JP2017522880A - Ｃｄ３３キメラ抗原受容体を使用する癌の処置 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ＣＤ３３の発現と関係する疾患を処置するための組成物および方法に関する。本発明はまた、ＣＤ３３に特異的なキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)、それをコードするベクターおよびＣＤ３３ ＣＡＲを含む組み換えＴ細胞にも関する。本発明はまた、ＣＤ３３結合ドメインを含むＣＡＲを発現する遺伝的に修飾されたＴ細胞を投与することを含む、方法にも関する。

Description

本出願は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１４／０８２５８９(２０１４年７月２１日出願)およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１４／０９０５０４(２０１４年１１月６日出願)に基づく優先権を主張する。これらの内容を、その全体を引用により本明細書に包含させる。
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発明の分野
本発明は、一般に、表面抗原分類３３タンパク質(ＣＤ３３)の発現と関係する疾患を処置するための、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の使用に関する。
発明の背景
急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)の大部分の患者は標準治療を使用して不治であり(Mrozek et al, 2012, J Clin Oncol, 30:4515-23)、再発性または難治性ＡＭＬ(ＲＲ−ＡＭＬ)の患者は特に予後不良である(Kern et al, 2003, Blood 2003, 101:64-70; Wheatley et al, 1999, Br J Haematol, 107:69-79)。
遺伝子工学は、選択した標的に対するＴ細胞特異性を付与できる。Ｔ細胞を、シグナル伝達分子と共に、それにより非ＭＨＣ制限的方法で細胞表面抗原を認識するために、相補性決定領域(ＣＤＲ)を使用して、抗体の単一鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)をコードする遺伝物質で形質導入する。これらの細胞は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)Ｔ細胞と呼ばれる。多様な悪性腫瘍における少なくとも２０の異なる表面分子を標的とするよう試みられた前臨床および臨床は、いくぶん活性を示すが、これらの試みはしばしば注入ＣＡＲ Ｔ細胞産物の乏しい残留性により限定された(Sadelain et al, 2009, Curr Opin Immunol 2009, 21:215-23)。進行型慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)および急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)を有する患者における抗ＣＤ１９再指向Ｔ細胞での最近の成功(Porter et al, 2011, N Engl J Med, 365:725-33; Kalos et al, 2011, Science Transl Med, 3:95ra73; GruppおよびKalos, 2013, N Engl J Med, 368:1509-18)は、これらの細胞が、１回注入後大きな腫瘍負荷を根絶でき、寛解は今まで最大３年持続することを示し、ＣＡＲ Ｔ細胞療法の劇的能力を強調する。動物モデルでＡＭＬを標的とするいくつかの前臨床の試みがある(Marin et al, 2010, Haematologica, 95:2144-52; Tettamanti et al, 2013, Br J Haematol, 161:389-401)。最近公開された小臨床試験は、攻撃的悪性腫瘍を有する患者に対してＴ細胞を産生し、注入することが実現可能であることを示す(Ritchie et al, 2013, Mol Ther,2013 Nov;21(11):2122-9)。遺伝的に修飾されたＴ細胞上のキメラ抗原受容体が標的細胞を認識し、破壊する能力以外に、治療的Ｔ細胞療法の成功は、長期に増殖し、持続する能力を有することおよびさらに白血病性細胞逸脱をモニターすることが必要である。Ｔ細胞の質の変化は、アネルギー、抑制または枯渇のいずれの結果であれ、ＣＡＲ形質転換Ｔ細胞の性能に影響を与え得る。当業者は、現在までＴ細胞の質の変動の限られた制御しかできない。有効であるために、ＣＡＲ形質転換患者Ｔ細胞は、ＣＡＲの抗原に応答して増殖する能力を持続し、維持する必要がある。ＡＬＬ患者からのＴ細胞は、マウスｓｃＦｖを含むＣＡＲＴ１９でこれができることが示されている(例えば、Grupp et al., NEJM 368:1509-1518(2013)参照)。
発明の要約
第一の面において、本発明は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)をコードする単離核酸分子に関し、ここで、ＣＡＲは、ＣＤ３３結合ドメイン(例えば、ヒトまたはヒト化ＣＤ３３結合ドメイン)、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン)を含む抗体または抗体フラグメントを含む。ある態様において、ＣＡＲは、ここに記載するＣＤ３３結合ドメイン(例えば、ここに記載するヒトまたはヒト化ＣＤ３３結合ドメイン)、ここに記載する膜貫通ドメインおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン)を含む抗体または抗体フラグメントを含む。
ある態様において、コードされたＣＤ３３結合ドメインは、ここに記載するＣＤ３３結合ドメインの軽鎖相補的決定領域１(ＬＣ ＣＤＲ１)、軽鎖相補的決定領域２(ＬＣ ＣＤＲ２)および軽鎖相補的決定領域３(ＬＣ ＣＤＲ３)の１以上(例えば、全３)および／またはここに記載するＣＤ３３結合ドメインの重鎖相補的決定領域１(ＨＣ ＣＤＲ１)、重鎖相補的決定領域２(ＨＣ ＣＤＲ２)および重鎖相補的決定領域３(ＨＣ ＣＤＲ３)の１以上(例えば、全３)を含み、例えば、ＬＣ ＣＤＲの１以上、例えば、全３およびＨＣ ＣＤＲの１以上、例えば、全３を含むＣＤ３３結合ドメインを含む。ある態様において、コードされたＣＤ３３結合ドメイン(例えば、ヒトまたはヒト化ＣＤ３３結合ドメイン)は、ここに(例えば、表２または９に)記載された軽鎖可変領域および／またはここに(例えば、表２または９に)記載された重鎖可変領域を含む。ある態様において、コードされたＣＤ３３結合ドメインは、表２または９のアミノ酸配列の軽鎖および重鎖を含むｓｃＦｖである。ある態様において、コードされたＣＤ３３結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖ)は、配列表２または９に提供する軽鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾(例えば、置換、例えば、保存的置換)を有するが、修飾(例えば、置換、例えば、保存的置換)が３０、２０または１０を超えないアミノ酸または表２または９のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域；および／または表２または９に提供する重鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾(例えば、置換、例えば、保存的置換)を有するが、修飾(例えば、置換、例えば、保存的置換)が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列または表２または９のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。
他の態様において、コードされたＣＤ３３結合ドメインは、表２または９に記載されたいずれかのＣＤ３３重鎖結合ドメインアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を含む。ある態様において、ＣＤ３３結合ドメインは、さらにＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３を含む。ある態様において、ＣＤ３３結合ドメインは、表２または９に記載されたいずれかのＣＤ３３軽鎖結合ドメインアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３を含む。
ある態様において、コードされたＣＤ３３結合ドメインは、表２または９に記載されたいずれかのＣＤ３３軽鎖結合ドメインアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３の１、２または全ておよび表２または９に記載されたいずれかのＣＤ３３重鎖結合ドメインアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３の１、２または全てを含む。
ある態様において、コードされたＣＤ３３結合ドメインは、配列番号３９〜４７、５７〜６５、６６〜７４または２６２〜２６８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。ある態様において、コードされたＣＤ３３結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖ)は、列配列番号３９〜４７、５７〜６５、６６〜７４または２６２〜２６８のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾(例えば、置換、例えば、保存的置換)を有するが、修飾(例えば、置換、例えば、保存的置換)が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配または配列番号３９〜４７、５７〜６５、６６〜７４または２６２〜２６８のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。他の態様において、コードされたＣＤ３３結合ドメインは、配列番号５７〜６５からなる群から選択されるアミノ酸配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含むを含む重鎖可変領域を含む。他の態様において、コードされたＣＤ３３結合ドメインは、配列番号６６〜７４からなる群から選択されるアミノ酸配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある態様において、核酸分子は、配列番号２５５〜２６１からなる群から選択されるヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
ある態様において、コードされたＣＤ３３結合ドメインは、(Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ)ｎリンカーを含み、ここで、ｎは１、２、３、４、５または６、好ましくは３または４である(配列番号２６)。ＳｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、次の配向のいずれかであり得る：軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域。
ある態様において、コードされたＣＡＲは、タンパク質、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４から選択される、例えば、ここに記載するタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む。ある態様において、コードされた膜貫通ドメインは、配列番号６の配列を含む。ある態様において、コードされた膜貫通ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を含むが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号６と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、膜貫通ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１７の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
ある態様において、コードされたＣＤ３３結合ドメインは、ヒンジ領域、例えば、ここに記載するヒンジ領域により膜貫通ドメインに結合される。ある態様において、コードされたヒンジ領域は、配列番号２またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、ヒンジ領域をコードする核酸配列は、配列番号１３の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
ある態様において、単離核酸分子さらに共刺激ドメイン、例えば、ここに記載する共刺激ドメインをコードする配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む。
ある態様において、コードされた共刺激ドメインは、例えば、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ性活性化分子(ＳＬＡＭタンパク質)、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃbp、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドから選択される、例えば、ここに記載する、タンパク質から得られる機能的シグナル伝達ドメインである。ある態様において、コードされた共刺激ドメインは４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８またはＩＣＯＳを含む。
ある態様において、コードされた４−１ＢＢの共刺激ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。ある態様において、コードされた共刺激ドメインは、配列番号７または配列番号７と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、共刺激ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１８のヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。他の態様において、コードされたＣＤ２８の共刺激ドメインは、配列番号３７９のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、コードされた共刺激ドメインは、配列番号３７９のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号３７９のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、ＣＤ２８の共刺激ドメインをコードする核酸配列は、配列番号３８０のヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。他の態様において、コードされたＣＤ２７の共刺激ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。ある態様において、コードされた共刺激ドメインは、配列番号８に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号８と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、ＣＤ２７の共刺激ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１９のヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。他の態様において、コードされたＩＣＯＳの共刺激ドメインは、配列番号３８１のアミノ酸配列を含む。ある態様において、コードされたＩＣＯＳの共刺激ドメインは、配列番号３８１のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号３８１のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、ＩＣＯＳの共刺激ドメインをコードする核酸配列は、配列番号３８２のヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
ある態様において、コードされた一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、ＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインは、配列番号９(変異体ＣＤ３ゼータ)または配列番号１０(野生型ヒトＣＤ３ゼータ)のアミノ酸配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
ある態様において、コードされた細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、コードされた細胞内４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列のＣＤ３ゼータを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７および／または配列番号９もしくは配列番号１０に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、コードされた細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７の配列および配列番号９または配列番号１０の配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は、同じフレームにおよび単一ポリペプチド鎖として発現される。ある態様において、細胞内４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１８のヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列および／または配列番号２０もしくは配列番号２１のＣＤ３ゼータヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
ある態様において、コードされた細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７の機能的シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、コードされた細胞内ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のＣＤ３ゼータアミノ酸配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号８および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、コードされた細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８の配列および配列番号９または配列番号１０の配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は、同じフレームにおよび単一ポリペプチド鎖として発現される。ある態様において、細胞内ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１９のヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列および／または配列番号２０もしくは配列番号２１のＣＤ３ゼータヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
ある態様において、コードされた細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８の機能的シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、ＣＤ２８のコードされた細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号３７９のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のＣＤ３ゼータアミノ酸配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号３７９のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列または配列番号３７９のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列を含む。ある態様において、コードされた細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号３７の配列９の配列および配列番号９または配列番号１０の配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は、同じフレームにおよび単一ポリペプチド鎖として発現される。ある態様において、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、配列番号３８０のヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列および／または配列番号２０もしくは配列番号２１のＣＤ３ゼータヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
ある態様において、コードされた細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＣＯＳの機能的シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、ＩＣＯＳのコードされた細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号３８１のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のＣＤ３ゼータアミノ酸配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号３８１のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列または配列番号３８１のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列を含む。ある態様において、コードされた細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号３８１の配列および配列番号９または配列番号１０の配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は、同じフレームにおよび単一ポリペプチド鎖として発現される。ある態様において、ＩＣＯＳの細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、配列番号３８のヌクレオチド配列２のヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列および／または配列番号２０もしくは配列番号２１のＣＤ３ゼータヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
他の面において、本発明は、リーダー配列、例えば、ここに記載するリーダー配列、例えば、配列番号１のアミノ酸配列；ここに記載するＣＤ３３結合ドメイン、例えば、ここに記載するＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、ＬＣ ＣＤＲ３、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３(例えば、表２または９に記載のヒトまたはヒト化ＣＤ３３結合ドメイン)またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含むＣＤ３３結合ドメイン；ここに記載するヒンジ領域、例えば、配列番号２のアミノ酸配列；例えば、配列番号６の配列を有する、ここに記載する膜貫通ドメイン；および細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインを含む、ＣＡＲ構築物をコードする単離核酸分子に関する。ある態様において、コードされた細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメイン、例えば、ここに記載する共刺激ドメイン(例えば、配列番号７のアミノ酸配列を有する４−１ＢＢ共刺激ドメインまたは配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤ２７共刺激ドメイン)および／または一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載する一次シグナル伝達ドメイン(例えば、配列番号９または配列番号１０の配列を有するＣＤ３ゼータ刺激性ドメイン)を含む。ある態様において、ＣＡＲ構築物をコードする単離核酸分子は、配列番号１の核酸配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列によりコードされたリーダー配列を含む。
ある態様において、単離核酸分子は、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５または配列番号５６のＣＡＲアミノ酸配列；または配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５もしくは配列番号５６のアミノ酸配列に１、２または３修飾(例えば、置換)を有するが、修飾(例えば、置換、例えば、保存的置換)が３０、２０または１０を超えないアミノ酸；または配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５もしくは配列番号５６のアミノ酸配列と８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸を含む(例えば、それからなる)。
ある態様において、単離核酸分子は、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２または配列番号８３の核酸配列または配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２または配列番号８３の核酸配列と８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する核酸配列を含む(例えば、それからなる)。
ある面において、本発明は、ＣＤ３３結合ドメインをコードする単離核酸分子に関し、ここで、ＣＤ３３結合ドメインは、ここに記載するＣＤ３３結合ドメインの１以上の(例えば、全３の)軽鎖相補的決定領域１(ＬＣ ＣＤＲ１)、軽鎖相補的決定領域２(ＬＣ ＣＤＲ２)および／または軽鎖相補的決定領域３(ＬＣ ＣＤＲ３)およびここに記載するＣＤ３３結合ドメインの重鎖相補的決定領域１(ＨＣ ＣＤＲ１)、重鎖相補的決定領域２(ＨＣ ＣＤＲ２)および重鎖相補的決定領域３(ＨＣ ＣＤＲ３)の１以上(例えば、全３)、例えば、ヒトまたはヒト化ＬＣ ＣＤＲの１以上、例えば、全３およびＨＣ ＣＤＲの１以上、例えば、全３を含むＣＤ３３結合ドメインを含む。
他の態様において、コードされたＣＤ３３結合ドメインは、表２または９に記載されたいずれかのＣＤ３３重鎖結合ドメインアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を含む。ある態様において、ＣＤ３３結合ドメインは、さらにＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３を含む。ある態様において、ＣＤ３３結合ドメインは、表２または９に記載されたいずれかのＣＤ３３軽鎖結合ドメインアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３を含む。
ある態様において、コードされたＣＤ３３結合ドメインは、表２または９に記載されたいずれかのＣＤ３３軽鎖結合ドメインアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３の１、２または全ておよび表２または９に記載されたいずれかのＣＤ３３重鎖結合ドメインアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３の１、２または全てを含む。
ある態様において、コードされたＣＤ３３結合ドメインは、ここに(例えば、配列番号６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３または７４に)記載する軽鎖可変領域および／または(例えば、配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に)記載する重鎖可変領域を含む。ある態様において、コードされたＣＤ３３結合ドメインは、配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６または４７のアミノ酸配列の軽鎖および重鎖を含むｓｃＦｖである。ある態様において、ＣＤ３３結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖ)は、配列番号６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３または７４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾(例えば、置換、例えば、保存的置換)を有するが、修飾(例えば、置換、例えば、保存的置換)が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列または配列番号６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３または７４のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域；および／または配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５の重鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾(例えば、置換、例えば、保存的置換)を有するが、修飾(例えば、置換、例えば、保存的置換)が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列または配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。ある態様において、ＣＤ３３結合ドメインは、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７からなる群から選択される配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、コードされたＣＤ３３結合ドメインは、ｓｃＦｖを含み、ここに、例えば、表２に記載されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が、ここに、例えば、表２に記載されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に、リンカー、例えば、ここに記載するリンカーにより結合している。ある態様において、コードされたＣＤ３３結合ドメインは、(Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ)ｎリンカー(ここで、ｎは１、２、３、４、５または６、好ましくは４である)(配列番号２６)を含む。ＳｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、次の配向のいずれかであり得る：軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域。
他の面において、本発明は、核酸分子によりコードされた単離ＣＤ３３結合ドメイン(例えば、ポリペプチド、抗体またはそのフラグメント)分子に関する。ある態様において、単離ＣＤ３３結合ドメインは、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６からなる群から選択される配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
他の面において、本発明は、ＣＤ３３結合ドメイン(例えば、ＣＤ３３に特異的に結合するヒトまたはヒト化抗体または抗体フラグメント)、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン)を含む単離キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)分子(例えば、ポリペプチド)に関する。ある態様において、ＣＡＲは、ここに記載するＣＤ３３結合ドメイン(例えば、ここに記載するようなＣＤ３３に特異的に結合するヒトまたはヒト化抗体または抗体フラグメント)、ここに記載する膜貫通ドメインおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含むここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン)を含む抗体または抗体フラグメントを含む。
ある態様において、ＣＤ３３結合ドメインは、ここに記載するＣＤ３３結合ドメインの軽鎖相補的決定領域１(ＬＣ ＣＤＲ１)、軽鎖相補的決定領域２(ＬＣ ＣＤＲ２)および軽鎖相補的決定領域３(ＬＣ ＣＤＲ３)の１以上(例えば、全３)およびここに記載するＣＤ３３結合ドメインの重鎖相補的決定領域１(ＨＣ ＣＤＲ１)、重鎖相補的決定領域２(ＨＣ ＣＤＲ２)および／または重鎖相補的決定領域３(ＨＣ ＣＤＲ３)の１以上(例えば、全３)、例えば、ＬＣ ＣＤＲの１以上、例えば、全３およびＨＣ ＣＤＲの１以上、例えば、全３を含むＣＤ３３結合ドメインを含む。ある態様において、ＣＤ３３結合ドメインは、ここに(例えば、表２に)記載する軽鎖可変領域および／またはここに(例えば、表２または９に)記載された重鎖可変領域を含む。ある態様において、ＣＤ３３結合ドメインは、表２または９に記載のアミノ酸配列の軽鎖および重鎖を含むｓｃＦｖである。ある態様において、ＣＤ３３結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖ)は、表２または９に提供する軽鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾(例えば、置換、例えば、保存的置換)を有するが、修飾(例えば、置換、例えば、保存的置換)が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列または表２または９に提供するアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域；および／または表２または９に提供する重鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾(例えば、置換、例えば、保存的置換)を有するが、修飾(例えば、置換、例えば、保存的置換)が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列または表２または９に提供するアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。
他の態様において、ＣＤ３３結合ドメインは、表２または９に記載されたいずれかのＣＤ３３重鎖結合ドメインアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を含む。ある態様において、ＣＤ３３結合ドメインは、さらにＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３を含む。ある態様において、ＣＤ３３結合ドメインは、表２または９に記載するＣＤ３３軽鎖結合ドメインアミノ酸配列のいずれかのＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３を含む。
ある態様において、ＣＤ３３結合ドメインは、表２または９に記載されたいずれかのＣＤ３３軽鎖結合ドメインアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３の１、２または全ておよび表２または９に記載されたいずれかのＣＤ３３重鎖結合ドメインアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３の１、２または全てを含む。
ある態様において、ＣＤ３３結合ドメインは、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号５７〜７４または配列番号２６２〜２６８からなる群から選択される配列；または上記配列に少なくとも１、２または３修飾(例えば、置換、例えば、保存的置換)を有するが、修飾(例えば、置換、例えば、保存的置換)が３０、２０または１０を超えないアミノまたは上記配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、ＣＤ３３結合ドメインはｓｃＦｖであり、ここに、例えば、表２または９に記載されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が、ここに、例えば、表２または９に記載されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に、リンカー、例えば、ここに記載するリンカーにより結合している。ある態様において、ＣＤ３３結合ドメインは、(Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ)ｎリンカー(ここで、ｎは１、２、３、４、５または６、好ましくは４である)(配列番号２６)を含む。ＳｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、次の配向のいずれかであり得る：軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域。
ある態様において、単離ＣＡＲ分子は、タンパク質、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群から選択される、例えば、ここに記載するタンパク質の膜貫通ドメインを含む。ある態様において、膜貫通ドメインは、配列番号６の配列を含む。ある態様において、膜貫通ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列の少なくとも１、２または３修飾(例えば、置換、例えば、保存的置換)を有する、しかし修飾(例えば、置換、例えば、保存的置換)が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号６と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
ある態様において、ＣＤ３３結合ドメインは、ヒンジ領域により膜貫通ドメインに結合される、例えば、ここに記載するヒンジ領域。ある態様において、コードされたヒンジ領域は、配列番号２またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含むを含む。
ある態様において、単離ＣＡＲ分子さらに共刺激ドメインをコードする配列、例えば、ここに記載する共刺激ドメインを含む。
ある態様において、単離ＣＡＲ分子の細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインを含む。ある態様において、単離ＣＡＲ分子の細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、単離ＣＡＲ分子の細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む。
ある態様において、共刺激ドメインは、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ性活性化分子(ＳＬＡＭタンパク質)、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃbp、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。
ある態様において、４−１ＢＢの共刺激ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。ある態様において、共刺激ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾(例えば、置換、例えば、保存的置換)を有するが、修飾(例えば、置換、例えば、保存的置換)が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号７と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。他の態様において、ＣＤ２８の共刺激ドメインは、配列番号３７９のアミノ酸配列を含む。ある態様において、共刺激ドメインは、配列番号３７９のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号３７９のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。他の態様において、ＣＤ２７の共刺激ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。ある態様において、共刺激ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号８のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。他の態様において、ＩＣＯＳの共刺激ドメインは、配列番号３８１のアミノ酸配列を含む。ある態様において、共刺激ドメインは、配列番号３８１のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号３８１のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
ある態様において、一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、ＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインは、配列番号９(変異体ＣＤ３ゼータ)または配列番号１０(野生型ヒトＣＤ３ゼータ)またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾(例えば、置換、例えば、保存的置換)を有するが、修飾(例えば、置換、例えば、保存的置換)が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号７および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７の配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０の配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は、同じフレームにおよび単一ポリペプチド鎖として発現される。
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７の機能的シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、細胞内ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のＣＤ３ゼータアミノ酸配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾)を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号８および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８の配列および配列番号９または配列番号１０の配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は、同じフレームにおよび単一ポリペプチド鎖として発現される。
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８の機能的シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、ＣＤ２８のコードされた細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号３７９のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のＣＤ３ゼータアミノ酸配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号３７９のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列または配列番号３７９のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号３７の配列および配列番号９または配列番号１０の配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は、同じフレームにおよび単一ポリペプチド鎖として発現される。
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＣＯＳの機能的シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、ＩＣＯＳの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号３８１のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のＣＤ３ゼータアミノ酸配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号３８１のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号３８１および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、コードされた細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号３８１の配列および配列番号９または配列番号１０の配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は、同じフレームにおよび単一ポリペプチド鎖として発現される。
ある態様において、単離ＣＡＲ分子は、さらにリーダー配列、例えば、ここに記載するリーダー配列を含む。ある態様において、リーダー配列は、配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
他の面において、本発明は、リーダー配列、例えば、ここに記載するリーダー配列、例えば、配列番号１の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有するリーダー配列、ここに記載するＣＤ３３結合ドメイン、例えば、ここに記載するＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、ＬＣ ＣＤＲ３、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を含むＣＤ３３結合ドメイン、例えば、表２に記載するＣＤ３３結合ドメインまたはそれと９５〜９９％同一性を有する配列、ヒンジ領域、例えば、ここに記載するヒンジ領域、例えば、配列番号２またはそれと９５〜９９％同一性を有するヒンジ領域、膜貫通ドメイン、例えば、ここに記載する膜貫通ドメイン、例えば、配列番号６の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を有する膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン)を含む、単離ＣＡＲ分子に関する。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメイン、例えば、ここに記載する共刺激ドメイン、例えば、配列番号７の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する４−１ＢＢ共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載する一次シグナル伝達ドメイン、例えば、配列番号９または配列番号１０の配列を有するまたはそれと９５〜９９％同一性を有するＣＤ３ゼータ刺激性ドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメイン、例えば、ここに記載する共刺激ドメイン、例えば、配列番号７の配列を有する４−１ＢＢ共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載する一次シグナル伝達ドメイン、例えば、配列番号９または配列番号１０の配列を有するＣＤ３ゼータ刺激性ドメインを含む。
ある態様において、単離ＣＡＲ分子は、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５もしくは配列番号５６のアミノ酸配列または配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５もしくは配列番号５６のアミノ酸配列の少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０または３０修飾(例えば、置換、例えば、保存的置換)を有するが、６０、５０または４０修飾(例えば、置換、例えば、保存的置換)を超えないアミノ酸配列または配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５もしくは配列番号５６のアミノ酸配列と８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む(例えば、それからなる)。
ある面において、本発明は、ここに記載するＣＤ３３結合ドメインの軽鎖相補的決定領域１(ＬＣ ＣＤＲ１)、軽鎖相補的決定領域２(ＬＣ ＣＤＲ２)および軽鎖相補的決定領域３(ＬＣ ＣＤＲ３)の１以上(例えば、全３)および／またはここに記載するＣＤ３３結合ドメインの重鎖相補的決定領域１(ＨＣ ＣＤＲ１)、重鎖相補的決定領域２(ＨＣ ＣＤＲ２)および重鎖相補的決定領域３(ＨＣ ＣＤＲ３)の１以上(例えば、全３)、例えば、ＬＣ ＣＤＲの１以上、例えば、全３およびＨＣ ＣＤＲの１以上、例えば、全３を含むＣＤ３３結合ドメインを含む、ＣＤ３３結合ドメインに関する。
他の態様において、ＣＤ３３結合ドメインは、表２または９に記載されたいずれかのＣＤ３３重鎖結合ドメインアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を含む。ある態様において、ＣＤ３３結合ドメインは、さらにＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３を含む。ある態様において、ＣＤ３３結合ドメインは、表２または９に記載のいずれかのＣＤ３３軽鎖結合ドメインアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３を含む
ある態様において、ＣＤ３３結合ドメインは、表２または９に記載されたいずれかのＣＤ３３軽鎖結合ドメインアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３の１、２または全ておよび表２または９に記載されたいずれかのＣＤ３３重鎖結合ドメインアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３の１、２または全てを含む。
ある態様において、ＣＤ３３結合ドメインは、ここに(例えば、配列番号６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３または７４に)記載する軽鎖可変領域および／またはここに(例えば配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に)記載する重鎖可変領域を含む。ある態様において、ＣＤ３３結合ドメインは、配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６または４７のアミノ酸配列の軽鎖および重鎖を含むｓｃＦｖを含む。ある態様において、ＣＤ３３結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖ)は、配列番号６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３または７４に提供する軽鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾(例えば、置換、例えば、保存的置換)を有するが、修飾(例えば、置換、例えば、保存的置換)が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列または配列番号６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３または７４のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域；および／または配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に提供する重鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾(例えば、置換、例えば、保存的置換)を有するが、修飾(例えば、置換、例えば、保存的置換)が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列または配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。ある態様において、ＣＤ３３結合ドメインは、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７からなる群から選択される配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、ＣＤ３３結合ドメインはｓｃＦｖであり、ここに、例えば、表２または９に記載されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が、ここに、例えば、表２または９に記載されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に、リンカー、例えば、ここに記載するリンカーを介して結合している。ある態様において、ＣＤ３３結合ドメインは、(Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ)ｎリンカー(ここで、ｎは１、２、３、４、５または６、好ましくは４である)(配列番号２６)を含む。ＳｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、次の配向のいずれかであり得る：軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域。
他の面において、本発明は、ここに記載する核酸分子、例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸分子を含むベクターに関する。ある態様において、ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターからなる群から選択さっる。
ある態様において、ベクターはレンチウイルスベクターである。ある態様において、ベクターは、さらにプロモーターを含む。ある態様において、プロモーターは、ＥＦ−１プロモーターである。ある態様において、ＥＦ−１プロモーターは、配列番号１１の配列を含む。他の態様において、プロモーターは、ＰＧＫプロモーター、例えば、ここに記載するような切断ＰＧＫプロモーターである。
ある態様において、ベクターは、インビトロ転写ベクター、例えば、ここに記載する核酸分子のＲＮＡを転写するベクターである。ある態様において、ベクターにおける核酸配列は、さらに、例えば、約１５０アデノシン塩基(配列番号３７７)を含む、ポリ(Ａ)テイル、例えば、ここに記載するポリＡテイルを含む。ある態様において、ベクターにおける核酸配列は、さらに３’ＵＴＲ、例えば、ヒトベータ−グロブリン由来の３’ＵＴＲの少なくとも一つのを含む、例えば、ここに記載する３’ＵＴＲを含む。ある態様において、ベクターにおける核酸配列は、さらにプロモーター、例えば、Ｔ２Ａプロモーターを含む。
他の面において、本発明は、ここに記載するベクターを含む細胞に関する。ある態様において、細胞は、ここに記載する細胞、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、ヒトＴ細胞、例えば、ここに記載するヒトＴ細胞またはヒトＮＫ細胞、例えば、ここに記載するヒトＮＫ細胞である。ある態様において、ヒトＴ細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、他の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤をさらに発現できる。例えば、ある態様において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であり得る。阻害分子の例は、例えば、ここに記載するように、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータを含む。ある態様において、阻害分子を阻害する薬剤は、細胞に正のシグナルを提供する第二ポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインに結合した、第一ポリペプチド、例えば、阻害分子を含む。ある態様において、薬剤は、例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＣＴＬＡ４、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ３、２Ｂ４、ＴＧＦＲベータ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＩＧＩＴまたはこれらのいずれかのフラグメント(例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部分)のような阻害分子の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインである第二ポリペプチド(例えば、共刺激ドメイン(例えば、ここに記載のような、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)を含む)を含む。ある態様において、薬剤は、ＰＤ１またはそのフラグメント(例えば、ＰＤ１の少なくとも細胞外ドメインの部分)の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインの第二ポリペプチド(例えば、ここに記載するＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／またはここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)を含む。
他の面において、本発明は、ここに記載する細胞、例えば、ここに記載する免疫エフェクター細胞、例えば、ここに記載するＴ細胞またはＮＫ細胞を、ＣＡＲをコードする核酸、例えば、ここに記載するＣＡＲを含むベクターで形質導入することを含む、細胞を製造する方法に関する。
本発明はまた、一過性に外来性ＲＮＡを発現する、ＲＮＡ操作細胞、例えば、ここに記載された細胞、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の集団を産生する方法も提供する。方法は、インビトロ転写ＲＮＡまたは合成ＲＮＡを細胞に導入することを含み、ここで、ＲＮＡは、ここに記載するＣＡＲ分子をコードする核酸を含む。
他の面において、本発明は、哺乳動物に、有効量のＣＡＲ分子を発現する細胞、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞を投与することを含む、哺乳動物に抗腫瘍免疫を提供する方法に関する。ある態様において、細胞は、自己免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。ある態様において、細胞は、同種異系免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。ある態様において、哺乳動物は、ヒト、例えば、血液癌を有する患者である。
他の面において、本発明は、哺乳動物に有効量のＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞を投与することを含む、ＣＤ３３の発現と関係する疾患(例えば、ＣＤ３３の発現と関係する増殖性疾患、前癌状態および非癌関連徴候)を有する哺乳動物を処置する方法を提供する。ある態様において、哺乳動物は、ヒト、例えば、血液癌を有する患者である。
ある態様において、疾患は、ここに記載する疾患である。ある態様において、ＣＤ３３発現と関係する疾患は、癌もしくは悪性腫瘍または骨髄異形成、骨髄異形成症候群もしくは前白血病のような前癌状態のような増殖性疾患から選択されるかまたはＣＤ３３の発現と関係する非癌関連徴候である。ある態様において、疾患は、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)を含むが、これに限定されない１以上の急性白血病；骨髄異形成症候群；骨髄増殖性新生物；慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)；芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物；およびＣＤ３３を発現する非定型および／または非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態または増殖性疾患を含むが、これらに限定されないＣＤ３３発現と関係する疾患；およびこれらの組み合わせからなる群から選択される血液癌である。
ある態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞を、ＣＡＲ分子を発現する細胞の効果を高める薬剤、例えば、ここに記載する薬剤と組み合わせて投与する。
他の面において、本発明は、対象に有効量のここに開示するＣＡＲ分子を含む細胞を投与することを含む、細胞移植前に対象をコンディショニングする方法に関する。ある態様において、細胞移植は幹細胞移植である。幹細胞移植は造血幹細胞移植または骨髄移植である。ある態様において、細胞移植は同種または自己である。
ある態様において、細胞移植前の対象のコンディショニングは、対象におけるＣＤ３３発現細胞の数を減らすことを含む。対象におけるＣＤ３３発現細胞はＣＤ３３発現正常細胞またはＣＤ３３発現癌細胞であり、ある場合、対象におけるコンディショニングは、細胞移植前にＣＤ３３発現正常および癌細胞の両者を減らす。
ある態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞を、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて投与する。理論に縛られることを望まないが、低い免疫増強用量(例えば、免疫系を完全に抑制するには不十分であるが、免疫機能の改善には十分である用量)での処置は、ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞減少またはＰＤ−１陰性細胞の増加を伴うと考えられる。ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)ではなく、ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)が、ＰＤ−１リガンド、例えば、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を発現する細胞との結合により枯渇させられ得る。
ある態様において、この試みは、対象におけるここに記載されたＣＡＲ細胞の性能を最適化するために使用される。理論に縛られることを望まないが、ある態様において、内在性、非修飾免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の性能が改善されると考えられる。理論に縛られることを望まないが、ある態様において、ＣＤ３３ ＣＡＲ発現細胞の性能が改善されると考えられる。他の態様において、ＣＡＲを発現するように操作されているまたは操作される細胞、例えば、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を、エクスビボでＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞ＮＫ細胞数増加またはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞比を増加させる量のｍＴＯＲ阻害剤との接触により処置する。
ある態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤の投与を、ここに記載するＣＡＲ発現細胞、例えば、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)の投与前に開始する。ある態様において、ＣＡＲ細胞を、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞のレベルまたはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞比が、少なくとも一過性に、増加するように、十分な時間または十分な投薬後に投与する。ある態様において、ＣＡＲを発現するように操作する細胞、例えば、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を、対象または対象からの採取物においてＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞のレベルまたはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞比が、少なくとも一過性に、増加するように、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の十分な時間または十分な投薬後に採取する。
ある態様において、本発明は、対象の処置に使用するためのｍＴＯＲ阻害剤を提供し、ここで、該ｍＴＯＲ阻害剤は該対象の免疫応答を増強し、ここで、該対象は、ここに記載するようにＣＤ３３ ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を受けているまたは受けようとしている。
ある態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞を、ＣＡＲ分子を発現する細胞の投与と関係する１以上の副作用を軽減する薬剤、例えば、ここに記載する薬剤と組み合わせて投与する。
ある態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞を、ＣＤ３３と関係する疾患を処置する薬剤、例えば、ここに記載する薬剤と組み合わせて投与する。ある態様において、ＣＤ３３と関係する疾患は、癌もしくは悪性腫瘍または骨髄異形成、骨髄異形成症候群もしくは前白血病のような前癌状態のような増殖性疾患またはＣＤ３３の発現と関係する非癌関連徴候である。
ある態様において、ＣＤ３３と関係する疾患は、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)を含むが、これに限定されない１以上の急性白血病；骨髄異形成症候群；骨髄増殖性新生物；慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)；芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物；およびＣＤ３３を発現する非定型および／または非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態または増殖性疾患を含むが、これらに限定されないＣＤ３３発現と関係する疾患；およびこれらの組み合わせからなる群から選択される血液癌である。
ある態様において、ここに記載するＣＤ３３ ＣＡＲは、ＣＤ３３発現細胞を標的とする。ある態様において、ここに記載するＣＤ３３ ＣＡＲは、ＭＤＳ芽細胞を標的とする。ある態様において、ＭＤＳ芽細胞は、５ｑ欠失(ｄｅｌ(５ｑ))を含む。ある態様において、ここに記載するＣＤ３３ ＣＡＲ発現細胞を使用して、ＭＤＳを有する対象を処置する。ある態様において、ここに記載するＣＤ３３ ＣＡＲ発現細胞を使用して、孤立性ｄｅｌ(５ｑ)と関係するＭＤＳを有する対象を処置する。
ある態様において、ここに記載するＣＤ３３ ＣＡＲは、ＭＤＳＣ、例えば、癌(例えば、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病または卵巣癌、結腸癌または乳癌のような固形悪性腫瘍)を有する対象におけるＭＤＳＣを標的とする。ある態様において、ＭＤＳＣは、細胞系譜陰性(ＬＩＮ−)、ＨＬＡ−ＤＲ陰性およびＣＤ３３陽性である。ある態様において、ここに記載するＣＤ３３ ＣＡＲ発現細胞は、ＭＤＳ芽細胞およびＭＤＳＣを標的とする。ある態様において、ここに記載するＣＤ３３ ＣＡＲ発現細胞を使用して、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)または卵巣癌、結腸癌または乳癌のような固形悪性腫瘍を処置する。
他の面において、本発明は、例えば、ここに使用するような、医薬として使用するための、本発明のＣＡＲをコードする単離核酸分子、本発明のＣＡＲの単離ポリペプチド分子、本発明のＣＡＲを含むベクターおよび本発明のＣＡＲを含む細胞に関する。
他の面において、本発明は、本発明のＣＡＲをコードする単離核酸分子、本発明のＣＡＲの単離ポリペプチド分子、本発明のＣＡＲを含むベクターおよび本発明のＣＡＲを含む細胞を、ＣＤ３３を発現する疾患、例えば、ここに記載するようなＣＤ３３を発現する疾患の処置に使用する。
前記組成物および方法のさらなる性質および態様は、次の１以上を含む。
ある態様において、ＣＤ３３ ＣＡＲ分子(例えば、ここに記載するようなＣＤ３３ ＣＡＲ核酸またはＣＤ３３ ＣＡＲポリペプチド)またはここに記載するようなＣＤ３３結合ドメインは、表３に提供する重鎖可変領域からの１、２または３ＣＤＲ(例えば、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２および／またはＨＣ ＣＤＲ３)；および／または表４に提供するＣＡＲ３３−１、ＣＡＲ３３−２、ＣＡＲ３３−３、ＣＡＲ３３−４、ＣＡＲ３３−５、ＣＡＲ３３−６、ＣＡＲ３３−７、ＣＡＲ３３−８、ＣＡＲ３３−９の軽鎖可変領域からの１、２または３ＣＤＲ(例えば、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２および／またはＬＣ ＣＤＲ３)；または前記のいずれかと実質的に同一(例えば、９５〜９９％同一または最大５、４、３、２または１アミノ酸変化、例えば、置換(例えば、保存的置換))である配列を含む。
ある態様において、ＣＤ３３ ＣＡＲ分子(例えば、ここに記載するようなＣＤ３３ ＣＡＲ核酸またはＣＤ３３ ＣＡＲポリペプチド)またはここに記載するような抗ＣＤ３３抗原結合ドメインは、表１０に提供する重鎖可変領域からの１、２または３ＣＤＲ(例えば、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２および／またはＨＣ ＣＤＲ３)に提供する重鎖可変領域からの１、２または３ＣＤＲ(例えば、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２および／またはＨＣ ＣＤＲ３)；および／または表１１に提供するＣＡＲ３３−１、ＣＡＲ３３−２、ＣＡＲ３３−３、ＣＡＲ３３−４、ＣＡＲ３３−５、ＣＡＲ３３−６、ＣＡＲ３３−７、ＣＡＲ３３−８、ＣＡＲ３３−９の軽鎖可変領域からの１、２または３ＣＤＲ(例えば、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２および／またはＬＣ ＣＤＲ３)；または前記のいずれかと実質的に同一(例えば、９５〜９９％同一または最大５、４、３、２または１アミノ酸変化、例えば、置換(例えば、保存的置換))である配列を含む。
ある態様において、ＣＤ３３ ＣＡＲ分子または抗ＣＤ３３抗原結合ドメインは、表１２に提供する重鎖可変領域からの１、２または３ＣＤＲ(例えば、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２および／またはＨＣ ＣＤＲ３)；および／または表１３に提供するＣＡＲ３３−１、ＣＡＲ３３−２、ＣＡＲ３３−３、ＣＡＲ３３−４、ＣＡＲ３３−５、ＣＡＲ３３−６、ＣＡＲ３３−７、ＣＡＲ３３−８、ＣＡＲ３３−９の軽鎖可変領域からの１、２または３ＣＤＲ(例えば、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２および／またはＬＣ ＣＤＲ３)；または前記のいずれかと実質的に同一(例えば、９５〜９９％同一または最大５、４、３、２または１アミノ酸変化、例えば、置換(例えば、保存的置換))である配列を含む。
ある態様において、ＣＤ３３ ＣＡＲ分子または抗ＣＤ３３抗原結合ドメインは、
(ｉ)表２または９に記載されたいずれかのＣＤ３３軽鎖結合ドメインアミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３または表４、９、１１または１３におけるＬＣ ＣＤＲ；および／または
(ii)表２または９に記載されたいずれかのＣＤ３３重鎖結合ドメインアミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３または表３、９、１０または１２におけるＨＣ ＣＤＲ
を含む。
ある態様において、ＣＤ３３ ＣＡＲ分子(例えば、ここに記載するようなＣＤ３３ ＣＡＲ核酸またはＣＤ３３ ＣＡＲポリペプチド)またはここに記載するような抗ＣＤ３３抗原結合ドメインは、
(１)次の一つから選択される３軽鎖(ＬＣ)ＣＤＲ：
(ｉ)ＣＡＲ３３−１の配列番号１１１のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号１２０のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号１２９のＬＣ ＣＤＲ３；
(ii)ＣＡＲ３３−２の配列番号１１２のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号１２１のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号１３０；
(iii)ＣＡＲ３３−３の配列番号１１３のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号１２２のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号１３１のＬＣ ＣＤＲ３；
(iv)ＣＡＲ３３−４の配列番号１１４のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号１２３のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号１３２のＬＣ ＣＤＲ３；
(iv)ＣＡＲ３３−５の配列番号１１５のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号１２４のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号１３３のＬＣ ＣＤＲ３；
(vi)ＣＡＲ３３−６の配列番号１１６のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号１２５のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号１３４のＬＣ ＣＤＲ３；
(vii)ＣＡＲ３３−７の配列番号１１７のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号１２６のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号１３５のＬＣ ＣＤＲ３；
(viii)ＣＡＲ３３−８の配列番号１１８のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号１２７のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号１３６のＬＣ ＣＤＲ３；または
(ix)ＣＡＲ３３−９の配列番号１１９のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号１２８のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号１３７のＬＣ ＣＤＲ３；および／または
(２)次の一つから選択される３重鎖(ＨＣ)ＣＤＲ：
(ｉ)ＣＡＲ３３−１の配列番号８４のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号９３のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号１０２のＨＣ ＣＤＲ３；
(ii)ＣＡＲ３３−２の配列番号８５のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号９４のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号１０３のＨＣ ＣＤＲ３；
(iii)ＣＡＲ３３−３の配列番号８６のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号９５のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号１０４のＨＣ ＣＤＲ３；
(iv)ＣＡＲ３３−４の配列番号８７のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号９６のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号１０５のＨＣ ＣＤＲ３；
(iv)ＣＡＲ３３−５の配列番号８８のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号９７のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号１０６のＨＣ ＣＤＲ３；
(vi)ＣＡＲ３３−６の配列番号８９のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号９８のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号１０７のＨＣ ＣＤＲ３；
(vii)ＣＡＲ３３−７の配列番号９０のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号９９のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号１０８のＨＣ ＣＤＲ３；
(viii)ＣＡＲ３３−８の配列番号９１のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号１００のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号１０９のＨＣ ＣＤＲ３；または
(ix)ＣＡＲ３３−９の配列番号９２のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号１０１のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号１１０のＨＣ ＣＤＲ３
を含む。
ある態様において、ＣＤ３３ ＣＡＲ分子(例えば、ここに記載するようなＣＤ３３ ＣＡＲ核酸またはＣＤ３３ ＣＡＲポリペプチド)またはここに記載するような抗ＣＤ３３抗原結合ドメインは、
(１)次の一つから選択される３軽鎖(ＬＣ)ＣＤＲ：
(ｉ)ＣＡＲ３３−１の配列番号２９６のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３０５のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３１４のＬＣ ＣＤＲ３；
(ii)ＣＡＲ３３−２の配列番号２９７のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３０６のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３１５のＬＣ ＣＤＲ３；
(iii)ＣＡＲ３３−３の配列番号２９８のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３０７のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３１６のＬＣ ＣＤＲ３；
(iv)ＣＡＲ３３−４の配列番号２９９のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３０８のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３１７のＬＣ ＣＤＲ３；
(iv)ＣＡＲ３３−５の配列番号３００のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３０９のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３１８のＬＣ ＣＤＲ３；
(vi)ＣＡＲ３３−６の配列番号３０１のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３１０のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３１９のＬＣ ＣＤＲ３；
(vii)ＣＡＲ３３−７の配列番号３０２のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３１１のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３２０のＬＣ ＣＤＲ３；
(viii)ＣＡＲ３３−８の配列番号３０３のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３１２のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３２１のＬＣ ＣＤＲ３；または
(ix)ＣＡＲ３３−９の配列番号３０４のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３１３のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３２２のＬＣ ＣＤＲ３；および／または
(２)次の一つから選択される３重鎖(ＨＣ)ＣＤＲ：
(ｉ)ＣＡＲ３３−１の配列番号２６９のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号２７８のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号２８７のＨＣ ＣＤＲ３；
(ii)ＣＡＲ３３−２の配列番号２７１のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号２８０のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号２８９のＨＣ ＣＤＲ３；
(iii)配列番号２７１のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号２８０のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号２８９のＨＣ ＣＤＲ３のＣＡＲ３３−３；
(iv)ＣＡＲ３３−４の配列番号２７２のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号２８１のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号２９０のＨＣ ＣＤＲ３；
(iv)ＣＡＲ３３−５の配列番号２７３のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号２８２のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号２９１のＨＣ ＣＤＲ３；
(vi)ＣＡＲ３３−６の配列番号２７４のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号２８３のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号２９２のＨＣ ＣＤＲ３；
(vii)ＣＡＲ３３−７の配列番号２７５のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号２８４のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号２９３のＨＣ ＣＤＲ３；
(viii)ＣＡＲ３３−８の配列番号２７６のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号２８５のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号２９４のＨＣ ＣＤＲ３；または
(ix)ＣＡＲ３３−９の配列番号２７７のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号２８６のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号２９５のＨＣ ＣＤＲ３
を含む。
ある態様において、ＣＤ３３ ＣＡＲ分子(例えば、ここに記載するようなＣＤ３３ ＣＡＲ核酸またはＣＤ３３ ＣＡＲポリペプチド)またはここに記載するような抗ＣＤ３３抗原結合ドメインは、
(１)次の一つから選択される３軽鎖(ＬＣ)ＣＤＲ：
(ｉ)ＣＡＲ３３−１の配列番号３５０のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３５９のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３６８のＬＣ ＣＤＲ３；
(ii)ＣＡＲ３３−２の配列番号３５１のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３６０のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３６９のＬＣ ＣＤＲ３；
(iii)ＣＡＲ３３−３の配列番号３５２のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３６１のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３７０のＬＣ ＣＤＲ３；
(iv)ＣＡＲ３３−４の配列番号３５３のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３６２のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３７１のＬＣ ＣＤＲ３；
(iv)ＣＡＲ３３−５の配列番号３５４のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３６３のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３７２のＬＣ ＣＤＲ３；
(vi)ＣＡＲ３３−６の配列番号３５５のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３６４のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３７３のＬＣ ＣＤＲ３；
(vii)ＣＡＲ３３−７の配列番号３５６のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３６５のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３７４のＬＣ ＣＤＲ３；
(viii)ＣＡＲ３３−８の配列番号３５７のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３６６のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３７５のＬＣ ＣＤＲ３；または
(ix)ＣＡＲ３３−９の配列番号３５８のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３６７のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３７６のＬＣ ＣＤＲ３；および／または
(２)次の一つから選択される３重鎖(ＨＣ)ＣＤＲ：
(ｉ)ＣＡＲ３３−１の配列番号３２３のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号３３２のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号３４１のＨＣ ＣＤＲ３；
(ii)ＣＡＲ３３−２の配列番号３２４のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号３３３のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号３４２のＨＣ ＣＤＲ３；
(iii)ＣＡＲ３３−３の配列番号３２５のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号３３４のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号３４３のＨＣ ＣＤＲ３；
(iv)ＣＡＲ３３−４の配列番号３２６のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号３３５のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号３４４のＨＣ ＣＤＲ３；
(iv)ＣＡＲ３３−５の配列番号３２７のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号３３６のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号３４５のＨＣ ＣＤＲ３；
(vi)ＣＡＲ３３−６の配列番号３２８のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号３３７のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号３４６のＨＣ ＣＤＲ３；
(vii)ＣＡＲ３３−７の配列番号３２９のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号３３８のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号３４７のＨＣ ＣＤＲ３；
(viii)ＣＡＲ３３−８の配列番号３３０のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号３３９のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号３４８のＨＣ ＣＤＲ３；または
(ix)ＣＡＲ３３−９の配列番号３３１のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号３４０のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号３４９のＨＣ ＣＤＲ３
を含む。
ある態様において、ＣＤ３３ ＣＡＲ分子(例えば、ここに記載するようなＣＤ３３ ＣＡＲ核酸またはＣＤ３３ ＣＡＲポリペプチド)またはここに記載するような抗ＣＤ３３抗原結合ドメインは、２２１３ ｓｃＦｖアミノ酸配列(配列番号１４２)または２２１３ ｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列(配列番号１４１)またはその抗原結合ドメイン(例えば、そのＶＨ、ＶＬまたは１以上のＣＤＲ)を含む。
ある態様において、ＣＤ３３ ＣＡＲ分子(例えば、ここに記載するようなＣＤ３３ ＣＡＲ核酸またはＣＤ３３ ＣＡＲポリペプチド)またはここに記載するような抗ＣＤ３３抗原結合ドメインは、ｍｙ９６ ｓｃＦｖアミノ酸配列(配列番号１４７)またはその抗原結合ドメイン(例えば、そのＶＨ、ＶＬまたは１以上のＣＤＲ)を含む。
特記しない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により共通して理解される意味を有する。本発明の実施または試験にここに記載するものに類似するまたは同等な方法および材料を使用できるが、適当な方法および材料を下に記載する。ここに記載するすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体を引用により本明細書に包含させる。加えて材料、方法および実施例は説明のためのみであり、限定する意図はない。タイトル、サブタイトルまたは番号または文字表記、例えば、(ａ)、(ｂ)、(ｉ)などは、読みやすくするためだけのものである。本明細書におけるタイトルまたは番号または文字表記の使用は、当該工程または要素がアルファベット順で実施すべきであることまたは工程もしくは要素が必ず互いに分離していることを必要とするものではない。本発明の他の特性、目的および利点は、明細書および図面ならびに特許請求の範囲から明らかである。
好ましい本発明の態様の次の詳細な記載は、添付する図面と組み合わせてみたとき、よりよく理解される。本発明の説明の目的で、現時点で好ましい態様を図に示す。しかしながら、本発明は図面に示す厳密な配置および装置に限定されないことは理解すべきである。
図１は、ＣＤ３３が、ＡＭＬを有する多くの初代患者サンプルにおける大部分の芽細胞で発現されることを示す図である(ＡＭＬ芽細胞を、標準側方散乱光低ＣＤ４５ｄｉｍ特徴を使用してゲーティングした)；群あたりｎ＝３５〜４６。
図２Ａ〜２Ｃは、骨髄異形成症候群患者からの骨髄にけるＣＤ３３の発現を示すグラフおよびフローサイトメトリープロファイルである。図２Ａは、ＭＤＳ患者におけるＣＤ３４＋ ＣＤ３８−造血幹細胞区画におけるＣＤ３３発現細胞のパーセンテージを示す。図２Ｂは、ＭＤＳ患者における骨髄前駆細胞含有ＣＤ３４＋ ＣＤ３８＋区画におけるＣＤ３３発現細胞のパーセンテージを示す。図２Ｃは、ＭＤＳ患者からのＣＤ３４＋ ＣＤ３８−区画における平均蛍光強度を示すヒストグラムである。
図３は、実施例１において使用したＣＡＲ構築物の略図である。全ては、４１ＢＢおよびＣＤ３ゼータシグナル伝達を使用する第二世代ＣＡＲである。ＣＡＲＴ３３のｓｃＦｖはクローンＭＹ９−６に由来した。
図４は、ＣＡＲＴ３３のインビトロ活性を示す図である。ＣＡＲＴ３３介在Ｔ細胞脱顆粒：ＣＡＲ３３形質導入および非形質導入Ｔ細胞をＣＤ３３＋細胞株ＭＯＬＭ１４および対照ＡＬＬ細胞株ＮＡＬＭ６と、４時間、ＣＤ２８、ＣＤ４９ｄおよびモネンシン存在下インキュベートした。ＣＤ１０７ａ脱顆粒をフローサイトメトリーにより測定した。マウスおよびヒト化ＣＡＲＴ３３構築物両者の発現は、特定の脱顆粒を、ＭＯＬＭ１４存在か惹起した(Ｐ＜０.００１)。
図５は、ＣＡＲＴ３３のインビトロ活性を示す図である。サイトカイン産生：Ｔ細胞を発現するヒト化およびマウスＣＡＲ３３両者は、ＭＯＬＭ１４とインキュベーション後サイトカインを産生した。Ｔ細胞を、ＣＤ３３＋細胞株ＭＯＬＭ１４および対照細胞株ＮＡＬＭ６と４時間インキュベーションした。細胞を、次いで固定化し、透過処理し、細胞内腫瘍壊死アルファおよびインターフェロンガンマについて染色した。サンプルを、次いでフローサイトメトリーで分析した。
図６は、ＣＡＲＴ３３のインビトロ活性を示す図である。ＣＡＲ１２３およびＣＡＲ３３発現Ｔ細胞の増殖：ヒト化ＣＡＲＴ３３およびマウスＣＡＲＴ３３は、ＭＯＬＭ１４に応答して増殖した。Ｔ細胞をＣＦＳＥで標識し、対照条件下またはＭＯＬＭ１４と１２０時間インキュベーションし、ＣＦＳＥ希釈を増殖のマーカーとしてフローサイトメトリーにより測定した。
図７Ａおよび７Ｂは、ＣＡＲＴ３３のインビトロ活性を示す２つのグラフである。ＣＡＲ１２３、ヒト化ＣＡＲ３３およびマウスＣＡＲ３３発現Ｔ細胞特異的細胞致死：Ｔ細胞を、ＭＯＬＭ１４またはＴ細胞ＡＬＬ細胞株Ｊｕｒｋａｔ(対照)と２４時間インキュベートした。ｈｕＣＡＲＴ３３は、低Ｅ：Ｔ比のマウスＣＡＲＴ３３と比較して、有意に多い特異的細胞致死をもたらした。図７Ｂにおいて、ＣＡＲＴ３３−Ｊｕｒｋａｔは三角で示し、ＣＡＲＴ３３−ＭＯＬＭ１４は逆三角で示し、ＣＡＲＴ１２３−ＭＯＬＭ１４は四角で示す。
図８は、ＣＡＲＴ３３(ＩｇＧ４ヒンジ)およびＣＡＲＴ３３(ＣＤ８ヒンジ)が同等なインビトロ活性を有することを示す図である。脱顆粒アッセイ：ＣＡＲＴ３３(ＩｇＧ４ヒンジ)、ＣＡＲＴ３３(ＣＤ８ヒンジ)、ＣＡＲＴ１２３および非形質導入Ｔ細胞ｗをＣＤ３３＋細胞株ＭＯＬＭ１４とインキュベートし、ＣＤ１０７ａ脱顆粒をフローサイトメトリーにより測定した。両ＣＡＲＴ３３構築物は、ＭＯＬＭ１４存在下、特異的脱顆粒を受ける。
図９は、ＣＡＲＴ３３(ＩｇＧ４ヒンジ)およびＣＡＲＴ３３(ＣＤ８ヒンジ)が同等なインビトロ活性を有することを示す図である。サイトカイン産生：両ＣＡＲ３３構築物およびＣＡＲ１２３は、ＭＯＬＭ１４細胞株とインキュベーション後、特異的にサイトカイン産生を誘発する。Ｔ細胞をＭＯＬＭ１４と４時間、ＣＤ２８、ＣＤ４９ｄおよびモネンシン存在下インキュベートした。細胞を次いで採取し、固定化し、透過処理し、腫瘍壊死アルファ、ＭＩＰ１ａおよびインターフェロンガンマについて染色した。サイトカイン産生細胞パーセンテージを、次いでフローサイトメトリーにより測定した。
図１０は、ＣＡＲＴ３３(ＩｇＧ４ヒンジ)およびＣＡＲＴ３３(ＣＤ８ヒンジ)が同等なインビトロ活性を有することを示す図である。ＭＯＬＭ１４に応答する対照非形質導入、ＣＡＲ３３−(ＩｇＧ４ヒンジ)(すなわち、ＣＡＲ３３−ＩｇＧ４Ｈ)、ＣＡＲ３３−(ＣＤ８ヒンジ)(すなわち、ＣＡＲ３３−ＣＤ８Ｈ)またはＣＡＲ１２３発現Ｔ細胞の増殖。Ｔ細胞をＣＦＳＥで標識し、ＭＯＬＭ１４と１２０時間インキュベートした。
図１１は、ＣＡＲＴ３３−ＣＤ８Ｈ、ＣＡＲＴ３３−ＩｇＧ４ＨおよびＣＡＲＴ１２３のインビボ抗腫瘍効果の比較を示す概略図である。ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−共通ガンマ鎖ノックアウト(ＮＳＧ)マウスに、ＡＭＬ細胞株ＭＯＬＭ１４ １×１０６ ivを注射し、６日後生着にちて造影した。７日目、マウスをＣＡＲ３３(ＩｇＧ４ヒンジ)、ＣＡＲ３３(ＣＤ８ヒンジ)、ＣＡＲ１２３または対照媒体(非形質導入細胞)を発現するＴ細胞で処置した。注射したＴ細胞の総数は２×１０６ ivであった。その後マウスは、腫瘍負荷を評価するために連続的に毎週造影した。
図１２は、ＣＡＲＴ３３−ＣＤ８Ｈ、ＣＡＲＴ３３−ＩｇＧ４ＨおよびＣＡＲＴ１２３ Ｔ細胞の同等なインビボ抗腫瘍効果を示す図である。生物発光造影(ＢＬＩ)による経時的腫瘍負荷；マウスの４独立実験を代表する１実験からのデータ(群あたりｎ＝５)を図１１に示す。
図１３は、インビボで初代ＡＭＬのＣＡＲＴ３３およびＣＡＲＴ１２３根絶の比較を示す概略図である。ヒトサイトカインＩＬ３／ＧＭ−ＣＳＦ／ＳＣＦ(ＮＳＧＳマウス)についてトランスジェニックなＮＳＧマウスに、初代ＡＭＬサンプルを５××１０６ ivで注射した。生着を、２〜４週間後、眼窩後洞採血により確認し、マウスをＣＡＲＴ３３、ＣＡＲＴ１２３または対照媒体(非形質導入細胞)で処置した。注射したＴ細胞の総数は１×１０５ ivであった。ＡＭＬ負荷を評価するために、マウスを連続的眼窩後洞採血で追跡した。
図１４は、ＣＡＲＴ３３およびＣＡＲＴ１２３がインビボで初代ＡＭＬの同等な根絶をもたらすことを示す図である。ベースライン、１４日目および＋７０日目の非形質導入(ＵＴＤ)、ＣＡＲＴ３３またはＣＡＲＴ１２３処置マウスからの末梢血分析。図１３に記載した実験設定に従うＡＭＬは、ＣＡＲＴ３３またはＣＡＲＴ１２３で処置したマウスで検出されなかった。
図１５は、ＣＡＲＴ３３およびＣＡＲＴ１２３がインビボで初代ＡＭＬの同等な根絶をもたらすことを示す図である。図１３に記載した実験設定におけるマウスから示したような異なる時点で眼窩後洞採血から芽細胞／μlにより測定した疾患負荷の要約。
図１６は、ＣＡＲＴ３３およびＣＡＲＴ１２３がインビボで初代ＡＭＬの同等な根絶をもたらすことを示す図である。図１３に記載した実験設定に従いＣＡＲＴ３３、ＣＡＲＴ１２３またはＵＴＤで処置したマウスの生存(ＣＡＲＴ３３またはＣＡＲＴ１２３の処置をＵＴＤと比較したときｐ＜０.００１)。
図１７は、ＣＡＲＴ３３細胞の造血幹細胞毒性の試験のための設定を示す概略図である。実験スキーム：ヒト化免疫系(ＨＩＳ)マウスを、ヒト細胞の生着を確認するために、胎児肝臓由来のヒトＣＤ３４＋細胞の注射６〜８週間後後眼窩から採血した。次いでマウスをＣＡＲＴ３３またはＵＴＤ(各１×１０６細胞)で処置し、その後連続的に毎週眼窩後洞採血した。次いでマウスを２８日目に屠殺し、臓器を採取し、分析した。
図１８は、ＣＡＲＴ３３細胞の造血幹細胞毒性を示す図である。図１７に示す実験の結論の２８日からのフローサイトメトリーによる末梢血(vi眼窩後洞採血)の分析。ＣＡＲＴ３３処置は、非形質導入Ｔ細胞での処置と比較して、末梢血骨髄細胞および単球の有意な減少をもたらす。
図１９は、ＣＡＲＴ３３細胞の造血幹細胞毒性を示す図である。図１７に示す実験からのＣＡＲＴ３３、ＵＴＤで処置したまたは未処置(ｎ＝５)マウスからの２８日の末梢血分析の統計の要約。ＣＡＲＴ３３は、単球およびＣＤ３３＋骨髄細胞系譜細胞に対する有意な毒性とＢ細胞および血小板には比較的少ない毒性をもたらした。
図２０は、ＣＡＲＴ３３細胞の造血幹細胞毒性を示す図である。図１７に示す実験からのマウスの２８日に対するフローサイトメトリーによる骨髄分析からのプロット。ＣＡＲＴ３３処置は、一重項、ｈｕＣＤ４５ｄｉｍ、細胞系譜陰性でゲーティングして骨髄前駆細胞(ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋)および造血幹細胞(ＣＤ３４＋ＣＤ３８−)の有意な減少をもたらした。
図２１は、ＣＡＲＴ３３細胞の造血幹細胞毒性を示す図である。図１７に示す実験からのマウスの大腿骨切片を、ＵＴＤ Ｔ細胞またはＣＡＲＴ３３細胞処置後２８日にマウスから採った。ＩＨＣによるｈｕＣＤ４５およびＣＤ３４染色を実施した。対照Ｔ細胞とＣＡＲＴ３３でｈｕＣＤ４５に差はないが、これら両群は同種異系ヒト−抗ヒト効果とおそらく一致する低ｈｕＣＤ４５を示す。ＣＡＲＴ３３で処置したマウスでＣＤ３４＋細胞の特異的減少があった。結果は２実験の代表である。
図２２は、インビボでＣＡＲＴ３３およびＣＡＲＴ１２３造血毒性を試験するための設定を示す概略図である。実験スキーム：ＮＳＧＳマウスは、ブスルファンｉ.ｐ.、続いて正常ドナーからの２×１０６ Ｔ細胞枯渇骨髄細胞を、翌日受けた。生着を４週間後末梢血のフローサイトメトリー分析により確認し、ついで、マウスを１×１０６ ＣＡＲＴ３３、ＣＡＲＴ１２３またはＵＴＤ形質導入自己Ｔ細胞で処置した。マウスをその後７日目および１４日目に眼窩後洞採血で追跡し、１４日に屠殺して剖検した。
図２３は、ＣＡＲＴ３３およびＣＡＲＴ１２３がインビボで同等な造血毒性を生じることを示す図である。図２２に示す実験からのマウスの２８日のフローサイトメトリーによる骨髄分析の代表的プロットを示す。ＣＡＲＴ３３およびＣＡＲＴ１２３処置は、ｈｕＣＤ４５ｄｉｍ、Ｌｉｎ−でゲーティングした、骨髄前駆細胞(ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋)および造血幹細胞(ＣＤ３４＋ＣＤ３８−)の有意な減少をもたらす。結果は２実験の代表である。
図２４は、ＣＡＲＴ３３およびＣＡＲＴ１２３が骨髄異形成症候群(ＭＤＳ)骨髄細胞に細胞毒性であることを示す図である。ＭＤＳを有する患者からのＣＤ３４富化ＢＭをＵＴＤ、ＣＡＲＴ３３(ＩｇＧ４ヒンジ)、ＣＡＲＴ３３(ＣＤ８ヒンジ)またはＣＡＲＴ１２３とインキュベートした。ＣＡＲＴ３３またはＣＡＲＴ１２３で処置したサンプルにおけるＣＤ４５ｄｉｍＣＤ３４＋細胞の減少があった。
マウスＣＡＲＴ３３を発現するベクターの概略図である。
ヒト化ＣＡＲＴ３３を発現するベクターの概略図である。
ＮＦＡＴ制御プロモーターにより駆動されるルシフェラーゼレポーターを含むＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株(ＪＮＬ細胞と呼ぶ)におけるｓｃＦｖの細胞表面発現を記載する図である。ＪＮＬ細胞を、ＧＦＰをコードするｃＤＮＡ、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖまたはｈｓＣＤ３３に対して惹起したｃＦｖをコードするｃＤＮＡを発現するレンチウイルスベクターで形質導入した。ＪＮＬの個々のｓｃＦｖの細胞表面発現を、細胞と組み換えＦｃタグ付きｈｓＣＤ３３をインキュベートし、続いてフェコエリスリンにコンジュゲートしたＦｃ特異的二次抗体でインキュベートすることにより検出した。
図２８Ａ、２８Ｂ、２８Ｃおよび２８Ｄは、ＪＮＬ細胞におけるＮＦＡＴ活性を惹起するｈｓＣＤ３３を標的とする個々のｓｃＦｖの能力を示す図である。ＨｓＣＤ３３に対してｓｃＦｖを発現するＪＮＬ細胞を、それぞれ、ｈｓＣＤ３３を発現するまたはｈｓＣＤ３３細胞表面発現を欠くＭＯＬＭ１３またはＭＯＬＰ８細胞株と共培養した(図２８Ａ；ｈｓＣＤ３３、緑色線；アイソタイプ対照、灰色点線および影付き領域)。図２８Ｂは、ＭＯＬＭ１３(線)またはＭＯＬＰ８(点線)細胞存在下、ｈｓＣＤ３３を標的とするｓｃＦｖを発現するＪＮＬ細胞の活性化を記載する。個々のｓｃＦｖを発現するＪＮＬ細胞を異なるエフェクター(すなわちＪＮＬ細胞)対標的(すなわちＭＯＬＭ１３またはＭＯＬＰ８)比で播種し、インキュベーション２４時間後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ装置でＢｒｉｇｈｔ−ＧｌｏTMルシフェラーゼアッセイを使用する相対的ルシフェラーゼ単位(ＲＬＵ)の発現について分析した。図２８Ｃは、図２８Ｂのバージョンであり、ＭＯＬＭ１３存在下のＪＮＬ細胞活性化を記載する。図２８Ｄは、図２８Ｂのバージョンであり、ＭＯＬＰ８存在下のＪＮＬ細胞活性化を記載する。
図２９Ａおよび２９Ｂは、ドナー由来初代Ｔ細胞におけるｈｓＣＤ３３を標的とするｓｃＦｖの活性を示す一団の図である。ｈｓＣＤ３３を標的とするｓｃＦｖを発現するレンチウイルスベクターで形質導入した初代ヒトＴ細胞の細胞表面のｓｃＦｖ発現を記載する。ＳｃＦｖの発現を、図２７に記載のように細胞と組み換えＦｃタグ付きｈｓＣＤ３３およびフェコエリスリンにコンジュゲートしたＦｃ特異的二次抗体のインキュベートにより検出した。
図３０Ａおよび３０Ｂは、ＣＤ３３を標的とするｓｃＦｖを発現するＴ細胞の増殖性活性を記載する図である。Ｔ細胞はＣＦＳＥを標的とし、ＭＯＬＭ１３(図３０Ａ、黒色線)、ＭＯＬＰ８(図３０Ａ、白抜き棒)存在下共培養または単独で培養(図３０Ａ、斜線を引いた棒)して、ＵＴＤ初代Ｔ細胞またはｈｓＣＤ３３を標的とするｓｃＦｖを発現する細胞の増殖能力を評価した。加えて、初代Ｔ細胞の抗原駆動細胞分裂を、ＭＯＬＭ１３、ＭＯＬＰ８細胞と共培養したまたは単独培養したｓｃＦｖクローンＣＤ３３−２、−３、−４、−５、−６および−９を発現するＣＦＳＥ標識Ｔ細胞の中央蛍光強度(ＭＦＩ)を測定することにより評価した(図３０Ｂ)。
図３１は、ＣＤ３３を標的とするｓｃＦＶを発現するＴ細胞の細胞溶解活性を記載する図である。細胞溶解活性を評価するために、２５,０００ ＭＯＬＭ１３細胞を、異なるエフェクター(すなわちＴ細胞)対標的(すなわちＭＯＬＭ１３)比で個々のｓｃＦｖを発現する初代Ｔ細胞と播種し、培養４日後のＣＦＳＥ標識ＭＯＬＭ１３細胞の絶対数の計数によりＭＯＬＭ１３死滅程度について分析した。
図３２は、フローサイトメトリーによりＣＤ３３を標的とするｓｃＦＶを発現するＴ細胞とカニクイザルＣＤ３３(ｃｙＣＤ３３)の交差反応性を記載する図である。ＨｓＣＤ３３に対して惹起したｓｃＦｖを発現するレンチウイルスベクターで形質導入したＪＮＬ細胞を、組み換えＦｃタグ付きｈｓＣＤ３３(点線)またはｃｙＣＤ３３(線)とインキュベートし、続いてフェコエリスリンにコンジュゲートしたＦｃ特異的二次抗体とインキュベートした。
図３３Ａおよび３３Ｂは、電気穿孔法後の正常ドナーからのＴ細胞におけるｍＲＮＡ ＣＡＲ３３の発現を記載する。図３３Ａは、記載する時点でのＴ細胞集団におけるＣＡＲ３３の発現を示す一連のフローサイトメトリープロファイルである。ＣＡＲ３３発現細胞(四角で囲む)のパーセンテージを定量し、プロファイルに示す。図３３Ｂは、ＣＡＲ３３発現のパーセンテージのグラフ表示である。
図３４Ａおよび３４Ｂは、レンチウイルス形質導入ＣＡＲ３３とｍＲＮＡ電気穿孔ＣＡＲ３３の発現を比較する。図３４Ａは、４日間にわたり、記載する時点でレンチウイルス形質導入ＣＡＲ３３(ＣＡＲＴ３３ＬＶ)の安定発現を示す。図３４Ｂは、４日間にわたり、記載する時点でｍＲＮＡ電気穿孔ＣＡＲ３３(ＣＡＲＴ３３ ＲＮＡ)の一過性発現を示す。ＣＡＲ３３の発現をｘ軸の平均蛍光強度(ＭＦＩ)により示し、総細胞数をｙ軸に示す。
図３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃおよび３５Ｄは、レンチウイルス形質導入またはｍＲＮＡ 電気穿孔法後ＣＤ３３を発現するＴ細胞の細胞溶解活性を比較するグラフ表示である。実験を、Ｔ細胞の電気穿孔法後１日(図３５Ａ)、２日(図３５Ｂ)、３日(図３５Ｃ)および４日(図３５Ｄ)に繰り返した。ＣＡＲＴ３３細胞を、ＣＤ３３陽性細胞株ＭＯＬＭ１４および対照対照マントル細胞リンパ腫細胞株ＪＥＫＯとｘ軸に記載するＥ：Ｔ(エフェクター対標的)比でインキュベートした。各比での細胞死パーセンテージ各比での細胞死パーセンテージをｙ軸に示す。
図３６Ａおよび３６Ｂレンチウイルス形質導入またはｍＲＮＡ電気穿孔法後ＣＤ３３を発現するＴ細胞の細胞溶解活性を経時的に比較するグラフ表示である。図３６Ａは、ＭＯＬＭ１４細胞と４日間にわたり２：１Ｅ：Ｔ(エフェクター：標的)比でインキュベートしたときのＲＮＡ ＣＡＲ３３細胞と比較したレンチウイルス形質導入ＣＡＲ３３細胞の特異的細胞致死を示す。図３６Ｂは、ＭＯＬＭ１４細胞と４日間にわたり１：１Ｅ：Ｔ(エフェクター：標的)比でインキュベートしたときのＲＮＡ ＣＡＲ３３細胞と比較したレンチウイルス形質導入ＣＡＲ３３細胞の特異的細胞致死を示す。
図３７Ａ、３７Ｂ、３７Ｃおよび３７Ｄは、ＣＡＲＴ３３細胞が、ＣＤ３３＋細胞株ＭＯＬＭ１４または初代ＡＭＬサンプルに応答する今日こなインビトロエフェクター機能を示すことを示す。プロットは４独立実験の代表である。図３７Ａは、ＣＤ１０７ａ脱顆粒を示す。ＣＡＲＴ３３、ＣＡＲＴ１２３および非形質導入Ｔ細胞(ＵＴＤ)を、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ２８共刺激性分子およびモネンシンの存在下、ＣＤ３３＋／ＣＤ１２３＋細胞株ＭＯＬＭ１４、陽性非特異的Ｔ細胞刺激因子としてのＰＭＡ／イオノマイシンおよび対照Ｔ細胞ＡＬＬ細胞株Ｊｕｒｋａｔとインキュベートした。ＣＤ１０７ａ脱顆粒をインキュベーション４時間後フローサイトメトリーにより測定した。図３７Ｂは、ＣＤ３３発現細胞の特異的細胞致死を示す。ＣＡＲＴ３３、ＣＡＲＴ１２３およびＵＴＤを、ＭＯＬＭ１４−ｌｕｃまたはＪｕｒｋａｔ−ｌｕｃと２４時間、記載する異なるＥ：Ｔ比でインキュベートし、生物発光造影を、残存生存細胞の測定として実施した。黒色／線(四角)は、ＭＯＬＭ１４とインキュベートしたＣＡＲＴ１２３を示す；青色／点線(下向き三角／黒塗り三角)はＭＯＬＭ１４とインキュベートしたＣＡＲＴ３３を示す；および赤色／点線(上向き三角／白抜き三角)は、ＪｕｒｋａｔとインキュベートしたＣＡＲＴ３３を示す。図３７Ｃおよび３７Ｄは、ＣＤ３３発現細胞に応答したＣＡＲＴ３３細胞の増殖を示す。Ｔ細胞をＣＦＳＥで標識し、ＭＯＬＭ１４、陽性非特異的Ｔ細胞刺激因子としてのＰＭＡ／ＩＯＮＯ、陰性対照としてのＪｕｒｋａｔまたはＡＭＬサンプルと１２０時間インキュベートする。増殖するＴ細胞数は、Ｊｕｒｋａｔと比較してＭＯＬＭ１４に応答して有意に高く、ＣＡＲＴ１２３と同等であった。
図３８Ａ、３８Ｂおよび３８Ｃは、ＣＤ３３発現細胞ＭＯＬＭ１４に応答するＣＡＲＴ３３細胞によるサイトカイン産生を示す。ＣＡＲＴ３３、ＣＡＲＴ１２３およびＵＴＤ細胞を、ＭＯＬＭ１４、ＰＭＡ／イオノマイシンおよびＪｕｋａｔと４時間インキュベートした。細胞を次いで固定化し、透過処理し、５つの異なるサイトカイン(腫瘍壊死因子アルファ、インターフェロンガンマ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージ炎症性タンパク質１ｂおよびインターロイキン−２)で染色し、フローサイトメトリー分析を実施した。大多数のＣＡＲ Ｔ３３細胞は、ＭＯＬＭ１４に応答して１を超えるサイトカインを産生し(図３８Ａ)、ＰＭＡ／イオノマイシンに対する応答に類似した(陽性対照、図３８Ｂ)。図３８Ｃは、ＭＯＬＭ１４に応答するＩＬ−２、ＩＦＮ−ｇ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−ａの産生が、ＣＡＲＴ１２３細胞におけるＣＡＲＴ３３より有意に高かったことを示す。ＣＡＲＴ３３、ＣＡＲＴ１２３およびＵＴＤ細胞をＭＯＬＭ１４、ＪｕｒｋａｔおよびＰＭＡ／イオノマイシンと２４時間インキュベートした。上清を次いで採取し、３０−ｐｌｅｘ Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイを実施した。残りのサイトカインのレベルを図３９に示す。
図３９は、ＭＯＬＭ１４に応答したＣＡＲＴ３３およびＣＡＲＴ１２３細胞によるサイトカイン産生の比較を示す一連のグラフである。ＣＡＲＴ３３、ＣＡＲＴ１２３およびＵＴＤ細胞を、ＭＯＬＭ１４、ＪｕｒｋａｔおよびＰＭＡ／イオノマイシンと２４時間インキュベートした。上清を次いで採取し、３０−ｐｌｅｘ Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイを、記載したサイトカインについて実施した。
図４０は、インビトロでのＣＤ３３発現ＭＯＬＭ１４細胞の特異的細胞致死を示す。ＣＡＲＴ１２３、ＣＡＲＴ３３(ＣＤ８ヒンジ)およびＣＡＲＴ３３(ＩｇＧ４ヒンジ)を記載するＥ：Ｔ比でＭＯＬＭ１４とインキュベートし、細胞死を生物発光造影により評価した。ＣＡＲＴ３３(ＩｇＧ４ヒンジ)は、低Ｅ：Ｔ比でＣＡＲＴ３３(ＣＤ８ヒンジ)より特異的細胞致死をもたらした比。
図４１Ａ、４１Ｂおよび４１Ｃ骨髄異形成症候群(ＭＤＳ)における抗腫瘍活性を示す。図４１Ａは、ＭＤＳ患者からの骨髄細胞に応答した特定のＣＤ１０７ａ脱顆粒を示す。図４１Ｂは、５ｑ欠失を有するＭＤＳクローンの特異的細胞致死を示す一連の図である。図４１Ｃは、ＦＩＳＨで決定して、処置後に残存する５ｑ欠失クローンの定量を示すグラフである。ＵＴＤ群および未処置群と比較して、ＣＡＲＴ３３処置群で５ｑ−クローンパーセンテージの有意な減少があった。
図４２Ａ、４２Ｂおよび４２Ｃは、ＣＡＲＴ３３処置およびＭＯＬＭ１４移植異種移植片の生存結果を示す。実験スキームを図１１に示す。図４２Ａにおいて、生物発光造影(ＢＬＩ)による経時的腫瘍負荷を定量した；１実験からのデータ(群あたりｎ＝５)、各マウスを線で表す。図４２Ｂは、３独立実験の混成生存を示す。ＣＡＲＴ３３での処置は、ＵＴＤでの処置と比較して、有意な延命効果をもたらした。図４２Ｃは、１実験からの代表的生物発光図である。
図４３Ａおよび４３Ｂは、ＣＡＲＴ３３処置がＭＯＬＭ１４移植異種移植片における白血病負荷の用量依存性減少をもたらすことを示す。図４３Ａは、実施例６に記載する実験設定を示す模式図である。図４３Ｂは、異なる群の生物発光造影(ＢＬＩ)により測定した経時的腫瘍負荷の定量を示す。
図４４は、図１１に示す実験設定における種々の群の生物発光造影(ＢＬＩ)により測定した経時的腫瘍負荷を示すグラフである。
図４５は、ＲＮＡ−ＣＡＲＴ３３および化学療法結果の組み合わせがＭＯＬＭ１４移植異種移植片における白血病性負荷のさらなる減少をもたらすことを示す。
図４６Ａおよび４６Ｂは、インビボ実験で使用したＭＯＬＭ１４および初代ＡＭＬサンプルに対するＣＤ３３およびＣＤ１２３の抗体結合能を示す。アッセイをＱＵＡＮＴＵＭ ＳＩＭＰＬＹ ＣＥＬＬＵＬＡＲキット(Bangs Laboratories, Inc)を使用して実施した。サンプルをフロー緩衝液で洗浄し、その後ＰＥにコンジュゲートした記載する抗体(ＣＤ３３またはＣＤ１２３)で染色した。キットに提供された５つの異なるマイクロスフェアも同じ抗体で染色した。標的の平均蛍光強度を５マイクロスフェアと比較し、抗体結合能の値を、次いで業者のプロトコールに従い計算した。図４６ＡはＣＤ３３およびＣＤ１２３に対するＭＯＬＭ１４の抗体結合能を示し、一方図４６Ｂは、これらの実験で使用した一次サンプルのＣＤ３３およびＣＤ１２３に対する抗体結合能を示す。
図４７は、ＰＬ２１、ＨＬ−６０またはＭＯＬＰ８標的細胞に晒したときの、種々のＴ細胞−ＣＡＲＴ−３３ Ｔ細胞(ＣＤ３３−１〜ＣＤ３３−９またはＵｐｅｎｎ)、ＣＡＲＴ−ＣＤ１９ Ｔ細胞(ＣＤ１９)または非形質導入Ｔ細胞(細胞)の細胞数による増殖を示すグラフである。
図４８Ａは、種々のエフェクター対Ｔ細胞比で種々のＣＡＲＴ−３３ Ｔ細胞(ＣＤ３３−１〜ＣＤ３３−９またはＵｐｅｎｎ)、ＣＡＲＴ−ＣＤ１９ Ｔ細胞(ＣＤ１９)または非形質導入Ｔ細胞(細胞)に曝したときの、ＨＬ−６０−Ｌｕｃ標的細胞溶解のパーセントを示すグラフである。図４８Ｂは、種々のエフェクター対Ｔ細胞比で種々のＣＡＲＴ−３３ Ｔ細胞(ＣＤ３３−１〜ＣＤ３３−９またはＵｐｅｎｎ)、ＣＡＲＴ−ＣＤ１９ Ｔ細胞(ＣＤ１９)または非形質導入Ｔ細胞(細胞)に曝したときのＰＬ２１／Ｌｕｃ標的細胞溶解のパーセントを示すグラフである。図４８Ｃは、種々のエフェクター対Ｔ細胞比で種々のＣＡＲＴ−３３ Ｔ細胞(ＣＤ３３−１〜ＣＤ３３−９またはＵｐｅｎｎ)、ＣＡＲＴ−ＣＤ１９ Ｔ細胞(ＣＤ１９)または非形質導入Ｔ細胞(細胞)に曝したときのＵ８７／Ｌｕｃ標的細胞溶解のパーセントを示すグラフである。
図４９は、ＰＬ２１、ＨＬ６０またはＭＯＬＰ８標的細胞に曝したときの種々のＣＡＲＴ−３３ Ｔ細胞(ＣＤ３３−１〜ＣＤ３３−９またはＵｐｅｎｎ)、ＣＡＲＴ−ＣＤ１９ Ｔ細胞(ＣＤ１９)または非形質導入Ｔ細胞(細胞)により産生されるサイトカイン(ヒトインターフェロン−ガンマ(ＩＦＮ−γ)、ヒトインターロイキン−２(ＩＬ−２)およびヒト腫瘍壊死因子(ＴＮＦ))の濃度を示すグラフである。
図５０Ａは、ＭＤＳＣのためのゲーティング戦略を示すフローサイトメトリープロットである。図５０Ｂは、正常ドナー(ＮＤ ＢＭ)または骨髄異形成症候群(ＭＤＳ)患者(ＭＤＳ ＢＭ)からの骨髄における細胞系譜陰性、ＨＬＡ−ＤＲ陰性、ＣＤ３３＋(ＬＩＮ−ＨＬＤＲ−ＣＤ３３＋)細胞のパーセントを示すグラフである。図５０Ｃは、悪性ＭＤＳ集団(ＭＤＳ)および正常ドナー集団(ＮＤ−ＢＭ)と比較したＭＤＳＣ集団(ＭＤＳＣ)における平均蛍光強度(ＭＦＩ)により測定したＣＤ３３のレベルを示すグラフである。
図５１Ａは、ＣＡＲＴ３３からの脱顆粒(ＣＤ１０７ａレベル)およびサイトカイン産生(ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−ａ)の程度を示す一団のフローサイトメトリープロットである。ＣＤ１０７ａ脱顆粒およびサイトカイン産生をｙ軸に示し、抗ＣＤ３３ ＣＡＲをｘ軸に示す。陰性対照(Ｊｕｒｋａｔ)を左、ＭＤＳＣを右に示す。図５１Ｂは、種々の標的−Ｊｕｒｋａｔ、ＰＭＡ／イオノマイシン(ＰＭＡ／ＩＯＮＯ)、ＭＤＳ(非ＭＤＳＣ)およびＭＤＳＣに対するＣＡＲＴ３３による脱顆粒およびサイトカイン産生の定量を示すグラフである。
図５２Ａ〜５２Ｄは、単一ベクター、例えば、Ｕ６制御ｓｈＲＮＡが、ＥＦ１アルファ制御ＣＡＲコード化要素の上流または下流である、種々の配置を示す。図５２Ａおよび５２Ｂに記載する例示的構築物において、転写は、Ｕ６およびＥＦ１アルファプロモーターを経て同じ方向で起こる。図５２Ｃおよび５２に記載する例示的構築物において、転写は、Ｕ６およびＥＦ１アルファプロモーターを経て異なる方向で起こる。図５２Ｅにおいて、ｓｈＲＮＡ(および対応するＵ６プロモーター)は第一ベクターにあり、ＣＡＲ(および対応するＥＦ１アルファプロモーター)は第二ベクターにある。
図５３は、ＲＣＡＲ配置の２例の構造を示す。抗原結合メンバーは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよびスイッチドメインを含む。細胞内結合メンバーは、スイッチドメイン、共刺激性シグナル伝達ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む。２配置は、ここに記載する第一および第二スイッチドメインが、抗原結合メンバーおよび細胞内結合メンバーに関して異なる配向であり得ることを示す。他のＲＣＡＲ配置をここにさらに記載する。
図５４は、ＣＡＲ発現、形質導入Ｔ細胞の増殖が、細胞培養系における低ＲＡＤ００１の用量により増強されることを示す。ＣＡＲＴを、種々の濃度のＲＡＤ００１の存在下、Ｎａｌｍ−６細胞と共培養した。多数のＣＡＲ陽性ＣＤ３陽性Ｔ細胞(黒色)および総Ｔ細胞(灰色)を、共培養４日後に評価した。
図５５は、０.３、１、３および１０mg／kg(mpk)での連日ＲＡＤ００１投薬または媒体投薬を用いるＮＡＬＭ６−ｌｕｃ細胞の腫瘍増殖測定を示す。丸は媒体を示す；四角は１０mg／kgＲＡＤ００１の用量を示す；三角は３mg／kgＲＡＤ００１の用量を示し、逆三角は１mg／kgＲＡＤ００１の用量を示す；菱形は０.３mg／kgＲＡＤ００１の用量を示す。
図５６Ａおよび５６Ｂは、ＮＡＬＭ６腫瘍を有するＮＳＧマウスの血中のＲＡＤ００１の量を示す薬物動態曲線を示す。図５６Ａは、最初のＲＡＤ００１の用量後の０日目のＰＫを示す。図５６Ｂは、最終ＲＡＤ００１用量のちの１４日目のＰＫを示す。菱形は１０mg／kgＲＡＤ００１の用量を示す；四角は１mg／kgＲＡＤ００１の用量を示す；三角は３mg／kgＲＡＤ００１の用量を示す；ｘは１０mg／kgＲＡＤ００１の用量を示す。
図５７Ａおよび５７Ｂは、ＲＡＤ００１投薬したまたはしていないヒト化ＣＤ１９ ＣＡＲＴ細胞のインビボ増殖を示す。低ＲＡＤ００１の用量(０.００３mg／kg)連日は、正常レベルのｈｕＣＡＲ１９増殖を超える、ＣＡＲ Ｔ細胞増殖の増強に至る。図５７ＡはＣＤ４＋ ＣＡＲ Ｔ細胞を示す；図５７ＢはＣＤ８＋ ＣＡＲ Ｔ細胞を示す。丸はＰＢＳを示す；四角はｈｕＣＴＬ０１９を示す；三角は３mg／kg ＲＡＤ００１を伴うｈｕＣＴＬ０１９を示す；逆三角は０.３mg／kg ＲＡＤ００１を伴うｈｕＣＴＬ０１９を示す；菱形は０.０３mg／kg ＲＡＤ００１を伴うｈｕＣＴＬ０１９を示す；丸は０.００３mg／kg ＲＡＤ００１を伴うｈｕＣＴＬ０１９を示す。
図５８は、ＨＬ−６０−ｌｕｃ異種移植ＡＭＬ疾患進行を示すグラフである。青色丸：尾静脈から１００μlのＰＢＳで処置したマウス；赤色四角：ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞処置マウス；緑色三角：ＣＤ３３−１ ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞処置マウス；逆紫色三角：ＣＤ３３−２ ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞処置マウス；橙色菱形：ＣＤ３３−４ ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞処置マウス；黒色四角：ＣＤ３３−５ ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞処置マウス；褐色三角：ＣＤ３３−６ ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞処置マウス；暗青色丸：ＣＤ３３−７ ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞処置マウス；および逆暗紫色三角：ＣＤ３３−９ ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞処置マウス。
詳細な記載
定義
特記しない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により共通して理解される意味を有する。
単数表現は、文法上の目的が１個以上(すなわち、少なくとも１)をいう。例として、“要素”は、１個の要素または１を超える要素を意味する。
用語“約”は、量、期間などのような測定可能な値をいうとき、特定した値からの±２０％またはある場合±１０％またはある場合±５％またはある場合±１％またはある場合±０.１％のばらつきを、このようなばらつきが開示された方法の実施において妥当であるとして、包含することを意味する。
用語“キメラ抗原受容体”または代替的に“ＣＡＲ”は、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび下に定義するような刺激性分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン(ここでは“細胞内シグナル伝達ドメイン”とも呼ぶ)を含む、組み換えポリペプチド構築物をいう。ある態様において、ＣＡＲポリペプチド構築物におけるドメインは、同じポリペプチド鎖にあり、例えば、キメラ融合タンパク質を含む。ある態様において、ＣＡＲポリペプチド構築物におけるドメインは互いに隣接しておらず、例えば、ここに記載するようなＲＣＡＲにおいて提供されるように、例えば、異なるポリペプチド鎖にある。
ある面において、ＣＡＲの刺激性分子は、Ｔ細胞受容体複合体と関係するゼータ鎖である。ある面において、細胞質シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達ドメイン)を含む。ある面において、細胞質シグナル伝達ドメインは、さらに、下に定義するような少なくとも１つの共刺激性分子に由来する１以上の機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある面において、共刺激性分子は、４１ＢＢ(すなわち、ＣＤ１３７)、ＣＤ２７、ＩＣＯＳおよび／またはＣＤ２８から選択される。ある面において、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン、膜貫通ドメインおよび刺激性分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある面において、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン、膜貫通ドメインならびに共刺激性分子由来の機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激性分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある面において、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン、膜貫通ドメインおよび１以上の共刺激性分子および刺激性分子由来の２つの機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある面において、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン、膜貫通ドメインおよび１以上の共刺激性分子および刺激性分子由来の機能的シグナル伝達ドメイン由来の少なくとも２つの機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある面において、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端(Ｎ−ｔｅｒ)にいずれかのリーダー配列を含む。ある面において、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインのＮ末端にさらにリーダー配列を含み、ここで、リーダー配列は、場合により細胞プロセシングおよび細胞膜へのＣＡＲ局在化の間に抗原認識ドメイン(例えば、ａａ ｓｃＦｖ)から開裂される。
特異的腫瘍マーカーＸ(ここで、Ｘはここに記載するような腫瘍マーカーである)を標的とする抗原結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体またはＴＣＲ(例えば、ＴＣＲアルファ結合ドメインまたはＴＣＲベータ結合ドメイン))を含むＣＡＲをＸＣＡＲとも呼ぶ。例えば、ＣＤ３３を標的とする抗原結合ドメインを含むＣＡＲをＣＤ３３ＣＡＲと呼ぶ。ＣＡＲはあらゆる細胞、例えば、ここに記載するような免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)において発現できる。
用語“シグナル伝達ドメイン”は、第二メッセンジャーの産生によりまたはこのようなメッセンジャーに応答することによりエフェクターとして機能することにより、規定されたシグナル伝達経路を経て細胞活性を制御するために、細胞内で情報を伝達することにより作用する、タンパク質の機能的部分をいう。
ここで使用する用語“ＣＤ３３”は、白血病細胞ならびに骨髄細胞系譜の正常前駆体細胞で検出可能な抗原決定基である表面抗原分類３３タンパク質である。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔおよびＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔのような公的データベースに見ることができる。例えば、ヒトＣＤ３３のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ２０１３８に要ることができ、ヒトＣＤ３３をコードするヌクレオチド配列は、受託番号ＮＭ＿００１７７２.３に見ることができる。ある面において、ＣＡＲの抗原結合部分は、ＣＤ３３タンパク質またはそのフラグメントの細胞外ドメイン内のエピトープを認識し、結合する。ある面において、ＣＤ３３タンパク質は癌細胞に発現される。ここで使用する“ＣＤ３３”は、完全長野生型ＣＤ３３の変異、例えば、点変異、フラグメント、挿入、欠失およびスプライスバリアントを含むタンパク質を含む。
ここで使用する用語“抗体”は、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子由来のタンパク質またはポリペプチド配列をいう。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル、複数または一本鎖または完全免疫グロブリンであってよく、天然源由来でも組み換え源由来でもよい。抗体は、免疫グロブリン分子の四量体であり得る。
用語“抗体フラグメント”は、完全抗体またはその組み換えバリアントの少なくとも一つの部分をいい、抗原のような標的に対する抗体フラグメントの認識および特異的結合を与えるのに十分である、抗原結合ドメイン、例えば、完全抗体の抗原性決定可変領域をいう。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２およびＦｖフラグメント、ｓｃＦｖ抗体フラグメント、線形抗体、ｓｄＡｂのような単一ドメイン抗体(ＶＬまたはＶＨのいずれか)、ラクダ科ＶＨＨドメインおよびヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結した２個のＦａｂフラグメントまたは２個以上、例えば、２個の単離ＣＤＲを含む二価フラグメントのような抗体フラグメントから形成される多特異性抗体または連結した抗体の他のエピトープ結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。抗体フラグメントは、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、二重特異性抗体、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖにも取り込まれ得る(例えば、Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005参照)。抗体フラグメントは、フィブロネクチンIII型(Ｆｎ３)のようなポリペプチドに基づくスキャフォールドに移植もできる(フィブロネクチンポリペプチドミニボディを記載する米国特許６,７０３,１９９号参照)。
用語“ｓｃＦｖ”は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１抗体フラグメントおよび重鎖の可変領域を含む少なくとも１抗体フラグメントを含む融合タンパク質をいい、ここで、軽鎖および重鎖可変領域は、短可動性ポリペプチドリンカーにより隣接して連結され、単一鎖ポリペプチドとして発現されることが可能であり、ｓｃＦｖはそれが由来する完全抗体の特異性を保持する。特記しない限り、ここで使用するｓｃＦｖは、いずれの順序でＶＬおよびＶＨ可変領域を含んでもよく、例えば、ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端に関してｓｃＦｖはＶＬ−リンカー−ＶＨを含んでも、ＶＨ−リンカー−ＶＬを含んでもよい。
ここで使用する用語“相補性決定領域”または“ＣＤＲ”は、抗原特異性および結合親和性を与える、抗体可変領域内のアミノ酸の配列をいう。例えば、一般に、各重鎖可変領域に３ＣＤＲ(例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３)および各軽鎖可変領域に３ＣＤＲ(ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３)が存在する。あるＣＤＲの厳密なアミノ酸配列境界は、により記載のものを含む多くの周知のスキームのいずれかを使用して決定できるKabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(“Ｋａｂａｔ”番号付けスキーム)、Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948(“Ｃｈｏｔｈｉａ”番号付けスキーム)またはこれらの組み合わせ。Ｋａｂａｔ番号付けスキーム下、ある態様において、重鎖可変ドメイン(ＶＨ)のＣＤＲアミノ酸残基は３１〜３５(ＨＣＤＲ１)、５０〜６５(ＨＣＤＲ２)および９５〜１０２(ＨＣＤＲ３)と番号付けされ；そして軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)におけるＣＤＲアミノ酸残基は２４〜３４(ＬＣＤＲ１)、５０〜５６(ＬＣＤＲ２)および８９〜９７(ＬＣＤＲ３)と番号付けされる。Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム下、ある態様において、ＶＨにおけるＣＤＲアミノ酸は２６〜３２(ＨＣＤＲ１)、５２〜５６(ＨＣＤＲ２)および９５〜１０２(ＨＣＤＲ３)と番号付けされ；そしてＶＬにおけるＣＤＲアミノ酸残基は２６〜３２(ＬＣＤＲ１)、５０〜５２(ＬＣＤＲ２)および９１〜９６(ＬＣＤＲ３)と番号付けされる。複合ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ番号付けスキームにおいて、ある態様において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲまたは両者の一部であるアミノ酸残基に対応する。例えば、ある態様において、ＣＤＲは、ＶＨ、例えば、哺乳動物ＶＨ、例えば、ヒトＶＨにおけるアミノ酸残基２６〜３５(ＨＣＤＲ１)、５０〜６５(ＨＣＤＲ２)および９５〜１０２(ＨＣＤＲ３)；およびＶＬ、例えば、哺乳動物ＶＬ、例えば、ヒトＶＬにおけるアミノ酸残基２４〜３４(ＬＣＤＲ１)、５０〜５６(ＬＣＤＲ２)および８９〜９７(ＬＣＤＲ３)に対応する。
本発明のＣＡＲ組成物の抗体または抗体そのフラグメントを含む部分は、例えば、単一ドメイン抗体フラグメント(ｓｄＡｂ)、一本鎖抗体(ｓｃＦｖ)または例えば、ヒト化またはヒト抗体を含む、例えば、抗原結合ドメインがポリペプチド鎖の一部として発現される、多種多様な形態で存在し得る(Harlowet al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Har低et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426)。ある面において、本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合ドメインは、抗体フラグメントを含む。さらなる面において、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体フラグメントを含む。
ここで使用する用語“結合ドメイン”または“抗体分子”は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む、タンパク質、例えば、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメントをいう。用語“結合ドメイン”または“抗体分子”は、抗体および抗体フラグメントを包含する。ある態様において、抗体分子は多特異性抗体分子であり、例えば、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、ここで、複数の中の第一免疫グロブリン可変ドメイン配列は第一エピトープに対する結合特異性を有し、複数の中の第二免疫グロブリン可変ドメイン配列は第二エピトープに対する結合特性を有する。ある態様において、多特異性抗体分子は二特異性抗体分子である。二特異性抗体は、２以下の抗原に特異性を有する。二特異性抗体分子は、第一エピトープに対する結合特異性を有する第一免疫グロブリン可変ドメイン配列および第二エピトープに対する結合特異性を有する第二免疫グロブリン可変ドメイン配列により特徴付けられる。
用語“抗体重鎖”は、天然に存在する立体構造の抗体分子に存在する２タイプのポリペプチド鎖の大きいほうをいい、通常、当該抗体が属するクラスを決定する。
用語“抗体軽鎖”は、天然に存在する立体構造の抗体分子に存在する２タイプのポリペプチド鎖の小さいほうをいう。カッパ(κ)およびラムダ(λ)軽鎖は、２つの主用抗体軽鎖アイソタイプをいう。
用語“組み換え抗体”は、例えば、バクテリオファージまたは酵母発現系により発現させた抗体のような、組み換えＤＮＡテクノロジーを使用して産生させる抗体をいう。本用語はまた抗体をコードするＤＮＡ分子の合成により産生され、そのＤＮＡ分子が抗体タンパク質または抗体を特定するアミノ酸配列を発現するものである抗体を意味するとも解釈すべきであり、ここで、ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、当分野で利用可能であり、周知である組み換えＤＮＡまたはアミノ酸配列テクノロジーを使用して得られている。
用語“抗原”または“Ａｇ”は、免疫応答を惹起する分子をいう。この免疫応答は、抗体産生または特異的免疫適格細胞の活性化または両者が関与し得る。当業者は、実質的に全タンパク質またはペプチドを含むあらゆる巨大分子が抗原として働き得ることを理解する。さらに、抗原は組み換えまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。当業者は、免疫応答を惹起するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含むあらゆるＤＮＡが、それゆえに、“抗原”を、当該用語がここで使用される限り、コードすることを理解する。さらに、当業者は、抗原が遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要がないことを理解する。本発明が、１を超える遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含むが、これらに限定されず、これらのヌクレオチド配列が所望の免疫応答を惹起するポリペプチドをコードするように種々の組み合わせで配置されることが容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原が全く“遺伝子”によりコードされる必要がないことを理解する。抗原を合成により製造できるかまたは生体サンプルに由来し得るかまたはポリペプチド以外の巨大分子であるかもしれないことは容易に明らかである。このような生体サンプルは、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞または他の生物学的成分を伴う液体を含み得るが、これらに限定されない。
用語“抗腫瘍効果”は、例えば、腫瘍体積減少、腫瘍細胞数減少、転移数減少、余命延長、腫瘍細胞増殖減少、腫瘍細胞生存減少または癌性状態に付随する種々の生理学的症状改善を含むが、これらに限定されない種々の手段により顕在化され得る生物学的効果をいう。“抗腫瘍効果”はまたそもそも腫瘍の発生の予防における本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体の能力によっても顕在化され得る。
用語“抗癌効果”は、例えば、腫瘍体積減少、癌細胞数減少、転移数減少、余命延長、癌細胞増殖減少、癌細胞生存減少または癌性状態に付随する種々の生理学的症状改善を含むが、これらに限定されない、種々の手段により顕在化され得る生物学的効果をいう。“抗癌効果”は、ペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体が、そもそも癌の発生を予防する能力によっても顕在化され得る。用語“抗腫瘍効果”は、例えば、腫瘍体積減少、腫瘍細胞数減少、腫瘍細胞増殖減少または腫瘍細胞生存減少を含むが、これらに限定されない種々の手段により顕在化され得る生物学的効果をいう。
用語“自己”は、後に再導入される個体と同じ個体由来のあらゆる物質をいう。
用語“同種”は、物質が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来する何らかの物質をいう。２以上の個体は、１以上の座位の遺伝子が同一でないとき、互いに同種異系といわれる。ある面において、同じ種の個体由来の同種異系物質は、抗原性に相互作用するのに十分遺伝的に似ていない可能性がある。
用語“異種”は、異なる種の動物由来の移植片をいう。
ここで使用する用語“アフェレーシス”は、ドナーまたは患者の血液をドナーまたは患者から採り、選択した特定の成分を分ける装置を通し、残りをドナーまたは患者の循環に、例えば、輸血により戻す、当分野で認められている体外過程をいう。それゆえに、“アフェレーシスサンプル”の文脈においては、アフェレーシスを使用して得たサンプルをいう。
用語“組み合わせ”は、一投与単位形態の固定された組み合わせまたは本発明の化合物および組み合わせパートナー(例えば“治療剤”または“併用剤”とも称する下記のような他の薬剤)を、独立して同時にまたは一定間隔で、特に組み合わせパートナーが協調的、例えば相乗効果を示すことを可能にする間隔で別々に投与し得る組み合わせ投与をいう。単一成分をキットに包装してもまたは別々でもよい。要素の一方または両方(例えば、粉末または液体)を、投与前に所望の用量に再構成または希釈し得る。ここに使用する用語“共投与”または“組み合わせ投与”などは、選択した組み合わせパートナーを、それを必要とする一対象(例えば患者)に投与することを包含することを意図し、これら薬剤が必ずしも同じ投与経路でまたは同時に投与されるものではない処置レジメンを包含することを意図する。ここで使用する用語“医薬組み合わせ”は、１個を超える活性成分の混合または組み合わせに由来する産物を意味し、活性成分の固定されたおよび固定されていない組み合わせの両者を含む。用語用語“固定された組み合わせ”は、複数活性成分、例えば本発明の化合物および組み合わせパートナーが、両者とも患者に、同時に一個の物または投与量として投与されることを意味する。用語“非固定されていない組み合わせ”は、複数活性成分、例えば本発明の化合物および組み合わせパートナーを、別々の物として、同時に、一緒にまたは別々に具体的時間制限なく患者に投与し、ここで、このような投与が、患者の体内で２化合物の治療的有効レベルを提供することを意味する。後者はまたカクテル療法、例えば３種以上の活性成分の投与にも適用される。
用語“癌”は、異常細胞の急速かつ未制御の増殖により特徴付けられる疾患をいう。癌細胞は、局所的にまたは血流およびリンパ系により体の他の部分に拡散できる。種々の癌の例はここに記載され、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、脳腫瘍、リンパ腫、白血病、肺癌などを含むが、これらに限定されない。用語“腫瘍”および“癌”は、ここでは交換可能に使用し、例えば、両用語は固形および液性、例えば、拡散もしくは循環腫瘍を含む。ここで使用する用語“癌”または“腫瘍”は、前悪性、ならびに悪性癌および腫瘍を含む。
ここで使用する用語“由来する”は、第一分子と第二分子の関係を示す。一般に第一分子と第二分子の構造的類似性をいい、第二分子に由来する第一分子の過程または源限定を暗示または包含しない。例えば、ＣＤ３ゼータ分子に由来する細胞内シグナル伝達ドメインの場合、細胞内シグナル伝達ドメインは、必要な機能、すなわち、適切な条件下でシグナルを産生する能力を有するように、十分なＣＤ３ゼータ構造を保持する。細胞内シグナル伝達ドメインを産生する特定の過程の限定を暗示または包含しない、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインを提供するために、ＣＤ３ゼータ配列から出発し、細胞内シグナル伝達ドメインに到達するために望まない配列を削除するかまたは変異させなければならないことを意味しない。
ここで使用する用語“ＣＤ３３の発現と関係する疾患”は、例えば、癌もしくは悪性腫瘍または骨髄異形成、骨髄異形成症候群もしくは前白血病のような前癌状態のような増殖性疾患；またはＣＤ３３(例えば、野生型または変異体ＣＤ３３)を発現する細胞と関係する非癌関連徴候を含む、ＣＤ３３を発現する細胞(例えば、野生型または変異体ＣＤ３３)と関係する疾患またはＣＤ３３(例えば、野生型または変異体ＣＤ３３)を発現する細胞と関係する状態をいう。誤解を避けるために、ＣＤ３３の発現と関係する疾患は、例えば、ＣＤ３３発現が、例えば、ＣＤ３３を標的とする分子、例えば、こに記載するＣＤ３３阻害剤での処置により下方制御されているために、現在ＣＤ３３を発現しないが、かつてＣＤ３３を発現した細胞と関係する状態を含み得る。ある面において、ＣＤ３３(例えば、野生型または変異体ＣＤ３３)の発現と関係する癌は血液癌である。ある面において、血液癌は、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、骨髄線維症および骨髄増殖性新生物、急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)、ヘアリー細胞白血病、前リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物などを含むが、これらに限定されない。さらにＣＤ３３(例えば、野生型または変異体ＣＤ３３)の発現と関係する疾患は、例えば、非定型および／または非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態または増殖性ＣＤ３３(例えば、野生型または変異体ＣＤ３３)の発現と関係する疾患を含むが、これらに限定されない。ＣＤ３３(例えば、野生型または変異体ＣＤ３３)の発現と関係する非癌関連徴候も含まれ得る。ある態様において、ＣＤ３３の発現と関係する非癌関連徴候は、例えば、自己免疫性疾患(例えば、狼瘡)、炎症性障害(アレルギーおよび喘息)および移植を含むが、これらに限定されない。ある態様において、腫瘍抗原発現細胞は、腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡを発現するまたは何れかの時点で発現した。ある態様において、腫瘍抗原発現細胞は腫瘍抗原タンパク質(例えば、野生型または変異体)を産生し、腫瘍抗原タンパク質は正常レベルまたは減少したレベルで存在し得る。ある態様において、腫瘍抗原発現細胞は、検出可能なレベルの腫瘍抗原タンパク質をある時点で産生しており、その後、実質的に検出可能な腫瘍抗原タンパク質を産生していない。
用語“保存的配列修飾”は、当該アミノ酸配列を含む抗体または抗体フラグメントの結合特性に顕著に影響しないまたは変えないアミノ酸修飾をいう。このような保存的修飾は、アミノ酸置換、付加および欠失を含む。部位特異的変異誘発およびＰＣＲ介在変異誘発のような当分野で知られる標準技術により、本発明の抗体または抗体フラグメントに修飾を導入できる。保存的置換は、アミノ酸残基が類似側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものである。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非電荷極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。それゆえに、本発明のＣＡＲ内の１以上のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換えてよく、改変したＣＡＲを、ここに記載する機能的アッセイを使用して試験できる。
用語“刺激”は、刺激性分子(例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体)とその同族リガンドの結合により誘発され、それによりＴＣＲ／ＣＤ３複合体によるシグナル伝達のような、しかし、これに限定されない、シグナル伝達事象を介在する、一次応答をいう。刺激は、ＴＧＦ−βの下方制御および／または細胞骨格構造再構築などのような、ある分子の発現改変も仲介する。
用語“刺激性分子”は、Ｔ細胞シグナル伝達経路の少なくともある面では刺激性方向にＴＣＲ複合体の一次活性化を制御する、初代細胞質シグナル伝達配列を提供するＴ細胞により発現される分子をいう。ある面において、一次シグナルは、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体と、ペプチドを載せたＭＨＣ分子の結合により開始され、これは、増殖、活性化、分化などを含むが、これらに限定されないＴ細胞応答の仲介に至る。刺激性方向に作用する初代細胞質シグナル伝達配列(“一次シグナル伝達ドメイン”とも呼ばれる)は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。本発明において特に有用であるＩＴＡＭ含有初代細胞質シグナル伝達配列の例は、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８(“ＩＣＯＳ”としても知られる)、ＦｃεＲＩおよびＣＤ６６ｄ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２由来のものを含むが、これらに限定されない。本発明の特定のＣＡＲにおいて、いずれかの１以上の本発明のＣＡＲにおける細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内シグナル伝達配列、例えば、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達配列を含む。本発明の特定のＣＡＲにおいて、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達配列は、配列番号９として提供される配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基である。本発明の特定のＣＡＲにおいて、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達配列は、配列番号１０として提供される配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基である。
用語“抗原提示細胞”または“ＡＰＣ”は、表面に主要組織適合抗原(ＭＨＣ)と複合体化した外来抗原を呈示するアクセサリー細胞(例えば、Ｂ細胞、樹状細胞など)のような免疫系細胞をいう。Ｔ細胞は、そのＴ細胞受容体(ＴＣＲ)を使用してこれらの複合体を認識し得る。ＡＰＣは抗原を処理し、それらをＴ細胞に提示する。
ここで使用する用語“細胞内シグナル伝達ドメイン”は、分子の細胞内部分をいう。ある態様において、細胞内シグナルドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊化された機能の実施を指示する。細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いることができるが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達の切断された一部を使用する範囲内で、このような切断された一部を、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、完全鎖の代わりに使用してよい。用語細胞内シグナル伝達ドメインは、それゆえに、エフェクター機能シグナルの伝達に十分な細胞内シグナル伝達ドメインのあらゆる切断された一部を含むことを意図する。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ含有細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを産生できる。例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞における免疫エフェクター機能の例は、サイトカイン分泌を含む、細胞溶解活性およびヘルパー活性を含む。
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは初代細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。初代細胞内シグナル伝達ドメインの例は、一次刺激または抗原依存刺激を担う分子に由来するものを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激性細胞内ドメインを含み得る。共刺激性細胞内シグナル伝達ドメインの例は、共刺激性シグナルまたは抗原非依存的刺激を担う分子に由来するものを含む。例えば、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞の場合、初代細胞内シグナル伝達ドメインはＴ細胞受容体の細胞質配列を含むことができ、共刺激性細胞内シグナル伝達ドメインは共受容体または共刺激性分子の細胞質配列を含むことができる。
初代細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。ＩＴＡＭ含有初代細胞質シグナル伝達配列の例は、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８(“ＩＣＯＳ”としても知られる)、ＦｃεＲＩおよびＣＤ６６ｄ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２由来のものを含むが、これらに限定されない。
用語“ゼータ”または代替的にゼータ鎖”、“ＣＤ３ゼータ”または“ＴＣＲゼータ”は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＧ３６６６４.１として提供されるタンパク質または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な塩基として定義され、“ゼータ刺激性ドメイン”または代替的に“ＣＤ３ゼータ刺激性ドメイン”または“ＴＣＲゼータ刺激性ドメイン”は、Ｔ細胞活性化に必要な初期シグナルを機能的に伝達するのに十分であるゼータ鎖の細胞質ドメイン由来のアミノ酸残基として定義する。ある面において、ゼータの細胞質ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＧ３６６６４.１の残基５２〜１６４または、その機能的オルソログである非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基を含む。ある面において、“ゼータ刺激性ドメイン”または“ＣＤ３ゼータ刺激性ドメインは、配列番号９。ある面において、“ゼータ刺激性ドメイン”または“ＣＤ３ゼータ刺激性ドメインは配列番号１０として提供される配列である。
用語“共刺激性分子”は、共刺激性リガンドと特異的に結合するＴ細胞上の同族結合パートナーをいい、それにより、増殖のような、しかし、それに限定されないＴ細胞による共刺激性応答が仲介される。共刺激性分子は、効率的免疫応答に必要な抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激性分子は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ性活性化分子(ＳＬＡＭタンパク質)、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃbp、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドを含むが、これらに限定されない。
共刺激性細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激性分子の細胞内部分をいう。
細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子の細胞内部分全体または天然細胞内シグナル伝達ドメイン全体またはその機能的フラグメントを含み得る。
用語“４−１ＢＢ”は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６２４７８.２として提供されるアミノ酸配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基を有するＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーをいう；そして“４−１ＢＢ共刺激ドメイン”は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６２４７８.２のアミノ酸残基２１４〜２５５または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基として定義される。ある面において、“４−１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号７として提供される配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基である。
ここで使用する用語“免疫エフェクター細胞”は、免疫応答、例えば、免疫エフェクター応答の増強に関与する細胞をいう。免疫エフェクター細胞の例は、Ｔ細胞、例えば、アルファ／ベータＴ細胞およびガンマ／デルタＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、ナチュラルキラーＴ(ＮＫＴ)細胞、肥満細胞および骨髄由来貪食細胞を含む。
ここで使用する用語“免疫エフェクター機能または免疫エフェクター応答”は、標的細胞の免疫攻撃を増強または促進する、例えば、免疫エフェクター細胞の、機能または応答をいう。例えば、免疫エフェクター機能または応答は、標的細胞の死滅を促進するまたは成長もしくは増殖を阻害するＴ細胞またはＮＫ細胞の特性をいう。Ｔ細胞の場合、一次刺激および共刺激は免疫エフェクター機能または応答の例である。
用語“エフェクター機能”は、細胞の特殊化された機能をいう。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。
用語“コードする”は、ヌクレオチドの規定された配列(例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ)またはアミノ酸の規定された配列のいずれかを有する生物学的過程において他のポリマーおよび巨大分子の合成の鋳型として役立つ、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡのようなポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特定の配列の固有の特性およびそれ由来の生物学的特性をいう。それゆえに、遺伝子、ｃＤＮＡまたはＲＮＡは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が、細胞または他の生物系においてタンパク質を産生するならば、タンパク質をコードする。遺伝子またはｃＤＮＡの転写の鋳型として使用される、ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常配列表に提供されるコード鎖および非コード鎖の両者を、タンパク質または該遺伝子またはｃＤＮＡの他の産物をコードするとしていうことができる。
特に断らない限り、“アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列”は、互いの縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする全ヌクレオチド配列を含む。用語タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、あるバージョンにおいて、イントロンを含み得る限り、イントロンも含み得る。
用語“有効量”または“治療有効量”は、ここでは相互交換可能に使用し、特定の生物学的結果を達成するのに有効な、ここに記載するような化合物、製剤、物質または組成物の量をいう。
用語“内在性”は、生物、細胞、組織または系に由来するまたはそれらの中で産生されるあらゆる物質をいう。
用語“外来性”は、生物、細胞、組織または系の外から導入されたまたはそれらの外で産生されるあらゆる物質をいう。
用語“発現”は、プロモーターにより駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳をいう。
用語“転移ベクター”は、単離核酸を含み、単離核酸の細胞内部への送達に使用できる組成物をいう。多数のベクターが当分野で知られ、直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを含むが、これらに限定されない。それゆえに、用語“転移ベクター”は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。本用語はまた、例えば、ポリリシン化合物、リポソームなどのような、核酸の細胞への転移を促進する非プラスミドおよび非ウイルス化合物をさらに含むとも解釈すべきである。ウイルス転移ベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されない。
用語“発現ベクター”は、発現するヌクレオチド配列に操作可能に連結した発現制御配列を含む組み換えポリヌクレオチドを含む、ベクターをいう。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用領域を含み、発現のための他の要素は宿主により細胞またはインビトロ発現系において供給され得る。発現ベクターは、組み換えポリヌクレオチドを取り込むコスミド、プラスミド(例えば、裸のまたはリポソームに含まれた)およびウイルス(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)を含む、当分野で知られる全てのこのようなものを含む。
用語“レンチウイルス”は、レトロウイルス科ファミリーの属をいう。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染できるという点で、レトロウイルスの中でも独特である；それらは、相当量の遺伝情報を宿主細胞のＤＮＡに送達でき、それゆえに、それらは遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の一つである。ＨＩＶ、ＳＩＶおよびＦＩＶは、全てレンチウイルスの例である。
用語“レンチウイルスベクター”は、少なくとも一部レンチウイルスゲノムに由来するベクターをいい、特に、Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464(2009)において提供されるような自己不活性化レンチウイルスベクターを含む。臨床で使用し得るレンチウイルスベクターの他の例は、Oxford BioMedicaからのLENTIVECTOR(登録商標)遺伝子送達テクノロジー、LentigenからのLENTIMAXTMを含むが、これらに限定されない。非臨床タイプのレンチウイルスベクターも利用可能であり、当業者に知られる。
用語“相同”または“同一性”は、２ポリマー分子間、例えば、２核酸分子間、例えば、２ＤＮＡ分子または２ＲＮＡ分子間または２ポリペプチド分子間のブユニット配列同一性をいう。２分子の両者におけるサブユニットが同じモノマーサブユニットで占拠されているとき；例えば、２ＤＮＡの各々におけるある位置がアデニンで占拠されているならば、それらは、その位置で相同または同一である。２配列間の相同性は、マッチしたまたは相同な位置の数の直接関数である；例えば、２配列の位置の半分(例えば、１０サブユニット長ポリマー中５位置)が相同であるならば、２配列は５０％相同である；位置の９０％(例えば、１０中９)がマッチするまたは相同であるならば、２配列は９０％相同である。
非ヒト(例えば、マウス)抗体の“ヒト化”形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最少配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２または抗体の他の抗原結合部分配列)である。大部分について、ヒト化抗体および抗体そのフラグメントは、レシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)からの残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲからの残基で置き換えられているヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体または抗体フラグメント)である。ある例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基により置き換えられる。さらに、ヒト化抗体／抗体フラグメントは、レシピエント抗体にも移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体または抗体フラグメント性能をさらに精錬および最適化できる。一般に、ヒト化抗体または抗体そのフラグメントは、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは相当部分がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１および一般に２可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体または抗体フラグメントは、一般にヒト免疫グロブリンのものである、免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部も含み得る。さらなる詳細に関して、Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992を参照のこと。
“完全ヒト”は、分子全体がヒト起源または抗体もしくは免疫グロブリンのヒト形態と同一のアミノ酸配列からなる、抗体または抗体フラグメントのような免疫グロブリンをいう。
用語“単離”は、自然な状態から変えられたまたは除かれたことを意味する。例えば、生存動物に天然に存在する核酸またはペプチドは“単離”されていないが、その自然な状態の併存物質から部分的にまたは完全に離された同じ核酸またはペプチドは、“単離”されている。単離核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在できまたは、例えば、宿主細胞のような、非天然環境で存在できる。
本発明の文脈において、一般的に生じる核酸塩基について次の略語を使用する。“Ａ”はアデノシンをいい、“Ｃ”はシトシンをいい、“Ｇ”はグアノシンをいい、“Ｔ”はチミジンをいい、そして“Ｕ”はウリジンをいう。
用語“操作可能に連結”または“転写制御”は、制御配列と異種核酸配列の間の、後者の発現を生じる機能的連結をいう。例えば、第一核酸配列は、第一核酸配列が第二核酸配列と機能的関係におかれたとき、操作可能に連結している。例えば、プロモーターは、プロモーターがコーディング配列の転写または発現に影響するならば、コーディング配列に操作可能に連結する。操作可能に連結したＤＮＡ配列は互いに隣接してよく、そして、例えば、２タンパク質コーディング領域を合わせる必要があるとき、同じリーディングフレーム内にある。
免疫原性組成物の“非経腸”投与なる用語は、例えば、皮下(ｓ.ｃ.)、静脈内(ｉ.ｖ.)、筋肉内(ｉ.ｍ.)または胸骨内、腫瘍内注射または注入技術を含む。
用語“核酸”または“ポリヌクレオチド”は、一本鎖または二本鎖形態いずれかのデオキシリボ核酸(ＤＮＡ)またはリボ核酸(ＲＮＡ)およびそのポリマーをいう。特に限定しない限り、本用語は、対照核酸と類似の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと類似する方法で代謝される、天然ヌクレオチドの既知アナログを含む核酸を包含する。特に断らない限り、特定の核酸配列はまた、黙示的に保存的に修飾されたそのバリアント(例えば、縮重コドン置換)、アレル、オルソログ、ＳＮＰおよび相補的配列ならびに明示的に示される配列も包含する。具体的に、縮重コドン置換は、１以上の選択した(または全)コドンの３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を賛成することにより達成し得る(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); およびRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。
用語“ペプチド”、“ポリペプチド”および“タンパク質”は相互交換可能に使用し、ペプチド結合により共有結合したアミノ酸残基からなる化合物をいう。タンパク質またはペプチドは少なくとも２アミノ酸を含まなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸数の上限の設定はない。ポリペプチドは、互いにペプチド結合により連結した２以上のアミノ酸を含むあらゆるペプチドまたはタンパク質を含む。ここで使用する本用語は、例えば、ペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとしても一般に呼ばれる短鎖および一般にタンパク質として当分野で呼ばれ、多くのタイプが存在する長鎖の両者をいう。“ポリペプチド”は、とりわけ、例えば、生物学的に活性なフラグメント、実質的に相同ポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾ポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質を含む。ポリペプチドは天然ペプチド、組み換えペプチドまたはこれらの組み合わせを含む。
用語“プロモーター”は、ポリヌクレオチド配列の特定の転写の開始に必要な、細胞の合成装置または導入された合成装置により認識されるＤＮＡ配列をいう。
用語“プロモーター／制御配列”は、該プロモーター／制御配列に操作可能に連結した遺伝子産物の発現に必要な核酸配列をいう。ある例において、この配列はコアプロモーター配列であってよく、他の例において、この配列はまた遺伝子産物の発現に必要なエンハンサー配列および他の制御要素も含んでよい。プロモーター／制御配列は、例えば、組織特異的方法で遺伝子産物を発現するものであり得る。
用語“構成的”プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと操作可能に連結したとき、細胞のほとんどのまたは全ての生理学的条件下で、当該細胞内で遺伝子産物の産生を誘発するヌクレオチド配列をいう。
用語“誘導性”プロモーターは、遺伝子産物をコードするまたは特定するポリヌクレオチドと操作可能に連結したとき、遺伝子産物を、実質的に細胞にプロモーターに対応するインデューサーが存在するときのみ細胞において産生させる、ヌクレオチド配列をいう。
用語“組織特異的”プロモーターは、遺伝子によりコードされるまたは特定化されるポリヌクレオチドと操作可能に連結したとき、実質的に、細胞がプロモーターに対応する組織タイプの細胞であるときにのみ、細胞において遺伝子産物を産生させる、ヌクレオチド配列をいう。
用語“癌関連抗原”または“腫瘍抗原”は、交換可能に、正常細胞と比較して、癌細胞の表面上に、全体的であれフラグメンとしてであれ(例えば、ＭＨＣ／ペプチド)、優勢に発現される分子(一般にタンパク質、炭水化物または脂質)をいい、これは、薬物の癌細胞への優先的ターゲティングに有用である。ある態様において、腫瘍抗原は、正常細胞および癌細胞両者から発現されるマーカー、例えば、細胞系譜マーカー、例えば、Ｂ細胞のＣＤ１９である。ある態様において、腫瘍抗原は、正常細胞と比較して癌細胞で過発現されている、例えば、正常細胞と比較して１倍過発現、２倍過発現、３倍過発現またはそれ以上過発現されている、細胞表面分子である。ある態様において、腫瘍抗原は、正常細胞で発現される分子と比較して、癌細胞で不適切に合成される細胞表面分子、例えば、欠失、付加または変異を含む分子である。ある態様において、腫瘍抗原は、癌細胞の表面上に、全体的であれフラグメンとしてであれ(例えば、ＭＨＣ／ペプチド)、排他的に発現され、正常細胞の表面には合成または発現されない。ある態様において、本発明のＣＡＲは、ＭＨＣ提示ペプチドに結合する抗原結合ドメイン(例えば、抗体または抗体フラグメント)を含むＣＡＲを含む。通常、内在性タンパク質由来のペプチドは主要組織適合遺伝子複合体(ＭＨＣ)クラスＩ分子のポケットを満たし、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球のＴ細胞受容体(ＴＣＲ)により認識される。ＭＨＣクラスＩ複合体は、全有核細胞により構成的に発現される。癌において、ウイルス特異的および／または腫瘍特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体は、免疫療法のための細胞表面標的の独特なクラスを表す。ヒト白血球抗原(ＨＬＡ)−Ａ１またはＨＬＡ−Ａ２の状況におけるウイルスまたは腫瘍抗原由来のペプチドを標的とするＴＣＲ様抗体は記載されている(例えば、Sastry et al., J Virol. 2011 85(5):1935-1942; Sergeeva et al., Blood, 2011 117(16):4262-4272; Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2156-2165; Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21) :1601-1608 ; Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176) :176ra33 ; Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100参照)。例えば、ＴＣＲ様抗体は、ヒトｓｃＦｖファージ提示ライブラリーのようなライブラリーのスクリーニングにより特定できる。
用語“腫瘍支持抗原”または“癌支持抗原”は、相互交換可能に、それ自体は、癌性ではないが、例えば、その増殖または生存、例えば、免疫細胞に対する耐性を促進することにより、癌細胞を支持する、細胞表面に発現される分子(一般にタンパク質、炭水化物または脂質)をいう。このタイプの細胞の例は、間質細胞および骨髄由来サプレッサー細胞(ＭＤＳＣ)を含む。腫瘍支持抗原それ自体は、抗原が癌細胞を支持する細胞に発現されている限り、腫瘍細胞支持に役割を有する必要はない。
ｓｃＦｖの文脈においてここで使用する用語“可動性ポリペプチドリンカー”または“リンカー”は、可変重鎖領域と可変軽鎖領域を一緒に連結するために、単独でまたは組み合わせで使用されるグリシンおよび／またはセリン残基のようなアミノ酸からなるペプチドリンカーをいう。ある態様において、可動性ポリペプチドリンカーはＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、アミノ酸配列(Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ)ｎ(配列番号３８)(ここで、ｎは１以上の正の整数である)を含む。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３。ｎ＝４、ｎ＝５およびｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９およびｎ＝１０。ある態様において、可動性ポリペプチドリンカーは、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)４(配列番号２７)または(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)３(配列番号２８)を含むが、これらに限定されない。他の態様において、リンカーは、(Ｇｌｙ２Ｓｅｒ)、(ＧｌｙＳｅｒ)または(Ｇｌｙ３Ｓｅｒ)(配列番号２９)の複数反復を含む。ＷＯ２０１２／１３８４７５号(引用により本明細書に包含させる)に記載のリンカーも本発明の範囲内に含まれる。
ここで使用する５’キャップ(別名ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ ７−メチルグアノシンキャップまたはＲＮＡ ｍ７Ｇキャップ)は、転写開始直後に真核メッセンジャーＲＮＡの“前面”または５’末端に付加されている修飾グアニンヌクレオチドである。５’キャップは、第一転写ヌクレオチドに連結した末端基からなる。その存在は、リボゾームによる認識およびＲＮａｓｅからの保護に重要である。キャップ付加は転写と結びつき、互いに影響し合うように共転写的に生じる。転写開始直後、合成中のｍＲＮＡの５’末端は、ＲＮＡポリメラーゼと結合したキャップ合成複合体により結合される。この酵素複合体は、ｍＲＮＡキャッピングに必要な化学反応を触媒する。合成は、多工程生化学反応として進行する。キャッピング部分は、安定性または翻訳効率のようなｍＲＮＡの機能性を調節するために修飾できる。
ここで使用する“インビトロ転写ＲＮＡ”は、インビトロで合成されている、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡをいう。一般に、インビトロ転写ＲＮＡは、インビトロ転写ベクターから産生される。インビトロ転写ベクターは、インビトロ転写ＲＮＡを産生するために使用する鋳型を含む。
ここで使用する“ポリ(Ａ)”は、ポリアデニル化によりｍＲＮＡに結合した一連のアデノシンである。一過性発現のための構築物の好ましい態様において、ポリＡは５０〜５０００(配列番号３０)、好ましくは６４を超え、より好ましくは１００を超え、最も好ましくは３００または４００を超える。ポリ(Ａ)配列は、局在化、安定性または翻訳効率のようなｍＲＮＡ機能性を調節するために、化学的にまたは酵素的に修飾できる。
ここで使用する“ポリアデニル化”は、メッセンジャーＲＮＡ分子への、ポリアデニリル部分またはその修飾バリアントの供給結合をいう。真核生物において、ほとんどのメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)分子は、３’末端でポリアデニル化されている。３’ポリ(Ａ)テイルは、酵素、ポリアデニル酸ポリメラーゼの作用によりプレｍＲＮＡに添加されたアデニンヌクレオチドの長い配列(しばしば数百)である。高等真核生物において、ポリ(Ａ)テイルは、特異的配列、ポリアデニル化シグナルを含む転写物に添加される。ポリ(Ａ)テイルおよびそれに結合したタンパク質は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼによる分解から守るのに役立つ。ポリアデニル化は、転写終結、ｍＲＮＡの核からの排出および翻訳にも重要である。ポリアデニル化は、核でＤＮＡのＲＮＡへの転写直後だけでなく、さらに、細胞質で後に起こり得る。転写が中血された後、ｍＲＮＡ鎖は、ＲＮＡポリメラーゼと結合したエンドヌクレアーゼ複合体の作用により開裂される。開裂部位は、通常、開裂部位近くの塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在により特徴付けられる。ＭＲＮＡが開裂された後、アデノシン残基は、開裂部位の遊離３’末端に付加される。
ここで使用する“一過性”は、数時間、数日または数週間の期間の非統合導入遺伝子の発現をいい、ここで、発現の期間は、宿主細胞におけるゲノムに統合されたときまたは安定プラスミドレプリコン内に含まれるときの遺伝子の発現期間より短い。
ここで使用する用語“処置”および“処置する”は、１以上の治療剤(例えば、本発明のＣＡＲのような１以上の治療剤)の投与に起因する、増殖性障害の進行、重症度および／または期間の減少または改善または増殖性障害の１以上の症状(好ましくは、１以上の認識できる症状)の改善をいう。特定の態様において、用語“処置”および“処置する”は、患者により必ずしも認識できるものではない、腫瘍増殖のような増殖性障害の少なくとも一つの測定可能な身体的パラメータの改善をいう。他の態様において、用語“処置”および“処置する”は、身体的な、例えば、認識できる症状の安定化、生理学的な、例えば、身体的パラメータの安定化のいずれかまたは両者の、増殖性障害の進行阻害をいう。他の態様において、用語“処置”および“処置する”は、腫瘍サイズまたは癌性細胞数の減少または安定化をいう。
用語“シグナル伝達経路”は、細胞のある部分から細胞の他の部分へのシグナルの伝達に役割を有する多様なシグナル伝達分子間の生化学的関係をいう。用語“細胞表面受容体”は、シグナルを受け、細胞膜を通ってシグナルを伝達できる分子および分子複合体を含む。
用語“対象”は、免疫応答が惹起できる生存生物(例えば、哺乳動物、ヒト)を含むことを意図する。
用語“実質的に精製された”細胞は、他の細胞型を本質的に含まない細胞をいう。実質的に精製された細胞はまた、天然に存在する状態では通常関係している他の細胞型から離されている細胞もいう。ある例において、実質的に精製された細胞の集団は、細胞の均一集団をいう。他の例において、この用語は、単に、その天然の状態で本来関係している細胞から離されている細胞をいう。ある面において、細胞は、インビトロで培養される。他の面において、細胞は、インビトロで培養されない。
ここで使用する用語“治療”は、処置を意味する。治療効果は、疾患状態の軽減、抑制、寛解または消失により得られる。
ここで使用する用語“予防”は、疾患または疾患状態に対する予防または防御的処置を意味する。
本発明の文脈において、“腫瘍抗原”または“過増殖性障害抗原”または“過増殖性障害と関係する抗原”は、特定の過増殖性障害に共通する抗原をいう。ある面において、本発明の過増殖性障害抗原は、原発性または転移黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎癌および乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌などのような腺癌を含むが、これらに限定されない癌由来である。
用語“遺伝子導入”または“形質転換”または“形質導入”は、外来性核酸が宿主細胞に伝達または導入される過程をいう。“遺伝子導入”または“形質転換”または“形質導入”細胞は、外来性核酸が遺伝子導入、形質転換または形質導入されているものである。細胞は、初代対象細胞およびその子孫を含む。
用語“特異的に結合”は、サンプルに存在する同族結合パートナー(例えば、Ｔ細胞に存在する刺激性および／または共刺激性分子)タンパク質を認識し、結合する抗体またはリガンドをいうが、その抗体またはリガンドはサンプルにおける他の分子を実質的に認識または結合しない。
ここで使用する用語“制御可能キメラ抗原受容体(ＲＣＡＲ)”は、一連のポリペプチド、一般に最も単純な態様で２ポリペプチドをいい、免疫エフェクター細胞にあるとき、細胞に標的細胞、一般に癌細胞に対する特異性および細胞内シグナル産生を与える。ある態様において、ＲＣＡＲは、ＣＡＲ分子の文脈において定義したような、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび刺激性分子由来の機能的シグナル伝達ドメインおよび／または共刺激性分子を含む細胞質シグナル伝達ドメイン(ここでは“細胞内シグナル伝達ドメイン”とも呼ぶ)を含む。ある態様において、ＲＣＡＲにおける一連のポリペプチドは互いに隣接しておらず、例えば、異なるポリペプチド鎖にある。ある態様において、ＲＣＡＲは、二量体化分子の存在下、ポリペプチドを互いに結合できる、例えば、抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに結合できる、二量体化スイッチを含む。ある態様において、ＲＣＡＲは、ここに記載するような細胞(例えば、免疫エフェクター細胞)、例えば、ＲＣＡＲ発現細胞(ここでは“ＲＣＡＲＸ細胞”とも呼ぶ)で発現される。ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞はＴ細胞であり、ＲＣＡＲＴ細胞と称する。ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞はＮＫ細胞であり、ＲＣＡＲＮ細胞と称する。ＲＣＡＲは、ＲＣＡＲ発現細胞に、標的細胞、一般に癌細胞に対する特異性および、ＲＣＡＲ発現細胞の免疫エフェクター特性を最適化できる制御可能細胞内シグナル産生または増殖を提供する。ある態様において、ＲＣＡＲ細胞は、少なくとも一部、抗原結合ドメインにより結合される抗原を含む標的細胞に対する特性を提供するのを抗原結合ドメインに頼る。
ここで使用する用語“膜アンカー”または“膜繋留ドメイン”は、細胞外または細胞内ドメインを原形質膜に繋留するのに十分なポリペプチドまたは部分、例えば、ミリストイル基をいう。
ここで使用する“スイッチドメイン”は、例えば、ＲＣＡＲをいうとき、二量体化分子の存在下、他のスイッチドメインと結合する物、一般にポリペプチドベースの物をいう。結合は、第一スイッチドメインに結合、例えば融合した第一の物と、第二スイッチドメインに結合、例えば融合した第二の物の機能的カップリングをもたらす。第一および第二スイッチドメインは、まとめて二量体化スイッチとして呼ばれる。ある態様において、第一および第二スイッチドメインは互いに同一であり、例えば、同じ一次アミノ酸配列を有するポリペプチドであり、集合的にホモ二量体化スイッチと呼ばれる。ある態様において、第一および第二スイッチドメインは互いに異なり、例えば、異なる一次アミノ酸配列を有するポリペプチドであり、集合的にヘテロ二量体化スイッチと呼ばれる。ある態様において、スイッチは細胞内である。ある態様において、スイッチは細胞外である。ある態様において、スイッチドメインはポリペプチドベースの物、例えば、ＦＫＢＰまたはＦＲＢベースの物であり、二量体化分子は小分子、例えば、ラパログである。ある態様において、スイッチドメインはポリペプチドベースの物、例えば、ｍｙｃペプチドに結合するｓｃＦｖであり、二量体化分子は、１以上のｍｙｃ ｓｃＦｖと結合するポリペプチド、そのフラグメントまたはポリペプチドの多量体、例えば、ｍｙｃリガンドまたはｍｙｃリガンドの多量体である。ある態様において、スイッチドメインはポリペプチドベースの物、例えば、ｍｙｃ受容体であり、二量体化分子は抗体またはそのフラグメント、例えば、ｍｙｃ抗体である。
ここで使用する用語“二量体化分子”は、例えば、ＲＣＡＲをいうとき、第一スイッチドメインと第二スイッチドメインの結合を促進する分子をいう。ある態様において、二量体化分子は対象に天然に存在しないかまたは顕著な二量体化をもたらす濃度で生じない。ある態様において、二量体化分子は小分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１である。
用語“生物学的同等”は、対照化合物(例えば、ＲＡＤ００１)の対照用量または対照量により産生される効果と同等な効果を産生するのに必要な対照化合物(例えば、ＲＡＤ００１)以外の薬剤の量をいう。ある態様において、効果は、例えば、インビボまたはインビトロアッセイにおいて評価した、例えば、ここに記載するアッセイ、例えば、Ｂｏｕｌａｙアッセイで測定した、例えば、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ阻害により測定した、ｍＴＯＲ阻害のレベルまたはウェスタンブロットによるリン酸化Ｓ６レベルの測定である。ある態様において、効果は、細胞選別により測定して、ＰＤ−１陽性／ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞比の改変である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の生物学的同等量または用量は、対照化合物の対照用量または対照量と同じレベルのＰ７０ Ｓ６キナーゼ阻害を達成する量または用量である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の生物学的同等量または用量は、対照化合物の対照用量または対照量と同じレベルのＰＤ−１陽性／ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞比を達成する量または用量である。
用語“低い免疫増強用量”はｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１またはラパマイシンまたは触媒的ｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて使用したとき、例えば、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ活性の阻害により測定して、ｍＴＯＲ活性を一部、しかし完全ではなく、阻害するｍＴＯＲ阻害剤の用量をいう。例えば、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼの阻害により、ｍＴＯＲ活性を評価する方法は、ここに記載する。本用量は、完全な免疫抑制を生じるには不十分であるが、免疫応答の増強に十分である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の低い免疫増強用量は、ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の数の減少および／またはＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の数の増加またはＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)／ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)比の増加をもたらす。
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の低い免疫増強用量は、ナイーブＴ細胞の数の増加をもたらす。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の低い免疫増強用量は、次の１以上をもたらす：
１以上の次のマーカーの発現の増加：例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２；
例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＫＬＲＧ１の発現減少；および
次の特徴のいずれか一つまたは組み合わせを有する記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、細胞の数の増加：増加したＣＤ６２Ｌ高、増加したＣＤ１２７高、増加したＣＤ２７＋、減少したＫＬＲＧ１および増加したＢＣＬ２；
ここで、上記の何れかの変化は、例えば、非処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に、生じる。
ここで使用する“難治性”は、処置に応答しない疾患、例えば、癌をいう。ある態様において、難治性癌は、処置前または開始時点で処置に耐性であり得る。他の態様において、難治性癌は、処置中に耐性になり得る。難治性癌は、耐性癌とも呼ばれる。
ここで使用する“再発性”または“再発”は、一定期間の改善または応答後、例えば、先の治療、例えば、癌治療の処置後の、疾患(例えば、癌)または癌のような疾患の兆候および症状の再出現をいう。例えば、応答期間は、癌細胞のレベルの、ある閾値未満、例えば、２０％、１％、１０％、５％、４％、３％、２％または１％未満への低下を含む。再出現は、癌細胞のレベルの、ある閾値を越える、例えば、２０％、１％、１０％、５％、４％、３％、２％または１％を超える増加を含み得る。
範囲：本開示をとおして、本発明の種々の面は、範囲形式で示され得る。範囲形式での記載は単に便宜さおよび簡潔さのためであり、本発明の範囲上の確固たる限定として解釈してはならないと理解されるべきである。よって、範囲の記載は、具体的に記載された全ての可能な下位範囲ならびにその範囲内の個々の数値を有すると考慮すべきである。例えば、１〜６のような範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などのような具体的に開示された下位範囲、ならびにその範囲内の個々の数値、例えば、１、２、２.７、３、４、５、５.３および６を有すると解釈すべきである。他の例として、９５〜９９％同一性のような範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する何かを含み、９６〜９９％、９６〜９８％、９６〜９７％、９７〜９９％、９７〜９８％および９８〜９９％同一性のような下位範囲を含む。これは、範囲の広さと無関係に適用される。
記載
ここに提供されるのは、ＣＤ３３キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を使用する、癌のような疾患の処置または予防に使用するための組成物および方法である。
ある面において、本発明は、ＣＤ３３タンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合するために操作した抗体または抗体フラグメントを含む多数のキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を含む。ある面において、本発明は、ＣＡＲを発現するように操作した細胞(例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)に関し、ここで、細胞(例えば、“ＣＡＲＴ”)は抗腫瘍特性を示す。ある面において、細胞はＣＡＲで形質転換され、ＣＡＲまたは少なくともその一部は細胞表面に発現される。ある態様において、細胞(例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)は、ＣＡＲをコードするウイルスベクターで形質導入される。ある態様において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。ある態様において、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。あるこのような態様において、細胞はＣＡＲを安定に発現し得る。他の態様において、細胞(例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)は、ＣＡＲをコードする核酸、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡで遺伝子導入される。あるこのような態様において、細胞は、ＣＡＲを一過性に発現し得る。
ある面において、ＣＡＲのＣＤ３３結合ドメイン、例えば、ヒトまたはヒト化ＣＤ３３結合ドメインは、ｓｃＦｖ抗体フラグメントである。ある面において、このような抗体フラグメントは、同じ重鎖および軽鎖可変領域を有するＩｇＧ抗体と等価な結合親和性を保持する例えば、同等な有効性で同じ抗原に結合する点で、機能的である。ある面において、このような抗体フラグメントは、当業者に理解されるように、免疫応答活性化、その標的抗原からのシグナル伝達開始阻害を含むが、これらに限定されない生物学的応答を提供する点で、機能的である。
ある面において、本発明の抗体は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)に取り込まれる。ある面において、ＣＡＲは、配列番号４８〜５６としてここに提供されるポリペプチド配列を含む。
ある面において、ＣＤ３３結合ドメイン、例えば、ヒト化またはヒトＣＤ３３結合ドメイン、本発明のＣＡＲの部分は、配列が哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている導入遺伝子によりコードされる。ある面において、本発明のＣＡＲ構築物全体は、配列全体が哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている導入遺伝子によりコードされる。コドン最適化は、コーディングＤＮＡにおける同義コドン(すなわち、同じアミノ酸をコードするコドン)の出現頻度が、種によって偏っているとの発見をいう。このようなコドン縮退は、同一ポリペプチドが多様なヌクレオチド配列によりコードされることを可能にする。種々のコドン最適化方法が当分野で知られ、例えば、少なくとも米国特許５,７８６,４６４号および６,１１４,１４８号に開示された方法を含む。
ある面において、ヒトＣＤ３３結合ドメインは、配列番号３９〜４７に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。ある面において、ヒトＣＤ３３結合ドメインは、配列番号３９に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。ある面において、ヒトＣＤ３３結合ドメインｃは、配列番号４０に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。ある面において、ヒトＣＤ３３結合ドメインは、配列番号４１に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。ある面において、ヒトＣＤ３３結合ドメインは、配列番号４２に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。ある面において、ヒトＣＤ３３結合ドメインは、配列番号４３に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。ある面において、ヒトＣＤ３３結合ドメインは、配列番号４４に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。ある面において、ヒトＣＤ３３結合ドメインは、配列番号４５に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。ある面において、ヒトＣＤ３３結合ドメインは、配列番号４６に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。ある面において、ヒトＣＤ３３結合ドメインは、配列番号４７に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。ある面において、本発明のＣＡＲは、特異的抗体の抗原結合ドメインと細胞内シグナル伝達分子をあわせる。例えば、ある面において、細胞内シグナル伝達分子は、ＣＤ３ゼータ鎖、４−１ＢＢおよびＣＤ２８シグナル伝達モジュールおよびこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。ある面において、抗原結合ドメインは、ＣＤ３３に結合する。ある面において、ＣＤ３３ ＣＡＲは、配列番号４８〜５６の１以上に提供される配列〜選択されるＣＡＲを含む。ある面において、ＣＤ３３ ＣＡＲは、配列番号４８に提供する配列を含む。ある面において、ＣＤ３３ ＣＡＲは、配列番号４９に提供する配列を含む。ある面において、ＣＤ３３ ＣＡＲは、配列番号５０に提供する配列を含む。ある面において、ＣＤ３３ ＣＡＲは、配列番号５１に提供する配列を含む。ある面において、ＣＤ３３ ＣＡＲは、配列番号５２に提供する配列を含む。ある面において、ＣＤ３３ ＣＡＲは、配列番号５３に提供する配列を含む。ある面において、ＣＤ３３ ＣＡＲは、配列番号５４に提供する配列を含む。ある面において、ＣＤ３３ ＣＡＲは、配列番号５５に提供する配列を含む。ある面において、ＣＤ３３ ＣＡＲは、配列番号５６に提供する配列を含む。
さらに、本発明は、数ある疾患の中で、癌またはＣＤ３３を発現する細胞または組織が関与するあらゆる悪性腫瘍または自己免疫性疾患を処置するための、ＣＤ３３ ＣＡＲ組成物およびその医薬における使用または方法を提供する。
ある面において、本発明のＣＡＲはＣＤ３３発現正常細胞を根絶するために使用でき、それにより細胞移植または他の適当な治療前に細胞コンディショニング治療としての使用が適用可能である。細胞移植は、幹細胞移植、例えば、造血幹細胞移植および骨髄移植を含む。細胞移植は同種または自己である。ある態様において、本発明のＣＡＲは、細胞移植または他の適当な治療前にＣＤ３３発現正常細胞またはＣＤ３３発現癌細胞または両者を根絶する。ある面において、ＣＤ３３発現正常細胞は、ＣＤ３３発現骨髄前駆細胞であり、細胞移植は幹細胞移植である。
ある面において、本発明は、本発明のキメラ抗原受容体(例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞、例えば、ＣＡＲＴ)を発現するように操作した細胞(例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を提供し、ここで、細胞(例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞、例えば、“ＣＡＲＴ”)は抗腫瘍特性を示す。よって、本発明は、ＣＤ３３結合ドメインを含み、細胞(例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)に操作されたＣＤ３３−ＣＡＲおよびその養子治療における使用方法を提供する。
ある面において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ヒトＣＤ３３抗体または抗体フラグメントを含む。ある面において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ヒト化ＣＤ３３抗体または抗体フラグメントを含む。ある面において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含むヒトＣＤ３３抗体フラグメントを含む。ある面において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ヒトＣＤ３３ ｓｃＦｖである。ある面において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含むヒト化ＣＤ３３抗体フラグメントを含む。ある面において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ヒト化ＣＤ３３ ｓｃＦｖである。
ある面において、ＣＤ３３−ＣＡＲは、例えば、ＣＤ１３７(４−１ＢＢ)シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータシグナルドメインおよびいずれかのこれらの組み合わせからなる群から選択される、例えば、ここに記載の、少なくとも一つの細胞内ドメインを含む。ある面において、ＣＤ３３−ＣＡＲは、ＣＤ１３７(４−１ＢＢ)またはＣＤ２８以外の１以上の共刺激性分子由来である少なくとも一つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)
本発明はまた、抗ＣＤ３３結合ドメイン(例えば、ここに記載するようなＣＤ３３結合ドメイン)、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ(例えば、ＣＡＲポリペプチド)を提供し、ここで、該ＣＤ３３結合ドメインは、表２または９に記載するいずれかの重鎖結合ドメインアミノ酸配列の重鎖相補的決定領域１(ＨＣ ＣＤＲ１)、重鎖相補的決定領域２(ＨＣ ＣＤＲ２)および重鎖相補的決定領域３(ＨＣ ＣＤＲ３)を含む。ＣＡＲのＣＤ３３結合ドメインは、さらに表２または９に記載するいずれかの重鎖結合ドメインアミノ酸配列の軽鎖相補的決定領域１(ＬＣ ＣＤＲ１)、軽鎖相補的決定領域２(ＬＣ ＣＤＲ２)および軽鎖相補的決定領域３(ＬＣ ＣＤＲ３)を含み得る。
本発明はまた、ここに記載するようなＣＡＲをコードする、例えば、ＣＤ３３結合ドメイン(例えば、ここに記載のような)、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインおよびここで、該ＣＤ３３結合ドメインは、表２または９に記載するいずれかの重鎖結合ドメインアミノ酸配列の重鎖相補的決定領域１(ＨＣ ＣＤＲ１)、重鎖相補的決定領域２(ＨＣ ＣＤＲ２)および重鎖相補的決定領域３(ＨＣ ＣＤＲ３)を含むＣＡＲをコードする、核酸分子も提供する。ある態様において、コードされたＣＡＲのＣＤ３３結合ドメインは、さらに表２または９に記載のいずれかの抗ＢＭＣＡ重鎖結合ドメインアミノ酸配列の軽鎖相補的決定領域１(ＬＣ ＣＤＲ１)、軽鎖相補的決定領域２(ＬＣ ＣＤＲ２)および軽鎖相補的決定領域３(ＬＣ ＣＤＲ３)を含み得る。
特定の面において、本発明のＣＡＲ構築物は、配列番号３９〜４７からなる群から選択されるヒトｓｃＦｖドメインを含み、ここで、ｓｃＦｖは、配列番号１に提供されるようないずれかのリーダー配列が前にあり、後ろに配列番号２または配列番号３または配列番号４または配列番号５に提供されるようないずれかのヒンジ配列、配列番号６に提供されるような膜貫通領域、配列番号７または配列番号８を含む細胞内シグナル伝達ドメインおよび配列番号９または配列番号１０を含むＣＤ３ゼータ配列があり、例えば、ここで、ドメインは、単一融合タンパク質を形成するように同じリーディングフレームに隣接するかその中にある。また本発明に包含されるのは、配列番号３９〜４７からなる群から選択されるヒトｓｃＦｖフラグメントの各々のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。また本発明に包含されるのは、配列番号３９〜４７からなる群から選択されるヒトｓｃＦｖフラグメントの各々のポリペプチドおよび配列番号１、２および６〜９の各ドメインに加えて、コードされた本発明のＣＤ３３ ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列である。
ある面において、ＣＤ３３ＣＡＲ構築物例は、いずれかのリーダー配列、細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメインおよび細胞内刺激性ドメインを含む。ある面において、ＣＤ３３ＣＡＲ構築物例は、いずれかのリーダー配列、細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激ドメインおよび細胞内刺激性ドメインを含む。本発明のヒト化ｓｃＦｖドメインを含む特定のＣＤ３３ ＣＡＲ構築物は、配列番号１３８として提供される。
ある態様において、完全長ＣＤ３３ ＣＡＲ配列も、表２に示すような配列番号４８〜５６として提供する。
リーダー配列の例は、配列番号１として提供される。ヒンジ／スペーサー配列の例は、配列番号２または配列番号３または配列番号４または配列番号５として提供される。膜貫通ドメイン配列の例は、配列番号６として提供される。４−１ＢＢタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの配列の例は、配列番号７として提供される。ＣＤ２７の細胞内シグナル伝達ドメインの配列の例は、配列番号８として提供される。ＣＤ３ゼータドメイン配列の例は、配列番号９または配列番号１０として提供される。
ある面において、本発明は、ＣＡＲをコードする核酸分子を含む組み換え核酸構築物を包含し、ここで、核酸分子は、例えば、ここに記載する、ＣＤ３３結合ドメインをコードする核酸配列を含み、例えば、それは、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と同じリーディングフレームと隣接するかその中にある。ある面において、ヒトＣＤ３３結合ドメインは、配列番号３９〜４７の１以上から選択される。ある面において、ヒトＣＤ３３結合ドメインは、配列番号３９である。ある面において、ヒトＣＤ３３結合ドメインは、配列番号４０である。ある面において、ヒトＣＤ３３結合ドメインは、配列番号４１である。ある面において、ヒトＣＤ３３結合ドメインは、配列番号４２である。ある面において、ヒトＣＤ３３結合ドメインは、配列番号４３である。ある面において、ヒトＣＤ３３結合ドメインは、配列番号４４である。ある面において、ヒトＣＤ３３結合ドメインは、配列番号４５である。ある面において、ヒトＣＤ３３結合ドメインは、配列番号４６である。ある面において、ヒトＣＤ３３結合ドメインは、配列番号４７である。
ある面において、本発明は、ＣＡＲをコードする核酸分子を含む組み換え核酸構築物を包含し、ここで、核酸分子は、ＣＤ３３結合ドメインをコードする核酸配列を含み、例えば、ここで、配列は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と同じリーディングフレームに隣接するかその中にある。ＣＡＲにおいて使用できる細胞内シグナル伝達ドメインの例は、例えば、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、４−１ＢＢなどの、１以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含むが、これらに限定されない。ある例において、ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、４−１ＢＢなどのいずれかの組み合わせを含み得る。
ある面において、本発明のＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号７５〜８３の１以上から選択される。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号７５を含む(例えば、それからなる)。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号７６を含む(例えば、それからなる)。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号７７を含む(例えば、それからなる)。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号７８を含む(例えば、それからなる)。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号７９を含む(例えば、それからなる)。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号８０を含む(例えば、それからなる)。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号８１を含む(例えば、それからなる)。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号８２を含む(例えば、それからなる)。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号８３を含む(例えば、それからなる)。
所望の分子をコードする核酸配列は、標準技術を使用して、例えば遺伝子を発現する細胞からのライブラリーのスクリーニングにより、それを含むことが知られるベクターからの遺伝子を誘導化することによりまたはそれを含むことが知られる細胞および組織から直接単離することによるような、組み換え当分野で知られる方法を使用して得ることができる。あるいは、目的の核酸を、クローン化より合成により産生できる。
本発明は、細胞に直接形質導入できるＣＡＲを発現するレトロウイルスおよびレンチウイルスベクター構築物を含む。
本発明はまた細胞に直接遺伝子導入できるＲＮＡ構築物を含む。トランスフェクションに使用するためのｍＲＮＡを産生する方法は、特異的に設計したプライマーの鋳型のインビトロ転写(ＩＶＴ)、続くポリＡ付加を含み、３’および５’非翻訳配列(“ＵＴＲ”)、５’キャップおよび／または配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)、発現させる核酸およびポリＡテイル、一般に５０〜２０００塩基長を含む構築物を産生する(配列番号３５)。このように産生されたＲＮＡは、異なる種の細胞において効率的に翻訳され得る。ある態様において、鋳型は、ＣＡＲの配列を含む。ある態様において、ＲＮＡ ＣＡＲベクターを、電気穿孔法により細胞に形質導入する。
抗原結合ドメイン
本発明のＣＡＲは、標的特異的結合要素を含む。選り抜きの部分は、標的細胞の表面を規定するリガンドのタイプおよび数による。例えば、抗原結合ドメインは、特定の疾患状態と関係する標的細胞の細胞表面マーカーとして作用する高原を認識するよう選択し得る。
ある面において、ＣＡＲ介在Ｔ細胞応答は、所望の抗原と特異的に結合する抗原結合ドメインをＣＡＲに操作する目的で、目的の抗原に指向させ得る。
ある面において、本発明のＣＡＲは、ＣＤ３３に特異的に結合する結合ドメインを含む。ある面において、本発明のＣＡＲは、ヒトＣＤ３３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む。
抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体および重鎖可変ドメイン(ＶＨ)、軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)およびラクダ科由来ナノボディの可変ドメイン(ＶＨＨ)のような単一ドメイン抗体を含むが、これらに限定されないその機能的フラグメントならびに組み換えフィブロネクチンドメインなどのような、当分野で抗原結合ドメインとして機能することが知られる代替天然スキャフォールドを含むが、これらに限定されない、抗原に結合するあらゆるドメインであり得る。ある例において、抗原結合ドメインがＣＡＲを最終的に使用するのと同じ種由来であることは有利である。例えば、ヒトにおける使用のために、ＣＡＲの抗原結合ドメインが、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインについてヒトまたはヒト化残基を含むことが有利であり得る。
ある例において、抗原結合ドメインがＣＡＲを最終的に使用するのと同じ種由来であることは有利である。例えば、ヒトにおける使用のために、ＣＡＲの抗原結合ドメインが、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインについてヒトまたはヒト化残基を含むことが有利であり得る。それゆえに、ある面において、抗原結合ドメインは、ヒト抗体または抗体フラグメントを含む。ある態様において、ヒトＣＤ３３結合ドメインは、ここに記載するヒトＣＤ３３結合ドメインの軽鎖相補的決定領域１(ＬＣ ＣＤＲ１)、軽鎖相補的決定領域２(ＬＣ ＣＤＲ２)および軽鎖相補的決定領域３(ＬＣ ＣＤＲ３)の１以上(例えば、全３)および／またはここに記載するヒトＣＤ３３結合ドメインの重鎖相補的決定領域１(ＨＣ ＣＤＲ１)、重鎖相補的決定領域２(ＨＣ ＣＤＲ２)および重鎖相補的決定領域３(ＨＣ ＣＤＲ３)の１以上(例えば、全３)、例えば、ヒトＬＣ ＣＤＲの１以上、例えば、全３およびＨＣ ＣＤＲの１以上、例えば、全３を含むＣＤ３３結合ドメインを含む。ある態様において、ヒトＣＤ３３結合ドメインは、ここに記載するヒトＣＤ３３結合ドメインの重鎖相補的決定領域１(ＨＣ ＣＤＲ１)、重鎖相補的決定領域２(ＨＣ ＣＤＲ２)および重鎖相補的決定領域３(ＨＣ ＣＤＲ３)の１以上(例えば、全３)を含み、例えば、ヒトＣＤ３３結合ドメインは２可変重鎖領域を含み、各々、ここに記載するＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を含む。ある態様において、ヒトＣＤ３３結合ドメインは、ここに(例えば、表４に)記載するヒト軽鎖可変領域および／またはここに(例えば、表３に)記載するヒト重鎖可変領域を含む。ある態様において、ヒトＣＤ３３結合ドメインは、ここに(例えば、表３に)記載するヒト重鎖可変領域、例えば、少なくとも２つのここに(例えば、表３に)記載するヒト重鎖可変領域を含む。ある態様において、ＣＤ３３結合ドメインは、表３〜４のアミノ酸配列の軽鎖および重鎖を含むｓｃＦｖを含む。ある態様において、ＣＤ３３結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖ)は、表４に提供する軽鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾(例えば、置換、例えば、保存的置換)を有するが、修飾(例えば、置換、例えば、保存的置換)が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列または表５のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域；および／または表４に提供する重鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾(例えば、置換、例えば、保存的置換)を有するが、修飾(例えば、置換、例えば、保存的置換)が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列または表３のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。ある態様において、ヒトＣＤ３３結合ドメインは、配列番号３９〜４７からなる群から選択される配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ＣＤ３３ ある態様において、ヒトＣＤ３３結合ドメインはｓｃＦｖであり、ここに、例えば、表４に記載するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域が、ここに、例えば、表３に記載するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域に、リンカー、例えば、ここに記載するリンカーを経て結合している。ある態様において、ヒトＣＤ３３結合ドメインは、(Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ)ｎリンカーを含み、ここで、ｎは１、２、３、４、５または６、好ましくは３または４である(配列番号２６)。ＳｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、次の配向のいずれかであり得る：軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域。
ある面において、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体または抗体フラグメントを含む。ある態様において、ヒト化ＣＤ３３結合ドメインは、ここに記載するＣＤ３３結合ドメインの軽鎖相補的決定領域１(ＬＣ ＣＤＲ１)、軽鎖相補的決定領域２(ＬＣ ＣＤＲ２)および軽鎖相補的決定領域３(ＬＣ ＣＤＲ３)の１以上(例えば、全３)および／またはここに記載するＣＤ３３結合ドメインの重鎖相補的決定領域１(ＨＣ ＣＤＲ１)、重鎖相補的決定領域２(ＨＣ ＣＤＲ２)および重鎖相補的決定領域３(ＨＣ ＣＤＲ３)の１以上(例えば、全３)、例えば、ヒト化ＬＣ ＣＤＲの１以上、例えば、全３およびＨＣ ＣＤＲの１以上、例えば、全３を含むＣＤ３３結合ドメインを含む。ある態様において、ヒト化ＣＤ３３結合ドメインは、(Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ)ｎリンカーを含み、ここで、ｎは１、２、３、４、５または６、好ましくは３または４である(配列番号２６)。ＳｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、次の配向のいずれかであり得る：軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域。
ある面において、ヒト化ＣＤ３３結合ドメインを含むＣＤ３３ ＣＡＲは、列番号１４３を含む。ある面において、非ヒト抗体は、抗体の特定の配列または領域がヒトにおいて天然に産生される抗体またはそのフラグメントに対する類似性を高めるために修飾されるものである、ヒト化される。ある面において、抗原結合ドメインは、ヒト化される。ここに記載するＣＡＲＴと使用するためのヒト化ＣＤ３３抗体の例は、ＷＯ２０１２１２３７５５号に記載のような、ｈｐ６７.６またはゲムツズマブを含む。
ヒト化抗体は、ＣＤＲ移植(例えば、各々をその全体を引用により本明細書に包含させる、欧州特許ＥＰ２３９,４００号；国際公開ＷＯ９１／０９９６７号；および米国特許５,２２５,５３９号、５,５３０,１０１号および５,５８５,０８９号参照)、ベニアリングまたはリサーフェシング(例えば、各々をその全体を引用により本明細書に包含させる欧州特許ＥＰ５９２,１０６号およびＥＰ５１９,５９６号；Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4／5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814; およびRoguska et al., 1994, PNAS, 91:969-973参照)、鎖シャッフリング(例えば、その全体を引用により本明細書に包含させる米国特許５,５６５,３３２号参照)および、例えば、各々引用によりその全体を本明細書に包含させる米国特許出願公開ＵＳ２００５／００４２６６４号、米国特許出願公開ＵＳ２００５／００４８６１７、米国特許６,４０７,２１３号、米国特許５,７６６,８８６号、国際公開ＷＯ９３１７１０５号、Tan et al., J. Immunol., 169:1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994)およびPedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994)に記載の技術を含むが、これらに限定されない、当分野で知られる多様な方法を使用して産生できる。しばしば、フレームワーク領域におけるフレームワーク残基を、抗原結合を変える、例えば改善するために、ＣＤＲドナー抗体からの対応する残基で置換する。これらのフレームワーク置換は、当分野で周知の方法、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用のモデリングおよび特定の位置の異常フレームワーク残基を同定するための配列比較により、同定される(例えば、引用により本明細書に包含させるQueen et al.、米国特許５,５８５,０８９号；およびRiechmann et al., 1988, Nature, 332:323参照)。
ヒト化抗体または抗体フラグメントは、非ヒトである源から残留している１以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、一般に“インポート”可変ドメインからとられる、“インポート”残基という。ここに提供されるように、ヒト化抗体または抗体フラグメントは、フレームワークが完全にまたは大部分ヒト生殖細胞系に由来する、非ヒト免疫グロブリン分子およびフレームワーク領域からの１以上のＣＤＲを含む。抗体または抗体フラグメントのヒト化のための多数の技術が当分野で知られ、本質的に、Winter and co-workers (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))の方法に従い、齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより、すなわち、ＣＤＲ移植(内容を引用によりその全体を本明細書に包含させるＥＰ２３９,４００号；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７号；および米国特許４,８１６,５６７号；６,３３１,４１５号；５,２２５,５３９号；５,５３０,１０１号；５,５８５,０８９号；６,５４８,６４０号)により実施できる。このようなヒト化抗体および抗体フラグメントにおいて、非ヒト種からの対応する配列により置換されるのは実質的に完全より少ないヒト可変ドメインである。ヒト化抗体は、しばしば、あるＣＤＲ残基およびおそらくあるフレームワーク(ＦＲ)残基が、齧歯類抗体における類似部位からの残基により置換される、ヒト抗体である。抗体および抗体フラグメントのヒト化は、ベニアリングまたはリサーフェシング(ＥＰ５９２,１０６号；ＥＰ５１９,５９６号；Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4／5):489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994); およびRoguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994)))または鎖シャッフリング(米国特許５,５６５,３３２号)によっても達成でき、その内容は、引用によりその全体を本明細書に包含させる。
ヒト化抗体を製造するために使用する軽および重両者のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を減少するためである。いわゆる“ベストフィット”法により、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を、既知ヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。齧歯類に最も近いヒト配列を、その後、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク(ＦＲ)として受け入れる(その内容を引用によりその全体を本明細書に包含させるSims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)参照)。他の使用は、特定のサブグループの軽鎖または重鎖の全抗体のコンセンサス配列由来の特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークは、数種の異なるヒト化抗体のために使用し得る(例えば、その内容を引用によりその全体を本明細書に包含させる、Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)参照)。ある態様において、重鎖可変領域のフレームワーク領域、例えば、全４フレームワーク領域は、ＶＨ４＿４−５９生殖細胞系配列由来である。ある態様において、フレームワーク領域は、例えば、対応するマウス配列のアミノ酸からの、１、２、３、４または５修飾、例えば、置換を含み得る(例えば、配列番号１３８)。ある態様において、軽鎖可変領域のフレームワーク領域、例えば、全４フレームワーク領域は、ＶＫ３＿１.２５生殖細胞系配列由来である。ある態様において、フレームワーク領域は、例えば、対応するマウス配列のアミノ酸からの、１、２、３、４または５修飾、例えば、置換を含み得る(例えば、配列番号１３８)。
ある面において、本発明のＣＡＲ組成物の抗体フラグメントを含む部分は、標的抗原に対する高親和性および他の有利な生物学的特性を維持しながらヒト化される。本発明のある面によって、ヒト化抗体および抗体フラグメントは、親およびヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列および種々の概念的ヒト化産物の分析の過程により製造される。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用可能であり、当業者は熟知している。選択した候補免疫グロブリン配列の可能性のある三次元立体構造的構造を説明および提示するコンピュータープログラムは利用可能である。これらのディスプレイの検査は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、例えば、候補免疫グロブリンの標的抗原への結合能に影響する残基の分析を可能にする。この方法で、ＦＲ残基は、標的抗原に対する親和性増加のような、所望の抗体または抗体フラグメント時調が達成されるように、レシピエントおよびインポート配列から選択および組み合わせできる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合の直接的かつ最も実質的な影響に関与する。
ヒト化抗体または抗体フラグメントは、例えば、本発明における、元の抗体と類似の抗原性特異性、ヒトＣＤ３３またはそのフラグメントに結合する能力を維持し得る。ある態様において、ヒト化抗体または抗体フラグメントは、ヒトＣＤ３３またはそのフラグメントに対する結合親和性および／または特異性が改善され得る。
ある面において、抗原結合ドメイン部分は、配列番号３９〜４７から選択される１以上の配列を含む。ある面において、ヒトＣＤ３３結合ドメインを含むＣＤ３３ ＣＡＲは、配列番号４８〜５６から選択される１以上の配列から選択される。
ある面において、ＣＤ３３結合ドメインは、抗体または抗体フラグメントの特定の機能的性質または特性により特徴付けられる。例えば、ある面において、本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合ドメインを含む部分は、ヒトＣＤ３３またはそのフラグメントと特異的に結合する。ある面において、本発明は、抗体または抗体フラグメントを含む抗原結合ドメインに関し、ここで、抗体結合ドメインはＣＤ３３タンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合し、ここで、抗体または抗体フラグメントは、配列番号４８〜５６のアミノ酸配列を含む可変軽鎖および／または可変重鎖を含む。ある面において、抗原結合ドメインは、配列番号３９〜４７から選択されるｓｃＦｖのアミノ酸配列を含む。ある面において、ｓｃＦｖは、リーダー配列に隣接しかつ同じリーディングフレームにある。ある面において、リーダー配列は、配列番号１として提供されるポリペプチド配列である。
ある面において、ＣＤ３３結合ドメインは、フラグメント、例えば、一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)である。ある面において、ＣＤ３３結合ドメインは、Ｆｖ、Ｆａｂ、(Ｆａｂ’)２または二機能性(例えば二特異性)ハイブリッド抗体である(例えば、Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105(1987))。ある面において、本発明の抗体およびそのフラグメントは、野生型のまたは増強した親和性でＣＤ３３タンパク質またはそのフラグメントに結合する。
ある例において、ヒトｓｃＦｖは、ディスプレイライブラリー由来であり得る。ディスプレイライブラリーは、エンティティのコレクションである；各エンティティはポリペプチド成分をコードまたは特定する、アクセス可能ポリペプチド成分および回復可能成分を含む。ポリペプチド成分は、異なるアミノ酸配列が表されるように変わる。ポリペプチド成分はいずれかの長さ、例えば３アミノ酸から３００超アミノ酸までであり得る。ディスプレイライブラリーエンティティは、Ｆａｂの１を超えるポリペプチド成分、例えば、２ポリペプチド鎖を含み得る。一つの例示的態様において、ディスプレイライブラリーを使用して、ヒトＣＤ３３結合ドメインを同定できる。選択において、ライブラリーの各メンバーのポリペプチド成分をＣＤ３３またはそのフラグメントでプローブし、ポリペプチド成分がＣＤ３３に結合するならば、ディスプレイライブラリーメンバーを、一般に支持体上への保持により同定する。
保持されたディスプレイライブラリーメンバーを支持体から改修し、分析する。分析は、増幅および続く類似または非類似条件下での選択を含み得る。例えば、陽性および陰性選択が交互であり得る。分析はまたポリペプチド成分、すなわち、抗ＣＤ３３結合ドメインのアミノ酸配列の決定および詳細な特徴付けのためのポリペプチド成分の精製も含み得る。
ディスプレイライブラリーについて多様な形式が使用され得る。例はファージディスプレイを含む。ファージディスプレイにおいて、タンパク質成分を、一般に共有的にバクテリオファージコートタンパク質に結合させる。結合は、コートタンパク質に融合したタンパク質成分をコードする核酸の翻訳に由来する。結合は、可動性ペプチドリンカー、プロテアーゼ部位または停止コドンの抑制の結果として取り込まれたアミノ酸を含む。ファージディスプレイは、例えば、Ｕ.Ｓ.５,２２３,４０９号； Smith(1985) Science 228:1315-1317；ＷＯ９２／１８６１９号；ＷＯ９１／１７２７１号；ＷＯ９２／２０７９１号；ＷＯ９２／１５６７９号；ＷＯ９３／０１２８８号；ＷＯ９２／０１０４７号；ＷＯ９２／０９６９０号；ＷＯ９０／０２８０９号；de Haard et al. (1999) J. Biol. Chem 274:18218-30; Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4:1-20; Hoogenboom et al. (2000) Immunol Today 2:371-8 and Hoet et al. (2005) Nat Biotechnol. 23(3)344-8に記載されている。タンパク質成分をディスプレイするバクテリオファージを、標準ファージ分取法、例えば増殖培地からのＰＥＧ沈降を使用して増殖および採取できる。個々のディスプレイファージ選択後、選択タンパク質成分をコードする核酸を、増幅後、選択したファージで感染させた細胞またはファージ自体から単離できる。個々のコロニーまたはプラークを採り、核酸を単離および配列決定できる。
他のディスプレイ形式は、細胞ベースのディスプレイ(例えば、ＷＯ０３／０２９４５６号参照)、タンパク質−核酸融合(例えば、ＵＳ６,２０７,４４６号参照)、リボソームディスプレイ(例えば、Mattheakis et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022 and Hanes et al. (2000) Nat Biotechnol. 18:1287-92; Hanes et al. (2000) Methods Enzymol. 328:404-30; and Schaffitzel et al. (1999) J Immunol Methods. 231(1-2):119-35参照)および大腸菌ペリプラズムディスプレイ(2005 Nov 22;PMID: 16337958)を含む。
ある例において、ｓｃＦｖｓは、当分野で知られる方法により製造できる(例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426およびHuston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883参照)。ＳｃＦｖ分子は、可動性ポリペプチドリンカーを使用して、ＶＨ領域とＶＬ領域を一緒に連結することにより産生できる。ｓｃＦｖ分子は、最適長および／またはアミノ酸組成を有するリンカー(例えば、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー)を含む。リンカー長は、ｓｃＦｖの可変領域がどのように折りたたまれ、相互作用するかに大きく影響し得る。実際、短ポリペプチドリンカーを用いるならば、(例えば、５〜１０アミノ酸)、鎖内折りたたみは阻止される。鎖内折りたたみは、２可変領域が一体となって機能的エピトープ結合部位を形成させるためにも必要である。リンカー配向およびサイズの例は、例えば、引用により本明細書に包含させるHollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448、米国特許出願公開２００５／０１００５４３号、２００５／０１７５６０６号、２００７／００１４７９４号およびＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０２０２５８号およびＷＯ２００７／０２４７１５号参照。
ｓｃＦｖは、そのＶＬ領域とＶＨ領域の間に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ以上のアミノ酸残基のリンカーを含み得る。リンカー配列は、あらゆる天然に存在するアミノ酸を含み得る。ある態様において、リンカー配列は、アミノ酸グリシンおよびセリンを含む。他の態様において、リンカー配列は、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)ｎ(ここで、ｎは１以上の正の整数である)のような、一連のグリシンおよびセリン反復を含む(配列番号２５)。ある態様において、リンカーは(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)４(配列番号２７)または(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)３(配列番号２８)であり得る。リンカー長の変動は、活性を維持または増強し、活性試験において優れた有効性を生じ得る。
ヒトＣＤ３３ ＣＡＲ構築物および抗原結合ドメイン例
ここに開示するＣＤ３３ ＣＡＲ構築物の例は、ｓｃＦｖ(例えば、ここでの表２および９に記載のようなヒトｓｃＦｖ、場合によりいずれかのリーダー配列(例えば、それぞれリーダーアミノ酸およびヌクレオチド配列例として配列番号１および配列番号１２)が前にある)を含む。ヒトｓｃＦｖフラグメントの配列(配列番号３９〜８３、いずれかのリーダー配列を含む)をここに表２に提供する。リーダー配列を伴わないヒトｓｃＦｖフラグメントの配列を、表９にここに提供する(ヌクレオチド配列について配列番号２５５〜２６１およびアミノ酸配列について配列番号２６２〜２６８)。ＣＤ３３ ＣＡＲ構築物は、さらにいずれかのヒンジドメイン、例えば、ＣＤ８ヒンジドメイン(例えば、配列番号２のまたは配列番号１３の核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を含む)；膜貫通ドメイン、例えば、ＣＤ８膜貫通ドメイン(例えば、配列番号６のまたは配列番号１７のヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列を含む)；細胞内ドメイン、例えば、４−１ＢＢ細胞内ドメイン(例えば、配列番号７のまたは配列番号１８のヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列を含む；および機能的シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメイン(例えば、配列番号９または１０のまたは配列番号２０または２１のヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列を含む)を含む。ある態様において、ドメインは、単一融合タンパク質を形成するように同じリーディングフレームに隣接するかその中にある。他の態様において、ドメインは、例えば、ここに記載するようなＲＣＡＲ分子におけるような、別々のポリペプチドにある。
ある態様において、完全長ＣＤ３３ ＣＡＲ分子は、表２に提供するＣＡＲ３３−１、ＣＡＲ３３−２、ＣＡＲ３３−３、ＣＡＲ３３−４、ＣＡＲ３３−５、ＣＡＲ３３−６、ＣＡＲ３３−７、ＣＡＲ３３−８、ＣＡＲ３３−９またはそれと実質的に(例えば、９５〜９９％)同一の配列のアミノ酸配列であるかまたはそのヌクレオチド配列によりコードされる。
ある態様において、ＣＤ３３ ＣＡＲ分子または抗ＣＤ３３抗原結合ドメインは、表２に提供するＣＡＲ３３−１、ＣＡＲ３３−２、ＣＡＲ３３−３、ＣＡＲ３３−４、ＣＡＲ３３−５、ＣＡＲ３３−６、ＣＡＲ３３−７、ＣＡＲ３３−８、ＣＡＲ３３−９のｓｃＦｖアミノ酸配列(リーダー配列を伴うまたは伴わない)を含むか；または表９に提供されるＣＡＲ３３−１、ＣＡＲ３３−２、ＣＡＲ３３−４、ＣＡＲ３３−５、ＣＡＲ３３−６、ＣＡＲ３３−７、ＣＡＲ３３−９のｓｃＦｖアミノ酸配列を含むかまたはそのヌクレオチド配列によりコードされるものを含むかまたは前記配列のいずれかと実質的に同一(例えば、９５〜９９％同一または最大２０、１５、１０、８、６、５、４、３、２または１アミノ酸変化、例えば、置換(例えば、保存的置換))である配列を含む。
ある態様において、ＣＤ３３ ＣＡＲ分子または抗ＣＤ３３抗原結合ドメインは、表２に提供するＣＡＲ３３−１、ＣＡＲ３３−２、ＣＡＲ３３−３、ＣＡＲ３３−４、ＣＡＲ３３−５、ＣＡＲ３３−６、ＣＡＲ３３−７、ＣＡＲ３３−８、ＣＡＲ３３−９の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域または前記配列のいずれかと実質的に同一(例えば、９５〜９９％同一または最大２０、１５、１０、８、６、５、４、３、２または１アミノ酸変化、例えば、置換(例えば、保存的置換))である配列を含む。
ある態様において、ＣＤ３３ ＣＡＲ分子または抗ＣＤ３３抗原結合ドメインは、表３に提供する重鎖可変領域からの１、２または３ＣＤＲ(例えば、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２および／またはＨＣ ＣＤＲ３)；および／または表４に提供するＣＡＲ３３−１、ＣＡＲ３３−２、ＣＡＲ３３−３、ＣＡＲ３３−４、ＣＡＲ３３−５、ＣＡＲ３３−６、ＣＡＲ３３−７、ＣＡＲ３３−８、ＣＡＲ３３−９の軽鎖可変領域からの１、２または３ＣＤＲ(例えば、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２および／またはＬＣ ＣＤＲ３)；または前記のいずれかと実質的に同一(例えば、９５〜９９％同一または最大５、４、３、２または１アミノ酸変化、例えば、置換(例えば、保存的置換))である配列を含む。
ある態様において、ＣＤ３３ ＣＡＲ分子または抗ＣＤ３３抗原結合ドメインは、表１０に提供する重鎖可変領域からの１、２または３ＣＤＲ(例えば、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２および／またはＨＣ ＣＤＲ３)；および／または表１１に提供するＣＡＲ３３−１、ＣＡＲ３３−２、ＣＡＲ３３−３、ＣＡＲ３３−４、ＣＡＲ３３−５、ＣＡＲ３３−６、ＣＡＲ３３−７、ＣＡＲ３３−８、ＣＡＲ３３−９の軽鎖可変領域からの１、２または３ＣＤＲ(例えば、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２および／またはＬＣ ＣＤＲ３)；または前記のいずれかと実質的に同一(例えば、９５〜９９％同一または最大５、４、３、２または１アミノ酸変化、例えば、置換(例えば、保存的置換))である配列を含む
ある態様において、ＣＤ３３ ＣＡＲ分子または抗ＣＤ３３抗原結合ドメインは、表１２に提供する重鎖可変領域(例えば、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２および／またはＨＣ ＣＤＲ３)からの１、２または３ＣＤＲ；および／または表１３に提供するＣＡＲ３３−１、ＣＡＲ３３−２、ＣＡＲ３３−３、ＣＡＲ３３−４、ＣＡＲ３３−５、ＣＡＲ３３−６、ＣＡＲ３３−７、ＣＡＲ３３−８、ＣＡＲ３３−９の軽鎖可変領域からの１、２または３ＣＤＲ(例えば、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２および／またはＬＣ ＣＤＲ３)；または前記のいずれかと実質的に同一(例えば、９５〜９９％同一または最大５、４、３、２または１アミノ酸変化、例えば、置換(例えば、保存的置換))である配列を含む。
ｓｃＦｖドメインのヒトＣＤＲ配列の配列を、重鎖可変ドメインについて表３および軽鎖可変ドメインについて表４に示す。“ＩＤ”は、各ＣＤＲの各配列番号を意味する。表３および４に提供するＣＤＲは、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ番号付けスキームの組み合わせに従う。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ分子(例えば、ＣＡＲ核酸またはＣＡＲポリペプチド)またはＣＤ３３結合ドメインは、次のものを含む。
(１)次のものから選択される、１、２または３軽鎖(ＬＣ)ＣＤＲ：
(ｉ)ＣＡＲ３３−１の配列番号１１１のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号１２０のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号１２９のＬＣ ＣＤＲ３；
(ii)ＣＡＲ３３−２の配列番号１１２のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号１２１のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号１３０；
(iii)ＣＡＲ３３−３の配列番号１１３のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号１２２のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号１３１のＬＣ ＣＤＲ３；
(iv)ＣＡＲ３３−４の配列番号１１４のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号１２３のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号１３２のＬＣ ＣＤＲ３；
(iv)ＣＡＲ３３−５の配列番号１１５のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号１２４のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号１３３のＬＣ ＣＤＲ３；
(vi)ＣＡＲ３３−６の配列番号１１６のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号１２５のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号１３４のＬＣ ＣＤＲ３；
(vii)ＣＡＲ３３−７の配列番号１１７のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号１２６のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号１３５のＬＣ ＣＤＲ３；
(viii)ＣＡＲ３３−８の配列番号１１８のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号１２７のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号１３６のＬＣ ＣＤＲ３；または
(ix)ＣＡＲ３３−９の配列番号１１９のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号１２８のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号１３７のＬＣ ＣＤＲ３；および／または
(２)次のものから選択される、１、２または３重鎖(ＨＣ)ＣＤＲ：
(ｉ)ＣＡＲ３３−１の配列番号８４のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号９３のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号１０２のＨＣ ＣＤＲ３；
(ii)ＣＡＲ３３−２の配列番号８５のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号９４のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号１０３のＨＣ ＣＤＲ３；
(iii)ＣＡＲ３３−３の配列番号８６のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号９５のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号１０４のＨＣ ＣＤＲ３；
(iv)ＣＡＲ３３−４の配列番号８７のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号９６のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号１０５のＨＣ ＣＤＲ３；
(iv)ＣＡＲ３３−５の配列番号８８のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号９７のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号１０６のＨＣ ＣＤＲ３；
(vi)ＣＡＲ３３−６の配列番号８９のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号９８のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号１０７のＨＣ ＣＤＲ３；
(vii)ＣＡＲ３３−７の配列番号９０のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号９９のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号１０８のＨＣ ＣＤＲ３；
(viii)ＣＡＲ３３−８の配列番号９１のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号１００のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号１０９のＨＣ ＣＤＲ３；または
(ix)ＣＡＲ３３−９の配列番号９２のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号１０１のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号１１０のＨＣ ＣＤＲ３。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ分子(例えば、ＣＡＲ核酸またはＣＡＲポリペプチド)は次のものを含む。
(１)次のものから選択される、１、２または３軽鎖(ＬＣ)ＣＤＲ：
(ｉ)ＣＡＲ３３−１の配列番号２９６のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３０５のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３１４のＬＣ ＣＤＲ３；
(ii)ＣＡＲ３３−２の配列番号２９７のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３０６のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３１５のＬＣ ＣＤＲ３；
(iii)ＣＡＲ３３−３の配列番号２９８のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３０７のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３１６のＬＣ ＣＤＲ３；
(iv)ＣＡＲ３３−４の配列番号２９９のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３０８のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３１７のＬＣ ＣＤＲ３；
(iv)ＣＡＲ３３−５の配列番号３００のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３０９のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３１８のＬＣ ＣＤＲ３；
(vi)ＣＡＲ３３−６の配列番号３０１のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３１０のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３１９のＬＣ ＣＤＲ３；
(vii)ＣＡＲ３３−７の配列番号３０２のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３１１のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３２０のＬＣ ＣＤＲ３；
(viii)ＣＡＲ３３−８の配列番号３０３のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３１２のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３２１のＬＣ ＣＤＲ３；または
(ix)ＣＡＲ３３−９の配列番号３０４のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３１３のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３２２のＬＣ ＣＤＲ３；および／または
(２)次のものから選択される、１、２または３重鎖(ＨＣ)ＣＤＲ：
(ｉ)ＣＡＲ３３−１の配列番号２６９のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号２７８のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号２８７のＨＣ ＣＤＲ３；
(ii)ＣＡＲ３３−２の配列番号２７１のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号２８０のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号２８９のＨＣ ＣＤＲ３；
(iii)配列番号２７１のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号２８０のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号２８９のＨＣ ＣＤＲ３のＣＡＲ３３−３；
(iv)ＣＡＲ３３−４の配列番号２７２のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号２８１のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号２９０のＨＣ ＣＤＲ３；
(iv)ＣＡＲ３３−５の配列番号２７３のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号２８２のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号２９１のＨＣ ＣＤＲ３；
(vi)ＣＡＲ３３−６の配列番号２７４のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号２８３のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号２９２のＨＣ ＣＤＲ３；
(vii)ＣＡＲ３３−７の配列番号２７５のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号２８４のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号２９３のＨＣ ＣＤＲ３；
(viii)ＣＡＲ３３−８の配列番号２７６のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号２８５のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号２９４のＨＣ ＣＤＲ３；または
(ix)ＣＡＲ３３−９の配列番号２７７のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号２８６のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号２９５のＨＣ ＣＤＲ３。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ分子(例えば、ＣＡＲ核酸またはＣＡＲポリペプチド)は次のものを含む。
(１)次のものから選択される、１、２または３軽鎖(ＬＣ)ＣＤＲ：
(ｉ)ＣＡＲ３３−１の配列番号３５０のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３５９のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３６８のＬＣ ＣＤＲ３；
(ii)ＣＡＲ３３−２の配列番号３５１のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３６０のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３６９のＬＣ ＣＤＲ３；
(iii)ＣＡＲ３３−３の配列番号３５２のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３６１のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３７０のＬＣ ＣＤＲ３；
(iv)ＣＡＲ３３−４の配列番号３５３のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３６２のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３７１のＬＣ ＣＤＲ３；
(iv)ＣＡＲ３３−５の配列番号３５４のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３６３のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３７２のＬＣ ＣＤＲ３；
(vi)ＣＡＲ３３−６の配列番号３５５のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３６４のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３７３のＬＣ ＣＤＲ３；
(vii)ＣＡＲ３３−７の配列番号３５６のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３６５のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３７４のＬＣ ＣＤＲ３；
(viii)ＣＡＲ３３−８の配列番号３５７のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３６６のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３７５のＬＣ ＣＤＲ３；または
(ix)ＣＡＲ３３−９の配列番号３５８のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３６７のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号３７６のＬＣ ＣＤＲ３；および／または
(２)次のものから選択される、１、２または３重鎖(ＨＣ)ＣＤＲ：
(ｉ)ＣＡＲ３３−１の配列番号３２３のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号３３２のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号３４１のＨＣ ＣＤＲ３；
(ii)ＣＡＲ３３−２の配列番号３２４のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号３３３のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号３４２のＨＣ ＣＤＲ３；
(iii)ＣＡＲ３３−３の配列番号３２５のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号３３４のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号３４３のＨＣ ＣＤＲ３；
(iv)ＣＡＲ３３−４の配列番号３２６のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号３３５のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号３４４のＨＣ ＣＤＲ３；
(iv)ＣＡＲ３３−５の配列番号３２７のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号３３６のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号３４５のＨＣ ＣＤＲ３；
(vi)ＣＡＲ３３−６の配列番号３２８のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号３３７のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号３４６のＨＣ ＣＤＲ３；
(vii)ＣＡＲ３３−７の配列番号３２９のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号３３８のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号３４７のＨＣ ＣＤＲ３；
(viii)ＣＡＲ３３−８の配列番号３３０のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号３３９のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号３４８のＨＣ ＣＤＲ３；または
(ix)ＣＡＲ３３−９の配列番号３３１のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号３４０のＨＣ ＣＤＲ２および配列番号３４９のＨＣ ＣＤＲ３。
ある態様において、完全ヒト抗ＣＤ３３一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)を産生し、細胞内ＣＤ３ゼータ鎖および４−１ＢＢの細胞内共刺激性ドメインを有するレンチウイルス発現ベクターにクローン化する。完全ヒト抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ例の名称を表１に記載する。
ある態様において、ＶＬおよびＶＨドメインがｓｃＦｖにおいて現れる順序は変わり(すなわち、ＶＬ−ＶＨまたはＶＨ−ＶＬ配向)、各サブユニットが配列ＧＧＧＧＳ(配列番号２５)(例えば、(Ｇ４Ｓ)３(配列番号２８)または(Ｇ４Ｓ)４(配列番号２７))を含む３または４コピーの“Ｇ４Ｓ”(配列番号２５)サブユニットは、表３に示すように、可変ドメインに結合して、ｓｃＦｖドメイン全体を作る。
ヒトｓｃＦｖフラグメント(配列番号３９〜８３、いずれかのリーダー配列を含む)の配列例をここに表２に提供する。リーダー配列を伴わない(例えば、配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１２のヌクレオチド配列を伴わない)配列番号３９〜８３のｓｃＦｖフラグメントも本発明に包含されることは注意すべきである。リーダー配列を伴わないヒトｓｃＦｖフラグメントの配列例をここに表９に示す(ヌクレオチド配列について配列番号２５５〜２６１およびアミノ酸配列について配列番号２６２〜２６８)。
リーダー(アミノ酸配列)(配列番号１)
MALPVTALLLPLALLLHAARP
リーダー(核酸配列)(配列番号１２)
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCC
ＣＤ８ヒンジ(アミノ酸配列)(配列番号２)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
ＣＤ８ヒンジ(核酸配列)(配列番号１３)
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT
ＣＤ８膜貫通(アミノ酸配列)(配列番号６)
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
ＣＤ８膜貫通(核酸配列)(配列番号１７)
ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC
４−１ＢＢ細胞内ドメイン(アミノ酸配列)(配列番号７)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
４−１ＢＢ細胞内ドメイン(核酸配列)(配列番号１８)
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
ＣＤ２８細胞内ドメイン(アミノ酸配列)(配列番号３７９)
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (配列番号379)
ＣＤ２８細胞内ドメイン(ヌクレオチド配列)(配列番号３８０)
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC (配列番号380)
ＩＣＯＳ細胞内ドメイン(アミノ酸配列)(配列番号３８１)
T K K K Y S S S V H D P N G E Y M F M R A V N T A K K S R L T D V T L (配列番号381)
ＩＣＯＳ細胞内ドメイン(ヌクレオチド配列)(配列番号３８２)
ACAAAAAAGAAGTATTCATCCAGTGTGCACGACCCTAACGGTGAATACATGTTCATGAGAGCAGTGAACACAGCCAAAAAATCCAGACTCACAGATGTGACCCTA (配列番号382)
ＣＤ３ゼータドメイン(アミノ酸配列)(配列番号９)
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
ＣＤ３ゼータ(核酸配列)(配列番号２０)
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
ＣＤ３ゼータドメイン(アミノ酸配列；ＮＣＢＩ対照配列ＮＭ＿０００７３４.３)(配列番号１０)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
ＣＤ３ゼータ(核酸配列；ＮＣＢＩ対照配列ＮＭ＿０００７３４.３)；(配列番号２１)
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAG
AACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTT
TGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGA
AGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGG
AGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGC
ACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGC
CCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
ＩｇＧ４ヒンジ(アミノ酸配列)(配列番号３６)
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM
ＩｇＧ４ヒンジ(ヌクレオチド配列)(配列番号３７)
GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG
ある態様において、これらのクローンは、ＣＤ３ゼータ鎖由来の共刺激性ドメインのシグナルドメインにおけるＱ／Ｋ残基変化を含む。
ある態様において、ＣＡＲ ｓｃＦｖフラグメントは、単一コーディングフレーム内に完全長ＣＡＲ構築物を作るためにレンチウイルスベクター内にコーディングされ、発現のためにプロモーター、例えば、ＥＦ１アルファプロモーターを使用する(配列番号１１)。
配列番号１１ ＥＦ１アルファプロモーター
CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ(配列番号２５)
GGGGS
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ(配列番号２６)：
この配列は、１〜６“Gly Gly Gly Gly Ser”反復単位を含み得る。
GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ(配列番号２７)
GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ(配列番号２８)
GGGGSGGGGS GGGGS
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ(配列番号２９)
GGGS
ポリＡ：(Ａ)５０００(配列番号３０)
この配列は５０〜５０００アデニンを含み得る。
ポリＡ：(Ｔ)１００(配列番号３１)
ポリＡ：(Ｔ)５０００(配列番号３２)
この配列は５０〜５０００チミンを含み得る。
ポリＡ：(Ａ)５０００(配列番号３３)
この配列は１００〜５０００アデニンを含み得る。
ポリＡ：(Ａ)４００(配列番号３４)
ポリＡ：(Ａ)２０００(配列番号３５)
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ(配列番号３８)：この配列は１〜１０“Gly Gly Gly Ser”反復単位を含み得る。
GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS
ＣＡＲ分子または抗体そのフラグメントのさらなる例を実施例３に提供する。抗ＣＤ３３抗体、２２１３のマウスおよびヒト化バージョンを開示する。例えば、実施例３は次のものを提供する：２２１３ マウス抗ＣＤ３３ ＩｇＧ４ヌクレオチド配列(配列番号１３８)；２２１３ ＣＡＲヌクレオチド配列(配列番号１３９)；２２１３ ＣＡＲアミノ酸配列(配列番号１４０)；２２１３ ｓｃＦｖヌクレオチド配列(配列番号１４１)；および２２１３ ｓｃＦｖアミノ酸配列(配列番号１４２)；２２１８ヒト化抗ＣＤ３３ ＩｇＧ４Ｈヌクレオチド配列(配列番号１４３)。
実施例３に開示する他の態様は、以前はマイロターグとして市販されていたゲムツズマブオゾガマイシンのＣＡＲ分子および抗ＣＤ３３抗体フラグメントを含む(例えば、ここでは、“ヒト化ｍｙ９６”と称するヒト化バージョン)。４１ＢＢおよびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを伴うゲムツズマブオゾガマイシン(ＣＤ３３を標的とする免疫コンジュゲート)の抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖのアミノ酸配列を実施例３；および配列番号１４５に記載する。ヒト化ｍｙ９６の対応するヌクレオチド配列を配列番号１４４として記載する。ヒト化ｍｙ９６ヌクレオチド配列をここに配列番号１４６として、アミノ酸配列を配列番号１４７に提供する。
ある態様において、ここに記載するＣＤ３３ ＣＡＲおよびＣＤ３３ ＣＡＲＴは、ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＡＭ４０２９７４.１によりコードされるｓｃＦｖ配列の重鎖可変ドメインの１以上の、例えば、１、２または３、ＣＤＲおよび／または軽鎖可変ドメインの１以上の、例えば、１、２または３、ＣＤＲまたはＶＨまたはＶＬを含む抗原結合ドメインを含む(引用により本明細書に包含させるWang et al., Mol. Ther., vol. 23:1, pp. 184-191(2015)参照)。
ＣＡＲ ｓｃＦｖフラグメントを、単一コーディングフレーム中の完全長ＣＡＲ構築物の製造のためにレンチウイルスベクターにクローン化でき、ＥＦ１アルファプロモーターを発現のために使用する(配列番号１１)。
ＣＡＲ構築物は、次の配列の１以上を有するＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーを含み得る：ＧＧＧＧＳ(配列番号２５)；１〜６“Gly Gly Gly Gly Ser”反復単位を含む、例えば、GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS(配列番号２６)；GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS(配列番号27); GGGGSGGGGS GGGGS(配列番号２８)；GGGS(配列番号２９)；または１〜１０“Gly Gly Gly Ser”反復単位を含む、例えば、GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS(配列番号３８)。
ある態様において、ＣＡＲ構築物は、ポリＡ配列、例えば、５０〜５０００または１００〜５０００アデニンを含む配列(例えば、配列番号３０、配列番号３３、配列番号３４または配列番号３５)または５０〜５０００チミンを含む配列(例えば、配列番号３１、配列番号３２)を含む。あるいは、ＣＡＲ構築物は、例えば、配列GSTSGSGKPGSGEGSTKGを含むリンカーを含み得る(配列番号３８３)。
二特異性ＣＡＲ
ある態様において、多特異性抗体分子は二特異性抗体分子である。二特異性抗体は、２以下の抗原に特異性を有する。二特異性抗体分子は、第一エピトープに対する結合特異性を有する第一免疫グロブリン可変ドメイン配列および第二エピトープに対する結合特異性を有する第二免疫グロブリン可変ドメイン配列により特徴付けられる。ある態様において、第一および第二エピトープは同じ抗原、例えば、同じタンパク質(または多量体タンパク質のサブユニット)である。ある態様において、第一および第二エピトープは重複する。ある態様において、第一および第二エピトープは重複しない。ある態様において、第一および第二エピトープは、異なる抗原、例えば、異なるタンパク質(または多量体タンパク質の異なるサブユニット)にある。ある態様において、二特異性抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列ならびに第二エピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列を含む。ある態様において、二特異性抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する半抗体および第二エピトープに結合特異性を有する半抗体を含む。ある態様において、二特異性抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する半抗体またはそのフラグメントおよび第二エピトープに結合特異性を有する半抗体またはそのフラグメントを含む。ある態様において、二特異性抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有するｓｃＦｖまたはそのフラグメントおよび第二エピトープに結合特異性を有するｓｃＦｖまたはそのフラグメントを含む。
ある態様において、抗体分子は、多特異性(例えば、二特異性または三特異性)抗体分子である。二特異性またはヘテロ二量体抗体分子を産生するためのプロトコールは当分野で知られる；例えば、ＵＳ５７３１１６８号に記載の、“ノブ・イン・ア・ホール”アプローチ；例えば、ＷＯ０９／０８９００４号、ＷＯ０６／１０６９０５号およびＷＯ２０１０／１２９３０４号に記載のような静電的ステアリングＦｃ対形成；例えば、ＷＯ０７／１１０２０５号に記載のような鎖交換操作ドメイン(ＳＥＥＤ)ヘテロ二量体形成；例えば、ＷＯ０８／１１９３５３号、ＷＯ２０１１／１３１７４６号およびＷＯ２０１３／０６０８６７号に記載のようなＦａｂアーム交換；例えば、ＵＳ４４３３０５９号に記載のような、例えば、アミン反応性基とスルフヒドリル反応性基を有するヘテロ二官能性試薬を使用して二特異性構造を製造するための、抗体架橋結合による、二重抗体コンジュゲート；例えば、ＵＳ４４４４８７８号に記載のような、２重鎖間のジスルフィド結合の還元および酸化のサイクルを経る異なる抗体からの半抗体(重−軽鎖対またはＦａｂ)の組み換えにより産生する二特異性抗体決定基；例えば、ＵＳ５２７３７４３号に記載のような、３機能性抗体、スルフヒドリル反応性基により架橋された３Ｆａｂ’フラグメント；例えば、ＵＳ５５３４２５４号に記載のような、生合成結合タンパク質、例えば、Ｃ末端テイル、好ましくはジスルフィドまたはアミン反応性化学架橋結合により架橋されたｓｃＦｖの対；例えば、ＵＳ５５８２９９６号に記載のような、二機能性抗体、例えば、置換された定常ドメインを有する、ロイシンジッパー(例えば、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎ)により二量体化された異なる結合特性を有するＦａｂフラグメント；例えば、ＵＳ５５９１８２８号に記載のような、二特異性およびオリゴ特異性一価およびオリゴ価受容体、例えば、一方の抗体のＣＨ１領域と他方の一般に軽鎖を伴う抗体のＶＨ領域の間のポリペプチドスペーサーを経て連結した２抗体(２Ｆａｂフラグメント)のＶＨ−ＣＨ１領域；例えば、ＵＳ５６３５６０２号に記載のような、二特異性ＤＮＡ−抗体コンジュゲート、例えば、二本鎖切片のＤＮＡを経た抗体またはＦａｂフラグメントの架橋；例えば、ＵＳ５６３７４８１号に記載のような、二特異性融合タンパク質、例えば、親水性らせん状ペプチドリンカーを間に含み、完全定常領域を含む、２ｓｃＦｖを含む発現構築物；例えば、ＵＳ５８３７２４２号に記載のような、多価および多特異性結合タンパク質、例えば、Ｉｇ重鎖可変領域の結合領域を有する第一ドメインおよびＩｇ軽鎖可変領域の結合領域を有する第二ドメインを有し、一般に二重特異性抗体(二特異性、三特異性、四特異性の分子を作るための高次構造も包含される)と呼ばれるポリペプチドの二量体；例えば、ＵＳ５８３７８２１号に記載のような、二特異性／多価分子を形成するように二量体できる、ペプチドスペーサーでさらに抗体ヒンジ領域およびＣＨ３領域に結合した、連結ＶＬ鎖およびＶＨ鎖を有するミニボディ構築物；二特異性二重特異性抗体を形成するように二量体を形成できる、いずれかの配向で短ペプチドリンカー(例えば、５または１０アミノ酸)またはによりまたはリンカー無しで連結されたＶＨおよびＶＬドメイン；例えば、ＵＳ５８４４０９４号に記載のような、三量体および四量体；例えば、ＵＳ５８６４０１９号に記載のような、一連のＦＶ(またはｓｃＦｖ)を形成するようにさらにＶＬドメインと結合した、Ｃ末端で架橋可能基とのペプチド結合により連結した一連のＶＨドメイン(またはファミリーメンバーにおけるＶＬドメイン)；および、例えば、ＵＳ５８６９６２０号に記載のような、ｓｃＦＶまたは二重特異性抗体形態の両者を使用して、例えば、ホモ二価、ヘテロ二価、三価および四価構造を形成するように、非共有または化学架橋により多価構造に合わさっている、ペプチドリンカーにより連結してＶＨドメインおよびＶＬドメインの両者を有する一本鎖結合ポリペプチドを、例えば、含むが、これらに限定されない。多特異性および二特異性分子およびそれを製造するためのさらなる例は、例えば、ＵＳ５９１０５７３号、ＵＳ５９３２４４８号、ＵＳ５９５９０８３号、ＵＳ５９８９８３０号、ＵＳ６００５０７９号、ＵＳ６２３９２５９号、ＵＳ６２９４３５３号、ＵＳ６３３３３９６号、ＵＳ６４７６１９８号、ＵＳ６５１１６６３号、ＵＳ６６７０４５３号、ＵＳ６７４３８９６号、ＵＳ６８０９１８５号、ＵＳ６８３３４４１号、ＵＳ７１２９３３０号、ＵＳ７１８３０７６号、ＵＳ７５２１０５６号、ＵＳ７５２７７８７号、ＵＳ７５３４８６６号、ＵＳ７６１２１８１号、ＵＳ２００２００４５８７Ａ１号、ＵＳ２００２０７６４０６Ａ１号、ＵＳ２００２１０３３４５Ａ１号、ＵＳ２００３２０７３４６Ａ１号、ＵＳ２００３２１１０７８Ａ１号、ＵＳ２００４２１９６４３Ａ１号、ＵＳ２００４２２０３８８Ａ１号、ＵＳ２００４２４２８４７Ａ１号、ＵＳ２００５００３４０３Ａ１号、ＵＳ２００５００４３５２Ａ１号、ＵＳ２００５０６９５５２Ａ１号、ＵＳ２００５０７９１７０Ａ１号、ＵＳ２００５１００５４３Ａ１号、ＵＳ２００５１３６０４９Ａ１号、ＵＳ２００５１３６０５１Ａ１号、ＵＳ２００５１６３７８２Ａ１号、ＵＳ２００５２６６４２５Ａ１号、ＵＳ２００６０８３７４７Ａ１号、ＵＳ２００６１２０９６０Ａ１号、ＵＳ２００６２０４４９３Ａ１号、ＵＳ２００６２６３３６７Ａ１号、ＵＳ２００７００４９０９Ａ１号、ＵＳ２００７０８７３８１Ａ１号、ＵＳ２００７１２８１５０Ａ１号、ＵＳ２００７１４１０４９Ａ１号、ＵＳ２００７１５４９０１Ａ１号、ＵＳ２００７２７４９８５Ａ１号、ＵＳ２００８０５０３７０Ａ１号、ＵＳ２００８０６９８２０Ａ１号、ＵＳ２００８１５２６４５Ａ１号、ＵＳ２００８１７１８５５Ａ１号、ＵＳ２００８２４１８８４Ａ１号、ＵＳ２００８２５４５１２Ａ１号、ＵＳ２００８２６０７３８Ａ１号、ＵＳ２００９１３０１０６Ａ１号、ＵＳ２００９１４８９０５Ａ１号、ＵＳ２００９１５５２７５Ａ１号、ＵＳ２００９１６２３５９Ａ１号、ＵＳ２００９１６２３６０Ａ１号、ＵＳ２００９１７５８５１Ａ１号、ＵＳ２００９１７５８６７Ａ１号、ＵＳ２００９２３２８１１Ａ１号、ＵＳ２００９２３４１０５Ａ１号、ＵＳ２００９２６３３９２Ａ１号、ＵＳ２００９２７４６４９Ａ１号、ＥＰ３４６０８７Ａ２号、ＷＯ０００６６０５Ａ２号、ＷＯ０２０７２６３５Ａ２号、ＷＯ０４０８１０５１Ａ１号、ＷＯ０６０２０２５８Ａ２号、ＷＯ２００７０４４８８７Ａ２号、ＷＯ２００７０９５３３８Ａ２号、ＷＯ２００７１３７７６０Ａ２号、ＷＯ２００８１１９３５３Ａ１号、ＷＯ２００９０２１７５４Ａ２号、ＷＯ２００９０６８６３０Ａ１号、ＷＯ９１０３４９３Ａ１号、ＷＯ９３２３５３７Ａ１号、ＷＯ９４０９１３１Ａ１号、ＷＯ９４１２６２５Ａ２号、ＷＯ９５０９９１７Ａ１号、ＷＯ９６３７６２１Ａ２号、ＷＯ９９６４４６０Ａ１号に見ることができる。上に引用した出願の内容は、引用によりその全体を本明細書に包含させる。
二特異性抗体分子の各抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)内で、ＶＨは、ＶＬの上流でも下流でもよい。ある態様において、上流抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)は、そのＶＬ(ＶＬ１)の上流のそのＶＨ(ＶＨ１)と共に配置され、下流抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)は、そのＶＬ(ＶＬ２)の上流のそのＶＨ(ＶＨ２)と共に配置され、その結果全体的二特異性抗体分子は、配置ＶＨ１−ＶＬ１−ＶＬ２−ＶＨ２を有する。他の態様において、上流抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)は、そのＶＨ(ＶＨ１)の上流のそのＶＬ(ＶＬ１)と共に配置され、下流抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)は、そのＶＨ(ＶＨ２)の上流のそのＶＬ(ＶＬ２)と共に配置され、その結果、全体的二特異性抗体分子は配置ＶＬ１−ＶＨ１−ＶＨ２−ＶＬ２を有する。場合により、リンカーは、２抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)の間、例えば、構築物がＶＨ１−ＶＬ１−ＶＬ２−ＶＨ２として配列されるならば、ＶＬ１とＶＬ２の間または構築物がＶＬ１−ＶＨ１−ＶＨ２−ＶＬ２として配置されるならばＶＨ１とＶＨ２の間に配置される。リンカーは、ここに記載するリンカー、例えば、(Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ)ｎリンカー(ここで、ｎは１、２、３、４、５または６、好ましくは４である)であってよい(配列番号２６)。一般に、２ｓｃＦｖ間のリンカーは、２ｓｃＦｖのドメイン間の誤対合を避けるのに十分長くなければならない。場合により、リンカーは、第一ｓｃＦｖのＶＬとＶＨの間に配置される。場合により、リンカーは、第二ｓｃＦｖのＶＬとＶＨの間に配置される。複数リンカーを有する構築物において、リンカーのいずれかの２以上は同一でも異なってもよい。よって、ある態様において、二特異性ＣＡＲは、ここに記載するような配置で、ＶＬ、ＶＨおよび場合により１以上のリンカーを含む。
ある面において、二特異性抗体分子は、第一免疫グロブリン可変ドメイン配列、例えば、ｓｃＦｖにより特徴付けられ、これは、ＣＤ３３に結合特異性を有し、例えば、ここに記載するような、例えば、表２または表９に記載するようなｓｃＦｖを含むかまたはここに記載するＣＤ３３ ｓｃＦｖからの軽鎖ＣＤＲおよび／または重鎖ＣＤＲおよび第二エピトープに対する結合特異性を有する第二免疫グロブリン可変ドメイン配列を異なる抗原に含む。ある面において、第二免疫グロブリン可変ドメイン配列は、ＡＭＬ細胞上に発現された抗原、例えば、ＣＤ３３以外の抗原に結合特異性を有する。例えば、第二免疫グロブリン可変ドメイン配列は、ＣＤ１２３に対する結合特異性を有する。他の例として、第二免疫グロブリン可変ドメイン配列は、ＣＬＬ−１に対する結合特異性を有する。他の例として、第二免疫グロブリン可変ドメイン配列は、ＣＤ３４に対する結合特異性を有する。他の例として、第二免疫グロブリン可変ドメイン配列は、ＦＬＴ３に対する結合特異性を有する。例えば、第二免疫グロブリン可変ドメイン配列は、葉酸受容体ベータに対する結合特異性を有する。ある面において、第二免疫グロブリン可変ドメイン配列は、Ｂ細胞に発現される抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＲＯＲ１に対する結合特異性を有する。
キメラＴＣＲ
ある面において、本発明のＣＤ３３抗体および抗体フラグメント(例えば、表２および９に開示のもの)を、ＣＤ３３に特異的に結合するキメラＴＣＲを作るために、Ｔ細胞受容体(“ＴＣＲ”)鎖の１以上の定常ドメイン、例えば、ＴＣＲアルファまたはＴＣＲベータ鎖に移植できる。理論に縛られないが、キメラＴＣＲは、抗原結合によりＴＣＲ複合体を経てシグナル伝達すると考えられる。例えば、ここに記載するようなＣＤ３３ ｓｃＦｖを、ＴＣＲ鎖、例えば、ＴＣＲアルファ鎖および／またはＴＣＲベータ鎖の定常ドメイン、例えば、少なくとも細胞外定常ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの部分に移植できる。他の例として、ＣＤ３３抗体フラグメント、例えばここに記載するようなＶＬドメインを、ＴＣＲアルファ鎖の定常ドメインに移植でき、ＣＤ３３抗体フラグメント、例えばここに記載するようなＶＨドメインを、ＴＣＲベータ鎖の定常ドメインに移植できる(または代替的に、ＶＬドメインを、ＴＣＲベータ鎖の定常ドメインに移植してよく、ＶＨドメインを、ＴＣＲアルファ鎖に移植してよい)。他の例として、ＣＤ３３抗体または抗体フラグメントのＣＤＲ、例えば、表３、４、１０、１１、１２または１３に記載のようなＣＤ３３抗体または抗体フラグメントのＣＤＲをＴＣＲアルファおよび／またはベータ鎖に移植して、ＣＤ３３に特異的に結合するキメラＴＣＲを作り得る。例えば、ここに記載するＬＣＤＲをＴＣＲアルファ鎖の可変ドメインに移植してよく、ここに記載するＨＣＤＲをＴＣＲベータ鎖の可変ドメインに移植してよくまたはその逆も可能である。このようなキメラＴＣＲは、当分野で知られる方法により産生し得る(例えば、Willemsen RA et al, Gene Therapy 2000; 7: 1369-1377; Zhang T et al, Cancer Gene Ther 2004; 11: 487-496; Aggen et al, Gene Ther. 2012 Apr;19(4):365-74)。
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、種々の態様において、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに結合する膜貫通ドメインを含むように設計できる。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接した１以上のさらなるアミノ酸、例えば、膜貫通が由来するタンパク質の細胞外領域と関係する１以上のアミノ酸(例えば、細胞外領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から最大１５アミノ酸)および／または膜貫通タンパク質が由来するタンパク質の細胞内領域と関係する１以上のアミノ酸(例えば、細胞内領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から最大１５アミノ酸)を含み得る。ある面において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの他のドメインと結合するものである。ある例において、膜貫通ドメインは、このようなドメインが、同一または異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインと結合するのを避けるように、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するように選択またはアミノ酸置換による修飾ができる。ある面において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞、表面上の他のＣＡＲとホモ二量体化できる。異なる面において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴに存在する天然結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小化するように修飾または置換され得る。
膜貫通ドメインは、天然由来でも組み換え源由来でもよい。源が天然であるとき、ドメインは、あらゆる膜結合または膜貫通タンパク質由来であり得る。ある面において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲが標的に結合したときは常に細胞内ドメインにシグナル伝達できる。本発明において特に有用な膜貫通ドメインは、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８(例えば、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ)、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の少なくとも膜貫通領域を含み得る。ある態様において、膜貫通ドメインは、例えば、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃbp、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃの少なくとも膜貫通領域を含み得る。
ある例において、膜貫通ドメインは、ヒンジ、例えば、ヒトタンパク質からのヒンジを介して、ＣＡＲの細胞外領域、例えば、ＣＡＲの抗原結合ドメインに結合できる。例えば、ある態様において、ヒンジは、ヒトＩｇ(免疫グロブリン)ヒンジ、例えば、ＩｇＧ４ヒンジまたはＣＤ８ａヒンジであり得る。ある態様において、ヒンジまたはスペーサーを含む(例えば、それからなる)配列番号２のアミノ酸配列。ある面において、膜貫通ドメインは、配列番号６の膜貫通ドメインを含む(例えば、それからなる)。
ある面において、ヒンジまたはスペーサーは、ＩｇＧ４ヒンジを含む。例えば、ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、アミノ酸配列ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM(配列番号３)のヒンジを含む。ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG(配列番号１４)のヌクレオチド配列によりコードされたヒンジを含む。
ある面において、ヒンジまたはスペーサーは、ＩｇＤヒンジを含む。例えば、ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、アミノ酸配列RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH(配列番号４)のヒンジを含む。ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACTGCACAGCCCCAGGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTACGCGCAATACTGGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGAAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCCCATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATCTCTTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAGGCCACCTTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCCGGAAAGGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAGCCAGCACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCTGTCACATGTACTCTAAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTGATGGCCCTTAGAGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAGCCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCCAACATCTTGCTCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACACCAGCGGCTTCGCTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTGGGCCTGGAGTGTCTTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCCCAGCCAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAAGATAGCAGGACCCTGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACCATT(配列番号１５)のヌクレオチド配列によりコードされたヒンジを含む。
ある面において、膜貫通ドメインは組み換えであってよく、その場合、ロイシンおよびバリンのような疎水性残基を優勢に含む。ある面において、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットを、組み換え膜貫通ドメインの各末端に見ることができる。
場合により、２〜１０アミノ酸長の短オリゴまたはポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質領域の間に結合を形成し得る。グリシン−セリンダブレットは特に適当なリンカーを提供する。例えば、ある面において、リンカーは、GGGGSGGGGSのアミノ酸配列を含む(配列番号５)。ある態様において、リンカーは、GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCCのヌクレオチド配列によりコードされる(配列番号１６)。
ある面において、ヒンジまたはスペーサーは、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジを含む。
細胞質ドメイン
本ＣＡＲの細胞質ドメインまたは領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが導入されている免疫細胞の正常エフェクター機能の少なくとも一つの活性化ができる。
本発明のＣＡＲにおいて使用する細胞内シグナル伝達ドメインの例は、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)および抗原受容体結合後にシグナル伝達を開始するために協調して働く共受容体の細胞質配列ならびにこれらのあらゆる誘導体またはバリアントおよび同じ機能的能力を有するあらゆる組み換え配列を含む。
ＴＣＲ単独により産生されたシグナルはＴ細胞の完全活性化には不十分であり、二次および／または共刺激性シグナルも必要であることが知られる。それゆえに、Ｔ細胞活性化は、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列が介在するということができる：ＴＣＲ(初代細胞内シグナル伝達ドメイン)を介して抗原依存性一次活性化を開始するものおよび二次または共刺激性シグナル(二次細胞質ドメイン、例えば、共刺激ドメイン)を提供するように抗原非依存的方法で作用するもの。
一次シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体の一次活性化を刺激性方向または阻害性方向のいずれかで制御する。刺激性方向で作用する初代細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。
本発明において特に有用であるＩＴＡＭ含有初代細胞内シグナル伝達ドメインの例は、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８(“ＩＣＯＳ”としても知られる)、ＦｃεＲＩ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２およびＣＤ６６ｄのものを含む。ある態様において、本発明のＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達ドメインを含む。
ある態様において、一次シグナル伝達ドメインは、天然ＩＴＡＭドメインと比較して改変された(例えば、増加または減少した)活性を有する、修飾ＩＴＡＭドメイン、例えば、変異ＩＴＡＭドメインを含む。ある態様において、一次シグナル伝達ドメイン修飾ＩＴＡＭ含有初代細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、最適化および／または切断されたＩＴＡＭ含有初代細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、一次シグナル伝達ドメインは、１、２、３、４またはそれ以上のＩＴＡＭモチーフを含む。
本発明で特に有用である初代細胞内シグナル伝達ドメインを含む分子のさらなる例は、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２およびＣＤ３２のものを含む。
ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインをそれ自体で含むことができまたは本発明のＣＡＲの状況において有用ないずれかの他の所望の細胞内シグナル伝達ドメインと組み合わせ得る。例えば、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータ鎖部分および共刺激性シグナル伝達ドメインを含み得る。共刺激性シグナル伝達ドメインは、共刺激性分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの部分をいう。共刺激性分子は、リンパ球の抗原に対する効率的応答に必要な、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。このような分子の例は、ＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ性活性化分子(ＳＬＡＭタンパク質)、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃbp、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどを含む。例えば、ＣＤ２７共刺激は、インビトロでヒトＣＡＲＴ細胞の拡張、エフェクター機能および生存を増強し、インビボでヒトＴ細胞残留性および抗腫瘍活性を増強することが示されている(Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706)。
本発明のＣＡＲの細胞質部分内の細胞内シグナル伝達配列は、互いに無作為にまたは特定の順序で連結し得る。場合により、例えば、２〜１０アミノ酸(例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸)長の短オリゴまたはポリペプチドリンカーは、細胞内シグナル伝達配列間に結合を形成し得る。ある態様において、グリシン−セリンダブレットを適当なリンカーとして使用できる。ある態様において、単一アミノ酸、例えば、アラニン、グリシンを適当なリンカーとして使用できる。
ある面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２以上、例えば、２、３、４、５またはそれ以上の共刺激性シグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある態様において、２以上、例えば、２、３、４、５または以上の共刺激性シグナル伝達ドメインは、リンカー分子、例えば、ここに記載するリンカー分子により分けられる。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２つの共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、リンカー分子はグリシン残基である。ある態様において、リンカー分子はアラニン残基である。
ある面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある面において、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号７のシグナル伝達ドメインである。ある面において、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号９(変異体ＣＤ３ゼータ)または配列番号１０(野生型ヒトＣＤ３ゼータ)のシグナル伝達ドメインである。
ある面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２７のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある面において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(配列番号８)のアミノ酸配列を含む。
ある面において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(配列番号１９)の核酸配列によりコードされる。
ある面において、細胞内は、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある面において、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインは、配列番号３７９のアミノ酸配列を含む。ある面において、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインは、配列番号３８０の核酸配列によりコードされる。
ある面において、細胞内は、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＩＣＯＳのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある面において、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインは、配列番号３８１のアミノ酸配列を含む。ある面において、ＩＣＯＳのシグナル伝達ドメインは、配列番号３８２の核酸配列によりコードされる。
ある面において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、さらに第二ＣＡＲ、例えば、同じ標的(ＣＤ３３)または異なる標的(例えば、ＣＤ１２３、ＣＬＬ−１、ＣＤ３４、ＦＬＴ３または葉酸受容体ベータ)に対する、例えば、第二ＣＡＲの異なる抗原結合ドメインを含み得る。ある態様において、第二ＣＡＲは、例えば、ＣＤ１２３、ＣＬＬ−１、ＣＤ３４、ＦＬＴ３または葉酸受容体ベータのような、急性骨髄性白血病細胞に発現される標的に対する抗原結合ドメインを含む。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞は、第一抗原を標的とし、共刺激性シグナル伝達ドメインを有するが、一次シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第一ＣＡＲおよび第二の、異なる、抗原を標的とし、一次シグナル伝達ドメインを有するが、共刺激性シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲを含む。理論に縛られることを望まないが、第一ＣＡＲへの共刺激性シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳまたはＯＸ−４０および一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータの第二ＣＡＲへの配置は、両標的が発現される細胞に対してＣＡＲ活性を制限する。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ３３結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激ドメインを含む第一ＣＤ３３ ＣＡＲおよびＣＤ３３以外の抗原(例えば、ＡＭＬ細胞に発現される抗原、例えば、ＣＤ１２３、ＣＬＬ−１、ＣＤ３４、ＦＬＴ３または葉酸受容体ベータ)を標的とし、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲを含む。他の態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ３３結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む第一ＣＤ３３ ＣＡＲおよびＣＤ３３以外の抗原(例えば、ＡＭＬ細胞に発現される抗原、例えば、ＣＤ１２３、ＣＬＬ−１、ＣＤ３４、ＦＬＴ３または葉酸受容体ベータ)を標的とし、抗原に対する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激性シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲを含む。
ある態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ここに記載するＣＤ３３ ＣＡＲおよび阻害性ＣＡＲを含む。ある態様において、阻害性ＣＡＲは、正常細胞、例えば、ＣＤ３３をまた発現する正常細胞に見られるが、癌細胞に見られない抗原に結抗原結合ドメイン合する抗原結合ドメインを含む。ある態様において、阻害性ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび阻害分子の細胞内ドメインを含む。例えば、阻害性ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータの細胞内ドメインであり得る。
ある態様において、ＣＡＲ発現細胞が２以上の異なるＣＡＲを含むとき、種々のＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインが互いに相互作用しないようなものである。例えば、第一および第二ＣＡＲを発現する細胞は、第二ＣＡＲの抗原結合ドメイン、例えば、ＶＨＨである第二ＣＡＲの抗原結合ドメインと結合を形成しない、例えば、フラグメント、例えば、ｓｃＦｖとしての第一ＣＡＲの抗原結合ドメインを有し得る。
ある態様において、抗原結合ドメインは、単一ドメイン抗原結合(ＳＤＡＢ)分子を含み、相補的決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である分子を含む。例は、重鎖可変ドメイン、軽鎖を天然に欠く結合分子、慣用の４鎖抗体由来の単一ドメイン、操作されたドメインおよび抗体由来のもの以外の単一ドメインスキャフォールドを含むが、これらに限定されない。ＳＤＡＢ分子は、当分野のまたは将来的な単一ドメイン分子であり得る。ＳＤＡＢ分子は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤツメウナギ、魚類、サメ、ヤギ、ウサギおよびウシを含むが、これらに限定されないいずれかの種由来であり得る。この用語はまたラクダ科およびサメ以外の種由来の天然に存在する単一ドメイン抗体分子も含む
ある面において、ＳＤＡＢ分子は、例えば、サメの血清に見られる新規抗原受容体(ＮＡＲ)として知られる免疫グロブリンアイソタイプ由来であるような、魚類で見られる免疫グロブリンの可変領域に由来し得る。ＮＡＲ(“ＩｇＮＡＲ”)の可変領域由来の単一ドメイン分子を製造する方法は、ＷＯ０３／０１４１６１号およびStreltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-2909に記載されている。
他の面によって、ＳＤＡＢ分子は、軽鎖を欠く重鎖として知られる天然に存在する単一ドメイン抗原結合分子である。このような単一ドメイン分子は、例えば、ＷＯ９４０４６７８号およびHamers-Casterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448に記載されている。明確化するために、天然に軽鎖を欠く重鎖分子由来のこの可変ドメインは、ここでは、４鎖免疫グロブリンの慣用のＶＨと区別するために、ＶＨＨまたはナノボディとして知られる。このようなＶＨＨ分子は、ラクダ科種、例えばラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびグアナコ由来であり得る。ラクダ科以外の他の種は天然に軽鎖を欠く重鎖分子を産生し得、このようなＶＨＨは本発明の範囲内である。
ＳＤＡＢ分子は、組み換え、ＣＤＲ移植、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化および／またはインビトロ産生され得る(例えば、ファージディスプレーにより選択)。
受容体の抗原結合ドメイン間を相互作用する抗原結合ドメインを含む複数のキメラ膜包埋受容体を有する細胞は、例えば、抗原結合ドメインの１以上がその同族抗原に結合することを阻止するため、望ましくない可能性があることも判明した。よって、ここに開示されるのは、このような相互作用を最小化する、抗原結合ドメインを含む第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体を有する細胞である。またここに開示されるのは、このような相互作用を最小化する抗原結合ドメインを含む第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体をコードする核酸ならびにこのような細胞および核酸を製造および使用する方法である。ある態様において、該第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体の抗原結合ドメインの一方はｓｃＦｖを含み、他方は単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科、サメもしくはヤツメウナギ単一ＶＨドメインまたはヒトもしくはマウス配列由来の単一ＶＨドメインを含む。
ある態様において、本発明は第一および第二ＣＡＲを含み、ここで、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、可変軽ドメインおよび可変重ドメインを含まない。ある態様において、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり、他方はｓｃＦｖではない。ある態様において、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科、サメもしくはヤツメウナギ単一ＶＨドメインまたはヒトもしくはマウス配列由来の単一ＶＨドメインを含む。ある態様において、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ナノボディを含む。ある態様において、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ラクダ科ＶＨＨドメインを含む。
ある態様において、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方は単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科、サメもしくはヤツメウナギ単一ＶＨドメインまたはヒトもしくはマウス配列由来の単一ＶＨドメインを含む。ある態様において、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方はナノボディを含む。ある態様において、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方はラクダ科ＶＨＨドメインを含む。
ある態様において、細胞の表面上に存在するとき、該第一ＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、該第二ＣＡＲの存在により実質的に低減されない。ある態様において、該第二ＣＡＲ存在下の該第一ＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、該第二ＣＡＲ非存在下の該第一ＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合の８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。
ある態様において、細胞の表面上に存在するとき、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの抗原結合ドメインは、両者がｓｃＦｖ抗原結合ドメインである場合より少なく互いに結合する。ある態様において、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの抗原結合ドメインは、両者がｓｃＦｖ抗原結合ドメインである場合より８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％少なく互いに結合する。
他の面において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、他の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤をさらに発現できる。例えば、ある態様において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であり得る。阻害分子、例えば、ＰＤ１は、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を減少させ得る。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータを含む。ある態様において、阻害分子を阻害する薬剤は、例えば、ここに記載する分子、例えば、細胞に正のシグナルを提供する第二ポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインに結合した、第一ポリペプチド、例えば、阻害分子を含む薬剤である。ある態様において、薬剤は、例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータまたはこれらのいずれかのフラグメント(例えば、これらのいずれかの少なくとも細胞外ドメインの部分)のような阻害分子の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインである第二ポリペプチド(例えば、共刺激ドメイン(例えば、ここに記載するような、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７、ＩＣＯＳまたはＣＤ２８)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)を含む。ある態様において、薬剤は、ＰＤ１またはそのフラグメント(例えば、ＰＤ１の少なくとも細胞外ドメインの部分)の第一ポリペプチドならびにここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／またはここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)の第二ポリペプチドを含む。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、例えば、引用によりその全体を本明細書に包含させるＷＯ２０１３／０１９６１５号に記載のような、スイッチ共刺激性受容体を含む。ＰＤ１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡも含む受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害性メンバーである。ＰＤ−１は、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄細胞に発現される(Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75)。ＰＤ１に対する２リガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、ＰＤ１への結合によりＴ細胞活性化を下方制御することが示されている(Freeman et al. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43)。ＰＤ−Ｌ１は、ヒト癌において豊富である(Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制は、ＰＤ１とＰＤ−Ｌ１の局所相互作用の阻害により逆転できる。
ある態様において、阻害分子、例えば、プログラム細胞死１(ＰＤ１)の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)を含む薬剤を、膜貫通ドメインおよび４１ＢＢおよびＣＤ３ゼータのような細胞内シグナル伝達ドメインに融合できる(ここでは、ＰＤ１ ＣＡＲと称する)。ある態様において、ＰＤ１ ＣＡＲは、ここに記載するＣＤ３３ ＣＡＲと組み合わせで使用したとき、ＣＡＲ発現細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の残留性を改善する。ある態様において、ＣＡＲは、配列番号２４において下線で示すＰＤ１の細胞外ドメインを含むＰＤ１ ＣＡＲである。ある態様において、ＰＤ１ ＣＡＲは、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。
Malpvtalllplalllhaarppgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr (配列番号24)
ある態様において、ＰＤ１ ＣＡＲは、下記アミノ酸配列を含む(配列番号２２)。
pgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr (配列番号22)
ある態様において、薬剤は、ＰＤ１ ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＰＤ１ ＣＡＲをコードする核酸配列を含む。ある態様において、ＰＤ１ ＣＡＲの核酸配列を下に示し、ＰＤ１ ＥＣＤを下記配列番号２３で下線を引く。
atggccctccctgtcactgccctgcttctccccctcgcactcctgctccacgccgctagaccacccggatggtttctggactctccggatcgcccgtggaatcccccaaccttctcaccggcactcttggttgtgactgagggcgataatgcgaccttcacgtgctcgttctccaacacctccgaatcattcgtgctgaactggtaccgcatgagcccgtcaaaccagaccgacaagctcgccgcgtttccggaagatcggtcgcaaccgggacaggattgtcggttccgcgtgactcaactgccgaatggcagagacttccacatgagcgtggtccgcgctaggcgaaacgactccgggacctacctgtgcggagccatctcgctggcgcctaaggcccaaatcaaagagagcttgagggccgaactgagagtgaccgagcgcagagctgaggtgccaactgcacatccatccccatcgcctcggcctgcggggcagtttcagaccctggtcacgaccactccggcgccgcgcccaccgactccggccccaactatcgcgagccagcccctgtcgctgaggccggaagcatgccgccctgccgccggaggtgctgtgcatacccggggattggacttcgcatgcgacatctacatttgggctcctctcgccggaacttgtggcgtgctccttctgtccctggtcatcaccctgtactgcaagcggggtcggaaaaagcttctgtacattttcaagcagcccttcatgaggcccgtgcaaaccacccaggaggaggacggttgctcctgccggttccccgaagaggaagaaggaggttgcgagctgcgcgtgaagttctcccggagcgccgacgcccccgcctataagcagggccagaaccagctgtacaacgaactgaacctgggacggcgggaagagtacgatgtgctggacaagcggcgcggccgggaccccgaaatgggcgggaagcctagaagaaagaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctactccgaaattgggatgaagggagagcggcggaggggaaaggggcacgacggcctgtaccaaggactgtccaccgccaccaaggacacatacgatgccctgcacatgcaggcccttccccctcgc (配列番号23)
他の面において、本発明は、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞の集団を提供する。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、種々のＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む。例えば、ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団(例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)は、ここに記載するＣＤ３３結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第一細胞および異なるＣＤ３３結合ドメイン、例えば、第一細胞により発現されるＣＡＲにおけるＣＤ３３結合ドメインと異なるここに記載するＣＤ３３結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第二細胞を含み得る。他の例として、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、ここに記載するような、ＣＤ３３結合ドメインを含むＣＡＲを発現する第一細胞およびＣＤ３３以外の標的(例えば、ＣＤ１２３、ＣＤ３４、ＣＬＬ−１、ＦＬＴ３または葉酸受容体ベータ)に対する抗原結合ドメインを含むＣＡＲを発現する第二細胞を含み得る。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、初代細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第一細胞および二次シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第二細胞、例えば、共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。
他の面において、本発明は細胞の集団を提供し、ここで、集団内の少なくとも１細胞は、ここに記載するＣＤ３３ドメインを有するＣＡＲを発現し、第二細胞は他の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を発現する。例えば、ある態様において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であり得る。阻害分子は、例えば、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を減少させ得る。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータを含む。ある態様において、阻害分子を阻害する薬剤は、例えば、ここに記載され、例えば、薬剤は、細胞に正のシグナルを提供する第二ポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインに結合した、第一ポリペプチド、例えば、阻害分子を含む。ある態様において、薬剤は、例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータまたはこれらのいずれかのフラグメント(例えば、これらのいずれかの少なくとも細胞外ドメインの部分)のような阻害分子の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインである第二ポリペプチド(例えば、共刺激ドメイン(例えば、ここに記載するような、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７、ＩＣＯＳまたはＣＤ２８)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む)を含む。ある態様において、薬剤は、ＰＤ１またはそのフラグメント(例えば、ＰＤ１の少なくとも細胞外ドメインの部分)の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインの第二ポリペプチド(例えば、ここに記載するＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／またはここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)を含む。
ある面において、本発明は、他の薬剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤のようなキナーゼ阻害剤と組み合わせて、ＣＡＲ発現細胞の集団(例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)、例えば、種々のＣＡＲを発現する細胞の混合物を投与することを含む、方法を提供する。他の面において、本発明は、集団内の少なくとも１細胞がここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現し、第二細胞が他の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を発現する細胞の集団を、他の薬剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤のようなキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与することを含む、方法を提供する。
ナチュラルキラー細胞受容体(ＮＫＲ)ＣＡＲ
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ分子はナチュラルキラー細胞受容体(ＮＫＲ)の１以上の成分を含み、それによりＮＫＲ−ＣＡＲを形成する。ＮＫＲ成分は、次のナチュラルキラー細胞受容体のいずれか由来の膜貫通ドメイン、ヒンジドメインまたは細胞質ドメインであり得る：キラー細胞免疫グロブリン様受容体(ＫＩＲ)、例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＤＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＬ１／Ｓ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＰ１およびＫＩＲ３ＤＰ１；天然細胞傷害性受容体(ＮＣＲ)、例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６；免疫細胞受容体のシグナル伝達リンパ球活性化分子(ＳＬＡＭ)ファミリー、例えば、ＣＤ４８、ＣＤ２２９、２Ｂ４、ＣＤ８４、ＮＴＢ−Ａ、ＣＲＡＣＣ、ＢＬＡＭＥおよびＣＤ２Ｆ−１０；Ｆｃ受容体(ＦｃＲ)、例えば、ＣＤ１６およびＣＤ６４；およびＬｙ４９受容体、例えば、ＬＹ４９Ａ、ＬＹ４９Ｃ。ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲ分子は、アダプター分子または細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＤＡＰ１２と相互作用し得る。ＮＫＲ要素を含むＣＡＲ分子の配置および配列の例は国際公開ＷＯ２０１４／１４５２５２号に記載され、その内容を引用により本明細書に包含させる。
キメラ抗原受容体を制御するための戦略
ＣＡＲ活性が制御され得る多くの方法がある。ある態様において、ＣＡＲ活性が制御できる制御可能ＣＡＲ(ＲＣＡＲ)は、ＣＡＲ治療の安全性および有効性を最適化するために望ましい。例えば、例えば、二量体化ドメインに融合した、カスパーゼを使用するアポトーシスの誘導(例えば、Di et al., N Engl. J. Med. 2011 Nov. 3; 365(18):1673-1683参照)を、本発明のＣＡＲ治療における安全スイッチとして使用できる。他の例において、ＣＡＲ発現細胞はまた誘導性カスパーゼ−９(ｉＣａｓｐａｓｅ−９)分子も発現でき、これは、二量体化因子薬物(例えば、ｒｉｍｉｄｕｃｉｄ(ＡＰ１９０３(Bellicum Pharmaceuticals)またはＡＰ２０１８７(Ariad)とも呼ばれる)の投与により、細胞のカスパーゼ−９活性化およびアポトーシスに至る。ｉＣａｓｐａｓｅ−９分子は、二量体化(ＣＩＤ)結合ドメインの化学誘導因子を含み、これは、ＣＩＤ存在下で二量体化に介在する。これは、ＣＡＲ発現細胞の誘導的および選択的枯渇に至る。ある場合、ｉＣａｓｐａｓｅ−９分子は、ＣＡＲコードベクターと別の核酸分子によりコードされる。ある場合、ｉＣａｓｐａｓｅ−９分子は、ＣＡＲコードベクターと同じ核酸分子によりコードされる。ｉＣａｓｐａｓｅ−９は、ＣＡＲ発現細胞の何らかの毒性を避けるための安全スイッチを提供できる。例えば、Song et al. Cancer Gene Ther. 2008; 15(10):667-75; Clinical Trial Id. No. NCT02107963; およびDi Stasi et al. N. Engl. J. Med. 2011; 365:1673-83参照。
本発明のＣＡＲ治療を制御するための代替的戦略は、例えば、抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)の誘発により、例えば、ＣＡＲ発現細胞を消失させることにより、ＣＡＲ活性の脱活性化または遮断する小分子または抗体の利用を含む。例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、細胞死、例えば、ＡＤＣＣまたは補体誘導性細胞死を誘発できる分子により認識される抗原も発現し得る。例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞はまた抗体または抗体フラグメントにより標的化され得る受容体も発現し得る。このような受容体の例は、ＥｐＣＡＭ、ＶＥＧＦＲ、インテグリン(例えば、インテグリンανβ３、α４、αΙ3／4β３、α４β７、α５β１、ανβ３、αν)、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバー(例えば、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２)、ＰＤＧＦ受容体、インターフェロン受容体、葉酸受容体、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＡＭ−１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ１、ＴＡＧ−７２、ＩＬ−６受容体、５Ｔ４、ＧＤ２、ＧＤ３、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ／ＬＦＡ−１、ＣＤ１５、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３／ｌｇＥ受容体、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７／ベイシジン、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５４／ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１９５／ＣＣＲ５、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ７およびＥＧＦＲおよびその切断バージョン(例えば、１以上の細胞外エピトープを保持するが、細胞質ドメイン内の１以上の領域を欠くバージョン)を含む。例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、シグナル伝達能力を欠くが、ＡＤＣＣを誘発できる分子、例えば、セツキシマブ(アービタックス(登録商標))により認識されるエピトープを保持する切断型上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)も発現し、その結果、セツキシマブの投与がＡＤＣＣおよび続くＣＡＲ発現細胞の枯渇を誘発する(例えば、ＷＯ２０１１／０５６８９４号およびJonnalagadda et al., Gene Ther. 2013; 20(8)853-860参照)。他の戦略は、例えば、ＡＤＣＣによりＣＡＲ発現細胞の選択的枯渇をもたらす、リツキシマブに結合する、ここに記載するＣＡＲ発現細胞におけるＣＤ３２およびＣＤ２０抗原両者からの標的エピトープをあわせる、高度に小型のマーカー／自殺遺伝子の発現を含む(例えば、Philip et al., Blood. 2014; 124(8)1277-1287参照)。ここに記載するＣＡＲ発現細胞を枯渇させる他の方法は、例えば、ＡＤＣＣ誘発により、破壊するために、成熟リンパ球、例えば、ＣＡＲ発現細胞に選択的に結合し、標的とするモノクローナル抗ＣＤ５２抗体であるキャンパス(登録商標)の投与を含む。他の態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＡＲリガンド、例えば、抗イディオタイプ抗体を使用して選択的に標的化され得る。ある態様において、抗イディオタイプ抗体は、エフェクター細胞活性、例えば、ＡＤＣＣまたはＡＤＣ活性を引き起こし、それによりＣＡＲ発現細胞数を減らすことができる。他の態様において、ＣＡＲリガンド、例えば、抗イディオタイプ抗体は、細胞致死を誘発する薬剤、例えば、トキシンに結合させ、それによりＣＡＲ発現細胞数を減らすことができる。あるいは、ＣＡＲ分子自体、下記のように、活性が制御され得る、例えば、活性化または遮断され得るように配置できる。
ある態様において、ＲＣＡＲは、ここに記載する標準的ＣＡＲの要素、例えば、抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインが、別々のポリペプチドまたはメンバーに配置された、一連の、一般に最も単純な態様において２つの、ポリペプチドを含む。ある態様において、一連のポリペプチドは、二量体化分子存在下、互いにポリペプチドを結合できる、例えば、抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに結合できる、二量体化スイッチを含む。このような制御可能ＣＡＲのさらなる記載および例示定期配置は、ここにおよび、引用により本明細書にその全体を包含させる国際公開ＷＯ２０１５／０９０２２９号に提供される。
ある態様において、ＲＣＡＲは、２ポリペプチドまたはメンバーを含む：１)例えば、ここに記載する初代細胞内シグナル伝達ドメインおよび第一スイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン２)例えば、ここに記載のような腫瘍抗原を標的とする抗原結合ドメインおよび第二スイッチドメインを含む抗原結合メンバー。場合により、ＲＣＡＲは、ここに記載する膜貫通ドメインを含む。ある態様において、膜貫通ドメインは、細胞内シグナル伝達メンバー上、抗原結合メンバー上または両者の上に配置できる。(特に断らない限り、ＲＣＡＲのメンバーまたは要素がここに記載されるものであるとき、順序は記載したとおりであり得るが、他の順序も同様に含まれる。換言すると、ある態様において、順序は本書に記載のとおりであるが、他の態様において、順序は異なり得る。例えば、膜貫通領域の一端の要素の順序は例と異なってよく、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインに対するスイッチドメインの配置は異なって、例えば逆でよい)。
ある態様において、第一および第二スイッチドメインは、細胞内または細胞外二量体化スイッチを形成できる。ある態様において、二量体化スイッチは、例えば、第一および第二スイッチドメインが同一であるホモ二量体化スイッチでも、例えば、第一および第二スイッチドメインが互いに異なるヘテロ二量体化スイッチでもよい。
ある態様において、ＲＣＡＲは、“多スイッチ”を含み得る。多スイッチは、ヘテロ二量体化スイッチドメインまたはホモ二量体化スイッチドメインを含み得る。多スイッチは、複数の、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のスイッチドメインを、独立して、第一メンバー、例えば、抗原結合メンバーおよび第二メンバー、例えば、細胞内シグナル伝達メンバー上に含む。ある態様において、第一メンバーは複数の第一スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインを含んでよく、第二メンバーは複数の第二スイッチドメイン、例えば、ＦＲＢベースのスイッチドメインを含んでよい。ある態様において、第一メンバーは第一および第二スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよびＦＲＢベースのスイッチドメインを含んでよく、第二メンバーは第一および第二スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよびＦＲＢベースのスイッチドメインを含んでよい。
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、１以上の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、初代細胞内シグナル伝達ドメインおよび１以上の共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。
ある態様において、抗原結合メンバーは、１以上の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、１以上の共刺激性シグナル伝達ドメインを含み得る。ある態様において、抗原結合メンバーは、複数の、例えば、２または３の、例えば、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳおよびＯＸ４０から選択される、ここに記載する共刺激性シグナル伝達ドメインを含み、ある態様において、初代細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。ある態様において、抗原結合メンバーは、細胞外から細胞内方向で、次の共刺激性シグナル伝達ドメインを含む：４−１ＢＢ−ＣＤ２７；４１ＢＢ−ＣＤ２７；ＣＤ２７−４−１ＢＢ；４−１ＢＢ−ＣＤ２８；ＣＤ２８−４−１ＢＢ；ＯＸ４０−ＣＤ２８；ＣＤ２８−ＯＸ４０；ＣＤ２８−４−１ＢＢ；または４−１ＢＢ−ＣＤ２８。このような態様において、細胞内結合メンバーはＣＤ３ゼータドメインを含む。このような態様において、ＲＣＡＲは、(１)抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび２共刺激ドメインおよび第一スイッチドメインを含む抗原結合メンバー；および(２)膜貫通ドメインまたは膜繋留ドメインおよび少なくとも一つの初代細胞内シグナル伝達ドメインおよび第二スイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
ある態様は、抗原結合メンバーがＣＡＲ細胞表面に繋留されていないＲＣＡＲを提供する。これは、細胞内シグナル伝達メンバーを有する細胞が、細胞を抗原結合メンバーをコードする配列で形質転換する必要なく、１以上の抗原結合ドメインと好都合に対合することを可能とする。このような態様において、ＲＣＡＲは１)第一スイッチドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、初代細胞内シグナル伝達ドメインおよび第一スイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー；および２)抗原結合ドメインおよび第二スイッチドメインを含む抗原結合メンバーを含み、ここで、抗原結合メンバーは膜貫通ドメインまたは膜繋留ドメインを含まず、場合により細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。ある態様において、ＲＣＡＲは、３)第二抗原結合ドメイン、例えば、抗原結合ドメインにより結合されるのと異なる抗原に結合する第二抗原結合ドメイン；および第二スイッチドメインを含む第二抗原結合メンバーをさらに含み得る。
またここで提供されるのは、抗原結合メンバーが二特異性活性化およびターゲティング能を含む、ＲＣＡＲである。この態様において、抗原結合メンバーは、複数の、例えば、２、３、４または５抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖを含んでよく、ここで、各原結合ドメインは、標的抗原、例えば異なる抗原または同じ抗原、例えば、同じ抗原の同一または異なるエピトープに結合する。ある態様において、複数の抗原結合ドメインはタンデムであり、場合により、リンカーまたはヒンジ領域が抗原結合ドメインの各々の間に配置される。適当なリンカーおよびヒンジ領域は、ここに記載される。
ある態様は、増殖のスイッチングが可能な配置を有するＲＣＡＲを提供する。この態様において、ＲＣＡＲは１)場合により、膜貫通ドメインまたは膜繋留ドメイン；例えば、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳおよびＯＸ４０およびスイッチドメインから選択される１以上の共刺激性シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー；および２)抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび初代細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメインを含む抗原結合メンバーを含み、ここで、抗原結合メンバーはスイッチドメインを含まないまたは細胞内シグナル伝達メンバー上のスイッチドメインと二量体化するスイッチドメインを含まない。ある態様において、抗原結合メンバーｄは、共刺激性シグナル伝達ドメインを含まない。ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、ホモ二量体化スイッチからのスイッチドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、ヘテロ二量体化スイッチの第一スイッチドメインを含み、ＲＣＡＲは、ヘテロ二量体化スイッチの第二スイッチドメインを含む第二細胞内シグナル伝達メンバーを含む。このような態様において、第二細胞内シグナル伝達メンバーは、細胞内シグナル伝達メンバーと同じ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、二量体化スイッチは細胞内である。ある態様において、二量体化スイッチは細胞外である。
ここに記載するＲＣＡＲ配置のいずれかにおいて、第一および第二スイッチドメインは、ここに記載するようなＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチを含む
またここで提供されるのは、ここに記載するＲＣＡＲを含む細胞である。ＲＣＡＲを発現するように操作したあらゆる細胞を、ＲＣＡＲＸ細胞として使用できる。ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞はＴ細胞であり、ＲＣＡＲＴ細胞と称する。ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞はＮＫ細胞であり、ＲＣＡＲＮ細胞と称する。
またここで提供されるのは、ＲＣＡＲコード化配列を含む核酸およびベクターである。ＲＣＡＲの種々の要素をコードする配列は、同じ核酸分子、例えば、同じプラスミドまたはベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターに配置できる。ある態様において、(ｉ)抗原結合メンバーをコードする配列および(ii)細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列は、同じ核酸、例えば、ベクターに存在できる。対応するタンパク質の産生は、例えば、別々のプロモーターの使用によりまたはバイシストロニック転写産物(これは、単一翻訳産物の開裂または２つの別々のタンパク質産物の翻訳により２タンパク質の産生を生じ得る)の使用により、達成できる。ある態様において、開裂可能ペプチドをコードする配列、例えば、Ｐ２ＡまたはＦ２Ａ配列を、(ｉ)と(ii)の間に配置する。ある態様において、ＩＲＥＳ、例えば、ＥＭＣＶまたはＥＶ７１ ＩＲＥＳをコードする配列を、(ｉ)と(ii)の間に配置する。これらの態様において、(ｉ)および(ii)は、単一ＲＮＡとして転写される。ある態様において、は、(ｉ)および(ii)が別々のｍＲＮＡとして転写されるように、第一プロモーターは(ｉ)に操作可能に連結し、第二プロモーターは(ii)に操作可能に連結する。
あるいは、ＲＣＡＲの種々の要素をコードする配列を、種々の核酸分子、例えば、異なるプラスミドまたはベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターに配置できる。例えば、(ｉ)抗原結合メンバーをコードする配列を第一核酸、例えば、第一ベクターに配置でき、(ii)細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列は、第二核酸、例えば、第二ベクターに存在できる。
二量体化スイッチ
二量体化スイッチは非共有でも共有でもよい。非共有二量体化スイッチにおいて、二量体化分子は、スイッチドメイン間の非共有相互作用を促進する。共有二量体化スイッチにおいて、二量体化分子は、スイッチドメイン間の共有相互作用を促進する。
ある態様において、ＲＣＡＲは、ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰまたはＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチを含む。ＦＫＢＰ１２(ＦＫＢＰまたはＦＫ５０６結合タンパク質)は、天然産物免疫抑制剤、ラパマイシンのための最初の細胞内標的として働く、豊富な細胞質タンパク質である。ラパマイシンは、ＦＫＢＰおよび大ＰＩ３ＫホモログＦＲＡＰ(ＲＡＦＴ、ｍＴＯＲ)に結合する。ＦＲＢは、ＦＫＢＰ−ラパマイシン複合体の結合のために十分であるＦＲＡＰの９３アミノ酸部分である(Chen, J., Zheng, X. F., Brown, E. J. & Schreiber, S. L. (1995) Identification of an 11-kDa FKBP12-rapamycin-binding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associated protein and characterization of a critical serine residue. Proc Natl Acad Sci U S A 92: 4947-51.)
ある態様において、ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰ、例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースのスイッチは、二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパマイシンアナログを使用できる。
ＦＫＢＰのアミノ酸配列は次のとおりである。
D V P D Y A S L G G P S S P K K K R K V S R G V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S Y (配列番号148)
ある態様において、ＦＫＢＰスイッチドメインは、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、配列番号１４８の下線部分の存在下、ＦＲＢまたはそのフラグメントまたはアナログと結合する能力を有するＦＫＢＰのフラグメントを含み、これは次のとおりである。
V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S (配列番号149)
ＦＲＢのアミノ酸配列は次のとおりである。
ILWHEMWHEG LEEASRLYFG ERNVKGMFEV LEPLHAMMER GPQTLKETSF NQAYGRDLME AQEWCRKYMK SGNVKDLTQA WDLYYHVFRR ISK (配列番号150)
ここで使用する用語“ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰ、例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースのスイッチ”は、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１の存在下、ＦＲＢまたはそのフラグメントまたはアナログと結合する能力を有するＦＫＢＰフラグメントまたはそのアナログを含み、配列番号１４８または１４９のＦＫＢＰ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するかまたは３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基を超えて異ならない第一スイッチドメイン；およびラパマイシンまたはラパログの存在下に、ＦＲＢまたはそのフラグメントまたはアナログと結合する能力を有するＦＲＢフラグメントまたはそのアナログを含み、配列番号１５０のＦＲＢ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するかまたは３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基を超えて異ならない第二スイッチドメインを含む、二量体化スイッチをいう。ある態様において、ここに記載するＲＣＡＲは、配列番号１４８(または配列番号１４９)に開示するアミノ酸残基を含む１スイッチドメインおよび配列番号１５０に開示するアミノ酸残基を含む１スイッチドメインを含む。
ある態様において、ＦＫＢＰ／ＦＲＢ二量体化スイッチは、ＦＲＢベースのスイッチドメイン、例えば、修飾ＦＲＢスイッチドメイン、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよび二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１の間の複合体形成が変えられた、例えば、増強された、修飾ＦＲＢスイッチドメインを含む。ある態様において、修飾ＦＲＢスイッチドメインは、アミノ酸位置Ｌ２０３１、Ｅ２０３２、Ｓ２０３５、Ｒ２０３６、Ｆ２０３９、Ｇ２０４０、Ｔ２０９８、Ｗ２１０１、Ｄ２１０２、Ｙ２１０５およびＦ２１０８から選択される、１以上の、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の変異を含み、ここで、野生型アミノ酸は、いずれかの他の天然に存在するアミノ酸への変異されている。ある態様において、変異体ＦＲＢはＥ２０３２に変異を含み、ここで、Ｅ２０３２は、フェニルアラニン(Ｅ２０３２Ｆ)、メチオニン(Ｅ２０３２Ｍ)、アルギニン(Ｅ２０３２Ｒ)、バリン(Ｅ２０３２Ｖ)、チロシン(Ｅ２０３２Ｙ)、イソロイシン(Ｅ２０３２Ｉ)、例えば、配列番号１５１またはロイシン(Ｅ２０３２Ｌ)、例えば、配列番号１５２に変異されている。ある態様において、変異体ＦＲＢはＴ２０９８に変異を含み、ここで、Ｔ２０９８は、フェニルアラニン(Ｔ２０９８Ｆ)またはロイシン(Ｔ２０９８Ｌ)、例えば、配列番号１５３に変異されている。ある態様において、変異体ＦＲＢはＥ２０３２およびＴ２０９８に変異を含み、ここで、Ｅ２０３２はいずれかのアミノ酸に変異され、Ｔ２０９８はいずれかのアミノ酸に変異され、例えば、配列番号１５４である。ある態様において、変異体ＦＲＢはＥ２０３２ＩおよびＴ２０９８Ｌ変異を含み、例えば、配列番号１５５である。ある態様において、変異体ＦＲＢはＥ２０３２ＬおよびＴ２０９８Ｌ変異を含み、例えば、配列番号１５６である。
他の適当な二量体化スイッチは、ＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースの二量体化スイッチ、ジベレリンベースの二量体化スイッチ、タグ／バインダー二量体化スイッチおよびハロタグ／ｓｎａｐタグ二量体化スイッチを含む。ここに提供する手引きに従い、このようなスイッチおよび関連する二量体化分子は、当業者に明らかである。
二量体化分子
スイッチドメイン間の結合は、二量体化分子により促進される。二量体化分子存在下、スイッチドメイン間の相互作用または結合は、第一スイッチドメインに結合、例えば融合したポリペプチドと、第二スイッチドメインに結合、例えば融合したポリペプチドの間のシグナル伝達を可能にする。非律速レベルの二量体化分子存在下、ここに記載するシステムにおいて測定して、シグナル伝達は１.１倍、１.２倍、１.３倍、１.４倍、１.５倍、１.６倍、１.７倍、１.８倍、１.９倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍増加する。
ラパマイシンおよびラパマイシンアナログ(ラパログと呼ぶこともある)、例えば、ＲＡＤ００１は、ここに記載するＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチにおける二量体化分子として使用できる。ある態様において、二量体化分子は、ラパマイシン(シロリムス)、ＲＡＤ００１(エベロリムス)、ゾタロリムス、テムシロリムス、ＡＰ−２３５７３(リダフォロリムス)、バイオリムスおよびＡＰ２１９６７から選択できる。ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチで使用するのに適するさらなるラパマイシンアナログは、“組み合わせ治療”なる表題の部分または“低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤との組み合わせ”なる表題の小部分にさらに記載する。
スプリットＣＡＲ
ある態様において、ＣＡＲ発現細胞は、スプリットＣＡＲを使用する。スプリットＣＡＲアプローチは、引用により本明細書に包含させる公報ＷＯ２０１４／０５５４４２号およびＷＯ２０１４／０５５６５７号により詳細に記載されている。簡潔には、スプリットＣＡＲ系は、第一抗原結合ドメインおよび共刺激ドメイン(例えば、４１ＢＢ)を有する第一ＣＡＲを発現する細胞を含み、細胞はまた第二抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ＣＤ３ゼータ)を有する第二ＣＡＲも発現する。細胞が第一抗原に遭遇したとき、共刺激ドメインが活性化され、細胞が増殖する。細胞が第二抗原に遭遇したとき、細胞内シグナル伝達ドメインが活性化され、殺細胞活性が開始される。それゆえに、ＣＡＲ発現細胞は、両抗原存在下でのみ完全活性化される。ある態様において、第一抗原結合ドメインはＣＤ３３を認識し、例えば、ここに記載する抗原結合ドメインを含み、第二抗原結合ドメインは、急性骨髄性白血病細胞に発現される抗原、例えば、ＣＤ１２３、ＣＬＬ−１、ＣＤ３４、ＦＬＴ３または葉酸受容体ベータを認識する。ある態様において、第一抗原結合ドメインはＣＤ３３を認識し、例えば、ここに記載する抗原結合ドメインを含み、第二抗原結合ドメインはＢ細胞に発現される抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＲＯＲ１を認識する。
安定性および変異
ＣＤ３３結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖ分子(例えば、可溶性ｓｃＦｖ)の安定性を、慣用の対照ｓｃＦｖ分子または完全長抗体の生物物理学的特性(例えば、熱安定性)を参照して評価できる。ある態様において、ヒトｓｃＦｖは、記載するアッセイにおいて、対照結合分子(例えば慣用のｓｃＦｖ分子)より、約０.１℃、約０.２５℃、約０.５℃、約０.７５℃、約１℃、約１.２５℃、約１.５℃、約１.７５℃、約２℃、約２.５℃、約３℃、約３.５℃、約４℃、約４.５℃、約５℃、約５.５℃、約６℃、約６.５℃、約７℃、約７.５℃、約８℃、約８.５℃、約９℃、約９.５℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃または約１５℃高い熱安定性を有する。
ＣＤ３３結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖの熱安定性の改善は、続いて、ＣＡＲ３３構築物全体に貢献し、ＣＡＲ３３構築物の治療的特性改善に至る。ＣＤ３３結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖの熱安定性は、慣用の抗体と比較して少なくとも約２℃または３℃改善され得る。ある態様において、ＣＤ３３結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、慣用の抗体に対して１℃改善された熱安定性を有する。他の態様において、ＣＤ３３結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、慣用の抗体に対して２℃改善された熱安定性を有する。他の態様において、ｓｃＦｖは、慣用の抗体に対して４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃改善された熱安定性を有する。比較は、例えば、ここに記載するｓｃＦｖ分子と完全長抗体の間でなし得る。熱安定性を、当分野で知られる方法を使用して測定できる。例えば、ある態様において、Ｔｍを測定できる。Ｔｍを測定する方法およびタンパク質安定性を決定する他の方法は、下にさらに詳細に記載する。
ｓｃＦｖの変異は、ｓｃＦｖの安定性を変え、ｓｃＦｖおよびＣＡＲ３３構築物の全体的安定性を改善する。ヒト化またはヒトｓｃＦｖの安定性を、Ｔｍ、変性温度および凝集温度の測定により決定できる。
変異体ｓｃＦｖの結合能を、実施例に記載するアッセイを使用して決定できる。
ある態様において、ＣＤ３３結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、変異ｓｃＦｖがＣＡＲ３３構築物の安定性改善に貢献するように、少なくとも一つの変異を含む。他の態様において、ＣＤ３３結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、変異ｓｃＦｖが、ＣＡＲ３３構築物のの安定性改善に貢献するように、ヒト化過程に起因する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０変異を含む。
タンパク質安定性を評価する方法
抗原結合ドメインの安定性は、例えば、下記の方法を使用して、評価し得る。このような方法は、最小安定ドメインが最初に変性するまたは協調的に変性する多ドメイン単位(例えば、単一変性遷移を示す多ドメインタンパク質)の全体的安定性閾値を制限する、複数熱的変性遷移の決定を可能にする。最小安定ドメインを、多数のさらなる方法で同定できる。変異誘発を、どのドメインが全体的安定性を制限するか探索するために実施できる。さらに、多ドメインタンパク質のプロテアーゼ抵抗性を、最小安定ドメインが本質的に変性することが知られる条件下、ＤＳＣまたは他のスペクトル方法により実施できる(Fontana, et al., (1997) Fold. Des., 2: R17-26; Dimasi et al. (2009) J. Mol. Biol. 393: 672-692)。最小安定ドメインが同定されたら、このドメインをコードする配列(またはその部分)を、本方法における試験配列として用い得る。
ａ)熱安定性
組成物の熱安定性を、当分野で知られる、多数の非限定的生物物理学的または生化学的技術を使用して分析し得る。ある態様において、熱安定性を、分析的スペクトロスコピーにより評価する。
分析的スペクトロスコピー法の例は示差走査熱量測定(ＤＳＣ)である。ＤＳＣは、大部分のタンパク質またはタンパク質ドメインの変性に付随する熱熱吸収性に感受性である熱量計を用いる(例えばSanchez-Ruiz, et al., Biochemistry, 27: 1648-52, 1988参照)。タンパク質の熱安定性を決定するために、タンパク質サンプルを熱量計に入れ、ＦａｂまたはｓｃＦｖが変性するまで温度を上げる。タンパク質が変性する温度が、全体的タンパク質安定性の指標である。
分析的スペクトロスコピー法の他の例は、円二色性(ＣＤ)スペクトロスコピーである。ＣＤスペクトロメトリーは、組成物の光学活性を温度上昇の関数として測定する。円二色性(ＣＤ)スペクトロスコピーは、構造的不斉に起因する左手側偏光対右手側偏光の吸収の差異を測定する。障害されたまたは変性した構造は、規則正しいまたは折りたたまれた構造と極めて異なるＣＤスペクトルをもたらす。ＣＤスペクトルは、温度上昇の変性効果に対するタンパク質の感受性を反映し、それゆえに、タンパク質熱安定性の指標である(van Mierlo and Steemsma, J. Biotechnol., 79(3):281-98, 2000参照)。
熱安定性を測定するための分析的スペクトロスコピー法の他の例は、蛍光発光スペクトロスコピーである(van Mierlo and Steemsma, supra参照)。熱安定性を測定するための分析的スペクトロスコピー法のさらに他の例は、核磁気共鳴(ＮＭＲ)スペクトロスコピーである(例えば、van Mierlo and Steemsma, supra参照)。
組成物の熱安定性は、生化学的に測定できる。熱安定性を評価するための生化学的方法の例は、熱負荷アッセイである。“熱負荷アッセイ”において、組成物を、設定した一定期間、一定範囲の高温に付す。例えば、ある態様において、試験ｓｃＦｖ分子またはｓｃＦｖ分子を含む分子を、例えば、１〜１.５時間、一定範囲の温度上昇に付す。その後、タンパク質の活性を、関連する生化学的アッセイによりアッセイする。例えば、タンパク質が結合タンパク質(例えばｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ含有ポリペプチド)であるならば、結合タンパク質の結合活性を、機能的または定量的ＥＬＩＳＡにより決定できる。
このようなアッセイはハイスループット形式で実施でき、大腸菌およびハイスループットスクリーニングを使用する実施例に記載のものである。ＣＤ３３結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖバリアントのライブラリーを、当分野で知られる方法を使用して作り得る。ＣＤ３３結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖ発現を誘発し、ＣＤ３３結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖを熱負荷に付し得る。負荷試験サンプルを結合についてアッセイでき、安定であるＣＤ３３結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖをスケールアップし、さらに特徴付けしてよい。
熱安定性を、上記技術のいずれかを使用して、組成物の融解温度(Ｔｍ)を測定することにより評価する(例えば分析的スペクトロスコピー技術)。融解温度は、組成物の分子の５０％が折りたたまれた状態である、温度遷移曲線の中点の温度である(例えば、Dimasi et al. (2009) J. Mol Biol. 393: 672-692参照)。ある態様において、ＣＤ３３結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖのＴｍ値は、約４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、１００℃である。ある態様において、ＩｇＧのＴｍ値は、約４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、１００℃である。ある態様において、多価抗体のＴｍ値は、約４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、１００℃である。
熱安定性はまた、分析的熱量測定技術(例えばＤＳＣ)を使用して組成物の比熱または熱容量(Ｃｐ)を測定することによっても評価する。組成物の比熱は、１molの水の温度を１℃上げるのに必要なエネルギー(例えばkcal／molで)である。大きなＣｐは、変性または不活性タンパク質組成物の特徴である。組成物の熱容量(ΔＣｐ)の変化を、温度遷移前後の組成物の比熱の決定により測定する。熱安定性は、変性のギブズ自由エネルギー(ΔＧ)、変性のエンタルピー(ΔＨ)または変性のエントロピー(ΔＳ)を含む、熱力学的安定性の他のパラメータの測定または決定によっても評価し得る。上記生化学的アッセイ(例えば熱負荷アッセイ)の１以上を使用して、組成物の５０％がその活性(例えば結合活性)を保持する温度(すなわちＴＣ値)を決定する。
加えて、ＣＤ３３結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖへの変異は、非変異のＣＤ３３結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖと比較して、ＣＤ３３結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖの熱安定性を変え得る。ヒト化またはヒトＣＤ３３結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖをＣＡＲ３３構築物に取り込んだとき、ＣＤ３３結合ドメイン、例えば、ヒト化またはヒトｓｃＦｖは、全体的ＣＤ３３ ＣＡＲ構築物に対する熱安定性を与える。ある態様において、ＣＤ３３結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、ＣＤ３３結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖに熱安定性を与える単一変異を含む。他の態様において、ＣＤ３３結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、ＣＤ３３結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖに熱安定性を与える複数変異を含む。ある態様において、ＣＤ３３結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖにおける複数変異は、ＣＤ３３結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖの熱安定性に相加効果を有する。
ｂ)凝集％
組成物の安定性は、その凝集傾向の測定により決定できる。凝集は、多くの非限定的生化学的または生物物理学的技術により測定できる。例えば、組成物の凝集は、クロマトグラフィー、例えばサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)を使用して評価し得る。ＳＥＣは、サイズに基づき分子を分ける。カラムを、イオンおよび小分子を内側に入れるが、大きいものは入れないポリマーゲルの半固体ビーズで満たす。タンパク質組成物をカラムの上部に適用したとき、小型の折りたたまれたタンパク質(すなわち非凝集タンパク質)は、大タンパク質凝集が利用可能であるより大量の溶媒に分散される。その結果、大きな凝集体はカラムをより速く移動し、この方法で混合物をその要素に分離または分画できる。各フラクションは、ゲルから溶出するに連れて別々に定量できる(例えば、光散乱による)。よって、組成物の凝集％を、フラクションの濃度と、ゲルに適用したタンパク質の総濃度の比較により決定できる。安定組成物は、本質的に単一フラクションとしてカラムから溶出し、溶出プロファイルまたはクロマトグラムにおいて本質的に単一ピークとして見える。
ｃ)結合親和性
組成物の安定性を、その標的結合親和性の決定により評価できる。決定結合親和性のための広範な方法が当分野で知られる。結合親和性を決定するための方法の例は、表面プラズモン共鳴を用いる。表面プラズモン共鳴は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステム(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.)を使用する、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変更の検出により実時間生体分子特異的相互作用の分析を可能にする、光学的現象である。さらなる記載については、U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., i (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; およびJohnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277を参照のこと。
ある面において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ここに記載する抗原結合ドメインアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を含み、抗原結合ドメインは、ここに記載するＣＤ３３抗体フラグメントの所望の機能的特性を保持する。ある特定の面において、本発明のＣＡＲ組成物は、抗体フラグメントを含む。さらなる面において、その抗体フラグメントｓｃＦｖを含む。
種々の面において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、一方または両方の可変領域(例えば、ＶＨおよび／またはＶＬ)内、例えば１以上のＣＤＲ領域内および／または１以上のフレームワーク領域の、１以上のアミノ酸の修飾により操作される。ある特定の面において、本発明のＣＡＲ組成物は、抗体フラグメントを含む。さらなる面において、その抗体フラグメントｓｃＦｖを含む。
本発明の抗体または抗体フラグメントが、アミノ酸配列が(例えば、野生型から)違うようにさらに修飾されてよいが、所望の活性は修飾されないことは、当業者には理解される。例えば、“非必須”アミノ酸残基でのアミノ酸置換を生じるさらなるヌクレオチド置換を、タンパク質に行ってよい。例えば、分子における非必須アミノ酸残基を同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換えてよい。他の態様において、一連のアミノ酸を、側鎖ファミリーメンバーの順序および／または組成が異なる構造的に類似する一連のもので置き換えることができ、例えば、アミノ酸残基が類似側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられた保存的置換をなし得る。
塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非電荷極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む、類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野で定義されている。
２以上の核酸またはポリペプチド配列の状況における同一性パーセントは、同じである、２以上の配列をいう。２配列は、次の配列比較アルゴリズムの一つを使用してまたは手動アラインメントおよび目視により、比較窓または指定領域にわたり、最大対応を比較およびアラインしたとき、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドを特定パーセント有するならば、“実質的に同一”である(特定領域または、特定されていないとき、配列全体にわたり、例えば、６０％同一性、場合により７０％、７１％。７２％。７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性)。場合により、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド(または１０アミノ酸)長の領域またはより好ましくは１００〜５００または１０００またはそれ以上のヌクレオチド(または２０、５０、２００またはそれ以上のアミノ酸)長の領域にわたり、同一性が存在する。
配列比較のために、一般に１配列が対照配列として働き、それに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験および対照配列をコンピューターに入力し、必要であれば、部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを使用できまたは代替パラメータを指定できる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づき、対照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。比較のために配列をアラインメントする方法は、当分野で周知である。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Smith and Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cの局所相同性アルゴリズム、Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443の相同性アラインメントアルゴリズム、Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444のサーチのための類似法、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ)または手動アラインメントおよび目視(例えば、Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology参照)により実施できる。
配列同一性および配列類似性パーセントの決定に適するアルゴリズムの例はＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２.０アルゴリズムであり、これらはそれぞれAltschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; およびAltschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウエアは、National Center for Biotechnology Informationから公的に入手可能である。
２アミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０荷重残基表、ギャップ長ペナルティ２およびギャップペナルティ４を使用して、ＡＬＩＧＮEプログラム(バージョン２.０)に取り込まれている、Meyers and W. Miller( (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17)アルゴリズムを使用しても決定できる。加えて、２アミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｏｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスおよびギャップ荷重１６、１４、１２、１０、８、６または４および長さ荷重１、２、３、４、５または６を使用する、ＧＣＧソフトウエアパッケージ(www.gcg.comで利用可能)のＧＡＰプログラムに取り込まれているNeedleman and Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48:444-453)アルゴリズムを使用して決定できる。
ある面において、本発明は、機能的に等価な分子を産生する、出発抗体またはフラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)アミノ酸配列の修飾を企図する。例えば、ＣＡＲを構成するＣＤ３３結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖのＶＨまたはＶＬを、ＣＤ３３結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖの出発ＶＨまたはＶＬフレームワーク領域の少なくとも約７０％、７１％。７２％。７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性を保持するように修飾できる。本発明は、機能的に等価な分子を産生するための、ＣＡＲ構築物全体の修飾、例えば、ＣＡＲ構築物における種々のドメインの１以上のアミノ酸配列における修飾を企図する。ＣＡＲ構築物は、出発ＣＡＲ構築物の少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性を保持するように修飾され得る。
ＲＮＡトランスフェクション
ここに開示されるのは、インビトロで転写されたＲＮＡ ＣＡＲを産生する方法である。本発明はまた、細胞に直接遺伝子導入できるＲＮＡ構築物をコードするＣＡＲも含む。トランスフェクションに使用するためのｍＲＮＡを産生する方法は、特異的に設計したプライマーを用いる鋳型のインビトロ転写(ＩＶＴ)、続くポリＡ付加を含み、３’および５’非翻訳配列(“ＵＴＲ”)、５’キャップおよび／または配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)、発現させる核酸およびポリＡテイルを含む構築物、一般に５０〜２０００塩基長(配列番号３５)を産生し得る。このように産生されたＲＮＡは、異なる種の細胞において効率的に翻訳され得る。ある面において、鋳型は、ＣＡＲの配列を含む。
ある面において、ＣＤ３３ ＣＡＲは、メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)によりコードされる。ある面において、ＣＤ３３ ＣＡＲをコードするｍＲＮＡを、ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)の産生のために免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)に導入する。
ある態様において、インビトロ転写ＲＮＡ ＣＡＲを、一過性トランスフェクションの形として細胞に導入できる。ＲＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)産生鋳型を使用するインビトロ転写により産生される。いずれかの源からの目的のＤＮＡを、適切なプライマーおよびＲＮＡポリメラーゼを使用してインビトロｍＲＮＡ合成のための鋳型にＰＣＲにより直接変換できる。ＤＮＡの源は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列またはＤＮＡのあらゆる他の適切な源であり得る。インビトロ転写のための望ましい鋳型は、本発明のＣＡＲである。例えば、ＲＮＡ ＣＡＲのための鋳型は、抗腫瘍抗体の単一鎖可変ドメインを含む細胞外領域；ヒンジ領域、膜貫通ドメイン(例えば、ＣＤ８ａの膜貫通ドメイン)；および例えば、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含む、細胞内シグナル伝達ドメインを含む、細胞質領域を含む。
ある態様において、ＰＣＲに使用するＤＮＡはオープンリーディングフレームを含む。ＤＮＡは、生物のゲノムからの天然に存在するＤＮＡ配列由来であり得る。ある態様において、核酸は、５’および／または３’非翻訳領域(ＵＴＲ)のいくぶんかまたは全てを含み得る。核酸はエクソンおよびイントロンを含み得る。ある態様において、ＰＣＲに使用するＤＮＡはヒト核酸配列である。他の態様において、ＰＣＲに使用するＤＮＡは、５’および３’ＵＴＲを含むヒト核酸配列である。ＤＮＡは、あるいは、天然に存在する生物で通常発現されない人工ＤＮＡ配列であり得る。人工ＤＮＡ配列の例は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成するようにライゲートされた遺伝子の部分を含むものである。ライゲートされたＤＮＡの部分は、単一生物由来でも１を超える生物由来でもよい。
ＰＣＲを使用して、トランスフェクションに使用するｍＲＮＡのインビトロ転写のための鋳型を産生する。ＰＣＲを実施する方法は、当分野で周知である。ＰＣＲにおいて使用するプライマーは、ＰＣＲのための鋳型として使用するＤＮＡの領域に実質的に相補的である領域を有するように設計する。ここで使用する“実質的に相補的”は、プライマー配列の残基の大部分または全てが相補的であるまたは１以上の塩基が非相補的またはミスマッチである、ヌクレオチドの配列をいう。実質的に相補的配列は、ＰＣＲに使用するアニーリング条件下で、ＤＮＡ標的とアニールまたはハイブリダイズできる。プライマーは、ＤＮＡ鋳型のいずれかの部分と実質的に相補的であるように設計できる。例えば、プライマーは、５’および３’ＵＴＲを含む、細胞において通常転写される(オープンリーディングフレーム)核酸の部分を増幅するように設計できる。プライマーは、目的の特定のドメインをコードする核酸の部分を増幅するようにも設計できる。ある態様において、プライマーは、５’および３’ＵＴＲの全てまたは一部を含む、ヒトｃＤＮＡのコーディング領域を増幅するように設計する。ＰＣＲに有用なプライマーは、当分野で周知である合成法により産生できる。“順方向プライマー”は、増幅するＤＮＡ配列の上流であるＤＮＡ鋳型上にヌクレオチドに対して実質的に相補的であるヌクレオチドの領域を含むプライマーである。“上流”は、コード鎖に対して、増幅するＤＮＡ配に対する５位をいうためにここで使用する。“逆方向プライマー”は、増幅するＤＮＡ配列の下流である、二本鎖ＤＮＡ鋳型に対して実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーである。“下流”は、コード鎖に対して、増幅するＤＮＡ配に対する３位をいうためにここで使用する。
ＰＣＲに有用なあらゆるＤＮＡポリメラーゼをここに開示する方法で使用できる。試薬およびポリメラーゼは、多数の業者から市販されている。
安定性および／または翻訳効率を促進する能力を有する化学構造も使用し得る。ＲＮＡは、好ましくは５’および３’ＵＴＲを有する。ある態様において、５’ＵＴＲは、１〜３０００ヌクレオチド長である。コーディング領域に付加する５’および３’ＵＴＲ配列の長さは、ＵＴＲの異なる領域をアニールするＰＣＲのためのプライマーの設計を含むが、これに限定されない、異なる方法により変わり得る。この試みを使用して、当業者は、転写ＲＮＡのトランスフェクション後、最適翻訳効率を達成するのに必要な５’および３’ＵＴＲ長を修飾できる。
５’および３’ＵＴＲは、目的の核酸のための天然に存在する、内在性５’および３’ＵＴＲであり得る。あるいは、目的の核酸に対して内在性ではないＵＴＲ配列を、順方向および逆方向プライマーへのＵＴＲ配列の取り込みによりまたは鋳型のいずれかの他の修飾により付加できる。目的の核酸に対して内在性ではないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率の修飾のために有用であり得る。例えば、３’ＵＴＲ配列のＡＵリッチ要素は、ｍＲＮＡの安定性を低下させることが知られる。それゆえに、３’ＵＴＲを、当分野で周知であるＵＴＲの特性に基づき、転写されたＲＮＡの安定性を増加するように選択および設計できる。
ある態様において、５’ＵＴＲは、内在性核酸のＫｏｚａｋ配列を含み得る。あるいは、目的の核酸に対して内在性ではない５’ＵＴＲを上記のようにＰＣＲにより付加するとき、コンセンサスＫｏｚａｋ配列を、５’ＵＴＲ配列の付加により再設計できる。Ｋｏｚａｋ配列は、あるＲＮＡ転写物の翻訳効率を上げることはできるが、効率的翻訳を可能とするために全ＲＮＡで必要であるようには見えない。多くのｍＲＮＡについてのＫｏｚａｋ配列に対する必要性は、当分野で知られる。他の態様において、５’ＵＴＲは、ＲＮＡゲノムが細胞で安定であるＲＮＡウイルスの５’ＵＴＲであり得る。他の態様において、種々のヌクレオチドアナログを、ｍＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解を妨害するために、３’または５’ＵＴＲにおいて使用できる。
遺伝子クローニングの必要性なしにＤＮＡ鋳型からのＲＮＡの合成を可能にするために、転写のプロモーターは、転写する配列の上流のＤＮＡ鋳型に結合すべきである。ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターとして機能する配列が順方向プライマーの５’末端に結合されたとき、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、転写されるオープンリーディングフレームの上流のＰＣＲ産物に取り込まれる。ある好ましい態様において、プロモーターは、本明細書の他の箇所に記載するような、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターは、Ｔ３およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むが、これらに限定されない。Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列が当分野で知られる。
好ましい態様において、ｍＲＮＡは、リボソーム結合、翻訳開始および細胞におけるｍＲＮＡの安定性を決定する、５’末端および３’ポリ(Ａ)テイルの両者にキャップを有する。環状ＤＮＡ鋳型、例えば、プラスミドＤＮＡ上で、ＲＮＡポリメラーゼは真核細胞における発現に適しない長いコンカテマー産物を産生する。３’ＵＴＲの末端で直線化されたプラスミドＤＮＡの転写は、転写後ポリアデニル化されても、真核トランスフェクションに有効ではない正常サイズのｍＲＮＡを生じる。
直鎖状ＤＮＡ鋳型で、ファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは鋳型の最後の塩基を越えて転写物の３’末端を伸長できる(Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003))。
ＤＮＡ鋳型に伸びるポリＡ／Ｔの組込みの慣用法は分子クローニングである。しかしながらプラスミドＤＮＡに統合されたポリＡ／Ｔ配列は、プラスミド不安定性を生じ得て、これが、なぜ細菌細胞から得たプラスミドＤＮＡ鋳型がしばしば欠失および他の異常で高度に汚染されているかの理由である。これによりクローニング工程が骨がおれ、時間かかかるだけでなく、しばしば信頼できないものとなる。これが、クローニングを伴わないポリＡ／Ｔ ３’ストレッチを有するＤＮＡ鋳型の産生を可能にする方法が非常に望まれているかの理由である。
転写ＤＮＡ鋳型のポリＡ／Ｔセグメントは、１００ＴテイルのようなポリＴテイルを含む逆方向プライマーを使用するＰＣＲ中(配列番号３１)(サイズは５０〜５０００Ｔであり得る(配列番号３２))またはＤＮＡライゲーションまたはインビトロ組み換えを含むが、これらに限定されないいずれかの他の方法によりＰＣＲ後に産生できる。ポリ(Ａ)テイルはまたＲＮＡに安定性を提供し、その分解を減らす。一般に、ポリ(Ａ)テイルの長さは、転写されたＲＮＡの安定性と正に相関する。ある態様において、ポリ(Ａ)テイルは、１００〜５０００アデノシンである(配列番号３３)。
ＲＮＡのポリ(Ａ)テイルは、大腸菌ポリＡポリメラーゼ(Ｅ−ＰＡＰ)のようなポリ(Ａ)ポリメラーゼの使用により、インビトロ転写後さらに伸長できる。ある態様において、ポリ(Ａ)テイルの１００ヌクレオチドから３００〜４００ヌクレオチドへの長さの延長(配列番号３４)は、ＲＮＡの翻訳効率の約２倍増加を生じる。さらに、３’末端への異なる化学基の付加は、ｍＲＮＡ安定性を増加させ得る。このような結合は、修飾／人工ヌクレオチド、アプタマーおよび他の化合物を含み得る。例えば、ＡＴＰアナログは、ポリ(Ａ)ポリメラーゼを使用してポリ(Ａ)テイルに取り込まれ得る。ＡＴＰアナログは、ＲＮＡの安定性をさらに高め得る。
５’キャップもＲＮＡ分子に安定性を提供する。好ましい態様において、ここに開示する方法により産生されたＲＮＡは、５’キャップを含む。５’キャップは当分野で知られ、ここに記載する技術を使用して提供される(Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005))。
ここに開示する方法により産生されたＲＮＡは配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)配列も含み得る。ＩＲＥＳ配列は、ｍＲＮＡへのキャップ非依存的リボソーム結合を開始し、翻訳開始を促進する、あらゆるイルス、染色体または人工設計配列であり得る。糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤および界面活性剤のような細胞透過性および生存能を促進する因子を含み得る、細胞電気穿孔法に適するいずれかの溶質を包含できる。
ＲＮＡを、多数の異なる方法、例えば、商業的に利用可能な方法のいずれかを使用して、標的細胞に導入でき、これは、電気穿孔法(Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Cologne, Germany))、(ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Mass.)またはGene Pulser II (BioRad, Denver, Colo.)、Multiporator (Eppendort, Hamburg Germany)、リポフェクションを使用するカチオン性リポソーム介在トランスフェクション、ポリマー封入、ペプチド介在トランスフェクションまたは“遺伝子銃”のような微粒子銃粒子送達系(例えば、Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)参照)を含むが、これらに限定されない。
非ウイルス送達方法
ある面において、非ウイルス方法を使用して、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸を細胞または組織または対象に送達できる。
ある態様において、非ウイルス方法は、トランスポゾン(転位因子とも呼ばれる)の使用を含む。ある態様において、トランスポゾンは、ゲノムの位置にそれ自体挿入できるＤＮＡの断片、例えば、自己複製性であり、そのコピーをゲノムに挿入することができるＤＮＡの断片または長い核酸の外にスプライシングされ、ゲノムの他の場所に挿入されることができるＤＮＡの断片である。例えば、トランスポゾンは、転位のための逆位反復フランキング遺伝子からなるＤＮＡ配列を含む
トランスポゾンを使用する核酸送達法の例は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系(ＳＢＴＳ)およびｐｉｇｇｙＢａｃ(ＰＢ)トランスポゾン系を含む。例えば、Aronovich et al. Hum. Mol. Genet. 20.R1(2011):R14-20; Singh et al. Cancer Res. 15(2008):2961-2971; Huang et al. Mol. Ther. 16(2008):580-589; Grabundzija et al. Mol. Ther. 18(2010):1200-1209; Kebriaei et al. Blood. 122.21(2013):166; Williams. Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16; Bell et al. Nat. Protoc. 2.12(2007):3153-65; およびDing et al. Cell. 122.3(2005):473-83(これらは全て引用により本明細書に包含させる)を参照のこと。
ＳＢＴＳは２要素を含む：１)導入遺伝子を含むトランスポゾンおよび２)トランスポサーゼ酵素の源。トランスポサーゼは、担体プラスミド(または他のドナーＤＮＡ)から、宿主細胞染色体／ゲノムのような標的ＤＮＡにトランスポゾンを転位できる。例えば、トランスポサーゼは、担体プラスミド／ドナーＤＮＡに結合し、トランスポゾン(導入遺伝子含有)をプラスミドの外に切り出し、宿主細胞のゲノムに入れる。例えば、Aronovich et al. supra参照。
トランスポゾンの例は、ｐＴ２ベースのトランスポゾンを含む。例えば、その全てを引用により本明細書に包含させるGrabundzija et al. Nucleic Acids Res. 41.3(2013):1829-47; およびSingh et al. Cancer Res. 68.8(2008): 2961-2971参照。トランスポサーゼの例は、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型トランスポサーゼ、例えば、ＳＢ１０トランスポサーゼまたはＳＢ１１トランスポサーゼを含む(例えば、サイトメガロウイルスプロモーターから発現できる、機能亢進トランスポサーゼ)。例えば、全て引用により本明細書に包含させるAronovich et al.; Kebriaei et al.; およびGrabundzija et al.参照。
ＳＢＴＳの使用は、導入遺伝子、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸の効率的組込みおよび発現を可能にする。ここに提供されるのは、例えば、ＳＢＴＳのようなトランスポゾン系を使用する、ここに記載するＣＡＲを安定に発現する細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を産生する方法である。
ここに記載する方法によって、ある態様において、ＳＢＴＳ要素を含む１以上の核酸、例えば、プラスミドが細胞に送達される(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)。例えば、核酸は、核酸(例えば、プラスミドＤＮＡ)送達の標準法、例えば、ここに記載する方法、例えば、電気穿孔法、トランスフェクションまたはリポフェクションにより送達される。ある態様において、核酸は、導入遺伝子、例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸を含むトランスポゾンを含む。ある態様において、核酸は、導入遺伝子(例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸)を含むトランスポゾンならびにトランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列を含む。他の態様において、例えば、デュアルプラスミド系、例えば、第一プラスミドが導入遺伝子を含むトランスポゾンを含み、第二プラスミドがトランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列を含む、２核酸の系が提供される。例えば、第一および第二核酸は、宿主細胞に共送達される。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞が、ヌクレアーゼ(例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ＺＦＮ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系または操作されたメガヌクレアーゼ再操作ホーミングエンドヌクレアーゼ)を使用する、ＳＢＴＳおよび遺伝子編集の遺伝子挿入の組合せを使用して産生される。
ある態様において、非ウイルス送達方法の使用は、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の再プログラミングおよび対照への細胞の直接注入を可能にする。非ウイルスベクターの利点は、患者集団に見合うために必要な十分量の産生が容易かつ比較的安価であること、保存中の安定性および免疫原性の欠如を含むが、これらに限定されない。
ＣＡＲをコードする核酸構築物
本発明はまたここに記載する１以上のＣＡＲ構築物をコードする核酸分子を提供する。ある面において、核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡ転写物として提供される。ある面において、核酸分子は、ＤＮＡ構築物として提供される。
よって、ある面において、本発明はキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)をコードする単離核酸分子に関し、ここで、ＣＡＲは、ＣＤ３３結合ドメイン(例えば、ヒト化またはヒトＣＤ３３結合ドメイン)、膜貫通ドメインおよび刺激性ドメイン、例えば、共刺激性シグナル伝達ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ゼータ鎖を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、ＣＤ３３結合ドメインは、ここに記載するＣＤ３３結合ドメイン、例えば、配列番号３９〜４７からなる群から選択される配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含むＣＤ３３結合ドメインである。ある態様において、膜貫通ドメインは、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群から選択される、例えば、ここに記載する、タンパク質の膜貫通ドメインである。ある態様において、膜貫通ドメインは、配列番号６の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、ＣＤ３３結合ドメインは、ヒンジ領域、例えば、ここに記載するヒンジにより膜貫通ドメインに結合する。ある態様において、ヒンジ領域は、配列番号２または配列番号３または配列番号４または配列番号５またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、単離核酸分子さらに共刺激ドメインをコードする配列を含む。ある態様において、共刺激ドメインは、例えば、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ性活性化分子(ＳＬＡＭタンパク質)、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃbp、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群から選択される、例えば、ここに記載する、タンパク質の機能的シグナル伝達ドメインである。ある態様において、共刺激ドメインは、配列番号７の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７の配列または配列番号８またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列および配列番号９または配列番号１０の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は、同じフレームにおよび単一ポリペプチド鎖として発現される。
他の面において、本発明は、配列番号１のリーダー配列、配列番号３９〜４７(またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列)からなる群から選択される配列を有するｓｃＦｖドメイン、配列番号２または配列番号３または配列番号４または配列番号５の配列(またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列)のヒンジ領域、配列番号６の配列(またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列)を有する膜貫通ドメイン、配列番号７の配列を有する４−１ＢＢ共刺激ドメインまたは配列番号８の配列(またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列)を有するＣＤ２７共刺激ドメインまたは配列番号３７９の配列(またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列)を有するＣＤ２８共刺激ドメインまたは配列番号３８１の配列(またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列)を有するＩＣＯＳ共刺激ドメインおよび配列番号９または配列番号１０の配列を有するＣＤ３ゼータ刺激性ドメイン(またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列)を含む、ＣＡＲ構築物をコードする単離核酸分子に関する。
他の面において、本発明は、核酸分子によりコードされる単離ポリペプチド分子に関する。ある態様において、単離ポリペプチド分子は、配列番号４８〜５６からなる群から選択される配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
他の面において、本発明は、ＣＤ３３結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび刺激性ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)分子をコードする核酸分子に関し、ここで、該ＣＤ３３結合ドメインは、配列番号７５〜８３からなる群から選択される配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、コードされたＣＡＲ分子さらに共刺激ドメインをコードする配列を含む。ある態様において、共刺激ドメインは、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ性活性化分子(ＳＬＡＭタンパク質)、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃbp、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインである。ある態様において、共刺激ドメインは、配列番号７の配列を含む。ある態様において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａおよびＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒｇ(共通ガンマ)、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４、(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲおよびＰＡＧ／Ｃbpからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインである。
ある態様において、膜貫通ドメインは、配列番号６の配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメインおよびゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７の配列および配列番号９の配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は、同じフレームにおよび単一ポリペプチド鎖として発現される。ある態様において、ＣＤ３３結合ドメインは、ヒンジ領域により膜貫通ドメインに結合される。ある態様において、ヒンジ領域は配列番号２を含む。ある態様において、ヒンジ領域は配列番号３または配列番号４または配列番号５を含む。
他の面において、本発明は、配列番号１のリーダー配列、配列番号３９〜４７からなる群から選択される配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を有するｃＦｖドメイン、配列番号２または配列番号３または配列番号４または配列番号５のヒンジ領域、配列番号６の配列を有する膜貫通ドメイン、配列番号７の配列を有する４−１ＢＢ共刺激ドメインまたは配列番号８の配列を有するＣＤ２７共刺激ドメインおよび配列番号９または配列番号１０の配列を有するＣＤ３ゼータ刺激性ドメインを含む、コードされたＣＡＲ分子に関する。ある態様において、コードされたＣＡＲ分子は、配列番号４８〜５６からなる群から選択される配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
所望の分子をコードする核酸配列は、標準技術を使用して、例えば遺伝子を発現する細胞からのライブラリーのスクリーニングにより、それを含むことが知られるベクターからの遺伝子を誘導化することによりまたはそれを含むことが知られる細胞および組織から直接単離することによるような、組み換え当分野で知られる方法を使用して得ることができる。あるいは、目的の遺伝子を、クローン化ではなく、合成により産生できる。
本発明はまた本発明のＤＮＡが挿入されているベクターも提供する。レンチウイルスのようなレトロウイルス由来のベクターは、それらが導入遺伝子の長期の安定した組み込みおよび娘細胞への伝播を可能にするため、長期遺伝子導入を達成するのに適するツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞のような非増殖細胞を形質導入できる点で、マウス白血病ウイルスのようなオンコ−レトロウイルス由来のベクターを超えるさらなる利点を有する。さらに低免疫原性であるという付加的利点も有する。レトロウイルスベクターは、例えば、ガンマレトロウイルスベクターでもあり得る。ガンマレトロウイルスベクターは、例えば、プロモーター、パッケージングシグナル(ψ)、プライマー結合部位(ＰＢＳ)、１以上の(例えば、２)末端反復配列(ＬＴＲ)および目的の導入遺伝子、例えば、ＣＡＲをコードする遺伝子を含み得る。ガンマレトロウイルスベクターは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖのようなウイルス構造的遺伝子を欠き得る。ガンマレトロウイルスベクターの例は、マウス白血病ウイルス(ＭＬＶ)、脾フォーカス形成ウイルス(ＳＦＦＶ)および骨髄増殖性肉腫ウイルス(ＭＰＳＶ)およびそれら由来のベクターを含む。他のガンマレトロウイルスベクターは、例えば、Tobias Maetzig et al., “Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application” Viruses. 2011 Jun; 3(6): 677-713に記載される。
他の態様において、所望の本発明のＣＡＲをコードする核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター(Ａ５／３５)である。他の態様において、ＣＡＲをコードする核酸の発現は、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ、ｃｒｉｓｐｅｒ、ＣＡＳ９および亜鉛フィンガーヌクレアーゼのようなトランスポゾンを使用して達成できる。引用により本明細書に包含する、下記June et al. 2009 Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716参照。
概説すると、ＣＡＲをコードする天然または合成核酸の発現は、一般に、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸またはその一部をプロモーターに操作可能に連結させ、当該構築物を発現ベクターに取り込むことにより達成される。ベクターは、真核生物での複製および組込みに適し得る。典型的クローニングベクターは、所望の核酸配列の発現の制御に有用な転写および翻訳ターミネーター、開始配列およびプロモーターを含む。
本発明の構築物の発現はまた、標準遺伝子送達プロトコールを使用する、核酸免疫化および遺伝子治療にも使用し得る。遺伝子送達のための方法が当分野で知られる。例えば、引用によりその全体を本明細書に包含させる、米国特許５,３９９,３４６号、５,５８０,８５９号、５,５８９,４６６号参照。他の態様において、本発明は、遺伝子治療ベクターを提供する。
核酸は、多数のタイプのベクターにクローン化できる。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルスおよびコスミドを含むが、これらに限定されないベクターにクローン化できる。特に興味深いベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ産生ベクターおよびシークエンシングベクターを含む。
さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形で細胞に提供され得る。ウイルスベクターテクノロジーは当分野で周知であり、例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1 -4, Cold Spring Harbor Press, NYおよび他のウイルス学および分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスを含むが、これらに限定されない。一般に、適当なベクターは、少なくとも１生物で機能的な複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位および１以上の選択可能マーカーを含む(例えば、ＷＯ０１／９６５８４号；ＷＯ０１／２９０５８号；および米国特許６,３２６,１９３号)。
多数のウイルスベースの系が、哺乳動物細胞への遺伝子移入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための簡便なプラットフォームを提供する。選択した遺伝子を、当分野で知られる技術を使用して、ベクターに挿入し、レトロウイルス粒子に包装できる。次いで、組み換えウイルスが単離され、対象の細胞にインビボまたはエクスビボで送達され得る。多数のレトロウイルス系が当分野で知られる。ある態様において、アデノウイルスベクターを使用する。多数のアデノウイルスベクターが当分野で知られる。ある態様において、レンチウイルスベクターを使用する。
さらなるプロモーター要素、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を制御する。一般に、これらは、開始部位の上流３０〜１１０bpの領域に位置するが、多数のプロモーターが、同様に開始部位の下流に機能的要素を含むことが示されている。プロモーター要素間の空間はしばしば可動性であり、それゆえに、要素が互いに逆になったり移動したときにプロモーター機能が保持される。チミジンキナーゼ(ｔｋ)プロモーターにおいて、プロモーター要素間の空間は、活性が落ち始める前、５０bp離れるまで増加し得る。プロモーターによって、個々の要素は、転写を活性化するために協調的または独立的に機能できるように見える。プロモーターの例は、ＣＭＶ ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣまたはホスホグリセロキナーゼ(ＰＧＫ)プロモーターを含む。
哺乳動物Ｔ細胞においてＣＡＲ導入遺伝子の発現ができるプロモーターの例は、ＥＦ１ａプロモーターである。天然ＥＦ１ａプロモーターは、アミノアシルｔＲＮＡのリボソームへの酵素送達を担う、伸長因子−１複合体のアルファサブユニットの発現を駆動する。ＥＦ１ａプロモーターは哺乳動物発現プラスミドで広く使用されており、レンチウイルスベクターにクローン化された導入遺伝子からＣＡＲ発現を駆動するのに有効であることが示されている。例えば、Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464(2009)参照。ある面において、ＥＦ１ａプロモーターは、配列番号１１として提供される配列を含む。
プロモーターの他の例は、最初期サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに操作可能に連結したあらゆるポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動できる、強い構成的プロモーター配列である。しかしながら、サルウイルス４０(ＳＶ４０)初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス(ＭＭＴＶ)、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)末端反復配列(ＬＴＲ)プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターを含むが、これらに限定されない他の構成的プロモーター配列ならびにアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子−１ａプロモーター、ヘモグロビンプロモーターおよびクレアチンキナーゼプロモーターのような、しかしこれらに限定されないヒト遺伝子プロモーターも使用し得る。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定すべきではない。誘導性プロモーターも本発明の一部であるとして意図される。誘導性プロモーターの使用は、操作可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現を、発現が望まれるときに発現を活性化し、発現が望まれないときに発現を遮断することができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例は、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーターおよびテトラサイクリンプロモーターを含むが、これらに限定されない。
プロモーターの他の例は、ホスホグリセラートキナーゼ(ＰＧＫ)プロモーターである。ある態様において、切断ＰＧＫプロモーター(例えば、野生型ＰＧＫプロモーター配列と比較したとき、１以上の、例えば、１、２、５、１０、１００、２００、３００または４００ヌクレオチド欠失を有するＰＧＫプロモーター)が望ましいことがある。ＰＧＫプロモーター例のヌクレオチド配列を下に提供する。
ＷＴ ＰＧＫプロモーター
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCGCGGCGACGCAAAGGGCCTTGGTGCGGGTCTCGTCGGCGCAGGGACGCGTTTGGGTCCCGACGGAACCTTTTCCGCGTTGGGGTTGGGGCACCATAAGCT
(配列番号３８４)
切断ＰＧＫプロモーター例：
ＰＧＫ１００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTG
(配列番号３８５)
ＰＧＫ２００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACG
(配列番号３８６)
ＰＧＫ３００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCG
(配列番号３８７)
ＰＧＫ４００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCG
(配列番号３８８)
ベクターは、例えば、分泌を促進するためのシグナル配列、ポリアデニル化シグナルおよび転写ターミネーター(例えば、ウシ成長ホルモン(ＢＧＨ)遺伝子から)、エピソーム複製および原核生物における複製を可能にする要素(例えばＳＶ４０起源およびＣｏｌＥ１または当分野で知られるその他)および／または選択を可能にする要素(例えば、アンピシリン耐性遺伝子および／またはゼオシンマーカー)も含み得る。
ＣＡＲポリペプチドまたはその一部の発現を評価するために、細胞に導入する発現ベクター遺伝子導入またはウイルスベクターによる感染が探求される細胞の集団から発現細胞から発現細胞の同定および選択を容易にするために、選択可能マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子または両者も含んでよい。他の面において、選択可能マーカーは、ＤＮＡの別の断面に担持され、共トランスフェクション法において使用される。選択可能マーカーおよびレポーター遺伝子のいずれも、宿主細胞における発現が可能であるように、適切な制御配列が隣接し得る。有用な選択可能マーカーは、例えば、ｎｅｏなどの、抗生物質耐性遺伝子を含む。
レポーター遺伝子は、恐らく遺伝子導入されている細胞を同定し、制御配列の機能性を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織に存在または発現されず、発現がある容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性により顕在化されるポリペプチドをコードする、遺伝子である。レポーター遺伝子の発現を、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入されてから適当な時間後にアッセイする。適当なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼまたは緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含み得る(例えば、Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82)。適当な発現系は周知であり、既知技術により製造できまたは商業的に入手できる。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小５’フランキング領域を有する構築物をプロモーターとして同定する。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結し、プロモーター駆動転写を調節する能力について薬剤を評価するのに使用し得る。
ある態様において、ベクターは、さらに第二ＣＡＲをコードする核酸を含むことができる。ある態様において、第二ＣＡＲは、例えば、ＣＤ１２３、ＣＤ３４、ＣＬＬ−１、ＦＬＴ３または葉酸受容体ベータのような、急性骨髄性白血病細胞に発現される標的に対する抗原結合ドメインを含む。ある態様において、ベクターは、第一抗原に特異的に結合し、共刺激性シグナル伝達ドメインを有する細胞内シグナル伝達ドメインを含むが、一次シグナル伝達ドメインを含まない第一ＣＡＲをコードする核酸配列および第二の、異なる、抗原に特異的に結合し、一次シグナル伝達ドメインを有するが、共刺激性シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲをコードする核酸を含む。ある態様において、ベクターは、ＣＤ３３結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激ドメインを含む第一ＣＤ３３ ＣＡＲをコードする核酸およびＣＤ３３以外の抗原(例えば、ＡＭＬ細胞に発現される抗原、例えば、ＣＤ１２３、ＣＤ３４、ＣＬＬ−１、ＦＬＴ３または葉酸受容体ベータ)に特異的に結合し、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲをコードする核酸を含む。他の態様において、ベクターは、ＣＤ３３結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む第一ＣＤ３３ ＣＡＲをコードする核酸およびＣＤ３３以外の抗原(例えば、ＡＭＬ細胞に発現される抗原、例えば、ＣＤ１２３、ＣＬＬ−１、ＣＤ３４、ＦＬＴ３または葉酸受容体ベータ)に特異的に結合し、該抗原に対する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激性シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲをコードする核酸を含む。
ある態様において、ベクターは、ここに記載するＣＤ３３ ＣＡＲをコードする核酸および阻害性ＣＡＲをコードする核酸を含む。ある態様において、阻害性ＣＡＲは、正常細胞、例えば、ＣＤ３３をまた発現する正常細胞に見られるが、癌細胞に見られない抗原に結抗原結合ドメイン合する抗原結合ドメインを含む。ある態様において、阻害性ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび阻害分子の細胞内ドメインをフ有無。例えば、阻害性ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータの細胞内ドメインであり得る。
ある態様において、ベクターは、２以上の核酸ＣＡＲをコードする配列、例えば、ここに記載するＣＤ３３ ＣＡＲおよび第二ＣＡＲ、例えば、阻害性ＣＡＲまたはＣＤ３３以外の抗原(例えば、ＡＭＬ細胞に発現される抗原、例えば、ＣＤ１２３、ＣＬＬ−１、ＣＤ３４、ＦＬＴ３または葉酸受容体ベータ)に特異的に結合するＣＡＲを含み得る。このような態様において、ＣＡＲをコードする２以上の核酸配列は、同じフレーム内の単一核分子により、かつ単一ポリペプチド鎖としてコードされる。この面において、２以上のＣＡＲは、例えば、１以上のペプチド開裂部位により分離され得る。(例えば、自己開裂部位細胞内プロテアーゼのためのまたは基質)。ペプチド開裂部位の例は次のものを含み、ここで、ＧＳＧ残基はいずれかである。
Ｔ２Ａ：(GSG) E G R G S L L T C G D V E E N P G P (配列番号389)
Ｐ２Ａ：(GSG) A T N F S L L K Q A G D V E E N P G P (配列番号390)
Ｅ２Ａ：(GSG) Q C T N Y A L L K L A G D V E S N P G P (配列番号391)
Ｆ２Ａ：(GSG) V K Q T L N F D L L K L A G D V E S N P G P (配列番号392)
細胞に遺伝子を導入し、発現させる方法は当分野で知られる。発現ベクターの状況において、ベクターは、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母または昆虫細胞に、当分野のいずれかの方法により容易に導入できる。例えば、例えば、発現ベクターは、物理的、化学的または生物学的手段により、宿主細胞に移入される。
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、微量注入、エレクトロポレーションなどを含む。ベクターおよび／または外来性核酸を含む細胞を産生する方法は、当分野で周知である。例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY参照)。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入に好ましい方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
宿主細胞に目的のポリヌクレオチドを導入するための生物学的方法は、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えば、ヒト細胞への遺伝子挿入に最も広く使用される方法となってきている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許５,３５０,６７４号および５,５８５,３６２号参照。
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための化学的手段は、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズおよび水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質ベースの系のようなコロイド分散体系を含む。インビトロおよびインビボで送達媒体として使用するための代表的コロイド系は、リポソーム(例えば、人工膜小胞)である。標的化ナノ粒子または他の適当なサブミクロンサイズの送達系を用いるポリヌクレオチドの送達のような、最新式の核酸の標的化送達の他の方法が利用可能である。
非ウイルス送達系を利用する場合、代表的送達媒体はリポソームである。脂質製剤の使用は、宿主細胞への核酸の導入のために意図される(インビトロ、エクスビボまたはインビボ)。他の面において、核酸は、脂質と結合され得る。脂質と結合した核酸は、リポソームの水性内部への被包、リポソームの脂質二重層内への分散、リポソームとオリゴヌクレオチドの両者と結合する連結分子を介するリポソームへの結合、リポソームへの封入、リポソームとの複合体化、脂質含有溶液への分散、脂質との混合、脂質との組み合わせ、脂質中の懸濁液としての包含、ミセル内への包含または複合体化または他の方法で脂質と結合する。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクター結合組成物は、溶液中の何らかの特定の構造に限定されない。例えば、それらは、二重層構造において、ミセルとしてまたは“崩壊”構造を有して存在し得る。それらはまた単に溶液に分散され、恐らく、サイズまたは形が均一ではない凝集体を形成し得る。脂質は、天然に存在するまたは合成脂質であり得る脂肪物質である。例えば、例えば、脂質は、細胞質に天然に生じる脂肪滴ならびに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコールおよびアルデヒドのような長鎖脂肪族炭化水素を含む化合物群およびその誘導体を含む。
使用に適する脂質は、商業的供給源から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン(“ＤＭＰＣ”)は、Sigma, St. Louis, MOから得ることができ、リン酸ジセチル(“ＤＣＰ”)はK & K Laboratories(Plainview, NY)から得ることができ；コレステロール(“Ｃｈｏｉ”)はCalbiochem-Behringから得ることができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール(“ＤＭＰＧ”)および他の脂質は、Avanti Polar Lipids, Inc.(Birmingham, AL.)から得ることができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質の原液を、約−２０℃で保存できる。クロロホルムを、メタノールよりも容易に揮発するために、唯一の溶媒として使用する。“リポソーム”は、封入された脂質二重層または凝集体の産生により形成される多様な単および多層状脂質媒体を包含する一般的用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部水性媒体を伴う小胞構造を有することにより特徴付けられる。多層状リポソームは、水性媒体により分離された、複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁されたときに自然に形成される。脂質要素は、閉構造形成前に自己凝集し、水および溶解した溶質を脂質二重層の間に封入する(Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10)。しかしながら、通常の小胞構造と異なる構造を溶液で有する組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造であるかまたは単に脂質分子の不均一凝集体として存在すると考えられ得る。リポフェクタミン−核酸複合体もまた考慮される。
外来性核酸を宿主細胞に導入するまたはそうでなければ細胞を本発明の阻害剤に曝す方法に関係なく、宿主細胞における組み換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、多様なアッセイを行い得る。このようなアッセイは、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲのような当業者に周知の“分子生物学的”アッセイ、薬剤の同定に使用するための、例えば、免疫学的手段(ＥＬＩＳＡｓおよびウェスタンブロット)により、特定のペプチドの存在または不在を検出するような“生化学的”アッセイまたは本発明の範囲内に入るここに記載するアッセイを含む。
本発明は、さらにＣＡＲコード化核酸分子を含むベクターを提供する。ある面において、ＣＡＲベクターは、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に直接形質導入できる。ある面において、ベクターは、クローニングまたは発現ベクター、例えば、１以上のプラスミド(例えば、発現プラスミド、クローニングベクター、ミニサークル、ミニベクター、二重分染色体)、レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター構築物を含むが、これらに限定されない、ベクターである。ある面において、ベクターは、哺乳動物Ｔ細胞におけるＣＡＲ構築物の発現が可能である。ある面において、哺乳動物Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞である。
細胞の供給源
増殖および遺伝的修飾または他の修飾の前に、細胞(例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)の供給源を、対象から得ることができる。用語“対象”は、免疫応答が惹起できる生存生物(例えば、哺乳動物)を含むことを意図する。対象の例は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラットおよびそれらのトランスジェニック種を含む。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍を含む、多数の供給源から得ることができる。
本発明のある面において、当分野で利用可能ないずれかの数の免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)系を使用し得る。本発明のある面において、Ｔ細胞を、ＦｉｃｏｌｌＴＭ分離のような、当業者に知られるあらゆる技術を使用して、対象から採取した血液の単位から得ることができる。ある好ましい面において、個体の循環血液からの細胞をアフェレーシスにより得る。アフェレーシス産物は、一般にＴ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球を含む、リンパ球、赤血球および血小板を含む。ある面において、アフェレーシスにより採取した細胞は血漿画分を除去するために洗浄し、細胞を続くプロセシング過程のために適切な緩衝液または媒体に入れる。本発明のある面において、細胞を、リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)で洗浄する。別の面において、洗浄溶液はカルシウムを欠き、マグネシウムを欠いてよくまたは全てではないにしても多くの二価カチオンを欠いてよい。
カルシウム非存在下の初期活性化過程は、活性化の増強に至り得る。当業者には容易に認識されるように、洗浄工程は、製造業者の指示に従う、半自動化“フロースルー”遠心分離(例えば、Cobe 2991 cell processor、Baxter CytoMateまたはHaemonetics Cell Saver 5)により達成され得る。洗浄後、細胞を、例えば、無Ｃａ、無ＭｇＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａまたは他の緩衝剤を含むまたは含まない食塩水溶液のような、多様な生体適合性緩衝液に再懸濁し得る。あるいは、アフェレーシスサンプルの望ましくない要素を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁し得る。
本出願の方法は、５％以下、例えば２％の、ヒトＡＢ血清を含む培養培地条件を利用でき、既知培養培地条件および組成物、例えばSmith et al., “Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement” Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi:10.1038／cti.2014.31に記載のものを用いることができることは認識される。
ある面において、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬＴＭ勾配による遠心分離または対向流遠心溶出法により単球を枯渇させることにより、末梢血リンパ球から単離する。
ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞のようなＴ細胞の特異的下位集団を、陽性または陰性選択技術によりさらに単離し得る。例えば、ある面において、Ｔ細胞を、所望のＴ細胞の陽性選択に十分な時間、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ(登録商標)Ｍ−４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔのような抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８(例えば、３ｘ２８)コンジュゲートビーズとインキュベーションすることにより単離する。ある面において、時間は約３０分である。さらなる面において、時間は３０分〜３６時間またはそれより長い範囲およびその間のいずれかの整数値である。さらなる面において、時間は少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間または６時間である。他の好ましい面において、時間は１０〜２４時間である。ある面において、インキュベーション時間は２４時間である。腫瘍組織または免疫不全状態個体から腫瘍浸潤性リンパ球(ＴＩＬ)を単離するような、他の細胞型と比較してＴ細胞が少ないあらゆる状況において、Ｔ細胞を単離するために長いインキュベーション時間が使用され得る。さらに、長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の捕獲効率を高め得る。それゆえに、単にＴ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと結合させる時間を短くするまたは長くするおよび／またはビーズ対Ｔ細胞比を増加または減少させる(さらにここに記載するとおり)ことにより、Ｔ細胞の亜集団が、培養開始時または工程中の他の時点で優先的に選択される。さらに、ビーズまたは他の表面上の抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体比を増加または減少させることにより、Ｔ細胞の亜集団が、培養開始時または工程中の他の時点で優先的に選択される。複数回の選択も本発明で使用できることを当業者は認識する。ある面において、選択過程を実施し、“未選択”細胞を活性化および増殖過程で使用することが望ましいことがある。“未選択”細胞もさらなる選択に付し得る。
陰性選択によるＴ細胞集団富化は、陰性に選択される細胞に独特な表面マーカーを指向する抗体の組み合わせにより達成できる。一つの方法は、陰性に選択される細胞に存在する細胞表面マーカーを指向するモノクローナル抗体のカクテルを使用する陰性磁気免疫粘着またはフローサイトメトリーによる細胞選別および／または選択である。例えば、陰性選択によりＣＤ４＋細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルは、一般にＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８に対する抗体を含む。ある面において、一般にＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋およびＦｏｘＰ３＋を発現する制御性Ｔ細胞について富化または陽性選択することが望ましいことがある。あるいは、ある面において、Ｔ制御性細胞を、抗Ｃ２５コンジュゲートビーズまたは他の類似選択法により枯渇させる。
ここに記載する方法は、例えば、ここに記載する、例えば、陰性選択技術を使用する、例えば、Ｔ制御性細胞枯渇集団、ＣＤ２５＋枯渇細胞である、免疫エフェクター細胞の特異的亜集団、例えば、Ｔ細胞の選択を含み得る。好ましくは、Ｔ制御性枯渇細胞の集団は３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含む。
ある態様において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋ Ｔ細胞を、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド、ＩＬ−２を使用して集団から除去する。ある態様において、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンドを、基質、例えば、ビーズにコンジュゲートするかまたは他に基質、例えば、ビーズ上に被覆させる。ある態様において、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントを、ここに記載の基質にコンジュゲートさせる。
ある態様において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋ Ｔ細胞を、MiltenyiＴＭからのＣＤ２５枯渇剤を使用して集団から除去する。ある態様において、細胞対ＣＤ２５枯渇剤の比は１ｅ７細胞対２０μLまたは１ｅ７細胞対１５μLまたは１ｅ７細胞対１０μLまたは１ｅ７細胞対５μLまたは１ｅ７細胞対２.５μLまたは１ｅ７細胞対１.２５μLである。ある態様において、例えば、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋枯渇のために、５億細胞／mlを使用する。さらなる面において、６億、７億、８億または９億細胞／mlの細胞濃度を使用する。
ある態様において、枯渇すべき免疫エフェクター細胞の集団は、約６×１０９ ＣＤ２５＋ Ｔ細胞を含む。他の面において、枯渇すべき免疫エフェクター細胞の集団は、約１×１０９〜１×１０１０(およびその間のいずれかの整数値)ＣＤ２５＋ Ｔ細胞を含む。ある態様において、得られたＴ制御性枯渇細胞集団は、２×１０９ Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞またはそれ以下(例えば、１×１０９、５×１０８、１×１０８、５×１０７、１×１０７またはそれ以下のＣＤ２５＋細胞)を含む。
ある態様において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞を、例えば、チュービング１６２−０１のような、枯渇チュービングセットと共にＣｌｉｎｉＭＡＣ系を使用して集団から除去する。ある態様において、ＣｌｉｎｉＭＡＣ系を、例えば、ＤＥＰＬＥＴＩＯＮ２.１のような、枯渇設定において動かす。
特定の理論に縛られることを望まないが、アフェレーシス前またはＣＡＲ発現細胞産物の製造中の対象における免疫細胞の負のレギュレーターのレベルの減少(例えば、望まない免疫細胞、例えば、ＴＲＥＧ細胞の数の減少)は、対象の再発リスクを減らし得る。例えば、ＴＲＥＧ細胞を枯渇する方法は当分野で知られる。例えば、ＴＲＥＧ細胞を減少させる方法は、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体(抗ＧＩＴＲここに記載する抗体)、ＣＤ２５枯渇およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
ある態様において、製造法は、ＣＡＲ発現細胞製造前のＴＲＥＧ細胞の数の減少(例えば、枯渇)を含む。例えば、製造法は、例えば、サンプル、例えば、アフェレーシスサンプルと抗ＧＩＴＲ抗体および／または抗ＣＤ２５抗体(またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド)を接触させ、ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)産物の製造前にＴＲＥＧ細胞を枯渇させることを含む。
ある態様において、対象は、ＣＡＲ発現細胞産物製造のための細胞採取前にＴＲＥＧ細胞を減らす１以上の治療で前処置されており、それにより対象がＣＡＲ発現細胞処置を再び必要とするリスクを軽減する。ある態様において、ある態様において、ＴＲＥＧ細胞を低減する方法は、対象へのシクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇またはこれらの組み合わせの１以上の投与を含むが、これらに限定されない。シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇またはこれらの組み合わせの１以上の投与は、ＣＡＲ発現細胞産物注入前、注入中または注入後に行い得る。
ある態様において、対象は、ＣＡＲ発現細胞産物製造のための細胞の採取前にシクロホスファミドで前処置され、それにより対象がＣＡＲ発現細胞処置を再発するリスクを軽減する。ある態様において、対象は、ＣＡＲ発現細胞産物製造のための細胞の採取前に抗ＧＩＴＲ抗体で前処置され、それにより対象がＣＡＲ発現細胞処置を再発するリスクを軽減する。
ある態様において、除去すべき細胞の集団は、制御性Ｔ細胞または腫瘍細胞ではなく、ＣＡＲＴ細胞の増殖および／または機能に他に負に影響する細胞、例えばＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ１５または潜在的免疫抑制性細胞により発現される他のマーカーを発現する細胞である。ある態様において、このような細胞は、制御性Ｔ細胞および／または腫瘍細胞と同時にまたは該枯渇後にまたは他の順序で除去することが意図される。
ここに記載する方法は、１を超える選択工程、例えば、１を超える枯渇工程を含み得る。陰性選択によるＴ細胞集団の富化は、例えば、陰性に選択される細胞に独特な表面マーカーを指向する抗体の組み合わせにより達成できる。一つの方法は、陰性に選択される細胞に存在する細胞表面マーカーを指向するモノクローナル抗体のカクテルを使用する、陰性磁気免疫付着またはフローサイトメトリーを経る細胞選別および／または選択である。例えば、陰性選択によりＣＤ４＋細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルはＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８に対する抗体を含み得る。
ここに記載する方法は、さらに腫瘍抗原、例えば、ＣＤ２５を含まない腫瘍抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂを発現する細胞の集団からの除去を含み、それによりＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲの発現に適するＴ制御性枯渇、例えば、ＣＤ２５＋枯渇および腫瘍抗原枯渇細胞の集団を提供する。ある態様において、腫瘍抗原発現細胞は、Ｔ制御性、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗腫瘍抗原抗体またはそのフラグメントを同じ基質、例えば、ビーズに結合でき、これを、細胞の除去に使用できまたは抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗腫瘍抗原抗体またはそのフラグメントを別のビーズに結合でき、その混合物を細胞の除去に使用できる。他の態様において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞の除去および腫瘍抗原発現細胞の除去は逐次的であり、例えば、いずれの順序で生じてもよい。
チェックポイント阻害剤、例えば、ここに記載するチェックポイント阻害剤を発現する細胞、例えば、ＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞およびＴＩＭ３＋細胞の１以上の集団からの除去を含み、それによりＴ制御性枯渇、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞およびチェックポイント阻害剤枯渇細胞、例えば、ＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋および／またはＴＩＭ３＋枯渇細胞の集団を提供する方法も提供される。代表的チェックポイント阻害剤は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータを含む。ある態様において、チェックポイント阻害剤発現細胞は、Ｔ制御性、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗チェックポイント阻害剤抗体またはそのフラグメントを同じビーズに結合でき、それを細胞の除去に使用できまたは抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗チェックポイント阻害剤抗体またはそのフラグメントを別のビーズに結合でき、その混合物を細胞の除去に使用できる。他の態様において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞の除去およびチェックポイント阻害剤発現細胞の除去は逐次的であり、例えば、いずれ順序の順序で生じてもよい。
ある態様において、Ｔ細胞ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、グランザイムＢおよびパーフォリンまたは他の適切な分子、例えば、他のサイトカインの１以上を発現するＴ細胞集団を選択できる。細胞発現についてスクリーニングする方法は、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／１２６７１２号に記載する方法により決定できる。
陽性または陰性選択により所望の細胞の集団を単離するために、細胞および表面(例えば、ビーズのような粒子)の濃度は変わり得る。ある面において、細胞とビーズの最大接触を確実にするために、ビーズと細胞を一緒に混合する体積を顕著に低下させる(例えば、細胞濃度を増加させる)ことが望まれ得る。例えば、ある面において、２０億細胞／mlの濃度を使用する。ある面において、１０億細胞／mlの濃度を使用する。さらなる面において、１億細胞／ml超を使用する。さらなる面において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万または５０００万細胞／mlの細胞濃度を使用する。さらなる面において、細胞の７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万または１億細胞／mlの濃度を使用する。さらなる面において、１億２５００万または１億５０００万細胞／mlの濃度を使用できる。
高濃度を使用して、細胞収率、細胞活性化および細胞増殖を増加できる。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞のような目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞のまたは多くの腫瘍細胞が存在するサンプル(例えば、白血病性血液、腫瘍組織など)からのより効率的な捕獲を可能にする。このような細胞集団は、治療的価値を有しており、取得することが望ましい。例えば、高濃度細胞の使用は、通常ＣＤ２８発現が弱いＣＤ８＋ Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。
関連する面において、低濃度の細胞を使用することが望ましいことがある。Ｔ細胞と表面(例えば、ビーズのような粒子)の混合物を顕著に希釈することにより、粒子と細胞の相互作用が最小化される。これは、粒子に結合する所望の抗原を高量で発現する細胞で選択する。例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、高レベルのＣＤ２８を発現し、希釈濃度でＣＤ８＋ Ｔ細胞より効率的に捕獲される。ある面において、使用する細胞の濃度は５×１０ｅ６／mlである。他の面において、使用する濃度は約１×１０５／ml〜１×１０６／mlおよびその間のいずれかの整数値であり得る。
他の面において、細胞を、種々の長さの時間、種々の速度で、２〜１０℃または室温でローテータでインキュベートし得る。
刺激のためのＴ細胞はまた洗浄工程後凍結させ得る。理論に縛られることを望まないが、凍結と続く解凍工程は、細胞集団から顆粒球およびある程度単球を除去することにより、より均一な産物を提供する。血漿および血小板を除去する洗浄工程後、細胞を凍結溶液に懸濁し得る。多くの凍結溶液およびパラメータが当分野で知られ、この状況において有用であるが、ある方法は、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミンを含むＰＢＳまたは１０％Ｄｅｘｔｒａｎ ４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンおよび７.５％ＤＭＳＯまたは３１.２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、３１.２５％デキストロース５％、０.４５％ＮａＣｌ、１０％Ｄｅｘｔｒａｎ ４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンおよび７.５％ＤＭＳＯを含む培養培地または例えば、ＨｅｓｐａｎおよびＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含む他の適当な細胞凍結媒体を使用し、次いで細胞を１°／分の速度で−８０℃に凍結し、気相の液体窒素貯蔵タンクに保存する制御凍結の他の方法ならびに直ぐに−２０℃または液体窒素の非制御凍結も使用できる。
ある面において、凍結保存細胞をここに記載するように解凍し、洗浄し、本発明の方法を使用する活性化の前に室温で１時間休息させる。
本発明の文脈においてまた意図されるのは、ここに記載する増殖させた細胞が必要したがって、増殖する細胞の供給源を、必要ないずれかの時点で採取でき、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞のような所望の細胞を、ここに記載するような細胞療法、例えば、Ｔ細胞療法により利益を得るあらゆる疾患または状態のための細胞療法、例えば、Ｔ細胞療法へのその後の使用のために単離および凍結できる。ある面において、血液サンプルまたはアフェレーシスを、一般に健常対象から採取する。ある面において、血液サンプルまたはアフェレーシスを、一般に、疾患を発症するリスクにあるが、まだ疾患を発症していない健常対象から採取し、目的の細胞をその後の使用のために単離および凍結する。ある面において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、その後の時点で増殖、凍結および使用し得る。ある面において、サンプルを、ここに記載する特定の疾患の診断の直後に、しかし、何らかの処置前に患者から採取する。さらなる面において、細胞を、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法剤、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレートおよびＦＫ５０６のような免疫抑制剤、抗体またはキャンパス、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８および照射のような他の免疫除去剤のような、手段での処置を含むが、これらに限定されないあらゆる関連する処置モダリティーの前に、対象からの血液サンプルまたはアフェレーシスから単離する。
本発明のさらなる面において、Ｔ細胞を、対象に機能的Ｔ細胞を残す処置の後、患者から直接得る。ある癌処置、特に免疫系を損傷させる薬物での処置後、処置の直後、患者が通常該処置から回復するまでの間、得られるＴ細胞の品質がエクスビボで増殖する能力について最適であるまたは改善されていることが観察されている。同様に、ここに記載する方法を使用するエクスビボ操作後、これらの細胞は、生着およびインビボ増殖について好ましい状態であり得る。それゆえに、本発明の状況において、Ｔ細胞、樹状細胞または造血細胞系譜の他の細胞を含む血液細胞をこの回復期に採取することが企図される。さらに、ある面において、可動化(例えば、ＧＭ−ＣＳＦでの可動化)およびコンディショニングレジメンを使用して、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生および／または増殖に好都合である条件を、特に、治療後の定められた時間枠中に、対象に形成できる。細胞型の例には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞および免疫系の他の細胞を含む。
ある態様において、免疫エフェクターＣＡＲ分子を発現する細胞、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子は、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤を受けた対象から得る。ある態様において、ＣＡＲを発現するように操作される免疫エフェクター細胞の集団、例えば、Ｔ細胞を、対象または対象から採取したＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞のレベルまたはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比が少なくとも一過性に増加するように、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投薬から十分な時間後または十分な用量の後に、採取する。
他の態様において、ＣＡＲを発現するように操作されているまたは操作する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の集団を、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の数を増やすまたはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比を増やす量のｍＴＯＲ阻害剤と接触させることにより、エクスビボで処理できる。
ある態様において、Ｔ細胞集団は、ジアシルグリセロールキナーゼ(ＤＧＫ)欠損である。ＤＧＫ欠損細胞は、ＤＧＫ ＲＮＡまたはタンパク質を発現しないかまたはＤＧＫ活性が低下したまたは阻害された細胞である。ＤＧＫ欠損細胞は、ＤＧＫ発現を低減または阻止するための遺伝的方法、例えば、ＲＮＡ干渉剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの投与により産生できる。あるいは、ＤＧＫ欠損細胞は、ここに記載するＤＧＫ阻害剤での処置により産生できる。
ある態様において、Ｔ細胞集団は、イカロス欠損である。イカロス欠損細胞は、イカロス ＲＮＡまたはタンパク質を発現しないかまたはイカロス活性が低下したまたは阻害された細胞を含み、イカロス欠損細胞は、イカロス発現を低減または阻止するための遺伝的方法、例えば、ＲＮＡ干渉剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの投与により産生できる。あるいは、イカロス欠損細胞は、イカロス阻害剤、例えば、レナリドマイドでの処置により産生できる。
ある態様において、Ｔ細胞集団は、ＤＧＫ欠損およびイカロス欠損であり、例えば、ＤＧＫおよびイカロスを発現せずまたはＤＧＫおよびイカロス活性が低下または阻害されている。このようなＤＧＫおよびイカロス欠損細胞は、ここに記載する方法のいずれかにより産生できる。
ある態様において、ＮＫ細胞を対象から得る。他の態様において、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞株、例えば、ＮＫ−９２細胞株(Conkwest)である。
同種異系ＣＡＲ
ここに記載するある態様において、免疫エフェクター細胞は、同種免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞であり得る。例えば、細胞は、同種Ｔ細胞、例えば、機能的Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)および／またはヒト白血球抗原(ＨＬＡ)、例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスIIの発現を欠く同種Ｔ細胞である。
機能的ＴＣＲを欠くＴ細胞は、例えば、その表面に何ら機能的ＴＣＲを発現しないように操作され、機能的ＴＣＲを含む１以上のサブユニットを発現しないように操作され(例えば、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＴＣＲガンマ、ＴＣＲデルタ、ＴＣＲイプシロンおよび／またはＴＣＲゼータの発現がない(または発現の減少を示す)ように操作される)またはその表面に微少の機能的ＴＣＲを産生するように操作され得る。あるいは、Ｔ細胞は、例えば、ＴＣＲのサブユニットの１以上の変異したまたは切断型の発現により、実質的に障害されたＴＣＲを発現する。用語“実質的に障害されたＴＣＲ”は、このＴＣＲが、宿主で有害な免疫反応を惹起しないことを意味する。
ここに記載するＴ細胞は、例えば、その表面に機能的ＨＬＡを発現しないように操作され得る。例えば、ここに記載するＴ細胞は、細胞表面発現ＨＬＡ、例えば、ＨＬＡクラス１および／またはＨＬＡクラスIIが下方制御されるように操作され得る。ある面において、ＨＬＡの下方制御は、ベータ−２ミクログロブリン(Ｂ２Ｍ)の発現の減少または排除を伴い得る。
ある態様において、Ｔ細胞は、機能的ＴＣＲおよび機能的ＨＬＡ、例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスIIを欠き得る。
機能的ＴＣＲおよび／またはＨＬＡの発現を欠く修飾Ｔ細胞は、ＴＣＲまたはＨＬＡの１以上のサブユニットのノックアウトまたはノックダウンを含む、いずれかの適当な手段により得ることができる。例えば、Ｔ細胞は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、群生性等間隔短回文反復配列(ＣＲＩＳＰＲ)転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を使用して、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡのノックダウンを含み得る。
ある態様において、同種細胞は、阻害分子を発現しないまたは低レベルで発現する細胞、例えばここに記載する方法のいずれかで操作した細胞であり得る。例えば、細胞は、例えば、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を低下できる、阻害分子を発現しないまたは阻害分子を低レベルで発現する細胞であり得る。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータを含む。ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルでの阻害による、阻害分子の阻害はＣＡＲ発現細胞性能を最適化できる。ある態様において、例えば、ここに記載する、阻害性核酸、例えば、阻害性核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、群生性等間隔短回文反復配列(ＣＲＩＳＰＲ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を使用できる。
ＴＣＲまたはＨＬＡを阻害するためのｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ
ある態様において、ＴＣＲ発現および／またはＨＬＡ発現を、Ｔ細胞におけるＴＣＲおよび／またはＨＬＡおよび／またはここに記載する阻害分子(例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータ)をコードする核酸を標的とするｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを使用して、阻害できる。
Ｔ細胞におけるｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの発現は、例えば、レンチウイルス発現系のような、いずれかの慣用の発現系を使用して達成できる。
ＴＣＲの要素の発現を下方制御する代表的ｓｈＲＮＡは、例えば、米国公開２０１２／０３２１６６７号に開示されている。ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスII遺伝子の発現を下方制御する代表的ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、例えば、米国公開ＵＳ２００７／００３６７７３号に開示されている。
ＴＣＲまたはＨＬＡを阻害するためのＣＲＩＳＰＲ
ここで使用する“ＣＲＩＳＰＲ”または“ＴＣＲおよび／またはＨＬＡに対するＣＲＩＳＰＲ”または“ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害するためのＣＲＩＳＰＲ”は、一連の群生性等間隔短回文反復配列またはこのような一連の反復を含む系をいう。ここで使用する“Ｃａｓ”は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をいう。“ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ”系は、ＴＣＲおよび／またはＨＬ遺伝子および／またはここに記載する阻害分子(例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータ)の発現抑制または変異に使用できる、ＣＲＩＳＰＲおよびＣａｓ由来の系をいう。
天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、配列決定された真正細菌ゲノムの約４０％および配列決定された古細菌の９０％に見られる。Grissa et al. (2007) BMC Bioinformatics 8: 172。この系は、プラスミドおよびファージのような外来遺伝的要素に対する抵抗性を付与する１種の原核生物免疫系であり、後天性免疫の形態を提供する。Barrangou et al. (2007) Science 315: 1709-1712; Marragini et al. (2008) Science 322: 1843-1845。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、マウスまたは霊長類のような真核生物における遺伝子エディティング(特定の遺伝子のサイレンシング、増強または変更)に使用するために修飾されている。Wiedenheft et al. (2012) Nature 482: 331-8。これは、真核細胞に、特別に設計したＣＲＩＳＰＲおよび１以上の適切なＣａｓを含むプラスミドを導入することにより達成される。
ＣＲＩＳＰＲ座位と呼ばれることもあるＣＲＩＳＰＲ配列は、交互の反復およびスペーサーを含む。天然に存在するＣＲＩＳＰＲにおいて、スペーサーは、通常細菌に対して外来であるプラスミドまたはファージ配列のような配列を含み、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系において、スペーサーはＴＣＲまたはＨＬＡ遺伝子配列に由来する。
ＣＲＩＳＰＲ座位からのＲＮＡは構成的に発現され、Ｃａｓタンパク質により小ＲＮＡに加工される。これらは、反復配列が隣接したスペーサーを含む。ＲＮＡは、他のＣａｓタンパク質を、ＲＮＡまたはＤＮＡレベルで外来性遺伝的要素に対して発現抑制するように導く。Horvath et al. (2010) Science 327: 167-170; Makarova et al. (2006) Biology Direct 1: 7。スペーサーは、それゆえに、ｓｉＲＮＡに類似して、ＲＮＡ分子の鋳型として働く。Pennisi (2013) Science 341: 833-836。
多くの異なるタイプの細菌で自然に生じるように、ＣＲＩＳＰＲの正確な配置および構造、Ｃａｓ遺伝子の機能および数およびそれらの産物は種毎にいくぶん異なる。Haft et al. (2005) PLoS Comput. Biol. 1: e60; Kunin et al. (2007) Genome Biol. 8: R61; Mojica et al. (2005) J. Mol. Evol. 60: 174-182; Bolotin et al. (2005) Microbiol. 151: 2551-2561; Pourcel et al. (2005) Microbiol. 151: 653-663; and Stern et al. (2010) Trends. Genet. 28: 335-340。例えば、Ｃｓｅ(Ｃａｓサブタイプ、大腸菌)タンパク質(例えば、ＣａｓＡ)は、機能的複合体、Ｃａｓｃａｄｅを形成し、これは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ転写物を、Ｃａｓｃａｄｅが保持するスペーサー−反復単位に加工する。Brouns et al. (2008) Science 321: 960-964。他の原核生物において、Ｃａｓ６は、ＣＲＩＳＰＲ転写物を加工する。大腸菌におけるＣＲＩＳＰＲベースのファージ不活性化はＣａｓｃａｄｅおよびＣａｓ３を必要とするが、Ｃａｓ１またはＣａｓ２を必要としない。パイロコッカス・フリオサスおよび他の原核生物におけるＣｍｒ(Ｃａｓ ＲＡＭＰモジュール)タンパク質は、小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと機能的複合体を形成し、これは相補的標的ＲＮＡを認識し、開裂する。より単純なＣＲＩＳＰＲ系は、二重らせんの各鎖のための２活性切断部位を有するヌクレアーゼであるタンパク質Ｃａｓ９を頼る。Ｃａｓ９と修飾ＣＲＩＳＰＲ座位ＲＮＡの組み合わせを、遺伝子エディティングのための系に使用できる。Pennisi (2013) Science 341: 833-836。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡ遺伝子を編集でき(塩基対の付加または欠失)または未成熟終止を導入でき、これは、そうしてＴＣＲおよび／またはＨＬＡの発現を減少させる。あるいはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を、ＲＮＡ干渉のように使用し、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡ遺伝子を可逆性形式でオフにできる。哺乳動物細胞において、例えば、ＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質をＴＣＲおよび／またはＨＬＡプロモーターに導くことができ、ＲＮＡポリメラーゼを立体的に遮断する。
当分野で知られるテクノロジー、例えば、米国公開２０１４００６８７９７号およびCong (2013) Science 339: 819-823に記載のものを使用して、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害する人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を産生できる。例えば、Tsai (2014) Nature Biotechnol., 32:6 569-576、米国特許８,８７１,４４５号；８,８６５,４０６号；８,７９５,９６５号；８,７７１,９４５号；および８,６９７,３５９号に記載されるもののような、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害する当分野で知られる他の人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系も産生できる。
ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害するためのＴＡＬＥＮ
“ＴＡＬＥＮ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲに対するＴＡＬＥＮ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するためのＴＡＬＥＮ”は、ＨＬＡおよび／またはＴＣＲ遺伝子および／またはここに記載する阻害分子(例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータ)の編集に使用できる人工ヌクレアーゼである、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼをいう。
ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ開裂ドメインを融合することにより人工的に産生される。転写アクティベーター様効果(ＴＡＬＥ)は、ＨＬＡまたはＴＣＲ遺伝子の部分を含む、いずれかの所望のＤＮＡ配列に結合するように操作できる。操作されたＴＡＬＥとＤＮＡ開裂ドメインを合わせることにより、ＨＬＡまたはＴＣＲ配列を含む、いずれかの所望のＤＮＡ配列に特異的な、制限酵素を産生できる。次いで、これらを細胞に導入でき、そこで、それらはゲノムエディティングのために使用され得る。Boch (2011) Nature Biotech. 29: 135-6;およびBoch et al. (2009) Science 326: 1509-12; Moscou et al. (2009) Science 326: 3501。
ＴＡＬＥは、ザントモナス細菌により分泌されるタンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインは、１２番目および１３番目のアミノ酸以外、反復した、高度に保存的３３〜３４アミノ酸配列を含む。これらの２箇所は高度に可変であり、特定のヌクレオチド認識と強い相関を示す。それらは、それゆえに、所望のＤＮＡ配列と結合するように操作され得る。
ＴＡＬＥＮを産生するために、ＴＡＬＥタンパク質を、野生型または変異ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼであるヌクレアーゼ(Ｎ)と融合する。ＴＡＬＥＮにおいて使用するために、ＦｏｋＩについていくつかの変異が行われており、これらは、例えば、開裂特異性または活性の改善を含む。Cermak et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39: e82; Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8; Hockemeyer et al. (2011) Nature Biotech. 29: 731-734; Wood et al. (2011) Science 333: 307; Doyon et al. (2010) Nature Methods 8: 74-79; Szczepek et al. (2007) Nature Biotech. 25: 786-793;およびGuo et al. (2010) J. Mol. Biol. 200: 96。
ＦｏｋＩドメインは、二量体として機能し、適切な配向および間隔を有する標的ゲノムにおける部位のための独特なＤＮＡ結合ドメインを有する２つの構築物を必要とする。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ開裂ドメインの間のアミノ酸残基数および２の個々のＴＡＬＥＮ結合部位の間の塩基数の両者が、高レベルの活性を達成するために重要なパラメータであると考えられる。Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8。
ＨＬＡまたはＴＣＲ ＴＡＬＥＮを細胞内で使用して、二重鎖切断(ＤＳＢ)を産生できる。変異は、修復機構が切断を非相同末端結合により不適切に修復するならば、切断部位に導入できる。例えば、不適切な修復は、フレームシフト変異を導入し得る。あるいは、外来ＤＮＡを、ＴＡＬＥＮと共に細胞に導入でき、外来ＤＮＡの配列および染色体配列により、この方法はＨＬＡまたはＴＣＲ遺伝子における欠損の補正またはｗｔ ＨＬＡまたはＴＣＲ遺伝子におけるこのような欠損の導入に使用でき、そうして、ＨＬＡまたはＴＣＲの発現を減少させる。
ＨＬＡまたはＴＣＲにおける配列に特異的なＴＡＬＥＮは、モジュラー要素を使用する多様なスキームを含む、当分野で知られるいずれかの方法を使用して構築できる。Zhang et al. (2011) Nature Biotech. 29: 149-53; Geibler et al. (2011) PLoS ONE 6: e19509。
ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するための亜鉛フィンガーヌクレアーゼ
“ＺＦＮ”または“亜鉛フィンガーヌクレアーゼ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲに対するＺＦＮ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するためのＺＦＮ”は、ＨＬＡおよび／またはＴＣＲ遺伝子および／またはここに記載する阻害分子(例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータ)の編集に使用できる人工ヌクレアーゼである、亜鉛フィンガーヌクレアーゼをいう。
ＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメインに融合したＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン(またはその誘導体)を含む。ＺＦＮの場合、ＤＮＡ結合ドメインは、１以上の亜鉛フィンガーを含む。Carroll et al. (2011) Genetics Society of America 188: 773-782;およびKim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-1160。
亜鉛フィンガーは、１以上の亜鉛イオンにより安定化される小タンパク質構造モチーフである。亜鉛フィンガーは、例えば、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２を含むことができ、約３bp配列を認識できる。既知特異性の多様な亜鉛フィンガーを合わせて、約６bp、９bp、１２bp、１５bpまたは１８bp配列を認識する多フィンガーポリペプチドを産生できる。ファージディスプレイ、酵母ワンハイブリッド系、細菌ワンハイブリッドおよびツーハイブリッド系および哺乳動物細胞を含む、特異的配列を認識する亜鉛フィンガー(およびそれらの組み合わせ)を産生するための多様な選択およびモジュラーアセンブリー技術が利用可能である。
ＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮは、ＤＮＡを開裂するために二量体化しなければならない。それゆえに、ＺＦＮの対が、非パリンドロームＤＮＡ部位を標的とすることが必要である。２つのそれぞれのＺＦＮは、そのヌクレアーゼが適切に離れて、ＤＮＡの逆の鎖に結合しなければならない。Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10570-5。
またＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮは、ＤＮＡに二重鎖切断を創製でき、これは、不適切に修復されたならばフレームシフト変異を創製でき、細胞におけるＨＬＡおよび／またはＴＣＲの発現および量の減少に至る。ＺＦＮはまた、ＨＬＡまたはＴＣＲ遺伝子における変異のために相同組換えと使用もできる。
ＨＬＡおよび／またはＴＣＲにおける配列に特異的なＺＦＮは、当分野で知られるいずれかの方法を使用して構築できる。例えば、Provasi (2011) Nature Med. 18: 807-815; Torikai (2013) Blood 122: 1341-1349; Cathomen et al. (2008) Mol. Ther. 16: 1200-7; Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 400: 96；米国特許公開２０１１／０１５８９５７号；および米国特許公開２０１２／００６０２３０号参照。
テロメラーゼ発現
何らかの特定の理論に縛られることを望まないが、ある態様において、治療的Ｔ細胞は、Ｔ細胞における短縮されたテロメアのために、患者における残留性が短く、したがって、テロメラーゼ遺伝子を用いるトランスフェクションは、Ｔ細胞のテロメアを延長し、患者におけるＴ細胞の残留性を改善し得る。Carl June, “Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic”, Journal of Clinical Investigation, 117:1466-1476 (2007)参照。それゆえに、ある態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞、異所性にテロメラーゼサブユニットを、例えば、テロメラーゼの触媒的サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴ発現する。ある面において、本開示は、細胞とテロメラーゼサブユニット、例えば、テロメラーゼの触媒的サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸を接触させることを含む、ＣＡＲ発現細胞を産生する方法を提供する。細胞を、ＣＡＲをコードする構築物と接触させる前に、同時にまたは後に核酸と接触させ得る。
ある面において、本開示は、免疫エフェクター細胞の集団(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を製造する方法に関する。ある態様において、本方法は、免疫エフェクター細胞の集団(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を提供し、免疫エフェクター細胞の集団とＣＡＲをコードする核酸を接触させ、そして、免疫エフェクター細胞の集団とテロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸を、ＣＡＲおよびテロメラーゼ発現を可能とする条件下に接触させることを含む。
ある態様において、テロメラーゼサブユニットをコードする核酸はＤＮＡである。ある態様において、テロメラーゼサブユニットをコードする核酸は、テロメラーゼサブユニットの発現を駆動できるプロモーターを含む。
ある態様において、ｈＴＥＲＴは、GenBank Protein ID AAC51724.1のアミノ酸配列を有し(Meyerson et al., “hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization” Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795)、次のとおりである。
MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRGCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD (配列番号157)
ある態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号１５７の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を有する。ある態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号１５７の配列を有する。ある態様において、ｈＴＥＲＴは、Ｎ末端、Ｃ末端または両方に欠失(例えば、５、１０、１５、２０または３０アミノ酸を超えない)を含む。ある態様において、ｈＴＥＲＴは、Ｎ末端、Ｃ末端または両方にトランスジェニックアミノ酸配列(例えば、５、１０、１５、２０または３０アミノ酸を超えない)を含む。
ある態様において、ｈＴＥＲＴは、GenBank Accession No. AF018167の核酸配列によりコードされる(Meyerson et al., “hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization” Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795)。
1 caggcagcgt ggtcctgctg cgcacgtggg aagccctggc cccggccacc cccgcgatgc
61 cgcgcgctcc ccgctgccga gccgtgcgct ccctgctgcg cagccactac cgcgaggtgc
121 tgccgctggc cacgttcgtg cggcgcctgg ggccccaggg ctggcggctg gtgcagcgcg
181 gggacccggc ggctttccgc gcgctggtgg cccagtgcct ggtgtgcgtg ccctgggacg
241 cacggccgcc ccccgccgcc ccctccttcc gccaggtgtc ctgcctgaag gagctggtgg
301 cccgagtgct gcagaggctg tgcgagcgcg gcgcgaagaa cgtgctggcc ttcggcttcg
361 cgctgctgga cggggcccgc gggggccccc ccgaggcctt caccaccagc gtgcgcagct
421 acctgcccaa cacggtgacc gacgcactgc gggggagcgg ggcgtggggg ctgctgttgc
481 gccgcgtggg cgacgacgtg ctggttcacc tgctggcacg ctgcgcgctc tttgtgctgg
541 tggctcccag ctgcgcctac caggtgtgcg ggccgccgct gtaccagctc ggcgctgcca
601 ctcaggcccg gcccccgcca cacgctagtg gaccccgaag gcgtctggga tgcgaacggg
661 cctggaacca tagcgtcagg gaggccgggg tccccctggg cctgccagcc ccgggtgcga
721 ggaggcgcgg gggcagtgcc agccgaagtc tgccgttgcc caagaggccc aggcgtggcg
781 ctgcccctga gccggagcgg acgcccgttg ggcaggggtc ctgggcccac ccgggcagga
841 cgcgtggacc gagtgaccgt ggtttctgtg tggtgtcacc tgccagaccc gccgaagaag
901 ccacctcttt ggagggtgcg ctctctggca cgcgccactc ccacccatcc gtgggccgcc
961 agcaccacgc gggcccccca tccacatcgc ggccaccacg tccctgggac acgccttgtc
1021 ccccggtgta cgccgagacc aagcacttcc tctactcctc aggcgacaag gagcagctgc
1081 ggccctcctt cctactcagc tctctgaggc ccagcctgac tggcgctcgg aggctcgtgg
1141 agaccatctt tctgggttcc aggccctgga tgccagggac tccccgcagg ttgccccgcc
1201 tgccccagcg ctactggcaa atgcggcccc tgtttctgga gctgcttggg aaccacgcgc
1261 agtgccccta cggggtgctc ctcaagacgc actgcccgct gcgagctgcg gtcaccccag
1321 cagccggtgt ctgtgcccgg gagaagcccc agggctctgt ggcggccccc gaggaggagg
1381 acacagaccc ccgtcgcctg gtgcagctgc tccgccagca cagcagcccc tggcaggtgt
1441 acggcttcgt gcgggcctgc ctgcgccggc tggtgccccc aggcctctgg ggctccaggc
1501 acaacgaacg ccgcttcctc aggaacacca agaagttcat ctccctgggg aagcatgcca
1561 agctctcgct gcaggagctg acgtggaaga tgagcgtgcg gggctgcgct tggctgcgca
1621 ggagcccagg ggttggctgt gttccggccg cagagcaccg tctgcgtgag gagatcctgg
1681 ccaagttcct gcactggctg atgagtgtgt acgtcgtcga gctgctcagg tctttctttt
1741 atgtcacgga gaccacgttt caaaagaaca ggctcttttt ctaccggaag agtgtctgga
1801 gcaagttgca aagcattgga atcagacagc acttgaagag ggtgcagctg cgggagctgt
1861 cggaagcaga ggtcaggcag catcgggaag ccaggcccgc cctgctgacg tccagactcc
1921 gcttcatccc caagcctgac gggctgcggc cgattgtgaa catggactac gtcgtgggag
1981 ccagaacgtt ccgcagagaa aagagggccg agcgtctcac ctcgagggtg aaggcactgt
2041 tcagcgtgct caactacgag cgggcgcggc gccccggcct cctgggcgcc tctgtgctgg
2101 gcctggacga tatccacagg gcctggcgca ccttcgtgct gcgtgtgcgg gcccaggacc
2161 cgccgcctga gctgtacttt gtcaaggtgg atgtgacggg cgcgtacgac accatccccc
2221 aggacaggct cacggaggtc atcgccagca tcatcaaacc ccagaacacg tactgcgtgc
2281 gtcggtatgc cgtggtccag aaggccgccc atgggcacgt ccgcaaggcc ttcaagagcc
2341 acgtctctac cttgacagac ctccagccgt acatgcgaca gttcgtggct cacctgcagg
2401 agaccagccc gctgagggat gccgtcgtca tcgagcagag ctcctccctg aatgaggcca
2461 gcagtggcct cttcgacgtc ttcctacgct tcatgtgcca ccacgccgtg cgcatcaggg
2521 gcaagtccta cgtccagtgc caggggatcc cgcagggctc catcctctcc acgctgctct
2581 gcagcctgtg ctacggcgac atggagaaca agctgtttgc ggggattcgg cgggacgggc
2641 tgctcctgcg tttggtggat gatttcttgt tggtgacacc tcacctcacc cacgcgaaaa
2701 ccttcctcag gaccctggtc cgaggtgtcc ctgagtatgg ctgcgtggtg aacttgcgga
2761 agacagtggt gaacttccct gtagaagacg aggccctggg tggcacggct tttgttcaga
2821 tgccggccca cggcctattc ccctggtgcg gcctgctgct ggatacccgg accctggagg
2881 tgcagagcga ctactccagc tatgcccgga cctccatcag agccagtctc accttcaacc
2941 gcggcttcaa ggctgggagg aacatgcgtc gcaaactctt tggggtcttg cggctgaagt
3001 gtcacagcct gtttctggat ttgcaggtga acagcctcca gacggtgtgc accaacatct
3061 acaagatcct cctgctgcag gcgtacaggt ttcacgcatg tgtgctgcag ctcccatttc
3121 atcagcaagt ttggaagaac cccacatttt tcctgcgcgt catctctgac acggcctccc
3181 tctgctactc catcctgaaa gccaagaacg cagggatgtc gctgggggcc aagggcgccg
3241 ccggccctct gccctccgag gccgtgcagt ggctgtgcca ccaagcattc ctgctcaagc
3301 tgactcgaca ccgtgtcacc tacgtgccac tcctggggtc actcaggaca gcccagacgc
3361 agctgagtcg gaagctcccg gggacgacgc tgactgccct ggaggccgca gccaacccgg
3421 cactgccctc agacttcaag accatcctgg actgatggcc acccgcccac agccaggccg
3481 agagcagaca ccagcagccc tgtcacgccg ggctctacgt cccagggagg gaggggcggc
3541 ccacacccag gcccgcaccg ctgggagtct gaggcctgag tgagtgtttg gccgaggcct
3601 gcatgtccgg ctgaaggctg agtgtccggc tgaggcctga gcgagtgtcc agccaagggc
3661 tgagtgtcca gcacacctgc cgtcttcact tccccacagg ctggcgctcg gctccacccc
3721 agggccagct tttcctcacc aggagcccgg cttccactcc ccacatagga atagtccatc
3781 cccagattcg ccattgttca cccctcgccc tgccctcctt tgccttccac ccccaccatc
3841 caggtggaga ccctgagaag gaccctggga gctctgggaa tttggagtga ccaaaggtgt
3901 gccctgtaca caggcgagga ccctgcacct ggatgggggt ccctgtgggt caaattgggg
3961 ggaggtgctg tgggagtaaa atactgaata tatgagtttt tcagttttga aaaaaaaaaa
4021 aaaaaaa (配列番号158)
ある態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号１５８の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６、９７％、９８％または９９％同一である配列を有する核酸によりコードされる。ある態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号１５８の核酸によりコードされる。
Ｔ細胞の活性化および増殖
Ｔ細胞は、例えば、米国特許６,３５２,６９４号；６,５３４,０５５号；６,９０５,６８０号；６,６９２,９６４号；５,８５８,３５８号；６,８８７,４６６号；６,９０５,６８１号；７,１４４,５７５号；７,０６７,３１８号；７,１７２,８６９号；７,２３２,５６６号；７,１７５,８４３号；５,８８３,２２３号；６,９０５,８７４号；６,７９７,５１４号；６,８６７,０４１号；および米国特許出願公開２００６０１２１００５号に記載する方法を使用して、一般的に活性化および増殖できる。
一般に、本発明のＴ細胞を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体結合シグナルを刺激する薬剤が結合したその表面とＴ細胞の表面上の共刺激性分子を刺激するリガンドを接触させることにより増殖できる。特に、Ｔ細胞集団は、表面上に固定された抗ＣＤ３抗体または抗原結合そのフラグメントまたは抗ＣＤ２抗体との接触またはカルシウムイオノフォアと組み合わせたタンパク質キナーゼＣアクティベーター(例えば、ブリオスタチン)との接触により、ここに記載するように刺激し得る。Ｔ細胞表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子と結合するリガンドを使用する。例えば、Ｔ細胞の集団を、Ｔ細胞の増殖刺激に適する条件下、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させ得る。ＣＤ４＋ Ｔ細胞またはＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を使用できる。抗ＣＤ２８抗体の例は９.３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８を含み(Diaclone, Besancon, France)、当分野で一般に知られる他の方法のように使用できる(Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999)。
ある面において、Ｔ細胞のための一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルは、異なるプロトコールにより提供し得る。例えば、例えば、各シグナルを提供する薬剤は溶液中でも、表面と結合していてよい。表面に結合しているとき、薬剤は同じ表面(すなわち、“ｃｉｓ”形態)または別の表面(すなわち、“ｔｒａｎｓ”形態)に結合し得る。あるいは、あるいは、一方の薬剤が表面に結合し、他方のが溶液にあってよい。ある面において、共刺激シグナルを提供する薬剤は細胞表面に結合し、一次活性化シグナルを提供する薬剤は溶液中であるかまたは表面と結合する。ある面において、両剤は溶液中にあり得る。ある面において、ある面において、薬剤は不溶性形態であり、Ｆｃ受容体または抗体または薬剤と結合する他の結合剤を発現する細胞のような表面に架橋され得る。この点に関して、例えば、本発明におけるＴ細胞の活性化および増殖のために意図される人工抗原提示細胞(ａＡＰＣ)について、米国特許出願公開２００４０１０１５１９号および２００６００３４８１０号を参照のこと。
ある面において、２剤は、ビーズに、同じビーズ、すなわち、“ｃｉｓ”または別のビーズ、すなわち、“ｔｒａｎｓ”で固定化される。例として、一次活性化シグナルを提供する薬剤は抗ＣＤ３抗体または抗原結合そのフラグメントであり、共刺激シグナルを提供する薬剤は抗ＣＤ２８抗体または抗原結合そのフラグメントであり、両剤が、等価な分子量で同じビーズに共固定化される。ある面において、ＣＤ４＋ Ｔ細胞増殖およびＴ細胞増殖のためのビーズに結合した１：１比の各抗体を使用する。本発明のある面において、１：１比を使用して観察された増殖と比較して、Ｔ細胞増殖の増殖が観察されるように、ビーズに結合した抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比を使用する。ある特定の面において、１：１比を使用して観察された増殖と比較して、約１〜約３倍増加が観察される。ある面において、ビーズに結合したＣＤ３：ＣＤ２８抗体比は１００：１〜１：１００およびその間の全ての整数値の範囲である。本発明のある面において、抗ＣＤ３抗体より多くの抗ＣＤ２８抗体が粒子に結合している、すなわち、ＣＤ３：ＣＤ２８比が１未満である。本発明のある面において、ビーズに結合した抗ＣＤ２８抗体対抗ＣＤ３抗体比は２：１より大きい。ある特定の面において、ビーズに結合した１：１００ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。ある面において、ビーズに結合した１：７５ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。さらなる面において、ビーズに結合した１：５０ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。ある面において、ビーズに結合した１：３０ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。ある好ましい面において、ビーズに結合した１：１０ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。ある面において、ビーズに結合した１：３ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。さらなる面において、ビーズに結合した３：１ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。
１：５００〜５００：１およびその間のいずれかの整数値の粒子対細胞比を、Ｔ細胞または他の標的細胞の刺激のために使用し得る。当業者には容易に認識され得るように、粒子対細胞比は、標的細胞に対する粒子径による。例えば、小さいサイズのビーズは少ない細胞しか結合できず、大きなビーズはたくさん結合できる。ある面において、細胞対粒子比は、１：１００〜１００：１およびその間のいずれかの整数値の範囲であり、さらなる面において１：９〜９：１およびその間のいずれかの整数値からなる比をＴ細胞刺激に使用し得る。Ｔ細胞刺激をもたらす抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８結合粒子対Ｔ細胞の比は、上記のように変わりうるが、しかしながらある好ましい値は１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１および１５：１を含み、一つの好ましい比は少なくとも１：１粒子対Ｔ細胞である。ある面において、１：１以下の粒子対細胞比を使用する。ある特定の面において、好ましい粒子：細胞比は１：５である。さらなる面において、粒子対細胞比は、刺激の日により変わり得る。例えば、ある面において、粒子対細胞比は、１日目は１：１〜１０：１であり、さらなる粒子をその後１０日目まで連日または隔日で細胞に添加し、最終比１：１〜１：１０である(添加の比の細胞数に基づく)。ある特定の面において、粒子対細胞比は刺激１日目に１：１であり、刺激３日目および５日目に１：５に調節する。ある面において、粒子を、１日目の１：１および刺激３日目および５日目の１：５の最終比に基づき、連日または隔日で添加する。ある面において、粒子対細胞比は、刺激１日目は２：１であり、刺激３日目および５日目に１：１０に調節する。ある面において、粒子を、１日目の１：１および３日目および５日目の１：１０の最終比に基づき、連日または隔日で添加する。当業者は、多様な他の比が本発明における使用に適し得ることを認識する。特に、比は、粒子径ならびに細胞サイズおよびタイプによる。ある面において、使用するための最も典型的な比は、１日目の１：１、２：１および３：１付近である。
本発明のさらなる面において、Ｔ細胞のような細胞を、薬剤被覆ビーズと組み合わせ、ビーズおよび細胞をその後分離し、次いで細胞を培養する。異なる面において、培養前に、薬剤被覆ビーズおよび細胞を分離するが、一緒に培養する。さらなる面において、ビーズおよび細胞を、磁気力のような力の適用によりまず濃縮し、細胞表面マーカーのライゲーションを増加させ、それにより細胞刺激を誘導する。
例として、細胞表面タンパク質を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８が結合した常磁性ビーズ(３ｘ２８ビーズ)とＴ細胞を接触させることにより、ライゲートし得る。ある面において、細胞(例えば、１０４〜１０９ Ｔ細胞)およびビーズ(例えば、ＤＹＮＡビーズＳ(登録商標)Ｍ−４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ常磁性ビーズを１：１比)を、緩衝液、例えばＰＢＳ(カルシウムおよびマグネシウムのような二価カチオン不含)中で合わせる。再び、いずれかの細胞濃度を使用し得ることは当業者には容易に認識され得る。例えば、標的細胞は、サンプル中に極めて稀であり、サンプルの０.０１％しか含まれないかまたはサンプル全体(すなわち、１００％)が目的の標的細胞で構成され得る。したがって、あらゆる細胞数が本発明の状況と一体となる。ある面において、細胞と粒子の最大接触を確実にするために、粒子および細胞を混合する体積を顕著に減少させる(すなわち、細胞の濃度を高める)ことが望ましいことがある。例えば、ある面において、約１００億細胞／ml、９０億／ml、８０億／ml、７０億／ml、６０億／ml、５０億／mlまたは２０億細胞／mlの濃度を使用する。ある面において、１億細胞／ml超を使用する。さらなる面において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万または５０００万細胞／mlの細胞濃度を使用する。さらなる面において、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万または１億細胞／mlの細胞濃度を使用する。さらなる面において、１億２５００万または１億５０００万細胞／mlをの濃度使用できる。高濃度を使用して、細胞収率、細胞活性化および細胞増殖を増加できる。さらに、高細胞濃度の使用はＣＤ２８陰性Ｔ細胞のような目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞のより効率的な捕獲を可能にする。このような細胞の集団は、治療的価値を有し得て、得ることが望まれる。例えば、高濃度の細胞の使用は、通常ＣＤ２８発現が弱いＣＤ８＋ Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。
ある態様において、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸が形質導入された細胞を、例えば、ここに記載する方法により増殖する。ある態様において、細胞を、数時間(例えば、約２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、１８時間、２１時間)〜約１４日(例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日または１４日)の期間の培養により増殖する。ある態様において、細胞は、４〜９日の期間増殖される。ある態様において、細胞は、８日以下、例えば、７日、６日または５日の期間増殖される。ある態様において、細胞、例えば、ここに記載するＣＤ３３ ＣＡＲ細胞は、５日の培養により増殖され、得られた細胞は、同じ培養条件で、９日間培養で増殖された同じ細胞よりも強力である。効力は、例えば、多様なＴ細胞機能、例えば増殖、標的細胞死、サイトカイン産生、活性化、遊走またはそれらの組み合わせにより規定され得る。ある態様において、５日増殖された細胞、例えば、ここに記載するＣＤ３３ ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下に９日間培養で増殖された同じ細胞と比較して、抗原刺激による細胞倍加の少なくとも１倍、２倍、３倍または４倍増加を示す。ある態様において、細胞、例えば、ここに記載するＣＤ３３ ＣＡＲを発現する細胞は、５日の培養により増殖され、得られた細胞は、同じ培養条件下に９日間培養で増殖された同じ細胞と比較して、高い炎症誘発性サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルを示す。ある態様において、５日増殖された細胞、例えば、ここに記載するＣＤ３３ ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下に９日間培養で増殖された同じ細胞と比較して、炎症誘発性サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルのｐｇ／mlで、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍またはそれ以上増加する。
本発明のある面において、混合物を、数時間(約３時間)〜約１４日またはその間のいずれかの時間的整数値、培養してよい。ある面において、混合物を２１日培養し得る。本発明のある面において、ビーズおよびＴ細胞を一緒に約８日培養する。ある面において、ビーズおよびＴ細胞を一緒に２〜３日培養する。Ｔ細胞の培養期間が６０日以上となるような、数サイクルの刺激も望まれ得る。Ｔ細胞培養に適する条件は、血清(例えば、胎児ウシまたはヒト血清)、インターロイキン−２(ＩＬ−２)、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβおよびＴＮＦ−αまたは当業者に知られる細胞増殖のためのいずれかの他の添加剤を含む、増殖および生存能に必要な因子を含み得る、適切な培地(例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０またはＸ−ｖｉｖｏ １５(Lonza))を含む。細胞の増殖のための他の添加剤は、界面活性剤、プラスマネートおよびＮ−アセチル−システインおよび２−メルカプトエタノールのような還元剤を含むが、これらに限定されない。培地は、無血清または適切な量の血清(または血漿)が添加されたまたは規定されたセットのホルモンおよび／またはＴ細胞の増殖および拡大に十分な量のサイトカインが添加されたＲＰＭＩ １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ １５およびＸ−Ｖｉｖｏ ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを含み得る。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは実験的培養においてのみ包含され、対象に注入すべき細胞の培養には含まれない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件、例えば、適切な温度(例えば、３７℃)および雰囲気(例えば、空気＋５％ＣＯ２)で維持される。
ある態様において、細胞は、例えば、フローサイトメトリーのようなここに記載する方法により測定して、１４日の増殖期間にわたり、細胞の少なくとも２００倍(例えば、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍)増加をもたらす１以上のインターロイキンを含む、適切な培地(例えば、ここに記載する培地)で増殖させる。ある態様において、細胞は、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７(例えば、ＩＬ−１５およびＩＬ−７)の存在下増殖させる。
ある態様において、ここに記載する方法、例えば、ＣＡＲ発現細胞製造法は、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋ Ｔ細胞を、例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド、ＩＬ−２を使用して、細胞集団から除去することを含む。細胞集団からＴ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋ Ｔ細胞を除去する方法は、ここに記載される。ある態様において、方法、例えば、製造法は、さらに細胞集団(例えば、ＣＤ２５＋ Ｔ細胞のようなＴ制御性細胞が枯渇されている細胞集団；または抗ＣＤ２５抗体、そのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンドと前に接触された細胞集団)とＩＬ−１５および／またはＩＬ−７の接触を含む。例えば、細胞集団(例えば、抗ＣＤ２５抗体、そのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンドと先に接触されている)を、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７の存在下で増殖させる。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、インターロイキン−１５(ＩＬ−１５)ポリペプチド、インターロイキン−１５受容体アルファ(ＩＬ−１５Ｒａ)ポリペプチドまたはＩＬ−１５ポリペプチドとＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの組み合わせ、例えば、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物を、ＣＡＲ発現細胞の製造中、例えば、エクスビボで接触させることを含む。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲ発現細胞の製造中、例えば、エクスビボで、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む組成物と接触させる。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲ発現細胞の製造中、例えば、エクスビボで、ＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両者の組合せを含む組成物と接触させる。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲ発現細胞の製造中、例えば、エクスビボで、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と接触させる。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、エクスビボ増殖中、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と接触させる。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、エクスビボ増殖中、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む組成物と接触させる。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、エクスビボ増殖中、ＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両者を含む組成物と接触させる。ある態様において、接触は、リンパ球亜集団、例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の生存および増殖をもたらす。
種々の刺激時間に曝されているＴ細胞は、異なる特徴を示し得る。例えば、典型的な血液またはアフェレーシスした末梢血単核細胞産物は、細胞毒性またはサプレッサーＴ細胞集団(ＴＣ、ＣＤ８＋)より大きいヘルパーＴ細胞集団(ＴＨ、ＣＤ４＋)を有する。ＣＤ３およびＣＤ２８受容体での刺激によるＴ細胞のエクスビボ増殖は、約８〜９日目前まで主にＴＨ細胞からなるＴ細胞の集団を産生するが、約８〜９日目後、Ｔ細胞の集団は、徐々に大きくなるＴＣ細胞の集団を含む。したがって、処置の目的によって、対象に、主にＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を注入することは有利であり得る。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットが単離されているならば、このサブセットを大きな程度まで増殖させることが有利であり得る。
さらに、ＣＤ４およびＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーは、細胞増殖過程の経過中に、顕著に、しかし大部分、再現性よく変化する。そうして、このような再現性は、特定の目的のために活性化Ｔ細胞産物をあつらえる能力を可能とする。
ＣＤ３３ ＣＡＲが構築されたら、適切なインビトロおよび動物モデルにおける抗原刺激後にＴ細胞を増殖させる能力、再刺激の非存在下でのＴ細胞増殖の持続および抗癌活性のような、しかしこれらに限定されない分子の活性を評価するために、種々のアッセイが使用され得る。ＣＤ３３ ＣＡＲの効果を評価するためのアッセイは、下にさらに詳細に記載する。
初代Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現のウェスタンブロット分析を、単量体および二量体の存在を検出するために使用できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。極めて簡潔には、ＣＡＲを発現するＴ細胞(ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の１：１混合物)をインビトロで１０日超増殖させ、続いて溶解および還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う。完全長ＴＣＲ−ζ細胞質ドメインおよび内因性ＴＣＲ−ζ鎖を含むＣＡＲを、ＴＣＲ−ζ鎖に対する抗体を使用するウェスタンブロッティングにより検出する。同じＴ細胞サブセットを、共有結合性二量体形成の評価を可能とするために非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に使用する。
抗原刺激後のＣＡＲ＋ Ｔ細胞のインビトロ増殖を、フローサイトメトリーにより測定できる。例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の混合物をαＣＤ３／αＣＤ２８ ａＡＰＣで刺激し、続いて分析すべきプロモーターの制御下に、ＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターで形質導入する。代表的プロモーターは、ＣＭＶ ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣまたはホスホグリセロキナーゼ(ＰＧＫ)プロモーターを含む。ＧＦＰ蛍光を、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞サブセットの培養６日目に、フローサイトメトリーにより評価する。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。あるいは、ＣＤ４＋とＣＤ８＋ Ｔ細胞の混合物を、０日目にαＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズで刺激し、２Ａリボソームスキッピング配列を使用するＣＡＲとｅＧＦＰを発現するバイシストロニックレンチウイルスベクターを使用して、１日目にＣＡＲを形質導入する。培養物を、洗浄後、ＣＤ１９＋ Ｋ５６２細胞(Ｋ５６２−ＣＤ１９)、野生型Ｋ５６２細胞(Ｋ５６２野生型)または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体存在下ｈＣＤ３２および４−１ＢＢＬを発現するＫ５６２細胞(Ｋ５６２−ＢＢＬ−３／２８)で、再刺激する。外来性ＩＬ−２を、１００ＩＵ／mlを隔日で培養物に添加する。ＧＦＰ＋ Ｔ細胞を、ビーズベースの計数を使用するフローサイトメトリーにより数える。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。類似アッセイを、抗ＣＤ１２３ Ｔ細胞(例えばGill et al Blood 2014;123:2343参照)または抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞を用いて実施できる。
再刺激非存在下の持続するＣＡＲ＋ Ｔ細胞増殖も測定できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。簡潔には、平均Ｔ細胞体積(ｆｌ)を、０日目のαＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズでの刺激および１日目の記載するＣＡＲの形質導入後、培養８日目にCoulter Multisizer III粒子カウンター、Nexcelom Cellometer VisionまたはMillipore Scepterを使用して測定する。
動物モデルも、ＣＡＲＴ活性の測定に使用できる。例えば、免疫欠損マウスにおける初代ヒトプレＢ ＡＬＬを処置するための、ヒトＣＤ１９特異的ＣＡＲ＋ Ｔ細胞を使用する異種移植モデルを使用できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。極めて簡潔には、ＡＬＬ確立後、マウスを処置群に無作為化する。αＣＤ１９−ζおよびαＣＤ１９−ＢＢ−ζ操作Ｔ細胞の異なる数を、１：１の等量比でＢ−ＡＬＬを担持するＮＯＤ−ＳＣＩＤ−γ-/-マウスに共注射する。マウスからの脾臓ＤＮＡにおけるαＣＤ１９−ζおよびαＣＤ１９−ＢＢ−ζベクターのコピー数をＴ細胞注射注射後種々の時点で評価する。動物を、１週間間隔で白血病について評価する。末梢血ＣＤ１９＋ Ｂ−ＡＬＬ芽細胞数を、αＣＤ１９−ζ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞または偽形質導入Ｔ細胞を注射したマウスで測定する。ログランク検定を使用して、群の生存曲線を比較する。さらに、ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−γ-/-マウスへのＴ細胞注射４週間後の絶対的末梢血ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞数も分析する。マウスに、白血病性細胞を注射し、３週間後、ｅＧＦＰに連結したＣＡＲをコードするバイシストロニックレンチウイルスベクターによりＣＡＲを発現するように操作されたＴ細胞を注射する。Ｔ細胞を、注入ＧＦＰ＋ Ｔ細胞の４５〜５０％に、注射前に偽形質導入細胞と混合することにより標準化し、フローサイトメトリーにより確認する。動物を、１週間間隔で白血病について評価する。ＣＡＲ＋ Ｔ細胞群の生存曲線を、ログランク検定を使用して比較する。類似の実験をＣＤ３３ ＣＡＲＴで実施できる。
用量依存的ＣＡＲ処置応答を評価できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。例えば、２１日目にＣＡＲ Ｔ細胞、等しい数の偽形質導入Ｔ細胞で処置したまたはＴ細胞処置なしの、マウスにおいて白血病が確立した後３５〜７０日後に、末梢血を得る。各群からのマウスを、末梢血ＣＤ１９＋ ＡＬＬ芽細胞数の決定のために無作為に採血し、３５日目および４９日目に殺す。残りの動物を５７日目および７０日目に評価する。類似の実験をＣＤ３３ ＣＡＲＴで実施できる。
細胞増殖およびサイトカイン産生の評価は、先に、例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)に記載されている。簡潔には、ＣＡＲ介在増殖の評価を、洗浄したＴ細胞と、ＣＤ１９(Ｋ１９)またはＣＤ３２およびＣＤ１３７(ＫＴ３２−ＢＢＬ)を発現するＫ５６２細胞と、最終Ｔ細胞：Ｋ５６２比２：１で混合することによりマイクロタイタープレートにおいて実施する。Ｋ５６２細胞を、使用前にガンマ線で照射する。抗ＣＤ３(クローンＯＫＴ３)および抗ＣＤ２８(クローン９.３)モノクローナル抗体を、これらのシグナルがエクスビボでの長期ＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖を支持するため、刺激Ｔ細胞増殖について陽性対照として役立つＫＴ３２−ＢＢＬ細胞の培養物に添加する。Ｔ細胞を、製造者による記載のとおり、CountbrightＴＭ蛍光ビーズ(Invitrogen, Carlsbad, CA)およびフローサイトメトリーを使用して、培養において数える。ＣＡＲ＋ Ｔ細胞を、ｅＧＦＰ−２Ａ連結ＣＡＲ発現レンチウイルスベクターで操作されたＴ細胞を使用するＧＦＰ発現により同定する。ＧＦＰを発現しないＣＡＲ＋ Ｔ細胞について、ＣＡＲ＋ Ｔ細胞を、ビオチニル化組み換えＣＤ３３タンパク質および二次アビジン−ＰＥコンジュゲートにより検出する。Ｔ細胞のＣＤ４＋およびＣＤ８＋発現も、特異的モノクローナル抗体(BD Biosciences)を使用して同時に検出する。サイトカイン測定を、製造業者の指示に従いヒトＴＨ１／ＴＨ２サイトカイン細胞数測定ビーズアレイキット(BD Biosciences, San Diego, CA)を使用して再刺激２４時間後に回収した上清でまたはLuminex 30-plexキット(Invitrogen)を使用して実施する。蛍光をBD Fortessaフローサイトメーターを使用して評価し、データを製造業者の指示に従い分析する。類似の実験をＣＤ３３ ＣＡＲＴで実施できる。
細胞毒性を、標準的５１Ｃｒ放出アッセイにより評価できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。簡潔には、標的細胞(Ｋ５６２株および初代プロＢ−ＡＬＬ細胞)に、５１Ｃｒ(ＮａＣｒＯ４として、New England Nuclear, Boston, MA)を、３７℃で２時間、頻繁に撹拌しながら充填し、完全ＲＰＭＩで２回洗浄し、マイクロタイタープレートに播種する。エフェクターＴ細胞を、ウェル中で完全ＲＰＭＩ中、標的細胞と種々のエフェクター細胞：標的細胞(Ｅ：Ｔ)比で混合する。さらなる培地のみ(自発的放出、ＳＲ)またはｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００洗剤１％溶液(全放出、ＴＲ)を含むウェルも調製する。３７℃で４時間のインキュベーション後、各ウェルから上清を回収する。放出された５１Ｃｒを、次いでガンマ粒子カウンター(Packard Instrument Co., Waltham, MA)を使用して測定する。各条件を少なくとも３回行い、溶解のパーセントを式：溶解％＝(ＥＲ−ＳＲ)／(ＴＲ−ＳＲ)(式中、ＥＲは各実験条件で放出された平均５１Ｃｒを示す)を使用して計算する。
造影テクノロジーを使用して、腫瘍担持動物モデルにおけるＣＡＲの特異的輸送および増殖を評価できる。このようなアッセイは、例えば、Barrett et al., Human Gene Therapy 22:1575-1586 (2011)に記載されている。簡潔には、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ−／−(ＮＳＧ)マウスに、Ｎａｌｍ−６細胞をＩＶ注射し、７日後ＣＡＲ構築物でエレクトロポレーション４時間後Ｔ細胞を注射する。Ｔ細胞は、ホタルルシフェラーゼを発現するようにレンチウイルス構築物で安定にトランスフェクトされ、マウスをバイオルミネセンスについて造影する。あるいは、Ｎａｌｍ−６異種移植モデルにおけるＣＡＲ＋ Ｔ細胞の単回注射の治療有効性および特異性を、次のように測定できる。ＮＳＧマウスに、ホタルルシフェラーゼを安定に発現するように形質導入したＮａｌｍ−６を注射し、続いて７日後にＣＤ３３ ＣＡＲで電気穿孔したＴ細胞を１回尾静脈注射する。動物を、注射後種々の時点で造影する。例えば、５日目(処置２日前)および８日目(ＣＡＲ＋ ＰＢＬ後２４時間)に、代表的マウスにおけるホタルルシフェラーゼ陽性白血病の光子密度ヒートマップを作成できる。ここでの実施例部分に記載のものならびに当分野で知られるものを含む、他のアッセイも、本発明のＣＤ３３ ＣＡＲ構築物の評価に使用できる。
ここに開示する方法の代わりにまたはこれと組み合わせて、ＣＡＲリガンドの使用を含む、ＣＡＲ発現細胞(例えば、インビトロまたはインビボ(例えば、臨床モニタリング))、免疫細胞増殖および／または活性化および／またはＣＡＲ特異的選択の１以上の検出および／または定量のための方法および組成物が開示される。一つの例示的態様において、ＣＡＲリガンドは、ＣＡＲ分子に結合する、例えば、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインに結合する抗体である(例えば、抗原結合ドメインに結合する抗体、例えば、抗イディオタイプ抗体；または細胞外結合ドメインの定常領域に結合する抗体)。他の態様において、ＣＡＲリガンドは、ＣＡＲ抗原分子である(例えば、ここに記載のような)。
ある面において、ＣＡＲ発現細胞を検出および／または定量する方法が開示される。例えば、ＣＡＲリガンドは、インビトロまたはインビボでＣＡＲ発現細胞の検出および／または定量に使用できる(例えば、患者におけるＣＡＲ発現細胞の臨床モニタリングまたは患者への投薬)。方法は、
ＣＡＲリガンド(場合により、標識ＣＡＲリガンド、例えば、タグ、ビーズ、放射活性または蛍光標識を含むＣＡＲリガンド)を提供し；
ＣＡＲ発現細胞を獲得し(例えば、製造サンプルまたは臨床サンプルのようなＣＡＲ発現細胞含有サンプルの獲得)；
ＣＡＲ発現細胞とＣＡＲリガンドを、結合が生じる条件下で接触させ、それにより、存在するＣＡＲ発現細胞のレベル(例えば、量)を検出することを含む。ＣＡＲ発現細胞とＣＡＲリガンドの結合は、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡなどのような標準技術を使用して検出できる。
他の面において、増殖および／または活性化細胞(例えば、免疫エフェクター細胞)を増殖する方法が開示される。方法は、
ＣＡＲ発現細胞(例えば、第一ＣＡＲ発現細胞または一過性に発現されるＣＡＲ細胞)を提供し)；
該ＣＡＲ発現細胞とＣＡＲリガンド、例えば、ここに記載するようなＣＡＲリガンドを、免疫細胞拡張および／または増殖が生じる条件下で接触させ、それにより、活性化および／または増殖集団を産生することを含む。
ある態様において、ＣＡＲリガンドは存在する(例えば、基質、例えば、天然に存在しない基質に固定化または結合される)。ある態様において、基質は、非細胞基質である。非細胞基質は、例えば、プレート(例えば、マイクロタイタープレート)、膜(例えば、ニトロセルロース膜)、マトリックス、チップまたはビーズから選択される固体支持体であり得る。ある態様において、ＣＡＲリガンドは、基質に存在する(例えば、基質表面上)。ＣＡＲリガンドを、基質に共有非共有(例えば、架橋)により固定、結合または会合させ得る。ある態様において、ＣＡＲリガンドは、ビーズに結合(例えば、共有結合)する。前記態様において、免疫細胞集団をインビトロまたはエクスビボで増殖できる。方法は、さらに、例えば、ここに記載する方法のいずれかを使用して、ＣＡＲ分子のリガンド存在下、免疫細胞の集団を培養することをさらに含む。
他の態様において、細胞を増殖および／または活性化する方法は、さらに第二刺激性分子、例えば、ＣＤ２８の添加を含む。例えば、ＣＡＲリガンドおよび第二刺激性分子を基質、例えば、１以上のビーズに固定し、それにより細胞増殖および／または活性化を増加させ得る。
さらに他の面において、ＣＡＲ発現細胞を選択または富化する方法を提供する。方法は、ＣＡＲ発現細胞とここに記載のようなＣＡＲリガンドを接触させ、ＣＡＲリガンドの結合に基づき細胞を選択することを含む。
さらに他の態様において、ＣＡＲ発現細胞を枯渇、減少および／または死滅する方法が提供される。方法は、ＣＡＲ発現細胞とここに記載するようなＣＡＲリガンドを接触させ；そして細胞を、ＣＡＲリガンドの結合に基づきターゲティングし、それによりＣＡＲ発現細胞の数を減らすおよび／または殺すことを含む。ある態様において、ＣＡＲリガンドは、毒性剤と結合する(例えば、トキシンまたは細胞除去剤)。他の態様において、抗イディオタイプ抗体は、エフェクター細胞活性、例えば、ＡＤＣＣまたはＡＤＣ活性を生じ得る。
ここに開示する方法において使用できる抗ＣＡＲ抗体の例は、例えば、ＷＯ２０１４／１９０２７３号およびJena et al., “Chimeric Antigen Receptor (CAR)-Specific Monoclonal Antibody to Detect CD19-Specific T cells in Clinical Trials”, PLOS March 2013 8:3 e57838に記載され、その内容を引用により本明細書に包含させる。ある態様において、抗イディオタイプ抗体分子は、抗ＣＤ１９抗体分子、例えば、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖを認識する。例えば、抗イディオタイプ抗体分子は、Jena et al., PLOS March 2013 8:3 e57838に記載のＣＤ１９特異的ＣＡＲ ｍＡｂクローン番号１３６.２０.１と結合について競合でき；ＣＤ１９特異的ＣＡＲ ｍＡｂクローン番号１３６.２０.１と同じＣＤＲ(例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義またはＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ定義の組合せを使用して１以上の、例えば、全ての、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＣＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３)を有し得て；ＣＤ１９特異的ＣＡＲ ｍＡｂクローン番号１３６.２０.１のような１以上の(例えば、２)可変領域を有し得るかまたはＣＤ１９特異的ＣＡＲ ｍＡｂクローン番号１３６.２０.１を含み得る。ある態様において、抗イディオタイプ抗体は、Jena et al.に記載の方法により製造した。他の態様において、抗イディオタイプ抗体分子は、ＷＯ２０１４／１９０２７３号に記載の抗イディオタイプ抗体分子である。ある態様において、抗イディオタイプ抗体分子は、１３６.２０.１のようなＷＯ２０１４／１９０２７３号に記載の抗体分子と同じＣＤＲ(例えば、１以上の、例えば、全ての、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＣＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３)を有し；ＷＯ２０１４／１９０２７３号の抗体分子の１以上の(例えば、２)可変領域を有してよくまたは１３６.２０.１のようなＷＯ２０１４／１９０２７３号に記載の抗体分子を含み得る。他の態様において、抗ＣＡＲ抗体は、例えば、ＷＯ２０１４／１９０２７３号に記載のようなＣＡＲ分子の細胞外結合ドメインの定常領域に結合する。ある態様において、抗ＣＡＲ抗体は、ＣＡＲ分子の細胞外結合ドメインの定常領域、例えば、重鎖定常領域(例えば、ＣＨ２−ＣＨ３ヒンジ領域)または軽鎖定常領域に結合する。例えば、ある態様において、抗ＣＡＲ抗体は、ＷＯ２０１４／１９０２７３号に記載の２Ｄ３モノクローナル抗体と結合について競合し、２Ｄ３と同じＣＤＲ(例えば、１以上の、例えば、全ての、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＣＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３)を有しまたは２Ｄ３の１以上の(例えば、２)可変領域を有しまたはＷＯ２０１４／１９０２７３に記載のような２Ｄ３を含む。
ある面および態様において、ここでの組成物および方法は、例えば、その全体を引用により本明細書に包含させる、２０１４年７月３１日出願の米国特許出願号に記載のような、Ｔ細胞の特定のサブセットのために最適化される。ある態様において、Ｔ細胞の最適化サブセットは、対照Ｔ細胞、例えば、同じ構築物を発現する異なるタイプ(例えば、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋)のＴ細胞と比較して、残留性の増強を示す。
ある態様において、ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、ここに記載するＣＡＲを含み、当該ＣＡＲは、ＣＤ４＋ Ｔ細胞に適する(例えば、最適化、例えば、残留性の増強に至る)細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＩＣＯＳドメインを含む。ある態様において、ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ここに記載するＣＡＲを含み、当該ＣＡＲは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞に適する(例えば、最適化、例えば、残留性の増強に至る)細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン、ＣＤ２８ドメインまたはＩＣＯＳドメイン以外の共刺激ドメインを含む。ある態様において、ここに記載するＣＡＲは、ここに記載する抗原結合ドメイン、例えば、ＣＤ３３を標的とする抗原結合ドメインを含むＣＡＲ、例えば、表２のＣＡＲまたは配列番号１４０のアミノ酸配列を有するＣＡＲまたは配列番号１４７のアミノ酸配列を含む抗原結合ドメインを含む。
ある面において、ここに記載するのは、対象、例えば、癌を有する対象を処置する方法である。方法は、該対象に、有効量の：
１)抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載する抗原結合ドメイン、例えば、ＣＤ３３を標的とする抗原結合ドメイン、例えば、表２または９の抗原結合ドメインまたは配列番号１４０または１４７のアミノ酸配列を含む抗原結合ドメイン；
膜貫通ドメインおよび
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、第一共刺激ドメイン、例えば、ＩＣＯＳドメイン
を含むＣＡＲを含むＣＤ４＋ Ｔ細胞(ＣＡＲＣＤ４＋)：
および
２)抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載する抗原結合ドメイン、例えば、ＣＤ３３を標的とする抗原結合ドメイン、例えば、表２または９の抗原結合ドメインまたは配列番号１４０または１４７のアミノ酸配列を含む抗原結合ドメイン；
膜貫通ドメインおよび
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、第二共刺激ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン、ＣＤ２８ドメインまたはＩＣＯＳドメイン以外の他の共刺激ドメイン
を含むＣＡＲを含むＣＤ８＋ Ｔ細胞(ＣＡＲＣＤ８＋)
を投与することを含み、
ここで、ＣＡＲＣＤ４＋およびＣＡＲＣＤ８＋は互いに異なる。
場合により、方法は、さらに
３)抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載する抗原結合ドメイン、例えば、ＣＤ３３に特異的に結合する抗原結合ドメイン、例えば、表２または９の抗原結合ドメインまたは配列番号１４０または１４７のアミノ酸配列を含む抗原結合ドメイン；
膜貫通ドメインおよび
細胞内シグナル伝達ドメインを含む
ＣＡＲを含む第二ＣＤ８＋ Ｔ細胞(第二ＣＡＲＣＤ８＋)
をさらに投与することを含み、
ここで、第二ＣＡＲＣＤ８＋は、ＣＡＲＣＤ８＋に存在しない細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、共刺激性シグナル伝達ドメインを含み、場合により、ＩＣＯＳシグナル伝達ドメインを含まない。
治療適用
ＣＤ３３関連疾患および／または障害
本発明は、とりわけ、例えば、癌もしくは悪性腫瘍または骨髄異形成、骨髄異形成症候群もしくは前白血病のような前癌状態のような増殖性疾患を含む、ＣＤ３３を発現する細胞と関係するＣＤ３３の発現と関係する疾患または状態；またはＣＤ３３を発現する細胞と関係する非癌関連徴候を処置するための組成物および方法に関する。ある面において、ＣＤ３３の発現と関係する癌は血液癌である。ある面において、血液癌は、ＡＭＬ、骨髄異形成症候群、ＡＬＬ、慢性骨髄性白血病、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物、骨髄増殖性新生物などを含むが、これらに限定されない。さらにＣＤ３３の発現と関係する疾患発現は、例えば、非定型および／または非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態または増殖性ＣＤ３３の発現と関係する疾患を含むが、これらに限定されない。ＣＤ３３の発現と関係する非癌関連徴候も含まれ得る。
ある面において、本発明は、ＣＤ３３発現と関係する疾患を処置する方法を提供する。ある面において、本発明は、腫瘍の一部がＣＤ３３陰性であり、腫瘍の一部がＣＤ３３陽性である疾患を処置する方法を提供する。例えば、本発明のＣＡＲは、ＣＤ３３の高発現レベルと関係する疾患の処置を受けている対象の処置に有用であり、ここで、ＣＤ３３レベル増加に対する処置を受けている対象は、高レベルのＣＤ３３と関係する疾患を有する。ある態様において、本発明のＣＡＲは、ＣＤ３３の発現と関係する疾患の処置を受けている対象の処置に有用であり、ここで、ＣＤ３３の発現と関係する処置を受けている対象は、ＣＤ３３の発現と関係する疾患を示す。
ある面において、本発明は、哺乳動物免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞における発現のためのプロモーターに操作可能に連結したＣＤ３３ ＣＡＲを含むベクターに関する。ある面において、本発明は、ＣＤ３３発現腫瘍の処置に使用するためのＣＤ３３ ＣＡＲを発現する組み換え免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を提供し、ここで、ＣＤ３３ ＣＡＲを発現する組み換え免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)をＣＤ３３ ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＤ３３ ＣＡＲＴまたはＣＤ３３ ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)と呼ぶ。ある面において、本発明のＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＤ３３ ＣＡＲＴまたはＣＤ３３ ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)は、ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＤ３３ ＣＡＲＴまたはＣＤ３３ ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)が腫瘍細胞を標的とし、腫瘍の増殖が阻害されるように、腫瘍細胞と、その表面に発現される少なくとも一つの本発明のＣＤ３３ ＣＡＲを接触させることができる。
ある面において、本発明は、ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＤ３３ ＣＡＲＴまたはＣＤ３３ ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)が抗原に応答して活性化され、癌細胞を標的とし、ここで、腫瘍の増殖が阻止されるように、腫瘍細胞と本発明のＣＤ３３ ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＤ３３ ＣＡＲＴまたはＣＤ３３ ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)を接触させることを含む、ＣＤ３３発現腫瘍細胞の増殖を阻止する方法に関する。
ある面において、本発明は、対象における癌を処置する方法に関する。方法は、癌が対象において処置されるように、対象に本発明のＣＤ３３ ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＤ３３ ＣＡＲＴまたはＣＤ３３ ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)を投与することを含む。本発明のＣＤ３３ ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＤ３３ ＣＡＲＴまたはＣＤ３３ ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)により処置可能な癌の例は、ＣＤ３３の発現と関係する癌である。本発明のＣＤ３３ ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＤ３３ ＣＡＲＴまたはＣＤ３３ ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)により処置可能な癌の例は、ＡＭＬ、骨髄異形成症候群,、慢性骨髄性白血病および他の骨髄増殖性新生物または芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物などを含むが、これらに限定されない。
本発明は、ある種の細胞治療を含み、ここで、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するように遺伝的に修飾され、ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＤ３３ ＣＡＲＴまたはＣＤ３３ ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)が、それを必要とするレシピエントに注入される。注入された細胞は、レシピエントで腫瘍細胞を殺すことができる。抗体療法と異なり、ＣＡＲ修飾細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)は、インビボで複製でき、持続腫瘍制御に至り得る長期残留性をもたらす。種々の面において、患者に投与した細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)またはその子孫は、患者で、患者に細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)投与後少なくとも４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月、２年、３年、４年または５年持続する。
本発明はまた、ある種の細胞治療を含み、ここで、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を一過性に発現するように、例えば、インビトロ転写ＲＮＡにより修飾され、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)がそれを必要とするレシピエントに注入される。注入された細胞は、レシピエントで腫瘍細胞を殺すことができる。それゆえに、種々の面において、患者に投与された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)は、患者に免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)投与後、１ヶ月、例えば、３週間、２週間、１週間未満持続する。
何らかの特定の理論に縛られないが、ＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)により惹起される抗腫瘍免疫応答は、能動的または受動的免疫応答であり得るかまたはあるいは直接的対間接的免疫応答によるものであり得る。ある面において、ＣＡＲ形質導入免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)は、ＣＤ３３を発現するヒト癌細胞に応答して特定の炎症誘発性サイトカイン分泌および強力な細胞溶解性活性を示し、可溶性ＣＤ３３阻害に抵抗し、バイスタンダー細胞死に介在し、確立されたヒト腫瘍の退縮に介在する。例えば、ＣＤ３３発現腫瘍の不均一な場における抗原低腫瘍細胞は、近辺の抗原陽性癌細胞に対して先に反応している癌関連抗原の再指向免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)による間接的破壊を受け得る。
ある面において、本発明の完全ヒトＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)は、哺乳動物におけるエクスビボ免疫化および／またはインビボ治療のための１種のワクチンである。ある面において、哺乳動物は、ヒトである。
エクスビボ免疫化に関して、次の少なくとも１つが、哺乳動物に細胞を投与する前にインビトロで起こる。ｉ)細胞の増殖、ii)細胞へのＣＡＲをコードする核酸の導入またはiii)細胞の凍結保存。
エクスビボ過程は当分野で周知であり、下によりより詳細に記載する。簡潔には、細胞を哺乳動物(例えば、ヒト)から単離し、ここに記載するＣＡＲを発現するベクターで遺伝子修飾(すなわち、インビトロで形質導入またはトランスフェクト)する。ＣＡＲ修飾細胞を、哺乳動物レシピエントに投与して、治療効果を提供できる。哺乳動物レシピエントはヒトであってよく、ＣＡＲ修飾細胞はレシピエントに対して自己であり得る。あるいは、細は、レシピエントに対して同種、同系または異種であり得る。
引用により本明細書に包含させる米国特許５,１９９,９４２号に記載する造血幹細胞および前駆細胞のエクスビボ増殖のための方法を、本発明の細胞に適用できる。他の適当な方法は当分野で知られ、それゆえに本発明は、細胞のエクスビボ増殖の特定の方法に制限されない。簡潔には、Ｔ細胞のエクスビボ培養および増殖は、(１)哺乳動物からの採取した末梢血または骨髄外植体からのＣＤ３４＋造血幹細胞および前駆細胞回収；および(２)エクスビボでのこのような細胞の増殖を含む。米国特許５,１９９,９４２号に記載される細胞増殖因子に加えて、ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ−１、ＩＬ−３およびｃ−ｋｉｔリガンドのような他の因子を細胞の培養および増殖に使用できる。
エクスビボ免疫化の点で細胞ベースのワクチンを使用するのに加えて、本発明はまた患者における抗原に対する免疫応答を惹起するための、インビボ免疫化のための組成物および方法も提供する。
一般に、ここに記載するような細胞活性化および増殖は、免疫不全状態の個体で生じる疾患の処置および予防に利用し得る。特に、本発明のＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を、ＣＤ３３の発現と関係する疾患、障害および状態の処置に使用する。ある面において、本発明の細胞を、の発現と関係する疾患、障害および状態を発症するリスクのある患者の処置に使用するＣＤ３３。それゆえに、本発明は、治療有効量の本発明のＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、ＣＤ３３の発現と関係する疾患、障害および状態を処置または予防する方法を提供する。
ある面において、本発明のＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)を癌または悪性腫瘍のような増殖性疾患または骨髄異形成、骨髄異形成症候群または前白血病のような前癌状態の処置に使用し得る。ある面において、ＣＤ３３の発現と関係する癌は、細胞の異常により特徴付けられる血液癌である前白血病過増殖性障害、過形成または異形成である。
ある面において、本発明のＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)を癌の処置に使用し、ここで、癌は血液癌である。血液癌状態は、血液、骨髄およびリンパ系に影響する、白血病および悪性リンパ球増殖状態のようなタイプの癌である。
ある面において、本発明の組成物およびＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)は、骨髄性白血病、ＡＭＬおよびそのサブタイプ、慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)および骨髄異形成症候群(ＭＤＳ)の処置に特に有用である。
白血病は急性白血病および慢性白血病に分類できる。急性白血病はさらに急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)および急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)として分類され得る。慢性白血病は慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)および慢性リンパ系白血病(ＣＬＬ)を含む。他の関連する状態は、骨髄球性血液細胞の産生不良(または異形成)によりまとめられる血液学的状態の多様なコレクションであり、ＡＭＬに癌化するリスクがある、骨髄異形成症候群(ＭＤＳ、以前は“前白血病状態”として知られる)である。
リンパ腫は、リンパ球から生じる血液細胞腫瘍の群である。代表的リンパ腫は非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫を含む。
ＡＭＬにおいて、悪性形質転換および異常に分化した、長命骨髄前駆細胞の未制御な増殖は、未熟血液形態の高循環数および正常骨髄の悪性細胞による置き換えに至る。症状は、疲労、蒼白、易皮下出血および出血、発熱および感染を含み、白血病性浸潤の症状は、患者の約５％にしか存在しない(しばしば皮膚所見として)。末梢血スメアおよび骨髄の試験は診断的である。既存の処置は、寛解を達成するための導入化学療法および再発を避けるための寛解後化学療法(幹細胞移植を伴うまたは伴わない)である。
ＡＭＬは、形態学、免疫表現型および細胞化学により互いに区別される多数のサブタイプがある。骨髄、骨髄−単球、単球、赤血球および巨核球を含む優勢細胞型に基づき、５タイプが記載される。
寛解導入率は５０〜８５％の範囲である。長期無病生存は、患者の２０〜４０％で生じ、幹細胞移植で処置した若い患者では４０〜５０％と報告されている。
予後因子は処置プロトコールおよび強度の決定を助ける；極めて予後不良な性質を有する患者は、通常、利益の可能性が、処置毒性増加を正当化すると考えられるために、より強い形態の治療を与える。最も重要な予後因子は、白血病細胞核型である；有利な核型は、ｔ(１５；１７)、ｔ(８；２１)およびｉｎｖ１６(ｐ１３；ｑ２２)を含む。陰性因子は、高齢、先行骨髄異形成相、二次性白血病、高ＷＢＣ数およびアウエル小体不在である。
最初の治療は寛解の導入を試み、ＡＭＬに応答する薬剤が少ない点で、ＡＬＬと大きく異なる。基本的導入レジメンは、５〜７日連続的ＩＶ注入または高用量によるシタラビン；ダウノルビシンまたはイダルビシンは、この間３日ＩＶで与えられる。いくつかのレジメンは６−チオグアニン、エトポシド、ビンクリスチンおよびプレドニゾンを含むが、それらの貢献は不明確である。処置は、通常、感染または出血を伴う顕著な骨髄抑制をもたらす；骨髄回復前に相当な潜時がある。この間、注意深い予防的および支持的処置が重要である。
慢性骨髄性(または骨髄)白血病(ＣＭＬ)は慢性顆粒球性白血病としても知られ、白血球の癌である。ＣＭＬの一般的処置レジメンは、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤、イマチニブ(グリーベック(登録商標))、ダサチニブおよびニロチニブを含む。Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤は、フィラデルフィア染色体転座を有するＣＭＬ患者に特に有用である。
骨髄異形成症候群(ＭＤＳ)は、障害されかつ無効な造血または血液産生により特徴付けられる血液学的医学的状態である。それゆえに、血液形成細胞の数および質が非可逆的に低下する。ＭＤＳを有する患者の一部は重度の貧血を発症するが、他は非症候性である。ＭＤＳの分類スキームは当分野で知られ、基準は特定の血液細胞型、例えば、骨髄芽細胞、単球および赤血球前駆体の比または頻度を特定する。ＭＤＳは、難治性貧血、環状鉄芽細胞を伴う難治性貧血、過剰の芽細胞を伴う難治性貧血、形質転換における過剰な芽細胞を伴う難治性貧血、慢性骨髄単球性白血病(ＣＭＬ)を含む。
ＭＤＳの処置は、症状の重症度で異なる。重篤な症状を経験している患者のための処置の積極的形態は、骨髄移植および血液産物支持(例えば、輸血)および造血増殖因子(例えば、エリスロポエチン)での支持的ケアを含む。他の薬剤は、ＭＤＳの処置に頻繁に使用される：５−アザシチジン、デシタビンおよびレナリドマイド。ある場合、鉄キレート剤デフェロキサミン(デスフェラール(登録商標))およびデフェラシロクス(エクジェイド(登録商標))も投与し得る。
他の態様において、本発明のＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)を使用して、白血病幹細胞を伴う癌または白血病を処置する。例えば、白血病幹細胞はＣＤ３４＋／ＣＤ３８−白血病細胞である。
本発明は、とりわけ、癌を処置するための組成物および方法を提供する。ある面において、癌は、白血病(例えば急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病および骨髄異形成症候群)およびリンパ腫(例えば多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫および小細胞−および大細胞−濾胞性リンパ腫)を含む悪性リンパ球増殖状態を含むが、これらに限定されない血液癌である。
ある面において、本発明のＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)を、例えば、Ｂ細胞急性リンパ性白血病(“ＢＡＬＬ”)、Ｔ細胞急性リンパ性白血病(“ＴＡＬＬ”)、急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)を含むが、これらに限定されない、例えば急性白血病；例えば、慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)を含むが、これらに限定されない１以上の慢性白血病；例えば、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞−または大細胞−濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、周辺帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、血漿芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症および骨髄血液細胞の無効な産生(または異形成)により一体化される血液状態の雑多なコレクションである“前白血病”などを含むが、これらに限定されないさらなる血液癌または血液状態のような他の癌および悪性腫瘍の処置に使用し得る。本発明のＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を、単独でまたは希釈剤および／またはＩＬ−２または他のサイトカインまたは細胞集団のような他の成分と組み合わせて医薬組成物として投与し得る。
本発明はまたＣＤ３３発現細胞集団の増殖を阻止するまたは減らす方法も提供し、方法は、ＣＤ３３発現細胞を含む細胞の集団と、ＣＤ３３発現細胞に結合する本発明のＣＤ３３ ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞またはＣＤ３３ ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)を接触させることを含む。特定の面において、本発明は、ＣＤ３３を発現する癌細胞の集団の増殖を阻止するまたは減らす方法を提供し、方法は、ＣＤ３３発現癌細胞集団と、ＣＤ３３発現細胞に結合する本発明のＣＤ３３ ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞またはＣＤ３３ ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)を接触させることを含む。ある面において、本発明ＣＤ３３を発現する癌細胞の集団の増殖を阻止するまたは減らす方法を提供し、方法は、ＣＤ３３発現癌細胞集団と、ＣＤ３３発現細胞に結合する本発明のＣＤ３３ ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞またはＣＤ３３ ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)を接触させることを含む。ある面において、本発明のＣＤ３３ ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞またはＣＤ３３ ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)は、細胞および／または癌細胞の含量、数、量またはパーセンテージを、陰性対照と比較して、骨髄性白血病またはＣＤ３３発現細胞と関係する他の癌を有する対象または動物モデルで少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％または少なくとも９９％減少させる。ある面において、対象は、ヒトである。
本発明はまた、ＣＤ３３発現細胞と関係する疾患(例えば、ＣＤ３３を発現する血液癌または非定型癌)を予防、処置および／または管理する方法も提供し、方法は、処置を必要とする対象に、ＣＤ３３発現細胞と結合する本発明のＣＤ３３ ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞またはＣＤ３３ ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)を投与することを含む。ある面において、対象は、ヒトである。ＣＤ３３発現細胞と関係する障害の非限定的例は、自己免疫性障害(例えば狼瘡)、炎症性障害(例えばアレルギーおよび喘息)および癌(例えばＣＤ３３を発現する血液癌または非定型癌)を含む。
本発明はまた、ＣＤ３３発現細胞と関係する疾患を予防、処置および／または管理する方法も提供し、方法は、処置を必要とする対象に、ＣＤ３３発現細胞と結合する本発明のＣＤ３３ ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞またはＣＤ３３ ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)を投与することを含む。ある面において、対象は、ヒトである。
本発明は、ＣＤ３３発現細胞と関係する癌の再発を予防する方法を提供し、方法は、処置を必要とする対象に、ＣＤ３３発現細胞に結合する本発明のＣＤ３３ ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞またはＣＤ３３ ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)を投与することを含む。ある面において、方法は、処置を必要とする対象に、有効量のＣＤ３３発現細胞と結合するここに記載するＣＤ３３ ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞またはＣＤ３３ ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)を、有効量の他の治療と組み合わせて投与することを含む。
組み合わせ治療
ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、他の既知薬剤および治療と組み合わせて使用し得る。ここで使用する“組み合わせて”投与するは２(またはそれ以上)の異なる処置を、対象が障害に苦しんでいる過程の間に対象に送達することを意味し、例えば、２以上の処置を、対象が障害と診断された後にかつ障害が治癒または撲滅される前にまたは処置が他の理由で中止される前に送達される。ある態様において、投与期間の重複があるように、一方の処置の送達は、第二の処置の送達開始時にまだ行われている。これは、ここでは“同時の”または“一緒の送達”ということがある。他の態様において、他の態様において、一方の処置の送達は、他の処置の送達が始まる前に終わる。いずれかの場合のある態様において、処置は、組み合わせ投与のためにより有効である。例えば、第二処置剤はより有効である、例えば、等しい効果が少ない第二処置剤で見られるまたは第二処置剤が、第二処置剤を第一処置剤非存在下で投与したときに見られるよりも大きな程度で症状を軽減するまたは第一処置剤で同様な状況が見られる。ある態様において、送達、障害と関係する症状または他のパラメータの減少が、他方の処置剤の非存在下で一方の処置剤の送達で観察されるより大きい。２処置の効果は一部相加的、完全相加的または相加的より大きいものであり得る。送達は、送達した第一処置の効果が、第二剤の送達時になお検出可能であるようなものであり得る。
ここに記載するＣＡＲ発現細胞および少なくとも一つのさらなる治療剤を同時に、同じまたは別の組成物でまたは逐次的に投与できる。逐次投与について、ここに記載するＣＡＲ発現細胞をまず投与してよく、さらなる薬剤を次に投与してよくまたは投与の順序は逆でよい。
ＣＡＲ治療および／または他の治療剤、方法またはモダリティーを、活動性障害の期間または寛解または低活動性疾患の期間に投与できる。ＣＡＲ治療を、他の処置の処置前、処置と同時、処置後または障害の寛解中に投与できる。
組み合わせて投与するとき、ＣＡＲ治療およびさらなる薬剤(例えば、第二または第三の薬剤)または全てを、個々に、例えば、単剤療法として使用する各薬剤の量または投与より高い、低いまたは同じ量または用量で投与できる。ある態様において、ＣＡＲ治療、さらなる薬剤(例えば、第二または第三薬剤)または全ての投与される量または用量は、個々に、例えば、単剤療法として使用する各薬剤の量または用量より低い(例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％)。他の態様において、所望の効果(例えば、癌の処置)を生じるＣＡＲ治療、さらなる薬剤(例えば、第二または第三薬剤)または全ての投与される量または用量は、同じ治療効果を達成するのに必要な、個々に、例えば、単剤療法として使用する各薬剤の量または用量より低い(例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％低い)。
さらなる面において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、手術、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸およびＦＫ５０６のような免疫抑制剤、抗体またはキャンパス、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８および照射のような他の免疫除去剤と組み合わせて使用し得る。Izumoto et al. 2008 J Neurosurg 108:963-971に記載のようなペプチドワクチン。
ある例において、本発明の化合物を、他の抗癌剤、抗アレルギー剤、制吐剤(または鎮吐剤)、鎮痛剤、細胞保護剤およびこれらの組み合わせのような他の治療剤と組み合わせる。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、化学療法剤と組み合わせて使用できる。化学療法剤の例は、アントラサイクリン(例えば、ドキソルビシン(例えば、リポソームドキソルビシン))、ビンカアルカロイド(例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン)、アルキル化剤(例えば、シクロホスファミド、ダカルバジン、メルファラン、イホスファミド、テモゾロミド)、免疫細胞抗体(例えば、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、オファツムマブ、トシツモマブ、ブレンツキシマブ)、代謝拮抗剤(例えば、葉酸アンタゴニスト、ピリミジンアナログ、プリンアナログおよびアデノシンデアミナーゼ阻害剤(例えば、フルダラビン))、ｍＴＯＲ阻害剤、ＴＮＦＲグルココルチコイド誘発ＴＮＦＲ関連タンパク質(ＧＩＴＲ)アゴニスト、プロテアソーム阻害剤(例えば、アクラシノマイシンＡ、グリオトキシンまたはボルテゾミブ)、サリドマイドまたはサリドマイド誘導体(例えば、レナリドマイド)のような免疫調節剤を含む。
組み合わせ治療における使用が企図される一般的化学療法剤は、ブスルファン(ミレラン(登録商標))、ブスルファン注射(ブスルフェクス(登録商標))、クラドリビン(ロイスタチン(登録商標))、シクロホスファミド(シトキサン(登録商標)またはＮｅｏｓａｒ(登録商標))、シタラビン、シトシンアラビノシド(Cytosar-U(登録商標))、シタラビンリポソーム注射(ＤｅｐｏＣｙｔ(登録商標))、塩酸ダウノルビシン(Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ(登録商標))、ダウノルビシンシトレートリポソーム注射(ＤａｕｎｏＸｏｍｅ(登録商標))、デキサメサゾン、塩酸ドキソルビシン(アドリアマイシン(登録商標)、Ｒｕｂｅｘ(登録商標))、エトポシド(ベプシド(登録商標))、リン酸フルダラビン(フルダラ(登録商標))、ヒドロキシ尿素(ハイドレア(登録商標))、イダルビシン(ダマイシン(登録商標))、ミトキサントロン(ノバントロン(登録商標))、ゲムツズマブオゾガマイシン(マイロターグ(登録商標))を含む。
ある態様において、組み合わせ治療における使用が企図される一般的化学療法剤は、アナストロゾール(アリミデックス(登録商標))、ビカルタミド(カソデックス(登録商標))、硫酸ブレオマイシン(Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ(登録商標))、ブスルファン(マイレラン(登録商標))、ブスルファン注(ブスルフェクス(登録商標))、カペシタビン(ゼローダ(登録商標))、Ｎ４−ペントキシカルボニル−５−デオキシ−５−フルオロシチジン、カルボプラチン(パラプラチン(登録商標))、カルムスチン(ＢｉＣＮＵ(登録商標))、クロラムブシル(リューケラン(登録商標))、シスプラチン(Ｐｌａｔｉｎｏｌ(登録商標))、クラドリビン(ロイスタチン(登録商標))、シクロホスファミド(シトキサン(登録商標)またはＮｅｏｓａｒ(登録商標))、シタラビン、シトシンアラビノシド(Cytosar-U(登録商標))、シタラビンリポソーム注射(ＤｅｐｏＣｙｔ(登録商標))、ダカルバジン(ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ(登録商標))、ダクチノマイシン(アクチノマイシンＤ、Ｃｏｓｍｅｇａｎ)、塩酸ダウノルビシン(Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ(登録商標))、クエン酸ダウノルビシンリポソーム注射(ＤａｕｎｏＸｏｍｅ(登録商標))、デキサメサゾン、ドセタキセル(タキソテール(登録商標))、塩酸ドキソルビシン(アドリアマイシン(登録商標)、Ｒｕｂｅｘ(登録商標))、エトポシド(ベプシド(登録商標))、リン酸フルダラビン(フルダラ(登録商標))、５−フルオロウラシル(アドルシル(登録商標)、エフデックス(登録商標))、フルタミド(Ｅｕｌｅｘｉｎ(登録商標))、テザシチビン、ゲムシタビン(ジフルオロデオキシシチジン)、ヒドロキシ尿素(ハイドレア(登録商標))、イダルビシン(イダマイシン(登録商標))、イホスファミド(ＩＦＥＸ(登録商標))、イリノテカン(Ｃａｍｐｔｏｓａｒ(登録商標))、Ｌ−アスパラギナーゼ(ＥＬＳＰＡＲ(登録商標))、ロイコボリンカルシウム、メルファラン(アルケラン(登録商標))、６−メルカプトプリン(ピュリネソール(登録商標))、メトトレキサート(Ｆｏｌｅｘ(登録商標))、ミトキサントロン(ノバントロン(登録商標))、マイロターグ、パクリタキセル(タキソール(登録商標))、ｐｈｏｅｎix(イットリウム９０／ＭＸ−ＤＴＰＡ)、ペントスタチン、ポリフェプロザン２０とカルムスチンインプラント(グリアデル(登録商標))、クエン酸タモキシフェン(ノルバデックス(登録商標))、テニポシド(Ｖｕｍｏｎ(登録商標))、６−チオグアニン、チオテパ、チラパザミン(Ｔｉｒａｚｏｎｅ(登録商標))、注射用塩酸トポテカン(ハイカムチン(登録商標))、ビンブラスチン(Ｖｅｌｂａｎ(登録商標))、ビンクリスチン(オンコビン(登録商標))およびビノレルビン(ナベルビン(登録商標))を含む。
本発明の化合物と組み合わせるための特に興味深い抗癌剤は、アントラサイクリン；アルキル化剤；代謝拮抗剤；カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンまたはｐ７０Ｓ６キナーゼＦＫ５０６)を阻害するまたはｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する薬剤；ｍＴＯＲ阻害剤；免疫調節剤；アントラサイクリン；ビンカアルカロイド；プロテオソーム阻害剤；ＧＩＴＲアゴニストタンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤；ＣＤＫ４キナーゼ阻害剤；ＢＴＫ阻害剤；ＭＫＮキナーゼ阻害剤；ＤＧＫキナーゼ阻害剤；または腫瘍溶解性ウイルスを含む。
代謝拮抗剤の例は、ピリミジンアナログ、プリンアナログおよびアデノシンデアミナーゼ阻害剤)：メトトレキサート(リウマトレックス(登録商標)、Ｔｒｅｘａｌｌ(登録商標))、５−フルオロウラシル(Ａｄｒｕｃｉｌ(登録商標)、エフデックス(登録商標)、フルオロプレクス(登録商標))、フロクスウリジン(ＦＵＤＦ(登録商標))、シタラビン(Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ(登録商標)、Ｔａｒａｂｉｎｅ ＰＦＳ)、６−メルカプトプリン(プリントール(登録商標)))、６−チオグアニン(チオグアニンＴａｂｌｏｉｄ(登録商標))、リン酸フルダラビン(フルダラ(登録商標))、ペントスタチン(Ｎｉｐｅｎｔ(登録商標))、ペメトレキセド(アリムタ(登録商標))、ラルチトレキセド(トムデックス(登録商標))、クラドリビン(ロイスタチン(登録商標))、クロファラビン(Ｃｌｏｆａｒｅｘ(登録商標)、クロラール(登録商標))、アザシチジン(ビダーザ(登録商標))、デシタビンおよびゲムシタビン(ジェムザール(登録商標))を含むが、これらに限定されない。好ましい代謝拮抗剤は、シタラビン、クロファラビンおよびフルダラビンを含む。
アルキル化剤の例は、窒素マスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソウレア類およびトリアゼン)：ウラシルマスタード(アミノウラシルマスタード(登録商標)、Ｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎａｃｉｌ(登録商標)、Ｄｅｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ(登録商標)、Ｄｅｓｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ(登録商標)、Ｈａｅｍａｎｔｈａｍｉｎｅ(登録商標)、Ｎｏｒｄｏｐａｎ(登録商標)、Ｕｒａｃｉｌ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄ(登録商標)、Ｕｒａｃｉｌｌｏｓｔ(登録商標)、Ｕｒａｃｉｌｍｏｓｔａｚａ(登録商標)、ウラムスチン(登録商標)、ウラムスチン(登録商標))、クロルメチン(Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ(登録商標))、シクロホスファミド(シトキサン(登録商標)、Ｎｅｏｓａｒ(登録商標)、Ｃｌａｆｅｎ(登録商標)、エンドキサン(登録商標)、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ(登録商標)、ＲｅｖｉｍｍｕｎｅＴＭ)、イホスファミド(Ｍｉｔｏｘａｎａ(登録商標))、メルファラン(アルケラン(登録商標))、クロラムブシル(リューケラン(登録商標))、ピポブロマン(Ａｍｅｄｅｌ(登録商標)、Ｖｅｒｃｙｔｅ(登録商標))、トリエチレンメラミン(ヘメル(登録商標)、Ｈｅｘａｌｅｎ(登録商標)、Ｈｅｘａｓｔａｔ(登録商標))、トリエチレンチオホスホロアミン、テモゾロミド(テモダール(登録商標))、チオテパ(Ｔｈｉｏｐｌｅｘ(登録商標))、ブスルファン(Ｂｕｓｉｌｖｅｘ(登録商標)、マイレラン(登録商標))、カルムスチン(ＢｉＣＮＵ(登録商標))、ロムスチン(ＣｅｅＮＵ(登録商標))、ストレプトゾシン(Ｚａｎｏｓａｒ(登録商標))およびダカルバジン(ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ(登録商標))を含むが、これらに限定されないロムスチン(ＣｅｅＮＵ(登録商標))、ストレプトゾシン(Ｚａｎｏｓａｒ(登録商標))およびダカルバジン(ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ(登録商標))。アルキル化剤のさらなる例は、オキサリプラチン(エロキサチン(登録商標))；テモゾロミド(テモダール(登録商標)およびテモダール(登録商標))；ダクチノマイシン(別名アクチノマイシン−Ｄ、Ｃｏｓｍｅｇｅｎ(登録商標))；メルファラン(別名Ｌ−ＰＡＭ、Ｌ−サルコリシンおよびフェニルアラニンマスタード、アルケラン(登録商標))；アルトレタミン(別名ヘキサメチルメラミン(ＨＭＭ)、Ｈｅｘａｌｅｎ(登録商標))；カルムスチン(ＢｉＣＮＵ(登録商標))；ベンダムスチン(Ｔｒｅａｎｄａ(登録商標))；ブスルファン(ブスルフェクス(登録商標)およびマイレラン(登録商標))；カルボプラチン(パラプラチン(登録商標))；ロムスチン(別名ＣＣＮＵ、ＣｅｅＮＵ(登録商標))；シスプラチン(別名ＣＤＤＰ、Ｐｌａｔｉｎｏｌ(登録商標)およびＰｌａｔｉｎｏｌ(登録商標)−ＡＱ)；クロラムブシル(リューケラン(登録商標))；シクロホスファミド(シトキサン(登録商標)およびＮｅｏｓａｒ(登録商標))；ダカルバジン(別名ＤＴＩＣ、ＤＩＣおよびイミダゾールカルボキサミド、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ(登録商標))；アルトレタミン(別名ヘキサメチルメラミン(ＨＭＭ)、Ｈｅｘａｌｅｎ(登録商標))；イホスファミド(Ｉｆｅｘ(登録商標))；Ｐｒｅｄｎｕｍｕｓｔｉｎｅ；プロカルバジン(Ｍａｔｕｌａｎｅ(登録商標))；メクロレタミン(別名窒素マスタード、ムスチンおよび塩酸メクロロエタミン、Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ(登録商標))；ストレプトゾシン(Ｚａｎｏｓａｒ(登録商標))；チオテパ(別名チオホスホアミド、ＴＥＳＰＡおよびＴＳＰＡ、Ｔｈｉｏｐｌｅｘ(登録商標))；シクロホスファミド(エンドキサン(登録商標)、シトキサン(登録商標)、Ｎｅｏｓａｒ(登録商標)、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ(登録商標)、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ(登録商標))；およびベンダムスチンＨＣｌ(Ｔｒｅａｎｄａ(登録商標))を含むが、これらに限定されない。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、フルダラビン、シクロホスファミドおよび／またはリツキシマブと組み合わせて対象に投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、フルダラビン、シクロホスファミドおよびリツキシマブ(ＦＣＲ)と組み合わせて対象に投与する。ある態様において、対象はＣＬＬを有する。例えば、対象は、染色体１７の短腕に欠失を有する(例えば、白血病性細胞におけるｄｅｌ(１７ｐ))。他の例において、対象は、ｄｅｌ(１７ｐ)を有しない。ある態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶＨ)遺伝子に変異を含む白血病性細胞を含む。他の態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶＨ)に変異を含む白血病性細胞を含まない。ある態様において、フルダラビンを、約１０〜５０mg／ｍ２(例えば、約１０〜１５mg／ｍ２、１５〜２０mg／ｍ２、２０〜２５mg／ｍ２、２５〜３０mg／ｍ２、３０〜３５mg／ｍ２、３５〜４０mg／ｍ２、４０〜４５mg／ｍ２または４５〜５０mg／ｍ２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。ある態様において、シクロホスファミドを、約２００〜３００mg／ｍ２(例えば、約２００〜２２５mg／ｍ２、２２５〜２５０mg／ｍ２、２５０〜２７５mg／ｍ２または２７５〜３００mg／ｍ２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。ある態様において、リツキシマブを、約４００〜６００mg／ｍ２(例えば、４００〜４５０mg／ｍ２、４５０〜５００mg／ｍ２、５００〜５５０mg／ｍ２または５５０〜６００mg／ｍ２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ベンダムスチンおよびリツキシマブと組み合わせて対象に投与する。ある態様において、対象はＣＬＬを有する。例えば、対象は、染色体１７の短腕に欠失を有する(例えば、白血病性細胞におけるｄｅｌ(１７ｐ))。他の例において、対象は、ｄｅｌ(１７ｐ)を有しない。ある態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶＨ)遺伝子に変異を含む白血病性細胞を含む。他の態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶＨ)に変異を含む白血病性細胞を含まない。ある態様において、ベンダムスチンを、約７０〜１１０mg／ｍ２(例えば、７０〜８０mg／ｍ２、８０〜９０mg／ｍ２、９０〜１００mg／ｍ２または１００〜１１０mg／ｍ２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。ある態様において、リツキシマブを、約４００〜６００mg／ｍ２(例えば、４００〜４５０mg／ｍ２、４５０〜５００mg／ｍ２、５００〜５５０mg／ｍ２または５５０〜６００mg／ｍ２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、リツキシマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよび／またはコルチコステロイド(例えば、プレドニゾン)と組み合わせて対象に投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、リツキシマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾン(Ｒ−ＣＨＯＰ)と組み合わせて対象に投与する。ある態様において、対象は、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫(ＤＬＢＣＬ)を有する。ある態様において、対象は、巨大腫瘤がない限局したステージのＤＬＢＣＬ(例えば、７cm未満のサイズ／直径の腫瘍を含む)を有する。ある態様において、対象は、Ｒ−ＣＨＯＰと組み合わせて放射線で処置される。例えば、対象に、Ｒ−ＣＨＯＰ(例えば、１〜６サイクル、例えば、１、２、３、４、５または６サイクルのＲ−ＣＨＯＰ)、続いて放射線を投与する。ある場合、対象に、放射線後Ｒ−ＣＨＯＰ(例えば、１〜６サイクル、例えば、１、２、３、４、５または６サイクルのＲ−ＣＨＯＰ)を投与する。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、エトポシド、プレドニゾン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、ドキソルビシンおよび／またはリツキシマブと組み合わせて対象に投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、エトポシド、プレドニゾン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、ドキソルビシンおよびリツキシマブ(ＥＰＯＣＨ−Ｒ)と組み合わせて対象に投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、用量調節ＥＰＯＣＨ−Ｒ(ＤＡ−ＥＰＯＣＨ−Ｒ)と組み合わせて対象に投与する。ある態様において、対象は、Ｂ細胞リンパ腫、例えば、Ｍｙｃ再配列侵襲性Ｂ細胞リンパ腫を有する。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、リツキシマブおよび／またはレナリドマイドと組み合わせて対象に投与する。レナリドマイド((ＲＳ)−３−(４−アミノ−１−オキソ−１,３−ジヒドロ−２Ｈ−イソインドール−２−イル)ピペリジン−２,６−ジオン)は、免疫調節剤である。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、リツキシマブおよびレナリドマイドと組み合わせて対象に投与する。ある態様において、対象は濾胞性リンパ腫(ＦＬ)またはマントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)を有する。ある態様において、対象はＦＬを有し、癌治療剤で先に処置されていない。ある態様において、レナリドマイドを、約１０〜２０mg(例えば、１０〜１５mgまたは１５〜２０mg)、例えば、連日投与する。ある態様において、リツキシマブを、約３５０〜５５０mg／ｍ２(例えば、３５０〜３７５、３７５〜４００、４００〜４２５、４２５〜４５０、４５０〜４７５または４７５〜５００mg／ｍ２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。
ｍＴＯＲ阻害剤の例は、例えば、テムシロリムス；リダフォロリムス(以前はデフェロリムスとして既知、(１Ｒ,２Ｒ,４Ｓ)−４−[(２Ｒ)−２−[(１Ｒ,９Ｓ,１２Ｓ,１５Ｒ,１６Ｅ,１８Ｒ,１９Ｒ,２１Ｒ、２３Ｓ,２４Ｅ,２６Ｅ,２８Ｚ,３０Ｓ,３２Ｓ,３５Ｒ)−１,１８−ジヒドロキシ−１９,３０−ジメトキシ−１５,１７,２１,２３、２９,３５−ヘキサメチル−２,３,１０,１４,２０−ペンタオキソ−１１,３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ[３０.３.１.０４,９]ヘキサトリアコンタ−１６,２４,２６,２８−テトラエン−１２−イル]プロピル]−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネート、ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９としても知られ、ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０６４３８３に記載)；エベロリムス(アフィニトール(登録商標)またはＲＡＤ００１)；ラパマイシン(ＡＹ２２９８９、シロリムス(登録商標))；セマピモド(ＣＡＳ １６４３０１−５１−３)；エムシロリムス、(５−{２,４−ビス[(３Ｓ)−３−メチルモルホリン−４−イル]ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−イル}−２−メトキシフェニル)メタノール(ＡＺＤ８０５５)；２−アミノ−８−[ｔｒａｎｓ−４−(２−ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]−６−(６−メトキシ−３−ピリジニル)−４−メチル−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７(８Ｈ)−オン(ＰＦ０４６９１５０２、ＣＡＳ １０１３１０１−３６−４)；およびＮ２−[１,４−ジオキソ−４−[[４−(４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル)モルホリニウム−４−イル]メトキシ]ブチル]−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリン−(配列番号３７８)、分子内塩(ＳＦ１１２６、ＣＡＳ ９３６４８７−６７−１)およびＸＬ７６５を含む。
免疫調節剤の例は、例えば、アフツズマブ(Ｒｏｃｈｅ(登録商標)から入手可能)；ペグフィルグラスチム(Ｎｅｕｌａｓｔａ(登録商標))；レナリドマイド(ＣＣ−５０１３、レブリミド(登録商標))；サリドマイド(サロミド(登録商標))、ａｃｔｉｍｉｄ(ＣＣ４０４７)；およびＩＲＸ−２(インターロイキン１、インターロイキン２およびインターフェロンγを含むヒトサイトカイン混合物、ＣＡＳ ９５１２０９−７１−５、ＩＲＸ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから入手可能)を含む。
アントラサイクリンの例は、例えば、ドキソルビシン(アドリアマイシン(登録商標)およびＲｕｂｅｘ(登録商標))；ブレオマイシン(ｌｅｎｏｘａｎｅ(登録商標))；ダウノルビシン(塩酸ダウノルビシン、ダウノマイシンおよび塩酸ルビドマイシン、Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ(登録商標))；ダウノルビシンリポソーム(クエン酸ダウノルビシンリポソーム、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ(登録商標))；ミトキサントロン(ＤＨＡＤ、ノバントロン(登録商標))；エピルビシン(ＥｌｌｅｎｃｅＴＭ)；イダルビシン(イダマイシン(登録商標)、イダマイシンＰＦＳ(登録商標))；マイトマイシンＣ(ムタマイシン(登録商標))；ゲルダナマイシン；ハービマイシン；ラビドマイシン；およびデスアセチルラビドマイシンを含む。
ビンカアルカロイドの例は、例えば、酒石酸ビノレルビン(ナベルビン(登録商標))、ビンクリスチン(オンコビン(登録商標))およびビンデシン(Ｅｌｄｉｓｉｎｅ(登録商標)))；ビンブラスチン(別名硫酸ビンブラスチン、ビンカロイコブラスチンおよびＶＬＢ、Ａｌｋａｂａｎ−ＡＱ(登録商標)およびＶｅｌｂａｎ(登録商標))；およびビノレルビン(ナベルビン(登録商標))を含む。
プロテオソーム阻害剤の例は、ボルテゾミブ(ベルケイド(登録商標))；カーフィルゾミブ(ＰＸ−１７１−００７、(Ｓ)−４−メチル−Ｎ−((Ｓ)−１−(((Ｓ)−４−メチル−１−((Ｒ)−２−メチルオキシラン−２−イル)−１−オキソペンタン−２−イル)アミノ)−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル)−２−((Ｓ)−２−(２−モルホリノアセトアミド)−４−フェニルブタンアミド)−ペンタンアミド)；マリゾミブ(ＮＰＩ−００５２)；イキサゾミブクエン酸エステル(ＭＬＮ−９７０８)；デランゾミブ(ＣＥＰ−１８７７０)；およびＯ−メチル−Ｎ−[(２−メチル−５−チアゾリル)カルボニル]−Ｌ−セリル−Ｏ−メチル−Ｎ−[(１Ｓ)−２−[(２Ｒ)−２−メチル−２−オキシラニル]−２−オキソ−１−(フェニルメチル)エチル]−Ｌ−セリンアミド(ＯＮＸ−０９１２)を含む。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ブレンツキシマブと組み合わせて対象に投与する。ブレンツキシマブは、抗ＣＤ３０抗体およびモノメチルオーリスタチンＥの抗体−薬物コンジュゲートである。ある態様において、対象は、ホジキンリンパ腫(ＨＬ)、例えば、再発性または難治性ＨＬを有する。ある態様において、対象はＣＤ３０＋ ＨＬを含む。ある態様において、対象は、自己幹細胞移植(ＡＳＣＴ)を受けている。ある態様において、対象は、ＡＳＣＴを受けていない。ある態様において、ブレンツキシマブを、約１〜３mg／kg(例えば、約１〜１.５mg／kg、１.５〜２mg／kg、２〜２.５mg／kgまたは２.５〜３mg／kg)を、例えば、静脈内に、例えば、３週間毎に投与する。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ブレンツキシマブおよびダカルバジンまたはブレンツキシマブとベンダムスチンの組合せと組み合わせて対象に投与する。ダカルバジンは、化学名を５−(３,３−ジメチル−１−トリアゼニル)イミダゾール−４−カルボキサミド有するアルキル化剤である。ベンダムスチンは、化学名４−[５−[ビス(２−クロロエチル)アミノ]−１−メチルベンズイミダゾール−２−イル]ブタン酸を有するアルキル化剤である。ある態様において、対象はホジキンリンパ腫(ＨＬ)を有する。ある態様において、対象は、癌治療剤で先に処置されていない。ある態様において、対象は少なくとも６０歳、例えば、６０歳、６５歳、７０歳、７５歳、８０歳、８５歳またはそれ以上である。ある態様において、ダカルバジンを、約３００〜４５０mg／ｍ２(例えば、約３００〜３２５mg／ｍ２、３２５〜３５０mg／ｍ２、３５０〜３７５mg／ｍ２、３７５〜４００mg／ｍ２、４００〜４２５mg／ｍ２または４２５〜４５０mg／ｍ２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。ある態様において、ベンダムスチンを、約７５〜１２５mg／ｍ２(例えば、７５〜１００mg／ｍ２または１００〜１２５mg／ｍ２、例えば、約９０mg／ｍ２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。ある態様において、ブレンツキシマブを、約１〜３mg／kg(例えば、約１〜１.５mg／kg、１.５〜２mg／kg、２〜２.５mg／kgまたは２.５〜３mg／kg)を、例えば、静脈内に、例えば、３週間毎に投与する。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にＣＤ２０阻害剤、例えば、抗ＣＤ２０抗体(例えば、抗ＣＤ２０単−または二重特異的抗体)またはそのフラグメントと組み合わせて投与する。抗ＣＤ２０抗体の例は、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブ、オビヌツズマブ、ＴＲＵ−０１５(Trubion Pharmaceuticals)、オカラツズマブおよびＰｒｏ１３１９２１(Genentech)を含むが、これらに限定されない。例えば、Lim et al. Haematologica. 95.1(2010):135-43参照。
ある態様において、抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブを含む。リツキシマブは、例えば、www.accessdata.fda.gov／drugsatfda_docs／label／2010／103705s5311lbl.pdfに記載のように、ＣＤ２０に結合し、ＣＤ２０発現細胞の細胞溶解を起こすキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体ＩｇＧ１カッパである。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、リツキシマブと組み合わせて対象に投与する。ある態様において、対象はＣＬＬまたはＳＬＬを有する。
ある態様において、リツキシマブを、静脈内に、例えば、静脈内点滴として投与する。例えば、各点滴は、約５００〜２０００mg(例えば、約５００〜５５０mg、５５０〜６００mg、６００〜６５０mg、６５０〜７００mg、７００〜７５０mg、７５０〜８００mg、８００〜８５０mg、８５０〜９００mg、９００〜９５０mg、９５０〜１０００mg、１０００〜１１００mg、１１００〜１２００mg、１２００〜１３００mg、１３００〜１４００mg、１４００〜１５００mg、１５００〜１６００mg、１６００〜１７００mg、１７００〜１８００mg、１８００〜１９００mgまたは１９００〜２０００mg)のリツキシマブを提供する。ある態様において、リツキシマブを、１５０mg／ｍ２〜７５０mg／ｍ２、例えば、約１５０〜１７５mg／ｍ２、１７５〜２００mg／ｍ２、２００〜２２５mg／ｍ２、２２５〜２５０mg／ｍ２、２５０〜３００mg／ｍ２、３００〜３２５mg／ｍ２、３２５〜３５０mg／ｍ２、３５０〜３７５mg／ｍ２、３７５〜４００mg／ｍ２、４００〜４２５mg／ｍ２、４２５〜４５０mg／ｍ２、４５０〜４７５mg／ｍ２、４７５〜５００mg／ｍ２、５００〜５２５mg／ｍ２、５２５〜５５０mg／ｍ２、５５０〜５７５mg／ｍ２、５７５〜６００mg／ｍ２、６００〜６２５mg／ｍ２、６２５〜６５０mg／ｍ２、６５０〜６７５mg／ｍ２または６７５〜７００mg／ｍ２の用量で投与し、ここで、ｍ２は対象の体表面積を示す。ある態様において、リツキシマブを、少なくとも４日、例えば、４日、７日、１４日、２１日、２８日、３５日またはそれ以上の投薬間隔で投与する。例えば、リツキシマブを、少なくとも０.５週間、例えば、０.５週間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間またはそれ以上の投薬間隔で投与する。ある態様において、リツキシマブを、一定期間、例えば、少なくとも２週間、例えば、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間またはそれより長く、ここに記載する用量および投薬間隔で投与する。例えば、リツキシマブを、ここに記載する用量および投薬間隔で、処置サイクルあたり計少なくとも４投与で投与する(例えば、処置サイクルあたり少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６またはそれ以上の投与)。
ある態様において、抗ＣＤ２０抗体はオファツムマブを含む。オファツムマブは、分子量約１４９kDaを有する抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１κヒトモノクローナル抗体である。例えば、オファツムマブはトランスジェニックマウスおよびハイブリドーマテクノロジーを使用して産生し、組み換えマウス細胞株(ＮＳ０)から発現および精製する。例えば、www.accessdata.fda.gov／drugsatfda_docs／label／2009／125326lbl.pdf；およびClinical Trial Identifier number NCT01363128、NCT01515176、NCT01626352およびNCT01397591参照。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、オファツムマブと組み合わせて対象に投与する。ある態様において、対象はＣＬＬまたはＳＬＬを有する。
ある態様において、オファツムマブを、静脈内点滴として投与する。例えば、各点滴は、約１５０〜３０００mg(例えば、約１５０〜２００mg、２００〜２５０mg、２５０〜３００mg、３００〜３５０mg、３５０〜４００mg、４００〜４５０mg、４５０〜５００mg、５００〜５５０mg、５５０〜６００mg、６００〜６５０mg、６５０〜７００mg、７００〜７５０mg、７５０〜８００mg、８００〜８５０mg、８５０〜９００mg、９００〜９５０mg、９５０〜１０００mg、１０００〜１２００mg、１２００〜１４００mg、１４００〜１６００mg、１６００〜１８００mg、１８００〜２０００mg、２０００〜２２００mg、２２００〜２４００mg、２４００〜２６００mg、２６００〜２８００mgまたは２８００〜３０００mg)のオファツムマブを投与する。ある態様において、オファツムマブを約３００mgの出発用量、続いて２０００mg、例えば、約１１用量、例えば、２４週間投与する。ある態様において、オファツムマブを、少なくとも４日、例えば、４日、７日、１４日、２１日、２８日、３５日またはそれ以上の投薬間隔で投与する。例えば、オファツムマブを、少なくとも１週間、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、２４週間、２６週間、２８週間、２０週間、２２週間、２４週間、２６週間、２８週間、３０週間またはそれ以上の投薬間隔で投与する。ある態様において、オファツムマブを、一定期間、例えば、少なくとも１週間、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２２週間、２４週間、２６週間、２８週間、３０週間、４０週間、５０週間、６０週間またはそれ以上または１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月またはそれ以上または１年、２年、３年、４年、５年またはそれ以上、ここに記載する用量および投薬間隔で投与する。例えば、オファツムマブを、処置サイクルあたり計少なくとも２用量で、ここに記載する用量および投薬間隔で投与する(例えば、処置サイクルあたり少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０またはそれ以上の用量)。
ある場合、抗ＣＤ２０抗体は、オクレリズマブを含む。オクレリズマブは、例えば、Clinical Trials Identifier Nos. NCT00077870、NCT01412333、NCT00779220、NCT00673920、NCT01194570およびKappos et al. Lancet. 19.378(2011):1779-87に記載のような、ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。
ある場合、抗ＣＤ２０抗体は、ベルツズマブを含む。ベルツズマブは、ＣＤ２０に対するヒト化モノクローナル抗体である。例えば、Clinical Trial Identifier No. NCT00547066、NCT00546793、NCT01101581およびGoldenberg et al. Leuk Lymphoma. 51(5)(2010):747-55参照。
ある場合、抗ＣＤ２０抗体は、ＧＡ１０１を含む。ＧＡ１０１(オビヌツズマブまたはＲＯ５０７２７５９とも称する)は、ヒト化および糖鎖改変抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。例えば、Robak. Curr. Opin. Investig. Drugs. 10.6(2009):588-96; Clinical Trial Identifier Numbers: NCT01995669、NCT01889797、NCT02229422およびNCT01414205; and www.accessdata.fda.gov／drugsatfda_docs／label／2013／125486s000lbl.pdf参照。
ある場合、抗ＣＤ２０抗体は、ＡＭＥ−１３３ｖを含む。ＡＭＥ−１３３ｖ(ＬＹ２４６９２９８またはオカラツズマブとも称する)は、リツキシマブと比較してＦｃγＲIIIａ受容体に対する親和性が増加し、抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)活性が増強された、ＣＤ２０に対するヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。例えば、Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25; and Forero-Torres et al. Clin Cancer Res. 18.5(2012):1395-403参照。
ある場合、抗ＣＤ２０抗体は、ＰＲＯ１３１９２１を含む。ＰＲＯ１３１９２１は、リツキシマブと比較してＦｃγＲIIIａへの結合が良好であり、ＡＤＣＣが増強されるように操作された、ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。例えば、Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25; およびCasulo et al. Clin Immunol. 154.1(2014):37-46;およびClinical Trial Identifier No. NCT00452127参照。
ある場合、抗ＣＤ２０抗体は、ＴＲＵ−０１５を含む。ＴＲＵ−０１５は、ＣＤ２０に対する抗体のドメイン由来の抗ＣＤ２０融合タンパク質である。ＴＲＵ−０１５はモノクローナル抗体より小さいが、Ｆｃ介在エフェクター機能を保持する。例えば、Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25参照。ＴＲＵ−０１５は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに連結した抗ＣＤ２０一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)を含むが、ＣＨ１およびＣＬドメインを欠く。
ある態様において、ここに記載する抗ＣＤ２０抗体を、治療剤、例えば、ここに記載する化学療法剤(例えば、シトキサン、フルダラビン、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、デメチル化剤、ペプチドワクチン、抗腫瘍抗生物質、チロシンキナーゼ阻害剤、アルキル化剤、抗微小管または有糸分裂阻害剤)、抗アレルギー剤、制吐剤(または鎮吐剤)、鎮痛剤または細胞保護的薬剤にコンジュゲートまたは他の方法で結合する。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、Ｂ細胞リンパ腫２(ＢＣＬ−２)阻害剤(例えば、ＡＢＴ−１９９またはＧＤＣ−０１９９とも称されるベネトクラクス)および／またはリツキシマブと組み合わせて対象に投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ベネトクラクスおよびリツキシマブと組み合わせて対象に投与する。ベネトクラクスは、抗アポトーシスタンパク質、ＢＣＬ−２を阻害する小分子である。ベネトクラクス(４−(４−{[２−(４−クロロフェニル)−４,４−ジメチルシクロｈｅｘ−１−エン−１−イル]メチル}ピペラジン−１−イル)−Ｎ−({３−ニトロ−４−[(テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イルメチル)アミノ]フェニル}スルホニル)−２−(１Ｈ−ピロロ[２,３−ｂ]ピリジン−５−イルオキシ)ベンズアミド)の構造を下に示す。
ある態様において、対象はＣＬＬを有する。ある態様において、対象は再発したＣＬＬを有し、例えば、対象は、先に癌治療を投与されている。ある態様において、ベネトクラクスを、約１５〜６００mg(例えば、１５〜２０mg、２０〜５０mg、５０〜７５mg、７５〜１００mg、１００〜２００mg、２００〜３００mg、３００〜４００mg、４００〜５００mgまたは５００〜６００mg)、例えば、連日投与する。ある態様において、リツキシマブを、約３５０〜５５０mg／ｍ２(例えば、３５０〜３７５mg／ｍ２、３７５〜４００mg／ｍ２、４００〜４２５mg／ｍ２、４２５〜４５０mg／ｍ２、４５０〜４７５mg／ｍ２または４７５〜５００mg／ｍ２)を、例えば、静脈内で、例えば、毎月投与する。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、腫瘍溶解性ウイルスと組み合わせて投与する。ある態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞内で選択的に複製し、その死を誘発するかまたは増殖を遅延することができる。ある場合、腫瘍溶解性ウイルスは、非癌細胞に効果を有しないか効果が最小である。腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性アデノウイルス、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス、腫瘍溶解性レトロウイルス、腫瘍溶解性パルボウイルス、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、腫瘍溶解性シンドビスウイルス、腫瘍溶解性インフルエンザウイルスまたは腫瘍溶解性ＲＮＡウイルス(例えば、腫瘍溶解性レオウイルス、腫瘍溶解性ニューカッスル病ウイルス(ＮＤＶ)、腫瘍溶解性麻疹ウイルスまたは腫瘍溶解性水疱性口内炎ウイルス(ＶＳＶ))を含むが、これらに限定されない。
ある態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、その全体を引用により本明細書に包含させるＵＳ２０１０／０１７８６８４Ａ１号に記載のウイルス、例えば、組み換え腫瘍溶解性ウイルスである。ある態様において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、例えば、その全体を引用により本明細書に包含させるＵＳ２０１０／０１７８６８４Ａ１号に記載のような、免疫または炎症性応答の阻害剤をコードする核酸配列(例えば、異種核酸配列)を含む。ある態様において、組み換え腫瘍溶解性ウイルス、例えば、腫瘍溶解性ＮＤＶは、アポトーシス促進性タンパク質(例えば、アポプチン)、サイトカイン(例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロン−ガンマ、インターロイキン−２(ＩＬ−２)、腫瘍壊死因子−アルファ)、免疫グロブリン(例えば、ＥＤ−Ｂフィブロネクチンに対する抗体)、腫瘍関連抗原、二特異性アダプタータンパク質(例えば、ＮＤＶ ＨＮタンパク質およびＣＤ３またはＣＤ２８のようなＴ細胞共刺激性受容体に対する二特異性抗体または抗体フラグメント；またはヒトＩＬ−２およびＮＤＶ ＨＮタンパク質に対する一本鎖抗体の融合タンパク質)を含む。例えば、引用によりその全体を本明細書に包含させるZamarin et al. Future Microbiol. 7.3(2012):347-67参照。ある態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、各々引用によりその全体を本明細書に包含させるＵＳ８５９１８８１Ｂ２号、ＵＳ２０１２／０１２２１８５Ａ１号またはＵＳ２０１４／０２７１６７７Ａ１号に記載のキメラ腫瘍溶解性ＮＤＶである。
ある態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、排他的に癌細胞において複製するよう設計された、条件的複製アデノウイルス(ＣＲＡｄ)である。例えば、Alemany et al. Nature Biotechnol. 18(2000):723-27参照。ある態様において、腫瘍溶解性アデノウイルスは、その全体を引用により本明細書に包含させるAlemany et al.の７２５頁の表１に記載のものを含む。
腫瘍溶解性ウイルスの例は、次のものを含むが、これらに限定されない。
Ｂ群腫瘍溶解性アデノウイルス(ColoAd1)(PsiOxus Therapeutics Ltd.)(例えば、Clinical Trial Identifier: NCT02053220参照)；
顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)を含むアデノウイルスであるＯＮＣＯＳ−１０２(以前はＣＧＴＧ−１０２と呼ばれた)(Oncos Therapeutics)(例えば、 Clinical Trial Identifier: NCT01598129参照)；
ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼをコードする遺伝的に修飾された腫瘍溶解性ヒトアデノウイルスであるＶＣＮ−０１(VCN Biosciences, S.L.)(例えば、Clinical Trial Identifiers: NCT02045602およびNCT02045589参照)；
網膜芽細胞腫／Ｅ２Ｆ経路の脱制御を伴い癌細胞で選択的に複製するように修飾されている野生型ヒトアデノウイルス血清型５(Ｈａｄ５)由来のウイルスである条件的複製アデノウイルスＩＣＯＶＩＲ−５(Institut Catala d'Oncologia)(例えば、Clinical Trial Identifier: NCT01864759参照)；
ＩＣＯＶＩＲ５、腫瘍溶解性アデノウイルスで感染させた骨髄由来自己間葉性幹細胞(ＭＳＣ)を含むCelyvir(Hospital Infantil Universitario Nino Jesus, Madrid, Spain／Ramon Alemany)(例えば、Clinical Trial Identifier: NCT01844661参照)；
ヒトＥ２Ｆ−１プロモーターが必須Ｅ１ａウイルス遺伝子の発現を駆動し、それによりＲｂ経路欠損腫瘍細ウイルス複製および細胞毒性を制限する、条件複製腫瘍溶解性血清型５アデノウイルス(Ａｄ５)であるＣＧ００７０胞に対する(Cold Genesys, Inc.)(例えば、Clinical Trial Identifier: NCT02143804参照)；または
路網膜芽細胞腫(Ｒｂ)経路欠損細胞で選択的に複製し、ある種のＲＧＤ結合インテグリンをより効率的に発現する細胞に感染するように操作されているアデノウイルスであるＤＮＸ−２４０１(以前の名前デルタ−２４−ＲＧＤ)(Clinica Universidad de Navarra, Universidad de Navarra／ DNAtrix, Inc.)(例えば、Clinical Trial Identifier: NCT01956734参照)。
ある態様において、ここに記載する腫瘍溶解性ウイルスを、注射、例えば、皮下、動脈内、静脈内、筋肉内、髄腔内または腹腔内注射により投与する。ある態様において、ここに記載する腫瘍溶解性ウイルスを、腫瘍内、経皮、経粘膜、経口、鼻腔内または肺投与により投与する。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞を、Ｔｒｅｇ細胞集団を減少させる分子と組み合わせて対象に投与する。Ｔｒｅｇ細胞数を減らす(例えば、枯渇させる)方法は当分野で知られ、例えば、ＣＤ２５枯渇、シクロホスファミド投与、ＧＩＴＲ機能修飾を含む。理論に縛られることを望まないが、アフェレーシス前またはここに記載するＣＡＲ発現細胞投与前に対象におけるＴｒｅｇ細胞数を減らすことは、腫瘍微小環境における望まない免疫細胞(例えば、Ｔｒｅｇ)の数を減らし、対象の再発のリスクを減らすと考えられる。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象に、制御性Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)を枯渇させるＧＩＴＲアゴニストおよび／またはＧＩＴＲ抗体のようなＧＩＴＲを標的とするおよび／またはＧＩＴＲ機能を調節する分子と組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞を、対象にシクロホスファミドと組み合わせて投与する。ある態様において、ＧＩＴＲ結合分子および／またはＧＩＴＲ機能を調節する分子(例えば、ＧＩＴＲアゴニストおよび／またはＴｒｅｇ枯渇ＧＩＴＲ抗体)を、ＣＡＲ発現細胞の前に投与する。例えば、ある態様において、ＧＩＴＲアゴニストを、細胞のアフェレーシス前に投与できる。ある態様において、シクロホスファミドを、対象にＣＡＲ発現細胞の投与(例えば、注入または再注入)前または細胞のアフェレーシス前に投与する。ある態様において、シクロホスファミドおよび抗ＧＩＴＲ抗体を、対象にＣＡＲ発現細胞の投与(例えば、注入または再注入)前または細胞のアフェレーシス前に投与する。ある態様において、対象は癌(例えば、固形癌またはＡＬＬまたはＣＬＬのような血液癌)を有する。ある態様において、対象はＣＬＬを有する。ある態様において、対象はＡＬＬを有する。ある態様において、対象は固形癌、例えば、ここに記載する固形癌を有する。ＧＩＴＲアゴニストの例は、例えば、米国特許６,１１１,０９０号、欧州特許０９０５０５Ｂ１号、米国特許８,５８６,０２３号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１０／００３１１８号および２０１１／０９０７５４号に記載のＧＩＴＲ融合タンパク質または、例えば、米国特許７,０２５,９６２号、欧州特許１９４７１８３Ｂ１号、米国特許７,８１２,１３５号、米国特許８,３８８,９６７号、米国特許８,５９１,８８６号、欧州特許ＥＰ１８６６３３９号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０２８６８３号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／０３９９５４号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／００７１９０号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００７／１３３８２２号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／０５５８０８号、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／４０１９６号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００１／０３７２０号、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／２０７５８号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０８３２８９号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／１１５４５１号、米国特許７,６１８,６３２号およびＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０５１７２６号に記載のような抗ＧＩＴＲ抗体のような、例えば、ＧＩＴＲ融合タンパク質および抗ＧＩＴＲ抗体(例えば、二価抗ＧＩＴＲ抗体)を含む。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、エベロリムスのようなラパログと組み合わせて対象に投与する。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤を、ＣＡＲ発現細胞の前に投与する。例えば、ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤を、細胞のアフェレーシス前に投与できる。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＧＩＴＲアゴニスト、例えば、ここに記載するＧＩＴＲアゴニストと組み合わせて対象に投与する。ある態様において、ＧＩＴＲアゴニストを、ＣＡＲ発現細胞の前に投与する。例えば、ある態様において、ＧＩＴＲアゴニストを、細胞のアフェレーシス前に投与できる。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤、例えば、ここに記載するタンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤と組み合わせて対象に投与する。ある態様において、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤は、ＳＨＰ−１阻害剤、例えば、スチボグルコン酸ナトリウムのような、例えば、ここに記載するＳＨＰ−１阻害剤である。ある態様において、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤はＳＨＰ−２阻害剤である。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、キナーゼ阻害剤と組み合わせて使用できる。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＣＤＫ４阻害剤、例えば、ここに記載するＣＤＫ４阻害剤、例えば、６−アセチル−８−シクロペンチル−５−メチル−２−(５−ピペラジン−１−イル−ピリジン−２−イルアミノ)−８Ｈ−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−オン、ヒドロクロライド(パルボシクリブまたはＰＤ０３３２９９１とも呼ばれる)のような、例えば、ＣＤ４／６阻害剤である。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＢＴＫ阻害剤、例えば、イブルチニブのような、例えば、ここに記載するＢＴＫ阻害剤である。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシン、ラパマイシンアナログ、ＯＳＩ−０２７のような、例えば、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤である。ｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、ｍＴＯＲＣ１阻害剤および／またはｍＴＯＲＣ２阻害剤、例えば、ここに記載するｍＴＯＲＣ１阻害剤および／またはｍＴＯＲＣ２阻害剤であり売る。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＭＮＫ阻害剤、例えば、４−アミノ−５−(４−フルオロアニリノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンのような、例えば、ここに記載するＭＮＫ阻害剤である。ＭＮＫ阻害剤は、例えば、ＭＮＫ１ａ、ＭＮＫ１ｂ、ＭＮＫ２ａおよび／またはＭＮＫ２ｂ阻害剤であり得る。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、例えば、ＰＦ−０４６９５１０２のような、ここに記載するデュアルＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤である。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＤＧＫ阻害剤、例えば、ＤＧＫｉｎｈ１(Ｄ５９１９)またはＤＧＫｉｎｈ２(Ｄ５７９４)のような、例えば、ここに記載するＤＧＫ阻害剤である。
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、アロイシンＡ；フラボピリドールまたはＨＭＲ−１２７５、２−(２−クロロフェニル)−５,７−ジヒドロキシ−８−[(３Ｓ,４Ｒ)−３−ヒドロキシ−１−メチル−４−ピペリジニル]−４−クロメノン；クリゾチニブ(ＰＦ−０２３４１０６６；２−(２−クロロフェニル)−５,７−ジヒドロキシ−８−[(２Ｒ,３Ｓ)−２−(ヒドロキシメチル)−１−メチル−３−ピロリジニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、ヒドロクロライド(Ｐ２７６−００)；１−メチル−５−[[２−[５−(トリフルオロメチル)−１Ｈ−イミダゾール−２−イル]−４−ピリジニル]オキシ]−Ｎ−[４−(トリフルオロメチル)フェニル]−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−アミン(ＲＡＦ２６５)；インジスラム(Ｅ７０７０)；ロスコビチン(ＣＹＣ２０２)；パルボシクリブ(ＰＤ０３３２９９１)；ジナシクリブ(ＳＣＨ７２７９６５)；Ｎ−[５−[[(５−ｔｅｒｔ−ブチルオキサゾール−２−イル)メチル]チオ]チアゾール−２−イル]ピペリジン−４−カルボキサミド(ＢＭＳ ３８７０３２)；４−[[９−クロロ−７−(２,６−ジフルオロフェニル)−５Ｈ−ピリミド[５,４−ｄ][２]ベンズアゼピン−２−イル]アミノ]−安息香酸(ＭＬＮ８０５４)；５−[３−(４,６−ジフルオロ−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル)−１Ｈ−インダゾール−５−イル]−Ｎ−エチル−４−メチル−３−ピリジンメタンアミン(ＡＧ−０２４３２２)；４−(２,６−ジクロロベンゾイルアミノ)−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸Ｎ−(ピペリジン−４−イル)アミド(ＡＴ７５１９)；４−[２−メチル−１−(１−メチルエチル)−１Ｈ−イミダゾール−５−イル]−Ｎ−[４−(メチルスルホニル)フェニル]−２−ピリミジンアミン(ＡＺＤ５４３８)；およびＸＬ２８１(ＢＭＳ９０８６６２)から選択されるＣＤＫ４阻害剤である。
ある態様において、キナーゼ阻害剤はＣＤＫ４阻害剤、例えば、パルボシクリブ(ＰＤ０３３２９９１)であり、パルボシクリブを、一定期間、１日約５０mg、６０mg、７０mg、７５mg、８０mg、９０mg、１００mg、１０５mg、１１０mg、１１５mg、１２０mg、１２５mg、１３０mg、１３５mg(例えば、７５mg、１００mgまたは１２５mg)の用量で、例えば、２８日サイクルの１４〜２１日間連日または２１日サイクルの７〜１２日間連日投与する。ある態様において、１サイクル、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクル、６サイクル、７サイクル、８サイクル、９サイクル、１０サイクル、１１サイクル、１２サイクルまたはそれ以上のパルボシクリブを投与する。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、サイクリン依存性キナーゼ(ＣＤＫ)４または６阻害剤、例えば、ここに記載するＣＤＫ４阻害剤またはＣＤＫ６阻害剤と組み合わせて対象に投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＣＤＫ４／６阻害剤(例えば、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６の両者を標的とする阻害剤)、例えば、ここに記載するＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせて対象に投与する。ある態様において、対象は、ＭＣＬを有する。ＭＣＬは、現在利用可能な治療にはほとんど応答しない、すなわち、本質的に不治の侵襲性癌である。ＭＣＬの多くの症例で、サイクリンＤ１(ＣＤＫ４／６のレギュレーター)が、ＭＣＬ細胞で発現される(例えば、免疫グロブリンおよびサイクリンＤ１遺伝子が関与する染色体転座のため)。それゆえに、理論に縛られないが、ＭＣＬ細胞は、高特異性(すなわち、正常免疫細胞に対する最小限の影響)でＣＤＫ４／６阻害に高度に感受性であると考えられる。ＣＤＫ４／６阻害剤単独で、ＭＣＬの処置にいくぶん有効性を有しているが、部分的寛解しか達成されず、高再発率である。ＣＤＫ４／６阻害剤の例はＬＥＥ０１１(リボシクリブ)であり、その構造を下に示す。
理論に縛られないが、ここに記載するＣＡＲ発現細胞とＣＤＫ４／６阻害剤(例えば、ＬＥＥ０１１または他のここに記載するＣＤＫ４／６阻害剤)の投与は、例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤単独と比較して、高い応答性、例えば、高い寛解率および／または低い再発率を達成すると考えられる。
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、イブルチニブ(ＰＣＩ−３２７６５)；ＧＤＣ−０８３４；ＲＮ−４８６；ＣＧＩ−５６０；ＣＧＩ−１７６４；ＨＭ−７１２２４；ＣＣ−２９２；ＯＮＯ−４０５９；ＣＮＸ−７７４；およびＬＦＭ−Ａ１３から選択されるＢＴＫ阻害剤である。好ましい態様において、ＢＴＫ阻害剤はインターロイキン−２−誘導性キナーゼ(ＩＴＫ)のキナーゼ活性を低減または阻害せず、ＧＤＣ−０８３４；ＲＮ−４８６；ＣＧＩ−５６０；ＣＧＩ−１７６４；ＨＭ−７１２２４；ＣＣ−２９２；ＯＮＯ−４０５９；ＣＮＸ−７７４；およびＬＦＭ−Ａ１３から選択される。
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＢＴＫ阻害剤、例えば、イブルチニブ(ＰＣＩ−３２７６５)である。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＢＴＫ阻害剤(例えば、イブルチニブ)と組み合わせて対象に投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、イブルチニブ(ＰＣＩ−３２７６５とも称す)と組み合わせて対象に投与する。イブルチニブ(１−[(３Ｒ)−３−[４−アミノ−３−(４−フェノキシフェニル)−１Ｈ−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−１−イル]ピペリジン−１−イル]プロプ−２−エン−１−オン)の構造を下に示す。
ある態様において、対象はＣＬＬ、マントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)または小リンパ球性リンパ腫(ＳＬＬ)を有する。例えば、対象は、染色体１７の短腕に欠失を有する(例えば、白血病性細胞におけるｄｅｌ(１７ｐ))。他の例において、対象は、ｄｅｌ(１７ｐ)を有しない。ある態様において、対象は再発したＣＬＬまたはＳＬＬを有し、例えば、対象は、先に癌治療を投与されている(例えば、先に１、２、３または４癌治療を投与されている)。ある態様において、対象は、難治性ＣＬＬまたはＳＬＬを有する。他の態様において、対象は、濾胞性リンパ腫、例えば、再発性または難治性濾胞性リンパ腫を有する。ある態様において、イブルチニブを、約３００〜６００mg／日(例えば、約３００〜３５０、３５０〜４００、４００〜４５０、４５０〜５００、５００〜５５０または５５０〜６００mg／日、例えば、約４２０mg／日または約５６０mg／日)、例えば、経口。ある態様において、イブルチニブを、約２５０mg、３００mg、３５０mg、４００mg、４２０mg、４４０mg、４６０mg、４８０mg、５００mg、５２０mg、５４０mg、５６０mg、５８０mg、６００mg(例えば、２５０mg、４２０mgまたは５６０mg)の用量で、連日一定期間、例えば、２１日サイクルで連日または２８日サイクルで連日投与する。ある態様において、１サイクル、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクル、６サイクル、７サイクル、８サイクル、９サイクル、１０サイクル、１１サイクル、１２サイクルまたはそれ以上のイブルチニブを投与する。ある態様において、イブルチニブを、リツキシマブと組み合わせて投与する。例えば、Burger et al. (2013) Ibrutinib In Combination With Rituximab (iR) Is Well Tolerated and Induces a High Rate Of Durable Remissions In Patients With High-Risk Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL): New, Updated Results Of a Phase II Trial In 40 Patients, Abstract 675 presented at 55th ASH Annual Meeting and Exposition, New Orleans, LA 7-10 Dec参照。理論に縛られないが、イブルチニブの添加はＴ細胞増殖性応答を増強し、Ｔ細胞をＴ−ヘルパー−２(Ｔｈ２)からＴ−ヘルパー−１(Ｔｈ１)表現型にシフトさせると考えられる。Ｔｈ１およびＴｈ２は、ヘルパーＴ細胞の表現型であり、Ｔｈ１とＴｈ２で異なる免疫応答経路を指向する。Ｔｈ１表現型は、例えば、細胞内病原体／ウイルスまたは癌性細胞のような細胞を殺すための、炎症誘発性応答または自己免疫性応答永続化と関係する。Ｔｈ２表現型は、好酸球蓄積および抗炎症性応答と関係する。
ここでの方法、使用および組成物のある態様において、ＢＴＫ阻害剤は、引用によりその全体を本明細書に包含させる国際出願ＷＯ／２０１５／０７９４１７号に記載のＢＴＫ阻害剤である。例えば、ある態様において、ＢＴＫ阻害剤は、式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩である。
〔式中、
Ｒ１は水素、場合によりヒドロキシで置換されていてよいＣ１−Ｃ６アルキルであり；
Ｒ２は水素またはハロゲンであり；
Ｒ３は水素またはハロゲンであり；
Ｒ４は水素であり、
Ｒ５は水素またはハロゲンであり；
またはＲ４とＲ５は互いに結合し、結合、−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−；−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−；または−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−を意味し；
Ｒ６およびＲ７は互いに独立してＨ、場合によりヒドロキシで置換されていてよいＣ１−Ｃ６アルキル、場合によりハロゲンまたはヒドロキシまたはハロゲンで置換されていてよいＣ３−Ｃ６シクロアルキルであり；
Ｒ８、Ｒ９、Ｒ、Ｒ’、Ｒ１０およびＲ１１は互いに独立してＨまたは場合によりＣ１−Ｃ６アルコキシで置換されていてよいＣ１−Ｃ６アルキルであり；またはＲ８、Ｒ９、Ｒ、Ｒ’、Ｒ１０およびＲ１１のいずれかの２個は、それらが結合している炭素原子と一体となって３〜６員飽和炭素環式環を形成してよく；
Ｒ１２は水素または場合によりハロゲンもしくはＣ１−Ｃ６アルコキシで置換されていてよいＣ１−Ｃ６アルキルであり；
またはＲ１２とＲ８、Ｒ９、Ｒ、Ｒ’、Ｒ１０またはＲ１１のいずれか一つは、それらが結合している原子と一体となって、４員、５員、６員または７員アザシクロ環を形成してよく、該環は場合によりハロゲン、シアノ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ１−Ｃ６アルコキシで置換されていてよく；
ｎは０または１であり；
Ｒ１３は場合によりＣ１−Ｃ６アルキルで置換されていてよいＣ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシまたは場合によりＣ１−Ｃ６アルキルもしくはＣ１−Ｃ６アルコキシで置換されていてよいＮ,Ｎ−ジ−Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノＣ２−Ｃ６アルキニル；または場合によりＣ１−Ｃ６アルキルで置換されていてよいＣ２−Ｃ６アルキレニルオキシドである。〕。
ある態様において、式ＩのＢＴＫ阻害剤は、Ｎ−(３−(５−((１−アクリロイルアゼチジン−３−イル)オキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｅ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−((１−(ブト−２−エノイル)アゼチジン−３−イル)オキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−((１−プロピオロイルアゼチジン−３−イル)オキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−((１−(ブト−２−イノイル)アゼチジン−３−イル)オキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(５−((１−アクリロイルピペリジン−４−イル)オキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−メチルアクリルアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｅ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−メチルブト−２−エンアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−メチルプロピオｌアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｅ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(４−メトキシ−Ｎ−メチルブト−２−エンアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−メチルブト−２−インアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(２−((４−アミノ−６−(３−(４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)ピリミジン−５−イル)オキシ)エチル)−Ｎ−メチルオキシラン−２−カルボキサミド；Ｎ−(２−((４−アミノ−６−(３−(６−シクロプロピル−８−フルオロ−１−オキソイソキノリン−２(１Ｈ)−イル)フェニル)ピリミジン−５−イル)オキシ)エチル)−Ｎ−メチルアクリルアミド；Ｎ−(３−(５−(２−アクリルアミドエトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−エチルアクリルアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−(２−フルオロエチル)アクリルアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(５−((１−アクリルアミドシクロプロピル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(５−(２−アクリルアミドプロポキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(ブト−２−インアミド)プロポキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−メチルアクリルアミド)プロポキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−メチルブト−２−インアミド)プロポキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(３−(Ｎ−メチルアクリルアミド)プロポキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(５−((１−アクリロイルピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−((１−(ブト−２−イノイル)ピロリジン−２−イル)メトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−２−(３−(５−((１−アクリロイルピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−(ヒドロキシメチル)フェニル)−６−シクロプロピル−３,４−ジヒドロイソキノリン−１(２Ｈ)−オンＮ−(２−((４−アミノ−６−(３−(６−シクロプロピル−１−オキソ−３,４−ジヒドロイソキノリン−２(１Ｈ)−イル)−５−フルオロ−２−(ヒドロキシメチル)フェニル)ピリミジン−５−イル)オキシ)エチル)−Ｎ−メチルアクリルアミド；Ｎ−(３−(５−(((２Ｓ,４Ｒ)−１−アクリロイル−４−メトキシピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(((２Ｓ,４Ｒ)−１−(ブト−２−イノイル)−４−メトキシピロリジン−２−イル)メトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；２−(３−(５−(((２Ｓ,４Ｒ)−１−アクリロイル−４−メトキシピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−(ヒドロキシメチル)フェニル)−６−シクロプロピル−３,４−ジヒドロイソキノリン−１(２Ｈ)−オンＮ−(３−(５−(((２Ｓ,４Ｓ)−１−アクリロイル−４−メトキシピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(((２Ｓ,４Ｓ)−１−(ブト−２−イノイル)−４−メトキシピロリジン−２−イル)メトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(５−(((２Ｓ,４Ｒ)−１−アクリロイル−４−フルオロピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(((２Ｓ,４Ｒ)−１−(ブト−２−イノイル)−４−フルオロピロリジン−２−イル)メトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(５−((１−アクリロイルアゼチジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−((１−プロピオロイルアゼチジン−２−イル)メトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−２−(３−(５−((１−アクリロイルアゼチジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−(ヒドロキシメチル)フェニル)−６−シクロプロピル−３,４−ジヒドロイソキノリン−１(２Ｈ)−オン；(Ｒ)−Ｎ−(３−(５−((１−アクリロイルアゼチジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｒ)−Ｎ−(３−(５−((１−アクリロイルピペリジン−３−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(５−(((２Ｒ,３Ｓ)−１−アクリロイル−３−メトキシピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(５−(((２Ｓ,４Ｒ)−１−アクリロイル−４−シアノピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；またはＮ−(３−(５−(((２Ｓ,４Ｓ)−１−アクリロイル−４−シアノピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミドから選択される。
特に断らない限り、上記式ＩのＢＴＫ阻害剤で使用した化学的用語は、引用によりその全体を本明細書に包含させる国際出願ＷＯ／２０１５／０７９４１７号に示す意味に従い使用する。
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、テムシロリムス；リダフォロリムス(１Ｒ,２Ｒ,４Ｓ)−４−[(２Ｒ)−２−[(１Ｒ,９Ｓ,１２Ｓ,１５Ｒ,１６Ｅ,１８Ｒ,１９Ｒ,２１Ｒ、２３Ｓ,２４Ｅ,２６Ｅ,２８Ｚ,３０Ｓ,３２Ｓ,３５Ｒ)−１,１８−ジヒドロキシ−１９,３０−ジメトキシ−１５,１７,２１,２３、２９,３５−ヘキサメチル−２,３,１０,１４,２０−ペンタオキソ−１１,３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ[３０.３.１.０４,９]ヘキサトリアコンタ−１６,２４,２６,２８−テトラエン−１２−イル]プロピル]−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネート、ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９としても知られる；エベロリムス(ＲＡＤ００１)；ラパマイシン(ＡＹ２２９８９)；セマピモド；(５−{２,４−ビス[(３Ｓ)−３−メチルモルホリン−４−イル]ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−イル}−２−メトキシフェニル)メタノール(ＡＺＤ８０５５)；２−アミノ−８−[ｔｒａｎｓ−４−(２−ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]−６−(６−メトキシ−３−ピリジニル)−４−メチル−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７(８Ｈ)−オン(ＰＦ０４６９１５０２)；およびＮ２−[１,４−ジオキソ−４−[[４−(４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル)モルホリニウム−４−イル]メトキシ]ブチル]−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリン−(配列番号３７８)、分子内塩(ＳＦ１１２６)；およびＸＬ７６５から選択されるｍＴＯＲ阻害剤である。
ある態様において、キナーゼ阻害剤はｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンであり、ラパマイシンを、約３mg、４mg、５mg、６mg、７mg、８mg、９mg、１０mg(例えば、６mg)の用量で連日、一定期間、例えば、２１日サイクルで連日または２８日サイクルで連日投与する。ある態様において、１サイクル、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクル、６サイクル、７サイクル、８サイクル、９サイクル、１０サイクル、１１サイクル、１２サイクルまたはそれ以上のラパマイシンを投与する。ある態様において、キナーゼ阻害剤はｍＴＯＲ阻害剤、例えば、エベロリムスであり、エベロリムスを、一定期間、１日約２mg、２.５mg、３mg、４mg、５mg、６mg、７mg、８mg、９mg、１０mg、１１mg、１２mg、１３mg、１４mg、１５mg(例えば、１０mg)の用量で、例えば、２８日サイクルで連日投与する。ある態様において、１サイクル、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクル、６サイクル、７サイクル、８サイクル、９サイクル、１０サイクル、１１サイクル、１２サイクルまたはそれ以上のエベロリムスを投与する。
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＣＧＰ０５２０８８；４−アミノ−３−(ｐ−フルオロフェニルアミノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン(ＣＧＰ５７３８０)；セルコスポラミド；ＥＴＣ−１７８０４４５〜２；および４−アミノ−５−(４−フルオロアニリノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンから選択されるＭＮＫ阻害剤である。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ホスホイノシチド３−キナーゼ(ＰＩ３Ｋ)阻害剤(例えば、ここに記載するＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば、イデラリシブまたはドゥベリシブ)および／またはリツキシマブと組み合わせて対象に投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、イデラリシブおよびリツキシマブと組み合わせて対象に投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ドゥベリシブおよびリツキシマブと組み合わせて対象に投与する。イデラリシブ(ＧＳ−１１０１またはＣＡＬ−１０１とも呼ばれる；Gilead)は、ＰＩ３Ｋのデルタアイソフォームを遮断する小分子である。イデラリシブ(５−フルオロ−３−フェニル−２−[(１Ｓ)−１−(７Ｈ−プリン−６−イルアミノ)プロピル]−４(３Ｈ)−キナゾリノン)の構造を下に示す。
ドゥベリシブ(ＩＰＩ−１４５とも呼ばれる；Infinity PharmaceuticalsおよびAbbvie)は、ＰＩ３Ｋ−δ,γを遮断する小分子である。ドゥベリシブ(８−クロロ−２−フェニル−３−[(１Ｓ)−１−(９Ｈ−プリン−６−イルアミノ)エチル]−１(２Ｈ)−イソキノリノン)の構造を下に示す。
ある態様において、対象はＣＬＬを有する。ある態様において、対象は再発したＣＬＬを有し、例えば、対象は、先に癌治療を投与されている(例えば、先に抗ＣＤ２０抗体を投与されているかまたは先にイブルチニブを投与されている)。例えば、対象は、染色体１７の短腕に欠失を有する(例えば、白血病性細胞におけるｄｅｌ(１７ｐ))。他の例において、対象は、ｄｅｌ(１７ｐ)を有しない。ある態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶＨ)遺伝子に変異を含む白血病性細胞を含む。他の態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶＨ)に変異を含む白血病性細胞を含まない。ある態様において、対象は、染色体１１の長腕に欠失を有する(ｄｅｌ(１１ｑ))。他の態様において、対象はｄｅｌ(１１ｑ)を有しない。ある態様において、イデラリシブを、約１００〜４００mg(例えば、１００〜１２５mg、１２５〜１５０mg、１５０〜１７５mg、１７５〜２００mg、２００〜２２５mg、２２５〜２５０mg、２５０〜２７５mg、２７５〜３００mg、３２５〜３５０mg、３５０〜３７５mgまたは３７５〜４００mg)、例えば、ＢＩＤ投与する。ある態様において、ドゥベリシブを、約１５〜１００mg(例えば、約１５〜２５、２５〜５０、５０〜７５または７５〜１００mg)、例えば、１日２回投与する。ある態様において、リツキシマブを、約３５０〜５５０mg／ｍ２(例えば、３５０〜３７５mg／ｍ２、３７５〜４００mg／ｍ２、４００〜４２５mg／ｍ２、４２５〜４５０mg／ｍ２、４５０〜４７５mg／ｍ２または４７５〜５００mg／ｍ２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、２−アミノ−８−[ｔｒａｎｓ−４−(２−ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]−６−(６−メトキシ−３−ピリジニル)−４−メチル−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７(８Ｈ)−オン(ＰＦ−０４６９１５０２)；Ｎ−[４−[[４−(ジメチルアミノ)−１−ピペリジニル]カルボニル]フェニル]−Ｎ’−[４−(４,６−ジ−４−モルホリニル−１,３,５−トリアジン−２−イル)フェニル]尿素(ＰＦ−０５２１２３８４、ＰＫＩ−５８７)；２−メチル−２−{４−[３−メチル−２−オキソ−８−(キノリン−３−イル)−２,３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−１−イル]フェニル}プロパンニトリル(ＢＥＺ−２３５)；アピトリシブ(ＧＤＣ−０９８０、ＲＧ７４２２)；２,４−ジフルオロ−Ｎ−{２−(メチルオキシ)−５−[４−(４−ピリダジニル)−６−キノリニル]−３−ピリジニル}ベンゼンスルホンアミド(ＧＳＫ２１２６４５８)；８−(６−メトキシピリジン−３−イル)−３−メチル−１−(４−(ピペラジン−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル)−１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−２(３Ｈ)−オンマレイン酸(ＮＶＰ−ＢＧＴ２２６)；３−[４−(４−モルホリニルピリド[３’,２’：４,５]フロ[３,２−ｄ]ピリミジン−２−イル]フェノール(ＰＩ−１０３)；５−(９−イソプロピル−８−メチル−２−モルホリノ−９Ｈ−プリン−６−イル)ピリミジン−２−アミン(ＶＳ−５５８４、ＳＢ２３４３)；およびＮ−[２−[(３,５−ジメトキシフェニル)アミノ]キノキサリン−３−イル]−４−[(４−メチル−３−メトキシフェニル)カルボニル]アミノフェニルスルホンアミド(ＸＬ７６５)から選択されるデュアルホスファチジルイノシトール３−キナーゼ(ＰＩ３Ｋ)およびｍＴＯＲ阻害剤である。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、未分化リンパ腫キナーゼ(ＡＬＫ)阻害剤と組み合わせて対象に投与する。ＡＬＫキナーゼの例は、クリゾチニブ(Pfizer)、セリチニブ(Novartis)、アレクチニブ(中外)、ブリガチニブ(ＡＰ２６１１３とも呼ばれる；Ariad)、エントレクチニブ(Ignyta)、ＰＦ−０６４６３９２２(Pfizer)、ＴＳＲ−０１１(Tesaro)(例えば、Clinical Trial Identifier No. NCT02048488参照)、ＣＥＰ−３７４４０(Teva)およびＸ−３９６(Xcovery)を含む。ある態様において、対象は固形癌、例えば、ここに記載する固形癌、例えば、肺癌を有する。
クリゾチニブの化学名は３−[(１Ｒ)−１−(２,６−ジクロロ−３−フルオロフェニル)エトキシ]−５−(１−ピペリジン−４−イルピラゾール−４−イル)ピリジン−２−アミンである。セリチニブの化学名は５−クロロ−Ｎ２−[２−イソプロポキシ−５−メチル−４−(４−ピペリジニル)フェニル]−Ｎ４−[２−(イソプロピルスルホニル)フェニル]−２,４−ピリミジンジアミンである。アレクチニブの化学名は９−エチル−６,６−ジメチル−８−(４−モルホリノピペリジン−１−イル)−１１−オキソ−６,１１−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ[ｂ]カルバゾール−３−カルボニトリルである。ブリガチニブの化学名は５−クロロ−Ｎ２−{４−[４−(ジメチルアミノ)−１−ピペリジニル]−２−メトキシフェニル}−Ｎ４−[２−(ジメチルホスホリル)フェニル]−２,４−ピリミジンジアミンである。エントレクチニブの化学名はＮ−(５−(３,５−ジフルオロベンジル)−１Ｈ−インダゾール−３−イル)−４−(４−メチルピペラジン−１−イル)−２−((テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル)アミノ)ベンズアミドである。ＰＦ−０６４６３９２２の化学名は(１０Ｒ)−７−アミノ−１２−フルオロ−２,１０,１６−トリメチル−１５−オキソ−１０,１５,１６,１７−テトラヒドロ−２Ｈ−８,４−(メテノ)ピラゾロ[４,３−ｈ][２,５,１１]−ベンズオキサジアザシクロテトラデシン−３−カルボニトリルである。ＣＥＰ−３７４４０の化学名は(Ｓ)−２−((５−クロロ−２−((６−(４−(２−ヒドロキシエチル)ピペラジン−１−イル)−１−メトキシ−６,７,８,９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾ[７]アヌレン−２−イル)アミノ)ピリミジン−４−イル)アミノ)−Ｎ−メチルベンズアミドである。Ｘ−３９６の化学名は(Ｒ)−６−アミノ−５−(１−(２,６−ジクロロ−３−フルオロフェニル)エトキシ)−Ｎ−(４−(４−メチルピペラジン−１−カルボニル)フェニル)ピリダジン−３−カルボキサミドである。
カルシウム依存的ホスファターゼカルシニューリンを阻害する(シクロスポリンおよびＦＫ５０６)または増殖因子誘発シグナル伝達に重要であるｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する薬物(ラパマイシン)(Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993)も使用できる。さらなる面において、本発明の細胞組成物を、患者に骨髄移植、フルダラビンのような化学療法剤、体外照射療法(ＸＲＴ)、シクロホスファミドおよび／またはＯＫＴ３またはキャンパスのような抗体を使用するＴ細胞除去療法と組み合わせて(例えば、前に、同時にまたは後に)投与し得る。ある面において、本発明の細胞組成物を、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、リツキサンのようなＢ細胞除去療法後に投与する。例えば、ある態様において、対象を、高用量化学療法剤と続く末梢血幹細胞移植の標準的処置に付す。ある態様において、移植後、対象は、本発明の増殖した免疫細胞の注入を受ける。さらなる態様において、増殖細胞を手術の前または後に投与する。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、インドールアミン２,３−ジオキシゲナーゼ(ＩＤＯ)阻害剤と組み合わせて対象に投与する。ＩＤＯは、アミノ酸、Ｌ−トリプトファンのキヌレニンへの分解を触媒する酵素である。多くの癌、例えば、前立腺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、子宮頸癌、胃癌、卵巣癌、頭部癌および肺癌がＩＤＯを過発現する。ｐＤＣ、マクロファージおよび樹状細胞(ＤＣ)がＩＤＯを発現できる。理論に縛られないが、Ｌ−トリプトファンの減少(例えば、ＩＤＯによる触媒)が、Ｔ細胞アネルギーおよびアポトーシスの誘発による免疫抑制性環境をもたらすと考えられる。それゆえに、理論に縛られないが、ＩＤＯ阻害剤が、例えば、ＣＡＲ発現免疫細胞の抑制または死を減少させることによりここに記載するＣＡＲ発現細胞の効果を増強できると考えられる。ある態様において、対象は、固形腫瘍、例えば、ここに記載する固形腫瘍、例えば、前立腺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、子宮頸癌、胃癌、卵巣癌、頭部癌または肺癌を有する。ＩＤＯ阻害剤の例は、１−メチル−トリプトファン、インドキシモド(NewLink Genetics)(例えば、Clinical Trial Identifier Nos. NCT01191216; NCT01792050参照)およびＩＮＣＢ０２４３６０(Incyte Corp.)(例えば、Clinical Trial Identifier Nos. NCT01604889; NCT01685255参照)を含むが、これらに限定されない。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、骨髄由来サプレッサー細胞(ＭＤＳＣ)のモジュレーターと組み合わせて対象に投与する。ＭＤＳＣは、末梢および多くの固形腫瘍の腫瘍部位に蓄積する。これらの細胞はＴ細胞応答を抑制し、それによりＣＡＲ発現細胞療法の効果を障害する。理論に縛られないが、ＭＤＳＣモジュレーター投与は、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の効果を増強すると考えられる。ある態様において、対象は、固形腫瘍、例えば、ここに記載する固形腫瘍、例えば、神経膠芽腫を有する。ＭＤＳＣのモジュレーターの例は、ＭＣＳ１１０およびＢＬＺ９４５を含むが、これらに限定されない。ＭＣＳ１１０は、マクロファージコロニー刺激因子(Ｍ−ＣＳＦ)に対するモノクローナル抗体(ｍＡｂ)である。例えば、Clinical Trial Identifier No. NCT00757757参照。ＢＬＺ９４５は、コロニー刺激因子１受容体(ＣＳＦ１Ｒ)の小分子阻害剤である。例えば、Pyonteck et al. Nat. Med. 19(2013):1264-72参照。ＢＬＺ９４５の構造を下に示す。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＣＤ１９ ＣＡＲＴ細胞(例えば、引用により本明細書に包含するＷＯ２０１２／０７９０００号に記載のような、例えば、ＣＴＬ０１９)と組み合わせて対象に投与する。ある態様において、対象は急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、例えば、ＣＤ１９陽性ＡＭＬまたはＣＤ１９陰性ＡＭＬを有する。ある態様において、対象は、ＣＤ１９＋リンパ腫、例えば、ＣＤ１９＋非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、ＣＤ１９＋ ＦＬまたはＣＤ１９＋ ＤＬＢＣＬを有する。ある態様において、対象は再発性または難治性ＣＤ１９＋リンパ腫を有する。ある態様において、リンパ球枯渇性化学療法剤を、ＣＤ１９ ＣＡＲＴ細胞の投与前、同時または後に投与(例えば、注入)する。一例において、リンパ球枯渇性化学療法剤を、ＣＤ１９ ＣＡＲＴ細胞の投与前に対象に投与する。例えば、リンパ球枯渇性化学療法剤は、ＣＤ１９ ＣＡＲＴ細胞注入１〜４日(例えば１日、２日、３日または４日)前に終わる。ある態様において、複数用量のＣＤ１９ ＣＡＲＴ細胞を、例えば、ここに記載するように、投与する。例えば、単一用量は、約５×１０８ ＣＤ１９ ＣＡＲＴ細胞を含む。ある態様において、リンパ球枯渇性化学療法剤を、ここに記載するＣＡＲ発現細胞、例えば、非ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞の投与(例えば、注入)前、同時または後に対象に投与する。ある態様において、ＣＤ１９ ＣＡＲＴを、非ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ここに記載する非ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞の投与(例えば、注入)前、同時または後に対象に投与する。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＣＤ３３の発現と関係する疾患、例えば、ここに記載する癌の処置のために、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えば、引用により本明細書に包含させるＷＯ２０１２／０７９０００号に記載のような、例えば、ＣＴＬ０１９と組み合わせて対象に投与する。理論に縛られないが、ＣＡＲ発現細胞と組み合わせたＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞の投与は、初期細胞系譜癌細胞、例えば、癌幹細胞を標的とすることにより、免疫応答を調節することにより、制御性Ｂ細胞を枯渇することによりおよび／または腫瘍微小環境を改善することにより、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の効果を改善すると考えられる。例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞は、初期細胞系譜マーカー、例えば、癌幹細胞およびＣＤ１９発現細胞を発現する癌細胞を標的とするのに対し、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、後期細胞系譜マーカー、例えば、ＣＤ３３を発現する癌細胞を標的とする。この前処理アプローチは、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の効果を改善できる。このような態様において、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞を、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の投与(例えば、注入)前、同時または後に投与する。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲ、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲも発現する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞およびＣＤ１９ ＣＡＲを、ここに記載する癌、例えば、ＡＭＬの処置ために対象に投与する。ある態様において、一方または両方のＣＡＲ分子の配置は、初代細胞内シグナル伝達ドメインおよび共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。他の態様において、一方または両方のＣＡＲ分子の配置は、初代細胞内シグナル伝達ドメインおよび２以上、例えば、２、３、４または５またはそれ以上の共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。このような態様において、ここに記載するＣＡＲ分子およびＣＤ１９ ＣＡＲは、同一または異なる初代細胞内シグナル伝達ドメイン、同一または異なる共刺激性シグナル伝達ドメインまたは同数または異なる数の共刺激性シグナル伝達ドメインを有し得る。あるいは、ここに記載するＣＡＲおよびＣＤ１９ ＣＡＲは、スプリットＣＡＲとして配置され、そこで、ＣＡＲ分子の一方は抗原結合ドメインおよび共刺激ドメイン(例えば、４−１ＢＢ)を含み、他のＣＡＲ分子は抗原結合ドメインおよび初代細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ＣＤ３ゼータ)を含む。
ある態様において 、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、インターロイキン−１５(ＩＬ−１５)ポリペプチド、インターロイキン−１５受容体アルファ(ＩＬ−１５Ｒａ)ポリペプチドまたは両者の組み合わせ、例えば、ｈｅｔＩＬ−１５(Admune Therapeutics, LLC)と組み合わせて対象に投与する。ｈｅｔＩＬ−１５は、ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒａのヘテロ二量体非共有複合体である。ｈｅｔＩＬ−１５は、例えば、引用により本明細書に包含させる米国８,１２４,０８４、米国２０１２／０１７７５９８号、米国２００９／００８２２９９号、米国２０１２／０１４１４１３号および米国２０１１／００８１３１１号に記載されている。ある態様において、ｈｅｔ−ＩＬ−１５を皮下投与する。ある態様において、対象は、癌、例えば、固形癌、例えば、黒色腫または結腸癌を有する。ある態様において、対象は、転移癌を有する。
ある態様において、ここに記載する疾患、例えば、血液学的障害、例えば、ＡＭＬまたはＭＤＳを有する対象に、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、薬剤、例えば、細胞毒性または化学療法剤、生物学的治療(例えば、抗体、例えば、モノクローナル抗体または細胞治療)または阻害剤(例えば、キナーゼ阻害剤)と組み合わせて投与する。ある態様において、対象は、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、細胞毒性剤、例えば、ＣＰＸ−３５１(Celator Pharmaceuticals)、シタラビン、ダウノルビシン、ボサロキシン(Sunesis Pharmaceuticals)、サパシタビン(Cyclacel Pharmaceuticals)、イダルビシンまたはミトキサントロンと組み合わせて投与される。ＣＰＸ−３５１は、シタラビンおよびダウノルビシンを５：１モル比で含むリポソーム製剤である。ある態様において、対象に、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、低メチル化剤、例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、例えば、アザシチジンまたはデシタビンと組み合わせて投与する。ある態様において、対象に、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、生物学的治療、例えば、抗体または細胞治療、例えば、２２５Ａｃ−リンツズマブ(Ａｃｔｉｍａｂ−Ａ; Actinium Pharmaceuticals)、ＩＰＨ２１０２(Innate Pharma／Bristol Myers Squibb)、ＳＧＮ−ＣＤ３３Ａ(Seattle Genetics)またはゲムツズマブオゾガマイシン(マイロターグ；Pfizer)と組み合わせて投与する。ＳＧＮ−ＣＤ３３Ａは、抗ＣＤ３３抗体に結合するピロロベンゾジアゼピン二量体を含む抗体−薬物コンジュゲート(ＡＤＣ)である。Ａｃｔｉｍａｂ−Ａは、アクチニウムで標識された抗ＣＤ３３抗体(リンツズマブ)である。ＩＰＨ２１０２は、キラー免疫グロブリン様受容体(ＫＩＲ)を標的とするモノクローナル抗体である。ある態様において、対象に、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＦＬＴ３阻害剤、例えば、ソラフェニブ(Bayer)、ミドスタウリン(Novartis)、キザルチニブ(第一三共)、クレノラニブ(Arog Pharmaceuticals)、ＰＬＸ３３９７(第一三共)、ＡＫＮ−０２８(Akinion Pharmaceuticals)またはＡＳＰ２２１５(アステラス)と組み合わせて投与する。ある態様において、対象に、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、イソシトレートデヒドロゲナーゼ(ＩＤＨ)阻害剤、例えば、ＡＧ−２２１(Celgene／Agios)またはＡＧ−１２０(Agios／Celgene)と組み合わせて投与する。ある態様において、対象に、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、細胞サイクルレギュレーター、例えば、ポロ様キナーゼ１(Ｐｌｋ１)阻害剤、例えば、ボラセルチブ(Boehringer Ingelheim)；またはサイクリン依存性キナーゼ９(Ｃｄｋ９)阻害剤、例えば、アルボシジブ(Tolero Pharmaceuticals／Sanofi Aventis)と組み合わせて投与する。ある態様において、対象に、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、Ｂ細胞受容体シグナル伝達ネットワーク阻害剤、例えば、Ｂ細胞リンパ腫２(Ｂｃｌ−２)阻害剤、例えば、ベネトクラクス(Abbvie／Roche)；またはブルトン型チロシンキナーゼ(Ｂｔｋ)阻害剤、例えば、イブルチニブ(Pharmacyclics／Johnson & Johnson Janssen Pharmaceutical)と組み合わせて投与する。ある態様において、対象に、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、Ｍ１アミノペプチダーゼ阻害剤、例えば、トセドスタット(CTI BioPharma／Vernalis)；ヒストンデアセチラーゼ(ＨＤＡＣ)阻害剤、例えば、pracinostat(MEI Pharma)；多キナーゼ阻害剤、例えば、リゴサチブ(Onconova Therapeutics／Baxter／SymBio)；またはペプチド性ＣＸＣＲ４逆アゴニスト、例えば、ＢＬ−８０４０(BioLineRx)と組み合わせて投与する。ある態様において、対象に、ＣＤ３３標的ＣＡＲ発現細胞を、ＣＤ３３以外の抗原、例えば、ＣＬＬ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＦＬＴ−３または葉酸受容体ベータを標的とするＣＡＲ発現細胞と組み合わせて投与する。
他の態様において、対象は、本発明のＣＡＲＴ３３細胞組成物を、細胞の移植、例えば、同種異系幹細胞移植前に注入される。好ましい態様において、ＣＡＲＴ３３細胞は、例えば、ｍＲＮＡ抗ＣＤ３３ ＣＡＲの電気穿孔法により、ＣＡＲ３３を一過性に発現し、それによってＣＡＲ３３の発現は、生着失敗を避けるためにドナー幹細胞注入前に終了する。
投与中または後に本発明の化合物および／または他の抗癌剤に対するアレルギー反応を経験する患者がいるかもしれない；それゆえに、抗アレルギー剤を、アレルギー反応のリスクを最小化するためにしばしば投与する。適当な抗アレルギー剤はデキサメサゾン(例えば、デカドロン(登録商標))、ベクロメタゾン(例えば、Beclovent(登録商標))、ヒドロコルチゾン(コルチゾン、ヒドロコルチゾンナトリウムスクシネート、ヒドロコルチゾンナトリウムホスフェートとしても知られ、商品名Ａｌａ−Ｃｏｒｔ(登録商標)、ヒドロコルチゾンホスフェート、Ｓｏｌｕ−Ｃｏｒｔｅｆ(登録商標)、Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔ Ａｃｅｔａｔｅ(登録商標)およびＬａｎａｃｏｒｔ(登録商標)として販売)、プレドニゾロン(商品名Ｄｅｌｔａ−Ｃｏｒｔｅｌ(登録商標)、Ｏｒａｐｒｅｄ(登録商標)、Ｐｅｄｉａｐｒｅｄ(登録商標)およびＰｒｅｌｏｎｅ(登録商標)として販売)、プレドニゾン(商品名Ｄｅｌｔａｓｏｎｅ(登録商標)、Ｌｉｑｕｉｄ Ｒｅｄ(登録商標)、Ｍｅｔｉｃｏｒｔｅｎ(登録商標)およびＯｒａｓｏｎｅ(登録商標)として販売)、メチルプレドニゾロン(６−メチルプレドニゾロン、メチルプレドニゾロンアセテート、メチルプレドニゾロンナトリウムスクシネートとしても知られ、商品名Ｄｕｒａｌｏｎｅ(登録商標)、Ｍｅｄｒａｌｏｎｅ(登録商標)、Ｍｅｄｒｏｌ(登録商標)、Ｍ−Ｐｒｅｄｎｉｓｏｌ(登録商標)およびＳｏｌｕ−Ｍｅｄｒｏｌ(登録商標)として販売)のようなコルチコステロイド；ジフェンヒドラミン(例えば、Ｂｅｎａｄｒｙｌ(登録商標))、ヒドロキシジンおよびシプロヘプタジンのような抗ヒスタミン剤；およびベータ−アドレナリン受容体アゴニスト、アルブテロール(例えば、Ｐｒｏｖｅｎｔｉｌ(登録商標))およびテルブタリン(Ｂｒｅｔｈｉｎｅ(登録商標))のような気管支拡張剤を含む。
本発明の化合物および／または他の抗癌剤の投与中および後に悪心を経験する患者がいるかもしれない；それゆえに、鎮吐剤を、悪心(胃上部)および嘔吐の予防に使用する。適当な鎮吐剤は、アプレピタント(Emend(登録商標))、オンダンセトロン(Zofran(登録商標))、グラニセトロンＨＣｌ(Ｋｙｔｒｉｌ(登録商標))、ロラゼパム(Ａｔｉｖａｎ(登録商標)。デキサメサゾン(デカドロン(登録商標))、プロクロルペラジン(Ｃｏｍｐａｚｉｎｅ(登録商標))、カソピタント(Ｒｅｚｏｎｉｃ(登録商標)およびＺｕｎｒｉｓａ(登録商標))およびこれらの組み合わせを含む。
処置中に経験する疼痛を軽減する投薬も、患者がより快適になるようにしばしば処方される。タイレノール(登録商標)のような、一般的非処方鎮痛剤がしばしば使用される。しかしながら、ヒドロコドン／パラセタモールまたはヒドロコドン／アセトアミノフェン(例えば、Ｖｉｃｏｄｉｎ(登録商標))、モルヒネ(例えば、Ａｓｔｒａｍｏｒｐｈ(登録商標)またはＡｖｉｎｚａ(登録商標))、オキシコドン(例えば、ＯｘｙＣｏｎｔｉｎ(登録商標)またはＰｅｒｃｏｃｅｔ(登録商標))、塩酸オキシモルホン(Ｏｐａｎａ(登録商標))およびフェンタニル(例えば、Ｄｕｒａｇｅｓｉｃ(登録商標))のようなオピオイド鎮痛剤剤も、軽度または重度疼痛に有用である。
正常細胞を処置毒性から保護するおよび臓器毒性を制限する試みの中で、細胞保護剤(例えば神経保護剤、フリーラジカルスカベンジャー、心保護剤、アントラサイクリン溢血中和剤、栄養素など)を補助剤治療として使用し得る。適当な細胞保護剤は、アミホスチン(Ｅｔｈｙｏｌ(登録商標))、グルタミン、ジメスナ(Ｔａｖｏｃｅｐｔ(登録商標))、メスナ(Ｍｅｓｎｅｘ(登録商標))、デクスラゾキサン(Ｚｉｎｅｃａｒｄ(登録商標)またはＴｏｔｅｃｔ(登録商標))、キサリプロデン(Ｘａｐｒｉｌａ(登録商標))およびロイコボリン(カルシウムロイコボリン、シトロボラム因子およびフォリン酸としても既知)を含む。
コード番号、一般名または商品名により同定した活性化合物の構造は、標準参考書“The Merck Index”の現行版またはデータベース、例えばPatents International(例えばIMS World Publications)から取り得る。
本発明の化合物と組み合わせて使用できる上記化合物を、上に引用した文献に記載のような、当分野で記載されるように製造し、投与できる。
ある態様において、本発明は、少なくとも一つの本発明の化合物(例えば、本発明の化合物)またはその薬学的に許容される塩を、ヒトまたは動物対象の投与に適する薬学的に許容される担体適当なと共に、単独でまたは他の抗癌剤と組み合わせて含む、医薬組成物を提供する。
ある態様において、本発明は、癌のような細胞増殖性疾患を有するヒトまたは動物対象を処置する方法を提供する。本発明は、治療有効量の本発明の化合物(例えば、本発明の化合物)またはその薬学的に許容される塩を、単独でまたは他の抗癌剤と組み合わせて対象に投与することを含む、処置を必要とするヒトまたは動物対象を処置する方法を提供する。
特に、組成物は、組み合わせ治療として製剤してもまたは別々に投与してもよい。
組み合わせ治療において、本発明の化合物および他の抗癌剤を、同時に、一緒にまたは逐次的に特定の時間制限なく投与してよく、ここで、このような投与が、患者体内で２化合物の治療的有効なレベルを提供する。
好ましい態様において、本発明の化合物および他の抗癌剤を、一般にいずれかの順序で注入または経口により逐次的に投与する。投薬レジメンは、疾患ステージ、患者の体力、個々の薬物の安全性プロファイルおよび個々の薬物の耐容性、ならびに組み合わせを投与する処置医および医療従事者には周知の他の基準により代わり得る。本発明の化合物および他の抗癌剤を、処置に使用する特定のサイクルにより、互いに数分、数時間、数日または数週間離れて投与する。加えて、サイクルは、処置サイクル中、一方の薬剤の他方より多い投与および薬物投与あたりの異なる用量を含む。
本発明の他の面において、ここに開示されるような１以上の本発明の化合物および組み合わせパートナを含むキットが提供される。代表的キットは、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩、(ｂ)例えば、上記のような少なくとも一つの組み合わせパートナーを含み、それによってこのようなキットは、投与指示を含む添付文書または他のラベリングを含み得る。
本発明の化合物はまた既知治療法、例えば、ホルモン投与または特に放射線と組み合わせても遊離に使用し得る。本発明の化合物は、特に放射線療法に低感受性を示す腫瘍の処置のために、特に、放射線増感剤として使用され得る。
ある態様において、対象は、ＣＡＲ発現細胞の投与に関連する副作用を低減または緩和する薬剤を投与することができる。ＣＡＲ発現細胞の投与に付随する副作用は、ＣＲＳおよびマクロファージ活性化症候群(ＭＡＳ)とも呼ばれる血液貪食リンパ組織球増多症(ＨＬＨ)を含むが、これらに限定されない。ＣＲＳの症状は、高熱、悪心、一過性低血圧、低酸素症などを含む。ＣＲＳは、発熱、疲労、食欲不振、筋肉痛、関節痛(arthalgias)、悪心、嘔吐、頭痛などの臨床的体質的徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、発疹などの臨床皮膚徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、悪心、嘔吐および下痢のような臨床的消化器徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、頻呼吸および低酸素血症のような臨床的呼吸器徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、頻脈、脈圧の増大、低血圧、心拍出量の増加(早期)および心拍出量の低下(後期)などの臨床的心血管徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、凝固兆候およびｄ−二量体増加、出血の有無にかかわらず低フィブリノーゲン血などの症状を含み得る。ＣＲＳは、高窒素血症などの臨床腎徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、高トランスアミナーゼ血症および高ビリルビン血症などの臨床肝徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、頭痛、精神状態の変化、混乱、せん妄、言語発見困難またはフランク失語、幻覚、振戦、ジメトリア、異常歩行、発作などの臨床的神経徴候および症状を含み得る。
よって、ここに記載する方法は、対象にここに記載するＣＡＲ発現細胞を投与し、さらに、ＣＡＲ発現細胞処置に由来する可溶性因子のレベル増加を管理する１以上の薬剤の投与を含み得る。ある態様において、対象で増加し得る可溶性因子は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−６の１以上である。ある態様において、対象において増加する因子は、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＩＬ−５およびフラクタルカインの１以上である。それゆえに、これらの副作用を処置するために投与する薬剤は、これらの可溶性因子の１以上を中和する薬剤であり得る。ある態様において、これらの可溶性形態の１以上を中和する薬剤は、抗体または抗体フラグメントである、このような薬剤の例は、ステロイド(例えば、コルチコステロイド)、ＴＮＦα阻害剤およびＩＬ−６阻害剤を含むが、これらに限定されない。ＴＮＦα阻害剤の例は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴールおよびゴリムマブのような抗ＴＮＦα抗体分子である。ＴＮＦα阻害剤の他の例は、エタネルセプトのような融合タンパク質である。小分子ＴＮＦα阻害剤は、キサンチン誘導体(例えばペントキシフィリン)およびブプロピオンを含むが、これらに限定されない。ＩＬ−６阻害剤の例は、トシリズマブ(ｔｏｃ)、サリルマブ、エルシリモマブ、ＣＮＴＯ ３２８、ＡＬＤ５１８／ＢＭＳ−９４５４２９、ＣＮＴＯ １３６、ＣＰＳＩ−２３６４、ＣＤＰ６０３８、ＶＸ３０、ＡＲＧＸ−１０９、ＦＥ３０１およびＦＭ１０１のような抗ＩＬ−６抗体分子である。ある態様において、抗ＩＬ−６抗体分子は、トシリズマブである。ＩＬ−１Ｒベースの阻害剤の例は、アナキンラである。
ある態様において、対象に、とりわけ、例えば、メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾンのような、コルチコステロイドを投与する。
ある態様において、対象に、例えば、ノルエピネフリン、ドーパミン、フェニレフリン、エピネフリン、バソプレシンまたはこれらの組み合わせのような、昇圧剤を投与する。
ある態様において、対象に解熱剤を投与できる。ある態様において、対象に鎮痛剤を投与できる。
ある態様において、対象を、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤と投与できる。例えば、ある態様において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であり得る、例えば、薬剤は、チェックポイント阻害剤である。阻害分子、例えば、プログラム細胞死１(ＰＤ１)は、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を減少させ得る。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータを含む。ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルでの阻害による、阻害分子の阻害はＣＡＲ発現細胞性能を最適化できる。ある態様において、例えば、ここに記載のような、阻害性核酸、例えば、阻害性核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、群生性等間隔短回文反復配列(ＣＲＩＳＰＲ)、転写−アクティベータ様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を使用して、ＣＡＲ発現細胞の阻害分子の発現を阻害できる。ある態様において、阻害剤はｓｈＲＮＡである。ある態様において、阻害分子はＣＡＲ発現細胞内で阻害される。これらの態様において、阻害分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子を、ＣＡＲの要素、例えば、要素全部をコードする核酸と連結する。
ある態様において、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子を、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子が、発現、例えば、ＣＡＲ発現細胞内で発現されるようにプロモーター、例えば、Ｈ１またはＵ６駆動プロモーターに操作可能に連結する。例えば、Tiscornia G., “Development of Lentiviral Vectors Expressing siRNA,” Chapter 3, in Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA and RNA (eds. Friedmann and Rossi)参照。Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 2007; Brummelkamp TR, et al. (2002) Science 296: 550-553; Miyagishi M, et al. (2002) Nat. Biotechnol. 19: 497-500。ある態様において、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲの成分、例えば、要素の全てをコードする核酸分子を含む、同じベクター、例えば、レンチウイルスベクター上に存在する。このような態様において、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲの成分、例えば、要素の全てをコードする核酸に５’または３’に位置するベクター、例えば、レンチウイルスベクターに位置する。Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲの成分、例えば、要素の全てをコードする核酸と同一または異なる方向で転写され得る。ある態様において、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲの成分、例えば、要素の全てをコードする核酸分子を含むベクター以外のベクターに存在する。ある態様において、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲ発現細胞内で一過性に発現される。ある態様において、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲ発現細胞のゲノムに安定に統合される。図５２Ａ〜５２Ｅは、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子を有するＣＡＲの成分、例えば、全要素を発現するベクターの例を記載する。
Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現の阻害に有用なｄｓＲＮＡ分子の例であって、ここで、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子がＰＤ−１であるものを下に提供する。
下記表７に、ＤＮＡ配列を表す配列番号１５９〜２０６と共に、ＰＤＣＤ１(ＰＤ１) ＲＮＡｉ剤の名称(マウスＰＤＣＤ１遺伝子ＮＭ＿００８７９８.２におけるそれらの位置由来)を提供する。センス(Ｓ)およびアンチセンス(ＡＳ)配列の両者を、本表では１９ｍｅｒおよび２１ｍｅｒ配列として提供する。位置(ＰｏＳ、例えば、１７６)は、マウスＰＤＣＤ１遺伝子ＮＭ＿００８７９８.２における位置番号由来であることに注意すべきである。配列番号を、“センス１９”配列番号１５９〜１７０；“センス２１”配列番号１７１〜１８２；“アセンス２１”配列番号１８３〜１９４；“アセンス１９”配列番号１９５〜２０６に対応する１２群で示す。
下記表８に、ＤＮＡ配列を表す配列番号２０７〜２５４と共に、ＰＤＣＤ１(ＰＤ１)ＲＮＡｉ剤(ヒトＰＤＣＤ１遺伝子におけるそれらの位置由来)を提供する。センス(Ｓ)およびアンチセンス(ＡＳ)配列の両者を、本表では１９ｍｅｒおよび２１ｍｅｒ配列として提供する。配列番号を、“センス１９”配列番号“センス１９”配列番号２０７〜２１８；“センス２１”配列番号２１９〜２３０；“アセンス２１”配列番号２３１〜２４２；“アセンス１９”配列番号２４３〜２５４に対応する１２群で示す。
ある態様において、阻害シグナルの阻害剤は、例えば、阻害分子と結合する抗体または抗体フラグメントであり得る。例えば、薬剤は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２またはＣＴＬＡ４に結合する抗体または抗体フラグメントであり得る(例えば、イピリムマブ(ＭＤＸ−０１０およびＭＤＸ−１０１とも称し、ヤーボイ(登録商標)として市販；Bristol-Myers Squibb；トレメリムマブ(Pfizerから入手可能なＩｇＧ２モノクローナル抗体、以前はチシリムマブ、ＣＰ−６７５,２０６として既知。))。ある態様において、ある態様において、薬剤は、ＴＩＭ３に結合する抗体または抗体フラグメントである。ある態様において、薬剤は、ＬＡＧ３に結合する抗体または抗体フラグメントである。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤、例えば、阻害分子の阻害剤を、同種異系ＣＡＲ、例えば、同種異系ここに記載するＣＡＲと組み合わせて投与する(例えば、ここでの同種異系ＣＡＲにおいて記載)。
ＰＤ１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡも含む受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害性メンバーである。ＰＤ１は、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄細胞に発現される(Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75)。ＰＤ１に対する２リガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、ＰＤ１への結合によりＴ細胞活性化を下方制御することが示されている(Freeman et al. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43)。ＰＤ−Ｌ１は、ヒト癌において豊富である(Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制は、ＰＤ１とＰＤ−Ｌ１の局所相互作用の阻害により逆転できる。ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の抗体、抗体フラグメントおよび他の阻害剤は当分野で入手可能であり、ここに記載するＣＤ３３ ＣＡＲと組み合わせて使用し得る。例えば、ニボルマブ(ＢＭＳ−９３６５５８またはＭＤＸ１１０６とも称す；Bristol-Myers Squibb)は、ＰＤ１を特異的に遮断する完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ＰＤ１に特異的に結合するニボルマブ(クローン５Ｃ４)および他のヒトモノクローナル抗体は、ＵＳ８,００８,４４９号およびＷＯ２００６／１２１１６８号に開示されている。ピディリズマブ(ＣＴ−０１１；Cure Tech)は、ＰＤ１に結合するヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体である。ピディリズマブおよび他のヒト化抗ＰＤ１モノクローナル抗体は、ＷＯ２００９／１０１６１１号に開示されている。ランブロリズマブ(ＭＫ０３４７５とも称す；Merck)は、ＰＤ１に結合するヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ランブロリズマブおよび他のヒト化抗ＰＤ１抗体は、ＵＳ８,３５４,５０９号およびＷＯ２００９／１１４３３５号に開示される。ＭＤＰＬ３２８０Ａ(Genentech／Roche)は、ＰＤ−Ｌ１に結合するヒトＦｃ最適化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ＰＤ−Ｌ１に対するＭＤＰＬ３２８０Ａおよび他のヒトモノクローナル抗体は、米国特許７,９４３,７４３号およびＵ.Ｓ公開２０１２００３９９０６号に記載されている。他の抗ＰＤ−Ｌ１結合剤は、ＹＷ２４３.５５.Ｓ７０(重鎖および軽鎖可変領域は、ＷＯ２０１０／０７７６３４号の配列番号２０および２１に示される)およびＭＤＸ−１ １０５(別名ＢＭＳ−９３６５５９および例えば、ＷＯ２００７／００５８７４号に開示される抗ＰＤ−Ｌ１結合剤)である。ＡＭＰ−２２４(Ｂ７−ＤＣＩｇ；Amplimmune；例えば、ＷＯ２０１０／０２７８２７号およびＷＯ２０１１／０６６３４２号に開示)は、ＰＤ１とＢ７−Ｈ１の相互作用を遮断するＰＤ−Ｌ２ Ｆｃ融合可溶性受容体である。他の抗ＰＤ１抗体は、とりわけ、ＡＭＰ ５１４(Amplimmune)、例えば、ＵＳ８,６０９,０８９号、ＵＳ２０１００２８３３０号および／またはＵＳ２０１２０１１４６４９号に開示の抗ＰＤ１抗体を含む。
ＴＩＭ３(Ｔ細胞免疫グロブリン−３)も、特にＩＦＮ−ｇ分泌ＣＤ４＋ Ｔヘルパー１およびＣＤ８＋ Ｔ細胞毒性１細胞において、Ｔ細胞機能を負に制御し、Ｔ細胞枯渇に重要な役割を有する。ＴＩＭ３とそのリガンド、例えば、ガレクチン−９(Ｇａｌ９)、ホスファチジルセリン(ＰＳ)およびＨＭＧＢ１の相互作用の阻害は免疫応答を高め得る。ＴＩＭ３およびそのリガンドの抗体、抗体フラグメントおよび他の阻害剤は当分野で利用可能であり、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲと組み合わせて使用し得る。例えば、ＴＩＭ３を標的とする抗体、抗体フラグメント、小分子またはペプチド阻害剤は、そのリガンドとの相互作用を阻害するためにＴＩＭ３のＩｇＶドメインに結合する。ＴＩＭ３を阻害する抗体およびペプチドは、ＷＯ２０１３／００６４９０号およびＵＳ２０１００２４７５２１号に開示されている。他の抗ＴＩＭ３抗体は、ＲＭＴ３−２３のヒト化バージョン(Ngiow et al., 2011, Cancer Res, 71:3540-3551に開示)およびクローン８Ｂ.２Ｃ１２(Monney et al., 2002, Nature, 415:536-541に開示)を含む。ＴＩＭ３およびＰＤ−１を阻害する二特異性抗体はＵＳ２０１３０１５６７７４号に開示されている。
他の態様において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤は、ＣＥＡＣＡＭ阻害剤(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５阻害剤)である。ある態様において、ＣＥＡＣＡＭの阻害剤は、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体分子である。抗ＣＥＡＣＡＭ−１抗体の例は、ＷＯ２０１０／１２５５７１号、ＷＯ２０１３／０８２３６６号、ＷＯ２０１４／０５９２５１およびＷＯ２０１４／０２２３３２号に開示され、例えば、モノクローナル抗体３４Ｂ１、２６Ｈ７および５Ｆ４；または例えば、ＵＳ２００４／００４７８５８号、ＵＳ７,１３２,２５５号およびＷＯ９９／０５２５５２号に開示のようなその組み換え形態である。他の態様において、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体は、例えば、Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529 (DOI:10:1371／journal.pone.0021146)に記載のようにＣＥＡＣＡＭ−５と結合するかまたは例えば、ＷＯ２０１３／０５４３３１号およびＵＳ２０１４／０２７１６１８号に記載のようにＣＥＡＣＡＭ−１およびＣＥＡＣＡＭ−５と交差反応する。
理論に縛られることを望まないが、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＣＥＡＣＡＭ−５のような癌胎児性抗原細胞接着分子(ＣＥＡＣＡＭ)は、少なくとも一部、抗腫瘍免疫応答の阻害を仲介すると考えられる(例えば、Markel et al. J Immunol. 2002 Mar 15;168(6):2803-10; Markel et al. J Immunol. 2006 Nov 1;177(9):6062-71; Markel et al. Immunology. 2009 Feb;126(2):186-200; Markel et al. Cancer Immunol Immunother. 2010 Feb;59(2):215-30; Ortenberg et al. Mol Cancer Ther. 2012 Jun;11(6):1300-10; Stern et al. J Immunol. 2005 Jun 1;174(11):6692-701; Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529参照)。例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１は、ＴＩＭ−３のヘテロ親和性リガンドとして、そしてＴＩＭ−３介在Ｔ細胞耐容性および枯渇に役割を有するとしてが記載されている(例えば、ＷＯ２０１４／０２２３３２号；Huang, et al. (2014) Nature doi:10.1038／nature13848)。ある態様において、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＴＩＭ−３の共遮断が、異種移植結腸直腸癌モデルにおいて抗腫瘍免疫応答を増強することが示されている(例えば、ＷＯ２０１４／０２２３３２号；Huang, et al. (2014), supra参照)。他の態様において、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＰＤ−１の共遮断は、例えば、ＷＯ２０１４／０５９２５１号に記載されるようにＴ細胞耐容性を減少させる。それゆえに、ＣＥＡＣＡＭ阻害剤を、ここに記載する他の免疫調節剤(例えば、抗ＰＤ−１および／または抗ＴＩＭ−３阻害剤)と使用して、癌、例えば、黒色腫、肺癌(例えば、ＮＳＣＬＣ)、膀胱癌、結腸癌、卵巣癌およびここに記載の他の癌に対する免疫応答を増強させ得る。
ＬＡＧ−３(リンパ球活性化遺伝子−３またはＣＤ２２３)は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞枯渇に役割を有することが示されている、活性化Ｔ細胞およびＢ細胞に発現される細胞表面分子である。ＬＡＧ−３およびそのリガンドの抗体、抗体フラグメントおよび他の阻害剤は当分野で入手可能であり、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲと組み合わせて使用し得る。例えば、ＢＭＳ−９８６０１６(Bristol-Myers Squib)は、ＬＡＧ３を標的とするモノクローナル抗体である。ＩＭＰ７０１(Immutep)は、アンタゴニストＬＡＧ−３抗体であり、ＩＭＰ７３１(ImmutepおよびGlaxoSmithKline)は枯渇性ＬＡＧ−３抗体である。他のＬＡＧ−３阻害剤は、ＬＡＧ３の可溶性部分とＭＨＣクラスII分子のＩｇの組み換え融合タンパク質であり、抗原提示細胞(ＡＰＣ)を活性化するＩＭＰ３２１(Immutep)である。他の抗体は、例えば、ＷＯ２０１０／０１９５７０号に開示されている。
ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤は、例えば、第一ドメインおよび第二ドメインを含む融合タンパク質であってよく、ここで、第一ドメインは阻害分子またはそのフラグメントであり、第二ドメインは陽性シグナルと関係するポリペプチド、例えば、ここに記載の細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドである。ある態様において、陽性シグナルと結合するポリペプチドは、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳの共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ２７および／またはＩＣＯＳの細胞内シグナル伝達ドメインおよび／または例えば、ここに記載する、例えば、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達ドメインを含み得る。ある態様において、融合タンパク質は、ＣＡＲを発現するのと同じ細胞により発現される。他の態様において、融合タンパク質は、ＣＤ３３ ＣＡＲを発現しない細胞、例えば、Ｔ細胞により発現される。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤はｍｉＲ−１７−９２である。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲの活性を増強する薬剤はサイトカインである。サイトカインは、Ｔ細胞増殖、分化、生存および恒常性に関連する重要な機能を有する。ここに記載するＣＡＲ発現細胞を受ける対象に投与できるサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１またはこれらの組み合わせを含む。好ましい態様において、投与するサイトカインはＩＬ−７、ＩＬ−１５またはＩＬ−２１またはこれらの組み合わせである。サイトカインを、１日１回または１日１回以上、例えば、１日２回、１日３回または１日４回投与できる。サイトカインを、１日以上投与でき、例えば、サイトカインを２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間または４週間投与する。例えば、サイトカインを１日１回、７日間投与する。
ある態様において、サイトカインをＣＡＲ発現Ｔ細胞と組み合わせて投与する。サイトカインを、ＣＡＲ発現Ｔ細胞と同時にまたは一緒に投与でき、例えば、同じ日に投与する。サイトカインをＣＡＲ発現Ｔ細胞と同じ医薬組成物に製剤しても、別の医薬組成物に製剤してもよい。あるいは、サイトカインを、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の投与後間もなく、例えば、ＣＡＲ発現Ｔ細胞投与１日、２日、３日、４日、５日、６日または７日後に投与してよい。サイトカインを１日を超える投薬レジメンで投与する態様において、サイトカイン投薬レジメンの１日目はＣＡＲ発現Ｔ細胞の投与と同じ日でよくまたはサイトカイン投薬レジメンの１日目は、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の投与１日、２日、３日、４日、５日、６日または７日後であってよい。ある態様において、１日目に、ＣＡＲ発現Ｔ細胞を対象に投与し、２日目に、サイトカインを１日１回、翌７日間投与する。好ましい態様において、ＣＡＲ発現Ｔ細胞と組み合わせて投与するサイトカインはＩＬ−７、ＩＬ−１５またはＩＬ−２１である。
他の態様において、サイトカインを、ＣＡＲ発現細胞の投与から一定期間後、例えば、ＣＡＲ発現細胞の投与から少なくとも２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、１０週間、１２週間、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月または１年またはそれ以上の後に投与する。ある態様において、サイトカインを、ＣＡＲ発現細胞に対する対象の応答の評価後に投与する。例えば、対象にここに記載する用量およびレジメンに従い、ＣＡＲ発現細胞を投与する。ＣＡＲ発現細胞治療に対する対象の応答を、腫瘍増殖阻止、循環腫瘍細胞減少または腫瘍退縮を含む、ここに記載する方法のいずれかを使用して、ＣＡＲ発現細胞の投与２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、１０週間、１２週間、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月または１年またはそれ以上後に評価する。ＣＡＲ発現細胞治療に対して十分な応答を示さない対象にサイトカインを投与し得る。ＣＡＲ発現細胞治療に対して応答が最適以下である対象へのサイトカインの投与は、ＣＡＲ発現細胞有効性または抗癌活性を改善する。好ましい態様において、ＣＡＲ発現細胞の投与後に投与するサイトカインはＩＬ−７である。
低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤との組み合わせ
ここに記載する方法は、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１のようなラパログを含むアロステリックｍＴＯＲ阻害剤を使用する。低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与(例えば、それ自体、免疫系を完全に抑制するには不十分であるが、免疫機能の改善に十分である用量)は、対象における免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＣＡＲ発現細胞の性能を最適化できる。ｍＴＯＲ阻害を測定する方法、用量、処置レジメンおよび適当な医薬組成物は、引用により本明細書に包含させる米国特許出願２０１５／０１２４００３６号に記載される。
ある態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、次の１以上をもたらし得る。
ｉ)ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞の数の減少；
ii)ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞の数の増加；
iii)ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞／ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞比の増加；
iv)ナイーブＴ細胞の数の増加；
ｖ)１以上の次のマーカーの発現の増加：例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２；
vi)例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＫＬＲＧ１の発現減少；または
vii)次の特徴のいずれか一つまたは組み合わせを有する記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、細胞の数の増加：増加したＣＤ６２Ｌ高、増加したＣＤ１２７高、増加したＣＤ２７＋、減少したＫＬＲＧ１および増加したＢＣＬ２；
ここで、前記、例えば、ｉ)、ii)、iii)、iv)、ｖ)、vi)またはvii)のいずれかは、例えば、非処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に生じる。
他の態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、例えば、非処置ＣＡＲ発現細胞または非処置対象と比較して、例えば、培養または対象における、ＣＡＲ発現細胞の増殖の増加もしくは延長をもたらす。ある態様において、増殖の増加は、ＣＡＲ発現細胞の数の増加と関係する。増殖の増加または持続を測定する方法は、実施例８および９に記載する。他の態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、例えば、非処置ＣＡＲ発現細胞または非処置対象と比較して、例えば、培養または対象における、ＣＡＲ発現細胞による癌細胞死を増加させる。ある態様において、癌細胞死増加は、腫瘍体積減少と相関する。癌細胞死増加を測定する方は実施例６に記載する。
ある態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞を、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的ｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて投与する。例えば、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の投与前に解しでき；ここに記載するＣＡＲ発現細胞の投与前に終了でき；ここに記載するＣＡＲ発現細胞の投与と同時に介しでき；ここに記載するＣＡＲ発現細胞の投与と重複でき；またはここに記載するＣＡＲ発現細胞の投与後継続できる。
これとは別にまたはこれに加えて、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、ここに記載するＣＡＲ分子を発現するよう操作した免疫エフェクター細胞を最適化できる。このような態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤の投与を、ここに記載するＣＡＲ分子を発現するように操作する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の対象からの採取前に開始または完了する。
他の態様において、ここに記載するＣＡＲ分子を発現するように操作する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、例えば、対象から採取後またはＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の、例えば、対象への投与前、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤存在下で培養できる。
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、例えば、週に１回、例えば、即時放出剤形で、０.１〜２０mg、０.５〜１０mg、２.５〜７.５mg、３〜６mgまたは約５mgのＲＡＤ００１またはそれと生物学的同等用量で投与することを含む。ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、例えば、週に１回、例えば、持続放出性剤形で、０.３〜６０mg、１.５〜３０mg、７.５〜２２.５mg、９〜１８mgまたは約１５mgのＲＡＤ００１またはそれと生物学的同等用量の投与を含む。
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％であるが、９０％を超えない、少なくとも１０％であるが、９０％を超えない、少なくとも１５％であるが、９０％を超えない、少なくとも２０％であるが、９０％を超えない、少なくとも３０％であるが、９０％を超えない、少なくとも４０％であるが、９０％を超えない、少なくとも少なくとも５０％であるが、９０％を超えない、少なくとも６０％であるが、９０％を超えない、少なくとも少なくとも７０％であるが、９０％を超えない、少なくとも５％であるが、８０％を超えない、少なくとも１０％であるが、８０％を超えない、少なくとも１５％であるが、８０％を超えない、少なくとも２０％であるが、８０％を超えない、少なくとも３０％であるが、８０％を超えない、少なくとも４０％であるが、８０％を超えない、少なくとも５０％であるが、８０％を超えない、少なくとも６０％であるが、８０％を超えない、少なくとも５％であるが、７０％を超えない、少なくとも１０％であるが、７０％を超えない、少なくとも１５％であるが、７０％を超えない、少なくとも２０％であるが、７０％を超えない、少なくとも３０％であるが、７０％を超えない、少なくとも４０％であるが、７０％を超えない、少なくとも５０％であるが、７０％を超えない、少なくとも５％であるが、６０％を超えない、少なくとも１０％であるが、６０％を超えない、少なくとも１５％であるが、６０％を超えない、少なくとも２０％であるが、６０％を超えない、少なくとも３０％であるが、６０％を超えない、少なくとも４０％であるが、６０％を超えない、少なくとも５％であるが、５０％を超えない、少なくとも１０％であるが、５０％を超えない、少なくとも１５％であるが、５０％を超えない、少なくとも２０％であるが、５０％を超えない、少なくとも３０％であるが、５０％を超えない、少なくとも４０％であるが、５０％を超えない、少なくとも５％であるが、４０％を超えない、少なくとも１０％であるが、４０％を超えない、少なくとも１５％であるが、４０％を超えない、少なくとも２０％であるが、４０％を超えない、少なくとも３０％であるが、４０％を超えない、少なくとも３５％であるが、４０％を超えない、少なくとも５％であるが、３０％を超えない、少なくとも１０％であるが、３０％を超えない、少なくとも１５％であるが、３０％を超えない、少なくとも２０％であるが、３０％を超えないまたは少なくとも２５％であるが、３０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するまたは提供する。
ｍＴＯＲ阻害の程度は、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ阻害の程度により伝達または対応されえて、例えば、ｍＴＯＲ阻害の程度は、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ活性における低下レベルにより、例えば、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ基質のリン酸化の減少により決定できる。ｍＴＯＲ阻害のレベルは、引用により本明細書に包含させる米国特許出願２０１５／０１２４００３６号にまたは引用により本明細書に包含させる米国特許７,７２７,９５０号に記載のようなＢｏｕｌａｙアッセイによるＰ７０ Ｓ６キナーゼ活性の測定；ウェスタンブロットによるリン酸化Ｓ６レベルの測定；またはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞対ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞比の変化の評価のような種々の方法により評価できる。
ここで使用する用語“ｍＴＯＲ阻害剤”は、細胞におけるｍＴＯＲキナーゼを阻害する、化合物またはリガンドまたはその薬学的に許容される塩をいう。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は、アロステリック阻害剤である。アロステリックｍＴＯＲ阻害剤は、中性三環式化合物ラパマイシン(シロリムス)、例えば、ラパマイシン誘導体、ラパマイシンアナログ(ラパログとも称する)およびｍＴＯＲ活性を阻害する他のマクロライド化合物を含む、ラパマイシンと構造的および機能的類似性を有する化合物であるラパマイシン関連化合物を含む。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は、触媒的阻害剤である。
ラパマイシンは、式Ａに示す構造を有する、ストレプトミセス・ハイグロスコピクスにより産生されるマクロライド抗生物質である。
例えば、McAlpine, J.B., et al., J. Antibiotics (1991) 44: 688; Schreiber, S.L., et al., J. Am. Chem. Soc. (1991) 113: 7433; 米国特許３,９２９,９９２号参照。ラパマイシンについて種々のナンバリングスキームが提唱されている。混乱を避けるため、特定のラパマイシンアナログをここで命名するとき、名称は、式Ａのナンバリングスキームを使用したラパマイシンを参照して付与する。
本発明において有用なラパマイシンアナログは、例えば、本発明において有用なラパマイシンアナログは、例えば、ラパマイシンのシクロヘキシル環上のヒドロキシ基がＯＲ１(ここで、Ｒ１はヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルコキシアルキル、アシルアミノアルキルまたはアミノアルキルである)で置き換えられているＯ−置換アナログ；例えば引用により本明細書に包含させる、ＵＳ５,６６５,７７２号およびＷＯ９４／０９０１０号に記載のような、エベロリムスとして知られるＲＡＤ００１である。
他の適当なラパマイシンアナログは、２６位または２８位が置換されたものを含む。ラパマイシンアナログは、例えば、内容を引用により本明細書に包含させるＵＳ６,０１５,８１５号、ＷＯ９５／１４０２３号およびＷＯ９９／１５５３０号に記載のような、上記アナログのエピマー、特に４０位、２８位または２６位が置換され、場合によりさらに水素化されていてよいアナログのエピマーであってよく、例えばゾタロリムスとしても知られるＡＢＴ５７８またはその内容を引用により本明細書に包含させるＵＳ７,０９１,２１３号、ＷＯ９８／０２４４１号およびＷＯ０１／１４３８７号に記載のラパマイシンアナログ、例えばリダフォロリムスとしても知られるＡＰ２３５７３である。
ＵＳ５,６６５,７７２号からの、本発明における使用に適するラパマイシンアナログの例は、４０−Ｏ−ベンジル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(４’−ヒドロキシメチル)ベンジル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[４’−(１,２−ジヒドロキシエチル)]ベンジル−ラパマイシン、４０−Ｏ−アリル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[３’−(２,２−ジメチル−１,３−ジオキソラン−４(Ｓ)−イル)−プロプ−２’−エン−１’−イル]−ラパマイシン、(２’Ｅ,４’Ｓ)−４０−Ｏ−(４’,５’−ジヒドロキシペント−２’−エン−１’−イル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ)エトキシカルボニルメチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(３−ヒドロキシ)プロピル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(６−ヒドロキシ)ヘキシル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[２−(２−ヒドロキシ)エトキシ]エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[(３Ｓ)−２,２−ジメチルジオキソラン−３−イル]メチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[(２Ｓ)−２,３−ジヒドロキシプロプ−１−イル]−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−アセトキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ニコチノイルオキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[２−(Ｎ−モルホリノ)アセトキシ]エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−Ｎ−イミダゾリルアセトキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[２−(Ｎ−メチル−Ｎ’−ピペラジニル)アセトキシ]エチル−ラパマイシン、３９−Ｏ−デスメチル−３９,４０−Ｏ,Ｏ−エチレン−ラパマイシン、(２６Ｒ)−２６−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−アミノエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−アセトアミノエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ニコチンアミドエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−(Ｎ−メチル−イミダゾ−２’−イルカルベトキサミド)エチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−エトキシカルボニルアミノエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−トリルスルホンアミドエチル)−ラパマイシンおよび４０−Ｏ−[２−(４’,５’−ジカルボエトキシ−１’,２’,３’−トリアゾール−１’−イル)−エチル]−ラパマイシンを含むが、これらに限定されない。
本発明において有用な他のラパマイシンアナログは、ラパマイシンのシクロヘキシル環上のヒドロキシ基および／または２８位のヒドロキシ基がヒドロキシエステル基で置き換えられたアナログが知られ、例えば、ＵＳＲＥ４４,７６８号に見られるラパマイシンアナログ、例えばテムシロリムスである。
本発明において有用な他のラパマイシンアナログは、１６位のメトキシ基が他の置換基、好ましくは(場合によりヒドロキシ置換)アルキニルオキシ、ベンジル、オルトメトキシベンジルまたはクロロベンジルにより置き換えられているおよび／または３９位のメトキシ基が３９炭素と共に除去され、ラパマイシンのシクロヘキシル環が３９位のメトキシ基を欠くシクロペンチル環になるものを含む；例えばその内容を引用により本明細書に包含するＷＯ９５／１６６９１号およびＷＯ９６／４１８０７号に記載のような。アナログは、ラパマイシンの４０位のヒドロキシがアルキル化されおよび／または３２−カルボニルが還元されるようにさらに修飾され得る。
ＷＯ９５／１６６９１号からのラパマイシンアナログは、１６−デメトキシ−１６−(ペント−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−(ブト−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−(プロパルギル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−(４−ヒドロキシ−ブト−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−ベンジルオキシ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−ベンジルオキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−オルト−メトキシベンジル−ラパマイシン、１６−デメトキシ−４０−Ｏ−(２−メトキシエチル)−１６−ペント−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−ホルミル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−ヒドロキシメチル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−カルボキシ−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−(４−メチル−ピペラジン−１−イル)カルボニル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−(モルホリン−４−イル)カルボニル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−[Ｎ−メチル、Ｎ−(２−ピリジン−２−イル−エチル)]カルバモイル−４２−ノル−ラパマイシンおよび３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−(ｐ−トルエンスルホニルヒドラゾノメチル)−４２−ノル−ラパマイシンを含むが、これらに限定されない。
ＷＯ９６／４１８０７号からのラパマイシンアナログは、３２−デオキソ−ラパマイシン、１６−Ｏ−ペント−２−イニル−３２−デオキソ−ラパマイシン、１６−Ｏ−ペント−２−イニル−３２−デオキソ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ−エチル)−ラパマイシン、１６−Ｏ−ペント−２−イニル−３２−(Ｓ)−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン、３２(Ｓ)−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−メトキシ)エチル−ラパマイシンおよび３２(Ｓ)−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンを含むが、これらに限定されない。
他の適当なラパマイシンアナログは、その内容を引用により本明細書に包含させるＵＳ２００５／０１０１６２４号に記載のようなウミロリムスである。
エベロリムス(アフィニトール(登録商標))としても知られるＲＡＤ００１は、各々、引用によりその内容を本明細書に包含させるＵＳ５,６６５,７７２号およびＷＯ９４／０９０１０号に記載のような、化学名(１Ｒ,９Ｓ,１２Ｓ,１５Ｒ,１６Ｅ,１８Ｒ,１９Ｒ,２１Ｒ,２３Ｓ,２４Ｅ,２６Ｅ,２８Ｅ,３０Ｓ,３２Ｓ,３５Ｒ)−１,１８−ジヒドロキシ−１２−{(１Ｒ)−２−[(１Ｓ,３Ｒ,４Ｒ)−４−(２−ヒドロキシエトキシ)−３−メトキシシクロヘキシル]−１−メチルエチル}−１９,３０−ジメトキシ−１５,１７,２１,２３,２９,３５−ヘキサメチル−１１,３６−ジオキサ−４−アザ−トリシクロ[３０.３.１.０４,９]ヘキサトリアコンタ−１６,２４,２６,２８−テトラエン−２,３,１０,１４,２０−ペンタオンを有する。
アロステリックｍＴＯＲ阻害剤のさらなる例は、シロリムス(ラパマイシン、ＡＹ−２２９８９)、４０−[３−ヒドロキシ−２−(ヒドロキシメチル)−２−メチルプロパノエート]−ラパマイシン(テムシロリムスまたはＣＣＩ−７７９とも呼ばれる)およびリダフォロリムス(ＡＰ−２３５７３／ＭＫ−８６６９)を含む。アロステリックｍＴＯＲ阻害剤のさらなる例は、ゾタロリムス(ＡＢＴ５７８)およびウミロリムスを含む。
これとは別にまたはこれに加えて、触媒的、ＡＴＰ競合的ｍＴＯＲ阻害剤が、ｍＴＯＲキナーゼドメインを直接標的とし、かつｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２の両者を標的とすることが判明している。これらはまた、４ＥＢＰ１−Ｔ３７／４６リン酸化およびキャップ依存性翻訳のようなラパマイシン耐性ｍＴＯＲＣ１アウトプットを調節するために、ラパマイシンのようなアロステリックｍＴＯＲ阻害剤よりもｍＴＯＲＣ１の効果的な阻害剤である。
触媒的阻害剤は、ＢＥＺ２３５または２−メチル−２−[４−(３−メチル−２−オキソ−８−キノリン−３−イル−２,３−ジヒドロ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−１−イル)−フェニル]−プロピオニトリルまたはモノトシル酸塩形態(ＢＥＺ２３５の合成はＷＯ２００６／１２２８０６号に記載)；ＣＣＧ１６８(ＡＺＤ−８０５５としても知られる、Chresta, C.M., et al., Cancer Res, 2010, 70(1), 288-298)であり、これは、化学名{５−[２,４−ビス−((Ｓ)−３−メチル−モルホリン−４−イル)−ピリド[２,３ｄ]ピリミジン−７−イル]−２−メトキシ−フェニル}−メタノール；３−[２,４−ビス[(３Ｓ)−３−メチルモルホリン−４−イル]ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−イル]−Ｎ−メチルベンズアミド(ＷＯ０９１０４０１９号)；３−(２−アミノベンゾ[ｄ]オキサゾール−５−イル)−１−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−４−アミン(ＷＯ１００５１０４３号およびＷＯ２０１３０２３１８４号)；Ｎ−(３−(Ｎ−(３−((３,５−ジメトキシフェニル)アミノ)キノキサリン−２−イル)スルファモイル)フェニル)−３−メトキシ−４−メチルベンズアミド(ＷＯ０７０４４７２９号およびＷＯ１２００６５５２号)；ＰＫＩ−５８７(Venkatesan, A.M., J. Med.Chem., 2010, 53, 2636-2645)であり、これは、化学名１−[４−[４−(ジメチルアミノ)ピペリジン−１−カルボニル]フェニル]−３−[４−(４,６−ジモルホリノ−１,３,５−トリアジン−２−イル)フェニル]尿素；ＧＳＫ−２１２６４５８(ACS Med. Chem. Lett., 2010, 1, 39-43)であり、これは、化学名２,４−ジフルオロ−Ｎ−{２−メトキシ−５−[４−(４−ピリダジニル)−６−キノリニル]−３−ピリジニル}ベンゼンスルホンアミド；５−(９−イソプロピル−８−メチル−２−モルホリノ−９Ｈ−プリン−６−イル)ピリミジン−２−アミン(ＷＯ１０１１４４８４号)；および(Ｅ)−Ｎ−(８−(６−アミノ−５−(トリフルオロメチル)ピリジン−３−イル)−１−(６−(２−シアノプロパン−２−イル)ピリジン−３−イル)−３−メチル−１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−２(３Ｈ)−イリデン)シアナミド(ＷＯ１２００７９２６号)を含む。
触媒的ｍＴＯＲ阻害剤のさらなる例は、８−(６−メトキシ−ピリジン−３−イル)−３−メチル−１−(４−ピペラジン−１−イル−３−トリフルオロメチル−フェニル)−１,３−ジヒドロ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−２−オン(ＷＯ２００６／１２２８０６号)およびＫｕ−００６３７９４(Garcia-Martinez JM, et al.,Biochem J., 2009, 421(1), 29-42)を含む。Ｋｕ−００６３７９４は、哺乳動物ラパマイシンの標的(ｍＴＯＲ)の特異的阻害剤である。ＷＹＥ−３５４は、触媒的ｍＴｏｒ阻害剤の他の例である(Yu K, et al. (2009). Biochemical, Cellular, and In vivo Activity of Novel ATP-Competitive and Selective Inhibitors of the Mammalian Target of Rapamycin. Cancer Res. 69(15): 6232-6240)。
本発明によって有用なｍＴＯＲ阻害剤はまた、前記のいずれかのプロドラッグ、誘導体、薬学的に許容される塩そのアナログも含む。
ＲＡＤ００１のようなｍＴＯＲ阻害剤は、ここに記載する特定の用量に基づき、当分野で十分に確立された方法に基づき送達用に製剤され得る。特に、ＵＳ特許６,００４,９７３号(引用により本明細書に包含させる)は、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤で使用できる製剤例を提供する。
ＣＡＲ有効性またはサンプル適性を評価するための方法およびバイオマーカー
他の面において、本発明は、対象(例えば、癌を有する対象、例えば、血液癌)におけるＣＡＲ発現細胞療法(例えば、ＣＤ３３ＣＡＲ治療)の有効性またはＣＡＲ治療(例えば、ＣＤ３３ＣＡＲ治療)のためのサンプル(例えば、アフェレーシスサンプル)の適性を評価またはモニタリングする方法に関する。方法は、ＣＡＲ治療またはサンプル適性に対する有効性の値を得て、ここで、該値はＣＡＲ発現細胞療法の有効性または適性の指標である。
ある態様において、ＣＡＲ治療またはサンプル適性の有効性の値は、次の１、２、３、４、５、６またはそれ以上(全て)の測定を含む。
(ｉ)サンプル(例えば、アフェレーシスサンプルまたは製造ＣＡＲ発現細胞産物サンプル)における休止ＴＥＦＦ細胞、休止ＴＲＥＧ細胞、若いＴ細胞(例えば、若いＣＤ４またはＣＤ８細胞またはガンマ／デルタＴ細胞)または早期記憶Ｔ細胞またはこれらの組み合わせの１、２、３またはそれ以上(例えば全)のレベルまたは活性；
(ii)サンプル(例えば、アフェレーシスサンプルまたは製造ＣＡＲ発現細胞産物サンプル)における活性化ＴＥＦＦ細胞、活性化ＴＲＥＧ細胞、古いＴ細胞(例えば、古いＣＤ４またはＣＤ８細胞)または後期記憶Ｔ細胞またはこれらの組み合わせの１、２、３またはそれ以上(例えば全)のレベルまたは活性；
(iii)サンプル(例えば、アフェレーシスサンプルまたは製造ＣＡＲ発現細胞産物サンプル)における免疫細胞枯渇マーカー、例えば、免疫チェックポイント阻害剤(例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ−３および／またはＬＡＧ−３)の１、２以上のレベルまたは活性。ある態様において、免疫細胞は、枯渇表現型を有し、例えば、少なくとも２枯渇マーカーを共発現し、例えば、ＰＤ−１およびＴＩＭ−３を共発現する。他の態様において、免疫細胞は、枯渇表現型を有し、例えば、少なくとも２枯渇マーカーを共発現し、例えば、ＰＤ−１およびＬＡＧ−３を共発現する；
(iv)サンプル(例えば、アフェレーシスサンプルまたは製造ＣＡＲ発現細胞産物サンプル)における、ＣＤ２７および／またはＣＤ４５ＲＯ−(例えば、ＣＤ２７＋ ＣＤ４５ＲＯ−)免疫エフェクター細胞のレベルまたは活性；
(ｖ)ＣＣＬ２０、ＩＬ−１７ａおよび／またはＩＬ−６、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＤ５７、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ６２Ｌ、ＫＬＲＧ１から選択されるバイオマーカーの１、２、３、４、５、１０、２０またはそれ以上のレベルまたは活性；
(vi)ＣＡＲ発現細胞産物サンプルにおけるサイトカインレベルまたは活性(例えば、サイトカインレパートリーの質)、例えば、ＣＡＲ３３発現細胞産物サンプル；または
(vii)製造ＣＡＲ発現細胞産物サンプルにおけるＣＡＲ発現細胞の形質導入効率。
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、ＣＡＲ発現細胞療法は、複数(例えば、集団)のＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞、例えば、複数(例えば、集団)のＴ細胞またはＮＫ細胞またはこれらの組み合わせを含む。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞療法はＣＤ３３ＣＡＲ治療である。
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、(ｉ)〜(vii)の１以上の測定は、対象から得たアフェレーシスサンプルから得る。アフェレーシスサンプルは、注入または再注入前に評価できる。
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、(ｉ)〜(vii)の１以上の測定は、製造ＣＡＲ発現細胞産物サンプル、例えば、ＣＤ３３ＣＡＲ発現細胞産物サンプルから得る。製造ＣＡＲ発現細胞産物は、注入または再注入前に評価できる。
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、対象を、ＣＡＲ発現細胞療法を受ける前、途中または後に評価する。
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、(ｉ)〜(vii)の１以上の測定は、遺伝子発現、フローサイトメトリーまたはタンパク質発現の１以上のプロファイルを評価する。
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、方法は、さらに、(ｉ)〜(vii)の１以上の測定に基づき対象を応答者、非応答者、再発者または非再発者として特定することを含む。
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、応答者(例えば、完全応答者)は、非応答者と比較して、ＧＺＭＫ、ＰＰＦ１ＢＰ２またはナイーブＴ細胞の１、２以上(全て)のレベルまたは活性が高いかまたは高いとして同定される。
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、非応答者は、応答者と比較して、ＩＬ２２、ＩＬ−２ＲＡ、ＩＬ−２１、ＩＲＦ８、ＩＬ８、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２２、エフェクターＴ細胞または制御性Ｔ細胞の１、２、３、４、５、６、７またはそれ以上(例えば、全)のレベルまたは活性が高いかまたは高いとして同定される。
ある態様において、再発者は、非再発者と比較して、次の遺伝子の１以上(例えば、２、３、４または全)の発現レベルが高いかまたは高いとして同定される患者である：ＭＩＲ１９９Ａ１、ＭＩＲ１２０３、ｕｃ０２１ｏｖｐ、ＩＴＭ２ＣおよびＨＬＡ−ＤＱＢ１；および／または非再発者と比較して、次の遺伝子の１以上(例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または全)の発現レベルが減少している患者である：ＰＰＩＡＬ４Ｄ、ＴＴＴＹ１０、ＴＸＬＮＧ２Ｐ、ＭＩＲ４６５０−１、ＫＤＭ５Ｄ、ＵＳＰ９Ｙ、ＰＲＫＹ、ＲＰＳ４Ｙ２、ＲＰＳ４Ｙ１、ＮＣＲＮＡ００１８５、ＳＵＬＴ１Ｅ１およびＥＩＦ１ＡＹ。
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、完全応答者は、対照値、例えば、非応答者のＣＤ８＋ Ｔ細胞パーセンテージと比較して、大きい、例えば、統計学的に有意に大きい、ＣＤ８＋ Ｔ細胞パーセンテージを有するかまたは有するとして同定される。
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、完全応答者は、対照値、例えば、非応答者のＣＤ２７＋ ＣＤ４５ＲＯ−免疫エフェクター細胞数と比較して、大きなパーセンテージのＣＤ２７＋ ＣＤ４５ＲＯ−免疫エフェクター細胞を有するかまたは有するとして同定される。
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、完全応答者または部分的応答者は、対照値、例えば、非応答者ＣＤ４＋ Ｔ細胞パーセンテージと比較して、大きい、例えば、統計学的に有意に大きい、ＣＤ４＋ Ｔ細胞パーセンテージを有するかまたは有するとして同定される。
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、完全応答者は、対照値、例えば、非応答者の休止ＴＥＦＦ細胞、休止ＴＲＥＧ細胞、若いＴ細胞(例えば、若いＣＤ４またはＣＤ８細胞)または早期記憶Ｔ細胞数と比較して、大きなパーセンテージの休止ＴＥＦＦ細胞、休止ＴＲＥＧ細胞、若いＴ細胞(例えば、若いＣＤ４またはＣＤ８細胞またはガンマ／デルタＴ細胞)または早期記憶Ｔ細胞またはこれらの組み合わせの１、２、３またはそれ以上(例えば全)を有するまたは有すると同定される。
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、非応答者は、対照値、例えば、応答者の活性化ＴＥＦＦ細胞、活性化ＴＲＥＧ細胞、古いＴ細胞(例えば、古いＣＤ４またはＣＤ８細胞)または後期記憶Ｔ細胞活性化ＴＥＦＦ細胞、活性化ＴＲＥＧ細胞、古いＴ細胞(例えば、古いＣＤ４またはＣＤ８細胞)または後期記憶Ｔ細胞数と比較して大きなパーセンテージの活性化ＴＥＦＦ細胞、活性化ＴＲＥＧ細胞、古いＴ細胞(例えば、古いＣＤ４またはＣＤ８細胞)または後期記憶Ｔ細胞またはこれらの組み合わせの１、２、３またはそれ以上(例えば全)を有するかまたは有するとして同定される。
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、非応答者は、免疫細胞枯渇マーカー、例えば、１、２以上の免疫チェックポイント阻害剤(例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ−３および／またはＬＡＧ−３)の大きなパーセンテージを有するかまたは有するとして同定される。ある態様において、非応答者は、応答者からのＰＤ−１またはＬＡＧ−３発現免疫エフェクター細胞のパーセンテージと比較して、大きなパーセンテージのＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＬＡＧ−３発現免疫エフェクター細胞(例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞)(例えば、ＣＡＲ発現ＣＤ４＋細胞および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞)を有するかまたは有するとして同定される。
ある態様において、非応答者は、大きなパーセンテージの枯渇表現型を有する免疫細胞、例えば、少なくとも２枯渇マーカーを共発現する、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１および／またはＴＩＭ−３を共発現する免疫細胞を有するかまたは有するとして同定される。他の態様において、非応答者は、大きなパーセンテージの枯渇表現型を有する免疫細胞、例えば、少なくとも２枯渇マーカーを共発現する、例えば、ＰＤ−１およびＬＡＧ−３を共発現する免疫細胞を有するかまたは有するとして同定される。
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、非応答者は、ＣＡＲ発現細胞療法への応答者(例えば、完全応答者)と比較して、ＣＡＲ発現細胞集団(例えば、ＣＤ３３ＣＡＲ＋細胞集団)における大きなパーセンテージのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１＋／ＬＡＧ−３＋細胞を有するかまたは有するとして同定される。
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、部分的応答者は、ＣＡＲ発現細胞集団において、応答者よりも高いパーセンテージのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１＋／ＬＡＧ−３＋細胞を有するかまたは有するとして同定される(例えば、ＣＤ３３ＣＡＲ＋細胞集団)。
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、非応答者は、ＣＡＲ発現細胞集団(例えば、ＣＤ３３ＣＡＲ＋細胞集団)においてＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１＋ ＣＡＲ＋の枯渇表現型およびＬＡＧ３共発現を有するかまたは有するとして同定される。
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、非応答者は、応答者(例えば、完全応答者)と比較して、ＣＡＲ発現細胞集団(例えば、ＣＤ３３ＣＡＲ＋細胞集団)における大きなパーセンテージのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１＋／ＴＩＭ−３＋細胞を有するかまたは有するとして同定される。
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、部分的応答者は、ＣＡＲ発現細胞集団(例えば、ＣＤ３３ＣＡＲ＋細胞集団)において、応答者より高いパーセンテージのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１＋／ＴＩＭ−３＋細胞を有するかまたは有するとして同定される。
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、アフェレーシスサンプルにおけるＣＤ８＋ ＣＤ２７＋ ＣＤ４５ＲＯ− Ｔ細胞の存在は、ＣＡＲ発現細胞療法(例えば、ＣＤ３３ＣＡＲ治療)に対する対象の応答の正の予測因子である。
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、アフェレーシスサンプルにおける高いパーセンテージのＰＤ１＋ ＣＡＲ＋およびＬＡＧ３＋またはＴＩＭ３＋ Ｔ細胞は、ＣＡＲ発現細胞療法(例えば、ＣＤ３３ＣＡＲ治療)に対する対象の応答が不良である負の予測因子である。
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、応答者(例えば、完全または部分的応答者)は、次のプロファイルの１、２、３またはそれ以上(または全)を有する。
(ｉ)対照値、例えば、非応答者のＣＤ２７＋免疫エフェクター細胞数と比較して、ＣＤ２７＋免疫エフェクター細胞数が多い；
(ii)(ｉ)対照値、例えば、非応答者のＣＤ８＋ Ｔ細胞数と比較して、ＣＤ８＋ Ｔ細胞数が多い；
(iii)対照値、例えば、非応答者の１以上のチェックポイント阻害剤を発現する細胞数と比較して、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３またはＫＬＲＧ−１または組み合わせから選択される１以上のチェックポイント阻害剤、例えば、チェックポイント阻害剤を発現する免疫細胞数が少ない；または
(iv)対照値、例えば、非応答者の休止ＴＥＦＦ細胞、休止ＴＲＥＧ細胞、ナイーブＣＤ４細胞、非刺激記憶細胞または早期記憶Ｔ細胞数と比較して、休止ＴＥＦＦ細胞、休止ＴＲＥＧ細胞、ナイーブＣＤ４細胞、非刺激記憶細胞または早期記憶Ｔ細胞またはこれらの組み合わせの１、２、３、４またはそれ以上(全て)の数が多い。
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、(vi)のサイトカインレベルまたは活性は、サイトカインＣＣＬ２０／ＭＩＰ３ａ、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１３、ＩＬ２、ＩＬ２１、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ９またはＴＮＦαまたはこれらの組み合わせの１、２、３、４、５、６、７、８またはそれ以上(全て)から選択される。サイトカインは、ＩＬ−１７ａ、ＣＣＬ２０、ＩＬ２、ＩＬ６またはＴＮＦａの１、２、３、４またはそれ以上(全て)から選択できる。ある態様において、ＩＬ−１７ａおよびＣＣＬ２０から選択される一方または両方のサイトカインのレベルまたは活性の増加は、増加した応答性または減少した再発の指標である。
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、(vii)における１５％以上の形質導入効率は、増加した応答性または減少した再発の指標である。
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、(vii)における１５％未満の形質導入効率は、低下した応答性または増加した再発の指標である。
ある態様において、ここの方法で同定した応答者、非応答者、再発者または非再発者は、臨床基準によりさらに評価できる。例えば、完全応答者は、処置に対する完全応答、例えば、完全寛解を示す、疾患、例えば、癌を有する対象であるまたはそう同定される。完全応答は、ここに記載するように、例えば、NCCN Guidelines(登録商標)またはCheson et al, J Clin Oncol 17:1244 (1999) and Cheson et al., “Revised Response Criteria for Malignant Lymphoma”, J Clin Oncol 25:579-586 (2007)(両者ともこれは引用により本明細書に包含させる)を使用して同定し得る。部分的応答者は、処置に対する部分的応答、例えば、部分的寛解を示す、疾患、例えば、癌を有する対象であるまたはそう同定される。部分的応答は、ここに記載するように、例えば、NCCN Guidelines(登録商標)またはCheson基準を使用して同定され得る。非応答者は、処置に応答を示さない、例えば、疾患が安定したまたは疾患が進行した、疾患、例えば、癌を有する対象であるまたはそう同定される。非応答者は、ここに記載するように、例えば、NCCN Guidelines(登録商標)またはCheson基準を使用して同定され得る。
ここに開示する方法とは別にまたはそれと組み合わせて、該値に対する応答は、次の１、２、３、４またはそれ以上を実施する。
例えば、応答者または非再発者に、ＣＡＲ発現細胞療法を投与する；
ＣＡＲ発現細胞療法の別の用量を投与する；
ＣＡＲ発現細胞療法のスケジュールまたはタイムコースを変更する；
例えば、非応答者または部分的応答者に、ＣＡＲ発現細胞療法に加えて、さらなる薬剤、例えば、チェックポイント阻害剤、例えば、ここに記載するチェックポイント阻害剤を投与する；
非応答者または部分的応答者に、ＣＡＲ発現細胞療法での処置前に対象の若いＴ細胞の数を増加させる治療を投与する；
例えば、非応答者または部分的応答者として同定された対象について、ＣＡＲ発現細胞療法の製造法を修飾する、例えば、ＣＡＲをコードする核酸導入前に若いＴ細胞を富化するまたは形質導入効率を増加する；
例えば、非応答者または部分的応答者または再発者に対して、別の治療を投与する；または
対象が非応答者または再発者であるまたはそうであると同定されたならば、例えば、ＣＤ２５枯渇、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体またはこれらの組み合わせ投与の１以上により、ＴＲＥＧ細胞集団および／またはＴＲＥＧ遺伝子サインを減少させる。
ある態様において、対象は抗ＧＩＴＲ抗体で前処置される。ある態様において、対象は、注入または再注入前に抗ＧＩＴＲ抗体で処置される。
バイオポリマー送達方法
ある態様において、ここに開示する１以上のＣＡＲ発現細胞を、バイオポリマー足場、例えば、バイオポリマーインプラントにより対象に投与または送達し得る。バイオポリマーを、バイオポリマー足場、例えば、バイオポリマーインプラントにより対象に投与または送達し得る。
適当なバイオポリマーの例は、寒天、アガロース、アルギン酸、アルギン酸／リン酸カルシウムセメント(ＣＰＣ)、ベータ−ガラクトシダーゼ(β−ＧＡＬ)、(１,２,３,４,６−ペンタアセチルａ−Ｄ−ガラクトース)、セルロース、キチン、キトサン、コラーゲン、エラスチン、ゼラチン、ヒアルロン酸コラーゲン、ヒドロキシアパタイト、ポリ(３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシ−ヘキサノエート)(ＰＨＢＨＨｘ)、ポリ(ラクチド)、ポリ(カプロラクトン)(ＰＣＬ)、ポリ(ラクチド−コ−グリコリド)(ＰＬＧ)、ポリエチレンオキシド(ＰＥＯ)、ポリ(乳酸−コ−グリコール酸)(ＰＬＧＡ)、ポリプロピレンオキシド(ＰＰＯ)、ポリビニルアルコール)(ＰＶＡ)、絹、大豆タンパク質および大豆タンパク質単離体の、単独でまたはいずれかの他のポリマー組成物との、あらゆる濃度およびあらゆる比での混合物を含むが、これらに限定されない。バイオポリマーは、接着または遊走促進分子、例えば、リンパ球のコラーゲン受容体に結合するコラーゲン模倣ペプチドおよび／または送達する細胞の送達、増殖または機能、例えば、抗癌活性を増強する刺激分子で増強または修飾され得る。バイオポリマー足場は、注射可能な、例えば、ゲルまたは半固体または固体組成物であり得る。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象への送達前にバイオポリマー足場上に播種する。ある態様において、バイオポリマー足場は、例えば、足場のバイオポリマーに取り込まれたまたはコンジュゲートされた、さらにここに記載する１以上のさらなる治療剤(例えば、他のＣＡＲ発現細胞、抗体または小分子)またはＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を含む。ある態様において、バイオポリマー足場を、例えば、腫瘍内に注射するかまたは腫瘍にまたは抗腫瘍効果を仲介するのに十分に腫瘍に近位に外科的にインプラントする。バイオポリマー組成物およびその送達のための方法さらなる例は、Stephan et al., Nature Biotechnology, 2015, 33:97-101；およびＷＯ２０１４／１１０５９１号に記載される。
医薬組成物および処置
本発明の医薬組成物は、ここに記載のように、ＣＡＲ発現細胞、例えば、複数のＣＡＲ発現細胞を、１以上の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤または添加物と組み合わせて含む。このような組成物は、中性緩衝化食塩水、リン酸緩衝化食塩水などのような緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールのような炭水化物；タンパク質；グリシンのようなポリペプチドまたはアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンのようなキレート剤；アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム)；および防腐剤を含み得る。本発明の組成物は、一つの面において静脈内投与用に製剤される。
本発明の医薬組成物を、処置する(または予防する)疾患に適する方法で投与し得る。投与の量および頻度は、患者の状態および患者の疾患のタイプおよび重症度のような因子により決定されるが、適切な用量は、臨床試験により決定され得る。
ある態様において、医薬組成物は、例えば、エンドトキシン、マイコプラズマ、複製可能レンチウイルス(ＲＣＬ)、ｐ２４、ＶＳＶ−Ｇ核酸、ＨＩＶ ｇａｇ、残留抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズ、マウス抗体、貯留ヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培養培地要素、ベクターパッケージング細胞またはプラスミド成分、細菌および真菌からなる群から選択される汚染物が実質的にない、例えば、検出可能なレベルで存在しない。ある態様において、細菌は、アルガリゲネス・フェカリス、カンジダ・アルビカンス、エシェリキア・コリ、ヘモフィルス・インフルエンザエ、ナイセリア・メニンギティディス、シュードモナス・エルジノーサ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ニューモニエおよびストレプトコッカス・ピオゲネスＡ群からなる群から選択される少なくとも１つである。
“免疫学的に有効量”、“抗腫瘍有効量”、“腫瘍阻害有効量”または“治療量”が示されるとき、本発明の組成物の投与すべき正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染の程度または転移および患者(対象)の状態の個体差を考慮して医師が決定できる。ここに記載する免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を含む医薬組成物を、１０４〜１０９細胞／kg体重、いくつかの例において１０５〜１０６細胞／kg体重の範囲の用量で、これらの範囲内の全整数値を含み、投与し得ると一般に述べることができる。Ｔ細胞組成物を、また、この用量で複数回投与し得る。細胞を、免疫療法において一般に知られる注入技術を使用して投与できる(例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988参照)。
ある面において、活性化免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を対象に投与し、続いて血液を採り(またはアフェレーシスを実施し)、本発明に従いそこからの免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を活性化し、これらの活性化し、かつ増殖させた免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を患者に再注入することが望ましいことがある。この過程を数週間毎に複数回実施できる。ある面において、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、１０cc〜４００ccの採血した血液から活性化できる。ある面において、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、２０cc、３０cc、４０cc、５０cc、６０cc、７０cc、８０cc、９０ccまたは１００ccの採血した血液から活性化する。
対象組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸注、留置または移植を含む、いずれかの簡便な方法により実施し得る。ここに記載する組成物を、患者に経動脈的に、皮下に、皮内に、腫瘍内に、節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内(ｉ.ｖ.)注射によりまたは腹腔内に投与し得る。一つの面において、本発明のＴ細胞組成物を、患者に皮内または皮下注射により投与するする。一つの面において、本発明のＴ細胞組成物を、ｉ.ｖ.注射により投与する。ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の組成物を、腫瘍、リンパ節または感染部位に直接注射し得る。
特定の例示的面において、対象は、白血球を採取し、エクスビボで富化または枯渇させて、目的の細胞、例えば、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を選択および／または単離する、白血球除去を受け得る。これらの免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)単離体を、当分野で知られる方法により増殖させ、１以上の本発明のＣＡＲ構築物が導入され、それにより１以上の本発明のＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)が創製されるように処理し得る。処置を必要とする対象を、その後高用量の化学療法剤と続く末梢血幹細胞移植の標準的処置に付し得る。ある面において、移植後または移植と同時に、対象は、増殖させた本発明のＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)の注入を受ける。さらなる面において、増殖細胞を手術の前または後に投与する。
ある態様において、リンパ球枯渇を、対象に、例えば、ここに記載するＣＡＲ例えば、ＣＤ３３−結合ここに記載するＣＡＲを発現する１以上の細胞を投与する前に行う。ある態様において、リンパ球枯渇は、メルファラン、シトキサン、シクロホスファミドおよびフルダラビンの１以上の投与を含む。
患者に投与すべき上記処置の用量は、処置する状態の正確な性質および処置の受け手により変わる。ヒト投与のためのスケーリングは、当分野で認識されている習慣に従い実施できる。キャンパスの用量は、例えば、概して成人患者に１〜約１００mgの範囲であり、通常連日、１〜３０日の期間投与する。好ましい１日用量は１〜１０mg／日であるが、いくつかの例において最大４０mg／日までの高用量を使用し得る(米国特許６,１２０,７６６号に記載)。
ある態様において、ＣＡＲを、例えば、インビトロ転写を使用して免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)に導入し、対象(例えば、ヒト)は、本発明のＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の初期投与と、その後の本発明のＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の１回以上の投与を受け、ここで、その後の１回以上の投与は、先の投与の後、１５日、例えば、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日または２日以内に行う。ある態様において、本発明のＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の１回を超える投与を、対象(例えば、ヒト)に１週間当たりに行い、例えば、本発明のＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の２、３または４投与を週あたりに投与する。ある態様において、対象(例えば、ヒト対象)は、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の週あたり１回を超える投与を受け(例えば、１週間当たり２回、３回または４回投与)(ここではサイクルとも呼ぶ)、続いて１週間、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)投与されず、その後さらにＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の１回以上のさらなる投与(例えば、週あたりＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の１回を超える投与)を対象に投与する。他の態様において、対象(例えば、ヒト対象)は、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の１回を超えるサイクルの投与を受け、各サイクル間の期間は１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日または３日より短い。ある態様において、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、隔日で１週間３回投与する。ある態様において、本発明のＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間またはそれ以上投与する。
ある面において、ＣＤ３３ ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＤ３３ ＣＡＲＴまたはＣＤ３３ ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)を、レンチウイルスのようなレンチウイルスウイルスベクターを使用して産生する。この方法で産生したＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲＴまたはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)は、安定なＣＡＲ発現を有する。
ある面において、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴを、ガンマレトロウイルスベクター、例えば、ここに記載するガンマレトロウイルスベクターのようなウイルスベクターを使用して産生する。これらのベクターを使用して産生されたＣＡＲＴは、安定なＣＡＲ発現を有する。
ある面において、ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲＴまたはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)は、形質導入４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日後、ＣＡＲベクターを一過性に発現する。ＣＡＲの一過性発現は、ＲＮＡ ＣＡＲベクター送達により行われ得る。ある面において、ＣＡＲ ＲＮＡを、電気穿孔法により、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に形質導入する。
一過性にＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞(例えば、ＣＡＲＴまたはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)(特にＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲＴまたはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)担持マウスｓｃＦｖで)を使用して処置される患者で生じ得る可能性のある問題は、複数処置後のアナフィラキシーである。
この理論に縛られることを望まないが、このようなアナフィラキシー応答は、液性抗ＣＡＲ応答を発達させる患者、すなわち、抗ＩｇＥアイソタイプを有する抗ＣＡＲ抗体が原因であると考えられる。細胞を産生する患者の抗体が、抗原への暴露の１０〜１４日の中断があるとき、ＩｇＧアイソタイプ(これはアナフィラキシーを生じない)からＩｇＥアイソタイプへのクラススイッチを受けると考えられる。
患者が一過性ＣＡＲ治療(例えばＲＮＡ形質導入により完成されたもののような)中に抗ＣＡＲ抗体応答を産生する高リスクにあるならば、ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲＴまたはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)注入中断は１０〜１４日を超えて継続してはならない。
本発明を、次の実験的実施例を参照してさらに詳細に記載する。これらの実施例は、説明のみを目的として提供し、特に断らない限り限定を意図しない。そうして、本発明は、決して次の実施例に限定されると解釈してはならず、むしろ、ここに提供する教示の結果として明らかとなるいずれかかつ全ての異形を含むと解釈すべきである。
さらに記載せずとも、当業者は、前の記載および次の説明的実施例を使用して、本発明の化合物を製造および利用し、本願発明方法を実施できると考える。次の作業実施例は、本発明の多様な面を特に示すものであり、本開示を限定するものと解釈されるべきでない。
実施例１：ヒト化ＣＡＲ構築物
ＣＤ３３レベルを、市販の抗体(クローンＨＩＭ３−４、eBioscience；またはクローンＷＭ５３、Biolegend)を使用するフローサイトメトリーにより、ＡＭＬを有する患者の一次開存性サンプルにおいて測定した。ここに示す結果は、ＣＤ３３が多くのＡＭＬを有する一次患者サンプルで発現されたことを示す(ＡＭＬ芽細胞を、標準側方散乱光低ＣＤ４５ｄｉｍ特徴を使用してゲーティングした；群あたりｎ＝３５〜４６)。
本実施例で使用したＣＡＲ構築物の略図を図３に示す。全ては、４１ＢＢおよびＣＤ３ゼータシグナル伝達を使用する第二世代ＣＡＲである。ＣＡＲＴ３３のｓｃＦｖは、クローンＭＹ９−６由来であった。
ＣＡＲＴ３３のインビトロ活性
ここに記載する実験は、ＣＡＲＴ３３介在Ｔ細胞脱顆粒を測定した。ＣＡＲＴ３３形質導入およびＵＴＤ Ｔ細胞をＣＤ３３＋細胞株ＭＯＬＭ１４とインキュベートし、対照ＡＬＬ細胞株ＮＡＬＭ６およびＣＤ１０７ａ脱顆粒をフローサイトメトリーにより測定した。マウスおよびヒト化ＣＡＲＴ３３構築物の両者の発現は、ＭＯＬＭ１４存在下、特異的脱顆粒を誘発した(Ｐ＜０.００１)(図４)。
ここに記載する実験は、ＣＡＲＴ３３に対する応答におけるサイトカイン産生を測定した。Ｔ細胞を発現するヒト化およびマウスＣＡＲＴ３３両者は、ＭＯＬＭ１４とインキュベーション後サイトカインを産生した(図５)。細胞内腫瘍壊死アルファおよびインターフェロンガンマをフローサイトメトリーにより測定した。
ここに記載する実験は、ＣＡＲＴ１２３およびＣＡＲＴ３３発現Ｔ細胞の増殖を測定した。ヒト化ＣＡＲＴ３３およびマウスＣＡＲＴ３３増殖を、ＭＯＬＭ１４に対する応答において測定した。結果を図６に示す。Ｔ細胞をＣＦＳＥで標識し、対照条件下またはＭＯＬＭ１４と１２０時間インキュベートした。非増殖Ｔ細胞は、ＣＦＳＥ発現の単一の明るいピークを保持し(ＦＩＴＣチャネルにおける緑色蛍光により)、一方増殖ＣＡＲＴ細胞は、１を超えるＣＦＳＥピークおよびベースラインより遅い発現を有する。
ここに記載する実験は、ＣＡＲＴ１２３、ヒト化ＣＡＲＴ３３−およびマウスＣＡＲＴ３３発現Ｔ細胞の特異的細胞致死を測定した。Ｔ細胞をＭＯＬＭ１４またはＮＡＬＭ６(対照)と２４時間インキュベートした。ｈｕＣＡＲＴ３３の発現は、低Ｅ：Ｔ比でマウスＣＡＲＴ３３と比較して、有意に多い特異的細胞致死をもたらした(図７)。細胞死は、腫瘍細胞ＣＦＳＥ標識後、フローサイトメトリーベースのアッセイを使用して(例えばCao et al, Cytometry Part A 2010;7&A:534-545)またはＣＡＲＴ細胞とルシフェラーゼ発現標的細胞を、種々のエフェクター対標的比で最大２０時間インキュベートし、続いて標的細胞により放出される光子の光学造影により測定した。この後者のアッセイにおいて、生存標的細胞数は、放出される光子の数に正に比例する。
ヒト化ＣＡＲＴ３３、マウスＣＡＲＴ３３、ＣＡＲＴ１２３発現Ｔ細胞のサイトカインプロファイルを、Ｔ細胞培地単独、ＰＭＡ／イオノマイシン、ＭＯＬＭ１４またはＮＡＬＭ６(対照細胞株)と２４時間インキュベーション後(図８)、３０−ｐｌｅｘ Ｌｕｍｉｎｅｘキット(Invitrogen)を使用して測定した。
ＣＡＲＴ３３(ＩｇＧ４ヒンジ)およびＣＡＲＴ３３(ＣＤ８ヒンジ)は同等なインビトロ活性を有する
ここに記載する実験は脱顆粒を測定した。ＣＡＲＴ３３(ＩｇＧ４ヒンジ)、ＣＡＲＴ３３(ＣＤ８ヒンジ)、ＣＡＲＴ１２３および非形質導入Ｔ細胞をＣＤ３３＋細胞株ＭＯＬＭ１４とインキュベートし、ＣＤ１０７ａ脱顆粒をフローサイトメトリーにより測定した。ここに示す結果は、両ＣＡＲＴ３３構築物が、ＭＯＬＭ１４存在下特異的脱顆粒を受けることを示す(図８)。
ここに記載する実験は、サイトカイン産生を測定した。ＣＡＲＴ３３構築物およびＣＡＲＴ１２３両者は、ＭＯＬＭ１４細胞株とインキュベーション後、特異的にサイトカイン産生を誘発する(図９)。細胞内腫瘍壊死アルファ、ＭＩＰ１ａおよびインターフェロンガンマをフローサイトメトリーにより測定した。
ここに記載する実験は、ＭＯＬＭ１４に対する応答における対照非形質導入、ＣＡＲＴ３３−(ＩｇＧ４ヒンジ)、ＣＡＲＴ３３−(ＣＤ８ヒンジ)またはＣＡＲＴ１２３発現Ｔ細胞の増殖を測定した(図１０)。Ｔ細胞をＣＦＳＥで標識し、ＭＯＬＭ１４と１２０時間インキュベートした。増殖をＣＦＳＥ希釈により測定した。非増殖Ｔ細胞はＣＦＳＥで明るく染まり、単一ピークを示す。１細胞分裂は２ピークとして、２細胞分裂は２ピークなどとして観察される。
ＣＡＲＴ３３−ＣＤ８Ｈ、ＣＡＲＴ３３−ＩｇＧ４ＨおよびＣＡＲＴ１２３の同等なインビボ抗腫瘍効果
ＣＡＲＴ３３−ＣＤ８Ｈ、ＣＡＲＴ３３−ＩｇＧ４ＨおよびＣＡＲＴ１２３、ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−共通ガンマ鎖のインビボ抗腫瘍効果を比較するために、ノックアウト(ＮＳＧ)マウスにＡＭＬ細胞株ＭＯＬＭ１４ １×１０６ ivを注射し、６日後生着について造影した。７日目、マウスを、ＣＡＲＴ３３(ＩｇＧ４ヒンジ)、ＣＡＲＴ３３(ＣＤ８ヒンジ)、ＣＡＲＴ１２３または対照媒体(非形質導入細胞)を発現するＴ細胞で処置した。注射したＴ細胞の総数は２×１０６ ＩＶであった。その後マウスは、腫瘍負荷を評価するために連続的に毎週造影した(図１１)。
経時的腫瘍負荷についてのデータを生物発光造影(ＢＬＩ)により得た。マウスの４独立実験の代表である１実験からのデータ(群あたりｎ＝５)を図１２に示す。ここに示す結果は、ＣＡＲＴ３３−ＣＤ８Ｈ、ＣＡＲＴ３３−ＩｇＧ４ＨおよびＣＡＲＴ１２３ Ｔ細胞の同等なインビボ抗腫瘍効果を示す。
ＣＡＲＴ３３およびＣＡＲＴ１２３は、インビボで初代ＡＭＬの同等な根絶を生じる
インビボでの初代ＡＭＬのＣＡＲＴ３３およびＣＡＲＴ１２３根絶を比較するために、ヒトサイトカインＩＬ３／ＧＭ−ＣＳＦ／ＳＣＦ(ＮＳＧＳマウス)についてトランスジェニックなＮＳＧマウスに、初代ＡＭＬサンプルを５××１０６ ivで注射した。生着を、２〜４週間後、眼窩後洞採血により確認し、マウスをＣＡＲＴ３３、ＣＡＲＴ１２３または対照媒体(非形質導入細胞)で処置した。注射したＴ細胞の総数は１×１０５ ivであった。ＡＭＬ負荷を評価するために、マウスを連続的眼窩後洞採血で追跡した(図１３)。
ＵＴＤ、ＣＡＲＴ３３またはＣＡＲＴ１２３で処置したマウスからの末梢血の分析をベースライン、１４日および＋７０日に実施した(図１４)。標準技術を使用して、血液を麻酔マウスの眼窩後洞から得た。５０〜６０μlの標準体積血液を次いで１mlのＡＣＫ溶解緩衝液に溶解した。次いで血液を蛍光標識抗体で染色し、ＡＭＬまたはＣＡＲＴ細胞の存在をフローサイトメトリーを使用して検出した。ＡＭＬは、ＣＡＲＴ３３またはＣＡＲＴ１２３で処置したマウスで検出されなかった。
疾患負荷を、異なる時点での眼窩後洞採血からの芽細胞／μlにより測定した(図１５)。
ＣＡＲＴ３３、ＣＡＲＴ１２３またはＵＴＤで処置したマウスの生存(ＣＡＲＴ３３またはＣＡＲＴ１２３をＵＴＤと比較したときｐ＜０.００１)を測定した(図１６)。ここに示す結果は、ＣＡＲＴ３３およびＣＡＲＴ１２３がインビボで初代ＡＭＬの同等な根絶を生じることを示す
ＣＡＲＴ３３細胞の造血幹細胞毒性
ＣＡＲＴ３３細胞の造血幹細胞毒性を決定するために、ヒト化免疫系(ＨＩＳ)マウスを、ヒト細胞の生着を確認するために、胎児肝臓由来のヒトＣＤ３４＋細胞の注射６〜８週間後後眼窩から採血した。次いでマウスをＣＡＲＴ３３またはＵＴＤ(各１×１０６細胞)で処置し、その後連続的に毎週眼窩後洞採血した。次いでマウスを２８日目に屠殺し、臓器を採取し、分析した(図１７)。
実験の終わりにあたる２８日からのフローサイトメトリーによる末梢血(vi眼窩後洞採血)の分析を実施した(図１８)。ＣＡＲＴ３３、ＵＴＤ処置または未処置(ｎ＝５)マウスの２８日末梢血分析の統計学的分析は、ＣＡＲＴ３３は、単球およびＣＤ３３＋骨髄細胞系譜細胞に対する有意な毒性とＢ細胞および血小板には比較的少ない毒性をもたらしたことを示す(図１９)。２８日のフローサイトメトリーによる骨髄分析は、ＣＡＲＴ３３処置は、一重項、ｈｕＣＤ４５ｄｉｍ、細胞系譜陰性でゲーティングして骨髄前駆細胞(ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋)および造血幹細胞(ＣＤ３４＋ＣＤ３８−)の有意な減少をもたらしたことを示す(図２０)。
大腿骨切片を、ＵＴＤ Ｔ細胞またはＣＡＲＴ３３細胞処置後２８日にマウスから採った。ＩＨＣによるｈｕＣＤ４５およびＣＤ３４染色を実施した(図２１)。対照Ｔ細胞とＣＡＲＴ３３でｈｕＣＤ４５に差はないが、これら両群は同種異系ヒト−抗ヒト効果とおそらく一致する低ｈｕＣＤ４５を示す。ＣＡＲＴ３３で処置したマウスでＣＤ３４＋細胞の特異的減少があった。結果は２実験の代表である。
ＣＡＲＴ３３およびＣＡＲＴ１２３は、インビボで同等な造血毒性を生じる
インビボでのＣＡＲＴ３３およびＣＡＲＴ１２３造血毒性を決定するために、ＮＳＧＳマウスは、ブスルファンｉ.ｐ.、続いて正常ドナーからの２×１０６ Ｔ細胞枯渇骨髄細胞を、翌日受けた。生着を４週間後末梢血のフローサイトメトリー分析により確認し、次いで、マウスを１×１０(６) ＣＡＲＴ３３、ＣＡＲＴ１２３またはＵＴＤ形質導入自己Ｔ細胞で処置した。マウスをその後７日目および１４日目に眼窩後洞採血で追跡し、１４日に屠殺して剖検した(図２２)。
骨髄分析を２８日にフローサイトメトリーにより実施した。ＣＡＲＴ３３およびＣＡＲＴ１２３処置は、ｈｕＣＤ４５ｄｉｍ、Ｌｉｎ−でゲーティングした、骨髄前駆細胞(ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋)および造血幹細胞(ＣＤ３４＋ＣＤ３８−)の有意な減少をもたらす。結果は２実験の代表である(図２３)。ここに示す結果は、ＣＡＲＴ３３およびＣＡＲＴ１２３は、インビボで同等な造血毒性を生じることを示唆する。
ＭＤＳを有する患者からのＣＤ３４富化ＢＭをＵＴＤ、ＣＡＲＴ３３(ＩｇＧ４ヒンジ)、ＣＡＲＴ３３(ＣＤ８ヒンジ)またはＣＡＲＴ１２３とインキュベートした。ＣＡＲＴ３３またはＣＡＲＴ１２３処置サンプルでＣＤ４５ｄｉｍＣＤ３４＋細胞の有意な減少があった(図２４)。ここに示す結果は、ＣＡＲＴ３３およびＣＡＲＴ１２３は、骨髄異形成症候群(ＭＤＳ)骨髄細胞に細胞毒性であることを示す。
ヒト化ＣＡＲＴ３３の活性を試験するさらなる実験は、実施例５〜６に記載される。
実施例２：ＣＡＲ構築物
完全ヒト抗ＣＤ３３一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)を産生し、細胞内ＣＤ３ゼータ鎖および４−１ＢＢの細胞内共刺激性ドメインと共にレンチウイルス発現ベクターにクローン化し、表１に記載する名称を付した(これは、詳細な記載に示す)。
ｓｃＦｖ中でＶＬおよびＶＨドメインが出現する順序は可変であり(すなわち、ＶＬ−ＶＨまたはＶＨ−ＶＬ配向)、表３に示すように、各サブユニットが配列ＧＧＧＧＳ(配列番号２５)(例えば、(Ｇ４Ｓ)３(配列番号２８)または(Ｇ４Ｓ)４(配列番号２７))を含む３または４コピーの“Ｇ４Ｓ”(配列番号２５)サブユニットは、可変ドメインに結合して、ｓｃＦｖドメイン全体を作る。
ヒトｓｃＦｖフラグメントの配列(配列番号３９〜８３、いずれかのリーダー配列を含む)をここに表２に(詳細な記載に)提供する。リーダー配列を伴わないヒトｓｃＦｖフラグメントの配列を、詳細な記載における表９(ヌクレオチド配列について配列番号２５５〜２６１およびアミノ酸配列について配列番号２６２〜２６８)にここに記載する。
これらのクローンは、全て、ＣＤ３ゼータ鎖由来の共刺激性ドメインのシグナルドメインにＱ／Ｋ残基変化を含む。次いで、ＣＡＲ ｓｃＦｖフラグメントを、レンチウイルスベクターにクローン化して、単一コーディングフレーム内に完全長ＣＡＲ構築物を構築し、発現のためにＥＦ１アルファプロモーターを使用する(配列番号１１)。
ＣＡＲ構築物の配列およびそれらのドメイン配列を詳細な記載に記載する。ヒトＣＡＲ構築物の分析を、実施例４に記載のゆに実施した。
実施例３：ヒト化ＣＡＲＴ配列
２２１３ マウス抗ＣＤ３３ ＩｇＧ４ヌクレオチド配列(配列番号１３８)
GTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCGCGCAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTGCAAGCTTAATGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTGAATTGCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACATAAACGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCGCTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTATCGATTAGACTGTAGCCCAGGAATATGGCAGCTAGATTGTACACATTTAGAAGGAAAAGTTATCTTGGTAGCAGTTCATGTAGCCAGTGGATATATAGAAGCAGAAGTAATTCCAGCAGAGACAGGGCAAGAAACAGCATACTTCCTCTTAAAATTAGCAGGAAGATGGCCAGTAAAAACAGTACATACAGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTACTACAGTTAAGGCCGCCTGTTGGTGGGCGGGGATCAAGCAGGAATTTGGCATTCCCTACAATCCCCAAAGTCAAGGAGTAATAGAATCTATGAATAAAGAATTAAAGAAAATTATAGGACAGGTAAGAGATCAGGCTGAACATCTTAAGACAGCAGTACAAATGGCAGTATTCATCCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGGCTGCATACGCGTCGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACTGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGTGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGCTAGCTCTAGAGCCACCATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCCGGATCCAACATCATGCTGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGGCCGTGTCTGCCGGCGAGAAAGTGACCATGAGCTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTGTTCTTCAGCAGCTCCCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGATCCCCGGCCAGAGCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTCACCGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATCAGCAGCGTGCAGAGCGAGGACCTGGCCATCTACTACTGCCACCAGTACCTGAGCAGCCGGACCTTTGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAGAGAGGCGGCGGAGGCTCAGGCGGAGGCGGATCTAGTGGCGGAGGATCTCAGGTGCAGCTGCAGCAGCCAGGCGCCGAGGTCGTGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGATGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTACATCCACTGGATCAAGCAGACCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGGTGGGAGTGATCTACCCCGGCAACGACGACATCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGTCTAGCACCACCGCCTACATGCAGCTGTCCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAAGTGCGGCTGCGGTACTTCGATGTGTGGGGAGCCGGCACCACCGTGACCGTGTCATCTTCCGGAGAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATGATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAAGTCGACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGGAATTCGAGCTCGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATCTGCTTTTTGCTTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTAGTAGTTCATGTCATCTTATTATTCAGTATTTATAACTTGCAAAGAAATGAATATCAGAGAGTGAGAGGAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGCTCTAGCTATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGCTAGGGACGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACGCGCGCTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGG
２２１３ ＣＡＲヌクレオチド配列(配列番号１３９)
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCCGGATCCAACATCATGCTGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGGCCGTGTCTGCCGGCGAGAAAGTGACCATGAGCTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTGTTCTTCAGCAGCTCCCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGATCCCCGGCCAGAGCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTCACCGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATCAGCAGCGTGCAGAGCGAGGACCTGGCCATCTACTACTGCCACCAGTACCTGAGCAGCCGGACCTTTGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAGAGAGGCGGCGGAGGCTCAGGCGGAGGCGGATCTAGTGGCGGAGGATCTCAGGTGCAGCTGCAGCAGCCAGGCGCCGAGGTCGTGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGATGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTACATCCACTGGATCAAGCAGACCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGGTGGGAGTGATCTACCCCGGCAACGACGACATCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGTCTAGCACCACCGCCTACATGCAGCTGTCCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAAGTGCGGCTGCGGTACTTCGATGTGTGGGGAGCCGGCACCACCGTGACCGTGTCATCTTCCGGAGAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATGATCTACATC
TGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
２２１３ ＣＡＲアミノ酸配列(配列番号１４０)
MALPVTALLLPLALLLHAARPGSNIMLTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQSEDLAIYYCHQYLSSRTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSSGGGSQVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGAGTTVTVSSSGESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKMIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
２２１３ ｓｃＦｖヌクレオチド配列(配列番号１４１)
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCCGGATCCAACATCATGCTGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGGCCGTGTCTGCCGGCGAGAAAGTGACCATGAGCTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTGTTCTTCAGCAGCTCCCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGATCCCCGGCCAGAGCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTCACCGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATCAGCAGCGTGCAGAGCGAGGACCTGGCCATCTACTACTGCCACCAGTACCTGAGCAGCCGGACCTTTGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAGAGAGGCGGCGGAGGCTCAGGCGGAGGCGGATCTAGTGGCGGAGGATCTCAGGTGCAGCTGCAGCAGCCAGGCGCCGAGGTCGTGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGATGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTACATCCACTGGATCAAGCAGACCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGGTGGGAGTGATCTACCCCGGCAACGACGACATCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGTCTAGCACCACCGCCTACATGCAGCTGTCCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAAGTGCGGCTGCGGTACTTCGATGTGTGGGGAGCCGGCACCACCGTGACCGTGTCATCT
２２１３ ｓｃＦｖアミノ酸配列(配列番号１４２)
MALPVTALLLPLALLLHAARPGSNIMLTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQSEDLAIYYCHQYLSSRTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSSGGGSQVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGAGTTVTVSS
２２１８ヒト化抗ＣＤ３３ ＩｇＧ４Ｈヌクレオチド配列(配列番号１４３)
GTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCGCGCAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTGCAAGCTTAATGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTGAATTGCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACATAAACGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCGCTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTATCGATTAGACTGTAGCCCAGGAATATGGCAGCTAGATTGTACACATTTAGAAGGAAAAGTTATCTTGGTAGCAGTTCATGTAGCCAGTGGATATATAGAAGCAGAAGTAATTCCAGCAGAGACAGGGCAAGAAACAGCATACTTCCTCTTAAAATTAGCAGGAAGATGGCCAGTAAAAACAGTACATACAGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTACTACAGTTAAGGCCGCCTGTTGGTGGGCGGGGATCAAGCAGGAATTTGGCATTCCCTACAATCCCCAAAGTCAAGGAGTAATAGAATCTATGAATAAAGAATTAAAGAAAATTATAGGACAGGTAAGAGATCAGGCTGAACATCTTAAGACAGCAGTACAAATGGCAGTATTCATCCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGGCTGCATACGCGTCGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCC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ヒト化ｍｙ９６(Ｌ２Ｈ)ＩｇＧ４Ｈ ＢＢｚ ＮＴ(配列番号１４４)
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCCGGATCCGAGATCGTGCTGACACAGAGCCCTGGAAGCCTGGCCGTGTCTCCTGGCGAGCGCGTGACAATGAGCTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTGTTCTTCAGCAGCTCCCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGATCCCCGGCCAGAGCCCCAGACTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTCACCGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATCAGCAGCGTGCAGCCCGAGGACCTGGCCATCTACTACTGCCACCAGTACCTGAGCAGCCGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGAGAGGCGGCGGAGGCTCTGGCGGAGGCGGATCTAGTGGCGGAGGATCTCAGGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGCGCCGAGGTCGTGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGATGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTACATCCACTGGATCAAGCAGACCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGGTGGGAGTGATCTACCCCGGCAACGACGACATCAGCTACAACCAGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGTCTAGCACCACCGCCTACATGCAGCTGTCCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAAGTGCGGCTGCGGTACTTCGATGTGTGGGGCCAGGGAACCACCGTGACCGTGTCATCTTCCGGAGAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATGATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
ヒト化ｍｙ９６(Ｌ２Ｈ)ＩｇＧ４Ｈ ＢＢｚ ＡＡ(配列番号１４５)
MALPVTALLLPLALLLHAARPGSEIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKLEIKRGGGGSGGGGSSGGGSQVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTVSSSGESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKMIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
ヒト化ｍｙ９６(Ｌ２Ｈ)ｓｃＦｖ ｎｔ(配列番号１４６)
GAGATCGTGCTGACACAGAGCCCTGGAAGCCTGGCCGTGTCTCCTGGCGAGCGCGTGACAATGAGCTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTGTTCTTCAGCAGCTCCCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGATCCCCGGCCAGAGCCCCAGACTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTCACCGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATCAGCAGCGTGCAGCCCGAGGACCTGGCCATCTACTACTGCCACCAGTACCTGAGCAGCCGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGAGAGGCGGCGGAGGCTCTGGCGGAGGCGGATCTAGTGGCGGAGGATCTCAGGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGCGCCGAGGTCGTGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGATGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTACATCCACTGGATCAAGCAGACCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGGTGGGAGTGATCTACCCCGGCAACGACGACATCAGCTACAACCAGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGTCTAGCACCACCGCCTACATGCAGCTGTCCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAAGTGCGGCTGCGGTACTTCGATGTGTGGGGCCAGGGAACCACCGTGACCGTGTCATCT
ヒト化ｍｙ９６(Ｌ２Ｈ)ｓｃＦｖ ＡＡ(配列番号１４７)
EIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKLEIKRGGGGSGGGGSSGGGSQVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTVSS
実施例４：ヒトＣＡＲ構築物
ＮＦＡＴ制御プロモーターにより駆動されるルシフェラーゼレポーターを含むＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株(ＪＮＬ細胞と称す)のｓｃＦｖの細胞表面発現を表すために、ＪＮＬ細胞を、ＧＦＰをコードするｃＤＮＡ、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖまたはｈｓＣＤ３３に対して惹起したｃＦｖをコードするｃＤＮＡを発現するレンチウイルスベクターで形質導入した(図２７)。ＪＮＬの個々のｓｃＦｖの細胞表面発現を、細胞と組み換えＦｃタグ付きｈｓＣＤ３３をインキュベートし、続いてフェコエリスリンにコンジュゲートしたＦｃ特異的二次抗体でインキュベートすることにより検出した。クローンＣＤ３３−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７および−９が、このアッセイで陰性対照として役立った、ＧＦＰまたはＣＤ１９を標的とするｓｃＦｖを発現するＪＮＬ細胞に対して、ｈｓＣＤ３３に認識できるレベルで結合することが観察された。ＣＤ３３−８がｈｓＣＤ３３または、免疫グロブリン軽鎖に結合する細菌細胞表面タンパク質であるタンパク質Ｌ(データは示していない)への認識できる結合を欠くことが観察された。ここに示すデータは、クローンＣＤ３３−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７および−９が、ｈｓＣＤ３３に結合するｓｃＦｖをコードすることを示す。
ｈｓＣＤ３３を標的とする個々のｓｃＦｖを、ＪＮＬ細胞におけるＮＦＡＴ活性を惹起する能力について評価した(図２８)。ＨｓＣＤ３３に対してｓｃＦｖを発現するＪＮＬ細胞を、それぞれ、ｈｓＣＤ３３を発現するまたはｈｓＣＤ３３細胞表面発現を欠くＭＯＬＭ１３またはＭＯＬＰ８細胞株と共培養した(図２８Ａ；ｈｓＣＤ３３、緑色線；アイソタイプ対照、灰色点線および影付き領域)。図２８Ｂは、ＭＯＬＭ１３(線)またはＭＯＬＰ８(点線)細胞存在下、ｈｓＣＤ３３を標的とするｓｃＦｖを発現するＪＮＬ細胞の活性化を記載する。個々のｓｃＦｖを発現するＪＮＬ細胞を異なるエフェクター(すなわちＪＮＬ細胞)対標的(すなわちＭＯＬＭ１３またはＭＯＬＰ８)比で播種し、インキュベーション２４時間後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ装置でＢｒｉｇｈｔ−ＧｌｏTMルシフェラーゼアッセイを使用する相対的ルシフェラーゼ単位(ＲＬＵ)の発現について分析した。ｓｃＦｖクローンＣＤ３３−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−９およびヒトＣＤ３３抗原(ＣＤ３３−ＵＰｅｎｎ)に結合するモノクローナル抗体であるマイロターグの配列に基づくｓｃＦｖは、種々の程度であるにも関わらず、ＮＦＡＴ依存性ルシフェラーゼ活性を、ＭＯＬＰ８またはＧＦＰを発現するＪＮＬ細胞に対して、ＭＯＬＭ１３の存在下惹起することができた。
ｈｓＣＤ３３を標的とするｓｃＦｖの活性を、ドナー由来初代Ｔ細胞でさらに評価した(図２９Ａおよび２９Ｂ)。ナイーブＴ細胞を、標準プロトコールを使用する陰性選択により健常ドナーＰＢＭＣから単離し、DYNABEADS(登録商標)Human T-Expander CD3／CD28 Invitrogenキットを使用して活性化そた。刺激２４時間後、Ｔ細胞を、ｈｓＣＤ３３を標的とする個々のｓｃＦｖを発現するレンチウイルスで形質導入し、さらなる９日の培養で増殖させた。Ｔ細胞培養を、抗原依存性および抗原非依存的方法で細胞増殖を受け、細胞溶解活性を惹起する能力について分析した。ｈｓＣＤ３３を標的とするｓｃＦｖを発現するレンチウイルスベクターで形質導入した初代ヒトＴ細胞の細胞表面のｓｃＦｖ発現を図２９Ａおよび２９Ｂに記載する。ＳｃＦｖの発現を、図２７に記載のように、細胞と組み換えＦｃタグ付きｈｓＣＤ３３およびフェコエリスリンにコンジュゲートしたＦｃ特異的二次抗体のインキュベートにより検出した。図２７における先の知見に一致して、初代Ｔ細胞で発現されたｓｃＦｖクローンＣＤ３３−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７および−９は、ｈｓＣＤ３３に結合する能力を欠くＧＦＰを発現するＴ細胞と比較して認識できるレベルでｈｓＣＤ３３に結合した。それゆえに、ｓｃＦｖクローンＣＤ３３−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７および−９を、ヒトＣＤ３３抗原を標的とする初代Ｔ細胞の操作に使用した。
Ｔ細胞をＣＦＳＥで標識し、ＭＯＬＭ１３(図３０Ａ、黒色線)、ＭＯＬＰ８(図３０Ａ、白抜き棒)存在下で共培養または単独で培養(図３０Ａ、斜線を引いた棒)して、ＵＴＤ初代Ｔ細胞またはｈｓＣＤ３３を標的とするｓｃＦｖを発現する細胞の増殖能力を評価した。ＳｃＦｖクローンＣＤ３３−２、−３、−４、−５、−６および−９を発現するＴ細胞が、ＵＴＤまたはＣＤ３３陰性ＭＯＬＰ８細胞と比較した、ＣＤ３３発現ＭＯＬＭ１３細胞存在下でＴ細胞の絶対数増加により証明されるように、抗原依存的様式で増殖できた(図３０Ａ)。加えて、初代Ｔ細胞における抗原駆動細胞分裂を、ＭＯＬＭ１３、ＭＯＬＰ８細胞と共培養したまたは単独培養したｓｃＦｖクローンＣＤ３３−２、−３、−４、−５、−６および−９を発現するＣＦＳＥ標識Ｔ細胞の中央蛍光強度(ＭＦＩ)を測定することにより評価した(図３０Ｂ)。Ｔ細胞増殖の前記増加に一致して(図３０Ａ)、ＵＴＤまたはＭＯＬＰ８細胞と比較したＭＯＬＭ１３で共培養したＴ細胞のＣＦＳＥレベル低減が観察された(図３０Ｂ)。 ｓｃＦｖ＋またはｓｃＦｖ−であったＴ細胞のゲーティングにより、ｓｃＦｖ発現Ｔ細胞が、ＭＯＬＭ１３と共培養したとき、ｓｃＦｖ−カウンターパートに対して減少したＣＦＳＥレベルを有することが判明した。しかしながら、抗原認識に対する応答における増殖増加の指標である、ＣＦＳＥレベルは、ＭＯＬＰ８細胞と共培養したｓｃＦｖ＋またはｓｃＦｖ− Ｔ細胞で類似した(図３０Ｂ)。ここに示す結果はまたＣＤ３３存在下でＪＮＬ細胞のｓｃＦｖ依存性活性化を惹起するｓｃＦｖクローンＣＤ３３−２、−３、−４、−５、−６および−９の能力とも一致する(図２８Ｂ)。それゆえに、ｓｃＦｖクローンＣＤ３３−２、−３、−４、−５、−６および−９を、ＣＤ３３依存的様式で、初代Ｔ細胞の増殖の活性化に使用できる。
さらに、ＣＡＲＴ−ＣＤ３３ Ｔ細胞を、標的細胞上の抗原への暴露に対して増殖する能力について試験した。標的細胞は、ＰＬ−２１、ＨＬ６０およびＭｏｌｐ８細胞を含んだ。アッセイの日(日０)、標的細胞を計数し、３ｅ６細胞／mlで６mLのＴ細胞培地を含む５０mlチューブに移した。標的細胞を、氷上で１０,０００radで照射した。照射後、標的細胞をＴ細胞培地で２回洗浄し、計数し、氷上でＴ細胞培地中５ｅ５細胞／mlで再懸濁した。凍結形質導入Ｔ細胞を融解し、１０mL 完全Ｔ細胞培地で洗浄し、３００ｇで１０分遠心し、ＲＴで３mLの完全Ｔ細胞培地に穏やかに再懸濁した。Ｔ細胞を次いで血球計算器で係数し、１０mLの培地中２.５ｅ６／mLに再懸濁した。９６ウェルＵ底プレートにおいて、２５,０００照射的細胞および２５,０００形質導入ＣＡＲ Ｔ細胞(１：１比)を、二連のウェルで合わせた。別のウェルで、７５,０００抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを１００μlの培地中２５,０００形質導入Ｔ細胞に添加して、陽性対照として１：３細胞対ビーズ比とした；他のウェルで、１００μlの培地を２５,０００形質導入Ｔ細胞単独に培地のみ対照として添加した。細胞を、４日、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。４日目、細胞を採取し、デュプリケートをピペッティングにより合わせ、タンパク質Ｌまたは組み換えヒトＣＤ３３タンパク質を使用するＣＤ４、ＣＤ８およびＣＡＲのＦＡＣＳのための染色のためにＵ底プレートの同じウェルに移した。染色後、細胞を１２０μl ＭＡＣＳ＋０.５％ＢＳＡ緩衝液に再懸濁し、２０μl／ウェルカウントブライドビーズを各ウェルに添加した。増殖を、２５００ビーズの計数に使用した時間で検出されたＦＡＣＳ陽性細胞の数として測定した(図４７)。試験したＣＡＲＴ−ＣＤ３３ Ｔ細胞(例えば、ｓｃＦｖクローンＣＤ３３−１、−２、−４、−５、−６、−７、−９およびヒト化Ｍｙ９６由来(“Ｕｐｅｎｎ”と称す)は、ＨＬ−６０標的細胞に曝したとき、非形質導入細胞またはＣＡＲＴ−ＣＤ１９ Ｔ細胞より大きな程度で増殖した。ＣＡＲＴ−ＣＤ３３ Ｔ細胞(例えば、ｓｃＦｖクローンＣＤ３３−１、−２、−４、−５、−６、−７、−９およびヒト化Ｍｙ９６由来(Ｕｐｅｎｎと称す)は、ＰＬ２１標的細胞に曝したとき、非形質導入細胞より大きな程度でかつＣＡＲＴ−ＣＤ１９ Ｔ細胞とほぼ同じまたはそれより大きな程度で増殖した。ＣＡＲＴ−ＣＤ３３ Ｔ細胞は、ＣＤ３３標的を発現しないＭＯＬＰ８細胞に曝したとき、非形質導入細胞またはＣＡＲＴ−ＣＤ１９ Ｔ細胞とほぼ同程度またはそれよりわずかに大きな程度で増殖した。
細胞溶解活性を評価するために、２５,０００ ＭＯＬＭ１３細胞を、異なるエフェクター(すなわちＴ細胞)対標的(すなわちＭＯＬＭ１３)比で個々のｓｃＦｖを発現する初代Ｔ細胞と播種し、培養４日後のＣＦＳＥ標識ＭＯＬＭ１３細胞の絶対数の計数によりＭＯＬＭ１３死滅程度について分析した(図３１)。ｓｃＦｖクローンＣＤ３３−２、−３、−４、−５、−６および−９が、種々の程度であるにも関わらず、標的細胞溶解を誘発できることが判明した。それゆえに、ｓｃＦｖクローンＣＤ３３−２、−３、−４、−５、−６および−９を、ＣＤ３３発現標的細胞を直接標的とし、殺す初代Ｔ細胞の操作に使用できる。
Ｔ細胞致死は、ＣＤ３３発現ＰＬ２１およびルシフェラーゼを安定に発現するＨＬ−６０急性骨髄性白血病細胞株に向かった。非ＣＤ３３発現Ｕ８７細胞を対照として使用し、非形質導入Ｔ細胞(ＵＴＤを、非特異的背景細胞致死レベルの決定のために使用した。ＣＡＲＴ−ＣＤ３３の細胞溶解性活性を、１０：１のエフェクター：標的細胞非のタイトレーションおよびＴ細胞の２倍下方希釈として測定し、ここで、エフェクターは抗ＣＤ３３キメラ受容体を発現するＴ細胞であるとして定義された。アッセイを、適切な数のＴ細胞と一定数の標的細胞の混合により開始した。２０時間後、ルシフェラーゼシグナルを、ＥｎＶｉｓｉｏｎ装置でＢｒｉｇｈｔ−ＧｌｏTMルシフェラーゼアッセイを使用して測定した。これらの細胞死曲線の比較により、エフェクター細胞量のタイトレーションは、これらのＣＤ３３発現細胞が破壊されたことが示される(図４８Ａ、４８Ｂおよび４８Ｃ)。ヒトｓｃＦｖ担持ＣＡＲ−ＣＤ３３細胞のいずれかで形質導入した同じドナーからのＴ細胞は、ＣＤ３３＋標的を選択的に殺すことが可能であったが、活性の差異は、臨床活性の差異に反映されることが示された。
ＣＡＲＴ−ＣＤ３３細胞を、抗原に対する応答においてサイトカインを産生する能力について試験した。細胞を融解し、一夜回復させた。非形質導入Ｔ細胞(ＵＴＤ)を、背景Ｔ細胞効果のための非特異的対照として使用した。Ｔ細胞は、ＨＬ−６０、ＰＬ２１またはＭＯＬＰ８細胞に対するものであった。アッセイは、エフェクター：標的比２.５：１で試験し、ここで、エフェクターは、抗ＣＤ３３ ＣＡＲを発現するＴ細胞として定義された。アッセイを、細胞混合後１６時間行い、その時点で、培地をヒトサイトカイン検出用ＣＢＡ−Ｆｌｅｘキットを使用するサイトカインＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファおよびＩＬ−２の分析のために採る。ＣＡＲＴ−ＣＤ３３ Ｔ細胞を、内因性にＣＤ３３を発現する癌細胞と培養したとき、全ＣＤ３３−ＣＡＲＴは、標的発現細胞に対する応答においてサイトカインを産生した(図４９)。低ＣＤ３３発現標的細胞に対する種々のＣＤ３３−ＣＡＲＴクローンの反応性の差異は、これらの構築物を用いるＣＡＲＴ細胞形質導入の良好な臨床有効性に反映され得る。
最後に、カニクイザルＣＤ３３(ｃｙＣＤ３３)へのｓｃＦｖ交差反応性を、図３２に記載のようにフローサイトメトリーにより評価した。ＨｓＣＤ３３に対して惹起したｓｃＦｖを発現するレンチウイルスベクターで形質導入したＪＮＬ細胞を、組み換えＦｃタグ付きｈｓＣＤ３３(赤色線)またはｃｙＣＤ３３(青色線)とインキュベートし、続いてフェコエリスリンにコンジュゲートしたＦｃ特異的二次抗体とインキュベートした。ｓｃＦｖクローンＣＤ３３−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−９およびＣＤ３３−ＵＰｅｎｎは、ｈｓＣＤ３３に結合できたが、ｓｃＦｖクローンＣＤ３３−５のみが、ｈｓＣＤ３３およびｃｙＣＤ３３の両者に交差反応性を有することに我々は注目した(図３２)。
実施例５：ＲＮＡ電気穿孔ＣＡＲＴ３３細胞の特徴付け
Ｔ細胞レンチウイルス形質導入またはＲＮＡ電気穿孔におけるＣＡＲ３３発現の比較
ヒト化抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖおよびＩｇＧ４ヒンジ、例えば、配列番号１４５を含むｍＲＮＡ抗ＣＤ３３ ＣＡＲを、インビトロ転写により産生した。正常ドナーからのＴ細胞を単離し、ＣＡＲ３３ ｍＲＮＡで電気穿孔した。電気穿孔後、細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激、培養して増殖させた。ＣＡＲ３３発現を、電気穿孔後８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日または７日にフローサイトメトリーにより測定および定量した(図３３Ａ)。この実験からの結果は、ＣＡＲ３３のＲＮＡ電気穿孔は、少なくとも７日ドナーＴ細胞におけるＣＡＲ３３発現をもたらす。発現は、電気穿孔法後４日間最高であった(例えば、６０％より高い)(図３３Ｂ)。ＣＡＲ３３発現は、電気穿孔５〜７日後減少した。
ＲＮＡ電気穿孔からのＣＡＲ３３発現を、レンチウイルス形質導入からの安定ＣＡＲ３３発現と比較した。ドナーＴ細胞を、図２６のベクターのような、ＣＡＲ３３を含むレンチウイルス構築物で、標準法を使用して形質導入した。ＣＡＲ３３発現をフローサイトメトリー分析により測定し、平均蛍光強度(ＭＦＩ)により定量した。ＣＡＲ３３発現を、電気穿孔８時間、１日、２日、３日および４日後またはレンチウイルス形質導入ＣＡＲＴ３３細胞(図３４Ａ)およびＲＮＡ遺伝子導入ＣＡＲＴ３３細胞について形質導入を評価した(図３４Ｂ)。図３４のヒストグラムの左側の灰色ピークは、ＣＡＲ３３発現の欠失を示し、増加したＣＡＲ３３発現の増加が、グラフの右に向かって増える。レンチウイルス形質導入は、Ｔ細胞におけるＣＡＲ３３の安定発現をもたらし、ここで、ＣＡＲ３３発現レベルは、形質導入８時間〜４日後未変化のままである。対照的に、ＲＮＡ電気穿孔法は、Ｔ細胞におけるＣＡＲ３３の一過性発現をもたらす。具体的に、ＣＡＲ３３発現は、電気穿孔８時間〜１日後最高であり、ＣＡＲ３３発現は、電気穿孔２〜４日後減少する。
インビトロ細胞毒性活性
ＲＮＡ−電気穿孔およびレンチウイルス形質導入ＣＡＲＴ３３細胞の特異的殺細胞活性を評価するために、ＣＡＲＴ３３細胞を、急性骨髄性白血病細胞株ＭＯＬＭ１４のようなＣＤ３３発現標的細胞またはマントル細胞リンパ腫細胞株ＪＥＫＯのようなＣＤ３３陰性対照細胞と、種々のエフェクター(ＣＡＲＴ３３細胞)対標的(ＣＤ３３陽性または陰性細胞)比で２４時間インキュベートした。エフェクター対標的比は、０：１、０.１２５：１、０.２５：１、０.５：１、１：１および２：１の範囲であった。実験を、Ｔ細胞電気穿孔法／形質導入１日、２日、３日および４日後の種々の時点で反復した。電気穿孔法１日後、ＲＮＡ電気穿孔ＣＡＲＴ３３細胞は、Ｅ：Ｔ比０.１２５：１で特異的細胞致死を示した(図３５Ａ)。ＣＡＲ３３陽性ＭＯＬＭ１４細胞の特異的細胞致死は、ＣＡＲＴ３３細胞電気穿孔後２日(図３５Ｂ)、３日(図３５Ｃ)および４日(図３５Ｄ)で見られたが、特異的細胞致死のためのＥ：Ｔ比は経時的に増加し、特異的細胞致死の一過性性質を示した。レンチウイルス形質導入ＣＡＲＴ３３細胞は、低Ｅ：Ｔ比でも１〜４日、強力な特異的細胞致死活性を維持した。
結果を種々の方法で示したとき、電気穿孔１〜４日後のある特定のＥ：Ｔ比の特定の活性に関して、データは、ＲＮＡ電気穿孔ＣＡＲＴ３３細胞の特異的細胞致死が、Ｅ：Ｔ比が２：１(図３６Ａ)または１：１(図３６Ｂ)であるとき、電気穿孔後経時的に減少することを示す。これらの結果は、ＲＮＡ電気穿孔ＣＡＲＴ３３細胞の特異的細胞致死の一過性性質を示す。対照的に、レンチウイルス形質導入ＣＡＲＴ３３細胞は、形質導入１〜４日後、特異的細胞致死の安定レベルを示した。
実施例６：ヒト化ＣＡＲＴ３３は、ヒトＡＭＬおよびＭＤＳに対する強力な前臨床活性を示す
第二世代ＣＡＲを、ゲムツズマブオゾガマイシン(ＣＤ３３を標的とする免疫コンジュゲート)と４−１ＢＢおよびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン(実施例３に記載；および配列番号１４５)の抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖから構築した。ここで、第二世代ＣＡＲ３３の前臨床活性を記載し、先に開発したＣＤ１２３を標的とするＣＡＲ(ＣＡＲ１２３)と比較する。結果は、ＣＡＲＴ３３がヒト急性骨髄リンパ腫および骨髄異形成症候群ＣＤ３４＋細胞を根絶できたが、一方で、マウス異種移植において顕著な骨髄毒性をもたらすことを示す。それゆえに、一過性に発現されたｍＲＮＡ修飾ＣＡＲＴ３３も、その後の試験および臨床試験に使用するために産生した。
次の材料および方法を本実施例で使用した。
ＣＡＲＴ細胞の産生
ｐＴＲＰＥ抗ＣＤ３３−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ(ＣＡＲ３３)プラスミドＤＮＡを、ゲムツズマブオゾガマイシン(クローンｍｙ９６)由来のヒト化抗ヒトＣＤ３３ ｓｃＦｖを、軽鎖から重鎖配向で先に記載したマウスＣＡＲＴ１９プラスミドベクターにクローニングすることにより産生した。２５正常ドナーＴ細胞を、抗ＣＤ４および抗ＣＤ８マイクロビーズ(Miltenyi)を使用して白血球除去パックから陽性に選択し、１：１比で混合し、インビトロで抗ＣＤ３／ＣＤ２８ DYNABEADS(Invitrogen、培養第一日に添加)を低用量ＩＬ−２と共に使用して増殖させた。Ｔ細胞を、刺激翌日、ｐＴＲＰＥ ｍｙ９６−ＣＤ３３−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータプラスミドで遺伝子導入した２９３Ｔ細胞からのレンチウイルス上清で、感染効率(ＭＯＩ)３で形質導入した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８ DYNABEADSを６日目に除去し、Ｔ細胞を、Ｔ細マイクロビーズ培地(Ｘ−ｖｉｖｏ １５培地、ヒト血清５％、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびｇｌｕｔａｍａｘ)で最大１５日培養することにより増殖させ、その後の実験のために凍結保存した。全実験前、Ｔ細胞を融解し、一夜、３７度で休息させた。ＣＡＲＴ１２３細胞の産生は先に記載されている(Gill et al., 2014, Blood, 123:2343-54)。
細胞
ＭＯＬＭ１４細胞株をＡＴＣＣから得て、Ｒ１０培地(１０％ウシ胎児血清、ペニシリンおよびストレプトマイシン添加ＲＰＭＩ培地)に維持した。ＭＯＬＭ１４−ルシフェラーゼ−ＧＦＰ細胞をいくつかの実験で使用した。非特定化された初代ヒトＡＭＬおよびＭＤＳ骨髄検体をUniversity of Pennsylvania Stem Cell and Xenograft Core facilityから得た。全ての機能的試験について、ＡＭＬ細胞を分析の少なくとも１２時間前に融解し、一夜、３７度で休息させた。ＭＤＳ骨髄サンプルを、ＭＡＣＳＱｕａｎｔカラム(Miltenyi)を使用する陽性選択により、ＣＤ３４＋細胞について富化した。
フローサイトメトリー分析
抗ヒト抗体をBiolegend、eBioscienceまたはBecton Dickinsonから購入した。細胞を、インビトロ培養物または動物から単離し、２％ウシ胎児血清添加ＰＢＳで１回洗浄し、Ｆｃ受容体遮断の血、氷上で染色した。細胞数定量のために、Countbrightビーズを、業者の指示に従い使用した(Invitrogen)。全ての分析において、目的の集団を、順方向対側方散乱光特徴に基づきゲーティングし、続いて一重項ゲーティングし、生存細胞をLive Dead Aqua(Invitrogen)を使用して染色した。抗ＣＤ３３ ＣＡＲの表面発現を、Jackson ImmunoresearchからのAlexa Fluor 647コンジュゲートヤギ抗マウスＦ(ａｂ’)２抗体での染色により検出した。フローサイトメトリーを、４レーザーFortessa analyzer(Becton-Dickinson)で実施した。
Ｔ細胞機能アッセイ
１. Ｔ細胞脱顆粒アッセイ。
脱顆粒アッセイを、先に記載のように実施した。２６Ｔ細胞を標的細胞と１：５比でインキュベートした。ＣＤ１０７ａ、ＣＤ２８、ＣＤ４９ｄおよびモネンシンを、インキュベーション時に添加した。４時間後、細胞を採取し、ＣＡＲ発現、ＣＤ３およびLive Dead染色について染色した。細胞を固定し、透過性処理し、細胞内サイトカイン染色を次いで実施した。
２. 増殖アッセイ：
Ｔ細胞を洗浄し、１×１０７／mlで１００μlのＰＢＳに差異懸濁し、１００μlのＣＦＳＥ ２.５mM(Life Technologies)で５分、３７℃で染色した。次いで冷Ｒ１０で反応停止させ、細胞を３回洗浄した。標的を１００Gyの線量で照射した。Ｔ細胞を１：１比で照射的細胞と１２０時間インキュベートした。次いで細胞を採取し、ＣＤ３、ＣＡＲおよびLive Dead Aquaについて染色し、Countbrightビーズ(Invitrogen)を添加して、フローサイトメトリー分析した。
３. 細胞毒性アッセイ：
ルシフェラーゼ＋ ＭＯＬＭ１４細胞またはＣＦＳＥ標識初代ＡＭＬサンプルを、先に記載のような細胞毒性アッセイに使用した(Cao et al., 2010, Cytometry A, 77:534-545)。概説すると、標的を、記載した比でエフェクターＴ細胞と４時間または１６時間インキュベートした。Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ−２００スペクトルカメラでの生物発光造影またはフローサイトメトリーにより細胞死を計算した。後者について、細胞を採取し、Ｃｏｕｎｔｂｒｉｇｈｔビーズおよび７−ＡＡＤを分析前に添加した。残存生存標的細胞は、ＣＦＳＥ＋ ７−ＡＡＤ−であった。ＭＤＳについて、Ｔ細胞をＣＤ３４富化骨髄と１：１比で示すように４時間または２４時間インキュベートし、次いで細胞毒性をフローサイトメトリーまたは蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(ＭＤＳサンプルにおける特異的染色体異常に対するプローブを使用)により測定した。
４. サイトカイン測定：
エフェクターおよび標的細胞を、Ｔ細胞培地で、１：１比で記載するように２４時間または７２時間インキュベートした。上清を採取し、業者のプロトコールにより３０−ｐｌｅｘ Ｌｕｍｉｎｅｘアレイで分析した(Invitrogen)。
インビボ実験
ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−γ鎖−／−(ＮＳＧ)およびヒトＩＬ−３、幹細胞因子およびＧＭ−ＣＳＦ(ＮＳＧ−Ｓ)にトランスジェニックなＮＳＧマウスを元々Jackson Labsから得た。全実験を、Institutional Animal Care and Use Committee of the University of Pennsylvaniaにより承認されたプロトコールで実施した。利用した異種移植モデルのスキームを関連する図面および結果の部分に詳述する。細胞(ＭＯＬＭ １４、初代細胞またはＴ細胞)を、記載する濃度で２００mlのＰＢＳ中、マウスの尾静脈に注射した。生物発光造影をXenogen IVIS-200スペクトルカメラを使用して実施した。ヒト化免疫系(ＨＩＳ)マウスを、胎児肝臓ＣＤ３４＋細胞を新生ＮＳＧマウスに注射することにより造り、約８週齢で使用した。
ｍＲＮＡ修飾ＣＡＲＴ３３の産生
ｐＴＲＰＥ抗ＣＤ３３−４１ＢＢ−ＣＤ３ｚプラスミドからのＣＡＲ構築物を、先に公開されたように、ｐＤＡベクター２８にサブクローン化した。インビトロ転写をmMESSAGE mMachine(登録商標)T7 ULTRA転写キット(Ambion)を使用して実施した。ＲＮＡをRNeasy Mini Kit(Qiagen)を使用して精製した。ＲＮＡ−ＣＡＲ３３を、先に記載のようにＴ細胞に電気穿孔した。電気穿孔法は、ECM830 Electro Square Wave Porator(Harvard Apparatus BTX)を使用して実施した。
組織学および免疫組織化学
マウス大腿からのホルマリン固定、パラフィン包埋切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、ヒトＣＤ４５およびヒトＣＤ３４に対するｍＡｂで対比染色し、Ｎｉｋｏｎ顕微鏡で獲得した。
結果：
ＡＭＬおよびＣＡＲＴ３３構築物における標的としてのＣＤ３３
ＡＭＬにおける免疫療法のための標的としてのＣＤ３３の臨床的関連を確認するために、ＡＭＬにおけるＣＤ３３の発現レベルをまず評価し、ほぼ全ての初代ＡＭＬサンプルにおける大多数のＡＭＬ芽細胞(図１)ならびにＭＤＳ患者からの骨髄(図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃ)で発現されることが判明した。ＣＡＲＴ３３の標的外毒性の可能性を評価するために、組織免疫組織化学を、抗ＣＤ３３抗体(ＬＳＢｉｏ)で染色した３０正常組織で実施した。ＣＤ３３は骨髄における骨髄分化系列および肝臓、肺および腎臓の常在マクロファージで発現された(図２１)。ＣＡＲ３３の効果を試験するために、ゲムツズマブオゾガマイシンクローンｍｙ９６由来のマウスおよびヒト化ｓｃＦｖ由来の４構築物を設計した。２構築物はＩｇＧ４ヒンジを利用し、２構築物はＣＤ８ヒンジを使用した(図３)。
ＣＡＲＴ３３は、ＡＭＬ細胞株、初代ＡＭＬサンプルおよびＭＤＳに対し強力なインビトロ活性を示す
４つの異なるＣＡＲＴ３３構築物の活性をインビトロで試験し、ＣＡＲＴ１２３と比較した(Gill et al, 2014, Blood, 123:2343-2354)。ヒト化ＣＡＲＴ３３は、一貫してマウスＣＡＲＴ３３より優れ(実施例１参照)、それゆえに以後の実験は全て２つのヒト化ＣＡＲ３３構築物で実施した。ＭＯＬＭ１４細胞株をモデル腫瘍として使用した(ＭＯＬＭ１４はＣＤ３３およびＣＤ１２３を発現する)。ＣＡＲＴ３３とＭＯＬＭ１４のインキュベーションは、顕著な脱顆粒(図３７Ａ)、低エフェクター：標的比で強力な細胞毒性(図３７Ｂ)、広範な増殖(図３７Ｃおよび３７Ｄ)および強固なサイトカイン産生(図３８Ａ、３８Ｂ、３８Ｃおよび３９)をもたらし、これは、対照Ｔ細胞白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔより有意に高かった。大多数のＣＡＲＴ３３は、ＰＭＡ／イオノマイシンでの強力な非特異的刺激に類似するパターンで、ＭＯＬＭ１４とのインキュベーション後、細胞あたり２以上のサイトカインを産生した(図３８Ａおよび３８Ｂ)。この機能は、優れたインビボ活性と関係する(Carpenito et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA, 106:3360-3365)。さらに、ＣＡＲＴ３３細胞は、ＣＡＲＴ１２３細胞より多くのサイトカインを産生し(図３８Ｃ)また初代ＡＭＬサンプルに対する顕著なインビトロ活性をもたらした。ＩｇＧ４ヒンジを有するＣＡＲＴ３３は、ＣＤ８ヒンジを有するＣＡＲＴ３３と比較して、優れた細胞毒性をもたらした(図８、９、１０および４０)。
ＭＤＳにおけるＣＡＲＴ３３のインビトロ活性も試験した。ＭＤＳ患者からの骨髄サンプルをＣＤ３４富化し(約８５％純度)、次いで、ＣＡＲＴ３３、ＣＡＲＴ１２３または非形質導入対照Ｔ細胞(ＵＴＤ)細胞とＥ：Ｔ比１：５で４時間、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ２８共刺激およびモネンシン存在下インキュベートした。次いでＣＤ１０７ａ脱顆粒をフローサイトメトリーにより測定し、脱顆粒のパーセンテージを定量した。図４１Ｂおよび４１Ｃは、５ｑ欠失を有するＭＤＳクローンの特異的細胞致死を示す。ＭＤＳでかつ５ｑ欠失を有する患者からのＣＤ３４富化骨髄サンプルをＣＡＲＴ３３、ＵＴＤ細胞とまたは未処置で１：１ Ｅ：Ｔ比で４時間インキュベートした。次いでサンプルを採取し、５ｑ−についてのＦＩＳＨを実施した(図４１Ｂ)。ＣＡＲＴ３３は、ＭＤＳにおいて顕著なインビトロ活性を示した。これは、ＣＤ３４富化ＭＤＳサンプルに対する応答におけるＣＡＲＴ３３の特異的脱顆粒(図４１Ａ)、ＣＡＲＴ３３とＣＤ３４富化ＭＤＳサンプルの２４時間インキュベーション後の特異的細胞致死(１：１エフェクター：標的比、図２４)およびインキュベーション４時間後の悪性クローンの特異的減少(ＦＩＳＨにより測定)(図４１Ｂおよび４１Ｃ)により証明される。
上記インビトロアッセイからの結果を下表に要約する。
＊全ｐ値は、ＵＴＤと比較して＜０.０５
ＣＡＲＴ３３は白血病負荷減少およびＭＯＬＭ１４移植異種移植片における延命効果をもたらす
ＣＡＲＴ３３のインビボ活性を試験するために、ＮＳＧマウスにルシフェラーゼ＋ＭＯＬＭ１４を注射した(図１１)。生物発光造影による生着確認後、マウスは、異なる用量レベルのＣＡＲＴ３３または対照非形質導入Ｔ細胞(ＵＴＤ)の１回注射を受けた。次いで、マウスを連続造影により追跡し、疾患負荷を生物発光を使用して定量した。対照Ｔ細胞処置マウスは疾患に直ぐに負けたが、ＣＡＲＴ３３処置マウスは、疾患の有意な減少および延命効果を示した(図４２Ａ、４２Ｂおよび４２Ｃ)。さらに、ＣＡＲＴ３３処置マウスで用量応答を試験した。図４３Ａの模式図に示すように、ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−ガンマ鎖ノックアウト(ＮＳＧ)マウスにＡＭＬ細胞株ＭＯＬＭ１４ １×１０６ Ｉ.Ｖ.注射し、６日後生着を造影した。マウスをＣＡＲＴ３３ ５×１０６、ＣＡＲＴ３３ ２×１０６、ＣＡＲＴ３３ １×１０６または対照非形質導入Ｔ細胞５×１０６で処置した。マウスを連続的な毎週造影により追跡し、ＡＭＬ負荷を評価した。ＣＡＲＴ３３処置マウスで用量依存的応答(図４３Ａおよび４３Ｂ)およびＣＤ８ヒンジを有するＣＡＲＴ３３と比較してＩｇＧ４ヒンジを有するＣＡＲＴ３３の優れた抗白血病性活性図４４)が観察された。以後の全実験について、ＩｇＧ４ヒンジを有するＣＡＲＴ３３のみを使用した。
ＣＡＲＴ３３は、初代ＡＭＬ異種移植における白血病の根絶および長期無病生存をもたらす
一次白血病細胞は、長期繁殖細胞株よりもクローン的により異種性であり、よりヒト疾患をあらわす可能性がある。それゆえに、初代ＡＭＬ異種移植におけるＣＡＲＴ３３の有効性を評価した。ＮＳＧ−Ｓマウスに、ＣＤ３３およびＣＤ１２３を発現する初代ＡＭＬサンプルを注射した。疾患負荷を末梢血および生存分析により定量した(図１３)。生着は、＞１％循環ｈｕＣＤ４５＋細胞として定義し、一般に白血病性細胞注射２〜４週間後に達成された。これらのマウスを、次いで、ＣＡＲＴ３３、ＣＡＲＴ１２３またはＵＴＤ細胞(尾静脈注射による１×１０５)の１回注射により処置した。白血病は、ＣＡＲＴ３３またはＣＡＲＴ１２３注射４週間後に根絶され(図１４および１５)、長期無病生存が示された(図１６)。
ＣＡＲＴ３３は、予測される造血幹細胞および骨髄前駆細胞毒性をもたらす
ＣＤ３３が、白血病性細胞と比較して低レベルであるにも関わらず、骨髄前駆細胞で発現されていることが知られているため、ＣＡＲＴ３３の正常造血に対する影響を試験した。２つの異なるモデルを使用して、ＣＡＲＴ３３の造血毒性を評価した。出生後ヒト胎児ＣＤ３４＋細胞を移植したヒト化免疫系(ＨＩＳ)マウスを採血して、生着を確認し、ＣＡＲＴ３３、ＣＡＲＴ１２３または非形質導入Ｔ細胞で処置した(図１７)。マウスは、毎週、４週間採血した。次いで、マウスを屠殺し、これらのマウスからの骨髄および脾臓を分析のために採取した。骨髄細胞系譜におけるＣＤ３３発現に基づき予測されるとおり、これらのマウスは、非形質導入Ｔ細胞処置マウスと比較して、単球を含む末梢血骨髄細胞の減少を発生した(図２２)。処置４週間後の骨髄の分析は、フローサイトメトリー(図２０)または免疫組織化学(図２１)によるＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血幹細胞およびＣＤ３４＋ＣＤ３８＋骨髄前駆細胞の減少を示した。ＨＩＳモデルは、Ｂ細胞系譜に偏っており、したがって、より骨髄偏向の第二モデルをもちいた。ここで、正常成人ドナーからの骨髄をＴ細胞枯渇し、ブスルファン条件付けＮＳＧ−Ｓマウスに注射した。自己ＣＡＲＴ３３、ＣＡＲＴ１２３またはＵＴＤを、骨髄ドナーからの末梢血Ｔ細胞を適切なレンチウイルスで形質導入することにより産生した。これらのマウスの生着確認後、それらを自己ＣＡＲＴ３３、ＣＡＲＴ１２３またはＵＴＤで処置し、毎週、計４週間、眼窩後洞採血により追跡した(図２２)。次いでマウスを屠殺し、組織を採取し、分析した。ＨＩＳ異種移植に類似して、我々は、末梢血骨髄細胞および単球およびＣＤ３４＋骨髄区画の減少を観察した。
一過性ＲＮＡ修飾“生分解性”ＣＡＲＴ３３は、強力なしかし、一過性の抗白血病活性を生じる
ＣＤ３３が正常造血細胞および組織常在マクロファージに発現されるため(図１および２)、臨床適用前に安全性機構を確認することが重要である。それゆえに、ＲＮＡ修飾ＣＡＲＴ３３を開発した。ＲＮＡ修飾ＣＡＲ−３３を有するＴ細胞の電気穿孔は、７日間に徐々に減少するＣＡＲの高レベル発現をもたらした(図３３Ａ、３３Ｂおよび３４および実施例９に記載のとおり)。レンチウイルス形質導入ＣＡＲＴ３３(ＬＶ−ＣＡＲＴ３３)と比較して、ＲＮＡ修飾ＣＡＲＴ３３は類似するが、一過性であるインビトロ活性を有する。ＭＯＬＭ１４とＲＮＡ−ＣＡＲＴ３３のインキュベーションは、Ｅ：Ｔ比１：１および２：１でＬＶ−ＣＡＲＴ３３と同等な特異的細胞毒性を示し、これは電気穿孔後時間と共に減少した(図３５および実施例９に記載のとおり)。
インビボのＲＮＡ−ＣＡＲＴ３３と化学療法の組み合わせを試験した。ＭＯＬＭ１４移植ＮＳＧマウスを、シクロホスファミド(６０mg／kg Ｉ.Ｐ)３用量＋ＲＮＡ−ＣＡＲＴ３３またはシクロホスファミド＋ＵＴＤの組み合わせで処置した。１０×１０６ Ｔ細胞を３用量ＩＶで与えた(図４５)。具体的に、ＮＳＧマウスにＭＯＬＭ１４−ｌｕｃ(１×１０６ Ｉ.Ｖ)を注射し、４日後生着を確認するために造影した。次いでマウスをＲＮＡ−ＣＡＲＴ３３とシクロホスファミドまたは非形質導入Ｔ細胞とシクロホスファミド(６０mg／kg Ｉ.Ｐ)のいずれかを受けるように無作為化した。Ｔ細胞を、１０×１０６ Ｉ.Ｖ用量で３回の、５日、９日、１６日の別々の投与で与えた。シクロホスファミドを８日および１４日に与えた。シクロホスファミドおよびＲＮＡ修飾ＣＡＲＴ３３の組み合わせは、対照マウスと比較して、白血病制御を改善した。
考察
本実施例において、ＡＭＬにおけるＣＡＲＴ３３の前臨床活性および安全性が検出され、難治性ＡＭＬを有する患者に使用した際の毒性を避ける方法として、一過性に発現されるＣＡＲＴ３３が開発され、確認された。これは、複数マウスモデルを取り込む包括的な生存および毒性データならびにＲＮＡ修飾ＣＡＲＴ３３の抗白血病性活性を含む、ＣＡＲＴ３３の活性の最初の広範な前臨床報告である。ＣＡＲＴ３３は、ＡＭＬ細胞株および初代ＡＭＬサンプルに対し、低Ｅ：Ｔ比での特異的細胞致死、脱顆粒、著明な増殖および強固なサイトカイン産生を含む強力なエフェクター機能を示し、１：１比でわずか４時間のインキュベーション後、ＭＤＳクローンの減少にも活性であった。
ＣＡＲＴ３３での処置はまた１回注入後、ＭＯＬＭ１４および初代ＡＭＬ異種移植の両者におけるＡＭＬ根絶および延命効果ももたらした。ＣＡＲＴ３３で予測された骨髄造血毒性は２つの異なるヒト化マウスモデルで観察された。骨髄毒性の可能性および常在組織マクロファージのＣＤ３３発現の懸念のため、ＲＮＡ修飾ＣＡＲＴ３３を開発し、強力であるが、一過性のインビトロ活性が示された。抗白血病性効果は、ＲＮＡ−ＣＡＲＴ３３と化学療法の組み合わせによっても示された。
ここにおよび実施例１に記載する実験は、ＣＡＲＴ３３とＩｇＧ４ヒンジの使用が、ＣＤ８ヒンジの使用より優れることも示した。ＩｇＧ４分子はＣＤ８分子と顕著に異なる。これは３倍多いアミノ酸を含み、これがより可動性のヒンジをもたらすのであろう。
これらの前臨床試験でＣＡＲＴ３３で観察された造血毒性および骨髄前駆細胞減少ならびに末梢血血球減少は、白血病性ならびに骨髄前駆細胞のＣＤ３３発現に基づき、予測される。
ＣＡＲＴ３３の使用による標的外毒性の可能性は、臨床試験における、持続性ではなくｍ一過性に発現される抗ＣＤ３３治療の取り込みを義務付ける。ＲＮＡ修飾ＣＡＲが前臨床モデルで使用されており(Barrett et al., 2013, Hum Gene Ther, 24:717-727; and Barrett et al., 2011, Hum Gene Ther, 22:1575-1586)、固形腫瘍を有する患者におけるＲＮＡ修飾抗メソテリンＣＡＲ Ｔ細胞のフェーズＩ知見が、この試みが安全かつ実現可能であることを示している(Beatty et al., 2014, Cancer Immunol Res, 2:112-120)。それゆえに、ＲＮＡ修飾ＣＡＲＴ３３を、ＣＡＲＴ３３の可能性のある標的外毒性を軽減するために、一過性に発現する“生分解性”ＣＡＲの方法として開発した。
最近の大規模臨床試験は、低および中リスク疾患においてＧＯを化学療法と組み合わたとき、延命効果を示した(Hills et al., 2014, Lancet Oncol., 15:986-996)、ＡＭＬマウス異種移植におけるＲＮＡ修飾ＣＡＲＴ３３と化学療法の複数注入の組み合わせの有効性を試験した(図４５)。この組み合わせは、これらのマウスに対して、深くかつ長い応答および延命効果を示した。
これらの観察は、ＲＮＡ修飾ＣＡＲＴ３３のいくつかのあまり可能性のない翻訳的適用を強調する。これは、同種異系幹細胞移植を受けることが不可能な再発した難治性ＡＭＬを有する患者において、移植適格とするために、単独でまたは化学療法と組み合わせて使用できる。加えて、ＲＮＡ修飾ＣＡＲＴ３３を、同種異系幹細胞移植前のコンディショニングレジメンに組み込み得る。この試みの安全性および実現可能性が患者で証明されたら、さらなる戦略は、“オフ”スイッチを有するレンチウイルスＣＡＲＴ３３を含む。さらに、ＣＡＲＴ３３およびＣＡＲＴ１２３両者がＡＭＬに対して有効であるというこれらの知見は、組み合わせ標的細胞治療における新規治療的領域を開く。
実施例７：癌における骨髄由来サプレッサー細胞(ＭＤＳＣ)に対するキメラ抗原受容体Ｔ細胞療法の使用
最近のデータは、骨髄異形成症候群(ＭＤＳ)骨髄環境は、無効な造血ならびに免疫抑制を促進するサイトカイン分泌によりＭＤＳの病因に重要な役割を有するＣＤ３３発現骨髄由来サプレッサー細胞(ＭＤＳＣ)の集団を含むことを示す(Chen et al. J. Clin. Investig. 23(2013): 21-223)。Chen et al.は、ＭＤＳＣがＣＤ３３−Ｓ１００Ａ９相互作用による骨髄異形成の誘発に役割を有することを記載する。この実施例は、ＭＤＳＣが抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞療法を使用して標的化され得るか否かを決定する実験を記載する。ここに記載する結果は、異常ＭＤＳクローンおよびその支持的ＭＤＳＣ集団の両者が、単一抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞産物で同時に標的化され得ることを示す。
ＭＤＳＣは、４ＭＤＳおよび３正常骨髄検体に表現分類された(図５０Ａ、５０Ｂおよび５０Ｃ)。表現型分類のために、次のゲーティング戦略を使用するフローサイトメトリーを実施した：ＭＤＳＣは、ＭＤＳ骨髄サンプルにおける細胞系譜陰性(ＬＩＮ−)、ＨＬＡ−ＤＲ陰性、ＣＤ３３陽性細胞と道程した(図５０Ａ)。ＭＤＳＣは、正常骨髄(ＮＤ−ＢＭ)と比較して形成異常骨髄(ＭＤＳ−ＢＭ)でより豊富であった(図５０Ｂ)。加えて、ＭＤＳＣ集団におけるＣＤ３３平均蛍光強度(ＭＦＩ)は、悪性ＭＤＳ集団におけるＣＤ３３ ＭＦＩと同等であり、ＮＤ−ＢＭからのｈｕＣＤ４５＋ＬＩＮ−集団におけるＣＤ３３ ＭＦＩより有意に高かった(図５０Ｃ)。それゆえに、ＭＤＳＣにおけるＣＤ３３発現は、悪性ＭＤＳ集団におけるその発現と同等であり、正常骨髄におけるその発現とより有意に高かった。ＣＡＲＴ３３がＭＤＳ芽細胞およびＭＤＳ骨髄からのＭＤＳＣに応答を解しする能力を、ＣＤ１０７ａ脱顆粒およびＣＡＲＴ３３細胞からのサイトカイン産生の程度の定量により評価した。ＣＡＲＴ３３を４時間、陰性対照(Ｊｕｒｋａｔ細胞)、陽性対照(ＰＭＡおよびイオノマイシン)、ＭＤＳ骨髄からのソートしたＭＤＳ ＣＤ３４＋またはソートしたＭＤＳＣとインキュベートした。ＣＡＲ３３−ＵＰｅｎｎ構築物(ゲムツズマブオゾガマイシンの抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ由来)を使用して、ＭＤＳ ＣＤ３４細胞およびＭＤＳＣが、ＣＡＲＴ３３に対して、広く同等な応答を誘発することが判明した(図５１Ａおよび５１Ｂ)。これらの結果は、低親和性を有するＣＡＲＴ−３３が、ＭＤＳＣに対して差示的活性を有し得ることを示す。
ＭＤＳＣはまた、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)(ここで、これらはナース様細胞として知られる)ならびに卵巣癌、乳癌および結腸癌のような固形悪性腫瘍を含む複数の他の悪性腫瘍の免疫攻撃に対する抵抗にも役割を有する(Di Mitri et al. Nature 515.7525(2014):134-137; ; Gabrilovich et al. Nat. Reviews Immunol. 12.4(2012):253-68; and Kim et al. Proc. Acad. Sci. U.S.A. 111.32(2014):1-6)。これらの結果は、ＭＤＳＣがＣＡＲＴ３３により単独でまたは他の免疫療法と組み合わせて標的化され得ることを示す。
実施例８：低用量ＲＡＤ００１は、細胞培養モデルにおけるＣＡＲＴ増殖を刺激する
インビトロでのＣＡＲ Ｔ細胞増殖に対するＲＡＤ００１の低用量の効果を、ＣＡＲＴ発現細胞と標的細胞を種々の濃度のＲＡＤ００１存在下で共培養することにより評価した。
材料および方法
ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の産生
ヒト化、抗ヒトＣＤ１９ ＣＡＲ(ｈｕＣＡＲＴ１９)レンチウイルス転移ベクターを、ＶＳＶｇ偽型レンチウイルス粒子に封入されたゲノム材料を産生するために使用した。ヒト化抗ヒトＣＤ１９ ＣＡＲ(ｈｕＣＡＲＴ１９)のアミノ酸およびヌクレオチド配列は、２０１４年３月１５日に出願されたＰＣＴ出願、ＷＯ２０１４／１５３２７０号に記載されたＣＡＲ １、ＩＤ １０４８７５であり、そこで配列番号８５および３１とされている。
レンチウイルス転移ベクターＤＮＡを、３パッケージング要素ＶＳＶｇ ｅｎｖ、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｒｅｖと、リポフェクタミン試薬と組み合わせて混合し、レンチ−Ｘ ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトする。培地をその後２４時間および３０時間に交換し、ウイルス含有培地を採取し、濾過し、−８０℃で保存する。ＣＡＲＴを、健常ドナー血液またはｌｅｕｋｏｐａｋの陰性磁気選択により得た新鮮または凍結ナイーブＴ細胞の形質導入により産生する。Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズと２４時間インキュベーションすることにより活性化し、ウイルス上清または濃縮ウイルス(それぞれ、ＭＯＩ＝２または１０)を培養に添加する。修飾Ｔ細胞を約１０日増殖させる。細胞形質導入のパーセンテージ(細胞表面のＣＡＲを発現)およびＣＡＲ発現レベル(相対蛍光強度、Geo Mean)を、７〜９日目にフローサイトメトリー分析で決定する。増殖速度遅延および約３５０fLに近づくＴ細胞サイズの組み合わせが、Ｔ細胞をその後の分析のために凍結保存する状態を決定する。
ＣＡＲＴ増殖評価
ＣＡＲＴの機能性を評価するために、Ｔ細胞を融解し、計数し、生存能をCellometerで評価する。各培養における多数のＣＡＲ陽性細胞を、非形質導入Ｔ細胞(ＵＴＤ)を使用して標準化する。ＣＡＲＴに対するＲＡＤ００１の影響を、５０nMから開始してＲＡＤ００１のタイトレーションにより試験した。全共培養実験において使用する標的細胞株は、ＣＤ１９を発現し、ルシフェラーゼを発現するように形質導入されたヒト前Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病(ＡＬＬ)細胞株であるＮａｌｍ−６である。
ＣＡＲＴの増殖を測定するために、Ｔ細胞を標的細胞と１：１比で培養する。アッセイを４日行い、細胞をＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＡＲ発現について染色する。多数のＴ細胞を、対照としてカウンティングビーズを使用するフローサイトメトリーにより評価する。
結果
ＣＡＲＴ細胞の増殖能力を、４日共培養アッセイで試験した。多数のＣＡＲ陽性ＣＤ３陽性Ｔ細胞(濃色棒)および総ＣＤ３陽性Ｔ細胞(薄色棒)を、ＣＡＲ形質導入および非形質導入Ｔ細胞とＮａｌｍ−６の培養後評価した(図５４)。ｈｕＣＡＲＴ１９細胞は、０.０１６nM未満のＲＡＤ００１の存在下で培養したとき増殖し、化合物が高濃度ではそれより少なく増殖した。重要なことに、０.００３２および０.０１６nM ＲＡＤ００１両者で、増殖はＲＡＤ００１非添加で観察されるより高かった。非形質導入Ｔ細胞(ＵＴＤ)は検出可能な増殖を示さなかった。
実施例９：低用量ＲＡＤ００１はインビボでＣＡＲＴ増殖を刺激する
本実施例は、ｈｕＣＡＲ１９細胞が種々の濃度のＲＡＤ００１存在下でインビボで増殖する能力を評価する。
材料および方法：
ＮＡＬＭ６−ｌｕｃ細胞：ＮＡＬＭ６ヒト急性リンパ芽球性白血病(ＡＬＬ)細胞株は、再発ＡＬＬ患者の末梢血から展開された。その後、細胞はホタルルシフェラーゼでタグ付けされた。これらの懸濁細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩで増殖させた。
マウス：６週齢ＮＳＧ(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl／SzJ)マウスを、Jackson Laboratory(stock number 005557)から得た。
腫瘍インプラント：ＮＡＬＭ６−ｌｕｃ細胞を、インビトロで１０％熱不活性化ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩで増殖および拡張した。次いで、細胞を１５mlコニカルチューブに移し、２回冷滅菌ＰＢＳで洗浄した。ＮＡＬＭ６−ｌｕｃ細胞を、次いで、計数し、ＰＢＳ１ミリリットルあたり１０×１０６細胞濃度で再懸濁した。細胞を氷上に置き、直ぐに(１時間以内に)マウスにインプラントした。ＮＡＬＭ６−ｌｕｃ細胞を、１００μl体積で、合計マウスあたり１×１０６細胞で尾静脈に静脈注射した。
ＣＡＲ Ｔ細胞投薬：マウスに、腫瘍インプラント７日後５×１０６ ＣＡＲ Ｔ細胞を投与した。細胞を、３７℃水浴で一部溶かし、その後、１mlの冷滅菌ＰＢＳを細胞を含むチューブに添加しながら完全に融解した。融解細胞を１５mlファルコンチューブに移し、ＰＢＳで最終体積１０mlに合わせた。細胞を、各１０００rpmで１０分、２回洗浄し、次いで、血球計数器で計数した。Ｔ細胞を、次いで、冷ＰＢＳ１mlあたり５０×１０６ ＣＡＲ Ｔ細胞濃度で懸濁し、マウスに投薬するまで氷上に維持した。マウスに、１００μlのＣＡＲ Ｔ細胞を、マウスあたり５×１０６ ＣＡＲ Ｔ細胞の用量で、尾静脈から静脈注射した。群あたり８マウスが、１００μlのＰＢＳ単独(ＰＢＳ)またはヒト化ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置された。
ＲＡＤ００１投薬：１mg ＲＡＤ００１に相当する５０mg濃縮マイクロエマルジョンを製剤し、投薬時にＤ５Ｗ(デキストロース５％水溶液)に再懸濁した。マウスに、２００μlの所望の用量のＲＡＤ００１を連日経口投与(強制喫食)した。
ＰＫ分析：マウスに、腫瘍インプラント７日後から開始して、連日ＲＡＤ００１を投薬した。投薬群は次のとおりであった：０.３mg／kg、１mg／kg、３mg／kgおよび１０mg／kg。マウスは最初のおよび最後のＲＡＤ００１投与０日目および１４日後、ＰＫ分析のために次の時点で採血した：１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間および２４時間。
結果：
ＲＡＤ００１の増殖および薬物動態を、ＮＡＬＭ６−ｌｕｃ腫瘍担持ＮＳＧマウスで試験した。ＲＡＤ００１単独の連日経口投与は、ＮＡＬＭ６−ｌｕｃ腫瘍増殖に影響を有しなかった(図５５)。ＲＡＤ００１の薬物動態分析は、腫瘍担持マウスの血中でかなり安定であることを示した(図５６Ａおよび５６Ｂ)。０日目および１４日目両者のＰＫ分析は、血中のＲＡＤ００１濃度が、試験した最低用量(０.３mg／kg)の投薬の２４時間後でも１０nm以上であることを示す。
これらの用量に基づき、ｈｕＣＡＲ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を、これらの細胞の増殖能を決定するために、ＲＡＤ００１を伴いまたは伴わずに投薬した。使用した最高用量は、投薬２４時間後の血中のＲＡＤ００１のレベルに基づき、３mg／kgであった。最後のＲＡＤ００１の投与の２４時間後ＲＡＤ００１濃度が１０nMを超えていたため、いくつかのＲＡＤ００１の低用量を、ＣＡＲ Ｔ細胞でのインビボ研究に使用した。ＣＡＲ Ｔ細胞を、連日経口ＲＡＤ００１投薬開始１日前にＩＶ投与した。マウスを、Ｔ細胞増殖についてＦＡＣＳでモニターした。
最低用量のＲＡＤ００１は、ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖増加を示す(図５７)。この増殖増加は、ＣＤ８＋ ＣＡＲ Ｔ細胞よりもＣＤ４＋ ＣＡＲ Ｔ細胞でより明白であり、長い。しかしながら、ＣＤ８＋ ＣＡＲ Ｔ細胞で、増殖増加は、ＣＡＲ Ｔ細胞投与後最初の時点でしか見ることができない。
実施例１０：インビボでのＣＤ３３ ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の抗腫瘍活性
ＨＬ−６０は、３６白人女性ＡＭＬ患者の末梢血から単離したヒト急性前骨髄球性白血病細胞株であり、異種移植として免疫不全状態マウスで増殖できる。この異種移植は、ヒトで見られる骨髄の疾患を模倣し、骨におけるＡＭＬの治療の効果を試験するモデルとして確立されている。これらのマウスを、ＣＤ３３(Ｓｉｇｌｅｃ−３)のような急性骨髄(または前骨髄球性)白血病細胞に見られる細胞マーカーに特異的なキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)Ｔ細胞の効果を試験するために使用できる。
ＨＬ−６０細胞をホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子で標識し、NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl／SzJ(ＮＳＧ)マウスにおける急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)の同所性モデルで使用して、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ Ｔ細胞の効果を試験した。
ＣＤ３３発現をＨＬ−６０細胞で試験し、これらの細胞をインビトロアッセイで使用して、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ Ｔ細胞が標的を認識し、応答する能力を見た。インビボＨＬ−６０細胞は、尾静脈から静脈内移植したとき増殖し、増殖は主に骨髄に限定された。腫瘍細胞インプラント１週間後、疾患は十分に骨に移り、指数関数的速度で増殖を開始した。未処置のままのマウスは臨床症状を停止始め、腫瘍インプラント４〜６週間後後脚麻痺を呈する。インビトロスクリーニングからのいくつかのＣＤ３３ ｓｃＦｖクローンを、このインビボモデルで試験した。
材料および方法：
ＨＬ−６０細胞株：ＨＬ−６０ヒトＡＭＬ細胞株は、急性前骨髄球性白血病患者の末梢血から開発した。その後、細胞はホタルルシフェラーゼでタグ付けされた。これらの懸濁液細胞を１０％熱不活性化ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩで増殖させた。
マウス：６週齢ＮＳＧ(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl／SzJ)マウスを、Jackson Laboratory(stock number 005557)から得た。
腫瘍インプラント：ＨＬ−６０−ｌｕｃ細胞を、インビトロで１０％熱不活性化ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩで増殖および拡張した。次いで細胞を５０ml円錐チューブに移し、冷滅菌ＰＢＳで２下位洗浄した。ＨＬ−６０−ｌｕｃ細胞を、次いで、計数し、ＰＢＳ１ミリリットルあたり１０×１０６細胞濃度で再懸濁した。細胞を氷上におき、直ぐに(１時間以内に)マウスにインプラントした。ＨＬ−６０−ｌｕｃ細胞を、１００ml体積で、マウスあたり計１×１０６細胞で尾静脈から静脈内投与した。
ＣＡＲ Ｔ細胞投薬：マウスに、５×１０６ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞を腫瘍インプラント１４日後に投与した。インプラント細胞はマウスでゆっくり増殖した；１４日までに、腫瘍速度を上げ始めていた。細胞を、３７℃水浴で一部溶かし、その後、１mlの冷滅菌ＰＢＳを細胞を含むチューブに添加しながら完全に融解した。融解細胞を１５mlファルコンチューブに移し、ＰＢＳで最終体積１０mlに合わせた。細胞を、各１０００rpmで１０分、２回洗浄し、次いで、血球計数器で計数した。ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＡＲ 形質導入について標準化し、それゆえ、各群はＣＡＲ＋ Ｔ細胞を同じパーセンテージで有した。次いで５×１０６ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞を冷ＰＢＳ１mlあたり ５０×１０６ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞濃度で再懸濁し、マウスに投与するまで氷上に置いた。マウスに、マウスあたり５×１０６ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞の用量で１００mlのＣＡＲ Ｔ細胞を尾静脈から静脈内注射した。
群あたり８マウスを１００mlのＰＢＳ単独(ＰＢＳ)、ＣＤ１９−ＣＡＲ対照Ｔ細胞(ＣＤ１９)、ＣＤ３３−１(クローン１)ＣＡＲ Ｔ細胞、ＣＤ３３−２(クローン２)ＣＡＲ Ｔ細胞、ＣＤ３３−４(クローン４)ＣＡＲ Ｔ細胞、ＣＤ３３−５(クローン５)ＣＡＲ Ｔ細胞、ＣＤ３３−６(クローン６)ＣＡＲ Ｔ細胞、ＣＤ３３−７(クローン７)ＣＡＲ Ｔ細胞およびＣＤ３３−９(クローン９)ＣＡＲ Ｔ細胞のいずれかで処置した。Ｔ細胞は、全て、並行して同じヒトドナーから調整した。
動物モニタリング：マウスの健康状態を、週２回の体重測定を含み、連日モニターした。体重変化パーセントを(ＢＷ現在−ＢＷ初期)／(ＢＷ初期)×１００％として計算した。腫瘍負荷を、週２回生物発光造影によりモニターした。マウスにＤ−ルシフェリンを麻酔１０分前に腹腔内投与し、マウスをＸｅｎｏｇｅｎで造影した。疾患負荷は、腫瘍細胞の生物発光の計算(光子／秒)により計算した。
結果：
ヒト急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)のＨＬ−６０モデルにおいて７ＣＤ３３ ＣＡＲの抗腫瘍活性を評価し、ＣＤ１９を指向するＣＡＲ Ｔ細胞と直接比較した。０日目の腫瘍インプラント後、マウスを処置群に無作為化し、５×１０６ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞静脈内で７日目に処置した。ＡＭＬ疾患負荷および動物健康状態を、動物がエンドポイントを達成するまでモニターした。対照ＰＢＳおよびＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞群のマウスを、対照群の疾患負荷が、造影でほぼ最高発光となった時点であるＣＡＲ Ｔ細胞投薬２２日後(腫瘍インプラント２９日後)屠殺した。ＣＤ３３−１、ＣＤ３３−２、ＣＤ３３−７およびＣＤ３３−９ ＣＡＲ Ｔ細胞処置群のマウスを、これらの群における発光が、対照群を屠殺した発光に達したときであるＣＡＲ Ｔ細胞投薬２９日後(腫瘍インプラント３６日後)屠殺した。ＣＤ３３−４、ＣＤ３３−５およびＣＤ３３−６ ＣＡＲ Ｔ細胞処置群のマウスは、疾患負荷の尾そり減少を示した。
本研究の生物発光造影結果を図５８に示す。腫瘍細胞の平均生物発光(±ＳＥＭ)は、動物全体の疾患負荷を示した。これは、マウス全体であるＲＯＩ(目的領域)の光子／秒(ｐ／ｓ)で示した。何らＴ細胞を受けなかったＰＢＳ処置群は、静脈内インプラントＮＳＧマウスにおけるベースラインＨＬ−６０腫瘍増殖動態を示した。ＣＤ１９処置群は、ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞と同じインビトロ増殖処理に付したＨＬ−６０細胞に特異的ではない対照ＣＡＲ Ｔ細胞を受けた。これらの細胞は、この腫瘍モデルにおけるＴ細胞の非特異的応答を示すＴ細胞対照として役立った。ＰＢＳおよびＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞処置群両者は、実験の間中継続する腫瘍進行を示した。ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞の全てが、５×１０６ ＣＡＲ Ｔ細胞注射後疾患進行の遅延を示したが、差次的応答を有する２群にクローンが分かれるように見えた。
ＣＤ３３ ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞抗腫瘍活性を、ヒトＡＭＬの異種移植モデルを担持するＮＳＧマウスにおけるこの有効性研究で試験した。これらの試験は、ＨＬ−６０−ｌｕｃモデルがＮＳＧマウスにおいてヒトＡＭＬを再現し、ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞により標的化され得ることを示した(図５８)。ＣＤ３３特異的ＣＡＲ Ｔ細胞で処置後のＮＳＧマウスにおけるＨＬ−６０−ｌｕｃヒトＡＭＬ異種移植増殖は、疾患進行遅延を示す(図５８)。この研究は、７ＣＤ３３ ＣＡＲがＡＭＬの異種移植モデルにおいて抗腫瘍応答を開始できることを示した(図５８)。
均等物
ここに引用する各および全ての特許、特許出願および刊行物の開示は、その全体を引用により本明細書に包含させる。本発明は、具体的面を参照して開示しているが、本発明の他の面および異形が、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく他の当業者により考案され得ることは明らかである。下記特許請求の範囲は、全てのこのような面および等価な異形を含むと解釈されることを意図する。

Claims (64)

  1. キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)をコードする単離核酸分子であって、ここで、ＣＡＲがヒトＣＤ３３結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含み、ここで、該ＣＤ３３結合ドメインが表２または９に記載のいずれかのＣＤ３３重鎖結合ドメインアミノ酸配列の重鎖相補的決定領域１(ＨＣ ＣＤＲ１)、重鎖相補的決定領域２(ＨＣ ＣＤＲ２)および重鎖相補的決定領域３(ＨＣ ＣＤＲ３)を含む、単離核酸分子。
  2. 該ヒトＣＤ３３結合ドメインがさらに表２または９に記載のいずれかのＣＤ３３重鎖結合ドメインアミノ酸配列の軽鎖相補的決定領域１(ＬＣ ＣＤＲ１)、軽鎖相補的決定領域２(ＬＣ ＣＤＲ２)および軽鎖相補的決定領域３(ＬＣ ＣＤＲ３)を含む、請求項１に記載の単離核酸分子。
  3. 該ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３が表１１、１３または４に記載のＬＣ ＣＤＲ配列である、請求項２に記載の単離核酸分子。
  4. 該ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３が表１０、１２または３に記載のＨＣ ＣＤＲ配列である、請求項１〜３のいずれかに記載の単離核酸分子。
  5. (ｉ)表２または９に記載のいずれかの軽鎖可変領域のアミノ酸配列；
    (ii)表２または９に記載のいずれかの軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２または３修飾を有するが、３０、２０または１０修飾を超えないアミノ酸配列；または
    (iii)表２または９に提供する軽鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
    を含むＣＡＲをコードする、請求項１〜４のいずれかに記載の単離核酸分子。
  6. (ｉ)表２または９に記載のいずれかの重鎖可変領域のアミノ酸配列；
    (ii)表２または９に記載のいずれかの重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２または３修飾を有するが、３０、２０または１０修飾を超えないアミノ酸配列：または
    (iii)表２または９に提供する重鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
    を含むＣＡＲをコードする、請求項１〜５のいずれかに記載の単離核酸分子。
  7. 表２または９に記載のいずれかの軽鎖可変領域のアミノ酸配列および表２または９に記載のいずれかの重鎖可変領域を含むＣＡＲをコードする、請求項１〜６のいずれかに記載の単離核酸分子。
  8. コードされたＣＤ３３結合ドメインが
    (ｉ)配列番号３９〜４７、５７〜６５、６６〜７４または２６２〜２６８からなる群から選択されるアミノ酸配列；
    (ii)配列番号３９〜４７、５７〜６５、６６〜７４または２６２〜２６８のいずれかの少なくとも１、２または３修飾を有するが、３０、２０または１０修飾を超えないアミノ酸配列；または
    (iii)配列番号３９〜４７、５７〜６５、６６〜７４または２６２〜２６８のいずれかと９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
    を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の単離核酸分子。
  9. ＣＤ３３結合ドメインが配列番号２５５〜２６１からなる群から選択されるヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の単離核酸分子。
  10. コードされたＣＡＲがＴ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む、請求項１〜９のいずれかに記載の単離核酸分子。
  11. (ｉ)コードされた膜貫通ドメインが配列番号６のアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸配列の少なくとも１、２または３修飾を有するが、２０、１０または５修飾を超えないアミノ酸配列または配列番号６のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む；または
    (ii)膜貫通ドメインをコードする核酸配列が配列番号１７の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の単離核酸分子。
  12. コードされたＣＤ３３結合ドメインがヒンジ領域により膜貫通ドメインに結合される、請求項１〜１１のいずれかに記載の単離核酸分子。
  13. (ｉ)コードされたヒンジ領域が配列番号２のアミノ酸配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む；または
    (ii)ヒンジ領域をコードする核酸配列が配列番号１３のヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む、
    請求項１２に記載の単離核酸分子。
  14. コードされた共刺激ドメインがＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ性活性化分子(ＳＬＡＭタンパク質)、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃbp、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群から選択されるタンパク質から得られる機能的シグナル伝達ドメインである、請求項１〜１３のいずれかに記載の単離核酸分子。
  15. コードされた共刺激ドメインが配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列の少なくとも１、２または３修飾を有するが２０、１０または５修飾を超えないアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列に９５〜９９％同一性を有する配列を含む、請求項１４に記載の単離核酸分子。
  16. 刺激ドメインをコードする核酸配列が配列番号１８のヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む、請求項１４に記載の単離核酸分子。
  17. コードされた細胞内シグナル伝達ドメインが４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の単離核酸分子。
  18. コードされた細胞内シグナル伝達ドメインが配列番号７の配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０の配列；または配列番号７のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列の少なくとも１、２または３修飾を有するが２０、１０または５修飾を超えないアミノ酸配列；または配列番号７のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の単離核酸分子。
  19. コードされた細胞内シグナル伝達ドメインが配列番号７の配列および配列番号９または配列番号１０の配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列が同じフレームにおよび単一ポリペプチド鎖として発現される、請求項１〜１８のいずれかに記載の単離核酸分子。
  20. 細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列が配列番号１８の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列および／または配列番号２０の配列または配列番号２１またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む、請求項１〜１９のいずれかに記載の単離核酸分子。
  21. さらに配列番号１のアミノ酸配列をコードするリーダー配列を含む、請求項１〜２０のいずれかに記載の単離核酸分子。
  22. (ｉ)配列番号４８〜５６のいずれかのアミノ酸配列；
    (ii)配列番号４８〜５６のいずれかの少なくとも１、２または３修飾を有するが、３０、２０または１０修飾を超えないアミノ酸配列；または
    (iii)配列番号４８〜５６のいずれかと９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
    を含むＣＡＲをコードする、請求項１〜２１のいずれかに記載の単離核酸分子。
  23. 配列番号７５〜８３のいずれかのヌクレオチド配列または配列番号７５〜８３のいずれかと９５〜９９％同一性を有するヌクレオチド配列を服務、請求項１〜２２のいずれかに記載の単離核酸分子。
  24. 請求項１〜２３のいずれかに記載の核酸分子によりコードされる、単離ポリペプチド分子。
  25. 単離キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)ポリペプチドであって、ここで、ＣＡＲはヒトＣＤ３３結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む抗体または抗体フラグメントを含み、ここで、該ＣＤ３３結合ドメインは表２または９に記載のいずれかのＣＤ３３重鎖結合ドメインアミノ酸配列の重鎖相補的決定領域１(ＨＣ ＣＤＲ１)、重鎖相補的決定領域２(ＨＣ ＣＤＲ２)および重鎖相補的決定領域３(ＨＣ ＣＤＲ３)を含む、単離ＣＡＲポリペプチド。
  26. 該ヒトＣＤ３３結合ドメインがさらに表２または９に記載のいずれかのＣＤ３３重鎖結合ドメインアミノ酸配列の軽鎖相補的決定領域１(ＬＣ ＣＤＲ１)、軽鎖相補的決定領域２(ＬＣ ＣＤＲ２)および軽鎖相補的決定領域３(ＬＣ ＣＤＲ３)を含む、請求項２５に記載の単離ＣＡＲポリペプチド。
  27. 該ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３が表１１、１３または４に記載のＬＣ ＣＤＲ配列である、請求項２６に記載の単離ＣＡＲポリペプチド。
  28. 該ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３が表１０、１２または３に記載のＨＣ ＣＤＲ配列である、請求項２５〜２７のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド。
  29. (ｉ)表２または９に記載のいずれかの軽鎖可変領域のアミノ酸配列；
    (ii)表２または９に提供する軽鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列の少なくとも１、２または３修飾を有するが、３０、２０または１０修飾を超えないアミノ酸配列；または
    (iii)表２または９に提供する軽鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
    を含む、請求項２５〜２８のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド。
  30. (ｉ)表２または９に記載のいずれかの重鎖可変領域のアミノ酸配列；
    (ii)表２または９に提供する重鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列の少なくとも１、２または３修飾を有するが、３０、２０または１０修飾を超えないアミノ酸配列：または
    (iii)表２または９に提供する重鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
    を含む、請求項２５〜２９のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド。
  31. 表２または９に記載のいずれかの軽鎖可変領域のアミノ酸配列および表２または９に記載のいずれかポリペプチド。
  32. (ｉ)配列番号３９〜４７、５７〜６５、６６〜７４および２６２〜２６８からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列；
    (ii)配列番号３９〜４７、５７〜６５、６６〜７４または２６２〜２６８のいずれかの少なくとも１、２または３修飾を有するが、３０、２０または１０修飾を超えないアミノ酸配列；または
    (iii)配列番号３９〜４７、５７〜６５、６６〜７４または２６２〜２６８のいずれかと９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
    を含む、請求項２５〜３１のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド。
  33. 膜貫通ドメインがＴ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群から選択されるタンパク質からの膜貫通ドメインを含む、請求項２５〜３２のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド。
  34. (ｉ)膜貫通ドメインが配列番号６のアミノ酸配列を含む、
    (ii)アミノ酸配列が配列番号６のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を含むが、２０、１０または５修飾を超えないまたは
    (iii)配列番号６のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列
    である、請求項２５〜３３のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド。
  35. ＣＤ３３結合ドメインがヒンジ領域により膜貫通ドメインに結合される、請求項２５〜３４のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド。
  36. ヒンジ領域が配列番号２またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む、請求項３５に記載の単離ＣＡＲポリペプチド。
  37. 共刺激ドメインがＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ性活性化分子(ＳＬＡＭタンパク質)、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃbp、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群から選択されるタンパク質から得られる機能的シグナル伝達ドメインである、請求項２５〜３６のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド。
  38. 共刺激ドメインが配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列の少なくとも１、２または３修飾を有するが２０、１０または５修飾を超えないアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列に９５〜９９％同一性を有する配列を含む、請求項２５〜３７のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド。
  39. 細胞内シグナル伝達ドメインが４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む、請求項２５〜３７のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド。
  40. 細胞内シグナル伝達ドメインが配列番号７の配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０の配列；または配列番号７のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列の少なくとも１、２または３修飾を有するが２０、１０または５修飾を超えないアミノ酸配列；または配列番号７のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む、請求項２５〜３９のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド。
  41. 細胞内シグナル伝達ドメインが配列番号７の配列および配列番号９または配列番号１０の配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は、同じフレームにおよび単一ポリペプチド鎖として発現される、請求項２５〜４０のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド。
  42. さらに配列番号１のアミノ酸配列を含むリーダー配列を含む、請求項２５〜４１のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド。
  43. (ｉ)配列番号４８〜５６のいずれかのアミノ酸配列；
    (ii)配列番号４８〜５６のいずれかの少なくとも１、２または３修飾を有するが、３０、２０または１０修飾を超えないアミノ酸配列；または
    (iii)配列番号４８〜５６のいずれかと９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
    を含む、請求項２５〜４２のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド。
  44. 請求項１〜４３のいずれかに記載のＣＡＲをコードする核酸分子またはＣＤ３３結合ドメインを含むベクターであって、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターからなる群から選択される、ベクター。
  45. さらに配列番号１１の配列を含むＥＦ−１プロモーターを含む、請求項４４に記載のベクター。
  46. 請求項１〜２３のいずれかに記載の核酸、請求項２４〜４３のいずれかに記載のＣＡＲポリペプチドまたは請求項４４または４５に記載のベクターを含む、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞。
  47. 免疫エフェクター細胞を請求項４４または４５に記載のベクターで形質導入することを含む、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞を製造する方法。
  48. インビトロ転写ＲＮＡまたは合成ＲＮＡを細胞に導入することを含み、ここで、ＲＮＡが請求項１〜４７のいずれかに記載のＣＡＲポリペプチドをコードする核酸を含む、ＲＮＡ操作細胞の集団を産生する方法。
  49. 哺乳動物に有効量のＣＡＲ請求項１〜２３のいずれかに記載の核酸または請求項２４〜４３のいずれかに記載のＣＡＲポリペプチドを含む細胞、例えば、免疫エフェクター細胞の集団を投与することを含む、哺乳動物に抗腫瘍免疫を提供する方法。
  50. 細胞が自己Ｔ細胞または同種異系Ｔ細胞である、請求項４９に記載の方法。
  51. 哺乳動物に有効量のＣＡＲ請求項１〜２３のいずれかに記載の核酸または請求項２４〜４３のいずれかに記載のＣＡＲポリペプチドを含む細胞、例えば、免疫エフェクター細胞の集団を投与することを含む、ＣＤ３３の発現と関係する疾患を有する哺乳動物を処置する方法。
  52. ＣＤ３３発現と関係する疾患が
    (ｉ)癌または悪性腫瘍骨髄異形成、骨髄異形成症候群もしくは前白血病の１以上から選択されるまたは前癌状態または
    (ii)ＣＤ３３の発現と関係する非癌関連徴候
    である、請求項５１に記載の方法。
  53. 疾患が血液癌、請求項５１または５２に記載の方法。
  54. 疾患が急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性新生物、慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、または芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物またはこれらの組み合わせの１以上から選択される急性白血病である、請求項５１〜５３のいずれかに記載の方法。
  55. 細胞、例えば、免疫エフェクター細胞の集団を
    (ｉ)ＣＡＲ核酸またはＣＡＲポリペプチドを含む細胞の効果を高める薬剤；
    (ii)ＣＡＲ核酸またはＣＡＲポリペプチドを含む細胞の投与と関係する副作用を軽減する薬剤；または
    (iii) ＣＤ３３と関係する疾患を処置する薬剤
    の１以上と組み合わせて投与する、請求項５１〜５４のいずれかに記載の方法。
  56. 医薬として使用するための、請求項１〜２３のいずれかに記載の単離核酸分子、請求項２４〜４３のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド分子、請求項４４または４５に記載のベクターまたは請求項４６に記載の細胞。
  57. ＣＤ３３の発現と関係する疾患の処置に使用するための、請求項１〜２３のいずれかに記載の単離核酸分子、請求項２４〜４３のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド分子、請求項４４または４５に記載のベクターまたは請求項４６に記載の細胞。
  58. 細胞内シグナル伝達ドメインからの陽性シグナルを含む第二ポリペプチドと関係する、阻害分子の少なくとも一部を含む第一ポリペプチドを含む阻害分子をさらに発現する、請求項４９に記載の細胞、例えば、免疫エフェクター細胞の集団。
  59. 阻害分子がＰＤ１の少なくとも一部を含む第一ポリペプチドならびに共刺激ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む第二ポリペプチドを含む、請求項５８に記載の細胞。
  60. 薬剤がｍＴＯＲ阻害剤であり、対象が低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１またはラパマイシンを投与される、請求項５５に記載の方法。
  61. ｍＴＯＲ阻害剤を、対象の末梢血または対象から単離したＴ細胞の調製物における、ＰＤ−１陽性Ｔ細胞の比率の減少、ＰＤ−１陰性Ｔ細胞の比率の増加またはＰＤ−１陰性Ｔ細胞／ＰＤ−１陽性Ｔ細胞比の増加に十分な時間の後に投与する、請求項６０に記載の方法。
  62. 対象に有効量の請求項１〜２３のいずれかに記載のＣＡＲ核酸分子または請求項２４〜４３のいずれかに記載のＣＡＲポリペプチドを含む細胞を投与することを含む、細胞移植前に対象をコンディショニングする方法。
  63. 細胞移植が幹細胞移植、例えば、造血幹細胞移植または骨髄移植である、請求項６２に記載の方法。
  64. 細胞移植前の対象のコンディショニングが、対象におけるＣＤ３３発現細胞、例えば、ＣＤ３３発現正常細胞またはＣＤ３３発現癌細胞の数を減らすことを含む、請求項６２または６３に記載の方法。
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