DE69432487T2

DE69432487T2 - Änderung der zellulären immunität durch rezeptorchimäre

Info

Publication number: DE69432487T2
Application number: DE69432487T
Authority: DE
Inventors: Brian Seed; Charles Romeo; Waldemar Kolanus
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1993-07-16
Filing date: 1994-06-14
Publication date: 2004-04-08
Anticipated expiration: 2014-06-15
Also published as: NO960175D0; AU686646B2; HU224137B1; DE69432487D1; FI960178A0; FI119995B; AU6476798A; ZA945204B; AU712245C; AU7314094A; HUT74252A; ATE236973T1; JP2004222735A; KR100278352B1; EP0804552A4; WO1995002686A1; CZ291754B6; AU712245B2; JPH09500020A; PT804552E

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft funktionelle Protein-Tyrosin-Kinase-Chimäre, welche fähig sind Immunsystemfunktionen umzuleiten. Spezieller betrifft sie die Regulierung von Lymphocyten, Makrophagen, natürlichen Killer-Zellen oder Granulocyten durch die Expression von Chimären in den genannten Zellen, welche Chimären verursachen, daß die Zellen auf durch die Chimären erkannte Targets antworten. Die Erfindung betrifft auch funktionelle Protein-Tyrosin-Kinase-Chimäre, welche fähig sind therapeutische Zellen zu steuern, um entweder Zellen, welche mit einem spezifischen Infektionsmittel infiziert sind, das Infektionsmittel selbst, eine Tumorzelle oder eine Autoimmungebildete Zelle zu erkennen und zu zerstören. Spezieller bezieht sich die Erfindung auf die Herstellung von Protein-Tyrosin-Kinase-Chimären, welche fähig sind cytotoxische T-Lymphocyten zu steuern, damit diese HIV-Hüllproteine exprimierende Zellen spezifisch erkennen und lysieren. Die Erfindung liefert daher eine Therapie für Erkrankungen wie AIDS (erworbenes Immunschwächesyndrom), welche durch den HIV-Virus hervorgerufen werden.
Hintergrund der Erfindung
Die T-Zellen-Erkennung eines Antigens durch den T-Zell-Rezeptor ist die Grundlage für einen Bereich von immunologischen Phänomenen. Die T-Zellen steuern, was als zellvermittelte Immunität bezeichnet wird. Diese umfaßt die Zerstörung von Fremdgeweben oder von infizierten Zellen durch Zellen des Immunsystems. Es existiert eine Vielzahl von T-Zellen, einschließlich "Helfer-" und "Supressorzellen", welche die Immunantwort modulieren, und cytotoxischer (oder "Killer-") Zellen, welche abnorme Zellen direkt abtöten können.
Eine T-Zelle, welche ein einzigartiges Antigen erkennt und bindet, welches auf der Oberfläche einer anderen Zelle auftritt, wird aktiviert; sie kann sich anschließend vervielfältigen und, wenn es eine cytotoxische Zelle ist, kann sie die gebundene Zelle abtöten.
Eine Autoimmunerkrankung ist durch die Produktion von entweder Antikörpern, welche mit dem Wirtsgewebe reagieren, oder von Immuneffektor-T-Zellen, welche autoreaktiv sind, gekennzeichnet. In einigen Fällen können Autoantikörper durch eine normale T- und B-Zellantwort hervorgerufen werden, welche durch Fremdsubstanzen oder Organismen aktiviert wird, die Antigene enthalten, welche mit ähnlichen Verbindungen in Körpergeweben kreuzreagieren. Beispiele von klinisch relevanten Autoantikörpern sind Antikörper gegen Acetylcholin-Rezeptoren bei Myasthenia gravis; und Anti-DNA-, Anti-Erythrocyten- und Antiblättchen-Antikörper bei systemischem Lupus Erythematosus.
HIV und Immunopathogenese
1984 wurde gezeigt, daß HIV das ätiologische Mittel von AIDS ist. Seit damals wurde die Definition von AIDS mehrmals im Hinblick darauf überarbeitet, welche Kriterien in der Diagnose enthalten sein sollten. Trotz der Fluktuation in den diagnostischen Parametern ist der einfache gemeinsame Nenner von AIDS die Infektion mit HIV und die darauffolgende Entwicklung von anhaltenden konstitutionellen Symptomen und AIDS-definierenden Erkrankungen, wie sekundären Infektionen, Neoplasmen und neurologische Erkrankung. Harrison's Principles of Internal Medicine, 12. Ausgabe, McGraw Hill (1991).
HIV ist ein Human-Retrovirus der Lentivirus-Gruppe. Die vier anerkannten Human-Retroviren gehören zwei verschiedenen Gruppen an: Den humanen T-lymphotrophen (oder Leukämie)-Retro viren, HTLV-1 und HTLV-2, und den Human-Immunschwächeviren, HIV-1 und HIV-2. Die vorstehenden sind transformierende Viren, wogegen die letztgenannten cytopatische Viren sind.
HIV-1 wurde weltweit als häufigste Ursache von AIDS identifiziert. Die Sequenzhomologie zwischen HIV-2 und HIV-1 beträgt etwa 40%, wobei HIV-2 mit einigen Mitgliedern einer Gruppe von Affen-Immunschwächeviren (SIV) enger verwandt ist. Siehe Curran, J. et al., Science 329: 1357–1359 (1985); Weiss, R. et al., Nature 324: 572–575 (1986).
HIV besitzt die üblichen retroviralen Gene (env, gag, und pol) sowie sechs Extragene, welche in der Replikation und in anderen biologischen Aktivitäten des Virus involviert sind. Wie zuvor angeführt, ist der gemeinsame Nenner von AIDS eine profunde Immunosuppression, überwiegend der zellvermittelten Immunität. Diese Immunsuppression führt zu einer Vielzahl von opportunistischen Erkrankungen, insbesondere bestimmten Infektionen und Neoplasmen.
Die Hauptursache für den Immundefekt bei AIDS wurde als quantitative und qualitative Schwäche in der Untergruppe von aus Thymus-stammenden (T) Lymphocyten, der T4-Population, identifiziert. Diese Untergruppe von Zellen wird phenotypisch durch das Vorhandensein des CD4-Oberflächenmoleküls definiert, von welchem gezeigt wurde, daß es der Zellrezeptor für HIV ist. Dalgleish et al., Nature 312: 763 (1984). Obwohl die T4-Zelle der Hauptzelltyp ist, welcher mit HIV infiziert wird, ist im wesentlichen jede beliebige Humanzelle, welche das CD4-Molekül an ihrer Oberfläche exprimiert, fähig, an HIV zu binden oder damit infiziert zu werden.
Traditionell wurde CD4⁺ T-Zellen die Rolle von Helfer/Induktionszellen zugeordnet, was auf ihre Funktion zur Bereitstellung eines aktivierenden Signals für B-Zellen, oder das Indu zieren von T-Lymphocyten hinweist, welche den reziproken CD8-Marker tragen, um zu cytotoxischen/Suppressorzellen zu werden. Reinherz und Schlossman, Cell 19: 821–827 (1980); Goldstein et al., Immunol. Rev. 68: 5–42 (1982).
HIV bindet sich spezifisch und mit hoher Affinität über eine Anzahl von Aminosäuren in der viralen Hülle (gp120) an einen Abschnitt der V1-Region des CD4-Moleküls, welcher nahe dessen N-Terminus angeordnet ist. Auf die Bindung folgend verschmilzt der Virus mit der Targetzellmembran und wird internalisiert. Einmal internalisiert, verwendet er das Enzym reverse Transkriptase um seine genomische RNA in DNA zu transkribieren, welche in die Zell-DNA integriert wird, wo sie für die Lebensdauer der Zelle als ein "Provirus" existiert.
Der Provirus kann latent bleiben oder er kann aktiviert werden, um mRNA und genomische RNA zu transkribieren, was zu einer Proteinsynthese, einer Zusammenstellung, zur Ausbildung eines neuen Virions und zur Entwicklung des Viruses von der Zelloberfläche führt. Obwohl der genaue Mechanismus, durch welchen der Virus einen Zelltot hervorruft, nicht aufgeklärt wurde, wird angenommen, daß der Hauptmechanismus das massive virale Entwickeln von der Zelloberfläche ist, was zum Aufbrechen der Plasmamembran und zu einem osmotischen Ungleichgewicht führt.
Während des Infektionsverlaufs entwickelt der Wirtsorganismus Antikörper gegen virale Proteine, einschließlich der Haupt-Hüllglycoproteine gp120 und gp41. Trotz dieser humoralen Immunität schreitet die Erkrankung fort, was zu einer lethalen Immunosuppression führt, die durch mehrere opportunistische Infektionen, Parasitämie, Demenz und Tod gekennzeichnet ist. Das Versagen der anti-viralen Wirts-Antikörper, das Fortschreiten der Erkrankung zu beenden, stellt einen der irritierensten und alarmierensten Aspekte der Infektion dar und ist ein schlech tes Zeichen für auf herkömmlichen Ansätzen basierende Impfanstrengungen.
Zwei Faktoren können eine Rolle bei der Wirksamkeit der humoralen Antwort auf Immunschwächeviren spielen. Erstens zeigen die Immunschwächeviren, wie andere RNA-Viren (und wie Retroviren im besonderen), eine hohe Mutationsrate als Antwort der Immunüberwachung seitens des Wirtes. Zweitens sind die Hüllglycoproteine ihrerseits stark glycosylierte Moleküle, welche wenige Epitope anbieten, die für eine hochaffine Antikörperbindung geeignet sind. Das schlechte Antigentarget, welches die virale Hülle darstellt, bietet dem Wirt nur eine geringe Möglichkeit, die virale Infektion durch spezifische Antikör- perproduktion zu beschränken.
Zellen, welche vom HIV-Virus infiziert sind, exprimieren das gp120-Glycoprotein auf ihrer Oberfläche. Gp120 überträgt Fusionsevents unter CD4⁺-Zellen durch eine Reaktion, die jener ähnlich ist, durch welche der Virus in die uninfizierten Zellen eindringt, was zur Ausbildung von kurzlebigen Mehrkern-Riesenzellen führt. Diese Syncytiumbildung hängt von einer direkten Wechselwirkung des gp120-Hüllglycoproteins mit dem CD4-Protein ab. Dalgleish et al., oben; Klatzman, D. et al., Nature 312: 763 (1984); McDougal, J. S. et al., Science 231: 382 (1986); Sodroski, J. et al., Nature 322: 470 (1986); Lifson, J. D. et al., Nature 323: 725 (1986); Sodroski, J. et al., Nature 321: 412 (1986).
Ein Nachweis, daß die CD4-gp120-Bindung für die virale Infektion von das CD4-Antigen tragenden Zellen verantwortlich ist, umfaßt die Feststellung, daß ein spezifischer Komplex zwischen gp120 und CD4 ausgebildet wird. McDougal et al., oben. Andere Untersuchungen haben gezeigt, daß die Zellinien, welche durch HIV nicht infizierbar waren, im Anschluß an eine Transfektion und Expression von Human-CD4-cDNA-Gen in infizierbare Zellinien übergeführt wurden. Maddon et al., Cell 46: 333–348 (1986).
Therapeutische Programme, welche auf löslichem CD4 als passivem Mittel zur Störung der viralen Adsorption und zur Syncytium-übertragenen Zelltransmission basieren, wurden von einer Anzahl von Gruppen vorgeschlagen und erfolgreich in vitro de- monstriert (Deen et al., Nature 331: 82–84 (1988); Fisher et al., Nature 331: 76–78 (1988); Hussey et al., Nature 331: 78–81 (1988); Smith et al., Science 238: 1704–1707 (1987); Traunecker et al., Nature 331: 84–86 (1988)); und CD4-Immunoglobulinfusionsproteine mit ausgedehnten Halbwertszeiten und einer mäßigen biologischen Aktivität wurden daraufhinfolgend entwickelt. (Capon et al., Nature 337: 525–531 (1989); Traunecker et al. Nature 339, 68–70 (1989); Byrn et al., Nature 344: 667–670 (1990); Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol. 9: 347–353 (1990)). Obwohl CD4-Immunotoxinkonjugate oder Fusionsproteine eine potente Cytotoxizität für infizierte Zellen in vitro zeigen (Chaudhary et al., Nature 335: 369–372 (1988); Till et al., Science 242: 1166–1168 (1988)), macht es die Latenz des Immunschwächesyndroms unwahrscheinlich, daß irgendeine Einzelbehandlungstherapie zur Eliminierung der viralen Belastung wirksam sein wird, und es ist wahrscheinlich, daß die Antigenizität fremder Fusionsproteine deren Annehmbarkeit in Behandlungen, welche eine wiederholte Dosierung erfordern, einschränkt. Versuche mit Affen, welche mit SIV befallen waren, haben gezeigt, daß lösliches CD4, wenn es an Tiere ohne markante CD4-Cytopönie verabreicht wird, den SIV-Titer verringern und die in vitro Anteile des Myeloidpotentials verbessern kann. (Watanabe et al., Nature 337: 267–270 (1989)). Es wurde jedoch ein sofortiges virales Wiederauftreten beobachtet, nachdem die Behandlung unterbrochen wurde, was nahelegt, daß eine lebenslange Verabreichung erforderlich sein könnte, um eine fortschreitende Schwächung des Immunsystems zu verhindern.
Zelloberflächenrezeptor-assoziierte Protein-Tyrosin-Kinasen
Der erste Anstoß für die Beteiligung von zellulären Effektorprogrammen im Immunsystem ist oft die Zellerkennung von im Cluster vorliegenden Liganden. Unter den Rezeptoren, von welchen bekannt ist, daß sie bei einer Aggregierung aktivierende Signale übermitteln, sind die B- und T-Zell-Antigen-Rezeptoren (DeFranco, 1992, Eur. J. Biochem. 210: 381–388; Weiss, 1991, Annu. Rev. Genet. 25: 487–510), Mitglieder der IgG- und IgE-Fc-Rezeptorfamilien (Fanger et al., 1989, Immunol. Today 10: 92-99; Ravetch und Kinet, 1991, Annu. Rev. Immunol. 9: 457–492) und eine Anzahl von accessorischen Rezeptoren, einschließlich CD2, CD4, CD8 und CD28 in T-Zellen (Yokoyama und Shevach, 1989, Year Immunol. 4: 110–146), CD19, CD20, CD21 und CD40 in B-Zellen (Clark und Ledbetter, 1989, Adv. Cancer Res. 52: 81-149), und CD44, CD45 und CD58 in Monocyten (Webb et al., 1990, Science 249: 1295–1297). Zusätzlich fördert eine große Anzahl von Phospholipid-verbundenen Proteinen die Zellaktivierung in einer Antigen-Rezeptor-abhängigen Weise, wenn diese auf der Oberfläche von T-Zellen vernetzt sind (Balk und Terhorst, 1989, Immunol. Ser. 45: 411–416; Kroczek et al., 1986, Nature 322: 181–184; Yeh et al., 1987, J. Immunol. 138: 91–97; Yokoyama und Shevach, 1989, Year Immunol. 4: 110–146).
Gegenwärtig ist nicht klar, wie ein einfaches physikalisches Ereignis, die Aggregierung, zu einem sich deutlich unterscheidenden physiologischen Signal führt. Die Beteiligung von Zelleffektorprogrammen, die durch die T-Zell- und B-Zell-Antigen-Rezeptoren vermittelt werden, und verschiedene Formen von Fc-Rezeptor können durch Vernetzen von chimären Proteinen, welche die intrazellulären Domänen der einzelnen Ketten der Rezeptorkomplexe tragen, nachgeahmt werden (Irving und Weiss, 1991, Cell 64: 891–901; Kolanus et al., 1992, EMBO J. 11: 4861–4868; Letourneur und Klausner, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8905-8909; Letourneur und Klausner, 1992, Science 255: 79- 82; Romeo und Seed, 1991, Cell 64: 1037–1046; Wegener et al., 1992, Cell 68: 83–95, WO 92/15322). In WO 92/15322 ist ein Verfahren zur Steuerung einer Zellantwort in einem Säugetier durch Exprimieren eines chimären Rezeptors in einer Zelle des Säugetiers, welcher chimäre Rezeptor verursacht, daß die Zellen ein Infektionsmittel, eine mit einem Infektionsmittel infizierte Zelle, eine Tumor- oder krebsartige Zelle oder eine Autoimmun-gebildete Zelle spezifisch erkennen und zerstören, beschrieben. Ebenfalls beschrieben sind Zellen, welche die chimären Rezeptoren exprimieren und DNA, welche für die chimären Rezeptoren codiert. Das minimale, wirksame Triggerelement scheint eine phyologenetisch konservierte (Reth, 1989, Nature 338: 383-384) Peptidsequenz zu erfordern, welche zwei Tyrosinreste enthält, die durch 10 oder 11 Reste voneinander getrennt und in einen hydrophilen, typischerweise sauren Kontext eingebettet sind (Romeo et al., 1992, Cell 68: 889–897; Irving et al., 1993, J. Exp. Med. 177, 1093–1103). Die Clusterbildung von Rezeptoren, welche dieses Element tragen, initiiert eine Aktivierungskaskade, für welche die Aktivität von Protein-Tyrosin-Kinase (PTK) wesentlich zu sein scheint; PTK-Inhibitoren blockieren sowohl frühe Ereignisse in der B- und T-Zellaktivierung, wie, die Calciummobilisierung und die späte ren Folgeerscheinungen von Cytokinfreisetzung und Zellwachstum (June et al., 1990, J. Immunol. 144: 1591–1599; Lane et al., 1991, J. Immunol. 146: 715–722; Mustelin et al., 1990, Science 247: 1584–1587; Stanley et al., 1990, J. Immunol. 145: 2189-2198). Obwohl die distaleren Konsequenzen der Rezeptoraktivierung nach dem Zelltyp differieren, sind die frühen Ereignisse unter Zellen aus verschiedenen hämatopoetischen Linien überraschend ähnlich. Beispielsweise haben die schnellen Anstiege in der PTK-Aktivität, welche auf eine Vernetzung des B-Zell-Antigen-Rezeptors (Gold et al., 1990, Nature 345: 810–813; Campbell und Sefton, 1990, EMBO J. 9: 2125–2131), des T-Zell-Antigen-Rezeptors (June, C. H., et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7722–7726; June, C. H., et al., 1990, J. Immunol.
144: 1591–1599) und des hochaffinen IgE-Rezeptors (Eiseman und Bolen, 1992, Nature 355: 78–80; Li et al., 1992, Mol. Cell. Biol. 12: 3176–3182) folgend beobachtet werden, die alle unter ihren frühen Phosphorylierungstargets die γ-Isoform von Phosphatidylinosit-spezifischer Phospholipase C (Carter et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2745–2749; Li et al., 1992, Mol. Cell Biol. 12: 3176–3182; Park et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 24237–24240; Park et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5453-5456; Secrist et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 12135–12139; Weiss et al., 1991, Annu. Rev. Genet. 25: 487–510), welche durch Tyrosinphosphorylierung direkt aktiviert wird (Nishibe et al., 1990, Science 250: 1253–1256).
Die PTK-Aktivitäten, von welchen soweit bekannt ist, daß sie mit Zelloberflächenrezeptoren assoziieren, fallen in zwei Klassen: jene, welche zur Familie der Src-Proto-oncogen-verwandten Kinasen zählen, und jene, welche mit der kürzlich gekennzeichneten Syk-Kinase verwandt sind. Von den Vorstehenden wurde für die Fyn-Kinase gezeigt, daß sie mit dem T-Zellrezeptor assoziiert (Gassmann et al., 1992, Eur. J. Immunol. 22: 283–286; Samelson et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 4358–4362), von den Lyn-, Fyn-, Blk- und Lck-Kinasen wurde berichtet, daß sie mit dem B-Zell-IgM-Rezeptor assoziieren (Burkhardt et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7410–7414; Campbell und Sefton, 1992, Mol. Cell. Biol. 12: 2315–2321; Yamanashi et al., 1991, Science 251: 192–194) und von den Lyn- und Yes-Kinasen wurde gezeigt, daß sie mit dem hochaffinen IgE-Rezeptor assoziieren (Eiseman und Bolen, 1992, Nature 355: 78–80; Hutchcroft et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9107–9111; Hutchcroft, J. E., et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 613–8619). Der Mechanismus der beobachteten Assoziierung ist im Detail noch nicht aufgeklärt worden, aber vorläufige Daten legen nahe, daß die intrazellulären Domänen der Rezeptorkomplexketten physikalisch mit den Src-Familie- Kinasen assoziieren können. (Clark et al., 1992, Science 258: 123–126; Timson Gauen et al., 1992, Mol. Cell. Biol. 12: 5438–5446). Gegenwärtig ist nicht klar, ob diese Assoziierungen direkt oder indirekt sind.
Gegenwärtig ist der zwingendste Nachweis für die Wichtigkeit von Kinasen der Src-Familie in der Zellaktivierung aus der Studie der Fyn- und Lck-Kinasen in T-Zellen erhalten worden. Die Überexpression von Fyn in transgenen Mäusen führt zu einem auf Antigen überansprechenden Phenotyp in den resultierenden T-Zellen, während die Überexpression einer katalytisch inaktiven Form das durch den T-Zell-Rezeptor-vermittelte Wachstum blockiert (Cooke et al., 1991, Cell 65: 281–291). Thymus-T-Zellen, welche von mutanten Mäusen isoliert werden, welchen die Fyn-Kinase-Aktivität fehlt, zeigen einen schweren Defekt in der Fähigkeit, eine proliferative Antwort als Antwort auf eine Behandlung mit einer Kombination aus Phorbolester plus entweder Anti-CD3-Antikörper oder Concanavalin A zu zeigen (Appleby et al., 1992, Cell 70: 751–763; Stein et al., 1992, Cell 70: 741–-750). Milz-T-Zellen, welche aus solchen Mäusen isoliert werden, zeigen eine weniger schwerwiegende, aber substantielle, Verstärkung der Zellaktivierungsantwort (Appleby et al., 1992, Cell 70: 751–763; Stein et al., 1992, Cell 70: 741–750).
In T-Zellen assoziiert die Lck-Kinase indirekt mit den TCR durch die CD4- und CD8-Corezeptoren (Rudd et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5190–5194; Shaw et al., 1989, Cell 59: 627–636; Turner et al., 1990, Cell 60: 755-765; Veillette et al., 1988, Cell 55: 301–308). Die Überexpression von Lck in einer auf Antigen ansprechenden Zelllinie potenziert die Rezeptorempfindlichkeit in ähnlicher Weise zu jener, welche mit Fyn beobachtet wird (Abraham und Veillette, 1990, Mol. Cell. Biol. 10: 5197–5206; Davidson et al., 1992, J. Exp. Med. 175: 1483-1492; Luo und Sefton, 1992, Mol. Cell. Biol. 12: 4724–4732). In einem CD4-abhängigen Mäuse-T-Zellen-Hybridomamodell konnte die Rekonstituierung der Antigen-spezifischen Helferfunktion nur mit CD4-Molekülen erzielt werden, welche zur Wechselwirkung mit Lck fähig waren (Glaichenhaus et al., 1991, Cell 64: 511-520).
Der stärkste Nachweis für die direkte Teilnahme der Lck-Kinase in der Antigen-Rezeptor-vermittelten Signalisierung stammt jedoch aus Studien von mutanten Zelllinien, welchen Lck fehlt. Zwei derartige Linien wurden untersucht, eine von der Jurkat-Human-T-Zellen-Leukämielinie abgeleitete (Goldsmith und Weiss, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6879–6883; Straus und Weiss, 1992, Cell 70: 585–593) und eine andere aus dem Mäusecytotoxischen T-Zellen-Klon CTLL-2 abgeleitete (Karnitz et al., 1992, Mol. Cell. Biol. 12: 4521–4530). Beide Lck-negative Mutantenlinien sind in der TCR-vermittelten Signalisierung fehlerhaft und die Ergänzung jeder Mutantenlinie durch Transfektion mit einem Lck-Expressionsplasmid stellt das Ansprechen auf TCR-Vernetzungsstimuli wieder her (Karnitz et al., 1992, Mol. Cell. Biol. 12: 4521–4530; Straus und Weiss, 1992, Cell. 70: 585–593).
Jüngste Mitglieder einer neuen Familie von Tyrosin-Kinasen, die ursprünglich durch die eng verwandten oder identen Kinasen Syk (Taniguchi et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 15790–15796) und PTK 72 (Zioncheck et al., 1986, J. Biol. Chem. 261: 15637-15643; Zioncheck et al., 1988, J. Biol. Chem. 263: 19195–19202) repräsentiert wurde, haben gezeigt, daß sie mit Zelloberflächenrezeptoren assoziieren. Obwohl von PTK 72 und Syk nicht definitiv gezeigt wurde, daß sie identisch sind, teilen sie eine übliche Gewebeverteilung (in der Thymusdrüse und in der Milz), die Molekularmasse und die Anfälligkeit gegenüber einer Proteolyse. Von PTK 72 wurde gezeigt, daß sie mit dem B-Zell-IgM-Rezeptor assoziiert (Hutchcroft et al., 1992, Proc. Natl., Acad. Sci. USA 89: 9107–9111; Hutchcroft, J. E., et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 8613–8619) und nach Vernetzung des Rezeptors mit Anti-IgM phosphoryliert wird (Hutchcroft et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 14846–14849). Eine gleichzeitig erfolgende Aktivierung des Enzyms, gemessen sowohl durch Autophosphorylierung als auch durch Phosphorylierung eines exogenen Proteinfragments, wurde auf die Oberflächen-IgM-Vernetzung folgend gezeigt (Hutchcroft et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9107–9111; Hutchcroft, J. E. et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 8613–8619). Von PTK 72 wurde auch festgestellt, daß sie mit dem hochaffinen IgE-Rezeptor in einer Ratten-basophilen Leukämiezelllinie assoziiert (Hutchcroft et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9107–9111; Hutchcroft, J. E., et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 8613–8619).
Von einem zweiten Mitglied der Syk-Familie, ZAP-70, wurde gezeigt, daß es eine PTK ist, welche auf eine Rezeptorvernetzung folgend mit der Zeta-Kette eines T-Zell-Rezeptors assoziiert (Chan et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9166–9170). Obwohl die Expression in COS-Zellen von ZAP-70, Fyn oder Lck zu mäßigen Anstiegen im Gesamtzelltyrosinphosphat führt, führt die Coexpression von ZAP-70 und entweder Lck oder Fyn zu einem dramatischen Anstieg in der Nettotyrosinphosphorylierung (Chan et al., 1992, Cell 71: 649–662). Wenn auch ein CD8-Zeta-Kette-Chimär vorhanden ist, wird das Chimär phosphoryliert und es wird festgestellt, daß ZAP-70 damit assoziiert (Chan et al., 1992, Cell 71: 649–662). Gegenwärtig ist nicht klar, ob ZAP-70 die Kinasen der Src-Familie aktiviert und/oder vice versa, noch warum die Coexpression von Kinasen in COS-Zellen zu einer sichtbaren wesentlichen Aktivierung führen sollte. Nichtsdestotrotz legt die aktive Assoziierung von ZAP-70 mit vernetztem TCR eine Rolle für diese PTK in der Verbreitung der Rezeptorantwort nahe.
Im Gegensatz zu den Kinasen der Src-Familie besitzen Syk und ZAP-70 zwei SH2-Domänen und keine N-terminale Myristoylierungsstelle (Taniguchi et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 15790-15796; Chan et al., 1992, Cell 71: 649–662). Eine natürliche Erwartung für den Mechanismus der Kinase-Rezeptor-Assoziierung ist jene, das die beiden SH2-Domänen die beiden Tyrosine des Antigen-Rezeptor-Triggermotivs binden, nachdem sie. phosphoryliert sind. Gegenwärtig ist dies jedoch lediglich eine Hypothese.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung zeigt die Möglichkeit der Ausbildung von Chimären zwischen der intrazellulären Domäne eines Protein-Tyrosin-Kinasemoleküls und einer extrazellulären Domäne, welche fähig ist, die Aufgabe der Targeterkennung zu erfüllen. Insbesondere löst die Clusterbildung von Chimären, welche Sykoder ZAP-70-Kinase-Sequenzen tragen, die Calciummobilisierung aus. Die Aggregierung von Syk-Chimär alleine oder die Coaggregierung von Chimären, welche Fyn- oder Lck- und ZAP-70-Kinasen tragen, reicht aus, um die cytolytische Effektorfunktion zu initiieren. Eine derartige Effektorfunktion ermöglicht die spezifische Erkennung und Zerstörung von unerwünschten Targetzellen, beispielsweise von Pathogenen, von mit Pathogen infizierten Zellen, von Tumorzellen oder Autoimmunzellen.
Es kann jede beliebige Anzahl von nützlichen erfindungsgemäßen chimären Molekülen hergestellt werden. Beispielsweise erlaubt die Ausbildung von Chimären, welche aus dem intrazellulären Anteil einer Protein-Tyrosin-Kinase, gebunden an. den extrazellulären Anteil eines geeigneten manipulierten Antikörpermoleküls besteht, daß das Targeterkennungspotential einer Immunzelle spezifisch auf das Antigen umgeleitet wird, welches durch den extrazellulären Antikörperanteil erkannt wird. Somit würden mit einem Antikörperanteil, welcher zur Erkennung einiger Determinanten auf der Oberfläche eines Pathogens fähig ist, Immunsystemzellen, welche mit dem Chimär ausgerüstet sind, auf das Vorhandensein des Pathogens mit dem Effektorprogramm reagieren, welches für ihre Linie geeignet ist, z. B. Helfer-T-Lymphocyten würden mit einer cytotoxischen Aktivität gegenüber dem Target antworten und B-Lymphocyten würden aktiviert werden, um Antikörper zu synthetisieren. Die Makrophagen und Granulocyten würden ihre Effektorprogramme, einschließlich der Cytokinfreisetzung, der Phagocytose und der reaktiven Sauerstoffbildung ausüben. In ähnlicher Weise würde mit einem Antikörperanteil, der zur Erkennung von Tumorzellen fähig ist, die Immunsystemantwort auf den Tumor in günstiger Weise erhöht werden. Mit einem Antikörper, welcher zur Erkennung von Immunzellen fähig ist, welche Zellen eine ungeeignete Reaktivität mit eigenen Determinanten besitzen, könnten die autoreaktiven Zellen selektiv für eine Zerstörung ausgesucht werden.
Obwohl diese Beispiele auf die Verwendung von Antikörperchimären als zweckmäßiges erklärendes Tool hinzielen, ist die Erfindung ihrem Umfang nicht auf Antikörperchimäre beschränkt und tatsächlich kann die Verwendung von spezifischen Nicht-Antikörper-extrazellulären Domänen wichtige Vorteile besitzen. Beispielsweise würden bei einem extrazellulären Anteil, welcher der Rezeptor für einen Virus, ein Bakterium oder einen Parasiten ist, Zellen, die mit den Chimären ausgerüstet sind, spezifisch Zellen ansteuern, welche die viralen, bakteriellen oder Parasitendeterminanten exprimieren. Der Vorteil dieses Ansatzes gegenüber der Verwendung von Antikörpern besteht darin, daß der native Rezeptor für das Pathogen eine einzigartig hohe Selektivität oder Affinität für das Pathogen besitzen kann, was ein größeres Ausmaß an Genauigkeit in der resultierenden Immunantwort ermöglicht. In ähnlicher Weise kann es, um Immunsystemzellen zu zerstören, welche in ungeeigneter Weise mit einem eigenen Antigen reagieren, ausreichend sein, das Antigen (entweder als ein intaktes Protein, im Fall von B-Zell-Verdünnungstherapien, oder als MHC-Komplex, im Fall von T-Zell-Verdünnungstherapien) an intrazelluläre Protein-Tyrosin-Kinaseketten zu binden, und dadurch die spezifische Targeter kennung der Zellen, die in ungeeigneter Weise auf eigene Determinanten ansprechen, zu beeinträchtigen.
Eine weitere Verwendung von Chimären ist die auf andere Formen der Genmanipulation folgende Regulierung von Zellpopulationen in vivo. Beispielsweise wurde die Verwendung von Tumorinfiltrierenden Lymphocyten oder natürlichen Killer-Zellen vorgeschlagen, um cytotoxische Prinzipien an die Stelle der Tumore zu tragen. Die vorliegende Erfindung liefert ein zweckmäßiges Mittel, um die Anzahl und die Aktivität derartiger Lymphocyten und Zellen zu steuern, ohne diese aus dem Körper des Patienten zur Amplifikation in vitro entfernen zu müssen. Da die intrazellulären Domänen der chimären Rezeptoren das proliferative Ansprechen der Zellen vermitteln, wird die Koordination der extrazellulären Domänen durch eine Vielzahl von aggregierenden Stimuli, welche für die extrazellulären Domänen spezifisch sind (z. B. ein Antikörper, welcher für die extrazelluläre Domäne spezifisch ist), somit zu einem Wachstum der die Chimären tragenden Zellen führen.
Obwohl die spezifischen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung Chimäre zwischen der Syk- oder den Syk- und den Src-Familien von Protein-Tyrosin-Kinasen umfassen, könnte jede beliebige Tyrosin-Kinase, welche eine ähnliche Funktion wie diese Moleküle besitzt, für die hierin beschriebenen Zwecke verwendet werden. Die unterscheidenden Merkmale von wünschenswerten Immunzelle-Trigger-Molekülen umfassen die Fähigkeit, autonom exprimiert zu werden, die Fähigkeit, an eine extrazelluläre Domäne (direkt oder indirekt durch eine Transmembrandomäne) gebunden zu werden, sodaß das entstehende Chimär auf der Oberfläche einer therapeutischen Zelle vorhanden ist, und die Fähigkeit Zelleffektorprogramme nach einer Aggregation zu initiieren, welche auf ein Zusammentreffen mit einem Targetliganden folgt.
Gegenwärtig ist das zweckmäßigste Verfahren zur Abgabe der Chimären an Immunsystemzellen durch eine Form der Gentherapie. Das Rekonstituieren von Immunsystemzellen mit chimären Rezeptoren durch Mischen der Zellen mit geeignet solubilisiertem, gereinigtem, chimärem Protein würde jedoch auch zur Ausbildung einer manipulierten Zellpopulation führen, die fähig ist, auf die Targets zu antworten, welche durch die extrazelluläre Domäne der Chimären erkannt werden. Ähnliche Ansätze wurden beispielsweise verwendet, um den intakten HIV-Rezeptor, CD4, für therapeutische Zwecke in Erythrocyten einzubringen. In diesem Fall würde die manipulierte Zellpopulation nicht zur Selbsterneuerung fähig sein.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf funktionell vereinfachte Protein-Tyrosin-Kinase-Chimäre, welche fähig sind Immunsystemfunktionen umzuleiten. Spezieller bezieht sie sich auf die Regulierung von Lymphocyten, Makrophagen, natürlichen Killer-Zellen oder Granulocyten durch die Expression von Chimären in den genannten Zellen, welche Chimären verursachen, daß die Zellen auf durch die Chimäre erkannte Targets anworten. Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Steuerung der Zellantwort auf ein Infektionsmittel, einen Tumor oder eine Krebszelle, oder eine Autoimmun-hervorgerufene Zelle. Das Verfahren der Steuerung der Zellantwort in einem Säugetier umfaßt das Verabreichen einer wirksamen Menge an therapeutischen Zellen an das genannte Säugetier, welche Zellen fähig sind, das genannte Infektionsmittel, den Tumor, die Krebszelle oder die Autoimmun-gebildete Zelle zu erkennen und zu zerstören.
In einer weiteren Ausführungsform umfaßt das Verfahren der Steuerung einer Zellantwort auf ein Infektionsmittel das Verabreichen von therapeutischen Zellen, welche fähig sind, das genannte Mittel zu erkennen und zu zerstören, wobei das Mittel ein spezifischer Virus, ein spezifisches Bakterium, eine spe zifische Protozoe oder ein spezifischer Pilz ist. Spezieller richtet sich das Verfahren gegen Mittel, wie HIV und Pneumocystis carinii.
Um eine HIV-Infektion zu behandeln, wird eine wirksame Menge von chimären Rezeptor exprimierenden, cytotoxischen T-Lymphocyten an einen Patienten verabreicht; die Lymphocyten sind fähig, Zellen, die mit HIV infiziert sind, sowie zirkulierende Viren spezifisch zu erkennen und zu lysieren.
In einer Ausführungsform wird daher erfindungsgemäß ein Verfahren zur Steuerung der Zellantwort auf HIV-infizierte Zellen bereitgestellt, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge an cytotoxischen T-Lymphocyten an einen Patienten, wel- che fähig sind, mit HIV-infizierte Zellen spezifisch zu erkennen und zu lysieren.
In noch einer weiteren Ausführungsform wird gewährleistet, daß chimäre Rezeptorproteine, welche die cytotoxischen T-Lymphocyten steuern, die mit HIV-infizierten Zellen erkennen und lysieren. Noch eine weitere Ausführungsform der Erfindung umfaßt Wirtszellen, die mit einem Vektor transformiert sind, der die chimären Rezeptoren umfaßt.
Diese und andere nicht-einschränkende Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden den Fachleuten aus der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung klar werden.
In der folgenden detaillierten Beschreibung werden Bezugnahmen auf verschiedene Verfahrensweisen gemacht werden, die den Fachleuten auf dem Gebiet der Molekularbiologie und der Immunologie bekannt sind.
Standardreferenzarbeiten, welche die allgemeinen Prinzipien der rekombinanten DNA-Technologie ausführen, umfassen Watson, J. O. et al., Molecular Biology of the Gene, Band I und II, The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Herausgeber, Menlo Park, CA (1987); Darnell, J. E. et al., Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Inc., Herausgeber, New York, N. Y. (1986); Lewin, B. M., Genes II , John Wiley & Sons, Herausgeber, New York, N. Y. (1985); Old, R. W. et al., Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2. Ausgabe, University of California Press, Herausgeber, Berkeley, CA (1981); Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Herausgeber, Cold Spring Harbor, NY (198); und Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Wiley Press, New York, NY (1989).
DEFINITIONEN
Unter "Klonieren" wird die Verwendung von In-Vitro-Rekombinationsverfahren zur Insertierung eines speziellen Gens oder einer anderen DNA-Sequenz in ein Vektormolekül verstanden. Um ein gewünschtes Gen erfolgreich zu klonieren, ist es erforderlich, Verfahren zur Ausbildung von DNA-Fragmenten, zur Bindung der Fragmente an Vektormoleküle, zur Einführung des Composite-DNA-Moleküls in eine Wirtszelle, worin sie sich replizieren kann, und zur Auswahl des Klons, welcher unter den Empfängerwirtszellen das Targetgen besitzt, anzuwenden.
Unter "cDNA" wird eine komplementäre DNA oder DNA-Kopie verstanden, welche aus einem RNA-Template durch die Wirkung von RNA-abhängiger DNA-Polymerase (reversive Transkriptase) hergestellt wird. Ein "cDNA-Klon" bedeutet somit eine Duplex-DNA-Sequenz, die zu einem RNA-Molekül von Interesse komplementär ist, welche in einem Klonierungsvektnr enthalten ist.
Unter "cDNA-Bank" wird eine Sammlung von rekombinanten DNA-Molekülen verstanden, welche cDNA-Inserts enthalten, die DNA- Kopien von mRNA umfassen, welche durch die Zelle zum Zeitpunkt, an welchem die cDNA-Bank hergestellt wurde, exprimiert wurden. Eine derartige cDNA-Bank kann durch Verfahren hergestellt werden, welche den Fachleuten bekannt sind, und ist beispielsweise in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, oben, beschrieben. Im allgemeinen wird RNA zuerst aus den Zellen eines Organismus isoliert, aus dessen Genom ein bestimmtes Gen kloniert werden soll. Bevorzugt für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind Säugetier- und insbesondere Human-Lymphocyten-Zellinien. Ein gegenwärtig bevorzugter Vektor für diesen Zweck ist der Vaccinavirus WR-Stamm.
Unter "Vektor" wird ein DNA-Molekül verstanden, welches z. B. aus einem Plasmid, einem Bacteriophagen oder einem Säugetier- oder Insektenvirus erhalten wird, in welches Fragmente von DNA insertiert oder kloniert werden können. Ein Vektor wird eine oder mehrere einzigartige Restriktionsstellen enthalten und er kann zur autonomen Replikation in einem definierten Wirts- oder Trägerorganismus fähig sein, so daß die klonierte Sequenz reproduzierbar ist. Somit wird unter "DNA-Expressionsvektor" jedes beliebige autonome Element verstanden, welches fähig ist, die Synthese eines rekombinanten Peptids zu steuern. Derartige DNA-Expressionsvektoren umfassen bakterielle Plasmide und Phagen und Säugetier- und Insektenplasmide und -viren.
Unter "im wesentlichen rein" wird eine Verbindung, z. B. ein Protein, ein Polypeptid oder ein Antikörper verstanden, welches/welcher von den Komponenten, die ihn natürlich begleiten, im wesentlichen frei ist. Im allgeminen ist eine Verbindung im wesentlichen rein, wenn mindestens 60%, stärker bevorzugt mindestens 75% und am stärksten bevorzugt mindestens 90% des gesamten Materials in einer Probe von der interessierenden Verbindung gebildet werden. Die Reinheit kann durch jedes beliebige geeignete Verfahren, z. B. Säulenchromatographie, Po- lyacrylamidgelelektrophorese oder HPLC-Analyse gemessen wer den. Im Zusammenhang mit einer Nukleinsäure bedeutet "im wesentlichen rein" eine Nukleinsäuresequenz, ein Segment oder ein Fragment, welches nicht unmittelbar benachbart zu (d. i. kovalent gebunden an) beide der codierenden Sequenzen ist (d. i. eine am 5'-Ende und eine am 3'-Ende), zu welchen diese/dieses im natürlich auftretenden Genom des Organismus, aus welchem die DNA der Erfindung erhalten wird, unmittelbar benachbart ist.
Unter einem "funktionellen Derivat" werden "Fragmente", "Varianten", "Analoga" oder "chemische Derivate" eines Moleküls verstanden. Ein "Fragment" eines Moleküls, wie jedes beliebige der cDNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung, soll sich auf jede beliebige Nukleotiduntergruppe des Moleküls beziehen. Eine "Variante" eines solchen Moleküls soll ein natürlich auftretendes Molekül bezeichnen, welches entweder zu dem gesamten Molekül oder einem Fragment hievon. im wesentlichen ähnlich ist. Ein "Analogon" eines Moleküls soll ein nicht-natürliches Molekül bezeichnen, welches entweder zu dem gesamten Molekül oder einem Fragement hievon im wesentlichen ähnlich ist. Ein Molekül ist "im wesentlichen ähnlich" zu einem weiteren Molekül, wenn die Sequenz der Aminosäuren in beiden Molekülen im wesentlichen die gleiche ist. Im wesentlichen ähnliche Aminosäuremoleküle werden eine ähnliche biologische Aktivität besitzen. Unter der Voraussetzung, daß zwei Moleküle eine ähnliche Aktivität besitzen, werden sie somit als Varianten in der Form, wie diese Bezeichnung hierin verwendet wird, angesehen, sogar wenn eines der Moleküle zusätzliche oder weniger Aminosäurereste enthält, die im anderen nicht aufgefunden werden, oder wenn die Sequenz der Aminosäurereste nicht identisch ist. Wie hierin verwendet, ist ein Molekül "ein chemisches Derivat" eines weiteren Moleküls, wenn es zusätzliche chemische Reste enthält, die normalerweise nicht Teil des Moleküls sind. Derartige Reste können die Löslichkeit des Moleküls, die Absorption, die biologische Halbwertszeit, etc. verbessern. Die Re ste können in alternativer Weise die Toxizität des Moleküls verringern, jedwede unerwünschte Nebenwirkung der Moleküls eliminieren oder abschwächen, etc. Reste, die fähig sind, derartige Wirkungen zu vermitteln, sind beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, Mack Publishing Co., Easton, PA (1980), beschrieben.
Ein "funktionelles Derivat" eines Rezeptorchimär-Gens der vorliegenden Erfindung soll in ähnlicher Weise "Fragmente", "Varianten" oder "Analoga" des Gens umfassen, welche in der Nukleotidsequenz "im wesentlichen ähnlich" sind, und welche für ein Molekül codieren, das eine ähnliche Aktivität zu einem Protein-Tyrosin-Kinase-Chimär besitzt.
Wie hierin verwendet, wird somit unter einem Protein-Tyrosin-Kinase-Chimärprotein verstanden, daß es jedes beliebige funktionelle Derivat, jedwede Fragmente, Varianten, Analoga oder chemische Derivate umfaßt, welche zum "Wildtyp"-Chimären im wesentlichen ähnlich sind und welche eine ähnliche Aktivität besitzen (das heißt am stärksten bevorzugt 90%, stärker bevorzugt 70%, bevorzugt 40% oder mindestens 10% der Aktivität des Wildtyp-Rezeptorchimären). Die Aktivität eines funktionellen chimären Rezeptorderivats umfaßt die spezifische Bindung (mit seinen extrazellulären Anteil) an ein Target-Mittel oder eine Zelle und die darausfolgende Zerstörung (welche durch seinen intrazellulären Anteil gesteuert wird) jenes Mittels oder jener Zelle; eine derartige Aktivität kann z. B. unter Verwendung jedes beliebigen der hierin beschriebenen Assays überprüft werden.
Eine DNA-Sequenz, welche für das Chimär der vorliegenden Erfindung oder dessen funktionelle Derivate codiert, kann mit Vektor-DNA nach herkömmlichen Verfahren rekombiniert werden, einschließlich stumpfer Enden oder versetzter Enden zur Ligierung, der Restriktionsenzymverdauung, um geeignete Enden be reitzustellen, des Einbringens kohäsiver Enden nach Bedarf, der alkalischen Phosphatasebehandlung, um ein unerwünschtes Binden zu vermeiden, und der Ligierung mit geeigneten Ligasen. Techniken für derartige Manipulationen sind von Maniatis, T. et al., oben, beschrieben worden und sind in der Technik gut bekannt.
Ein Nukleinsäuremolekül, wie DNA, ist "zur Expression" eines Polypeptids "fähig", wenn es Nukleotidsequenzen enthält, welche regulatorische Information für die Transkription und die Translation enthalten, und derartige Sequenzen sind "operabel" mit Nukleotidsequenzen "verbunden", welche für das Polypeptid codieren. Eine operable Bindung ist eine Bindung, worin die regulatorischen DNA-Sequenzen und die zu exprimierende DNA-Sequenz in einer derartigen Weise verbunden sind, daß eine Genexpression möglich ist. Die genaue Natur der regulatorischen Regionen, die für eine Genexpression erforderlich sind, kann von Organismus zu Organismus variieren, aber sie soll im allgemeinen eine Promotorregion umfassen, welche bei Prokaryoten sowohl den Promotor (welcher die Initiierung der RNA-Transkription steuert) als auch DNA-Sequenzen enthält, die, wenn sie in RNA überschrieben werden, den Beginn der Proteinsynthese signalisieren werden. Derartige Regionen werden im allgemeinen jene 5'-nicht-codierenden-Sequenzen enthalten, die mit der Initiierung der Transkription und der Translation verbunden sind, wie die TATA-Box, die verkappende Sequenz, die CAAT-Sequenz, und dergleichen.
Gewünschtenfalls kann die nicht-codierende Region 3' zur Gensequenz, welche für das Protein codiert, durch die vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten werden. Diese Region kann wegen ihrer Transkriptions-Terminations-regulatorischen Sequenzen, wie zur Beendigung und Polyadenylierung, beibehalten werden. Durch Beibehaltung der 3'-Region, welche natürlich zu der für das Protein codierenden DNA-Sequenz benachbart ist, können die Transkriptions-Terminations-Signale bereitgestellt werden. Wenn die Transkriptions-Terminations-Signale in der Expressionswirtszelle nicht zufriedenstellend funktionell sind, dann kann eine 3'-Region funktionell in der Wirtszelle substituiert werden.
Zwei DNA-Sequenzen (wie eine Promtorregionsequenz und eine für das Protein-Tyrosin-Kinase-Chimär codierende Sequenz) sollen operabel verbunden sein, wenn die Natur der Verbindung zwischen den beiden DNA-Sequenzen (1) nicht zur Einführung einer Frame-Shift-Mutation führt, (2) die Fähigkeit der Promotorregionsequenz zur Steuerung der Transkription der Rezeptorchimär-Gensequenz nicht beeinträchtigt, oder (3) die Fähigkeit der Rezeptorchimär-Gensequenz zur Überschreibung in die Promotorregionsequenz nicht beeinträchtigt. Eine Promotorregion wäre operabel mit einer DNA-Sequenz verbunden, wenn der Promotor fähig wäre, eine Transkription dieser DNA-Sequenz zu bewirken. Um das Protein zu exprimieren, sind somit Transkriptions- und Translationssignale erforderlich, die von einem geeigneten Wirt erkannt werden.
Die vorliegende Erfindung umfaßt die Expression eines Protein-Tyrosin-Kinase-Chimär-Proteins (oder eines funktionellen Derivats hievon) in entweder prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen, obwohl die eukaryotische Expression (und insbesondere die Expression in Humanlymphocyten) bevorzugt wird.
Erfindungsgemäße Antikörper können durch jedes einer Vielzahl von Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise können Zellen, welche das Rezeptorchimär-Protein oder ein funktionelles Derivat hievon exprimieren, an ein Tier verabreicht werden, um die Produktion von Seren hervorzurufen, welche polyklonale Antikörper enthalten, die fähig sind, das Chimär zu binden.
In einem bevorzugten Verfahren sind die erfindungsgemäßen Antikörper monoklonale Antikörper. Derartige monoklonale Antikörper können unter Verwendung von Hybridomatechnologie hergestellt werden (Kohler et al., Nature 256: 495 (1975); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 292 (1976); Hammerling et al., In: Monoclonal Antibodies and T-Cells Hybridomas, Elsevier, N. Y., Seiten 563–684 (1981)). Im allgemeinen umfassen derartige Verfahren das Immunisieren eines Tieres mit dem Cimär-Antigen. Die Splenocyten derartiger Tiere werden extrahiert und mit einer geeigneten Myelomazellinie verschmolzen. Jede beliebige geeignete Myelomazellinie kann in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung angewandt werden. Nach dem Verschmelzen werden die entstehenden Hybridomazellen selektiv in HAT-Medium gehalten und anschließend durch beschränkende Verdünnung, wie von Wands et al. (Gastroenterology 80: 225–232 (1981)) beschrieben, kloniert. Die Hybridomazellen, welche durch eine derartige Auswahl erhalten werden, werden anschließend einem Assay unterworfen, um Klone zu identifizieren, die zur Bindung des Chimären fähige Antikörper ausscheiden.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können auch polyklonale Antikörper oder vorzugsweise für die Region spezifische polyklonale Antikörper sein.
Erfindungsgemäße Antikörper gegen das Chimär können verwendet werden, um die Menge an Rezeptorchimär (oder den Rezeptorchimär-tragenden Zellen) bei einem Patienten zu überwachen. Derartige Antikörper sind für die Verwendung in Standardimmunodiagnoseassays, die in der Technik bekannt sind, einschließlich derartiger immunometrischer oder "Sandwich"-Assays wie der Vorwärts-Sandwich-, der Revers-Sandwich- und der simultanen Sandwich-Assays gut geeignet. Die Antikörper können in jeder beliebigen Anzahl von Kombinationen verwendet werden, wie es von den Fachleuten ohne unmäßige exprimentelle Anstrengung ermittelt werden kann, um Immunoassays mit annehmbarer Spezifität, Empfindlichkeit und Genauigkeit zu erhalten.
Standardreferenzarbeiten, worin allgemeine Prinzipien der Immunologie angeführt sind, umfassen Roitt, I., Essential Immunology, 6. Auflage, Blackwell Scientific Publications, Herausgeber, Oxford (1988); Kimball, J. W., Introduction to Immunology, 2. Auflage, Macmillan Publishing Co., Herausgeber, New York (1986); Roitt, I. et al., Immunology, Gower Medical Publishing Ltd., Herausgeber, London, (1985); Campbell, A., "Monoclonal Antibody Technology", in Burdon, R. L. et al., Herausgeber, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 13, Elsevier, Herausgeber, Amsterdam (1984); Klein, J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, Herausgeber, New York (1982); und Kennett, R. L. et al., Herausgeber, Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Press, Herausgeber, New York (1980).
"Ermitteln" soll das Feststellen des Vorhandenseins oder des Fehlens einer Substanz oder das Quantifizieren der Menge einer Substanz umfassen. Der Ausdruck bezieht sich somit auf die Verwendung der Materialien, Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung für qualitative und quantitative Bestimmungen.
Die Isolierung von anderen Hybrodomazellen, welche monoklonale Antikörper der gleichen Spezifität wie die hierin beschriebene ausscheiden, kann durch das Verfahren des anti-idiotypischen Screenings durchgeführt werden (Petocmjak, et al., Science 215: 1637 (1982)). Kurz zusammengefaßt ist ein anti-idiotypischer Antikörper ein Antikörper, welcher einzigartige Determinanten erkennt, die am Antikörper vorhanden sind, der vom interessierenden Klon produziert wird. Der anti-idiotypische Antikörper wird durch Immunisieren eines Tiers des gleichen Stammes, wie der, welcher als Quelle des monoklonalen Antikörpers verwendet wird, mit dem interessierenden monoklonalen Antikörper hergestellt. Das immunisierte Tier wird die idiotypischen Determinanten des immunisierenden Antikörpers erkennen und darauf antworten, indem es Antikörper auf diese idiotypischen Determinanten produziert (anti-idiotypischer Antikörper).
Zur Replikation können die Hybridzellen sowohl in vitro als auch in vivo kultiviert werden. Eine hohe in vivo-Produktion macht diese zum gegenwärtig bevorzugten Kultivierungsverfahren. Kurz zusammengefaßt, werden Zellen aus den einzelnen Hybridstämmen intraperitoneal in Pristan-geprimte BALB/c-Mäuse injiziert, um Aszitesflüssigkeit zu produzieren, die hohe Konzentrationen der gewünschten monoklonalen Antikörper enthält. Monoklonale Antikörper vom Isotyp IgM oder IgG können aus kultivierten Überständen unter Verwendung von Säulenchromatographieverfahren gereinigt werden, die den Fachleuten gut bekannt sind.
Antikörper nach der vorliegenden Erfindung sind für die Verwendung in Immunoassays besonders geeignet, worin sie in flüssiger Phase oder gebunden an einen Festphasenträger angewandt werden können. Zusätzlich können die Antikörper in diesen Immunoassays auf verschiedene Weise detektierbar markiert werden.
Es gibt viele verschiedene in der Technik bekannte Markierungen und Markierungsverfahren. Beispiele von Markierungstypen, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Enzyme, Radioisotope, fluoreszierende Verbindungen, chemilumineszierende Verbindungen, biolumineszierende Verbindungen und Metallchelate. Die Fachleute werden andere geeignete Markierungen zur Bindung an Antikörper kennen oder sie werden fähig sein, diese durch die Verwendung von Routineexperimenten zu ermitteln. Darüber hinaus kann das Binden dieser Markierungen an Antikörper unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt werden, welche den Fachleuten üblicherweise bekannt sind.
Einer der Wege, auf welchen Antikörper nach der vorliegenden Erfindung detektierbar markiert werden können, besteht im Binden des Antikörpers an ein Enzym. Dieses Enzym wird seinerseits, wenn es später einem Substrat ausgesetzt ist, mit dem Substrat in solch einer Weise reagieren, daß ein chemischer Rest produziert wird, welcher beispielsweise durch spektrophotometrische oder fluorometrische Mittel festgestellt werden kann. Beispiele von Enzymen, welche verwendet werden können, um Antikörper detektierbar zu markieren, umfassen Malat-Dehydrogenase, Staphylococcen-Nuklease, delta-V-Steroid-Isomerase, Hefe-Alkohol-Dehydrogenase, alpha-Glycerophosphat-Dehydrogenase, Triose-Phosphat-Isomerase, Biotinavidin-Peroxidase, Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, Asparaginase, Glucoseoxidase, β-Gallactosidase, Ribonuclease, Urease, Katalase, Glycose-VI-Phosphat-Dehydrogenase, Glucoamylase und Acetylcholin-Esterase.
Das Vorhandensein von detektierbar markierten Antikörpern kann auch durch Markieren der Antikörper mit einem radioaktiven Isotop festgestellt werden, welches anschließend durch solche Mittel wie die Verwendung eines Gammazählers oder eines Scintillationszählers bestimmt werden kann. Isotope, die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung besonders nützlich sind, sind ³H, ¹²⁵I, ³²P,³⁵S, ¹⁴C, ⁵¹Cr, ³⁶Cl, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe und ⁷⁵Se.
Es ist auch möglich, die Bindung von detektierbar markierten Antikörpern durch Markieren der Antikörper mit einer fluoreszierenden Verbindung festzustellen. Wenn ein fluoreszierend markierter Antikörper Licht der geeigneten Wellenlänge ausgesetzt ist, kann dessen Vorhandensein anschließend in Folge der Fluoreszenz des Farbstoffes festgestellt werden. Unter den am häufigsten verwendeten fluoreszierend markierenden Verbindungen sind Fluorescein, Isothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthaldehyd und Fluorescamin.
Die Antikörper der Erfindung können auch unter Verwendung von Fluoreszenz-emitierenden Metallen, wie ¹⁵²Eu oder anderen der Lanthaniden-Reihe, detektierbar markiert werden. Diese Metalle können an das Antikörpermolekül unter Verwendung von solchen Metallchelatgruppen wie Diethyl-Enteriaminpentaessigsäure (DTPA) oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) gebunden werden.
Antikörper können auch detektierbar markiert werden, indem sie an eine chemilumineszente Verbindung gekuppelt werden. Das Vorhandensein des chemilumineszent-markierten Antikörpers wird anschließend durch Feststellen des Vorhandenseins von Luminszenz ermittelt, welche während des Verlaufs der chemischen Reaktion auftritt. Beispiele von besonders nützlichen chemilumineszenten markierenden Verbindungen sind Luminal, Isoluminol, theromatische Acridiniumester, Imidazol, Acridiniumsalze, Oxalatester und Dioxetan.
In gleicher Weise kann eine biolumineszente Verbindung verwendet werden, um die Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung zu markieren. Biolumineszenz ist ein Typ von Chemilumineszenz, welcher in biologischen Systemen gefunden wird, worin ein katalytisches Protein die Effizienz der chemilumineszenten Reaktion erhöht. Das Vorhandensein eines biolumineszenten Antikörpers wird durch Ermitteln des Vorhandenseins von Lumineszenz bestimmt. Wichtige biolumineszente Verbindungen für die Zwecke der Markierung umfassen Luciferin, Luciferaseäquorin.
Die Antikörper und das im wesentlichen gereinigte Antigen sind ideal für die Herstellung eines Kits geeignet. Ein derartiger Kit kann einen Trägermittel umfassen, welches in Kammern aufgeteilt ist, um damit in enger Nachbarschaft einen oder mehrere Behältermittel zu erhalten, wie Phiolen, Röhrchen und dergleichen, wobei jedes der genannten Behältermittel die getrennten Elemente des zu verwendenden Assays umfaßt.
Die Typen der Assays, welche in Kitform einverleibt sein können, sind viele und umfassen beispielsweise kompetitive und nicht-kompetitive Assays. Typische Beispiele von Assays, welche die Antikörper der Erfindung verwenden können, sind Radio- immunassays (RIA), Enzymimmunoassays (EIA), mit Enzymen verbundene Immunosorbensassays (ELISA) und immunometrische oder Sandwich-Immunoassays.
Unter dem Ausdruck "immunometrischer Assay" oder "Sandwich-Immunoassay" wird verstanden, daß dieser einen simultanen Sandwich-, einen Vorwärts-Sandwich- und einen Revers-Sandwich-Immunassay umfaßt. Diese Ausdrücke sind den Fachleuten gut bekannt. Die Fachleute werden auch anerkennen, daß die Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung in anderen Variationen und Formen von Assays nützlich sein werden, welche gegenwärtig bekannt sind oder welche in der Zukunft entwickelt werden können. Diese sollen vom Rahmen der vorliegenden Erfindung umfaßt sein.
In der bevorzugten Durchführungsart der Assays ist es wichtig, daß bestimmte "Blocker" im Inkubationsmedium vorhanden sind (üblicherweise zugesetzt mit dem makierten löslichen Antikörper). Die "Blocker" werden zugesetzt, um sicherzustellen, daß unspezifische Proteine, Protease oder Human-Antikörper auf Maus-Immunoglobuline, die in den Experimentproben vorhanden sind, die Antikörper auf dem Festphasenträger oder den radioaktiv makierten Indikatorantikörper nicht vernetzen oder zerstören, um so falsche positive oder falsche negative Ergebnisse zu liefern. Die Auswahl von "Blockern" trägt daher wesent lich zur Spezifität der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Assays bei.
Es wurde festgestellt, daß eine Anzahl von nicht-relevanten (das heißt nicht-spezifischen) Antikörpern der gleichen Klasse oder der gleichen Unterklasse (Isotyp) wie jener, die in den Assays verwendet werden (z. B. IgG₁, IgG_2a, IgM, etc.) als "Blocker" verwendet werden können. Die Konzentration der "Blocker" (üblicherweise 1–100 μg/μl) ist wichtig, um die geeignete Empfindlichkeit aufrechtzuerhalten, aber dennoch jede unerwünschte Störung durch gleichzeitig auftretende kreuzreaktive Proteine in Humanserum zu inhibieren. Zusätzlich muß das Puffersystem, welches die "Blocker" enthält, optimiert werden. Bevorzugte Puffer sind jene, welche auf schwachen organischen Säuren beruhen, wie Imidazol, HEPPS, MOPS, TES, ADA, ACES, HEPES, PIPES, TRIS, und dergleichen, bei physiologischen pH-Werten. Etwas weniger bevorzugte Puffer sind anorganische Puffer wie Phosphat, Borat oder Carbanat. Abschließend sollten bekannte Proteaseinhibitoren zum Puffer, welcher die "Blocker" enthält, zugesetzt werden (üblicherweise 0,01–10 μg/ml).
Es gibt viele Festphasenimmunoadsorbierende Mittel, welche angewandt wurden und welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Gut bekannte Immunoadsorbentien umfassen Glas, Polystyrol, Polypropylen, Dextran, Nylon und andere Materialien, in der Form von Rohren, Perlen und Mikrotiterplatten, die daraus gebildet oder mit derartigen Materialien beschichtet sind, und dergleichen. Die immobilisierten Antikörper können entweder kovalent oder physikalisch an das Festphasenimmunoadsorbens gebunden werden, durch Verfahren wie eine kovalente Bindung über eine Amid- oder Esterbindung, oder durch Absorption. Den Fachleuten werden viele andere geeignete Festphasenimmunoabsorbentien und Verfahren zur Immobilisierung von Antikörpern darauf bekannt sein oder sie werden fähig sein, diese unter Verwendung von nicht mehr als Routineexperimenten, zu ermitteln.
Für die in vivo-, in vitro- oder in situ-Diagnose können Markierungen, wie Radionukleide, an Antikörper gemäß der vorlie- genden Erfindung entweder direkt oder durch Verwenden einer intermediären funktionellen Gruppe gebunden werden. Eine intermediäre Gruppe, welche oft verwendet wird, um Radioisotope an Antikörper zu binden, die als metallische Kationen existieren, ist Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA). Typische Beispiele von metallischen Kationen, welche auf diese Weise gebunden werden sind: ^99mTC, ¹²³I, ¹¹¹In, ¹³¹I, ⁹⁷Ru, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga und ⁶⁸Ga. Die Antikörper der Erfindung können auch mit nichtradioaktiven Isotopen für die Zwecke der Diagnose markiert werden. Elemente, welche dafür besonders nützlich sind, sind ¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn, ¹⁶²Dy, ⁵²Cr und ⁵⁶Fe.
Das Antigen der Erfindung kann in im wesentlichen reiner Form isoliert werden, indem Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung angewandt werden. Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt somit ein im wesentlichen reines Protein-Tyrosin-Kinase-Chimär bereit, welches Antigen dadurch gekennzeichnet ist, daß es durch Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung erkannt wird und sich daran bindet. In einer weiteren Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Isolierung oder Reinigung des Chimären Rezeptorantigens, indem ein Komplex des genannten Antigens mit einem oder mehreren Antikörpern ausgebildet wird, welche gegen das Rezeptorchimär gerichtet sind.
Die im wesentlichen reinen Chimär-Antigene der vorliegenden Erfindung können ihrerseits verwendet werden, um Antikörper auf das Chimär in einer Probe, wie Serum oder Urin, festzustellen oder zu messen. Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt daher ein Verfahren zur Feststellung des Vor handenseins oder der Menge an Antikörper auf Protein-Tyrosin-Kinase-Antigen in einer Probe, umfassend das Inkontaktbringen einer Probe, welche einen Antikörper- auf das Chimäre Antigen enthält, mit detektierbar markiertem Rezeptorchimär und Feststellen der genannten Markierung. Es wird anerkannt werden, daß immunoreaktive Fraktionen und immunoreaktive Analoga der Chimären ebenfalls verwendet werden können. Unter dem Ausdruck "immunoreaktive Fraktion" soll jeder Anteil des Chimären Antigens verstanden werden, welcher eine äquivalente Immunantwort auf einen gegen das Rezeptorchimär gerichteten Antikörper zeigt. Unter dem Ausdruck "immunoreaktives Analogon" soll ein Protein verstanden werden, welches sich vom Rezeptorchimärprotein durch ein oder mehrere Aminosäuren unterscheidet, welches aber eine äquivalente Immunantwort auf einen Antikörper der Erfindung zeigt.
Unter "spezifisch erkennen und binden" wird verstanden, daß der Antikörper das Rezeptorchimär-Palypeptid erkennt und sich daran bindet, aber andere damit nicht in Verbindung stehende Moleküle in einer Probe, z. B. einer biologischen Probe, im wesentlichen nicht erkennt und sich daran im wesentlichen nicht bindet.
Unter "autoimmun-gebildete Zelle" werden Zellen verstanden, welche Antikörper produzieren, die mit Wirtsgewebe reagieren, oder Immuneffektor-T-Zellen, welche autoreaktiv sind; derartige Zellen umfassen Antikörper gegen Acetylcholin-Rezeptoren (was z. B. zu Myasthenia gravis führt) oder Anti-DNA-, Anti-Erythrocyten- und Anti-Blättchen-Autoantikörper (welche z. B. zu Lupus-Erythematosus führen).
Unter "therapeutische Zelle" wird eine Zelle verstanden, welche durch ein Chimär der Erfindung transformiert wurde, sodaß sie fähig ist, ein spezifisches Infektionsmittel, eine mit einem spezifischen Mittel infizierte Zelle, eine Tumor- oder Krebszelle, oder eine autoimmun-gebildete Zelle zu erkennen und zu zerstören; vorzugsweise sind derartige therapeutische Zellen Zellen des hämatopoetischen Systems.
Unter einem "Target-Infektionsmittel" wird jedes beliebige Infektionsmittel (z. B. ein Virus, Bakterium, eine Protozoe oder ein Pilz) verstanden, welches durch eine ein Rezeptorchimär tragende therapeutische Zelle erkannt werden kann. Unter einer "Targetzelle" wird jede beliebige Wirtszelle verstanden, welche durch eine ein Rezeptorchimär tragende therapeutische Zelle erkannt werden kann; Targetzellen umfassen ohne Einschränkung Wirtszellen, welche mit einem Virus, Bakterium, einer Protozoe oder einem Pilz infiziert sind, sowie Tumor- oder krebsartige Zellen und autoimmun-gebildete Zellen.
Unter "extrazellulär" wird verstanden, daß mindestens ein Teil des Moleküls an der Zelloberfläche freiliegt. Unter "intrazellulär" wird verstanden, daß mindestens ein Teil des Moleküls im Cytoplasma der therapeutischen Zelle enthalten ist. Unter "Transmembran" wird verstanden, daß mindestens ein Teil des Moleküls die Plasmamembran durchspannt. Ein "extrazellulärer Anteil", ein "intrazellulärer Anteil" und ein "Transmembrananteil", wie hierin verwendet, können flakierende Aminosäuresequenzen enthalten, welche sich in benachbarte zelluläre Abschnitte erstrecken.
Unter "Oligomerisieren" wird ein Komplexieren mit anderen Proteinen zur Ausbildung von Dimeren, Trimeren, Tetrameren oder anderen Oligomeren höherer Ordnung verstanden. Derartige Oligomere können Homooligomere oder Heterooligomere sein. Ein "oligomerisierender Anteil" ist jene Region eines Moleküls, welche die Komplexbildung (d. i. die Oligomerbildung) steuert.
Unter "cytolytisch" wird verstanden, daß etwas fähig ist, eine Zelle (z. B. eine mit einem Pathogen infizierte Zelle, eine Tu mor- oder Krebszelle, oder eine autoimmun-gebildete Zelle) zu zerstören, oder fähig ist, ein infizierendes Mittel (z. B. ei- nen Virus) zu zerstören.
Unter "Immunschwächevirus" wird ein Retrovirus verstanden, welcher in Wildtypform fähig ist, T4-Zellen eines Primatenwirts zu infizieren und eine virale Morphogenese und die morphologische Eigenschaft der Lentivirus-Unterfamilie besitzt. Der Ausdruck umfaßt ohne Einschränkung alle Varianten von HIV und SIV, einschließlich HIV-1, HIV-2, SIVmac, SIVagm, SIVmnd, SIVsmm, SIVman, SIVmand und SIVcpz.
Unter "MHC-unabhängig" wird verstanden, daß die cytolytische Zellantwort kein Vorhandensein eines MHC-Klasse II-Antigens auf der Oberfläche der Zielzelle erfordert.
Unter einem "funktionellen, ein Cytolysesignal-übertragenden Derivat" wird ein funktionelles Derivat (wie es vorstehend definiert ist) verstanden, welches fähig ist, mindestens 10%, bevorzugt 40%, stärker bevorzugt 70% oder am stärksten bevorzugt mindestens 90% der biologischen Aktivität des Wildtypmoleküls zu steuern. Wie hierin verwendet, kann ein "funktionelles, ein Cytolysesignal-übertragendes Derivat" durch direktes Signalisieren der therapeutischen Zelle ein rezeptorgebundenes Mittel oder eine Zelle (z. B. im Fall eines intrazellulären Rezeptorchimäranteils) zu zerstören, wirken, oder es kann indirekt durch Fördern der Oligomerisierung mit ein Cytolysesignal-übertragenden Proteinen der therapeutischen Zelle (z. B. im Fall einer Transmembrandomäne) wirken. Derartige Derivate können hinsichtlich ihrer Wirksamkeit untersucht werden, z. B. durch Verwenden der hierin beschriebenen in vitro-Assays.
Unter einem "funktionellen HIV-Hüllbindungsderivat" wird ein funktionelles Derivat (wie vorstehend definiert) verstanden, welches fähig ist, jedes beliebige HIV-Hüllprotein zu binden.
Funktionelle Derivate können unter Verwendung von z. B. der hierin beschriebenen in vitro-Assays identifiziert werden.
THERAPEUTISCHE VERABREICHUNG
Die transformierten Zellen der vorliegenden Erfindung können für die Therapie einer Anzahl von Krankheiten verwendet werden. Gegenwärtige Verfahren der Verabreichung derartiger transformierter Zellen umfassen die adoptive Immuntherapie oder die Zelltransfertherapie. Diese Verfahren erlauben das Zurückkehren der transformierten Immunsystemzellen in den Blutstrom. Rosenberg, S. A., Scientific American 62 (Mai 1990); Rosenberg et al., The New England Journal of Medicine, 323: 570 (1990).
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können an jedes beliebige Tier verabreicht werden, welches die vorteilhaften Wirkungen der Verbindungen der Erfindung erfahren kann. Unter derartigen Tieren sind zu aalererst Menschen, obwohl nicht beabsichtigt ist, die Erfindung so einzuschränken.
Detaillierte Beschreibung
Es werden zuerst die Zeichnungen beschrieben werden.
Beschreibung der Zeichnungen
1A ist ein schematisches Diagramm, welches die Organisation von Rezeptor-Kinase-Fusionsproteinen der Erfindung zeigt. 1B zeigt Durchflußcytometrieergebnisse für CD16/7/Zeta, CD16/7/Lck, CD16/7/Fyn(T), CD16/7/Syk und CD16/7/ZAP-70, exprimiert durch Vacciniarekombinanten in Jurkat-Zellen. 1C zeigt ein in vitro-Kinaseaktivitätsassay von immunogefälltem CD16/7/Zeta (negative Kontrolle), CD16/7/Lck, CD16/7/Fyn(T), CD16/7/Syk und CD16/7/ZAP-70; die ein niedrigeres Molekularge wicht aufweisende Spezies, welche im Fyn-Chimär-Immunopräzipitat aufscheint, ist noch zu identifizieren.
2 zeigt die cytosolische Calciumantwort, getriggert durch das Vernetzen von Kinasechimären in TCR-negativen Jurkat-Zellen. Die relative intrazelluläre Calciumkonzentration der positiven Population (gemessen durch das Verhältnis von Indo-1-Violett-zu-Blau-Fluoreszenz) ist gezeigt. Jurkat-Zellen, welche mit Vacciniarekombinanten infiziert sind, die die verschiedenen Fusionsproteine exprimieren, wurden Anti-CD16 mAb 3G8 ausgesetzt, gefolgt von Phycoerythrin-konjugierten Ziegen-F(ab')₂-Antikörpern auf Maus-IgG zum Zeitpunkt 0. Chimäre, welche auf TCR-Zeta-Ketten und FcRIIB2 basieren, dienen als positive bzw. negative Kontrollen.
3 zeigt das vorzeitige Eintreten einer Calciumantwort in TCR-positiven Zellen, welche Syk-Kinase-Chimär exprimieren. Die Infektion und die Analyse wurden wie vorstehend für 2 beschrieben, durchgeführt. Ein wesentlicher Anteil der Zellen, die Syk-Chimär exprimieren, zeigte ein hohes Verhältnis von Violett-zu-Blau-Fluoreszenz vor der Zugabe von primärem Antikörper.
4A und 4B zeigen ein Anti-Hybridoma-Abtötungsassay.
4A zeigt den Prozentsatz an ⁵¹-Cr-Chromat, welches aus Hybridoma-Targetzellen freigesetzt wird, gezeigt als Funktion des Verhältnisses von Effektorzellen (CTL-exprimierendes Kinase-Chimär) zu Targetzellen; Zellen, welche Rezeptorchimäre exprimieren, die die intrazellulären Domänen von TCR-Zeta-Kette und FcRIIB2 tragen, dienen als positive bzw. negative Kontrollen. 4B zeigt die Spezifität der Abtötung (fehlende Abtötung von Nebenstehenden). BW5147-Zellen (welchen der Oberflächen-Anti-CD16-Antikörper fehlt) wurden mit ⁵¹Cr-Chromat beladen und CTL-exprimierenden Kinase-Chimären unter den gleichen Bedingungen wie eine parallele Probe von mit Chromat beladenen 3G8-Zellen (welche Anti-CD16-Antikörper exprimieren) ausgesetzt. Es wurde keine bemerkbare Freisetzung von Chromat aus den BW5147-Zellen festgestellt.
5A, 5B und 5C zeigen, daß die Coexpression von ZAP-70 und Fyn oder Lck die Induktion der Cytolyse erlaubt und die Latenz für die Calciumantwort verringert. CTL wurden mit Vacciniarekombinanten koinfiziert, die die angegebenen Chimären exprimieren, und hinsichtlich des cytolytischen Potentials oder der Calciummobilisierung analysiert. Die Effizienz der Chimären wird durch diese Analyse unterbewertet, da der Anteil an Zellen, die beide Chimäre exprimieren, nicht unabhängig gemessen wurde (der Anteil an Zellen, die mindestens ein Chimär exprimieren, wurde verwendet, um die Aktivität zu normalisieren). 5A zeigt ein Cytolyseassay unter Verwendung von CTL, welche Paare von CD16/7/Kinase-Chimären exprimieren. 5B zeigt die Calciumantwort von TCR-negativen Zellen, die Paare von CD16/7/Kinase-Chimären exprimieren. 5C zeigt ein Cytolyseassay von CTL, welche ein CD4/CD7/Fyn-Chimär und ein CD16/CD7/ZAP-70-Chimär coexprimieren. Ein CD16/7/Zeta-Chimär dient als positive Kontrolle, wogegen ein CD16/7/FcRIIB2-Chimär als negative Kontrolle dient.
6A und 6B zeigen, daß Chimäre, die Kinasedeletionen oder Punktmutationen tragen, bei der Calciummobilisierung und der Umleitung der Cytolyse ineffektiv sind. Kinase-negative Fusionsproteinvarianten wurden durch Deletion (im Fall von Syk) oder Punktmutation (im Fall von ZAP-70) hergestellt und hinsichtlich der Calciumantwort und der Cytolyse überprüft. 6A zeigt die Calciumantwort in TCR-negativen Zellen. 6B zeigt ein Assay der umgeleiteten Cytolyse.
7A, 7B und 7C zeigen, daß Chimäre, die auf Human-Syk basieren, mit Chimären im wesentlichen äquipotent sind, welche auf Schweine-Syk basieren. 7A ist die Sequenz von Human-Syk und zeigt einen Vergleich mit Schweine-Syk; die ersten 11 und letzten 7 Reste werden durch die Primersequenzen ermittelt. 7B zeigt die Calciummobilisierungsanalyse von TCRnegativen Zellen, welche Human-Syk-Chimär exprimieren. 7C zeigt ein Assay der umgeleiteten Cytolyse von CTL, welche Human-Syk-Chimär exprimieren.
8 zeigt Veränderungen in Tyrosinphosphorylierungsmuster, welche auf eine Vernetzung mit Chimären Kinasen folgen. T-Zellen-Antigen-Rezeptor-negative Jurkat-Zellen, welche die angegebenen Chimären oder Chimärenpaare exprimieren, wurden mit Anti-CD16- und Ziegen-Anti-Maus-IgG sekundären Antikörpern behandelt und anschließend lysiert, auf einem Polyacrylamidgel fraktioniert, auf Nitrocellulose übergeführt und mit Anti-Phosphortyrosin-Antikörper geprobt. Bahnen, gekennzeichnet mit '+' stellen Extrakte von Zellen dar, welche einem Vernetzen unterworfen wurden, wogegen jene, die mit '–' bezeichnet sind, direkt ohne vorheriges Aussetzen unter einen sekundären Antikörper lysiert wurden. Kontrollbahnen wurden durch eine ähnliche Behandlung von TCR-negativen Zellen gebildet, welche ein CD16/7-Fusionsprotein exprimieren, das keine intrazelluläre Domäne enthielt. Zum Vergleich sind die Wirkungen der Anti-CD3-Behandlung von TCR-positiven Jurkat-Zellen (mit oder ohne Wildtyp-Vacciniavirusinfektion) rechts gezeigt. Die prominenten Banden in der Nähe von 100 kD am linken Teil dieser Testgruppe entsprechen den erwarteten Molekularmassen der Kinasechimären.
9 zeigt die Tyrosinphosphorylierung von Phospholipase-C-γl, gefolgt von der Aggregation von Chimären. PLC-γ1 wurde aus Zellen immunogefällt, welche einer Antikörpervernetzung unterworfen wurden, und die Immunopräzipitate wurden auf Gelen fraktioniert, auf Nitrozellulose übergeführt und mit Anti-Phosphortyrosin-Antikörper beprobt. Ein wesentlicher Anstieg in phosphoryliertem PLC-γ1 wurde auf die Aggregation von Syk-Chimären folgend beobachtet, wogegen ein eingeschränkterer, aber leicht feststellbarer Anstieg auf die Coaggregation von Fyn- und ZAP-70-Chimären beobachtet wird.
10A und 10B zeigen in vitro-Kinase-Assays. Zellen, welche Chimäre Kinasen exprimieren, wurden einer Antikörper vermittelten Vernetzung von Chimären unterworfen, wonach die Kinasen immunogefällt wurden und die Immunopräzipitate hinsichtlich der Phosphorylierung von endogenem Substrat bewertet wurden. 10A zeigt einen Vergleich der Aktivität von immunogefällten Kinasechimären über einer Inkubationsdauer von 10 Minuten unter Verwendung von Immunopräzipitaten, welche aus vernetzten (+) oder unvernetzten (–) Zellen isoliert wurden. 10B zeigt einen Zeitverlauf der Assimilierung vom Phosphatmarker in endogene Substrate durch Syk-Kinasechimär, mit (+) oder ohne (–) Vernetzung.
T-Zellen-Aktivierung durch Cluster-Tyrosin-Kinasen
Es folgt nun eine Beschreibung von speziellen Ausführungsformen der Erfindung. In dieser Beschreibung wird gezeigt, daß Nicht-Rezeptor-Kinasen durch einfache Cluster-Ereignisse aktiviert werden. Künstliche Rezeptor-Kinasen wurden hergestellt, deren intrazelluläre Domänen aus den vollständigen Src- oder Syk-Kinasesefamilie-Sequenzen bestanden und hinsichtlich der Konsequenzen der Aggregation durch externe Vernetzungsstimuli untersucht. Es zeigte sich ein deutlicher Unterschied zwischen den Aktivitäten der Syk- und Src-Kinasefamilien: Die Vernetzung der letztgenannten führte zu keiner signifikanten Zellaktivierung, wogegen die Vernetzung der zuvor genannten zum Auftreten von freiem intrazellulärem Calciumion führte und, im Fall von Syk, von cytolytischem Potential. Das Versagen von ZAP-70-Chimären, Distalrezeptor vermittelte Programme hervorzurufen, konnte durch gemeinsame Clusterbildung von ZAP-70- Chimär mit entweder Fyn- oder Lck-Kinasechimären überwunden werden. Die nun beschriebenen Beispiele werden zum Zweck. der Veranschaulichung der Erfindung und nicht zu deren Einschränkgung bereitgestellt.
Herstellung von Protein-Tyrosin-Kinase-Chimären und Nachweis der Effizienz
Genfusionen, welche für Proteine codieren, die Zelloberflächen-Rezeptor-Kinasen ähneln, wurden durch Anfügen eines DNA-Fragments, das für die extrazelluläre Domäne des CD16-Moleküls codiert, an ein kurzes Spacer-Segment hergestellt, welches für die Nebenmembran- und Transmembrandomänen von CD7 codiert, ihrerseits an die vollständige codierende Sequenz von Human-Lck(Koga et al., 1986, Eur. J. Immunol. 16: 1643–1646), Mäuse-Fyn (T)- (Cooke und Perlmutter, 1989, New. Biol. 1: 66–74), Schweine-Syk- (Taniguchi et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 15790-15796) und Human-ZAP-70- (Chan et al., 1992, Cell 71: 649–662) Tyrosin-Kinasen gebunden (1A). Die entstehenden Tripartit-Genfusionen wurden in rekombinante Vacciniaviren eingebracht durch homologe Rekombination und Selektion hinsichtlich der Coexpression des E. coli-gpt-Genprodukts. Die Infektion von Zellen mit den Rekombinanten führte zur effizienten Oberflächenexpression aller vier Kinasechimären (1B). Die Immunofällung der resultierenden Proteinchimären mit Anti-CD16-Antikörpern zeigte das Vorhandensein von Molekülspezies der erwarteten Massen, welche in einem in vitro-Phosphorylierungsassay aktiv waren (1C).
Wir untersuchten anschließend, ob die Vernetzung der Fusionsproteine die Akkumulierung von freiem intrazellulärem Calcium auf eine Art erlauben würde, die jener ähnlich ist, die mit Fusionsproteinen festgestellt wird, welche auf T-Zellen-Antigen-Rezeptor-intrazellulären Domänen basieren. Dazu infizierten wir verschiedene Zellen mit Vacciniarekombinanten und er mittelten auf ein Vernetzen der extrazellulären Domänen mit Antikörpern folgend die relative Cytoplasmacalciumkonzentration. Sowohl die spektrofluorimetrische (Bulkpopulation) als auch die durchflußcytometrische Messung (Einzelzellen) wurden mit Zellen durchgeführt, welche mit dem Farbstoff Indo-1 beladen waren (Grynkiewicz et al., 1985, J. Biol. Chem. 260: 3440-3450; Rabinovitch et al., 1986, J. Immunol. 137: 952–961). Die Durchflußcytometrieanalysen wurden mit den Daten durchgeführt, die aus den Zellen erhalten wurden, deren Zelloberflächenexpression von CD16, ermittelt durch Phycoerythrinfluoreszenzintensität, in einen verhältnismäßig engen, zuvor definierten Bereich fielen. Obwohl weiterhin geringfügige Variationen in der mittleren Fluoreszenzintensität innerhalb dieses Bereiches beobachtet wurden (infolge der Unterschiede in der zugrunde- liegenden Verteilung von Chimären, die durch die Zellen exprimiert werden), ermöglichte uns dieser Ansatz eine Gegenüberstellung der Antworten von Zellen, welche ungefähr die gleiche Anzahl von Rezeptoren tragen. 2. zeigt eine Analyse von Daten, die aus Zellen mit einer Mutationsvariante der Jurkat-Human-T-Zell-Leukämielinie gesammelt wurden, welcher der T-Zellen-Antigen-Rezeptor fehlt (Weiss und Stobo, 1984, J. Exp. Med. 160: 1284–1299). In diesen Zellen besaßen weder die Lcknoch die Fyn-Chimären die Kapazität, Calcium auf eine Vernetzung folgend zu mobilisieren. In mehreren Experimenten führt die Clusterbildung des Lck-Fusionsproteins zu einer geringfügigen Verringerung der Ruhecalciumkonzentration, relativ zur negativen Kontrolle, ein Infusionsprotein, welches auf der niedrigaffinen IgG-Rezeptor-FcRIIB2-intrazellulären Domäne basiert (Kolanus et al., 1992, EMBO J. 11: 4861–4868). Die Aggregation von Fusionsproteinen, welche sowohl auf ZAP-70 als auch auf Syk basieren, war zur Förderung des Auftretens von freiem Cytoplasmacalciumion hochwirksam, annähernd ebenso wirksam wie die Aggregation eines ähnlichen Chimärs, welches die intrazelluläre Domäne der T-Zellen-Rezeptor-Zeta-Ketten trägt. Eine geringfügige Verzögerung im Beginn der Calciumantwort wude so wohl mit ZAP-70- als auch mit Syk-Kinase-Chimären festgestellt, relativ zu der Beginnzeit der Calciummobilisierung durch das Zeta-Chimär. In T-Zellen-Rezeptor-positiven Zellen (3) wurde die Durchflußbewertung von Syk-Chimären teilweise durch eine hohe Ruhekonzentration an freiem Calciumion vereitelt, was eine konstitutive Involvierung des regulatorischen Calciumapparats nahelegt.
Die Einbringung der Chimären in eine cytolytische T-Zelllinie erlaubte es uns anschließend, das Potential der Fusionsproteine zur Übernahme der Effektorfunktion zu bewerten. In diesem Assay wurden Anti-CD16-Hybridomazellen, welche Zelloberflächen-IgG-Antikörper gegen CD16 exprimieren (Fleit et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 3275–3279; Shen et al., 1989, Mol. Immunol. 26: 959–969) als Targetzellen verwendet. Die Hybridomazellen wurden durch Einverleiben von ⁵¹Cr-Chromat markiert und mit Effektorzellen cosedimentiert, welche durch Infektion einer Human-allospezifischen, cytotoxischen T-Lymphocyten (CTL)-Linie mit Vacciniarekombinanten, welche die CD16/CD7/Kinase-Fusionsproteine exprimieren, hergestellt wurden. Die Expression der Chimären Rezeptorkinasen erlaubt es den infizierten CTL-Zellen sich an die Targetzellen zu binden und, wenn sie kompetent sind, diese zu lysieren, ein Prozeß, welcher durch die Freisetzung des einverleibten ⁵¹Cr-Chromats gemessen wird. Die relative Potenz der ausgerüsteten CTL wird durch Vergleich des Verhältnisses von Effektorzellen zu Targetzellen bestimmt, welche zur Erzielung eines angegebenen Verhältnisses an ⁵¹Cr-Freisetzung erforderlich sind. 4A zeigt, daß CTL, welche Chimäre Rezeptoren exprimieren, die Src-Kinasefamilien Lck oder Fyn (T) oder die Syk-Kinasefamilie ZAP-70 umfassen, keine Cytolyse gegen Anti-CD16-Hybridoma Targets vermitteln können. CTL, welche ein Kinasechimär basierend auf dem Syk-Proteinprodukt exprimieren, waren jedoch im wesentlichen ebenso wirksam wie CTL, welche ein Chimär exprimieren, das sich aus CD16 zusammensetzt, das in der gleichen Weise mit der intrazellulären Domäne der Zetakette des T-Zell-Rezeptors fusioniert ist. Die durch die CD16/CD7/Kinase-Chimären gesteuerte cytolytische Aktivität konnte keiner nicht-spezifischen Freisetzung von cytotoxischen Körnchen zugeschrieben werden, da die Cosedimentation eines irrelevanten mit Chrom beladenen Targets mit den mit Kinase-ausgerüsteten CTL nicht zu einer feststellbaren Freisetzung des markierten Chroms führte (4B).
Die Verschiedenheit zwischen Syk- und ZAP-70-Aktivitäten im Cytolyseassay war im Licht der ähnlichen Aktivitäten der beiden Chimären im Calciumantwortassay unerwartet. Im Hinblick auf den Nachweis, daß die Coexpression von nicht-chimären ZAP-70- und Src-Kinasefamilien zu einer Aktivierung in COS-Zellen führte (Chan et al., 1992, Cell 71: 649–662), unternahmen wir eine Bewertung des relativen Potentials von Kinasechimärpaaren, eine Cytolyse zu bewirken. CTL-Effektoren wurden mit rekombinanten Vacciniaviren coinfiziert, welche für ZAP-70 und Lck-Chimäre, ZAP-70- und Fyn (T)-Chimäre oder Lck- und Fyn (T)-Chimäre codieren. 5A zeigt, daß die Coexpression von ZAP-70- und Fyn (T)-Chimären, oder ZAP-70- und Lck-Chimären, die CTL mit einer Aktivität ausstatteten, welche im wesentlichen jener von CTL gleichwertig war, die CD16/CD7/Syk-Kinasechimäre alleine exprimieren, eine Aktivität die ihrer- seits so potent wie jene ist, welche durch CD16/CD7/Zeta-Chimäre gezeigt wird. Die Coexpression von Lck- und Fyn(T)-Chimären erlaubte keine Umleitung eines signifikanten cytolytischen Potentials gegen Anti-CD16-Targetzellen (5A). Die Bewertung des Calciummobilisierungspotentials von Zellen, welche mit Paaren von Kinasefusionsproteinen coinfiziert wurden, zeigte, daß die Coexpression von ZAP-70- und Src-Kinasefamilien-Chimären die Schnelligkeit erhöhte, mit welcher Calcium in Antwort auf die Rezeptorvernetzung mobilisiert wurde, und daß die Coexpression von Lck- und Fyn(T)-Chimären nicht zu einer signifikanten Akkumulierung von freiem intra zellulärem Calcium führte (5B). Um die Rolle des Fyn-Chimärs in der durch eine Coaggregation hervorgerufenen Aktivierungsantwort weiter zu untersuchen, stellten wir ein Fyn-Chimär her, welches aus den extrazellulären und den Transmembrandomänen von CD4 besteht, fusioniert mit Fyn auf eine Weise, die ähnlich jener der CD16-Chimären ist. 5C zeigt, daß die Wirksamkeit dieses Chimärs im gerichteten Cytolyseassay 10 bis 20-fach niedriger als jene des vergleichbaren CD16-Chimärs ist, was nahelegt, daß die physikalische Assoziierung der Chimären Kinasen für die Aktivierung wichtig ist. Die cytolytische Aktivität von Zellen, welche die beiden Chimären exprimieren, ist jedoch signifikant größer, als sie für Zellen beobachtet würde, welche das ZAP-70-Chimär allein exprimieren. Aufgrund des verhältnismäßig hohen Niveaus der Kinaseexpression in diesem System kann nicht ausgeschlossen werden, daß die verbleibende Aktivität die spontane zufällige Assoziierung des CD4/Fyn-Chimärs mit CD16/ZAP-70 reflektiert.
Um nachzuweisen, daß die Aktivierung, die sowohl im Calciumantwort-Assay als auch in Cytolyseassay festgestellt wurde, direkt der relevanten Kinaseaktivität und nicht einer passiven Assoziierung der Kinasen mit existierenden signalübertragenden Elementen zurechenbar ist, welche indirekte Aggregation dann die Aktivierungsantwort initiierte, bildeten wir Kinase- negative Varianten sowohl des Schweine-Syk- als auch des Human-ZAP-70-Rezeptorchimärs aus. 6 zeigt, daß Rezeptorchimären, welchen entweder im wesentlichen die gesamte Kinasedomäne fehlt (im Fall von Syk) oder welche eine Punktmutation tragen, welche die Phosphotransferaseaktivität aufhebt (im Fall von ZAP-70), die in vitro-Kinaseaktivität fehlt und daß diese unfähig waren, auf eine Vernetzung folgend die Calciummobilisierung zu vermitteln oder die Rezeptor-umgeleitete Cytolyse zu vermitteln.
Da die Wechselwirkung von Schweine-Syk mit dem Human-Zellapparat nicht identisch mit der Wechselwirkung von Human-Syk sein könnte, konstruierten wir auch ähnliche Proteinchimäre, basierend auf Human-Syk, nach dem Isolieren von Human-Syk-Sequenzen durch PCR mit Primern, welche den Amino- und Carboxyl-Termini der Schweine-Proteinsequenz entsprechen. 7A zeigt, daß Schweine- und Human-Syk überraschend ähnliche Proteine sind, wie es durch die Analyse von PCR-Produkten nahegelegt wird, welche Teilen der Kinase- und zweiten SH2-Domänen entsprechen (Chan et al., 1992, Cell 71: 649–662). In Übereinstimmung damit. verhielten sich Human-Syk-chimäre Rezeptorproteine hinsichtlich der Calciumfreisetzung und der Cytolyseassays im wesentlichen identisch zu den Schweinekonstrukten (7B und 7C).
Um festzustellen, ob die Aggregation der chimären Tyrosin-Kinasen zu einer signifikanten Änderung in der Häufigkeit von Phosphotyrosinproteinen führt, wurden T-Zell-Rezeptor-negative Zellen mit Vacciniarekombinanten infiziert, welche für die chimären Kinasen codieren. Die extrazellulären Domänen der Chimären wurden mit Antikörpern vernetzt und die gesamten Zelllysate der aktivierten Zellen wurden durch Elektrophorese fraktioniert, auf Membranen übergeführt und mit einem Phosphotyrosin erkennenden Antikörper analysiert. Es wurden Lysate hergestellt durch Aufbrechen von Zellen in nichtionischen Detergentien in Gegenwart von Vanadat mit oder ohne EDTA, oder durch Lysis in Gegenwart von Natriumdodecylsulaft, gefolgt von einem Beschallen, um die freigesetzte DNA zu scheren. Das Muster der Phosphotyrosinproteine war in jedem Fall verschieden und Lysate, die mit Vanadat, aber ahne EDTA hergestellt wurden, zeigten zusätzliche Spezies, welche in Lysaten, die in SDS alleine hergestellt wurden, nicht vorhanden sind, was nahelegt, daß EDTA die Postlysiswirkung von Tyrosin-Kinasen sowie von Phosphatasen inhibieren kann. Es wurde festgestellt, daß die Verwendung einer direkten Lysis in SDS zu reproduzier baren Mustern der Proteintyrosinphusphorylierung führt, als die Lysis mit nichtionischen Detergentien in Gegenwart von EDTA und Vanadat. 8 zeigt, daß die Aggregation von Chimären, welche Syk, ZAP-70, oder Fyn plus ZAP-70 tragen, zum Auftreten oder einer erhöhten Phosphorylierung von mehreren Proteinspezies führt, die mit Proteinen comigrieren, die eine auf eine Antigen-Rezeptor-Vernetzung folgende erhöhte Phosphorylierung zeigen. Insbesondere ist das Muster von Banden, welche durch Syk-Chimär-Clusterbildung hervorgerufen wird, dem Muster sehr ähnlich, welches durch den Anti-CD3-Antikörper in T-Zell-Rezeptor-positiven Zellen hervorgerufen wird (8). Darunter ist ein ungefähr 150 kD-Protein, welches durch die Aggregation von Syk-Chimär, aber auch durch die Coaggregation von Fyn- und ZAP-70-Chimären induziert wird. In vorläufigen Experimenten wurde festgestellt, daß dieses Phosphoprotein mit Phospholipase c-γ comigriert (Daten nicht gezeigt).
Um die Wirkungen der Clusterbildung von Kinasechimär auf PLC-γ direkt nachzuweisen, vernetzten wir Chimäre, fällten PLC-γ mit einem Gemisch von monoklonalen Antikörpern und analysierten die entstehenden Immunopräzipitate auf das Vorhandensein von Phosphotyrosylproteinen hin. 9 zeigte, daß die Clusterbildung von Syk zu einem wesentlichen Anstieg im Tyrosinphosphatgehalt von PLC-γ führte, wogegen das Covernetzen von Fyn plus ZAP-70-Chimären zu einem weniger dramatischen, aber leicht feststellbaren Anstieg im Tyrosinphosphat führte. Zellen, welche Fyn-Chimär allein exprimieren, zeigten eine mäßige basale Phosphorylierung von PLC-γ, welche auf eine Rezep- toraggregation folgend nicht anstieg (9). Ob die gleichen Tyrosinreste durch Syk, Fyn oder ZAP-70 plus Fyn phosphoryliert werden, ist gegenwärtig unbekannt. Da Zellen, welche Fyn-Chimär exprimieren, weder eine Ruhecalciummobilisierung zeigten, noch eine Calciummobilisierung hervorriefen, kann das Phosphotyrosinsignal, welches in diesen Zellen beobachtet wird, die Verwendung von anderen Steilen auf PLC-γ zeigen, als jenen, welche die Phospholipaseaktivierung vermitteln.
In einem vorläufigen Versuch die Änderungen im Phosphotyrosin- muster zu begründen, bewerteten wir die auf die Clusterbildung folgenden Aktivitäten der verschiedanen Kinasen in einem in vitro-Autophosphorylierungsassay. Die Chimären wurden aggregiert, immunogefällt und hinsichtlich ihrer Fähigkeit, einen Phosphatmarker in die in der Immunofällung vorhandenen Proteinspezies einzuverleiben, untersucht. 10A zeigt, daß unter diesen Bedingungen kein auf die Vernetzung folgender Anstieg in der Kinaseaktivität beobachtet wurde, wenn das Kinaseassay während 10 Minuten ausgeführt wurde. Obwohl die Einverleibung von markiertem Phosphat fortgesetzt während bis zu 30 Minuten in diesem Assay ansteigt, ist es unklar, welche Faktoren die Aktivität beschränken; insbesondere die beobachtete Kinetik kann durch die Dissoziierungsrate der Immunkomplexe dominiert werden, was eine Kinasediffusion zu nicht verwendetem Substrat ermöglicht. In einem Versuch, diese Wirkung zu steuern sowie die Empfindlichkeit des Assays zu maximieren, bewerteten wir auch die Syk-Kinaseaktivität mit oder ohne vorhergehendes Vernetzen über eine sehr kurze Zeitdauer von 5 bis 30 Sekunden; jedoch wurde auch hier kein signifikanter Anstieg in der Kinaseaktivität beobachtet (10B). Obwohl wir gegenwärtig die Möglichkeit nicht ausschließen können, daß ein Anstieg in der Aktivität mit einem geeigneten Substrat nachweisbar wäre, wurde ein durch Aggregation hervorgerufener Anstieg in der Aktivität von Syk-Chimär ebenfalls nicht beobachtet, wenn ein exogenes Peptidsubstrat (eine Y 19 K-Substitution von cdc-2-Resten 6–20) zur Messung der Kinaseaktivität verwendet wurde.
Mögliche Mechanismen
Der Mechanismus, durch welchen ein einfacher physikalischer Stimulus, eine Rezeptoraggregation, zur Transmission eines distinktiven chemischen Signals an die Immunsystemzellen führt, bleibt unbekannt. Frühere Studien haben gezeigt, daß die Src-Familie-Kinasen mit vielen der wichtigen durch Aggregation aktivierten Rezeptoren des Immunsystems assoziiert gefunden werden können, und daß die Vernetzung derartiger Rezeptoren häufig zu einer erhöhten Kinaseaktivität führt. Kürzlicher wurde von den verwandten Syk- und ZAP-70-Kinasen gezeigt, daß sie entweder stabil (im Fall von Syk) oder vorübergehend (im Fall von ZAP-70) mit den B- bzw. T-Zell-Antigen-Rezeptoren assoziieren, und mindestens im Fall von Syk wurde über eine Rezeptorvernetzung berichtet, welche in einer erhöhten Kinaseaktivität resultiert.
In dieser Arbeit haben wir gezeigt, daß die Aggregation der Syk-Familie-Kinasen, aber nicht der Src-Familie-Kinasen Lck oder Fyn, zu einer Calciumantwort in Zellen führt, welchen der T-Zell-Rezeptor fehlt. Die Antwort scheint nicht auf einer indirekten Assoziierung mit einem anderen T-Zell-Rezeptor oder signalübertragenden Komponenten zu beruhen, da Kinase-negative Mutanten die Calciumantwort nicht hervorrufen können. Die Aggregation von Chimären, welche die Syk-Kinase enthalten, ist ausreichend, um die Induktion einer spezifischen Cytolyse zu ermöglichen, während die Induktion einer ähnlichen Cytolyse durch ZAP-70-Chimär die zusätzliche Teilnahme einer Src-Familie-Kinase erfordert. Gegenwärtig ist es unklar, welche der Syk-Familie-Kinasen wahrscheinlich eine wichtigere Rolle in der T-Zell-Aktivierung spielt: sowohl ZAP-70 als auch Syk werden in T-Zellen exprimiert, einschließlich der in dieser Studie verwendeten Zelllinien, und mindestens eine responsive Human-T-Zelllinie enthält Syk, aber nicht ZAP-70, bewertet mittels spezifischer PCR-Amplifikationsprodukte. Das Muster der erhöhten Proteintyrosinphosphorylierung, welches auf eine Clusterbildung von Syk-Chimär folgend beobachtet wird, ist sehr ähnlich dem Muster, welches nach einer Vernetzung des T-Zellen-Antigen-Rezeptors festgestellt wird.
Ein einfaches Modell zur Aktivierung von Immunsystemzellen durch Nicht-Rezeptor-Tyrosin-Kinasen, zieht eine mit Rezeptorassoziierte Kinase heran, deren Aggregation zu einer Aktivierung entweder durch physikalische Assoziierung (z. B. durch Ausbildung von aktiven Kinase-Dimeren) oder durch gegenseitige enzymatische Wirkung (z. B. Kreuzphosphorylierung) führt; das aktivierte Enzym wirkt dann auf intrazelluläre Schlüsselsubstrate, welche für die Calciummobilisierung und die Inositphosphatsynthese benötigt werden. Unterstützung für diese Sequenz von Ereignissen kann in Studien gefunden werden, die von auf eine Rezeptorvernetzung folgenden Anstiegen in der Rezeptor-assoziierten Kinaseaktivität berichten (z. B. Bolen et al., 1991, Adv. Cancer Res. 57: 103–149; Burkhardt et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7410–7414; Eiseman und Bolen, 1992, Nature 355: 78–80; Hutchcroft et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9107–91111/J. Biol. Chem. 267: 8613-8619; Tsygankov et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 18259–18262; Wong et al., 1992, Oncogene 7: 2407–2415). Die berichteten Veränderungen in der Kinaseaktivität sind jedoch in den meisten Fällen mäßig und kontrastieren mit den dramatischen Veränderungen im Phosphotyrosylproteinmuster, welches in vivo beobachtet wird. Da es schwierig ist, einwandfrei die Aktivierung durch schwache allosterische Wechselwirkungen bei Verwendung von in vitro-Kinase-Assays als Tool auszuschließen, können wir an diesem Punkt keine definitive Aussage über die relative Wichtigkeit der Kinaseaktivierung in der Initiierung der Signalübertragung treffen. Aber die hier vorgestellten Daten legen nahe, daß die durch Aggregation induzierte Wiederaufteilung von Enzym und Substrat ein wichtiger Faktor in der Steue rung einer existierenden Aktivität hin zum geeigneten physiologischen Target sein kann.
Die Aggregation von Chimären; welche auf Syk-Familie-Kinasen beruhen, führt zu einer Calciumantwort, welche geringfügig verzögert, aber in der Amplitude der Antwort ähnlich war, die auf die Aggregation von Zeta-Rezeptorchimären in Zellen folgte, welchen endogener T-Zell-Rezeptor fehlt. Eine profundere Verzögerung im Auftreten von freiem Calciumion wurde auf die Vernetzung mit ZAP-70-Chimär folgend beobachtet, und diese Verzögerung konnte im wesentlichen durch Covernetzen von ZAP-70- und Fyn-Chimären vermieden werden. Gegenwärtig ist die Erklärung für die beobachtete Latenz unklar. Da die Covernetzung die Calciummobilisierung beschleunigte, ist man versucht, die Verzögerung der relativen Ineffizienz von ZAP-70 zur Aggregation-vermittelten Autoaktivierung zuzuschreiben. Aber andere Faktoren können gleich wichtig sein, und die Anbindung von ZAP- und Syk-Kinasen auf der Zelloberfläche kann tatsächlich ein Hindernis für die Aktivierung sein, im Vergleich zum normalen Prozess; beispielsweise, wenn im normalen Ablauf der Ereignisse Syk-Familie-Kinasen vorübergehend zu Rezeptorclustern rekrutiert, aktiviert und anschließend freigesetzt werden, um zu ihren Substraten zu diffundieren, könnte die permanente Verbindung der Kinasedomäne an die Plasmamembran restriktiv sein, indem sie den Zutritt zum Substrat behindert und/oder die Signalamplifikation in Folge der Unfähigkeit der chimären Rezeptoren als katalytisches Zentrum für die Kinaseaktivität zu dienen, einschränkt.
Eine zweite Besonderheit der Calciumantwort war die Feststellung, daß T-Zell-Rezeptor-positive Zellen, welche Chimäre exprimieren, die auf Human- oder Schweine-Syk basieren, eine hohe Grundlinienkonzentration an freiem Calciumion zeigten, was nahelegt, daß die Calciumfreisetzung spontan veranlaßt wurde. Eine ähnliche Feststellung wurde nicht in Rezeptor-negativen Zellen beobachtet. Dieses Ergebnis läuft entgegen einem allgemeinen Trend, den wir beobachtet. haben, wonach T-Zell-Rezeptor-negative Mutanten von Human-T-Zell-Tumorlinien typischerweise auf exogen eingebrachte Triggermoleküle hyperansprechend sind. Um das augenscheinliche Erfordernis eines T-Zell-Rezeptors im spontanen Aktivierungsprozeß zu berücksichtigen, haben wir zwei mögliche und verwandte Erklärungen vorgeschlagen. Eine besteht darin, daß die Chimäre Syk-Kinase konstitutiv auf T-Zell-Rezeptor-intrazelluläre Domänen wirken kann, um Phosphotyrosintargets für die SH2-Domänen des Rezeptorchimärs zu kreieren, was zu einer intrazellulären Aggregation durch eine mehrwertige T-Zell-Rezeptor-Brücke führt, die ihrerseits die Kinaseaktivierung fördert. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, daß die T-Zell-Rezeptor-negative Zelllinie niedrigere Mengen einer membranassoziierten Kinase besitzen kann, welche für die Aktivierung von Syk erforderlich ist, da entweder ein globaler regulatorischer Kreislauf zu einer verringerten De Novo-Synthese der hypothetischen Kinase führt, oder das Fehlen von Antigen-Rezeptor zu einem unregulierten intrazellulären Austausch führt.
In B-Zellen wurde von der Syk-Kinase berichtet, daß sie mit den intrazellulären Elementen des IgM-Antigen-Rezeptors konstitutiv assoziiert ist. (Hutchcroft et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9107–91111; Hutchcroft et al., 1992, J. Bi- ol. Chem. 267: 8613–8619). Der exakte Mechanismus dieser Assoziierung ist unklar, aber eine Möglichkeit ist, daß Phosphotyrosin für die Wechselwirkung von Syk-SH2-Domänen mit dem Tyrosin-Triggermotiv, welches in der cytoplasmischen Domäne der mb-l- und der B 29-Rezeptorketten vorliegt, nicht erforderlich ist. Ein Teilpräjudiz für diesen Vorschlag ist der Bericht, daß sich das Philadelphia-Chromosom-Bruchstelle-Clusterregion-Genprodukt BCR an eine Vielzahl von SH2-Domänen in einer Phosphotyrosin-unabhängigen Weise bindet (Pendergast et al., 1991, Cell 66: 161–171; Muller et al., 1992, Mol. Cell. Biol.
12: 5087–5093). In diesem Fall scheint es jedoch wahrscheinlich, daß Phosphoserin- und/oder Phosphotreoninreste eine kritische Rolle in der Wechselwirkung spielen. Alternativ kann Syk mit IgM-Rezeptor-intrazellulären Motiven durch die einzigartige Region assoziieren, welche zwischen den Syk-SH2-Elementen und der katalytischen Domäne lokalisiert ist. Eine dritte Möglichkeit besteht darin, daß nur eine sehr geringe Menge an Tyrosin-phosphoryliertem Peptid erforderlich ist, um funktional wichtige Mengen von Syk an der inneren Seite der Plasmamembran zu rekrutieren, und daß diese geringe Menge an Tyrosinphosphat bislang einer Feststellung entgangen ist.
Obwohl in B-Zellen das Erfordernis für eine Src-Familie-Kinase in der Aktivierung nicht definitiv nachgewiesen wurde, wurde in T-Zellen durch somatische oder Organismengenetik gezeigt, daß zwei Kinasen, Lck und Fyn (T), wichtige Rollen spielen (Appleby et al., 1992, Cell 70: 751–763; Karnitz et al., 1992, Mol. Cell. Biol. 12: 4521–4530; Stein et al., 1992, Cell 70: 741–750; Straus und Weiss, 1992, Cell 70: 585–593). Gegenwärtig können wir nicht zwingend nachweisen, ob die Wirkung dieser Kinasen der Wirkung der Syk-Familie-Kinasen üblicherweise vorauseilt oder dieser folgt. Eine Hypothese, welche für die Wirkung von ZAP-70 in der T-Zell-Aktivierung spricht, bezieht eine Rezeptor-assoziierte Src-Familie-Kinase ein, deren Aggregation eine vorübergehende Phosphorylierung von Rezeptorketten erlaubt, welche ihrerseits zur Assoziierung von ZAP-70 führt und darauffolgend zur Zellaktivierung. Die Anfangsphosphorylierung der Rezeptorketten, welche in diesem Modell vorgeschlagen wird, muß von der stabilen Phosphorylierung von Zeta, welche für längere Zeitspannen auf die Rezeptorvernetzung folgend beobachtet wird, unterschieden werden.
In Mäuse-T-Zellen kann ein geringer Anteil von T-Zell-Rezeptor-Komplexen ein Zeta-verwandtes Molekül, genannt Eta, enthalten (Baniyash et al., 1988, J. Biol. Chem. 263: 9874- 9878), welches eine alternativ gespleißte Form darstellt (Clayton et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5202-5206). Eta unterscheidet sich von Zeta am Carboxylterminus und es fehlt ihm das distalste der sechs Tyrosine, die in Mäuse-Zeta gefunden werden (Jin et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3319–3323). Obwohl die Phosphorylierung der Zeta-Kette von Mäuse-TCR-Zeta-Zeta-Isoformen auf die. Antikörpervermittelte Rezeptorvernetzung folgend leicht festgestellt werden kann, ist unter ähnlichen Umständen die TCR-Eta-Kette nicht feststellbar phosphoryliert (Bauer et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3842–3846). Die stabile Phosphorylierung der Zeta-Kette scheint zwei eng angeordnete Zeta-Ketten zu erfordern, da TCR-Isoformen, welche Zeta-Eta-Heterodimere tragen, auf eine Rezeptorvernetzung folgend nicht phosphoryliert werden (Bauer et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3842-3846). Trotz der Unterschiede in der Phosphorylierung sind Zelllinien, welche TCR-Isoformen umfassen, die ausschließlich aus Eta-Homodimeren bestehen, funktional von Zelllinien nicht unterscheidbar, die nur Zeta-Homodimere tragen (Bauer et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3842–3846). Die Phosphorylierung von Zeta, wie sie 30 Minuten nach der Antikörpervermittelten Rezeptoraggregation beobachtet wird, korrelliert daher nicht mit der Aktivierung. In einer getrennten Studie hat die Untersuchung des Zeitverlaufes der auf die TCR-Aggregation folgenden Akkumulierung von Phosphotyrosinphosphoproteinen gezeigt, daß die frühesten beobachtbaren Spezies 2 Proteine der Masse 135 und 100 kD sind, deren Phosphorylierung erstmals 5 bzw. 15 Sekunden nach der Vernetzung feststellbar ist, und deren halbe maximale Phosphorylierung, in beiden Fäl-len bei ungefähr 30 Sekunden, den Zeiten der halben maximalen Calciummobilisierung und der Inositphosphatbildung vorausgeht (June et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87-7722-7726; June et al., 1990, J. Immunol. 144: 1591–1599). Im Gegensatz dazu ist die Phosphorylierungsgeschiwindigkeit von Zeta wesentlich langsamer, was zu einer halben maximalen Substitution bei ungefähr 3 bis 5 Minuten nach der Stimmulierung führt, gut nachdem eine Calciumakkumulierung und Freisetzung von Inositphosphaten beobachtet wird (June et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7722–7726; June et al., 1990, J. Immunol. 144: 1591–1599).
Wenn das Zweistufenmodell korrekt ist, muß die Tyrosinphosphorylierung, die notwendig ist, um ZAP-70 an die Innenseite der Plasmamembran zu rekrutieren, somit ein schnelleres, vermutlich vorübergehendes Ereignis sein, als es in den vorstehenden Studien beobachtet wurde. Vor kurzem wurde vorgeschlagen, daß die Tyrosinphosphorylierung mit einem geeignet raschen (ca. 15 Sekunden) Beginn sowohl auf Zeta- als auch auf CD3-Epsilon-Ketten auf eine Rezeptorvernetzung folgend festgestellt werden kann (Wange et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 11685–11688), und daß ein 70 kD-Protein, welches Tyrosinphosphat trägt, sowohl mit Zeta- als auch mit Epsilon-Ketten assoziiert gefunden werden kann. Es ist gegenwärtig nicht klar, ob eine stabile Assoziierung mit phosphorylierten Rezeptorketten ein Erfordernis für eine erfolgreiche T-Zell-Aktivierung ist.
Als allgemeine Erklärung legen die hier berichteten Ergebnisse jedoch nahe, daß Syk-Familie-Kinasen direkter auf den Effektorapparat von T-Zellen wirken, als Src-Familie-Kinasen. Eine steigende Anzahl von Beweisen legt nahe, daß Src-Familie-Kinasen mit einer Anzahl von Zelloberflächenmolekülen assoziieren können, welche keine Mitglieder der Antigen/FC-Rezeptorfamilie sind, einschließlich CD2 (Bell et al., 1992, Mol. Cell. Biol. 12: 5548–5554), CD23 (Sugie et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9132–9135), CD36 (Huang et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 5467–5473), IL-2-Rezeptor-Beta-Kette (Hatakeyama et al., 1991, Science 252: 1523–1528) und verschiedener Phosphatidylinosit-verankerter Proteine (Stefanova et al., 1991, Science 254: 1016–1019; Thomas und Samelson, 1992, J. Bi ol. Chem. 267: 12317–12322), wovon einige bekanntermaßen das zusätzliche Vorhandensein des Antigen-Rezeptors erfordern, um eine Aktivierung in T-Zellen zu fördern. Eine einfache Erklärung für das letztgenannte Erfordernis kann sein, daß die Triggermotive auf dem Antigen-Rezeptor als Substrate für Src-Familie-Kinasen dienen, was das darauffolgende Andocken von Syk-Familie-Kinasen erlaubt, möglicherweise gefolgt von einem modifizierenden Ereignis, welches deren Aktivierung fördert. Aufgrund der Schwierigkeit, eine kausale Kette der Phosphorylierung und Aktivierung zu etablieren, kann es auch sein, daß die Triggermotive nur eine vorrübergehende Rolle besitzen, um als Art eines katalytischen Zentrums für die Rekrutierung, Aktivierung und Freisetzung von Effektorkinasen zu dienen.
Src-Familie-Kinasen sind überall in den nicht-hämatopoetischen Linien weit verbreitet und kürzliche Studien unter Verwendung von Fyn-negativen Mäusen haben gezeigt, daß für Fyn in der Aufrechterhaltung einer Langzeitpotenzierung eine Rolle existiert, dem Phänomen der erleichterten synaptischen Übertragung, von welchem angenommen wird, daß es der ursprünglichen Konsolidierung von assoziiertem Gedächtnis zugrunde liegt (Grant et al., 1992, Science 258: 1903–1910). Wenn ähnliche Aktivierungspfade durch Src-Familie-Kinasen in anderen Zelltypen vermittelt werden, können sich die Syk-Familie-Kinasen auch als in den extrahämatopoetischen Abteilungen weitgehender verbreitet erweisen.
Experimentelle Verfahren
Konstruktion von Chimären. Die gesamten codierenden Regionen von Human-Lck- (Koga et al., 1986, Eur. J. Immunol. 16: 1643-1646), Mäuse-Fyn (T)- (Cooke und Perlmutter, 1989, New. Biol. 1: 66–74), Schweine-Syk- (Taniguchi et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 15790–15796) und Human-ZAP-70- (Chan et al., 1992, Cell 71: 649–662) Kinasen wurden an die intrazelluläre Domäne eines chimären Transmembranproteins gebunden, welches aus der CD16 extrazellulären Domäne besteht, die an ein kurzes "Stangen"-Segment und die Transmembrandomäne von CD7 gebunden ist. Die CD7-intrazelluläre Domäne war an der Stop-Transfersequenz durch Addition einer Mlu-Stelle trunkiert. Die verschiedenen Kinasen wurden mit einer Mlu-Stelle im geeigneten Leserahmen adaptiert, um die Expression eines Tripartitfusionsproteins zu erlauben. Die Schweine-Syk-Sequenz wurde durch reverse Transkription und PCR von Gesamt-Schweine-Lymphocyten-RNA unter Verwendung von Primern, welche die geeigneten Restriktionsstellen besitzen, erhalten. Die ZAP-70-Sequenzen wurden in ähnlicher Weise durch PCR aus einer Human-T-Zell-cDNA-Bank erhalten. Mehrere Isolate wurden parallel sequenziert und eine mutationsfreie codierende Sequenz wurde für jede Kinase durch Restriktionsfragmentaustausch erhalten. Die entstehenden codierenden Sequenzen wurden in einen Vacciniavirus-Expressionsvektor stromabwärts von den CD16/CD7-Sequenzen insertiert. Human-Syk wurde aus einer natürlichen Killer-Zell-cDNA-Bank und aus einer Daudi-Zell-Bank unter Verwendung von Primern isoliert, welche den Enden der Schweinesequenz entsprechen. Der Vorwärts-Primer trug die Sequenz atg gca gac agt gcc aac cac ttg ccc ttc ttc t und der Revers-Primer trug die Sequenz cgc ggg gcg gcc gct tta att cac cac gtc gta gta gta. Nachdem die Anfangsamplifikation das Vorhandensein von Banden der erwarteten Größe zeigte, wurde eine Reamplifikation (10 Zyklen) unter Verwendung eines Extensionsprimers am 5'-Ende mit der Sequenz cgc ggg acg cgt acc atg gca gac agt gcc aac durchgeführt, was ermöglichte, daß das Fragment an einen Mlu I-geschnittenen Vektor ligiert wird.
Calciummobilisierungsanalyse. Die Durchflußcytometrie- und Bulkspektrophotometrieanalysen wurden mit Zellen durchgeführt, welche rekombinante Kinasen exprimieren, unter Verwendung des calciumempfindlichen Fluorophors Indo-1, wie zuvor beschrieben (Romeo und Seed, 1991, Cell 64: 1037–1046; Romeo et al., 1992, Cell 68: 889–897). Kurz zusammengefaßt, wurden die Zellen der Jurkat-mutanten Unterlinie JRT 3.T 3.5 (Weiss und Stobo, 1984, J. Exp. Med. 160: 1284–1299) mit rekombinanten Vacciniaviren während einer Stunde in serumfreiem IMDM bei einer moi von 10 infiziert und drei bis neuen Stunden in IMDM, 10% FBS inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt und mit 3 × 10⁶/ml in vollständigem Medium resuspendiert, welches 1 mM Indo-1-Acetomethoxyester enthielt (Grynkiewicz et al., 1985, J. Biol. Chem. 260: 3440–3450) (Molecular Probes, Eugene, OR), und bei 37°C während 45 Minuten inkubiert. Die mit Indo-1 beladenen Zellen wurden pelletiert und mit 1 × 10⁶/ml in serumfreiem IMDM resuspendiert und bei Raumtemperatur im dunklen gelagert. Die Zellen wurden auf freies Calciumion durch simultane Messung der violetten und der blauen Fluoreszenzemission durch Durchflußcytometrie analysiert (Rabinovitch et al., 1986, J. Immunol. 137: 952–961). Um den Calciumdurchfluß zu injizieren, wurde entweder unkonjugierter 3G8 (Anti-CD16) monoklonaler Antikörper (mit 1 μg/ml) der Zellsuspension zugesetzt, gefolgt von 10 μg/ml Phycoerythrin (PE)-konjugiertem Fab 02-Ziegen-Anti-Maus-IgG zum Zeitpunkt 0, oder es wurde ein PE-konjugierter Anti-CD4-Antikörper (Leu-3a, Becton Dickinson) zugesetzt, gefolgt von einem nichtkonjugierten zweiten Antikörper. Histogramme des Violett/Blau-Emissionsverhältnisses wurden aus der PE-positiven (infizierten) Zellpopulation gesammelt, welche typischerweise 40 bis 80% der Zellen darstellte. Das Violett/Blau-Emissionsverhältnis vor der Zugabe von Antikörper wurde verwendet, um das normalisierte, Anfangsverhältnis einzustellen, welches der Einheit gleichgesetzt wurde.
Lymphocytencytolyseassay. Eine CD8⁺-CD4^–-HLA-B44-restriktierte cytolytische Linie (WH3) wurde in IMDM, 10% Humanserum mit 100 U/ml IL-2 gehalten und periodisch mit bestrahlten (3000 rad) mononuklearen Zellen mit dem HLA-B44-Haplotyp stimuliert. Die Zellen wurden mindestens 10 Tage auf die Stimulierung folgend wachsen gelassen, bevor sie in Cytotoxizitätsassays verwendet wurden. Die Zellen wurden mit rekombinantem Vaccinia mit einer Multiplizität der Infektion von mindestens 10 während einer Stunde in serumfreiem Medium infiziert, gefolgt von der Inkubation in vollständigem Medium während drei Stunden. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren geerntet und mit einer Dichte von 1 × 10⁷/ml resuspendiert. 100 μl wurden zu jeder Vertiefung einer einen U-Boden aufweisenden Mikrotiterplatte zugesetzt, welche 100 μl/Vertiefung an vollständigem Medium enthielt. Die Zellen wurden in zweifachen seriellen Schritten verdünnt. Zwei Vertiefungen für jede Probe enthielten keine Lymphocyten, um eine spontane Chromfreisetzung und die Messung der Gesamtchromaufnahme zu ermöglichen. Ein Aliquot von 10⁶ 3G8-10-2 Targetzellen (Shen et al., 1989, Mol. Immunol. 26: 959–969) wurde zentrifugiert und in 50 μl sterilem ⁵¹Cr-Natriumchromat (1 m Ci/ml, DuPont) während einer Stunde bei 37°C mit unterbrochenem Mischen resuspendiert, anschließend dreimal mit PBS gewaschen. 100 μl markierte Zellen, resuspendiert in Medium mit 10⁵/ml wurden zu jeder Vertiefung zugesetzt. Die Mikrotiterplatte wurde bei 750 × g während 1 Minute zentrifugiert und während 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Am Ende der Inkubationsdauer wurden die Zellen in jeder Vertiefung durch sorgsames Pipetieren resuspendiert, es wurde eine Probe entfernt, um die einverleibten Gesamtcounts zu bestimmen, und die Mikrotiterplatte wurde bei 750 × g während 1 Minute zentrifugiert. 100 μl Aliquote des Überstandes wurden entfernt und in einem Gammastrahlenscintillationszähler gezählt. Das Verhältnis von Effektor zu Target wurde hinsichtlich des Prozentsatzes an infizierten Effektorzellen (üblicherweise >70%) korrigiert.
Ausbildung von mutanten Kinase-Chimären. Eine Schweine-Syk-Kinase-negative Fusionsproteinvariante wurde durch Spaltung des Chimärs mit Stu I und Not I (das letztgenannte liegt unmittelbar 3' zum Carboxylterminus), Einsetzen in die Not I-Stelle und Zusammenligieren der Enden hergestellt. Die entstehende Sequenz verband die ersten 298 Reste von Schweine-Syk an 4 fremde Reste (GPRL) vor der Terminierung. Eine Punktmutation (K369G) in der ATP-Bindungsstelle von ZAP-70 wurde durch Insertion eines Duplex-Oligonukleotid-Fragments zwischen die Ba-lI- und EarI-Stellen, welche zwischen den Nukleotidresten 1319 und 1345 des Topstranges der Sequenz angeordnet sind, welche von Chan et al. (1992, Cell 71: 649–662) beschrieben wird, ausgebildet. Die entstehende Sequenz codierte für Glycin am Rest 369 anstelle von Lysin.
Immunofällung und Kinaseassay. Ungefähr 2 × 10⁶ Hela-S3-Zellen wurden eine Stunde in serumfreiem DME-Medium mit rekombinantem Vaccinia mit einer Multiplizität der Infektion von mindestens 10 infiziert. 5 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen geerntet, zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen und in 1% Triton X-100, 0,15 M NaCl, 0,02 M HEPES pH 7,3, 5 mM EDTA, 5 mM NaF, 0,2 m MNaVO₃, 10 μg/ml-Peptin, 10 μg/ml Protinin und 1 mM PMSF lysiert. Nach 10 Minuten Inkubation auf Eis wurden die Kerne durch Zentrifugieren entfernt und die CD16-Fusionsproteine mit Antikörper BMA209/2 und Protein-A-Sepharose immunogefällt. Das mit Fusionsprotein beladene Harz wurde 3 mal mit Lysispuffer gewaschen, gefolgt von einer finalen Wäsche mit 20 mM Hepes pH 7.3. Zu jeder Probe wurden 10 μl Kinase-Buffer (20 mM Hepes pH 7.3, 10 mM MgCl₂, 10 mM MnCl₂) , welcher 10 μCi [γ-³²P]ATP (>3000 Ci/mMol.) enthielt, zugesetzt. Die Reaktionen wurden bei Raumtemperatur während 10 Minuten inkubieren gelassen und durch die Zugabe von 20 ml von 2X Probenbeladungspuffer (4% SDS, 100 mM Tris pH 6.8, 20% Glycerin und 10% β-Mercaptoethanol) beendet. Nachdem die Proben während 3 Minuten gekocht wurden, wurden Aliquote auf einem 4-15% Gratienten-Gel laufen gelassen. Die Kinaseassays mit einem löslichen Peptidsubstrat, entsprechend den Positionen 6 bis 20 von cdc 2, worin tyr 20 durch lys ersetzt wurde, wurden entsprechend den Empfehlungen des Herstellers (UBI) durchgeführt.
Immunoblotanalyse der Proteintyrosinphosphorylierung.
TCR-negative 3.5 Zellen wurden mit rekombinanten Virusausgangsmaterialien (moi von mindestens 10) während einer Stunde infiziert. Die Zellen wurden darauffolgend bei 37°C während 8-12 Stunden inkubiert, zentrifugiert, gewaschen und in Iscove's Medium ohne Serum mit 10⁷ Zellen pro ml resuspendiert. Aliquote von Zellen wurden mit Anti-CD16-mAb (3G8, Medarex oder BMA209/2, Behringwerke) mit 1 μg Antikörper pro 2–3 × 10⁶ Zellen inkubiert. Stimulierte Proben wurden ferner mit einem 3-5fachen Überschuß eines affinitätsgereinigten Anti-Maus-IgG 1-Antikörpers (Southern Biotechnology) während 5 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden darauffolgend nach Secrist, J. P.
Burns, L. A., Karnitz, L., Koretzky, G. A., und Abraham, R. T. (J. Biol. Chem. 268, 5886–5893, 1993) mit geringfügigen Modifikationen verarbeitet. Die Inkubationen wurden durch Zusetzen von SDS auf eine Endkonzentration von 1% beendet und die Proben wurden während 3 Minuten gekocht. Die DNA wurde durch Beschallen während 1 Minute unter Verwendung von Heat Systems Ultrasonics, Inc., geschert, zweifach Probenbuffer wurde zugesetzt und Aliquote, welche 10⁵ bis 2,5 × 10⁵-Zellen entsprechen, wurden auf Polyacrylamidgelen getrennt und die Proteine wurden durch halbtrockenes Elektroblotten (Hoefer) auf Nitrozellulose (Schleicher und Schuell BA45) übergeführt. Die Filter wurden während einer Stunde in Tris gepufferter Salzlösung mit 0,05% Tween-20 (TBST), enthaltend 1,5% Hühnerovalbumin (Sigma), geblockt, in TBST gewaschen und in eine Lösung übergeführt, welche Anti-Phosphotyrosin-Antikörper 4G10 (UBI) in einer 1 : 10000-Verdünnung enthielt, und bei 22° während 1–2h inkubiert. Nach dem Waschen mit TBST wurden die Filter in TBST und einer 1 : 5000-Verdünnung von Anti-Maus-Meerrettichperoxidase-Konjugat während 1 Stunde inkubiert. Die phosphorylierten Proteinbanden wurden durch Chemielumineszenz (ECL, Amersham) festgestellt. Die Aussetzungsdauer variierte von 2 Sekunden bis 5 Minuten.
Herstellung von Human-IgG1: Protein-Tyrosin-Kinase-Chimären
Es können Chimäre Moleküle hergestellt werden, welche die extrazelluläre Domäne eines Antikörpermoleküls enthalten, die für eine Targetzelle spezifisch ist, und die intrazelluläre Domäne einer Protein-Tyrosin-Kinase (z. B. jener der hierin beschriebenen Kinasen). Um ein derartiges Molekül herzustellen, werden Human-IgG1-schwere Kette-Sequenzen durch Verbinden der Sequenzen in der C_H3-Domäne an ein cDNA-Fragment, welches aus dem 3'-Ende der Transmembranform der Antikörper-mRNA abgeleitet ist, hergestellt. Das 3'-Ende Fragment wird durch Polymerasekettenreaktion unter Verwendung einer Mandel-cDNA-Bank als Substrat, und von Oligonukleotiden mit den Sequenzen:
entsprechend den 5'- bzw. den 3'-Enden der gewünschten DNA-Fragmente, hergestellt. Das 5'-Oligo ist zu einer Stelle in der C_H1-Domäne von Human-IgG1 komplenentär und das 3'-Oligo ist zu einer Stelle unmittelbar 5' von den Sequenzen komplementär, welche für die Membran-durchspannende Domäne codieren. Das PCR-Produkt wird mit BstXI und BamHI verdaut und zwischen BstXI- und BamHI-Stellen eines semisynthetischen IgG1-Antikörper-Gens ligiert, welches variable und konstante Regionen trägt. Auf die Insertion des BstXI bis BamHI-Fragments folgend, werden die amplifizierten Anteile des Konstruktes bis zur SmaI-Stelle in C_H3 durch Restriktionsfragmentaustausch ersetzt, sodaß nur der Anteil zwischen der SmaI-Stelle und dem 3'-Oligo aus der PCR-Reaktion abgeleitet ist.
Um einen Human-IgG1-chimären Rezepror auszubilden, wird das schwere-Kette-Gen, welches in einer BamHI-Stelle endet, durch Standardverfahren an die interessierende Kinase-intrazelluläre Domäne gebunden. Das Niveau der Expression an chimärem Rezeptor kann durch Durchflußcytometrie ermittelt werden. Die An stiege in der Expression können durch eine Coexpression eines Plasmids, welches für eine Antikörper-leichte Kette-cDNA codiert, durchgeführt werden.
Um eine einzelne Transkriptionseinheit auszubilden, welche es erlauben würde, daß sowohl die schwere als auch die leichte Kette aus einem einzelnen Promotor exprimiert wird, wird ein Plasmid ausgebildet, das für eine biscistronische mRNA codiert, welches Plasmid aus für die schwere- und die leichte-Kette codierenden Sequenzen ausgebildet wird, und dem 5'untranslatierten Anteil der mRNA, welche für das 78 kD Glucoseregulierte Protein codiert, anderwertig als grp78 bekannt, oder BiP. grp78-Sequenzen werden durch PCR von genomischer Human-DNA unter Verwendung von Primern mit den Sequenzen:
am 5'- bzw. 3'-Ende erhalten. Die Polymerasekettenreaktionen mit diesen Oligos werden in Gegenwart von 10% Dimethylsulfoxid durchgeführt. Das durch PCR erhaltene Fragment wird mit NotI und HincII verdaut und zwischen NotI- und HpaI-Stellen stromabwärts von den für Human-IgG1 codierenden Sequenzen insertiert. Sequenzen, welche für eine Human-IgG-kappa-leichte Kette-cDNA codieren, werden stromabwärts vom grp78-Leader insertiert, unter Verwendung der HincII-Stelle und einer weiteren Stelle im Vektor. Das Expressionsplasmid, welches aus diesen Manipulationen resultiert, besteht aus dem semisynthetischen schwere-Kette-Gen, gefolgt von den grp78-Leader-Sequenzen, gefolgt von den kappa-leichte-Kette-cDNA-Sequenzen, gefolgt von den Polyadenylierungssignalen, die aus einem SV40-DNA-Fragment abgeleitet sind. Wir haben früher gezeigt, daß die Transfektion von COS-Zellen mit diesem Expressionsplasmid eine merklich verbesserte Expression von schwere-Kette-Determinanten ergab, im Vergleich zur Transfektion von Plasmid, welches alleine für schwere-Kette-Determinanten codiert.
Um ein bicistronisches Gen auszubilden, welches ein schwere-Kette/Rezeptor-Chimär und eine leichte Kette umfaßt, können die stromaufwärts schwere-Kette-Sequenzen durch jedes beliebige chimäre schwere-Kette/Rezeptor-Gen, welches hierin beschrieben ist, ersetzt werden.
Nach der Herstellung können die IgG-Tyrosin-Kinase-Chimären in einen Expressionsvektor geklont, in eine Wirtszelle eingebracht und durch jedes beliebige der hierin beschriebenen Assays getestet werden (z. B. durch Calciummobilisierungs- oder Cytolyseassays).
Herstellung von CD4-Tyrosin-Kinase-Chimären
Es können chimäre Moleküle hergestellt werden, welche die extrazelluläre Domäne des CD4-Moleküls und die intrazelluläre Domäne einer Protein-Tyrosin-Kinase (z. B. jener hierin beschriebenen Kinasen) enthalten können. Um ein derartiges Molekül herzustellen, wird die für die Tyrosin-Kinase codierende Sequenz (beispielsweise cDNA) isoliert (wie beispielsweise vorstehend beschrieben). Diese Sequenz wird anschließend durch Standardverfahren an die extrazelluläre Domäne einer manipulierten Form von CD4 gebunden, welche eine BamHI-Stelle gerade stromaufwärts von der Membran-durchspannenden Domäne besitzt. (Aruffo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 8573–8577 (1987b); Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol., 9347–353 (1990)) Um dieses Fusionsprotein auszubilden, kann eine BamHI-Stelle in die Sequenz an der geeigneten Stelle (wieder durch Standardverfahren) eingesetzt werden. Die Genfusionen werden in ein Vacciniavirusexpressionsplasmid eingebracht (wie hierin beschrieben) und in das Genom des Vaccinia-WR-Stammes durch homologe Rekombination und Selektion durch Wachstum in Mycophenolsäure insertiert (Falkner et al., J. Virol., 62: 1849-1854 (1988); Boyle et al., Gene, 65: 123–128 (1988)). Die Durchflußcytometrieanalyse wird verwendet, um die Expression durch die Vacciniarekombinanten der CD4-Tyrosin-Kinase-Fusionsproteine an der Zelloberfläche zu untersuchen. Die Immunofällung von Zellen, welche mit den Vacciniarekombinanten infiziert sind, wird verwendet, um die Ergebnisse zu bestätigen (wie vorstehend beschrieben).
Die Wirksamkeit von CD4-Chimären kann durch jedes beliebige der hierin beschriebenen Calciummobilisierungs- oder Cytolyseassays überprüft werden. In einem speziellen Beispiel wird ein Modell-Target: Effektor-System, basierend auf der CD4-Erkennung des HIV-Hüll-gp120/gp41-Komplexes ausgebildet. HeLa-Zellen werden mit rekombinanten Vacciniaviren infiziert, welche 9p120/gp41 exprimieren (Chakrabarti et al., Nature, 320: 535–537 (1986); Earl et al., J. Virol., 64: 2448–2451 (1990)) und mit ⁵¹Cr markiert. Die markierten Zellen werden mit Zellen einer Human-allospezifischen (CD8⁺, CD4^–) cytotoxischen-T-Lymphocyten-Linie inkubiert, welche mit Vacciniarekombinanten infiziert wurde, die das CD4-Tyrosin-Kinase-Chimär exprimieren und hinsichtlich der spezifischen Lysis untersucht.
Um die Möglichkeit zu steuern, daß die Vacciniainfektion eine künstliche Erkennung durch CTL fördern könnte, wurden ähnliche Cytolysexperimente mit Targetzellen durchgeführt, die mit Vacciniarekombinanten infiziert waren, welche die Phosphatidylinnosit-gebundene Form von CD16 (CD16_PI) exprimieren und mit ⁵¹Cr markiert, und mit CTL, infiziert mit Kontrollrekombinanten, welche CD16-Chimäre exprimieren.
In einem weiteren Beispiel sind neutrophile Granulocyten, welche eine sehr kurze Lebensdauer (≈ 4h) im Kreislauf aufweisen und intensiv cytolytisch sind, attraktive Zellen zur Expression von CD4-Tyrosin-Kinase-Chimären. Die Infektion von Neutrophilen mit HIV führt wahrscheinlich nicht zu einer Virusfreisetzung und die Häufigkeit dieser Zellen (die häufigsten der Leukocyten) sollte die Wirtsabwehr ermöglichen. Eine wei tere attraktive Möglichkeit für Wirtszellen sind reife T-Zellen, eine Population, welche gegenwärtig durch retrovirale Manipulation zugänglich ist (Rosenberg, S. A. Sci. Am., 262: 62-69 (1990)). Mit Hilfe von rekombinantem IL-2 können T-Zell-Populationen in Kultur mit verhältnismäßiger Leichtigkeit vergrößert werden und die vergrößerten Populationen besitzen typischerweise eine begrenzte Lebensdauer, wenn sie reinfundiert werden (Rosenberg et al., N. Engl. J. Med., 323: 570–578 (1990)) .
Unter den geeigneten Bedingungen sollte die HIV-Erkennung durch Zellen, welche CD4-Chimäre exprimieren, auch mitogene Stimuli hervorrufen, was die Möglichkeit zuläßt, daß die aus- gerüstete Zellpopulation dynamisch auf eine virale Belastung antworten könnte. Obwohl wir uns hier auf das Verhalten der Fusionsproteine in cytolytischen T-Lymphocyten konzentriert haben, könnte die Expression der Chimären in Helfer-Lymphocyten eine HIV-mobilisierte Quelle von Cytokinen gewährleisten, welche dem Zusammenbruch des Helferzellen-Subsets bei AIDS entgegenwirken könnte. Eine kürzliche Beschreibung von mehreren Schemata zur Manipulierung der Widerstandsfähigkeit gegenüber einer Infektion bei Stufen, welche keine Viruspenetration sind (Friedman et al., Nature, 335: 452454 (1988); Green et al., Cell, 58: 215–223 (1589); Malim et al., Cell, 58: 205–214 (1989); Trono et al., Cell, 59: 113–120 (1989); Buonocore et al., Nature, 345: 625–628 (1990)) legt nahe, daß CD4-Chimäre tragende Zellen entworfen werden könnten, um die Virusproduktion durch Expression von geeigneten Mitteln mit einer intrazellulären Wirkungsstelle zu vereiteln.
Die Fähigkeit zur Übertragung von Signalen an T-Lymphocyten durch autonome Chimäre gewährleistet auch die Fähigkeit zur Regulierung von retroviral manipulierten Lymphocyten in vivo. Vernetzungsstimuli, beispielsweise vermittelt durch spezifische IgM-Antikörper, die manipuliert wurden, um komplementbin dende Domänen zu entfernen, können es derartigen Lymphocyten erlauben, in situ in der Zahl anzusteigen, während die Behandlung mit ähnlichen spezifischen IgG-Antikörpern (welche beispielsweise eine Aminosäurevariation erkennen, die in die Chimärkette eingefügt wurde) selektiv die manipulierte Population vermindern könnte. Wir haben zuvor festgestellt, daß Anti-CD4-IgM-Antikörper kein zusätzliches Vernetzen erfordern, um Calcium in Jurkat-Zellen zu mobilisieren, welche CD4:ζ-Chimäre exprimieren. Die Fähigkeit zur Regulierung von Zellpopulationen ohne Rückgriff auf wiederholte extrakorporale Amplifikation kann den Bereich und die Wirksamkeit von gegenwärtigen Anwendungen, die für genetisch manipulierte T-Zellen vorgeschlagenwerden, beträchtlich erweitern.
Andere Ausführungsformen
Um andere Chimäre herzustellen, welche aus Protein-Kinaseintrazellulären Sequenzen bestehen, können cDNA oder genomische Sequenzen, welche für eine extrazelluläre Domäne des Rezeptors codieren, mit einer Restriktionsstelle versehen werden, welche an einer Stelle unmittelbar vor der extrazellulären Domäne der Wahl eingebracht wird. Das extrazelluläre Domänenfragment, welches in der Restriktionsstelle endet, kann anschließend an die Protein-Kinase-Sequenzen gebunden werden. Typische extrazelluläre Domänen können aus Rezeptoren erhalten werden, welche Komplemente, Kohlenhydrate, virale Proteine, Bakterien, Protozoen oder Metazoen-Parasiten oder durch diese hervorgerufene Proteine erkennen. In ähnlicher weise können Liganden oder Rezeptoren, welche von Pathogenen oder Tumorzellen exprimiert werden, an Protein-Kinase-Sequenzen gebunden werden, um die Immunantworten gegen Zellen zu steuern, welche diese Liganden erkennende Rezeptoren tragen.
Um die minimalen Protein-Kinase-Sequenzen zu identifizieren, welche für eine Cytolyse notwendig sind, kann eine Reihe von Deletionsmutanten durch Standardverfahren hergestellt werden, worin nacheinander mehr der Kinase-intrazellulären Domäne entfernt wird. Derartige Deletionsmutanten werden hinsichtlich der Wirksamkeit in jedem beliebigen der hierin beschriebenen Assays untersucht. Nützliche intrazelluläre Domänen für die Syk-Protein-Kinase umfassen beispielsweise die Aminosäuren 336–628 der Schweine-Syk-Sequenz und die Aminosäuren 338–630 der humanen Syk-Sequenz.
SEQUENZLISTE

Claims

Therapeutische Zelle, die einen Membran-gebundenen, proteinhältigen Chimären Rezeptor exprimiert, welcher Rezeptor (a) einen intrazellulären Anteil aus einer Protein-Tyrosin-Kinase, welcher fähig ist, der therapeutischen Zelle zu signalisieren, daß eine Rezeptor-gebundene Targetzelle oder ein Rezeptor-gebundener Targetinfektionserreger zu zerstören ist, und (b) einen extrazellulären Anteil umfaßt, welcher fähig ist, die Targetzelle oder den Targetinfektionserreger spezifisch zu erkennen und zu den, wodurch jede der therapeutischen Zellen fähig ist, die Targetzelle oder den Targetinfektionserreger spezifisch zu erkennen und zu zerstören.
Zelle nach Anspruch 1, wobei die Protein-Tyrosin-Kinase ein Mitglied der Syk-Kinasefamilie ist.
Zelle nach Anspruch 2, wobei die Protein-Tyrosin-Kinase Syk ist.
Zelle nach Anspruch 3, wobei der intrazelluläre Anteil die Schweine-Syk-Aminosäuren 336–628 oder die Human-Syk-Aminosäuren 338–630 umfaßt.
Zelle nach Anspruch 1, wobei jede der therapeutischen Zellen einen zweiten Membran-gebundenen, proteinhältigen Chimären Rezeptor exprimiert, welcher zweite Chimäre Rezeptor (a) einen intrazellulären Anteil aus einer zweiten Protein-Tyrosin-Kinase, welcher fähig ist, der therapeutischen Zelle zu signalisieren, daß eine Rezeptor-gebundene Targetzelle oder ein Rezeptor-gebundener Targetinfektionserreger zu zerstören ist, und (b) einen extrazellulären An- teil umfaßt, welcher fähig ist, die Targetzelle oder den Targetinfektionserreger spezifisch zu erkennen und zu bin den, wodurch jede der therapeutischen Zellen fähig ist, eine Targetzelle oder einen Targetinfektionserreger spezifisch zu erkennen und zu zerstören.
Zelle nach Anspruch 5, wobei eine der Protein-Tyrosin-Kinasen ein Mitglied der Syk-Kinasefamilie ist und die andere der Protein-Tyrosin-Kinasen ein Mitglied der Src-Kinasefamilie ist.
Zelle nach Anspruch 6, wobei eine der Protein-Tyrosin-Kinasen ZAP-70 ist und die andere der Protein-Tyrosin-Kinasen Fyn ist.
Zelle nach Anspruch 6, wobei eine der Protein-Tyrosin- Kinasen ZAP-70 ist und die andere der Protein-Tyrosin-Kinasen Lck ist.
Zelle nach den Ansprüchen 1 oder 5, wobei die therapeutischen Zellen von der Gruppe bestehend aus: (a) T-Lymphocyten; (b) cytotoxischen T-Lymphocyten; (c) natürlichen Killerzellen; (d) Neutrophilen; (e) Granulocyten; (f) Makrophagen; (g) Mastzellen; und (h) HeLa-Zellen ausgewählt sind.
Zelle nach Anspruch 1, wobei der Targetinfektionserreger ein Immunschwächevirus ist.
Zelle nach Anspruch 10, wobei der extrazelluläre Anteil einen HIV-Hüllen-bindenden Anteil von CD4 umfaßt.
Zelle nach den Ansprüchen 1 oder 5, wobei die Bindung MHCunabhängig ist.
Zelle nach den Ansprüchen 1 oder 5, wobei der extrazelluläre Anteil den Liganden-bindenden Anteil eines Rezeptors, den Rezeptor-bindenden Anteil eines Liganden, den Antigenbindenden Anteil eines Antikörpers oder ein funktionelles Derivat hievon umfaßt.
DNA, welche für einen Chimären Rezeptor von 1 oder 5 codiert. 15, Vektor, umfassend die Chimäre Rezeptor-DNA der Ansprüche 1 oder 5.