA0003013334950001329
和
Figure BDA00030133349500013210
)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramine)、替莫唑胺(Temozolomide，
Figure BDA00030133349500013211
)、噻替哌(
Figure BDA00030133349500013212
)、白消安(
Figure BDA00030133349500013213
和
Figure BDA00030133349500013214
)、卡莫司汀(
Figure BDA00030133349500013215
)、洛莫司汀(lomustine，
Figure BDA00030133349500013216
)、链佐星(streptozocin，
Figure BDA00030133349500013217
)和达卡巴嗪(
Figure BDA00030133349500013218
)。其他示例性烷化剂包括但不限于奥沙利铂(Oxaliplatin，
Figure BDA00030133349500013219
)；替莫唑胺(
Figure BDA00030133349500013220
和
Figure BDA00030133349500013221
)；放线菌素(也称为放线菌素-D，
Figure BDA00030133349500013222
)；美法仑(也称为L-PAM、L-沙可来新(L-sarcolysin)和苯丙氨酸氮芥，
Figure BDA00030133349500013223
)；六甲密胺(也称为六甲基三聚氰胺(HMM)，
Figure BDA00030133349500013224
)；卡莫斯汀(
Figure BDA00030133349500013225
)；苯达莫司汀(Bendamustine，
Figure BDA00030133349500013226
)；白消安(
Figure BDA00030133349500013227
和
Figure BDA00030133349500013228
)；卡铂(
Figure BDA00030133349500013229
)；洛莫斯汀(也称为CCNU，
Figure BDA00030133349500013230
)；顺铂(也称为CDDP、
Figure BDA00030133349500013231
和
Figure BDA00030133349500013232
)；苯丁酸氮芥(
Figure BDA00030133349500013233
)；环磷酰胺(
Figure BDA00030133349500013234
和
Figure BDA00030133349500013235
)；达卡巴嗪(也称为DTIC、DIC和咪唑甲酰胺、
Figure BDA00030133349500013236
)；六甲密胺(也称为六甲基三聚氰胺(HMM)、
Figure BDA00030133349500013237
)；异环磷酰胺(
Figure BDA00030133349500013238
)；异环磷酰胺普雷德氮芥(Prednumustine)；甲苄肼(Procarbazine，
Figure BDA00030133349500013239
)；二氯甲基二乙胺(Mechlorethamine，也称为芥子气(nitrogen mustard)、氮芥(mustine)和双氯乙基甲胺盐酸盐(mechloroethamine hydrochloride)，
Figure BDA00030133349500013240
)；链霉素(
Figure BDA00030133349500013241
)；噻替哌(也称为硫代磷酰胺(thiophosphoamide)、TESPA和TSPA，以及
Figure BDA00030133349500013242
)；环磷酰胺(
Figure BDA00030133349500013243
和
Figure BDA00030133349500013244
)；和盐酸苯达莫司汀(
Figure BDA00030133349500013245
)。
本发明的CAR工程化的免疫细胞可以在烷化剂之前、之后或伴随施用给受试者。
在一些实施方案中，本发明的CAR工程化的免疫细胞可以与免疫抑制剂联合施用。可以使用本领域已知的任何免疫抑制剂。免疫抑制剂的实例包括但不限于环孢菌素(cyclosporine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、甲氧沙林(methoxsalen)、雷帕霉素、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)、霉酚酸(mycophenolicacid)、利妥昔单抗(rituximab)、西罗莫司(sirolimus)、巴利昔单抗(basiliximab)、达克珠单抗(daclizumab)、莫罗单抗-CD3(muromonab-CD3)、他克莫司(tacrolimus)、糖皮质类固醇、肾上腺皮质类固醇例如泼尼松(prednisone)和泼尼松龙(prednisolone)，及其任意组合。
本发明的CAR工程化的免疫细胞可以在免疫抑制剂之前、之后或与免疫抑制剂同时施用给受试者。
本发明的CAR工程化的免疫细胞和/或免疫抑制剂可以在移植后施用给受试者。可选地，或另外，本发明的CAR工程化的免疫细胞和/或免疫抑制剂可以在移植之前施用给受试者。在一些实施方案中，本发明的CAR工程化的免疫细胞和/或免疫抑制剂可以在移植手术期间施用给受试者。
在一些实施方案中，一旦免疫抑制疗法已经开始，就将CAR工程化的免疫细胞施用给受试者。
在一些实施方案中，将所述方法进行不止一次，例如，以随时间监测移植接受者，并且如果适用，用在不同的免疫抑制治疗方案中。
在一些实施方案中，如果预期移植物接受者对移植物耐受，则减少免疫抑制疗法。在一些实施方案中，如果预期移植物接受者对移植物耐受，则不开具免疫抑制疗法，例如停止免疫抑制疗法。
本发明的CAR工程化的免疫细胞可以在诊断移植器官或组织排斥之后施用，随后是本发明的CAR工程化的免疫细胞和免疫抑制剂两者的剂量，直到器官或组织排斥的症状消退。
在进一步的实施方案中，本发明的CAR工程化的免疫细胞组合物可以与骨髓移植联合(例如，之前、同时或之后)施用给受试者。
在一些实施方案中，本发明的CAR工程化的免疫细胞可在B细胞消融疗法(例如与CD20反应的试剂，例如利妥昔单抗(rituximab))后施用。例如，在一些实施方案中，受试者可经历高剂量化疗的标准治疗，随后进行外周血干细胞移植。在某些实施方案中，在移植后，受试者可以接受本发明的扩增的CAR工程化的免疫细胞的输注。在某些实施方案中，可以在手术之前或之后施用扩增的CAR工程化的免疫细胞。
在一些实施方案中，本发明的CAR工程化的免疫细胞可以与抗感染剂联合施用。可以使用本领域已知的任何抗感染剂。抗感染剂的实例包括但不限于抗阿米巴药(amebicide)、氨基糖苷类、驱虫药(anthelmintics)、抗寄生虫药、抗真菌药(唑类抗真菌药、棘白霉素(echinocandin)、杂类抗真菌药(miscellaneous antifungal)和多烯)、抗疟药(抗疟药组合、抗疟喹啉和杂类抗疟药(miscellaneous antimalarial))、抗结核药(对氨基水杨酸酯、抗结核药组合、二芳基喹啉、酰肼衍生物、杂类抗结核药(miscellaneousantituberculosis agent)、烟酸衍生物、利福霉素(rifamycin)衍生物和链霉菌衍生物)、抗病毒剂(金刚烷抗病毒剂、抗病毒增强剂(antiviral booster)、抗病毒剂组合、抗病毒干扰素、趋化因子受体拮抗剂、整合酶链转移抑制剂、杂类抗病毒剂(miscellaneousantiviral)、神经氨酸酶抑制剂、NNRTI、NS5A抑制剂、核苷逆转录酶抑制剂(NRTI)、蛋白酶抑制剂和嘌呤核苷)、碳青霉烯类(carbapenem)、碳青霉烯类/β-内酰胺酶抑制剂、头孢菌素(cephalosporin)(头孢菌素/β-内酰胺酶抑制剂、第一代头孢菌素、第四代头孢菌素、下一代头孢菌素、第二代头孢菌素和第三代头孢菌素)、抗生素、糖肽类抗生素、甘氨酰环素(glycylcycline)、leprostatics、林可霉素(lincomycin)衍生物、大环内酯衍生物(酮内酯和大环内酯)、杂类抗生素、恶唑烷酮类抗生素、青霉素(氨基青霉素、抗假青霉素(antipseudomonal penicillin)、β-内酰胺酶抑制剂、天然青霉素、青霉素酶和耐青霉素(resistant penicillin))、喹诺酮类、磺酰胺类、四环素类和泌尿抗感染剂。
在一些实施方案中，受试者(例如人)接受本发明的免疫细胞或群体的初始施用，和一次或多次后续施用，其中一次或多次后续施用是在前次施用后少于15天，例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天施用。
在一些实施方案中，将或将要将治疗有效量的本发明的免疫细胞施用给受试者。
在一些实施方案中，施用给受试者的本发明的免疫细胞群体的免疫细胞的量是至少102、103、104、105、106、107、108或109个细胞。
在一些实施方案中，施用给受试者的本发明的免疫细胞群体的免疫细胞的量在约102至约109、约103至约108、约104至约107或约105至约106个细胞的范围内。
在一些实施方案中，施用给受试者的本发明的免疫细胞群体的免疫细胞的量在约102至约109、约102至108、约102至107、约102至106、约102至105、约102至104、约102至103个细胞的范围内。在一些实施方案中，施用给受试者的本发明的免疫细胞群体的免疫细胞的量为约102、约103、约104、约105、约106、约107、约108或约109个细胞。
在一些实施方案中，施用给受试者的本发明的免疫细胞群体的免疫细胞的量为至少102、103、104、105、106、107、108或109个细胞/kg体重。
在一些实施方案中，施用给受试者的本发明的免疫细胞群体的免疫细胞的量在约102至109个细胞/kg体重或103至108个细胞/kg体重的范围内，包括在范围内的所有整数值。
在一些实施方案中，受试者每周接受不止一次的本发明的免疫细胞群体施用，例如，每周向受试者施用本发明的Treg细胞群体2、3或4次。
在一些实施方案中，将Treg细胞群体与活性剂(active agent)组合施用给有此需要的受试者。根据一些实施方案，在施用活性剂之前、同时或之后施用免疫细胞群体。
在一些实施方案中，可能需要向受试者施用本发明的激活的免疫细胞，并随后再抽血(或进行单采术)，根据本发明激活其中的T细胞，并将这些激活和扩增的免疫细胞再输注到受试者体内。这个过程可以每几周进行多次。在某些实施方案中，免疫细胞可以通过10cc至400cc的抽血被激活。在某些实施方案中，免疫细胞通过20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的抽血被激活。不受理论的束缚，使用这种多次抽血/多次再输注方案可以用于选出某些免疫细胞群体。
应当理解，本文所述的CAR、细胞群体和组合物可以用于本文所述的治疗方法中，可以用作本文所述的药物，可以用于本文所述的治疗，和/或可用于制造本文所述治疗的药物。
制品和试剂盒
本发明还提供了包含任何本文所述的核酸、载体、细胞群体或组合物的制品，以及用于制造所述制品的方法。
此外，本发明提供了于合适容器中包含任何本文所述的核酸、载体、细胞群体或组合物的试剂盒。
实施方案
下面列出了本发明的具体的实施方案。
1.嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
-至少一个细胞外结合结构域，
-任选至少一个细胞外铰链结构域，
-至少一个跨膜结构域，
-至少一个细胞内结构域，
其中至少一个细胞内结构域包含任选至少一个共刺激性细胞内信号传导结构域和至少一个第一细胞内信号传导结构域，且
其中
-至少一个跨膜结构域是人TNFR2跨膜结构域或其片段或变体，或任意跨膜结构域或其片段或变体，或其组合，和/或
-至少一个共刺激性细胞内信号传导结构域是人TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体，或任意共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体，或其组合，且
其中跨膜结构域和共刺激性细胞内信号传导结构域中的至少一个是TNFR2跨膜结构域或其片段或变体或TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体。
2.如实施方案1所述的CAR，其中所述人TNFR2跨膜结构域包含来自序列SEQ IDNO：22或来自与SEQ ID NO：22具有至少约70％同一性的序列的至少2个氨基酸，优选来自SEQ ID NO：22或来自与SEQ ID NO：22具有至少约70％同一性的至少2个连续氨基酸。
3.如实施方案1或实施方案2所述的CAR，其中所述人TNFR2跨膜结构域与至少一个其他跨膜结构域组合。
4.如实施方案1至3中任一项所述的CAR，其中所述人TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域包含来自序列SEQ ID NO：34或来自与SEQ ID NO：34具有至少约70％同一性的序列的至少2个氨基酸，优选来自SEQ ID NO：34或来自与SEQ ID NO：34具有至少约70％同一性的序列的至少2个连续氨基酸。
5.如实施方案1至4中任一项所述的CAR，其中所述TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域与至少一个其他共刺激性细胞内信号传导结构域组合。
6.如实施方案1至5中任一项所述的CAR，其中第一细胞内信号传导结构域包含免疫细胞第一细胞内信号传导结构域，优选人CD3的T细胞第一细胞内信号传导结构域，更优选具有序列SEQ ID NO：28、29、30或31或与SEQ ID：28、29、30或31具有至少约70％同一性的序列的人CD3ζ的T细胞第一细胞内信号传导结构域。
7.如实施方案1至6中任一项所述的CAR，其中铰链结构域是人CD8的铰链区，优选SEQ ID NO：14或与SEQ ID NO：14具有至少约70％同一性的序列。
8.如实施方案1至7中任一项所述的CAR，其中CAR包含至少一个TNFR2跨膜结构域和至少一个细胞内结构域，其中所述细胞内结构域包含任选至少一个共刺激性细胞内信号传导结构域和至少一个免疫细胞第一细胞内信号传导结构域。
9.如实施方案1至7中任一项所述的CAR，其中CAR包含至少一个跨膜结构域和至少一个细胞内结构域，其中所述细胞内结构域包含至少一个TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域和至少一个免疫细胞第一细胞内信号传导结构域。
10.编码如实施方案1至9中任一项所述的CAR的核酸序列。
11.包含实施方案10所述的核酸序列的载体。
12.包含实施方案10的核酸序列，或实施方案11的载体，或表达实施方案1至9中任一项所述的CAR的免疫细胞群体。
13.如实施方案12所述的免疫细胞群体，其中所述免疫细胞群体选自由以下组成的组：T细胞、自然杀伤(NK)细胞、γδT细胞、双阴性(DN)细胞、调节性免疫细胞、调节性T细胞、效应免疫细胞、效应T细胞、B细胞和髓系来源的细胞，及其任意组合。
14.包含至少一种如实施方案12至13中任一项所述的细胞群体的组合物。
15.如实施方案14所述的组合物，其是药物组合物并且进一步包含至少一种药学上可接受的赋形剂。
16.一种治疗有此需要的受试者中的疾病或病症的方法，其包括向受试者施用至少一种如实施方案12或13所述的免疫细胞群体或如实施方案14或15所述的组合物。
17.如实施方案16所述的方法，其中所述方法是细胞治疗方法。
18.如实施方案16或17所述的方法，其中所述疾病或病症包括炎性疾病、自身免疫疾病、过敏性疾病、器官移植病况、癌症和感染性疾病。
19.如实施方案16至18中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞群体是调节性免疫细胞群体或Treg细胞群体，并且其中所述疾病或病症是炎性疾病、自身免疫疾病、过敏性疾病或器官移植病况，优选选自移植排斥和移植物抗宿主病。
20.如实施方案16至18中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞群体是T效应细胞群体、NK细胞群体或γδ细胞群体，且其中所述疾病或病症是癌症或感染性疾病。
本发明涉及嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
-至少一个细胞外结合结构域，
-任选至少一个细胞外铰链结构域，
-至少一个跨膜结构域(例如，人TNFR2跨膜结构域或其片段或变体，任意跨膜结构域或其片段或变体，或其任意组合)，和
-至少一个细胞内结构域(包含至少一个第一细胞内信号传导结构域并任选包含至少一个共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体，其中至少一个共刺激性细胞内信号传导结构域是人TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体，任意共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体，或其任意组合)，
其中跨膜结构域是TNFR2跨膜结构域或其片段或变体，和/或共刺激性细胞内信号传导结构域是TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体。
在一些实施方案中，所述人TNFR2跨膜结构域或其片段或变体包含来自SEQ IDNO：22的序列或来自与SEQ ID NO：22具有至少约70％同一性的序列的至少2个氨基酸(例如，至少2个连续氨基酸)。
在一些实施方案中，所述人TNFR2跨膜结构域或其片段或变体与至少一个其他跨膜结构域或其片段或变体组合。
在一些实施方案中，所述人TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其变体或片段包含来自SEQ ID NO：34的序列或来自与SEQ ID NO：34具有至少约70％同一性的序列的至少2个氨基酸(例如，至少2个连续氨基酸)。
在一些实施方案中，所述TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其变体或片段与至少一个其他共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体组合。
在一些实施方案中，第一细胞内信号传导结构域包含免疫细胞第一细胞内信号传导结构域。在某些实施方案中，第一细胞内信号传导结构域是人CD3的T细胞第一细胞内信号传导结构域。在具体的实施方案中，第一细胞内信号传导结构域是具有SEQ ID NO：28、29、30或31的序列或与SEQ ID：28、29、30或31具有至少约70％同一性的序列的人CD3ζ的T细胞第一细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，铰链结构域是人CD8的铰链区，优选SEQ ID NO：14或与SEQ IDNO：14具有至少约70％同一性的序列。
在一些实施方案中，CAR包含至少一个TNFR2跨膜结构域或其片段或变体，和至少一个细胞内结构域，其中所述细胞内结构域包含至少一个免疫细胞第一细胞内信号传导结构域和任选地包含至少一个共刺激性细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，CAR包含至少一个跨膜结构域和至少一个细胞内结构域，其中所述细胞内结构域包含至少一个TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体和至少一个免疫细胞第一细胞内信号传导结构域。
本发明进一步涉及编码本发明所述的CAR的核酸序列。
本发明进一步涉及包含本发明所述的核酸序列的载体。
本发明进一步涉及包含本发明所述的核酸序列，或本发明所述的载体，或表达本发明所述的CAR的免疫细胞群体。在一些实施方案中，免疫细胞群体选自由以下组成的组：T细胞、自然杀伤(NK)细胞、γδT细胞、双阴性(DN)细胞、调节性免疫细胞、调节性T细胞、效应免疫细胞、效应T细胞、B细胞和髓系来源的细胞，及其任意组合。
本发明进一步涉及包含至少一种本发明所述的细胞群体的组合物。在一些实施方案中，组合物是药物组合物，且进一步包含至少一种药学上可接受的赋形剂。
本发明进一步涉及一种治疗有此需要的受试者中的疾病或病症的方法，其包括向受试者施用至少一种本发明所述的细胞群体或组合物。在一些实施方案中，所述方法是细胞治疗方法。在一些实施方案中，所述疾病或病症包括炎性疾病、自身免疫疾病、过敏性疾病、器官移植病况、癌症和感染性疾病。在一些实施方案中，细胞群体是调节性免疫细胞群体或Treg细胞群体，且所述疾病或病症是炎性疾病、自身免疫疾病、过敏性疾病或器官移植病况(例如，移植排斥或移植物抗宿主病)。在一些实施方案中，免疫细胞群体是T效应细胞群体、NK细胞群体或γδ细胞群体，且所述疾病或病症是癌症或感染性疾病。
除非本文另有定义，否则与本公开结合使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面描述了示例性方法和材料，与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料也可以用于本公开的实践或检测中。在有冲突的情况下，以本说明书，包括定义为准。通常，本文所述的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、分析化学、合成有机化学、医药和药物化学以及蛋白和核酸化学和杂交相关的命名法和技术是本领域公知的和常用的那些。酶促反应和纯化技术依据制造商的说明书进行，如本领域通常所做的或如本文所述的。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。贯穿整个说明书和实施方案，词语“具有”和“包含”(has，have，comprise)将理解为暗指涵盖所示整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。应当理解，本文所述的本发明的方面和变化包括“由...组成”和/或“基本上由...组成”的方面和变化。本文提及的所有出版物和其他参考文献通过引用以其整体并入本文。尽管本文引用了许多文件，但这种引用并不意味着承认这些文件中的任何文件构成本领域公知常识的一部分。
实施例
通过以下实施例进一步说明本发明。
实施例1：TNFR2衍生的CAR-Treg
材料与方法
PBMC的分离
匿名健康供体的血细胞由Etablissement
Figure BDA0003013334950001411
du Sang(EFS)遵循EFS指南并征得了供体的知情同意后收集。采血后第二天，通过Ficoll梯度离心从血沉棕黄层(buffycoat)中分离出外周血单核细胞(PBMC)，这使得能够去除血液产物中不想要的部分，例如粒细胞、血小板和残留的红细胞污染物。然后如下所述分离感兴趣的细胞。
FoxP3 Treg的分离
使用人CD4+CD127低CD25+调节性T细胞分离试剂盒(StemCell)，按照制造商的说明书分离CD4+CD25+CD127低Treg。简而言之，首先使用EasySepTM Releasable RapidSpheresTM通过无柱免疫磁性阳性选择从400-500x106个PBMC中分离出CD25+细胞。然后，从EasySepTM分离出的CD25+细胞中去除结合的磁性颗粒，并靶向清除不需要的非Treg。最终分离出的部分含有表达高水平的FoxP3并可立即用于下游应用的高度纯化的CD4+CD127低CD25+细胞。
自体B细胞的分离
使用人B细胞分离试剂盒(StemCell)，按照制造商的说明书分离自体CD19+CD20+B细胞。简而言之，通过免疫磁性阴性选择从200x106个PBMC中分离出CD19+CD20+B细胞。分离后，立即冷冻细胞以进一步用作CD19+CD20+呈递细胞。
CD4+CD25-常规T细胞的分离
通过进行调节性T细胞分离试剂盒(StemCell)的可选方案分离CD4+CD25-T细胞，这可以分离CD4+CD25-细胞用于与Treg平行的功能性研究。
分离的Treg的激活和培养
激活分离的Treg细胞并培养9天。简而言之，在第0天，在24孔板(Costar)中将Treg细胞(0.5x106)培养在含有人转铁蛋白(OZYME)并补充有1000U/mL IL-2(Euromedex)和100nM雷帕霉素(Sigma-Aldrich)的Xvivo15无血清培养基中。使用来自Life Technology的抗CD3/抗CD28 Dynabead(每孔0.5x106个珠子)进行多克隆激活。在第2、4或5天，以及第7或8天，细胞使用补充有1000U/mL IL-2的新鲜培养基。最后，在第8或9天，回收、计数并重新激活细胞。
转导方案
在Treg激活后2天，用嵌合抗原受体(见下)转导。简而言之，通过每孔加入0.5x107个转导单位(TU)/ml来进行转导。在37℃下6小时后，通过冲洗去除病毒颗粒。然后将板在37℃和5％CO2下一起孵育。五天后，通过在流式细胞术中测量GFP阳性细胞的百分比来分析转导效率。
CAR表达的定量
通过用缀合APC的蛋白L或针对HA标记的CAR的缀合APC的抗血凝素(HA)抗体标记CAR，进行细胞表面CAR表达的定量，并使用流式细胞术进行分析。
通过蛋白质印迹分析进行总CAR表达的定量。简而言之，将5×104个转导的Treg或非转导的(“空白”)Treg在RIPA缓冲液中裂解，在变性条件下进行SDS-PAGE，并在PVDF膜上印迹。然后，用CD3ζ特异性抗体(抗CD247，BD Pharmingen)对表达CAR的CD3ζ以及内源性CD3ζ进行染色。最后，洗涤膜并用β-肌动蛋白抗体再次探测作为上样对照。使用Image J软件来定量条带强度。
用于转导的CAR构建体
设计了如下的CAR：其包含TNFR2、TNFR1或CD8跨膜(TM)和共刺激性细胞内信号传导结构域，串联有CD3ζ，并结合有针对CD19(FMC63)、CD20(B9E9)和/或IL-23R(14-11-D07；PCT专利公开WO 2016/184570；SEQ ID NO：65)的典型scFv。表1和图1列出并描述了这个研究中使用的构建体。
表1：CAR构建体
Figure BDA0003013334950001421
Figure BDA0003013334950001431
更具体地，抗CD19 CAR由人CD8前导序列(aa1-22)、血凝素标签、针对人CD19的FMC63 scFv和衍生自人CD8α的接头(aa138-182)组成。
在接头之后，CD19-CAR(CD8TM/4-1BB)构建体由人CD8α的跨膜(TM)结构域(aa183-206)和人4-1BB的共刺激性细胞内信号传导结构域(aa214-255)以及CD3ζ(aa52-164)组成；而CD19-CAR(TNFR2)构建体由人TNFR2的TM和细胞内结构域(aa258-461)以及CD3ζ组成。
抗CD20 CAR由人CD8前导序列(aa1-22)、针对人CD20的B9E9 scFv、链霉亲和素标签和衍生自人CD8α的接头(aa138-182)组成。
在接头之后，CD20-CAR(CD8TM/4-1BB)构建体由人CD8α的TM结构域(aa183-206)和人4-1BB的共刺激性细胞内信号传导(aa214-255)以及CD3ζ(aa52-164)组成；同时：
-CD20-CAR(TNFR2)构建体包含人TNFR2的TM和共刺激性细胞内信号传导结构域(aa258-461)以及CD3ζ；且
-CD20-CAR(TNFR1)包含人TNFR1的TM和共刺激性细胞内信号传导结构域(aa212-455)和CD3ζ。
抗IL-23R CAR包含人CD8前导序列(aa1-22)、针对人IL-23R的scFv和衍生自人CD8α的接头(aa138-182)。
在接头之后，IL-23R-CAR(CD8TM/4-1BB)构建体包含人CD8α的跨膜结构域(aa183-206)和人4-1BB的共刺激性细胞内信号传导结构域(aa214-255)以及CD3ζ(aa52-164)；而IL-23R-CAR(TNFR2)构建体包含人TNFR2的跨膜和共刺激性细胞内信号传导结构域(aa258-461)和CD3ζ。
将所有CAR构建体与P2A接头和增强型绿色荧光蛋白(GFP)的开放阅读框同步克隆。
转导的Treg的表型分析
在培养的第9天，通过流式细胞术分析Treg表型，以确保转导过程不影响Treg状态。表2中列出了用于这个分析的标志物。
表2：材料和试剂
试剂 制造商 目录号
CD4 VioGreen Miltenyi 130-096-900
Helios eF450(HamIgG) eBioscience 48-9883-42
CD25PE Miltenyi 130-109-020
CD152(CTLA-4)PE/Cy7(mIgG2a) Biolegend 369614
FoxP3 AF647(mIgG1；2μl) BD 560045
CD127-APC-Vio770 Miltenyi 130-109-438
CAR的激活测定
在Jurkat-Lucia-NFAT细胞系(Invivogen)或在人原代Treg中评估CAR激活。对于报告细胞系，在CAR与CD19+Daudi细胞(1：1比例)接合后，通过监测Lucia荧光素酶活性(参见制造商的说明书)并使用GloMax光度计(Promega)来评估NFAT的激活。
对于Treg，在培养的第9天进行激活测定。简而言之，将0.05x106 Treg单独接种在96U底板中，或在抗CD28/抗CD3包被的珠子(以1：1的Treg与珠子的比例)存在下接种，或在新鲜解冻的自体B细胞或CD19+Daudi细胞(以1：1的Treg与珠子的比例)存在下接种，最终体积为200μL。在37℃、5％CO2下24小时后，对细胞进行CD4和CD69染色，然后使用流式细胞仪进行分析。相对于非转导的Treg细胞对CAR Treg细胞的CD69自发表达的监测可以测定递补信号传导强度。
T细胞增殖的抑制测定
在培养的第9天进行抑制测定。简而言之，通过使用抗CD28/抗CD3包被的珠子(以1：1的Treg与珠子的比例)的TCR，或通过使用新鲜解冻的自体B细胞(以1：1的Treg与珠子的比例)的TCR来回收、计数和激活Treg，或保持非激活，以评估其自发抑制活性。
平行地，将同种异体Tconv(常规T细胞)解冻，用染料450染色，并用抗CD28/抗CD3包被的珠子(以3：1的Tconv与珠子的比例)激活。第二天，在与非激活或激活的Treg(非转导或转导的)共培养之前，从Tconv中去除珠子。
在第3天，收获细胞，并通过流式细胞术确定Dye 450稀释度来评估Tconv的增殖。Tconv增殖的抑制百分比计算如下：
Figure BDA0003013334950001451
结果
转导效率和细胞表面的CAR表达
通过评估GFP阳性细胞的百分比来确定转导效率，并且通过评估重组蛋白L，针对CD20-CAR(CD8TM/4-1BB和TNFR2)和IL-23RCAR(CD8TM/4-1BB和TNFR2)的免疫球蛋白κ轻链结合蛋白，或针对CD19-CAR(CD8TM/4-1BB和TNFR2)的抗HA标签的抗体，来监测CAR表达。
表3显示了转导效率百分比和在细胞表面表达CAR的转导细胞百分比的结果(图2显示了原始数据的实例)，作为这个实施例中测试的所有供体的概述(n＝5)。
表3：转导效率和细胞表面的CAR表达
Figure BDA0003013334950001461
如图2和/或表3所示，CD19-CAR(CD8TM/4-1BB)、CD20-CAR(CD8TM/4-1BB)和IL-23R-CAR(CD8TM/4-1BB)转导的细胞在细胞表面具有95％以上的CAR，而CD19-CAR(TNFR2)、CD20-CAR(TNFR2)和IL-23R-CAR(TNFR2)转导的细胞在细胞表面表达46％至75％的CAR。另外，代表每个细胞的CAR数量的平均荧光强度(MFI)对于CD19-CAR(TNFR2)降低了约15倍，对于CD20-CAR(TNFR2)降低了约6倍，对于IL-23R-CAR(TNFR2)降低了约9倍。由于GFP的表达在所有实验条件下都相当，因此这种细胞表面CAR表达的强烈降低并不归因于较低的转导效率。
此外，如图3小图A所示，用CD20-CAR(CD8TM/4-1BB)转导的细胞在用CD3ζ抗体染色后表达了对应于CAR的62kD蛋白，用CD20-CAR(TNFR2)转导的细胞表达了82kD蛋白，而未转导的细胞仅标记有对应于内源CD3ζ的16kD条带。有趣的是，如使用流式细胞术观察到的(图2)，条带强度的定量显示了与CD20-CAR(CD8TM/4-1BB)相比，CD20-CAR(TNFR2)的表达较低(图3小图B)。
总的来说，结果证明了TNFR2细胞内结构域和TNFR2跨膜结构域出人意料地导致了CAR的整体表达降低，尤其是在细胞表面。
CAR特异性激活
与传统的4-1BB/CD3ζ构建体相比，在用包含针对三个不同的scFv靶标(CD19、CD20和IL-23R)的TNFR2结构域的CAR转导的Treg细胞中，观察到抗原依赖性递补信号传导的全体降低(图4小图A-C)。此外，尽管细胞表面上的TNFR2衍生的CAR表达(CD19、CD20或IL-23R)强烈降低(表3)，但仍保持了CAR特异性激活。
因此，这些结果证明，TNFR2跨膜和TNFR2细胞内结构域的存在出乎意料地导致了CAR Treg细胞中激活背景的强烈降低，并因此增加了CAR特异性激活和不依赖配体的递补信号传导之间的比例。由于三个不同的scFv是以相同的方式测试并运行的(CD19、CD20和IL-23R)，因此这个现象与感兴趣的scFv无关。
CAR介导的抑制活性
对于带有TNFR2衍生的结构域的CD19-CAR构建体，即使在细胞表面的CAR表达降低了15倍，也观察到抑制活性的CAR特异性触发与4-1BB衍生的构建体相当(图5小图A)。
最有趣的是，对于CD20-CAR和IL-23R-CAR构建体而言，虽然4-1BB衍生的构建体的自发抑制活性太强而无法凸显CAR介导的抑制活性，但TNFR2衍生的CAR构建体提供了强烈降低的抑制活性背景，这使得首次观察到了特定的CAR介导的阻抑活性(图5小图B和5C)。
总之，TNFR2/CD3ζ衍生的CAR中的不依赖配体的递补信号传导的降低使得首次观察到CD20-CAR和IL-23R-CAR介导的阻抑活性，而相同的与4-1BB/CD3ζ结构域的融合未观察到高于背景的活性。
实施例2：TNFR2衍生的CD19-CAR的比较
材料与方法
除了CAR构建体之外，材料与方法和在实施例1中描述的相同。在此，用CAR构建体转导以下两种类型的细胞：人Treg和Jurkat-Lucia-NFAT细胞。
用于转导的CAR构建体
表4和图6中列出并描述了在这个研究中使用的CAR构建体。
表4：CD19-CAR构建体
Figure BDA0003013334950001481
抗CD19 CAR包含人CD8前导序列(aa1-22)、针对人CD19的FMC63scFv、链霉亲和素标签和衍生自人CD8α的接头(aa138-182)。
在一些情况下，TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域是TNFR2结构域的片段，其中已在C末端去除了18个、59个、104个或151个氨基酸残基(分别为Δ18、Δ59、Δ104或Δ151)。TNFR2信号传导结构域可以细分成5个结构域，每个结构域对于触发各种信号传导通路的不同信号传导分子的相互作用都是重要的。另外，描述了某些结构域调节TNFR2的内吞作用(Ji et al.,Arterioscler Thromb Vasc Biol.32(9):2271-9(2012)。为了分析某个结构域是否负责相应的表型，构建了多个缺失突变体。缺失与定位的细胞内结构域一致，从C末端删除了TNFR2结构域。具体来说，在构建体TNFR2Δ18中删除结构域V；在TNFR2Δ59中删除结构域V和IV；在TNFR2Δ104中删除结构域V、IV和III，以及在TNFR2Δ151中删除结构域V、IV、III和II。表5中列出了这些结构域的推定功能：
表5：TNFR2结构域
结构域 推定功能
I 未知
II JNK激活，定位
III JNK激活，定位；TRAF2降解
IV TRAF1/2/3结合
V Bmx，酪氨酸激酶/Akt-激活/促进Traf2结合/NFkb信号传导
为了进一步剖析TNFR2跨膜结构域的影响，生成了具有CD8 TM和随后的TNFR2跨膜结构域的构建体，以及仅含有TNFR2 TM和随后的CD3z或膜杂交体(由不同量的CD8和TNFR2衍生的氨基酸组成)的构建体。
跨膜结构域的融合体包含整个或部分人TNFR2跨膜结构域，并融合有部分人CD8α跨膜结构域。表6中描述了实施例2中使用的融合氨基酸序列。
表6：CD19-CAR跨膜融合序列
Figure BDA0003013334950001491
Figure BDA0003013334950001501
结果
人Treg细胞表面的CD19-CAR表达
使用包含TNFR2跨膜结构域和任选整个TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段的CD19-CAR，用来确定TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域是否参与降低细胞表面的CAR表达。包含CD8跨膜结构域和4-1BB细胞内结构域的CD19-CAR用作对照。
使用包含TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域和任选TNFR2跨膜结构域或CD8/TNFR2融合跨膜结构域的CD19-CAR，用来确定TFNR2跨膜结构域是否参与降低细胞表面的CAR表达。包含TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域和CD8跨膜结构域的CD19-CAR用作对照。
如表7所示，使用包含TNFR2跨膜结构域的CAR和包含TNFR2细胞内结构域的CAR观察到细胞表面CAR表达降低，但包含CD8跨膜结构域和4-1BB细胞内结构域且不存在任何TNFR2结构域的CAR并未如此。
表7：没有激活时人Treg细胞表面的CD19-CAR表达
Figure BDA0003013334950001502
Figure BDA0003013334950001511
总的来说，这些结果表明，TNFR2跨膜和共刺激性细胞内信号传导结构域均参与降低人Treg细胞表面的CAR表达。
人Treg中的CD19-CAR特异性激活
使用包含TNFR2跨膜结构域和任选整个TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段的CD19-CAR，用以确定TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域是否参与CAR激活。包含4-1BB共刺激性细胞内信号传导结构域和CD8跨膜结构域的CD19-CAR用作对照。
使用包含TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域和任选TNFR2跨膜结构域或CD8/TNFR2融合跨膜结构域的CD19-CAR，用以确定TFNR2跨膜结构域是否参与CAR激活。包含4-1BB共刺激性细胞内信号传导结构域和CD8跨膜结构域的CD19-CAR用作对照。
如表8所示，使用包含TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域和CD8/TNFR2融合跨膜结构域的CAR，观察到通过CD69早期激活标志物的表达水平评估的递补信号转导的降低，但包含CD8跨膜结构域/4-1BB共刺激性细胞内信号传导结构域的CAR并未如此。尽管表达水平低，但CD19+Daudi细胞有效激活了TNFR2衍生的CAR。在未转导的细胞中，CD69表达背景在Daudi细胞不存在下为9％，或在Daudi细胞存在下为32％。
表8：人Treg中的CD19-CAR激活
Figure BDA0003013334950001512
Figure BDA0003013334950001521
Jurkat-T细胞细胞表面的CD19-CAR表达
与人Treg细胞一样，也使用表5中描述的CAR构建体分析在Jurkat-Lucia-NFAT细胞中CD19-CAR表达。这个报告细胞系衍生自永生化的人T淋巴细胞Jurkat细胞。
如表9所示，使用包含TNFR2跨膜结构域的CAR以及包含TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域的CAR，在Jurkat-T细胞中也观察到细胞表面的CAR表达的降低，但包含CD8跨膜结构域/4-1BB共刺激性细胞内信号传导结构域构建体的CAR并未如此。
表9：没有激活时Jurkat-T细胞细胞表面的CD19-CAR表达
Figure BDA0003013334950001522
Figure BDA0003013334950001531
这些结果表明，TNFR2跨膜和TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域均参与降低Jurkat-T细胞细胞表面上的CAR表达。
TNFR-c-末端缺失构建体表现出不同的表面表达图谱，并在Jurkat-NFAT细胞的CD3z信号传导中起作用
为了检测所创建的CD19-CAR构建体的完整性，在Jurkat NFAT-Lucia T细胞系中测定了表面表达水平和NFAT信号传导。
与CD8TM-41BB CAR相比，使用完整的TNFR2 CAR观察到细胞表面表达强烈降低(图7)。当将TNFR2-TM结构域替换为CD8 TM结构域时，这种表达水平的降低被部分消除。此外，TNFR2结构域V、IV和III的缺失并未改变来自TNFR2结构域的细胞表面表达。然而，在结构域II和I缺失之后，表达水平增加到使用4-1BB构建体观察到的水平的一半。同时，所有构建体继续展现依赖靶标的NFAT信号传导。这些结果共同表明，TNFR2结构域I和II有助于降低TNFR2衍生的CAR中的细胞表面表达，并且缺失突变体的减弱作用不是由于未折叠的蛋白，因为CAR仍然能够表现出依赖CD3z的NFAT-信号传导。
Jurkat-T细胞中的CD19-CAR特异性激活
还通过在与CD19+Daudi细胞一同孵育后测量CAR-配体接合后的NFAT激活，分析了Jurkat-Lucia-NFAT细胞中的D19-CAR特异性激活。
如表10所示，尽管表达水平低，但CD19+Daudi细胞有效激活了所有TNFR2衍生的CAR。
表10：Jurkat-Lucia-NFAT细胞的CD19-CAR激活
Figure BDA0003013334950001541
实施例3：评估具有衍生自多种TNFR受体(4-1BB、TNFR1和TNFR2)的不同跨膜和细胞内信号传导结构域的抗CD20 CAR
材料与方法
所使用的材料与方法和在实施例1中描述的相同。
结果
具有不同TNFR细胞内结构域的抗CD20 CAR的表达水平
在先前，和在本研究中，与具有4-1BB细胞内结构域的构建体相比，对于具有TNFR2跨膜和细胞内结构域的构建体观察到抗CD20 CAR表达降低(图8)。在这个研究中，使用人TNFR1的跨膜和细胞内结构域设计了具有TNFR衍生的信号传导结构域的新CAR(CD20-CAR(TNFR1TM-TNFR1-CD3z)-P2A-GFP的核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID NO：108和109)。如图8所示，与4-1BB衍生的CAR相比，这些新CAR在细胞表面的表达水平也低。然而，包含TNFR1衍生的序列的CAR是有毒的，并且强烈影响了FoxP3 Treg的存活(63％的存活率)。此外，活细胞/凋亡细胞以扩散谱表达TNFR1衍生的CAR(图8，左下图)。具有不同TNFR细胞内结构域的抗CD20 CAR的不依赖配体的递补信号传导和激活能力
通过监测未激活的CAR-Treg细胞上的CD69标志物表达，先前使用带有4-1BB细胞内结构域的抗CD20 CAR构建体观察到强烈的不依赖配体的递补信号传导。相比之下，对于带有TNFR2跨膜和细胞内结构域的抗CD20 CAR，这种递补信号传导大大降低。本研究表明，在所有TNFR衍生的CAR中(图9)，仅TNFR2衍生的CAR能够强烈降低递补信号传导(15％，相对于对照的11％)，而具有4-1BB和TNFR1序列的构建体的递补信号传导分别为约40％和32％。这个结果突出了TNFR2衍生的CAR特异性降低不依赖配体的递补信号传导的能力。
为了评估CAR激活，将CAR-Treg细胞与表达CD20 CAR配体的自体B细胞一起孵育24小时。如图9所示，在TNFR2衍生的CAR中观察到了最强力的CAR激活(2.5倍)，而所有其他CAR-Treg的激活都差(低于1.8倍)。
通过监测在B细胞不存在或存在(B细胞)下与CAR-Treg共培养的Tconv细胞的增殖，来评估CAR-Treg细胞的抑制活性(图10)。再一次，传统抗CD20 CAR构建体(CD8 TM/4-1BB)的自发抑制活性太强而无法突出CAR介导的抑制活性。相比之下，TNFR2衍生的抗CD20CAR可以观察到CAR介导的抑制活性。TNFR1衍生的抗CD20 CAR表现出非常弱的抑制活性。
为了更好地定义和比较各种TNFR衍生的CAR的CAR效力，将抑制Tconv增殖的能力表示为共培养物中存在的CAR-Treg细胞的绝对数量的函数。如图11所示，TNFR1衍生的CAR效率极低(14750个CAR-Treg以触发50％抑制)。
这些结果证明，在不同的人TNFR候选者中，在CAR中使用TNFR2跨膜和TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域是对于设计具有非常低的不依赖配体的递补信号传导和最佳的依赖CAR的Treg激活和抑制活性的CAR-Treg的最佳组合。
实施例4：Treg标志物/表型
材料与方法
所使用的材料与方法和在实施例1中描述的相同。
结果
培养物中的抗IL-23R CAR-Treg表型
下表(表11)中显示了第9天的IL-23R CAR-Treg表型的结果。结果表示为对每种标志物呈阳性的细胞的百分比。
表11：第9天的IL-23R CAR-Treg表型
Figure BDA0003013334950001561
Figure BDA0003013334950001571
有趣的是，我们观察到转导在细胞表面高度表达的IL-23R-CAR(4-1BB/CD3z)的Treg表现出稳定性丧失，这主要表现为FoxP3、Helios和CD62L的减少(粗体)和CD127(粗体)的增加。然而，用IL-23R-CAR(TNFR2/CD3z)转导的Treg，其细胞表面表达降低了9倍(4-1BB衍生的CAR为191.1±53.2，而TNFR2衍生的CAR为20.5±3.4；参见表3)，突显了培养9天后稳健的Treg表型。
培养物中的抗CD20 CAR-Treg表型
下表(表12)中显示了第15天的抗CD20 CAR-Treg表型的结果。结果表示为对每种标志物呈阳性的细胞的百分比或平均荧光。
表12：抗CD20 CAR-Treg表型
Figure BDA0003013334950001581
有趣的是，Treg表型在不同的CAR-Treg构建体和仅用GFP转导的对照之间没有统计学上的差异。
实施例5：CAR-Treg的体内使用
材料与方法
GvHD
在注射HLA-A2+PBMC的前一天，通过IP注射30mg/kg的白消安来对总共23只NSG小鼠(8周)进行处理，以有利于人细胞的植入。一天后(第0天)，对小鼠IV注射HLA-A*02+人PBMC(每只小鼠5x106个PBMC)，并以1：1的PBMC：CAR-Treg比例注射人HLA-A2 CAR Treg。每周三次对小鼠进行称重(BW)，并评估GvHD得分。每周采集血样。在处死时，还分析了脾和肺。从HLA-A2阴性健康志愿者中分离出人Treg，并如前所述地进行转导。
结果
在GvHD小鼠模型中测试了包含CD28、TNFR2或TNFR2+4-1BB共信号传导结构域的CAR Treg的体内活性。如前所述地在CD4+CD25+CD127低、CD45RA+人Tregs中转导了三种不同的CAR构建体(图12)。
通过GFP阳性细胞表达百分比来评估转导效率，并使用
Figure BDA0003013334950001591
监测CAR表达。如图13所示，用CD28或TNFR2或TNFR2+4-1BB HLA*A2CAR以27％、56％和34％转导了Treg。
三种不同的HLA*A2 CAR-Treg显示出CD4+CD45RA+FoxP3+CTLA-4+的稳健的Treg表型(图14)。
将HLA*A2 CAR-Treg以1：1的比例(PBMC：CAR-Treg)注射到NSG小鼠中。包含TNFR2、TNFR2+4-1BB或CD28共信号传导结构域的HLA*A2CAR-Treg均能够控制GvHD(图15)。
表13：序列
Figure BDA0003013334950001593
Figure BDA0003013334950001592
Figure BDA0003013334950001601
Figure BDA0003013334950001611
序列表
<110> 桑格摩生物治疗法国公司（SANGAMO THERAPEUTICS FRANCE）
<120>包含TNFR2结构域的新型CAR构建体
<130> 025297.WO003
<140>
<141>
<150> 62/717,234
<151> 2018-08-10
<160> 117
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的多肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="anti-CD19 ScFv"
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln
195 200 205
Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
210 215 220
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 2
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的多肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="FMC63"
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 3
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的多肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="利妥昔单抗"
<400> 3
Ser Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro
1 5 10 15
Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe
20 25 30
Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ser Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gln Val
115 120 125
Gln Leu Arg Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val
130 135 140
Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met
145 150 155 160
His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala
165 170 175
Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly
180 185 190
Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln
195 200 205
Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
Ser His Tyr Gly Ser Asn Tyr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
225 230 235 240
Leu Thr Val Ser Ser
245
<210> 4
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的多肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="anti-CD20 ScFv"
<400> 4
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Thr Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asp Val Met Gly Val Asp Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Pro Gly
130 135 140
Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu
145 150 155 160
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Pro Ser Ser Thr Leu
165 170 175
His Tyr Ala Asp Arg Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
180 185 190
Pro Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Lys Leu Pro Ser Leu Cys Tyr
195 200 205
Gly Leu Leu Gly Pro Arg Asp His Val His Arg Leu Leu Lys His His
210 215 220
His His His His Leu Glu Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Thr
225 230 235 240
Thr Asp Ala Ala His Pro Gly Arg Ser Val Val Pro Ala Leu Leu Pro
245 250 255
Leu Leu Ala Gly Thr Leu Leu Leu Leu Glu Thr Ala Thr Ala Pro
260 265 270
<210> 5
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的多肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="anti-CD20 ScFv"
<400> 5
Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser
20 25 30
Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys
50 55 60
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ala Gln Leu Arg Pro Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Lys Ile Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Asp
130 135 140
Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu
145 150 155 160
Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
165 170 175
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala
180 185 190
Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp
210 215 220
Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ile Ser Asn Pro Pro Thr Phe
225 230 235 240
Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
245
<210> 6
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的多肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="anti-CD20 ScFv"
<400> 6
Ser Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro
1 5 10 15
Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe
20 25 30
Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ser Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gln Val
115 120 125
Gln Leu Arg Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val
130 135 140
Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met
145 150 155 160
His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala
165 170 175
Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly
180 185 190
Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln
195 200 205
Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
Ser His Tyr Gly Ser Asn Tyr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
225 230 235 240
Leu Thr Val Ser Ser
245
<210> 7
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的多肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="anti-desmo 3 (结构域 1-4)"
<400> 7
Glu Trp Val Lys Phe Ala Lys Pro Cys Arg Glu Gly Glu Asp Asn Ser
1 5 10 15
Lys Arg Asn Pro Ile Ala Lys Ile Thr Ser Asp Tyr Gln Ala Thr Gln
20 25 30
Lys Ile Thr Tyr Arg Ile Ser Gly Val Gly Ile Asp Gln Pro Pro Phe
35 40 45
Gly Ile Phe Val Val Asp Lys Asn Thr Gly Asp Ile Asn Ile Thr Ala
50 55 60
Ile Val Asp Arg Glu Glu Thr Pro Ser Phe Leu Ile Thr Cys Arg Ala
65 70 75 80
Leu Asn Ala Gln Gly Leu Asp Val Glu Lys Pro Leu Ile Leu Thr Val
85 90 95
Lys Ile Leu Asp Ile Asn Asp Asn Pro Pro Val Phe Ser Gln Gln Ile
100 105 110
Phe Met Gly Glu Ile Glu Glu Asn Ser Ala Ser Asn Ser Leu Val Met
115 120 125
Ile Leu Asn Ala Thr Asp Ala Asp Glu Pro Asn His Leu Asn Ser Lys
130 135 140
Ile Ala Phe Lys Ile Val Ser Gln Glu Pro Ala Gly Thr Pro Met Phe
145 150 155 160
Leu Leu Ser Arg Asn Thr Gly Glu Val Arg Thr Leu Thr Asn Ser Leu
165 170 175
Asp Arg Glu Gln Ala Ser Ser Tyr Arg Leu Val Val Ser Gly Ala Asp
180 185 190
Lys Asp Gly Glu Gly Leu Ser Thr Gln Cys Glu Cys Asn Ile Lys Val
195 200 205
Lys Asp Val Asn Asp Asn Phe Pro Met Phe Arg Asp Ser Gln Tyr Ser
210 215 220
Ala Arg Ile Glu Glu Asn Ile Leu Ser Ser Glu Leu Leu Arg Phe Gln
225 230 235 240
Val Thr Asp Leu Asp Glu Glu Tyr Thr Asp Asn Trp Leu Ala Val Tyr
245 250 255
Phe Phe Thr Ser Gly Asn Glu Gly Asn Trp Phe Glu Ile Gln Thr Asp
260 265 270
Pro Arg Thr Asn Glu Gly Ile Leu Lys Val Val Lys Ala Leu Asp Tyr
275 280 285
Glu Gln Leu Gln Ser Val Lys Leu Ser Ile Ala Val Lys Asn Lys Ala
290 295 300
Glu Phe His Gln Ser Val Ile Ser Arg Tyr Arg Val Gln Ser Thr Pro
305 310 315 320
Val Thr Ile Gln Val Ile Asn Val Arg Glu Gly Ile Ala Phe Arg Pro
325 330 335
Ala Ser Lys Thr Phe Thr Val Gln Lys Gly Ile Ser Ser Lys Lys Leu
340 345 350
Val Asp Tyr Ile Leu Gly Thr Tyr Gln Ala Ile Asp Glu Asp Thr Asn
355 360 365
Lys Ala Ala Ser Asn Val Lys Tyr Val Met Gly Arg Asn Asp Gly Gly
370 375 380
Tyr Leu Met Ile Asp Ser Lys Thr Ala Glu Ile Lys Phe Val Lys Asn
385 390 395 400
Met Asn Arg Asp Ser Thr Phe Ile Val Asn Lys Thr Ile Thr Ala Glu
405 410 415
Val Leu Ala Ile Asp Glu Tyr Thr Gly Lys Thr Ser Thr Gly Thr Val
420 425 430
Tyr Val Arg Val Pro Asp Phe Asn Asp
435 440
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的多肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="接头"
<400> 8
Ala Gly Ser Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Thr Gly Gly Ser Thr Thr
1 5 10 15
<210> 9
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="接头"
<400> 9
Gly Thr Thr Ala Ala Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ser Gly Ala
1 5 10 15
<210> 10
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的多肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="接头"
<400> 10
Ser Ser Ala Thr Ala Thr Ala Gly Thr Gly Ser Ser Thr Gly Ser Thr
1 5 10 15
<210> 11
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="接头"
<400> 11
Thr Ser Gly Ser Thr Gly Thr Ala Ala Ser Ser Thr Ser Thr Ser Thr
1 5 10 15
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的多肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="接头"
<400> 12
ggtggcggag gttctggagg tggaggttcc 30
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<220>
<221> 来源
<223> /注意="KIR2DS2铰链结构域"
<400> 13
Lys Ile Arg Arg Asp Ser Ser
1 5
<210> 14
<211> 45
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<220>
<221> 来源
<223> /注意="CD8铰链结构域"
<400> 14
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 15
<211> 135
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<220>
<221> 来源
<223> /注意="CD8铰链结构域"
<400> 15
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 16
<211> 230
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<220>
<221> 来源
<223> /注意="IgG4铰链结构域"
<400> 16
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys Met
225 230
<210> 17
<211> 690
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<220>
<221> 来源
<223> /注意="IgG4铰链结构域"
<400> 17
gagagcaagt acggccctcc ctgcccccct tgccctgccc ccgagttcct gggcggaccc 60
agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagccg gacccccgag 120
gtgacctgtg tggtggtgga cgtgtcccag gaggaccccg aggtccagtt caactggtac 180
gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag accaagcccc gggaggagca gttcaatagc 240
acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggaa 300
tacaagtgta aggtgtccaa caagggcctg cccagcagca tcgagaaaac catcagcaag 360
gccaagggcc agcctcggga gccccaggtg tacaccctgc cccctagcca agaggagatg 420
accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 480
gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 540
gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc cggctgaccg tggacaagag ccggtggcag 600
gagggcaacg tctttagctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 660
aagagcctga gcctgtccct gggcaagatg 690
<210> 18
<211> 282
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<220>
<221> 来源
<223> /注意="IgD铰链结构域"
<400> 18
Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala
1 5 10 15
Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala
20 25 30
Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
35 40 45
Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln
65 70 75 80
Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly
85 90 95
Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val
100 105 110
Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly
115 120 125
Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn
130 135 140
Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro
145 150 155 160
Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys
165 170 175
Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser
180 185 190
Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu
195 200 205
Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro
210 215 220
Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser
225 230 235 240
Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr
245 250 255
Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg
260 265 270
Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His
275 280
<210> 19
<211> 847
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<220>
<221> 来源
<223> /注意="IgD铰链结构域"
<400> 19
aggtggcccg aaagtcccaa ggcccaggca tctagtgttc ctactgcaca gccccaggca 60
gaaggcagcc标签ccaaagc tactactgca cctgccacta cgcgcaatac tggccgtggc 120
ggggaggaga agaaaaagga gaaagagaaa gaagaacagg aagagaggga gaccaagacc 180
cctgaatgtc catcccatac ccagccgctg ggcgtctatc tcttgactcc cgcagtacag 240
gacttgtggc ttagagataa ggccaccttt acatgtttcg tcgtgggctc tgacctgaag 300
gatgcccatt tgacttggga ggttgccgga aaggtaccca cagggggggt tgaggaaggg 360
ttgctggagc gccattccaa tggctctcag agccagcact caagactcac ccttccgaga 420
tccctgtgga acgccgggac ctctgtcaca tgtactctaa atcatcctag cctgccccca 480
cagcgtctga tggcccttag agagccagcc gcccaggcac cagttaagct标签cctgaat 540
ctgctcgcca gtagtgatcc cccagaggcc gccagctggc tcttatgcga agtgtccggc 600
tttagcccgc ccaacatctt gctcatgtgg ctggaggacc agcgagaagt gaacaccagc 660
ggcttcgctc cagcccggcc cccaccccag ccgggttcta ccacattctg ggcctggagt 720
gtcttaaggg tcccagcacc acctagcccc cagccagcca catacacctg tgttgtgtcc 780
catgaagata gcaggaccct gctaaatgct tctaggagtc tggaggtttc ctacgtgact 840
gaccatt 847
<210> 20
<211> 39
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<220>
<221> 来源
<223> /注意="CD28铰链结构域"
<400> 20
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
35
<210> 21
<211> 117
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<220>
<221> 来源
<223> /注意="CD28铰链结构域"
<400> 21
attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60
catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagccc 117
<210> 22
<211> 30
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<220>
<221> 来源
<223> /注意="TNFR2 TM结构域"
<400> 22
Phe Ala Leu Pro Val Gly Leu Ile Val Gly Val Thr Ala Leu Gly Leu
1 5 10 15
Leu Ile Ile Gly Val Val Asn Cys Val Ile Met Thr Gln Val
20 25 30
<210> 23
<211> 90
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<220>
<221> 来源
<223> /注意="TNFR2 TM结构域"
<400> 23
ttcgctcttc cagttggact gattgtgggt gtgacagcct tgggtctact aataatagga 60
gtggtgaact gtgtcatcat gacccaggtg 90
<210> 24
<211> 24
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<220>
<221> 来源
<223> /注意="CD8 TM"
<400> 24
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 25
<211> 72
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<220>
<221> 来源
<223> /注意="CD8 TM"
<400> 25
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gc 72
<210> 26
<211> 27
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<220>
<221> 来源
<223> /注意="CD28 TM"
<400> 26
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 27
<211> 81
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<220>
<221> 来源
<223> /注意="CD28 TM"
<400> 27
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt g 81
<210> 28
<211> 112
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<220>
<221> 来源
<223> /注意="CD3 zeta"
<400> 28
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 29
<211> 112
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<220>
<221> 来源
<223> /注意="CD3 zeta"
<400> 29
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 30
<211> 113
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<220>
<221> 来源
<223> /注意="CD3 zeta"
<400> 30
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210> 31
<211> 113
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<220>
<221> 来源
<223> /注意="CD3 zeta"
<400> 31
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210> 32
<211> 336
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<220>
<221> 来源
<223> /注意="CD3 zeta"
<400> 32
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 33
<211> 336
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<220>
<221> 来源
<223> /注意="CD3 zeta"
<400> 33
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 34
<211> 174
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<220>
<221> 来源
<223> /注意="TNFR2细胞内的"
<400> 34
Lys Lys Lys Pro Leu Cys Leu Gln Arg Glu Ala Lys Val Pro His Leu
1 5 10 15
Pro Ala Asp Lys Ala Arg Gly Thr Gln Gly Pro Glu Gln Gln His Leu
20 25 30
Leu Ile Thr Ala Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ser Ser Ala
35 40 45
Ser Ala Leu Asp Arg Arg Ala Pro Thr Arg Asn Gln Pro Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Val Glu Ala Ser Gly Ala Gly Glu Ala Arg Ala Ser Thr Gly Ser
65 70 75 80
Ser Asp Ser Ser Pro Gly Gly His Gly Thr Gln Val Asn Val Thr Cys
85 90 95
Ile Val Asn Val Cys Ser Ser Ser Asp His Ser Ser Gln Cys Ser Ser
100 105 110
Gln Ala Ser Ser Thr Met Gly Asp Thr Asp Ser Ser Pro Ser Glu Ser
115 120 125
Pro Lys Asp Glu Gln Val Pro Phe Ser Lys Glu Glu Cys Ala Phe Arg
130 135 140
Ser Gln Leu Glu Thr Pro Glu Thr Leu Leu Gly Ser Thr Glu Glu Lys
145 150 155 160
Pro Leu Pro Leu Gly Val Pro Asp Ala Gly Met Lys Pro Ser
165 170
<210> 35
<211> 522
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<220>
<221> 来源
<223> /注意="TNFR2细胞内的"
<400> 35
aaaaagaagc ccttgtgcct gcagagagaa gccaaggtgc ctcacttgcc tgcagataag 60
gccaggggta cacagggtcc cgagcagcag cacctcctga tcacagcgcc gagctccagc 120
agcagctccc tggagagctc ggccagtgcg ctagacagaa gggcccccac tcggaaccag 180
ccacaggcac caggcgtgga ggcgagtggg gctggggagg cgagggcaag caccgggagc 240
tcagattctt cccctggtgg tcatggcacc caggtcaatg tcacctgtat cgtgaacgtc 300
tgtagcagct ctgaccacag ctcacagtgc tcctcccaag cctcgtccac aatgggagac 360
acagattcca gcccctcgga gtccccgaag gacgagcaag tacccttctc caaggaggaa 420
tgtgcctttc ggtcacagct ggagacgcca gagaccctgc tggggagcac cgaagagaag 480
cccctgcccc ttggagtgcc tgatgctggg atgaagccca gt 522
<210> 36
<211> 42
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<220>
<221> 来源
<223> /注意="4-1BB细胞内的"
<400> 36
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 37
<211> 126
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<220>
<221> 来源
<223> /注意="4-1BB细胞内的"
<400> 37
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 38
<211> 48
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<220>
<221> 来源
<223> /注意="CD27细胞内的"
<400> 38
Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro
1 5 10 15
Ala Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr
20 25 30
Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro
35 40 45
<210> 39
<211> 144
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<220>
<221> 来源
<223> /注意="CD27细胞内的"
<400> 39
caacgaagga aatatagatc aaacaaagga gaaagtcctg tggagcctgc agagccttgt 60
cgttacagct gccccaggga ggaggagggc agcaccatcc ccatccagga ggattaccga 120
aaaccggagc ctgcctgctc cccc 144
<210> 40
<211> 41
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<220>
<221> 来源
<223> /注意="CD28细胞内的"
<400> 40
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 41
<211> 123
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<220>
<221> 来源
<223> /注意="CD28细胞内的"
<400> 41
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 42
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="前导序列CD8"
<400> 42
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="标签"
<400> 43
Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 44
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="标签"
<400> 44
Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5 10
<210> 45
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的多肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="P2A标签"
<400> 45
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 46
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的多肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="GFP标签"
<400> 46
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 47
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="链霉亲和素标签"
<400> 47
Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Ser Gly
1 5 10
<210> 48
<211> 365
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的多肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="CD8 H-TNFR2TM-TNFR2-3z"
<400> 48
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Ala Leu
35 40 45
Pro Val Gly Leu Ile Val Gly Val Thr Ala Leu Gly Leu Leu Ile Ile
50 55 60
Gly Val Val Asn Cys Val Ile Met Thr Gln Val Lys Lys Lys Pro Leu
65 70 75 80
Cys Leu Gln Arg Glu Ala Lys Val Pro His Leu Pro Ala Asp Lys Ala
85 90 95
Arg Gly Thr Gln Gly Pro Glu Gln Gln His Leu Leu Ile Thr Ala Pro
100 105 110
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Ala Leu Asp Arg
115 120 125
Arg Ala Pro Thr Arg Asn Gln Pro Gln Ala Pro Gly Val Glu Ala Ser
130 135 140
Gly Ala Gly Glu Ala Arg Ala Ser Thr Gly Ser Ser Asp Ser Ser Pro
145 150 155 160
Gly Gly His Gly Thr Gln Val Asn Val Thr Cys Ile Val Asn Val Cys
165 170 175
Ser Ser Ser Asp His Ser Ser Gln Cys Ser Ser Gln Ala Ser Ser Thr
180 185 190
Met Gly Asp Thr Asp Ser Ser Pro Ser Glu Ser Pro Lys Asp Glu Gln
195 200 205
Val Pro Phe Ser Lys Glu Glu Cys Ala Phe Arg Ser Gln Leu Glu Thr
210 215 220
Pro Glu Thr Leu Leu Gly Ser Thr Glu Glu Lys Pro Leu Pro Leu Gly
225 230 235 240
Val Pro Asp Ala Gly Met Lys Pro Ser Gly Ser Arg Val Lys Phe Ser
245 250 255
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
260 265 270
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
275 280 285
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
290 295 300
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
305 310 315 320
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
325 330 335
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
340 345 350
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Ala Ser
355 360 365
<210> 49
<211> 347
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的多肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="CD8 H-TNFR2 TM-TNFR2del18-3z"
<400> 49
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Ala Leu
35 40 45
Pro Val Gly Leu Ile Val Gly Val Thr Ala Leu Gly Leu Leu Ile Ile
50 55 60
Gly Val Val Asn Cys Val Ile Met Thr Gln Val Lys Lys Lys Pro Leu
65 70 75 80
Cys Leu Gln Arg Glu Ala Lys Val Pro His Leu Pro Ala Asp Lys Ala
85 90 95
Arg Gly Thr Gln Gly Pro Glu Gln Gln His Leu Leu Ile Thr Ala Pro
100 105 110
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Ala Leu Asp Arg
115 120 125
Arg Ala Pro Thr Arg Asn Gln Pro Gln Ala Pro Gly Val Glu Ala Ser
130 135 140
Gly Ala Gly Glu Ala Arg Ala Ser Thr Gly Ser Ser Asp Ser Ser Pro
145 150 155 160
Gly Gly His Gly Thr Gln Val Asn Val Thr Cys Ile Val Asn Val Cys
165 170 175
Ser Ser Ser Asp His Ser Ser Gln Cys Ser Ser Gln Ala Ser Ser Thr
180 185 190
Met Gly Asp Thr Asp Ser Ser Pro Ser Glu Ser Pro Lys Asp Glu Gln
195 200 205
Val Pro Phe Ser Lys Glu Glu Cys Ala Phe Arg Ser Gln Leu Glu Thr
210 215 220
Pro Glu Thr Leu Leu Gly Ser Gly Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
225 230 235 240
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
245 250 255
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
260 265 270
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
275 280 285
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
290 295 300
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
305 310 315 320
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
325 330 335
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Ala Ser
340 345
<210> 50
<211> 306
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的多肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="CD8 H-TNFR2 TM-TNFR2del59-3z"
<400> 50
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Ala Leu
35 40 45
Pro Val Gly Leu Ile Val Gly Val Thr Ala Leu Gly Leu Leu Ile Ile
50 55 60
Gly Val Val Asn Cys Val Ile Met Thr Gln Val Lys Lys Lys Pro Leu
65 70 75 80
Cys Leu Gln Arg Glu Ala Lys Val Pro His Leu Pro Ala Asp Lys Ala
85 90 95
Arg Gly Thr Gln Gly Pro Glu Gln Gln His Leu Leu Ile Thr Ala Pro
100 105 110
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Ala Leu Asp Arg
115 120 125
Arg Ala Pro Thr Arg Asn Gln Pro Gln Ala Pro Gly Val Glu Ala Ser
130 135 140
Gly Ala Gly Glu Ala Arg Ala Ser Thr Gly Ser Ser Asp Ser Ser Pro
145 150 155 160
Gly Gly His Gly Thr Gln Val Asn Val Thr Cys Ile Val Asn Val Cys
165 170 175
Ser Ser Ser Asp His Ser Ser Gln Cys Ser Ser Gln Ala Ser Gly Ser
180 185 190
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
195 200 205
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
210 215 220
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
225 230 235 240
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
245 250 255
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
260 265 270
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
275 280 285
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
290 295 300
Ala Ser
305
<210> 51
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的多肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="CD8 H-TNFR2 TM-TNFR2del104-3z"
<400> 51
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Ala Leu
35 40 45
Pro Val Gly Leu Ile Val Gly Val Thr Ala Leu Gly Leu Leu Ile Ile
50 55 60
Gly Val Val Asn Cys Val Ile Met Thr Gln Val Lys Lys Lys Pro Leu
65 70 75 80
Cys Leu Gln Arg Glu Ala Lys Val Pro His Leu Pro Ala Asp Lys Ala
85 90 95
Arg Gly Thr Gln Gly Pro Glu Gln Gln His Leu Leu Ile Thr Ala Pro
100 105 110
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Ala Leu Asp Arg
115 120 125
Arg Ala Pro Thr Arg Asn Gln Pro Gln Ala Pro Gly Val Glu Ala Ser
130 135 140
Gly Gly Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
145 150 155 160
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
165 170 175
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
180 185 190
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
195 200 205
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
210 215 220
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
225 230 235 240
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
245 250 255
Pro Pro Arg Ala Ser
260
<210> 52
<211> 189
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的多肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="CD8 H-TNFR2 TM-3z"
<400> 52
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Ala Leu
35 40 45
Pro Val Gly Leu Ile Val Gly Val Thr Ala Leu Gly Leu Leu Ile Ile
50 55 60
Gly Val Val Asn Cys Val Ile Met Thr Gln Val Arg Val Lys Phe Ser
65 70 75 80
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
85 90 95
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
100 105 110
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
115 120 125
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
130 135 140
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
145 150 155 160
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
165 170 175
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Ala Ser
180 185
<210> 53
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的多肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="CD8 H-3z-TNFR2 TM"
<400> 53
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys Thr Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
65 70 75 80
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
85 90 95
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
100 105 110
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
115 120 125
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
130 135 140
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
145 150 155 160
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
165 170 175
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Ala Ser Lys Lys Lys Pro Leu Cys Leu
180 185 190
Gln Arg Glu Ala Lys Val Pro His Leu Pro Ala Asp Lys Ala Arg Gly
195 200 205
Thr Gln Gly Pro Glu Gln Gln His Leu Leu Ile Thr Ala Pro Ser Ser
210 215 220
Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Ala Leu Asp Arg Arg Ala
225 230 235 240
Pro Thr Arg Asn Gln Pro Gln Ala Pro Gly Val Glu Ala Ser Gly Ala
245 250 255
Gly Glu Ala Arg Ala Ser Thr Gly Ser Ser Asp Ser Ser Pro Gly Gly
260 265 270
His Gly Thr Gln Val Asn Val Thr Cys Ile Val Asn Val Cys Ser Ser
275 280 285
Ser Asp His Ser Ser Gln Cys Ser Ser Gln Ala Ser Ser Thr Met Gly
290 295 300
Asp Thr Asp Ser Ser Pro Ser Glu Ser Pro Lys Asp Glu Gln Val Pro
305 310 315 320
Phe Ser Lys Glu Glu Cys Ala Phe Arg Ser Gln Leu Glu Thr Pro Glu
325 330 335
Thr Leu Leu Gly Ser Thr Glu Glu Lys Pro Leu Pro Leu Gly Val Pro
340 345 350
Asp Ala Gly Met Lys Pro Ser Ala Ser
355 360
<210> 54
<211> 359
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的多肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="CD8 H-CD8 TM- TNFR2-3z"
<400> 54
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Lys Lys Pro Leu Cys Leu Gln Arg Glu Ala
65 70 75 80
Lys Val Pro His Leu Pro Ala Asp Lys Ala Arg Gly Thr Gln Gly Pro
85 90 95
Glu Gln Gln His Leu Leu Ile Thr Ala Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser
100 105 110
Leu Glu Ser Ser Ala Ser Ala Leu Asp Arg Arg Ala Pro Thr Arg Asn
115 120 125
Gln Pro Gln Ala Pro Gly Val Glu Ala Ser Gly Ala Gly Glu Ala Arg
130 135 140
Ala Ser Thr Gly Ser Ser Asp Ser Ser Pro Gly Gly His Gly Thr Gln
145 150 155 160
Val Asn Val Thr Cys Ile Val Asn Val Cys Ser Ser Ser Asp His Ser
165 170 175
Ser Gln Cys Ser Ser Gln Ala Ser Ser Thr Met Gly Asp Thr Asp Ser
180 185 190
Ser Pro Ser Glu Ser Pro Lys Asp Glu Gln Val Pro Phe Ser Lys Glu
195 200 205
Glu Cys Ala Phe Arg Ser Gln Leu Glu Thr Pro Glu Thr Leu Leu Gly
210 215 220
Ser Thr Glu Glu Lys Pro Leu Pro Leu Gly Val Pro Asp Ala Gly Met
225 230 235 240
Lys Pro Ser Gly Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
245 250 255
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
260 265 270
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
275 280 285
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
290 295 300
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
305 310 315 320
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
325 330 335
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
340 345 350
Ala Leu Pro Pro Arg Ala Ser
355
<210> 55
<211> 363
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的多肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="CD8 H-FUSED 1 TM- TNFR2-3z"
<400> 55
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Cys Val Ile Met Thr Gln Val Lys Lys Lys Pro Leu Cys Leu
65 70 75 80
Gln Arg Glu Ala Lys Val Pro His Leu Pro Ala Asp Lys Ala Arg Gly
85 90 95
Thr Gln Gly Pro Glu Gln Gln His Leu Leu Ile Thr Ala Pro Ser Ser
100 105 110
Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Ala Leu Asp Arg Arg Ala
115 120 125
Pro Thr Arg Asn Gln Pro Gln Ala Pro Gly Val Glu Ala Ser Gly Ala
130 135 140
Gly Glu Ala Arg Ala Ser Thr Gly Ser Ser Asp Ser Ser Pro Gly Gly
145 150 155 160
His Gly Thr Gln Val Asn Val Thr Cys Ile Val Asn Val Cys Ser Ser
165 170 175
Ser Asp His Ser Ser Gln Cys Ser Ser Gln Ala Ser Ser Thr Met Gly
180 185 190
Asp Thr Asp Ser Ser Pro Ser Glu Ser Pro Lys Asp Glu Gln Val Pro
195 200 205
Phe Ser Lys Glu Glu Cys Ala Phe Arg Ser Gln Leu Glu Thr Pro Glu
210 215 220
Thr Leu Leu Gly Ser Thr Glu Glu Lys Pro Leu Pro Leu Gly Val Pro
225 230 235 240
Asp Ala Gly Met Lys Pro Ser Gly Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
245 250 255
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
260 265 270
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
275 280 285
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
290 295 300
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
305 310 315 320
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
325 330 335
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
340 345 350
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Ala Ser
355 360
<210> 56
<211> 365
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的多肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="CD8 H-FUSED 2TM- TNFR2-3z"
<400> 56
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Val Asn Cys Val Ile Met Thr Gln Val Lys Lys Lys Pro Leu
65 70 75 80
Cys Leu Gln Arg Glu Ala Lys Val Pro His Leu Pro Ala Asp Lys Ala
85 90 95
Arg Gly Thr Gln Gly Pro Glu Gln Gln His Leu Leu Ile Thr Ala Pro
100 105 110
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Ala Leu Asp Arg
115 120 125
Arg Ala Pro Thr Arg Asn Gln Pro Gln Ala Pro Gly Val Glu Ala Ser
130 135 140
Gly Ala Gly Glu Ala Arg Ala Ser Thr Gly Ser Ser Asp Ser Ser Pro
145 150 155 160
Gly Gly His Gly Thr Gln Val Asn Val Thr Cys Ile Val Asn Val Cys
165 170 175
Ser Ser Ser Asp His Ser Ser Gln Cys Ser Ser Gln Ala Ser Ser Thr
180 185 190
Met Gly Asp Thr Asp Ser Ser Pro Ser Glu Ser Pro Lys Asp Glu Gln
195 200 205
Val Pro Phe Ser Lys Glu Glu Cys Ala Phe Arg Ser Gln Leu Glu Thr
210 215 220
Pro Glu Thr Leu Leu Gly Ser Thr Glu Glu Lys Pro Leu Pro Leu Gly
225 230 235 240
Val Pro Asp Ala Gly Met Lys Pro Ser Gly Ser Arg Val Lys Phe Ser
245 250 255
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
260 265 270
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
275 280 285
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
290 295 300
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
305 310 315 320
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
325 330 335
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
340 345 350
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Ala Ser
355 360 365
<210> 57
<211> 363
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的多肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="CD8 H-FUSED 3 TM- TNFR2-3z"
<400> 57
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Ala Leu Gly Leu Leu Ile Ile Gly Val
50 55 60
Val Asn Cys Val Ile Met Thr Gln Val Lys Lys Lys Pro Leu Cys Leu
65 70 75 80
Gln Arg Glu Ala Lys Val Pro His Leu Pro Ala Asp Lys Ala Arg Gly
85 90 95
Thr Gln Gly Pro Glu Gln Gln His Leu Leu Ile Thr Ala Pro Ser Ser
100 105 110
Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Ala Leu Asp Arg Arg Ala
115 120 125
Pro Thr Arg Asn Gln Pro Gln Ala Pro Gly Val Glu Ala Ser Gly Ala
130 135 140
Gly Glu Ala Arg Ala Ser Thr Gly Ser Ser Asp Ser Ser Pro Gly Gly
145 150 155 160
His Gly Thr Gln Val Asn Val Thr Cys Ile Val Asn Val Cys Ser Ser
165 170 175
Ser Asp His Ser Ser Gln Cys Ser Ser Gln Ala Ser Ser Thr Met Gly
180 185 190
Asp Thr Asp Ser Ser Pro Ser Glu Ser Pro Lys Asp Glu Gln Val Pro
195 200 205
Phe Ser Lys Glu Glu Cys Ala Phe Arg Ser Gln Leu Glu Thr Pro Glu
210 215 220
Thr Leu Leu Gly Ser Thr Glu Glu Lys Pro Leu Pro Leu Gly Val Pro
225 230 235 240
Asp Ala Gly Met Lys Pro Ser Gly Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
245 250 255
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
260 265 270
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
275 280 285
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
290 295 300
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
305 310 315 320
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
325 330 335
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
340 345 350
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Ala Ser
355 360
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="LAGLIDADG基序"
<400> 58
Leu Ala Gly Leu Ile Asp Ala Asp Gly
1 5
<210> 59
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="融合体1 - CD8 SEQ"
<400> 59
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr
20
<210> 60
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="融合体2 - CD8 SEQ"
<400> 60
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr
20
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="融合体3 - CD8 SEQ"
<400> 61
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
1 5
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="融合体1 - TNFR2 SEQ"
<400> 62
Cys Val Ile Met Thr Gln Val
1 5
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="融合体2 - TNFR2 SEQ"
<400> 63
Val Asn Cys Val Ile Met Thr Gln Val
1 5
<210> 64
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的多肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="融合体3 - TNFR2 SEQ"
<400> 64
Thr Ala Leu Gly Leu Leu Ile Ile Gly Val Val Asn Cys Val Ile Met
1 5 10 15
Thr Gln Val
<210> 65
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的多肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="scFv anti-IL-23R"
<400> 65
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Phe
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Lys Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Arg Tyr Ser Asn
85 90 95
Pro Asp Ile Tyr Asn Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Asp Phe Asn Ser Asn
145 150 155 160
Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
165 170 175
Ile Gly Cys Ile Tyr Val Gly Ser His Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asn
180 185 190
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
195 200 205
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
210 215 220
Tyr Cys Ala Thr Ser Gly Ser Ser Val Leu Tyr Phe Lys Phe Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 66
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的多肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="scFv anti-IL-23R"
<400> 66
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Phe
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Lys Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Arg Tyr Ser Asn
85 90 95
Pro Asp Ile Tyr Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Asp Phe Asn Ser Asn
145 150 155 160
Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
165 170 175
Ile Gly Cys Ile Tyr Val Gly Ser His Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asn
180 185 190
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
195 200 205
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
210 215 220
Tyr Cys Ala Thr Ser Gly Ser Ser Val Leu Tyr Phe Lys Phe Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 67
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的多肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="scFv anti IL-23R"
<400> 67
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Phe
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Lys Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Arg Tyr Ser Asn
85 90 95
Pro Asp Ile Tyr Asn Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Asp Phe Asn Ser Asn
145 150 155 160
Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
165 170 175
Ile Gly Cys Ile Tyr Val Gly Ser His Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asn
180 185 190
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
195 200 205
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
210 215 220
Tyr Cys Ala Thr Ser Gly Ser Ser Val Leu Tyr Phe Lys Phe Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 68
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的多肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="anti-HLA-A2 scFv"
<400> 68
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Val Leu Met Thr
130 135 140
Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Val Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245 250
<210> 69
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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<220>
<221> 来源
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gagaaagtga ccatgacctg标签agccagc agcagcgtgt cctatatgca ctggtatcag 600
cagaagcccg gcagcagccc taagccttgg atctacgcca caagcaatct ggccagcgga 660
gtgcctgcca gattttctgg ctctggcagc ggcacaagct actccctgac aatcagcaga 720
gtggaagccg aggatgccgc cacctactac tgtcagcagt ggatcagcaa ccctcctacc 780
tttggcgctg gcaccaagct ggaactgaag tctgcatggt cccatcctca gttcgagaag 840
tctggaatgc atacaacaac ccctgctcct cggcctccta caccagctcc tacaattgcc 900
agccagccac tgtctctgag gcccgaagct tgtagacctg ctgctggcgg agccgtgcat 960
acaagaggac tggatttcgc ctgcgacgtg ctgttgcccc tggtcatttt ctttggtctt 1020
tgccttttat ccctcctctt cattggttta atgtatcgct accaacggtg gaagtccaag 1080
ctctactcca ttgtttgtgg gaaatcgaca cctgaaaaag agggggagct tgaaggaact 1140
actactaagc ccctggcccc aaacccaagc ttcagtccca ctccaggctt cacccccacc 1200
ctgggcttca gtcccgtgcc cagttccacc ttcacctcca gctccaccta tacccccggt 1260
gactgtccca actttgcggc tccccgcaga gaggtggcac caccctatca gggggctgac 1320
cccatccttg cgacagccct cgcctccgac cccatcccca acccccttca gaagtgggag 1380
gacagcgccc acaagccaca gagcctagac actgatgacc ccgcgacgct gtacgccgtg 1440
gtggagaacg tgcccccgtt gcgctggaag gaattcgtgc ggcgccttgg gctgagcgac 1500
cacgagatag atcggctgga gctacagaac gggcgctgcc tgcgcgaggc gcaatacagt 1560
atgctggcga cctggaggcg gcgcacgcca cggcgcgagg ccacgctgga gctgctgggt 1620
cgcgtgctcc gcgacatgga cctgctgggc tgcctggagg acatcgagga ggcgctttgc 1680
ggccccgccg ccctcccgcc cgcgcccagt cttctcagaa cgcgtagagt gaagttcagc 1740
agatccgccg acgctcctgc ctatcagcag ggccaaaacc agctgtacaa cgagctgaac 1800
ctggggagaa gagaagagta cgacgtgctg gacaagcgga gaggcagaga tcctgaaatg 1860
ggcggcaagc ccagacggaa gaatcctcaa gagggcctgt ataatgagct gcagaaagac 1920
aagatggccg aggcctacag cgagatcgga atgaagggcg agcgcagaag aggcaaggga 1980
cacgatggac tgtaccaggg cctgagcacc gccaccaagg atacctatga tgccctgcac 2040
atgcaggccc tgcctccaag agctagcgga agcggagcta ctaacttcag cctgctgaag 2100
caggctggag acgtggagga gaaccctgga cctatggtga gcaagggcga ggagctgttc 2160
accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc 2220
gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc 2280
accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg 2340
cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg 2400
cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc 2460
cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc 2520
gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac 2580
aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc 2640
cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc 2700
ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc 2760
aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg 2820
atcactctcg gcatggacga gctgtacaag taa 2853
<210> 109
<211> 950
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的多肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="CD20-CAR (TNFR1TM-TNFR1-CD3z)-P2A-GFP"
<400> 109
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
20 25 30
Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly
35 40 45
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly
50 55 60
Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr
65 70 75 80
Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys
85 90 95
Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp
100 105 110
Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Gln Leu Arg Pro Asn Tyr Trp
115 120 125
Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Lys Ile
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Gly Gly Ser Ser Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser
165 170 175
Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser
180 185 190
Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys
195 200 205
Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg
210 215 220
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg
225 230 235 240
Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ile Ser
245 250 255
Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Ser Ala
260 265 270
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Ser Gly Met His Thr Thr Thr Pro
275 280 285
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
290 295 300
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
305 310 315 320
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Val Leu Leu Pro Leu Val Ile
325 330 335
Phe Phe Gly Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Phe Ile Gly Leu Met Tyr
340 345 350
Arg Tyr Gln Arg Trp Lys Ser Lys Leu Tyr Ser Ile Val Cys Gly Lys
355 360 365
Ser Thr Pro Glu Lys Glu Gly Glu Leu Glu Gly Thr Thr Thr Lys Pro
370 375 380
Leu Ala Pro Asn Pro Ser Phe Ser Pro Thr Pro Gly Phe Thr Pro Thr
385 390 395 400
Leu Gly Phe Ser Pro Val Pro Ser Ser Thr Phe Thr Ser Ser Ser Thr
405 410 415
Tyr Thr Pro Gly Asp Cys Pro Asn Phe Ala Ala Pro Arg Arg Glu Val
420 425 430
Ala Pro Pro Tyr Gln Gly Ala Asp Pro Ile Leu Ala Thr Ala Leu Ala
435 440 445
Ser Asp Pro Ile Pro Asn Pro Leu Gln Lys Trp Glu Asp Ser Ala His
450 455 460
Lys Pro Gln Ser Leu Asp Thr Asp Asp Pro Ala Thr Leu Tyr Ala Val
465 470 475 480
Val Glu Asn Val Pro Pro Leu Arg Trp Lys Glu Phe Val Arg Arg Leu
485 490 495
Gly Leu Ser Asp His Glu Ile Asp Arg Leu Glu Leu Gln Asn Gly Arg
500 505 510
Cys Leu Arg Glu Ala Gln Tyr Ser Met Leu Ala Thr Trp Arg Arg Arg
515 520 525
Thr Pro Arg Arg Glu Ala Thr Leu Glu Leu Leu Gly Arg Val Leu Arg
530 535 540
Asp Met Asp Leu Leu Gly Cys Leu Glu Asp Ile Glu Glu Ala Leu Cys
545 550 555 560
Gly Pro Ala Ala Leu Pro Pro Ala Pro Ser Leu Leu Arg Thr Arg Arg
565 570 575
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
580 585 590
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
595 600 605
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
610 615 620
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
625 630 635 640
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
645 650 655
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
660 665 670
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Ala
675 680 685
Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp
690 695 700
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe
705 710 715 720
Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly
725 730 735
His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly
740 745 750
Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro
755 760 765
Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser
770 775 780
Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met
785 790 795 800
Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly
805 810 815
Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val
820 825 830
Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile
835 840 845
Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile
850 855 860
Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg
865 870 875 880
His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln
885 890 895
Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr
900 905 910
Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp
915 920 925
His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly
930 935 940
Met Asp Glu Leu Tyr Lys
945 950
<210> 110
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成的肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注意="CD8 H-TNFR2 TM-TNFR2del151-3z"
<400> 110
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Ala Leu
35 40 45
Pro Val Gly Leu Ile Val Gly Val Thr Ala Leu Gly Leu Leu Ile Ile
50 55 60
Gly Val Val Asn Cys Val Ile Met Thr Gln Val Lys Lys Lys Pro Leu
65 70 75 80
Cys Leu Gln Arg Glu Ala Lys Val Pro His Leu Pro Ala Asp Lys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
100 105 110
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
115 120 125
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
130 135 140
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
145 150 155 160
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
165 170 175
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
180 185 190
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
195 200 205
Leu Pro Pro Arg Ala Ser
210
<210> 111
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成肽"
<220>
<221> 来源
<223> ./注意="接头"
<400> 111
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 112
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成肽"
<220>
<221> 来源
<223> ./注意="接头"
<400> 112
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 113
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成肽"
<220>
<221> 来源
<223> ./注意="接头"
<400> 113
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 114
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成肽"
<220>
<221> 来源
<223> ./注意="接头"
<400> 114
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 115
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成肽"
<220>
<221> 来源
<223> ./注意="接头"
<400> 115
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 116
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成肽"
<220>
<221> 来源
<223> ./注意="接头"
<400> 116
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 117
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述：合成肽"
<220>
<221> 来源
<223> ./注意="接头"
<400> 117
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20

Claims (36)

1.嵌合抗原受体(CAR)，其包含细胞外结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，其中
(i)所述跨膜结构域包含人肿瘤坏死因子受体2(TNFR2)跨膜结构域或其片段或变体，或
(ii)所述细胞内结构域包含人TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体，或
(iii)(i)和(ii)两者。
2.如权利要求1所述的CAR，其进一步包含细胞外铰链结构域。
3.如权利要求2所述的CAR，其中所述铰链结构域包含人CD8或CD28的铰链区。
4.如权利要求3所述的CAR，其中所述铰链结构域包含SEQ ID NO：14的序列或与SEQ IDNO：14具有至少约70％同一性的序列。
5.如前述权利要求中任一项所述的CAR，其中所述细胞内结构域包含免疫细胞第一细胞内信号传导结构域。
6.如权利要求5所述的CAR，其中所述细胞内结构域包含人CD3的T细胞第一细胞内信号传导结构域。
7.如前述权利要求中任一项所述的CAR，其中所述细胞内结构域包含人CD3ζ的第一细胞内信号传导结构域，其任选包含SEQ ID NO：28、29、30或31的序列或与SEQ ID NO：28、29、30或31具有至少约70％同一性的序列。
8.如前述权利要求中任一项所述的CAR，其中所述CAR包含：
细胞外结合结构域，
包含人CD8或CD28的铰链区的细胞外铰链结构域，
包含人TNFR2跨膜结构域或其片段或变体的跨膜结构域，和
包含人CD3ζ的第一细胞内信号传导结构域的细胞内结构域。
9.如前述权利要求中任一项所述的CAR，其中所述CAR包含：
细胞外结合结构域，
包含人CD8或CD28的铰链区的细胞外铰链结构域，
跨膜结构域，和
包含人TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体的细胞内结构域，以及人CD3ζ的第一细胞内信号传导结构域。
10.如前述权利要求中任一项所述的CAR，其中所述CAR包含：
细胞外结合结构域，
包含人CD8或CD28的铰链区的细胞外铰链结构域，
包含人TNFR2跨膜结构域或其片段或变体的跨膜结构域，和
包含人TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域或其片段或变体的以及人CD3ζ的第一细胞内信号传导结构域细胞内结构域。
11.如前述权利要求中任一项所述的CAR，其中所述跨膜结构域包含SEQ ID NO：22或与SEQ ID NO：22具有至少约70％同一性的序列的至少八个连续氨基酸。
12.如权利要求11所述的CAR，其中所述跨膜结构域包含SEQ ID NO：22的至少八个连续氨基酸残基与来自非TNFR2的蛋白的跨膜结构域的氨基酸残基的组合。
13.如前述权利要求中任一项所述的CAR，其中所述跨膜结构域包含VNCVIMTQV(SEQ IDNO：63)的氨基酸序列。
14.如前述权利要求中任一项所述的CAR，其中所述细胞内结构域包含SEQ ID NO：34或与SEQ ID NO：34具有至少约70％同一性的序列的至少30个连续氨基酸残基。
15.如权利要求14所述的CAR，其中所述细胞内结构域包含SEQ ID NO：34的至少30个连续氨基酸残基与来自非TNFR2的蛋白的共刺激性细胞内信号传导结构域的氨基酸残基的组合。
16.如前述权利要求中任一项所述的CAR，其中所述细胞内信号传导结构域包含SEQ IDNO：34的残基1-70、1-115或1-156。
17.如前述权利要求中任一项所述的CAR，其包含：
细胞外结合结构域，
包含SEQ ID NO：14的CD8铰链区的细胞外铰链结构域，
包含SEQ ID NO：22的TNFR2跨膜结构域的跨膜结构域，和
包含以下的细胞内结构域：
a)SEQ ID NO：28、29、30或31的第一人CD3ζ细胞内信号传导结构域，和
b)SEQ ID NO：34的TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域。
18.如前述权利要求中任一项所述的CAR，其中所述细胞外结合结构域是抗体或其抗原结合片段。
19.如权利要求18所述的CAR，其中所述细胞外结合结构域是单链可变片段(scFv)。
20.如前述权利要求中任一项所述的CAR，其中所述细胞外结合结构域与以下特异性结合
(a)自身抗原，其中所述自身抗原任选是IL-23受体(IL-23R)；
(b)B细胞抗原，其任选选自CD19和CD20；或
(c)同种异体的HLA I类或II类分子，其中所述I类分子任选是HLA-A2。
21.编码权利要求1至20中任一项所述的CAR的核酸序列。
22.包含权利要求21所述的核酸序列的载体。
23.包含权利要求21所述的核酸序列或权利要求22所述的载体的宿主细胞。
24.表达权利要求1至20中任一项所述的CAR的免疫细胞群体。
25.如权利要求24所述的免疫细胞群体，其中所述免疫细胞选自由以下组成的组：T细胞、自然杀伤(NK)细胞、αβT细胞、γδT细胞、双阴性(DN)细胞、调节性免疫细胞、调节性T(Treg)细胞、效应免疫细胞、效应T细胞、B细胞和髓系来源的细胞，及其任意组合，其中所述免疫细胞任选是人细胞。
26.如权利要求24所述的免疫细胞群体，其中所述群体包含Treg细胞，其中所述Treg细胞任选是人细胞。
27.如权利要求26所述的免疫细胞群体，其中所述群体包含表达CAR的人Treg细胞，所述CAR包含：
细胞外结合结构域，
包含人CD8的铰链区的铰链结构域，
人TNFR2跨膜结构域，和
包含人TNFR2共刺激性细胞内信号传导结构域和人CD3ζ的第一细胞内信号传导结构域的细胞内结构域。
28.药物组合物，其包含表达权利要求1至20中任一项所述的CAR的免疫细胞，或权利要求23所述的宿主细胞，或权利要求24至27中任一项所述的免疫细胞群体，以及药学上可接受的赋形剂。
29.一种用于治疗有此需要的人受试者中的疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用权利要求28所述的药物组合物。
30.如权利要求1至20中任一项所述的嵌合抗原受体，或如权利要求24至27中任一项所述的免疫细胞群体，用于治疗有此需要的人受试者中的疾病或病症。
31.权利要求1至20中任一项所述的嵌合抗原受体或权利要求24至27中任一项所述的免疫细胞群体在制备用于治疗有此需要的人受试者中的疾病或病症的药物中的用途。
32.如权利要求29所述的方法，如权利要求30所述的CAR或免疫细胞群体，或如权利要求31所述的用途，其中所述疾病或病症选自由以下组成的组：炎性疾病、自身免疫疾病、过敏性疾病、器官移植病况、癌症和感染性疾病。
33.如权利要求29所述的方法，如权利要求30所述的CAR或免疫细胞群体，或如权利要求31所述的用途，其中所述人受试者需要免疫抑制并且所述CAR在所述人受试者的Treg细胞中表达。
34.如权利要求33所述的方法，如权利要求33所述的CAR或免疫细胞群体，或如权利要求33所述的用途，其中所述疾病或病症是炎性疾病、自身免疫疾病、过敏性疾病或器官移植病况。
35.如权利要求34所述的方法，如权利要求34所述的CAR或免疫细胞群体，或如权利要求34所述的用途，其中所述器官移植病况是移植排斥或移植物抗宿主病。
36.如权利要求1至20中任一项所述的嵌合抗原受体，或如权利要求24至27中任一项所述的免疫细胞群体，用作药物。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114262689A (zh) * 2021-12-17 2022-04-01 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 一种快速检测cd19/cd20-car-t细胞活性的方法

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3808766A1 (en) * 2019-10-15 2021-04-21 Sangamo Therapeutics France Chimeric antigen receptor specific for interleukin-23 receptor
WO2021183795A1 (en) * 2020-03-11 2021-09-16 Poseida Therapeutics, Inc. Chimeric stimulatory receptors and methods of use in t cell activation and differentiation
CN113528449A (zh) * 2020-04-20 2021-10-22 浙江瑞加美生物科技有限公司 一种制备通用型人源化car19-dnt细胞的技术及其应用
WO2023076912A2 (en) * 2021-10-26 2023-05-04 ImmPACT Bio USA Inc. Cd4+ and/or cd8+ cell populations comprising icars for use in treatment therapies
WO2023156587A1 (en) * 2022-02-18 2023-08-24 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of tcr-deficient car-tregs in combination with anti-tcr complex monoclonal antibodies for inducing durable tolerance

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015142661A1 (en) * 2014-03-15 2015-09-24 Novartis Ag Regulatable chimeric antigen receptor
CN106163547A (zh) * 2014-03-15 2016-11-23 诺华股份有限公司 使用嵌合抗原受体治疗癌症
WO2017025038A1 (en) * 2015-08-11 2017-02-16 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Chimeric antigen receptors based on single-domain antibodies and methods of use thereof
WO2018106993A1 (en) * 2016-12-09 2018-06-14 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. Tlr9-binding chimeric antigen receptors

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
EP0617706B1 (en) 1991-11-25 2001-10-17 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US5350674A (en) 1992-09-04 1994-09-27 Becton, Dickinson And Company Intrinsic factor - horse peroxidase conjugates and a method for increasing the stability thereof
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
CA2293632C (en) 1997-06-12 2011-11-29 Research Corporation Technologies, Inc. Artificial antibody polypeptides
WO2001029058A1 (en) 1999-10-15 2001-04-26 University Of Massachusetts Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
US6326193B1 (en) 1999-11-05 2001-12-04 Cambria Biosciences, Llc Insect control agent
IL151287A0 (en) 2000-02-24 2003-04-10 Xcyte Therapies Inc A method for stimulation and concentrating cells
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
WO2001096584A2 (en) 2000-06-12 2001-12-20 Akkadix Corporation Materials and methods for the control of nematodes
US7745140B2 (en) 2002-01-03 2010-06-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform as a research tool
ATE381620T1 (de) 2003-04-24 2008-01-15 San Raffaele Centro Fond Synthetische bidirektionale promotoren und deren verwendungen
WO2005118788A2 (en) 2004-05-27 2005-12-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel artificial antigen presenting cells and uses therefor
US20070036773A1 (en) 2005-08-09 2007-02-15 City Of Hope Generation and application of universal T cells for B-ALL
GB0603081D0 (en) 2006-02-15 2006-03-29 Dynal Biotech Asa Oslo Method
PT2126054T (pt) 2007-01-31 2016-10-12 Yeda Res & Dev Células t reguladoras geneticamente modificadas, redirecionadas e sua utilização na supressão de doenças inflamatórias e autoimunitárias
US9181527B2 (en) 2009-10-29 2015-11-10 The Trustees Of Dartmouth College T cell receptor-deficient T cell compositions
US8956828B2 (en) 2009-11-10 2015-02-17 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of T cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
EP2596011B1 (en) 2010-07-21 2018-10-03 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for modification of a hla locus
JP6076963B2 (ja) 2011-04-08 2017-02-15 アメリカ合衆国 抗上皮成長因子受容体変異体ｉｉｉキメラ抗原受容体及び癌の治療のためのその使用
DK2800811T3 (en) 2012-05-25 2017-07-17 Univ Vienna METHODS AND COMPOSITIONS FOR RNA DIRECTIVE TARGET DNA MODIFICATION AND FOR RNA DIRECTIVE MODULATION OF TRANSCRIPTION
EP4286402A3 (en) 2012-12-12 2024-02-14 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
DK3064585T3 (da) 2012-12-12 2020-04-27 Broad Inst Inc Konstruering og optimering af forbedrede systemer, fremgangsmåder og enzymsammensætninger til sekvensmanipulation
CN116478927A (zh) * 2013-12-19 2023-07-25 诺华股份有限公司 人间皮素嵌合抗原受体及其用途
EP3087101B1 (en) * 2013-12-20 2024-06-05 Novartis AG Regulatable chimeric antigen receptor
JP6919118B2 (ja) * 2014-08-14 2021-08-18 ノバルティス アーゲー ＧＦＲα−４キメラ抗原受容体を用いる癌の治療
EP3298041A1 (en) 2015-05-18 2018-03-28 Numab Therapeutics AG Novel treatment methods based on multifunctional molecules
AU2018246143A1 (en) 2017-03-28 2019-10-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods to protect transplanted tissue from rejection
EP3684821A4 (en) 2017-09-19 2021-06-16 The University Of British Columbia ANTI-HLA-A2 ANTIBODIES AND METHOD OF USING THEREOF

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015142661A1 (en) * 2014-03-15 2015-09-24 Novartis Ag Regulatable chimeric antigen receptor
CN106163547A (zh) * 2014-03-15 2016-11-23 诺华股份有限公司 使用嵌合抗原受体治疗癌症
WO2017025038A1 (en) * 2015-08-11 2017-02-16 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Chimeric antigen receptors based on single-domain antibodies and methods of use thereof
WO2018106993A1 (en) * 2016-12-09 2018-06-14 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. Tlr9-binding chimeric antigen receptors

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114262689A (zh) * 2021-12-17 2022-04-01 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 一种快速检测cd19/cd20-car-t细胞活性的方法

Also Published As

Publication number Publication date
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