CN106459989B - 人间皮素嵌合抗原受体及其用途 - Google Patents

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Abstract

提供了用于治疗与间皮素的表达相关的疾病的组合物和方法。还提供了间皮素特异性的嵌合抗原受体(CAR)、编码该嵌合抗原受体的载体和包含所述的间皮素CAR的重组的T细胞。还提供了施用表达包含间皮素结合结构域的CAR的基因修饰的T细胞的方法。

Description

人间皮素嵌合抗原受体及其用途
本申请要求2013年12月19日提交的国际申请号PCT/CN2013/089979、2014年7月21日提交的国际申请号PCT/CN2014/082610和2014年11月6日提交的国际申请号PCT/CN2014/090509的优先权,通过引用把这些申请中每一个的全部内容并入本文中。
发明领域
本发明一般地涉及被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞用于治疗与间皮素的表达相关的疾病的用途。
发明背景
间皮素(mesothelin)由于它被正常组织有限表达和在肿瘤上过度表达而最初被Pastan和同事鉴定为与肿瘤相关的抗原。Chang K等人,Cancer Res.1992；52(1):181-186和Chang K等人ProcNatlAcadSciUSA.1996；93(1):136-140。所述间皮素基因编码前体71-kDa蛋白，后者被加工而产生所述的40-kDa蛋白,间皮素,它被糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接和氨基端31-kDa脱落的片段锚固在细胞膜处，该片段被称为巨核细胞增强因子(MPF)。这两种片段都包含N-糖基化位点。被称为“与可溶的间皮素/MPF相关的”所述40-kDa羧基端片段的可溶的剪接变体已经在患有胰腺导管腺瘤(PDA)的患者的血清中被发现。Johnston,F等人Clinical Cancer Research.2009；15(21):6511。间皮素目前正在被开发既作为治疗靶又作为疾病活性和治疗反应的生物标记物。Argani P等人Clin Cancer Res.2001；7(12):3862-3868。
间皮素是也存在于正常组织上的分化抗原。利用被所述的Pastan小组开发的小鼠抗人间皮素抗体K1,已经在作为腹腔、胸腔和围心腔的一层的间皮细胞内证明了强的K1反应性,尽管处于比通常对于恶性组织所见到的更低的水平。Chang K等人,CancerRes.1992；52(1):181-186。已经在所述的输卵管上皮、气管基底上皮和扁桃体上皮内检测到弱的K1反应性。也已经在所有的角质层中发现了间皮素。Jirsova K等人Experimentaleye research.2010；91(5):623-629。然而,还没有在大多数正常组织中检测到K1反应性，这些正常组织包括肝脏,肾,脾,骨髓,淋巴结,胸腺,心肌,舌头,骨骼肌,皮肤,大脑皮层,小脑,脊髓,周围神经,脑垂体,肾上腺,唾液腺,乳腺,胸腺,副甲状腺,睾丸,前列腺,附睾,子宫颈上皮,肺实质,食管,小肠上皮,结肠上皮,膀胱上皮,胆囊上皮。Chang K等人,CancerRes.1992；52(1):181-186。
间皮素在绝大多数原发性胰腺腺瘤中被过度表达，而在良性的胰腺组织中见到罕见而且弱的表达。Argani P等人Clin Cancer Res.2001；7(12):3862-3868。上皮恶性胸膜间皮瘤(MPM)普遍性地表达间皮素而肉瘤样的MPM不表达间皮素。大多数浆液上皮卵巢瘤和相关的原发性腹膜瘤表达间皮素。
在卵巢癌中，间皮素是天然免疫反应的靶,并且已经被提议作为癌症免疫疗法的靶。Bracci L等人Clin Cancer Res.2007；13(2 Pt 1):644-653；Moschella F等人CancerRes.2011；71(10):3528-3539；Gross G等人FASEB J.1992；6(15):3370-3378；Sadelain M等人NatRevCancer.2003；3(1):35-45；Muul LM等人Blood.2003；101(7):2563-2569；Yee C等人Proc Natl Acad Sci U S A.2002；99(25):16168-16173。在患有胰腺癌的患者中，间皮素特异性的CTL的存在与总的存活率相关。Thomas AM等人J Exp Med.2004；200:297-306。另外,Pastan和同事已经使用与免疫毒素缀合的抗间皮素抗体的可溶的抗体片段来治疗患有间皮素阳性肿瘤的癌症患者。这种方法已经在胰腺癌中证明足够的安全性和一些临床活性。Hassan R等人Cancer Immun.2007；7:20和Hassan R等人Clin Cancer Res.2007；13(17):5144-5149。在卵巢癌中,根据RECIST标准，这种治疗策略产生了一个微小的应答并且在已经完全解决了他们腹水的第二个患者中产生了稳定的疾病。
发明概述
本发明特征在于,例如,通过施用被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞在患者中提供免疫反应的方法，该受体包括特异性地靶向间皮素的抗体(例如scFv)。特别地，本发明涉及被工程化以表达包含抗体例如其抗原结合片段的CAR的免疫效应细胞(例如，例如，T细胞或NK细胞)用于治疗与间皮素(或MSLN)的表达相关的癌症的用途。特别地，本发明涉及过继性细胞转移，它可能特别适用于患有表达间皮素的癌症(例如，例如，间皮瘤(例如，恶性胸膜间皮瘤,肺癌(例如，非小细胞肺癌,小细胞肺癌,鳞状细胞肺癌,或大细胞肺癌),胰腺癌(例如，胰腺导管腺瘤,胰腺转移性的),卵巢癌,结肠直肠癌和膀胱癌,或其任何组合)的患者。
因此，在一个方面中，本发明涉及编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子,其中所述的CAR包含抗间皮素结合结构域(例如，人抗间皮素结合结构域)、跨膜结构域和包含刺激结构域的细胞内信号传导结构域。在一种实施方式中，所述编码的抗间皮素结合结构域包含本文中描述的人抗间皮素结合结构域的一个或更多个(例如，所有3个)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3),以及本文中描述的人抗间皮素结合结构域的一个或更多个(例如，所有3个)重链互补决定区1(HCCDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。在一种实施方式中，所述编码的人抗间皮素结合结构域包含下列或由其组成:本文中描述的轻链可变区(例如，在表1、3或4中)和/或本文中描述的重链可变区(例如，在表1、3或4中)。在一种实施方式中，所述编码的抗间皮素结合结构域是scFv，其包含下列或由其组成:表1的氨基酸序列的轻链和重链。在一种实施方式中，所述的抗间皮素结合结构域(例如，scFV)包含下列或由其组成:轻链可变区，其包含具有表1中提供的轻链可变区的氨基酸序列的至少1、2或3个修饰(例如，取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列,或与表1的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，其包含下列或由其组成:具有表1中提供的重链可变区的氨基酸序列的至少1、2或3个修饰(例如，取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列,或与表1的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一种实施方式中，所述的人抗间皮素结合结构域包含下列或由其组成:选自由SEQ ID NO:39；SEQ IDNO:40,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:45,SEQ IDNO:46,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:51,SEQ IDNO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:57,SEQ IDNO:58,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:60,SEQ ID NO:61,和SEQ ID NO:62组成的组的序列,或与其具有95-99％同一性的序列。在一种实施方式中，所述的编码人抗间皮素结合结构域的核酸序列包含下列或由其组成:选自由SEQ ID NO:87；SEQ ID NO:88,SEQ ID NO:89,SEQID NO:90,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:92,SEQ ID NO:93,SEQ ID NO:94,SEQ ID NO:95,SEQID NO:96,SEQ ID NO:97,SEQ ID NO:98,SEQ ID NO:99,SEQ ID NO:100,SEQ ID NO:101,SEQ ID NO:102,SEQ ID NO:103,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:105,SEQ ID NO:106,SEQ IDNO:107,SEQ ID NO:108,SEQ ID NO:109,和SEQ ID NO:110组成的组的序列,或与其具有95-99％同一性的序列。
在一种实施方式中，所述分离的核酸进一步包含编码跨膜结构域的序列,例如，本文中描述的跨膜结构域。在一种实施方式中，所述编码的跨膜结构域包含下列或由其组成:选自下列的蛋白质的跨膜结构域:T细胞受体的α、β或ζ链,CD28,CD3ε,CD45,CD4,CD5,CD8,CD9,CD16,CD22,CD33,CD37,CD64,CD80,CD86,CD134,CD137和CD154。在一种实施方式中，所述编码的跨膜结构域包含下列或由其组成:SEQ ID NO:12的序列。在一种实施方式中，所述的跨膜结构域包含下列或由其组成:具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的至少1、2或3个修饰(例如，取代)但不超过20、10或5个修饰(例如，取代)的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
在一种实施方式中，所述编码的CAR包含通过铰链区(例如，本文中描述的铰链区)与所述跨膜结构域连接的抗间皮素结合结构域,例如，本文中描述的抗间皮素结合结构域。在一种实施方式中，所述的铰链区包含下列或由其组成:SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8。
在一种实施方式中，所述分离的核酸分子进一步包含编码共刺激结构域(例如，本文中描述的共刺激结构域)的序列。在一种实施方式中，所述的共刺激结构域是从选自由下列组成的组的蛋白质得到的功能性信号传导结构域:OX40,CD27,CD28,CDS,ICAM-1,LFA-1(CD11a/CD18),ICOS(CD278),和4-1BB(CD137)。在一种实施方式中，所述编码的共刺激结构域包含下列或由其组成:SEQ ID NO:14的序列。在一种实施方式中，所述的共刺激结构域包含下列或由其组成:具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的至少1、2或3个修饰(例如，取代)但不超过20、10或5个修饰(例如，取代)的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
在一种实施方式中，所述分离的核酸包含编码细胞内信号传导结构域(例如，本文中描述的细胞内信号传导结构域)的序列。在一种实施方式中，所述分离的核酸编码4-1BB的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域。在一种实施方式中，所述编码的细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:7的序列和/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的序列。在一种实施方式中，所述的细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列的至少1、2或3个修饰(例如，取代)但不超过20、10或5个修饰(例如，取代)的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:7的氨基酸序列和/或SEQID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一种实施方式中，所述编码的细胞内信号传导结构域包含下列或由其组成:SEQ ID NO:7的序列和SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的序列,其中所述的包含所述细胞内信号传导结构域的序列是在同一个框中并且以单一的多肽链形式被表达的。
在另一个方面中，本发明涉及编码CAR构建体的分离的核酸分子，其包含前导序列(例如，SEQ ID NO:1的前导序列)；本文中描述的抗间皮素结合结构域,例如，其具有表1的氨基酸序列,或与其具有95-99％同一性的序列；铰链区,例如，SEQ ID NO:2的铰链区；跨膜结构域,例如，其具有SEQ ID NO:6的序列；共刺激结构域,例如，具有SEQ ID NO:7的序列的4-1BB共刺激结构域；和主要信号传导结构域,例如，具有SEQ ID NO:9或10的序列的CD3ζ刺激结构域。在一种实施方式中，所述分离的核酸分子包括(例如，由其组成)编码具有表1的氨基酸序列的多肽的核酸序列。在一种实施方式中，所述分离的核酸分子包含(由其组成)编码多肽的核酸分子，该多肽包含具有表1的氨基酸序列的至少1、2或3个修饰(例如，取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列或与其具有95-99％同一性的序列。
在另一个方面中，本发明涉及由所述的核酸序列(例如，本文中描述的的核酸)编码的分离的多肽分子。
在另一个方面中，本发明涉及分离的多肽分子，其包含下列或由其组成:选自由下列组成的组的序列:表1、具有表1中提供的重链可变区的氨基酸序列的至少1、2或3个修饰(例如，取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列,或与表1的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一种实施方式中，所述分离的多肽包含本文中描述的人抗间皮素结合结构域的一个或更多个(例如，所有3个)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)以及本文中描述的人抗间皮素结合结构域的一个或更多个(例如，所有3个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。
在另一个方面中，本发明涉及分离的嵌合抗原受体(CAR)分子，其包含本文中描述的抗间皮素结合结构域(例如，本文中描述的人抗间皮素结合结构域)、跨膜结构域和包含刺激结构域的细胞内信号传导结构域。
在一种实施方式中，所述的抗间皮素结合结构域不与包含含有SEQ ID NO:279的序列的抗原结合结构域竞争与人间皮素的结合。
在一种实施方式中，所述的抗间皮素结合结构域与包含下列的抗原结合结构域竞争与人间皮素的结合:选自SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:49的抗间皮素轻链氨基酸序列的LCCDR1,LC CDR2和LC CDR3以及选自SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:49的抗间皮素重链氨基酸序列的HC CDR1,HC CDR2和HC CDR3。在一种实施方式中，所述的抗间皮素结合结构域与包含SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:49的抗原结合结构域竞争与人间皮素的结合。
在一种实施方式中，所述的抗间皮素结合结构域与包含含有SEQ ID NO:279的序列的抗原结合结构域所靶向的人间皮素的表位不同的人间皮素的表位结合。在一种实施方式中，所述的表位包含选自SEQ ID NO:278的氨基酸314-315,317-318,346-349和369-375或其任何组合的氨基酸序列。在一种实施方式中，所述的表位包含一个或更多个选自SEQID NO:278的氨基酸314-315,317-318,346-349和369-375或其任何组合的氨基酸。
在一种实施方式中,本文中描述的抗间皮素结合结构域不与如SEQ ID NO:278中所示的间皮素的N-端结合。在一种实施方式中，所述的抗间皮素结合结构域与人间皮素的C-端结合。在一种实施方式中，所述的抗间皮素结合结构域与SEQ ID NO:278的氨基酸450-588内的表位结合。在一种实施方式中，被所述的抗间皮素结合结构域结合的表位包含选自SEQ ID NO:278的氨基酸485-490,498-507,532-537和545-572或其组合的序列。在一种实施方式中，被所述的抗间皮素结合结构域结合的表位包含选自SEQ ID NO:278的氨基酸485-490,498-507,532-537和545-572或其组合的一个或多个氨基酸。在这些实施方式中,SEQ ID NO:278代表人间皮素的氨基酸296-588,例如，SEQ ID NO:278的第一个氨基酸是氨基酸296而SEQ ID NO:278的最后一个氨基酸是氨基酸588。
在一种实施方式中，所述的抗间皮素结合结构域包含本文中描述的人抗间皮素结合结构域的一个或更多个(例如，所有3个)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)以及本文中描述的人抗间皮素结合结构域的一个或更多个(例如，所有3个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。在一种实施方式中，所述的人抗间皮素结合结构域包含下列或由其组成:本文中描述的轻链可变区(例如，在表1中)和/或本文中描述的重链可变区(例如，在表1中)。在一种实施方式中，所述的抗间皮素结合结构域是scFv，其包含下列或由其组成:表1的氨基酸序列的轻链可变区和重链可变区。在一种实施方式中，所述的抗间皮素结合结构域(例如，scFV)包含下列或由其组成:轻链可变区，其包含具有表1中提供的轻链可变区的氨基酸序列的1、2或3个修饰(例如，取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列,或与表1的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，其包含具有表1中提供的重链可变区的氨基酸序列的1、2或3个修饰(例如，取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列,或与表1的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一种实施方式中，所述的人抗间皮素结合结构域包含下列或由其组成:,选自由下列组成的组的序列:SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:43,SEQID NO:44,SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:46,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQID NO:50,SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:55,SEQID NO:56,SEQ ID NO:57,SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:60,SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62,或与其具有95-99％同一性的序列。
在一种实施方式中，所述的跨膜结构域是选自由下列组成的组的蛋白质的跨膜结构域:所述T细胞受体的α、β或ζ链,CD28,CD3ε，CD45,CD4,CD5,CD8,CD9,CD16,CD22,CD33,CD37,CD64,CD80,CD86,CD134,CD137和CD154。在一种实施方式中，所述的跨膜结构域包含本文中描述的的跨膜结构域,例如，其具有SEQ ID NO:6的序列、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的至少1、2或3个修饰(例如，取代)但不超过20、10或5个修饰(例如，取代)的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
在一种实施方式中，通过铰链区使所述的抗间皮素结合结构域与所述的跨膜结构域相连。在一种实施方式中，所述的铰链区包含本文中描述的铰链区,例如，SEQ ID NO:2的铰链区。
在一种实施方式中，所述分离的CAR分子进一步包含共刺激结构域,例如，本文中描述的的共刺激结构域。在一种实施方式中，所述的共刺激结构域是从选自由下列组成的组的蛋白质得到的功能性信号传导结构域:OX40,CD27,CD28,CDS,ICAM-1,LFA-1(CD11a/CD18),ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)或其功能性变体。在一种实施方式中，所述的共刺激结构域包含下列或由其组成:SEQ ID NO:7的序列。在一种实施方式中，所述的共刺激结构域包含下列或由其组成:具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的至少1、2或3个修饰(例如，取代)但不超过20、10或5个修饰(例如，取代)的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
在一种实施方式中，所述分离的CAR分子包含细胞内信号传导结构域,例如，本文中描述的细胞内信号传导结构域。在一种实施方式中，所述的细胞内信号传导结构域包含4-1BB的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域。在一种实施方式中，所述的细胞内信号传导结构域包含下列或由其组成:SEQ ID NO:7的序列和/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的序列。在一种实施方式中，所述的细胞内信号传导结构域包含下列或由其组成:具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列的至少1、2或3个修饰(例如，取代)但不超过20、10或5个修饰(例如，取代)的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:7的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一种实施方式中，所述的细胞内信号传导结构域包含下列或由其组成:SEQ ID NO:9的序列和SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的序列,其中所述的包含所述细胞内信号传导结构域的序列是在同一个框中并且以单一的多肽链形式被表达的。
在另一个方面中，本发明涉及分离的CAR分子,其包含前导序列，例如，SEQ ID NO:1的序列；本文中描述的抗间皮素结合结构域,例如，具有表1的氨基酸序列或与其具有95-99％同一性的序列；铰链区,例如，SEQ ID NO:2的铰链区；跨膜结构域,例如，其具有SEQ IDNO:6的序列；共刺激结构域,例如，具有SEQ ID NO:7的序列的4-1BB共刺激结构域；和主要信号传导结构域,例如，具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的序列的CD3ζ刺激结构域。在一种实施方式中，所述分离的CAR分子包含(例如，由其组成)具有表1的氨基酸序列的多肽。在一种实施方式中，所述分离的CAR分子包括(由其组成)多肽，该多肽具有具表1的氨基酸序列的至少1、2或3个修饰(例如，取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列,或与表1的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一种实施方式中，所述分离的CAR分子包含下列或由其组成:选自由下列组成的组的氨基酸序列:SEQ ID NO:63；SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:66,SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:68,SEQ ID NO:69,SEQ IDNO:70,SEQ ID NO:71,SEQ ID NO:72,SEQ ID NO:73,SEQ ID NO:74,SEQ ID NO:75,SEQ IDNO:76,SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:78,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:80,SEQ ID NO:81,SEQ IDNO:82,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:84,SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:86。
在另一个方面中，本发明涉及包含本文中描述的核酸序列的载体。在一种实施方式中，所述的核酸序列编码CAR分子,例如，本文中描述的CAR分子。在一种实施方式中，所述的载体选自由下列组成的组:DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。
在一种实施方式中，所述的载体是慢病毒载体,例如，本文中描述的慢病毒载体。在一种实施方式中，所述的载体进一步包含启动子。在一种实施方式中，所述的启动子是EF-1α启动子。在一种实施方式中，所述的EF-1α启动子包含SEQ ID NO:11的序列。
在一种实施方式中，所述的载体是体外转录的载体,例如，转录本文中描述的核酸分子的RNA的载体。在一种实施方式中，所述的RNA是从体外转录载体转录的,其中所述的载体是pD-A.anti-meso BD OF.2bg.150A,其中所述的anti-meso BD是本文中描述的抗间皮素结合结构域。在一种实施方式中，所述载体中的核酸序列进一步包含聚腺苷酸尾,例如，本文中描述的聚腺苷酸尾,例如，其包含大约150个腺苷碱基(SEQ ID NO:271)。在一种实施方式中，所述载体中的核酸序列进一步包含3’非翻译区(UTR),例如，本文中描述的3’非翻译区,例如，其包含源于人β-球蛋白的3’非翻译区的至少一个重复。
在另一个方面中，本发明涉及包含所述载体的细胞。所述的细胞可以是,例如，本文中描述的细胞。在一种实施方式中，所述的细胞是人T细胞,例如，本文中描述的T细胞,或人NK细胞,例如，本文中描述的人NK细胞。在一种实施方式中，所述的人T细胞是CD8+T细胞。在一种实施方式中，所述的细胞是自体的T细胞。在一种实施方式中，所述的细胞是同种异体的T细胞。在一种实施方式中，所述的细胞是T细胞并且所述的T细胞是二酰基甘油激酶(DGK)缺少的。在一种实施方式中，所述的细胞是T细胞并且所述的T细胞是Ikaros缺少的。在一种实施方式中，所述的细胞是T细胞并且所述的T细胞是DGK和Ikaros两者都缺少的。
在一个方面中，本文中描述的表达CAR的细胞可以进一步包含第二CAR,例如，包含同一个靶(例如，间皮素)或不同靶的不同的抗原结合结构域的第二CAR,例如，该不同靶例如是基质细胞上除间皮素以外的靶,FAP；前列腺癌细胞上除间皮素以外的靶,例如，雄激素受体,OR51E2,PSMA,PSCA,PDGRF-β,TARP,GloboH,MAD-CT-1,或MAD-CT-2；卵巢癌细胞上除间皮素以外的靶,例如，Tn,PRSS21,CD171,Lewis Y,叶酸受体α,claudin6,GloboH,或精子蛋白17；例如，肺癌细胞上除间皮素以外的靶,例如，VEGF,HER3,IGF-1R,EGFR,DLL4,或Trop-2)。在一种实施方式中，所述表达CAR的细胞包含第一CAR，其靶向第一抗原并且包含具有共刺激信号传导结构域但不具有主要信号传导结构域的细胞内信号传导结构域,和第二CAR，其靶向第二个不同的抗原并且包含具有主要信号传导结构域但不具有共刺激信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一种实施方式中，所述表达CAR的细胞包含包括间皮素结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域的第一间皮素CAR，以及第二CAR，该第二CAR靶向除间皮素以外的抗原(例如，在基质细胞,肺癌细胞,前列腺癌细胞或卵巢癌细胞上表达的抗原)并且包含抗原结合结构域、跨膜结构域和主要信号传导结构域。在另一种实施方式中，所述表达CAR的细胞包含包括间皮素结合结构域、跨膜结构域和主要信号传导结构域的第一间皮素CAR以及第二CAR，该第二CAR靶向除间皮素以外的抗原(例如，在基质细胞,肺癌细胞,前列腺癌细胞或卵巢癌细胞上表达的抗原)并且包含所述抗原、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域的抗原结合结构域。
在一种实施方式中，所述表达CAR的细胞包含本文中描述的间皮素CAR和抑制性CAR。在一种实施方式中，所述的抑制性CAR含有抗原结合结构域，该结构域与正常细胞而非癌细胞(例如，也表达间皮素的正常细胞)上发现的抗原结合。在一种实施方式中，所述的抑制性CAR包含抑制性分子的抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。例如,所述的抑制性CAR的细胞内结构域可以是PD1,PD-L1,CTLA4,TIM3,CEACAM(例如，CEACAM-1,CEACAM-3和/或CEACAM-5),LAG3,VISTA,BTLA,TIGIT,LAIR1,CD160,2B4和TGFRβ的细胞内结构域。
在另一种实施方式中，本文中描述的表达CAR的细胞可以进一步表达另一种作用剂,例如，增强表达CAR的细胞的活性或适应性的作用剂,例如，本文中描述的作用剂。例如，在一种实施方式中，所述的作用剂可以是抑制调控或调节(例如，抑制)T细胞功能的分子的作用剂。在一些实施方式中，所述的调控或调节T细胞功能的分子是抑制性分子。抑制性分子的例子包括PD1,PD-L1,CTLA4,TIM3,CEACAM(例如，CEACAM-1,CEACAM-3和/或CEACAM-5),LAG3,VISTA,BTLA,TIGIT,LAIR1,CD160,2B4和TGFRβ。在多个实施方式中,正如本文中描述的那样,可以使用作用剂,例如，抑制性核酸,例如，dsRNA,例如，siRNA或shRNA；或例如，抑制性蛋白质或系统,例如，簇状的规则间隔的短回文结构的重复(CRISPR)、转录活化剂样的效应子核酸酶(TALEN)或例如，锌指核酸内切酶(ZFN)来抑制在所述表达CAR的细胞中调控或调节(例如，抑制)T-细胞功能的分子的表达。在一种实施方式中，所述的作用剂是shRNA,例如，本文中描述的shRNA。在一种实施方式中，所述的调控或调节(例如，抑制)T-细胞功能的作用剂在表达CAR的细胞内被抑制。例如,使抑制调控或调节(例如，抑制)T-细胞功能的分子的表达的dsRNA分子连接到编码所述CAR的组件(例如，所有的组件)的核酸。
在一种实施方式中，所述的抑制抑制性分子的作用剂包含第一多肽,例如，抑制性分子,其与向所述细胞提供阳性信号的第二多肽(例如，本文中描述的细胞内信号传导结构域)相联系。在一种实施方式中，所述的作用剂包含第一多肽,例如，抑制性分子的第一多肽，例如PD1,PD-L1,CEACAM(例如，CEACAM-1,CEACAM-3和/或CEACAM-5),LAG3,CTLA4,,VISTA,CD160,BTLA,LAIR1,TIM3,2B4,TGFRβ和TIGIT,或这些中任何一个的片段(例如，至少这些中任何一个的细胞外结构域的部分)；和第二多肽，它是本文中描述的细胞内信号传导结构域(例如，它包含共刺激结构域(例如，41BB,CD27或CD28,例如，正如本文中描述的那样)和/或主要信号传导结构域(例如，本文中描述的CD3ζ信号传导结构域))。在一种实施方式中，所述的作用剂包含PD1的第一多肽或其片段(例如，至少PD1的细胞外结构域的部分),和本文中描述的细胞内信号传导结构域的第二多肽(例如，本文中描述的CD28信号传导结构域和/或本文中描述的的CD3ζ信号传导结构域)。
在另一个方面中，本发明涉及生产细胞的方法，其包括给本文中描述的细胞(例如，T细胞或NK细胞)转导含有编码CAR分子(例如，本文中描述的CAR分子)的核酸的载体。在一种实施方式中，所述的载体是本文中描述的慢病毒载体。
本发明还提供产生RNA工程化的细胞(例如，本文中描述的细胞,例如，暂时地表达外源RNA的T细胞或NK细胞)群的方法。所述的方法包括把体外转录的RNA或合成的RNA引入到细胞中,其中所述的RNA包含编码本文中描述的CAR分子的核酸。
在另一个方面中，本发明涉及在受试者中提供抗肿瘤免疫的方法，其包括给所述的受试者施用有效量的含有CAR分子的细胞,例如，本文中描述的表达CAR分子的细胞、本文中描述的细胞。在一种实施方式中，所述的细胞是自体的T细胞或NK细胞。在一种实施方式中，所述的细胞是同种异体的T细胞或NK细胞。在一种实施方式中，所述的受试者是人。
在另一个方面中，本发明涉及治疗患有与间皮素的表达相关的疾病的受试者的方法(例如，增生性疾病,癌症前期状况和与间皮素的表达相关的非癌症相关的适应症)，包括给所述的受试者施用有效量的含有CAR分子的细胞,例如，正如本文中描述的那样。
在一种实施方式中，所述的与间皮素相关的疾病是癌症,例如，本文中描述的癌症。在一种实施方式中，所述的与间皮素相关的疾病选自由下列组成的组:间皮瘤(例如，恶性胸膜间皮瘤),肺癌(例如，非小细胞肺癌,小细胞肺癌,鳞状细胞肺癌,或大细胞肺癌),胰腺癌(例如，胰腺导管腺瘤),卵巢癌,结肠直肠癌和膀胱癌或其任何组合。在一种实施方式中，所述的疾病是胰腺癌,例如，转移性胰腺导管腺瘤(PDA),例如，在已经在至少一种现有的标准疗法上有进步的受试者中的PDA。在一种实施方式中，所述的疾病是间皮瘤(例如，恶性胸膜间皮瘤),例如，在已经在至少一种现有的标准疗法上有进步的受试者中的间皮瘤。在一种实施方式中，所述的疾病是卵巢癌,例如，浆液性上皮卵巢癌,例如，在已经在至少一种现有的标准疗法方案后有进步的受试者中的卵巢癌。
在一种实施方式中，给已经接受了先前剂量的美法仑的受试者施用所述的表达间皮素CAR的细胞,例如，T细胞或NK细胞。
在一种实施方式中，与增强表达CAR分子的细胞的活性或适应性的作用剂(例如，本文中描述的作用剂)联合施用所述的表达CAR分子的细胞,例如，本文中描述的CAR分子。
在一种实施方式中，与低的增强免疫剂量的mTOR抑制剂联合施用所述的表达CAR分子(例如，本文中描述的CAR分子)的细胞。虽然不希望受理论的限制,但是相信伴随采用低的增强免疫剂量(例如，不足以完全压制免疫系统但足以改善免疫功能的剂量)的治疗的是PD-1阳性T细胞的减少或PD-1阴性细胞的增加。PD-1阳性T细胞而非PD-1阴性T细胞能够因衔接表达PD-1配体(例如，PD-L1或PD-L2)的细胞而被消耗。
在一种实施方式中，这种方法能够被用来优化所述受试者中本文中描述的CAR细胞的性能。虽然不希望受理论的限制,但是相信,在一种实施方式中，所述内源性的没有修饰的免疫效应细胞(例如，T细胞)的性能得到了改善。虽然不希望受理论的限制,但是相信,在一种实施方式中，所述的表达间皮素CAR的细胞的性能得到了改善。在其它实施方式中，可以通过与一定量的增大PD1阴性的免疫效应细胞(例如，T细胞)的数目或增大PD1阴性的免疫效应细胞(例如，T细胞)/PD1阳性的免疫效应细胞(例如，T细胞)的比率的mTOR抑制剂在活体外接触，来处理已经或将要被工程化以表达CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)。
在一种实施方式中,在施用本文中描述的表达CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)之前,开始施用低的增强免疫剂量的mTOR抑制剂,例如，别构抑制剂,例如，RAD001,或有催化活性的抑制剂。在一种实施方式中，在足够的时间或足够的定量给药mTOR抑制剂之后，施用所述的CAR细胞,使得PD1阴性的免疫效应细胞(例如，T细胞)的水平或PD1阴性的免疫效应细胞(例如，T细胞)/PD1阳性的免疫效应细胞(例如，T细胞)的比率已经被至少暂时地增大了。
在一种实施方式中,在足够的时间或足够的定量给药所述的低的增强免疫剂量的mTOR抑制剂,使得在所述的受试者中或从所述的受试者收获的PD1阴性的免疫效应细胞(例如，T细胞)的水平或PD1阴性的免疫效应细胞(例如，T细胞)/PD1阳性的免疫效应细胞(例如，T细胞)的比率已经被至少暂时地增大之后，收获将要被工程化以表达CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)。
在一种实施方式中，与减轻一种或更多种与施用表达CAR分子的细胞相关的副作用的作用剂(例如，本文中描述的作用剂)联合，来施用所述的表达CAR分子(例如，本文中描述的CAR分子)的细胞。
在一种实施方式中，与治疗所述的与间皮素的表达相关的疾病的作用剂(例如，本文中描述的作用剂)联合，来施用所述的表达CAR分子(例如，本文中描述的CAR分子)的细胞。
在一种实施方式中，以本文中描述的剂量和/或定量给药计划施用所述的表达CAR分子(例如，本文中描述的CAR分子)的细胞。
在一种实施方式中，以用于所述疾病(例如，所述的癌症,例如，本文中描述的癌症)的一线治疗形式施用所述的表达CAR分子(例如，本文中描述的CAR分子)的细胞。在另一种实施方式中，以用于所述疾病(例如，所述的癌症,例如，本文中描述的癌症)的二、三、四线治疗形式施用所述的表达CAR分子(例如，本文中描述的CAR分子)的细胞。
在一种实施方式中，施用本文中描述的细胞群。
在一种实施方式中，例如，利用体外转录把所述的CAR分子引入T细胞或NK细胞中,并且所述的受试者(例如，人)接受包含CAR分子的细胞的初次施用,以及包含CAR分子的细胞的一次或更多次后续的施用,其中所述的一次或更多次后续的施用是在所述先前的施用之后15天以内，例如，14,13,12,11,10,9,8,7,6,5,4,3,或2天以内。在一种实施方式中，每个星期给所述的受试者(例如，人)施用多于一次的包含CAR分子的细胞施用，例如，每个星期施用2,3或4次包含CAR分子的细胞施用。在一种实施方式中，所述的受试者(例如，人受试者)每个星期接受超过一次的包含CAR分子的细胞施用(例如，每个星期2,3或4次施用)(本文中也被称为循环),随后一个星期不施用包含CAR分子的细胞,再然后给所述的受试者施用一次或更多次额外的包含CAR分子的细胞施用(例如，每个星期施用所述的包含CAR分子的细胞超过一次)。在另一种实施方式中，所述的受试者(例如，人受试者)接受超过一个循环的包含CAR分子的细胞,并且每个循环之间的时间少于10,9,8,7,6,5,4,或3天。在一种实施方式中，每个星期每隔一天施用所述的包含CAR分子的细胞，持续3次施用。在一种实施方式中，施用所述的包含CAR分子的细胞持续至少2，3，4，5，6，7，8个或更多个星期。
在一个方面中，本发明包括自体或同种异体的细胞群，所述的细胞群被转染或转导了包含编码间皮素-CAR分子(例如，如本文中描述的那样)的核酸分子的载体。在一种实施方式中，所述的载体是逆转录病毒载体。在一种实施方式中，所述的载体是如本文别处描述的自身灭活的慢病毒载体。在一种实施方式中，所述的载体被递送(例如，通过转染或电穿孔)到细胞,例如，T细胞或NK细胞,其中所述的载体包含编码如本文中描述的间皮素CAR分子的核酸分子，该核酸分子被转录为mRNA分子,并且从所述的RNA分子翻译所述的间皮素CAR分子并且表达在所述细胞的表面上。
在另一个方面中，本发明提供表达CAR的细胞(例如，CART细胞)群。在一些实施方式中,所述的表达CAR的细胞群包括表达不同的CAR的细胞混合物。例如,在一种实施方式中，所述的CART细胞群可以包含第一细胞，其表达具有本文中描述的抗间皮素结合结构域的CAR；和第二细胞，其表达具有不同的抗间皮素结合结构域(例如，本文中描述的抗间皮素结合结构域,它不同于由所述第一细胞表达的所述CAR中的抗间皮素结合结构域)的CAR。作为另一个例子,所述的表达CAR的细胞群可以包括：第一细胞，其表达包含抗间皮素结合结构域的CAR(例如，正如本文中描述的那样)；和第二细胞，其表达含有除间皮素以外的靶(例如，基质细胞上除间皮素以外的靶,例如，FAP；前列腺癌细胞上除间皮素以外的靶,例如，雄激素受体,OR51E2,PSMA,PSCA,PDGRF-β,TARP,GloboH,MAD-CT-1或MAD-CT-2；卵巢癌细胞上除间皮素以外的靶,例如，Tn,PRSS21,CD171,Lewis Y,叶酸受体α,claudin6,GloboH,或精子蛋白17；例如，肺癌细胞上除间皮素以外的靶,例如，VEGF,HER3,IGF-1R,EGFR,DLL4,或Trop-2)的抗原结合结构域的CAR。在一种实施方式中，所述的表达CAR的细胞群包括,例如，第一细胞，其表达含有主要细胞内信号传导结构域的CAR；和第二细胞，其表达含有次要信号传导结构域的CAR。
在另一个方面中，本发明提供细胞群，其中所述群中的至少一种细胞表达具有本文中描述的抗间皮素结合结构域的CAR,并且第二细胞表达另一种作用剂,例如，增强表达CAR的细胞的活性或功能的作用剂。例如,在一种实施方式中，所述的作用剂可以是抑制调控或调节(例如，抑制)T细胞功能的分子的作用剂。在一些实施方式中,所述的调控或调节T细胞功能的分子是抑制性分子,例如，本文中描述的作用剂。抑制性分子的例子包括PD1,PD-L1,CTLA4,TIM3,CEACAM(例如，CEACAM-1,CEACAM-3和/或CEACAM-5),LAG3,VISTA,BTLA,TIGIT,LAIR1,CD160,2B4和TGFRβ。在多个实施方式中,作用剂,例如，抑制性核酸,例如，dsRNA,例如，siRNA或shRNA；或例如，抑制性蛋白质或系统,例如，簇状的规则间隔的短回文结构的重复(CRISPR)、转录活化剂样的效应子核酸酶(TALEN)或锌指核酸内切酶(ZFN),例如，正如本文中描述的那样,能够被用于抑制在所述表达CAR的细胞中调控或调节(例如，抑制)T细胞功能的分子的表达。在一种实施方式中，所述的作用剂是shRNA,例如，本文中描述的shRNA。在一种实施方式中，所述的调控或调节(例如，抑制)T-细胞功能的作用剂在表达CAR的细胞内被抑制。例如,抑制调控或调节(例如，抑制)T-细胞功能的分子的表达的dsRNA分子与编码所述CAR的组件(例如，所有的组件)的核酸连接。
在一种实施方式中，所述的抑制抑制性分子的作用剂包含第一多肽,例如，抑制性分子,其与向所述细胞提供阳性信号的第二多肽(例如，本文中描述的细胞内信号传导结构域)相联系。在一种实施方式中，所述的作用剂包含第一多肽，例如，抑制性分子的，例如PD1,PD-L1,CEACAM(例如，CEACAM-1,CEACAM-3和/或CEACAM-5),LAG3,CTLA4,,VISTA,CD160,BTLA,LAIR1,TIM3,2B4,TGFRβ和TIGIT,或这些中任何一个的片段(例如，至少这些中任何一个的细胞外结构域的部分)；和第二多肽，它是本文中描述的细胞内信号传导结构域(例如，它包含共刺激结构域(例如，41BB,CD27或CD28,例如，正如本文中描述的那样)和/或主要信号传导结构域(例如，本文中描述的CD3ζ信号传导结构域)。在一种实施方式中，所述的作用剂包含PD1的第一多肽或其片段(例如，至少PD1的细胞外结构域的部分),和本文中描述的细胞内信号传导结构域(例如，本文中描述的CD28信号传导结构域和/或本文中描述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。
在一种实施方式中，所述的编码间皮素CAR分子的核酸分子(例如，正如本文中描述的那样)被表达成mRNA分子。在一种实施方式中，可以通过把编码所要的CAR的RNA分子(例如，没有载体序列)转染或电穿孔到所述的细胞中，来产生所述的基因修饰的表达间皮素CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)。在一种实施方式中，一旦所述的RNA分子被掺入，就从它翻译间皮素CAR分子并且表达在所述重组细胞的表面上。
在另一个方面中，本发明涉及编码CAR分子(例如，本文中描述的CAR分子)的分离的核酸分子、本文中描述的CAR分子、本文中描述的包含CAR分子的载体和/或本文中描述的包含CAR分子的细胞用作药物的用途。
在另一个方面中，本发明涉及本文中描述的编码CAR分子的分离的核酸分子、本文中描述的CAR分子、本文中描述的包含CAR分子的载体和/或本文中描述的包含CAR分子的细胞用于治疗表达间皮素的疾病的用途,例如，正如本文中描述的那样。
附图简述
图1是所述的pD-A.anti-meso BD.OF.BBZ.2bg.150A质粒的示意图。该图以SEQ IDNO:271公开了"150A"。
图2描绘了可以使用的细胞生产和治疗计划。(A)通过白细胞单采血液成分术获得了自体细胞，并且通过用抗CD3/CD28 mAb包被的磁珠扩展而富集了T细胞。扩展细胞8-12天。在培养的最后一天，利用磁场除去所述的磁珠，并且洗涤所述的细胞,用人间皮素CARmRNA构建体进行电穿孔,并且低温保存在不溶的介质中。(B)描绘了三个治疗输注计划。按照计划1,在第0天，患者通过静脉内(i.v.)输注接受1x108个含有人间皮素的CART细胞，随后在一个星期以后接受1x109个含有人间皮素的CART细胞。在患者适合于计划2之前，监测安全性最低一个月。按照计划2,患者通过每个星期静脉内输注3次持续一个星期来接受1x108个含有人间皮素的CART细胞，随后休息一个星期，然后每个星期施用3次持续一个星期来接受1x109个含有人间皮素的CART细胞。按照计划3,患者通过每个星期静脉内输注3次来接受3x108/m2个含有人间皮素的CART细胞，随后在第+35和+57天，通过肿瘤内注射，向原发性病灶中注入2x108个含有人间皮素的CART细胞。
图3A和3B是试验的被转导了小鼠SS1 CAR或本发明的抗MSLN CAR M1至M12，并且要么与不表达MSLN的对照K562细胞一起培养(如图3A中所示),要么与被转导以表达MSLN的K562细胞(K562-Meso)一起培养(如图3B中所示)的供体2(健康的供体)的T细胞的细胞毒性的图示。
图4A和4B是显示在通过MSLN+刺激时，所述的小鼠SS1和CD19CART以及所述的抗MSLN CART的IFNγ分泌的图。图4A显示对所述转导的细胞系K562-Meso及其MSLN-阴性的亲本系K562的反应性。图4B显示对天然地表达MSLN的癌细胞；所述的卵巢癌系Ovcar8和所述的胰腺癌系SW1990以及Panc0203的反应性。
图5显示为通过给CAR构建体转导慢病毒载体而生产的间皮素CART设计的临床试验。
图6A,6B,6C,和6D显示了CART-meso细胞的抗肿瘤活性。
图7A,7B,和7C显示CARTmeso细胞的体内持久性以及向原发性和转移性肿瘤位点的转移。
图8显示在CARTmeso细胞输注后，血清中的细胞因子和趋化因子。
图9A和9B显示CARTmeso细胞对抗肿瘤抗体的诱导。血清是从所述的MPM患者(图9A)和所述的胰腺癌患者(图9B)获得的。
图10显示被注射了EMMESO肿瘤细胞的NSG小鼠中的肿瘤生长。在肿瘤生长到～200mm3的尺寸以后,经由尾静脉注射mesoCAR T细胞并且在注射后39天进行测定。
图11A和11B通过流式细胞术分析显示，在注射的时间(图11A)或在40天以后在从异体移植的肿瘤收获的时间，mesoCAR的表达。
图12显示在39天以后，当从NSG小鼠的侧腹分离时或者在转导后低温保存的mesoCAR T细胞关于体外杀伤的功能性能力。
图13显示与整夜静息的TIL相比，在从EMESO侧腹肿瘤分离的TIL中，抑制剂酶DGK和SHP1的表达。
图14A,14B,14C,14D,14E,和14F显示采用具有下调mesoCART关于肿瘤细胞杀死的功能(图14A,14C和14E)和IFNγ细胞因子分泌(图14B,14C和14F)的抑制机制的抑制剂(抗PDL1,DGK抑制剂和SSG)的治疗效果。
图15A,15B,15C,和15D显示在用各种肿瘤细胞系刺激后，来自一小组人CART-MSLN的细胞因子分泌。图15A显示IFNγ分泌。图15B显示TNF。图15C显示IL-2。图15D显示IL-4。
图16A和16B显示CART-MSLN-5,CART-MSLN-11,CART-MSLN17和鼠CART-MSLN-SS1的抗Ovcar3(图16A)和U87mg(图16B)肿瘤细胞的杀死试验结果。
图17A和17B显示所述的CART-MSLN组抗Ovcar3肿瘤细胞的杀死试验结果。
图18显示在所述的Ovcar8异体移植模型中，第一组CART-MSLN(包括M5,M11,M17,和M21)的抗肿瘤活性。
图19显示在所述的Ovcar8异体移植模型中，第二组CART-MSLN(包括M12,M14,M16,和M23)的抗肿瘤活性。
图20A,20B,和20C描绘了与新鲜的或解冻的mesoCAR T细胞相比，在肿瘤微环境(TILs)中，mesoCAR T细胞的功能丧失随时间的变化。A)细胞毒性试验；B)IFNγ释放试验；和C)ERK信号传导(经由磷酸化)的蛋白质印迹分析。
图21描绘了DGK缺失对mesoCAR T细胞的细胞毒性的影响。在不同的效应子：靶标比例下评估靶细胞杀伤百分比。
图22描绘了DGK的缺失对IFNγ产生和从mesoCAR T细胞释放的影响。在不同的效应子:靶比率下估测了IFNγ的浓度。
图23描绘了DGK的缺失对ERK信号传导或T细胞活化、mesoCAR T细胞的影响。B:白蛋白,M:间皮素,3/28:CD3/CD28刺激的细胞。
图24描绘了DGK的缺失对mesoCAR T细胞关于细胞毒活性的TGFβ敏感性的影响。
图25A和25B描绘了在肿瘤小鼠模型中，DGK的缺失对mesoCAR T细胞的治疗效果的影响。A)通过肿瘤体积随时间的变化，显示了对抗肿瘤活性的影响。B)肿瘤浸润细胞的持久性和增殖。
图26A,26B,26C,26D,26E,和26F显示在具有减小的Ikaros水平的表达CAR的T细胞中，细胞因子的产生和细胞毒性的介体释放。图26A显示通过流式细胞术(左边的组)和蛋白质印迹(右边的组)测定的在野生型和Ikzf1+/-CAR T细胞中Ikaros的表达。在用间皮素包被的珠,PMA/离子霉素(PMA/I)或BSA包被的珠(对照)刺激后,测定了产生IFN-γ(图26B)、TNF-α(图26C)和IL-2(图26D)的细胞的百分数、所述细胞毒性的介体颗粒酶B(图26E)和CD107a的表达(图26F)。
图27A,27B,和27C显示在具有显性阴性的Ikaros等位基因的表达CAR的T细胞(IkDN)中细胞因子的产生和细胞毒性介体的释放。在用间皮素包被的珠,PMA/离子霉素(PMA/I),或BSA包被的珠(对照)刺激后,测定了产生IFN-γ(图27A)、IL-2(图27B)的细胞的百分数和CD107a的表达(图27C)。
图28A,28B,28C,28D,和28E显示:在抗原刺激后，Ikaros的消耗没有增大CAR T细胞的活化和信号传导。在所指示的时间点，通过流式细胞术测定了在Ikzf1+/-CAR T细胞中CD69(图28A),CD25(图28B),和4-1BB(图28C)的水平。在图28D中,在用CD3/CD28抗体进行TCR刺激后，在野生型(WT)和Ikaros显性阴性的细胞(IkDN)中检查了所述的RAS/ERK信号传导途径。通过蛋白质印迹估测了磷酸化的TCR信号传导蛋白质例如磷酸化的PLCγ,磷酸化的Lck,磷酸化的JNK,磷酸化的Akt,磷酸化的ERK,磷酸化的IKKα,和I Bα的水平。在图28E中,用BSA或间皮素包被的珠刺激被转导了mesoCAR的WT和IkDN细胞,并且通过蛋白质印迹通过估测磷酸化的ERK和磷酸化的PLCγ的水平，来检查下游的信号传导途径。
图29A,29B,29C,29D,和29E显示:在CAR T细胞中Ikaros的减少增大了体外抗靶细胞AE17或表达间皮素的AE17(AE17 meso)的反应。图29A描绘了在所指示的效应子:靶细胞比率下，在WT和Ikzf1+/-meso CART细胞中IFNγ的产生。在所指示的效应子:靶细胞比率下测定了表达meso CAR的WT和Ikzf1+/-(图29B)以及IkDN(图29C)的细胞溶解。在所指示的效应子:靶细胞比率下，测定了WT和被转导了FAP-CAR的Ikzf1+/-的IFNγ产生(图29D)和细胞溶解(图29E),其中所述的靶细胞是表达FAP的3T3细胞。
图30A,30B和30C显示Ikaros被耗尽的CAR T细胞对抗体内建立的肿瘤的效力。给具有建立的表达间皮素的AE17肿瘤的小鼠施用了CAR T细胞。在施用表达mesoCAR的WT和Ikzf1+/-(图30A)或IkDN(图30B)后，测量了肿瘤体积。在施用表达FAP-CAR的WT和Ikzf1+/-(图30C)后，测量了肿瘤体积。
图31A,31B,31C,31D,31E和31F显示，与WT CAR T细胞相比，在所述的免疫抑制性肿瘤微环境中，Ikzf1+/-CAR T细胞的增大的持久性和抗性。通过流式细胞术检测了从所述的脾(图31A)和肿瘤(图31B)收获的表达CAR的WT或Ikzf1+/-细胞(GFP阳性的)的百分数。在用CD3/CD28抗体(图31C)或PMA/离子霉素(PMA/I)(图31D)刺激后，通过测定IFNγ的产生，来估测在输注后3天，从所述的脾或肿瘤收获的所述CAR T细胞的功能性能力。通过测定在输注后9天，从所述的脾或肿瘤收获的CAR T细胞上Treg或巨噬细胞标记物的表达，估测了起调节作用的T细胞(CD4+FoxP3+表达)和巨噬细胞(CD206表达)。
图32A和32B显示:具有减小的Ikaros水平的T细胞对可溶性的抑制因子TGFβ和腺苷不太敏感。测试了表达mesoCAR的WT、Ikzf1+/-和IkDN细胞的对TGF-β或腺苷做出反应而产生IFNγ的能力图32A)和细胞毒性(图32B)。
图33A和33B是显示与安慰剂相比，对流感疫苗菌株的滴度增大的图。在图33A中显示了对于意图要处理群的每一个所述的RAD001定量给药组,在接种后4个星期，相对于在所述安慰剂组中的增大，针对所述3种流感疫苗菌株(H1N1 A/California/07/2009,H3N2A/Victoria/210/2009,B/Brisbane/60/2008)中的每一种，流感几何平均滴度在基线上方的增加。粗体黑线指示:为了达到所述研究的主要终点，对于3种流感疫苗菌株中的2种，要求满足相对于安慰剂滴度的1.2倍增大。星号“*”指示:相对于安慰剂，GMT滴度的增大以至少80％的后验概率超过1。图33B是关于具有<＝1:40的基线流感滴度的受试者亚组的与图33A中相同的数据图。
图34显示在接种后4个星期，RAD001浓度对针对每一种流感疫苗菌株的几何平均滴度的增大倍数的散布图。在已经给受试者定量给药4个星期后，测定RAD001浓度(定量给药后1小时)。所有已经具有药代动力学测量值的受试者都被包括在所述的分析组中。在y轴上显示了在接种后4个星期，几何平均滴度相对于基线的增大倍数。
图35是图示，显示了与安慰剂相比，针对异源流感株系的滴度增大。显示了对于意图要处理群的所述RAD001定量给药组中的每一个，在接种后4个星期，相对于在所述安慰剂组中的增大，在基线上方针对没有被包含在所述流感疫苗中的2种异源流感株系(A/H1N1株系A/New Jersey/8/76和A/H3N2株系A/Victoria/361/11)的流感几何平均滴度的增大。*指示:相对于安慰剂滴度增大超过1,后验概率为至少80％。
图36A和36B是在流感接种前后IgG和IgM水平的图示。在流感接种前和接种后4个星期，在从受试者获得的血清中测定了抗A/H1N1/California/07/2009流感IgG和IgM的水平。在所述的RAD001组和安慰剂组之间，从基线到接种后4个星期没有检测到在抗H1N1流感IgG和IgM水平的改变的显著性差异(根据Kruskal-Wallis秩和检验，所有的p值>0.05)。
图37A,37B和37C是在RAD001治疗后，PD-1-阳性的CD4和CD8的减少百分数以及PD-1-阴性的CD4 T细胞的增加百分数的图示。PD-1-阳性的CD4、CD8和PD-1-阴性的CD4 T细胞的百分数是通过处于基线时、在6个星期的研究药物治疗后(第6个星期)和在研究药物中断后6个星期以及在流感疫苗接种后4个星期(第12个星期)的PBMC样品的FACS分析来测定的。图37A显示在第12个星期时，与安慰剂组(n＝25)相比，以剂量水平0.5mg/天(n＝25),5mg/星期(n＝29)和20mg/星期(n＝30)接受了RAD001的组中，PD-1-阳性的CD4 T细胞有显著性减少(-37.1--28.5％)，分别具有p＝0.002(0.02),p＝0.003(q＝0.03)和p＝0.01(q＝0.05)。图37B显示在第12个星期时，与安慰剂组(n＝25)相比，在以剂量水平0.5mg/天(n＝25),5mg/星期(n＝29)和20mg/星期(n＝30)接受了RAD001(n＝109)的组中，PD-1-阳性的CD8 T细胞有显著性减少(-43.3--38.5％)，分别具有p＝0.01(0.05),p＝0.007(q＝0.04)和p＝0.01(q＝0.05)。图37C显示在第12个星期时，与安慰剂组(n＝25)相比，在以剂量水平0.5mg/天(n＝25),5mg/星期(n＝29)和20mg/星期(n＝30)接受了RAD001(n＝109)的组中，PD-1-阴性的CD4 T细胞有显著性增加(3.0-4.9％)，分别具有p＝0.0007(0.02),p＝0.03(q＝0.07)和p＝0.03(q＝0.08)。
图38A和38B是在RAD001治疗后，针对在基线PD-1表达方面的差异进行调整的PD-1-阳性的CD4和CD8的减少百分数以及PD-1-阴性的CD4T细胞的增加百分数的图示。PD-1-阳性的CD4、CD8和PD-1-阴性的CD4T细胞的百分数是通过处于基线时、在6个星期的研究药物治疗后(星期6)和在研究药物中断后6个星期以及在流感接种后4个星期(星期12)的PBMC样品的FACS分析而测定的。图38A显示在第6个星期时，与安慰剂组(n＝25)相比，在所述汇合的RAD组(n＝84)中，PD-1+CD4 T细胞有30.2％的显著性减少，p＝0.03(q＝0.13)。在第12个星期时，与所述安慰剂组相比，在所述汇合的RAD组中PD-1-阳性的CD4 T细胞的减少是32.7％，具有p＝0.05(q＝0.19)。图38B显示在第6个星期时，与安慰剂组(n＝25)相比，在所述汇合的RAD001组(n＝84)中，PD-1-阳性CD8 T细胞有37.4％的显著性减少，p＝0.008(q＝0.07)。在第12个星期时，在所述汇合的RAD001组中，与安慰剂组相比，PD-1-阳性的CD8 T细胞的减少是41.4％，p＝0.066(q＝0.21)。图38A和38B代表图37A,37B和37C中的数据，但是图37A,37B和37C的不同的RAD001剂量组被汇合到图38A和38B中的单一RAD001治疗组中。
图39描绘了对RAD001做出反应，在年老受试者中锻炼和能量的增加。
图40A和40B描绘了RAD001对细胞中P70 S6K活性的预测的影响。图40A描绘了每个星期和每日以较高剂量的RAD001对P70 S6激酶的抑制；图40B描绘了每个星期以较低剂量的RAD001对P70 S6激酶的抑制。
图41A、41B和41C是scFvs SS1的Biacore T200 SPR传感图(图41A)、M5的BiacoreT200 SPR传感图(图41B)和M11的Biacore T200 SPR传感图(图41C)。
图42A、42B和42C是所述的抗人间皮素scFvs与所述的鼠SS1 scFv相比的表位划分SPR传感图。观察到了对scFvs M12,M14,M16,M17,M21和M23(图42A)的竞争性结合。ScFv M5(图42B)和M11(图42C)与不同于SS1的表位结合。
图43是描绘在所述的OVCAR8肿瘤模型中，在各种间皮素CAR T治疗后肿瘤生长的图。平均肿瘤体积+/-SEM至肿瘤植入后第62天。在第14和19天施用T细胞。小圆圈:用100ulPBS经由侧尾静脉治疗的小鼠；黑方块:用同种型对照T细胞治疗的小鼠；灰三角:用一个剂量的SS1 CAR T细胞治疗的小鼠；倒置的三角:用双剂量的SS1 CAR T细胞治疗的小鼠；菱形:用单一剂量的M5 CAR T细胞治疗的小鼠；大圆圈:用双剂量的M5CAR T细胞治疗的小鼠；灰方块:用单一剂量的M11 CAR T细胞治疗的小鼠；和黑三角:用双剂量的M11 CAR T细胞治疗的小鼠。
图44是在氢氘交换质谱分析中，人间皮素肽覆盖的图示。每个黑棒代表一个肽。
图45A和45B是图示，显示了当人间皮素与SS1(黑棒)和M5(灰棒)的配合时，其在氘摄取方面的差别。对于每一种被检测的肽片段(被表示在x轴上),描绘了在抗体结合时在氘摄取方面的差别(被表示在y轴上)，在氨基酸297-464处的肽在图45A中，而在氨基酸458-586处的肽在图45B中。所有的差别都是相对于未结合的间皮素的氘摄取(对照)。*代表利用所述的Tukey检验，差异小于0.75Da肽的统计学上显著区域。
图46是图示，显示了抗原人间皮素(氨基酸296-588)的一级序列以及被SS1和M5保护的区域。所述的黑棒代表当与SS1(氨基酸314-315,317-318,346-349,和369-375)配合时，被保护的氨基酸。所述的灰棒代表当与M5(氨基酸485-490,498-507,532-537,和545-572)配合时，被保护的氨基酸。图47显示通用图，其显示构建体的不同构型，所述构建体编码含有shRNA的CAR，用于共表达所述的CAR和shRNA。图47A-47D显示在单一载体上的各种构型,例如，其中所述的U6调节的shRNA在所述EF1α调节的CAR编码元件的上游或下游。在图47A和47B中描绘的实例性构建体中，转录通过所述的U6和EF1α启动子沿着同一方向发生。在图47C和47D中描绘的示例性构建体中，转录通过所述的U6和EF1α启动子沿着不同的方向发生。在图47E中,所述的shRNA(以及相应的U6启动子)位于第一载体上,而所述的CAR(以及相应的EF1α启动子)位于第二载体上。
图48描绘了两种示例性的RCAR构型的结构。所述的抗原结合构件包括抗原结合结构域、跨膜结构域和开关结构域。所述的分子内结合构件包括开关结构域、共刺激信号传导结构域和主要信号传导结构域。这两种构型证实了:就所述的抗原结合构件和所述的分子内结合构件来说，本文中描述的第一和第二开关结构域可能沿着不同的取向。本文中进一步描述了其它的RCAR构型。
详述
定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术术语和科技术语具有与如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
术语“一个(一种)”是指冠词的一个(一种)或多于一个(一种)(即，至少一个(一种))的语法宾语。例如，“一个元件”是指一个元件或多于一个元件。
当涉及可测量值比如量、暂时持续时间等时，术语"约”是指包括指定值的±20％，或在某些情况下±10％，或在某些情况下±5％，或在某些情况下±1％，或在某些情况下±0.1％的变化，因此这样的变化适于进行所公开的方法。
术语“嵌合抗原受体”或备选地“CAR”是指一组多肽，在最简单的实施方式中通常是两组，当其在免疫效应细胞中时，给所述的细胞提供针对靶细胞(通常是癌细胞)的特异性，并且具有细胞内信号产生。在某些实施方式中，CAR包括至少一个细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞质信号传导结构域(本文中也称为“细胞内信号传导结构域”)，其包括来源于如下定义的刺激性分子和/或共刺激性分子的功能信号传导结构域。在某些方面，多肽组彼此邻接。在某些实施方式中，多肽组包括在存在二聚化分子时可以使多肽彼此偶联的二聚化开关，例如，可以使抗原结合结构域偶联至细胞内信号传导结构域。在一个方面，刺激性分子为与T细胞受体复合体结合的ζ链。在一个方面，细胞质信号传导结构域进一步包括一种或多种来源于至少一个如下定义的共刺激性分子的功能性信号传导结构域。在一个方面，共刺激性分子选自本文所述共刺激性分子，例如4-1BB(即，CD137)、CD27和/或CD28。在一个方面，CAR包括嵌合融合蛋白，该融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含来源于刺激性分子的功能性信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白，该融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含来源于共刺激性分子的功能性信号传导结构域和来源于刺激性分子的功能性信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一个方面中，CAR包含嵌合融合蛋白，该融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含来源于一个或更多个共刺激性分子的两个功能性信号传导结构域和来源于刺激分子的功能性信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一个方面中，CAR包含嵌合融合蛋白，该融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含至少两个来源于一个或更多个共刺激性分子的功能性信号传导结构域和来源于刺激分子的功能性信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一个方面，CAR包含在CAR融合蛋白的氨基末端(N-末端)的任选的前导序列。在一个方面，CAR进一步包含在细胞外抗原结合结构域的N-末端的前导序列，其中所述前导序列任选地在所述CAR的细胞加工和定位于细胞膜期间被从抗原结合结构域(例如scFv)上切割下来。
术语“信号传导结构域”是指通过在细胞内传递信息而起作用的蛋白质的功能性部分，用来通过产生第二信使或通过响应这样的信使起效应物作用经由确定的信号传导途径调节细胞的活性。
正如本文中使用的那样，术语“间皮素”是指40kDa的蛋白质间皮素，其通过由糖基磷脂酰肌醇(GPI)键和氨基末端的31-kDa脱落片段(称为巨核细胞增强因子)(MPF)锚固于细胞膜。两个片段都含有N-糖基化位点。该术语也指40-kDa羧基端片段的可溶性剪接变体，也称为“可溶性间皮素/MPF-相关的”。优选地，该术语是指GenBank登录号AAH03512.1的人间皮素及其天然切割下来的部分，例如在细胞膜(例如癌细胞膜)上表达的。
正如本文中使用的那样，术语“抗体”是指源于特异性地结合抗原的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以为多克隆的或单克隆的、多链或单链、或完整的免疫球蛋白，并且可以来源于天然来源或重组来源。抗体可以为免疫球蛋白分子的四聚体。
术语“抗体片段”是指保留与抗原的表位特异性地相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)的能力的抗体的至少一部分。抗体片段的实例包括，但不限于Fab，Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键-连接的Fvs(sdFv)、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、线性抗体、单域抗体比如sdAb(VL或VH)、camelid VHH结构域、由抗体片段(例如包括在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段)形成的多特异性抗体和抗体的分离的CDR或其它表位结合片段。抗原结合片段也可以被掺入单域抗体、最大抗体、微小抗体、纳米抗体、胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双-scFv(参见，例如Hollinger和Hudson，Nature Biotechnology 23:1126-1136,2005)。抗原结合片段也可以接枝到基于多肽的支架，比如III型纤连蛋白(Fn3)(参见美国专利号：6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽微小抗体)。
术语“scFv”是指包含至少一个包括轻链的可变区抗体片段和至少一个包括重链的可变区的抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链和重链可变区是邻接的(例如经由合成接头例如短的柔性多肽接头)，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scFv保留其所来源的完整抗体的特异性。除非指定，否则如正如本文中使用的那样，scFv可以以任何顺序(例如相对于多肽的N-末端和C末端)具有所述的VL和VH可变区，scFv可以包括VL-接头-VH或可以包括VH-接头-VL。
包含抗体或其抗体片段的本发明的CAR部分可以以多种形式存在，其中抗原结合结构域被表达为连续的多肽链的一部分，所述多肽链包括例如单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)人源化抗体或双特异性抗体(Harlow等人,1999,In:Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等人,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等人,1988,Science 242:423-426)。在一个方面，本发明的CAR组合物的抗原结合结构域包括抗体片段。在一个进一步的方面，CAR包括包含scFv的抗体片段。
术语“抗体重链”是指以其天然存在的构型存在于抗体分子中且通常决定抗体所属类型的两种多肽链中较大者。
术语“抗体轻链”是指以其天然存在构型存在于抗体分子中的两种多肽链的较小者。κ(k)和λ(l)轻链是指两种主要的抗体轻链的同种型。
术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，比如例如由噬菌体或酵母菌表达系统表达的抗体。该术语也应当解释为指已经通过合成编码抗体的DNA分子(且其中DNA分子表达抗体蛋白质)或指定抗体的氨基酸序列产生的抗体，其中所述DNA或氨基酸序列已经使用重组DNA或本领域可获得且熟知的氨基酸序列技术获得。
术语“抗原”或“Ag”是指引起免疫应答的分子。该免疫应答可以涉及抗体产生或有特异性免疫能力的细胞的活化或两者。本领域技术人员应当理解包括实际上所有蛋白质或肽的任何大分子都可以充当抗原。此外，抗原可以来源于重组或基因组DNA。当在本文中使用该术语时，本领域技术人员应当理解包括编码引起免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA，因此编码“抗原”。此外，本领域技术人员应当理解抗原无需仅通过基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用超过一个基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以不同组合排列以编码引发期望免疫应答的多肽。而且，本领域技术人员应当理解抗原根本无需由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以合成产生，或者可以来源于生物样品，或者可以是除了多肽之外的大分子。这样的生物样品可以包括，但不限于组织样品、肿瘤样品、具有其它生物组分的细胞或液体。
术语“竞争”是指抗原结合结构域例如抗体或其片段干扰另一个抗原结合结构域(例如本文提供的抗原结合结构域，例如本文提供的抗体或其片段)直接地或间接地结合靶(例如间皮素)的能力。抗原结合结构域例如抗体或其片段能够干扰另一个抗原结合结构域例如抗体或其片段结合至靶的程度(因此无论其是否被称为竞争)可以使用竞争结合试验来测定。在某些实施方式中，竞争结合试验是定量竞争试验。例如，一种特别合适的定量竞争试验使用基于表面等离振子共振(SPR)的方法测定一种抗体或其片段和另一种抗体或其片段与固定靶的结合(例如竞争)。一种示例性的基于SPR的竞争试验被描述在本文的实施例2中。另一种合适的定量竞争试验使用基于FACS方法测量标记的(例如，组氨酸标记的、生物素化的或放射性标记的等)抗体或其片段和另一个抗体或其片段之间结合靶的竞争。
术语“抗癌作用”是指可以通过多种手段表现的生物效应，包括但不限于例如肿瘤体积减小、癌细胞数量减少、转移数量减少、预期寿命增加、癌细胞增殖减少、癌细胞存活率降低或与癌性病症有关的各种生理学症状的改善。“抗癌作用”也可以通过肽、多核苷酸、细胞和抗体预防癌症首次出现的能力。术语“抗癌作用”是指可以通过各种手段表现的生物学效应，包括但不限于例如肿瘤体积减小、肿瘤细胞数量减少、肿瘤细胞增殖减少或肿瘤细胞存活率降低。
术语“自体的”是指来源于个体的任何物质，所述物质随后再被引入到的相同个体。
术语“同种异体的”是指来源于与将导入物质的个体相同物种的不同动物的任何物质。当一个或更多个基因座的基因不相同时，两个或多个个体被认为是彼此同种异体的。在某些方面，来自相同物种的个体的同种异体物质可以在遗传上是足够不同的而以在抗原性上相互作用。
术语“异种的”是指移植物来源于不同种类的动物。
术语“癌症”是指特征为异常细胞的不受控制生长的疾病。癌细胞可以局部扩散或穿过血流和淋巴系统至身体的其他部分。各种癌症的实例是本文描述的，包括但不限于间皮瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。
术语“与间皮素的表达有关的疾病”包括，但不限于与间皮素的表达有关的疾病或与表达间皮素的细胞有关的病症，包括例如增殖性疾病比如癌症或恶性肿瘤或癌变前病症，比如间皮增生；或与表达间皮素的细胞有关的非癌相关适应症。表达间皮素的各种癌症的实例包括，但不限于间皮瘤、肺癌、卵巢癌、胰腺癌等。
术语“保守的序列修饰”是指不会显著地影响或改变含有该氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。修饰可以通过本领域已知的标准技术(比如定点诱变和PCR-介导的诱变)引入到本发明的抗体或抗体片段中。保守的氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的取代。在本领域中已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天门冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，在本发明的CAR之内的一个或更多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的氨基酸残基替代，并且可以使用本文所述的功能性测定来测试改变的CAR例如结合间皮素的能力。
术语“刺激”是指由刺激性分子(例如，TCR/CD3复合体或CAR)与其同源配体(或在CAR的情况下为肿瘤抗原)的结合，由此介导信号转导事件(比如但不限于经由TCR/CD3复合体的信号转导或经由适合的NK受体或CAR的信号传导结构域的信号转导)而诱导的初次应答。刺激可以介导某些分子的改变的表达。
术语“刺激性分子”是指由免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、B细胞)表达的提供细胞质信号传导序列的分子，该信号传导序列以刺激性方式调节用于免疫细胞信号传导途径的至少一些方面的免疫细胞的活化。在一个方面，信号是通过例如TCR/CD3复合体与负载有肽的MHC分子的结合启动的初级信号，并且其导致介导T细胞应答，包括，但不限于增殖、活化、分化等。以刺激方式起作用的一级细胞质信号传导序列(也称为“初级信号传导结构域”)可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。特别地用于本发明的含有ITAM的细胞质信号传导序列的实例包括，但不限于来源于下述的那些：CD3ζ、常见的FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcEpsilon R1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12。在本发明的特异性CAR中，在本发明的任一个或更多个CAR中的细胞内信号传导结构域包括细胞内信号传导序列，例如CD3-ζ的初级信号传导序列。在本发明的特异性CAR中，CD3-ζ的初级信号传导序列是如SEQ ID NO:9中提供的序列或来自非人类种类例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等同残基。在本发明的特异性CAR中，CD3-ζ的初级信号传导序列是如SEQ ID NO:10中提供的序列或来自非人类种类例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等同残基。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指其表面上呈递与主要组织相容性复合体(MHC的)复合的外来抗原的免疫系统细胞，比如辅助细胞(例如，B-细胞、树突细胞等)。T-细胞可以使用其T-细胞受体(TCR)识别这些复合体。APC加工抗原且将其呈递给T-细胞。
正如本文中使用的那样，术语“细胞内信号传导结构域”是指分子的细胞内部分。细胞内信号传导结构域产生促进含有CAR的细胞例如CART细胞的免疫效应子功能的信号。在例如CART细胞中免疫效应子功能的实例包括细胞裂解活性和辅助活性，包括细胞因子的分泌。
在一种实施方式中，细胞内信号传导结构域可以包括一级细胞内信号传导结构域。示例性的一级细胞内信号传导结构域包括来源于负责初次刺激或抗原依赖性刺激的分子的那些。在一种实施方式中，细胞内信号传导结构域可以包括共刺激细胞内结构域。示例性的共刺激细胞内信号传导结构域包括来源于负责共刺激信号或抗原独立的刺激的分子的那些。例如，在CART的情况下，一级细胞内信号传导结构域可以包含T细胞受体的细胞质序列，并且共刺激细胞内信号传导结构域可以包含来自共同受体或共刺激性分子的细胞质序列。
一级细胞内信号传导结构域可以包括被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。含有ITAM的一级细胞质信号传导序列的实例包括，但不限于来源于下述的那些：CD3ζ、常见FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcEpsilon R1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12。
术语“ζ”或备选地“ζ链”、“CD3-ζ”或“TCRζ”定义为如GenBan Acc.No.BAG36664.1提供的蛋白质或来自非人类种类(例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等)的等同残基，且“ζ刺激结构域”或备选地“CD3-ζ刺激结构域”或“TCR-ζ刺激结构域”定义为来自ζ链的细胞质结构域的氨基酸残基或其功能性衍生物，其足以在功能上传递T细胞活化所需的起始信号。在一个方面，ζ的细胞质结构域包括GenBank Acc.No.BAG36664.1的残基52至164或作为其功能性同源物的来自非人类种类(例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等)的等同残基。在一个方面，“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”是如SEQ ID NO:9提供的序列。在一个方面，“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”为如SEQ ID NO:10提供的序列。
术语“共刺激性分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，其特异性地结合共刺激配体，从而介导T细胞的共刺激反应，比如但不限于增殖。共刺激性分子为除了抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其促进有效的免疫应答。共刺激性分子包括但不限于MHC I类分子，BTLA和Toll配体受体，以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。这样的共刺激性分子的进一步实例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、以及特异性地结合CD83的配体。
共刺激性细胞内信号传导结构域可以为共刺激性分子的细胞内部分。共刺激性分子可以以下述蛋白质家族代表：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞性活化分子(SLAM蛋白质)、和NK细胞受体。这样的分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、与淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)、CD2、CDS、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、以及特异性地结合CD83的配体等。
细胞内信号传导结构域可以包括分子的全部细胞内部分或全部天然细胞内信号传导结构域、或其功能片段或衍生物。
术语“4-1BB”是指具有如GenBank Acc.No.AAA62478.2提供的氨基酸序列的TNFR超家族的成员，或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基。在一个方面，“4-1BB共刺激结构域”被定义为GenBank Acc.No..AAA62478.2的氨基酸残基214-255，或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基。在一个方面，“4-1BB共刺激结构域”为如SEQ ID NO:7提供的序列或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基。
正如本文中使用的那样，“抗原呈递细胞”是指其表面上呈递与主要组织相容性复合体(MHC's)复合的外来抗原的免疫系统细胞，比如辅助细胞(例如，B-细胞、树突细胞等)。T-细胞可以使用它们的T-细胞受体TCR)识别这些复合体。APC加工抗原且将其呈递给T-细胞。
术语“编码”是指多核苷酸比如基因、cDNA、或mRNA中的核苷酸的特异性序列在生物学过程中作为合成其它聚合物和大分子的模板的固有特性，该聚合物以及大分子具有确定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列及由其得到的生物学特性。因此，如果与所述基因对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质，则基因、cDNA或RNA编码蛋白质。其核苷酸序列与mRNA序列相同且通常被提供在序列表中的编码链和用作转录基因或cDNA的模板的非编码链这两者都可以被称为编码该基因或cDNA的蛋白或其他产物。
除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括作为彼此的简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可包括内含子，其达到编码蛋白质的核苷酸序列可以在一些形式中含有内含子的程度。
术语“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换地使用，并且是指如本文中所述有效地实现特定生物学结果的化合物、制剂、物质或组合物的量。术语“内源的”是指来自或在生物体、细胞、组织或系统内部产生的任何物质。
术语“外源的”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入或产生的任何物质。
术语“表达”是指由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
术语“转移载体”是指包括分离的核酸且可用于将所分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。大量载体是本领域已知的，包括，但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物有关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应当被解释为进一步包括非质粒和促进核酸转移到细胞中的非病毒化合物，比如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的实例包括，但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒(lentiviral)载体等。
术语"表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，其包含有效连接要表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中。表达载体包括本领域已知的所有那些，包括被掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
术语“慢病毒”是指逆转录病毒家族的种类。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，因为其能够感染非分裂细胞；它们可以将大量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，从而它们是基因递送载体的最有效方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。术语“慢病毒载体”是指来源于慢病毒基因组的至少一部分的载体，特别地包括自我灭活性慢病毒载体，如Milone等人,Mol.Ther.17(8):1453–1464(2009)中提供的。可用于临床中的慢病毒载体的其它实例包括，但不限于例如来自Oxford BioMedica的
Figure GDA0003963633350000391
基因递送技术，来自Lentigen的
Figure GDA0003963633350000392
载体系统等。慢病毒载体的非临床种类也是可获得的，并且将是本领域技术人员已知的。
术语“同源的”或“同一性”是指两个聚合分子之间，例如两个核酸分子之间比如两个DNA分子或两个RNA分子之间，或两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当两个分子中的亚基位点被相同的单体亚基占据时；例如，如果两个DNA分子中的每个的位置被腺嘌呤占据时，则它们在该位置是同源的或同一的。两个序列之间的同源性为匹配或同源位置的数量的直接函数；例如，如果两个序列中的一半位点(例如，长度为十个亚基的聚合物中的五个位置)为同源的，则这两个序列是50％同源；如果90％的位点(例如10个中的9个)是匹配的或同源的，则这两个序列是90％同源的。
术语“人源化的”是指非人(例如，鼠科动物)抗体的那些形式是含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(比如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)。对于大部分，人源化的抗体和其抗体片段是人免疫球蛋白(接受者抗体或抗体片段)，其中来自接受者的互补决定区(CDR)的残基被来自具有期望特异性、亲和性和能力的比如小鼠、大鼠或兔子的非人类物种(供体抗体)的CDR的残基替代。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应非人类残基替代。此外，人源化抗体/抗体片段可以包括既没有在接受者抗体中发现，也没有在所引入的CDR或构架序列中发现的残基。这些修饰可以进一步改进和优化抗体或抗体片段性能。通常，人源化抗体或其抗体片段将包含至少一个且典型地两个可变结构域的显著部分，其中所有的或基本上所有的CDR区域对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的FR区域为人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体或抗体片段也可以包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地为人免疫球蛋白的那些。关于进一步的细节，参见Jones等人,Nature,321:522-525,1986；Reichmann等人,Nature,332:323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596,1992。
术语“完全人类”是指比如抗体或抗体片段的免疫球蛋白，其中整体分子具有人类来源或由与抗体或免疫球蛋白的人类形式相同的氨基酸序列组成。
术语“分离的”是指从天然状态改变或除去。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存物质部分或完全分离的相同核酸或肽为“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境比如例如宿主细胞中。
在本发明的上下文中，使用下述通常存在的核酸碱基的缩写。“A”是指腺苷、“C”是指胞嘧啶、“G”是指鸟苷、“T”是指胸苷、和“U”是指尿苷。
术语“有效连接”或“转录控制”是指调节序列和异源核酸序列之间的功能性连接，其导致异源核酸序列的表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能性关系时，第一核酸序列与第二核酸序列有效连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子有效连接编码序列。有效连接的DNA序列可以彼此邻接，并且在结合两个蛋白编码区时必需在同一读码框中。
术语免疫原性的组合物的“肠胃外”施用包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)或胸骨内注射、瘤内或输注技术。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非明确地限定，否则该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述已知类似物具有与参考核酸类似的结合性质，并且以与天然存在核苷酸类似的方式代谢。除非另有说明，否则特定的核酸序列也隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指定的序列。特别地，简并密码子取代可以通过产生序列而实现，所述序列中一个或更多个所选择的(或所有的)密码子的三个位置被混合碱基和/或去氧肌苷残基取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换地使用，并且是指由肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对于可以包括蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数量没限制。多肽包括含有彼此通过肽键结合的两个或多个氨基酸的任何肽或蛋白质。正如本文中使用的那样，该术语是指短链(其在本领域通常也称为例如肽、寡肽和寡聚物)以及较长链(其在本领域通常也称为蛋白质，其存在多种类型)。“多肽”包括例如生物学活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同型二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、重组肽或其组合。
术语“启动子”是指被细胞的合成机构识别的、或被引入了合成机构、启动多核苷酸序列的特异性转录所需要的DNA序列。
术语“启动子/调节序列”是指有效连接启动子/调节序列的基因产物的表达所需的核酸序列。在某些情况下，该序列可以是核心启动子序列，并且在其它情况下，该序列也可包括增强子序列及表达基因产物所需的其它调控元件。启动子/调节序列可以例如是以组织特异性方式表达基因产物的序列。
术语“组成型”启动子是指有效连接编码或指定基因产物的多核苷酸时，在细胞的大多数或全部生理条件下引起基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“可诱导的”启动子是指当有效连接编码或指定基因产物的多核苷酸时，基本上仅当细胞中存在对应于启动子的诱导物时，才引起基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“组织特异性的”启动子是指当有效连接编码或指定基因的多核苷酸时，基本上仅当细胞为对应于启动子的组织类型的细胞时才引起基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
如在scFv的上下文中使用的那样，术语“柔性的多肽接头”是指由比如单独或联合使用的甘氨酸和/或丝氨酸残基的氨基酸组成的肽接头，其将可变的重链和可变的轻链区域连接在一起。在一种实施方式中，柔性的多肽接头为Gly/Ser接头且包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n(SEQ ID NO:38)，其中n为等于或大于1的正整数。例如，n＝1、n＝2、n＝3.n＝4、n＝5和n＝6、n＝7、n＝8、n＝9和n＝10。在一种实施方式中，柔性的多肽接头包括但不限于(Gly4 Ser)4(SEQ ID NO:27)或(Gly4 Ser)3(SEQ ID NO:28)。在另一种实施方式中，接头包括多个重复的(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)(SEQ ID NO:29)。在本发明的范围内也包括被描述在WO2012/138475中的接头，将其并入本文作为参考。
正如本文中使用的那样，5'帽(也称为RNA帽，RNA7-甲基鸟苷帽或RNA m7G帽)是一种修饰的鸟嘌呤核苷酸，其在开始转录后不久已经被添加到真核信使RNA的“前面”或5'端。所述5'帽由与第一个转录的核苷酸连接的端基组成。其存在对于被核糖体识别和保护免遭RNA酶很重要。帽加入与转录偶联，并且以辅助转录方式进行，使得彼此影响。在转录开始后不久，合成的mRNA的5'端被与RNA聚合酶缔合的帽合成复合体结合。该酶复合体催化mRNA加帽所需的化学反应。合成以多步生化反应方式进行。加帽部分可以经修饰以调节mRNA的功能性，比如其翻译稳定性或效率。
正如本文中使用的那样，“体外转录的RNA”是指已经体外合成的RNA、优选mRNA。通常，体外转录的RNA是由体外转录载体产生的。体外转录载体包含用于产生体外转录的RNA的模板。
正如本文中使用的那样，“聚(A)”为通过聚腺苷酸化连接至mRNA的一系列腺苷。在用于短暂表达的构建体的优选的实施方式中，聚A在50至5000(SEQ ID NO:30)之间，优选地大于64，更优选地大于100，最优选大于300或400。聚(A)序列可以被化学或酶修饰以调节mRNA功能性，比如翻译的定位、稳定性或效率。
正如本文中使用的那样，“聚腺苷酸化”是指聚腺苷部分或其修饰的变体与信使RNA分子的共价连接。在真核生物中，大多数信使RNA(mRNA)分子在3'末端被聚腺苷酸化。3'聚(A)尾部为通过酶聚腺苷酸聚合酶的作用添加到前-mRNA的腺嘌呤核苷酸(通常几百)的长序列。在较高等的真核生物中，聚(A)尾部被添加到含有特异性序列(聚腺苷酸化信号)的转录物上。聚(A)尾及结合其的蛋白质有助于保护mRNA免于被外切核酸酶降解。聚腺苷酸化对于转录终止、mRNA从细胞核输出和翻译也很重要。聚腺苷酸化在DNA转录成RNA之后立即出现在细胞核中，但是另外也可更迟地出现在细胞质中。在转录已经终止之后，通过与RNA聚合酶结合的核酸内切酶复合体的作用，mRNA链被切割下来。切割位点通常的特征在于在切割位点附近存在碱基序列AAUAAA。在mRNA已经被切割下来之后，将腺苷残基添加到切割位点的游离3'末端。
正如本文中使用的那样，“短暂”是指表达非整合的转基因数小时、数天或数个星期的时间段，其中如果整合到基因组中或含在宿主细胞中的稳定质粒复制子之内，则该表达的时间段小于基因的表达时间段。
正如本文中使用的那样，术语“治疗(treat、treatment、treating)”是指由于施用一种或多种疗法(例如一种或多种治疗剂比如本发明的CAR)减慢或改善增生性病症的进展、严重程度和/或持续时间，或改善增生性病症的一种或多种症状(优选地，一种或多种可辨别的症状)。在特定实施方式中，术语“治疗”是指改善增生性病症的至少一种可测量的物理参数比如肿瘤生长，不必是患者可辨别的。在其它实施方案中，术语“治疗”是指通过例如稳定可辨别的症状以物理方式、通过例如稳定物理参数以生理学方式或两者抑制增生性病症的进展。在其它实施方案中，术语“治疗”是指减小或稳定肿瘤尺寸或癌细胞计数。
术语“信号转导途径”是指在将信号从细胞的一个部分转导到细胞的另一个部分中起作用的多种信号转导分子之间的生化关系。短语“细胞表面受体”包括能够跨越细胞膜接受信号和传递信号的分子和分子复合体。
术语“受试者”是指包括其中可以引出免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物、人类)。
术语“基本上纯化的”细胞是指基本上不含其它细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞是指其已经与其天然存在状态中通常有关的其它细胞类型分离的细胞。在某些情况下，基本上纯化的细胞群是指细胞的同源群体。在其它的情况下，该术语仅指在其天然状态下与其天然有关的细胞分离的细胞。在某些方面中，所述细胞是体外培养的。在其它方面中，所述细胞不是体外培养的。
正如本文中使用的那样，术语“治疗”是指治疗。治疗效果是通过减轻、抑制、缓解或根除疾病状态获得的。
正如本文中使用的那样，术语“预防”是指预防性或保护性治疗疾病或疾病状态。
术语“与癌症相关的抗原”或“肿瘤抗原”可互换地是指全部地或以片段形式(例如MHC/肽)在癌细胞表面上被表达的分子(通常为蛋白质、碳水化合物或脂质)，并且其用于将药理学作用剂优先靶向癌细胞。在某些实施方式中，肿瘤抗原为由正常细胞和癌细胞表达的标记物，例如谱系标记物例如在B细胞上的CD19。在某些实施方式中，肿瘤抗原为在癌细胞中与正常细胞相比过表达的细胞表面分子，例如与正常细胞相比1倍过表达、2倍过表达、3倍或以上过表达。在某些实施方式中，肿瘤抗原为癌细胞中被不适当地合成的细胞表面分子，例如，与正常细胞上被表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子。在某些实施方式中，肿瘤抗原应当全部或以片段形式(例如，MHC/肽)被专一性地表达在癌细胞的细胞表面上，而不是在正常细胞的表面上合成或表达。在某些实施方式中，本发明的CAR包括包含结合MHC呈递肽的抗原结合结构域(例如，抗体或抗体片段)的CAR。通常，来源于内源蛋白质的肽填充主要组织相容性复合体(MHC)的I类分子的口袋，并且被CD8+T淋巴细胞上的T细胞受体(TCRs)识别。MHC I类复合体由全部有核细胞组成型表达。在癌症中，病毒特异性和/或肿瘤特异性肽/MHC复合体代表免疫疗法的独特类型的细胞表面靶点。已经描述了在人类白细胞抗原(HLA)-A1或HLA-A2的情形中来源于病毒或肿瘤抗原的TCR-样抗体靶向肽(参见，例如Sastry等人,J Virol.2011 85(5):1935-1942；Sergeeva等人,Blood,2011 117(16):4262-4272；Verma等人,J Immunol 2010 184(4):2156-2165；Willemsen等人,Gene Ther2001 8(21):1601-1608；Dao等人,Sci Transl Med 2013 5(176):176ra33；Tassev等人,Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100)。例如，TCR-样抗体可以从筛选库比如人scFv噬菌体展示文库鉴别。
术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指外源性核酸通过其转移或引入到宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源性核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原发性受试者细胞及其后代。
术语“特异性地结合”是指识别并且结合存在于样品中的结合配偶体(例如肿瘤抗原)蛋白质的抗体或配体，但是该抗体或配体基本上不会识别或结合样品中的其它分子。
正如本文中使用的那样，术语“可调的嵌合抗原受体(RCAR)”是指一组多肽，在最简单的实施方案中通常为两个，当在RCARX细胞中时，其向RCARX细胞提供针对靶细胞(通常为癌细胞)的特异性，且具有可调的细胞内信号产生或增殖，其可以优化RCARX细胞的免疫效应子性质。RCARX细胞至少部分依赖于抗原结合结构域，以向包含被抗原结合结构域结合的抗原的靶细胞提供特异性。在一种实施方式中，RCAR包括二聚化开关，当存在二聚化分子时，其可以将细胞内信号传导结构域偶联至抗原结合结构域。
正如本文中使用的那样，术语“膜锚”或“膜系链结构域(membrane tetheringdomain)”是指足够将细胞外或细胞内结构域锚固于质膜的多肽或部分例如肉豆蔻基基团。
正如本文中使用的那样，术语“开关结构域”，例如当涉及RCAR时，是指在二聚化分子存在下与另一个开关结构域缔合的实体，通常为基于多肽的实体。该缔合导致与第一开关结构域连接(例如融合)的第一实体和与第二开关结构域连接(例如融合)的第二实体的功能性偶联。第一和第二开关结构域一起被称为二聚化开关。在实施方案中，第一和第二开关结构域是彼此相同的，例如它们是具有相同一级氨基酸序列的多肽，并且一起被称为均二聚化开关。在实施方案中，第一和第二开关结构域是彼此不同的，例如它们是具有不同的一级氨基酸序列的多肽，并且一起被称为异源二聚化开关。在实施方案中，所述开关在细胞内。在实施方案中，所述开关在细胞外。在实施方案中，所述开关结构域是基于多肽的实体，例如基于FKBP或FRB，并且所述二聚化分子是小分子，例如雷帕系物。在实施方案，开关结构域是基于多肽的实体，例如结合myc肽的scFv，并且二聚化分子为多肽、其片段或多肽的多聚体，例如结合一个或更多个myc scFvs的myc配体或myc配体的多聚体。在实施方案中，开关结构域是基于多肽的实体，例如myc受体，并且二聚化分子是抗体或其片段，例如myc抗体。
正如本文中使用的那样，术语“二聚化分子”，例如当涉及RCAR时，是指促进第一开关结构域与第二开关结构域结合的分子。在实施方案中，二聚化分子并没有天然存在于受试者中，或者没有以导致显著二聚化的浓度存在。在实施方案中，二聚化分子为小分子，例如雷帕霉素或雷帕系物，例如RAD001。
术语“生物等同的”是指要产生与参考剂量或参考量的参考化合物(例如RAD001)产生的效果等同的效果所需要的不同于参考化合物(例如RAD001)的作用剂的量。在一种实施方式中，所述的效果是mTOR抑制的水平或通过蛋白质印迹测量的磷酸化的S6水平，例如正如通过P70 S6激酶抑制测量的那样，例如正如在体内或体外试验中评价的那样，例如如通过本文所述试验测量的那样，例如Boulay试验。在一种实施方式中，所述作用是PD-1阳性/PD-1阴性T细胞的比率的改变，如通过细胞分选测量的那样。在一种实施方式中，mTOR抑制剂的生物等同量或剂量是获得与参考化合物的参考剂量或参考量相同水平的P70 S6激酶抑制的量或剂量。在一种实施方式中，mTOR抑制剂的生物等同量或剂量是获得与参考化合物的参考剂量或参考量相同水平的PD-1阳性/PD-1阴性T细胞的比率改变的量或剂量。
当与mTOR抑制剂例如变构的mTOR抑制剂(例如RAD001或雷帕霉素)或有催化活性的mTOR抑制剂一起使用时，术语“低的增强免疫的剂量”是指例如正如P70 S6激酶活性的抑制所测量的那样，部分(而不是完全)抑制mTOR活性的mTOR抑制剂的剂量。本文讨论了用于评价mTOR活性的方法，例如通过抑制P70 S6激酶。该剂量不足以导致完全免疫抑制，但足以增强免疫应答。在一种实施方式中，低的增强免疫的剂量的mTOR抑制剂导致PD-1阳性T细胞数量减少和/或PD-1阴性T细胞数量增加，或PD-1阴性T细胞/PD-1阳性T细胞之比增加。在一种实施方式中，低的增强免疫的剂量的mTOR抑制剂导致幼稚T细胞的数量增加。在一种实施方式中，低的增强免疫的剂量的mTOR抑制剂导致下述中的一个或更多个：
例如在记忆T细胞例如记忆T细胞前体上一个或更多个下述标记物的表达增加：CD62L高,CD127高,CD27+和BCL2，；
例如在记忆T细胞例如记忆T细胞前体上KLRG1的表达减少；和
记忆T细胞前体的数量增加，例如具有下述特征中的任一个或组合的细胞：CD62L高增加，CD127高增加，CD27+增加，KLRG1降低和BCL2增加；
其中例如与非治疗的受试者相比，上述存在的变化中任一个例如至少短暂出现。
范围∶在整个公开中，本发明的各个方面都可以以范围形式存在。应当理解，范围形式的描述仅仅为方便和简洁起见，而不应当被看作是对本发明的范围不可改变的限制。因此，范围的描述应当被认为特别地公开了所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，范围的描述比如从1至6就应当被认为具体地公开了子范围比如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单独数值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3、和6。作为另一个实例，范围比如95-99％的同一性包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的范围，并且包括子范围比如96-99％、96-98％、96-97％、97-99％、97-98％和98-99％的同一性。不考虑范围的宽度，这均适用。
说明
本文提供用于使用抗间皮素嵌合抗原受体(CAR)例如人间皮素CAR治疗疾病比如癌症的物质组合物和方法。
在一个方面，本发明提供多种嵌合抗原受体，其包含被工程化以特异性地结合间皮素蛋白质的抗体或抗体片段。在一个方面，本发明提供被工程化以表达CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)，例如其中所述CAR T细胞(“CART”)显示出抗癌性质。在一个方面，用CAR转化细胞且CAR被表达在细胞表面上。在某些实施方式中，用编码CAR的病毒载体转导细胞(例如T细胞或NK细胞)。在某些实施方式中，病毒载体是逆转录病毒载体。在某些实施方式中，病毒载体是慢病毒载体。在某些这样的实施方案中，细胞可以稳定地表达CAR。在另一种实施方式中，用编码CAR的核酸(例如mRNA、cDNA、DNA)转染细胞(例如T细胞或NK细胞)。在某些这样的实施方案中，细胞可以短暂地表达CAR。
在一个方面，CAR的间皮素蛋白结合部分为scFv抗体片段。在一个方面，这样的抗体片段是功能性的，原因在于它们保留了等同的结合亲和力，即它们以可比较的亲和力与其所源自的IgG抗体结合相同的抗原。在一个方面，这样的抗体片段是功能性的，原因在于它们提供可以包括但不限于下述的生物应答：活化免疫应答、抑制来源于其靶抗原的信号转导、抑制激酶活性等，正如本领域技术人员应当理解的那样。在一个方面，CAR的间皮素抗原结合结构域为scFv抗体片段，其与它所源自的鼠scFv的序列相比是人的或人源化的。在一种实施方式中，人抗间皮素scFv抗体片段包含图2中提供的轻链可变区和/或重链可变区，或与其具有实质性同一性(例如95-99％同一性)的序列。
在某些方面，本发明的抗体被掺入嵌合抗原受体(CAR)中。在一个方面，CAR包含本文提供的多肽序列，如SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ IDNO:61和SEQ ID NO:62，或与其具有95-99％同一性的序列。
在一个方面，CAR的人scFv部分是由已经针对在哺乳动物细胞中的表达对其序列进行了密码子优化的转基因编码的。在一个方面，本发明的整个CAR构建体是由已经针对在哺乳动物细胞中的表达对全部序列进行了密码子优化的转基因编码的。密码子优化是指编码DNA中的同义密码子(即，编码相同氨基酸的密码子)的出现频度在不同物种中有偏差的发现。这样的密码子简并允许相同的多肽由多种核苷酸序列编码。多种密码子优化方法是本领域已知的，包括例如在至少US专利号5,786,464和6,114,148中公开的方法。
在一个方面，人间皮素CAR分子包含SEQ ID NO:39中提供的scfv部分。在一个方面，人间皮素CAR分子包含SEQ ID NO:40中提供的scfv部分。在一个方面，人间皮素CAR分子包含SEQ ID NO:41中提供的scFv部分。在一个方面，人间皮素CAR分子包含SEQ ID NO:42中提供的scFv部分。在一个方面，人间皮素CAR分子包含SEQ ID NO:43中提供的scFv部分。在一个方面，人间皮素CAR分子包含SEQ ID NO:44中提供的scFv部分。在一个方面，人间皮素CAR分子包含SEQ ID NO:45中提供的scFv部分。在一个方面，人间皮素CAR分子包含SEQ IDNO:46中提供的scFv部分。在一个方面，人间皮素CAR分子包含SEQ ID NO:47中提供的scFv部分。在一个方面，人间皮素CAR分子包含SEQ ID NO:48中提供的scFv部分。在一个方面，人间皮素CAR分子包含SEQ ID NO:49中提供的scFv部分。在一个方面，人间皮素CAR分子包含SEQ ID NO:50中提供的scFv部分。在一个方面，人间皮素CAR分子包含SEQ ID NO:51中提供的scFv部分。在一个方面，人间皮素CAR分子包含SEQ ID NO:52中提供的scFv部分。在一个方面，人间皮素CAR分子包含SEQ ID NO:53中提供的scFv部分。在一个方面，人间皮素CAR分子包含SEQ ID NO:54中提供的scFv部分。在一个方面，人间皮素CAR分子包含SEQ ID NO:55中提供的scFv部分。在一个方面，人间皮素CAR分子包含SEQ ID NO:56中提供的scFv部分。在一个方面，人间皮素CAR分子包含SEQ ID NO:57中提供的scFv部分。在一个方面，人间皮素CAR分子包含SEQ ID NO:58中提供的scFv部分。在一个方面，人间皮素CAR分子包含SEQID NO:59中提供的scFv部分。在一个方面，人间皮素CAR分子包含SEQ ID NO:60中提供的scFv部分。在一个方面，人间皮素CAR分子包含SEQ ID NO:61中提供的scFv部分。在一个方面，人间皮素CAR分子包含SEQ ID NO:62中提供的scFv部分。
在一个方面，本文公开的CAR组合了特异性抗体的抗原结合结构域与细胞内信号传导分子。例如，在某些方面中，细胞内信号传导分子包含但不限于CD3-ζ链、4-1BB和CD28信号传导模块及其组合。在一个方面，抗原结合结构域结合间皮素。在一个方面，间皮素CAR包括表1中提供的序列。
在一个方面，间皮素CAR包含选自一个或更多个SEQ ID NOS:63-86中提供的序列。在一个方面，间皮素CAR包含SEQ ID NO:63中提供的序列。在一个方面，间皮素CAR包含SEQID NO:64中提供的序列。在一个方面，间皮素CAR包含SEQ ID NO:65中提供的序列。在一个方面，间皮素CAR包含SEQ ID NO:66中提供的序列。在一个方面，间皮素CAR包含SEQ ID NO:67中提供的序列。在一个方面，间皮素CAR包含SEQ ID NO:68中提供的序列。在一个方面，间皮素CAR包含SEQ ID NO:69中提供的序列。在一个方面，间皮素CAR包含SEQ ID NO:70中提供的序列。在一个方面，间皮素CAR包含SEQ ID NO:71中提供的序列。在一个方面，间皮素CAR包含SEQ ID NO:72中提供的序列。在一个方面，间皮素CAR包含SEQ ID NO:73中提供的序列。在一个方面，间皮素CAR包含SEQ ID NO:74中提供的序列。在一个方面，间皮素CAR包含SEQ ID NO:75中提供的序列。在一个方面，间皮素CAR包含SEQ ID NO:76中提供的序列。在一个方面，间皮素CAR包含SEQ ID NO:77中提供的序列。在一个方面，间皮素CAR包含SEQID NO:78中提供的序列。在一个方面，间皮素CAR包含SEQ ID NO:79中提供的序列。在一个方面，间皮素CAR包含SEQ ID NO:80中提供的序列。在一个方面，间皮素CAR包含SEQ ID NO:81中提供的序列。在一个方面，间皮素CAR包含SEQ ID NO:82中提供的序列。在一个方面，间皮素CAR包含SEQ ID NO:83中提供的序列。在一个方面，间皮素CAR包含SEQ ID NO:84中提供的序列。在一个方面，间皮素CAR包含SEQ ID NO:85中提供的序列。在一个方面，间皮素CAR包含SEQ ID NO:86中提供的序列。
此外，本发明提供间皮素CAR组合物及其在用于治疗疾病，尤其涉及表达间皮素的细胞或组织的癌症或任何恶性肿瘤或自身免疫疾病的药物或方法中的用途。
在一个方面，本发明提供被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如，T细胞或NK细胞)，其中所述CAR T细胞(“CART”)显示出抗肿瘤性质。优选的抗原为间皮素。在一个方面，CAR的抗原结合结构域包含人抗间皮素抗体片段。在一个方面，CAR的抗原结合结构域包括包含scFv的人抗间皮素抗体片段。因此，本发明提供包括人抗间皮素结合结构域且被工程化到T细胞或NK细胞中的间皮素CAR及其用于过继性疗法的方法。
在一个方面，间皮素CAR包含至少一个选自下述的胞内信号传导结构域：CD137(4-1BB)信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD3ζ信号结构域及其任意组合。在一个方面，间皮素CAR包含至少一个不同于CD137(4-1BB)或CD28的一个或更多个共刺激性分子的胞内信号传导结构域、CD3ζ信号结构域及其任意组合。
此外，本发明提供间皮素CAR组合物及其在治疗疾病，尤其涉及表达间皮素的细胞或组织的癌症或任何恶性肿瘤或自身免疫疾病的药物或方法中的用途。
嵌合抗原受体(CAR)
本发明包括包含编码CAR的序列的重组核酸构建体，其中所述CAR包含特异性地结合间皮素的抗体，例如特异性地结合间皮素的人抗体片段。在一个方面，间皮素为人间皮素，抗体片段的序列邻接编码胞内信号传导结构域的核酸序列且与其在相同读码框中。胞内信号传导结构域可以包含共刺激信号传导结构域和/或初级信号传导结构域，例如ζ链。共刺激信号传导结构域是指包括共刺激性分子的胞内结构域的至少一部分的CAR的一部分。
在特定的方面，本发明的CAR构建体包含选自SEQ ID NOS:39-62的scFv结构域，其中scFv之前可以是任选的前导序列，比如SEQ ID NO:1中提供的前导序列，接着是任选的铰链序列，比如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5中提供的，跨膜区域比如SEQ ID NO:6中提供的，包括SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的胞内信号传导结构域和包括SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的CD3ζ序列，其中所述结构域邻接同一读码框且在同一读码框中形成单融合蛋白。本发明还包括编码选自下述的多肽的核苷酸序列：SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ IDNO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ IDNO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109和SEQ IDNO:110或与其具有95-99％同一性的序列。本发明还包括编码选自下述的scFv片段中每一个的多肽的核苷酸序列：SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQID NO:61和SEQ ID NO:62或与其具有95-99％同一性的序列，并且SEQ ID NOS:1、2和6-9中的每个结构域加本发明的编码的间皮素CAR融合蛋白。在一个方面，示例性的间皮素CAR构建体包含任选的前导序列、胞外间皮素结合结构域、铰链、跨膜结构域和胞内刺激结构域。在一个方面，间皮素CAR构建体包含任选的前导序列、间皮素结合结构域、铰链、跨膜结构域、胞内共刺激结构域和胞内刺激结构域。含有人scFv结构域的特异性间皮素CAR构建体为如SEQ ID NOS:87-110中提供的。
本文还提供如下全长CAR序列：SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQID NO:84、SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:86。一种示例性的前导序列被提供为SEQ ID NO:1。一种示例性的铰链/间隔区序列被提供为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQID NO:5。一种示例性的跨膜结构域序列被提供为SEQ ID NO:6。一种示例性的4-1BB蛋白质的胞内信号传导结构域序列被提供为SEQ ID NO:7。一种示例性的CD27的胞内信号传导结构域序列被提供为SEQ ID NO:8。一种示例性的CD3ζ结构域序列被提供为SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。
在一个方面，本发明包括包含编码CAR的核酸分子的重组核酸构建体，其中核酸分子包含编码例如本文所述抗间皮素结合结构域的核酸序列，其邻接编码胞内信号传导结构域的核酸序列且与其在相同读码框中。在一个方面，抗间皮素结合结构域选自SEQ ID NOS:87-110中的一个或更多个。在一个方面，抗-间皮素结合结构域包含SEQ ID NO:87。在一个方面，抗间皮素结合结构域包含SEQ ID NO:88。在一个方面，抗-间皮素结合结构域包含SEQID NO:89。在一个方面，抗间皮素结合结构域包含SEQ ID NO:90。在一个方面，抗间皮素结合结构域包含SEQ ID NO:91。在一个方面，抗-间皮素结合结构域包含SEQ ID NO:92。在一个方面，抗间皮素结合结构域包含SEQ ID NO:93。在一个方面，抗间皮素结合结构域包含SEQ ID NO:94。在一个方面，抗-间皮素结合结构域包含SEQ ID NO:95。在一个方面，抗间皮素结合结构域包含SEQ ID NO:96。在一个方面，抗间皮素结合结构域包含SEQ ID NO:97。在一个方面，抗-间皮素结合结构域包含SEQ ID NO:98。在一个方面，抗间皮素结合结构域包含SEQ ID NO:99。在一个方面，抗间皮素结合结构域包含SEQ ID NO:100。在一个方面，抗-间皮素结合结构域包含SEQ ID NO:101。在一个方面，抗间皮素结合结构域包含SEQ ID NO:102。在一个方面，抗间皮素结合结构域包含SEQ ID NO:103。在一个方面，抗-间皮素结合结构域包含SEQ ID NO:104。在一个方面，抗间皮素结合结构域包含SEQ ID NO:105。在一个方面，抗间皮素结合结构域包含SEQ ID NO:106。在一个方面，抗-间皮素结合结构域包含SEQID NO:107。在一个方面，抗间皮素结合结构域包含SEQ ID NO:108。在一个方面，抗间皮素结合结构域包含SEQ ID NO:109。在一个方面，抗间皮素结合结构域包含SEQ ID NO:110。在一个方面，本发明包括包含编码CAR的转基因的重组DNA构建体，其中所述转基因包含编码本文所述抗间皮素结合结构域的核酸序列，例如选自SEQ ID NOS:87-110中一个或更多个的人抗间皮素结合结构域，其中所述序列邻接编码胞内信号传导结构域的核酸序列且与其在相同读码框中。一种可以用于CAR中的示例性的胞内信号传导结构域包括，但不限于下述的一种或多种胞内信号传导结构域：例如CD3-ζ、CD28、4-1BB等。在某些情况下，CAR可以包含CD3-ζ、CD28、4-1BB等中的任意组合。在一个方面，本发明的CAR构建体的核酸序列选自SEQ ID NOS：111-134中的一个或更多个。在一个方面，CAR构建体的核酸序列为SEQ ID NO:111。在一个方面，CAR构建体的核酸序列为SEQ ID NO:112。在一个方面，CAR构建体的核酸序列为SEQ ID NO:113。在一个方面，CAR构建体的核酸序列为SEQ ID NO:114。在一个方面，CAR构建体的核酸序列为SEQ ID NO:115。在一个方面，CAR构建体的核酸序列为SEQ ID NO:116。在一个方面，CAR构建体的核酸序列为SEQ ID NO:117。在一个方面，CAR构建体的核酸序列为SEQ ID NO:118。在一个方面，CAR构建体的核酸序列为SEQ ID NO:119。在一个方面，CAR构建体的核酸序列为SEQ ID NO:120。在一个方面，CAR构建体的核酸序列为SEQ ID NO:121。在一个方面，CAR构建体的核酸序列为SEQ ID NO:122。在一个方面，CAR构建体的核酸序列为SEQ ID NO:123。在一个方面，CAR构建体的核酸序列为SEQ ID NO:124。在一个方面，CAR构建体的核酸序列为SEQ ID NO:125。在一个方面，CAR构建体的核酸序列为SEQ ID NO:126。在一个方面，CAR构建体的核酸序列为SEQ ID NO:127。在一个方面，CAR构建体的核酸序列为SEQ ID NO:128。在一个方面，CAR构建体的核酸序列为SEQ ID NO:129。在一个方面，CAR构建体的核酸序列为SEQ ID NO:130。在一个方面，CAR构建体的核酸序列为SEQ ID NO:131。在一个方面，CAR构建体的核酸序列为SEQ ID NO:132。在一个方面，CAR构建体的核酸序列为SEQ ID NO:133。在一个方面，CAR构建体的核酸序列为SEQ ID NO:134。
编码期望分子的核酸序列可以使用本领域已知的重组方法获得，比如例如使用标准技术通过从表达基因的细胞筛选库、从已知包括基因的载体得到基因或通过从含有基因的细胞和组织直接分离。备选地，目的核酸可以合成产生而不是克隆产生。
本发明包括表达可以被直接地转导到细胞中的CAR的逆转录病毒和慢病毒的载体构建体。本发明还包括可以被直接转染到细胞中的RNA构建体。一种用于制备用于转染的mRNA的方法包括体外转录(IVT)具有特殊设计引物的模板，接着加入聚A，得到含有3’和5’非翻译序列(“UTR”)、5’帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)、待表达的核酸和通常长度为50-2000个碱基(SEQ ID NO:35)的聚A尾的构建体。如此产生的RNA可以有效地转染各种类型的细胞。在一种实施方式中，模板包括CAR的序列。在一种实施方式中，通过电穿孔将RNACAR载体转导到T细胞中。
抗原结合结构域
在一个方面，本发明的CAR包含靶特异性的结合元件，另外称为抗原结合结构域。抗原结合结构域的选择取决于定义靶细胞表面的抗原的类型和数量。例如，可以选择抗原结合结构域以识别在特定疾病状态有关的靶细胞上起细胞表面标记物作用的抗原。
在一个方面，CAR-介导的免疫效应细胞应答可涉及表达目的抗原的细胞，其中CAR包含特异性地结合目的抗原的抗原结合结构域。在一个方面，包含抗原结合结构域的CAR的部分包含靶向间皮素的抗原结合结构域。在一个方面，抗原结合结构域靶向人间皮素。
抗原结合结构域可以是结合如下抗原的任何结构域：包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体及其功能性片段，包括但不限于单结构域抗体，比如重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和骆驼科来源的纳米抗体的可变结构域(VHH)，且结合本领域已知的备选的支架以抗原结合结构域形式(比如重组纤连蛋白结构域等)起作用。在某些情况下，抗原结合结构域来源于与CAR的最终用处相同的物种是有利的。例如，为了用于人类，CAR的抗原结合结构域包含人类或人源化的用于抗体或抗体片段的抗原结合结构域的残基可能是有利的。因此，在一个方面，抗原结合结构域包含人抗体或抗体片段。
在一种实施方式中，例如在本文所述的竞争性试验中，抗间皮素结合结构域不与包括包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列的抗原结合结构域(例如鼠SS1 scFv)竞争与人间皮素的结合或竞争很弱。
鼠SS1 scFv的氨基酸序列(SEQ ID NO:279)被提供如下：
QVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWIGLITPYNGASSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYFCARGGYDGRGFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSVEAEDDATYYCQQWSGYPLTFGAGTKLEI
在一种实施方式中，例如在本文所述竞争性试验中，抗间皮素结合结构域与包括以下的抗原结合结构域竞争结合人间皮素：选自SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:49的抗间皮素轻链氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，及选自SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:49的抗间皮素重链氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3。在一种实施方式中，例如在本文所述竞争性试验中，抗间皮素结合结构域与包括以下的抗原结合结构域竞争结合人间皮素：选自SEQ ID NO:203或SEQ ID NO:209的LC CDR1、选自SEQ ID NO:227或SEQ ID NO:233的LC CDR2、和选自SEQ ID NO:251或SEQ ID NO:257的LC CDR3；和选自SEQ ID NO:138或SEQID NO:144的HC CDR1、选自SEQ ID NO:156或SEQ ID NO:162的HC CDR2、和选自SEQ ID NO:179或SEQ ID NO:185的HC CDR3。
在一种实施方式中，例如在本文所述竞争性试验中，抗间皮素结合结构域与包括选自SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:49的序列的抗原结合结构域竞争结合人间皮素。
在实施方案中，竞争试验是基于SPR的试验。简而言之，抗原例如人间皮素被固定在表面上。通过微流系统，将参考抗体注射到抗原层上。当参考抗体结合抗原时，检测到信号增加，通常以应答单位(RU)表示，例如参考信号。在期望的时间之后，将测试抗体注射到抗原层上。如果测试抗体结合抗原的不同区域或表位，则与当结合参考抗体时检测到的最高信号(例如参考信号)相比，检测到信号的另外增加，例如信号(例如RU)增加5％或以上、10％或以上、15％或以上、20％或以上、25％或以上、30％或以上、35％或以上、40％或以上、45％或以上、50％或以上、55％或以上、60％或以上、65％或以上、70％或以上、75％或以上、80％或以上、85％或以上、90％或以上、或95％或以上。如果测试抗体结合抗原的不同区域或表位，则与当结合参考抗体时检测到的最高信号(例如参考信号)相比，检测到信号(例如RU)几乎没有或没有增加，例如信号增加小于20％、小于15％、小于10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、或小于1％。当使用该基于SPR的竞争试验时，当与参考抗体结合抗原时检测到的参考信号相比时，当检测到信号(例如RU)增加小于20％、小于15％、小于10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％时，抗体被认为与参考抗体竞争。当与参考抗体结合抗原时检测到的参考信号相比，检测到信号(例如RU)增加5％或以上、10％或以上、15％或以上、20％或以上、25％或以上、30％或以上、35％或以上、40％或以上、45％或以上、50％或以上、55％或以上、60％或以上、65％或以上、70％或以上、75％或以上、80％或以上、85％或以上、90％或以上、或95％或以上时，则抗体被认为与参考抗体没有竞争或竞争很弱。
可以通过本领域已知的各种方法确定本文所述抗原结合结构域结合的表位的鉴别。例如，可以产生含有结合抗原或与其复合的抗原结合结构域的晶体结构。在另一个实例中，可以进行试验例如保护试验以鉴定对表位有贡献的抗原的区域或鉴定表位。一种示例性的保护试验，氢/氘交换(HDX)质谱试验，进一步被描述在实施例18中。进行HDX质谱以鉴定人MSLN上的推定表位，例如hMSLN296-588,例如SEQ ID NO:278，对于鼠SS1，例如SEQ IDNO:279和本文所述的M5 scFv，例如SEQ ID NO:43。hMSLN296-588,例如,SEQ ID NO:278，代表人间皮素的氨基酸296-588，例如SEQ ID NO:278的第一个氨基酸为氨基酸296且SEQ IDNO:278的最后一个氨基酸为氨基酸588。人间皮素的氨基酸序列，氨基酸296-588被提供如下：(SEQ ID NO:278)
EVEKTACPSGKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMSPEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQAPRRPLPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVLPLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQG
HDX质谱试验的结果表明hMSLN296-588(例如SEQ ID NO:278)的一个或更多个氨基酸314-315、317-318、346-349和369-375对SS1所识别的表位有贡献。HDX质谱试验的结果表明hMSLN296-588(例如SEQ ID NO:278)的一个或更多个氨基酸485-490、498-507、532-537或545-572对本文所述抗间皮素抗原结合结构域所识别的表位有贡献，例如M5scFv，例如SEQID NO:43。
在一种实施方式中，本文所述抗间皮素结合结构域与含有包含SEQ ID NO:279(例如鼠SS1)的序列的抗原结合结构域所靶向的人间皮素的表位不同的人间皮素的表位，例如SEQ ID NO:278结合。
在一种实施方式中，SS1所识别的表位包含选自hMSLN296-588(例如SEQ ID NO:278)的氨基酸314-315、317-318、346-349、或369-375或其任意组合的序列。在一种实施方式中，SS1所识别的表位包含选自hMSLN296-588(例如SEQ ID NO:278)的氨基酸314-315、317-318、346-349或369-375的一个或更多个氨基酸。
在一种实施方式中，本文所述抗间皮素结合结构域与人间皮素的C-末端结合。在一种实施方式中，本文所述抗间皮素结合结构域与SEQ ID NO:278的氨基酸450-588之内的表位结合，例如其中所述表位部分或全部存在于SEQ ID NO:278的氨基酸450-588之内、氨基酸480-580之内或氨基酸485-572之内。在一种实施方式中，本文所述抗间皮素结合结构域所识别的表位包含选自hMSLN296-588(例如SEQ ID NO:278)的氨基酸485-490、498-507、532-537或545-572或其任意组合的序列。在一种实施方式中，本文所述抗间皮素结合结构域所识别的表位包含一个或更多个选自hMSLN296-588(例如SEQ ID NO:278)的485-490、498-507、532-537或545-572或其任意组合的氨基酸。
在一种实施方式中，抗间皮素结合结构域包含选自SEQ ID NOS:39-62中的人抗间皮素结合结构域的一个或更多个(例如所有三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，和选自SEQ ID NOS:39-62中的人抗间皮素结合结构域的一个或更多个(例如所有三个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。在一种实施方式中，人抗间皮素结合结构域包含本文所述的轻链可变区(例如，表1中)和/或本文所述的重链可变区(例如，表1中)。在一种实施方式中，抗间皮素结合结构域为包括表1的氨基酸序列的轻链可变区和重链可变区的scFv。在一种实施方式中，抗间皮素结合结构域(例如，scFV)包含∶轻链可变区，其包含具有表1中提供的轻链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列，或与表1的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，其包含具有表1中提供的重链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列，或与表1的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
在一种实施方式中，人抗间皮素结合结构域包含选自SEQ ID NOS:39-62的序列或与其具有95-99％同一性的序列。在一种实施方式中，编码人抗间皮素结合结构域的核酸序列包含选自SEQ ID NO:87-110的序列或与其具有95-99％同一性的序列。在一种实施方式中，人抗间皮素结合结构域为scFv，并且包含本文所述氨基酸序列的轻链可变区(例如表1或2中)经由接头(例如，本文所述接头)连接至包含本文所述氨基酸序列的重链可变区(例如表1或2中)。在一种实施方式中，人源化的抗间皮素结合结构域包括(Gly4-Ser)n接头(SEQ ID NO:26)，其中n为1、2、3、4、5或6，优选3或4。scFv的轻链可变区和重链可变区可以为例如下述方向中的任一个：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。
在一个方面，抗原结合结构域部分包含选自SEQ ID NOS:39-62的一个或更多个序列。在一个方面，CAR选自选自SEQ ID NOS:63-86的一个或更多个序列。
在一个方面，本发明的抗体可以以多种其它形式存在，包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键-连接的Fvs(sdFv)、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、直链抗体、单域抗体比如sdAb(VL或VH)、骆驼科VHH结构域、由抗体片段比如二价片段形成的多特异性抗体(包括由二硫桥在铰链区连接的两个Fab片段)，和分离的CDR或抗体的其它表位结合片段。在一个方面，本文提供的抗体片段为scFv。在某些情况下，人scFv也可以来源于酵母展示文库。
展示文库是实体集合：每个实体包括可靠近的多肽组分和编码或鉴定多肽组分的可回收组分。多肽组分是变化的，因此代表不同的氨基酸序列。多肽组分可以具有任何长度，例如从三个氨基酸至超过300个氨基酸。展示文库实体可以包括超过一种多肽组分，例如Fab的两个多肽链。在一个示例性的实施方案中，展示文库可用于鉴定抗间皮素结合结构域。在一个选择中，用间皮素或其中的片段探测所述文库的每个成员的多肽组分，并且如果多肽组分结合间皮素，则通常通过在载体上的滞留来鉴定展示文库成员。
从载体回收保留的展示文库成员并分析。该分析可以包括扩增及随后在类似或不同的条件下选择。例如，可以交替进行阳性和阴性选择。所述的分析也可以包括测定多肽组分即抗间皮素结合结构域的氨基酸序列，并纯化多肽组分用于更详细表征。
可以使用多种形式用于展示文库。实例包括噬菌体展示。在噬菌体展示中，通常把蛋白质组分共价连接至噬菌体外壳蛋白。所述的连接产生于编码与外壳蛋白融合的蛋白质组分的核酸的翻译。所述的连接可以包括柔性肽接头、蛋白酶位点或由于抑制终止密码子而被掺入的氨基酸。噬菌体展示被描述在例如U.S.5,223,409；Smith(1985)Science 228:1315-1317；WO 92/18619；WO 91/17271；WO 92/20791；WO 92/15679；WO 93/01288；WO 92/01047；WO 92/09690；WO 90/02809；de Haard等人(1999)J.Biol.Chem 274:18218-30；Hoogenboom等人(1998)Immunotechnology 4:1-20；Hoogenboom等人(2000)Immunol Today2:371-8和Hoet等人(2005)Nat Biotechnol.23(3)344-8中。可以使用标准噬菌体制备方法(例如，从生长培养基的PEG沉淀)使展示蛋白质组分的噬菌体生长并且进行收获。在选择单独的展示噬菌体之后，可以在扩增之后从所选择的噬菌体感染的细胞或噬菌体本身分离编码所选择的蛋白质组分的核酸。可以挑选单独的菌落或斑块，分离核酸并测序。
其它展示形式包括基于细胞的展示(参见，例如WO 03/029456)、蛋白质-核酸融合(参见，例如US 6,207,446)、核糖体展示(参见，例如Mattheakis等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:9022 and Hanes等人(2000)Nat Biotechnol.18:1287-92；Hanes等人(2000)Methods Enzymol.328:404-30；和Schaffitzel等人(1999)J ImmunolMethods.231(1-2):119-35)和大肠杆菌周质展示(J Immunol Methods.2005 Nov 22；PMID:16337958)。
除了使用展示文库之外，可以使用其它方法获得抗间皮素结合结构域。例如，间皮素或其片段可被用作非人动物(例如啮齿类动物)的抗原。
在一种实施方式中，非人动物包括人免疫球蛋白基因的至少一部分。例如，有可能使用人类Ig基因座的大片段对缺乏小鼠抗体产生的小鼠品种进行工程化。使用杂交瘤技术，可以产生和选择来源于具有期望特异性的基因的抗原特异性单克隆抗体(Mabs)。参见，例如XENOMOUSETM,Green等人,1994,Nat.Gen.7:13-21；U.S.2003-0070185、1996年10月31日公开的WO 96/34096和1996年4月29日提交的PCT申请号PCT/US96/05928。
在某些情况下，可以根据本领域已知的方法(参见例如，Bird等人,(1988)Science242:423-426 and Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)制备scFvs。可以通过使用柔性的多肽接头将VH和VL连接在一起来制备ScFv分子。scFv分子可以包含具有优化长度和/或氨基酸组成的接头(例如，Ser-Gly接头)。接头长度可以极大地影响scFv可变区如何折叠和相互作用。实际上，如果使用短多肽接头(例如，5-10个氨基酸)，则防止链内折叠。也需要链间折叠使两个可变区一起形成功能性表位结合位点。对于接头方向和尺寸的实例，参见例如Hollinger等人1993Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448，美国专利申请公开号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794和PCT公开号WO2006/020258和WO2007/024715，被并入本文作为参考。
scFv可以在其VL和VH区域之间包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50个或以上的氨基酸残基的接头。所述的接头序列可以包含天然存在的氨基酸。在某些实施方式中，接头序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在另一种实施方式中，接头序列包含甘氨酸和丝氨酸重复的集合，比如(Gly4Ser)n，其中n为等于或大于1的正整数。(SEQ ID NO:135)在一种实施方式中，接头可以为(Gly4Ser)4(SEQ IDNO:27)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:28)。接头长度的变化可以保持或提高活性，在活性研究中产生优良的功效。
稳定性和突变
可以参考常规对照scFv分子或全长抗体的生物物理学性质(例如热稳定性)来评价抗间皮素结合结构域例如scFv分子(例如可溶性scFv)的稳定性。在一种实施方式中，在所述试验中，人类scFv具有比对照结合分子(例如，常规scFv分子)高大于约0.1、约0.25、约0.5、约0.75、约1、约1.25、约1.5、约1.75、约2、约2.5、约3、约3.5、约4、约4.5、约5、约5.5、约6、约6.5、约7、约7.5、约8、约8.5、约9、约9.5、约10度、约11度、约12度、约13度、约14度或约15摄氏温度的热稳定性。
接着，赋予整个间皮素CAR构建体改善的抗间皮素结合结构域例如scFv的热稳定性，导致改善了间皮素CAR构建体的治疗特性。与常规抗体相比，抗间皮素结合结构域例如scFv的热稳定性可以被提高至少约2℃或3℃。在一种实施方式中，与常规抗体相比，抗间皮素结合结构域例如scFv具有提高1℃的热稳定性。在另一种实施方式中，与常规抗体相比，抗间皮素结合结构域例如scFv具有提高2℃的热稳定性。在另一种实施方式中，与常规抗体相比，抗间皮素结合结构域例如scFv具有提高4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15℃的热稳定性。可以在例如本文公开的scFv分子与scFv VH和VL所来源的scFv分子或抗体的Fab片段之间进行比较。可以使用本领域已知的方法测量热稳定性。例如，在一种实施方式中，可以测量Tm。如下更详细地描述测量Tm的方法及测定蛋白质稳定性的其它方法。
scFv中的突变(由可溶性scFv的直接诱变产生)改变scFv的稳定性且提高scFv和CART构建体的总稳定性。使用量度比如Tm、温度变性和温度聚集来对比人源化的scFv与鼠scFv的稳定性。
在一种实施方式中，抗间皮素结合结构域例如scFv包含至少一个突变，使得突变的抗间皮素结合结构域例如scFv赋予抗间皮素构建体改善的稳定性。在另一种实施方式中，抗间皮素结合结构域例如scFv包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个突变，使得突变的抗间皮素结合结构域例如scFv赋予抗间皮素构建体改善的稳定性。可以使用实施例中所述的试验来确定突变的scFv的结合力。
结合亲和力
用于测定结合亲和力的多种方法是本领域已知的。一种用于测定结合亲和力的示例性的方法使用表面等离振子共振。表面等离振子公知是一种光学现象，其允许通过使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden and Piscataway,N.J.)检测生物传感器基质中蛋白质浓度的改变分析实时的生物特异性相互作用。对于进一步的描述，参见Jonsson,U.,等人(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26；Jonsson,U.,i(1991)Biotechniques 11:620-627；Johnsson,B.,等人(1995)J.Mol.Recognit.8:125-131；andJohnnson,B.,等人(1991)Anal.Biochem.198:268-277。
在一个方面，包括抗体或其片段的本发明的CAR组合物的部分包含与本文所述氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中所述抗体或其片段保留本发明的抗间皮素抗体片段的期望功能性质。在一个特定的方面，本发明的CAR组合物包含抗体片段。在一个进一步的方面，抗体片段包含scFv。
在多个方面，通过修饰一个或两个可变区(即，VH和/或VL)之内(例如在一个或更多个CDR区域之内和/或一个或更多个构架区之内)的一个或更多个氨基酸，对包含本发明的CAR组合物的抗体或其片段的部分进行工程化。在一个特定的方面，本发明的CAR组合物包含抗体片段。在一个进一步的方面，抗体片段包含scFv。
本领域普通技术人员应当理解，可以进一步修饰本发明的抗体或其抗体，使得它们的氨基酸序列(例如，来自野生型)不同，但期望的活性不变。例如，可以在“非必需”氨基酸残基处,对蛋白质进行导致氨基酸取代的另外的核苷酸取代。例如，分子中的非必需氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代。在另一种实施方式中，氨基酸串可以被侧链家族成员的顺序和/或组成不同的结构上类似的串所替代，即保守取代，其中可以进行氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代。
已经在本领域中定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天门冬氨酸、谷氨酸)、非极性侧链(例如，甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
在两种或多种核酸或多肽序列的上下文中，同一性百分数是指相同的两种或多种序列。当在比较窗或指定区域上比较和比对最大对应时，如使用下述序列比较算法中的一个或通过人工比对和目测检查测量，如果两个序列具有指定百分数的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在整个指定区域或当未指定时在整个序列上60％同一性，任选地70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％95％、96％、97％、98％、99％同一性)，则两个序列是“实质上相同的”。任选地，同一性存在于至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)长度的区域上，或更优选地100至500个或1000个或更多核苷酸(或20个、50个、200个或以上的氨基酸)长度的区域上。
对于序列比较，通常一个序列作为参考序列，把测试序列与其比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，指定子序列坐标，如有必要，并指定序列算法程序参数。可以使用预设定程序参数，或者可以指定备选的参数。然后，基于程序参数，所述的序列比较算法计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分数。用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。可以进行用于比较序列的最佳比对，例如，通过Smith和Waterman,(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源算法，Needleman和Wunsch,(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法，Pearson和Lipman,(1988)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机化实现(WisconsinGenetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI中的GAP,BESTFIT,FASTA和TFASTA)，或通过人工比对和目测检查(参见，例如Brent等人,(2003)Current Protocols in Molecular Biology)。
适于测定序列同一性百分数和序列相似性的算法的两个实例为BLAST和BLAST2.0算法，其分别被描述在Altschul等人,(1977)Nuc.Acids Res.25:3389-3402；和Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。用于进行BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心(the National Center for Biotechnology Information)公开获得的。
也可以使用E.Meyers and W.Miller,(1988)Comput.Appl.Biosci.4:11-17)算法(其被整合到ALIGN程序(2.0版)中)，使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分，测定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。另外，可以使用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:444-453)(其被整合到GCG软件包(在www.gcg.com可获得)的GAP程序中)，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵和16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重，测定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。
在一个方面，本发明设想产生功能等同分子的起始抗体或片段(例如scFv)氨基酸序列的修饰。例如，抗间皮素结合结构域的VH或VL，例如CAR中包含的scFv，可以被修饰以保留抗间皮素结合结构域的起始VH或VL构架区(例如scFv)的至少约70％、71％、72％.73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％,81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。本发明设想整个CAR构建体的修饰，例如CAR构建体的多个结构域的一个或更多个氨基酸序列的修饰，以产生功能等同分子。CAR构建体可以被修饰以保留起始CAR构建体的至少约70％、71％、72％.73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％,81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。
跨膜结构域
在多种实施方式中，关于跨膜结构域，CAR可以被设计成包括连接至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。跨膜结构域可以包括一个或更多个邻接跨膜区域的另外氨基酸，例如一个或更多个与所述跨膜所源自的蛋白质的胞外区域相关联的氨基酸(例如，胞外区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10直至15个氨基酸)和/或与所述跨膜蛋白所源自的蛋白质的胞外区域相关联的一个或更多个另外的氨基酸(例如，胞内区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10直至15个氨基酸)。在一个方面，跨膜结构域是与使用的CAR的其它结构域中的一个有关的结构域，例如，在一种实施方式中，所述跨膜结构域可以来自信号传导结构域、共刺激结构域或铰链结构域所源自的相同蛋白质。在另一个方面，跨膜结构域不是来源于CAR的任何其它域来源的相同蛋白质。在某些情况下，跨膜结构域可以被选择或通过氨基酸取代修饰以避免这样的结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如以使与受体复合体的其它成员的相互作用最小化。在一个方面，跨膜结构域能够与表达CAR的细胞的细胞表面上的另一个CAR同型二聚化。在一个不同的方面，跨膜结构域的氨基酸序列可以被修饰或取代，以便使与存在于表达相同CAR的细胞中的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用最小化。
跨膜结构域可以来源于天然或重组来源。当所述来源是天然的时，所述结构域可以来源于任何膜结合的蛋白质或跨膜蛋白质。在一个方面，跨膜结构域能够向胞内结构域传导信号，无论何时所述CAR与靶结合。在本发明中特别使用的跨膜结构域可以包括至少以下的跨膜结构域：例如，T-细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8(例如，CD8α，CD8β)、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。在某些实施方式中，跨膜结构域可以包括至少下述跨膜区域：例如KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D和NKG2C。
在某些情况下，跨膜结构域可以经由铰链(例如，来自人蛋白质的铰链)连接至CAR的胞外区域，例如CAR的抗原结合结构域。例如，在一种实施方式中，铰链可以是人Ig(免疫球蛋白)铰链(例如，IgG4铰链、IgD铰链)、GS接头(例如，本文所述的GS接头)、KIR2DS2铰链或CD8a铰链。在一种实施方式中，铰链或间隔区包含(例如，组成为)SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一个方面，跨膜结构域包含(例如，组成为)SEQ ID NO:6的跨膜结构域。
在一个方面，铰链或间隔区包含IgG4铰链。例如，在一种实施方式中，铰链或间隔区包含如下氨基酸序列的铰链：：ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM(SEQ ID NO:3)。
在某些实施方式中，铰链或间隔区包含如下核苷酸序列编码的铰链∶GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG(SEQID NO:14)。
在一个方面，铰链或间隔区包含IgD铰链。例如，在一种实施方式中，铰链或间隔区包含如下氨基酸序列的铰链：RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH(SEQ ID NO:4)。
在某些实施方式中，铰链或间隔区包含如下核苷酸序列编码的铰链∶AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACTGCACAGCCCCAGGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTACGCGCAATACTGGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGAAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCCCATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATCTCTTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAGGCCACCTTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCCGGAAAGGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAGCCAGCACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCTGTCACATGTACTCTAAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTGATGGCCCTTAGAGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAGCCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCCAACATCTTGCTCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACACCAGCGGCTTCGCTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTGGGCCTGGAGTGTCTTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCCCAGCCAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAAGATAGCAGGACCCTGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACCATT(SEQ ID NO:15)。
在一个方面，跨膜结构域可以是重组的，在这样情况下，其将会主要包含疏水性残基，比如亮氨酸和缬氨酸。在一个方面，在重组跨膜结构域的每个末端可以发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
任选地，长度在2至10个氨基酸之间的短的寡肽或多肽接头可以在CAR的跨膜结构域与细胞质信号传导区之间形成键。甘氨酸-丝氨酸二联体提供一种特别合适的接头。例如，在一个方面，接头包含如下氨基酸序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:5)。在某些实施方式中，接头由如下核苷酸序列编码：GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(SEQ ID NO:16)。
在一个方面，铰链或间隔区包含KIR2DS2铰链及其部分。
细胞质结构域
CAR的细胞质结构域或区域包括胞内信号传导结构域。胞内信号传导结构域通常负责其中已经引入CAR的免疫细胞的正常效应子功能中至少一个的活化。术语“效应子功能”是指细胞的特化功能。T细胞的效应子功能例如可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。因此，术语“胞内信号传导结构域”是指转导效应子功能信号且引导细胞执行特定功能的蛋白质的部分。虽然通常可以应用全部胞内信号传导结构域，但是在许多情况下不必使用整个链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分来说，可以使用这样的截短部分代替完整的链，只要其转导效应子功能信号。因此，术语胞内信号传导结构域意味着包括足以转导效应子功能信号的胞内信号传导结构域的截短部分。
用于本发明的CAR的胞内信号传导结构域的实例包括共同作用以在抗原受体衔接之后引发信号转导的T细胞受体(TCR)和共同受体的细胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能性能力的任何重组序列。
众所周知通过单独的TCR产生的信号不足以完全活化T细胞，并且也需要二级和/或共刺激信号。因此，T细胞活化可以被称为是由两个不同种类的细胞质信号传导序列介导的：通过TCR引发抗原依赖性一级活化的那些(一级胞内信号传导结构域)以及以抗原独立方式起作用以提供二级或共刺激信号的那些(二级细胞质结构域，例如共刺激结构域)。
一级细胞质信号传导结构域以刺激方式或以抑制方式调节TCR复合体的一级活化。以刺激方式起作用的一级胞内信号传导结构域可以含有信号传导基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。
特别地用于本发明中的含有ITAM的一级胞内信号传导结构域的实例包括如下那些：CD3ζ、常见的FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12。在一种实施方式中，本发明的CAR包含胞内信号传导结构域，例如CD3-ζ的初级信号传导结构域。
在一种实施方式中，初级信号传导结构域包含修饰的ITAM结构域，例如与天然ITAM结构域相比具有改变的(例如，增强或降低的)活性的突变ITAM结构域。在一种实施方式中，初级信号传导结构域包含含有修饰的ITAM的一级胞内信号传导结构域，例如含有优化的和/或截短的ITAM的一级胞内信号传导结构域。在一种实施方式中，初级信号传导结构域包含一个、两个、三个、四个或更多个ITAM基序。
特别地用在本发明中的含有一级胞内信号传导结构域的分子的其它实例包括DAP10、DAP12和CD32的那些。
CAR的胞内结构域可以包含CD3-ζ信号传导结构域本身，或者其可以与用于本发明的CAR的上下文中的任何其它期望的胞内信号传导结构域组合。例如，CAR的胞内信号传导结构域可以包括CD3ζ链部分和共刺激信号传导结构域。共刺激信号传导结构域是指包括共刺激性分子的胞内结构域的CAR的部分。共刺激性分子是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。这样的分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1(也称为PD1)、ICOS、与淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1),CD2,CD7,LIGHT,NKG2C,B7-H3以及特异性地结合CD83的配体等。例如，CD27共刺激已经表现出在体外增强人CART细胞的扩增、效应子功能和存活及在体内增强人T细胞持久性和抗肿瘤活性(Song等人Blood.2012；119(3):696-706)。这样的共刺激性分子的其它实例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、NKG2D、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76和PAG/Cbp。
可以使本发明的CAR的细胞质部分之内的胞内信号传导结构域以随机或指定顺序彼此连接。任选地，例如长度在2和10个氨基酸(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)之间的短的寡肽或多肽接头可以在胞内信号传导结构域之间形成连接。在一种实施方式中，甘氨酸-丝氨酸二联体可用作合适的接头。在一种实施方式中，单个氨基酸例如丙氨酸、甘氨酸可用作合适的接头。
在一个方面，胞内信号传导结构域被设计成包含两个或多个，例如2、3、4、5个或多个共刺激信号传导结构域。在一种实施方式中，两个或多个，例如2、3、4、5个或多个共刺激信号传导结构域被接头(例如本文所述的接头)分子分开。在一种实施方式中，胞内信号传导结构域包含两个共刺激信号传导结构域。在某些实施方式中，接头分子为甘氨酸残基。在某些实施方式中，接头为丙氨酸残基。
在一个方面，胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一个方面，胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。在一个方面，4-1BB的信号传导结构域为SEQ ID NO:16的信号传导结构域。在一个方面，CD3-ζ的信号传导结构域为SEQ ID NO:17的信号传导结构域。
在一个方面，胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD27的信号传导结构域。在一个方面，CD27的信号传导结构域包含氨基酸序列QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(SEQ ID NO:8)。在一个方面，CD27的信号传导结构域由核酸序列AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(SEQ ID NO:19)编码。
在一个方面，本文所述表达CAR的细胞可以进一步包括第二CAR，例如包括例如针对相同靶(间皮素)或不同靶(例如，基质细胞上不同于间皮素的靶，例如FAP；前列腺癌细胞上不同于间皮素的靶，例如雄激素受体、OR51E2、PSMA、PSCA、PDGRF-β、TARP、GloboH、MADCT-1或MAD-CT-2；卵巢癌细胞上不同于间皮素的靶，例如Tn、PRSS21、CD171、Lewis Y、叶酸受体α、claudin6、GloboH或精蛋白17；例如肺癌细胞上不同于间皮素的靶，例如VEGF、HER3、IGF-1R、EGFR、DLL4或Trop-2)的不同抗原结合结构域的第二CAR。在一种实施方式中，表达CAR的细胞包括靶向第一抗原且包括具有共刺激信号传导结构域而不是初级信号传导结构域的胞内信号传导结构域的第一CAR，和靶向第二、不同的抗原且包括具有初级信号传导结构域而不是共刺激信号传导结构域的胞内信号传导结构域的第二CAR。将共刺激信号传导结构域(例如4-1BB、CD28、CD27或OX-40)置于第一CAR上，并且将初级信号传导结构域例如CD3ζ置于第二CAR上可以将CAR活性限制为表达两个靶的细胞。在一种实施方式中，表达CAR的细胞包含第一间皮素CAR，其包括间皮素结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域，和第二CAR，其靶向不同于间皮素的抗原(例如，基质细胞上不同于间皮素的靶，例如，FAP；前列腺癌细胞上不同于间皮素的靶，例如雄激素受体、OR51E2、PSMA、PSCA、PDGRF-β、TARP、GloboH、MAD-CT-1或MAD-CT-2；卵巢癌细胞上不同于间皮素的靶，例如Tn、PRSS21、CD171、Lewis Y、叶酸受体α、claudin6、GloboH或精蛋白17，例如肺癌细胞上不同于间皮素的靶，例如VEGF、HER3、IGF-1R、EGFR、DLL4或Trop-2)且包括抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域。在另一种实施方式中，表达CAR的细胞包含第一间皮素CAR，其包括间皮素结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域，和第二CAR，其靶向不同于间皮素的抗原(例如，不同于基质细胞上的间皮素的靶，例如，FAP；前列腺癌细胞上不同于间皮素的靶，例如雄激素受体、OR51E2、PSMA、PSCA、PDGRF-β、TARP、GloboH、MAD-CT-1或MAD-CT-2；卵巢癌细胞上不同于间皮素的靶，例如Tn、PRSS21、CD171、Lewis Y、叶酸受体α、claudin6、GloboH或精蛋白17，例如肺癌细胞上不同于间皮素的靶，例如VEGF、HER3、IGF-1R、EGFR、DLL4或Trop-2)且包括所述抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域。
在一种实施方式中，表达CAR的细胞包含本文所述间皮素CAR和抑制性CAR。在一种实施方式中，抑制性CAR包含结合正常细胞(例如也表达间皮素的正常细胞)而不是癌细胞上发现的抗原的抗原结合结构域。在一种实施方式中，抑制性CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和抑制性分子的胞内结构域。例如，抑制性CAR的胞内结构域可以为PD1,PD-L1,CTLA4,TIM3,CEACAM(例如,CEACAM-1,CEACAM-3和/或CEACAM-5),LAG3,VISTA,BTLA,TIGIT,LAIR1,CD160,2B4和TGFRβ的胞内结构域。
在一种实施方式中，当表达CAR的细胞包括两个或多个不同的CAR时，不同的CAR的抗原结合结构域可以是这样的，使得所述抗原结合结构域彼此不相互作用。例如，表达第一和第二CAR的细胞可以具有第一CAR的抗原结合结构域，例如呈片段形式，例如scFv，其不与第二CAR的抗原结合结构域形成缔合，例如第二CAR的抗原结合结构域是VHH。
在某些实施方式中，抗原结合结构域包含单结构域抗原结合(SDAB)分子，包括其互补决定区为单结构域多肽的部分的分子。实例包括，但不限于重链可变结构域、天然缺乏轻链的结合分子、来源于常规4-链抗体的单结构域、工程化的结构域和不同于来源于抗体的那些的单结构域支架。SDAB分子可以是该领域的任一个，或者任何未来的单结构域分子。SDAB分子可以来源于任何种类，包括但不限于小鼠、人、骆驼、骆马、七鳃鳗、鱼、鲨鱼、山羊、兔子和牛。该术语也包括来自不同于骆驼和鲨鱼的物种的天然存在的单结构域抗体分子。
在一个方面，SDAB分子可以来源于鱼中存在的免疫球蛋白的可变区，比如例如来源于鲨鱼血清中存在的被称为新抗原受体(NAR)的免疫球蛋白同种型。制备来源于NAR("IgNARs")的可变区的单结构域分子的方法被描述在WO 03/014161和Streltsov(2005)Protein Sci.14:2901-2909中。
根据另一个方面，SDAB分子是天然存在的单结构域抗原结合分子，被称为缺乏轻链的重链。这样的单结构域分子例如被公开在WO 9404678和Hamers-Casterman C.等人(1993)Nature 363:446-448中。为了清楚的原因，来源于天然缺乏轻链的重链分子的该可变结构域在本文中称为VHH或纳米抗体，以将其与四链免疫球蛋白的常规VH区分。这样的VHH分子可以来源于骆驼科物种，例如骆驼、骆马、单峰骆驼、羊驼和原驼。除了骆驼科之外的其它物种可以产生天然缺乏轻链的重链分子；这样的VHH在本发明的范围之内。
SDAB分子可以是重组的、CDR-接枝的、人源化的、骆驼化的、去免疫的和/或体外产生的(例如，通过噬菌体展示选择的)。
也已经发现，具有多个嵌合性膜埋入受体(包含在受体的抗原结合结构域之间相互作用的抗原结合结构域)的细胞可能不是理想的，例如因为其抑制一个或更多个抗原结合结构域与其同源抗原结合的能力。因此，本文公开了具有第一和第二非天然存在的嵌合性膜埋入受体(包括最小化这样的相互作用的抗原结合结构域)的细胞。本文还公开了编码第一和第二非天然存在的嵌合性膜埋入受体(包含最小化这样的相互作用的抗原结合结构域)的核酸以及其制备方法和使用这样的细胞和核酸的方法。在一种实施方式中，所述第一和第二非天然存在的嵌合性膜埋入受体中一个的抗原结合结构域包含scFv，并且另一个包括单VH结构域，例如骆驼科、鲨鱼、七鳃鳗的单VH结构域，或来源于人类或小鼠序列的单VH结构域。
在某些实施方式中，本发明包含第一和第二CAR，其中第一和第二CAR中一个的抗原结合结构域不包含可变轻结构域和可变重结构域。在某些实施方式中，第一和第二CAR中一个的抗原结合结构域为scFv，并且另一个不为scFv。在某些实施方式中，第一和第二CAR中一个的抗原结合结构域包含单VH结构域，例如骆驼科、鲨鱼或七鳃鳗单VH结构域或来源于人类或小鼠序列的单VH结构域。在某些实施方式中，第一和第二CAR中一个的抗原结合结构域包含纳米抗体。在某些实施方式中，第一和第二CAR中一个的抗原结合结构域包含骆驼科VHH结构域。
在某些实施方式中，第一和第二CAR中一个的抗原结合结构域包含scFv，且另一个包括单VH结构域，例如骆驼科、鲨鱼或七鳃鳗单VH结构域或来源于人类或小鼠序列的单VH结构域。在某些实施方式中，第一和第二CAR中一个的抗原结合结构域包含scFv，并且另一个包含纳米抗体。在某些实施方式中，第一和第二CAR中一个的抗原结合结构域包含scFv，并且另一个包含骆驼科VHH结构域。
在某些实施方式中，当存在于细胞表面上时，第一CAR的抗原结合结构域与其同源抗原的结合不会受第二CAR的存在而实质性降低。在某些实施方式中，在第二CAR的存在下，第一CAR的抗原结合结构域与其同源抗原的结合是在不存在第二种CAR下第一CAR的抗原结合结构域与其同源抗原的结合的85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在某些实施方式中，当存在于细胞表面上时，第一和第二CAR的抗原结合结构域彼此缔合少于如果两者都为scFv抗原结合结构域时。在某些实施方式中，第一和第二CAR的抗原结合结构域彼此缔合少于如果两者都为scFv抗原结合结构域时的85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在另一个方面，本文所述表达CAR的细胞可以进一步表达另一种作用剂，例如增强表达CAR细胞的活性或适应性的作用剂。例如，在一种实施方式中，作用剂可以为抑制调控或调节(例如抑制)T细胞功能的分子的作用剂。在某些实施方式中，调控或调节T细胞功能的分子为抑制性分子。在某些实施方式中，抑制性分子例如PD1可以降低表达CAR的细胞建立免疫效应子应答的能力。抑制性分子的实例包括PD1,PD-L1,CTLA4,TIM3,CEACAM(例如CEACAM-1,CEACAM-3和/或CEACAM-5),LAG3,VISTA,BTLA,TIGIT,LAIR1,CD160,2B4和TGFRβ。在实施方案中，例如如本文所述的作用剂，例如抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA；或例如，抑制性蛋白质或系统，例如簇状的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)或锌指核酸内切酶(ZFN)可用于抑制调控或调节例如抑制表达CAR的细胞中T-细胞功能的分子的表达。在一种实施方式中，作用剂为shRNA，例如本文所述的shRNA。在一种实施方式中，调控或调节例如抑制T-细胞功能的作用剂在表达CAR的细胞内被抑制。例如，抑制调控或调节(例如抑制)T-细胞功能的分子表达的dsRNA分子连接到编码CAR的组分(例如所有组分)的核酸。
在一种实施方式中，抑制抑制性分子的作用剂包括第一多肽，例如抑制性分子，其与向细胞提供正信号的第二多肽缔合，例如本文所述胞内信号传导结构域。在一种实施方式中，作用剂包括例如抑制性分子的第一多肽，比如PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβT或这些中任一个的片段(例如，这些中任一个的胞外结构域的至少一部分)，和作为本文中描述的胞内信号传导结构域的第二多肽(例如，包括共刺激结构域(例如，如本文中所述的41BB、CD27或CD28)和/或初级信号传导结构域(例如，本文中所述的CD3ζ信号传导结构域)。在一种实施方式中，作用剂包含PD1的第一多肽或其片段(例如，PD1的胞外结构域的至少一部分)，和作为本文所述的胞内信号传导结构域的第二多肽(例如，本文中所述CD28信号传导结构域和/或CD3ζ信号传导结构域)。PD1为受体的CD28家族的抑制性成员，也包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1在活化的B细胞、T细胞和骨髓细胞上被表达(Agata等人1996Int.Immunol 8:765-75)。PD1、Pd-L1和PD-L2的两个配体已显示在结合PD1时下调T细胞的活化(Freeman等人.2000 J Exp Med 192:1027-34；Latchman等人2001 Nat Immunol2:261-8；Carter等人2002 Eur J Immunol 32:634-43)。PD-L1在人类癌症中大量存在(Dong等人2003 J Mol Med 81:281-7；Blank等人2005 Cancer Immunol.Immunother 54:307-314；Konishi等人2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制可以通过抑制PD1与PD-L1的局部相互作用来逆转。
在一种实施方式中，所述作用剂包含抑制性分子(例如程序性死亡1(PD1))的胞外结构域(ECD)，可以融合到跨膜结构域和胞内信号传导结构域(比如41BB和CD3ζ)(本文也称为PD1 CAR)。在一种实施方式中，当与本文所述间皮素CAR联合使用时，PD1 CAR提高T细胞的持久性。在一种实施方式中，CAR是PD1 CAR，其包含在SEQ ID NO:24中以下划线指示的PD1的胞外结构域和在SEQ ID NO:24的氨基酸1-21处的信号序列。在一种实施方式中，PD1CAR包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
Malpvtalllplalllhaarppgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnw yrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelr vterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(SEQ ID NO:24).
在一种实施方式中，没有N-末端信号序列的PD1 CAR包含如下提供的氨基酸序列(SEQ ID NO:22)。
pgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsq pgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpag qfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(SEQ ID NO:22)。
在一种实施方式中，所述作用剂包含编码具有N-末端信号序列的PD1 CAR的核酸序列，例如本文所述PD1 CAR。在一种实施方式中，用于PD1 CAR的核酸序列显示如下，具有如下SEQ ID NO:23中加下划线的PD1 ECD。
atggccctccctgtcactgccctgcttctccccctcgcactcctgctccacgccgctagaccacccgg atggtttctggactctccggatcgcccgtggaatcccccaaccttctcaccggcactcttggttgtgactgagggc gataatgcgaccttcacgtgctcgttctccaacacctccgaatcattcgtgctgaactggtaccgcatgagcccgt caaaccagaccgacaagctcgccgcgtttccggaagatcggtcgcaaccgggacaggattgtcggttccgcgtgac tcaactgccgaatggcagagacttccacatgagcgtggtccgcgctaggcgaaacgactccgggacctacctgtgc ggagccatctcgctggcgcctaaggcccaaatcaaagagagcttgagggccgaactgagagtgaccgagcgcagag ctgaggtgccaactgcacatccatccccatcgcctcggcctgcggggcagtttcagaccctggtcacgaccactccggcgccgcgcccaccgactccggccccaactatcgcgagccagcccctgtcgctgaggccggaagcatgccgccctgccgccggaggtgctgtgcatacccggggattggacttcgcatgcgacatctacatttgggctcctctcgccggaacttgtggcgtgctccttctgtccctggtcatcaccctgtactgcaagcggggtcggaaaaagcttctgtacattttcaagcagcccttcatgaggcccgtgcaaaccacccaggaggaggacggttgctcctgccggttccccgaagaggaagaaggaggttgcgagctgcgcgtgaagttctcccggagcgccgacgcccccgcctataagcagggccagaaccagctgtacaacgaactgaacctgggacggcgggaagagtacgatgtgctggacaagcggcgcggccgggaccccgaaatgggcgggaagcctagaagaaagaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctactccgaaattgggatgaagggagagcggcggaggggaaaggggcacgacggcctgtaccaaggactgtccaccgccaccaaggacacatacgatgccctgcacatgcaggcccttccccctcgc(SEQ ID NO:23)。
在另一个方面，本发明提供表达CAR的细胞例如CART细胞的群。在某些实施方式中，表达CAR的细胞群包括表达不同CAR的细胞混合物。例如，在一种实施方式中，CART细胞群可以包括表达具有本文所述抗-CD19结合结构域的CAR的第一细胞，和表达具有不同抗-CD19结合结构域(例如，不同于第一细胞所表达的CAR中抗间皮素结合结构域的本文所述的抗间皮素结合结构域)的CAR的第二细胞。作为另一个实例，表达CAR的细胞群可以包括表达包含(例如如本文所述的)抗间皮素结合结构域的CAR的第一细胞，和表达包含针对不同于间皮素的靶(例如，基质细胞上不同于间皮素的靶，例如FAP；前列腺癌细胞上不同于间皮素的靶，例如雄激素受体、OR51E2、PSMA、PSCA、PDGRF-β、TARP、GloboH、MAD CT-1或MAD-CT-2；卵巢癌细胞上不同于间皮素的靶，例如Tn、PRSS21、CD171、Lewis Y、叶酸受体α、claudin6、GloboH或精蛋白17；例如肺癌细胞上不同于间皮素的靶，例如VEGF、HER3、IGF-1R、EGFR、DLL4或Trop-2)的抗原结合结构域的CAR的第二细胞。在一种实施方式中，表达CAR的细胞群包括例如表达包含一级胞内信号传导结构域的CAR的第一细胞和表达包含二级信号传导结构域的CAR的第二细胞。
在另一个方面，本发明提供细胞群，其中该群中的至少一个细胞表达具有本文所述抗间皮素结合结构域的CAR，并且第二细胞表达另一种作用剂，例如增强表达CAR的细胞的活性或功能的作用剂。例如，在一种实施方式中，作用剂可以是调控或调节(例如抑制)T细胞功能的作用剂。在某些实施方式中，调控或调节T细胞功能的分子是抑制性分子，例如本文所述的作用剂。在某些实施方式中，例如抑制性分子可以降低表达CAR的细胞建立免疫效应物应答的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。在一种实施方式中，抑制抑制性分子的作用剂包括第一多肽，例如抑制性分子，其与向细胞提供阳性信号的第二多肽缔合，例如本文所述胞内信号传导结构域。在一种实施方式中，作用剂包括例如抑制性分子的第一多肽，比如PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如、CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ或这些中任一个的片段(例如，这些中任一个的胞外结构域的至少一部分)，和第二多肽，其为本文所述胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，如本文所述的41BB、CD27或CD28)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述CD3ζ信号传导结构域)。在一种实施方式中，作用剂包括PD1的第一多肽或其片段(例如，PD1的胞外结构域的至少一部分)，和本文所述胞内信号传导结构域的第二多肽(例如，本文所述CD28信号传导结构域和/或本文所述CD3ζ信号传导结构域)。
在一个方面，本发明提供方法，其包括与另一种作用剂(例如激酶抑制剂，比如本文所述激酶抑制剂)联合施用表达CAR的细胞群(例如，CART细胞，例如表达不同CAR的细胞混合物)。在另一个方面，本发明提供方法，其包括与另一种作用剂(例如激酶抑制剂，比如本文所述的激酶抑制剂)联合施用细胞群，其中该群中的至少一个细胞表达具有如本文所述的抗间皮素结合结构域的CAR，且第二细胞表达另一种作用剂，例如增强表达CAR的细胞的活性或适应性的作用剂。
可调节的嵌合抗原受体
在某些实施方式中，期望其中CAR活性是可被控制的可调节的CAR(RCAR)，以优化CAR疗法的安全性和功效。存在许多可以调节CAR活性的方式。例如，使用例如融合至二聚化结构域的胱天蛋白酶的可诱导的细胞凋亡(参见，例如Di等人,N Egnl.J.Med.2011Nov.3；365(18):1673-1683)可以被用作本发明的CAR疗法中的安全开关。在一个方面里，RCAR包括一组多肽，在最简单的实施方案中通常为两个，其中本文中所述的标准的CAR组分(例如抗原结合结构域和胞内信号传导结构域)被分配在分开的多肽或成员上。在某些实施方式中，多肽组包括二聚化开关，当存在二聚化分子时，其可以使多肽彼此偶联，例如可以偶联抗原结合结构域与胞内信号传导结构域。
在一个方面，RCAR包括两个多肽或成员∶1)胞内信号传导成员，包括胞内信号传导结构域，例如本文所述一级胞内信号传导结构域和第一开关结构域；2)抗原结合成员，其包含例如靶向本文所述的间皮素的抗原结合结构域，和第二开关结构域。任选地，RCAR包含本文所述的跨膜结构域。在一种实施方式中，跨膜结构域可以被设置在胞内信号传导成员上、抗原结合成员上或两者上。(除非另有说明，否则当本文描述RCAR的成员或元件时，顺序可以如所提供的那样，但是也包括其它顺序。换句话说，在一种实施方式中，顺序为如本文列出的那样，但是在其它实施方案中，顺序可以是不同的。例如，跨膜区域一侧上的成员顺序可以与实例不同，例如，开关结构域相对于胞内信号传导结构域的布置可以不同，例如是颠倒的)。
在一种实施方式中，第一和第二开关结构域可以形成胞内或胞外二聚化开关。在一种实施方式中，二聚化开关可以是同型二聚化开关，例如其中第一和第二开关结构域相同，或异源二聚化开关，例如其中第一和第二开关结构域彼此不同。
在实施方案中，RCAR可以包含“多重开关”。多重开关可以包括异源二聚化开关结构域或同型二聚化开关结构域。多重开关在第一成员例如抗原结合成员和第二成员例如胞内信号传导成员上独立地包括多个开关结构域，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在一种实施方式中，第一成员可以包括多个第一开关结构域，例如基于FKBP的开关结构域，并且第二成员可以包括多个第二开关结构域，例如基于FRB的开关结构域。在一种实施方式中，第一成员可以包括第一和第二开关结构域，例如基于FKBP的开关结构域和基于FRB的开关结构域，并且第二成员可以包括第一和第二开关结构域，例如基于FKBP的开关结构域和基于FRB的开关结构域。
在一种实施方式中，胞内信号传导成员包括一个或更多个胞内信号传导结构域，例如一级胞内信号传导结构域和一个或更多个共刺激信号传导结构域。
在一种实施方式中，抗原结合成员可以包括一个或更多个胞内信号传导结构域，例如一个或更多个共刺激信号传导结构域。在一种实施方式中，抗原结合成员包括多个，例如2个或3个本文所述共刺激信号传导结构域，例如选自41BB、CD28、CD27、ICOS和OX40，且在实施方案中，没有一级胞内信号传导结构域。在一种实施方式中，抗原结合成员从胞外至胞内方向包括下述共刺激信号传导结构域：41BB-CD27；41BB-CD27；CD27-41BB；41BB-CD28；CD28-41BB；OX40-CD28；CD28-OX40；CD28-41BB；或41BB-CD28。在这样的实施方案中，胞内结合成员包含CD3ζ结构域。在一个这样的实施方案中，RCAR包括(1)抗原结合成员，包括例如本文所述的抗原结合结构域、跨膜结构域和两个共刺激结构域和第一开关结构域；和(2)胞内信号传导结构域，包括跨膜结构域或膜系链结构域和至少一个一级胞内信号传导结构域及第二开关结构域。
一种实施方式提供RCAR，其中抗原结合成员没有系链至CAR细胞的表面。这允许具有胞内信号传导成员的细胞方便地与一个或更多个抗原结合结构域配对，而不用编码该抗原结合成员的序列转化该细胞。在这样的实施方案中，RCAR包含：1)胞内信号传导成员，包括：第一开关结构域、跨膜结构域、胞内信号传导结构域，例如一级胞内信号传导结构域和第一开关结构域；和2)抗原结合成员，包括：例如本文所述的抗原结合结构域，和第二开关结构域，其中所述抗原结合成员不包括跨膜结构域或膜系链结构域，且任选地不包括胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，RCAR可以进一步包括3)第二抗原结合成员，包括；例如与不同于抗原结合结构域所结合的抗原结合的第二抗原结合结构域；和第二开关结构域。
本文还提供RCAR，其中所述抗原结合成员包含双特异性活化和靶向能力。在该实施方案中，抗原结合成员可以包括多个，例如2、3、4、或5个抗原结合结构域，例如scFvs，其中每个抗原结合结构域与靶抗原(例如不同抗原或相同抗原，例如相同抗原上的相同或不同的表位)结合。在一种实施方式中，多个抗原结合结构域串联，任选地是设置在每个抗原结合结构域之间的接头或铰链区。本文中描述了合适的接头和铰链区。
一种实施方式提供具有允许开关增殖的构型的RCAR。在该实施方案中，RCAR包括∶1)胞内信号传导成员，其包含∶任选的跨膜结构域或膜系链结构域；一个或更多个共刺激信号传导结构域，例如选自41BB、CD28、CD27、ICOS和OX40，和开关结构域；和2)抗原结合成员，其包含：抗原结合结构域，正如本文所述的那样，跨膜结构域和一级胞内信号传导结构域，例如CD3ζ结构域，其中所述抗原结合成员不包括开关结构域，或者不包括与胞内信号传导成员上的开关结构域二聚化的开关结构域。在一种实施方式中，抗原结合成员不包括共刺激信号传导结构域。在一种实施方式中，胞内信号传导成员包括来自同型二聚化开关的开关结构域。在一种实施方式中，胞内信号传导成员包括异源二聚化开关的第一开关结构域，并且RCAR包括第二胞内信号传导成员，该成员包括异源二聚化开关的第二开关结构域。在这样的实施方案中，第二胞内信号传导成员包括与胞内信号传导成员相同的胞内信号传导结构域。在一种实施方式中，二聚化开关为胞内的。在一种实施方式中，二聚化开关为胞外的。
在本文所述的任一个RCAR构型中，第一和第二开关结构域包含如本文所述的基于FKBP/FRB的开关。
本文还提供包括本文所述的RCAR的细胞。被工程化以表达RCAR的任何细胞都可以被用作RCARX细胞。在一种实施方式中，RCARX细胞为T细胞，且被称为RCART细胞。在一种实施方式中，RCARX细胞为NK细胞，且被称为RCARN细胞。
本文还提供包含编码RCAR序列的核酸和载体。可以把编码多种RCAR元件的序列配置在相同核酸分子上，例如相同质粒或载体，例如病毒载体，例如慢病毒载体。在一种实施方式中，(i)编码抗原结合成员的序列和(ii)编码胞内信号传导成员的序列可以存在于相同核酸例如载体上。可以通过使用单独的启动子或通过使用双顺反子转录产品(其可以通过切割单个翻译产物或翻译两个不同的蛋白产物导致产生两个蛋白质)来实现相应蛋白质的产生。在一种实施方式中，把编码可切割肽的序列例如P2A或F2A序列设置在(i)和(ii)之间。在一种实施方式中，把编码IRES(例如EMCV或EV71 IRES)的序列设置在(i)和(ii)之间。在这些实施方案中，(i)和(ii)作为单RNA被转录。在一种实施方式中，使第一启动子与(i)有效连接，且使第二启动子与(ii)有效连接，使得(i)和(ii)作为分开的mRNA被转录。
备选地，可以把编码RCAR的多种元件的序列设置在不同的核酸分子上，例如不同的质粒或载体，例如病毒载体，例如慢病毒载体。例如，(i)编码抗原结合成员的序列可以存在于第一核酸例如第一载体上，和(ii)编码胞内信号传导成员的序列可以存在于第二核酸例如第二载体上。
二聚化开关
二聚化开关可以是非共价的或共价的。在一个非共价的二聚化开关中，二聚化分子促进开关结构域之间的非共价相互作用。在共价的二聚化开关中，二聚化分子促进开关结构域之间的共价相互作用。
在一种实施方式中，RCAR包含基于FKBP/FRAP或FKBP/FRB的二聚化开关。FKBP12(FKBP或FK506结合蛋白)是充当天然产物免疫抑制药物雷帕霉素的初始细胞内靶的丰富的细胞质蛋白。雷帕霉素结合FKBP和所述大的PI3K同源物FRAP(RAFT，mTOR)。FRB为FRAP的93个氨基酸的部分，其足以结合FKBP-雷帕霉素复合体(Chen,J.,Zheng,X.F.,Brown,E.J.&Schreiber,S.L.(1995)Identification of an 11-kDa FKBP12-rapamycin-bindingdomain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associated protein andcharacterization of a critical serine residue.Proc Natl Acad Sci U S A 92:4947-51.)。
在实施方案中，基于FKBP/FRAP，例如FKBP/FRB的开关可以使用二聚化分子，例如雷帕霉素或雷帕霉素类似物。
FKBP的氨基酸序列如下∶
D V P D Y A S L G G P S S P K K K R K V S R G V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S Y(SEQ ID NO:382)
在实施方案中，FKBP开关结构域可以包含FKBP的FRB结合片段，例如SEQ ID NO:382的加下划线部分：
V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K FD S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L TI S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S(SEQ IDNO:383)
FKBP的氨基酸序列如下∶ILWHEMWHEG LEEASRLYFG ERNVKGMFEV LEPLHAMMERGPQTLKETSF NQAYGRDLME AQEWCRKYMK SGNVKDLTQA WDLYYHVFRR ISK(SEQ ID NO:384)
正如本文中使用的那样，术语“基于FKBP/FRAP(例如FKPP/FRB)的开关”是指二聚化开关，其包含：第一开关结构域，其包含FRB结合片段或FKBP类似物，例如RAD001，且与SEQID NO:382或383的FKBP序列具有至少70、75、80、85、90、95、96、97、98或99％同一性，或与其相差不超过30、25、20、15、10、5、4、3、2或1个氨基酸残基；和第二开关结构域，其包括FKBP结合片段或FRB类似物，并且与SEQ ID NO:384的FRB序列具有至少70、75、80、85、90、95、96、97、98或99％同一性，或与其相差不超过30、25、20、15、10、5、4、3、2或1个氨基酸残基。在一种实施方式中，本文所述的RCAR包括一个包含SEQ ID NO:382(或SEQ ID NO:383)中公开的氨基酸残基的开关结构域，和一个包含SEQ ID NO:384中公开的氨基酸残基的开关结构域。
在实施方案中，FKBP/FRB二聚化开关包括修饰的FRB开关结构域，其显示出对于二聚化分子(例如雷帕霉素或雷帕系物，例如RAD001)的改变的(例如增加的)亲和力。在一种实施方式中，修饰的FRB开关结构域包含一个或更多个突变，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个以上选自在氨基酸位置L2031、E2032、S2035、R2036、F2039、G2040、T2098、W2101、D2102、Y2105和F2108的突变，其中所述野生型氨基酸突变成任何其它天然存在的氨基酸。在一种实施方式中，突变体FRB包括在E2032的突变，其中E2032突变成苯丙氨酸(E2032F)、甲硫氨酸(E2032M)、精氨酸(E2032R)、缬氨酸(E2032V)、酪氨酸(E2032Y)、异亮氨酸(E2032I)，例如SEQ ID NO:385或亮氨酸(E2032L)，例如SEQ ID NO:386。在一种实施方式中，突变体FRB包括在T2098处的突变，其中T2098突变成苯丙氨酸(T2098F)或亮氨酸(T2098L)，例如SEQ IDNO:387。在一种实施方式中，突变体FRB包括在E2032和T2098处的突变，其中E2032突变成任何氨基酸，且其中T2098突变成任何氨基酸，例如SEQ ID NO:388。在一种实施方式中，突变体FRB包括E2032I和T2098L突变，例如SEQ ID NO:389。在一种实施方式中，突变体FRB包括E2032L和T2098L突变，例如SEQ ID NO:340。
表14.具有对于二聚化分子增加的亲和力的示例性的突变体FRB
Figure GDA0003963633350000891
Figure GDA0003963633350000901
其它合适的二聚化开关包括基于GyrB-GyrB的二聚化开关、基于赤霉素的二聚化开关、标记/结合剂二聚化开关和卤代-标记/snap-标记二聚化开关。按照本文提供的指导，这样的开关和相关二聚化分子对本领域技术人员将是显而易见的。
二聚化分子
二聚化分子促进开关结构域之间的缔合。在二聚化分子相互作用或开关结构域之间的缔合的存在下，允许与第一开关结构域缔合的(例如融合的)多肽和与第二开关结构域缔合的(例如融合的)多肽之间的信号转导。例如，如在本文所述系统中测量的那样，在非限制水平的二聚化分子的存在下，信号转导增加1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、5、10、50、100倍。
雷帕霉素和雷帕霉素类似物(有时称为雷帕系物)例如RAD001可用作本文所述基于FKBP/FRB二聚化开关中的二聚化分子。在一种实施方式中，二聚化分子可以选自雷帕霉素(西罗莫司)、RAD001(依维莫司)、zotarolimus、坦罗莫司、AP-23573(雷达罗莫司)、biolimus和AP21967。适用于基于FKBP/FRB二聚化开关的另一种雷帕霉素类似物被进一步描述在名称为“组合疗法”的部分中或名称为“示例性的mTOR抑制剂”的子部分中。
RNA转染
本文公开了用于生产体外转录的RNA CAR的方法。本发明还包括可以直接转染到细胞中的编码CAR的RNA构建体。用于产生用于转染的mRNA的方法可包括体外转录(IVT)具有特别设计的引物的模板，接着加入聚A，得到含有3'和5'非翻译序列(“UTR”)、5'帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)、待表达的核酸和通常长度为50-2000个碱基(SEQ ID NO:35)的聚A尾的构建体。如此产生的RNA可以有效地转染不同类型的细胞。在一个方面，模板包括用于所述CAR的序列。
在一个方面，间皮素CAR由信使RNA(mRNA)编码。在一个方面，编码间皮素CAR的mRNA被引入到T细胞中用于产生CART细胞。
在一种实施方式中，体外转录的RNA CAR可以以短暂转染形式被引入到细胞中。通过使用聚合酶链反应(PCR)产生的模板的体外转录产生RNA。通过PCR使用适合的引物和RNA聚合酶可以将来自任何来源的目的DNA直接地转化成模板用于使用适合的引物和RNA聚合酶进行体外mRNA合成。DNA的来源可以是例如基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其它适合的DNA来源。用于体外转录期望的模板为本发明的CAR。例如，用于RNA CAR的模板包含胞外区域，其包含抗肿瘤抗体的单链可变结构域；铰链区，跨膜结构域(例如CD8a的跨膜结构域)；和胞质区域，其包括胞内信号传导结构域，例如包括CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。
在一种实施方式中，用于PCR的DNA含有可读框。该DNA可以来自生物体基因组的天然存在的DNA序列。在一种实施方式中，核酸可以包括一些或所有的5'和/或3'非翻译区(UTR)。核酸可以包括外显子和内含子。在一种实施方式中，用于PCR的DNA为人核酸序列。在另一种实施方式中，用于PCR的DNA为包括5'和3'UTR的人核酸序列。DNA可以备选地为通常在天然存在生物体中不表达的人工DNA序列。示例性的人工DNA序列为含有连接在一起形成编码融合蛋白的可读框的基因部分的序列。连接在一起的DNA部分可以来自单个生物体或多于一个生物体。
PCR用于产生用于转染的mRNA的体外转录的模板。进行PCR的方法是本领域所熟知的。把用于PCR的引物设计成具有与用作PCR模板的DNA的区域基本上互补的区域。术语“基本上互补的”是指核苷酸的序列，其中引物序列中大多数或所有的碱基都是互补的或一个或更多个碱基是非互补的或错配的。基本上互补的序列能够与目标DNA靶在用于PCR的退火条件下退火或杂交。可以把引物设计成与DNA模板的任何部分基本上互补。例如，可以把引物设计成扩增在细胞中通常转录的核酸的部分(可读框)，包括5'和3'UTR。也可以把引物设计成扩增编码目的特定结构域的核酸的部分。在一种实施方式中，把引物设计成扩增人cDNA的编码区，包括5'和3'UTRs的全部或部分。可以通过本领域熟知的合成方法产生用于PCR的引物。“正向引物”是含有与要被扩增的DNA序列上游的DNA模板上的核苷酸基本上互补的核苷酸区域的引物。术语“上游的”是指相对于编码链的待扩增的DNA序列的5’位。“反向引物”为含有与要被扩增的DNA序列下游的双链DNA模板基本上互补的核苷酸区域的引物。术语“下游的”是指相对于编码链的要扩增的DNA序列的3位。
用于PCR的任何DNA聚合酶都可以用于本文公开的方法中。试剂和聚合酶为从多个来源市售获得的。
也可以使用具有促进稳定性和/或翻译效率的能力的化学结构。RNA优选地具有5'和3'UTR。在一种实施方式中，5'UTR的长度在1个和3000个核苷酸之间。可以通过不同的方法改变添加到编码区的5'和3'UTR序列的长度，所述方法包括但不限于设计用于退火到UTR的不同区域的PCR引物。使用该方法，本领域普通技术人员可以改变在转染转录的RNA之后获得最佳翻译效率所需的5'和3'UTR长度。
5'和3'UTR可以是对于目的核酸来说天然存在的、内源性的5'和3'UTR。备选地，可以通过将UTR序列掺入到正向和反向引物中或通过模板的任何其它修饰加入不是目的核酸内源的UTR序列。使用不是目的核酸内源的UTR序列可以用于改变RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，众所周知3'UTR序列中的富含AU的元件可以降低mRNA的稳定性。因此，可以基于本领域熟知的UTR的性质来选择或设计3'UTR以提高转录的RNA的稳定性。
在一种实施方式中，5'UTR可含有内源性核酸的Kozak序列。备选地，当通过如上所述PCR加入不是目的核酸内源的5'UTR时，可以通过加入5'UTR序列来重新设计共有Kozak序列。Kozak序列可以提高一些RNA转录物的翻译效率，但是似乎并非是确保所有RNA有效翻译所需的。本领域已知许多mRNA需要Kozak序列。在其它实施方案中，5'UTR可以是RNA病毒的5'UTR，所述病毒的RNA基因组在细胞中是稳定的。在其它实施方案中，多种核苷酸类似物可用于3'或5'UTR中以阻止mRNA的核酸外切酶降解。
为了能够在不需基因克隆下从DNA模板合成RNA，应当把转录的启动子连接到待转录的序列的DNA模板上游。当把充当RNA聚合酶启动子的序列添加到正向引物的5'端时，RNA聚合酶启动子变得掺入待转录的可读框的PCR产物上游中。在一个优选的实施方式中，启动子为如本文在别处描述的T7聚合酶启动子。其它有用的启动子包括但不限于T3和SP6 RNA聚合酶启动子。用于T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列是本领域已知的。
在一个优选的实施方式中，mRNA具有决定核糖体结合、翻译起始和细胞中mRNA稳定性的5'端和3'聚(A)尾部上的帽。在环状DNA模板上，例如质粒DNA上，RNA聚合酶产生不适于真核细胞中表达的多联体产物。在3'UTR末端线性化的质粒DNA的转录产生正常尺寸mRNA，其即使在转录后聚腺苷酸化，在真核转染中也不是有效的。
在线性DNA模板上，噬菌体T7 RNA聚合酶可以使转录物的3'端延伸超出模板的最后一个碱基(Schenborn and Mierendorf,Nuc Acids Res.,13:6223-36(1985)；Nachevaand Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270:1485-65(2003)。
将一段聚A/T序列整合到DNA模板中的常规方法为分子克隆。然而，整合到质粒DNA中的聚A/T序列可以引起质粒不稳定，这就是为什么从细菌细胞得到的质粒DNA模板通常是高度污染的，具有缺失及其它畸变。这使得克隆过程不仅费力而且费时，但通常不可靠。这就是为什么非常期望一种允许用一段聚A/T 3序列而非克隆来构建DNA模板的方法的原因。
可以通过使用含有聚T尾(例如100T尾部)(SEQ ID NO:31)的反向引物(尺寸可以为50-5000T(SEQ ID NO:32))，或在PCR之后通过任何其它方法(包括，但不限于DNA连接或体外重组)，在PCR期间产生所述的转录DNA模板的聚A/T段。聚(A)尾也给RNA提供稳定性并且减少其降解。通常，聚(A)尾部的长度与转录的RNA的稳定性正相关。在一种实施方式中，聚(A)尾在100和5000个腺苷(SEQ ID NO:33)之间。
可以在体外转录之后，使用聚(A)聚合酶比如大肠杆菌聚(A)聚合酶(E-PAP)，进一步延伸RNA的聚(A)尾部。在一种实施方式中，聚(A)尾部的长度从100个核苷酸增加至在300至400个核苷酸(SEQ ID NO:34)之间，导致RNA的翻译效率提高约两倍。另外，将不同的化学基团连接至3'端可以提高mRNA稳定性。这样的连接可以含有修饰的/人工的核苷酸、适体及其它化合物。例如，可以使用聚(A)聚合酶将ATP类似物掺入到聚(A)尾部中。ATP类似物可以进一步提高RNA的稳定性。
5'帽也给RNA分子提供稳定性。在一个优选的实施方式中，通过本文公开的方法产生的RNA包括5'帽。使用本领域已知的(Cougot,等人,Trends in Biochem.Sci.,29:436-444(2001)；Stepinski,等人,RNA,7:1468-95(2001)；Elango,等人,Biochim.Biophys.Res.Commun.,330:958-966(2005))和本文所述的技术提供5'帽。
通过本文公开的方法产生的RNA也可以含有内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列可以是任何病毒、染色体或人工设计的序列，其引发帽独立性核糖体结合于mRNA和促进翻译的起始。可以包括适于细胞电穿孔的任何溶质，其可以含有有助于细胞渗透性和生存力的因子，比如糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂和表面活性剂。
可以使用大量不同方法中的任一种把RNA引入到靶细胞中，所述方法为例如市售可获得的方法，其包括但不限于电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany))、(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments,Boston,Mass.)或GenePulser II(BioRad,Denver,Colo.)、Multiporator(Eppendort,Hamburg Germany)、使用脂质转染的阳离子脂质体介导的转染、聚合物包封、肽介导的转染、或生物弹粒子递送系统比如“基因枪”(参见例如Nishikawa,等人Hum Gene Ther.,12(8):861-70(2001)。
编码CAR的核酸构建体
本发明提供CAR转基因，其包括编码一个或更多个本发明的CAR构建体的核酸序列。在一个方面，以信使RNA转录物形式提供CAR转基因。在一个方面，以DNA构建体形式提供CAR转基因。
因此，在一个方面，本发明涉及一种编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，其中所述CAR包括抗间皮素结合结构域(例如，人抗间皮素结合结构域)、跨膜结构域和包括刺激结构域的胞内信号传导结构域。在一种实施方式中，抗间皮素结合结构域为本文所述的抗间皮素结合结构域，例如包括选自序列SEQ ID NO:87-111或与其具有95-99％同一性的序列的抗间皮素结合结构域。在一种实施方式中，分离的核酸分子进一步包括编码共刺激结构域的序列。在一种实施方式中，跨膜结构域为选自下述的蛋白质的跨膜结构域：T-细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。在一种实施方式中，跨膜结构域包含序列SEQ ID NO:6或与其具有95-99％同一性的序列。在一种实施方式中，抗间皮素结合结构域通过铰链区(例如，本文所述的铰链)连接跨膜结构域。在一种实施方式中，铰链区包括SEQ ID NO:2或SEQID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5，或与其具有95-99％同一性的序列。在一种实施方式中，分离的核酸分子进一步包括编码共刺激结构域的序列。在一种实施方式中，共刺激结构域为选自下述的蛋白质的功能性信号传导结构域：OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。这样的共刺激性分子的进一步实例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76和PAG/Cbp。在一种实施方式中，共刺激结构域包含序列SEQ ID NO:7或与其具有95-99％同一性的序列。在一种实施方式中，胞内信号传导结构域包含4-1BB的功能性信号传导结构域和CD3ζ的功能性信号传导结构域。在一种实施方式中，胞内信号传导结构域包含序列SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8或与其具有95-99％同一性的序列，以及序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10或与其具有95-99％同一性的序列，其中包括胞内信号传导结构域的序列在相同的框架中且以单多肽链形式被表达。在另一个方面，本发明涉及编码CAR构建体的分离的核酸分子，其包括SEQ ID NO:1的前导顺序、具有选自下述序列的scFv结构域：SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ IDNO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62(或与其具有95-99％同一性的序列)、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5(或与其具有95-99％同一性的序列)的铰链区、具有序列SEQ ID NO:6(或与其具有95-99％同一性的序列)的跨膜结构域、具有序列SEQ ID NO:7(或与其具有95-99％同一性的序列)的4-1BB共刺激结构域或具有序列SEQ ID NO:8(或与其具有95-99％同一性的序列)的CD27共刺激结构域、以及具有序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10(或与其具有95-99％同一性的序列)的CD3ζ刺激结构域。
在另一个方面，本发明涉及由核酸分子编码的分离的多肽分子。在一种实施方式中，所述分离的多肽分子包含选自下述的序列：SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ IDNO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ IDNO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:86或与其具有95-99％同一性的序列。
在另一个方面，本发明涉及一种编码嵌合抗原受体(CAR)分子的分离的核酸分子，所述CAR分子包含抗间皮素结合结构域、跨膜结构域和包括刺激结构域的胞内信号传导结构域，并且其中编码抗间皮素结合结构域的核酸包括选自下述的序列：SEQ ID NO:111、SEQID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQID NO:123、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQID NO:134或与其具有95-99％同一性的序列。
在一种实施方式中，编码的CAR分子进一步包括编码共刺激结构域的序列。在一种实施方式中，共刺激结构域为选自下述的蛋白质的功能性信号传导结构域：OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)和4-1BB(CD137)。在一种实施方式中，共刺激结构域包含序列SEQ ID NO:7。在一种实施方式中，跨膜结构域为选自下述的蛋白质的跨膜结构域：T-细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。在一种实施方式中，跨膜结构域包含序列SEQ IDNO:6。在一种实施方式中，胞内信号传导结构域包含4-1BB的功能性信号传导结构域和ζ的功能性信号传导结构域。在一种实施方式中，胞内信号传导结构域包含序列SEQ ID NO:7和序列SEQ ID NO:9，其中所述包含胞内信号传导结构域的序列在相同的框架中且以单多肽链形式被表达。在一种实施方式中，抗间皮素结合结构域通过铰链区与跨膜结构域连接。在一种实施方式中，铰链区包含SEQ ID NO:2。在一种实施方式中，铰链区包括SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5。
在另一个方面，本发明涉及分离的CAR分子，其包含SEQ ID NO:1的前导序列、具有选自SEQ ID NOS：39-62的序列或与其具有99％同一性的序列的scFv结构域、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的铰链区、具有序列SEQ ID NO:6的跨膜结构域、具有序列SEQ ID NO:7的4-1BB共刺激结构域或具有序列SEQ ID NO:8的CD27共刺激结构域、以及具有序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的CD3ζ刺激结构域。在一种实施方式中，编码的CAR分子包含选自SEQ ID NOS:63-86的序列或与其具有95-99％同一性的序列。
本发明进一步提供包含CAR转基因的载体。在一个方面，可以直接地把CAR载体转导到细胞中，例如T细胞或NK细胞。在一个方面，载体为克隆载体或表达载体，例如包括，但不限于一个或更多个质粒(例如表达质粒、克隆载体、微环(minicircles)、微载体、双微染色体)、逆转录病毒和慢病毒载体构建体。在一个方面，载体能够在哺乳动物T细胞或NK细胞中表达CAR构建体。在一个方面，哺乳动物T细胞为人T细胞或人NK细胞。
本发明还包括编码CAR的RNA构建体，其可以被直接转染到细胞中，例如T细胞或NK细胞。一种用于制备用于转染的mRNA的方法，包括体外转录(IVT)具有特别设计引物的模板，接着加入聚A，得到含有3'和5'非翻译序列(“UTR”)、5'帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)、待表达的基因和通常长度为50-2000个碱基(SEQ ID NO:35)的聚A尾的构建体。如此制备的RNA可以有效地转染不同种类的细胞。在一个方面，模板包括用于CAR的序列。
在一个方面，间皮素CAR转基因由信使RNA(mRNA)编码。在一个方面，编码间皮素CAR转基因的mRNA被引入到T细胞中用于产生CART细胞或NK细胞。
载体
本发明还提供其中插入本发明的DNA的载体。来源于逆转录病毒比如慢病毒的载体是获得长期基因转移的合适的工具，因为它们允许长期、稳定地整合转基因及其在子细胞中的增殖。慢病毒具有优于来源于肿瘤逆转录病毒比如鼠白血病病毒的载体的优点，因为它们可以转导非增殖细胞，比如肝细胞。它们也具有低免疫原性的附加优点。
在一种实施方式中，包含编码本发明的期望CAR的核酸的载体为DNA、RNA、质粒、腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体。
在另一种实施方式中，包含编码本发明的期望CAR的核酸的载体为腺病毒载体(A5/35)。在另一种实施方式中，编码CAR的核酸的表达可以使用转座子比如sleepingbeauty、CRISPR、CAS9和锌指核酸酶实现。参见例如June等人2009 Nature ReviewsImmunology 9.10:704-716，将其全部内容引入本文作为参考。
简言之，编码CAR的天然或合成核酸的表达通常通过将编码CAR多肽或其部分的核酸与启动子有效连接，且将构建体掺入表达载体中来实现。载体可以适用于复制和整合真核生物。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列和用于调节期望的核酸序列表达的启动子。
本发明的表达构建体也可用于使用标准基因递送方案的核酸免疫和基因治疗。用于基因递送的方法是本领域已知的。参见，例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，将其全部内容引入本文作为参考。在另一种实施方式中，本发明提供基因治疗载体。
可以把核酸克隆到大量类型的载体中。例如，可以把核酸克隆到包括，但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒的载体中。特别目的载体包括表达载体、复制载体、产生探针的载体和测序载体。
进一步，可以以病毒载体的形式把表达载体提供到细胞中。病毒载体技术是本领域熟知的，并且被描述在例如Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORYMANUAL,volumes 1-4,Cold Spring Harbor Press,NY)和其它病毒学和分子生物学手册中。用作载体的病毒包括，但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性核酸内切酶位点和一种或多种可选的标记物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经针对基因转移到哺乳动物细胞中开发了多种基于病毒的系统。例如，逆转录病毒提供了用于基因递送系统的方便的平台。所选择的基因可以被插入到载体中，并使用本领域已知的技术包装到逆转录病毒粒子中。然后，重组病毒可以被分离且在体内或离体递送到受试者的细胞。多种逆转录病毒系统是本领域已知的。在某些实施方式中，使用腺病毒载体。多种腺病毒载体是本领域已知的。在一种实施方式中，使用慢病毒载体。
另外的启动子元件，例如增强子，调节转录启动的频度。通常，这些位于起始位点上游的区域30-110bp，尽管大量启动子已经显示出也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的距离通常是柔性的，因此当元件倒置或相对于彼此移动时保留启动子的功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间距在活性开始减退之前可以增加到间隔50bp。根据启动子，似乎单个元件可以合作地或独立地起活化转录的作用。示例性的启动子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。
能够在哺乳动物T细胞中表达CAR转基因的启动子的实例为EF1α启动子(EF1a或EFlα)。天然的EF1a启动子驱动延伸因子-1复合体的α亚基表达，所述复合体负责将氨酰tRNA酶促递送到核糖体。EF1a启动子已经广泛用于哺乳动物表达质粒中，并且已经显示有效地驱动从克隆到慢病毒载体中转基因进行CAR表达。参见，例如Milone等人,Mol.Ther.17(8):1453–1464(2009)。在一个方面，EF1a启动子包括如SEQ ID NO:11中提供的序列。
启动子的另一个实例是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列,其能够驱动与其有效连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。然而，也可以使用其他组成型启动子序列，包括，但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、EB病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、以及人类基因启动子，比如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1α启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。进一步，本发明将不限于使用组成型启动子。诱导型启动子也预期作为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供能够在需要这种表达时，开启有效连接的多核苷酸序列的表达或在不需要表达时，关闭表达的分子开关。诱导型启动子的实例包括，但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、黄体酮启动子和四环素启动子。
为了评价CAR多肽或其部分的表达，引入到细胞中的表达载体也可以含有可选的标记基因或报告基因或这两者，以促进从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞群鉴定和选择表达细胞。在其它方面，可选的标记物可以携带在DNA的单独片段上且用于共转染过程。选择标记和报告基因都可以侧接适合的调节序列，以能够在宿主细胞中表达。有用的选择标记包括例如抗生素抗性基因，比如neo等。
报告基因被用于鉴定潜在地转染的细胞和评价调节序列的功能性。通常，报告基因是受体生物体或组织中不存在或不表达且编码多肽的基因，所述多肽的表达通过某些容易可检测性质(例如酶活性)显现。在将DNA已经引入到受体细胞之后，在合适的时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可以包括编码萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白的基因(例如，Ui-Tei等人,2000 FEBSLetters 479:79-82)。合适的表达系统是熟知的，并且可以使用已知的技术制备或商业获得。通常，显示最高水平的报告基因表达的具有最小5'侧翼区域的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区域可以连接报告基因，并且用于评价作用剂调节启动子驱动的转录的能力。
在一种实施方式中，载体可以进一步包括编码第二CAR的核酸。在一种实施方式中，第二CAR包括对如下靶的抗原结合结构域：例如基质细胞上不同于间皮素的靶，例如FAP；前列腺癌细胞上不同于间皮素的靶，例如雄激素受体、OR51E2、PSMA、PSCA、PDGRF-β、TARP、GloboH、MAD CT-1或MAD-CT-2；卵巢癌细胞上不同于间皮素的靶，例如Tn、PRSS21、CD171、Lewis Y、叶酸受体α、claudin6、GloboH或精蛋白17；例如肺癌细胞上不同于间皮素的靶，例如VEGF、HER3、IGF-1R、EGFR、DLL4或Trop-2。在一种实施方式中，载体包括编码第一CAR的核酸序列，该第一CAR靶向第一抗原且包括具有共刺激信号传导结构域而不是初级信号结构域的胞内信号传导结构域，和编码第二CAR的核酸，该第二CAR靶向第二个不同的抗原且包括具有初级信号结构域而不是共刺激信号传导结构域的胞内信号传导结构域。在一种实施方式中，载体包括编码第一间皮素CAR的核酸，所述第一间皮素CAR包含间皮素结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域，和编码第二CAR的核酸，所述第二CAR靶向不同于间皮素的抗原(例如，基质细胞上不同于间皮素的靶，例如FAP；前列腺癌细胞上不同于间皮素的靶，例如雄激素受体、OR51E2、PSMA、PSCA、PDGRF-β、TARP、GloboH、MAD CT-1或MAD-CT-2；卵巢癌细胞上不同于间皮素的靶，例如Tn、PRSS21、CD171、Lewis Y、叶酸受体α、claudin6、GloboH或精蛋白17；例如肺癌细胞上不同于间皮素的靶，例如VEGF、HER3、IGF-1R、EGFR、DLL4或Trop-2)且包括抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域。在另一种实施方式中，载体包括编码第一间皮素CAR的核酸，所述第一间皮素CAR包含间皮素结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域，和编码第二CAR的核酸，所述第二CAR靶向不同于间皮素的抗原(例如，基质细胞上不同于间皮素的靶，例如FAP；前列腺癌细胞上不同于间皮素的靶，例如雄激素受体OR51E2、PSMA、PSCA、PDGRF-β、TARP、GloboH、MAD CT-1或MAD-CT-2；卵巢癌细胞上不同于间皮素的靶，例如Tn、PRSS21、CD171、Lewis Y、叶酸受体α、claudin6、GloboH或精蛋白17；例如肺癌细胞上不同于间皮素的靶，例如VEGF、HER3、IGF-1R、EGFR、DLL4或Trop-2)且包括抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域。
在一种实施方式中，载体包括编码本文所述间皮素CAR的核酸和编码抑制性CAR的核酸。在一种实施方式中，抑制性CAR包括结合正常细胞(例如，也表达CLL的正常细胞)而不是癌细胞上存在的抗原的抗原结合结构域。在一种实施方式中，抑制性CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和抑制性分子的胞内结构域。例如，抑制性CAR的胞内结构域可以为下述的胞内结构域：PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。
在一种实施方式中，载体包括编码本文所述间皮素CAR的核酸和抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA，例如如本文所述的。
向细胞中引入和表达基因的方法是本领域已知的。在表达载体的上下文中，载体可以通过本领域的任何方法容易地被引入宿主细胞中，例如哺乳动物、细菌、酵母菌或昆虫细胞。例如，表达载体可以通过物理、化学或生物学手段转移到宿主细胞中。
用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包括载体和/或外源性核酸的细胞的方法是本领域熟知的，参见例如Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,volumes 1-4,Cold Spring Harbor Press,NY)。一种用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的优选的方法是脂转染，例如使用脂质转染胺(Life Technologies)。
将目的多核苷酸引入到宿主细胞中的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经变成将基因插入哺乳动物例如人类细胞中的最广泛使用的方法。其它病毒载体可以来源于慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等。参见例如，美国专利号5,350,674和5,585,362。
用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的化学方法包括胶体分散系统，比如大分子复合体、纳米胶囊、微球体、珠和基于脂质的系统(包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体)。一种用作体外和体内递送载体的示例性的胶体系统为脂质体(例如，人工膜囊)。可利用现有技术靶向递送核酸的其它方法，比如用靶向纳米颗粒或其它合适的亚微米尺寸递送系统来递送多核苷酸。
在其中使用非病毒递送系统的情况下，示例性的递送载体是脂质体。预期使用脂质制剂将核酸引入到宿主细胞(体外，离体或体内)。在另一个方面，核酸可能与脂质结合。与脂质结合的核酸可以被包封在脂质体的水性内部、散布在脂质体的脂质双层内、经由与脂质体和寡核苷酸两者缔合的连接分子附着在脂质体上、俘获在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质组合、呈悬浮液含在脂质中、含有胶束或与胶束复合、或以其它方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或与脂质/表达载体缔合的组合物不限于在溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构、呈胶束存在或具有“塌陷(collapsed)”的结构。它们也可以仅简单地散布在溶液中，可能形成尺寸或形状不均匀的聚集体。脂质为脂肪物质，其可以天然存在或是合成脂质。例如，脂质包括细胞质中天然存在的脂肪滴以及含有长链脂肪族烃及其衍生物的化合物种类，比如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
适于使用的脂质可以从商业来源得到。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以得自Sigma,St.Louis,MO；磷酸三十二烷基酯(“DCP”)可以得自K&K Laboratories(Plainview,NY)；胆固醇(“Choi”)可以得自Calbiochem-Behring；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)及其它脂质可以得自Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL.)。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的贮存液可以储存在约-20℃。氯仿用作唯一溶剂，因为其比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是包括通过产生封闭脂质双层或聚集体形成的多种单层或多层脂质载体的通称。脂质体可以表征为具有磷脂双层膜和内部水介质的囊状结构。多层脂质体具有多个被水性介质分开的脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们自发地形成。脂质组分在形成封闭结构之前进行自我重排且在脂质双层之间俘获水和溶解的溶质(Ghosh等人,1991Glycobiology 5:505-10)。然而，也包括在溶液中具有与正常囊状结构不同的结构的组合物。例如，脂质可以采用胶束结构或仅仅作为脂质分子的非均匀聚集体存在。还预期lipofectamine-核酸复合体。
与用于将外源性核酸引入到宿主细胞中或以其它方式将细胞暴露于本发明的抑制剂的方法无关，为了确认宿主细胞中重组DNA序列的存在，可以进行多种试验。这样的试验包括，例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”试验，比如DNA印迹法和RNA印迹法、RT-PCR和PCR；“生化”试验，比如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学方法(ELISA和蛋白质印迹)或通过本文所述的试验，以鉴定落入本发明范围之内的作用剂。
本发明进一步提供包含编码CAR的核酸分子的载体。在一个方面，CAR载体可以被直接地转导到细胞中，例如T细胞或NK细胞。在一个方面，载体为克隆载体或表达载体，例如包括，但不限于一种或更多种质粒(例如表达质粒、克隆载体、微环(minicircles)、微载体、双微染色体)、逆转录病毒和慢病毒载体构建体。在一个方面，所述载体能够在哺乳动物T细胞中表达CAR构建体。在一个方面，哺乳动物T细胞为人类T细胞。在一个方面，哺乳动物细胞为人类NK细胞。
细胞来源
在扩增和基因修饰之前，细胞来源(例如，T细胞或NK细胞)是从受试者获得的。术语“受试者”意味着包括其中可以引发免疫应答的活生物体(例如哺乳动物)。受试者的实例包括人类、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。T细胞可以从大量来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织和肿瘤。在本发明的某些方面，可以使用本领域可获得的许多T细胞系。在本发明的某些方面，T细胞可以使用本领域技术人员已知的多种技术的任一种(比如FicollTM分离)从受试者收集的血液单位获得。在一个优选的方面，通过单采血液成分术，从个体的正在循环的血液获得细胞。单采血液成分术的产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在一个方面，可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以除去血浆级分，并将细胞置于适合的缓冲液或培养基中用于后续加工步骤。在本发明的一个方面，用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一个备选的方面，洗涤溶液不含钙，且可以不含镁或可以不含许多(即使不是全部)二价阳离子。在不存在钙下的初始活化步骤可以导致放大的活化。如本领域普通技术人员应当容易地理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法完成，比如通过根据制造商的说明使用半自动化的“流通”离心机(例如，Cobe2991细胞处理器、Baxter CytoMate、或Haemonetics Cell Saver 5)。在洗涤之后，可以将细胞再悬浮在多种生物相容性缓冲液中，比如例如不含Ca、不含Mg PBS、PlasmaLyteA、或含或不含缓冲剂的其它盐溶液。备选地，可以除去单采血液成分术样品的不期望组分，并将细胞直接再悬浮在培养基中。
在一个方面，通过溶解红细胞和例如通过离心穿过PERCOLLTM梯度或逆流离心机淘析耗尽单核细胞，从外周血淋巴细胞中分离T细胞。T细胞的特异性亚群体，比如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞可以通过正选择或负选择技术进一步分离。例如，在一个方面，通过用抗-CD3/抗-CD28(例如3×28)-缀合的珠(比如
Figure GDA0003963633350001071
M-450CD3/CD28T)培养足以正选择期望的T细胞的时期分离T细胞。在一个方面，所述时期为约30分钟。在一个进一步的方面，所述时期范围为30分钟至36小时或更长及其中所有整数值。在一个进一步的方面，所述时期为至少1、2、3、4、5或6小时。在仍然另一个优选的方面，所述时期为10至24小时。在一个方面，培养时期为24小时。为了从患有白血病的患者分离T细胞，使用较长的培养时间比如24小时可以提高细胞产率。在与其它细胞类型相比存在很少T细胞的任何情形中，比如从肿瘤组织或免疫功能受损的个体分离浸润肿瘤的淋巴细胞(TIL)，可以使用较长的培养时间以分离T细胞。进一步，使用较长的培养时间可以提高俘获CD8+T细胞的效率。因此，通过仅缩短或延长时间使T细胞结合CD3/CD28珠和/或通过增加或降低珠与T细胞的比率(如本文进一步描述的)，在培养开始或在该过程的其它时间点可以优选地选择T细胞的亚群。另外，通过增加或降低珠或其它表面上抗-CD3和/或抗-CD28抗体的比率，可以在培养开始或在其它期望时间点优选地选择T细胞的亚群。本领域技术人员应当认识到在本发明的上下文中也可以使用多轮选择。在某些方面，可能期望进行选择过程和在活化和扩增过程中使用“未选择的”细胞。“未选择的”细胞也可以进行其它轮的选择。
可以使用定向于负选择细胞独特的表面标记物的抗体组合来实现借助于负选择的T细胞群的富集。一种方法是经由负磁性免疫粘连或流式细胞术的细胞分选和/或选择，其使用定向于负选择细胞上存在的细胞表面标记物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过负选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些方面，可能期望富集或正选择通常表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调节T细胞。备选地，在某些方面，通过抗-C25缀合的珠或其它类似的选择方法耗尽T调节细胞。
在一种实施方式中，可以选择表达下述的一种或多种的T细胞群：IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、粒酶B和穿孔蛋白或其它适合的分子例如其它细胞因子。用于筛选细胞表达的方法可以例如通过PCT公开号WO 2013/126712中描述的方法确定。
在一种实施方式中，T细胞群为缺乏二酰基甘油(diaglycerol)激酶(DGK)的。缺乏DGK的细胞包括不表达DGK RNA或蛋白质或具有降低的或抑制的DGK活性的细胞。缺乏DGK的细胞可以通过遗传方法产生，例如施用RNA-干扰作用剂，例如siRNA、shRNA、miRNA，以减少或防止DGK表达。备选地，缺乏DGK的细胞可以通过用本文所述DGK抑制剂处理产生。
在一种实施方式中，T细胞群为缺乏Ikaros的。缺乏Ikaros的细胞包括不表达Ikaros RNA或蛋白质，或具有降低的或抑制的Ikaros活性的细胞。缺乏Ikaros的细胞可以通过遗传方法产生，例如施用RNA-干扰作用剂，例如siRNA、shRNA、miRNA，以减少或防止Ikaros表达。备选地，缺乏Ikaros的细胞可以通过用Ikaros抑制剂例如来那度胺处理产生。
在实施方案中，T细胞群为缺乏DGK的并且缺乏Ikaros的，例如不表达DGK和Ikaros，或具有降低的或抑制的DGK和Ikaros活性。这样的缺乏DGK和Ikaros的细胞可以通过本文所述的任一种方法产生。
对于通过正选择或负选择分离期望的细胞群，细胞的浓度和表面(例如，粒子，比如珠)可以变化。在某些方面，可能期望显著地降低其中珠和细胞混合在一起的体积(例如，提高细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一个方面，使用20亿个细胞/ml的浓度。在一个方面，使用10亿个细胞/ml的浓度。在一个进一步的方面，使用大于1亿个细胞/ml。在一个进一步的方面，使用1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、或5千万个细胞/ml。在仍然一个方面，使用来自7.5、8、8.5、9、9.5或10千万个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的方面，可以使用1.25亿或1.50亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以引起细胞产率提高、细胞活化和细胞扩增。进一步，使用高细胞浓度能够更有效地捕获可能弱表达目的靶抗原的细胞，比如CD28-阴性T细胞，或者从其中存在许多肿瘤细胞的样品(例如，白血病血液、肿瘤组织等)更有效地捕获细胞。这样的细胞群可以具有治疗价值，并且将是期望得到的。例如，使用高浓度的细胞能够更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一个相关的方面，可能期望使用较低的细胞浓度。通过显著地稀释T细胞和表面(例如，粒子比如珠)的混合物，使粒子和细胞之间的相互作用最小化。这选择表达大量的期望结合粒子的抗原的细胞。例如，CD4+T细胞表达较高水平的CD28，并且在稀浓度中比CD8+T细胞更有效地被捕获。在一个方面，使用的细胞浓度为5×106/ml。在其它方面，使用的浓度可以为约1×105/ml至1×106/ml及其中任何整数值。
在其它方面，可以在2-10℃或在室温下在旋转器中以可变速率培养细胞可变的时间长度。
也可以在洗涤步骤之后冷冻用于刺激的T细胞。不希望受到理论的束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过在细胞群中除去粒细胞及在一定程度上除去单核细胞来提供更均匀的产物。在除去血浆和血小板的洗涤步骤之后，将细胞悬浮在冷冻液中。虽然许多冷冻液和参数是本领域已知的且将适用于该情形，但是一种方法包括使用含有20％ DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％ DMSO、或31.25％ Plasmalyte-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％ NaCl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％ DMSO的培养基，或含有例如Hespan和PlasmaLyte的其它合适的细胞冷冻培养基，然后将细胞以1°/分钟的速率冷冻至-80℃并贮存在液氮贮槽的汽相中。可以使用控制冷冻的其它方法以及在-20℃下或在液氮中立即不受控制的冷冻。
在某些方面，将冷藏保存的细胞解冻并如本文所述洗涤，并且允许在室温下静置1小时，之后使用本发明的方法活化。
本发明的上下文中还涉及在可能需要如本文所述的扩增细胞之前的时间从受试者收集血样或单采血液成分术产物。因而，要扩增的细胞来源可以在任何必须的时间点收集，并且分离和冷冻期望的细胞比如T细胞用于随后用于许多将受益于T细胞疗法的疾病或病症(如本文所述那些)的T细胞疗法中。在一个方面，血样或单采血液成分术是从一般健康受试者采集的。在某些方面，血样或单采血液成分术是从处于发展为疾病的风险中但还没有发展为疾病的一般健康受试者采集的，并且分离和冷冻目的细胞用于随后使用。在某些方面，T细胞可以扩增、冷冻和在随后时间使用。在某些方面，可以在诊断如本文所述的特定疾病之后不久但在任何治疗之前，从患者采集样品。在一个进一步的方面，在许多相关的治疗模式之前，从受试者的血样或单采血液成分术分离细胞，所述治疗模式包括但不限于用如下作用剂治疗：比如那他珠单抗(natalizumab)、艾法珠单抗(efalizumab)、抗病毒剂、化疗、放射、免疫抑制剂比如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麦考酚酯和FK506、抗体、或其它免疫烧蚀剂(immunoablative agents)比如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇、FR901228和照射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环胞菌素和FK506)或者抑制对于生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等人,Cell 66:807-815,1991；Henderson等人,Immun.73:316-321,1991；Bierer等人,Curr.Opin.Immun.5:763-773,1993)。在一个进一步的方面，分离用于患者的细胞且冷冻用于随后与如下一起(例如，之前、同时或之后)的用途：骨髓或干细胞移植、使用化疗作用剂比如氟达拉滨的T细胞烧蚀疗法、外部-光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体比如OKT3或CAMPATH。在一个方面，之前分离细胞，并且可以冷冻以随后用于在B细胞烧蚀疗法之后的治疗，比如与CD20反应的作用剂例如Rituxan。
在本发明的一个进一步的方面，在给受试者留下功能性T细胞的治疗之后直接从患者获得T细胞。在这点上，已经观察到在一些癌症治疗之后，特别地用损害免疫系统的药物治疗之后，在患者通常从治疗恢复期间的治疗后不久，获得的T细胞的质量可能是最佳的或对其在离体扩增的能力有所改善。同样地，在使用本文所述方法离体处理之后，这些细胞可以对于增强移植和体内扩增处于优选的状态。因此，在本发明的上下文之内预期在该恢复期收集血细胞，包括T细胞、树突细胞或造血谱系的其它细胞。进一步，在某些方面，可以使用转移(例如，用GM-CSF转移)和调节方案产生受试者中的条件，其中特别地在治疗之后的定义时间窗期间，特定细胞类型的再增殖、再循环、再生和/或扩增是有利的。示例性的细胞类型包括T细胞、B细胞、树突细胞及免疫系统的其它细胞。
在一种实施方式中，NK细胞是从受试者获得的。在另一种实施方式中，NK细胞是NK细胞系，例如NK-92细胞系(Conkwest)。
同种异体的CAR
在本文所述的实施方案中，免疫效应细胞可以是同种异体的免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞。例如，细胞可以是同种异体T细胞，例如功能性T细胞受体(TCR)和/或人类白细胞抗原(HLA)(例如I类HLA和/或II类HLA)表达不足的同种异体T细胞。
缺乏功能性TCR的T细胞可以例如工程化以使得其在其表面上不表达任何功能性TCR，工程化以使其不表达包括功能性TCR的一个或更多个亚基，或工程化以使得其在其表面产生非常少的功能性TCR。备选地，T细胞可以表达基本上受损的TCR，例如通过表达突变或截短的形式的一个或更多个TCR的亚基。术语“基本上受损的TCR”是指该TCR不会在宿主中引发不利的免疫反应。
本文所述的T细胞可以例如工程化以使得其在表面上不表达功能性HLA。例如，本文所述的T细胞可以工程化以使得细胞表面表达HLA(例如1类HLA和/或II类HLA)下调。
在某些实施方式中，T细胞可以缺乏功能性TCR和功能性HLA(例如I类HLA和/或II类HLA)。
缺乏功能性TCR和/或HLA表达的修饰的T细胞可以通过任何合适的方法获得，包括一个或更多个TCR或HLA的亚基的基因敲除(knock out)或基因敲减(knock down)。例如，T细胞可以包括使用siRNA、shRNA、簇状的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)或锌指核酸内切酶(ZFN)的TCR和/或HLA的基因敲减。
在某些实施方式中，同种异体细胞可以是不表达或以低水平表达抑制性分子的细胞，例如通过本文所述任何方法。例如，细胞可以是不表达或以低水平表达抑制性分子的细胞，例如可以降低表达CAR的细胞建立免疫效应物应答的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。抑制性分子的抑制，例如通过在DNA、RNA或蛋白水平的抑制，可以优化表达CAR的细胞性能。在实施方案中，可以使用如本文所述的抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如dsRNA例如siRNA或shRNA，簇状的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)或锌指核酸内切酶(ZFN)。
抑制TCR或HLA的siRNA和shRNA
在某些实施方式中，可以使用靶向T细胞中编码TCR和/或HLA的核酸的siRNA或shRNA抑制TCR表达和/或HLA表达。
可以使用任何常规表达系统，例如比如慢病毒表达系统获得siRNA和shRNAs在T细胞中的表达。
下调TCR组分表达的示例性的shRNAs描述在例如US公开号2012/0321667中。下调I类HLA和/或II类HLA基因表达的示例性的siRNA和shRNA描述在例如美国公开号∶US 2007/0036773中。
抑制TCR或HLA的CRISPR
如本文中使用的“CRISPR”或“TCR和/或HLA的CRISPR”或“抑制TCR和/或HLA的CRISPR”是指簇状的规则间隔的短回文重复序列组或包括该重复序列组的系统。正如本文中使用的那样，“Cas”是指CRISPR-相关的蛋白。“CRISPR/Cas”系统指来源于CRISPR和Cas的系统，其可用于沉默或突变TCR和/或HLA基因。
天然存在的CRISPR/Cas系统在约40％的测序的真核生物基因组和90％的测序的古细菌中存在。Grissa等人(2007)BMC Bioinformatics 8:172.。该系统为一种原核免疫系统类型，其赋予对外来遗传元件(比如质粒和噬菌体)的抗性且提供一种形式的获得性免疫。Barrangou等人(2007)Science 315:1709-1712；Marragini等人(2008)Science 322:1843-1845。
CRISPR/Cas系统已经修饰用于真核生物比如小鼠或灵长类中的基因编辑(沉默、增强或改变特异性基因)。Wiedenheft等人(2012)Nature482:331-8。这通过向真核细胞中引入含有特异性设计的CRISPR和一种或多种合适的Cas来实现。
CRISPR序列，有时称为CRISPR基因座，包括交替重复序列和间隔区。在一种天然存在的CRISPR中，间隔区通常包括细菌的外源序列，比如质粒或噬菌体序列；在TCR和/或HLACRISPR/Cas系统中，间隔区来源于TCR或HLA基因序列。
使来自CRISPR基因座的RNA组成型表达并且通过Cas蛋白质加工成小RNA。这些包括侧接了重复序列的间隔区。RNA指导其它Cas蛋白质在RNA或DNA水平沉默外源性遗传元件。Horvath等人(2010)Science327:167-170；Makarova等人(2006)Biology Direct 1:7。因此，类似于siRNA，间隔区充当RNA分子的模板。Pennisi(2013)Science 341:833-836。
由于这些天然出现在许多不同类型的细菌中，CRISPR的精确排列和结构、Cas基因的功能和数量以及其产物在各种物种与物种之间多少有些不同。Haft等人(2005)PLoSComput.Biol.1:e60；Kunin等人(2007)Genome Biol.8:R61；Mojica等人(2005)J.Mol.Evol.60:174-182；Bolotin等人(2005)Microbiol.151:2551-2561；Pourcel等人(2005)Microbiol.151:653-663；and Stern等人(2010)Trends.Genet.28:335-340。例如，Cse(Cas亚型，大肠杆菌)蛋白质(例如，CasA)形成功能性复杂的级联，其将CRISPR RNA转录物加工成级联保留的间隔区-重复单元。Brouns等人(2008)Science 321:960-964。在其它原核生物中，Cas6加工CRISPR转录物。基于CRISPR的噬菌体在大肠杆菌中的灭活需要级联和Cas3，而不需要Cas1或Cas2。在激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)及其它原核生物中的Cmr(Cas RAMP模块)蛋白质与小CRISPR RNA形成识别和切割互补的靶RNA的功能性复合体。更简单的CRISPR系统依赖于蛋白质Cas9，其为具有两个活性切割位点的核酸酶，针对双螺旋的每条链各有一个。组合Cas9和修饰的CRISPR基因座RNA可用于基因编辑的系统。Pennisi(2013)Science 341:833-836。
因此，CRISPR/Cas系统可用于编辑TCR和/或HLA基因(添加或缺失碱基对)，或引入提前终止，其从而降低TCR和/或HLA的表达。CRISPR/Cas系统可以备选地使用，如RNA干扰，以可逆的方式关闭TCR和/或HLA基因。在哺乳动物细胞中，例如RNA可以将Cas蛋白质引导至TCR和/或HLA启动子，在空间上阻断RNA聚合酶。
可以使用本领域已知的技术，例如在美国公开号20140068797和Cong(2013)Science 339:819-823中所述的技术，产生抑制TCR和/或HLA的人工CRISPR/Cas系统。也可产生本领域已知的抑制TCR和/或HLA的其它人工CRISPR/Cas系统，例如在Tsai(2014)Nature Biotechnol.,32:6 569-576,美国专利号8,871,445；8,865,406；8,795,965；8,771,945；和8,697,359中描述的。
抑制TCR和/或HLA的TALEN
“TALEN”或“HLA和/或TCR的TALEN”或“抑制HLA和/或TCR的TALEN”是指转录活化剂样效应物核酸酶，一种可用于编辑HLA和/或TCR基因的人工核酸酶。
通过使TAL效应物DNA结合结构域与DNA切割结构域融合来人工产生TALEN。可以把转录活化剂样效应(TALEs)工程化以结合任何期望的DNA序列，包括HLA或TCR基因的一部分。通过把工程化的TALE与DNA切割结构域组合，可以产生对于任何期望的DNA序列(包括HLA或TCR序列)特异性的限制性内切酶。然后，这些可以被引入到细胞中，其中它们可用于基因组编辑。Boch(2011)Nature Biotech.29:135-6；和Boch等人(2009)Science 326:1509-12；Moscou等人(2009)Science 326:3501。
TALE是由黄单胞菌属(Xanthomonas)细菌分泌的蛋白质。DNA结合结构域含有重复的、高度保守的33-34个氨基酸序列，第12和13个氨基酸除外。这两个位置是高度可变的，显示与特异性核苷酸识别的强相关性。因此，它们可以被工程化以结合期望的DNA序列。
为了产生TALEN，将TALE蛋白质融合至核酸酶(N)，其为野生型或突变的FokI核酸内切酶。已经对FokI进行了一些突变以使其用于TALEN；这些例如改善了切割的特异性或活性。Cermak等人(2011)Nucl.Acids Res.39:e82；Miller等人(2011)Nature Biotech.29:143-8；Hockemeyer等人(2011)Nature Biotech.29:731-734；Wood等人(2011)Science333:307；Doyon等人(2010)Nature Methods 8:74-79；Szczepek等人(2007)NatureBiotech.25:786-793；和Guo等人(2010)J.Mol.Biol.200:96。
FokI结构域起二聚体的作用，需要两个构建体，所述构建体具有针对具有合适的方向和间距的靶基因组中的位点的独特DNA结合结构域。在TALE DNA结合结构域和FokI切割结构域之间的氨基酸残基数量和两个个体TALEN结合位点之间的碱基数量似乎是获得获得高水平活性的重要参数。Miller等人(2011)Nature Biotech.29:143-8。
可在细胞内使用HLA或TCR TALEN以产生双链断裂(DSB)。如果修复机制经由非同源端结合不适当地修复所述断裂，则可以在所述断裂位点处引入突变。例如，不合适的修复可能引入移码突变。备选地，可以把外源DNA与TALEN一起引入到细胞中；取决于外源DNA的序列和染色体的序列，该方法可被用于校正HLA或TCR基因中的缺陷或将这样的缺陷引入到wt HLA或TCR基因中，从而减少HLA或TCR的表达。
使用本领域已知的任何方法，包括使用模块组分的各种方案，可以构建对HLA或TCR中的序列特异的TALEN。Zhang等人(2011)Nature Biotech.29:149-53；Geibler等人(2011)PLoS ONE 6:e19509。
锌指核酸酶抑制HLA和/或TCR
“ZFN”或“锌指核酸酶”或“HLA和/或TCR的ZFN”或“抑制HLA和/或TCR的ZFN”是指锌指核酸酶，一种可用于编辑HLA和/或TCR基因的人工核酸酶。
类似于TALEN，ZFN包括与DNA-结合结构域融合的FokI核酸酶结构域(或其衍生物)。在ZFN的情况下，DNA-结合结构域包含一个或更多个锌指。Carroll等人(2011)Genetics Society of America 188:773-782；和Kim等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:1156-1160。
锌指是被一个或更多个锌离子稳定的小蛋白结构基序。锌指可以包括例如Cys2His2，并且可以识别约3-bp序列。可以把具有已知特异性的多种锌指组合来产生多指多肽，其识别约6、9、12、15或18-bp序列。可以利用多种选择和模块装配技术来产生识别特定序列的锌指(及其组合)，包括噬菌体展示、酵母菌单杂交系统、细菌单杂交系统和细菌二杂交系统及哺乳动物细胞。
类似于TALEN，ZFN必须二聚化才能切割DNA。因此，要求一对ZFN来靶向非回文结构的DNA位点。两个单个的ZFN必须与DNA的相对链结合，并且其核酸酶被适当地间隔隔开。Bitinaite等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:10570-5。
也类似于TALEN，ZFN可以在DNA中产生双链断裂，如果没有适合地修复，则其可以产生移码突变，导致细胞中HLA和/或TCR的表达和数量降低。ZFN也可以被用于同源重组，以在HLA或TCR的基因中突变。
使用本领域已知的任何方法可以构建对HLA和/或TCR中的序列特异性的ZFN。参见，例如Provasi(2011)Nature Med.18:807-815；Torikai(2013)Blood 122:1341-1349；Cathomen等人(2008)Mol.Ther.16:1200-7；和Guo等人(2010)J.Mol.Biol.400:96；美国专利公开2011/0158957；美国专利公开2012/0060230。
细胞的活化和扩增
通常可以使用例如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利公开号20060121005中所述的方法进行细胞活化和扩增。
通常，本发明的T细胞可以通过与连接有刺激CD3/TCR复合体相关的信号的作用剂和刺激T细胞表面上的共刺激性分子的配体的表面接触进行扩增。特别地，可以如本文所述的刺激T细胞群，比如通过与抗-CD3抗体或其抗原结合片段、或固定在表面上的抗-CD2抗体接触，或通过与钙离子载体协同与蛋白激酶C活化剂(例如苔藓抑素)接触。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，可以在适于刺激T细胞增殖的条件下，使T细胞群与抗-CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，抗-CD3抗体和抗-CD28抗体。可以如本领域已知的其它常用方法那样使用抗-CD28抗体的实例，包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,Besancon，France)(Berg等人,Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998；Haanen等人,J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garland等人,J.Immunol Meth.227(1-2):53-63,1999)。
在某些方面，可以通过不同的方案提供用于T细胞的初次刺激信号和共刺激信号。例如，提供每种信号的作用剂可以在溶液中或被偶联至表面。当与表面偶联时，可以把所述作用剂偶联到相同的表面(即，“顺式”形式)或单独的表面(即，“反式”形式)。备选地，可以把一种作用剂偶联到表面，且另一种作用剂可以在溶液中。在一个方面，提供共刺激信号的作用剂与细胞表面结合，且提供一级活化信号的作用剂在溶液中或被偶联至表面。在某些方面，两种作用剂都可以在溶液中。在一个方面，作用剂可以呈可溶性形式，然后被交联至表面，比如表达将会与该作用剂结合的Fc受体或抗体或其它结合剂的细胞。在这点上，关于人工抗原呈递细胞(aAPCs)，参见例如美国专利申请公开号：20040101519和20060034810，考虑其在本发明中用于活化和扩增T细胞。
在一个方面，把两种作用剂都固定在珠上，在相同的珠上，即“顺式”，或在不同的珠上，即“反式”。例如，提供一级活化信号的作用剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，并且提供共刺激信号的作用剂是抗-CD28抗体或其抗原结合片段；并且两种作用剂以等同的分子数量被共同固定在相同珠上。在一个方面，使用与所述珠结合的每种抗体的1:1的比率，用于CD4+T细胞扩增和T细胞生长。在本发明的某些方面，使用与所述珠结合的抗CD3:CD28抗体的比率，使得与使用1:1的比率观察的扩增相比，观察到T细胞扩增的增加。在一个特别的方面，与使用1:1的比率观察的扩增相比，观察到约1至约3倍的增加。在一个方面，与所述珠结合的CD3:CD28抗体的比率范围为100:1至1:100及其中所有整数值。在本发明的一个方面，与粒子结合的抗-CD28抗体比抗CD3抗体多，即CD3:CD28的比率小于1。在本发明的某些方面，与珠结合的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比率大于2:1。在一个特别的方面，使用1:100的与珠结合的抗体的CD3:CD28比率。在一个方面，使用1:75的与珠结合的抗体的CD3:CD28比率。在一个进一步的方面，使用1:50的与珠结合的抗体CD3:CD28比率。在一个方面，使用1:30的与珠结合的抗体的CD3:CD28比率。在一个优选的方面，使用1:10的与珠结合的抗体的CD3:CD28比率。在一个方面，使用的与珠结合的抗体的1:3CD3:CD28比率。在还有一个方面中，使用3:1的与珠结合的抗体CD3:CD28比率。
可以使用1:500至500:1及其间任何整数值的粒子与细胞的比率来刺激T细胞或其它靶细胞。正如本领域普通技术人员可以容易地理解的那样，粒子与细胞的比率可以取决于相对于靶细胞的粒子尺寸。例如，小尺寸珠可能仅结合少数细胞，而较大珠可结合许多细胞。在某些方面，细胞与粒子的比率范围为1:100至100:1及其中任何整数值，并且在进一步的方面，也可以使用包括1:9至9:1的及其中任何整数值的比率来刺激T细胞。导致T细胞刺激的抗-CD3-和抗-CD28偶联的粒子与T细胞的比率可以如上所述变化，然而某些优选值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1和15:1，一个优选的比率为至少1:1的粒子/T细胞。在一个方面，使用1:1或更小的粒子与细胞的比率。在一个特别的方面，优选的粒子：细胞比率为1:5。在进一步的方面，粒子与细胞的比率可以根据刺激的天数变化。例如，在一个方面，在第一天，粒子与细胞的比率为1:1至10:1，并且此后每天或每隔一天向细胞中加入另外的粒子，直到10天，最终比率为1:1至1:10(基于加入当天的细胞计数)。在一个特别的方面，在刺激的第一天，粒子与细胞的比率为1:1，并在刺激的第三天和第五天调节为1:5。在一个方面，以每日或每隔一天为基准加入粒子至刺激的第一天最终比为1:1，且在刺激的第三天和第五天为1:5。在一个特别的方面，在刺激的第一天，粒子与细胞的比率为2:1，并在刺激的第三天和第五天调节为1:10。在一个方面，以每日或每隔一天为基准加入粒子至刺激的第一天最终比为1:1，且在刺激的第三天和第五天为1:10。本领域技术人员应当理解多种其它比率都可以适用于本发明。特别地，比率将根据粒径及细胞尺寸和类型而变化。在一个方面，在第一天，最典型的使用比率为约1:1、2:1和3:1左右。
在本发明的进一步的方面，将细胞比如T细胞与作用剂包被的珠混合，接着分离珠和细胞，然后培养细胞。在备选的方面，在培养之前，作用剂-包被的珠和细胞没有分离，而是一起培养。在一个进一步的方面，首先通过施加力(比如磁力)浓缩珠和细胞，导致细胞表面标记物的连接增加，从而诱导细胞刺激。
例如，可以通过允许附着了抗-CD3和抗-CD28的顺磁性的珠(3x28珠)与T细胞接触来连接细胞表面蛋白。在一个方面，将细胞(例如104至109个T细胞)和珠(例如，比率1：1的
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M-CD3/CD28 T顺磁性的珠)在缓冲液中混合，缓冲液例如为PBS(不含二价阳离子，比如钙和镁)。此外，本领域普通技术人员可以容易地理解可以使用任何细胞浓度。例如，样品中靶细胞可能非常少，且仅占样品的0.01％，或全部样品(即，100％)可以包含目的靶细胞。因此，任何细胞数量都在本发明的上下文之内。在某些方面，可能期望显著减少其中粒子和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和粒子的最大接触。例如，在一个方面，使用约20亿个细胞/ml的浓度。在一个方面，使用大于1亿个细胞/ml的浓度。在一个方面，使用1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0千万个细胞/ml的浓度。在仍然一个方面，使用从7.5、8、8.5、9、9.5或10千万个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的方面，可以使用1.25亿或1.50亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以引起细胞产率提高、细胞活化和细胞扩增。进一步，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达目的靶抗原的细胞，比如CD28-阴性T细胞。这样的细胞群可以具有治疗价值，并且在某些方面将是期望得到的。例如，使用高浓度的细胞能够更有效地选择通常具有弱CD28表达的CD8+T细胞。
在本发明的一个方面，培养该混合物几小时(约3小时)至约14天或其中的任何小时整数值。在一个方面，可以培养该混合物21天。在本发明的一个方面，将珠和T细胞一起培养约八天。在一个方面，将珠和T细胞一起培养2-3天。也可能需要几个刺激循环，使得T细胞的培养时间可以为60天或以上。适于T细胞培养的条件包括合适的培养基(例如,极限必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15,(Lonza))，其可以含有增殖和生存所必需的因子，包括血清(例如胎牛血清或人血清)、白细胞介素-1(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或本领域技术人员已知用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括，但不限于表面活性剂、plasmanate和还原剂比如N-乙酰基半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimizer，具有加入的氨基酸、丙酮酸钠和维生素、无血清或补充有适合量的血清(或血浆)或定义的激素组、和/或足以使T细胞生长和扩增的量的细胞因子。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅包括在实验培养物中，而不在输注到受试者中的细胞培养物中。靶细胞保持在载体生长必需的条件下，例如适合的温度(例如37℃)和气氛(例如，空气加5％ CO2)。
已经暴露于不同刺激时间的T细胞可以显示出不同的特征。例如，典型的血液或单采血液成分术外周血单核细胞产物具有大于细胞毒性或抑制T细胞群(TC,CD8+)的辅助T细胞群(TH,CD4+)。通过刺激CD3和CD28受体的离体T细胞扩增产生T细胞群，该细胞群在约第8-9天前主要由TH细胞组成，而在约第8-9天之后，T细胞群包括越来越大的TC细胞群。因此，根据治疗的目的，向受试者输注主要包括TH细胞的T细胞群可能是有利的。类似地，如果已经分离了TC细胞的抗原特异性亚组，则使该亚组在更大程度上扩增可能是有益的。
进一步，除了CD4和CD8标记物之外，其它表型标记物显著变化，但大部分在细胞扩增过程中可再重现。因此，这样的可重现性使能够针对特定目的裁剪活化的T细胞产物。
一旦构建间皮素CAR，则可以使用多种试验来评价分子的活性，比如但不限于在抗原刺激后扩增T细胞的能力、在不存在再刺激下维持T细胞扩增和在适合的体外和动物模型中的抗癌活性。用于评价间皮素CAR的效应的试验在下文进一步详细描述。
可以使用对初级T细胞中CAR表达的蛋白质印迹分析来检测单体和二聚体的存在。参见，例如Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。非常简要地，让表达CAR的T细胞(CD4+和CD8+T细胞的1:1混合物)在体外扩增超过10天，随后在还原条件下进行细胞溶解和SDS-PAGE。使用针对TCR-ζ链的抗体，通过蛋白质印迹来检测含有全长TCR-ζ胞质结构域和内源性TCR-ζ链的CAR。在非还原条件下，使用相同T细胞亚组进行SDS-PAGE分析，以允许评价共价二聚体形成。
可以通过流式细胞测量术测量抗原刺激后CAR+T细胞的体外扩增。例如，用αCD3/αCD28 aAPC刺激CD4+和CD8+T细胞的混合物，接着在要被分析的启动子的控制下用表达GFP的慢病毒载体转导。示例性的启动子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。在第6天，通过流式细胞测量术测量CD4+和/或CD8+T细胞亚组中培养物的GFP荧光。参见，例如Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。备选地，在第0天，用αCD3/αCD28包被的磁珠刺激CD4+和CD8+T细胞的混合物，并在第1天使用表达CAR的双顺反子慢病毒载体用CAR转导以及使用2A核醣体跳跃序列用eGFP转导。例如，在抗-CD3和抗-CD28抗体(K562-BBL-3/28)的存在下，用表达hCD32和4-1BBL的K562细胞再刺激培养物，之后洗涤。每隔一天，向培养物中加入100IU/ml的外源性IL-2。通过流式细胞术，使用基于珠的计数对GFP+T细胞计数。参见，例如Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。
也可以测量在不存在再刺激下保持的CAR+T细胞扩增。参见，例如Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。简而言之，在第0天用αCD3/αCD28包被的磁珠刺激，并在第1天用指定的CAR转导，在培养的第8天，使用Coulter Multisizer III粒子计数器测量平均T细胞体积(fl)。
之前已经描述了对细胞增殖和细胞因子产生的评价，例如Milone等人,MolecularTherapy 17(8):1453-1464(2009)。简而言之，在微量滴定板中通过将洗涤的T细胞与靶细胞混合，直至最终T细胞：靶细胞比率为1:1，来评价CAR-介导的增殖，所述靶细胞比如是K562-Meso、Ovcar3、Ovcar8、SW1990、表达间皮素的Panc02.03或CD32和CD137(KT32-BBL)。将抗-CD3(克隆OKT3)和抗-CD28(克隆9.3)单克隆抗体添加到含有KT32-细胞的培养物中，作为刺激T-细胞增殖的阳性对照，因为这些信号支持长期CD8+T细胞离体扩增。如制造商所描述的，使用CountBrightTM荧光珠(Invitrogen,Carlsbad,CA)和流式细胞术对培养物中的T细胞计数。通过GFP表达，使用以eGFP-2A连接的表达CAR的慢病毒载体工程化的T细胞来鉴定CAR+T细胞。对于不表达GFP的CAR+T细胞，用生物素化的重组间皮素蛋白质和二级抗生物素蛋白-PE缀合物检测CAR+T细胞。也用特异性单克隆抗体(BD Biosciences)同时检测T细胞上的CD4+和CD8+表达。根据制造商的说明，使用人类TH1/TH2细胞因子细胞计数珠阵列试剂盒(BD Biosciences,San Diego,CA)，对再刺激之后24小时收集的上清液进行细胞因子测量。使用FACScalibur流式细胞仪评价荧光，并根据制造商的说明分析数据。
可以通过本文所述方法评价细胞毒性，例如在实施例中，或通过标准51Cr-释放测定。参见，例如Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。简而言之，在37℃下，在频繁搅拌下，给靶细胞(例如，表达间皮素的BHK或CHO细胞)负载51Cr(如NaCrO4,New England Nuclear,Boston,MA)2小时，在完全RPMI中洗涤2次，并铺板到微量滴定板中。在各孔中，在完全RPMI中，以可变的效应物细胞：靶细胞(E:T)比率，使效应物T细胞与靶细胞混合。还制备了仅含有培养基(自发释放，SR)或氚-X 100洗涤剂的1％溶液(总释放，TR)的另外的孔。在37℃下培养4小时之后，收集来自每个孔的上清液。然后，使用γ粒子计数器(Packard Instrument Co.,Waltham,MA)测量释放的51Cr。每个条件至少一式三份进行，并使用下式计算溶解的百分数∶溶解％＝(ER-SR)/(TR-SR)，其中ER代表每种实验条件下释放的平均51Cr。也可以使用备选的细胞毒性试验，比如基于流动的细胞毒性试验。
可以使用叩甲红(Click beetle red)和叩甲绿(click beetle green)萤光素酶同时追踪肿瘤进展和T细胞转移，因为每种使用相同的萤光素底物但在可见光谱的相反端发光。
其它试验，包括本文实施例部分中所述的那些试验以及本领域已知的那些试验，也可以被用于评价本发明的间皮素CAR构建体。
用于表达间皮素的疾病和病症的治疗应用
本发明提供用于治疗与间皮素有关的疾病和病症的组合物和方法。与间皮素有关的疾病或病症的实例为间皮瘤。
恶性间皮瘤是一种身体内脏器官衬里的细胞薄层(被称为间皮)中出现的癌症类型。存在三种已经确认的间皮瘤类型。胸膜间皮瘤(例如，恶性胸膜间皮瘤或MPM)是最常见的疾病形式，占约70％的病例，并出现在被称为胸膜的肺衬里中。腹膜间皮细胞瘤出现在被称为腹膜的腹腔的衬里中。心包间皮瘤来源于衬里心脏的心包中。
如果受试者暴露于石棉，则受试者可能处于发展为间皮瘤的风险中。暴露于石棉和吸入石棉粒子都可引起间皮瘤。在大多数情况下，暴露于石棉的受试者直到发生暴露后很多年才出现间皮瘤症状。
胸膜间皮瘤的症状包括例如下腰痛或侧胸痛，以及呼吸急促。其它症状包括吞咽困难、持续性咳嗽、发热、体重减轻或疲劳。某些患者感受到的另外的症状为肌肉无力、感官能力损失、咳出血、面部和手臂肿胀、及嘶哑。在该疾病的早期阶段，比如1期间皮瘤，症状可以是轻度的。患者通常报告似乎从未停止的胸部一个区域疼痛、体重减轻和发热。
腹膜间皮细胞瘤起源于腹部，因此，症状通常包括腹痛、体重减轻、恶心和呕吐。腹部可能出现液体聚集以及癌症的后果。腹膜间皮细胞瘤起源于腹部，通常将扩散到该区域的其它器官，包括肝、脾或肠。严重腹痛是患者首先感受到的最常见抱怨。腹部也可能出现液体聚集的不适程度。腹膜间皮细胞瘤的其它症状可包括肠蠕动困难、恶心和呕吐、发热和足部肿胀。
心包间皮瘤是间皮瘤的最不常见形式。心包间皮瘤，如名称表明的，涉及心脏。该罕见类型的间皮瘤癌症侵入心包，包围心脏的囊。随着癌症进展，心脏不能向身体有效地递送氧，导致健康以越来越快的速率进一步减退。最通常与心包间皮瘤有关的大多数症状模拟心脏病发作的症状：恶心、胸部疼痛和呼吸急促。
受益于根据本发明的治疗的受试者包括患有间皮瘤的受试者、疑似患有间皮瘤的受试者，例如由于存在本文所述的一种或多种症状和/或暴露于石棉所证实的。在特别的实施方案中，间皮瘤为胸膜间皮瘤(例如，恶性胸膜间皮瘤)。在其它方面，可以治疗患有癌变前病症(比如例如胸膜斑块、良性间皮瘤或间皮增生)的受试者。
另一个与间皮素有关的疾病或病症的实例为胰腺癌。可以用本文所述方法治疗的胰腺癌包括，但不限于外分泌胰腺癌和内分泌胰腺癌。外分泌胰腺癌包括，但不限于腺癌、腺泡细胞癌、腺鳞癌、胶样癌、具有破骨细胞样巨细胞的未分化癌、肝癌瘤、管内乳头状粘液性癌、粘液性膀胱瘤、胰母细胞瘤、浆液性囊腺瘤、印戒细胞癌(signet ring cellcarcinomas)、实体和假乳头状肿瘤、胰管癌和未分化癌。在某些实施方式中，外分泌胰腺癌为胰腺管癌瘤。内分泌胰腺癌包括但不限于胰岛素瘤和胰升血糖素瘤。
在某些实施方式中，胰腺癌为任何早期胰腺癌、非转移性胰腺癌、原发性胰腺癌、切除的胰腺癌、晚期胰腺癌、局部晚期胰腺癌、转移性胰腺癌、不可切除的胰腺癌、症状缓解的胰腺癌、复发性胰腺癌、辅助情形(adjuvant setting)中的胰腺癌或非辅助情形中的胰腺癌。在某些实施方式中，胰腺癌为局部晚期胰腺癌、不可切除的胰腺癌或转移性胰管癌。在某些实施方式中，胰腺癌为对于基于吉西他滨的治疗有抗性的。在某些实施方式中，胰腺癌为基于吉西他滨的治疗难治性的。
在其它方面，与间皮素表达有关的病症为卵巢癌。卵巢癌是根据肿瘤组织学分类的。表面上皮基质肿瘤也称为卵巢上皮癌，是最常见的卵巢癌类型。其包括浆液肿瘤(包括浆液乳头囊腺癌)、子宫内膜样肿瘤和粘液性囊腺癌。
本文所述方法可用于治疗多个阶段的卵巢癌，例如I期、II期、III期或IV期。例如，当除去卵巢癌时，可以进行分期。卵巢癌症如下分期：
I期癌症限于一个或两个卵巢。如果涉及一个或两个卵巢且已扩散到子宫和/或输卵管或骨盆的其他部位，则该癌症为II期。如果涉及一个或两个卵巢且已经扩散淋巴结或到骨盆之外的其它部位但仍然在腹腔之内，比如肠或肝表面，则该癌症为III期癌症。如果涉及一个或两个卵巢且该癌症扩散到腹部或肝脏内部，则该癌症为IV期癌症。
在某些实施方式中，卵巢癌症为对于一种或多种化疗剂有抗性的。在某些实施方式中，卵巢癌为一种或多种化疗剂难治性的。
可以用本文所述的CAR组合物治疗的其它癌症包括，例如脑癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠直肠癌、肝癌、肾癌、淋巴瘤、白血病、肺癌(例如肺腺癌)、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、间皮瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、皮肤癌、胸腺瘤、肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、子宫癌及其任意组合。
本发明提供用于抑制表达间皮素的细胞群的增殖或减少表达间皮素的细胞群的方法，所述方法包括:使结合表达间皮素的细胞的本发明的表达间皮素CAR的细胞与包含表达间皮素的细胞的细胞群接触。在一个特定的实施方案中，本发明提供用于抑制表达间皮素的癌细胞群的增殖或减少表达间皮素的癌细胞群的方法，所述方法包括:使结合表达间皮素的细胞的本发明的表达间皮素CAR的细胞与表达间皮素的癌细胞群接触。在另一种实施方式中，本发明提供用于抑制表达间皮素的癌细胞群的增殖或减少表达间皮素的癌细胞群的方法，所述方法包括:使结合表达间皮素的细胞的本发明的表达间皮素CAR的细胞与表达间皮素的癌细胞群接触。在某些实施方式中，相对于阴性对照，本发明的表达间皮素CAR的细胞在患有间皮瘤或与表达间皮素的细胞有关的另一种癌症的受试者或动物模型中减少细胞和/或癌细胞的数量、数目、量或百分数为至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少65％、至少75％、至少85％、至少95％、或至少99％。在一个方面，受试者为人类。
本发明还提供用于预防、治疗和/或控制与表达间皮素的细胞有关的病症(例如，间皮瘤)的方法，所述方法包括向需要的受试者施用结合表达间皮素的细胞的本发明的表达间皮瘤CAR的细胞。在一个方面，受试者为人。
本发明提供用于预防与表达间皮素的细胞有关的癌症复发的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用结合表达间皮素的细胞的本发明的表达间皮素CAR的细胞。在另一种实施方式中，所述方法包括:与有效量的另一种疗法联合，向需要其的受试者施用有效量的结合表达间皮素的细胞的本发明的表达间皮素CAR的细胞。
在一个方面，本发明涉及一种载体，其包括编码与启动子有效连接的间皮素CAR的序列，该启动子用于哺乳动物免疫效应细胞中的表达。在一个方面，本发明提供用于治疗表达间皮素的肿瘤的表达间皮素CAR的重组免疫效应细胞。在一个方面，本发明的表达间皮素CAR的细胞能够使肿瘤细胞与在其表面上表达的本发明的至少一种间皮素CAR接触，使得所述表达间皮素CAR的细胞在对所述抗原的响应中活化，并且所述的表达CAR的细胞靶向癌细胞，并且所述癌症的生长受到抑制。
在一个方面，本发明涉及一种抑制表达间皮素的癌细胞生长的方法，其包括使所述的肿瘤细胞与表达间皮素CAR的细胞接触，使得表达CAR的细胞在对抗原的响应中活化，并且靶向癌细胞，其中所述癌症的生长受到抑制。在一个方面，活化的CART靶向且杀死所述的癌细胞。
在一个方面，本发明涉及一种治疗受试者中的癌症的方法。所述方法包括向受试者施用表达间皮素CAR的细胞，以便治疗受试者的癌症。用本发明的表达间皮素CAR的细胞能治疗的癌症的一个实例为与间皮素的表达有关的癌症。在一个方面，与间皮素的表达有关的癌症选自间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌和肺癌。
本发明包括一种类型的细胞疗法，其中对免疫效应细胞例如T细胞或NK细胞进行基因修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)，并且将表达CAR的细胞输注到需要其的接受者。输注的细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞。与抗体疗法不同，CAR-修饰的免疫效应细胞能够在体内复制，导致可能引起持久肿瘤控制的长期持续性。在各个方面，向患者或其后代施用的细胞，在向患者施用所述细胞之后，在患者中保持至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、十三个月、十四个月、十五个月、十六个月、十七个月、十八个月、十九个月、二十个月、二十一个月、二十二个月、二十三个月、两年、三年、四年或五年。
本发明还包括一种类型的细胞疗法，其中免疫效应细胞(例如通过体外转录的RNA)被修饰，以短暂地表达嵌合抗原受体(CAR)，且所述表达CAR的细胞被输注到需要其的接受者。输注的细胞能够杀死接受者的癌细胞。因此，在各个方面，向患者施用的细胞，在所述细胞被施用到所述患者之后，存在少于一个月，例如三周、两周、一周。
不希望受任何特定理论的束缚，CAR-修饰的免疫效应细胞引发的抗癌免疫应答可以是主动的或被动的免疫应答，或者备选地可以由于直接的对间接的免疫应答所致。在一个方面，CAR转导的T细胞在对表达间皮素的人类癌细胞的响应中，显示出特异性促炎性细胞因子分泌和强效的细胞溶解活性，并且介导旁观者杀死和介导已经建立的人肿瘤退行。例如，在表达间皮素的肿瘤的异质性区域中的抗原较少的肿瘤细胞可能易于受间皮素重定向的T细胞的间接破坏的影响，该间皮素重定向T细胞先前对于相邻的抗原阳性癌细胞有反应。
在一个方面，携带完全人scFv的本发明的CAR-修饰的免疫效应细胞可以是用于哺乳动物中离体免疫和/或体内治疗的疫苗类型。在一个方面，哺乳动物为人类。
关于离体免疫接种，在将细胞施用到哺乳动物之前在体外出现下述之一：i)细胞扩增，ii)向细胞中引入编码CAR的核酸，iii)冷藏细胞。
离体过程是本领域熟知的，并且如下更完全地讨论。简而言之，从哺乳动物(例如，人类)分离细胞，并用表达本文公开的CAR的载体基因修饰(即，体外转导或转染)。可以将CAR-修饰的细胞施用到哺乳动物接受者以提供治疗益处。哺乳动物接受者可以是人类，并且CAR-修饰的细胞可以对于接受者是自体的。备选地，所述细胞可以对于接受者是同种异体的、同源的或异种的。
用于离体扩增造血干细胞和祖细胞的方法被描述在美国专利号5,199,942中，将其引入本文作为参考，可以应用于本发明的细胞。其它的合适的方法是本领域已知的，因此本发明不限于离体扩增细胞的任何特定的方法。简而言之，T细胞的离体培养和扩增包括:(1)从外周血液采集或骨髓外植体，从哺乳动物收集CD34+造血干细胞和祖细胞；和(2)离体扩增这样的细胞。除了美国专利号5,199,942中描述的细胞生长因子之外，其它因子比如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体可用于细胞的培养和扩增。
除了在离体免疫接种方面使用基于细胞的疫苗之外，本发明还提供用于体内免疫接种以针对患者中的抗原引发免疫应答的组合物和方法。
通常，所如本文所述的细胞活化和扩增可以用于治疗和预防免疫受损的个体中出现的疾病。特别地，本发明的CAR-修饰的免疫效应细胞用于治疗与间皮素的表达有关的疾病、障碍和病症。在某些方面，本发明的细胞用于治疗处于发展为与间皮素的表达有关的疾病、障碍和病症的风险中的患者。因此，本发明提供用于治疗或预防与间皮素的表达有关的疾病、障碍和病症的方法，包括向需要其的受试者施用治疗有效量的本发明的CAR-修饰的T细胞。
本发明的CAR-修饰的T细胞可以单独施用或作为与稀释剂和/或其它比如IL-2或其它细胞因子或细胞群组合的药物组合物施用。
本发明还提供用于抑制表达间皮素的细胞群的增殖或减少表达间皮素的细胞群的方法，所述方法包括使结合表达间皮素的细胞的本发明的表达间皮素CAR的细胞(例如，间皮素CART，也称为“CART-MSLN”)与包含表达间皮素的细胞的细胞群接触。在一个特别方面中，本发明提供用于抑制表达间皮素的癌细胞群的增殖或减少表达间皮素的癌细胞群的方法，所述方法包括使结合表达间皮素的细胞的本发明的表达间皮素CAR的细胞与表达间皮素的癌细胞群接触。在一个方面，本发明提供用于抑制表达间皮素的癌细胞群的增殖或减少其的方法，所述方法包括使结合表达间皮素的细胞的本发明的表达间皮素CAR的细胞与表达间皮素的癌细胞群接触。在某些方面，相对于阴性对照，本发明的表达间皮素CAR的细胞在患有间皮瘤或与表达间皮素的细胞有关的另一种癌症的受试者或动物模型中减少细胞和/或癌细胞的数量、数目、量或百分数为至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少65％、至少75％、至少85％、至少95％、或至少99％。在一个方面，受试者为人类。
本发明还提供用于预防、治疗和/或控制与表达间皮素的细胞有关的疾病(例如，间皮瘤)的方法，所述方法包括向需要的受试者施用结合表达间皮素的细胞的本发明的表达间皮瘤CAR的细胞。在一个方面，受试者为人类。
本发明提供用于预防与表达间皮素的细胞有关的癌症复发的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用结合表达间皮素的细胞的本发明的表达间皮素CAR的细胞。在一个方面，所述方法包括:与有效量的另一种疗法的联合,向需要其的受试者施用有效量的结合表达间皮素的细胞的本发明的表达间皮素CAR的细胞。
联合治疗
本文所述表达CAR的细胞可以与其它已知的作用剂和疗法联合使用。正如本文中使用的那样，“联合”施用是指在受试者受病症折磨的过程期间，向受试者递送两种(或多种)不同的治疗，例如在已经诊断受试者患有病症之后和在病症已经治愈或消除或治疗由于其它原因停止之前递送两种或多种治疗。在某些实施方式中，当递送第二种治疗开始时，一种治疗的递送仍然存在，因此施用方面存在重叠。这有时在本文称为“同时”或“同时递送”。在其它实施方案中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一情形的某些实施方式中，因为联合施用，治疗更有效。例如，与如果在不存在第一种治疗时施用第二种治疗所看到的，或采用第一种治疗看到类似的情形相比，第二种治疗更有效，例如，使用更少的第二种治疗可看到同等效果，或第二种治疗更大程度地减轻症状。在某些实施方式中，递送使得症状减轻，或与病症有关的其他参数大于在不存在另一种治疗时用一种治疗观察的参数。两种治疗的效果可部分相加，完全相加或大于相加。递送可以使得当递送第二种时递送第一种治疗的效果仍然可检测到。
本文所述的表达CAR的细胞和至少一种另外的治疗剂可以在相同的或不同的组合物中，同时施用或顺序施用。对于顺序施用，可以首先施用本文所述表达CAR的细胞，并接着施用另一种作用剂，或者可以颠倒施用顺序。
在进一步的方面，本文所述表达CAR的细胞与如下联合用于治疗方案中：外科手术、化疗、放射、免疫抑制剂比如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯(mycophenolate)和FK506、抗体或其它免疫烧蚀作用剂比如CAMPATH、抗-CD3抗体其它抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和照射。肽疫苗，比如在Izumoto等人2008J Neurosurg 108:963-971中描述的那些。
在一种实施方式中，本文所述表达CAR的细胞可以与化疗剂联合使用。示例性的化疗剂包括蒽环类(例如，多柔比星(例如，脂质体多柔比星))、长春花生物碱(例如，长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)、烷化剂(例如，环磷酰胺、达可巴嗪、美法仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)、免疫细胞抗体(例如，alemtuzamab、吉姆单抗、利妥昔单抗(rituximab)、托西莫单抗(tositumomab))、抗代谢药(包括，例如叶酸拮抗药、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂(例如氟达拉滨))、mTOR抑制剂、TNFR糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂、蛋白酶体抑制剂(例如，阿克拉霉素A、胶霉毒素或硼替佐米)、免疫调节剂比如沙利度胺或沙利度胺衍生物(例如来那度胺(lenalidomide))。
考虑用于组合疗法的一般化疗剂包括阿那曲唑
Figure GDA0003963633350001321
比卡鲁胺(bicalutamide)
Figure GDA0003963633350001322
硫酸博来霉素盐(bleomycin sulfate)
Figure GDA0003963633350001323
白消安(busulfan)
Figure GDA0003963633350001324
白消安注射剂
Figure GDA0003963633350001325
卡培他滨
Figure GDA0003963633350001326
N4-戊氧基羰基-5-脱氧-5-氟胞嘧啶核苷、卡铂
Figure GDA0003963633350001327
卡莫司汀
Figure GDA0003963633350001328
苯丁酸氮芥
Figure GDA0003963633350001329
顺铂
Figure GDA00039636333500013210
克拉屈滨
Figure GDA00039636333500013211
环磷酰胺
Figure GDA00039636333500013212
Figure GDA00039636333500013213
阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖胞苷
Figure GDA00039636333500013214
阿糖胞苷脂质体注射剂
Figure GDA00039636333500013215
达卡巴嗪
Figure GDA00039636333500013216
更生霉素(Actinomycin D,Cosmegan)、柔红霉素盐酸盐
Figure GDA00039636333500013217
柔红霉素柠檬酸盐脂质体注射剂
Figure GDA00039636333500013218
地塞米松、多西他赛
Figure GDA00039636333500013219
多柔比星盐酸盐
Figure GDA00039636333500013220
依托泊苷
Figure GDA00039636333500013221
氟达拉滨磷酸盐
Figure GDA00039636333500013222
5-氟尿嘧啶
Figure GDA00039636333500013223
氟他胺
Figure GDA00039636333500013224
tezacitibine、吉西他滨(二氟脱氧胞嘧啶核苷(difluorodeoxycitidine))、羟基脲
Figure GDA00039636333500013225
伊达比星
Figure GDA00039636333500013226
异环磷酰胺
Figure GDA00039636333500013227
依立替康
Figure GDA00039636333500013228
L-天冬酰胺酶
Figure GDA00039636333500013229
甲酰四氢叶酸钙、美法仑
Figure GDA00039636333500013230
6-巯基嘌呤
Figure GDA00039636333500013231
甲氨蝶呤
Figure GDA00039636333500013232
米托蒽醌
Figure GDA00039636333500013233
麦罗塔(mylotarg)、紫杉醇
Figure GDA00039636333500013234
phoenix(Yttrium90/MX-DTPA)、喷司他丁、聚苯丙生(polifeprosan)20与卡莫司汀植入物
Figure GDA00039636333500013235
枸橼酸它莫西芬
Figure GDA00039636333500013236
替尼泊苷
Figure GDA00039636333500013237
6-硫代鸟嘌呤、塞替派(thiotepa)、替拉扎明(tirapazamine)
Figure GDA00039636333500013238
用于注射的托泊替康盐酸盐
Figure GDA00039636333500013239
长春碱
Figure GDA00039636333500013240
长春新碱
Figure GDA00039636333500013241
和长春瑞滨
Figure GDA00039636333500013242
示例性的烷化剂包括，不限于：氮芥(nitrogen mustards)、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯)∶尿嘧啶氮芥(Aminouracil
Figure GDA0003963633350001331
Figure GDA0003963633350001332
Uracil nitrogen
Figure GDA0003963633350001333
)、氮芥(chlormethine)
Figure GDA0003963633350001334
环磷酰胺(
Figure GDA0003963633350001335
Figure GDA0003963633350001336
RevimmuneTM)、异环磷酰胺
Figure GDA0003963633350001337
美法仑
Figure GDA0003963633350001338
苯丁酸氮芥
Figure GDA0003963633350001339
哌泊溴烷(pipobroman)
Figure GDA00039636333500013310
三乙撑三聚氰胺(triethylenemelamine)
Figure GDA00039636333500013311
三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramine)、替莫唑胺
Figure GDA00039636333500013312
塞替派
Figure GDA00039636333500013313
白消安
Figure GDA00039636333500013314
卡莫司汀
Figure GDA00039636333500013315
洛莫司汀
Figure GDA00039636333500013316
链佐星(streptozocin)
Figure GDA00039636333500013317
和达卡巴嗪
Figure GDA00039636333500013318
另外的示例性的烷化剂包括，不限于奥沙利铂
Figure GDA00039636333500013319
替莫唑胺
Figure GDA00039636333500013320
更生霉素(也称为放线菌素-D，
Figure GDA00039636333500013321
)；美法仑(也称为L-PAM、L-溶肉瘤素和苯基丙氨酸氮芥，
Figure GDA00039636333500013322
)；六甲蜜胺(也称为六甲蜜胺(HMM),
Figure GDA00039636333500013323
)；卡莫司汀
Figure GDA00039636333500013324
苯达莫司汀(Bendamustine)
Figure GDA00039636333500013325
白消安
Figure GDA00039636333500013326
卡铂
Figure GDA00039636333500013327
洛莫司汀(也称为CCNU,
Figure GDA00039636333500013328
)；顺铂(也称为CDDP、
Figure GDA00039636333500013329
)；苯丁酸氮芥
Figure GDA00039636333500013330
环磷酰胺
Figure GDA00039636333500013331
达卡巴嗪(也称为DTIC、DIC和咪唑甲酰胺、
Figure GDA00039636333500013332
)；六甲蜜胺(也称为六甲蜜胺(HMM),
Figure GDA00039636333500013333
)；异环磷酰胺
Figure GDA00039636333500013334
Prednumustine；丙卡巴肼
Figure GDA00039636333500013335
氮芥(Mechlorethamine)(也称为氮芥(nitrogen mustard)、氮芥(mustine)和甲氯乙胺(mechloroethamine)盐酸盐、
Figure GDA00039636333500013336
)；链佐星
Figure GDA00039636333500013337
塞替派(也称为硫代磷酰胺(thiophosphoamide)、TESPA和TSPA,
Figure GDA00039636333500013338
)；环磷酰胺
Figure GDA00039636333500013339
Figure GDA00039636333500013340
和苯达莫司汀HCl
Figure GDA00039636333500013341
示例性的mTOR抑制剂包括，坦罗莫司；雷达罗莫司(ridaforolimus)(正式称为deferolimus、(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧代-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]六(三十烷)-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基亚膦酸酯，也称为AP23573和MK8669，且描述在PCT公开号WO 03/064383中)；依维莫司(
Figure GDA0003963633350001341
或RAD001)；雷帕霉素(AY22989,
Figure GDA0003963633350001342
)；simapimod(CAS 164301-51-3)；emsirolimus，(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502,CAS 1013101-36-4)；和N2-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)吗啉鎓-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰基甘氨酰基-L-α-天冬氨酰基L-丝氨酸-，内盐(SF1126,CAS 936487-67-1)和XL765。
示例性的免疫调节剂包括例如阿夫妥珠单抗(afutuzumab)(得自
Figure GDA0003963633350001343
)；乙二醇化非格司亭(pegfilgrastim)
Figure GDA0003963633350001344
来那度胺(lenalidomide)(CC-5013,
Figure GDA0003963633350001345
)；沙利度胺
Figure GDA0003963633350001346
actimid(CC4047)；和IRX-2(包括白细胞介素1、白细胞介素2和γ干扰素的人细胞因子的混合物，CAS 951209-71-5，得自IRXTherapeutics)。
示例性的蒽环类包括例如多柔比星
Figure GDA0003963633350001347
博来霉素
Figure GDA0003963633350001348
柔红霉素(daunorubicin)(柔红霉素盐酸盐、道诺霉素和红比霉素(rubidomycin)盐酸盐
Figure GDA0003963633350001349
)；柔红霉素脂质体(柠檬酸柔红霉素脂质体，
Figure GDA00039636333500013410
)；米托蒽醌(DHAD,
Figure GDA00039636333500013411
)；表柔比星(EllenceTM)；伊达比星(
Figure GDA00039636333500013412
Idamycin
Figure GDA00039636333500013413
)；丝裂霉素C
Figure GDA00039636333500013414
格尔德霉素(geldanamycin)；除莠霉素(herbimycin)；ravidomycin和desacetylravidomycin。
示例性的长春花生物碱包括例如长春瑞滨酒石酸盐
Figure GDA0003963633350001351
长春新碱
Figure GDA0003963633350001352
和长春地辛
Figure GDA0003963633350001353
)；长春碱(也称为硫酸长春碱、长春花碱和VLB,
Figure GDA0003963633350001354
)；和长春瑞滨
Figure GDA0003963633350001355
示例性的蛋白体抑制剂包括硼替佐米(bortezomib)
Figure GDA0003963633350001356
卡非佐米(carfilzomib)(PX-171-007,(S)-4-甲基-N-((S)-1-(((S)-4-甲基-1-((R)-2-甲基环氧乙烷-2-基)-1-氧代戊烷-2-基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-2-((S)-2-(2-吗琳子基乙酰氨基)-4-苯基丁酰氨基)-戊酰胺)；marizomib(NPI-0052)；ixazomib柠檬酸盐(MLN-9708)；delanzomib(CEP-18770)；和O-甲基-N-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-L-丝氨酰-O-甲基-N-[(1S)-2-[(2R)-2-甲基-2-环氧乙烷基]-2-氧代-1-(苯基甲基)乙基]-L-丝氨酰胺(ONX-0912)。
在一种实施方式中，将本文所述表达CAR的细胞与靶向GITR和/或调节GITR功能的分子(比如GITR激动剂和/或耗尽调节T细胞(Tregs)的GITR抗体)联合施用给受试者。在一种实施方式中，在表达CAR的细胞之前，施用GITR结合分子和/或调节GITR功能的分子(例如，GITR激动剂和/或耗尽GITR抗体的Treg)。例如，在一种实施方式中，可以在细胞单采血液成分术之前，施用GITR激动剂。示例性的GITR激动剂包括例如GITR融合蛋白和抗-GITR抗体(例如，二价抗GITR抗体)，比如例如美国专利号∶6,111,090、欧洲专利号：090505B1、美国专利号：8,586,023、PCT公开号∶WO 2010/003118和2011/090754中描述的GITR融合蛋白，或例如在美国专利号∶7,025,962、欧洲专利号∶1947183B1、美国专利号：7,812,135、美国专利号：8,388,967、美国专利号：8,591,886、欧洲专利号：EP 1866339、PCT公开号：WO 2011/028683、PCT公开号：WO 2013/039954、PCT公开号：WO2005/007190、PCT公开号：WO 2007/133822、PCT公开号：WO2005/055808、PCT公开号：WO 99/40196、PCT公开号：WO 2001/03720、PCT公开号：WO99/20758、PCT公开号：WO2006/083289、PCT公开号：WO 2005/115451、美国专利号∶7,618,632和PCT公开号：WO 2011/051726中所述的抗GITR抗体。
在一种实施方式中，将本文所述表达CAR的细胞与mTOR抑制剂(例如本文所述mTOR抑制剂，例如雷帕系物比如依维莫司(everolimus))联合施用至受试者。在一种实施方式中，在表达CAR的细胞之前，施用mTOR抑制剂。例如，在一种实施方式中，可以在细胞的单采血液成分术之前，施用mTOR抑制剂。
在一种实施方式中，将本文所述表达CAR的细胞与GITR激动剂(例如，本文所述GITR激动剂)联合施用给受试者。在一种实施方式中，在表达CAR的细胞之前，施用GITR激动剂。例如，在一种实施方式中，可以在细胞的单采血液成分术之前，施用GITR激动剂。
在一种实施方式中，将本文所述表达CAR的细胞与蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂(例如，本文所述蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂)联合施用给受试者。在一种实施方式中，蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂为SHP-1抑制剂，例如本文所述SHP-1抑制剂，比如例如葡萄糖酸锑钠。在一种实施方式中，蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂为SHP-2抑制剂，例如本文所述SHP-2抑制剂。
在一种实施方式中，可以把本文所述表达CAR的细胞与激酶抑制剂联合使用。在一种实施方式中，激酶抑制剂为CDK4抑制剂，例如本文所述CDK4抑制剂，例如CDK4/6抑制剂，比如例如6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮盐酸盐(也称为palbociclib或PD0332991)。在一种实施方式中，激酶抑制剂为BTK抑制剂，例如本文所述BTK抑制剂，比如例如ibrutinib。在一种实施方式中，激酶抑制剂为mTOR抑制剂，例如本文所述mTOR抑制剂，比如例如雷帕霉素、雷帕霉素类似物、OSI-027。mTOR抑制剂可以为例如mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂，例如本文所述mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂。在一种实施方式中，激酶抑制剂为MNK抑制剂，例如本文所述MNK抑制剂，比如例如4-氨基-5-(4-氟苯氨基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。MNK抑制剂可以为例如MNK1a、MNK1b、MNK2a和/或MNK2b抑制剂。在一种实施方式中，激酶抑制剂为本文所述双重PI3K/mTOR抑制剂，比如例如PF-04695102。在一种实施方式中，激酶抑制剂为DGK抑制剂，例如本文所述DGK抑制剂，比如例如DGKinh1(D5919)或DGKinh2(D5794)。
在一种实施方式中，激酶抑制剂为CDK4抑制剂，选自阿洛新A(aloisine A)；夫拉平度(flavopiridol)或HMR-1275,2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(3S,4R)-3-羟基-1-甲基4-哌啶基]-4-色酮(chromenone)；crizotinib(PF-02341066；2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(2R,3S)-2-(羟基甲基)-1-甲基-3-吡咯烷基]-4H-1-苯并吡喃-4-酮盐酸盐(P276-00)；1-甲基-5-[[2-[5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基]-4-吡啶基]氧基]-N-[4-(三氟甲基)苯基]-1H-苯并咪唑-2-胺(RAF265)；indisulam(E7070)；roscovitine(CYC202)；palbociclib(PD0332991)；dinaciclib(SCH727965)；N-[5-[[(5-叔丁基
Figure GDA0003963633350001371
唑-2-基)甲基]硫代]噻唑-2-基]哌啶-4-甲酰胺(BMS 387032)；4-[[9-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5H-嘧啶并[5,4-d][2]苯并氮杂
Figure GDA0003963633350001372
-2-基]氨基]-苯甲酸(MLN8054)；5-[3-(4,6-二氟-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吲唑-5-基]-N-乙基-4-甲基-3-吡啶甲胺(AG-024322)；4-(2,6-二氯苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-羧酸N-(哌啶-4-基)酰胺(AT7519)；4-[2-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-咪唑-5-基]-N-[4-(甲基磺酰基)苯基]-2-嘧啶胺(AZD5438)；和XL281(BMS908662)。
在一种实施方式中，激酶抑制剂为CDK4抑制剂，例如palbociclib(PD0332991)，并且palbociclib以每日约50mg、60mg、70mg、75mg、80mg、90mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg(例如，75mg、100mg或125mg)的剂量施用一段时间，例如28天周期的第14-21天每日施用，或21天周期的第7-12天每日施用。在一种实施方式中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个周期的palbociclib。
在一种实施方式中，激酶抑制剂为BTK抑制剂，选自ibrutinib(PCI-32765)；GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；和LFM-A13。在一个优选的实施方式中，BTK抑制剂不会降低或抑制白细胞介素-2诱导的激酶(ITK))的激酶活性，并且选自GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；和LFM-A13。
在一种实施方式中，激酶抑制剂为BTK抑制剂，例如ibrutinib(PCI-32765)，并且ibrutinib每日以约250mg、300mg、350mg、400mg、420mg、440mg、460mg、480mg、500mg、520mg、540mg、560mg、580mg、600mg(例如，250mg、420mg或560mg)的剂量施用一段时间，例如21天周期每日施用，或28天周期每日施用。在一种实施方式中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个周期的ibrutinib。
在一种实施方式中，激酶抑制剂为mTOR抑制剂，选自坦罗莫司；雷达罗莫司(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧代-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基亚膦酸酯，也称为AP23573和MK8669；依维莫司(RAD001)；雷帕霉素(AY22989)；simapimod(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基3-吡啶基)-4-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502)；和N2-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)吗啉鎓-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰基甘氨酰基-L-α-天冬氨酰基L-丝氨酸(SEQ ID NO:272)，内盐(SF1126)；和XL765。
在一种实施方式中，激酶抑制剂为mTOR抑制剂，例如雷帕霉素，并且雷帕霉素每日以约3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg(例如6mg)的剂量施用一段时间，例如21天周期每日施用，或28天周期每日施用。在一种实施方式中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个周期的雷帕霉素。在一种实施方式中，激酶抑制剂为mTOR抑制剂，例如依维莫司，并且依维莫司以每日约2mg、2.5mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg(例如，10mg)的剂量施用一段时间，例如28天周期每日施用。在一种实施方式中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个周期的依维莫司。
在一种实施方式中，激酶抑制剂为MNK抑制剂，选自CGP052088；4-氨基-3-(对-氟苯基氨基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶(CGP57380)；cercosporamide；ETC-1780445-2；和4-氨基-5-(4-氟苯氨基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。
在一种实施方式中，激酶抑制剂为双重磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和mTOR抑制剂，其选自2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基3-吡啶基)-4-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF-04691502)；N-[4-[[4-(二甲基氨基)-1-哌啶基]羰基]苯基]-N'-[4-(4,6-二-4-吗啉基-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]脲(PF-05212384,PKI-587)；2-甲基-2-{4-[3-甲基-2-氧代-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氢-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基}丙烷腈(BEZ-235)；apitolisib(GDC-0980,RG7422)；2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺(GSK2126458)；8-(6-甲氧基吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4-(哌嗪-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2(3H)-酮马来酸(NVP-BGT226)；3-[4-(4-吗啉基吡啶并[3',2':4,5]呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基]苯酚(PI-103)；5-(9-异丙基-8-甲基-2-吗琳子基-9H-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺(VS-5584,SB2343)；和N-[2-[(3,5-二甲氧基苯基)氨基]喹喔啉-3-基]-4-[(4-甲基-3-甲氧基苯基)羰基]氨基苯基磺酰胺(XL765)。
也可以使用抑制钙依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶(环胞菌素和FK506)或抑制对于生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶的药物(雷帕霉素)(Liu等人,Cell 66:807-815,1991；Henderson等人,Immun.73:316-321,1991；Bierer等人,Curr.Opin.Immun.5:763-773,1993)。在一个进一步的方面，本发明的细胞组合物可以与下述一起(例如，在其之前、同时或在其之后)施用于患者：骨髓移植、使用化疗剂比如氟达拉滨的T细胞烧蚀疗法、外部-光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺和/或抗体比如OKT3或CAMPATH。在一个方面，本发明的细胞组合物是在B细胞烧蚀疗法比如与CD20反应的作用剂例如Rituxan之后施用的。例如，在一种实施方式中，受试者可以进行用高剂量化疗，接着是周围血液干细胞移植的标准疗法。在某些实施方式中，在移植之后，受试者接受本发明的扩增免疫细胞的输注。在一个另外的实施方案中，在外科手术之前或之后施用扩增的细胞。
在一种实施方式中，可以向受试者施用减轻或改善与施用表达CAR的细胞有关的副作用的作用剂。与施用表达CAR的细胞有关的副作用包括，但不限于CRS和噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(HLH)，也称为巨噬细胞活化综合征(MAS)。CRS的症状包括高烧、恶心、短暂性低血压、缺氧等。CRS可以包括临床组成性体征和症状，比如发热、疲劳、厌食、肌痛、关节疼痛(arthalgias)、恶心、呕吐和头痛。CRS可以包括临床皮肤性体征和症状，比如皮疹。CRS可以包括临床胃肠道体征和症状，比如恶心、呕吐和腹泻。CRS可以包括临床呼吸性体征和症状，比如呼吸急促和低氧血症。CRS可以包括临床心血管体征和症状，比如心动过速、加宽的脉压、低血压、增加的心输出量(早期)和潜在减少的心输出量(晚期)。CRS可以包括临床凝血性体征和症状，比如升高的d-二聚体、具有或不具有出血的低纤维蛋白原血症。CRS可以包括临床肾脏性体征和症状，比如氮血症。CRS可以包括临床肝脏性体征和症状，比如转氨酶升高(transaminitis)和高胆红素血症。CRS可以包括临床神经性体征和症状，比如头痛、精神状态变化、意识错乱、谵忘、找字困难或frank失语症、幻觉、震颤、痴呆(dymetria)、步态改变和发作。
因此，本文所述方法可以包括向受试者施用本文所述表达CAR的细胞，并且进一步施用用于控制因采用表达CAR的细胞治疗而引起的可溶性因子水平升高的一种或多种作用剂。在一种实施方式中，受试者中升高的可溶性因子为IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-6中的一种或多种。在一种实施方式中，受试者中升高的因子为IL-1、GM-CSF、IL-10、IL-8、IL-5和fraktalkine中的一种或多种。因此，施用以治疗该副作用的作用剂可以是中和这些可溶性因子中一种或多种的作用剂。在一种实施方式中，中和一种或多种这些可溶性形式的作用剂是抗体或其抗原结合片段。这样的作用剂的实例包括，但不限于类固醇(例如，皮质类固醇)、TNFα的抑制剂和IL-6的抑制剂。TNFα抑制剂的实例为抗-TNFα抗体分子，比如英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)和戈利木单抗(golimumab)。TNFα抑制剂的另一个实例为融合蛋白，比如依他西普(entanercept)。TNFα的小分子抑制剂包括但不限于黄嘌呤衍生物(例如己酮可可碱)和安非他酮。IL-6抑制剂的实例为抗-IL-6抗体分子或抗-IL-6受体抗体分子，比如tocilizumab(toc)、sarilumab、elsilimomab、CNTO 328、ALD518/BMS-945429,CNTO 136,CPSI-2364,CDP6038,VX30,ARGX-109,FE301和FM101。在一种实施方式中，抗IL-6抗体分子为tocilizumab。基于IL-1R的抑制剂的实例为阿那白滞素(anakinra)。
在某些实施方式中，向受试者施用皮质类固醇，比如例如甲泼尼龙、氢化可的松等。
在某些实施方式中，向受试者施用血管加压剂，比如去甲肾上腺素、多巴胺、去氧肾上腺素、肾上腺素、加压素或其组合。
在一种实施方式中，可以向受试者施用解热剂。在一种实施方式中，可以向受试者施用镇痛剂。
在一种实施方式中，可以向受试者施用增强表达CAR的细胞的活性或适应性的作用剂。例如，在一种实施方式中，作用剂可以为抑制调控或调节(例如抑制)T细胞功能的分子的作用剂。在某些实施方式中，调控或调节T细胞功能的分子为抑制性分子。在某些实施方式中，抑制性分子例如程序化死亡1(PD1)可以降低表达CAR的细胞建立免疫效应物应答的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。抑制，例如通过抑制DNA、RNA或蛋白水平来调控或调节(例如抑制)T细胞功能的分子，可以优化表达CAR的细胞的功能。在实施方案中，作用剂例如如本文所述的抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA；或例如，抑制性蛋白质或系统，例如簇状的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录活化剂如效应物核酸酶(TALEN)、或锌指核酸内切酶(ZFN)，可用于抑制调控或调节(例如抑制)表达CAR的细胞中T-细胞功能的分子。在一种实施方式中，作用剂为shRNA。在一种实施方式中，调控或调节(例如，抑制)T-细胞功能的作用剂在表达CAR的细胞内被抑制。在这些实施方案中，抑制调控或调节(例如，抑制)T-细胞功能的分子表达的dsRNA分子连接至编码CAR的组分(例如所有组分)的核酸。在一种实施方式中，编码抑制调控或调节(例如抑制)T-细胞功能的分子表达的dsRNA分子的核酸分子与启动子有效连接，该启动子例如是H1-或U6-来源的启动子，使得抑制调控或调节(例如抑制)T-细胞功能的分子表达的dsRNA分子被表达，例如，在表达CAR的细胞内表达。参见，例如Tiscornia G.,“Development ofLentiviral Vectors Expressing siRNA,”Chapter 3,in Gene Transfer:Delivery and Expression of DNA and RNA(eds.Friedmann and Rossi).Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,USA,2007；Brummelkamp TR,等人(2002)Science 296:550–553；Miyagishi M,等人(2002)Nat.Biotechnol.19:497–500。在一种实施方式中，编码抑制调控或调节(例如抑制)T-细胞功能的分子表达的dsRNA分子的核酸分子存在于相同的载体上，例如慢病毒载体，其包括编码CAR的组分(例如所有组分)的核酸分子。在这样的一种实施方式中，编码抑制调控或调节(例如抑制)T-细胞功能的分子表达的dsRNA分子的核酸分子位于载体上，例如，慢病毒载体，编码CAR的组分(例如，所有组分)的核酸的5’-或3’-。编码抑制调控或调节(例如抑制)T-细胞功能的分子表达的dsRNA分子的核酸分子可以沿与编码CAR的组分(例如所有组分)的核酸相同或不同的方向转录。在一种实施方式中，编码抑制调节或调控(例如抑制)T-细胞功能的分子表达的dsRNA分子的核酸分子存在于与包括编码CAR的组分(例如所有组分)的核酸分子的载体不同的载体上。在一种实施方式中，编码抑制调控或调节(例如抑制T-细胞功能)的分子表达的dsRNA分子的核酸分子在表达CAR的细胞之内短暂地表达。在一种实施方式中，编码抑制调控或调节(例如抑制T-细胞功能)的分子表达的dsRNA分子的核酸分子被稳定地整合到表达CAR的细胞的基因组中。图47描绘了用于用抑制调控或调节(例如抑制)T-细胞功能的分子表达的dsRNA分子表达CAR的组分(例如所有组分)的载体的实例。
如下提供用于抑制调控或调节(例如抑制)T-细胞功能的分子表达的dsRNA分子的实例，其中所述调控或调节(例如抑制)T-细胞功能的分子为PD-1。
下表15提供了PDCD1(PD1)RNAi作用剂的名称(来源于其在小鼠PDCD1基因序列NM_008798.2中的位点)，以及代表DNA序列的SEQ ID NOs：280-327。有义和反义(AS)序列在该表中都以19mer和21mer序列存在。注意到，位点(PoS，例如176)来源于小鼠PDCD1基因序列NM_008798.2的位置编号。SEQ ID Nos被指示在对应于下列的12个的组中:“有义19”SEQ IDNOS:280-291；“有义21”SEQ ID NOs:292-303；“反义21”SEQ ID NOs:304-315；“反义19”SEQID NOs:316-327。
表15.小鼠PDCD1(PD1)shRNA序列
Figure GDA0003963633350001431
Figure GDA0003963633350001441
Figure GDA0003963633350001451
下表16提供了PDCD1(PD1)RNAi作用剂的名称(来源于其在人类PDCD1基因序列中的位置)，以及代表DNA序列的SEQ ID NOs：323-370。有义(S)和反义(AS)序列以19mer和21mer序列给出。SEQ ID NOs被指示在对应于下列的12个的组中:“有义19”SEQ ID NOS:328-339；“有义21”SEQ ID NOs:340-351；“反义21”SEQ ID NOs:352-363；“反义19”SEQ IDNOs:364-375。
表16.人类PDCD1(PD1)shRNA序列
Figure GDA0003963633350001452
Figure GDA0003963633350001461
Figure GDA0003963633350001471
在一种实施方式中，抑制性信号的抑制剂可以是例如结合抑制性分子的抗体或抗体片段。例如，作用剂可以为结合PD1、PD-L1、PD-L2或CTLA4(例如ipilimumab(也称为MDX-010和MDX-101，且作为
Figure GDA0003963633350001472
销售；Bristol-Myers Squibb；替西木单抗(Tremelimumab)(IgG2单克隆抗体，得自Pfizer，之前被称为ticilimumab，CP-675,206).))的抗体或抗体片段。在一种实施方式中，作用剂是结合TIM3的抗体或抗体片段。在一种实施方式中，作用剂是结合LAG3的抗体或抗体片段。
PD-1为CD28受体家族的抑制性成员，该受体家族也包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1在活化的B细胞、T细胞和骨髓细胞上表达(Agata等人1996 Int.Immunol 8:765-75)。PD-1的两个配体PD-L1和PD-L2已经显示出当结合PD-1时下调T细胞活化(Freeman eta.2000J Exp Med 192:1027-34；Latchman等人2001Nat Immunol 2:261-8；Carter等人2002 Eur J Immunol 32:634-43)。PD-L1在人类癌症中丰富地存在(Dong等人2003 J MolMed 81:281-7；Blank等人2005 Cancer Immunol.Immunother 54:307-314；Konishi等人2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制可以通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用来逆转。抗体、抗体片段及PD-1、PD-L1和PD-l2的其它抑制剂是本领域可获得的，并且可以与本文所述本发明的CAR联合使用。例如，nivolumab(也称为BMS-936558或MDX1106；Bristol-Myers)是一种完全人类IgG4单克隆抗体，其特异性地阻断PD-1。Nivolumab(克隆5C4)及特异性地结合PD-1的其他人类单克隆抗体公开在US 8,008,449和WO2006/121168中。Pidilizumab(CT-011；Cure Tech)是一种结合PD-1的人源化的IgG1k单克隆抗体。Pidilizumab及其它人源化的抗-PD-1单克隆抗体公开在WO2009/101611中。Pembrolizumab(之前称为lambrolizumab，也称为MK03475；Merck)是一种结合PD-1的人源化的IgG4单克隆抗体。pembrolizumab及其它人源化的抗-PD-1抗体公开在US 8,354,509和WO2009/114335中。MEDI4736(Medimmune)是一种人类单克隆抗体，其结合PDL1，并且抑制配体与PD1的相互作用。MDPL3280A(Genentech/Roche)是一种结合PD-L1的人类Fc优化的IgG1单克隆抗体。MDPL3280A及其它针对PD-1的人类单克隆抗体公开在美国专利号：7,943,743和美国公开号∶20120039906中。其它抗-PD-L1结合剂包括YW243.55.S70(重链和轻链可变区显示在WO2010/077634中的SEQ ID NOs 20和21中)和MDX-1 105(也称为BMS-936559，及例如WO2007/005874中公开的抗-PD-L1结合剂)。AMP-224(B7-DCIg；Amplimmune；例如WO2010/027827和WO2011/066342中公开的)是一种阻断PD-1和B7-H1之间的相互作用的PD-L2 Fc融合可溶性受体。其它抗PD-1抗体包括AMP 514(Amplimmune)，尤其例如US 8,609,089、US2010028330和/或US 20120114649中公开的抗-PD-1抗体。
TIM3(T细胞免疫球蛋白-3)也负向调节T细胞功能，特别是在IFN-g-分泌CD4+T辅助因子1和CD8+T细胞毒素1细胞中，并且在T细胞耗尽中起关键作用。抑制TIM3及其配体(例如半乳凝素-9(Gal9)、磷脂酰基丝氨酸(PS)和HMGB1)之间的相互作用可以提高免疫应答。TIM3及其配体的抗体、抗体片段及其它抑制剂是本领域可获得的，并且可以与本文所述CD19 CAR联合使用。例如，靶向TIM3的抗体、抗体片段、小分子或肽抑制剂结合TIM3的IgV结构域，以抑制与其配体的相互作用。抑制TIM3的抗体和肽公开在WO2013/006490和US20100247521中。其它抗-TIM3抗体包括RMT3-23的人源化形式(公开在Ngiow等人,2011,Cancer Res,71:3540-3551中)和克隆8B.2C12(公开在Monney等人,2002,Nature,415:536-541)中。抑制TIM3和PD-1的双特异性抗体公开在US20130156774中。
在其它实施方案中，提高表达CAR的细胞的活性的作用剂是CEACAM抑制剂(例如，CEACAM-1,CEACAM-3和/或CEACAM-5抑制剂)。在一种实施方式中，CEACAM的抑制剂是抗-CEACAM抗体分子。示例性的抗-CEACAM抗体分子被描述在WO 2010/125571、WO 2013/082366、WO 2014/059251和WO 2014/022332中，例如单克隆抗体34B1、26H7和5F4；或其重组形式，如被描述在例如US 2004/0047858、US 7,132,255和WO 99/052552中。在其它实施方案中，抗-CEACAM抗体结合CEACAM-5，如在例如Zheng等人PLoS One.2010Sep 2；5(9).pii:e12529(DOI:10:1371/journal.pone.0021146)中所述，或与CEACAM-1和CEACAM-5交叉反应，如在例如WO 2013/054331和US 2014/0271618中所述。
不希望受到理论的束缚，癌胚抗原细胞粘附分子(CEACAM)比如CEACAM-1和CEACAM-5被认为至少部分地介导、抑制抗肿瘤免疫应答(参见，例如Markel等人JImmunol.2002Mar 15；168(6):2803-10；Markel等人J Immunol.2006Nov 1；177(9):6062-71；Markel等人Immunology.2009Feb；126(2):186-200；Markel等人Cancer ImmunolImmunother.2010Feb；59(2):215-30；Ortenberg等人Mol Cancer Ther.2012Jun；11(6):1300-10；Stern等人J Immunol.2005Jun 1；174(11):6692-701；Zheng等人PLoSOne.2010Sep 2；5(9).pii:e12529)。例如，CEACAM-1已经被描述为TIM-3的异嗜性配体且在TIM-3-介导的T细胞耐受性和耗尽中起作用(参见，例如WO 2014/022332；Huang,等人(2014)Nature doi:10.1038/nature13848)。在实施方案中，在异种移植物结肠直肠癌模型中，CEACAM-1和TIM-3的共同阻断已经显示出增强抗肿瘤免疫应答(参见，例如WO 2014/022332；Huang,等人(2014)，同上)。在其它实施方案中，CEACAM-1和PD-1的共同阻断减低了T细胞耐受性，如例如WO 2014/059251中所述。因此，CEACAM抑制剂可以与本文所述其它免疫调节剂(例如，抗-PD-1和/或抗-TIM-3抑制剂)一起用于增强针对癌症，例如黑色素瘤、肺癌(例如NSCLC)、膀胱癌、结肠癌、卵巢癌及如本文所述的其它癌症的免疫应答。
LAG3(淋巴细胞活化基因-3或CD223)是在活化的T细胞和B细胞上表达的细胞表面分子，其已经显示在CD8+T细胞耗尽中起作用。LAG3及其配体的抗体、抗体片段及其它抑制剂是本领域可获得的，并且可以与本文所述CD19 CAR联合使用。例如，BMS-986016(Bristol-Myers Squib)是一种靶向LAG3的单克隆抗体。IMP701(Immutep)是一种拮抗剂LAG3抗体，并且IMP731(Immutep和GlaxoSmithKline)是一种耗尽LAG3的抗体。其它LAG3抑制剂包括IMP321(Immutep)，其为LAG3和Ig的可溶性部分的重组融合蛋白，其结合II类MHC分子且活化抗原呈递细胞(APC)。其它抗体被公开在例如WO2010/019570中。
在某些实施方式中，提高表达CAR的细胞的活性的作用剂可以是例如包含第一结构域和第二结构域的融合蛋白，其中第一结构域是抑制性分子或其片段，且第二结构域是与正信号缔合的多肽，例如包含如本文所述的胞内信号传导结构域的多肽。在某些实施方式中，与正信号缔合的多肽可以包括CD28、CD27、ICOS的共刺激结构域，例如CD28、CD27和/或ICOS的胞内信号传导结构域，和/或初级信号结构域，例如如本文所述的CD3ζ。在一种实施方式中，融合蛋白由表达CAR的相同细胞表达。在另一种实施方式中，融合蛋白由不表达间皮素CAR的细胞(例如T细胞)表达。
在一种实施方式中，本文所述提高表达CAR的细胞的活性的作用剂为miR-17-92。
与低剂量的mTOR抑制剂联合
在一种实施方式中，将表达CAR分子的细胞(例如本文所述CAR分子)与低的增强免疫的剂量的mTOR抑制剂联合施用。
在一种实施方式中，mTOR抑制剂的剂量与至少5％但不超过90％、至少10％但不超过90％、至少15％但不超过90％、至少20％但不超过90％、至少30％但不超过90％、至少40％但不超过90％、至少50％但不超过90％、至少60％但不超过90％或至少70％但不超过90％的mTOR抑制有关或提供上述mTOR抑制。
在一种实施方式中，mTOR抑制剂的剂量与至少5％但不超过80％、至少10％但不超过80％、至少15％但不超过80％、至少20％但不超过80％、至少30％但不超过80％、至少40％但不超过80％、至少50％但不超过80％或至少60％但不超过80％的mTOR抑制有关或提供上述mTOR抑制。
在一种实施方式中，mTOR抑制剂的剂量与至少5％但不超过70％、至少10％但不超过70％、至少15％但不超过70％、至少20％但不超过70％、至少30％但不超过70％、至少40％但不超过70％或至少50％但不超过70％的mTOR抑制有关或提供上述mTOR抑制。
在一种实施方式中，mTOR抑制剂的剂量与至少5％但不超过60％、至少10％但不超过60％、至少15％但不超过60％、至少20％但不超过60％、至少30％但不超过60％或至少40％但不超过60％的mTOR抑制有关或提供上述mTOR抑制。
在一种实施方式中，mTOR抑制剂的剂量与至少5％但不超过50％、至少10％但不超过50％、至少15％但不超过50％、至少20％但不超过50％、至少30％但不超过50％或至少40％但不超过50％的mTOR抑制有关或提供上述mTOR抑制。
在一种实施方式中，mTOR抑制剂的剂量与至少5％但不超过40％、至少10％但不超过40％、至少15％但不超过40％、至少20％但不超过40％、至少30％但不超过40％、或至少35但不超过40％的mTOR抑制有关或提供上述mTOR抑制。
在一种实施方式中，mTOR抑制剂的剂量与至少5％但不超过30％、至少10％但不超过30％、至少15％但不超过30％、至少20％但不超过30％或至少25％但不超过30％的mTOR抑制有关或提供上述mTOR抑制。
在一种实施方式中，mTOR抑制剂的剂量与至少1％、2％、3％、4％或5％但不超过20％、至少1％、2％、3％、4％或5％但不超过30％、至少1％、2％、3％、4％或5％但不超过35％、至少1％、2％、3％、4％或5％但不超过40％或至少1％、2％、3％、4％或5％但不超过45％的mTOR抑制有关或提供上述mTOR抑制。
在一种实施方式中，mTOR抑制剂的剂量与至少1％、2％、3％、4％或5％但不超过90％的mTOR抑制有关或提供上述mTOR抑制。
如本文所讨论的，mTOR抑制的程度可以表示为P70 S6抑制的程度，例如mTOR抑制的程度可以通过P70 S6活性的降低水平，例如通过P70 S6底物的磷酸化降低来测定。mTOR抑制的水平可以通过本文所述方法来评价，例如通过Boulay试验。
示例性的MTOR抑制剂
正如本文中所使用的那样,术语“mTOR抑制剂”是指在细胞中抑制所述的mTOR激酶的化合物或配体或其药学上可接受的盐。在一种实施方式中，mTOR抑制剂是别构抑制剂。在一种实施方式中，mTOR抑制剂是催化性抑制剂。
别构的mTOR抑制剂包括中性的三环化合物雷帕霉素(西罗莫司)、与雷帕霉素有关的化合物,即与雷帕霉素具有结构和功能相似性的化合物，包括例如,雷帕霉素衍生物、雷帕霉素类似物(也被称为雷帕系物)和抑制mTOR活性的其它大环内酯化合物。
已知雷帕霉素是由吸水链霉菌生产的大环内酯抗生素，其具有式A中所示的结构。
Figure GDA0003963633350001531
参见，例如,McAlpine,J.B.等人,J.Antibiotics(1991)44:688；Schreiber,S.L.等人,J.Am.Chem.Soc.(1991)113:7433；U.S.Patent No.3,929,992。有许多种为雷帕霉素提出的编号方案。为了避免混乱,当本文中给具体的雷帕霉素类似物命名时,参考雷帕霉素，利用式A的编号方案给出名称。
可用于本发明中的雷帕霉素类似物例如是O-取代的类似物，其中雷帕霉素的环己基环上的羟基被OR1替代，其中R1是羟基烷基、羟基烷氧基烷基、酰基氨基烷基或氨基烷基；例如RAD001,也被称为依维莫司,如US 5,665,772和WO94/09010中描述，将其内容并入作为参考。其它合适的雷帕霉素类似物包括在第26-或28-位取代的那些。所述的雷帕霉素类似物可以是前面提到的类似物的差向异构体,特别是在第40,28或26位取代的并且可以任选地进一步被氢化的类似物的差向异构体,例如如US 6,015,815、WO95/14023和WO99/15530中描述的那样，将其内容并入作为参考,例如ABT578也被称为zotarolimus或在US 7,091,213、WO98/02441和WO01/14387中描述的雷帕霉素类似物，将其内容并入作为参考,例如AP23573，也被称为ridaforolimus。
适用于本发明中的来自US 5,665,772的雷帕霉素类似物的例子包括但不限于:40-O-苄基-雷帕霉素,40-O-(4’-羟基甲基)苄基-雷帕霉素,40-O-[4’-(1,2-二羟基乙基)]苄基-雷帕霉素,40-O-烯丙基-雷帕霉素,40-O-[3’-(2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4(S)-基)-丙-2’-烯-1’-基]-雷帕霉素,(2’E,4’S)-40-O-(4’,5’-二羟基戊-2’-烯-1’-基)-雷帕霉素,40-O-(2-羟基)乙氧基羰基甲基-雷帕霉素,40-O-(2-羟基)乙基-雷帕霉素,40-O-(3-羟基)丙基-雷帕霉素,40-O-(6-羟基)己基-雷帕霉素,40-O-[2-(2-羟基)乙氧基]乙基-雷帕霉素,40-O-[(3S)-2,2-二甲基二氧戊环-3-基]甲基-雷帕霉素,40-O-[(2S)-2,3-二羟基丙-1-基]-雷帕霉素,40-O-(2-乙酰氧基)乙基-雷帕霉素,40-O-(2-烟酰氧基)乙基-雷帕霉素,40-O-[2-(N-吗啉代)乙酰氧基]乙基-雷帕霉素,40-O-(2-N-咪唑基乙酰氧基)乙基-雷帕霉素,40-O-[2-(N-甲基-N’-哌嗪基)乙酰氧基]乙基-雷帕霉素,39-O-去甲基-39,40-O,O-亚乙基-雷帕霉素,(26R)-26-二氢-40-O-(2-羟基)乙基-雷帕霉素,40-O-(2-氨基乙基)-雷帕霉素,40-O-(2-乙酰氨基乙基)-雷帕霉素,40-O-(2-烟酰胺基乙基)-雷帕霉素,40-O-(2-(N-甲基-咪唑并-2’-基乙氧甲酰氨基)乙基)-雷帕霉素,40-O-(2-乙氧基羰基氨基乙基)-雷帕霉素,40-O-(2-甲苯磺酰氨基乙基)-雷帕霉素和40-O-[2-(4’,5’-二乙氧羰基-1’,2’,3’-三唑-1’-基)-乙基]-雷帕霉素。
可用于本发明中的其它雷帕霉素类似物是其中雷帕霉素的环己基环上的羟基和/或在第28位的羟基被羟基酯基替代的类似物,例如,在US RE44,768中发现的雷帕霉素类似物,例如坦罗莫司。
可用于本发明中的其它雷帕霉素类似物包括其中在第16位的甲氧基被另一个取代基替代的那些,优选地(任选地羟基取代的)炔基氧基,苄基,正甲氧基苄基或氯代苄基和/或其中在第39位的甲氧基与所述的第39位的碳一起被缺失，使得雷帕霉素的环己基环变成缺少所述的第39位的甲氧基的环戊基环的那些；例如如WO95/16691和WO96/41807中描述的那样，将其内容并入作为参考。可以进一步修饰所述的类似物，使得雷帕霉素第40位的羟基被烷基化和/或所述的第32位的羰基被还原。
来自WO95/16691的雷帕霉素类似物包括但不限于:16-去甲氧基-16-(戊-2-炔基)氧基-雷帕霉素,16-去甲氧基-16-(丁-2-炔基)氧基-雷帕霉素,16-去甲氧基-16-(炔丙基)氧基-雷帕霉素,16-去甲氧基-16-(4-羟基-丁-2-炔基)氧基-雷帕霉素,16-去甲氧基-16-苄基氧基-40-O-(2-羟基乙基)-雷帕霉素,16-去甲氧基-16-苄基氧基-雷帕霉素,16-去甲氧基-16-正-甲氧基苄基-雷帕霉素,16-去甲氧基-40-O-(2-甲氧基乙基)-16-戊-2-炔基)氧基-雷帕霉素,39-去甲氧基-40-脱氧-39-甲酰基-42-去甲-雷帕霉素,39-去甲氧基-40-脱氧-39-羟基甲基-42-去甲-雷帕霉素,39-去甲氧基-40-脱氧-39-羧基-42-去甲-雷帕霉素,39-去甲氧基-40-脱氧-39-(4-甲基-哌嗪-1-基)羰基-42-去甲-雷帕霉素,39-去甲氧基-40-脱氧-39-(吗啉-4-基)羰基-42-去甲-雷帕霉素,39-去甲氧基-40-脱氧-39-[N-甲基,N-(2-吡啶-2-基-乙基)]氨基甲酰基-42-去甲-雷帕霉素和39-去甲氧基-40-脱氧-39-(对-甲苯磺酰基亚肼基甲基)-42-去甲-雷帕霉素。
来自WO96/41807的雷帕霉素类似物包括但不限于:32-脱氧-雷帕霉素,16-O-戊-2-炔基-32-脱氧-雷帕霉素,16-O-戊-2-炔基-32-脱氧-40-O-(2-羟基-乙基)-雷帕霉素,16-O-戊-2-炔基-32-(S)-二氢-40-O-(2-羟基乙基)-雷帕霉素,32(S)-二氢-40-O-(2-甲氧基)乙基-雷帕霉素和32(S)-二氢-40-O-(2-羟基乙基)-雷帕霉素。
另一种合适的雷帕霉素类似物是如US2005/010162 4中描述的umirolimus，将该文献并入本文作为参考。
RAD001,另外被称为依维莫司
Figure GDA0003963633350001551
具有化学名称(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-12-{(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-(2-羟基乙氧基)-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙基}-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-11,36-二氧杂-4-氮杂-三环[30.3.1.04,9]三十六烷-16,24,26,28-四烯-2,3,10,14,20-五酮。
别构的mTOR抑制剂的另外的例子包括西罗莫司(雷帕霉素,AY-22989),40-[3-羟基-2-(羟基甲基)-2-甲基丙酸酯]-雷帕霉素(也被称为坦罗莫司或CCI-779)和ridaforolimus(AP-23573/MK-8669)。其它别构的mTOR抑制剂的例子包括zotarolimus(ABT578)和umirolimus。
备选地或此外,已经发现了催化性的、ATP-竞争性的mTOR抑制剂直接靶向所述的mTOR激酶结构域并且靶向mTORC1和mTORC2两者。这些也是比诸如雷帕霉素的别构的mTOR抑制剂更加有效的mTORC1的抑制剂,因为它们调控雷帕霉素抗性的mTORC1输出，例如4EBP1-T37/46磷酸化和帽依赖性翻译。
催化性抑制剂包括:BEZ235或2-甲基-2-[4-(3-甲基-2-氧代-8-喹啉-3-基-2,3-二氢-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-苯基]-丙腈,或单甲苯磺酸盐形式。BEZ235的合成被描述在WO2006/122806中；CCG168(另外被称为AZD-8055,Chresta,C.M.等人,Cancer Res,2010,70(1),288-298)，它具有化学名称{5-[2,4-双-((S)-3-甲基-吗啉-4-基)-吡啶并[2,3d]嘧啶-7-基]-2-甲氧基-苯基}-甲醇；3-[2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺(WO09104019)；3-(2-氨基苯并[d]噁唑-5-基)-1-异丙基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(WO10051043和WO2013023184)；N-(3-(N-(3-((3,5-二甲氧基苯基)氨基)喹喔啉-2-基)氨磺酰基)苯基)-3-甲氧基-4-甲基苯甲酰胺(WO07044729和WO12006552)；PKI-587(Venkatesan,A.M.,J.Med.Chem.,2010,53,2636-2645)，它具有化学名称1-[4-[4-(二甲基氨基)哌啶-1-羰基]苯基]-3-[4-(4,6-二吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]脲；GSK-2126458(ACS Med.Chem.Lett.,2010,1,39-43)，它具有化学名称2,4-二氟-N-{2-甲氧基-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺；5-(9-异丙基-8-甲基-2-吗啉代-9H-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺(WO10114484)；(E)-N-(8-(6-氨基-5-(三氟甲基)吡啶-3-基)-1-(6-(2-氰基丙烷-2-基)吡啶-3-基)-3-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2(3H)-亚基)氰胺(WO12007926)。
催化性的mTOR抑制剂的进一步例子包括8-(6-甲氧基-吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4-哌嗪-1-基-3-三氟甲基-苯基)-1,3-二氢-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-酮(WO2006/122806)和Ku-0063794(Garcia-Martinez JM等人,Biochem J.,2009,421(1),29-42。Ku-0063794是哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)的特异性的抑制剂)。WYE-354是催化性的mTOR抑制剂的另一个例子(Yu K等人(2009).Biochemical,Cellular,and In vivo Activity of Novel ATP-Competitive and Selective Inhibitors of the Mammalian Target ofRapamycin.Cancer Res.69(15):6232-6240)。
根据本发明，有用的mTOR抑制剂还包括前述任何一种的前药、衍生物、药学上可接受的盐或其类似物。
可以基于本领域中成熟的方法,基于本文中描述的特定剂量,配制mTOR抑制剂,例如RAD001用于递送。特别地，美国专利6,004,973(并入本文作为参考)提供了可以与本文中描述的mTOR抑制剂一起使用的制剂的例子。
对MTOR抑制的评估
mTOR使激酶P70 S6磷酸化,从而活化P70 S6激酶并且允许它把它的底物磷酸化。可以把mTOR抑制的程度表示成P70 S6激酶抑制的程度,例如,通过P70 S6激酶活性减少的水平,例如,通过P70 S6激酶底物磷酸化的减少，可以测定mTOR抑制的程度。通过在不存在抑制剂时(例如,在施用抑制剂之前)，以及在存在抑制剂时，或者在施用抑制剂以后，测定P70 S6激酶活性(P70 S6激酶使底物磷酸化的能力)，可以测定mTOR抑制的水平。P70 S6激酶的抑制水平给出了mTOR抑制的水平。因此,如果P70 S6激酶被抑制了40％,则mTOR活性被抑制了40％,如通过P70 S6激酶活性所测定。本文中所指的抑制程度或水平是所述剂量区间上的平均抑制水平。举例来说,如果每个星期提供一次所述的抑制剂,则抑制水平就是由那个区间(即一个星期)上的平均抑制水平给出的。
Boulay等人,Cancer Res,2004,64:252-61(在此并入作为参考),教导了能够被用于评估mTOR抑制的水平的试验(本文中所称的Boulay试验)。在一种实施方式中,所述的试验依赖于对来自施用mTOR抑制剂(例如,RAD001)前和后的生物样品的P70 S6激酶活性的测定。可以在用mTOR抑制剂处理后在预先选择的时间，例如在处理后24、48和72小时，采集样品。可以使用生物样品,例如来自皮肤或外周血单核细胞(PBMC)。从所述的样品制备总蛋白提取物。利用特异性地识别P70 S6激酶的抗体，通过免疫沉淀，从所述的蛋白提取物中分离P70 S6激酶。可以在体外激酶试验中测定分离的P70 S6激酶的活性。可以把所述分离的激酶与40S核糖体亚基底物(它是P70 S6激酶的内源性底物)和γ-32P在允许磷酸化底物的条件下一起温育。然后可以使反应混合物在SDS-PAGE凝胶上分离,并且利用PhosphoImager分析32P信号。对应于所述40S核糖体亚基的尺寸的32P信号指示磷酸化的底物和P70 S6激酶的活性。激酶活性的增加和减小可以计算如下：把所述磷酸化的底物的32P信号面积和强度定量(例如使用ImageQuant,Molecular Dynamics),给所述定量的信号分配任意单位的值,并且比较来自施用后的值与来自施用前的值或者与参考值比较。例如,可以采用下列公式计算激酶活性的抑制百分数:1-(施用后获得的值/施用前获得的值)X 100。如上所述,本文中所指的抑制程度或水平是所述剂量区间上的平均抑制水平。
在US 7,727,950中还提供了评估激酶活性(例如,P70 S6激酶活性)的方法,在此并入作为参考。
也可以通过PD1阴性的与PD1阳性的T细胞的配给量的变化来评估MTOR抑制的水平。通过本领域已知的方法可以把来自外周血的T细胞鉴定为PD1阴性的或阳性的。
低剂量mTOR抑制剂
本文中描述的方法使用低的增强免疫剂量的mTOR抑制剂、多剂的mTOR抑制剂,例如,别构的mTOR抑制剂,包括雷帕系物例如RAD001。相比之下,完全或接近完全抑制所述的mTOR途径的抑制剂水平是抑制免疫的并且被例如,用来防止器官移植排异。此外,完全抑制mTOR的高剂量的雷帕系物也抑制肿瘤生长并且被用来治疗多种癌症(参见，例如,Antineoplastic effects of mammalian target of rapamycine inhibitors.SalvadoriM.World J Transplant.2012 Oct 24；2(5):74-83；Current and Future TreatmentStrategies for Patients with Advanced Hepatocellular Carcinoma:Role of mTORInhibition.Finn RS.Liver Cancer.2012Nov；1(3-4):247-256；Emerging SignalingPathways in Hepatocellular Carcinoma.Moeini A,CornellàH,Villanueva A.LiverCancer.2012Sep；1(2):83-93；Targeted cancer therapy-Are the days of systemicchemotherapy numbered？Joo WD,Visintin I,Mor G.Maturitas.2013Sep 20.；Role ofnatural and adaptive immunity in renal cell carcinoma response to VEGFR-TKIsand mTOR inhibitor.Santoni M,Berardi R,Amantini C,Burattini L,Santini D,Santoni G,Cascinu S.Int J Cancer.2013Oct 2)。
本发明至少部分地基于出人意料的发现:远低于目前临床环境中使用的mTOR抑制剂剂量的多剂的mTOR抑制剂在增加受试者中的免疫应答和增加PD-1阴性的T细胞/PD-1阳性的T细胞的比率方面具有优越的效果。出人意料的是:仅仅产生对mTOR活性的部分抑制的低的多剂的mTOR抑制剂,,能够在人受试者中有效地改善免疫应答并且增加PD-1阴性的T细胞/PD-1阳性的T细胞的比率。
备选地或此外,不希望受任何理论的限制,相信低剂量的、低的增强免疫剂量的mTOR抑制剂能够增加幼稚T细胞的数目,例如,至少短暂地,例如,当与没有治疗的受试者比较时。备选地或另外地,再次尽管不希望受理论的限制,但相信:在足够数量的时间或足够的定量给药之后，采用mTOR抑制剂治疗导致一种或更多种下列结果:
一种或更多种下列标记物表达的增加:CD62L高、CD127高、CD27+和BCL2,例如,在记忆T细胞上,例如,记忆T细胞前体；
KLRG1表达的减少,例如,在记忆T细胞上,例如,记忆T细胞前体；和
记忆T细胞前体数目的增加,例如,具有下列特征中的任何一个或组合的细胞:增加的CD62L高、增加的CD127高、增加的CD27+、减少的KLRG1和增加的BCL2；
并且其中上述变化中的任何一个都发生,例如,至少短暂地,例如,当与没有治疗的受试者比较时(Araki,K等人.(2009)Nature460:108-112)。记忆T细胞前体是处于分化进程早期的记忆T细胞。例如,记忆T细胞具有一个或更多个下列特征:增加的CD62L高、增加的CD127高、增加的CD27+、减少的KLRG1和/或增加的BCL2。
在一种实施方式中,本发明涉及mTOR抑制剂(例如,别构的mTOR抑制剂,例如,雷帕系物,雷帕霉素,或RAD001,或催化性的mTOR抑制剂)的组合物或剂型,当按照选定的定量给药方案施用时，例如每日一次或每星期一次,它与下列相关:mTOR抑制的水平，它不与完全的或显著的免疫抑制相关，但与免疫应答的增强相关。
可以以持续释放的制剂形式提供mTOR抑制剂,例如,别构的mTOR抑制剂,例如雷帕系物、雷帕霉素或RAD001或催化性的mTOR抑制剂。可以以持续释放的制剂形式提供本文中描述的任何组合物或单位剂型。在一些实施方式中，持续释放的制剂将具有比立即释放的制剂更低的生物利用度。例如,在多个实施方式中,为了达到与立即释放的制剂类似的治疗效果，持续释放的制剂将具有在立即释放制剂中提供的抑制剂数量的大约2倍至5倍、大约2.5倍至3.5倍或大约3倍。
在一种实施方式中,提供了立即释放形式,例如,RAD001的立即释放形式,典型地用于每个星期施用一次,其每个单位剂型具有0.1至20、0.5至10、2.5至7.5、3至6或大约5mg。对于每个星期施用一次,这些立即释放制剂对应于分别具有0.3至60、1.5至30、7.5至22.5、9至18或大约15mg的mTOR抑制剂(例如,别构的mTOR抑制剂,例如,雷帕霉素或RAD001)的持续释放形式。在多个实施方式中，这两种形式都是在一次/星期的基础上施用的。
在一种实施方式中,提供了立即释放形式,例如,RAD001的立即释放形式,典型地用于每日施用一次,其每个单位剂型具有0.005至1.5、0.01至1.5、0.1至1.5、0.2至1.5、0.3至1.5、0.4至1.5、0.5至1.5、0.6至1.5、0.7至1.5、0.8至1.5、1.0至1.5、0.3至0.6、或大约0.5mg。对于每日施用一次,这些立即释放形式对应于分别具有0.015至4.5、0.03至4.5、0.3至4.5、0.6至4.5、0.9至4.5、1.2至4.5、1.5至4.5、1.8至4.5、2.1至4.5、2.4至4.5、3.0至4.5、0.9至1.8或大约1.5mg的mTOR抑制剂(例如,别构的mTOR抑制剂,例如雷帕霉素或RAD001)的持续释放形式。对于每个星期施用一次,这些立即释放形式对应于分别具有0.1至30、0.2至30、2至30、4至30、6至30、8至30、10至30、1.2至30、14至30、16至30、20至30、6至12或大约10mg的mTOR抑制剂(例如别构的mTOR抑制剂,例如雷帕霉素或RAD001的持续释放形式)。
在一种实施方式中,提供了立即释放形式,例如RAD001的立即释放形式,典型地用于每日施用一次的,其每个单位剂型具有0.01至1.0mg。对于每日施用一次,这些立即释放剂型对应于分别具有0.03至3mg的mTOR抑制剂(例如,别构的mTOR抑制剂,例如,雷帕霉素或RAD001)的持续释放形式。对于每个星期施用一次,这些立即释放形式对应于分别具有0.2至20mg的mTOR抑制剂(例如,别构的mTOR抑制剂,例如,雷帕霉素或RAD001)的持续释放形式。
在一种实施方式中,提供了立即释放形式,例如RAD001的立即释放形式,典型地用于每个星期施用一次的,其每个单位剂型具有0.5至5.0mg。对于每个星期施用一次,这些立即释放形式对应于分别具有1.5至15mg的mTOR抑制剂(例如,别构的mTOR抑制剂,例如雷帕霉素或RAD001)的持续释放形式。
如上所述,所述的mTOR途径的一个靶是P70 S6激酶。因此,可用于本文中描述的方法和组合物中的mTOR抑制剂的剂量是足以达到相对于在不存在mTOR抑制剂时P70 S6激酶的活性,P70 S6激酶的活性不大于80％抑制的那些剂量，例如,如通过本文中描述的试验(例如,所述的Boulay试验)所测定的。在进一步的方面中,本发明提供了足以达到相对于在不存在mTOR抑制剂时P70 S6激酶的活性,P70 S6激酶的活性不大于38％抑制的mTOR抑制剂的数量。
在一个方面中，可用于本发明的方法和组合物中的mTOR抑制剂的剂量足以达到(例如,当给人受试者施用时)P70 S6激酶活性的90+/-5％(即85-95％)、89+/-5％、88+/-5％、87+/-5％、86+/-5％、85+/-5％、84+/-5％、83+/-5％、82+/-5％、81+/-5％、80+/-5％、79+/-5％、78+/-5％、77+/-5％、76+/-5％、75+/-5％、74+/-5％、73+/-5％、72+/-5％、71+/-5％、70+/-5％、69+/-5％、68+/-5％、67+/-5％、66+/-5％、65+/-5％、64+/-5％、63+/-5％、62+/-5％、61+/-5％、60+/-5％、59+/-5％、58+/-5％、57+/-5％、56+/-5％、55+/-5％、54+/-5％、54+/-5％、53+/-5％、52+/-5％、51+/-5％、50+/-5％、49+/-5％、48+/-5％、47+/-5％、46+/-5％、45+/-5％、44+/-5％、43+/-5％、42+/-5％、41+/-5％、40+/-5％、39+/-5％、38+/-5％、37+/-5％、36+/-5％、35+/-5％、34+/-5％、33+/-5％、32+/-5％、31+/-5％、30+/-5％、29+/-5％、28+/-5％、27+/-5％、26+/-5％、25+/-5％、24+/-5％、23+/-5％、22+/-5％、21+/-5％、20+/-5％、19+/-5％、18+/-5％、17+/-5％、16+/-5％、15+/-5％、14+/-5％、13+/-5％、12+/-5％、11+/-5％或10+/-5％抑制,例如如通过本文中描述的试验(例如所述的Boulay试验)所测定的。
通过使用本领域中已知的方法,例如，举例来说,根据在美国专利7,727,950中描述的方法,通过免疫印迹分析磷P70 S6K水平和/或磷P70S6水平或通过体外激酶活性试验，测定受试者中的P70 S6激酶活性。
如本文中所使用的,术语“大约”关于mTOR抑制剂的剂量时，是指在mTOR抑制剂的数量方面最多+/-10％可变度,但是可以围绕所声明的剂量不包含可变度。
在一些实施方式中，本发明提供了方法，包括以在靶波谷水平内的剂量给受试者施用mTOR抑制剂,例如别构抑制剂,例如,RAD001。在一些实施方式中，所述的波谷水平显著地低于与在器官移植和癌症患者所用的定量给药方案相关的波谷水平。在一种实施方式中，施用mTOR抑制剂(例如,RAD001,或雷帕霉素)，以产生比引起免疫抑制或抗癌效果的波谷水平的1/2、1/4、1/10或1/20低的波谷水平。在一种实施方式中，施用mTOR抑制剂(例如,RAD001,或雷帕霉素)，以产生比用于免疫抑制或抗癌适应症的FDA批准的包装插页上提供的波谷水平的1/2、1/4、1/10或1/20低的波谷水平。
在一种实施方式中，本文中公开的方法包括以提供0.1至10ng/ml、0.1至5ng/ml、0.1至3ng/ml、0.1至2ng/ml或0.1至1ng/ml的靶波谷水平的剂量，给受试者施用mTOR抑制剂,例如别构抑制剂,例如,RAD001。
在一种实施方式中，本文中公开的方法包括以提供0.2至10ng/ml、0.2至5ng/ml、0.2至3ng/ml、0.2至2ng/ml或0.2至1ng/ml的靶波谷水平的剂量，给受试者施用mTOR抑制剂,例如,别构抑制剂,例如,RAD001。
在一种实施方式中，本文中公开的方法包括以提供0.3至10ng/ml、0.3至5ng/ml、0.3至3ng/ml、0.3至2ng/ml或0.3至1ng/ml的靶波谷水平的剂量，给受试者施用mTOR抑制剂,例如，别构抑制剂,例如,RAD001。
在一种实施方式中，本文中公开的方法包括以提供0.4至10ng/ml、0.4至5ng/ml、0.4至3ng/ml、0.4至2ng/ml或0.4至1ng/ml的靶波谷水平的剂量，给受试者施用mTOR抑制剂,例如,别构抑制剂,例如,RAD001。
在一种实施方式中，本文中公开的方法包括以提供0.5至10ng/ml、0.5至5ng/ml、0.5至3ng/ml、0.5至2ng/ml或0.5至1ng/ml的靶波谷水平的剂量，给受试者施用mTOR抑制剂,例如,别构抑制剂,例如,RAD001。
在一种实施方式中，本文中公开的方法包括以提供1至10ng/ml、1至5ng/ml、1至3ng/ml或1至2ng/ml的靶波谷水平的剂量，给受试者施用mTOR抑制剂,例如,别构抑制剂,例如,RAD001。
如本文中所使用的,术语“波谷水平”是指刚好在下一剂之前血浆中的药物浓度,或两剂之间最低的药物浓度。
在一些实施方式中，RAD001的靶波谷水平在大约0.1和4.9ng/ml之间的范围内。在一种实施方式中,所述的靶波谷水平低于3ng/ml,例如,在0.3或更小和3ng/ml之间。在一种实施方式中,所述的靶波谷水平低于3ng/ml,例如,在0.3或更小和1ng/ml之间。
在进一步的方面中,本发明可以以与生物等效于RAD001的所规定的靶波谷水平相关的靶数量，利用除RAD001以外的mTOR抑制剂。在一种实施方式中,所述的除RAD001以外的mTOR抑制剂的靶波谷水平是提供与本文中描述的RAD001波谷水平相同的mTOR抑制水平的水平(例如如通过本文中描述的方法所测定的,例如P70 S6的抑制)。
药物组合物:mTOR抑制剂
在一个方面中，本发明涉及包含mTOR抑制剂(例如,如本文中描述的mTOR抑制剂)的药物组合物,其被配制用于与本文中描述的CAR细胞联合使用。
在一些实施方式中，所述的mTOR抑制剂被配制用于与另外一种抑制剂联合施用,例如正如本文中描述的抑制剂。
一般来说,本发明的化合物将会经由本领域中已知的通常的和可接受的任何方式，单独地或与一种或更多种治疗剂联合，以如上所述的治疗有效量被施用。
使用常规的溶解和混合方法可以制备药物制剂。例如,在本文中描述的一种或更多种赋形剂的存在下，把原料药物质(例如mTOR抑制剂或所述化合物的稳定化形式(例如与环糊精或其它已知的络合剂的络合物)溶解在合适的溶剂中。典型地把所述的mTOR抑制剂配制成药物剂型以提供容易控制的药物剂量并且为患者提供简洁并且易于操作的产品。
本发明的化合物可以通过常规方式,特别是肠内方式,例如口服方式,例如,以片剂或胶囊方式,或以肠胃外方式,例如,以可注射的溶液或混悬剂形式,以局部方式,例如,以洗剂、凝胶剂、油膏或乳膏形式,或以鼻剂或栓剂形式，以药物组合物形式施用。在一个方面中，当与另一种如本文中描述的作用剂联合(同时或分开)来施用mTOR抑制剂时,可以通过相同的途径(例如肠胃外方式)施用这两种组分。备选地,相对于所述的mTOR抑制剂，通过不同的途径施用另一种作用剂。例如,可以口服施用mTOR抑制剂并且以肠胃外方式施用另一种作用剂。
持续释放
可以以包含本文中公开的mTOR抑制剂(例如,雷帕霉素或RAD001)的药物制剂形式，以口服固体剂型的形式提供本文中公开的mTOR抑制剂,例如,别构的mTOR抑制剂或催化性的mTOR抑制剂,这些形式满足对所述立即释放(IR)片剂的产品稳定性要求并且/或具有有利的药代动力学性质,例如降低的平均血浆峰值浓度、患者间和患者内药物吸收度和血浆峰值浓度的降低的可变度、降低的C最大/C最小比值和/或减小的食物影响。提供的药物制剂可以允许更加精确的剂量调整和/或减少不利事件的频度，因此，采用本文中公开的mTOR抑制剂(例如,雷帕霉素或RAD001)，为患者提供了更加安全的治疗。
在一些实施方式中，本公开提供了本文中公开的mTOR抑制剂(例如,雷帕霉素或RAD001)的稳定的延长释放的制剂,它们是多颗粒的系统并且可以具有功能层和包衣。
如本文中所使用的术语“延长释放的、多颗粒的制剂”是指使得本文中公开的mTOR抑制剂(例如,雷帕霉素或RAD001)能够在延长的时间段上，例如在至少1,2,3,4,5或6小时上释放的制剂。所述延长释放的制剂可以包含基质和由特殊的赋形剂制成的包衣,例如正如本文中描述的那样,以一种方式配制所述的制剂，以便摄入后活性成分在延长的时间段上可以被利用。
术语“延长的释放”可以与术语“持续释放”(SR)或“持久的释放”互换使用。按照欧洲药典(第7版)关于片剂和胶囊剂的专论以及USP关于药物剂型的总章<1151>中的定义，术语“延长的释放”涉及在口服给药后不立即释放活性的药物物质而是在延长的时间上释放的药物制剂。按照“Guidance for Industry:“Dissolution Testing of ImmediateRelease Solid Oral Dosage Forms”(FDA CDER,1997)的定义，如本文中所使用的术语“立即释放”(IR)是指在少于60分钟内释放85％的活性药物物质的药物制剂。在一些实施方式中，术语“立即释放”意指依维莫司在30分钟的时间内被从片剂中释放,例如如本文中描述的溶解试验中所测量的那样。
可以利用本领域中已知的试验(例如如本文中描述的溶解试验)，通过体外释放分布图，来表征本文中公开的mTOR抑制剂(例如,雷帕霉素或RAD001)的稳定的延长释放的制剂:溶解容器装有处于37℃ pH6.8含有0.2％十二烷基硫酸钠的900mL磷酸盐缓冲液。分别根据USP试验专论711以及欧洲药典试验专论2.9.3.，采用桨法在75rpm下进行溶解。
在一些实施方式中，在所述的体外释放试验中，本文中公开的mTOR抑制剂(例如,雷帕霉素或RAD001)的稳定的延长的释放制剂按照下列释放规格释放所述的mTOR抑制剂:
0.5h:<45％,或<40,例如<30％
1h:20-80％,例如30-60％
2h:>50％,或>70％,例如>75％
3h:>60％,或>65％,例如>85％,例如>90％。
在一些实施方式中，在所述的体外溶解试验中，本文中公开的mTOR抑制剂(例如,雷帕霉素或RAD001)的稳定的延长的释放制剂释放50％所述的mTOR抑制剂不早于45,60,75,90,105分钟或120分钟。
药物组合物和治疗
本发明的药物组合物可以包含与一种或多种药学上可接受的或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合的表达CAR的细胞,例如,许多表达CAR的细胞(正如本文中描述的那样)。这样的组合物可以包含缓冲液例如中性的缓冲盐水、磷酸缓冲盐水以及诸如此类；碳水化合物例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。在一个方面中，把本发明的组合物配制成用于静脉内施用。
可以以合适的方式把本发明的药物组合物施用到将要被治疗(或预防)的疾病。施用的数量和频度将由这样的因素决定，如患者的状况以及患者的疾病类型和严重程度,然而合适的剂量可以由临床试验来确定。
在一种实施方式中,所述的药物组合物基本上不含有污染物,例如,没有可检测到的水平的污染物,例如,该污染物选自由下列组成的组:内毒素、支原体、有复制能力的慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、残留的抗CD3/抗CD28包被的珠、小鼠抗体、汇合的人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、包装载体的细胞或质粒组件、细菌和真菌。在一种实施方式中,所述的细菌是选自由下列组成的组的至少一种:粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis),白念珠菌(Candida albicans),大肠杆菌(Escherichia coli),流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza),脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides),绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia),和酿脓链球菌A群(Streptococcus pyogenes group A)。
当指示“免疫学上有效量”,“抗癌有效量”,“抑制癌症有效量”或“治疗有效量”时,将要被施用的本发明的组合物的精确数量可以由医师在考虑个体在年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者)的状况的情况下确定。一般地可以声明:可以以104至109个细胞/kg体重(在一些实例中105至106个细胞/kg体重,包括这些范围内所有的整数值)的剂量，施用包含本文中描述的免疫效应细胞的药物组合物。也可以以这些剂量多次施用所述的免疫效应细胞组合物。可以通过免疫疗法中通常已知的输注技术来施用所述的细胞(参见，例如,Rosenberg等人,New Eng.J.of Med.319:1676,1988)。
在某些方面中,可能希望的是:给受试者施用活化的免疫效应细胞，然后随后再次抽血(或者进行单采血液成分术),按照本发明活化从中得到的细胞,并且再给所述的患者输注这些活化的并且扩增的细胞。每隔几个星期可以进行这种方法多次。在某些方面中,可以从10cc至400cc的抽血中活化所述的细胞。在某些方面中,从20cc,30cc,40cc,50cc,60cc,70cc,80cc,90cc,或100cc的抽血中活化所述的细胞。
所述主题组合物的施用可以以常规方式进行,包括通过气雾剂吸入、注射、摄入、输液、植入或移植。可以以下列方式给患者施用本文中描述的组合物:经动脉方式,皮下方式,皮内方式,肿瘤内方式,节内方式,髓内,肌肉内方式,通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内方式。在一个方面中，通过皮内或皮下注射给患者施用本发明所述的T细胞组合物。在一个方面中，通过静脉内注射施用本发明所述的免疫效应细胞组合物。可以把所述的免疫效应细胞组合物直接注射到肿瘤、淋巴结或感染位点。
在一种特定的示例性的方面中,受试者可以经受白细胞去除术,其中将白细胞收集，富集或离体耗尽以选择和/或分离目的细胞,例如,T细胞。可以通过本领域中已知的方法把这些T细胞分离物扩增和处理，使得可以引入本发明的一种或更多种CAR构建体,从而创造本发明的CAR T细胞。需要其的受试者随后可以经受采用高剂量化疗然后外周血干细胞移植的标准治疗。在某些方面中,在所述的移植之后或与所述的移植同时，受试者接受本发明所述的扩增的CAR细胞的输注。在另外一个方面中,在外科手术之前和之后，施用所述的扩增的细胞。
上述将要给患者施用的治疗的剂量将会随被治疗的状况的精确性质和所述治疗的接受者而变化。可以根据本领域公认的实践进行用于人施用的剂量的定标。例如,对于成年患者，CAMPATH剂量一般将会在1至大约100mg的范围,通常每日施用，持续1至30天的一段时间。优选的每日剂量是1至10mg/天，然而在一些实例中，可以使用最多40mg/天的更大剂量(在美国专利号6,120,766中描述的)。
在一种实施方式中,把所述的CAR引入到免疫效应细胞中,例如利用体外转录,并且所述的受试者(例如人)接受本发明的表达CAR的细胞的初次施用,以及本发明的表达CAR的细胞的一次或更多次随后的施用,其中所述的一次或更多次随后的施用是在先前的施用之后15天以内,例如14,13,12,11,10,9,8,7,6,5,4,3,或2天内被施用的。在一种实施方式中,每个星期给所述的受试者(例如人)超过一次施用本发明的表达CAR的细胞,例如每个星期施用2,3或4次本发明的表达CAR的细胞。在一种实施方式中,每个星期所述的受试者(例如人受试者)接受超过一次表达CAR的细胞的施用(例如每个星期2,3或4次施用)(在本文中也被称为循环),随后一个星期不施用表达CAR的细胞,然后给所述的受试者施用一次或更多次表达CAR的细胞的额外施用(例如每个星期超过一次的表达CAR的细胞的施用)。在另一种实施方式中,所述的受试者(例如人受试者)接受超过一个循环的表达CAR的细胞,并且每个循环之间的时间少于10,9,8,7,6,5,4,或3天。在一种实施方式中,每隔一天施用表达CAR的细胞，每个星期持续3次施用。在一种实施方式中,施用本发明的表达CAR的细胞持续至少2,3,4,5,6,7,8或更多个星期。
在一个方面中，利用慢病毒病毒载体,例如慢病毒来产生表达间皮素CAR的细胞。以这种方式产生的表达CAR的细胞将会具有稳定的CAR表达。
在一个方面中，在转导后，所述表达CAR的细胞短暂地表达CAR载体持续4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15天。CAR的短暂表达可以由RNA CAR载体递送实现。在一个方面中，通过电穿孔把所述的CAR RNA转导到所述的T细胞中。
在一种实施方式中,所述的剂量和/或给药时间表是图6中提供的剂量和/或给药时间表。
可能在利用短暂地表达表达CAR的细胞(特别是采用具有鼠scFv的表达CAR的细胞)治疗的患者中产生的潜在问题是多次治疗后的过敏反应。
不受这个理论的限制,相信这样的过敏反应可能是由正在发展体液抗CAR应答,即具有抗IgE同种型的抗CAR抗体的患者引起的。认为当在暴露于抗原中有10到14天的间断时，患者的产生抗体的细胞发生从IgG同种型(它不引起过敏反应)到IgE同种型的类别转换。
如果在短暂的CAR治疗的过程期间，患者处于产生抗CAR抗体应答(例如通过RNA转导产生的那些)的高风险下,表达CAR的细胞输注间断不应该持续超过10至14天。
利用含有人(而不是鼠)scFv的CAR能够减小患者具有抗CAR应答的可能性和强度。
表1:人scFv和CAR的氨基酸序列(粗下划线是所述的前导序列，而灰色框是接头序列)。在所述scFv的情形中,剩余的氨基酸是重链可变区和轻链可变区,每一个所述的HCCDR(HC CDR1,HC CDR2,HC CDR3)和LC CDR(LC CDR1,LC CDR2,LCCDR3)加了下划线)。在所述CAR的情形中,更多剩余的氨基酸是所述CAR的剩余的氨基酸。)
Figure GDA0003963633350001701
Figure GDA0003963633350001711
Figure GDA0003963633350001721
Figure GDA0003963633350001731
Figure GDA0003963633350001741
Figure GDA0003963633350001751
Figure GDA0003963633350001761
Figure GDA0003963633350001771
Figure GDA0003963633350001781
Figure GDA0003963633350001791
Figure GDA0003963633350001801
表2:编码CAR分子的核酸序列(带下划线的是前导序列)
Figure GDA0003963633350001802
Figure GDA0003963633350001811
Figure GDA0003963633350001821
Figure GDA0003963633350001831
Figure GDA0003963633350001841
Figure GDA0003963633350001851
Figure GDA0003963633350001861
Figure GDA0003963633350001871
Figure GDA0003963633350001881
Figure GDA0003963633350001891
Figure GDA0003963633350001901
Figure GDA0003963633350001911
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Figure GDA0003963633350001931
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Figure GDA0003963633350001971
Figure GDA0003963633350001981
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Figure GDA0003963633350002001
Figure GDA0003963633350002011
Figure GDA0003963633350002021
Figure GDA0003963633350002031
Figure GDA0003963633350002041
Figure GDA0003963633350002051
Figure GDA0003963633350002061
Figure GDA0003963633350002071
Figure GDA0003963633350002081
Figure GDA0003963633350002091
表3.人抗间皮素scFv的重链(HC)CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列
Figure GDA0003963633350002092
Figure GDA0003963633350002101
Figure GDA0003963633350002111
表4.人抗间皮素scFv的轻链(LC)CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列
Figure GDA0003963633350002112
Figure GDA0003963633350002121
Figure GDA0003963633350002131
实施例
通过参考下列实验实施例进一步详细描述本发明。提供这些实施例仅仅是为了举例说明的目的,并不意图是限定性的，除非另有说明。因此,无论如何不应把本发明解释为限定到下列实施例,而是应该把本发明解释成包括任何以及所有的变化，这些变化作为本文中所提供的教导的结果而变成显而易见的。
实施例1:产生CAR构建体
将要被用于最后的CAR构建体中的ScFv源于对人scFV库的淘选。
在上述表1中提供了所述的人scFv片段的氨基酸序列，而在上述表2中提供了所述的人scFv片段的核酸序列。利用表1的scFv片段和下面所示的用来产生完全的CAR构建体的另外的序列：SEQ ID NO:1-2,6-7,9-10,12-13,17-18,20-21,和36-37，产生了完全的CAR构建体。
前导序列(氨基酸序列)(SEQ ID NO:1)
MALPVTALLLPLALLLHAARP
前导序列(核酸序列)(SEQ ID NO:12)
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCC
CD8铰链(氨基酸序列)(SEQ ID NO:2)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
CD8铰链(核酸序列)(SEQ ID NO:13)
ACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATCD8跨膜(氨基酸序列)(SEQ ID NO:6)
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
CD8跨膜(核酸序列)(SEQ ID NO:17)
ATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGT4-1BB细胞内结构域(氨基酸序列)(SEQ ID NO:7)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
4-1BB细胞内结构域(核酸序列)(SEQ ID NO:18)
AAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCD3ζ结构域(氨基酸序列)(SEQ ID NO:9)
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CD3ζ(核酸序列)(SEQ ID NO:20)
CGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG CD3ζ结构域(氨基酸序列；NCBI参考序列NM_000734.3)(SEQ ID NO:10)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CD3ζ(核酸序列；NCBI参考序列NM_000734.3)；(SEQ ID NO:21)
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
IgG4铰链(氨基酸序列)(SEQ ID NO:36)
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM
IgG4铰链(核苷酸序列)(SEQ ID NO:37)
GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG
这些克隆都含有在源于CD3ζ链的共刺激结构域的信号结构域中的Q/K残基变化。
然后把所述的CAR scFv片段克隆到慢病毒载体中而在单一的编码框中产生一个全长CAR构建体,并且使用所述的EF1α启动子用于表达(SEQ ID NO:11)。
EF1α启动子
CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA(SEQ ID NO:11).
Gly/Ser(SEQ ID NO:25)
GGGGS
Gly/Ser(SEQ ID NO:26):这个序列可以包含1-6"Gly Gly Gly Gly Ser"重复单元
GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS
Gly/Ser(SEQ ID NO:27)
GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS
Gly/Ser(SEQ ID NO:28)
GGGGSGGGGS GGGGS
Gly/Ser(SEQ ID NO:29)
GGGS
聚腺苷酸(SEQ ID NO:30)
这个序列可以包含50-5000个腺嘌呤。
Figure GDA0003963633350002181
Figure GDA0003963633350002191
聚腺苷酸(SEQ ID NO:31)
Figure GDA0003963633350002201
聚腺苷酸(SEQ ID NO:32)
这个序列可以包含50-5000个胸腺嘧啶。
Figure GDA0003963633350002202
Figure GDA0003963633350002211
聚腺苷酸(SEQ ID NO:33)
这个序列可以包含100-5000个腺嘌呤。
Figure GDA0003963633350002212
Figure GDA0003963633350002221
Figure GDA0003963633350002231
PolyA(SEQ ID NO:34)
Figure GDA0003963633350002232
PolyA(SEQ ID NO:35)
Figure GDA0003963633350002233
Gly/Ser(SEQ ID NO:38):这个序列可以包含1-10个"Gly Gly Gly Ser"重复单元
GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS
实施例2:用于CAR疗法的人抗间皮素scFv构建体的表达和表征
进行了另外的分析来表征所述的人抗间皮素scFv构建体,例如质谱分析、大小排阻层析和表面等离振子共振(SPR)。通过SPR测定了所述间皮素的细胞外结构域上的结合亲和性和表位结合(与SS1表位相比)。下面描述这些试验和从这种分析获得的结果。
scFv候选者和生物素化的人间皮素的表达
为了评估通过噬菌体淘选鉴定的人抗间皮素scFv的结合和生物物理特征,从HEK293F细胞以及人间皮素细胞外结构域(人MSLN ECD)短暂地生产和纯化scFv构建体。还生产了SS1 scFv(它是鼠抗间皮素scFv)作为参考。所测试的人抗间皮素scFv是M5,M11,M12,M14,M16,M17,M21和M23(参见表13)。在外部合成了编码M5(SEQ ID NO:43),M11(SEQID NO:49),M12(SEQ ID NO:50),M14(SEQ ID NO:52),M16(SEQ ID NO:54),M17(SEQ IDNO:55),M21(SEQ ID NO:59),M23(SEQ ID NO:61)和SS1(SEQ ID NO:275)以及人MSLN ECD(SEQ ID NO:276)的scFv构建体的氨基酸的质粒。采用所述构建体的C-端上的7x或8xHis标记生产了ScFv。所述的人scFv构建体(M5,M11,M12,M14,M16,M17,M21,和M23)具有短的接头序列，该接头序列包含把所述scFv的C-端连接到8xHis标记的N-端的序列GS,例如,GSHHHHHHHH(SEQ ID NO:277)。生产了具有C-端Avi-标记(SEQ ID NO:276)的人间皮素ECD，并且采用来自Avidity,LLC的BirA酶在体外进行位点选择性地生物素化。采用标准的方法进行HEK293F细胞的短暂表达和纯化。简单来说，对于scFv,采用100μg质粒和300μg聚乙烯亚胺对100ml 3x106个细胞/ml的HEK293F细胞进行转染。在37℃将所述细胞与8％ CO2一起温育并且使其以80rpm旋转。6天以后,通过在3500g下离心20分钟收获所述的细胞。通过使所述的scFv与200μl Ni-NTA琼脂糖珠(Qiagen)在4℃结合过夜来纯化上清液。用200μl300mM咪唑洗脱所述的蛋白质,并且对着磷酸缓冲盐水进行透析。
下面提供了具有His标记的所述SS1 scFv的序列:
QVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWIGLITPYNGASSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYFCARGGYDGRGFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSVEAEDDATYYCQQWSGYPLTFGAGTKLEIEFGSHHHHHHH(SEQ ID NO:275)
下面提供了具有所述的C-端Avi-标记的所述人间皮素ECD的序列:
DAAQPAASEVEKTACPSGKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMSPEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVLPLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGTRGSHHHHHHEFRHDSGLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO:276)
质谱分析
为了证实身份,采用与质谱仪偶联的高效液相层析(HPLC-MS)分析了纯化的scFv。把1μg每种scFv注射到加热到60℃的Poros R1/10 2.1mm x100mm柱子(LifeTechnologies)上。在Waters BioAcquity UPLC上进行分离。流动相A是0.1％甲酸；流动相B是在25％乙腈、75％异丙醇中的0.1％甲酸。以0.5mL/分钟，使用梯度为25-50％的流动相B在15分钟内洗脱所述的scFv。采用以电喷雾阳离子模式操作的Waters Xevo-T仪器进行质谱检测，扫描范围为600-4000m/z以及锥孔电压坡度为20-50V。使用来自Waters的MaxEnt1算法，在所述质谱峰的宽度上将所得的质谱平均化和去卷积而确定所表达的scFv的质量。
大小排阻层析分析
进行了大小排阻层析以确定所表达的scFv的寡聚状态。把25μg每一种scFv注射到加热到35℃的TSKGel Super SW3000 4.6mm x 300mm柱子上(Tosoh Bioscience)。以0.3mL/分钟在750mM精氨酸,1mM EDTA,20mM磷酸钠,250mM氯化钠,pH 7.2中洗脱所述的scFv；在280nm处监测紫外吸收。
表面等离振子共振(SPR)
在Biacore T200系统上测定了纯化的scFv的结合亲和性。简单来说,以150RU的密度，把重组的人生物素化的间皮素ECD固定在链霉亲和素(SA)传感器芯片表面上。在恒定的流速下，以3倍的连续稀释把纯化的scFv注射到所述的芯片上。监测所述的蛋白质络合物的缔合速率和解离速率分别持续270秒和400秒。对着空白固定的流动池和缓冲液空白，进行双参比。当可能时，采用朗缪尔1:1结合模型测定亲和性,对于其中由于快速的开关速率而导致精确拟合是不可能的那些scFV,使用了稳态模型。
为了确定与SS1相比,每一种所述的scFv的相对结合表位，通过固定在链霉亲和素传感器芯片上的生物素化的间皮素ECD，以180秒的接触时间捕获50nM SS1，产生70RU的相对密度。然后立即以100nM(M5,M11,M12,M14,M16,M17,M21,或M23)把纯化的scFv注射到所述芯片上来使所述的SS1/间皮素络合物的解离最小化。监测所述的二级scFv的结合持续270秒。
结果
通过HPLC-MS测定的所述scFv的观测质量与基于所述氨基酸序列的理论值一致。基于分析型大小排阻层析，表达的scFv范围从43％单体到>98％单体。与对间皮素ECD具有0.1nM的表观亲和力的SS1对照scFV相比，所选定的scFv表现出了从0.9nM到114nM的广泛的亲和性(表13)。SS1,M5,和M11的有代表性的SPR传感图分别被显示在图41A,B和C中。
相对表位划分(图42)表明M12,M14,M16,M17,M21,M23是与SS1竞争的人间皮素的结合剂，而M5和M11显现出与独特的表位结合,正如通过在所述试验中在注射它们时增加的应答所判断的那样。
表13.抗人间皮素scFv的特征
Figure GDA0003963633350002271
1高聚集体含量/低单体％可能由于潜在的亲合力效应而导致不太准确的亲和性测定。
2当可能时,采用1:1结合模型测定亲和性，对于其中准确的拟合由于快速的开关速率而成为不可能的那些scFvs,使用稳态模型。
3没有测定的,低浓度阻止了对单体％的准确测定。
实施例3:含有人scFv的CART的分析和体外活性
把抗MSLN抗体的单链可变片段克隆到具有所述的CD3ζ链和所述的4-1BB共刺激分子的慢病毒CAR表达载体中，并且基于在应答表达MSLN(“MSLN+”)的靶中MSLN CAR转导的T细胞(“CART-MSLN”或“CART-MSLN T细胞”)的效应T细胞应答的数量和品质，选择最优的构建体。效应T细胞应答包括但不限于:细胞的膨胀,增殖,加倍,细胞因子产生和杀死靶细胞或细胞裂解活性(脱粒)。
CART-MSLN的产生
使用所述的编码人scFv的慢病毒转移载体来生产被包装到VSVg假型的慢病毒颗粒中的基因组材料。将慢病毒转移载体DNA与所述VSVg的三个包装组件gag/pol和rev混合,与脂质转染胺试剂联合，将它们一起转染到Lenti-X 293T细胞(Clontech)中。
30小时以后,收集培养基,过滤并且储存在-80℃。通过以来自正常单采血液成分的供体的血液开始来生产治疗性的CART-MSLN，该供体的幼稚T细胞是通过对T细胞,CD4+和CD8+淋巴细胞的阴性选择而获得的。通过CD3x28珠(
Figure GDA0003963633350002281
人T-Exapander CD3/CD28,Invitrogen)以1:3的比例，在RPMI1640、10％热灭活的胎牛血清(FCS)、2mM L-谷氨酰胺、1x青霉素/链霉素、100μM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、10mM Hepes和55μM 2-巯基乙醇)中，在37℃,5％CO2下活化这些细胞。以在24-孔板的每个孔0.5mL培养基中1x106个T细胞培养T细胞。在24小时以后,所述的T细胞正在爆破，加入0.5mL没有浓缩的或较小体积的浓缩的病毒上清液。所述的T细胞开始以对数生长模式分裂,通过测定细胞计数/mL来监测所述的生长模式,并且每两天用新鲜的培养基稀释T细胞。在大约10天以后，当所述的T细胞开始静息下来时,所述的对数生长衰减了。正在减慢的生长速率和T细胞尺寸逼近～300fl的组合确定了T细胞将要被冷藏用于以后分析的状态。
在冷藏之前,通过在FACS-CantoII或FACS Fortessa上的流式细胞计数分析测定被转导的细胞(在所述细胞表面上表达所述间皮素特异性的CAR的)的百分数和它们的那种表达的相对荧光强度。比较来自该FACS的相对荧光强度的直方图显示了被转导的T细胞百分数。所述的病毒转导显示了与转导效率、被转导的细胞百分数相关的可比较的表达水平。所述结果指示:当与所述没有被转导的T细胞(“UTD”)和SS1CART-MSLN相比时，带有所述的人scFv的CAR-MSLN对细胞正常扩增的能力没有能够检测到的负作用。
评估CART-MSLN再定向的T细胞的细胞裂解活性和细胞因子分泌。
为了评估CART-MSLN T细胞杀死和分泌细胞因子的功能性能力,把所述的细胞解冻并且允许其恢复一整夜。除了含有所述人scFv的CART-MSLN以外,还使用含有所述的鼠scFv“SS1”(参见WO2013/040577)的CART-MSLN作为对照。在所有的试验中，使用所述的含有对照SS1 scFV的CART-MSLN(也被称为SS1 CART-MSLN)来比较试验变化和/或用作对照。所述的含有SS1 scFV的CART细胞以及所有其它的含有人scFv的MSLN-CART都是在研究级(即不是临床级)生产条件中被生产的。使用CD19-BBz或Iso1-BBz作为非靶向的CAR，用于背景CART效应。
T细胞杀死被定向于K562——慢性髓细胞性白血病细胞系。通过转导产生K652MSLN+(K562-Meso)细胞。把不表达MSLN的K5652用作对照。对于基于流动的细胞毒性试验,用羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CSFE)给所述的靶细胞染色来定量它们的存在。在10:1、3:1和1:1的效应细胞:靶细胞的滴度比率下，测定了CART-MSLN的细胞裂解活性，其中将效应细胞定义为表达所述的抗MSLN嵌合受体的T细胞。通过使适当数目的T细胞与恒定数目的靶细胞混合来启动试验。在20小时以后,把板离心，移走全部体积的每种混合物。洗涤每个孔中剩余的细胞沉淀并且用活的/死的标记物7AAD给细胞染色。在最后的洗涤以后,把所述沉淀的细胞再悬浮于含有预定数目的计数珠的特定体积中。通过CantoII流式细胞计收集细胞染色数据，并且使用用来定量结果的珠，采用FloJo软件来分析细胞染色数据。
来自20小时基于流动的杀死试验的图，其使用滴定效应子与靶(E:T)的比率，其中效应子CART-MSLN细胞靶向CSFE标记的K562(图3A.不表达MSLN的对照)和K562-Meso(图3B,被转导以表达MSLN的K562细胞)。比较这些杀死曲线,滴定效应子细胞的数量显示，表达MSLN的那些细胞被破坏了。来自同一供体并且被转导了要么含有人scFv的CAR-MSLN细胞要么SS1 CAR-MSLN细胞的T细胞能够选择性地杀死MSLN+靶。所有的CART-MSLN细胞的细胞裂解活性都是相似的并且与所述的鼠SS1 CART-MSLN相当。它们显示所有的CART-MSLN细胞都在转导并且获得杀死表达高水平的间皮素的靶细胞的能力时变成间皮素反应性的。为了测量含有人scFv的CART-MSLN的细胞因子的产生,把细胞解冻并且允许其恢复一整夜。除了所述的人CART-MSLN以外,还使用SS1 CART-MSLN(鼠scFv)用于比较的目的。把CD19-BBz CART用作背景CART细胞的效应的非靶向的对照。在所有的试验中都使用了SS1 CART-MSLN，用来比较试验变化。所述的T细胞被定向于K562,慢性髓细胞性白血病细胞系(MSLN+和MSLN两者),所述的表达MLSN的卵巢癌细胞系Ovcar8,和所述的胰腺癌系SW1990和Panc0203。当通过流式细胞术分析MSLN表达时,与MSLN+K562细胞相比，我们在Ovcar8上检测到低10倍的MSLN的表达；SW1990表达比Ovcar8少10倍。通过流式细胞术不能够在Panc0203上检测到MSLN表达,但通过RNA分析，MSLN表达是阳性的。此外,使用了PMA/离子霉素来评估T细胞应答所述内源性免疫信号的潜力。所述的试验仅仅测试1:1的效应子:靶比率。在把所述的细胞混合以后，运行所述的试验24小时,当移走所述的培养基用于细胞因子分析时，使用所述的IFN-γCBA-Flex试剂盒用于人细胞因子检测。
分析了在暴露于所述的不表达MSLN的对照K562细胞以后，从CART-MSLN细胞产生的细胞因子的背景水平。来自用PMA/离子霉素刺激所述的T细胞的潜在的细胞因子分泌指示:所述的细胞群具有分泌细胞因子的轻微可变的潜力。通过在所述最大释放(PMA/离子霉素)上把所述特异性的IFNγ释放归一化，来处理差别。
数据显示:当与过度表达MSLN的K562一起培养时，大多数含有人scFv的CART-MSLN和所述的鼠SS1 CART-MSLN产生IFNγ。当与内源性地表达MSLN(以较低的水平)的癌细胞一起培养时,只有很少的CART应答(M5,11,14,15,16,17和SS1),而所述的两种CART M5和M11显示了优越的IFNγ水平。内源性MSLN水平越低，它们可能越好地反映间皮素在癌细胞上的天然表达水平,与具有所述的SS1构建体的CART相比，具有那些scFV的那些CART可以具有增强的治疗性应答。
实施例4:慢病毒产生的CART的临床试验
患者将会从患有表达间皮素的癌症(例如重度上皮卵巢癌,恶性胸膜间皮瘤或胰腺癌)的那些患者中选出。
CART-MSLN细胞的生产和释放测试将会在宾夕法尼亚大学通过临床细胞和疫苗生产(CVPF)来进行。将会从所述患者的血液成分单采产品来生产CART-MSLN产品。
在宾夕法尼亚大学血液成分单采中心进行大约10L血液成分单采方法(在第一剂的CAR T细胞之前4个星期)。在这种方法期间，从患者获得了用于CAR T细胞的PBMC。从单一的白细胞单采术出发,目的是要收获至少5x109个白细胞来生产CAR T细胞。也获得了满足FDA回顾要求和用于研究的基线血白细胞并且进行冷藏。预期所述的间皮素修饰的T细胞产品准备在4个星期以后发布。
按照实施例2中描述的方式，利用从每个患者中分离的细胞(即自体的T细胞)制备慢病毒产生的CART。所述的从每个患者的T细胞制备的CART-MSLN表达人scFvs(包括M5和M11)或SS1。
在细胞培养结束时,把所述的细胞冷藏在袋子中难熔的低温培养基中。剂量是:对于第1组，1-5x107个CAR T细胞；对于第2和3组，1-5x108个CAR转导的细胞,计算为在总细胞中2-50％被转导的细胞的范围。含有自体修饰的CAR T细胞产品的袋子将会被储藏在位于宾夕法尼亚大学医院的CVPF的受控并且受监测的冷柜中。输注袋将会被储藏在所述的冷柜中，直到需要时。
每剂将会以一定体积被包装并且冷藏在1个输注袋，所述体积取决于所述的总细胞数目,是所述转导效率的函数；最小体积将会是10mL/袋。每个袋子将包含低温培养基的一份等分试样(体积取决于总的细胞剂量)。
第1组受试者(N＝3-6)将要在第0天接受单一的固定(flat)静脉内剂量的自体1-5x107个CART-MSLN细胞。第2组受试者(N＝3-6)将要在第0天接受单一的固定静脉内剂量的自体的1-5x108个CART-MSLN细胞。第1组和第2组中的受试者在接受CART-MSLN细胞之前将不接受任何消耗淋巴细胞的化疗。第3组(N＝6)将要在接受单一的固定静脉内剂量的自体的1-5x108个CART-MSLN细胞之前2天，以静脉内方式接受1.5g/m2的环磷酰胺。
预期接受环磷酰胺的患者可能经历作为治疗副作用的恶心和呕吐。针对恶心的抗吐预防术前用药法可以根据制度标准在输注化疗药之前被施用。对特定作用剂的选择可以留给研究者考虑,然而皮质类固醇类由于它们的免疫抑制效应不应该被使用。
T细胞输注后的副作用可以包括短暂的发烧,发冷,僵直,肌痛/关节痛,头疼,疲乏,和/或恶心。在CAR T细胞输注之前，将会采用口服650mg对乙酰氨基酚和通过口或静脉内施用苯海拉明盐酸盐对受试者进行术前用药。如果苯海拉明被禁忌,则将施用H2-阻断剂,例如雷尼替丁。根据需要，每6个小时可以重复施用这些药物。如果所述患者持续发烧，没有被对乙酰氨基酚缓解的话，可以开出非类固醇消炎药的疗程。推荐患者不接受全身性皮质类固醇类例如氢化可的松,泼尼松,泼尼松龙(Solu-Medrol),或地塞米松(Decadron)。如果需要皮质类固醇类用于急性输注反应,推荐100mg初始剂量的氢化可的松
一袋CART-MSLN细胞将会由所述研究协调人或CVPF人员放在来自CVPF的干冰上运送到所述CTRC中的患者床边。
转染的T细胞将会由一名CVPF职员在37℃的水浴中在患者的床边解冻。所述的袋子将会被温和地按摩，直到所述的细胞已经刚好解冻为止。如果所述的CAR T细胞产品看起来有损坏或者袋子泄漏或者以其它方式看起来受损坏,就不应该被输注,并且应该按照下列规定被退回到所述的CVPF。
细胞将会在解冻以后趁冷在大约10-15分钟内被输注到所述的受试者。将会以静脉内方式，通过一个具有三通旋塞阀的18标准不含乳胶的Y-型输血套件快速地静脉内输注所转染的T细胞。定量给药将会通过重力输注而发生。如果借助于重力的输注速率太低，则可以经由所述的旋塞阀把所述转染的T细胞药物产品抽到注射器中并且以所需的速率手工输注。不应该有冷冻的团块留在所述的袋子中。
在所述的输注之前,两个人将会在所述的受试者在场时独立地核实每个袋子标签上的信息，并且确认所述信息与所述参与者正确匹配。
在输注所述转染的T细胞期间和以后，将会监测患者。将会在紧接在定量给药之前以及在输注完成后每隔15分钟持续2小时，获得并且记录温度,血压,心率,呼吸速率和脉搏血氧测定值。
在所述的输注期间，在所述的受试者具有过敏性应答或重度低血压危机或对所述输注的任何其它反应的情况下，紧急医疗设备(即救护车)必须可用于紧急情况。
如果在所述的输注后2小时，没有症状发生并且患者的生命体征保持正常,则让所述的受试者回家并且指令其一旦发展任何症状就回到医院。如果生命体征测量值不稳定,就将继续大约每15分钟获得生命体征测量值，直到患者的生命体征稳定或者医师放所述的患者为止。将会要求所述的受试者不要离开，直到医师认为他或她这样做是安全的为止。
在完成转导的CAR T细胞的定量给药后，在60分钟(+5分钟)内，将会获得血液样品用于转导的CAR T细胞数目和细胞因子水平的基线测定。
将会指令受试者在第一次输注后24小时内回到所述的CTRC或Perelman中心，按照所述的SOE进行血液测试和跟踪检查。
对于含有scFv的CART，根据需要可以重复多剂细胞。
将会应用描述统计学来确定所述的CART-MSLN细胞的相对持久性和向血液(以及任选地肿瘤)的转移。将会以图的方式呈现关于在血液中CAR T细胞的数目、HAMA水平和可溶的生物标记物水平的跟踪的数据。将会确定与肿瘤负荷的放射照相测量和其它标准测量的相关性。我们将会计算比例和平均值的95％置信区间。
在所述的规程指定的AE报告期期间，将会收集不利事件并且针对所有的患者进行评估。将会使用国家癌症研究所(NCI)–普通毒性标准(v4)，给AE的严重程度打分。将会描述所有的不利事件，并且既在所有类别上也在主要类别内，产生关于不利事件率的精确的95％置信区间。将会持续地监测所述的数据以获取过多毒性的证据。将结果制表并且概括。
将会把临床应答比率概括在精确的95％置信区间中。使用Kaplan-Meier曲线，将会以图形方式呈列无进展的存活率和总体存活率的分布以及临床应答持续的时间。将会呈列所述的两年存活率。
通过监测患有可测量的疾病的那些受试者中的肿瘤应答比率，将会确定效力的初步证据。将会利用在输注后第28天、第3个和6个月时的放射照相成像(即CT成像)和血清生物标记物，评估肿瘤应答。
根据在实体肿瘤中的应答评估标准(RECIST 1.1)、修改的关于胸膜间皮瘤的RECIST标准和与免疫相关的应答标准(iRRC)，将会测量放射照相应答。
将会根据针对每种疾病的标准评估血清生物标记物应答；另外将要测定所有的受试者的SMRP。例如，将会在施用CAR T细胞之后，监测患有胰腺癌的受试者的CA19-9、CEA和与血清间皮素相关的蛋白质[SMRP])的水平。将会监测患有卵巢癌的受试者的血清CA125以及SMRP的水平。将会测量患有间皮瘤的受试者的血清SMRP水平。在所有的情形中,考虑到CART-MSLN细胞可能影响在这些生物标记物测量中所用的测定，将不把血清生物标记物用作肿瘤应答唯一的测量值。
针对所有的应答比率、无进展的存活率和总体存活率，将会对数据进行描述性的分析。
将会评估PFS和OS，直到输注后2年或直到受试者启动与癌症相关的治疗为止。
将进行安全性评估，包括细胞因子水平的血液监测。将会顺序地登记受试者。将会错开输注以允许在每个组中登记的受试者之间进行28天的安全性评估。
实施例5:关于RNA产生的CART的临床试验
把自体的T细胞工程化以表达细胞外的SS1 CAR构建体，其除了识别上面描述的人4-1BB和CD3ζ信号传导结构域以外，还识别间皮素以及跨膜结构域。参见，例如,WO2013/040577,实施例1.含有CAR的核酸的生产。
如下构建了SS1-CAR。使用相似方法还构建了含有人抗间皮素scFv的CAR。
利用两种不同的质粒来克隆所述的ss1.bbz片段。首先由TranslationalResearch Program(TRP)实验室，从Pastan博士先前公布的构建体(Chowdhury等人,1998)克隆了所述的间皮素scFv片段(ss1)。通过PCR从先前描述的pELNS.CD19-BB-ζ质粒(Milone等人,2009)克隆了所述的人CD8α铰链和跨膜结构域以及41BB和CD3ζ序列。所述铰链、跨膜和细胞内信号传导结构域的序列是本文中公开的。首先在pGEM.GFP.64A载体(由EliGilboa提供并且被描述在Boczkowsk,D等人,2000中)中克隆了所述的ss1.bbz片段。通过在pGEM.GFP.64A)中添加两个3’非翻译区β珠蛋白重复序列和150bp的聚腺苷酸序列(SEQ IDNO:271)(替换所述的64聚腺苷酸序列(SEQ ID NO:273)修饰了这种载体，用于增强的转基因表达(Holtkamp 2006)。通过把来自pGEM的ss1.bbz.2bgUTR.150A片段亚克隆到所述的pDrive载体中，得到了所述的用于临床用途的服从GMP的质粒。所述的pDrive克隆载体(Qiagen)是为通过UA杂交高效克隆PCR产品而设计的。它允许对重组的克隆进行氨苄青霉素和卡那霉素筛选两者,以及伴随着对引物位点以及用于体外转录的T7和SP6启动子的通用测序。首先,通过Hind III和NdeI从pGEM载体切下ss1.bbz.2bgUTR.150A(填充平末端)并且通过KpnI和NotI将其亚克隆到pDrive切口中(填充平末端)。具有正确定向的插入片段是被证实将要产生pDrive.ss1.bbz.2bgUTR.150A的序列。通过采用AhdI和BciVI的双消化使pDrive载体中的氨苄青霉素抗性基因缺失。为了消除从所述CAR ORF内部的内部可读框(ORF)翻译的潜在的反常蛋白质,通过诱变PCR使尺寸大于60bp的所有内部ORF突变,而所述ss1 CAR的ORF保持完整。所产生的质粒被定名为pD-A.ss1.bbz.OF.2bg.150A,如在图1中所显示。
用于引入自体的T细胞中的CAR核酸的生产如下制备。按照CVPF SOP 1188，把最终的pD-A.ss1.bbz.OF.2bg.150A构建体引入OneShot TOP10化学上感受态的大肠杆菌细胞(Invitrogen)中。按照SOP 1191，使用QIAfilter Plasmid Giga DNA分离试剂盒,从两份1.25升含有100μg/ml卡那霉素的LB培养基，产生了以一批制备的最多10mg质粒DNA。在37℃采用SpeI限制酶使1mg DNA一次性线性化一整夜。在使用所述Qiagen Plasmid Maxi试剂盒的大规模纯化之前，通过凝胶电泳证实了线性化。
通过利用所述的mScript mRNA系统，从所述的质粒转录了RNA并且使用所述的RNeasy Maxi试剂盒(Qiagen)进行分离。以0.5mL的等分试样以1mg/mL的浓度，将所述体外转录的RNA冷藏。在70℃在mRNA变性缓冲液(Invitrogen,Carlsbad,CA)中变性15分钟以后，通过1％琼脂糖凝胶电泳分析RNA的质量和数量并且通过紫外分光光度法(OD260/280)定量。
CAR T细胞产品生产
在第一剂的CAR T细胞之前大约4个星期，进行7至12升血液成分单采工序。在这个工序期间，获得了针对CAR T细胞的PBMC。从单一的白细胞单采术出发,目的是要收获至少5x109个白细胞，用来生产CAR T细胞。
通过耗尽单核细胞，经由在所述CaridianBCT Elutra上的对流离心冲洗法,从白细胞单采术产品中富集了CD3+T-细胞，该冲洗法利用单一用途的封闭系统的一次性套件。在第0天,采用抗CD3/CD28单克隆抗体包被的磁珠进行活化来启动所述的T细胞生产工艺,并且在静止的组织培养袋中启动扩增。在第5天,如果需要额外的扩增，将会把细胞转移到WAVE生物反应器中。在所述培养结束时,耗尽了所述磁珠的细胞,洗涤,并且使用所述的Haemonetics Cell Saver系统进行浓缩。在37℃培育所述收获后的细胞一整夜，用于第二天早晨的电穿孔。洗涤细胞并且再悬浮于电穿孔缓冲液(Maxcyte)中,并且加载到所述的Maxcyte加工装置中。采用所述的ss1 RNA把细胞电穿孔,并且允许细胞恢复4小时，然后配制在不熔化的冷藏培养基中。
包装
将会把1x108或1x109±20％个修饰的CAR T细胞提供在保持在湿冰上的静脉内输注袋中。每个袋子将包含低温培养基的等分试样(体积取决于剂量)，其含有下列不熔化级试剂(％v/v):31.25plasmalyte-A、31.25葡萄糖(5％)、0.45NaCl、至多7.50DMSO、1.00右旋糖苷40和5.00人血清白蛋白。可以把袋子冷冻在-135℃。
CAR T细胞产品的稳定性
在电穿孔后，将会把所述的ss1 CAR T细胞冷藏4小时,并且在T细胞生产以后在3个月的窗口期内将其解冻和施用。我们已经证明了在大约第30天时在≤-130℃下，所述冷藏的ss1CAR T细胞的间皮素scFv表达是97.4％,几乎与冷藏时的(96.9％)相同,并且其它冷藏的T细胞产品至少6个月是稳定的。基于锥虫蓝计数，相比于98.7％，解冻后的生存力是75.2％。所述的表达数据表明:最终的产品在为了所述试验而储存期间是稳定的,并且所述用于额外剂量的哨兵瓶应该满足70％生存力和≥20％ CAR表达的释放标准。额外的ss1CAR T细胞瓶将会在冷藏后3,6,9,和12个月被解冻,并且测试生存力和转基因表达以产生进一步的产品稳定性数据。
临床试验工序和结果:按照下列进行给患有恶性胸膜间皮瘤的患者施用的自体的间皮素再定向的T细胞的I期临床试验。可以利用类似的工序用于治疗患有胰腺癌的患者的研究。
剂量
第1组患者(n＝3)将要在第0天利用采用抗间皮素RNA CAR T细胞的单一固定剂量给药，接受1x108的单次输注，并且在第7天接受一次1x109个RNA CAR T细胞的输注,条件是所述患者在第7天输注前满足所述方案规定的安全性评估。
将会给予第2组患者(n＝6)2个循环的修饰的CAR T细胞。一个循环由每隔一天的3次输注(星期一、星期三、星期五)组成。第1循环由在星期一星期三星期五(MWF)(第0,2,4天)给药的3剂1x108个CAR T细胞组成；第2循环由在星期一星期三星期五(MWF)(第7,9,11天)给药的3剂1x109个CAR T细胞组成。
每次输注的靶剂量是1x108个细胞(对于第1组和第1个星期，1剂；对于第2组，多剂)和1x109±20％个细胞(对于第1组和第2个星期，1剂；对于第2组，多剂)。最小可接受剂量是1x108。如果所述的总细胞扩增低于所述总的可接受的细胞剂量,所述的患者可以经历第二次单采血液成分术，试图使更多的细胞扩增并且达到所述总的靶剂量。如果对所述的第二次单采血液成分术有禁忌或者如果所述的第二次单采血液成分术和扩增未能产生最小可接受剂量,所述的剂量将被认为是生产失败。对于第1组患者,尽可能多的间皮素CAR电穿孔的T细胞将会被生产/冷冻以减小在受试者将会遵守延长的第1组方案的情况下他们将会经历第二次白细胞单采术的可能性。
如果超过一个患者产生了来自修饰的CAR T细胞输注的DLT，剂量降低将会发生。在DLT的情况下,我们将会把剂量降低10倍。因此,如果在第1循环期间在108个CAR T细胞时发生毒性,则所有的输注(第1至6剂)将会被减小到107个CAR T细胞。在107个CAR T细胞时，在不能控制毒性的情况下,所述的试验将会被停止。
可能在使用暂时地表达CAR T细胞(特别是采用含有鼠scFv的CART)治疗的患者中产生的潜在的问题是在多次治疗以后的过敏反应。
不受这个理论的限制,相信这样的过敏性应答可能是由患者发生了体液抗CAR应答(即具有抗IgE同种型的抗CAR抗体)引起的。认为当在暴露于抗原中有10-14天的中断时，患者的产生抗体的细胞经历了从IgG同种型(它不引起过敏反应)到IgE同种型的类别转换。因此,对于暂时性CART(例如通过RNA电穿孔产生的那些),CART输注中断应该持续超过10-14天。
此外,使用具有人(而不是鼠)scFv的CAR能够减小患者产生抗CAR应答的可能性和强度。
研究步骤
所述的研究由下列组成:1)筛选阶段,2)由单采血液成分术、CAR T细胞输注、副作用评估和任选的肿瘤活组织检查组成的介入阶段,和3)跟踪访问。
筛选和基线评估
研究者必须向受试者详细地解释所述的研究方案的本质和与所述方案相关的风险。所述的受试者在参与研究之前必须在书面知情同意书上签名和日期。告知同意过程和日期将会被记录在所述患者的医疗记录和所述的CRF上。在进行方案程序之前，必须获得知情同意书。如果在签署所述的知情同意书之前进行了筛选所需的程序，并且所述的程序满足所述方案的时间限度,则该程序可以被用于所述的筛选评估。
所述的筛选程序(不是确定合格性所要求的)将会在第一剂的CAR T细胞的6星期内被完成(除非在所述的SOE中以其它方式注明)。在需要第二次单采血液成分术来使额外的T细胞扩增并且达到所述的靶细胞剂量的情形中,这个时间窗口不会覆盖所有所述的程序。因此,在这种特定的情形中,允许6-8个星期的时间段来进行所述的基线扫描。
筛选程序包括:
知情同意书
确认ECOG性能状态≤1
确定生产效率(对所述最初的2名患者):把血液样品送到所述的CVPF去确定T细胞生产可行性。在大约1个星期内,所述的CVPF将会就所述的受试者PBMC是否可能对于大规模CAR T细胞生产程序足够返回结果。在进行任何额外的研究程序之前，必须知道结果。
完全的医疗史
身体检查，包括生命体征,高度,重量和氧饱和度
伴随的药物的综述
血液学(有差别的WBC,RBC,Hct,Hgb和血小板)
PT和PTT
化学组成(钠,钾,氯化物,碳酸氢盐,脲氮,肌酸酐,葡萄糖,总蛋白,白蛋白,钙,碱性磷酸酶,总胆红素,ALT,AST)
病毒筛选:HIV,HCV,HBV和针对CMV的血清学
自身抗体组:ANA,ESR
尿分析
12导联心电图(ECG)
血清βHCG妊娠(有生育能力的妇女)
肺活量测定和DLCO
具有对比度的肿瘤评估胸部CT扫描,其它放射图评估如临床指示。PET/CT扫描是任选的。
上皮的或混合的(双相的)间皮瘤的病理学证实和由方案特异性的病理学家对间皮素的染色。
白细胞单采术
将会在宾夕法尼亚大学的单采血液成分术中心进行7至12-升单采血液成分术程序(在第一剂的CAR T细胞之前4个星期)。在这个程序期间，获得针对CAR T细胞的PBMC。从单一的白细胞单采术出发,目的是要收获至少5x109个白细胞来生产CAR T细胞。如果所述的收获不成功,患者将会有经历第二次白细胞单采术的选择权。也获得了用于FDA回顾要求和研究的基线血白细胞并且将其冷藏。预期所述的间皮素修饰的T细胞产品准备用于在大约4个星期以后释放。在所述的程序之前，将会对所有的患者进行所述标准的白细胞单采术筛选。
输注前评估(第-3研究日,在第一剂之前)
这个安全性评估包括身体检查(例如生命体征,重量,等),伴随的药疗法的综述,体力状态,化学组成,有微分的CBC,妊娠测试(尿)尿分析,EKG,CXR,和研究血液样本。
CAR T细胞施用
在每种CAR T细胞输注之前，将使患者进行有限的问题定向的PE、不利事件的综述、ECOG体力状态、CBC、化学组成和尿分析。在CAR T细胞输注后第1天(D1,D3,D8和D10)，受试者将会返回到HUP以使其进行有限的问题定向的PE、不利事件的综述、伴随的药疗法、ECOG体力状态、CBC和化学组成。在第7天,第1组患者还将进行EKG。在第14天，第2组患者还将进行CXR和EKG。
将会如上所述那样施用CAR T细胞。在定量给药之前,在所述的输注结束时以及在那以后每15分钟，将会评估受试者的生命体征并且做脉搏血氧测定，持续2小时，并且直到这些是稳定的为止。
输注后的评估
对于第1组的患者，将会在所述第一次输注之后的1小时,4小时,1天和3天以及在所述第二次输注之后的1小时,4小时,1天和3天,7天和14天，监测血液中的细胞因子水平。将会在所述的第一次输注之后，收集血液采集物持续21天，用于植入物植入分析(流式细胞术和RT-PCR)。
对于第2组(以及延长的第1组)患者,将会按照所述的SOE，在每次输注之后1小时以及在额外的时间点监测细胞因子水平。在所述的第一次(第0天)CAR T细胞施用之后，收集所述主要的安全性和植入物植入数据35天。
在所述的CAR T细胞输注以后1天,抽取血液进行流式细胞术和RT-PCR，以评估循环的CAR T细胞。将会把外周血样品加工来分离:a)外周血单核细胞(PBMC)，以评估免疫细胞表型和功能,b)RNA，以定量短期持久性和输注的CAR T细胞的分布，和c)血清，以定量和评估免疫细胞亚组和可溶的免疫和生长因子,评估抗输注的细胞免疫应答的发展,并且进行原阵列分析以评估经由免疫表位扩展的体液抗肿瘤免疫应答的发展。
将会在所述最后一次CAR T细胞输注之后，在第2和3个月(第1组),以及在第2,3和6个月(第2组和延长的第1组)评估受试者，用于如上所述的安全性评估。
肿瘤活组织检查和微型单采血液成分术
对于第2组和延长的第1组:如果肿瘤是能够以可视方式接近的或能够通过影像指引的活组织检查接近的,合格的受试者将经历直接的肿瘤活组织检查或影像指引下的活组织检查，以评估CAR T细胞和间皮素表达的存在。对于第2组受试者，这将要在T细胞输注以后第14天时被计划。将会测定总的浸润肿瘤的淋巴细胞和T细胞亚组以及T细胞抗肿瘤应答的分子标记物的表达的频度。将会把这些与在保存的手术肿瘤样本(如果可获得的话)上的基线值相比。将会给予受试者拒绝肿瘤活组织检查的选择权。也可以呈送腔内流体作为活组织检查。
为了研究目的和为了FDA“回顾”目的，在输注后第21天，做了微型单采血液成分术(2L)，来为CAR T细胞的安全性分析建档。可以采集血液样品代替白细胞单采术。
肿瘤应答评估
对于第1组，将会在所述最后一次CAR T细胞输注之后，在第35天和第2个月，以及对于第2组(和延长的第1组)，在第35天,第2和6个月,或者直到所述的患者要求替代的MPM疗法为止，评估肿瘤应答。将会通过具有对比度的胸部CT扫描和临床指示的其它程序，做肿瘤评估。
可以使用人的含有scFv的CART,使用例如所述CAR构建体M5,M11,M14,M15,M16和M17中的scFv，来做上述实施例。
实施例6:CART-MSLN在实体恶性肿瘤中诱导抗肿瘤活性
这个实施例呈现两例来自正在发生的临床试验的报告，它们指示:靶向间皮素的mRNA CAR T细胞(CART-MSLN)的过继性转移(用间皮素CAR构建体把PBMC电穿孔)是可行的和安全的，没有对正常组织的脱离肿瘤上靶毒性的明显证据。这些病例也证明:CART-MSLN能够浸润并且在实体恶性肿瘤(例如恶性胸膜间皮瘤(MPM)和胰腺癌)中具有抗肿瘤活性。
受试者17510-105患有MPM，并且被给予3次CARTmeso输注。受试者21211-101患有转移性胰腺癌(PDA)并且通过静脉内输注和2次肿瘤内注射被给予8剂CARTmeso。这两位患者都是老人并且患有晚期化疗难治的癌症，在登记时具有广泛性肿瘤负荷。
CART meso细胞的抗肿瘤临床活性
通过计算断层显像(CT)成像评估了这两个病例的肿瘤应答。此外,通过在输注之前和之后，在正电子发射断层显像/计算机化断层显像(PET/CT)成像上的[18F]2-氟-2-脱氧-D-葡萄糖(FDG)亲合力，评估了所述的PDA患者(图6)。在接受CARTmeso输注以后，所述的MPM患者患有稳定的疾病,然而，在按照计划2接受一次CARTmeso细胞输注以后，发展了被确认的部分应答(图6A)。所述的PDA患者在3个星期的静脉内CARTmeso治疗以后，患有稳定的疾病。通过FDG PET/Ct成像,在所有的疾病部位中看到了所述最大标准化摄取值(SUV最大)的减小。为了促进这种代谢性应答,测定了关于每个疾病部位的平均体积积(MVP平均)的变化(图6B,6C和6D)。仅仅在腹膜病灶中观察到MVP平均的减小。为了进一步了解CARTmeso细胞治疗对腹膜肿瘤负荷的影响,通过流式细胞术分析了腹水。在开始治疗以后第+3和+15天，对所述的腹水的分析显示了共表达间皮素和c-met的肿瘤细胞浓度的40％减少(图6D)。总的来说，这些发现表明CARTmeso细胞输注在这些患者中诱导抗肿瘤效果中的作用。
也评估了在这两位患者中的血清学肿瘤标记物。在CARTmeso细胞输注之前和之后，测定了与血清间皮素相关的肽(SMRP)和CA19-9水平。对于所述的MPM患者,在按照计划2接受第一次输注后，SMRP水平下降了,与通过CT成像看到的肿瘤负荷的减少一致。对于所述的PDA患者,CA19-9水平在治疗过程中缓慢地增加但保持稳定持续1个月。在完成CARTmeso细胞的肿瘤内注射以后,CA19-9水平上升，与疾病进展一致。
CARTmeso细胞的体内持久性和运输
开发了qPCR试验，用来在输注之后检测和定量患者中CARTmeso细胞的持久性。对来自所述的两位患者的外周血、腹水和肿瘤样品的分析被呈现在图7中。紧接在每次输注以后，在这两位患者中检测到CARTmeso转基因。与所述的CARTmeso转基因的可生物降解的本性一致,观察到在连续的日子里水平逐步减小。
通过在系列时间点采集腹水和通过肿瘤活组织检查，在所述的PDA患者中评估了CARTmeso细胞在肿瘤组织中的运输。
在CARTmeso细胞输注以后，体液表位扩展的诱导
测试了所述的假设:CARTmeso细胞,如果能够在体内识别和裂解原发性肿瘤细胞,则可以引发全身性抗肿瘤免疫应答。进行了高通量血清学分析来测量应答抗原的抗体诱导，以检测可能作为肿瘤遭受破坏和表位扩展的结果而发生的多克隆免疫应答的发展。这些分析是使用对将近10,000种独立的人蛋白质的治疗诱导的igG应答的无偏见的询问而完成的。在PDA患者中,在第+44天检测到对超过100种蛋白质的新的抗体应答。类似地,对于所述的MPM患者，观察到对蛋白质亚组的升高的抗体应答。总的来说，在这两位患者中观察到的这些抗体免疫应答与CAR T细胞介导的导致自身蛋白释放的肿瘤破坏一致，所述自身蛋白在经典的表位扩展方法中被交叉呈递。
也使用纯化的来自人MPM或PDA细胞系的与肿瘤相关的蛋白质或蛋白质裂解物，通过免疫印迹检查了这两位患者的治疗前和治疗后血清的抗肿瘤免疫应答的诱导。通过在免疫印迹上新的带的存在或先前存在的带的强度增加定义了抗肿瘤免疫应答(图9)。在这两位患者中，在治疗期间看到了抗体模式变化,例如,检测在同种异体的肿瘤细胞系中存在的蛋白质的抗体的增加。这些发现与所述的原阵列(protoarray)分析一起表明:通过CARTmeso细胞输注诱导了抗肿瘤体液免疫应答。
实施例7:用于改善在实体肿瘤中的CART功能的联合治疗
使用过继性转移的浸润肿瘤性淋巴细胞(TIL)的免疫疗法受限于在实体瘤微环境中T细胞功能性失活。在这个研究中,以静脉内方式把表达mesoCAR的人T细胞注射到有免疫缺陷的小鼠中，该小鼠带有大的已建立的表达人间皮素的间皮瘤侧腹肿瘤。对所述分离的meso-CAR T细胞(mesoCART)的分析显示了效应子功能的快速失去，该效应子功能似乎是多因子的。来自这些实验的所述结果证明:具有引起mesoCART的效应子功能失去的机制的抑制剂可能在用于增强体内mesoCART治疗效力的联合治疗中是有用的。
材料和方法
mesoCAR和慢病毒载体制剂的产生。按照先前所述制备了含有间皮素CAR ss1的慢病毒构建体。也可以使用先前描述的方法产生人间皮素CAR构建体和表达人间皮素CAR构建体的T细胞。
细胞系。使用了源于患者肿瘤的人间皮瘤细胞系–EMP(亲本的)。由于EMP不具有与所述肿瘤相关的抗原(TAA)间皮素的基线表达,给它转染了慢病毒来稳定地表达人间皮素(所述被转导的细胞系被命名为EMMESO)。也转导了细胞来使其稳定地表达萤火虫萤光素酶(称为EMPffluc,EMMESOffluc)。
T细胞效应子试验。把效应T细胞与表达萤火虫萤光素酶的肿瘤细胞以不同的比率共同培养规定长度的时间。在所述的共同培养培养期结束时,保留上清液，用于通过ELISA(酶联免疫吸附测定)分析IFN水平(Biolegend#430106),洗涤孔,并且用1X细胞裂解缓冲液裂解剩余的肿瘤细胞30分钟。使用萤光素酶试验系统，在GloMax Multi Detection System(Promega)上分析所述裂解物中所述的萤光素酶活性。基于在含有肿瘤但不含有T细胞的孔中萤光素酶活性，以杀死百分数的形式报告结果。(杀死％＝100-((来自含有效应子和靶细胞共同培养物的孔的RLU)/(来自含有靶细胞的孔的RLU)x100))。效应子/靶比率代表总的T细胞/靶细胞。
动物。所有的动物实验得到合适的机构动物保护和使用委员会(InstitutionalAnimal Care and Use Committee)的批准。NOD/scid/IL2rγ-/-(NSG)小鼠是在AnimalServices Unit of the Wistar Institute和Children’s Hospital of Philadelphia中饲养的。雌性小鼠在10至16星期龄时被用于实验。
体内异种移植物实验。把5x106个EMMESO肿瘤细胞以X-Vivo培养基(Lonza)和Matrigel(BD Biosciences)的溶液形式注射在NSG小鼠的侧腹内。在建立了肿瘤(100-200mm3)以后,所述的小鼠随机地分配到三个静脉内(尾静脉)治疗组中的一个组中:1)20x106个没有被转导的(NT)T细胞(
Figure GDA0003963633350002461
活化的T细胞),2)20x106个mesoCAR T细胞(被转导了mesoCAR的
Figure GDA0003963633350002462
活化的T细胞)，3)盐水。使用测径器测定了肿瘤并且使用下列公式计算了肿瘤体积:(π/6)*(长度)*(宽度)2。这些组每组包含10只小鼠。重复所述的体内实验三次。
结果
在浸润肿瘤的CART中观察到的机能减退
把所述的表达人间皮素的间皮瘤肿瘤细胞系EMMESO注射到NSG小鼠的侧腹中并且允许其生长到100和200mm3之间的尺寸。在那时,给带有肿瘤的小鼠一次静脉内注射2千万T细胞(mesoCAR表达是大约50％(没有显示数据))。在延迟14天以后，看到了显著的肿瘤生长减慢(图10),然而，与我们采用另一个间皮瘤细胞系所经历的不同(Carpenito等人,ProcNatl Acad Sci USA,106(9):3360-65(2009),Zhao等人,Cancer Res,70(22):9053-61(2010).)，没有注意到肿瘤衰退或治愈。当与所述的盐水治疗的对照(图10)相比时,注射没有被转导的T细胞具有最小的抗肿瘤效果，这表明在用表达mesoCAR的T细胞治疗的动物中观察到的肿瘤生长的减少是由于所述的mesoCAR的结果。
进行了多种分析来了解为什么在CART治疗以后没有观察到肿瘤衰退。检查了EMMESCO肿瘤并且发现mesoCART以很大的数目存在,然而，所述存在的T细胞已经变成机能减退的。考虑到在所述的CAR TIL上CAR表达的水平等于或大于在注射之前所述的细胞的水平(图11A和11B),我们比较了它们的功能性活性。我们在注射以后第40天，分离和分析了来自EMMESO肿瘤的所述mesoCAR TIL(紧接在分离以后，启动了所有的研究)，并且将它们与同一批已经被用于所述的初次注射和冻结(“cryo mesoCAR”)的mesoCAR T细胞进行比较。在解冻并且在37℃/5％CO2温育18小时以后，研究了这些细胞。当把cryo mesoCAR T细胞和侧腹mesoCAR TIL以20:1的比率添加到培养的表达萤火虫萤光素酶(EMMESOffluc)的EMMESO细胞持续18小时时,所述的cryo mesoCAR T细胞在杀死肿瘤细胞方面是高度有效的(>95％),而所述的mesoCAR TIL在该同一时间段上仅仅杀死所述肿瘤细胞的大约10％(图11C,p<0.001)。
额外的分析也证明,在暴露于抗原或PMA/离子霉素以后，所述的mesoCAR T细胞不生产细胞因子,例如IL-2和IFNg。相比之下,所述的cryo meso CAR T细胞产生细胞因子。所述的mesoCAR T细胞也通过在暴露于抗CD3/CD28包被的珠以后20分钟的免疫印迹，通过减小的或缺乏的磷-ERK表达，展示了减小的信号传导。相比之下,cryo meso CAR T细胞在暴露于所述的珠以后保留了磷-ERK表达。
人mesoCAR TIL表达增加的抑制性受体水平
其次,使用流式细胞术，评估了先前已经在从人中分离的机能减退的TIL中描述的四种抑制性受体(IR)的表达，其针对下列:i)被用于注射的cryo mesoCAR T细胞,ii)来自第39天从EMMESO新鲜地分离的mesoCAR TIL,和iii)已经被从所述的肿瘤移走了24小时的“恢复的”mesoCAR TIL(表5)。CAR TIL表达了高水平的抑制性受体。在24小时的远离所述的肿瘤微环境的恢复以后，这些水平一般低得多。对于所述的CD4 CAR TIL,PD-1从73％变为53％,LAG-3从63％变为3％,以及TIM3从24％变为1％。2B4的表达是高的并且在静息以后仍然是升高的(67％变为88％)。对于所述的CD8 CAR TIL,PD-1从26％变为21％,LAG-3从48％变为13％,以及TIM3从56％变为1％。2B4的表达是高的并且在静息以后仍然是升高的(96％变为98％).
表5.在TIL上抑制性受体(IR)的表达
Figure GDA0003963633350002481
也在可能从所述EMMESO小鼠的脾中分离的人T细胞上评估了这些IR中的三种。有趣地,与所述的TIL相比，在所述的脾T细胞上，PD-1、TIM3和LAG3的表达水平全都更低(表6),支持了所述的肿瘤微环境在所述IR的上调中的关键作用。
表6.在TIL和脾细胞上抑制性受体的表达的比较
Figure GDA0003963633350002491
人mesoCAR TIL表达增加的细胞内抑制性酶水平。
使用免疫印迹检查了T细胞功能的两种固有的抑制剂的表达水平，这些抑制剂与TIL机能障碍、SHP-1和DGK有牵连(图12)。与一整夜静息的TIL相比，在从EMMESO侧腹肿瘤中新鲜地分离的mesoCAR TIL中，DGK的两种同种型(α和ζ)以及SHP1的磷酸化形式(pSHP1)的水平显著地升高了。对于DGK，使用流式细胞术也证实了这一点，其中23％的新鲜的EMMESOTIL表达了DGK。在一整夜静息以后，不能检测到表达。
在人mesoCAR T细胞中抑制剂的阻断增强它们的离体杀死功能。
提供了这些表达数据,通过在所述的离体杀死和细胞因子释放试验期间引入可获得的阻断剂，研究了特异性的抑制性途径在mesoCAR TIL中的潜在的功能重要性。添加抗PDL1抗体显著地恢复了所述的mesoCAR TIL的杀死活性和分泌IFN的能力(图14A和14B)。10ug/ml的相对高剂量的抗PDL1抗体是基于先前公布的关于癌症免疫疗法的研究。无论添加I型还是II型DGK抑制剂，都显著地增加了所述的杀死能力(图14C),但是没有显著地增加肿瘤诱导的IFN分泌(图14D)。添加所述的SHP1抑制剂、葡萄糖酸锑钠盐(SSG),轻微地抑制了所述的冷mesoCAR T细胞的杀死能力,但是显著地增加了所述的mesoCAR TIL的杀死能力(图14E),以及显著地增加了mesoCAR TIL的肿瘤诱导的IFN分泌(图14F)。对于这两者DGK抑制剂和对于SSG，做了剂量应答曲线,并且使用了没有诱导直接的肿瘤细胞杀死的最高剂量。
一并考虑,来自这些试验的所述结果证明:体内CART的机能减退是可逆的。具体地,对减小CART功能的抑制剂机制的调控，能够增加效应子功能,并且因此可以增加治疗的效力。为了增加的效力，抑制性受体的抑制剂,例如PD-1,LAG3和TIM3,可用于与CART联合的治疗中。
实施例8:人meso CAR的表征
人CART-MSLN的产生
从血液样品中从分离的正常受试者的PBMC。给PBMC转导含有本文中描述的人间皮素CAR的慢病毒构建体。用来生产CART-MSLN的所述细胞的转导和培养被描述在前述的实施例中。所产生的CART表达具有scFv构建体的间皮素CAR，其包括M1,M2,M3,M4,M5,M6,M7,M8,M9,M10,M11,M12,M13,M14,M15,M16,M17,M18,M19,M20,M21,M22,M23,和M24。也产生了对照CART,其包括表达CAR-ss1(鼠抗间皮素scFv)的CART(用于阳性的对照)和抗CD19 CART(用于阴性的对照)。
细胞因子试验
评估了通过肿瘤细胞刺激以后的细胞因子产生。使表达M5,M11,M17,M21,ss1和CAR19的CART与不同的肿瘤细胞系以1:1的效应子/靶的比率混合,并且以50,000个细胞/孔铺板。所述的肿瘤细胞系是K562-meso(表达间皮素的CML细胞系)、Ovcar3(卵巢癌)、Ovcar8(卵巢癌)和SW1990(胰腺腺癌)。在24小时以后,进行了CBA分析以测定细胞因子表达和/或IFNγ,TNF,IL-2,和IL-4的分泌。
正如在图15A中显示的那样,CART-MSLN21(M21)通过K562-Meso导致最强的活化。通过SW1990刺激CART-MSLN5和CART-MSLN11来生产IFNγ。所述IL-2的产生/分泌类似于所测试的CART-MSLN(图15C)。正如在图15D中显示的那样,几乎没有任何IL-4的产生。其它研究也显示了非常少的IL-10的产生。
杀死试验
也在体外评估了所述的CART-MSLN靶向和杀死肿瘤细胞的能力。使用了基于萤光素酶的试验,采用表达萤光素酶报道基因的肿瘤细胞系。以20,000个靶/孔把靶细胞(肿瘤细胞)铺板。以10:1,5:1,2.5:1和1:1的不同的效应子:靶比率,添加CART-MSLN。培养所述的细胞20小时,并且检测每个孔的发光以确定被杀死的靶细胞的百分数。使用了表达萤光素酶的Ovcar3(卵巢癌)和U87mg(成胶质细胞瘤)细胞系作为靶细胞。
正如在图16A中显示的那样,表达M5,M11,M17和ss1的CART在杀死靶肿瘤细胞方面有类似的好的表现。对于CART-MSLN21，没有观察到杀死。相比之下,对于任何所述的CART构建体，没有观察到对成胶质细胞瘤细胞的杀死(图16B)。对于所述人meso CAR的组,得到了类似的结果，其中M11,M5,M17,和SS1具有对Ovcar3细胞的最高特异性的杀死(图17A和17B)。
体内小鼠模型
在体内在Ovcar8异种移植模型中评估了CART-MSLN的抗肿瘤活性。在第0天，把10x106个Ovcar8细胞以皮下方式植入NSG小鼠中。在第14天,以100l剂量以静脉内方式施用2x106个CART细胞(表达M5,M11,M17,M21,SS1,和CD19的CART,或没有被转导的细胞；10x106个总的T细胞)。在植入肿瘤细胞以后，监测小鼠和肿瘤大约40天。
来自这个实验的结果显示:在这种模型中，表达M5和M11的CART展示了强的抗肿瘤活性(图18)。当与所述的模拟物治疗的组相比时,M5和M11-治疗的小鼠展示了统计学上显著的肿瘤减少(p<0.05)。
进行了第二个体内异种移植实验以评估第二组CART-MSLN细胞的抗肿瘤活性，把10x106个OVCAR8-mcherry细胞注射到NSG小鼠中。一旦肿瘤达到150-250mm2,就把小鼠随机地分到治疗组中。以在100l中10x106个T细胞的剂量注射表达M12,M14,M16,M23,ss1,CD19的CART,或没有处理的细胞。大约40％的T细胞是表达CAR的,因此，以所施用的剂量,大约4x106个CART细胞被递送到每只动物。来自这个实验的结果显示:表达所述的人抗MSLN(M12,M14,M16和M23)的所述CART对肿瘤生长没有影响(图19)。把这些结果与来自评估的所述第一组CART-MSLN的结果结合起来考虑，表明了:与测试的另一种CART-MSLN相比，M5和M11具有特异性的抗肿瘤活性,并且因此证明它们用于进一步研究用于癌症治疗的潜力。此外,在所述的第一个异种移植实验或所述的第二个异种移植实验中,CART-SS1没有展示任何抗肿瘤活性，这进一步表明:含有M5和M11的CART-MSLN在减小肿瘤生长方面是更加有效的。
实施例9:DGK抑制扩大了CART的效力
先前的研究,例如,在实施例6中所论述的实验,已经表明了:CAR T细胞在体内(例如在所述的肿瘤微环境中)随着时间推移而失去效力。具体地,在T细胞输注以后，从肿瘤中分离被注射到肿瘤小鼠模型中的mesoCAR T细胞(例如在输注后第39天,在本文中以后被称为浸润肿瘤的淋巴细胞,TIL)，并且评估它们与新鲜地解冻mesoCAR T细胞相比的功能活性。所述结果显示了:在离体杀死试验和IFNγ释放试验中,从所述的肿瘤分离的所述mesoCAR T细胞在对抗原或CD3/CD28刺激的应答中，具有减小的杀死肿瘤细胞的能力(图20A)、减小的IFNg产生(图20B)和减小的ERK信号传导(正如由蛋白质印迹分析中的磷酸化所显示的那样,图20C),这表明了减小的T细胞活化。
有可能解释所述的体内CAR T细胞活性随着时间推移而减少的抑制性机制包括:可溶的因子(TGFb,PGE2,腺苷,IL10,RAGE配体,等),细胞与细胞接触(PD-1,LAG3,CTLA4,TIM3,CD160,等)和固有的活化诱导的细胞内阴性的反馈系统(甘油二酯激酶:α和同种型,Egr(2和3),SHP-1,NFAT2,BLIMP-1,Itch,GRAIL,Cbl-b,Ikaros,等)。T细胞活化能够诱导因子例如DGK。DGK转而通过磷酸化DAG而抑制DAG信号传导。这限制了DAG诱导的导致T细胞活化的所述RAS-ERK-AP1途径的活化。先前的研究已经显示了:缺乏DGKα或DGK的小鼠产生CD4T细胞，该T细胞展示增强的信号转导和表现得更抗能量诱导的刺激。
体外细胞毒性和细胞因子释放试验
为了研究DGK抑制对CART细胞效力的影响,使用了DGK基因DGKα、DGK或这两者缺失的转基因小鼠。从野生型和缺乏DGK的小鼠中分离了脾T细胞,使用逆转录病毒将其转导以表达mesoCAR(SS1BBZ)。把MIGR1 CAR用作对照。
使用与在先前的实施例中描述的那些方法类似的方法，进行了细胞毒性试验。在各种效应子:靶比率时，培养野生型的和缺乏DGK的(KO)表达mesoCAR的细胞，并且把细胞毒性(靶细胞被杀死的％)定量化(图21)。正如在图21中显示的那样,DGK的缺失显著地增强了CAR T细胞的效应子功能,尤其是在低的效应子:靶比率时。
类似地,检查了在不同的效应子:靶比率下，在18小时以后，在对靶细胞的应答中IFNγ的释放。如图22中所示,发现缺失DGK显著地增强所述的mesoCAR T细胞的效应子功能,尤其是在低的效应子:靶比率时。
与野生型mesoCAR T细胞相比，缺乏DGK的mesoCAR T细胞的蛋白质印迹分析显示了增加的ERK磷酸化(图23),这指示:DGK的存在抑制ERK信号传导,而DGK的缺失导致增加的ERK信号传导。在所述的DGK缺失的背景中ERK信号传导的增加表明:DGK的抑制导致所述的Ras-ERK-AP1途径的活化,以及因此T细胞的活化。
最近的研究已经显示了:TGFβ调控浸润肿瘤的CD8 T细胞的功能，但是干扰RAS/ERK信号转导,通过该相同的信号传导分子，DGK缺乏赋予了扩大的T细胞效应。检查了所述的缺乏DGK的mesoCAR T细胞对TGFβ的敏感性。把WT和缺乏DGK的mesoCAR T细胞与表达间皮素的AE17肿瘤细胞+或–10ng/ml的TGFβ一起培养18小时。测定了这些T细胞的细胞毒性和IFNg产生。正如在图24中显示的那样,TGFβ抑制了WT CAR T细胞的50％杀死(箭头)。然而，在缺失了DGK的CAR T细胞中，没有观察到这种TGFβ诱导的抑制,这表明缺乏DGK的细胞对TGFβ调控不敏感,并且更抗抑制剂刺激例如TGFβ,这可能有助于T细胞活性的增加。
在体内mesoCAR和DGK抑制的治疗效力
其次,在所述DGK受抑制或缺乏的环境中，检查了mesoCAR T细胞的治疗效力。以皮下方式把AE17meso肿瘤细胞(间皮瘤细胞)注射到C57BL/6小鼠中。当肿瘤达到100mm3时(大约一个星期以后),以静脉内方式经由尾静脉注射1千万个mesoCAR T细胞。然后跟踪肿瘤体积至少18天。
与野生型(WT)mesoCAR和没有处理的细胞(图25A)相比，缺乏DGK的mesoCAR T细胞展示了增强的并且延长的抗肿瘤活性。具体地,显示了与WT和没有处理的细胞相比，所述的三种缺乏DGK的mesoCAR T细胞中的每一种在注射以后抑制肿瘤体积的增长长达18天。也在小鼠中显示了与野生型meso CAR T细胞相比，表达mesoCAR的缺乏DGKz的细胞将要更持久并且增殖得更好(图25B)。
一并考虑，这些结果显示:DGK抑制与mesoCAR T细胞治疗联合，能够改善mesoCART细胞的活化和在治疗中的抗肿瘤活性。
实施例10:对Ikaros的抑制扩大了CAR-T细胞的抗肿瘤的能力
在CAR T细胞治疗中的一个主要障碍是T细胞信号传导的固有的负调节剂(例如甘油二酯激酶(DGK))的上调。正如实施例9中描述的那样,已经显示CAR T细胞在体内随着时间推移而失去效力。显示了对T细胞功能的负调节剂(例如DGK)的抑制将要增强表达CAR的T细胞的活性和功能。
T细胞功能的另一种重要的负调节剂是所述的转录因子Ikaros。与主要在邻近的TCR信号传导中发挥作用的DGK不同,Ikaros是锌指DNA结合蛋白质，其通过募集重塑染色质的复合体(例如Sin3A,CtBP,和HDAC)而负调节基因表达。Ikaros在在调节CD4+T细胞和CD8+T细胞中细胞因子产生和细胞溶解功能中发挥作用。
在这个实施例中,在体外和在体内检查了以逆转录病毒转导的具有减小的Ikaros表达的CAR T细胞的抗肿瘤的效力。
材料和方法
细胞系。小鼠AE17间皮瘤细胞被描述在Jackman等人,J Immunol.2003；171:5051-63)中。通过慢病毒转导把人间皮素引入AE17细胞中。3T3Balb/C细胞是从American TypeCulture Collection购买的。通过慢病毒转导所述的具有鼠FAP的FAP-3T3亲本系而产生了表达小鼠FAP的3T3BALB/C(3T3.FAP)细胞。
动物。不含病原体的C57BL/6小鼠是从Charles River Laboratories Inc.(Wilmington,MA)购买的。Ikaros DN+/-小鼠含有一个野生型Ikaros等位基因和一个缺失了DNA结合结构域的Ikaros等位基因(Winandy等人,Cell.1995；83:289-99)。Ikzf1+/-小鼠含有一个野生型Ikaros等位基因和一个缺失了外显子7的等位基因(Avitahl等人,Immunity.1999；10:333-43)。用于所有实验的动物都是在6和12星期龄之间的雌性小鼠，并且被安置在不含病原体的动物设施中。
原发性小鼠T淋巴细胞的分离、转导和扩增。按照生产商(Miltenyi Biotec)建议的方式，使用所述的“泛T细胞阴性筛选”试剂盒分离了原发性鼠脾T细胞,并且使该T细胞在预先包被了-CD3(1g/mL)和-CD28(2g/mL)的24-孔板(在2mL中4×106个细胞/孔，补充100U/mL IL-2的RPMI-1640)中活化。在48小时以后,使细胞(1x106个细胞/孔)与逆转录病毒(1mL粗病毒上清液)在包被了Retronectin(50g/mL；Clontech)的24-孔板中混合，并且在室温下，以1200g无制动地离心45分钟。在培养一整夜以后,用50U/mL的IL-2使细胞额外扩增48小时。
抗原或抗体包被的珠。根据生产商的说明书，使重组的间皮素-细胞外结构域蛋白、牛血清白蛋白(Fisher Scientific)或抗CD3/抗CD28抗体(eBioscience)与甲苯磺酰基活化的4.5m Dyna珠(Invitrogen,#140-13)化学交联。
免疫印迹。把抗间皮素-CAR转导的T细胞与BSA-、间皮素-或抗CD3抗体-包被的珠(以2:1的珠/T细胞比率)一起培养5和20分钟。然后制备了总的细胞裂解物并且针对磷酸化的ERK、磷酸化的AKT、磷酸化的IKK、磷酸化的JNK、磷酸化的Lck、磷酸化的PKC、磷酸化的PLC或磷酸化的ZAP70进行免疫印迹。所有的抗磷酸蛋白抗体是从Cell Signaling购买的,抗磷酸Lck例外,它是从Sigma Aldrich购买的。Ikaros的C-端反应性的山羊抗小鼠抗体(SC-9861)和山羊抗小鼠肌动蛋白抗体(SC-1615)是从Santa Cruz购买的。测定了β-肌动蛋白表达水平来使负载差别归一化。
细胞毒性和IFN酶联免疫吸附测定法。按照所述的(Moon等人,Clinical CancerResearch.2011；17:4719-30)，给AE17、AE17.meso、3T3和3T3.FAP细胞转导萤光素酶。以所指示的比率,以一式三份把T细胞和靶细胞共同培养在96-孔圆底板中。在18小时以后,收集所述的培养上清液，用于使用酶联免疫吸附测定法进行IFN分析(小鼠IFN,BDOpEIA)。通过使用先前描述的试验(Riese等人,Cancer Res.2013；73:3566-77)检测来自所述的细胞裂解物的剩余的萤光素酶活性，测定了转导的T细胞的细胞毒性。
CAR T细胞转移到带有建立的肿瘤的小鼠中。以皮下方式给小鼠注射2×106个AE17.meso肿瘤细胞到C57BL/6小鼠背侧的侧腹中。把含有大的建立的肿瘤(100-150mm3)的小鼠随机地分配以接受野生型CAR T细胞、缺乏Ikaros的CAR T细胞或依然没有被处理的(最小值,5只小鼠/组,每个实验重复至少一次)。通过尾静脉施用1x107个T细胞。分别通过电子尺和测径器测定了肿瘤尺寸。
为了第9天的T细胞活性评估,按照先前描述的那样(Moon等人,Clinical CancerResearch.2014；20(16):4262-73)，把脾和肿瘤加工成单一的细胞悬浮液。在Golgi Stop(BD Biosciences,0.66l/ml)的存在下，用可溶的抗CD3/CD28抗体(1.0g/ml)或用佛波酯/离子霉素(PMA/I:30ng/ml,1uM)把脾细胞和肿瘤的单个细胞悬浮液再刺激4-6小时，然后收获用于流式细胞术分析。
流式细胞术试验。针对抗小鼠IFN-γ(XMG1)、抗小鼠CD25(PC61)、抗小鼠IL-2(JES6-1A12)、抗小鼠CD8(53-6.7)、抗小鼠CD44(IM7)和抗小鼠CD4(GK1.5)的荧光染料缀合的抗体是从Biolegend购买的。可固定的活的/死的Aqua染料(L34957)是从Invitrogen购买的。抗小鼠颗粒酶B(NGZB)和FoxP3(FJK-16s)的荧光染料抗体是从eBioscience购买的。针对抗小鼠TNF-α(MP6-XT22)和抗小鼠CD69(H1.2F3)的荧光染料抗体是从BD Biosciences购买的。为了细胞内细胞因子的着色,用Golgi Stop(BD Biosciences,0.66g/ml)处理细胞4-6小时。在收获之后,用1％低聚甲醛固定细胞30分钟,将其旋转下来，并且用FACS缓冲液洗涤一次。然后用BD Perm Wash(BD Biosciences)洗涤细胞2次，然后在室温下，用细胞因子抗体染色45分钟。用BD Perm Wash洗涤细胞2次，然后将细胞再悬浮于FACS缓冲液中。为了转录因子的着色,在冰上用荧光染料标记的一级抗体对细胞进行表面性的染色20分钟。在FACS缓冲液中洗涤以后,用来自eBioscience的Fix/Perm缓冲液固定细胞。在固定之后,用APC抗小鼠FoxP3渗透细胞并将其染色。为了Ikaros的着色,在用所述的eBioscience FoxP3试剂盒固定和渗透之后，使用了兔子抗小鼠Ikaros(Abcam,ab26083,1:2000)。在用所述的Ikaros抗体着色之后,洗涤细胞，然后用PE标记的抗兔子二级抗体染色(1:2000)。在完成染色之后,在CyanADP(Beckman Coulter)上处理细胞，用于流式细胞术分析。
统计学分析。所有的统计学检验都是采用GraphPad Prism进行的。采用事后(posthoc)检验来执行双向的ANOVA,具有*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,和****p<0.0001。把数据表示成平均值+/-SEM。
结果
在具有减小的Ikaros水平的表达CAR的T细胞中，细胞因子产生和溶解细胞的介体释放被扩大了。
考虑到具有减小的Ikaros的溶解细胞的T淋巴细胞(CTLs)具有增强的体外和体内效应子功能(O’Brien等人,J Immunol.2014；192:5118-29),进行了实验以测试耗尽Ikaros是否能够改善所述的CAR T治疗的效力。将从野生型C57BL/6和在C57BL/6背景中的单缺乏Ikaros的小鼠(Ikzf1+/-)分离的T细胞用逆转录病毒转导以表达间皮素CAR。在离体活化之后,转导,并且在IL2中扩增,通过流式细胞术和蛋白质印迹证实了:与野生型(WT)CAR T细胞相比,Ikzf1+/-CAR T细胞继续表达较少的Ikaros蛋白(图26A)。
由于Ikaros是多细胞因子基因座的转录阻遏物(Thomas等人,J Immunol.2007；179:7305-15；Bandyopadhyay等人,Blood.2006；109:2878-2886；Thomas等人,J ofBiological Chemistry.2010；285:2545-53；和O’Brien等人,J Immunol.2014；192:5118-29),接下来检查了Ikaros的减少是否导致CAR T细胞自分泌产生细胞因子以及所述的单缺乏Ikaros的CAR T细胞对它们的靶抗原的应答是否好于它们的WT对应物。用包被了BSA-(对照)或间皮素(所述的CAR抗原)的珠，以2:1的珠:T细胞比率，刺激WT和Ikzf1+/-CAR T细胞6小时,并且通过流式细胞术分析它们产生IFNγ、TNFβ和IL2的能力。在基线处(BSA刺激),与WT CAR T细胞相比，在产生IFN的Ikzf1+/-CAR T细胞中有～3倍的增加(4.35％对1.4％,图26B),但是在所述产生IL2的细胞的％方面没有显著性差别(图26D)。在用间皮素包被的珠刺激之后,在所述产生IFN-γ细胞因子的Ikzf1+/-CAR T细胞的％方面有显著的增加(25％)，而在WT CAR T细胞中所述的应答是中等的(7％)。也看到了在TNFα产生方面的增加(图26C)。为了研究这种在细胞因子产生方面的增加不同的刺激中是否是普遍性的或限于CAR抗原,用PMA和离子霉素处理了WT和Ikzf+/-CAR T细胞6小时。在这种情形中,在所述的Ikzf1+/-CAR T细胞中观察到与它们的WT对应物相比更多的产生IFNγ、TNF-β和IL-2细胞因子的细胞(图26B-26D)。这些数据支持所述的假设:Ikaros是所述的抑制T细胞或CAR T细胞的细胞因子产生的限制性因子中的一种。
显示了在CD3/CD28-活化的缺乏Ikaros的OT-I细胞中，重要的细胞毒性的介体颗粒酶B被上调了,并且这增加了它们抗表达OVA的EL4肿瘤细胞的细胞裂解活性(O’Brien等人,J Immunol.2014；192:5118-29)。猜测在含有CAR的Ikzf+/-T细胞中颗粒酶B的产生也将被增强。用BSA-(基线)或间皮素-(CAR抗原)包被的珠，以2:1的珠:T细胞比率，刺激WT和Ikzf1+/-CAR T细胞6小时。把PMA/离子霉素用作所述试验的阳性对照。类似于上述数据,在基线处(BSA刺激；图26E)，在Ikzf+/-CAR T细胞中颗粒酶B的水平高于在WT CAR T细胞中的。在用间皮素包被的珠或PMA/离子霉素刺激以后,在WT和Ikzf+/-CAR T细胞这中，颗粒酶B的水平增加了，但是在所述的Ikzf+/-CAR T细胞中，所述的产生高得多(图26E)。为了确定在具有减小的Ikaros的CAR T细胞的脱粒方面是否也有差别,在抗原刺激以后评估了CD107a表达。在抗原再刺激之后，野生型的转导的T细胞具有中等的CD107a表达水平,然而，所述的具有减小的Ikaros的T细胞展示了增强的CD107a的上调(图26F)。因此,在对再刺激的应答中,与它们的野生型对应物相比，所述的具有减小的Ikaros的CTL脱粒更多并且释放更多的细胞毒性的介体，。
耗尽具有显性阴性的等位基因的Ikaros增强了CAR T细胞功能
除了所述具有较低水平的Ikaros的细胞以外,还研究了表达Ikaros的一个显性阴性的等位基因(IkDN)的来自小鼠的T细胞。表达IkDN的转基因小鼠具有正常的淋巴发育，但是其具有的周围T细胞拥有90％的减小的Ikaros DNA结合活性(Thomas等人,JImmunol.2007；179:7305-15；和Winandy等人,Cell.1995；83:289-99)。用平板结合的抗CD3/CD28抗体活化从WT和IkDN小鼠的脾分离的T细胞,给该T细胞转导间皮素CAR,随后用IL2扩增。通过蛋白质印迹证实了在IkDN CAR T细胞中Ikaros的敲减。用BSA-或间皮素-包被的珠，以2:1的珠:T细胞比率，再激发WT和IkDN CAR T细胞6小时,并且分析它们在对CAR抗原的应答中产生IFN和IL2以及脱粒的能力。类似于上述的Ikzf1+/-数据,在基线处观察到一些自分泌IFNγ的产生(图27A),但是没有IL2的产生(BSA刺激；图27B)。在所述的CAR与它的靶抗原间皮素连接时,IkDN T细胞产生比WT T细胞更多的IFNγ(间皮素刺激；图27A)。正如通过CD107a上调所测定的，脱粒在野生型和IkDN CAR T细胞中也是类似的(图27C)。
在抗原刺激之后，耗尽Ikaros没有增加CAR T细胞的活化和信号传导
考虑到Ikaros的耗尽扩大了细胞因子的释放并且增加了所述CAR T细胞的颗粒酶B水平和CD107a的表达,探究了可能的机制。貌似有理的是这些效应子功能的变化可能是由于在所述的野生型和Ikzf1+/-转导的T细胞的活化方面的差别而导致的。因此,在用间皮素包被的珠刺激6和24小时以后，通过流式细胞术测定了所述CD69,CD25和4-1BB(T细胞活化的标记物)的水平。早期活化标记物CD69被所述的野生型和Ikzf1+/-细胞这两者上调相同的程度(图28A)。采用更长时间的刺激,所述的野生型和表达Ikzf1+/-CAR的T细胞继续表达相似水平的CD69,但是Ikzf1+/-转导的T细胞展示了增加的CD25表达(图28B)。然而，这可能没有直接地指示在T细胞活化方面的差别,因为Ikzf1+/-细胞导致的增加的IL-2(图28D)能够以正前馈环作用于CD25、IL-2Ra(Depper等人,Proc Natl Acad of Sci USA.1985；82:4230-4；和Nakajima等人,Immunity.1997；7:691-701)。4-1BB,所述TNF受体超级家族的一员，也在活化的T细胞上被表达(Vinay等人,Seminars in Immunology.1998；10:481-9)并且在抗原刺激之后，以相似的水平被CAR转导的野生型和Ikzf1+/-T细胞表达(图28C)。因此,在我们的WT和Ikzf1+/-转导的T细胞之间的功能性差别不是由于在T细胞活化方面的差别而导致的。
在实施例9和Riese等人,Cancer Research.2013；73:3566-77中描述的实验证明了:在CAR T细胞中，所述的酶甘油二酯激酶(DGK)的耗尽导致RAS/ERK信号传导的增加,后者与CAR T细胞的增强的活化有很好的相关性。检查了在用CD3/CD28抗体TCR刺激以后，在WT和缺乏Ikaros的T细胞中的一些信号传导途径。制备了来自被刺激的T细胞的裂解物，并且针对与来自所述TCR的近端(PLC和Lck)和远端(ERK1/2,JNK,AKT和IKKa)信号传导有牵连的各种磷酸化蛋白，进行了免疫印迹分析。在缺乏Ikaros的T细胞中，存在着一些TCR信号传导蛋白质(包括Lck,ERK和AKT)的组成型的低水平基线活化(图28D)。当比较WT和Ikaros缺乏的T细胞时，采用TCR/CD28刺激,所有被研究的蛋白质都被磷酸化到相同的水平,磷酸－IKK除外,其在刺激以后20分钟，在缺乏Ikaros的T细胞中稍微更高。为了确定在具有减小的Ikaros水平的T细胞中所述的NFB途径是否被增强,针对IKK的下游靶IB，再次用探针探查了同样的印迹。在WT和Ikaros耗尽的T细胞之间的IB降解方面没有差别。为了研究CAR信号传导,用间皮素包被的珠再刺激WT和IkDN间皮素CAR转导的T细胞。类似于所述的采用CD3/CD28刺激的数据,在PLC和ERK的磷酸化方面没有发现差别(图28E)。总之,这些数据表明Ikaros的耗尽没有改变TCR/CAR-介导的信号传导。
在CAR T细胞中Ikaros的减少扩大了它们抗它们的靶细胞的应答。
考虑到由具有减少的Ikaros的CAR T细胞所导致的效应因子的增加的生产,测试了它们体外抗它们的靶肿瘤细胞的效力。使野生型、Ikzf1+/-和表达mesoCAR的IkDN T细胞以不同的比率与所述亲本的肿瘤细胞系AE17或所述的表达间皮素的细胞系AE17meso混合。当与所述的亲本细胞系混合时,在对AE17的应答中，所述的野生型、Ikzf1+/-和IkDN T细胞都未能产生IFN-γ或溶解细胞(图29A,29B和29C)。相比之下,当与AE17meso反应时,野生型T细胞的IFN-γ产生和细胞溶解随着所述的E:T比率的增加而增加(图29B和29C)。然而，与野生型T细胞相比，所述的Ikzf1+/-和IkDN T细胞这两者都产生了明显更多的IFN-γ并且具有明显增加的肿瘤溶解,甚至在最低的E:T比率1.3:1时(图29B,和29C)。
为了研究这种效应的普遍性,检查了表达不同的CAR构建体的T细胞,该CAR构建体靶向成纤维细胞活化蛋白质(FAP-CAR)并且具有与上面所用的间皮素CAR相同的细胞内信号传导结构域。把从WT C57BL/6中分离的可比较地转导的FAP-CAR脾T细胞的效力与来自Ikzf1+/-小鼠的那些效力进行了比较。与WT FAP CAR T细胞相比，Ikzf1+/-FAP-CAR T细胞在溶解3T3.FAP细胞方面(图29D)和在分泌更多的IFN方面更加有效(图29E),在体外保留了特异性。
耗尽Ikaros增强了CAR T细胞抗建立的肿瘤的效力
其次，检查了具有减小的Ikaros的间皮素特异性的T细胞(Ikzf1+/-和IkDN)控制所建立的AE17meso肿瘤在小鼠中生长的能力。把二百万个AE17meso肿瘤细胞注射到同系的C57BL/6小鼠的侧腹中并且允许其形成大的建立的肿瘤(～100-150mm3)。然后把从WT或缺乏Ikaros的(Ikzf1+/-和IkDN)小鼠制备的二百万个CAR T细胞过继转移到那些带有肿瘤的小鼠中,并且跟踪肿瘤测量。由野生型转导的mesoCAR T细胞诱导了温和的肿瘤生长抑制,而Ikzf1+/-和IkDN转导的mesoCAR T细胞更加显著地抑制了AE17meso肿瘤的生长(图30A和30B)。
也研究了Ikaros的减少是否能够增强FAP-CAR T细胞的治疗潜力。给具有建立的AE17meso肿瘤的小鼠(100-150mm3)过继转移1千万个野生型或Ikzf1+/-转导的抗小鼠FAPCAR T细胞。接受野生型转导的细胞的小鼠提供了最小的肿瘤延迟并且所述的AE17meso肿瘤继续生长(图30C)。相比之下,所述的Ikzf1+/-转导的T细胞能够显著地延迟肿瘤生长。
与WT CAR T细胞相比，Ikzf1+/-CAR T细胞持续更久并且更抗免疫抑制性肿瘤微环境
考虑到所述的Ikaros受抑制的CAR T细胞的增强的效力,探究了使用所述的Ikzf1+/-mesoCAR T细胞的可能机制。为了进一步探究在体内这些mesoCAR T细胞在免疫抑制性肿瘤微环境中是如何操作的,在过继性转移后第3和9天收获了肿瘤并且评估了它们的数目和功能。这两个时间点允许在所述抗肿瘤免疫应答期间的早和晚时间点表征它们的活性。
在转移后第3天,我们在所述的脾(图31A)和肿瘤(图31B)这两者中观察到野生型和Ikzf1+/-mesoCAR T细胞的相似的频度。这些相似的水平表明所述的野生型和Ikzf1+/-mesoCAR T细胞这两者最初同样好地向所述的肿瘤转移。在评估所述的第9天时间点中,在所述的脾中，野生型mesoCAR T细胞和Ikzf1+/-mesoCAR T细胞这两者的数目下降了。然而，当在这个时间点检查所述的肿瘤时,与WT mesoCAR T细胞比较，在Ikzf1+/-mesoCAR T细胞的数目方面有显著的增加(图31B)。这些数据表明在所述的免疫抑制性微环境中，与WTmesoCAR T细胞相比，所述的Ikzf1+/-mesoCAR T细胞要么持久性更好，要么增殖得更好。
在所述免疫抑制性肿瘤微环境内，在对它们的关联抗原的应答中，浸润肿瘤的淋巴细胞(TIL)变成机能减退的,并且是与肿瘤进展相关的关键现象(Prinz等人,JImmunol.2012；188:5990-6000；和Kerkar等人,Cancer Res.2012；72:3125-30)。尽管在第9天在所述的肿瘤中有更多的Ikzf1+/-mesoCAR T细胞,但是它们依然能够受到所述的肿瘤微环境的不利影响。为了评估功能,使用了CD3/CD28抗体来刺激在转移后第9天从野生型和Ikzf1+/-mesoCAR T细胞分离的TILS并且表征在溶解性介体产生方面的差别。在转移后第9天,在所述脾中的野生型mesoCAR T细胞继续产生一些中等水平的IFN(图31C)。正如所预期的那样,与从所述的脾分离的野生型T细胞相比，从所述的肿瘤分离的野生型T细胞产生远远更少的这种细胞因子。这表明所述的野生型TIL在转移后第9天开始变成机能减退的。相比之下,脾Ikzf1+/-mesoCAR T细胞在基线处和在刺激时继续产生更多的IFN-(图31C)。与所述的野生型TIL相比,所述的Ikzf1+/-TIL产生更高数量的IFNγ。这些数据表明Ikzf1+/-TIL可能对所述的免疫抑制性肿瘤微环境不太敏感。
经常在TIL中看到绕过所述TCR信号传导的近端缺陷(Prinz,PU等人,J.Immunol.2012；188:5990-6000)能够通过利用PMA/离子霉素(PMA/I)而实现(Prinz等人,J Immunol.2012；188:5990-6000)。用PMA/I再刺激野生型和Ikzf1+/-mesoCAR T细胞，来确定对TCR-刺激不敏感的野生型和Ikzf1+/-TIL是否依然能够在对其它刺激的应答中制造细胞因子。在转移后第9天,所述的野生型TIL在IFN-γ产生方面展示了引人注目的下降(图31C),并且这通过用PMA/I刺激而部分地得到恢复(图31D)。然而，与野生型转移的细胞相比，对从脾和肿瘤中分离的Ikzf1+/-mesoCAR T细胞的刺激依然导致增加的IFN-γ水平。通过绕过经由PMA/I刺激的TCR信号传导中的任何缺陷,这些结果证明:IFNγ的产生染色质水平上有差别并且可能是由于差别的Ikaros功能而导致的。
根据由所述转移的Ikzf1+/-T细胞所导致的增加的抗肿瘤活性,也在第9天检查了对于免疫抑制性肿瘤微环境的组成的影响，并且评估了调节性T细胞(Treg)和源于骨髓的抑制细胞(MDSC)的数目。在转移后第9天,在接受了野生型或Ikzf1+/-mesoCAR T细胞的宿主中观察到相似水平的Treg(图31E)。确定了Ly6G-/CD11b+/CD206+巨噬细胞的存在,所述巨噬细胞被典型地表征为抑制免疫的和促肿瘤生成的M2巨噬细胞。在所述第9天的治疗组中,在所有的3个组中，该CD206表达都是相似的(没有处理的、野生型的和Ikzf1+/-)(图31F)。
具有减小的Ikaros的T细胞对可溶的抑制性因子TGF和腺苷是不太敏感的
为了进一步表征所述的免疫抑制性肿瘤微环境与所述的mesoCAR T细胞的相互作用,利用了体外培养系统。已经显示可溶的抑制性因子(例如IDO、IL-10、腺苷和TGF-β(Wang等人,Oncoimmunology.2013；2:e26492)有助于抑制浸润肿瘤的淋巴细胞。在体外测试了选择的抑制性因子对所述的缺乏Ikaros的CAR T细胞的影响，以确定是否所述的免疫抑制性环境能够影响它们的溶解功能。在存在TGF-β和腺苷时，野生型CAR T细胞在它们的制造IFN-γ的能力方面有50％的减少并且在它们的溶解功能方面有减少(图32)。在不存在抑制剂时，具有减小的Ikaros水平的CAR T细胞(Ikzf1+/-和IkDN)继续产生比它们的野生型对应物更多的IFNγ，并且在存在TGFβ和腺苷时，仅仅略微地受到了抑制(图32A)。观察到与野生型T细胞相比，在Ikzf1+/-和IkDN CAR T细胞中增加的溶解功能(图32B)。这些数据证明了所述具有减小的Ikaros的T细胞对TGFβ和腺苷抑制是不太敏感的。
讨论
在这个实施例中,鉴定了用于使得表达CAR的T细胞能够在所述的肿瘤环境中存活并且增强它们的效应子功能的新方法:所述的转录阻遏物Ikaros的失活,已知它抑制参与T细胞功能的各种各样众多的基因,例如细胞因子基因(IL2和IFNγ)、细胞溶解介体(颗粒酶B)和影响T细胞分化的关键的T-盒子转录因子(R-Bet和Eomes)。
来自上面描述的实验的一个重要发现是缺乏Ikaros功能的CAR T细胞在限制肿瘤生长方面显著地好于野生型CAR T细胞(图30)。在多个肿瘤模型中并且使用两种不同的CAR构建体，观察到了这些结果。由于Ikaros调节的基因的高数目,貌似有理的是Ikaros可以调节通常对免疫抑制敏感的许多途径。通过降低在CAR T细胞中Ikaros的水平而增加的IFN-g产生可能导致在所述的肿瘤上I类MHC表达的上调,并且因此改善它的免疫原性,改善抗血管生成活性,以及驱动Th1细胞的STAT1介导的功能。增加的IFNγ的可能的效果可能是在所述的肿瘤内所述的巨噬细胞表型的改变,然而，既在所述巨噬细胞的总数目方面,也在M2-样巨噬细胞的比例方面没有观察到差别(正如通过CD206表达所测定的那样)。所述增加的IL-2生产也可能增加CD4 Treg细胞的形成,然而，当把所述的用WT CAR T细胞治疗的肿瘤与缺乏Ikaros的CAR T细胞比较时，没有观察到差别。
在注射以后第9天，观察到浸润肿瘤的淋巴细胞的数目的增加。这不可能是由于增加的转移所致,因为WT的数目和缺乏Ikaros的TIL的数目在第3天时相似。相反,这些结果表明:缺乏Ikaros的TIL显示了增加的增殖或减少的抗原诱导的细胞死亡(AICD)。体外研究表明:在这两种类型的T细胞之间AICD是相似的，使得更加可能的是:所述的差别是由于增加的增殖所致。这将会与由这些细胞生产的所述IL-2的增加一致。除了增加的持久性以外,所述缺乏Ikaros的TIL还表现为较少的机能减退。当用抗CD3抗体或PMA和离子霉素再刺激浸润肿瘤的CAR T细胞时,缺乏Ikaros的CAR TIL与它们的野生型对应物相比，能够制造更多的IFNγ(图31C和31D)。
所述的体外研究允许进一步研究所述的在体内观察到的增加的抗肿瘤效力的机制性基础。与Ikaros的已知的抑制性功能一致,用Ikaros显性阴性的构建体(IkDN)缺失一个Ikaros等位基因(Ikzf+/-)或替换了它的一个等位基因产生了T细胞，在体外在TCR或CAR刺激以后，所述T细胞具有一些增加的基线自分泌IFNγ和颗粒酶B产生(图26),但是更加重要地,显示了显著地扩大的细胞因子分泌和颗粒释放。这伴随着在体外增加的肿瘤细胞杀死。为了测试缺乏Ikaros的CAR T细胞是否具有比WT CAR T细胞更低的活化阈值,给Dyna珠包被了少10倍的间皮素蛋白质并且显示Ikzf+/-CAR T细胞依然能够以低密度应答所述的间皮素抗原，以产生IFNγ和TNF-α但是所述的WT CAR T细胞却不能。所述的Ikaros失能的CAR T细胞也更抗由已知的抑制免疫的因子例如TGF-β和腺苷(图32)所致的抑制。这可能是由于这个事实:在TCR/CAR活化之后,在缺乏Ikaros的T细胞中,细胞因子(即IL2和IFNγ和T细胞效应子(即颗粒酶B)基因更加易于接近用于转录。这似乎有助于补偿在免疫抑制性肿瘤微环境内欠佳的T细胞活化。
在先前的研究中(例如,实施例9),通过耗尽DGK(代谢所述的第二信使甘油二酯并且限制RAS/ERK活化的酶)已经在CAR T细胞中观察到相似的表型(即在细胞溶解和IFN产生方面的增加)。然而，由于DGK缺失,在所述的CAR/TCR信号传导途径中观察到清晰的变化。具体地,在TCR和CAR这两者活化以后，RAS/ERK活化被显著地增强了。然而，如通过增加的CD69上调所测定的那样,这导致效应子分子(例如TRAIL、FasL和IFNγ生产的增强的活化。在WT和缺乏DGK的CAR T细胞之间，穿孔蛋白和颗粒酶B是相似的。在这个研究中，缺乏Ikaros的CAR T细胞具有非常不同的表型。相比于所述的缺乏DGK的CAR T细胞,所述的缺乏Ikaros的CAR T细胞具有如通过CD69和CD25上调所显示的相似的CAR/TCR活化(图28),以及正如通过多个TCR信号传导分子的磷酸化(图34)和钙信号传导所测定的那样相似的CAR/TCR信号传导。与缺乏DGK的T细胞不同,Ikaros耗尽的CAR T细胞在基线处具有更高的颗粒酶B和IFN水平(图26和27),以及一些TCR信号传导级联(例如ERK和Akt)的组成型的低水平活化(图28)。这种基线活化可能是由于T-bet的诱导所致(Thomas等人,J of Biol Chemistry.2010；285:2545-53),该T-bet与其它转录因子比如Eomes合作来反式激活IFN和颗粒酶B的基因表达(Pearce等人,Science.2003；302:1041-3；和Intelkofer等人,Nat Immunol.2005；6:1236-44)。
这些发现提升这种可能性:使用遗传的或生物化学的方法，在转导的人T细胞中(在临床试验中)，治疗学上靶向Ikaros可能是有益的。遗传方法能够模拟在小鼠中的这些结果，并且包括使用shRNA敲减CAR T细胞中的Ikaros或使用显性阴性的构建体来与内源性Ikaros竞争。另一个选择将会使用药理学上的抑制剂来短暂地降低Ikaros水平。最近的报道已经指示:调控免疫的药物来那度胺通过所述的E3连接酶复合体CRL4CRBN靶向Ikaros，用于泛素介导的降解(Gandhi等人,Br J Haematol.2013；164:811-21；Kronke et al,Science.2014；343:301-5；和Sakamaki等人,Leukemia.2013；28:329-37)。用来那度胺治疗的CD3刺激的人T细胞产生更多的IL-2(Gandhi等人,Br J Haematol.2013；164:811-21),具有减小的Ikaros水平的T细胞的关键性状。在初步的研究中,在预先用来那度胺处理以后，TCR/CD28刺激的间皮素-CAR转导的人PBMC在体外产生更多的IL-2和IFNγ。因此,CAR T细胞治疗与在体内施用来那度胺的联合，可以通过抑制Ikaros提供用于逆转T细胞机能减退的治疗策略。
综上所述,这个实施例首次证明了:靶向转录阻遏物能够增强CAR-介导的抗肿瘤免疫力。所述的机制涉及增强的细胞因子和效应子功能，在信号转导方面没有改变。通过利用shRNA、显性阴性的构建体或药理学上的抑制剂(比如来那度胺)来靶向表达CAR的T细胞中的Ikaros，可以寻求把这个方法转入临床。
实施例11:在人卵巢癌中的Meso-CART
在这个实施例中,在患有晚期复发性浆液卵巢癌的人患者中，测定了静脉内输注被转导以表达间皮素CAR的自体的T细胞的安全性。
在计划的I期研究(正如实施例3中描述的那样)以后，把单一的患者治疗方案模型化以评估输注自体的表达间皮素CAR的T细胞(mesoCART)的安全性和可行性。把来自所述患者的T细胞转导以表达包含与4-1BB和TCRζ信号传导结构域融合的细胞外抗间皮素单链可变片段(scFv)的CAR。把3x107个mesoCAR T细胞/m2,总共4.65x107个meso CAR T细胞,输注到所述的患者中。在输注之前，没有提供消耗淋巴的化疗。
所述的mesoCART输注没有急性的毒性效果。所述的患者经历了第3级双侧胸膜渗出液,呼吸困难,发烧,低血压和吸出。没有由于所述的meso CART细胞的远离肿瘤/中靶效果而导致的临床毒性,例如心包炎或腹膜炎。在输注后第21天，用托珠单抗(抗IL6)治疗所述的患者，因基于无法解释的发烧、需要增压的低血压、升高的血清铁蛋白(>7000ng/mL)和CRP(>160mg/L)水平而怀疑其患有细胞因子释放综合症(CRS)。
能够在周围血液样品以及来自肝脏和腹膜的肿瘤样品中检测所述的mesoCAR T细胞,在围心液和胸膜液中有最高的数目。对细胞因子的评估显示了在所述的胸膜液内IL-6显著的增加(>在基线上80倍增加),峰值在第22-23天。对所述血液的评估也显示了在所述的血液中IL-6水平的提高(在第22天在基线上增加15倍)。没有检测到TNFα或IFNγ水平的升高。
初步的结果显示了:与两个星期以前的CT成像相比，在第21天进行的腹部和骨盆CT成像显示了腹膜癌扩散最低限度地改善了。具体地,一个肿瘤从3.4x3.1cm减小到3.0x2.6cm。在输注后第8天，来自左侧胸膜液的细胞学显示了恶性肿瘤,但是在第21天和第26天,没有恶性肿瘤的证据。
这些结果显示了:发现输注不消耗淋巴的meso CART细胞是可行的和安全的。没有有关输注的毒性或威胁生命的心包炎或腹膜炎的证据。也有治疗效力的临床证据，正如由恶性的胸膜渗出液的消失所证明的那样。
实施例12:具有不同的细胞内信号传导结构域的CAR的短暂表达
在这个实施例中,检查了不同的共刺激结构域在所述CAR结构中的用途，和它对细胞寿命、记忆分化和细胞代谢特征的影响。
开发了体外T细胞刺激的新的系统来研究单轮CAR特异性刺激的结果并且分析通过多种CAR信号传导内结构域的信号传导。把体外转录的编码具有CD3ζ、CD28:z和4-1BB:z的不同细胞内信号传导结构域的抗间皮素SS1-CAR构建体的mRNA电穿孔到原代静息的人T细胞中。通过这种方法获得了大于90％ CAR阳性的T细胞群。当核实CAR表达时,用固定在珠上的重组间皮素刺激所述的T细胞，然后培养。由于所述的RNA被暂时地表达了,在一轮刺激以后，所述的CAR从所述的细胞表面消失,允许单独通过所述的CAR(即没有随后的来自额外的间皮素结合事件的信号传导)清楚地分析信号传导。因此，这个方法消除了通过所述内源性T细胞受体进行刺激的必要性并且首次允许通过CAR T细胞的替代抗原来分析信号传导的结果。这些实验是在原发性周围血液T细胞、分类的幼稚T细胞和脐带血细胞上进行的。
以等价的水平，把所述的多种CAR构建体(含有CD3zeta的SS-1、含有CD28:z的SS1和含有4-1BB:z的SS1)表达在所述T细胞的表面上。证明了当与表达间皮素的靶细胞一起培养时，所有的信号传导结构域具有相当的并且特异性的细胞溶解能力。
当与基于CD28的CAR相比时，通过所述的含有4-1BBz的CAR刺激的原代T细胞显示了优越的存活和膨胀分布图。基于4-1BB的CAR和基于CD28的CAR这两者都展示了超过5倍的群体倍增。然而，所述的基于4-1BB的CAR T细胞在体外增殖更长的时间。所述基于4-1BB的CAR T细胞的表型分析揭示产生了具有中央记忆表面标记物的增加的细胞群。相比之下,所述的基于CD28的CAR迅速地分化成CAR T细胞的效应子记忆细胞库。
含有CD28z的CAR产生显著地更高比例的效应子记忆细胞,抑制性的PD-1,TIM3和LAG3分子相对于它们的4-1BBz对应物，在表达方面有中等的增加。无论使用了大量周围血液T细胞、幼稚(CD45RO-CD95-CD62L+CCR7+分类的)周围血液T细胞，还是使用了脐带血T细胞的起始群，这些结果都保持一致。
在培养中使用所述的海马试验(Seahorse Biosciences)的间皮素刺激的CAR T细胞的代谢分布揭示了:在4-1BBz-CAR刺激的细胞中它们的CD28z对应物相比，在脂质氧化方面有实质性增加。另外,微阵列研究已经揭示了在通过所述不同的CAR信号传导结构域刺激以后，在被恢复的细胞中独特的基因标记。
这些结果一起显示:CAR T细胞展示了不同的存活力和功能，这取决于所述的共刺激结构域。这个系统也允许对新的CAR设计进行快速表征和功能性分析。
实施例13:mTOR抑制对老年人中免疫衰老的影响
最清楚地与衰老相联系的一种途径是所述的mTOR途径。已经显示所述的mTOR抑制剂雷帕霉素在小鼠中延长寿命并且在老年小鼠中改善许多种与衰老相关的状况(Harrison,DE等人(2009)Nature 460:392-395；Wilkinson JE等人(2012)Aging Cell 11:675-682；和Flynn,JM等人(2013)Aging Cell 12:851-862)。因此,这些发现指示:mTOR抑制剂可能在人中对衰老和与衰老相关的状况具有有益的效果。
能够在短期临床试验时间范围中被研究的与年龄有关的表型是免疫衰老。免疫衰老是发生在老年人中的免疫功能衰退,其导致增加的易受感染性和减少的对接种(包括流感接种)的应答。免疫功能随年龄的衰退是由于免疫缺陷的积累而致,免疫缺陷包括造血干细胞(HSC)产生幼稚淋巴细胞的能力的减小，以及所述的对抗原的刺激具有缺陷型应答的耗尽了PD-1的阳性淋巴细胞数目的增加(Boraschi,D等人(2013)Sci.Transl.Med.5:185ps8；Lages,CS等人(2010)Aging Cell 9:785-798；和Shimatani,K等人,(2009)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 106:15807-15812)。年老小鼠中的研究显示:采用所述的mTOR抑制剂雷帕霉素的6个星期的治疗恢复了HSC功能，导致增加的幼稚淋巴细胞的生产、对流感接种的改善的应答和延长的寿命(Chen,C等人(2009)Sci.Signal.2:ra75)。
为了评估mTOR抑制对人与衰老相关的表型的影响以及所述的mTOR抑制剂RAD001是否减轻免疫衰老,在接受了RAD001或安慰剂的年老志愿者中评估了所述的对流感疫苗的应答。在本文中呈现的所述发现表明:RAD001以良好耐受的剂量，在年老志愿者中增强所述的对流感疫苗的应答。RAD001也减小随着年龄积累的(PD)-1阳性的CD4和CD8 T淋巴细胞的程序性死亡的百分数。这些结果显示:mTOR抑制对年老志愿者中的免疫衰老具有有益的效果。
正如本文中描述的那样,采用所述的mTOR抑制剂RAD001(一种雷帕霉素的类似物)的6个星期的治疗,在年老人志愿者中改善了对流感接种的应答。
方法
研究人群
在新西兰和澳大利亚的9个地点注册了>＝65岁没有不稳定的潜在医学疾病的年老志愿者。筛选时的排除标准包括血红蛋白<9.0g/dL、白细胞数<3,500/mm3、嗜中性粒细胞数<2,000/mm3或血小板数<125,000/mm3、不受控制的糖尿病、不稳定的缺血性心脏病、临床上显著的潜在性肺病、免疫缺陷或接受免疫抑制治疗的历史、凝血病或需要长期抗凝作用的医学状况的历史、估算的肾小球滤过率<30mL/分钟、重度不受控制的血胆固醇过多症(>350mg/dL,9.1mmol/L)或高甘油三脂血症(>500mg/dL,5.6mmol/L)的存在。
在所述的治疗组之间的基线人口统计学是相似的(表7)。在所述的218位登记的受试者中,211位完成了所述的研究。7位受试者从所述的研究中退出了。5位受试者由于不利事件(AE)而退出,1位受试者获准退出,以及1位受试者由于违反方案而离开了所述的研究。
表7:所述研究的患者的人口统计学特征和基线特征
Figure GDA0003963633350002721
*体重指数是以千克计算的重量除以以米计算的身高的平方
研究设计和执行
从2011年12月至2012年4月,把218位年老志愿者登记在随机化的观测者盲的安慰剂对照的试验中。使用验证的自动随机化系统把所述的受试者随机化到治疗组，在每一种治疗组中具有5:2的RAD001:安慰剂比率。所述的治疗组是:
RAD001 0.5mg/日或安慰剂
RAD001 5mg/星期或安慰剂
RAD001 20 mg/星期或安慰剂
所述的试验是观测者盲的，因为在所述的RAD001 0.5 mg/日和20mg/星期组中所述的安慰剂轻微地不同于在那些组中的RAD001片剂。评估所述的受试者的所述的研究人员没有看到所述的研究药物，因此是全盲的。对于所有的组，治疗期是6个星期，在此时间期间，受试者每两个星期在所述的诊所中经历安全性评估。在已经向受试者定量给药4个星期以后,测定了剂量前和剂量后一个小时时RAD001的稳态水平。在完成所述6个星期的研究药物课程以后,给予受试者2个星期的没有药物的休息以逆转任何可能的RAD001诱导的免疫抑制,然后给予他们含有菌株H1N1 A/California/07/2009,H3N2 A/Victoria/210/2009,B/Brisbane/60/2008的2012季节性流感接种(
Figure GDA0003963633350002731
Novartis Vaccines andDiagnostics,Siena,意大利)。在流感接种以后4个星期,采集受试者的血清用于流感滴度测定。通过标准的血细胞凝集抑制试验(Kendal,AP等人(1982)Concepts and proceduresfor laboratory-based influenza surveillance.Atlanta:Centers for DiseaseControl and Prevention B17-B35)，测定了针对所述的3株流感疫苗菌株以及2株异源菌株(A/H1N1菌株A/New Jersy/8/76和A/H3N2菌株A/Victoria/361/11)的抗体滴度。按照先前描述的那样(Spensieri,F.等人(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110:14330-14335)，测定了在流感接种之前和以后4个星期采集的血清样品中，对所述的A/H1N1/California/07/2009特异性的IgG和IgM的水平。把结果表示成荧光强度。
所有的受试者都提供了书面知情同意书。按照Good Clinical Practice的原则进行所述的研究，并且所述的研究得到了合适的道德委员会和管理机构的批准。
安全性
在研究访问期间进行了不利事件的评估和用于血液学和生物化学安全性评估的血液采集。也采集了受试者在他们接受研究药物的6个星期期间在家填写的日记中的不利事件信息。关于所有的不利事件的数据都是从所述知情同意书的时间起直到在所述最后一次研究访问以后30天为止采集的。由研究人员把事件分类成轻微的、中等的或严重的。
统计学分析
使用具有无信息先验的正规贝叶斯回归模型，进行几何平均滴度比率的初步分析。在所述的对数尺度上，把这个模型拟合到每一个抗体滴度。在每一个模型中的初步结果是第84天的测定值。把第63天的测量值包括在所述的结果向量中。使用与先前的声明混合的SAS 9.2proc拟合所述的模型。把所述矩阵的协方差结构看成是非结构性的(选择类型＝UN)。使用了平的先验。对于所述的血清转化比率的二次分析,使用了逻辑回归。
把意在治疗人群定义为接受了至少一个完全剂量的研究药物并且没有影响效力数据的大的方案偏差的所有的受试者。登记在所述的研究中的总共218位受试者中的199位是在所述的意在治疗人群中。
免疫表型分析
从在3个时间点采集的全血中分离外周血单核细胞:基线；在6的星期的研究药物治疗以后；和在研究结束时，当时受试者已经脱离研究药物6个星期并且在流感接种以后4个星期。按照先前描述的那样(Maecker,HT等人(2012)Nat Rev Immunol.12:191-200)，使用美国加州斯坦福大学人免疫监测中心的8-色免疫表型分析组，通过流式细胞术分析了76个PBMC子集。使用8-色冻干的免疫表型分析组(BD Lyoplate,BD Biosciences,San Diego,CA)，通过流式细胞术分析了76个PBMC子集。把生存力>80％并且生产2x106个细胞或更多细胞的PBMC样品包括在所述的分析中。
针对每一个所述的RAD001定量给药组，计算了从基线到研究药物治疗第6个星期时以及从基线到研究结束时(第12个星期)，所述免疫表型的相对变化。进行了Student T检验，以检查在针对安慰剂的效果作了调节以后，在每一个定量给药组内，从基线到所述的两个血液采样时间点，所述免疫表型的相对变化是否分别显著地不同于0。治疗效果的分析中，没有进行丢失数据的归责。因此，如果患者丢失了在基线时的表型数据,则这位患者就没有被包括在这个表型的所述分析中。如果患者丢失了在第6或12个星期时的表型数据,那么对于所述受影响的时间点，这位患者无助于这个表型的所述分析。
在处于3个定量给药组之下的76个表型中进行了608次测试，来比较所述的治疗效果与所述的安慰剂效果。实施了分层的假发现率(FDR)控制方法学来控制与多重测试相关联的假阳性的发生，但是提供相当更好的能力。把所述的细胞类型组作为所述的分层因素，并且分别在每一层内进行FDR(q-值)计算。在0.05的显著性水平并且相应的q-值≤0.1上，拒绝所有的零假设。具有在0.05的显著性水平并且相应的q<0.1上拒绝的所述的多重测试调整策略确保了少于10％的所述发现是假的。
在第二次分析中,在所述的汇合的治疗组和安慰剂组之间免疫表型发生变化,其中合并了所有3个RAD001定量给药组。为了确定哪些免疫表型变化在所述的治疗组和安慰剂组之间不同,针对每一种测定的表型，计算了在基线和研究药物治疗的第6个星期之间以及在基线和研究结束时(第12个星期)之间的患者内细胞计数比率。对所述的比率进行对数变换,并且通过在每个时间点的协方差分析进行分析，以便检测在所述汇合的治疗组和安慰剂组之间的差别。在76个表型中进行了152次测试来比较所述汇合的治疗效果相对所述安慰剂的效果。实施了分层的假发现率(FDR)控制方法学来控制与多重测试相关联的假阳性的发生，但是提供相当更好的能力(Benja最小i,Y.等人(1995)J.Roy.Statist.57:289-300；和Sun,L.等人(2006)Genet.Epidemiol.30:519-530)。把所述的细胞类型组作为所述的分层因素，并且分别在每一层内进行FDR(q-值)计算。在0.05的显著性水平并且q-值少于20％上，拒绝所有的零假设。可以把这个解释为仅仅拒绝那些具有少于0.05的P值的假设，并且所述的每个观察到的显著性结果是由于多重测试所致的概率小于20％。
结果
一般来说,RAD001是良好耐受的,特别是所述的0.5mg/日和5mg/星期定量给药方案。在所述的研究期间没有死亡发生。3位受试者经历了4次严重的不利事件(SAE)，估计这些事件与RAD001不相关。所述的4次SAE是在先前已经完成了6个星期每个星期5mg RAD001持续6个星期的疗程的具有正常的血小板数的受试者中，左眼视网膜出血并且随后失明；在用安慰剂治疗的受试者中的重度背痛和在用安慰剂治疗的受试者中的重度肠胃炎。在表8中提供了在任何治疗组中具有>2％的发生率的与治疗相关的不利事件的名单。最普通的与RAD001相关的AE是口腔溃疡,它在所述的大多数案例中具有温和的严重程度。总的来说，接受了RAD001的受试者具有与用安慰剂治疗的那些受试者相似的重度AE发生率。仅仅一个重度AE被评估为把用20mg/星期RAD001治疗的受试者中与RAD001口腔溃疡相关。
表8:通过优选项，在任何治疗组中与治疗相关的AE>2％的发生率
Figure GDA0003963633350002771
Figure GDA0003963633350002781
Figure GDA0003963633350002791
通过测定对2012季节性流感疫苗的血清学应答，评估了RAD001在年老志愿者中改善免疫功能的能力。在表9中提供了在基线时和在流感接种以后4个星期时，针对所述3株流感疫苗菌株中的每一株，所述的血细胞凝集抑制(HI)的几何平均滴度(GMT)。所述的初步分析变量是HI GMT比率(接种后4个星期/基线)。使所述的研究有力量能够证明在3株流感疫苗菌株中的至少2株中有:1)相对于安慰剂,≥1.2倍的GMT增加；和2)安慰剂校正的GMT比率超过1的后验概率不低于80％。选择这个端点是因为由所述的MF-59疫苗佐剂诱导的所述流感的GMT比率的1.2倍增加与流感疾病的减少相关联(Iob,A等人(2005)Epidemiol Infect133:687-693)。
表9.在基线时和在流感接种以后第4个星期时，每一株流感疫苗菌株的HI GMT
Figure GDA0003963633350002792
Figure GDA0003963633350002801
基线指示在流感接种之前2个星期
第4个星期指示在流感接种以后4个星期
N是每个组的受试者数目
GMT是几何平均滴度
GMT比率是在接种后第4个星期时的GMT/在基线时的GMT
CV％指示变异系数
在所述的意在治疗(ITT)人群中,所述的低的增强免疫剂量的RAD001(0.5mg/日或5mg/星期)组，但是不是更高的剂量(20mg/星期)组满足所述研究的所述主要终点(图33A)。这表明:在较低的剂量时，存在着不同的RAD001免疫调控机制,并且在较高的剂量时，所述mTOR抑制的已知的免疫抑制效应可能起作用。而且,所述结果提示了在低的增强免疫剂量的RAD001治疗之后，在所述年老人中朝向改善的免疫功能的趋势。
在子集分析中,所述具有低的基线流感滴度(≤1:40)的受试者的子集经历了比所述的ITT人群更大的与RAD001相关的滴度增加(图33B)。这些数据表明RAD001在增强不具有在基线时的保护性(>1:40)滴度并且因此处于最高的患流感疾病的风险中的所述受试者的流感疫苗应答方面，是特别有效的。
RAD001浓度对针对每个流感疫苗株的滴度增加的散点图显示了逆向的暴露/应答关系(图34)。基于mTOR介导的S6激酶(S6K)的磷酸化的建模和模拟预测:在所述的定量给药间隙期间，所述的20mg/星期的定量给药方案几乎完全地抑制mTOR-介导的S6K活性,所述的5mg/星期的定量给药方案抑制S6K活性超过50％,而所述的0.5mg/日的定量给药方案抑制S6K磷酸化大约38％(Tanaka,C等人(2008)J.Clin.Oncol 26:1596-1602)。因此,在增强所述年老人的免疫应答方面，部分mTOR抑制,例如,具有低的增强免疫剂量的RAD001的mTOR-介导的S6K磷酸化,即使不是更加有效的，也可能是与具有高剂量的RAD001的接近完全的mTOR抑制一样。
也评估了在流感接种以后4个星期时的血清转化比率。将血清转化定义为从接种前阴性的滴度(即HI滴度<1:10)到接种后HI滴度≥1:40的变化或从接种前非阴性的(≥1:10)HI滴度起至少4倍的增加。在所述的意在治疗人群中,与在所述的安慰剂组中相比，在所述的RAD001组中，所述的H3N2和B菌株的血清转化比率增加了，尽管所述的增加没有满足统计学上的显著性(表10)。在具有<＝1:40的基线流感滴度的所述受试者的子人群中,RAD001治疗也增加了所述的H3N2和B菌株的血清转化比率,并且对于在所述的0.5mg/日定量给药组中的所述的B菌株，这些结果达到了统计学上的显著性。这些数据进一步显示:在所述的年老人中，RAD001增强了对流感接种的血清学应答。
表10:在接种以后4个星期，具有针对流感的血清转化的受试者的百分数
Figure GDA0003963633350002821
*在RAD001和安慰剂之间，血清转化的比值比显著地不同于1(以治疗作为固定的效果，通过逻辑回归得到的双侧p-值<0.05)
目前的季节性流感疫苗经常提供不充分的抗连续不断地出现的流感株系的保护，这些流感株系呈现为先前正在流传的病毒的变体。然而，当与安慰剂相比时,在所述的mTOR抑制剂雷帕霉素的存在下,接种了抗流感疫苗的小鼠发展了更广谱的对流感的血清学应答。所述更广谱的血清学应答包括针对由多个流感流感亚型表达的保守型表位的抗体，其提供免于被包含在所述疫苗中的异源流感株系感染的保护(Keating,R等人(2013)NatImmunology 14:2166-2178)。为了确定RAD001是否在所述年老志愿者中增宽了对流感的血清学应答,测定了针对没有被包含在所述的流感疫苗中的2株异源流感株系(A/H1N1株系A/New Jersey/8/76和A/H3N2株系A/Victoria/361/11)的HI滴度。当与安慰剂组相比时，在所述的RAD001组中，针对所述异源株系的HI GMT比率的增加更高(图35)。此外,当与安慰剂组相比时，在所述的RAD001组中，针对所述的异源株系的血清转化比率更高。对于所述的H3N2异源株系，在所述的5和20mg/星期RAD001的定量给药组中，血清转化比率的增加在统计学上是显著性的(表11)。对于所述的汇合的RAD001组，所述的H3N2血清转化比率是39％，相比，所述的安慰剂组的H3N2血清转化比率是20％(p＝0.007)。呈现在本文中的所述结果表明:mTOR抑制增宽了年老志愿者对流感接种的血清学应答,并且增加了针对没有被包含在所述的季节性流感疫苗中的异源流感株系的抗体滴度。
在用雷帕霉素治疗的小鼠中，增宽的针对异源流感株系的血清学应答与在B细胞中对类别转换的抑制和抗流感的IgM水平的增加相关联(Keating,R.等人(2013)NatImmunol 14:2166-2178)。然而，在用RAD001治疗的人中，对类别转换的抑制可能没有参与到所述增宽的血清学应答中，因为在RAD001和安慰剂治疗的组之间，所述接种后的抗流感IgM和IgG水平没有区别(图36)。
表11:在季节性流感接种以后4个星期，针对异源流感株系发生血清转化的受试者的百分数
Figure GDA0003963633350002831
*在RAD001和安慰剂之间血清转化的比值比显著地不同于1(以治疗作为固定的效果，通过逻辑回归得到的双侧p-值<0.05)
为了查清RAD001在年老志愿者中增强免疫功能所借助的机制,在基线时、在6个星期的研究药物治疗以后和在流感接种(在研究药物中断以后6个星期)以后4个星期时，对从受试者得到的PBMC样品进行了免疫表型分析。尽管在所述的RAD001组和安慰剂组之间，大多数所述PBMC子集的百分数没有区别,但是当与安慰剂组相比时，在所述的RAD001组中，所述PD-1阳性的CD4和CD8细胞的百分数更低(图37)。PD-1阳性的CD4和CD8细胞随着年龄而积累并且对抗原刺激具有缺陷型应答，因为PD-1抑制T细胞受体诱导的T细胞增殖、细胞因子产生和细胞溶解功能(Lages,CS等人(2010)Aging Cell 9:785-798)。在所述的安慰剂组中，随着时间推移，PD-1阳性的T细胞的百分数增加。在第12个星期(在接种后4个星期)时，这种增加可能是由于流感接种所致，因为已经显示流感病毒将会增加PD-1阳性的T细胞(Erikson,JJ等人(2012)JCI 122:2967-2982)。然而，在所有的RAD001组中，所述CD4 PD-1阳性的T细胞的百分数从在第6和12个星期时的基线起减少了(图37A)。在所述的两个较低剂量的RAD001组中，所述的CD8 PD-1阳性的细胞的百分数也从在第6和12个星期这两者时的基线起减少了(图37B)。评估了与所述的安慰剂组相比，在所述的RAD001组中，所述的PD-1阴性的CD4 T细胞的百分数及其增加(图37C)。
根据更为严谨的统计学分析,其中把来自所述RAD001组的所述结果汇合，并且针对在基线PD-1表达方面的差别进行了调整,在第6个星期时，与安慰剂组(n＝25)相比，在所述汇合的RAD组(n＝84)中，PD-1阳性的CD4 T细胞有30.2％的统计学上显著性的减少，具有p＝0.03(q＝0.13)(图38A)。在第12个星期时，当与所述的安慰剂组相比时，在所述汇合的RAD中，所述的PD-1阳性的CD4 T细胞的减少是32.7％，具有p＝0.05(q＝0.19)。图38B显示在第6个星期时，与安慰剂组(n＝25)相比，在所述汇合的RAD001组(n＝84)中，PD-1阳性的CD8 T细胞的37.4％的统计学上显著的减少，具有p＝0.008(q＝0.07)。在第12个星期时，当与所述的安慰剂组相比时，在所述汇合的RAD001中，所述的PD-1阳性的CD8 T细胞的减少是41.4％，具有p＝0.066(q＝0.21)。因此,来自图37和38的所述结果一起表明:所述的与RAD001相关的所述PD-1阳性的CD4和CD8 T细胞的百分数的减少可促进增强的免疫功能。
结论
综上所述,呈现在本文中的所述数据显示:正如通过对流感接种的应答所评估的那样,所述的mTOR抑制剂RAD001减轻所述年老人的与年龄相关的免疫功能的衰退，并且这种减轻是在可接受的风险/收益平衡下得到的。在对年老小鼠的研究中,采用所述的mTOR抑制剂雷帕霉素处理6个星期不仅增强了所述的对流感接种的应答，而且也延长了寿命,提示免疫衰老的减轻可能是对与衰老相关的表型的更为宽广的影响的标志。
由于在接种之前中断了RAD001定量给药2个星期,可以通过药物治疗中断以后持续的相关细胞群的变化，来介导所述RAD001的增强免疫的效果。呈现在本文中的所述结果显示:当与安慰剂相比时，RAD001减少消耗的PD-1阳性的CD4和CD8 T细胞的百分数。通过TCR信号传导诱导了PD-1的表达并且在所述的包括慢病毒感染在内的持久性抗原刺激的设置中保持在高位。尽管不希望受理论的限制,但可能的是:RAD001在年老志愿者中减少了慢性免疫活化并且因此导致PD-1表达的减少。RAD001也可以直接地抑制PD-1表达，正如已经针对所述的亲免蛋白环孢素A所报道的那样(Oestreich,KJ等人(2008)J Immunol.181:4832-4839)。RAD001诱导的所述PD-1阳性的T细胞的百分数的减少有可能改善所述T细胞应答的品质。这与先前的研究一致，所述先前的研究显示:在小鼠和灵长类中，mTOR抑制改善所述的记忆CD8T细胞对接种的应答品质(Araki,K等人(2009)Nature 460:108-112)。在老年小鼠中,也已经显示mTOR抑制增加造血干细胞的数目,导致幼稚淋巴细胞的增加的产生(Chen,C等人(2009)Sci信号2:ra75)。尽管在这个实施例中，在所述的RAD001组中，对比安慰剂组，没有检测到在所述幼稚淋巴细胞的百分数方面的显著性差别,但是可以进一步研究这个可能的机制。
可以进一步研究RAD001增宽对异源流感株系的血清学应答所借助的机制。也已经显示在流感接种以后，雷帕霉素抑制B细胞中的类别转换。因此,产生了抗流感抗体的独特的全体成分，这些成分促进了抵抗被包含在所述的流感疫苗中的流感病毒亚型的致命感染的交叉的株系保护(Keating,R等人(2013)Nat Immunol.14:2166-2178)。本文中描述的所述结果没有显示:在流感接种之前已经中断了RAD001两个星期的所述年老受试者中，RAD001改变了B细胞的类别转换。尽管所述的潜在机制需要进一步阐明,但是当在所述的季节性疫苗和正在所述的群体中循环的流感株系之间存在着匹配不良时，对本文中描述的异源流感株系的增加的血清学应答可以赋予在几年内增强的对流感疾病的防护。
RAD001对流感抗体滴度的影响比得上所述的MF59疫苗佐剂的影响，该佐剂被批准用于增强所述年老人对流感接种的应答(Podda,A(2001)Vaccine 19:2673-2680)。因此,可以把RAD001驱动的对流感接种的抗体应答的增强转变为临床上的益处，正如采用MF59辅佐的流感疫苗在所述年老人中所证明的那样(Iob,A等人(2005)Epidemiol Infect.133:687-693)。然而，RAD001也被用来抑制器官移植患者的所述免疫应答。这些似乎矛盾的发现提升了这样的可能性:mTOR抑制剂的免疫调控的效果可能是剂量和/或抗原依赖性的(Ferrer,IR等人(2010)J Immunol.185:2004-2008)。在本文中看到了朝向逆向的RAD001暴露/接种应答关系的趋势。可能的是，完全的mTOR抑制通过所述正常的亲环蛋白-雷帕霉素机制抑制免疫功能,然而部分的mTOR抑制由于不同的与衰老相关的表型抑制而至少在所述的年老人中增强免疫功能。有趣的是,在衰老动物模型中，在包括造血干细胞在内的许多种组织中，mTOR活性增加了(Chen C.等人(2009)Sci Signal 2:ra75和Barns,M.等人(2014)Int JBiochem Cell Biol.53:174-185)。因此,与更加完全地抑制mTOR活性相反,把mTOR活性降低到在年轻的组织中看到的水平,在衰老性适应症中可能是临床上有益的。
在与衰老有关的适应症治疗中，mTOR抑制剂例如RAD001的安全性分布图一直是需要关心的。在肿瘤学或器官移植适应症中所用的剂量下，RAD001的毒性包括对于许多与相关衰老的适应症来说将会是不可接受的口腔炎,腹泻,恶心,血球减少,高脂血症,和高血糖症的比例。然而，这些AE是与血液中RAD001的波谷水平相关。因此，选择在这种研究中使用的所述的RAD001定量给药方案，以使波谷水平最小化。所述的0.5mg/日,5mg/星期和20mg/星期定量给药组的平均RAD001波谷水平分别是0.9ng/ml、低于0.3ng/ml(定量的下限)和0.7ng/ml。这些波谷水平显著地低于与在器官移植和癌症患者中所用的定量给药方案相关的波谷水平。此外,所述受限制的6个星期的疗程减少了不利事件的风险。这些发现表明:在这种研究中所用的定量给药方案对于所述年老人的一些状况具有可接受的风险/益处。然而,在本文中描述的实验中，显著性数目的受试者发展了口腔溃疡，甚至当以低至0.5mg/日定量给药时。因此，有必要进一步研究低的增强免疫剂量的RAD001的安全性分布图。开发mTOR抑制剂具有比目前可获得的雷帕霉素类似物更清晰的安全性分布图可以在未来为与衰老相关的状况提供更好的治疗选择。
实施例14:在年老受试者中增强对疫苗的免疫应答
在所述的年老人中免疫功能衰退,导致感染的发生率增加和减少的对接种的应答。作为确定mTOR抑制在人中是否具有抗衰老效果的第一步,进行了随机化的安慰剂对照的试验，以确定所述的mTOR抑制剂RAD001是否正如在年老志愿者中通过对接种的应答所评估的那样，逆转免疫功能的衰老相关的衰退。在所有的情形中,得到了合适的专利许可并且所述的研究得到了国家卫生部门的批准。
在所述的研究中使用了下列3个定量给药RAD001的方案:
20mg/星期(波谷水平:0.7ng/ml)
5mg/星期(波谷水平低于检测极限)
0.5mg/日(波谷水平:0.9ng/ml)
选择了这些定量给药方案，因为它们具有低于所述被批准用于移植和肿瘤学适应症的RAD001剂量的波谷水平。波谷水平是所述身体中最低的药物水平。与所述的10mg/日肿瘤学定量给药方案相关的所述RAD001的波谷水平是大约20ng/ml。与所述的0.75-1.5mg一日两次移植定量给药方案相关的波谷水平是大约3ng/ml。相比之下,与在我们的免疫研究中使用的所述定量给药方案相关的波谷水平低3-20倍。
由于与RAD001相关的AE与波谷水平相关,预计所述的3个定量给药方案对正常的志愿者具有足够的安全性。此外,预计所述的3剂提供一定范围的mTOR抑制。P70 S6激酶(P70 S6K)是下游的靶，它被mTOR磷酸化。P70 S6K磷酸化的水平充当mTOR活性的量度。基于建模和对在RAD001的临床前和临床研究中得到的P70 S6K磷酸化数据的模拟,预计20mg/星期将会几乎完全地抑制mTOR活性持续一整周,然而预计5mg/星期和0.5mg/日将会部分地抑制mTOR活性。
把>＝65岁的年老志愿者随机化地分配到所述3个RAD001治疗组中的一个组中(50位受试者/组)或安慰剂组(20位受试者/组)。用研究药物治疗受试者6个星期,给予受试者2个星期的休息,然后受试者接受了流感(Aggrippal,Novartis)和肺炎球菌(Pneumovax 23,Merck)接种。通过借助于血细胞凝集抑制试验，测定在接种以后4个星期时，针对所述流感疫苗中的所述3个流感株系(H1N1、H3N2和B流感亚型)的几何平均滴度(GMT)，评估了对流感接种的应答。所述研究的主要目标是:(1)安全性和耐受性和(2)当与安慰剂相比时，在接种以后4个星期时，在2/3的所述流感疫苗株系中，在流感滴度方面有1.2倍的增加。选择这个目标是因为流感滴度1.2倍的增加与接种后流感疾病的减少相关联,并且因此是临床上相关的。所述的5mg/星期和0.5mg/日剂量是被良好地耐受的并且不像所述的20mg/星期剂量,符合所述的GMT主要目标(图33A)。在年老志愿者中，当与安慰剂相比时，RAD001不仅改善所述的对流感接种的应答,它也改善所述的对肺炎球菌接种的应答。所述的肺炎球菌疫苗包含来自23种肺炎球菌血清型的抗原。在我们的受试者中测定了所述血清型中的7种的抗体滴度。与安慰剂相比，在所有的3个RAD组中，6/7的血清型的抗体滴度增加了。
组合后的流感和肺炎球菌滴度数据表明:部分的(少于80-100％的)mTOR抑制在逆转所述的与衰老相关的免疫功能衰退方面比更加完全的mTOR抑制更加有效。
实施例15:低剂量的mTOR抑制增加能量和运动
在临床前模型中,采用所述的雷帕系物雷帕霉素的mTOR抑制增加老年小鼠中自发性的身体活性(Wilkinson et al.Rapamycin slows aging in mice.(2012)Aging Cell；11:675-82)。有趣的是,在实施例2中描述的所述0.5mg/日定量给药组中的受试者，在定量给药以后一年时给予的调查表中也报告了当与安慰剂相比时，增加的能量和运动能力(图39)。这些数据表明:采用雷帕系物的部分mTOR抑制可能对除仅仅免疫功能以外的与衰老相关的病态具有有益的效果。
实施例16:采用RAD001的P70 S6激酶的抑制
进行了建模和模拟来预测预计部分地抑制mTOR活性的RAD001的每日和每个星期的剂量范围。正如上面所记载的那样,P70 S6K被mTOR磷酸化并且是最紧密地与老化相联系的mTOR的下游靶，因为P70 S6K的敲除增加寿命。因此进行了关于部分地抑制P70 S6K活性的RAD001的剂量的建模。预计在所述的>＝0.1mg并且<20mg范围内的每个星期定量给药将会达到对P70 S6K活性的部分抑制(图40)。
对于每日定量给药,30pM至4nM的RAD001浓度部分地抑制了细胞系中P70 S6K的活性(表12)。预计采用>＝0.005mg至<1.5mg/日的RAD001剂量，将会达到这些血清浓度。
表12:在体外在HeLa细胞中，P70 S6K活性的抑制百分数
RAD001浓度 0 6pM 32pM 160pM 800pM 4nM 20nM
P70 S6K抑制％ 0 0 18 16 62 90 95
结论
采用多剂仅仅部分地抑制P70 S6K的mTOR抑制剂治疗与衰老有关的的病态或一般地增强免疫应答的方法。采用低的多剂的RAD001在衰老性适应症中部分mTOR抑制的效力是意想不到的发现。范围在>＝0.1mg至<20mg/星期以及>＝0.005mg至<1.5mg/日的RAD001剂量将会达到部分mTOR抑制，并且因此预期其在与衰老相关的病态中或在增强所述的免疫应答中具有效力。
实施例17:在卵巢癌中的MSLN CART
先前在体内卵巢肿瘤小鼠模型中评估了单一的剂量的2x106个间皮素CAR T细胞的抗肿瘤活性,正如实施例8中描述的那样。正如实施例8中描述的那样,在这种模型中，为了看看所述的M5和M11 CAR T细胞的抗肿瘤活性是否可能被增加,在肿瘤植入以后14天，当时所述的肿瘤体积达到150mm3的平均值,给所述的CAR T细胞施用较高剂量的4x106个间皮素CAR T细胞，并且施用相同随诊剂量的CAR T细胞。5天以后，为一半所述的小鼠提供了第二次相同剂量的所述的CAR T细胞，来看看这是否将会增强先前在这种模型中看到的抗肿瘤活性。
材料和方法:
细胞系:OVCAR8是源于一位患有卵巢腺癌的64岁女性患者并且已经被转导以表达mCherry的人卵巢癌细胞系。让细胞生长在含有10％胎牛血清的RMPI培养基中。该细胞系在组织培养瓶中贴壁生长。当以皮下方式把该细胞系植入所述小鼠的侧腹中并且与基质胶混合时，该细胞系在小鼠中形成肿瘤。在所述的植入期间，向所述的细胞中添加基质胶允许基质在所述小鼠的侧腹中发育，这为所述的肿瘤细胞提供了开始在其上生长的结构。超过10-12天,所述的基质胶塞降解而留下的实体肿瘤由肿瘤细胞和周围的基质细胞组成。已经对所述的OVCAR8细胞进行了修饰，使其表达mCherry,使得也能够通过使所述的小鼠成像来监测肿瘤细胞的生长。
小鼠:6个星期龄的NSG(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠是从所述的Jackson Laboratory(货号005557)接收的。在实验之前，允许动物在所述的NovartisNIBRI动物设施中适应至少3天。按照Novartis ACUC规程和指南操作动物。在肿瘤植入之前一天，把用于动物识别的电子应答器植入动物的左侧腹上。在肿瘤植入之前，剔去所述小鼠的右侧腹上的毛。
肿瘤植入:在用0.25％胰蛋白酶-EDTA进行胰蛋白酶消化以后，收获了处在对数期的OVCAR8细胞。在50ml falcon管中，以1200rpm洗涤所述的细胞5分钟,在生长培养基中洗涤一次，然后在冷的无菌PBS中洗涤两次。以100x106个/ml的浓度把所述的细胞再悬浮于PBS中并且保持在冰上。然后使含有所述细胞的所述PBS溶液与基质胶1:1混合,产生最终浓度为50x106个细胞/ml的PBS-基质胶。把所述的细胞放置在冰上并且立刻植入小鼠中。以皮下方式把在200ul中的肿瘤植入所述小鼠的右侧腹上。
所述的OVCAR8模型内源性地表达间皮素，因此能够被用于测试所述间皮素定向的CAR T细胞的体内效力。当以皮下方式植入所述小鼠的侧腹中时，这个模型生长良好，并且能够用测径器测量它，获得肿瘤体积测定值。当以50:50的PBS和基质胶的混合物植入10x106个肿瘤细胞时,所述的肿瘤建立了并且能够在一个星期内被准确地测定。在13-15天内,平均肿瘤体积是100-200mm3,并且到60-65天时，肿瘤达到终点体积(1000-1200mm3)。一旦肿瘤被完全移植并且基质胶被再吸收，就经常测试治疗剂的抗肿瘤活性。因此,对于这个模型，存在着大的窗口期，在此期间能够观测所述的CAR T细胞的抗肿瘤活性。
CAR T细胞定量给药:在肿瘤植入以后14天，用4x106个CAR T细胞(13.3x106个总的T细胞)向小鼠定量给药。使细胞在37摄氏度的水浴中部分地解冻，然后通过向含有所述细胞的所述管中添加1ml冷的无菌PBS，使其完全地解冻。把所述解冻的细胞转移到15mlfalcon管中，并且用PBS调整到10ml的最终体积。以1000rpm洗涤所述的细胞两次，每次持续10分钟，然后在血细胞计数器上计数。然后以133x106个细胞/ml冷的PBS的浓度再悬浮T细胞，并且保持在冰上，直到所述的小鼠被定量给药为止。以静脉内方式，经由尾静脉给所述的小鼠注射100ul所述的T细胞，达到4x106个CAR T细胞(13.3x106个总的T细胞)/小鼠的剂量。用100ul单独的PBS(PBS)或被转导了同种型CAR(同种型)的T细胞处理每个组的7只小鼠。用所述的ss1间皮素CAR T细胞、M5间皮素CAR T细胞或M11间皮素CAR T细胞处理每个组的14只小鼠。5天以后，把所述的ss1、M5和M11组对半分割，并且用相同的第二剂所述的CART细胞处理每个组中的7只小鼠。把所述的组识别为SS1单(1剂SS1 CAR T细胞)、SS1双(2剂SS1 CAR T细胞)、M5单(1剂所述的M5 CAR T细胞)、M5双(2剂所述的M5 CAR T细胞)、M11单(1剂所述的M11 CAR T细胞)、M11双(2剂所述的M11 CAR T细胞)。所述的同种型T细胞、SS1T细胞、M5 T细胞和M11 T细胞都是从同一供体平行地制备的。
动物监测:每日监测所述的小鼠的健康状况,包括每个星期测定体重两次。按照下式计算了体重变化的百分数:(BW目前–BW初始)/(BW初始)x100％。每个星期通过测径器测量来监测肿瘤2-3次，并且使用下列所述的椭球体公式计算肿瘤体积(TV):TV(mm3)＝((长度x宽度2)x3.14159))/6。以平均值+/-平均值的标准误(SEM)形式报告肿瘤体积。使用下列公式计算了治疗/对照(T/C)的百分数值:
％T/C＝100xΔT/ΔC，如果ΔT>0；
％消退＝100xΔT/T初始，如果ΔT<0；
其中T＝在所述研究的最后一天，所述的药物治疗组的平均肿瘤体积；T初始＝在定量给药的初始那天，所述的药物治疗组的平均肿瘤体积；ΔT＝在所述研究的最后一天，所述的药物治疗组的平均肿瘤体积–所述的定量给药的初始那天，所述的药物治疗组的平均肿瘤体积；C＝在所述研究的最后一天，所述的对照组的平均肿瘤体积；和ΔC＝在所述研究的最后一天，所述对照组的平均肿瘤体积–在所述定量给药的初始那天，所述对照组的平均肿瘤体积。把在所述的100％–42％范围内的T/C值解释成没有或具有最小的抗肿瘤活性；把<42％并且>10％的T/C值解释成具有抗肿瘤活性或肿瘤生长抑制。把<10％的T/C值或>-10％的消退值解释成肿瘤停滞。把<-10％的消退值报告成消退。
结果:
在皮下卵巢腺癌异种移植模型中，评估了所述间皮素CAR T细胞的抗肿瘤活性。在肿瘤细胞植入之后在第0天,把含有肿瘤的小鼠随机地分到治疗组中，并且在肿瘤植入以后在第14天，以静脉内方式，经由所述的侧尾静脉施用4x106个CAR T细胞(13.3x106个总的T细胞)。5天以后，给所述小鼠中的一半提供第二剂相同剂量的T细胞。监测肿瘤生长和动物健康，直到动物达到目标为止。在第57天和第62天之间，当肿瘤开始显示溃疡的迹象，导致动物身体状况的得分变化时，对所有组中的所述小鼠实施安乐死。
对于所有的治疗组，把肿瘤体积的平均值+/-SEM绘制在图43中。所述的没有接受任何T细胞的PBS治疗组展示了在以皮下方式植入的NSG小鼠中基线OVCAR8肿瘤生长动力学。所述的同种型治疗组接受被转导了对照CAR的T细胞。在这种模型中，这些细胞充当T细胞对照来显示人供体T细胞的非特异性应答。所述的PBS组和所述的同种型治疗组贯穿这个研究，展示了连续的肿瘤进展。所述的同种型组显示稍微较慢的肿瘤生长,由于所述供体T细胞的的背景活性。类似于先前的研究，对于所述的ss1治疗的组，单剂的4x106个CAR+T细胞没有导致肿瘤生长的变化。双剂的所述ss1 CAR T细胞相似地没有导致OVCAR8肿瘤生长的变化。所述的M5和M11单剂组显示了清晰的抗肿瘤活性,正如先前当用2x106个CAR+T细胞定量给药时它们所显示的那样。当相比于所述的单剂组时，所述的M5和M11双剂组这两者显示了增加的抗肿瘤活性。在这些组中，所述的肿瘤显示了消退，与肿瘤生长抑制相反。所述的M5双剂组在4/7的小鼠中展示了完全的消退，对于多个时间点，没有可测量的肿瘤。
在第52天，针对所述的同种型组，计算了肿瘤体积的变化(ΔT/C％),它是在小鼠因肿瘤溃烂而被移走之前最后一次的肿瘤体积测量值。表13显示对于每个组，所述的ΔT/C值。所述的ss1单剂组和双剂组均显示无抗肿瘤活性,类似于所述的PBS对照治疗组。所述的M5单剂组显示肿瘤生长抑制，具有30.28％的ΔT/C值,而所述的M5双剂组显示了消退，-63.90％的消退值。所述的M11单剂组显示最小的抗肿瘤活性,具有52.91％的ΔT/C值,而所述的M11双剂组也展示消退，具有-15.80％的消退值。
表13.ΔT/C(治疗肿瘤体积/对照)
组 天 ΔT/C(％) 消退(％)
PBS 52 162.23 NA
同种型 52 100.00 NA
SS1单 52 172.05 NA
SS1双 52 166.15 NA
M5单 52 30.28 NA
M5双 52 NA -63.90
M11单 52 52.91 NA
M11双 52 NA -15.80
讨论:
这种研究证明了:当在初始T细胞剂量以后5天第二次对其定量给药时，所述的间皮素特异性的CAR T细胞(M5和M11)能够导致所述OVCAR8肿瘤的消退。这种应答与在单剂的所述M5和M11 CAR T细胞这两者之后的抗肿瘤活性一起都是持久的。此外,在所述的M5双剂组中，4/7的小鼠展示完全的消退，没有能够通过测径器或触诊测量的肿瘤。
正如先前(例如,在实施例8中)看到的那样,单剂的2x106个所述的M5或M11 CAR T细胞的CAR T细胞显示抗肿瘤活性，并且在NSG小鼠中，在所述的OVCAR8异种移植模型中，表现为停滞。在这种研究中,单剂的4x106个M5或M11 CAR T细胞显示同样的结果。与所述的同种型CAR T细胞或所述的ss1 CAR T细胞相比,所述的M5和所述的M11组显示了清晰的抗肿瘤活性，甚至作为单剂时(图43)。施用第2剂所述的ss1 CAR T细胞没有显示增加的抗肿瘤应答。然而，施用第2剂所述的M5或M11 CAR T细胞导致在这两组中增强的抗肿瘤应答并且导致所述的肿瘤消退。
可以把所述的M5和M11 CAR T细胞的增加的抗肿瘤活性归因于几个机制。第一个机制是:较大剂量的CAR T细胞在所述的OVCAR8模型中实现了消退。增加CAR T细胞的剂量(例如增加到8x106个CAR T细胞,例如在单剂中)可以增加抗肿瘤活性并且导致消退。另一个机制是：额外剂量的CAR T细胞改善抗肿瘤活性和肿瘤消退。例如,所述的初始剂量可以由于所述的CAR T细胞的扩增和由所述的T细胞所致的细胞因子的产生而导致一定的抗肿瘤活性。当所述的细胞仍然在发生扩增时，给予额外的剂量(例如在5天以后给予第二剂),可以由于已经由早期施用的所述CAR T细胞产生的细胞因子而增加所述细胞的活性。
此外,先前的研究已经显示所述的CAR T细胞浸润到所述的OVCAR8肿瘤中。也在已经接受了双剂量的所述CAR T细胞的所述小鼠中研究了CAR T细胞的浸润，以确定是否存在着更大的CD8+(细胞毒性的)T细胞的浸润。也通过分析这些小鼠的脾和骨髓中的所述细胞评估了所述的CAR T细胞的持久性。
实施例18:通过氢-氘交换质谱绘制表位图
进行了氢-氘交换(HDX)质谱来预测间皮素的区域，所述区域有助于通过scFv构建体SS1和M5识别的表位。在HDX中,靶蛋白质的酰胺骨架的氢与氘交换。在所述的靶蛋白和结合蛋白(例如,抗体)之间的相互作用“保护”所述的靶蛋白的多个区免于溶剂的靠近,从而防止在所述的靶蛋白和所述的结合蛋白之间在界面处的氢交换。因此,HDX质谱能够被用作用于绘制蛋白质结合界面图的探针,例如预测抗体的表位。
正如实施例2中描述的那样,通过基于SPR的针对SS1的表位划分，对scFv构建体M5,M11,M12,M14,M16,M17,M21和M23的分析指示:M5和M11与不同于SS1的表位结合。为了获得对可以被SS1和M5结合的所述人间皮素的区域的了解,按照下列方式运行了HDX质谱。
表达质粒的克隆
使用分别处于所述的5’-和3’-端的所述限制酶切位点HindIII和EcoRI，把对应于间皮素的氨基酸Val 297–Gly 588的DNA片段(Uniprot Q13421)克隆到哺乳动物表达载体。随后在对应于所述氨基酸METDTLLLWVLLLWVPGSTGDAAQPAASE(SEQ ID NO:376)的氨基末端处插入分泌信号。在所述的羧基末端处,也插入对应于所述的氨基酸TRGSGKPIPNPLLGLDSTRTGHHHHHHHHHHHH(SEQ ID NO:377)的V5-组氨酸标记。使所述三个预测的糖基化位点突变:N388Q、N496Q和N523Q。下面提供了最终表达的序列:
缺乏糖基化的间皮素(296-588；N388Q,N496Q,N523Q)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDAAQPAASEVEKTACPSGKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMSPEDIRKWQVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMQGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQQVSMDLATFMKLRTDAVLPLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGTRGSGKPIPNPLLGLDSTRTGHHHHHHHHHHHH(SEQ ID NO:378)
把对应于所述的M5 IgG的所述scFv(例如SEQ ID NO:43)相似地克隆到哺乳动物表达载体中，该载体具有N-端前导序列MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO:379)和C-端8组氨酸纯化标签GSHHHHHHHH(SEQ ID NO:380)。下面提供了最终表达的序列:
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVEKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCASGWDFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRYYLSWYQQKPGKAPKLLIYTASILQNGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQTYTTPDFGPGTKVEIKGSHHHHHHHH(SEQ ID NO:381)
蛋白质的表达和纯化
在所述的Expi293表达系统(Life Technologies)中，在CMV启动子的控制下表达了所述的间皮素和scFv M5这两者。使用在Opti-MEM培养基(Life Technologies)中的1mg每一种纯化的质粒和5mg聚乙烯亚胺(PEI)，以2.3x106个细胞/mL的密度和>97％的生存力，把所述的间皮素和scFv质粒共转染到2L的Expi293细胞中。按照相似的方案也单独转染了间皮素，但是使用1mg质粒DNA和2.5mg PEI，转染到1L的细胞中。所述的转染进行了5天，然后当所述的生存力达到80％时，收获了所述的细胞。
一旦所述的生存力下降到80％,就收集所述的细胞和条件培养基，并且以4000x g将其离心10分钟。然后通过0.22μM过滤器过滤所述的条件培养基以除去任何碎片，然后在4℃将其与罗氏完全组氨酸标签纯化树脂一起搅拌过夜。把总共3mL的珠添加到所述的scFv-M5/间皮素条件培养基中以及把1.5mL的珠添加到所述单独的间皮素培养基中。
在随后的早晨,把所述的珠加载到Bio-Rad Econo柱子上并且用15个柱体积的50mM Tris.Cl pH＝8.0,300mM NaCl洗涤，然后用8个柱体积的50mM Tris.Cl pH＝8.0,300mM NaCl,20mM咪唑洗涤。然后用50mM Tris.Cl pH＝8.0,300mM NaCl,250mM咪唑，把所述的蛋白质从所述的柱子上洗脱下来。收集所述的洗脱样品并且浓缩到6mL，再加载到与AKTAxpress(GE)相连的在20mM HEPES pH＝7.4,150mM NaCl中的Superdex 75 16/60柱子上。收集对应于所述的间皮素:M5复合体或单独的间皮素的预期尺寸的洗脱液并且浓缩到5mg/mL。
通过氢-氘交换/质谱进行表位作图
使用了氢-氘交换(HDx)与质谱(MS)联合(Woods VL,Hamuro Y(2001)HighResolution,High-Throughput Amide Deuterium Exchange-Mass Spectrometry(DXMS)Determination of Protein Binding Site Structure and Dynamics:Utility inPharmaceutical Design.J.Cell.Biochem.Supp.；84(37):89-98.)来绘制scFv抗体M5和人间皮素上的SS1(296-588)(在本文中被称为hMSLN296-588(SEQ ID No 278))的推定的结合位点图。在HDx中,蛋白质的可交换的酰胺氢被氘替换。这个方法是对蛋白质结构/动力学和溶剂可及性是灵敏的,因此,能够在配体结合时经历氘摄取减少的位置上报告。
使用相似于在所述文献中描述的那些方法(Chalmers MJ,BusbySA,Pascal BD,HeY,Hendrickson CL,Marshall AG,Griffin PR(2006)Probing protein ligandinteractions by automated hydrogen/deuterium exchange massspectrometry.Anal.Chem.；78(4):1005-1014.Chalmers,2006)的方法，进行了HDx/MS实验。在Waters HDx/MS平台上进行所述的实验,该平台包括LEAP自动取样器、nanoACQUITYUPLC和Synapt G2质谱仪。用于以氘标记hMSLN296-588的所述的蛋白质骨架的氘缓冲液是25mM HEPES,150mM NaCl,pH 7.4；氘在所述的溶液中的总百分数是94.5％。对于在不存在抗体时的hMSLN296-588氘标记实验,在4℃，使用100μl的所述氘缓冲液稀释6.9μl体积的400pmol的hMSLN296-58815分钟。然后用100μl处于2℃的冷的猝灭缓冲液猝灭所述的标记反应3分钟，然后注射到所述的LC-MS系统上，用于自动的胃蛋白酶消化和肽分析。
对于在存在scFv M5时的hMSLN296-588氘标记实验,在4℃，使用100μl所述的氘缓冲液稀释6.9μl体积的400pmol与M5共表达的hMSLN296-58815分钟。然后用100μl处于2℃的冷的猝灭缓冲液猝灭所述的标记反应3分钟，然后注射到所述的LC-MS系统上，用于自动的胃蛋白酶消化和肽分析。对于在存在scFv SS1时的hMSLN296-588氘标记实验,使400pmol的hMSLN296-588与480pmol的SS1 scFv组合。在4℃，将SS1与hMSLN296-588一起温育30分钟以后,在4℃，使用100μl所述的氘缓冲液稀释所述6.9μl的总体积15分钟。然后用100μl处于2℃的冷的猝灭缓冲液猝灭所述的标记反应3分钟，然后注射到所述LC-MS系统上，用于自动的胃蛋白酶消化和肽分析。
使用0.5M TCEP和3M脲(pH＝2.6)猝灭所有的氘交换实验。在猝灭以后,在12℃，使用Porozyme固定化的胃蛋白酶柱子(2.1x30mm)，使所述交换后的抗原进行在线胃蛋白酶消化，然后捕获在Waters Vanguard HSS T3捕获柱子上。把肽从所述的捕获柱子洗脱下来，并且使用二元的8.4分钟2至35％ B的梯度(流动相A是99.9％水和0.1％甲酸；流动相B是99.9％乙腈和0.1％甲酸)，以40μl/分钟的流速，在Waters BEH C18 1x100mm柱子(保持在1℃)上分离。
在图44中指示了通过所述的氘交换实验监测的来自hMSLN296-588的肽(每个棒代表一种肽)。实现了hMSLN296-588的超过80％的覆盖。
对于在抗体(M5或SS1)的结合状态和未结合状态之间的差别实验，检查所述的两种状态之间在氘摄取方面的差别提供了很多信息。在图45A和45B中，负值指示:相对于单独的间皮素，所述的间皮素-抗体复合体经历较少的氘摄取。氘摄取的减小可能是由于来自可交换的氘的保护或所述氢键网络的稳定化。相比之下,正值指示:相对于单独的间皮素，所述的复合体经历更多的氘摄取。在氘摄取方面的增加可能是由于氢键网络的去稳定化(即所述蛋白质的局部解折叠)所致。
在脱辅基间皮素和与SS1或M5复合的间皮素之间的差别氘交换被认为是显著性的，如果:1)如果所述的差别大于0.75Da，或者在其中所述的差别等于或小于0.75Da的情形中,2)当使用所述的Tukey检验时，所述的差别大于0.2Da并且是统计学上显著性的(p<0.01)。参见，例如,Houde D,Berkowitz SA,Engen JR(2010)The Utility of Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry in Biopharmaceutical ComparabilityStudies.J.Pharma.Sci.；100(6):2071-2086；Chalmers,MJ,Pascal BD,Willis S,ZhangJ,iturria SJ,Dodge JA,Griffin PR(2011)Methods for the Analysis of HighPrecision Differential Hydrogen Deuterium Exchange Data Int.J.Mass Spectrom.；302(1-3):59-68。
图45A显示来自间皮素上的氨基酸位297至464的所述M5-间皮素复合体(黑棒)的所述差别氚摄取和所述的ss1-间皮素复合体(灰棒)的所述差别摄取。在这个区域上，M5与间皮素的结合引起无保护并且观察到一些很轻微的去稳定化。相比之下,所述SS1与间皮素的结合在下列肽中引起显著性保护:297-315,315-322,316-325,337-346,337-349,350-375,和369-376。在所述的肽297-315,315-322,316-325,337-346,337-349中的保护与所公布的晶体学结构一致，其中残基E313,F317,K319,P343,和Y346形成所述表位的一个显著的部分(Ma J,Tang WK,Esser L,Pastan I,Xia D(2012)Recognition of Mesotehlin bythe Therapuetic Antibody MORAb-009 J.Biol.Chem.；(287)40:33123-33131)。图45B显示关于所述间皮素上的氨基酸位458-586的所述差别氘摄取。在这个区域上，M5的结合在下列肽中引起显著的保护:481-490,483-490,498-510,501-507,531-540,532-540,532-546,537-546,545-558,546-569,547-560,558-571,561-572。通过比较所述的对重叠肽的保护,我们推断:在所述的M5-间皮素复合体中，所述的区域485-490,498-507,532-537和545-572显著地受到保护。相比之下，所述的ss1-间皮素复合体不包含使用上述标准显著地受到保护的区域458-586中的任何肽。
图46提供了关于所述的M5和SS1复合体这两者的所述受保护区域的概括。这些数据指示:M5专一性地面向所述间皮素的C-端一侧保护,并且氨基酸残基485-490,498-507,532-537和545-572可能有助于所述的M5-间皮素相互作用。相比之下,SS1专一性地面向所述间皮素的N-端一侧保护，并且在所述的被SS1保护的区域以及那些被M5保护的区域中没有观察到重叠。对SS1和M5的两种不同的保护模式的观察表明M5可能与SS1所结合的表位不同的表位结合。预期当与M5相比时，M11与MSLN的相似区域结合？M11和M5在轻链和重链这两者中具有高同源性，包括相同的CDR3区域。
等同方案
在此通过引用把在本文中引用的每一篇专利、专利申请和出版物全文并入本文中。虽然参考具体的方面公开了本发明,但是显然本领域其他技术人员在不偏离本发明真正的精神和保护范围的情况下，可以设计本发明的其它方面和变型。所附的权利要求书意在被理解为包括所有这样的方面和等同的变型。
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Claims (76)

1.编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子,其中所述的CAR包含:i)含有抗间皮素结合结构域的抗体或抗体片段,ii)跨膜结构域,和iii)包含刺激结构域的细胞内信号传导结构域,并且其中所述的抗间皮素结合结构域包含
(a)轻链可变区，其包含：轻链互补决定区1(LC CDR1)，其由SEQ ID NO:203的氨基酸序列组成；轻链互补决定区2(LC CDR2)，其由SEQ ID NO:227的氨基酸序列组成；和轻链互补决定区3(LC CDR3)，其由SEQ ID NO:251的氨基酸序列组成；和
重链可变区，其包含：重链互补决定区1(HC CDR1)，其由SEQ ID NO:138的氨基酸序列组成；重链互补决定区2(HC CDR2)，其由SEQ ID NO:156的氨基酸序列组成；重链互补决定区3(HC CDR3)，其由SEQ ID NO:179的氨基酸序列的组成；或
(b)轻链可变区，其包含：LC CDR1，其由SEQ ID NO:209的氨基酸序列组成；LC CDR2，其由SEQ ID NO:233的氨基酸序列组成；和LC CDR3，其由SEQ ID NO:257的氨基酸序列组成；和
重链可变区，其包含：HC CDR1，其由SEQ ID NO:144的氨基酸序列组成；HC CDR2，其由SEQ ID NO:162的氨基酸序列组成；和HC CDR3，其由SEQ ID NO:185的氨基酸序列组成。
2.权利要求1所述的分离的核酸分子,其中所述的抗间皮素结合结构域包含：
(1)含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的轻链可变区和含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的重链可变区；或
(2)含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链可变区和含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的重链可变区。
3.权利要求1所述的分离的核酸分子,其中所述的抗间皮素结合结构域是scFv。
4.权利要求1所述的分离的核酸分子,其中所述抗间皮素结合结构域包含SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:49的序列。
5.权利要求1所述的分离的核酸分子,其中编码所述的抗间皮素结合结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:91或SEQ ID NO:97的序列。
6.权利要求1所述的分离的核酸分子,其中所述CAR包括跨膜结构域，该跨膜结构域包含选自由下列组成的组的蛋白质的跨膜结构域:T细胞受体的α、β或ζ链,CD28,CD3ε,CD45,CD4,CD5,CD8,CD9,CD16,CD22,CD33,CD37,CD64,CD80,CD86,CD134,CD137和CD154。
7.权利要求6所述的分离的核酸分子,其中所述跨膜结构域含有SEQ ID NO:6的序列。
8.权利要求1所述的分离的核酸分子,其中所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
9.权利要求1所述的分离的核酸分子,其中编码所述的跨膜结构域的核酸序列含有SEQID NO:17的序列。
10.权利要求1所述的分离的核酸分子,其中所述抗间皮素结合结构域通过铰链区与所述的跨膜结构域相连。
11.权利要求10所述的分离的核酸分子,其中所述铰链区含有SEQ ID NO:2。
12.权利要求10所述的分离的核酸分子,其中所述铰链区包含SEQ ID NO:13编码的氨基酸序列。
13.权利要求1所述的分离的核酸分子,进一步包含编码共刺激结构域的序列。
14.权利要求13所述的分离的核酸分子,其中所述共刺激结构域是从选自由下列组成的组的蛋白质得到的功能性信号传导结构域:OX40,CD2,CD27,CD28,CDS,ICAM-1,LFA-1(CD11a/CD18),ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。
15.权利要求13所述的分离的核酸分子,其中所述共刺激结构域含有SEQ ID NO:7的序列。
16.权利要求14所述的分离的核酸分子,其中所述共刺激结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
17.权利要求13所述的分离的核酸分子,其中编码所述的共刺激结构域的核酸序列含有SEQ ID NO:18的序列。
18.权利要求1所述的分离的核酸分子,其中所述细胞内信号传导结构域包含
(a)4-1BB的功能性信号传导结构域；
(b)CD3ζ的功能性信号传导结构域；
(c)4-1BB的功能性信号传导结构域和CD3ζ的功能性信号传导结构域。
19.权利要求18所述的分离的核酸分子,其中所述细胞内信号传导结构域包含
(a)SEQ ID NO:7的序列；
(b)SEQ ID NO:9的序列；
(c)SEQ ID NO:10的序列；
(d)SEQ ID NO:7的序列和SEQ ID NO:9的序列；或
(e)SEQ ID NO:7的序列和SEQ ID NO:10的序列。
20.权利要求13所述的分离的核酸分子,其中所述的细胞内信号传导结构域包含
(a)SEQ ID NO:7的氨基酸序列和SEQ ID NO:9的氨基酸序列；或
(b)SEQ ID NO:7的氨基酸序列和SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
21.权利要求1所述的分离的核酸分子,其中所述细胞内信号传导结构域包含
(a)SEQ ID NO:7的序列和SEQ ID NO:9的序列；或
(b)SEQ ID NO:7的序列和SEQ ID NO:10的序列,
其中所述的包含所述细胞内信号传导结构域的序列是在同一个框中并且作为单一的多肽链被表达的。
22.权利要求13所述的分离的核酸分子,其中编码所述的细胞内信号传导结构域的核酸序列含有
(a)SEQ ID NO:18的序列和SEQ ID NO:20的序列；或
(b)SEQ ID NO:18的序列和SEQ ID NO:21的序列。
23.权利要求1所述的分离的核酸分子,进一步包含前导序列。
24.权利要求23所述的分离的核酸分子,其中所述的前导序列包含SEQ ID NO:1。
25.由权利要求1-24中任意一项所述的核酸分子编码的分离的多肽分子。
26.权利要求25所述的分离的多肽，其包含SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:73的序列。
27.分离的嵌合抗原受体(CAR)分子，其包含i)抗体或抗体片段，其包括抗间皮素结合结构域,ii)跨膜结构域,和iii)细胞内信号传导结构域，其中所述抗间皮素结合结构域包含：
(a)含有SEQ ID NO:203的LC CDR1；SEQ ID NO:227的LC CDR2，SEQ ID NO:251的LCCDR3的轻链可变区；和含有SEQ ID NO:138的HC CDR1；SEQ ID NO:156的HC CDR2；和SEQ IDNO:179的HC CDR3的重链可变区；或者
(b)含有SEQ ID NO:209的LC CDR1；SEQ ID NO:233的LC CDR2；SEQ ID NO:257的LCCDR3的轻链可变区；和含有SEQ ID NO:144的HC CDR1；SEQ ID NO:162的HC CDR2；和SEQ IDNO:185的HC CDR3的重链可变区。
28.权利要求27所述的分离的CAR分子,其中所述的抗间皮素结合结构域是scFv。
29.权利要求27所述的分离的CAR分子,其中所述的抗间皮素结合结构域包含含有SEQID NO:43或SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:43或SEQ IDNO:49的氨基酸序列的重链可变区。
30.权利要求27所述的分离的CAR分子,其中所述的抗间皮素结合结构域含有SEQ IDNO:43或SEQ ID NO:49的序列。
31.权利要求27所述的分离的CAR分子,其中所述的跨膜结构域包括选自由下列组成的组的蛋白质的跨膜结构域:T细胞受体的α、β或ζ链,CD28,CD3ε,CD45,CD4,CD5,CD8,CD9,CD16,CD22,CD33,CD37,CD64,CD80,CD86,CD134,CD137和CD154。
32.权利要求31所述的分离的CAR分子,其中所述的跨膜结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
33.权利要求27所述的分离的CAR分子,其中所述的跨膜结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
34.权利要求27所述的分离的CAR分子,其中所述的人抗间皮素结合结构域通过铰链区与所述的跨膜结构域相连。
35.权利要求34所述的分离的CAR分子,其中所述的铰链区包含SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:36。
36.权利要求27所述的分离的CAR分子,其中所述的细胞内信号传导结构域包含编码共刺激结构域的序列。
37.权利要求36所述的分离的CAR分子，其中所述的共刺激结构域包含选自由下列组成的组的蛋白质的功能性信号传导结构域:OX40,CD2,CD27,CD28,CDS,ICAM-1,LFA-1(CD11a/CD18),ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。
38.权利要求36所述的分离的CAR分子,其中所述的共刺激结构域包含SEQ ID NO:7的序列。
39.权利要求37所述的分离的CAR分子,其中所述的共刺激结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
40.权利要求27所述的分离的CAR分子,其中所述的细胞内信号传导结构域包含
(a)4-1BB的功能性信号传导结构域和CD3ζ的功能性信号传导结构域；
(b)4-1BB的功能性信号传导结构域；或
(c)CD3ζ的功能性信号传导结构域。
41.权利要求40所述的分离的CAR分子,其中所述的细胞内信号传导结构域包含SEQ IDNO:7的序列和SEQ ID NO:9的序列。
42.权利要求40所述的分离的CAR分子,其中所述的细胞内信号传导结构域包含SEQ IDNO:7的序列和SEQ ID NO:10的序列。
43.权利要求27所述的分离的CAR分子,其中所述的细胞内信号传导结构域包含
(a)SEQ ID NO:7的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO:7的氨基酸序列和SEQ ID NO:9的氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO:9的氨基酸序列；
(d)SEQ ID NO:10的氨基酸序列；
(e)SEQ ID NO:7的氨基酸序列和SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
44.权利要求27所述的分离的CAR分子,其中所述的细胞内信号传导结构域包含
(a)SEQ ID NO:7的序列和SEQ ID NO:9的序列；或
(b)SEQ ID NO:7的序列和SEQ ID NO:10的序列,且
其中所述的包含所述细胞内信号传导结构域的序列是在同一个框中并且以单一的多肽链被表达的。
45.权利要求27所述的分离的CAR分子,进一步包含前导序列。
46.权利要求45所述的分离的CAR分子,其中所述的前导序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
47.抗间皮素结合结构域，其包含
(a)含有SEQ ID NO:203的LC CDR1；SEQ ID NO:227的LC CDR2；SEQ ID NO:251的LCCDR3的轻链可变区；和含有SEQ ID NO:138的HC CDR1；SEQ ID NO:156的HC CDR2；和SEQ IDNO:179的HC CDR3的重链可变区；或
(b)含有SEQ ID NO:209的LC CDR1；SEQ ID NO:233的LC CDR2；SEQ ID NO:257的LCCDR3的轻链可变区；和含有SEQ ID NO: 144的HC CDR1；SEQ ID NO:162的HC CDR2；和SEQID NO:185的HC CDR3的重链可变区。
48.权利要求47所述的抗间皮素结合结构域,其中所述的抗间皮素结合结构域是scFv，其包含选自SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:49的氨基酸序列。
49.权利要求47所述的抗间皮素结合结构域,其中所述的抗间皮素结合结构域包含:
(1)轻链可变区，该轻链可变区含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列；和重链可变区，其含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列；或
(2)轻链可变区，该轻链可变区含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列；和重链可变区，其含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列。
50.载体，其包含编码权利要求27－46中任意一项的CAR的核酸分子。
51.权利要求50所述的载体,其中所述的载体选自由下列组成的组:DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体。
52.权利要求50所述的载体,其进一步包含启动子。
53.权利要求52所述的载体,其中所述的启动子是EF-1启动子。
54.权利要求53所述的载体,其中所述的EF-1启动子包含SEQ ID NO:11的序列。
55.权利要求50所述的载体,其中所述的载体是体外转录的载体。
56.权利要求55所述的载体,其中所述载体中的核酸序列进一步包含聚腺苷酸尾。
57.权利要求55所述的载体,其中所述载体中的核酸序列进一步包含3’非翻译区。
58.包含权利要求50所述的载体的细胞。
59.权利要求58所述的细胞,其中所述的细胞是T细胞。
60.权利要求59所述的细胞,其中所述的T细胞是CD8+T细胞。
61.生产细胞的方法，其包括用权利要求50的载体转导T细胞。
62.产生RNA工程化的细胞群的方法，其包括将体外转录的RNA或合成的RNA引入到细胞中,其中所述的RNA包含编码权利要求27－46中任意一项的CAR分子的核酸。
63.表达权利要求27－46中任意一项的CAR分子的细胞的用途，用于制备在哺乳动物中提供抗癌免疫的药物。
64.权利要求63所述的用途,其中所述的细胞是自体T细胞。
65.权利要求63所述的用途,其中所述的细胞是同种异体的T细胞。
66.权利要求63所述的用途,其中所述的哺乳动物是人。
67.包含权利要求27－46中任意一项的CAR分子的细胞的用途，用于制备在受试者中治疗患有与间皮素的表达相关的疾病的药物。
68.权利要求67所述的用途,其中所述的与间皮素的表达相关的疾病选自增生性疾病、癌症、癌症前期状况或与间皮素的表达相关的非癌症相关的适应症。
69.权利要求67所述的用途,其中所述的与间皮素表达相关的疾病是选自由下列组成的组的癌症:间皮瘤、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌和膀胱癌,或其任何组合。
70.权利要求69所述的用途,其中所述肺癌选自非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、大细胞肺癌和肺腺癌。
71.权利要求69所述的用途,其中所述胰腺癌是转移性胰腺导管腺癌。
72.权利要求69所述的用途，其中所述间皮瘤选自恶性胸膜间皮瘤、恶性腹膜间皮瘤和恶性心包间皮瘤。
73.权利要求69所述的用途，其中所述卵巢癌选自浆液性上皮卵巢癌、原发性腹膜癌和输卵管癌。
74.权利要求58所述的细胞,进一步表达抑制性分子，所述抑制性分子包含与第二多肽结合的第一多肽，该第一多肽包含抑制性分子的至少部分，该第二多肽包含来自细胞内信号传导结构域的阳性信号。
75.权利要求74所述的细胞,其中所述的第一多肽包含至少PD1的部分并且所述的第二多肽包含共刺激结构域和细胞内信号传导结构域。
76.包含权利要求1-24中任意一项的核酸的细胞的用途,用于制备在受试者中治疗与间皮素的表达相关的疾病的药物，其中利用体外转录把所述的核酸引入T细胞或NK细胞中,并且所述的受试者接受包含所述核酸的所述细胞的初次施用,以及一次或更多次后续施用包含所述核酸的细胞,其中所述的一次或更多次后续施用是在所述先前的施用之后少于15天、14,13,12,11,10,9,8,7,6,5,4,3,或2天施用。
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