DE69634855T2

DE69634855T2 - Neuorientierung der zellulären immunität durch rezeptorchimären

Info

Publication number: DE69634855T2
Application number: DE69634855T
Authority: DE
Inventors: Brian Seed; Charles Romeo; Waldemar Kolanus
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1995-02-24
Filing date: 1996-01-25
Publication date: 2006-05-18
Anticipated expiration: 2016-01-26
Also published as: KR100490099B1; EP0871495B1; EP0871495A4; EP0871495A1; DE69634855D1; RU2167676C2; NZ337002A; HUP9801873A3; WO1996025953A1; ES2245456T3; HUP9801873A2; JP4170390B2; AU4858896A; FI973437A0; NO973864D0; ATE297986T1; NO973864L; HU225688B1; JPH11505409A; CA2209300A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft funktionelle T-Zell-Rezeptor-, Fc-Rezeptor- oder B-Zell-Rezeptor-Chimäre, die zur Redirektion der Immunsystemfunktion fähig sind. Sie betrifft insbesondere die Regulation von Lymphozyten, Makrophagen, natürlichen Killerzellen oder Granulozyten durch die Expression von Chimären in den genannten Zellen, wobei diese bewirken, daß die Zellen auf Ziele reagieren, die durch die Chimären erkannt werden. Die Erfindung betrifft auch funktionelle T-Zell-Rezeptor-, Fc-Rezeptor- oder B-Zell-Rezeptor-Chimäre, die fähig sind, therapeutische Zellen so zu lenken, daß sie spezifisch entweder Zellen, die mit einem spezifischen infektiösen Agens infiziert sind, das infektiöse Agens selbst, eine Tumorzelle oder eine autoimmun erzeugte Zelle erkennen und zerstören. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf die Produktion von T-Zell-Rezeptor-, Fc-Rezeptor- oder B-Zell-Rezeptor-Chimären, die fähig sind, cytotoxische T-Zell-Lymphozyten so zu steuern, daß sie spezifisch Zellen, die HIV-Hüllproteine exprimieren, erkennen und lysieren. Die Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Herstellung eines Medikaments für die Therapie von Krankheiten wie AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome), die durch das HIV-Virus verursacht werden, bereit.
Hintergrund der Erfindung
T-Zell-Erkennung von Antigen durch den T-Zell-Rezeptor ist die Grundlage einer Reihe von immunologischen Phänomenen. Die T-Zellen steuern was als Zell-vermittelte Immunität bezeichnet wird. Diese involviert die Zerstörung von Fremdgeweben oder infizierten Zellen durch Zellen des Immunsystems. Es existiert eine Vielzahl von T-Zellen, einschließlich "Helfer"- und "Supressor"-Zellen, die die Immunantwort modulieren, und cytotoxischer (oder "Killer"-) Zellen, die abnormale Zellen direkt abtöten können.
Eine T-Zelle, die ein einzelnes Antigen, das an der Oberfläche einer anderen Zelle präsentiert wird, erkennt und bindet, wird aktiviert; sie kann sich dann vermehren und, wenn es sich um eine cytotoxische Zelle handelt, kann sie die gebundene Zelle abtöten.
Eine Autoimmunkrankheit wird durch die Produktion entweder von Antikörpern, die mit Wirtsgewebe reagieren, oder Immuneffektor-T-Zellen, die autoreaktiv sind, charakterisiert. In einigen Fällen können Antikörper durch eine normal T-Zell- und B-Zell-Antwort entstehen, die durch fremde Substanzen oder Organismen aktiviert wird, welche Antigene enthalten, die mit ähnlichen Verbindungen in Körpergeweben kreuzreagieren. Beispiele für klinisch relevante Autoantikörper sind Antikörper gegen Acetylcholin-Rezeptoren bei Myasthenia gravis; und Anti-DNA, Anti-Erythrozyten- und Anti-Thrombozyten-Antikörper bei systemischem Lupus erythematodes.
HIV und Immunipathogenese
1984 wurde gezeigt, daß HIV das ätiologische Mittel von AIDS ist. Sei dieser Zeit wurde die Definiton von AIDS bezüglich der Tatsache, welche Kriterien in der Diagnose eingeschlossen sein sollten, mehrmals überarbeitet. Trotz der Schwankung bei den Diagnoseparametern ist die einfach gängige Bezeichnung für AIDS die Infektion mit HIV und die anschließende Entwicklung von persistenten konstitutionellen Symptomen und AIDS-definierenden Erkrankungen, zum Beispiel Sekundärinfektionen, Neoplasmen und neurologische Krankheit. Harrison's Principles of Internal Medicine, 12. Ausgabe, McGraw Hill (1991).
HIV ist ein humanes Retrovirus der Lentivirus-Gruppe. Die vier bekannten humanen Retroviren gehören zu zwei unterschiedlichen Gruppen: die humanen T-lymphotropen (oder Leukämie)-Retroviren HTLV-1 und HTLV-2 und die humanen Immundefizienz-Viren HIV-1 und HIV-2. Die erstgenannten sind transformierende Viren, wohingegen die letztgenannten cytopathische Viren sind.
HIV-1 wurde als der häufigste Grund für AIDS in der Welt identifiziert. Die Sequenzhomologie zwischen HIV-2 und HIV-1 beträgt etwa 40%, wobei HIV-2 mit einigen Mitgliedern einer Gruppe von Simian-Immundefizienz-Viren (SIV) näher verwandt ist. Siehe Curran et al., Science 329: 1357–1359 (1985); Weiss et al.; Nature 124: 572–575 (1986).
HIV hat die üblichen retroviralen Gene (env, gag und pol) wie auch sechs Extragene, die bei der Replikation und anderen biologischen Aktivitäten des Virus involviert sind. Wie vorher festgestellt wurde, ist der gemeinsame Namengeber von AIDS ein tiefe Immunsuppression, vornehmlich zellvermittelter Immunität. Diese Immunsuppression führt zu einer Vielzahl opportunistischer Erkrankungen, insbesondere bestimmten Infektionen und Neoplasmen.
Der Hauptgrund des Immundefekts bei AIDS wurde als quantitative und qualitative Defizienz im Untersatz Thymusabgeleiteter (T) Lymphozyten, der T4-Population identifiziert. Dieser Untersatz an Zellen wird phänotypisch durch das Vorliegen des CD4-Oberflächenmoleküls definiert, von dem bewiesen wurde, daß es der zelluläre Rezeptor für HIV ist. Dalgleish et al., Nature 112: 763 (1984). Obgleich die T4-Zelle der Hauptzelltyp ist, der mit HIV infiziert wird, ist im wesentlichen jede beliebige humane Zelle, die das CD4-Molekül an ihrer Oberfläche exprimiert, fähig an HIV zu binden und mit HIV infiziert zu werden.
Traditionell wurde CD4⁺ T-Zellen, die Helfer/Inducer-Rolle zugeordnet, was ihre Funktion bei der Bereitstellung eines Aktivierungssignals an B-Zellen anzeigt, oder sie induzieren T-Lymphozyten, die den reziprokalen CD8-Marker tragen, so daß sie cytotoxische/Suppressor-Zellen bilden. Reinherz und Schlossman, Cell 19: 821–827 (1980); Goldstein et al., Immunol. Rev. 68: 5–42 (1982).
HIV bindet spezifisch und mit hoher Affinität über eine Strecke von Aminosäuren in der viralen Hülle (gp120) an einen Teil der V1-Region des CD4-Moleküls, der nahe seinem N-Terminus lokalisiert ist. Nach der Bindung fusioniert das Virus mit der Zielzellenmembran und wird internalisiert. Sobald es internalisiert ist, verwendet es das Enzym reverse Transkriptase, um seine genomische RNA in DNA zu transkribieren, welche in die zelluläre DNA integriert wird, wo sie für das Leben der Zelle als "Provirus" existiert.
Das Provirus kann latent bleiben oder kann aktiviert werden, um RNA und genomische RNA zu transkribieren, was zur Proteinsynthese, Anordnung, neuer Virionbildung und zum Sprossen von Virus aus der Zelloberfläche führen. Obgleich der genaue Mechanismus, durch welchen das Virus Zelltod induziert, noch nicht geklärt wurde, wird angenommen, daß der Hauptmechanismus ein massives virales Sprossen aus der Zelloberfläche ist, was zum Zerreißen der Zellmembran führt und zu einem osmotischen Ungleichgewicht führt.
Während des Verlaufs der Infektion entwickelt der Wirtsorganismus Antikörper gegen virale Proteine, einschließlich der Haupthüllglycoproteine gp120 und gp41.
Trotz dieser humoralen Immunität schreitet die Krankheit fort, was in in einer letalen Immunsuppression resultiert, die durch mehrere opportunistische Infektionen, Parasitämie, Demens und Tod gekennzeichnet ist. Das Versagen der antiviralen Antikörper des Wirts, das Fortschreiten der Krankheit anzuhalten, stellt einen der quälendsten und alarmierendsten Aspekte der Infektion dar und verheißt für Impfanstrengungen auf der Basis herkömmlicher Ansätze nichts gutes.
Zwei Faktoren können bei der Wirksamkeit der humoralen Antwort auf Immundefizienzviren eine Rolle spielen. Erstens, wie andere RNA-Viren (und ähnliche Retroviren insbesondere) zeigen die Immundefizienzviren eine hohe Mutationsrate als Reaktion auf die Immunüberwachung des Wirts. Zweitens, die Hüllglycoproteine selbst sind stark glycosylierte Moleküle, die wenige Epitope präsentieren, die für eine Antikörperbindung hoher Affinität geeignet sind. Das schlecht antigene Ziel, das die virale Hülle präsentiert, läßt dem Wirt wenig Gelegenheit zur Beschränkung der viralen Infektion durch spezifische Antikörperproduktion.
Zellen die durch das HIV-Virus infiziert sind, exprimieren das gp120-Glycoprotein an ihrer Oberfläche. gp120 vermittelt Fusionsereignisse unter CD4⁺-Zellen über eine Reaktion, die ähnlich der ist, durch welches das Virus in die nicht-infizierten Zellen eintritt, was zur Bildung von kurzlebigen vielzelligen Riesenzellen führt. Syncytium-Bildung ist von einer direkten Wechselwirkung des gp120-Hüllglycoproteins mit dem CD4-Protein abhängig. Dalgleish et al., supra; Klatzmann et al., Nature 312: 763 (1984); McDougal et al., Science 231: 382 (1986); Sodroski et al., Nature 322: 470 (1986); Lifson et al., Nature 123: 725 (1986); Sodroski et al., Nature 321: 412 (1986).
Ein Beweis dafür, daß die CD4-gp120-Bindung für eine virale Infektion von Zellen, die das CD4-Antigen tragen, verantwortlich ist, umfaßt die Feststellung, daß ein spezifischer Komplex zwischen gp120 und CD4 gebildet wird (McDougal et al., supra). Andere Forscher haben gezeigt, daß die Zellinien, die für HIV nicht infektiös sind, in infektiöse Zellinien umgewandelt werden können, was auf Transfektion und Expression des humanen CD4-cDNA-Gens folgt. Maddon et al., Cell 46: 333–348 (1986).
Therapeutische Prgramme auf der Basis von löslichem CD4 als passives Agens, um mit viraler Adsorption und Syncytium-vermittelter zellulärer Transmission in Wechselwirkung zu treten, wurden vorgeschlagen und in vitro von einer Reihe von Gruppen erfolgreich demonstriert (Deen et al., Nature 331: 82–84 (1988); Fisher et al., Nature 331: 76–78 (1988); Hussey et al., Nature 331: 78–81 (1988); Smith et al., Science 238: 1704–1707 (1987); Traunecker et al., Nature 331: 84–86 (1988)); und anschließend wurden CD4-Immunglobulin-Fusionsproteine mit verlängerten Halbwertszeiten und moderater biologischer Aktivität entwickelt (Capon et al., Nature 337: 525–531 (1989); Traunecker et al., Nature 339, 68–70 (1989); Byrn et al., Nature 344: 667–670 (1990); Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol., 9: 347–353 (1990)). Obgleich CD4-Immuntoxin-Konjugate oder Fusionsproteine für infizierte Zellen in vitro starke Cytotoxizität zeigen (Chaudhary et al., Nature 335: 369–372 (1988); Till et al., Science 242: 1166–1168 (1988)), macht es die Latenz des Immundefizienzsyndroms unwahrscheinlich, daß eine Einzelbehandlungstherapie bei der Eliminierung der Viruslast wirksam sein kann, und die Antigenität von fremden Fusionsproteinen wird wahrscheinlich ihre Akzeptabilität bei Behandlungen, die eine Wiederholungsdosierung erfordern, begrenzen. Versuche mit Affen, die von SIV befallen waren, zeigten, daß lösliches CD4, wenn es Tieren ohne ausgeprägte CD4-Cytopenie verabreicht wurde, den SIV-Titer reduzieren kann und in vitro-Meßgrößen des myeloiden Potentials verbessern (Watanabe et al., Nature 337: 267–270 (1989)). Nachdem die Behandlung unterbrochen worden war, wurde allerdings ein sofortiges Wiederauftreten des Virus beobachtet, was nahelegt, daß eine Langzeitverabreichung notwendig sein könnte, um eine progressive Schwächung des Immunsystems zu verhindern.
T-Zell- und FC-Rezeptoren
Die Zelloberflächenexpression der am häufigsten vorkommenden Form des T-Zell-Antigen-Rezeptors (TCR) erfordert die Coexpression von wenigstens 6 unterschiedlichen Polypeptidketten (Weiss et al., J. Exp. Med. 160: 1284–1299 (1984); Orloffhashi et al., Nature 316: 606–609 (1985); Berkhout et al., J. Biol. Chem. 263: 8528–8536 (1988); Sussman et al., Cell 52: 85–95 (1988)), der α/β-Antigen-bindenden Ketten, der drei Polypeptide des CD3-Komplexes und ζ. Wenn eine beliegige der Ketten fehlt, kann keine stabile Expression der verbleibenden Glieder des Komplexes folgen. ζ ist das limitierende Polypeptid zur Oberflächenexpression des kompletten Komplexes (Sussman et al., Cell 52: 85–95 (1988)) und es wird angenommen, daß es zumindest eine Fraktion der zellulären Aktivierungsprogramme vermittelt, die durch Rezeptorerkennung des Liganden ausgelöst werden (Weissmann et al., EMBO J. 8: 3651–3656 (1989); Frank et al., Science 249: 174–177 (1990)). Ein integrales Membranhomodimer vom 32 kDa-Typ I, ζ (zeta) hat eine extrazelluläre Domäne mit neun Resten ohne Stellen für eine N-verknüpfte Glycan-Addition und eine intrazelluläre Domäne mit 112 Resten (Maus) oder 113 Resten (Mensch) (Weissman et al., Science 238: 1018–1020 (1988); Weissman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9709–9713 (1988)). Eine Isoform von ζ, die η (eta) genannt wird (Baniyash et al., J. Biol. Chem. 263: 9874–9878 (1988); Orloff et al., J. Biol. Chem. 264: 14812–14817 (1989)), die aus einem alternativen mRNA-Spleißweg stammt (Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3319–3233 (1990), liegt in reduzierten Mengen in Zellen vor, die den Antigen-Rezeptor exprimieren. Von ζ-η-Heterodimeren wird angenommen, daß sie die Bildung von Inositolphosphaten wie auch den Rezeptor-initiierten programmiertem Zelltod, Apoptose genannt, vermitteln (Merćep et al., Science 242: 571–574 (1988); Merćep et al., Science 246: 1162–1165 (1989)).
Wie ζ und η wird die Fc-Rezeptor-assoziierte γ (gamma)-Kette in Zelloberflächenkomplexen mit zusätzlichen Polypeptiden exprimiert, von denen einige eine Ligandenerkennung vermitteln und von denen andere eine undefinierte Funktion haben. γ trägt eine homodimere Struktur und eine Gesamtorganisation, die der von ζ sehr ähnlich ist und ist eine Komponente sowohl des Mastzell/Basophil-Hochaffinitäts-IgE-Rezeptors, FcεRI, der aus wenigstens drei unterschiedlichen Polypeptid-Ketten besteht (Blank et al., Nature 337: 187–189 (1989); Ra et al., Nature 241: 752–754 (1989)) und eines der Niedrigaffinitätsrezeptoren für IgG, repräsentiert in Mäusen durch FcγRIIα (Ra et al., J. Biol. Chem. 264: 15323–15327 (1989)), und in Menschen durch die CD16-Subtyp-Expression durch Makrophagen und natürliche Killerzellen, CD16T (CD16-Transmembran) (Lanier et al., Nature 342: 803–805 (1989); Anderson et al., Procl. Natol. Acad. Sci. USA 87: 2274–2278 (1990) und mit einem Polypeptid nicht-identifizierter Funktion (Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2274–2278 (1990)). Kürzlich wurde berichtet, daß γ durch eine Maus-T-Zellinie CTL, exprimiert wird, in der es Homodimere wie auch auch γ-ζ- und γ-η-Heterodimere bildet (Orloff et al., Nature 347: 189–191 (1990)).
Die Fc-Rezeptoren vermitteln die Phagocytose von Immunkomplexen, Transcytose und Antikörper-abhängige celluläre Cytotoxizität (ADCC) (Ravetch und Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457–492 (1991); Unkeless et al., Annu. Rev. Immunol. 6: 251–281 (1988); und Mellman, Curr. Opin. Immunol. 1: 16–25 (1988)). Kürzlich wurde gezeigt, daß eine der murinen Niedrigaffinitäts-Fc-Rezeptor-Isoformen, FcRγIIIB1, eine Internalisierung von Ig-beschichteten Targets in Clathrin-beschichtete Pits vermittelt und daß ein anderer Niedrigaffinitäts-Rezeptor, FcRγIIIA, ADCC durch seine Assoziierung mit einem oder mehreren Mitgliedern einer kleinen Familie von "Trigger-Molekülen" vermittelt (Miettinen et al., Cell 58: 317–327 (1989); und Hunziker und Mellman, J. Cell. Biol. 109: 3291–3302 (1989)). Diese Trigger-Moleküle, T-Zell-Rezeptor (TCR)-ζ-Kette, TCR-η-Kette und Fc-Rezeptor-γ-Kette wechselwirken mit Liganden-Erkennungsdomänen verschiedener Immunsystem-Rezeptoren und können autonom zelluläre Effektorprogramme initiieren, einschlließlich Cytolyse, die einer Aggregation folgt (Samelson et al., Cell 43: 223–231 (1985); Weissman et al., Science 239: 1018–1020 (1988); Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3319–3323 (1990); Blank et al., Nature 337: 187–189 (1989); Lanier et al., Nature 342: 803–805 (1989); Kuroski und Ravetch, Nature 342: 805–807 (1989); Hibbs et al., Science 246: 1608–1611 (1989); Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2274–2278 (1990); und Irving and Weiss, Cell 64: 891–901 (1991)).
Bei der Aufzeichnung von Parallelen zwischen den murinen und humanen Niedrigaffinitäts-Fc-Rezeptor-Familien wird allerdings klar, daß die humanen FcRγIIA- und -C-Isoformen kein murines Gegenstück haben. Teilweise aus dem Grund, daß ihre Funktion noch nicht definiert wurde.
Da humorale Agentien auf der Basis von CD4 allein in vivo eine begrenzte Verwendbarkeit haben, klärten frühere Arbeiten die Möglichkeit der Erhöhung der zellulären Immunität gegenüber HIV. Präparationen von Protein-Chimären, in denen die extrazelluläre Domäne von CD4 an die Transmembran- und/oder intrazelluläre Domäne von T-Zell-Rezeptor-, IgG-Fc-Rezeptor- oder B-Zell-Rezeptor-Signal-transduzierenden Elementen fusioniert ist, wurden identifiziert (U.S.S.N. 07/847,566 und 07/665,961, die hier durch Referenz aufgenommen gelten). Cytolytische T-Zellen, die Chimäre exprimieren, welche eine extrazelluläre CD4-Domäne enthalten, zeigen eine wirksame MHC-unabhängige Zerstörung von zellulären Targets, die HIV-Hüllproteine exprimieren. Eine extrem wichtige und neue Komponente dieses Ansatzes ist die Identifizierung von einzelnem T-Zell-Rezeptor, Fc-Rezeptor- und B-Zell-Rezeptor-Ketten, deren Aggregation ausreicht, um die zelluläre Antwort zu initiieren.
Eine besonders nützliche Anwendung dieses Ansatzes war die Erfindung von Chimären zwischen CD4 und ζ, η oder γ, die cytolytische T-Lymphozyten so steuern, daß sie Zellen erkennen und abtöten, welche HIV-gp120 exprimieren (U.S.S.N. 07/847 566 und 07/665 961, die hier durch Referenz aufgenommen werden).
Zusammenfassung der Erfindung
Obgleich native T-Zell-, B-Zell- und Fc-Rezeptoren hochkomplizierte multimere Strukturen sind oder sein können, die sich selbst nicht für eine zweckdienliche Manipulation eignen, beweist die vorliegende Erfindung die Möglichkeit, Chimäre zwischen der intrazellulären Domäne eines beliebigen einer Vielzahl von Molekülen zu schaffen, die fähig sind, die Aufgabe einer Targeterkennung bzw. Zielerkennung zu erfüllen. Speziell die Bildung von Chimären, die aus dem intrazellulären Teil von T-Zell-/Fc-Rezeptor-zeta-, -eta- oder -gamma-Ketten bestehen, welche mit dem extrazellulären Teil eines in geeigneter Weise konstruierten Antikörpermoleküls verbunden sind, ermöglicht, daß das Zielerkennungspotential einer Immunsystemzelle spezifisch auf das Antigen, das durch den extrazellulären Antikörperteil erkannt wird, umgesteuert wird. Mit einem Antikörperteil, der fähig ist, eine gewisse Determinante an der Oberfläche eines Pathogens zu erkennen, würden Immunsystemzellen, die mit den Chimären bewaffnet sind, auf das Vorhandensein des Pathogens mit dem Effektorprogramm, das für ihre Abstammung passend ist, z.B. Helfer-T-Lymphozyten, durch cytotoxische Aktivität gegen das Target reagieren und B-Lymphozyten würden aktiviert werden, um einen Antikörper zu synthetisieren. Makrophagen und Granulozyten werden ihre Effektorprogramme, einschließlich Cytokinfreisetzung, Phagozytose und Bildung von reaktiven Sauerstoff, durchführen. Mit einem Antikörperteil, der zur Erkennung von Tumorzellen fähig ist, würde die Antwort des Immunsystems auf den Tumor günstig beurteilt werden. Mit einem Antikörper, der fähig ist, Immunzellen, die eine ungeeignete Reaktivität mit Selbstdeterminanten haben, zu erkennen, könnten die autoreaktiven Zellen zur Zerstörung selektiv targetiert werden.
Obgleich sich diese Beispiele auf die Verwendung von Antikörper-Chimären als ein zweckdienliches expositorisches Werkzeug stützen, ist die Erfindung in ihrem Rahmen nicht auf Antikörper-Chimäre beschränkt und in der Tat kann die Verwendung von spezifischen, extrazellulären Nicht-Antikörperdomänen wichtige Vorzüge haben. Beispielsweise wäre bei einem extrazellulären Teil, der der Rezeptor für ein Virus, Bakterium oder einen Parasiten ist, Zellen, die mit den Chimären bewaffnet sind, spezifischerweise Targetzellen, die die viralen, bakteriellen oder parasitären Determinanten exprimieren. Der Vorteil dieses Ansatzes gegenüber der Verwendung von Antikörpern besteht darin, daß der native Rezeptor für ein Pathogen einzigartig hohe Selektivität oder Affinität für das Pathogen haben kann, was einen höheren Präzisionsgrad in der resultierenden Immunantwort zuläßt. Um Immumsystemzellen zu deletieren, die in ungeeigneter Weise mit einem Eigenautoantigen reagieren, kann es entsprechend ausreichend sein, das Antigen (entweder als ein intaktes Protein im Fall von B-Zell-Verarmungstherapien oder als MHC- Komplex im Fall von T-Zell-Verarmungstherapien) an intrazelluläre zeta- eta- oder gamma-Ketten zu binden und dadurch das spezifische Targeting der Zellen, die in ungeeigneter Weise auf Selbstdeterminanten antworten, nachteilig zu beeinflussen.
Eine andere Verwendung der Chimären ist die Kontrolle von Zellpopulationen in vivo nach anderen Formen der Gentechnologie. Beispielsweise wurde die Verwendung von Tumor-infiltrierenden Lymphozyten oder natürlichen Killerzellen vorgeschlagen, um cytotoxische Prinzipien an die Stelle von Tumoren zu tragen. Die vorliegende Erfindung stellt ein zweckdienliches Mittel bereit, um die Zahl und Aktivität solcher Lymphozyten und Zellen zu regulieren, ohne sie aus dem Körper des Patienten zur Amplifikation in vitro zu entfernen. Da die intrazellulären Domänen der chimären Rezeptoren die proliferativen Antworten der Zelle vermitteln, wird somit die Koordination der extrazellulären Domänen durch eine Vielzahl von aggregierenden Stimuli, die für die extrazellulären Domänen spezifisch sind (z.B. ein Antikörper, der für die extrazelluläre Domäne spezifisch ist), zu einer Proliferation der Zellen, die die Chimären tragen, führen.
Obgleich die spezifischen Ausführungsformen der vorliegenden Chimären zwischen zeta-, eta- oder gamma-Ketten oder aktiven Fragmenten davon (z.B. die unten diskutierten) umfassen, könnte eine Rezeptorkette mit einer ähnlichen Funktion wie diese Moleküle, z.B. in Granulozyten oder B.-Lymphozyten, zu dem hierin offenbarten Zweck eingesetzt werden. Die unterscheidenden Merkmale wünschenswerter Immunzell-Trigger-Moleküle umfassen die Fähigkeit, autonom exprimiert zu werden (d.h. als einzelne Kettte), die Fähigkeit, an eine extrazelluläre Domäne fusioniert zu werden, so daß das resultierende Chimäre an der Oberfläche einer therapeutischen Zelle vorliegt, und die Fähigkeit, zelluläre Effektorprogramme bei Aggregation nach Zusammentreffen mit einem Targetliganden zu initiieren.
Derzeit ist das zweckdienlichste Verfahren zur Abgabe der Chimären an Immunsystemzellen dasjenige durch eine gewisse Form der Gentherapie. Allerdings würden rekonstituierende Immunsystemzellen mit chimären Rezeptoren durch Mischen der Zellen mit geeigneterweise solubilisierten gereinigtem chimären Protein auch zur Bildung einer genetisch veränderten Zellpopulation führen, die fähig ist, auf die Ziele bzw. Targets zu reagieren, die durch die extrazelluläre Domäne der Chimären erkannt werden. Ähnliche Ansätze wurden zum Beispiel verwendet, um den intakten HIV-Rezeptor, CD4, zu therapeutischen Zwecken in Erythrozyten einzuführen. In diesem Fall wäre die genetisch veränderte Zellpopulation zur Selbsterneuerung nicht fähig.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Medikaments für die therapeutische Anwendung bei einer Infektion, einer Tumorerkrankung oder einer Autoimmunerkrankung, dadurch gekennzeichnet, daß therapeutische Zellen erzeugt werden, die wenigstens zwei Membran-gebundene, proteinische, chimäre Rezeptoren exprimieren,
wobei einer der Rezeptoren umfaßt: (a) einen extrazellulären Teil, der fähig ist, eine Zielzelle bzw. Targetzelle oder ein infektiöses Zielagens spezifisch zu erkennen und zu binden, und (b) einen intrazellulären oder Transmembran-Teil, der fähig ist, der therapeutischen Zelle das Signal zu geben, eine Rezeptor-gebundene Zielzelle oder ein Rezeptor-gebundenes, infektiöses Agens zu zerstören; wobei der intrazelluläre oder Transmembran-Teil von einem T-Zellrezeptor ζ-, η-, CD3-delta- oder T3-gamma-Protein; einem Fc-Rezeptor-γ-Protein oder einem B-Zellrezeptor mb1- oder B29-Protein oder einem funktionellen Derivat davon abgeleitet ist; und
wobei der zweite der Rezeptoren umfaßt: (a) einen extrazellulären Teil, der fähig ist die Zielzelle oder das infektiöse Zielagens spezifisch zu erkennen und zu binden und (b) einen intrazellulären Teil, der von CD28 abgeleitet ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zelle, die wenigstens zwei proteinische, Membran-gebundene chimäre Rezeptoren exprimiert, wobei einer der Rezeptoren umfaßt: (a) einen extrazellulären Teil, in dem der intrazelluläre oder Transmembran-Teil der Zellsignal-transduzierende Teil eines T-Zell-Rezeptorproteins, eines B-Zell-Rezeptorproteins oder eines Fc-Rezeptorproteins oder eines funktionellen Derivats davon ist, und der zweite der Rezeptoren umfaßt: einen extrazellulären Teil, wobei der extrazelluläre Teil des ersten und des zweiten Rezeptors einen HIV-Hülle-bindenden Teil von CD4 oder ein funktionelles HIV-Hülle-bindendes Derivat davon umfaßt, und (b) einen intrazellulären Teil, der von CD28 abgeleitet ist.
Die Erfindung betrifft außerdem eine Zelle, die wenigstens zwei proteinische Membran-gebundene, chimäre Rezeptoren exprimiert, wobei einer der Rezeptoren umfaßt: (a) einen extrazellulären Teil und (b) einen intrazellulären oder Transmembran-Teil, der von einem T-Zellrezeptor CD3-, zeta- oder eta-Polypeptid, einem B-Zellrezeptor oder einem Fc-Rezeptor abgeleitet ist; und
wobei der zweite der Rezeptoren umfaßt: (a) einen extrazellulären Teil, wobei der extrazelluläre Teil des ersten und des zweiten Rezeptors einen HIV-Hülle-bindenden Teil von CD4 oder ein funktionelles HIV-Hülle-bindendes Derivat davon umfaßt, und (b) einen intrazellulären Teil, der von CD28 abgeleitet ist.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Paar proteinischer Membran-gebundener chimärer Rezeptoren, wobei einer der Rezeptoren umfaßt: (a) einen extrazellulären Teil und (b) einen intrazellulären oder Transmembran-Teil, wobei der intrazelluläre oder Transmembran-Teil der signaltransduzierende Teil eines T-Zell-Rezeptorproteins, eines B-Zell-Rezeptorproteins oder eines Fc-Rezeptorproteins oder eines funktionellen Derivats davon ist; und der zweite der Rezeptoren umfaßt: (a) einen extrazellulären Teil, wobei die extrazellulären Teile des ersten und des zweiten Rezeptors einen HIV-Hülle-bindenden Teil von CD4 oder ein funktionelles HIV-Hülle-bindendes Derivat davon umfassen, und (b) einen intrazellulären Teil, der von CD28 abgeleitet ist.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Paar proteinischer Membran-gebundener chimärer Rezeptoren, wobei einer der Rezeptoren umfaßt: (a) einen extrazellulären Teil und (b) einen intrazellulären oder Transmembran-Teil, der von einem T-Zellrezeptor CD3^–, zeta- oder eta-Polypeptid, einem B-Zellrezeptor oder einem Fc-Rezeptor abgeleitet ist; und
der zweite der Rezeptoren umfaßt: (a) einen extrazellulären Teil, wobei die extrazellulären Teile des ersten und des zweiten Rezeptors einen HIV-Hülle-bindenden Teil von CD4 oder ein funktionelles HIV-Hülle-bindendes Derivat davon umfassen, und (b) einen intrazellulären Teil, der von CD28 abgeleitet ist.
In einer anderen Ausführungsform umfaßt das Verfahren zur Lenkung der zellulären Antwort auf ein infektiöses Agens Verabreichen therapeutischer Zellen, die fähig sind, das Agens zu erkennen und zu zerstören, wobei das Agens ein spezifisches Virus, Bakterien, Protozon oder Fungi ist. Noch spezifischer ist das Verfahren gegen Agentien, zum Beispiel HIV und Pneumocystis carinii, gerichtet.
Die Erfindung stellt spezifischer ein Verfahren zur Lenkung der zellulären Antwort auf eine HIV-infizierte Zelle bereit. Das Verfahren umfaßt Verabreichen einer wirksamen Menge an cytotoxischen T-Lymphozyten an einen Patienten, wobei die genannten Lymphozyten fähig sind, Zellen, die mit HIV infiziert sind, sowie im Blutkreislauf zirkulierendes Virus spezifisch zu erkennen und zu lysieren.
So wird in einer Ausführungsform erfindungsgemäß ein Verfahren zur Lenkung der zellulären Antwort auf HIV-infizierte Zellen bereitgestellt, das Verabreichen einer wirksamen Menge an cytotoxischen T-Lymphozyten, die fähig sind, Zellen, die mit HIV infiziert sind, spezifisch zu erkennen und zu lysieren, an einen Patienten umfaßt.
In noch einer anderen Ausführungsform werden die chimären Rezeptorproteine bereitgestellt, welche die cytotoxischen T-Lymphozyten steuern, damit sie die HIV-infizierte Zelle erkennen und lysieren. Noch eine andere Ausführungsform der Erfindung umfaßt Wirtszellen, die mit einem Vektor transformiert sind, welcher die chimären Rezeptoren umfaßt.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung einen Antikörper gegen die chimären Rezeptoren der Erfindung bereit.
Um cytotoxische T-Lymphozyten zu erhalten, welche mit HIV infizierte Zellen spezifisch binden und lysieren, haben die Erfinder Anstrengungen unternommen und stellen hier Rezeptor-Chimäre bereit. Diese chimären Rezeptoren sind funktionell aktiv und besitzen die außerordentliche Fähigkeit, Zellen, die gp120 exprimieren, spezifisch binden und lysieren zu können.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht dann in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Individuen, die mit HIV infiziert sind. Die vorliegende Erfindung stellt somit eine Reihe wichtige Vorteile bei der AIDS-Therapie bereit.
Diese und andere nicht-limitierende Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann aus der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung klar werden.
In der folgenden detaillierten Beschreibung wird auf verschiedene Methodologien Bezug genommen, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie und Immunologie bekannt sind.
Standardwerke, die die allgemeinen Prinzipien der DNA-Rekombinationstechnologie ausführen, umfassen Watson et al., Molecular Biology of the Gene, Band I und II, the Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Herausgeber, Menio Par, CA (1987); Darnell et al., Molecular Cell Biology Scientific American Books, Inc., Hrsg., New York, N.Y. (1986); Lewin, Genes II, John Wiley & Sons, Hrsg., New York, N.Y. (1985); Old et al., Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2. Ausgabe, University of California Press, Hrsg. Berkeley, CA (1981); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Hrsg. Cold Spring Harbor, NY (1989) und Current Protocols in Molecular biology, Ausubel et al., Wiley Press, New York, NY (1989).
Definitionen
Mit "Klonierung" bzw. "Klonieren" ist die Verwendung von in vitro-Rekombinationstechniken zum Insertieren eines besonderen Gens oder einer anderen DNA-Sequenz in ein Vektormolekül gemeint. Um ein gewünschtes Gen erfolgreich zu klonieren, ist es notwendig, Verfahren zur Erzeugung von DNA-Fragmenten zum Anfügen der Fragmente an Vektormoleküle, zur Einführung des zusammengesetzten DNA-Moleküls in eine Wirtszelle, in der es replizieren kann, und zum Selektieren des Klons, der das Targetgen bzw. Zielgen hat, aus den repizienten Wirtszellen zu verwenden.
Mit "cDNA" ist komplementäre oder Kopien-DNA gemeint, die von einer RNA-Matrize durch die Wirkung von RNA-abhängiger DNA-Polymerase (reverse Transkriptase) produziert wird. Somit meint ein "cDNA-Klon" eine doppelsträngige DNA-Sequenz, die zu einem RNA-Molekül von Interesse, das in einem Klonierungsvektor getragen wird, komplementär ist.
Mit "cDNA-Bibliothek" ist eine Sammlung rekombinanter DNA-Moleküle, die cDNA-Inserts enthalten, die DNA-Kopien von mRNA enthalten, die durch die Zelle zur Zeit der cDNA-Bibliothekherstellung exprimiert wird, gemeint. Eine solche cDNA-Bibliothek kann nach Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind und zum Beispiel bei Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra, beschrieben sind. Allgemein ausgedrückt, RNA wird zuerst aus den Zellen eines Organismus, aus dessen Genom ein bestimmtes Gen kloniert werden soll, isoliert. Zum Zwecke der vorliegenden Erfindung sind Säuger- und insbesondere Menschen-Lymphozytenzellinien bevorzugt. Ein derzeit bevorzugter Vektor zu diesem Zweck ist der Vaccinia-Virus-WR-Stamm.
Mit "Vektor" ist ein DNA-Molekül gemeint, das zum Beispiel aus einem Plasmid, Bakteriophagen oder Säuger- oder Insektenvirus stammt, in welches DNA-Fragmente insertiert oder kloniert werden können. Ein Vektor wird eine oder mehrere einmal vorkommende Restriktionsstellen enthalten und kann zur autonomen Replikation in einem definierten Wirt- oder Vehikelorganismus fähig sein, so daß die klonierte Sequenz reproduzierbar ist. Demnach ist mit "DNA-Expressionsvektor" ein beliebiges autonomes Element gemeint, das fähig ist, die Synthese eines rekombinanten Peptids zu steuern. Solche DNA-Expressionsvektoren umfassen bakterielle Plasmide und Phagen und Säuger- und Insekten-Plasmide und Viren.
Mit "im wesentlichen rein" ist eine Verbindung, zum Beispiel ein Protein, ein Polypeptid oder ein Antikörper gemeint, die im wesentlichen frei von den Komponenten ist, die sie natürlicherweise begleiten. Im allgemeinen ist eine Verbindung im wesentlichen rein, wenn wenigstens 60%, bevorzugter wenigstens 75% und am bevorzugtesten wenigstens 90% des gesamten Materials in einer Probe die Verbindung von Interesse ist. Reinheit kann durch ein geeignetes Verfahren gemessen werden, z.B. Säulenchromatographie, Polyacrylamidgelelektrophorese oder HPLC-Analyse. Im Kontext einer Nukleinsäure bedeutet "im wesentlichen rein" eine Nukleinsäuresequenz, ein Nukleinsäuresegment oder -fragment, die/das nicht unmittelbar (d.h. nicht kovalent daran gebunden) auf die beiden der codierenden Sequenzen folgt, denen sie/es im natürlich vorkommenden Genom des Organismus, aus dem die DNA der Erfindung abgeleitet ist, unmittelbar benachbart ist (d.h. eine am 5'-Ende und eine am 3'-Ende).
Mit "funktionelles Derivat" sind die "Fragmente", "Varianten", "Analoga" oder "chemischen Derivate" eines Moleküls gemeint. Ein "Fragment" eines Moleküls, zum Beispiel eine der cDNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung, soll sich auf einem beliebigen Nukleotiduntersatz des Moleküls beziehen. Mit einer "Variante" eines solchen Moleküls ist die Bezugnahme auf ein natürlich vorkommendes Molekül, das im wesentlichen entweder dem gesamten Molekül oder einem Fragment davon ähnlich ist, gemeint. Ein "Analogon" eines Moleküls soll ein nicht-natürliches Molekül bezeichnen, das im wesentlichen entweder dem gesamten Molekül oder einem Fragment davon entspricht. Ein Molekül wird als "im wesentlichen ähnlich" einem anderen Molekül oder "im wesentlichen entsprechend" einem anderem Molekül bezeichnet, wenn die Sequenz der Aminosäuren in beiden Molekülen im wesentlichen dieselbe ist. Eine "im wesentlichen ähnliche" Aminosäuresequenz ist insbesondere eine, die wenigstens 50%, vorzugsweise 85% und am stärksten bevorzugt 95% Aminosäuresequenz-Identität zu der natürlichen oder Referenzsequenz aufweist, und/oder eine, die sich von der natürlichen oder Referenz-Aminosäuresequenz nur durch konservative Aminosäure-Substitutionen unterscheidet. Im wesentlichen ähnliche Aminosäuremoleküle besitzen ähnliche biologische Aktivität. Vorausgesetzt, daß zwei Molekül ähnliche Aktivität besitzen, werden sie als Varianten angesehen, da dieser Ausdruck hierin sogar verwendet wird, wenn eines der Moleküle zusätzliche oder weniger Aminosäurereste, die in dem anderen nicht gefunden werden, enthält, oder wenn die Sequenz der Aminosäurereste nicht identisch ist. Hierin wird ein Molekül als ein "chemisches Derivat" eines anderen Moleküls bezeichnet, wenn es zusätzliche chemische Gruppierungen enthält, die normalerweise nicht Teil des Moleküls sind. Solche Gruppierungen können die Löslichkeit, die Absorption, die biologische Halbwertszeit usw. des Moleküls verbessern. Die Gruppierungen können alternativ die Toxizität des Moleküls verringern, eine unerwünschte Nebenwirkung des Moleküls eliminieren oder abschwächen usw. Gruppierungen, die fähig sind, solche Wirkungen zu vermitteln, sind zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Ausgabe, Mack Publishing Co., Easton, PA (1980) offenbart.
In entsprechender Weise soll ein "funktionelles Derivat" eines chimären Rezeptorgens der vorliegenden Erfindung "Fragmente", "Varianten" oder "Analoga" des Gens einschließen, welche in der Nukleotidsequenz "im wesentlichen ähnlich" sein können und die für ein Molekül codieren, das ähnliche Aktivität besitzt, zum Beispiel T-Zell-Rezeptor-Chimäre, B-Zell-Rezeptor-Chimäre oder Fc-Rezeptor-Chimäre. "Im wesentlichen ähnliche" Nukleinsäure codieren für im wesentlichen ähnliche Aminosäuresequenzen und umfassen auch eine beliebige Nukleinsäuresequenz, die fähig ist, unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen an die Wildtyp-Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren (siehe zum Beispiel Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Press, New York, NY (1989) bezüglich geeigneter Hybridisierungs-Stringens-Bedingungen).
Demnach soll ein chimäres T-Zell-, B-Zell- oder Fc-Rezeptorprotein auch ein beliebiges funktionelles Derivat, funktionelle Fragmente, Varianten, Analoga oder chemische Derivate, die dem "Wildtyp"-Chimären im wesentlichen ähnlich sind und die ähnliche Aktivität besitzen (d.h. am bevorzugtesten 90%, bevorzugter 70%, vorzugsweise 40% oder wenigstens 10% der Aktivität des Wildtyp-Rezeptor-Chimären) umfassen. Die Aktivität eines funktionellen chimären Rezeptorderivats beinhaltet spezifische Bindung (mit seinem extrazellulären Teil) an ein targetiertes Agens oder eine targetierte Zelle und resultierende Zerstörung (gesteuert durch seinen intrazellulären oder Transmembranteil) des Agenzes oder der Zelle; eine derartige Aktivität kann zum Beispiel unter Verwendung eines der hier beschriebenen Assays getestet werden.
Eine DNA-Sequenz, die für die T-Zell-, B-Zell- oder Fc-Rezeptor-Chimären der vorliegenden Erfindung codiert, oder ihre funktionellen Derivate können mit Vektor-DNA nach herkömmlichen Techniken rekombiniert werden. Diese schließen stumpfendige oder versetztendige Termini zur Ligation, Restriktionsenzymverdau unter Bereitstellung geeigneter Termini, Auffüllen von kohäsiven Enden, wenn dies geeignet ist, Behandlung mit alkalischer Phosphatase, um eine unerwünschte Verbindung zu vermeiden und Ligation mit geeigneten Ligasen ein. Techniken für solche Manipulationen werden von Maniatis et al., supra, offenbart und sind auf dem Fachgebiet gutbekannt.
Ein Nukleinsäuremolekül, zum Beispiel DNA, wird als "fähig, zum Exprimieren" bzw. "zur Expression fähig" eines Polypeptids bezeichnet, wenn es Nukleotidsequenzen enthält, die transkriptionale und translationale regulatorische Information enthalten, und derartige Sequenzen sind "funktionell verknüpft" mit Nukleotidsequenzen, die für das Polypeptid codieren. Eine funktionelle Verknüpfung ist eine Verknüpfung, in der die regulatorischen DNA-Sequenzen und die DNA-Sequenz, die exprimiert werden soll, derart verbunden sind, daß eine Genexpression zugelassen wird. Die genaue Natur der regulatorischen Regionen, die zur Genexpression benötigt werden, kann von Organismus zu Organismus variieren, soll aber im allgemeinen eine Promotorregion enthalten, die in Prokaryoten sowohl den Promotor (der die Initiation der RNA-Transkription steuert) wie auch die DNA-Sequenzen, die, wenn sie zu RNA transkribiert werden, die Initiation der Proteinsynthese signalisieren werden, enthalten. Solche Regionen werden normalerweise 5'-nicht-codierende Sequenzen einschließen, die bei der Initiation von Transkription und Translation involviert sind, zum Beispiel die TATA-Box, Verkappungssequenz, CAAT-Sequenz und dgl.
Wenn es gewünscht wird, kann die nicht-codierende Region 3' zu der Gensequenz, die für das Protein codiert, durch die oben beschriebenen Verfahren erhalten werden. Diese Region kann für ihre die transkriptionale Termination regulierenden Sequenzen, zum Beispiel Termination und Polyadenylierung, beibehalten werden. Durch Beibehalten der 3'-Region natürlich benachbart zu der DNA-Sequenz, die für das Protein codiert, können die Transkriptionsterminationssignale bereitgestellt werden. Wenn die Transkriptionsterminationssignale in der Expressions-Wirtszelle nicht zufriedenstellend funktionell sind, dann kann eine 3'-Region, die in der Wirtszelle funktionell ist, substituiert werden.
Zwei DNA-Sequenzen (zum Beispiel eine Promotorregionsequenz und ein T-Zell-Rezeptor-, B-Zell-Rezeptor- oder Fc-Rezeptor-Chimäre-codierende Sequenz) sollen funktionell verknüpft sein, wenn die Natur der Verknüpfung zwischen den zwei DNA-Sequenzen nicht (1) zu der Einführung einer Raster-Verschiebungsmutation führt, (2) die Fähigkeit der Promotorregionsequenz, die Transkription der Rezeptor-Chimären-Gensequenz zu steuern, stört oder (3) die Fähigkeit der Rezeptor-Chimären-Gensequenz, die durch die Promotorregionsequenz zu transkribieren ist, stört. Eine Promotorregion wäre funktionell an eine DNA-Sequenz geknüpft, wenn der Promotor fähig ist, eine Transkription jener DNA-Sequenz durchzuführen. Um das Protein zu exprimieren, sind demnach transkriptionale und translationale Signale notwendig, die von einem geeigneten Wirt erkannt werden.
Die vorliegende Erfindung umfaßt die Expression eines chimären T-Zell-Rezeptor-, B-Zell-Rezeptor- oder Fc-Rezeptor-Proteins (oder eines funktionellen Derivats davon) entweder in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen, obgleich eukaryotische (und insbesondere humane Lymphozyten-) Expression bevorzugt ist.
Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung können durch ein beliebiges einer Vielzahl von Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise können Zellen, die das Rezeptor-Chimären-Protein oder ein funktionelles Derivat davon exprimieren, einem Tier verabreicht werden, um die Produktion von Seren zu induzieren, die polyklonale Antikörper enthalten, welche fähig sind, an das Chimäre zu binden.
In einem bevorzugten Verfahren sind Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung monoklonale Antikörper. Solche monoklonalen Antikörper können unter Verwendung der Hybridomtechnologie hergestellt werden (Kohler et al., Nature 256: 495 (1975); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 292 (1976); Hammerling et al., In: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., S. 563–684 (1981)). Im allgemeinen involvieren solche Verfahren eine Immunisierung eines Tieres mit einem chimären T-Zell-Rezeptor-, B-Zell-Rezeptor- oder Fc-Rezeptor-Antigen. Die Splenocyten von solchen Tieren werden extrahiert und mit einer geeigneten Myelomzellinie fusioniert. Es kann eine beliebige geeignete Myelomzellinie gemäß der Erfindung verwendet werden. Nach Fusion werden die resultierenden Hybridomzellen selektiv in HAT-Medium gehalten und dann durch Begrenzen der Verdünnung kloniert, wie es von Wands et al. (Gastroenterology 80: 225–232 (1981)) beschrieben wurde. Die durch eine solche Selektion erhaltenen Hybridomzellen werden dann untersucht, um Klone zu identifizieren, welche Antikörper sezernieren, die zur Bindung des Chimären geeignet sind.
Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung können auch polyklonale Antikörper oder bevorzugter Region-spezifische polyklonale Antikörper sein.
Antikörper gegen die T-Zell-Rezeptor-, B-Zell-Rezeptor- oder Fc-Rezeptor-Chimären gemäß der Erfindung können eingesetzt werden, um die Menge an chimären Rezeptor (oder chimären Rezeptor-tragenden Zellen) in einem Patienten zu überwachen. Solche Antikörper sind zur Verwendung in immundiagnostischen Standardassays, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, gut geeignet; solche umfassen immunometrische oder "Sandwich"-Assays wie den Vorwärts-Sandwich-, Rückwärts-Sandwich- und den gleichzeitigen Sandwich-Assay. Die Antikörper können in einer beliebigen Anzahl von Kombinationen verwendet werden, was vom Fachmann ohne unnötiges Experimentieren bestimmt wird, um Immunoassays mit akzeptabler Spezifität, Empfindlichkeit und Genauigkeit durchzführen.
Standardwerke, die allgemeine Prinzipien der Immunologie darlegen, umfassen Roitt, Essential Immunology, 6. Aufl., Blackwell Scientific, Publications, Hrsg., Oxford (1988); Kimball, Introduction to Immunolog, 2. Aufl., Macmillan Publishing Co., Hrsg., New Yorik (1986; Roitt et al., Immunolgy Gower Medical Publishing Ltd., Hrsg. London (1985); Campbell, "Monoclonal Antibody Technology", in Burdon et al., Hrsg., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology; Bd. 14, Elsevier, Hrsg., Amsterdam (1984); Klein, Immunology: The Science of Self-Nonself Diescrimination, John Wiley & Sons, Hrsg., New York (1982); und Kennett et al., Hrsg., Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Hrsg., New York (1980).
Mit "Detektieren" soll eine Bestimmung des Vorliegens oder des Fehlens einer Substanz oder Quantifizieren der Menge einer Substanz gemeint sein. Der Ausdruck bezieht sich demnach auf die Verwendung der Materialien, Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung für qualitative und quantitative Bestimmungen.
Die Isolierung von anderen Hybridomen, die monoklonale Antikörper derselben Spezifität wie die oben hierin beschriebenen sezernieren, kann durch die Technik des antiidiotypischen Screenings (Protocmjak et al., Science 215: 1637 (1982)) erreicht werden. Kurz ausgedrückt, ein antiidiotypischer Antikörper ist ein Antikörper, der einzigartige Determinanten, die auf dem Antikörper vorliegen, der durch den Klon von Interesse produziert wird, erkannt. Der antiidiotypische Antikörper wird hergestellt, indem ein Tier desselben Stamms wie er als Quelle für den monoklonalen Antikörper verwendet wurde, mit dem monoklonalen Antikörper von Interesse immunisiert wird. Das immunisierte Tier wird die idiotypischen Determinanten des immunisierenden Antikörpers erkennen und darauf reagieren, indem es Antikörper gegen diese ideotypischen Determinanten (antiidiotypischer Antikörper) produziert.
Zur Replikation können die Hybridzellen sowohl in vitro als auch in vivo kultiviert werden. Eine hohe in vivo-Produktion macht diese derzeit zum bevorzugten Kulturverfahren. Kurz ausgedrückt, Zellen aus den einzelnen Hybridstämmen werden intraperitoneal mit Pristan immunologisch aktivierten BALB/c-Mäuse injiziert, um Aszitisflüssigkeit zu produzieren, die hohe Konzentrationen der gewünschten monoklonalen Antikörper enthält. Monoklonale Antikörper vom Isotyp IgM oder IgG können aus Kulturüberständen unter Verwendung von Säulenchromatographie-Verfahren, die dem Fachmann gutbekannt sind, gereinigt werden.
Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung sind besonders zur Verwendung in Immunoassays geeignet, wo sie in flüssiger Phase oder an einen Festphasenträger gebunden verwendet werden können. Außerdem können die Antikörper in diesen Immunoassays auf verschiedenen Wegen detektierbar markiert sein.
Auf dem Fachgebiet sind viele verschiedene Markierungen und Markierungsverfahren bekannt. Beispiele der Markierungstypen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Enzyme, Radioisotope, fluoreszierende Verbindungen, chemilumineszierende Verbindungen, biolumineszierende Verbindungen und Metallchelate. Der Fachmann wird andere geeignete Markierungen zur Bindung an Antikörper kennen oder wird in der Lage sein, durch Verwendung von Routineexperimenten diese zu ermitteln. Darüber hinaus kann die Bindung dieser Markierungen an Antikörper unter Verwendung von Standardtechniken, die dem Fachmann bekannt sind, erreicht werden.
Einer der Wege, auf dem Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung detektierbar markiert werden können, ist durch Verknüpfung des Antikörpers mit einem Enzym. Dieses Enzym wiederum wird, wenn es später seinem Substrat ausgesetzt wird, mit dem Substrat in einer Art reagieren, daß es eine chemische Gruppierung produziert, welche beispielsweise durch spektralphotometrische oder fluorometrische Mittel detektiert werden kann. Beispiele für Enzyme, die eingesetzt werden können, um Antikörper detektierbar zu markieren, umfassen Malatdehydrogenase, Staphylococcen-Nuklease, delta-V-Steroid-Isomerase, Hefe-Alkohol-Dehydrogenase, alpha-Glycerophosphat-Dehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Biotinavidinperoxidase, Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, Asparaginase, Glucoseoxidase, β-Galactosidase, Ribonuklease, Urease, Katalase, Glucose-VI-phosphatdehydrogenase, Glucoamylase und Acetylcholinesterase.
Das Vorliegen detektierbar markierter Antikörper kann auch detektiert werden, indem die Antikörper mit einem radioaktiven Isotop markiert werden, welches dann durch Mittel wie die Verwendung eines gamma-Zählers oder eines Szintilationszählers bestimmt werden kann. Isotope, die zum Zwecke der vorliegenden Erfindung besonders geeignet sind, sind ³H, ¹²⁵I, ³²P, ³⁵S, ¹⁴C, ⁵¹Cr, ³⁶Cl, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe und ⁷⁵Se.
Es ist auch möglich, die Bindung von detektierbar markierten Antikörpern zu detektieren, indem die Antikörper mit einer fluoreszierenden Verbindung markiert werden. Wenn ein fluoreszierend markierter Antikörper Licht der geeigneten Wellenlänge ausgesetzt wird, kann sein Vorliegen infolge der Fluoreszenz des Farbstoffs detektiert werden. Unter den am häufigsten verwendeten fluoreszierenden Markierungsverbindungen sind Fluoreszein, Isothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthaldehyd und Fluorescamin.
Die Antikörper der Erfindung können auch unter Verwendung fluoreszenzimittierender Metalle wie zum Beispiel ¹⁵²Eu oder andere der Lanthanidreihe detektierbar markiert werden. Diese Metalle können an das Antikörpermolekül gebunden werden, indem solche Metallchelat-bildenden Gruppen wie Diethylenteriaminpentaessigsäure (DTPA) oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) verwendet werden.
Antikörper können auch detektierbar markiert werden, indem sie an eine chemilumineszierende Verbindung gekoppelt werden. Das Vorliegen eines chemilumineszent markierten Antikörpers wird dann bestimmt, indem das Vorliegen von Lumineszenz, die im Verlauf der chemischen Reaktion auftritt, detektiert wird. Beispiele für besonders geeignete chemilumineszierende Markierungsverbindungen sind Luminal, Isoluminol, theromatischer Acridiumester, Imidazol, Acridiniumsalze, Oxalatester und Dioxetan.
In gleicher weise kann eine biolumineszierende Verbindung verwendet werden, um die Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung zu markieren. Biolumineszenz ist ein Chemilumineszenz-Typ, der in biologischen Systemen gefunden wird, in denen ein katalytisches Protein die Effizienz der chemilumineszierenden Reaktion erhöht. Das Vorliegen eines biolumineszierenden Antikörpers wird durch Detektieren des Vorliegens von Lumineszenz bestimmt. Bedeutende biolumineszierende Verbindungen zu Zwecken der Markierung umfassen Luciferin und Luciferase-Aequorin.
Die Antikörper und das im wesentlichen gereinigte Antigen der vorliegenden Erfindung sind idealerweise zur Herstellung eines Kits geeignet. Ein derartiger Kit kann ein Trägermittel umfassen, das in Kompartimente eingeteilt ist, um in engem Confinement ein Trägermittel oder mehrere Trägermittel, zum Beispiel Phiolen, Röhrchen und dgl., aufzunehmen, wobei jedes der Behältermittel die getrennten Elemente des Assays, die zu verwenden sind, umfaßt.
Es gibt viele Assaytypen, die in Kitform gearbeitet sein können, und diese umfassen zum Beispiel kompetitive und nicht-kompetitive Assays. Typische Beispiele für Assays, die die Antikörper der Erfindung verwenden können, sind Radioimmunoassays (RIA), Enzymimmunoassays (EIA), Enzymgekoppelte Immunabsorptionsbestimmung (ELISA) und immunometrische oder Sandwich-Immunoassays.
Der Ausdruck "immunometrischer Assay" oder "Sandwich-Immunoassay" soll gleichzeitigen Sandwich-, Vorwärts-Sandwich- und Rückwärts-Sandwich-Immunoassay einschließen. Diese Ausdrücke sind dem Fachmann geläufig. Der Fachmann wird auch erkennen, daß Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung in anderen Assay-Variationen und Formen einsetzbar sein werden, die derzeit bekannt sind oder die in der Zukunft entwickelt werden. Diese sollen im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sein.
In der bevorzugten Art zur Durchführung der Assays ist es wichtig, daß bestimmte "Blocker" im Inkubationsmedium vorliegen (üblicherweise mit dem markierten löslichen Antikörper versetzt). Die "Blocker" werden zugesetzt, um sicherzustellen, daß nicht-spezifische Proteine, Protease oder humane Antikörper gegen Maus-Immunglobuline, die in der experimentellen Probe vorliegen, nicht mit den Antikörpern am Festphasenträger oder dem markierten Indikatorantikörper vernetzen oder diese zerstören, was zu falsch positiven oder falsch negativen Resultaten führt. Die Selektion von "Blockern" trägt daher wesentlich zu der Spezifität der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Assays bei.
Es wurde gefunden, daß eine Reihe nicht-relevanter (d.h. nicht-spezifischer) Antikörper derselben Klasse oder Unterklasse (Isotyp) wie die, die in den Assays verwendet werden, (z.B. IgG₁, IgG_2a, IgM usw.) als "Blocker" eingesetzt werden können. Die Konzentration der "Blocker" (normalerweise 1–100 μg/μl) ist von Bedeutung, um die richtige Empfindlichkeit aufrecht zu erhalten, aber unerwünschte Interferenz durch wechselseitig auftretende kreuzreaktive Proteine in humanem Serum zu inhibieren. Außerdem muß das Puffersystem, das die "Blocker" enthält, optimiert werden. Bevorzugte Puffer sind die, die auf schwachen organischen Basen basieren, zum Beispiel Imidazol, HEPPS, MOPS, TES, ADA, ACES, HEPES, PIPES, TRIS und dgl. mit physiologischen pH-Bereichen. Etwas weniger bevorzugte Puffer sind anorganische Puffer wie zum Beispiel Phosphat, Borat oder Carbonat. Dem Puffer, der die "Blocker" enthält, werden schließlich vorzugsweisee bekannte Protease-Inhibitoren zugesetzt (normalerweise mit 0,01–10 μg/ml).
Es gibt viele Festphasen-Immunadsorbentien, die verwendet werden und die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können. Gutbekannte Immunadsorbentien umfassen, Glas, Polystyrol, Polypropylen, Dextran, Nylon und andere Materialien in Form von Röhrchen, Perlen und Mikrotiterplatten, die aus solchen Materialien geformt oder mit solchen Materialien beschichtet sind, und dgl. Die immobilisierten Antikörper können entweder kovalent oder physikalisch an das Festphasen-Immunadsorbens gebunden sein, zum Beispiel durch Techniken wie kovalente Bindung über Amid- oder Ester-Verknüpfung oder durch Absorption. Der Fachmann wird viele andere geeignete Festphasen-Immunadsorbentien und Verfahren zur Immobilisierung von Antikörpern daran kennen oder wird fähig sein, solche durch nicht mehr als Routineexperimente zu ermitteln.
Zur in-vivo-, in-vitro- oder in-situ-Diagnose können Markierungen wie zum Radionuklide an Antikörper gemäß der Erfindung entweder direkt oder unter Verwendung einer funktionellen Zwischengruppe gebunden werden. Eine Zwischengruppe, die oft verwendet wird, um Radioisotope, welche als metallische Kationen existieren, an Antikörper zu binden, ist Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA). Typische Beispiele für metallische Kationen, die auf diese Art gebunden werden, sind: ^99mTc, ¹²³I, ¹¹¹In, ¹³¹I, ⁹⁷Ru, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga und ⁶⁸Ga. Die Antikörper der Erfindung können zu Diagnosezwecken mit nicht-radioaktiven Isotopen markiert werden. Elemente, die auf diese Weise besonders nützlich sind, sind ¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn, ¹⁶²Dy, ⁵²Cr und ⁵⁶Fe.
Das Antigen der Erfindung kann in im wesentlichen reiner Form isoliert werden, indem Antikörper gemäß der Erfindung verwendet werden. Somit stellt eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung im wesentlichen reine T-Zell-Rezeptor-, B-Zell-Rezeptor- oder Fc-Rezeptor-Chimäre bereit, wobei das Antigen dadurch gekennzeichnet ist, daß es durch Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung erkannt wird und an diese bindet. In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Isolierung oder Reinigung des chimären Rezeptor-Antigens bereit, indem ein Komplex des Antigens mit einem Antikörper oder mehreren Antikörpern, der/die gegen das Rezeptor-Chimäre gerichtet sind, gebildet wird.
Die im wesentlichen reinen T-Zell-Rezeptor-, B-Zell-Rezeptor- oder Fc-Rezeptor-Chimären-Antigene der vorliegenden Erfindung können wiederum verwendet werden, um einen Antikörper auf das Chimäre in einer Probe, zum Beispiel Serum oder Urin, zu detektieren oder zu messen. Somit umfaßt eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Detektieren des Vorliegens oder der Menge von Antikörper gegen das T-Zell-Rezeptor-, B-Zell-Rezeptor- oder FC-Rezeptor-Chimären-Antigen in einer Probe, umfassend Inkontaktbringen einer Probe, die einen Antikörper gegen das chimäre Antigen enthält, mit detektierbar markiertem Rezeptor-Chimären und Detektieren der Markierung. Es wird einzusehen sein, daß auch immunreaktive Fraktionen und immunreaktive Analoga des Chimären eingesetzt werden können.
Mit dem Ausdruck "immunreaktive Fraktion" ist ein beliebiger Teil des chimären Antigens gemeint, der eine äquivalente Immunantwort auf einen Antikörper zeigt, welcher gegen die Rezeptorchimäre gerichtet ist. Mit dem Ausdruck "immunreaktives Analogon" ist ein Protein gemeint, das sich von dem Rezeptor-Chimärenprotein durch eine Aminosäure oder mehrere Aminosäuren unterscheidet, das aber eine äquivalente Immunantwort auf einen Antikörper der Erfindung zeigt.
Mit "spezifisch erkennt und bindet" ist gemeint, daß der Antikörper das chimäre Rezeptor-Polypeptid erkennt und bindet, aber andere nicht-verwandte Moleküle in einer Probe, zum Beispiel in einer biologischen Probe, im wesentlichen nicht erkennt.
Mit "autoimmun-erzeugte Zelle" sind Zellen gemeint, die Antikörper produzieren, welche mit derm Wirtsgewebe oder mit Immuneffektor-T-Zellen, die autoreaktiv sind, reagieren; solche Zellen umfassen Antikörper gegen Acetylcholin-Rezeptoren (die z.B. Myasthenia gravis führen) oder Anti-DNA-, Anti-Eryrhrozyten- und Anti-Thrombozyten-Autoantikörper (die z.B. zu Lupus erythematodes führen).
Mit "therapeutische Zelle" ist eine Zelle, die durch ein Chimäres der Erfindung so transformiert wurde, daß sie fähig ist, ein spezifisches infektiöses Agens zu erkennen und zu zerstören, eine Zelle, die durch ein spezifisches Agens infiziert ist, eine Tumor- oder Krebszelle oder eine autoimmun erzeugte Zelle gemeint; solche therapeutischen Zellen sind vorzugsweise Zellen des hämatopoetischen Systems.
Mit "infektiöses Targetagens" bzw. "infektiöses Zielgagens" ist ein beliebiges infektiöses Agens gemeint (z.B. ein Virus, Bakterium, Protozoon oder Fungus), das durch eine einen chimären Rezeptor-tragende therapeutische Zelle erkannt werden kann. Mit "Targetzelle" bzw. "Zielzelle" ist eine beliebige Wirtszelle gemeint, die durch eine chimären Rezeptor tragende therapeutische Zelle erkannt werden kann; Zielzellen umfassen, ohne Beschränkung, Wirtszellen, die mit einem Virus, Bakterium, Protozoon oder Fungus infiziert sind, wie auch Tumor- oder Krebszellen oder autoimmun erzeugte Zellen.
Mit "extrazellulär" ist gemeint, daß wenigstens ein Teil des Moleküls an der Zelloberfläche freiliegt. Mit "intrazellulär" ist gemeint, daß wenigstens ein Teil des Moleküls dem Cytoplasma der therapeutischen Zelle ausgesetzt ist. Mit "Transmembran" ist gemeint, daß wenigstens ein Teil des Moleküls sich durch die Plasmamembran erstreckt. Ein "extrazellulärer Teil", ein "intrazellulärer Teil" und ein "Transmembranteil" können, so wie die Begriffe hierin verwendet werden, flankierende Aminosäuresequenzen umfassen, welche sich in die benachbarten zellulärten Kompartimente erstrecken.
Mit "Oligomerisieren" ist gemeint, mit anderen Proteinen unter Bildung von Dimeren, Trimeren, Tetrameren oder Oligomeren höherer Ordnung Komplexe zu bilden. Solche Oligomere können Homooligomere oder Heterooligomere sein. Ein "oligomerisierender Teil" ist die Region eines Moleküls, die die Komplex (d.h. Oligomer)-Bildung steuert.
Mit "cytolytisch" ist gemeint, fähig zu sein, eine Zelle zu zerstören (z.B. eine Zelle, die mit einem Pathogen infiziert ist, eine Tumor- oder Krebszelle, oder eine autoimmun erzeugte Zelle) zu zerstören oder fähig zu sein, ein infektiöses Agens (z.B. ein Virus) zu zerstören.
Mit "Immundefizienzvirus" ist ein Retrovirus gemeint, das in Wildtypform fähig ist, T4-Zellen eines Primatenwirts zu infizieren, und das eine virale Morphogenese und Morphologiecharakteristika der Lentivirus-Unterfamilie besitzt. Der Ausdruck umfaßt ohne Beschränkung alle Varianten von HIV und SIV, einschließlich HIV-1, HIV-2, SIVmac, SIVagm, SIVmnd, SIVsmm, SIVman, SIVmand und SIVcpz.
Mit "MHC-unabhängig" ist gemeint, daß die zelluläre cytolytische Antwort kein Vorliegen eines MHC-Klasse II-Antigens an der Oberfläche der targetierten Zelle erfordert.
Mit "funktionelles cytolytische Signal-transduzierendes Derivat" ist ein funktionelles Derivat (wie oben definiert) gemeint, das fähig ist, wenigstens 10%, vorzugsweise 40%, bevorzugter 70% am bevorzugtesten wenigstens 90% der biologischen Aktivität des Wildtyp-Moleküls, zu steuern. Der hierin verwendete Ausdruck ein "funktionelles cytolytisches Signal-transduzierendes Derivat" kann wirken, indem der therapeutischen Zelle direkt signalisiert wird, ein Rezeptorgebundenes Agens oder eine Zelle zu zerstören (z.B. im Fall eines intrazellulären chimären Rezeptorteils) oder kann indirekt wirken, indem eine Oligomerisierung mit cytolytisches Signal-transduzierenden Proteinen der therapeutischen Zelle (z.B. im Fall einer Transmembrandomäne) begünstigt wird. Solche Derivate können beispielsweise unter Verwendung der hierin beschriebenen in vitro-Assays auf Wirksamkeit getestet werden.
Mit "ein funktionelles HIV-Hülle-bindendes Derivat" ist ein funktionelles Derivat (wie oben definiert) gemeint, das fähig ist ein beliebiges HIV-Hüllprotein zu binden. Funktionelle Derivate können zum Beispiel unter Verwendung der hierin beschriebenen in vitro-Assays identitiziert werden.
Therapeutische Verabreichung
Die transformierten Zellen der vorliegenden Erfindung können für die Therapie einer Reihe von Krankheiten verwendet werden. Gängige Verfahren zur Verabreichung von solchen transformierten Zellen umfassen adoptive Immuntherapie oder Zelltransfertherapie. Diese Verfahren erlauben die Rückführung der transformierten Immunsystemzellen in den Blutstrom. Rosenberg, Sci. Am. 62 (Mai 1990); Rosenbert et al., New Engl. J. Med. 323: 570 (1990).
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können einem beliebigen Tier verabreicht werden, das die günstigen Wirkungen der erfindungsgemäßen Verbindungen erfahren kann. Solche Tiere sind vor allem Menschen, obgleich die Erfindung nicht auf diese beschränkt werden soll.
Detaillierte Beschreibung
Zuerst werden die Zeichnungen beschrieben.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A stellt die Aminosäuresequenz etwa der Fusionsstelle zwischen CD4 (Reste 1-369) und verschiedenen Rezeptorketten (SEQ ID NOS.: 28-31) dar. Die unterstrichene Sequenz zeigt die Position der Aminosäuren, die innerhalb der BamHI-Stelle codiert werden, die zur Fusionskonstruktion verwendet wird. Der Anfang der Transmembrandomäne ist mit einem senkrechten Strich markiert. Die η-Sequenz ist am Aminterminus identisch der ζ-Sequenz, unterscheidet sich aber am Carboxyl-Terminus (Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3319–3323 (1990)). 1B zeigt die strömungscytometrische Analyse der Oberflächenexpression von CD4, CD4:ζ, CD4:γ und CD4:η in CV1-Zellen. Zellen wurden mit Virus infiziert, der CD4-Chimäre oder CD16_PI exprimiert, für 9 Stunden bei 37°C inkubiert und mit Phycoerythrin-konjugiertem Anti-CD4-MAb Leu3A gefärbt.
2 zeigt die Oberflächenexpression von CD16_TM nach Coinfektion, von CD16_TM allein (ausgefüllte Punkte) oder coinfiziert mit Virus, das CD4:γ exprimiert (gestrichelt) oder CD4:ζ exprimiert (durchgezogene Linie). Spärliche Punkte, Zellen, die mit CD4:ζ allein ifiziert sind, gefärbt mit 3G8 (Fleit et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 3275–3279 (1982)) (anti-CD16-MAb).
3 zeigt die Oberflächenexpression von CD16_TM nach Coinfektion durch Viren, die CD16_TM und die folgenden ζ-Chimären exprimieren; CD4:ζ (dicke Linie), CD4:ζ C11G (durchgezogene Linie); CD4:ζ (gestrichelte Linie); CD4:ζ C11G/D15G (dichte Punkte); keine Coinfektion (CD16_TM allein, spärliche Punkte). Zellen wurden mit Anti-CD16-MAb 3G8 und Phycoerythrin-konjugierten Fab'₂-Ziege-Antikörpern auf Maus-IgG inkubiert. Der Expressionslevel der ζ-Chimären war für die verschiedenen untersuchten Mutanten im wesentlichen identisch und eine Coinfektion von Zellen mit Viren, die CD16_TM und ζ-Chimäre exprimieren, veränderte die Oberflächenexpression der Chimären nicht merklich.
4A–D zeigen erhöhtes intrazelluläres freies Calciumion nach Vernetzung von mutanten ζ-Chimären in einer T-Zellinie. Jurkat E6-Zellen (Weise et al., J. Immunol. 133: 123–128 (1984)) wurden mit rekombinanten Vaccinia-Viren infiziert und durch Strömungscytometrie analysiert. Die dargestellten Resultate sind für die "gated CD4⁺-Population, so daß nur Zellen, die das relevante chimäre Protein exprimieren, analysiert werden. Das mittlere Verhältnis von violetter zu blauer Indo-1-Fluoreszenz gibt die Konzentration an interzellulärem freien Calcium in der Population als ganzes an und der Prozentwert der reagierenden Zellen gibt die Fraktion an Zellen wider, die ein vorbestimmtes Grenzverhältnis bzw. Schwellenverhältnis übersteigen (eingestellt, so daß 10% der unbehandelten Zellen positiv sind). 4A und 4B zeigen Jurkat-Zellen, die CD4:ζ (durchgezogene Linie) oder CD16:ζ (gestrichelte Linie) exprimieren, die Anti-CD4-MAb Leu3a (Phycoerythrin-Konjugat) ausgesetzt wurden, gefolgt von einer Vernetzung mit Ziege-Antikörper gegen Maus-IgG. Die gepunktete Linie zeigt die Reaktion von nicht-infizierten Zellen auf Anti-CD3-MAb OKT3). 4C und 4D zeigen Jurkat-Zellen, die CD4:ζD15G (durchgezogene Linie); CD4:ζC11G/D15G (gestrichelt); oder CD4:ζC11G (Punkte) exprimieren, welche wie bei den 4A und 4B behandelt und analysiert worden waren.
5A–C zeigen, daß CD4:ζ-, CD4:η- und CD4:γ-Rezeptoren es ermöglichen, daß cytolytische T-Lymphozyten (CTL) Targets abtöten, die HIV-1-gp120/41 exprimieren. 5A: ausgefüllte Kreise, CTL, die CD4:ζ exprimieren inkubiert mit HeLa-Zellen, die gp120/41 exprimieren; nicht-ausgefüllte Kreise, CTL, die CD4:ζ exprimieren, inkubiert mit nicht-infizierten HeLa-Zellen; ausgefüllte Quadrate, nicht-infizierte CTL, inkubiert mit HeLa-Zellen, die gp120/41 exprimieren; nicht-ausgefüllte Quadrate, nicht-ifizierte CTL, inkubiert mit nicht-infizierten HeLa-Zellen. 5B: ausgefüllte Kreise, CTL, die CD4:η exprimieren, inkubiert mit HeLa-Zellen, die gp120/41 exprimieren; nicht-ausgefüllte Kreise, CTL, die CD4:γ exprimieren, inkubiert mit HeLa-Zellen, die gp120/41 exprimieren; nicht-ausgefüllte Quadrate, CTL, die das C11G/D15G-Doppelmutanten-CD4:ζ-Chimäre exprimieren, inkubiert mit HeLa-Zellen, die gp120/41 exprimieren. 5C: strömungscytometrische Analyse der CD4-Expression durch die CTL, die in 5B eingesetzt wurden. Um die Target- bzw. Ziel-zu-Effektor-Verhältnisse zu korrigieren, wurde der prozentuale Anteil der Zellen, die das CD4-Chimäre exprimieren, bestimmt, indem die "scaled" negative (nicht-infizierte) Population durch Histogramm-Übereinanderlegen substrahiert wurde; zu Vergleichszwecken wurde in dieser Figur den nicht-infizierten Zelle eine willkürliche Schwelle zugeordnet, die grob dieselbe Fraktion positiv für die anderen Zellpopulationen gibt, wie es eine Histogrammsubtraktion ergeben würde.
6A–B zeigen die Spezifität von CD4-gerichteter Cytolyse. 6A: ausgefüllte Kreise, CTL, die CD4:ζ exprimieren, inkubiert mit HeLa-Zellen, die CD16_PI exprimieren; nicht-ausgefüllte Kreise, CTL, die CD4 exprimieren, inkubiert mit HeLa-Zellen, die gp120 exprimieren; ausgefüllte Quadrate, CTL, die CD16:ζ exprimieren, inkubiert mit HeLa-Zellen, die gp120/41 exprimieren; nicht-ausgefüllte Quadrate, CTL, die CD16_PI exprimieren, inkubiert mit HeLa-Zellen, die gp120/41 exprimieren. 6B: ausgefüllte Kreise, CTL, die CD4:ζ exprimieren, inkubiert mit Raji (MHC-Klasse-II⁺)-Zellen; offene Kreise, nicht-infizierte CTL-Zellen, inkubiert mit RJ2.2.5 (MHC-Klasse II^–-Raji-Mutanten)-Zellen; ausgefüllte Quadrate, nicht-infizierte CTL, inkubiert mit Raji (MHC-Klasse-II⁺)-Zellen; nicht-ausgefüllte Quadrate CTL, die CD4:ζ exprimieren, inkubiert mit RJ2.2.5 (MHC-Klasse II^–)-Zellen. Die Ordinatenskala ist erweitert.
7A–B zeigt eine Charakterisierung des CD16:ζ-chimären Rezeptors. 7A ist ein schematisches Diagramm des CD16:ζ-Fusionsproteins. Der extrazelluläre Teil der Phosphatidylinositol-verknüpften Form von monomerem CD16 wurde genau außerhalb der Transmembrandomäne an dimeres ζ gebunden. Die Proteinsequenz an der Fusionsverbindung ist am Boden gezeigt (SEQ ID NOS: 32, 33). 7B zeigt eine strömungscytometrische Analyse der Calciummobilisierung nach Vernetzung des CD16:ζ-Chimären entweder in einer TCR-positiven oder TCR-negativen Zellinie. Es ist das mittlere Verhältnis von violetter zu blauer Fluoreszenz (ein Maß für die relative Calciumionenkonzentration) unter Zellpopulationen, die mit Antikörpern behandelt worden waren, zur Zeit 0 gezeigt. Ausgefüllte Quadrate, die Reaktion von Jurkat-Zellen auf anti-CD3-MAb OKT3; ausgefüllte Dreiecke, die Reaktion von CD16:ζ auf Anti-CD16-MAb 3G8-Vernetzung in der REX33A TCR^–-Mutante; nicht-ausgefüllte Quadrate, die Antwort auf CD16:ζ-Vernetzung in der Jurkat TCR^–-Mutantenlinie JRT3.T3.5; nicht-ausgefüllte Dreiecke, die Antwort auf CD16:ζ-Vernetzung in Jurkat-Zellen; Kreuze, die Antwort auf nicht-chimäres CD16 in Jurkat-Zellen; und Punkte, die Antwort auf nicht-chimäres CD16 in der REX33A TCR^–-Zellinie.
8A–B zeigt die Deletionsanalyse des cytolytischen Potentials. 8A zeigt die Stellen der ζ-Deletionsendpunkte. Hier wie anderswo werden Mutationen in ζ durch die ursprüngliche Rest-Lage-Mutantenrest-Konvention dargestellt, so daß D66* zum Beispiel den Ersatz von Asp-66 durch ein Terminationscodon bezeichnet. 8B zeigt die Resultate des Cytolyse-Assays von nicht-deletiertem CD16:ζ und hervorstechenden ζ-Deletionen. Hybridomzellen, die Oberflächenantikörper gegen CD16 exprimieren, wurden mit ⁵¹Cr beladen und mit steigenden Zahlen humaner cytolytischer Lymphozyten (CTL) inkubiert, welche mit Vaccinia-Rekombinanten infiziert waren, die CD16:ζ-Chimäre exprimieren. Der prozentuale Anteil an ⁵¹Cr, der freigesetzt wird, wird als Funktion des Effektor (CTL)-zu-Target (Hybridom)-Zell-Verhältnisses (E/T) aufgetragen. Ausgefüllte Kreise, Cytolyse vermittelt durch Zellen, die CD16:ζ exprimieren (mfi 18.7); ausgefüllte Quadrate, Cytolyse, vermittelt durch Zellen, die CD16:ζ Asp66* exprimieren, (mfi 940.2); nicht-ausgefüllte Quadrate, Cytolyse, vermittelt durch Zellen, die CD16:ζGlu60* exprimieren (mfi 16.0); nicht-ausgefüllte Kreise, Cytolyse vermittelt durch Zellen, die CD16:ζTyr51* exprimieren (mfi 17,4); ausgefüllte Dreiecke, Cytolyse, vermittelt durch Zellen, die CD16:ζPhe34* exprimieren (mfi 17.8); und nicht-ausgefüllte Dreiecke, Cytolyse, vermittelt durch Zellen, die nicht-chimäres CD16 exprimieren (mfi 591). Obgleich in diesem Experiment die Expression von CD16:ζAsp66* nicht der der anderen Fusionsproteine entsprach, führte die Cytolyse durch Zellen, die CD16:ζ mit äquivalenten Leveln exprimieren, in demselben Experiment zu Resultaten, die im wesentlichen mit denen identisch sind, die von Zellen gezeigt werden, welche CD16:ζAsp66 exprimieren.
9A–D zeigt, daß die Eliminierung des Potentials für Transmembranwechselwirkungen ein kurzes ζ-Segment zeigt, das fähig ist, Cytolyse zu vermitteln. 9A ist ein schematisches Diagramm der monomeren zweiteiligen und dreiteiligen Chimären. Oben ist das CD16:ζ-Konstrukt, das am Rest 65 verkürzt ist und dem die Transmembranreste Cys und Asp fehlen. Unten sind die CD16:CD5:ζ- und CD16:CD7:ζ-Konstrukte und verwandte Kontrollen. Die Peptidsequenzen der intrazellulären Domänen werden unten gezeigt (SEQ ID NOS: 35-37). 9B zeigt die cytolytische Aktivität von monomeren chimären Deletionmutanten. Die cytolytische Aktivität von Zellen, die CD16:ζ exprimieren (ausgefüllte Kreise; mfi 495), wurde mit der von Zellen, die CD16:ζAsp66* exprimieren (ausgefüllte Quadrate; mfi 527), oder den Mutanten CD16:ζCys11Gly/Asp15Gly/Asp66* (nicht-ausgefüllte Quadrate; mfi 338) und CD16:ζCys11Gly/Asp15Gly/Glu60* (ausgefüllte Dreiecke; mfi 259) verglichen. 9C zeigt die cytolytische Aktivität, vermittelt durch dreiteilige Fusionsproteine. Ausgefüllte Dreiecke, CD16:ζAsp66*; nicht-ausgefüllte Quadrate, CD16:5:ζ(48-65); ausgefüllte Quadrate, CD16:7:ζ(48-65); nicht-ausgefüllte Dreiecke, CD16:7:ζ(48-59); nicht-ausgefüllte Kreise, CD16:5; ausgefüllte Kreise, CD16:7. 9D zeigt die Calciummobilisierung durch Mutante und dreiteilige Chimäre in der TCR-negativen Jurkat JRT3.T3.5-Mutanten-Zellinie. Nicht-ausgefüllte Kreise, Reaktion von Zellen, die dimeres CD16:ζAsp66* exprimieren; ausgefüllte Quadrate, Reaktion von Zellen, die CD16:ζCys11Gly/Asp15Gly/Asp66* exprimieren; nicht-ausgefüllte Quadrate, Antwort von Zellen, die CD16:ζCys11Gly/Asp15Gly/Glu60* exprimieren; ausgefüllte Dreiecke, Antwort von Zellen, die CD16:7:ζ(48-65) exprimieren und nicht-ausgefüllte Dreiecke, Antwort von Zellen, die CD16:ζ(48-59)exprimieren.
10A–F zeigt den Beitrag von einzelnen Aminosäuren zu der Aktivität des das cytolytische Signal-transuzierenden Motivs mit 18 Resten. 10A und 10B zeigen zytolytische Aktivität und 10C zeigt die Calciumionenmobilisierung, die durch Chimäre vermittelt wird, welche Punktmutationen in der Nähe des Carboxy-terminalen Tyrosin (Y62) tragen. 10A und 10B stellen Daten dar, die an Zellen gesammelt wurden, die niedrige bzw. hohe Mengen der CD16:ζ-Fusionsproteine exprimieren. Identische Symbole werden für die Calciummobilisierungs- und Cytolyse-Assays verwendet und sind auf der rechten Seite im Einbuchstabencode angegeben. Ausgefüllte Kreise, Zellen, die CD16:ζ exprimieren, (mfi in A, 21; B, 376); ausgefüllte Quadrate, Zellen, die CD16:7:ζ(48-65) exprimieren, (mfi A, 31; B, 82); nicht ausgefüllte Quadrate, CD16:7:ζ(48-65)Glu60Gln (mfi A, 33; B, 92), Kreuze, CD16:7:ζ(48-65)Asp63Asn (mfi A, 30; B, 74); ausgefüllte Dreiecke, CD16:7:ζ(48-65)Tyr62Phe (mfi A, 24; B, 88); nicht-ausgefüllte Kreise, CD16:7:ζ(48-65)Glu61Gln (mfi A, 20; B, 62) und nicht-ausgefüllte Dreiecke, CD16:7:ζ(48-65)Tyr62Ser (mfi B, 64). 10D und 10E zeigen die cytolytische Aktivität und 10F zeigt die Calciumionenmobilisierung durch Chimäre, die Punktmutationen in der Nähe des aminoterminalen Tyrosins (Y51) zeigen. Identische Symbole werden für den Calciummobilisierungs- und Cytolyse-Assay verwendet und sind an der rechten Seite angegeben. Ausgefüllte Kreise, Zellen, die CD16:ζ exprimieren, (mfi in D, 21.2; in E, 672); ausgefüllte Quadrate, Zellen, die CD16:7:ζ(48-65) exprimieren, (mfi D, 31,3; E, 179); ausgefüllte Dreiecke, CD16:7:ζ(48-65)Asn48Ser (mfi D, 22.4; E, 209); nicht-ausgefüllte Quadrate, CD16.7:ζ(48-65)Leu50Ser (mfi D, 25.0; E, 142) und nicht-ausgefüllte Dreiecke CD16:7:ζ(48-65)Tyr51Phe (mfi D, 32.3; E, 194).
11A–B zeigen eine Anordnung von internen Wiederholungen von ζ und einen Vergleich ihrer Fähigkeit, die Cytolyse zu unterstützen. 11A ist ein schematisches Diagramm von Chimären, die durch Aufteilen der intrazellulären ζ-Domäne in Drittel und Anhängen dieser an die Transmembrandomäne eines CD16:7-Chimären gebildet werden. Die Sequenzen der intrazellulären Domänen sind unten gezeigt (SEQ ID NOS: 38-40), wobei gemeinsame Reste eingekastelt sind und verwandte Reste mit Sternen gekennzeichnet sind. 11B zeigt die cytolytische Wirksamkeit der drei ζ-Subdomänen. Ausgefüllte Kreise, Zellen, die CD16:ζ exprimieren (mfi 476); ausgefüllte Quadrate, CD16::7:ζ(33-65) (mfi 68); nicht-ausgefüllte Quadrate CD16::7:ζ(71-104) (mfi 114) und ausgefüllte Dreiecke, CD16::7:ζ(104-138) (mfi 104).
12 ist eine schematische Darstellung der CD16:FcRγII-Chimären.
13A–B zeigt Calciummobilisierung nach Vernetzung von CD4:FcRγII- und CD16:FcRγII-Chimären. 13A zeigt das Verhältnis von violetter zu blauer Fluoreszenz, die von Zellen emittiert wird, welche mit dem Calcium-empfindlichen Fluorphor Indo-1 beladen sind als Funktion der Zeit nach Verknüpfung der extrazellulären CD16-Domäne mit Antikörpern. 13B zeigt eine ähnliche Analyse der Zunahme beim Verhältnis von violetter zu blauer Fluoreszenz bei Zellen, die CD4:FcRγII-Chimäre tragen, nach Vernetzung mit Antikörpern.
14A–B zeigt Cytolyse-Assays von CD4:FcRγII- und CD16:FcRγII-Chimären. 14A zeigt den prozentualen Anteil an ⁵¹Cr, das aus anti-CD16-Hybridom (Target)-Zellen freigesetzt wird, wenn die Zellen erhöhten Zahlen cytotoxischer T-Lymphozyten ausgesetzt werden, welche CD16:FcRγII-Chimäre exprimieren (Effektorzellen). 14B zeigt eine ähnliche Analyse der Cytotoxizität, vermittelt durch CD4:FcRγII-Chimäre gegen Targetzellen, die HIV-Hüll-Glycoproteine exprimieren.
15A–E zeigt eine Identifizierung von Resten im FcRγII-A-Schwanz, die für eine Cytolyse wichtig sind. 15A ist ein schematisches Diagramm der Deletionskonstrukte. 15B und 15C zeigen Calciummobilisierung und Cytolyse durch Carboxyterminale Deletionsvarianten von CD16:FcRγII A. 15D und 15E zeigen Calciummobilisierung und Cytolyse durch dreiteilige Chimären, die progressiv weniger des Aminterminus des intrazellulären Schwanzes von CD16:FcRγII A tragen.
16 (SEQ ID NO: 24) zeigt die Aminosäuresequenz des CD3-delta-Rezeptorproteins; die eingerahmte Sequenz stellt einen bevorzugten cytolytisches Signal-transduzierenden Teil dar.
17 (SEQ ID NO: 25) zeigt die Aminosäuresequenz des T3-gamma-Rezeptorproteins; die eingerahmte Sequenz stellt einen bevorzugten cytolytisches Signal-transduzierenden Teil dar.
18 (SEQ ID NO: zeigt die Aminosäuresequenz des mb1-Rezeptorproteins; die eingerahmte Sequenz stellt einen bevorzugten cytolytisches Signal-transduzierenden Teil dar.
19 (SEQ ID NO: 27) zeigt die Aminosäuresequenz des B29-Rezeptorproteins); die eingerahmte Sequenz stellt einen bevorzugten cytolytisches Signal-transduzierenden Teil dar.
Beispiel I
Konstruktion von humanes IgG1:Rezeptor-Chimären
Humane IgG1-schwere Kette-Sequenzen wurden hergestellt, indem Sequenzen in der C_H3-Domäne an ein cDNA-Fragment gebunden wurden, das vom 3'-Ende der Transmembranform der Antikörper-mRNA stammte. Das 3'-Endfragment wurde durch Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung einer Mandel-cDNA-Bibliothek als Substrat und Oligonukleotiden mit den Sequenzen:
CGC GGG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC (SEQ ID NO: 7) und
CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT GGG CCT CA (SEQ ID NO: 8),
die dem 5' und 3'-Ende der gewünschten DNA-Fragmente entsprechen, erhalten. Das 5'-Oligo ist zu einer Stelle in der C_H1-Domäne von humanem IgG1 komplementär und das 3'-Oligo ist zu einer Stelle genau 5' zu den Sequenzen, die für die Membran-überspannende Domäne codieren, komplementär. Das PCR-Produkt wurde mit BstXI und BamHI verdaut und zwischen BstXI- und BamHI-Stellen eines halbsynthetischen IgG1-Antikörper-Gens, das variable und konstante Regionen trägt, ligiert. Nach der Insertion des BstXI- bis BamHI-Fragments wurden die amplifizierten Teile des Konstrukts bis zu der SmaI-Stelle in C_H3 durch Restriktionsfragmentaustausch ersetzt, so daß nur der Teil zwischen der SmaI-Stelle und dem 3'-Oligo aus der PCR-Reaktion stammte.
Um ein humanes IgG1:ζ-Chimären-Rezeptor zu schaffen, wurden das schwere Kette-Gen, das in einer BamHI-Stelle endet, an die BamHI-Stelle des unten beschriebenen ζ-Chimären gebunden, so daß die Antikörpersequenzen den extrazellulären Teil bildeten. Strömungscytometrie von COS-Zellen, die mit einem Plasmid transfiziert waren, das für das Chimäre codiert, zeigten hohe Expressionslevel von Antikörperdeterminanten, wenn ein Expressionsplasmid, das für eine leichte Kette-cDNA codiert, cotransfiziert wurde, und eine moderate Expression von Antikörperdeterminanten, wenn das leichte Kette-Expressionsplasmid fehlte.
Ähnliche Chimäre, die humanes IgG1 an η oder γ (siehe unten) oder einen beliebigen Signal-transduzierenden Teil eines T-Zell-Rezeptor- oder Fc-Rezeptor-Proteins fusioniert haben, können im allgemeinen wie oben beschrieben unter Verwendung von Standardtechniken der Molekularbiologie konstruiert werden.
Um eine einzelne Transkriptionseinheit zu schaffen, die es ermöglicht, daß sowohl schwere wie auch leichte Ketten aus einem einzelnen Promotor exprimiert werden, wurde ein Plasmid, das für eine bicistronische mRNA codiert, aus für schwere und leichte Kette codierenden Sequenzen und dem 5'-untranslatierten Teil der mRNA, die für das 78 kD Glucoseregulierte Protein, auch als grp78 oder BiP bekannt, codiert, geschaffen. grp78-Sequenzen wurden durch PCR aus humaner genomischer DNA unter Verwendung von Primern mit den folgenden Sequenzen
CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC (SEQ ID NO: 9) und
CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG (SEQ ID NO: 10)
am 5'- bzw. 3'-Ende erhalten. Polymerase-Kettenreaktionen mit diesen Oligos wurden in Gegenwart von 10% Dimethylsulfoxid durchgeführt. Das durch PCR erhaltene Fragment wurde mit NotI und HincII verdaut und zwischen NotI- und HpaI-Stellen stromabwärts von für humanes IgG1 codierenden Sequenzen insertiert. Sequenzen, die für eine humanes IgG-kappa-leichte Kette-cDNA codieren, wurden dann stromabwärts vom grp78-Leader insertiert, wobei die HincII-Stelle und eine andere Stelle im Vektor verwendet wurden. Das Expressionsplasmid, das aus diesen Manipulationen resultierte, bestand aus dem halbsynthetischen schwere Kette-Gen, gefolgt von den grp78-Leader-Sequenzen, gefolgt von den kappa-leichte Kette-cDNA-Sequenzen, gefolgt von Polyadenylierungssignalen, die aus einem SV40-DNA-Fragment stammten. Eine Transfektion von COS-Zellen mit dem Expressionsplasmid ergab eine deutlich verbesserte Expression der schwere Kette-Determinanten im Vergleich zu einer Transfektion von Plasmid, das für die schwere Kette-Determinanten allein codiert.
Um ein bicistronisches Gen, das ein schwere Kette/Rezeptor-Chimäres und eine leichte Kette umfaßt, zu schaffen, können die stromaufwärts gelegenen schwere Kette-Sequenzen durch ein chimäres schwere Kette/Rezeptor-Gen, das hier beschrieben wird, ersetzt werden.
Beispiel II
Konstruktion von CD4-Rezeptor-Chimären
Humane ζ- (Weissman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9709–9713 (1988b)) und γ- (Küster et al., J. Biol. Chem. 265: 6448–6452 (1990)) cDNAs wurden durch Polymerase-Kettenreaktion aus Bibliotheken isoliert, die aus der HPB-ALL-Tumorzellinie (Aruffo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8573–8577 (1987b)) und humanen Killerzellen hergestellt worden waren, während η-cDNA (Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3319–3323 (1990)) aus einer murinen Thymocyten-Bibliothek isoliert wurde. ζ-, η- und γ-cDNAs wurden mit der extrazellulären Domäne einer konstruierten Form von CD4 verknüpft, die eine BamHI-Stelle genau stromaufwärts der Membran-überspannenden Domäne besitzt (Aruffo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8573–8577 (1987b); Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol. 9347–353 (1990)), die mit der BamHI-Stelle verknüpft ist, die natürlicherweise in den ζ- und η- cDNAs an einer ähnlichen Stelle weniger Reste stromabwärts der Membran überspannenden Domäne vorliegt (SEQ ID NOS: 1, 3, 4 und 6). Um das Fusionsprotein mit γ zu bilden, wurde eine BamHI-Stelle in die Sequenz an derselben ungefähren Stelle konstruiert (1; SEQ ID NO: 2 und 5). Die Genfusionen wurden in ein Vaccinia-Virus-Expressionsplasmid, das das E. coli-gpt-Gen als selektierbaren Marker trägt, eingeführt und in das Genom des Vaccinia-WR-Stamms durch homologe Rekombination und Selektion auf Wachstum in Mycophenolsäure insertiert (Falkner et al., J. Virol. 62: 1849–1854 (1988); Boyle et al., Gene 65: 123–128 (1988)). Eine Durchflußcytometrie-Analyse zeigte, daß die Vaccinia-Rekombinanten die reichliche Produktion von CD4:ζ- und CD4:γ-Fusionsproteinen an der Zelloberfläche steuern, wohingegen die Expression von CD4:η wesentlich schwächer ist (1B). Die letztgenannte Festellung steht mit einem neueren Bericht in Übereinstimmung, daß eine Transfektion eines η-cDNA-Expressionsplasmids in eine murine Hybridomzellinie eine wesentliche geringere Expression liefert als eine Transfektion eines vergleichbaren ζ-Expressionsplasmids (Clayton et al., J. Exp. Med. 172: 1243–1253 (1990)). Die Immunpräzipitation von Zellen, die mit den Vaccinia-Rekombinanten infiziert sind, zeigte, daß die Fusionsproteine kovalente Dimere bilden, anders als das natürlich auftretende CD4-Antigen. Die Molekülmassen der monomeren CD4:ζ- und CD4:γ-Fusionsproteine und von nativem CD4 wurden mit 63, 55 bzw. 53 kD festgestellt. Die größeren Massen der Fusionsproteine stehen ungefähr mit der größeren Länge des intrazellulären Teils in Übereinstimmung, der die Länge von nativem CD4 um 75 (CD4:ζ) oder 5 (CD4:γ) Reste übersteigt.
Beispiel III
CD4-Chimäre können mit anderen Rezeptorketten assoziieren
Die Zelloberflächenexpression der Makrophagen/natürliche Killerzellen-Form von humanem FcγRIII (CD16_T) bei Transfektanten wird durch Cotransfektion mit murinem (Kurosaki et al., Natzre 342: 805–807 (1989)) oder mit humanem (Hibbs et al., Science 246: 1608–1611 (1989)) γ wie auch mit humanem ζ (Lanier et al., Nature 342: 803–805 (1989)) erleichtert.
In Übereinstimmung mit diesen Berichten ermöglicht die Expression der Chimären auch eine Oberflächenexpression von CD16_TM, wenn sie entweder durch Cotransfektion oder durch Coinfektion mit rekombinanten Vaccinia-Viren an die Zielzelle bzw. Targetzelle abgegeben werden (2). Die Förderung der CD16_TM-Oberflächenexpression in den untersuchten Zellinien durch ζ war ausgeprägter als die Förderung durch γ (2), während natives CD4 die CD16_TM-Oberflächenexpression nicht verstärkt.
Beispiel IV
Asp-ζ-Mutanten machen keine Coassoziierung mit Fc-Rezeptor durch
Um Chimäre zu schaffen, die nicht mit existierenden Antigen- oder Fc-Rezeptoren assoziieren werden, wurden mutante ζ-Fusionsproteine hergestellt, denen entweder der intramembranöse Asp- oder der intramembranöse Cys-Rest oder beide fehlen. Die Strömungscytometrie zeigte, daß die Intensität der Zelloberflächenexpression durch verschiedene mutante Chimäre sich nicht merklich von der des nicht-mutierten Vorläufers unterschied, und Immunpräzipitationsexperimente zeigten, daß die Gesamtexpression die Chimären ähnlich war. Wie erwartet, wurde festgestellt, daß mutante Chimäre, denen der Transmembran-Cystein-Rest fehlt, keine Disulfid-gebundenen Dimere bilden. Die zwei Mutanten-Chimäre, denen Asp fehlt, waren nicht fähig, die Oberflächenexpression von CD16^TM zu unterstützen, wohingegen die monomeren Chimären, denen Cys fehlte, die aber Asp trugen, die Coexpression von CD16_TM zuließen, allerdings mit geringerer Effizient als das Elterndimer (3).
Beispiel V
Mutante Rezeptoren behalten die Fähigkeit bei, eine Calciumantwort zu initiieren
Um zu bestimmen, ob eine Vernetzung der Fusionsproteine die Akkumulation von freiem intrazellulären Calcium in ähnlicher weise wie die, die bekannterweise mit dem T-Zell-Antigen-Rezeptor auftritt, ermöglicht, wurden Zellen der humanen Leukämie-T-Zellinie Jurkat E6 (ATCC-Eingangsnummer TIB 152, American Type Culture Collection, Rockville, MD) mit den Vaccinia-Rekombinanten infiziert und die relative cytoplasmatische Calcium-Konzentration nach Vernetzung der extrazellulären Domäne mit Antikörpern wurde gemessen. Strömungscytometrische Messungen wurden mit den Zellen, die mit dem Calcium-sensitiven Farbstoff Indu-1 beladen waren, durchgeführt (Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260: 3340–3450 (1985); Rabinovitch et al., J. Immunol. 137: 952–961 (1986)). 4A–D zeigt die Resultate der Calciumflußexperimente mit Zellen, die mit CD4:ζ und den Asp^–- und Cys^–-Mutanten von ζ infiziert waren. Eine Vernetzung der Chimären erhöhte reproduzierbar intrazelluläres Calcium. CD4:η und CD4:γ erlaubten in entsprechender Weise eine Akkumulation von intrazellulärem Calcium in infizierten Zellen. Jurkat-Zellen exprimieren niedrigere Level an CD4 an der Zelloberfläche; allerdings verändert eine Vernetzung des nativen CD4 in Gegenwart oder Abwesenheit von CD16:ζ die intrazellulären Calciumlevel nicht (4A–B).
Beispiel VI
CD4:ζ-, -η- und -γ-Chimäre vermitteln Cytolyse von Targets, die HIV-gp120/41 exprimieren
Um zu bestimmen, ob die chimären Rezeptoren cytolytische Effektorprogramme auslösen würden, wurde ein Modellsystem Target:Effektor auf der Basis der CD4-Erkennung des HIV-Hülle-gp120/gp41-Komplexes entwickelt. HeLa-Zellen wurden mit rekombinanten Vaccinia-Viren, die gp120/gp41 exprimieren, infiziert (Charkrabarti et al., Nature 320: 535–537 (1986); Earl et al., J. Virol. 64: 2448–2451 (1990)) und mit ⁵¹Cr markiert. Die markierten Zellen wurden mit Zellen aus einer humanen allospezifischen (CD8⁺, CD4^–) cytotoxischen T-Lymphozytenlinie, welche mit Vaccinia-Rekombinanten, die CD4:ζ-, CD4:η- oder CD4:γ-Chimäre oder das CD4:ζCys11Gly:Asp15Gly-Doppelmutanten-Chimäre exprimieren, infiziert war, inkubiert. 5A–C zeigt, daß HeLa-Zellen, die gp120/41 exprimieren, durch cytotoxische T-Lymphocyten (CTL), die CD4-Chimäre exprimieren, spezifisch lysiert wurden. Nicht-infizierte HeLa-Zellen wurden durch CTL, bewaffnet mit CD4:ζ-Chimären, nicht targetiert und HeLa-Zellen, die gp120/41 exprimieren, wurden durch nicht-infizierte CTL nicht erkannt. Um die Wirksamkeit der verschiedenen Chimären zu vergleichen, wurden die Effektor-zu-Target-Verhältnisse für die Fraktion von CTL, die CD4-Chimäre exprimiert, und für die Fraktion von HeLa-Zellen, die gp120/41 exprimiert, wie es durch Strömungscytometrie gemessen wird, korrigiert. 5C zeigt eine cytometrische Analyse der CD4-Expression durch die CTL, die im Cytolyseexperiment verwendet werden, wie es in den 5A und 5B gezeigt ist. Obgleich die mittlere Dichte an Oberflächen-CD4:ζ die mittlere Dichte von CD4:η weit übersteigt, waren die cytolytischen Wirksamkeiten von Zellen, die eine beliebige Form exprimiert ähnlich. Unter Korrektur der Fraktion von Targets, die gp120 exprimiert, war die Cytolyseeffizienz, vermittelt durch CD4:ζ- und CD4:η-Proteine, vergleichbar mit der besten Effizienz, die für spezifische T-Zelle-Rezeptor-Targets:Effektor-Paare beschrieben wird (das mittlere Effektor-zu-Target-Verhältnis für 50% Freisetzung durch T-Zellen, die CD4:ζ exprimieren, war 1,9 ± 0,99, n = 10). Die CD4:γ-Fusion war weniger aktiv als es die CD4:ζ-Fusion war, der die Transmembranreste Asp und Cys fehlen. Allerdings wurde in beiden Fällen eine signifikante Cytolyse beobachtet (5B–C).
Um die Möglichkeit zu kontrollieren, daß eine Vaccinia-Infektion eine künstliche Erkennung durch CTL fördern könnte, wurden ähnliche Cytolyseexperimente mit Zielzellen, die mit Vaccinia-Rekombinanten infiziert waren, die die mit Phosphatidylinositol verknüpfte Form von CD16: (CD16_PI) exprimieren und mit ⁵¹Cr markiert waren, und mit CTL, die mit Kontrollrekombinanten infiziert waren, die entweder CD16_PI oder CD16:ζ exprimieren, durchgeführt. 6A zeigt, daß T-Zellen, die Nicht-CD4-Chimäre exprimieren, native HeLa-Zellen oder HeLa-Zellen, die gp120/41 exprimieren, nicht erkennen und daß entsprechend T-Zellen, die CD4-Chimäre exprimieren, HeLa-Zellen, die andere durch Vaccinia codiere Oberflächenproteine exprimieren, nicht erkennen. Außerdem lysieren CTLs, die nicht-chimäres CD4 exprimieren, HeLa-Zellen, die gp120/41 exprimieren, nicht signifikant (6A).
Beispiel VII
MHC-Klasse II-tragende Zellen werden durch die Chimären nicht targetiert
Es wird angenommen, daß CD4 mit einer nicht-polymorphen Sequenz, die durch MHC-Klasse II-Antigen exprimiert wird, wechselwirkt (Gay et al., Nature 128: 626–629 (1987); Sleckman et al., Nature 328: 351–353 (1987)). Obgleich niemals eine spezifische Wechselwirkung zwischen CD4 und Klasse II-Antigen mit gereinigten Proteinen dokumentiert wurde, kann unter bestimmten Bedingungen eine Adhäsion zwischen Zellen, die CD4 exprimieren, und Zellen, die Klasse II-Moleküle exprimieren, bewiesen werden (Doyle et al., Nature 330: 256–259 (1987); Clayton et al., J. Exp. Med. 172: 1243–1253 (1990); Lamarre et al., Science 245: 743–746 (1989)). Als nächstes wurde untersucht, ob eine Abtötung von Zellen, die Klasse II-Antigen tragen, detektiert werden könnte. 6B zeigt, daß es keine spezifische Cytolyse, die durch CD4:ζ gegen die Raji B-Zellinie, die reichlich Klasse II-Antigen exprimiert, gesteuert wird. Obgleich eine moderate (ungefähr 5%) Cytolyse beobachtet wird, zeigt eine Klasse II-negative Mutante von Raji, RJ2.2.5 (Accolla, J. Exp. Med. 157: 1053–1058 (1983)) eine ähnliche Empfindlichkeit wie es bei Raji-Zellen der Fall ist, die mit nicht-infizierten T-Zellen inkubiert werden.
Beispiel VIII
Sequenzanforderungen zur Induktion einer Cytolyse durch die T-Zelle-Antigen/Fc-Rezeptor-zeta-Kette
Obgleich Chimäre zwischen CD4 und ζ cytotoxische T-Lymphocyten (CTL) bewaffnen können, so daß sie Targetzellen, die HIV gp120 exprimieren, abtöten, wurde eine Alternative zu CD4 gesucht, um die Eigenschaften von zeta-Chimären, die in humane T-Zellinien eingeführt wurden, eindeutig zu vergleichen. Solche Linien können CD4 exprimieren, was es schwierig macht, die Beziehung zwischen dem Typ oder Grad der Calciummobilisierung und dem cytotoxischen Potential der unterschiedlichen Chimären spezifisch zu definieren. Um dies zu umgehen, wurden Chimäre zwischen ζ und CD16 geschaffen, in denen die extrazelluläre Domäne von CD16 mit den Transmembran- und intrazellulären Sequenzen von ζ verknüpft ist (7A). Die Genfusionen wurden in ein Vacciniavirus- Expressionsplasmid, das das E. coli gpt-Gen als selektiven Marker trägt, eingeführt und in das Genom des Vaccinia-WR-Stamms durch homologe Rekombination und Selektion auf Wachstum in Mycophenolsäure insertiert (Falkner und Moss, J. Virol. 62: 1849 (1988); Boyle und Coupar, Gene 65: 123 (1988)).
T-Zellinien wurden mit den Vaccinia-Rekombinanten infiziert und die relative cytoplasmatische freie Calciumionen-Konzentration wurde nach Vernetzung der extrazellulären Domänen mit Antikörpern gemessen. Es wurden sowohl spektralfluorometrische (Massenpopulation) als auch durchflußcytometrische (Einzell)-Messungen mit Zellen durchgeführt, die mit dem Farbstoff Indo-1 beladen waren (Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260: 3440 (1985); Rabinovitch et al., J. Immunol. 137: 952 (1986)). 7B zeigt eine Analyse von Daten, die aus Zellen der humanen Jurkat-Leukämie-T-Zellinie, die mit Vaccinia-Rekombinanten, welche CD16:ζ-Fusionsprotein exprimieren, infiziert waren. Eine Vernetzung der Chimären erhöhte reproduzierbar intrazelluläres Calcium, während eine ähnliche Behandlung von Zellen, die nicht chimäres CD16 exprimieren, wenig Wirkung oder keine Wirkung hatte. Wenn die Chimären in mutanten Zellinien, denen Antigenrezeptor fehlt, exprimiert wurden, wurde entweder mit REX33A (Breitmeyer et al., J. Immunol. 138: 726 (1987); Sancho et al., J. Biol. Chem. 264: 20760 (1989)) oder Jurkat-Mutanten JRT3.T3.5 (Weiss et al., J. Immunol. 135: 123 (1984)) eine starke Antwort auf eine CD16-Antikörper-Vernetzung erkannt. Ähnliche Daten wurden mit der mutanten REX20A-Zellinie (Breitmeyer et al., supra, 1987; Blumberg et al., J. Biol. Chem. 265: 14036 (1990)) und einer CD3/Ti-negativen Mutanten der Jurkat-Zellinie, die in diesem Labor entwickelt wurde, gesammelt. Eine Infektion mit Rekombinanten, die CD16:ζ exprimieren, stellte die Antwort auf Anti-CD3-Antikörper nicht wieder her, was zeigt, daß das Fusionsprotein nicht durch Rettung intrazellulärer CD3-Komplexketten wirkt.
Um die Fähigkeit der Chimären, die zellvermittelte Immunität umzulenken, wurden CTLs mit Vaccinia-Rekombinanten, die CD16-Chimäre exprimieren, infiziert und verwendet, um spezifisch Hybridomzellen, die Membran-gebundene Anti-CD16-Antikörper exprimieren, zu lysieren. Dieser Assay ist eine Erweiterung eines Hybridom-Cytotoxizitätsassays, der ursprünglich entwickelt worden war, um Effektormechanismen von Zellen, die Fc-Rezeptoren tragen, zu analysieren (Graziano und Fanger, J. Immunol. 138: 945, 1987; Graziano und Fanger, J. Immunol. 139: 35–36, 1987; Shen et al., Mol. Immunol. 26: 959, 1989; Fanger et al., Immunol. Today 10: 92, 1989). 8B zeigt, daß eine Expression von CD16:ζ in cytotoxischen T-Lymphozyten es ermöglicht, daß die "bewaffneten" CTL 3G8-Hybridomzellen abtöten (anti-CD16; Fleit et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 3275, 1982), wohingegen CTL, die die Phosphatidylinositolgebundenen Form von CD16 exprimieren, inaktiv sind. CTL, die mit CD16:ζ bewaffnet sind, töten auch Hybridomzellen nicht, die einen irrlevanten Antikörper exprimieren.
Zur Identifizierung der Minimal-ζ-Sequenzen, die zur Cytolyse notwendig sind, wurde ein Reihe von Deletionsmutanten hergestellt, in denen sukzessive mehr der intrazellulären ζ-Domäne vom Carboxyl-Terminus entfernt wurde (8A). Das meiste der intrazellulären zeta-Domäne konnte mit geringer Konsequenz für das cytolytische Potential entfernt werden; das Vollängen-Chimäre CD16:ζ war bezüglich der Wirksamkeit im wesentlichen gleich dem Chimären, das zu Rest 65 deletiert war, CD16:ζAsp66* (8B). Eine wesentliche Abnahme bei der Cytotoxizität wurde bei Deletion zu ζ-Rest 59 (Chimäres CD16:ζGlu60*) beobachtet und eine weitere Deletion zu Rest 50 resultierte in einer leicht geringeren Aktivität. Allerdings wurde kein vollständiger Aktivitätsverlust beobachtet, selbst wenn die intrazelluläre Domäne auf einen Transmembrananker mit drei Resten reduziert wurde (8B).
Da ζ ein Disulfid-verknüpftes Dimer ist, war eine Erklärung für die Retention der cytolytischen Aktivität die, daß endogenes ζ Heterodimere mit der chimären ζ-Deletion bildet, wodurch die Aktivität wieder hergestellt wird. Um diese These zu untersuchen, wurden die ζ-Reste 11 und 15 von Asp bzw. Cys in Gly geändert (Cys11Gly/Asp15Gly) und es wurden Immunpräzipitationen wie folgt durchgeführt. Etwa 2 × 10⁶ CV1-Zellen wurden für eine Stunde in serumfreiem DME-Medium mit einer Infektionsmultiplizität (moi) von wenigstens zehn mit rekombinantem Vaccinia infiziert. Sechs bis acht Stunden nach der Infektion wurden die Zellen mit PBS/1 mM EDTA von den Platten abgelöst und mit 0,2 mCi ¹²⁵I pro 2 × 10⁶ Zellen unter Verwendung von Lactoperoxidase und H₂O₂ oberflächenmarkiert und zwar nach dem Verfahren von Clark und Einfeld (Leukocyte Typing II, S. 155–167, Springer-Verlag, NY, 1986). Die markierten Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und in 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,15 M NaCl, 0,05 M Tris, pH 8,0, 5 mM MgCl₂, 5 mM KCl, 0,2 M Iodacetamid und 1 mM PMSF lysiert. Nuclei wurden durch Zentrifugation entfernt und CD16-Proteine wurden mit Antikörper 3G8 (Fleit et al., supra, 1982; Medarex) und Anti-Maus-IgG-Agarose (Cappel, Durham, NC) immunpräzipitiert. Proben wurden unter nicht-reduzierenden Bedingungen durch ein 8% Polyacrylamid/SDS-Gel oder durch ein 10% Gel unter reduzierenden Bedingungen einer Elektrophorese unterzogen. Diese Immunpräzipitationen bestätigten, daß das CD16:ζCys11Gly/Asp15Gly-Chimäre nicht in Disulfid-verknüpften Dimerstrukturen assoziiert.
Es wurde auch die cytolytische Aktivität der mutanten Rezeptoren getestet. Die mutante Chimäre, die zu Rest 65 deletiert war, CD16:ζCys11Gly/Asp15Gly/Asp66*) war im Cytolyseassay in Abhängigkeit von den Assaybedingungen 2- bis 8-fach weniger aktiv als die vergleichbare nicht-mutierte Chimäre (CD16:ζAsp66*), die üblicherweise im Vergleich zur Aktivität von CD16:ζ innerhalb eines Faktors von 2 lag oder nicht unterscheidbar war (9B). Die Aktivitätsverringerung bei den mutanten Chimären ist mit der Verringerung vergleichbar, die bei CD4-Chimären ähnlicher Struktur (siehe oben) zu sehen ist und die am wahrscheinlichsten der geringeren Wirksamkeit von ζ-Monomeren im Vergleich zu Dimeren zuzuschreiben ist. Dagegen hatten die Asp^–-, Cys^–- mutierten Chimären, die zu Rest 59 deletiert waren, keine cytolytische Aktivität (9B), was die Hypothese stützt, daß eine Assoziierung mit anderen Ketten, die durch die Transmembran-Cys- und/oder -Asp-Reste vermittelt wird, für die schwache Persistenz der cytolytischen Aktivität bei Deletionen von mehr aminoterminalen Resten als Rest 65 verantwortlich ist, stützt.
Strömungscytometrie-Studien zeigten, daß die Deletionsmutanten, denen die Transmembran-Asp- und -Cys-Reste fehlen, noch eine Erhöung bei der freien intrazellulären Calciumionen-Konzentration als Reaktion auf eine Antikörpervernetzung in einer mutanten TCR^–-Jurkat-Zellinie fördern (9D). Ähnliche Resultate wurde für Chimäre erhalten, die in der Elter-Jurkat-Zellinie exprimiert wurden. Im Fall von CD16:ζCys11Gly/Asp15Gly/Glu60* zeigen diese Daten, daß die Fähigkeit, das Calciumansprechen zu vermitteln, durch Mutation von der Fähigkeit, die Cytolyse zu unterstützen, getrennt werden kann.
Um definitiv den möglichen Beitrag von ζ-Transmembranresten zu eliminieren, wurden die Transmembranreste und die ersten 17 cytoplasmatischen Reste von ζ durch Sequenzen ersetzt, die für die Membran überspannenden und ersten 14 und ersten 17 cytoplasmatischen Reste der CD5- oder CD7-Antigene codieren (9A). Die resultierenden dreiteiligen Fusionsproteine CD16::5:ζ(48-65) und CD16:7:ζ(48-65) bilden keine Disulfid-verknüpften Dimere, wie es die einfacheren CD16:ζ-Chimäre tun, da diesen der Cystein-Rest in der ζ-Transmembrandomäne fehlt. Beide dreiteiligen Chimären waren fähig, in Jurkat- und TCR-negativen Zellinien Calcium zu mobilisieren (9D) und eine cytolytische Antwort in CTL zu entwickeln (9C und Daten nicht gezeigt). Allerdings setzt eine Verkürzung des ζ-Teils zu Rest 59 in der Chimären CD16:7:ζ(48-59) die Fähigkeit der dreiteiligen Fusion außer Kraft, das Calcium-Ansprechen in TCR-positiven oder -negativen Jurkat-Zellen zu steuern oder eine Cytolyse in reifen CTL zu steuern (9C und 9D und Daten nicht gezeigt).
Um die Beiträge von einzelnen Resten innerhalb des 18-Restemotivs zu untersuchen, stellten wir eine Reihe von Mutanten-Varianten durch ortsspezifische Mutagenese her und beurteilten ihre Fähigkeit eine Rezeptor-gesteuerte Abtötung unter Bedingungen einer niedrigen (10A und 10D) oder einer hohen (10B und 10E) Expression von chimären Rezeptor zu vermitteln. 10A–F zeigt, daß, während eine Reihe von relativ konservativen Substitutionen (d.h. Ersetzen von sauren Resten durch ihre verwandten Amide, oder Tyrosin durch Phenylalanin), die die Reste 59 bis 63 überspannten, zu einer moderaten Beeinträchtigung der cytolytischen Wirksamkeit führte, behielten die Varianten im allgemeinen die Fähigkeit bei, Calcium zu mobilisieren. Allerdings umfassen diese Reste kollektiv ein wichtiges Submotiv insoweit wie ihre Deletion die cytolytische Aktivität eliminiert. Eine Umwandlung von Tyr 62 entweder in Phe oder Ser eliminierte sowohl die cytotoxische Antwort als auch die Calciumantwort. Am Aminoterminus des 18-Restsegments hob ein Ersatz von Tyr 51 durch Phe sowohl die Calciummobilisierung als auch die cytolytische Aktivität auf, während eine Substitution von Leu durch Ser in Position 50 die Calciumantwort eliminierte, während die Cytolyse nur partiell verschlechtert wurde. Ohne eine Bindung an eine besondere Hypothese einzugehen, wird angenommen, daß die Unfähigkeit der Leu50Ser-Mutante, Calcium in Kurzzeitströmungscytrometischen Assays zu mobilisieren, nicht vollständig ihre Fähigkeit, eine substantielle Erhöhung bei den freien intrazellulären Calciumionen über die längere Zeitspanne des Cytolyse-Assays zu vermitteln, nicht vollständig wiedergibt. Allerdings wurde für einige cytolytische T-Zellinien eine Calcium-unempfindliche cytolytische Aktivität beschrieben und die Möglichkeit, daß ein ähnliches Phänomen den hierin beschriebenen Resultaten zugrundeliegt, wurde nicht ausgeschlossen. Ein Ersatz von Asn48 durch Ser verschlechterte in einigen Experimenten die Cytotoxizität partiell, während sie in anderen eine geringe Wirkung hatte.
Um die potentielle Rolle von rebundanten Sequenzelementen zu untersuchen, wurde die intrazelluläre Domäne von ζ in drei Segmente eingeteilt, die die Reste 33 bis 65, 71 bis 104 und 104 bis 138 überspannen. Jedes dieser Segmente wurde mit Hilfe einer MluI-Stelle, die genau distal zu den Basismembran-Verankerungssequenzen der intrazellulären Domäne von CD7 eingeführt worden war, an eine CD16::CD7-Chimäre gebunden (siehe unten; 11A). Ein Vergleich der cytolytischen Wirksamkeit der drei Elemente zeigte, daß sie im wesentlichen gleich wirksam waren (11B). Ein Sequenzvergleich (11A) zeigt, daß das zweite Motiv 11 Reste zwischen Tyrosinen trägt, wohingegen das erste und das dritte Motiv 10 tragen.
Obgleich eine genaue Darstellung des Prozesses der T-Zellaktivierung nicht erfolgte, ist klar, daß eine Aggregation des Antigenrezeptors oder von Rezeptorchimären, die intrazelluläre ζ-Sequenzen tragen, die Calciummobilisierung, Cytokin- und Granulum-Freisetzung auslöst und auch die Aktivierung des Auftretens von Zelloberflächenmarkern auslöst. Die aktive Stelle von ζ, eine kurze lineare Peptidsequenz, die wahrscheinlich zu klein ist, um eine eigene enzymatische Aktivität zu haben, wechselwirkt wahrscheinlich mit einem oder höchstens wenigen Proteinen unter Vermittlung zellulärer Aktivierung. Es ist auch klar, daß eine Mobilisierung von freiem Calcium für die celluläre Aktivität selbst ausreichend ist, da die Fähigkeit, Cytolyse zu vermitteln, durch Mutation von der Fähigkeit, Calcium-Akkumulierung zu vermitteln, getrennt werden kann.
Wie hierin gezeigt wurde, ermöglicht eine Addition von 18 Resten aus der intrazellulären Domäne von ζ an die Transmembran und intrazelluläre Domäne von zwei nichtverwandten Proteinen den resultierenden Chimären, die cytolytische Aktivität gegen Targetzellen zu richten, die an den extrazellulären Teil der Fusionsproteine binden. Obgleich Chimäre, die das 18-Rest-Motiv tragen, ungefähr 8-fach weniger aktiv sind als Chimäre, die auf Vollängen-ζ basieren, kann die reduzierte Aktivität dem Verlust von Transmembran-Wechselwirkungen zugeschrieben werden, die normalerweise Widtyp-ζ-Disulfid-verknüpfte Dimere bilden lassen. D.h., ζ-Deletionskonstrukte, die denselben Carboxylterminus wie das Motiv haben und denen Tranmembran-Cys- und -Asp-Reste fehlen, zeigen typischerweise eine geringfügig niedrigere Aktivität als Chimäre, die nur das 18-Rest-Motiv tragen.
Das cytolytische Kompetenzelement, auf das wir uns konzentriert haben, hat zwei Tyrosine und keine Serine oder Threonine, was die möglichen Phosphorylierungsbeiträge zur Aktivität beschränkt. Eine Mutation jedes Tyrosins zerstört Aktivität und obgleich vorläufige Experimente nicht auf eine substantielle Tyrosinphosporylierung nach Vernetzung von chimären Oberflächen-Antigenen, die das 18-Restmotiv tragen, hinweisen, kann die mögliche Beteiligung einer solchen Phosphorylierung mit einem niedrigen Level nicht ausgeschlossen werden. Zusätzlich zu den an den zwei Tyrosin-Resten bemerkten Effekten schwächen eine Reihe von Aminosäureaustausche am Amin- und Carboxyl-Terminus des Motivs die Aktivitäten unter Bedingungen einer geringen Rezeptordichte.
Sequenzen, die dem aktiven ζ-Motiv ähnlich sind, können in den cytoplasmatischen Domänen verschiedener anderer Transmembranproteine gefunden werden; diese schließen die CD3-δ- und -γ-Moleküle, die mit Oberflächen-IgM-assoziierten Proteine mb1 und B29 und die β- und γ-Ketten des Hochaffinitäts-IgE-Rezeptors FcεRI ein (Reth, Nature 338: 383, 1989). Obgleich die Funktion dieser Sequenzen unbestimmt ist, kann jede, wenn sie effizient exprimiert wird, zur autonomen T-Zell-Aktivierung fähig sein und eine solche Aktivität kann die restliche TCR-Reaktionsfähigkeit erlären, die in einer zeta-negativen Mutanten-Zellinie gefunden wird (Sussman et al., Cell 52: 85, 1988).
ζ selbst trägt drei derartige Sequenzen, etwa im gleichen Abstand, und eine grobe Dreiteilung der intrazellulären Domäne zeigt, daß jeder Teil fähig ist, eine cytolytische Reaktion zu initiieren. η, eine Spleiß-Isoform von zeta (Jin et al., supra, 1990; Clayton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5202, 1991) fehlt die Carboxylhälfte des dritten Motivs. Da eine Entfernung der Carboxylhälfte des ersten Motivs Aktivität aufhebt, scheint es wahrscheinlich, daß der Hauptteil der biologischen Wirksamkeit von η den ersten zwei Motiven zugeschrieben werden kann. Obgleich η in verschiedenen Messungen ebenso aktiv wie ζ bei der Begünstigung einer Antigen-vermittelten Cytokin-Freisetzung (Bauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3842, 1991) oder einer neugesteuerten Cytolyse (siehe oben) ist, wird η als Reaktion auf die Rezeptorstimulation nicht phosphoryliert (Bauer et al., supra, 1991). Somit ist entweder das Vorliegen aller drei Motive zur Phosphorylierung notwendig oder das dritte Motiv stellt ein begünstigtes Substrat für eine nicht-identifizierte Tyrosinkinase dar.
Beispiel IX
Cytolytische Signal-Transduktion durch humanen Fc-Rezeptor
Um die Wirkungen unterschiedlicher humaner Fc-Rezeptorsubtypen zu beurteilen, wurden chimäre Moleküle geschaffen, in denen die extrazelluläre Domäne der humanen der CD4-, CD5- oder CD16-Antigen an die Transmembran- und die intrazelluläre Domäne der FcRIIγA, -B1-, -B2- und -C-Subtypen gebunden war (Nomenklatur von Ravetch und Kinet, Ann. Rev. Immunol. 9: 457, 1991). Spezifischer ausgedrückt, cDNA-Sequenzen, die den Transmembran- und cytoplasmatischen Domänen der vorher beschriebenen FcRIIA-, -B1- und -B2-Isoformen entsprechen, wurden auf dem vorher existierenden Klon PC23 oder aus einer humanen Mandel-cDNA-Bibliothek (aufgebaut durch Standardtechniken) amplifiziert, wobei die folgenden synthetischen Oligonukleotide als Primer verwendet wurden:
CCC GGA TCC CAG CAT GGG CAG CTC TT (SEQ ID NO: 18; FcRII A-vorwärts);
CGC GGG GCG GCC GCT TTA GTT ATT ACT GTT GAC ATG GTC GTT (SEQ ID NO: 19; FcRII A-rückwärts);
GCG GGG GGA TCC CAC TGT CCA AGC TCC CAG CTC TTC ACC G (SEQ ID NO: 10; FcRII B1 und FcRII B2 vorwärts); und
GCG GGG GCG GCC GCC TAA ATA CGG TTC TGG TC (SEQ ID NO: 21; FcRII B1 und FcRII B2-rückwärts).
Diese Primer enthielten Spaltungsstellen für Enzyme BamHI bzw. NotI, geplant 6 Rest von 5'-Ende. Auf die NotI-Stelle folgte unmittelbar ein Antisense-Stopp-Codon, entweder CTA oder TTA. Alle Primer enthielten 18 oder mehr Reste komplementär zu den 5'- und 3'-Enden der gewünschten Fragmente. Das cDNA-Fragment, das der cytoplasmatischen FcRIIγ-C-Domäne entspricht, die sich von der IIA-Isoform nur in einem Aminosäurerest (L für P als Rest 268) unterscheidet, wurde durch ortsspezifische Mutagenese durch Überlappungs-PCR unter Verwendung von Primern der folgenden Sequenz gebildet:
TCA GAA AGA GAC AAC CTG AAG AAA CCA ACA A (SEQ ID NO: 22) und
TTG TTG GTT TCT TCA GGT TGT GTC TTT CTG A (SEQ ID NO: 23).
Die PCR-Fragmente wurden in Vaccinia-Virus-Expressionsvektoren insertiert, welche die CD16- oder CD4-extrazelluläre Domäne enthielten, und anschließend durch Rekombination am Thymidinkinase-Locus in Wildtyp-Vaccinia insertiert, wobei eine Selektion auf Cointegration von E. coli-gpt verwendet wurde, um eine Identifizierung der gewünschten Rekombinanten zu erleichtern. Die Identitäten aller Isoformen (in 12 gezeigt) wurden durch Didesoxy-Sequenzierung bestätigt.
Die Produktion der chimären Rezeptorproteine wurde außerdem durch Immunpräzipitationsstudien bestätigt. Etwa 10⁷ JRT3.T3.5-Zellen wurden für eine Stunde in serumfreien IMDM-Medium mit rekombinantem Vaccinia bei einer Infektionsmultiplizität von wenigstens 10 infiziert. 12 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen geerntet und mit 0,5 mCi ¹²⁵I pro 10⁷ Zellen unter Verwendung des Lactoperoxydase/Glucoseoxidase-Verfahrens (Clark und Einfeld, supra) oberflächenmarkiert. Die markierten Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und in 1% NP-40, 0,1 mM MgCl₂, 5 mM KCl, 0,2 M Iodoacetamid und 1 mM PMSF lysiert. Nuclei wurden durch Zentrifugation entfernt und CD16-Fusionsproteine wurden mit Antikörper 4G8 und Anti-Maus-IgG-Agarose immunpräzipitiert. Die Proben wurden unter reduzierenden Bedingungen einer Elektrophorese unterzogen. Alle immunpräzipitierten chimären Rezeptormoleküle hatten die erwarteten Molekülmassen.
Um die Fähigkeit der chimären Rezeptoren, eine Erhöhung der cytoplasmatischen freien Calciumionen zu vermitteln, zu testen, wurden die rekombinanten Viren verwendet, um die TCR^–-Mutanten-Jurkat-Zellinie JRT3.T3.5 (wie hierin beschrieben) zu infizieren, und das cytoplasmatische freie Calcium wurde in den Zellen (wie hierin beschrieben) nach Vernetzung der extrazellulären Rezeptordomänen mit monoklonalem Antikörper 3G8 oder Leu-3A (wie hierin beschrieben) gemessen. Diese Experimente zeigten, daß die intrazellulären Domänen von FcRγII A und C fähig waren, eine Erhöhung der Konzentration an cytoplasmatischen freien Calciumionen nach Vernetzung der extrazellulären Domänen zu vermitteln, wohingegen die intrazellulären Domänen von FcRγII B1 und B2 unter vergleichbaren Bedingungen inaktiv waren (13A und 13B). Die CD4-, CD5- und CD16-Hybride von FcRγII A teilten im wesentlichen die gleiche Kapazität zur Förderung der Calcium-Antwort (13A–B). Andere Zellinien von monocytischen und lymphocytischen Abstammungen waren fähig, auf das durch Vernetzung der extrazellulären Domänen initiierte Signal zu antworten.
Um die Beteiligung der verschiedenen FcRγII-intrazellulären Domänen bei der Cytolyse zu erklären, wurden humane cytotoxische T-Lymphozyten (CTL) mit Vaccinia-Rekombinanten infiziert, die CD16:FcRγII-A-, -B1-, -B2- und -C-Chimäre exprimieren. Die infizierten Zellen wurden dann mit ⁵¹Cr-beladenen Hybridomzellen (d.h. 3G8-10-2-Zellen) cokultiviert, die Zelloberflächenantikörper gegen CD16 exprimierten. In diesem Assay töteten CTLs, die das das CD16-Chimäre tragen, die Hybridom-Targetzellen ab (die die Freisetzung von freiem ⁵¹Cr) ermöglichen, wenn die extrazelluläre CD16-Domäne des Chimären an ein intrazelluläres Segment gebunden war, das fähig ist, das Lymphozyten-Effektor-Programm zu aktivieren; dieser Cytolyse-Assay wird unten detailliert beschrieben. 14A zeigt, daß CTL, die mit CD16:FcRγIIA und -C "bewaffnet" waren, nicht aber mit FcRγII-B1 oder -B2, fähig sind, Targetzellen, die Zelloberflächen-Anti-CD16-Antikörper exprimieren, zu lysieren.
Um die Möglichkeit zu eliminieren, daß die spezifische Cytolyse in gewisser Weise einer Wechselwirkung mit der CD16-Gruppierung zuzuordnen war, wurden Cytolyseexperimente durchgeführt, in welchen die intrazellulären FcRII-Domänen an eine extrazelluläre CD4-Domäne gebunden waren. In diesem Fall waren die Targetzellen HeLa-Zellen, die HIV-Hüllproteine gp120/41 exprimieren (spezifischerweise HeLa-Zellen, die mit dem Vaccinia-Vektor vPE16 infiziert waren (erhältlich vom National Institute of Allergy and Infections Disease AIDS Depository, Bethesda, MD)). Wie im CD16-System waren Targetzellen, die HIV-Hülle exprimieren, gegenüber einer Lyse durch T-Zellen, die das CD4:FcRγII-A-Chimäre exprimieren, nicht aber FcRγII B1 oder -B2 exprimieren, anfällig (14B).
Die intrazellulären Domänen von FcRγII-A und -C teilen keine erkennbare Sequenzhomologie mit einem anderen Protein, einschließlich der Mitglieder der ausgedehnten FcRγ/TCRζ-Familie. Um die Sequenzelemente zu definieren, die für eine Induktion der Cytolyse verantwortlich sind, wurden 5'- und 3'-Deletionen der für die intrazelluläre Domäne codierenden Sequenzen (unten beschrieben und in 15A gezeigt) hergestellt und wurden bezüglich der Wirksamkeit bei der Calciummobilisierung und in Cytolyseassays (wie hierin beschrieben) beurteilt. In den Experimenten, in denen der aminoterminale Teil der intrazellulären Domäne entfernt wurde, wurde die Transmembrandomäne von FcRγII mit der Transmembrandomäne des nicht-verwandten CD7-Antigens ersetzt, um den möglichen Beitrag von Wechselwirkungen, die durch die Membran- überspannende Domäne vermittelt werden, zu eliminieren.
15B und 15C zeigen, daß eine Entfernung der 14-Carboxy-terminalen Reste, einschließlich Tyrosin 298, zu einem vollständigen Verlust der cytolytischen Fähigkeit und zu einer wesentlichen Verringerung des Calcium-Mobilisierungspotentials führte. Eine weitere Deletion unmittelbar vor Tyrosin 282 lieferte einen identischen Phänotyp (15B und 15C). Eine Deletion vom N-Terminus der intrazellulären Domäne zu Rest 268 hatte keine wesentliche Wirkung auf das Calciumprofil oder die cytolytische Wirkung, wohingegen eine Deletion zu Rest 275 die Freisetzung von freiem Calcium deutlich verschlechterte, aber wenig Wirkung auf die Cytolyse hatte (15D und 15E). Eine weitere Deletion zu Rest 282 ergab FcRγII-Schwänze, denen die Fähigkeit fehlte, entweder Calcium zu mobilisieren oder eine Cytolyse auszulösen (15D und 15D). Das durch diese groben Messungen definierte "aktive Element" ist relativ groß (36 Aminosäuren) und enthält zwei Tyrosine, die durch 16 Reste getrennt sind.
Beispiel X
Zusätzliche T-Zell-Rezeptor- und B-Zell-Rezeptor-Trigger-Proteine
Andere intrazelluläre und Transmembran-Signal-transduzierende Domänen gemäß der Erfindung können von den T-Zell-Rezeptor-Proteinen CD3-delta und T3-gamma und den B-Zell-Rezeptor-Proteinen mb1 und B29 abgeleitet werden. Die Aminosäuresequenzen dieser Proteine sind in 16 (CD3 delta; SEQ ID NO: 24), 17 (T3 gamma; SEQ ID NO: 25), 18 (mb1; SEQ ID NO: 26) und 19 (B29; SEQ ID NO: 27) gezeigt. In Klammern sind die Teile der Sequenzen angegeben, die für die cytolytische Signaltransduktion ausreichend sind (und daher vorzugsweise in einem chimären Rezeptor der Erfindung enthalten sind). Chimäre Rezeptoren, die diese Proteindomänen enthalten, werden konstruiert und in den therapeutischen Verfahren der Erfindung, die im allgemeinen wie oben beschrieben sind, verwendet.
Beispiel XI
Chimäre CD28-Rezeptoren
Da gezeigt wurde, daß die T-Zell-Aktivierung durch Eingreifen von CD28 erhöht werden kann, umfaßt die vorliegende Erfindung auch therapeutische Zellen, die Paare chimärer Rezeptoren exprimieren: die erste Chimäre enthält die intrazelluläre Domäne von CD28 und die zweite Chimäre enthält eine beliebige intrazelluläre oder Transmembran-Signal-transduzierende Domäne, wie hierin beschrieben wird. Bei einem gegebenen Paar chimärer Rezeptoren können die extrazellulären Domänen identisch sein (beispielsweise können beide vom CD4-Protein stammen und können daher beide HIV oder eine HIV-infizierte Zelle erkennen) oder jede kann so konzipiert sein, daß sie ein unterschiedliches Target-Molekül an der Oberfläche einer Zelle oder ein Pathogen erkennt.
In einem besonderen Beispiel kann ein Paar von Chimären zwei unterschiedliche extrazelluläre Domänen enthalten, wobei jede ein anderes Antigen erkennt, das für einen targetierten Tumor charakteristisch ist. Beispiele für Tumorantigene umfassen, ohne Beschränkung, beliebige einer Reihe von Kohlenhydraten (z.B. Le^Y, Sialyl-Le^Y, Le^X und Sialyl-Le^X), karzinoembryogenes Antigen, CD40, modifizierte CD44, α-Fetoprotein, die T- und Tn-Antigene, Tenascin und Wachstumsfaktorrezeptoren (z.B. HER2/neu). Durch Erhöhung der Zahl der Tumoroberflächenmarker, die erkannt werden müssen, um eine wirksame destruktive Antwort zu zeigen, erhöht dieser Ansatz die therapeutische Spezifität, indem die Wahrscheinlichkeit und Häufigkeit der Zerstörung von Nicht-Krebszellen verringert wird.
Dieses Verfahren der kombinatorischen Kontrolle kann auf eine Reihe von cooperierenden chimären Rezeptoren erweitert werden und kann eingesetzt werden, um ein beliebiges therapeutisches Verfahren der Erfindung zu regulieren.
CD28-Chimäre werden nach den hierin beschriebenen Verfahren konstruiert und exprimiert. Die CD28-Sequenz wird bei Aruffo und Seed (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8573–8577 (1987)) bereitgestellt. In dieser Referenz sind auch Beschreibungen der CD28-intrazellulären und -Transmembrandomänen enthalten. Ein Beispiel für eine Chimäre, die eine intrazelluläre CD28-Domäne trägt, ist bei Romeo et al. (Cold Spring Harbor Symp. on Quant. Biol. LVII: 117–125 (1992) offenbart.
Beispiel XII
Experimentelle Verfahren
Vaccinia-Infektion und Radioimmunpräzipitation
Etwa 5 × 10⁶ CV1-Zellen wurden für eine Stunde in serumfreiem DME-Medium mit rekombinantem Vaccinia bei einer Infektionsmultiplizität (moi) von wenigstens 10 (Titer gemessen an CV1-Zellen) infiziert. Die Zellen wurden nach Infektion im frisches Medium gegeben und metabolisch mit 200 μCi/ml ³⁵S-Methionin plus Cystein (Tran³⁵S-Label, ICN; Costo Mesa, CA) in Methionin- und Cystein-freiem DMEM (Gibco); Grand Island, NY) für 6 Stunden markiert. Die markierten Zellen wurden mit PBS, der 1 mM EDTA enthielt, losgelöst, durch Zentrifugation gesammelt und in 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,15 M NaCl, 0,05 M Tris pH 8,0, 5 mM EDTA und 1 mM PMSF lysiert. Nuclei wurden durch Zentrifugation entfernt und CD4-Proteine wurden mit OKT4-Antikörper und Anti-Maus-IgG-Agarose (Cappel, Durham, NC) immunpräzipitiert. Proben wurden durch 8% Polycrylamid/SDS-Gele unter nichtreduzierenden (NR) und reduzierenden (R) Bedingungen einer Elektrophorese unterworfen. Gele, die ³⁵S-markierte Proben enthielten, wurden mit En³Hance (New England, Nuclear, Boston, MA) vor einer Autoradiographie imprägniert. Eine erleichterte Expression der Transmembranform von CD16, CD16_TM, wurde gemessen, indem ihre Expression in CV1-Zellen, die einzeln mit CD16_TM infiziert waren, in Zellen, die mit Viren, die für CD16_TM und ζ- oder γ-Chimäre codieren, coinfiziert waren, verglichen wurden. Nach Infektion und Inkubation für 6 Stunden oder mehr, wurden die Zellen von Platten mit PBS, 1 mM EDTA losgelöst und die Expression von CD16TM oder den Chimären wurde durch indirekte Fluoreszenz und Strömungscytometrie gemessen.
Calciumfluß-Assay
Zellen der Jurkat-Subzellinie E6 (Weiss et al., J. Immunol. 133: 123–128 (1984)) wurden mit rekombinanten Vaccinia-Viren für eine Stunde in serumfreiem IMDM bei einem moi-Wert von 10 infiziert und für 3 bis 9 Stunden in IMDM, 10% FBS, inkubiert. Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und mit 3 × 10⁶ Zellen/ml in vollständigem Medium, das 1 mM Indo-1-Acetomethoxyester enthielt (Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260: 3340–3450 (1985)) (Molecular Probes), resuspendiert und bei 37°C für 45 Minuten inkubiert. Die mit Indo-1 beladenen Zellen wurden pelletisiert und mit 1 × 10⁶/ml in serumfreiem IMDM resuspendiert und bei Raumtemperatur im Dunklen gelagert. Zellen wurden durch gleichzeitige Messung der violetten und blauen Fluoreszenzemission durch Strömungscytometrie auf freie Calciumionen analysiert (Rabinovitch et al., J. Immunol. 137: 952–961 (1986)). Um einen Calciumfluß zu initiieren wurde entweder Phycoerythrin (PE)-konjugiertes Leu-3A (anti-CD4) (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) mit 1 μg/ml zu der Zellsuspension gegeben, gefolgt von 10 μg/ml nicht-konjugiertem Ziege-Anti-Maus-IgG zur Zeit 0 oder nicht-konjugierter 3G8 (anti-CD16) monoklonaler Antikörper wurde zu der Zellsuspension mit 1 μg/ml, gefolgt von 10 μg/ml PE-konjugiertes Fab₂'-Ziege-anti-Maus-IgG zur Zeit 0, gegeben. Histogramme des violette/blaue Emission-Verhältnisses wurden von der PE-positiven (infizierten) Zellpopulation, die typischerweise 40–80% aller Zellen repräsentierte, gesammelt. Die T-Zelle-Antigen-Rezeptor-Antwort in nicht-infizierten Zellen wurde durch den Antikörper OKT3 ohne Vernetzung ausgelöst. Für Experimente, bei denen CD16-chimäre Rezeptoren beteiligt sind, wurden Proben, die eine Basislinienverschiebung zu niedrigerem intrazellulärem Calcium (ohne Antikörper) zeigten, von der Analyse ausgeschlossen. Histogrammdaten wurden anschließend durch Umwandlung der binären Daten in ASCII unter Verwendung der Write Hand Man (Cooper City, FL)-Software analysiert, wobei sich eine Analyse mit einer Sammlung von FORTRAN-Programmen anschloß. Das Verhältnis violette/blaue Emission vor der Zugabe der zweiten Antikörperreagentien wurde verwendet, um das normalisierte Anfangsverhältnis zu entwickeln, auf die Einheit umgewandelt und das verbleibende Grenzverhältnis so eingestellt, daß 10% der verbleibenden Population die Grenze überschritt.
Cytolyse-Assay
Die humane T-Zellinie WH3, eine restringierte cytolytische CD8⁺ CD4^– HLA B44- Linie wurde in IMDM, 10% humanes Serum mit 100 U/ml IL-2, gehalten und wurde periodisch entweder nicht-spezifisch mit bestrahlten (3000 rad), nicht mit HLA-gepaarten peripheren Blutlymphozyten und 1 μg/ml Phytohämagglutinin oder spezifischer mit bestrahlten B44-tragenden einkernigen Zellen stimuliert. Nach einem Tag nicht-spezifischer Stimulation wurde der PHA durch Zugabe von frischem Medium auf 0,5 μg/ml verdünnt und nach 3 Tagen wurde das Medium gewechselt. Zellen wurden für wenigstens 10 Tage nach der Stimulation vor Verwendung in Cytotoxizitäts-Assays wachsen gelassen. Die Zellen wurden mit rekombinantem Vaccinia in einer Infektionsmultiplizität von wenigstens 10 für eine Stunde in serumfreiem Medium infiziert, worauf sich eine Inkubation in vollständigem Medium für 3 Stunden anschloß. Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und mit einer Dichte von 1 × 10⁷ Zellen pro ml resuspendiert. 100 μl wurden in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit U-Boden, die 100 μl pro Vertiefung vollständiges Medium enthielt, gegeben Die Zellen wurden in zweifachen Verdünnungsschritten verdünnt. Zwei Vertiefungen für jede Probe enthielten keine Lymphozyten, um eine spontane Chromfreisetzung und Gesamtchromaufnahme messen zu können. Die Targetzellen aus der HeLa-Sublinie S3 wurden in 6,0 oder 10,0 cm-Platten bei einem ungefähren moi-Wert von 10 für eine Stunde in serumfreien Medium infiziert, worauf sich eine Inkubation in vollständigem Medium für 3 Stunden anschloß. Sie wurden dann mit PBS, 1 mM EDTA von den Platten losgelöst und gezählt. Ein Aliquot von 10⁶ Targetzellen (HeLa^–, Raji^– oder J2.2.5-Zellen für die CD4-chimärer Rezeptor-Experimente und 3G8 10-2-Zellen; Shen et al., Mol. Immunol. 26: 959 (1989) für die CD16-Chimären Rezeptor-Experimente) wurden zentrifugiert und in 50 μl sterilem ⁵¹Cr-Natriumchromat (1 mCi/ml, Dupont Wilmington, DE) für eine Stunde bei 37°C mit intermittierendem Mischen resuspendiert und dann 3-mal mit PBS gewaschen. 100 μl markierte Zellen, die in Medium mit 10⁵ Zellen/ml resuspendiert worden waren, wurden in jede Vertiefung gegeben. Raji- und RJ2.2.5-Targetzellen wurden in der gleichen Weise wie HeLa-Zellen markiert. Die Mikrotiterplatte wurde mit 750 × g für 1 Minute zentrifugiert und 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Am Ende des Inkubationszeitraums wurden die Zellen in jeder Vertiefung durch leichtes Pipettieren resuspendiert, eine Probe wurde entfernt, um die gesamten eingebauten Zahlen zu bestimmen und die Mikrotiterplatte wurde für 1 Minute mit 750 × g zentrifugiert. 100 μl-Aliquots Überstand wurden entfernt und in einem gamma-Röntgenstrahl-Szintillationszählers gezählt. Die prozentuale Abtötung wurde für die Fraktion infizierter Targetzellen (üblicherweise 50–90%), die durch Strömungscytometrie gemessen wurde, korrigiert. Für infizierte Effektorzellen wurde das Effektor:Target- Verhältnis für den prozentualen Anteil infizierter Zellen (üblicherweise 20 bis 50% für die CD4-chimärer Rezeptor-Experimente und > 70% für die CD16-chimärer Rezeptor-Experimente) korrigiert.
In vitro-Mutagenese der ζ-Sequenz
Um Punktmutationen in den Aminosäure-Resten 11 und/oder 15 der ζ-Sequenz zu schaffen, wurden synthetische Oligonukleotid-Primer, die sich von der BamHI-Stelle stromaufwärts der ζ-Transmembrandomäne erstrecken und den nativen ζ-Rest 11 von Cys in Gly (C11G) oder den Rest 15 von Asp in Gly (D15G) oder beide (C11G/D15G) umwandeln, hergestellt und in PCR-Reaktionen verwendet, um mutierte Fragmente zu erzeugen, die in die Wildtyp-CD4:ζ-Konstrukte reinsertiert wurden.
Um ζ-Deletionen zu schaffen, wurden ζ-cDNA-Sequenzen durch PCR unter Verwendung synthetischer Oligonukleotid-Primer, die so konzipiert waren, daß ein Stoppcodon (UAG) nach den Resten 50, 59 oder 65 geschaffen wurde, amplifiziert. Die Primer enthielten die Spaltungsstelle für das Enzym NotI, geplant fünf oder sechs Reste vom 5'-Ende, üblicherweise in einer Sequenz der Form CGC GGG CGG CCG CTA (SEQ ID NO: 11), wobei die letzten drei Reste dem Stopp-Anticodon entsprechen. Auf die NotI- und Stopp-Anticoden-Sequenzen folgten 18 oder mehr Reste, die zu dem gewünschten 3'-Ende des Fragments komplementär waren. Die resultierenden Chimären wurden CD16:ζY51*, CD16:ζE60* bzw. CD16:ζD66* genannt. Die BamHI-Stelle stromaufwärts der Transmembrandomäne und die NotI-Stelle wurden verwendet, um Fragmente zu schaffen, die in das Wildtyp-CD16:ζ-Konstrukt wieder eingeführt wurden. Monomere ζ-Chimäre wurden geschaffen, indem die ζ-Transmembran- und die Membran-proximalen intrazellulären Sequenzen durch BamHI- und SacI-Verdau des Asp^–- und Cys^–-CD4:ζ-Konstrukts, das oben beschrieben wurde, freigesetzt wurden und das Fragment in das CD16:ζE60*- bzw. CD16:ζD66*-Konstrukt insertiert wurden.
Dreiteilige CD16:ζ(48-65)- und CD16:7:ζ(48-59)-Chimären-Konstruktion
Um das Konstrukt CD16:ζD66* herzustellen, wurde die ζ-cDNA-Sequenz, die der Transmembrandomäne und den 17 folgenden Resten der cytoplasmatischen Domäne entspricht, durch die entsprechende Transmembran- und cytoplasmatische Domäne, die aus der CR5- und CD7-cDNA erhalten worden war, ersetzt. Die CD5- und CD7-Fragmente wurden durch eine PCR-Reaktion unter Verwendung von Vorwärts-Oligonukleotiden, die eine BamHI-Restriktionsspaltungsstelle enthalten und der Region unmittelbar stromaufwärts der Transdomäne von CD5 bzw. CD7 entsprechen, und der folgenden reversen Oligonukleotide, die CD5- und CD7-Sequenzen und die ζ-Sequenz, die die SacI-Restriktionsspaltungsstelle enthielt überlappen, erzeugt.
CD5:ζ: CGC GGG CTC GTT ATA GAG CTG GTT CTG GCG CTG CTT CTT CTG (SEQ ID NO: 12)
CD7:ζ: CGC GGG GAG CTC GTT ATA GAG CTG GTT TGC CGC CGA ATT CTT ATC CCG (SEQ ID NO: 13)
Die Cd5- und CD7-PCR-Produkte wurden mit BamHI und SacI verdaut und an BamHI- und SacI-verdautes CD16:ζE60* ligiert und die ζ-Sequenz von BamHI bis SacI wurde durch das CD7-Fragment ersetzt. Um die Konstrukte CD16:CD5 und CD16:CD7 herzustellen, wurden CD5- und CD7-Fragmente durch PCR erhalten, wobei ein Oligonukleotid, das eine NotI-Restriktionsspaltungsstelle enthielt und für ein Stoppcodon (UAA) nach dem Rest Gln416 und Ala193 von CD5 bzw. CD7 codiert, verwendet wurde. Das CD5- und das CD7-PCR-Fragment wurden mit BamHI und NotI verdaut und in das CD16:ζAsp66*-Konstrukt insertiert.
In vitro-Mutagenese der N-terminalen Reste innerhalb des cytologisches Signal-transduzierenden ζ-Motivs
Synthetische Oligonukleotid-Primer, die sich von der SacI-Stelle im Inneren des ζ-Motivs erstrecken und den nativen Rest 48 von Asn in Ser umwandeln (N48S), den Rest 50 von Leu in Ser umwandeln (L50S) und den Rest 51 von Tyr in Phe umwandeln (Y51F), wurden synthetisiert und in einer PCR-Reaktion eingesetzt, um Fragmente zu erzeugen, die wieder in das Wildtyp-CD16:7:ζ(48-65)-Konstrukt eingeführt wurden.
In vitro-Mutagenese der C-terminalen Reste innerhalb des cytologisches Signal-transduzierenden ζ-Motivs
Synthetischer Oligonukleotid-Primer, die sich von der NotI-Stelle 3' bis zu de Stoppcodon erstrecken und den nativen Rest 60 von Glu in Gln umwandeln (E60Q), den Rest 61 von Glu in Gln umwandeln (E61Q), den Rest 62 von Tyr in Phe oder Ser umwandeln (Y62F oder Y62S) und den Rest 63 von Asp in Asn umwandeln (D63N), wurden synthetisiert und in einer PCR eingesetzt, um Fragmente zu erzeugen, die in das Wildtyp-CD16:ζD66*-Konstrukt aus der BamHI-Stelle in die NotI-Stelle subkloniert wurden.
Chimäre Konstruktionen CD16:7:ζ(33-65), CD16:7:ζ(71-104), CD16:7:ζ(104-137)
Ein CD7-Transmembran-Fragment, das MluI- und NotI-Stellen an der Verknüpfung zwischen der Transmembran- und der intrazellulären Domäne trägt, wurde durch PCR unter Verwendung eines Oligonukleotids mit der folgenden Sequenz: CGC GGG GCG GCC ACG CGT CCT CGC CAG CAC ACA (SEQ ID NO: 14) erhalten. Das resultierende PCR-Fragment wurde mit BamHI und NotI verdaut und in das CD16:7:ζ(48-65)-Konstrukt reinsertiert. ζ-Fragmente, die für die Reste 33 bis 66, 71 bis 104 und 104 bis 137 codieren, wurden durch PCR-Reaktion unter Verwendung von Primerpaaren, die MluI-Stellen am 5'-Ende der Vorwärtsprimer und Stoppcodons, gefolgt von NotI-Stellen am 5'-Ende der Rückwärtsprimer enthalten, erhalten. In jedem Fall waren die Restriktionsstellen 6 Reste vom 5'-Terminus des Primers beabsichtigt, um eine Restriktionsenzymspaltung sicherzustellen.
ζ 33: CGC GGG ACG CGT TTC AGC CGT CCT CGC CAG CAC ACA (SEQ ID NO: 15);
ζ 71: CGC GGG ACG CGT GAC CCT GAG ATG GGG GGA AAG (SEQ ID NO: 16) und
ζ 104: CGC GGG ACG CGT ATT GGG ATG AAA GGC GAG CGC (SEQ ID NO: 17).
Konstruktion von FcRγIIA-Deletionsmutanten
Carboxyl-terminale FcRIIA-Deletionsmutanten wurden durch PCR in der gleichen Weise wie die Vollängenkonstrukte konstruiert, wobei die Sequenzen, die für Tyrosin in den Positionen 282 und 298 codieren, in Stoppcodons (TAA) umgewandelt wurden. Die N-terminalen Deletionen wurden durch Amplifizieren von Fragmenten, die sukzessiv für weniger der intrazellulären Domäne codieren, durch PCR erzeugt, wobei Oligonukleotide verwendet wurden, welche die Insertion der resultierenden Fragmente zwischen MluI- und NotI-Restriktionstellen in ein vorher konstruiertes Expressionsplasmid, das für die CD16-extrazelluläre Domäne fusioniert mit der CD7-Transmembrandomäne codiert, ermöglichte, wobei die letztgenannte in einer MluI-Stelle und der Verbindung zwischen der Transmembran und der intrazellulären Domäne endet.
Andere Ausführungsformen
Die oben beschriebenen Beispiele zeigen, daß eine Aggregation von ζ-, η- oder γ-Chimären ausreicht, um die cytolytische Effektorzellantwort in T-Zellen zu initiieren. Der bekannte Expressionsbereich von ζ, η und γ, der T-Lymphozyten, natürliche Killerzellen, basophile Granulozyten, Makrophagen und Mastzellen einschließt, legt nahe, daß konservierte Sequenzmotive mit einem sensorischen Apparat wechselwirken können, der Zellen hämatopoetischen Ursprungs gemeinsam ist, und daß eine wichtige Komponente der Wirtsabwehr im Immunsystem durch Rezeptoraggregationsereignisse vermittelt werden kann.
Die Stärke der cytolytischen Antwort und das Fehlen einer Antwort auf Zielzellen, die MHC-Klasse II-Rezeptoren tragen, zeigt, daß Chimäre auf der Basis von ζ, η oder γ, die Basis für eine genetische Intervention für AIDS durch adoptive Immuntherapie bilden. Die breite Verteilung von endogenem ζ und γ und der Beweis, daß Fc-Rezeptoren, die mit γ assoziiert sind, in verschiedenen Zelltypen Cytotoxizität vermitteln (Fanger et al., Immunol. Today 10: 92–99 (1989)), ermöglicht es einer Vielzahl von Zellen für diesen Zweck in Betracht zu kommen. Beispielsweise sind neutrophile Granulocyten, die eine sehr kurze Lebensdauer (ungefähr 4 h) im Blutkreislauf haben und die intensiv cytolytisch sind, attraktive Zielzellen für eine Expression der Chimären. Es ist unwahrscheinlich, daß eine Infektion von Neutrophilen mit HIV zur Virusfreisetzung führt und die Fülle dieser Zellen (am dominierendsten der Leukozyten) sollte eine Wirtsabwehr erleichtern. Eine weitere attraktive Möglichkeit für Wirtszellen sind reife T-Zellen, eine Population, die derzeit für eine retrovirale gentechnische Veränderung zugänglich ist (Rosenbert, Sci. Am. 262: 62–69 (1990)). Mit Hilfe von rekombinantem IL-2, können T-Zell-Populationen in Kultur mit relativer Leichtigkeit expandiert werden und die expandierten Populationen haben typischerweise eine begrenzte Lebenszeit, wenn sie reinfundiert werden (Rosenberg et al., N. Engl. J. Med., 323: 570–578 (1990)).
Unter den geeigneten Bedingungen sollte eine HIV-Erkennung durch Zellen, die CD4-Chimäre exprimieren, auch mitogene Stimuli liefern, was die Möglichkeit bietet, daß eine bewaffnete Zellpopulation dynamisch auf die Viruslast reagieren könnte. Obgleich wir uns hier auf das Verhalten der Fusionsproteine in cytolytischen T-Lymphozyten konzentriert haben, könnte eine Expression der Chimären in Helfer-Lymphozyten eine HIV-mobilisierte Quelle für Cytokine liefern, die dem Kollaps des Helferzellen-Untersatzes bei AIDS entgegenwirken könnten. Eine kürzliche Beschreibung verschiedener Schemata zur Modifikation von Resistenz gegen Infektion mit anderen Schritten als Viruspenetration (Friedman et al., Nature 333: 452–454 (1988); Green et al., Cell 58: 215–223 (1989); Malim et al., Cell 58: 205–214 (1989); Trono et al., Cell 59: 113–120 (1989); Buonocore et al., Nature 345: 625–628 (1990) legt nahe, daß Zellen die CD4-Chimäre tragen, so konzipiert sein könnten, daß sie einen Virusproduktion durch Expression geeigneter Mittel, die eine intrazelluläre Wirkstelle haben, vereiteln.
Die Fähigkeit, Signale auf T-Lymphozyten durch autonome Chimäre zu übertragen, liefert auch die Fähigkeit zur Regulation der retroviral entwickelten Lymphozyten in vivo. Vernetzungsstimuli, die zum Beispiel durch spezifische IgM-Antikörper vermittelt werden, die genetisch so aufgebaut sind, daß sie Komplement-bindende Domänen entfernen, können es ermöglichen, daß sich solche Lymphozyten in situ in der Zahl erhöhen, während eine Behandlung mit ähnlichen spezifischen IgG-Antikörpern (zum Beispiel Erkennung einer Aminosäurevariation, die in die chimäre Kette konstruiert ist) selektiv die genetisch veränderte Population auslöschen könnte. Zusätzlich erfordern Anti-CD4-IgM-Antikörper keine zusätzliche Vernetzung, um Calcium in Jurkatzellen, die CD4:ζ-Chimäre exprimieren, zu mobilisieren. Die Fähigkeit, Zellpopulationen zu regulieren, ohne auf wiederholte extrakorporeale Amplifikation zurückzugreifen, kann im wesentlichen den Bereich und die Wirksamkeit derzeitiger Verwendungen ausdehen, die für genetisch veränderte T-Zellen vorgeschlagen werden.
Um andere Chimäre zu schaffen, die aus intrazellulären ζ-, η- oder γ-Sequenzen bestehen, können cDNA oder genomische Sequenzen, die für eine extrazelluläre Domäne des Rezeptors codieren, mit einer Restriktionsstelle ausgestattet werden, die an einer Stelle eingeführt ist, die unmittelbar der Transmembrandomäne der Wahl vorausgeht. Das extrazelluläre Domänenfragment, das in der Restriktionsstelle endet, kann dann mit ζ-, η- oder γ-Sequenzen verbunden werden. Typische extrazelluläre Domänen können von Rezeptoren abgeleitet werden, die Komplement, Kohlenhydrate, virale Proteine, Bakterien, Protozoon oder Metazoon als Parasiten oder Proteine, die durch diese induziert werden, erkennen. Gleichermaßen können Liganden oder Rezeptoren, die durch Pathogene oder Tumorzellen exprimiert werden, an ζ-, η- oder γ-Sequenzen gebunden werden, um Immunantworten gegen Zellen, die Rezeptoren tragen, welche diese Liganden erkennen, zu steuern.
Obgleich die Erfindung in Verbindung mit spezifischen Ausführungsformen derselben beschrieben wurde, wird einzusehen sein, daß sie für weitere Modifikationen geeignet ist; und diese Anmeldung soll Variationen, Verwendungen oder Anpassungen der Erfindung abdecken und solche Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung mit umfassen, wie sie dem Fachmann bei der Durchführung der Erfindung einfallen und wie sie auf die wesentlichen Merkmale, die im Rahmen der beigefügten Ansprüche liegen, angewendet werden können.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Medikaments zur therapeutischen Anwendung bei einer Infektion, einer Tumorerkrankung oder einer Autoimmunerkrankung, dadurch gekennzeichnet, daß therapeutische Zellen erzeugt werden, die wenigstens zwei Membran-gebundene, proteinische, chimäre Rezeptoren exprimieren, wobei einer der Rezeptoren umfaßt: (a) einen extrazellulären Teil, der fähig ist, eine Zielzelle oder ein infektiöses Zielagens spezifisch zu erkennen und zu binden, und (b) einen intrazellulären oder Transmembran-Teil, der fähig ist, der therapeutischen Zelle das Signal zu geben, eine Rezeptor-gebundene Zielzelle oder ein Rezeptor-gebundenes, infektiöses Agens zu zerstören; wobei der intrazelluläre oder Transmembran-Teil von einem T-Zellrezeptor ζ-, η-, CD3-delta- oder T3-gamma-Protein; einem Fc-Rezeptor-γ-protein oder einem B-Zellrezeptor mb1- oder B29-Protein oder einem funktionellen Derivat davon abgeleitet ist; und wobei der zweite der Rezeptoren umfaßt: (a) einen extrazellulären Teil, der fähig ist, die Zielzelle oder das infektiöse Zielagens spezifisch zu erkennen und zu binden und (b) einen intrazellulären Teil, der von CD28 abgeleitet ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zielzelle eine mit einem infektiösen Agens infizierte Wirtszelle, eine Tumor- oder Krebszelle oder eine autoimmun gebildete Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die zelluläre Antwort MHC-unabhängig ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei nach Bindung des extrazellulären Teils an das Agens oder die Zelle der Transmembran-Teil mit einem cytolytischen, signaltransduzierenden Protein der therapeutischen Zelle oligomerisiert, was zur Zerstörung der Rezeptor-gebundenen Zelle oder des Rezeptor-gebundenen Agenses führt.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der chimäre Rezeptor entweder (a) Aminosäuren 421-532 von SEQ ID NO: 6 oder ein funktionelles, cytolytisches, signaltransduzierendes Derivat davon; (b) Aminosäuren (a) 423-455; (b) 438-455; (c) 461-494 oder (d) 494-528 von SEQ ID NO: 6; (c) Aminosäuren 400-420 von SEQ ID NO: 6; (d) Aminosäuren 421-575 von SEQ ID NO: 4 oder ein funktionelles, cytolytisches, signaltransduzierendes Derivat davon; (e) Aminosäuren (a) 423-455; (b) 438-455; (c) 461-494 oder (d) 494-528 von SEQ ID NO: 4; (f) Aminosäuren 400-420 von SEQ ID NO: 4 oder (g) Aminosäuren 421-462 von SEQ ID NO: 5 oder ein funktionelles, cytolytisches, signaltransduzierendes Derivat davon; (h) Aminosäuren 402-419 von SEQ ID NO: 5; (i) Aminosäuren Tyr282-Tyr298, einschließlich, von 15A; (j) Aminosäuren 132-171 von 16 (SEQ ID NO: 24); (k) Aminosäuren 140-182 von 17 (SEQ ID NO: 25); (l) Aminosäuren 162-220 von 18 (SEQ ID NO: 26); oder (m) Aminosäuren 183-228 von 19 (SEQ ID NO: 27) umfaßt.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei das Fc-Rezeptorprotein humanes FcγRIII, humanes FcRIIγA oder humanes FcRIIγC ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei die therapeutischen Zellen aus der Gruppe, bestehend aus (a) T-Lymphozyten; (b) cytotoxischen T-Lymphozyten; (c) natürlichen Killerzellen; (d) Neuthrophilen; (e) Granulozyten; (f) Makrophagen; (g) Mastzellen und (h) HeLa-Zellen, ausgewählt sind.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei des infektiöse Zielagens ein Immundefizienzvirus ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei der extrazelluläre Teil einen HIV-Hülle-bindenden Teil von CD4 oder ein funktionelles HIV-Hülle-bindendes Derivat davon umfaßt.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei der HIV-Hülle-bindenden Teil von CD4 das Peptid umfaßt, das durch die Nukleotide 1-369 von SEQ ID NO: 1 codiert wird.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei die therapeutischen Zellen die Rezeptor-gebundene Zielzelle oder das infektiöse Zielagens durch Cytolyse zerstören.
Zelle, die wenigstens zwei proteinische, membrangebundene, chimäre Rezeptoren exprimiert, wobei einer der Rezeptoren umfaßt: (a) einen extrazellulären Teil und (b) einen intrazellulären oder Transmembran-Teil, wobei der intrazelluläre Teil oder Transmembran-Teil der zellsignaltransduzierende Teil eines T-Zell-Rezeptorproteins, eines B-Zell-Rezeptorproteins oder eines Fc-Rezeptorproteins oder eines funktionellen Derivats davon ist; und der zweite der Rezeptoren umfaßt: (a) einen extrazellulären Teil, wobei der extrazelluläre Teil des ersten und des zweiten Rezeptors einen HIV-Hülle-bindenden Teil von CD4 oder ein funktionelles HIV-Hülle-bindendes Derivat davon umfaßt, und (b) einen intrazellulären Teil, der von CD28 abgeleitet ist.
Zelle nach Anspruch 12, wobei die Zielzelle einem mit einem infektiösen Agens infizierte Wirtszelle, eine Tumor- oder Krebszelle oder eine autoimmun gebildete Zelle ist.
Zelle nach Anspruch 12 oder 13, wobei die Bindung MHC-unabhängig ist.
Zelle nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei die intrazelluläre oder Transmembran-Domäne entweder von einem T-Zellrezeptor ζ-, -η-, CD3-delta- oder T3-gamma-Protein; einem Fc-Rezeptor-γ-protein oder einem B-Zellrezeptor mb1- oder B29-Protein abgeleitet ist.
Zelle nach Anspruch 15, wobei der chimäre Rezeptor entweder (a) Aminosäuren 421-532 von SEQ ID NO: 6 oder ein funktionelles, cytolytisches, signaltransduzierendes Derivat davon; (b) Aminosäuren (a) 423-455; (b) 438-455; (c) 461-494 oder (d) 494-528 von SEQ ID NO: 6; (c) Aminosäuren 400-420 von SEQ ID NO: 6; (d) Aminosäuren 421-575 von SEQ ID NO: 4 oder ein funktionelles, cytolytisches, signaltransduzierendes Derivat davon; (e) Aminosäuren (a) 423-455; (b) 438-455; (c) 461-494 oder (d) 494-528 von SEQ ID NO: 4; (f) Aminosäuren 400-420 von SEQ ID NO: 4 (g) Aminosäuren 421-462 von SEQ ID NO: 5 oder ein funktionelles, cytolytisches, signaltransduzierendes Derivat davon; (h) Aminosäuren 402-419 von SEQ ID NO: 5; (i) Aminosäuren Tyr282-Tyr298, einschließlich, von 15A; (j) Aminosäuren 132-171 von 16 (SEQ ID NO: 24); (k) Aminosäuren 140-182 von 17 (SEQ ID NO: 25); (l) Aminosäuren 162-220 von 18 (SEQ ID NO: 26); (m) Aminosäuren 183-228 von 19 (SEQ ID NO: 27) umfaßt.
Zelle nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei das Fc-Rezeptorprotein humanes FcγRIII, humanes FcRIIIγA oder humanes FcRIIγC ist.
Zelle nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei der extrazelluläre Teil den Liganden-bindenden Teil eines Rezeptors, den Rezeptor-bindenden Teil eines Liganden, den Antigen-bindenden Teil eines Antikörpers oder ein funktionelles Derivat davon umfaßt.
Zelle nach Anspruch 18, wobei das infektiöse Zielagens ein Immundefizienzvirus ist oder die Zielzelle eine mit einem Immundefizienzvirus infizierte Wirtszelle ist.
Zelle nach Anspruch 19, wobei der extrazelluläre Teil einen HIV-Hülle-bindenden Teil von CD4 oder ein funktionelles Derivat davon umfaßt.
Zelle nach Anspruch 20, wobei der HIV-Hülle-bindende Teil von CD4 das Peptid umfaßt, das durch die Nukleotide 1-369 von SEQ ID NO: 1 codier wird.
Zelle nach Anspruch 12, wobei die Zelle die Rezeptor-gebundene Zielzelle oder das infektiöse Zielagens durch Cytolyse zerstört.
Zelle, die wenigstens zwei proteinische Membrangebundene, chimäre Rezeptoren exprimiert, wobei einer der Rezeptoren umfaßt: (a) einen extrazellulären Teil und (b) einen intrazellulären oder Transmembran-Teil, der von einem T-Zellrezeptor CD3, zeta- oder eta-Polypeptid, einem B-Zellrezeptor oder einem Fc-Rezeptor abgeleitet ist, und der zweite der Rezeptoren umfaßt: (a) einen extrazellulären Teil, wobei der extrazelluläre Teil des ersten und des zweiten Rezeptors einen HIV-Hülle-bindenden Teil von CD4 oder ein funktionelles HIV-Hülle-bindendes Derivat davon umfaßt, und (b) einen intrazellulären Teil, der von CD28 abgeleitet ist.
Zelle nach Anspruch 12 oder 23, wobei der chimäre Rezeptor entweder (a) einen extrazellulären CD16-, CD7- oder CD5-Teil; (b) einen CD5- oder CD7-Transmembran-Teil oder (c) einen intrazellulären CD5-Teil umfaßt.
Paar proteinischer Membran-gebundener, chimärer Rezeptoren, wobei einer der Rezeptoren umfaßt: (a) einen extrazellulären Teil und (b) einen intrazellulären oder Transmembran-Teil, wobei der intrazelluläre oder Transmembran-Teil der signaltransduzierende Teil eines T-Zell-Rezeptorproteins, eines B-Zell-Rezeptorproteins oder eines Fc-Rezeptorproteins oder eines funktionellen Derivats davon ist; und der zweite der Rezeptoren umfaßt: (a) einen extrazellulären Teil, wobei die extrazellulären Teile des ersten und des zweiten Rezeptors einen HIV-Hülle-bindenden Teil von CD4 oder ein funktionelles HIV-Hülle-bindendes Derivat davon umfassen, und (b) einen intrazellulären Teil, der von CD28 abgeleitet ist.
Paar proteinischer membrangebundener, chimärer Rezeptoren, wobei einer der Rezeptoren umfaßt: (a) einen extrazellulären Teil und (b) einen intrazellulären oder Transmembran-Teil, der von einem T-Zellrezeptor CD3, zeta- oder eta-Polypeptid, einem B-Zellrezeptor oder einem Fc-Rezeptor abgeleitet ist; und der zweite der Rezeptoren umfaßt: (a) einen extrazellulären Teil, wobei die extrazellulären Teile des ersten und des zweiten Rezeptors einen HIV-Hülle-bindenden Teil von CD4 oder ein funktionelles HIV-Hülle-bindendes Derivat davon umfassen, und (b) einen intrazellulären Teil, der von CD28 abgeleitet ist.
Paar DNA-Moleküle, wobei jedes für einen proteinischen, Membran-gebundenen, chimären Rezeptor nach Anspruch 25 oder 26 codiert.