FI119995B - Menetelmä reseptorikimeerojen avulla immuniteettia uudelleensuuntavien solujen valmistamiseksi - Google Patents

Description

Menetelmä reseptorikimeeroj en avulla immuniteettia uudel-leensuuntaavien solujen valmistamiseksi

Keksinnön ala 5 Tämä keksintö koskee menetelmää funktionaalisten proteiini-tyrpsiinikinaäsikimeeröjen, jotka kykenevät suuntaamaan uudelleen immuunijärjestelmän toimintaa, valmistamiseksi. Tarkemmin sanottuna tämä keksintö koskee lymfosyyttien, makrofagien, luonnollisten tappajasolujen tai granulo-10 syyttien toiminnan säätelyä siten, että näissä keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettavissa soluissa ilmentyy ki-meeroja, joiden vaikutuksesta soluissa syntyy vaste kimeero-jen tunnistamia kohteita vastaan. Tämän keksinnön mukainen menetelmä liittyy myös funktionaalisiin proteiini-tyrosii-15 nikinaasikimeeroihin, jotka kykenevät ohjaamaan terapeuttisia soluja tunnistamaan spesifisesti spesifisellä, infektoi-valla agenssilla infektoituneet solut, infektoivan agenssin itsensä, tuumörisolun tai autoimmunologisesti muodostuneen solun ja tuhoamaan: ne. Tarkemmin sanottuna tämän keksinnön 20 mukainen menetelmä liittyy sellaisten proteiini-tyrosiini-kinaasikimeeroiden muodostamiseen, jotka kykenevät ohjaamaan sytotoksisia T-lymfosyyttejä tiinnistamaan spesifisesti HIV:n vaippaprötelineja ilmentäviä soluja ja hajottamaan niitä. Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettavista so-25 luista saadaan siis käyttöön terapeuttinen keino HTV-viruksen aiheuttamien tautien, kuten AIDS:in [Acquired Immunodeficiency Syndrome (immuunikato)], hoitoon.

Keksinnön tausta

Monet immunologiset ilmiöt perustuvat siihen, että 30 T-solu tunnistaa antigeenin T-solureseptorin välityksellä. T-solut ohjaavat soluvälitteiseksi immuniteetiksi kutsuttua ilmiötä. Tähän liittyy se, että immuunijärjestelmän solut tuhoavat vieraita kudoksia tai infektoituneita soluja. On olemassa useita erilaisia immuunivastetta sääteleviä T-solu-35 ja, kuten "auttaja"- ja "suppressori"-soluja, sekä sytotok- 2 s isiä {eli 11 kappa ja") soluja, jotka pys tyvä t s uo.r aan t appa ~ maan epänormaaleja soluja.

T-solu aktivoituu tunnistettuaan toisen solun pinnalla esiintyneen ainutlaatuisen antigeenin ja sitouduttu" 5 aan tähän; tämän jälkeen T-solu pystyy jakautumaan ja jos se on sytotoksinen solu, niin se pystyy tappamaan solun, johon se on kiinnittynyt.

Autoimmuunitaudille on tyypillistä, että siinä muodostuu joko isäntäkudoksen kanssa reagoivia vasta-aineita 10 tai autoreaktiivisxa immunologisia efektori-T-soluja. Joissain tapauksissa autovasta-aineita saattaa syntyä sellaisen normaalin: T- ja B-soluvasteen välityksellä, joka aktivoituu sellaisten vieraiden aineiden tai organismien vaikutuksesta, jotka sisältävät antigeenejä, jotka ristireagoiyat nii-15 den kanssa: samanlaisten elimistön kudosten kanssa. Kliinisesti merkittäviä autovasta-aineita ovat esimerkiksi mvas-tenia graviksessa esiintyvät asetyylikoliinireseptoreja vastaan suunnatut vasta-aineet; ja LED-taudissa (systemic lupus erythematosus) esiintyvät anti-DNA-, anti-erytro-20 syytti- ja anti-verihiutalevasta-aineet.

HTV ja immunopatogeneesi

Vuonna 1984 osoitettiin, että HIV on AIDS:in etnologinen agenssi. Siitä lähtien AIDS:in määritelmää on tarkastettu monia kertoja diagnoosin tekemiseen tarvittavien 25 kriteerien osalta. Diagnostisten parametrien vaihtuvuudesta huolimatta yksi yhteinen AIDS*in piirre on kuitenkin HIV-infektio ja sen seurauksenä kehittyvät persistentit terveydentilaan vaikuttavat oireet ja ÄIDSrilie tyypilliset taudit, kuten sekundaari-infektiot, kasvaimet ja neurologiset 30 sairaudet. Harrison's Principles of Internal Medicine, 12th ed., McGraw Hill {1991).

HIV on lentivi rusten ryhmään kuuluva humaani-retrovirus. Neljä tunnistettua humaani-retrovirusta voidaan jakaa kahteen toisistaan poikkeavaan ryhmään: humaani-T- 35 lymfotrooppisiin (eli leukemia-) retroviruksiin, HTLV-1 ja HTLV-2, ja humaani-immuunikatovi ruksi in, HIV-1 ja HIV-2.

3

Ensiksi mainitut virukset ovat transformoivia viruksia kun taas viimeksi mainitut ovat sytopaattisia viruksia.

HIV-I:n on todettu olevan yleisin AIDS:in aiheutfa ia kaikkialla maailmassa. HiV-lin ja HIV-2:n välinen sek-5 venssihomqlogia on noin 40 % ja HIV-2 on iäheisempää sukua joillekin apinoiden immuunikatovirusten (SIV) ryhmän jäsenille. Tätä on käsitelty julkaisuissa Curran, J., et ai.,

Science 329 (1985) 1357 ~ 1359; Weiss, R., et ai,, Nature 324 (1986) 572 - 575.

10 HIVrssä on retrovirusten tavalliset geenit (env, gag ja pol) sekä kuusi viruksen repiikaatioon ja muihin biologisiin aktiivisuuksiin osallistuvaa ylimääräistä geeniä. Kuten edellä mainittiin, AIDS:in eri ilmenemismuodoille yhteinen piirre on pääasiassa soluvälitteiseen im-15 munlteettiin vaikuttava immuunivasteen vaikea-asteinen vaimentuminen. Tämän immuunlsuppression seurauksena kehittyy monia erilaisia opportunistisia sairauksia, pääasiassa infektioita ja kasvaimia.

On havaittu, että AIDSrissa esiintyvän immuunikadon 20 pääasiallinen syy on kateenkorvasta peräsin olevien (T-) lymfosyyttien alaluokan, T4-solupopulaation, kvantitatiivinen ja kvalitatiivinen puutos. Tämä solujen alaluokka on määritelty fenotyyppinsä mukaisesti näiden solujen pinnalla esiintyvän, HIV:n solureseptoriksi tunnistetun CD4-mo-25 lekyylin perusteella. Dalgleish et ai., Nature 312 (1984) 763. Vaikka T4-solu on tärkein HIV:n infektoima solutyyppi, niin itse asiassa mikä tahansa humaanisolu, jonka pinnalla ilmentyy CD4-molekyyliä, pystyy sitomaan HIV:tä ja infektoitumaan sillä.

30 CD4+-T-soluja on perinteisesti pidetty auttaja/indu- sorisoluina, mikä nimitys viittaa niiden tehtävään antaa B-soluille aktivoiva signaali tai indusoida vaikutuksensa kohteena olevan CD8-markkerin sisältävät T-solut muuttumaan sytotoksisiksi/suppressorisoluiksi. Reinherz ja i 4

Schlossman, dell 19 (1980) 821 - 827; Goldstein,· et ai., Immunol. Rev, 68 (1982) 5-42, HIV sitoutuu spesifisesti ja suurella affiniteetil-lä viruksen vaipassa olevan aminohappojakson (gpl2Q) väli-5 tyksellä CD4-molekyyliin Vl-alueen osaan, joka sijaitsee lähellä molekyylin N-terminaalista päätä. Sitouduttuaan virus fuusioituu kohdesolun membraaniin ja menee solun sisään. Solun sisään mentyään virus käyttää käänteisko-piointientsyymlä transkriboimaan genomisen RNA:nsa 10 DNA: ksi, joka sitten integroituu solun DNAihan, jonne se jää solun elinajaksi "proviruksena".

Provirus saattaa pysyä latenttina tai se saattaa aktivoitua, jolloin alkaa mRNArn ja genomisen RNA;n transkriptio, mikä johtaa proteiinisynteesiin, muokkaukseen, 15 uusien virionien muodostumiseen ja viruksen silmukoitumi-seen solun pinnalta, mikä saa aikaan plasmamembraanin hajoamisen ja sen seurauksena syntyvän osmoottisen epätasapainon .

Infektion aikana isäntäeliössä muodostuu vasta-ai-20 neita virusproteiineja, kuten vaipan tärkeitä glykopro-teiineja gpl20:aa ja gp41:tä, vastaan. Tästä vasta-ainevä-litteisesbä immuniteetissa huolimatta tauti etenee ja aiheuttaa tappavan inunuunisuppression, jolle tyypillisiä piirteitä ovat opportunistiset infektiot, parasitemia, 25 dementia ja kuolema. Eräs tämän infektion kiusallisimmista ja pelattavimmista piirteistä on se, etteivät isännän virusta vastaan muodostuneet vasta-aineet pysty pysäyttämään taudin etenemistä, mikä ennakoi huonoa menestystä tavanomaisin menetelmin toteutetaville rokotuskokeiluille.

30 On olemassa kaksi tekijää, joilla saattaa olla osuutta immuunikatoviruksia vastaan kohdistuneen humoraa-lisen vasteen tehokkuuteen. Ensiksikin muiden RNA-virusten tavoin (ja varsinkin muiden retrovirusten tavoin) immuunikatovirusten on havaittu mutatoituvan voimakkaasti vastee-35 na isännän immuunipuolustukselle. Toiseksi vaipan glyko- 5 proteiinit sinänsä ovat voimakkaasti glykosyloituneita molekyylejä ja niissä on vain muutama epitoöppi, johon vasta-aine pystyy sitoutumaan suurella affiniteetilla. Koska viruksen vaippa on antigeenisesti huono kohde, ei 5 isännällä ole paljonkaan mahdollisuuksia virusinfektion rajoittamiseen spesisifiä vasta-aineita tuottamalla.

HIV-viruksen infektoimien solujen pinnalla ilmentyy gpl20-glFkoproteiinia. CD4+-solut fuusioituvat toisiinsa gpl20:n välityksellä reaktiolla, joka muistuttaa viruksen 10 tunkeutumista infektoitumattomiin soluihin, minkä seurauksena syntyy lyhytikäisiä monitumsisia jättisoluja. Solu-sitkoksen muodostuminen on riippuvainen gpl20-vaippaglyko-proteiinin ja GD4~proteiinin välisestä välittömästä vuorovaikutuksesta. Dalgleish, et ai., edellä; Klatzman, D., et 15 ai.. Nature, 312 (1984) 763; McDougal, J.S., et ai,.

Science, 231 (1986) 382; Sodroski, J., et ai., Nature, 322 (1986) 470; Lifson, J.D., et ai., Nature, 323 (1986) 725; Sodroski, J., et ai,, Nature, 321 (1986) 412.

Todisteena siitä, että CD4:n ja gpl20;n välinen 20 sitoutuminen aiheuttaa GD4-antigeenin sisältävien solujen infektoitumisen viruksella, on havainto, että gpl20:n ja CD4:n välille muodostuu spesifinen kompleksi. McDougal, et ai..., edellä. Myös muut tutkimusryhmät ovat osoittaneet, että HIV:11a infektoitumattomat solulinjat muuntuivat in-25 fektoituviksi sölulinjöiksi, kun ne transfektoitiin humaa- ni-CD4-cDNÄ~geenillä ja tätä ilmennettiin niissä. Maddon et ai., Cell 46 (1986) 333 - 348.

Monet tutkimusryhmät ovat ehdottaneet otettavaksi käyttöön sellaisia terapeuttisia ohjelmia, jotka perustu-30 vat liukoisen CD4:n käyttöön passiivisena aineena, joka häiritsee viruksen adsorptiota ja viruksen synsytium-vä-litteistä siirtymistä solusta toiseen, ja osöittaneet, että näillä saavutetaan suotuisia tuloksia in vitro -olosuhteissa [Deen, et ai., Nature 3321 (1988) 82 - 84; 35 Fisher, et ai., Nature 331 (1988) 76 - 78; Hussey, et ai., 6

Nature 331 (1988) 78 - 81; Smith, et al., Science 238 1 (1987) 1704 - 1707; Traunecker, et al.. Nature 331 (1988) 84 - 86]; ja tämän jälkeen on kehitetty CD4-±mmunoglobu-liinifuusioproteiineja, joiden puoliintumisaika on aikai-5 sempaa pitempi ja joiden biologinen aktiivisuus on kohtuullista luokkaa [Capon, et al., Nature, 337 (1989) 525 -531; Traunecker, et al. Nature, 339 (1989) 68 - 70; Byrn, et al., Nature 334 (1990) 667 - 670; Zettlmeissl, et al., DNA Cell Biöl. 9 (1990) 347 - 353]. Vaikka CD4-immunotok-10 siinikonjugaatit tai fuusioproteiinit ovat voimakkaasti sytotoksisia infektoituneita soluja kohtaan in vitro -olosuhteissa [Chaudhary, et al., Nature 335 (1988) 369 - 372;

Till, et ai., Science, 242 (1988) 1166 - 1168], niin immuunikadon latenssiajan vuoksi on epätodennäköistä, että 15 mikään kertahoitoterapia eliminoisi tehokkaasti viruksia elimistöstä, ja vieraiden fuusioproteiinien antigeenisyys todennäköisesti rajoittaa niiden käyttöä annosten toistuvaan antamiseen perustuvissa hoitomuodoissa. SIV:llä in-fektoiduilla apinoilla tehdyissä kokeissa on osoitettu, 20 että liukoisella CB4:llä voidaan pienentää SIV-tiitteriä ja parantaa myeloidista potentiaalia kuvaavia suureita in vitro -olosuhteissa, jos tätä annetaan eläimille, joilla ei ole huomattavaa CD4-sytopeniaa [Watanabe, et al.,

Nature 337 (1989) 267 - 270]. Hoidon keskeyttämisen jäl-25 keen virusten määrä palasi kuitenkin nopeasti ennalleen, mikä viittaa siihen, että immuunijärjestelmän etenevän heikentymisen estämiseksi täytyisi valmisteen antamista jatkaa koko eliniän.

Solun pinnan reseptoreihin assosioituvat proteiini-30 tyrösiinikinaasit

Usein immuunijärjestelmän soluvälitteisten efekto-rimekariismien käynnistymiseen tarvittava alkusysäys saadaan solujen tunnistaessa yhteen keräytyneitä ligandeja. Aggregoitumlsen yhteydessä aktivoivia signaaleja välittä-35 viä reseptoreita ovat muiden muassa B-solu- ja T-soluanti- | 7 geenireseptorit [DeFranco, Eur. J. Biochem. 210 (1992) 381 - 388; Weiss, Annu. Rev. Genet 25 (1991) 487 - 510], jotkin IgG- ja IgE-Fc-reseptariryhmiin kuuluvat molekyylit, [Fanger, et al., Immunol. Today 10 (1989) 92 ~ 99; 5 Revetch ja Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457 - 492] ja monet apureseptorit, kuten T-soluissa esiintyvät CD2, CD4, CD8 ja CD28 [Yokoyama ja Shevach, Year Immunol. 4 (1989) 110 - 146], B-soluissa esiintyvät CD19, CD20, CD21 ja CD40 [Clark ja Ledbetter, Adv. Cancer Res. 52 (1989) 10 81 - 149] ja monosyyteissä esiintyvät CD44, CD45 ja CD58 [Webb, et ai., Science 249 (1990) 1295 - 1297]· Lisäksi suuri määrä fosfolipidehin kytkeytyneitä proteiineja edistää solujen aktivoitumista antigeenireseptoreista riippuvaisella tayalla silloin, kun ne ovat silloituneina T-so-15 lujan pinnalla [Balk ja Terhorst, Immunol. Ser. 45 (1989) 411 - 416; Kroczek, et ai.. Nature 322 (1986) 181 - 184; Yeh, et ai., J. Immunol. 138 (1987) 91 - 97; Yokoyama ja Shevach, Year Immunol. 4 (1989) 110 - 146].

Tällä hetkellä on epäselvää millä tavalla yksinker-20 täinen fysikaalinen tapahtuma, aggregaatlo, saa aikaan selvästi erottuvan fysiologisen signaalin. T-solu- ja B-soluantlgeenireseptorien sekä monien erilaisten Fc-re-septorin muotojen välittämien soluvälitteisten mekanismien käynnistymistä voidaan jäljitellä silloittamalla kimeeri-25 siä proteiineja, joissa on reseptorlkompleksien yksittäisten ketjujen intrasellulaarlsia domeeneja [Irving ja Weiss, Cell 64 (1991) 891 - 901; Kolanus, et ai., EMBO J. 11 (1992) 4861 - 4868; Letourneur ja Klausner, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88 (1991) 8905 - 8909; Letourneur ja 30 Klausner, Science 255 (1992) 79 - 82; Romeo ja Seed, Cell 64 (1991) 1037 - 1046; Wegener, et ai.. Cell 68 (1992) 83 - 95] . Vaikuttaa siltä, että pienimpään tehokkaaseen laukaisevaan elementtiin tarvitaan fylogeneettisesti säi-lynyt [Reth, Nature 338 (1989) 383 - 384] peptidisekvens-35 si, joka sisältää kaksi tyrosiinlryhmää, joiden välissä on 8 10 tai 11 ryhmää ja joka on hydrofiilisessä, tyypillisesti happamassa ympäristössä [Romeo, et ai,. Cell 68 (1992) 889 " 897; Irving, et ai,, J. Exp. Mecl, 177 {1993) 1093 -1103]. Tämän elementin sisältävien reseptorien kertyminen 5 yhteen käynnistää aktivoitumisreaktlaiden sarjan, jossa keskeisenä vaikuttaa olevan proteiinityrosiinikinaasin (PTKj aktiivisuus; PTK-inhibiittorit estävät sekä varhaisia tapahtumia B- ja T-solujen aktivaatiossa, kuten kalsiumin mobilisaatiota, sekä myöhempiä vaiheita, kuten sy-10 tokiinien vapautumista ja solujen jakaantumista [June, et ai,, J. Immunol. 144 (1990) 1591 - 1599; Lane, et ai., J.

Immunol. 146 (1991) 715 - 722; Mustelin, et ai., Science 247 (1990) 1584 - 1587? Stanley et ai», J. Immunol. 145 (1990) 2189 ~ 2198]. Vaikka reseptoriaktivaation etäiset 15 seurausilrniöt eroavat toisistaan solutyypin mukaan, niin varhaiset vaiheet ovat huomattavan samanlaisia erilaisista hematopoeettisista solulinjoista peräisin olevissa soluissa. Esimerkiksi niiden PTK-aktiivisuuden nopeiden kohoamisten, joiden on havaittu esiintyvän B-soluantigeenire-20 septorin [Gold, et ai.. Nature 345 (1990) 810 - 813; Campbell ja Sefton, EMBO J. 9 (1990) 2125 - 2131], T-soluanti-geeniresepiorin [June, C.H., et ai. Proc. Natl. Äoad. Sei.

USA 87 (1990) 7722 - 7726? June, C.H., et ai., J. Immunol.

144 (1990) 1591 - 1599] ja suuriaffiniteettisen igE-resep-25 torin [Eiseman ja Bolen, Nature 355 (1992) 78 - 80; Li, et ai., Mol. Cell. Biol. 12 (1992) 3176 - 3182) silloittu-misen jälkeen, yhteisenä varhaisen fosforylaation kohteena on fosfatidyyli-inositolxspesifisen fosfdlipaasi-C;n γ-isomuotö [Carter, et ai., Proc. Natl, Acad. Sei. USA 88 30 (1991) 2745 - 2749; Li, et ai., Mol. Cell Biol. 12 (1992) 3176 - 3182; Park, et ai., J. Biol. Chem. 266 (1991) 24237 - 24240; Park, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88 (1991) 5453 - 5456; Secrist, et ai., J. Biol. Chem. 266 (1991) 12135 - 12139; Weiss, et ai., Annu. Rev. Genet. 25 | j 9 (1991} 487 - 510], jota tyrosiinifosforylaatiQ aktivoi suoraan [Nishibe, et ai., Science 250 (1990) 1253 ~ 1256).

PTK-aktiivxsuudet, joiden tähän ajankohtaan Mennessä tiedetään assosioituvan solun pinnan reseptoreihin, 5 voidaan jakaa kahteen luokkaan: niihin, jotka kuuluvat

Src-proto-onkogeeneihin liittyviin kinaaseihin, ja niihin, jotka ovat sukua jokin aika sitten karakterisoidulle Syk-kinaasille. Ensiksi mainituista Fyh-kinaasin on osoitettu assöäoituvan T-solureseptoriin [Gassmann, et ai., Eur, J. 10 Immunol. 22 (1992) 283 - 286; Samelson, et ai., Proc.

Natl. Acad. Sei. OSA 87 (1990) 4358 ~ 4362], Lyn-, Fyn-, Blk- ja Lck-kinaasien on raportoitu assosioituvan B-solun-IgM-reseptoriin [Burkhardt, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88 (1991) 7410 - 7414; Campbell ja Sefton, Mol. Cell. 15 Biol. 12 (1992) 2315 - 2321; Yamanashi, et ai., Science 251 (1991) 192 - 194], ja Lyn- ja Yes-kinaasien on osoitettu assosoituvan suuriaffiniteettiseen IgE-reseptoriin [Eiseman ja Bolen, Nature 355 (1992) 78 - 80; Hutchcroft, et ai., Prop. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992) 9107 - 9111; 20 Hutchcroft, J.E., et ai., J. Biol. Chem. 267 (1992) 8613 -8619]. Tämän havaitun assosioitumisen mekanismia ei ole saatu yksityiskohtaisesti selville mutta alustavat koetulokset viittaavat siihen, että reseptorikompleksiketjUjen intrasellulaariset domeenit saattavat fyysisesti assosioi-25 tua Src-kinaaseihin [Clark, et ai.. Science 258 (1992) 123 - 126; Timson Gauen, et ai., Mol. Cell. Biol. 12 (1992) 5438 - 5446). Tällä hetkellä on epäselvää, ovatko nämä assosiaatiot suoria vai epäsuoria.

Tähän päivämäärään mennessä sitovimmat todisteet 30 Sre-kinaasien suuresta merkityksestä solujen aktivaatiossa ovat tulosta tutkimuksesta, jossa tutkittiin T-soluissa olevia Fyn- ja Lek-kinaaseja. Transgeenisissä hiirissä Fyn:in ilmentyminen ylimäärin saa muodostuvissa T-soluissa aikaan antigeeneille yliherkästi reagoivan fenotyypin, kun 35 taas katalyyttisesti inaktiivisen muodon ilmentyminen yli 10 määrin estää 'Γ-solureseptQri välitteistä proliferaatiota [Cooke et ai., Cell 65 (1991) 281 - 291], Fyn-kinaaslak-tiivisuuden suhteen vaillinaisista mutanttihiiristä eristetyt kateenkorvan T-solut eivät kyenneet juuri lainkaan 5 saamaan aikaan proliferatiivista vastetta käsittelylle, jossa käytettiin forboliesterin ja joko anti-CD3-vasta-aineen tai konkanavaliini A:n yhdistelmää [Appleby, et ai., Cell 70 (1992) 751 - 763; Stein, et ai., Cell 70 (1992) 741 - 750]. Näistä hiiristä eristettyjen pernan 10 T-solujen soluaktivaatiovaste oli heikentynyt jonkin verran edellistä vähemmän mutta kuitenkin merkittävästi [Appleby, et ai., Cell 70 (1992) 751 - 763; Stein, et ai., Cell 70 (1992) 741 - 750], T-soluissa Lck-kinaasi on assosioitunut epäsuorasti 15 TCR:ään CD4- ja CD8-apureseptorien välityksellä [Rudd, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85 (1988) 5190 - 5194; Shaw, et al>, Cell 59 (1989) 627 - 636; Turner, et ai., Cell 60 (1990) 755 - 765; Veillette, et ai., Cell 55 (1988) 301 - 308]. Lck:n ilmentyminen ylimäärin antigee-20 neille reagoivassa solulinjassa voimistaa reseptorien herkkyyttä samalla tavalla kuin mitä on havaittu Fyn:in kyseessä ollessa [Abraham ja Veillette, Mol. Cell. Biol. 10 (1990) 5197 - 5206; Davidson, et ai., J. Exp. Med. 175 (1992) 1483 - 1492; Luo ja Sefton, Mol. Cell. Biol. 12 25 (1992) 4724 - 4732]. CD4:stä riippuvaisessa muriini-T-so- luhybridoomamallissa antigeenispesifiset auttaj asolutoi-minnot saatiin palautumaan ainoastaan, käyttämällä CD4-mo-lekyylejä, jotka kykenivät vuorovaikutukseen Lokin kanssa [GlaiChenhaus, et ai., Cell 64 (1991) 511 - 520].

30 Vahvimmat todisteet Lck-kinaasin suorasta osalli suudesta antigeenireseptorivälitteisessä signaalinvälityk-sessä on kuitenkin saatu tutkittaessa mutanttisolulinjoja, joista puuttuu Lck. On tutkittu kahta tällaista solulin-jaa, joista toinen on peräisin Jurkatin humaanileukemia-T-35 solulinjasta [Goldsmith ja Weiss, Proc. Natl. Acad. Sei.

11 USA 84 (1987) 6879 - 6883; Straus ja Weiss, Cell 70 (1992) 585 - 593] ja toinen on peräisin hiiren sytotoksisesta T-solukloonista CTLL-2 [Karnitz, et ai., Mol. Cell. Biol.

12 (1992) 4521 - 4530]. Kumpikaan Lck-negatiivinen mutant-5 tisolulinja ei kykene välittämään signaalia TCR:n välityksellä ja kumman tahansa mutanttisolulinj an komplementointi transfektoimalla Lckrta ilmentävällä plasmidilla palauttaa vasteen TCR:ää silloittaville ärsykkeille {Karnitz, et ai., Mol. Cell. Biol. 12 (1992) 4521 - 4530; Straus ja 10 Weiss, Cell 70 ¢1992) 585 -593].

Jonkin aikaa sitten on osoitettu, että solun pinnan reseptoreihin assosioituu sellaiseen uuteen tyrosiiniki-nääsiryhmään kuuluvia molekyylej ä, jota edustavat toisiaan läheisesti muistuttavat tai identtiset kinaasit Syk [Tani-15 guchi, et ai., J. Biol. Chem, 266 (1991) 15790 - 15796] ja PTK 72 [Zioncheok, et ai., J, Biol. Chem. 261 (1986) 15637 - 15643; Zloncheck, et ai., J. Biol. Chem. 263 (1988) 19195 - 19202). Vaikkei lopullisesti ole pystytty todistamaan, että PTK 72 ja Syk olisivat identtisiä, niin 20 niiden jakaantuminen kudoksiin (kateenkorvaan ja pernaan) on samanlaista, niiden suhteellinen moolimassa on saman suuruinen ja ne ovat yhtä labiileja proteolyysille. PTK 72:n on osoitettu assosoituvan B-solun XgM-reseptoriin [Hutchcroft, et ai., Proc. Natl. Acad. Soi. USA 89 (1992) 25 9107 - 9111; Hutchcroft, J.E., et ai., J. Biol. Chem. 267 (1992) 8613 - 8619] ja sen on osoitettu fosforyloituvan, kun reseptori silloitetaan anti-igMillä [Hutchcroft, et ai., J. Biol. Chem. 266 (1991) 14846 - 14849]. Tähän liittyvän entsyymin aktivoitumisen, joka määritettiin eksogee-30 nisen proteiinifragmentin autofosforylaation sekä fosfory-laation avulla, osoitettiin tapahtuvan pinnalla olevan IgM:n siilaittamisert jälkeen [Hutchcroft, et ai., Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992) 9107 - 9111; Hutchcroft, j,E., et ai. , J. Biol. Chem. 267 (1992) 8613 - 8619] , 35 PTK 72: n on myös rotan basofiilileukemiasölulinjassa ha- | 12: vaittu assosioituvan suuriaffiniteettiseen IgE-reseptoriin [Hutchcroft, et $1,, Proc, Natl, Acad. Sei. USA 89 (1992) 9107 - 9111; Hutchcroft/ J.E., et ai,, J. Biol. Chem. 267 (1992) 8613 - 8619].

5 Toisen Syk-ryhmäh molekyylin, ZAP-70:n, on osoitet tu olevan PTK, joka assosioituu reseptorin silloittarnisen jälkeen T-solureseptorin zeeta-ketjuun [Chan, et ai.,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88 (1991) 9166 - 9170]. Vaikka ZAP-70:n, Fyn:in tai Lck:n ilmentyminen COS-soluissa lisää 10 jonkin verran solun tyrosiinifosfaatin kokonaismäärää, niin ZAP-70:n ja joko Lck:n tai Fynrin ilmentyminen samanaikaisesti lisää tyrosiinin nettofosforyläatiota silmiinpistävästi [Chan, et ai.. Cell 71 (1992) 649 - 662].

Jos soluissa on myös CD8~zeetaketjukimeeraa, niin kimeera 15 fosforyloituu ja ZAP-70 esiintyy siihen assosioituneena [Chan, et ai., Cell 71 (1992) 649 - 662]. Tällä hetkellä on epäselvää aktivoiko ZAP-70 Scr-ryhmän kinaaseja ja/vai päinvastoin, eikä myöskään ole selvää miksi kinaasien ilmentyminen samanaikaisesti COS-soluissa saa aikaan ilmi-20 selvästi konstitutiivisen aktivaation, ZAP-70:n aktiivinen assosiaatio silloitettuun TCRrään viittaa kaikesta huolimatta siihen, että tällä PTK:11a on osuutta reseptorivasteen lisääntymisessä,

Src-ryhmän kinaaseista poiketen Syk:ssa ja ZAP-25 7Ö:ssä on kaksi SH2-domeenia eikä lainkaan N-terminaalista myristyXaatiokohtaa [Taniguchi, et ai,, J. Biol. Chem. 266 (1991) 15790 - 15796; Chan, et ai., Cell 71 (1992) 649 -662]. On luonnollista. olettaa, että kinaasireseptorin assosiaation mekanismi on näiden kahden SH2-domeenin sitou-30 tuminen antigeenireseptorin laukaisevien ryhmittymien (motif) kahteen tyrosiiniin niiden fosforylaätion jälkeen.

Tällä hetkellä tämä on kuitenkin pelkkä hypoteesi.

Keksinnön yhteenveto Tässä keksinnössä on osoitettu, että on mahdollista 35 valmistaa kimeefoita, jotka muodostuvat proteiini-tyrosii- ! : 13 nikinaasimolekyylin intrasellulaarisesta domeenista ja ekstrasellula&risesta domeenis ta., joka kykeöea toimimaan. köhteetitumiistaiBist.eJitäVäsSä'-«. Syk- tai ZAP-7ö-kinaasisek-venssejä sisältävien kimeerojen kerääntyminen yhteen lau-5 kais.ee' erityisesti kalsiumin modi li säätiön. Pelkän Syk- kimeeran aggregaatit); tai Fyn- tai Lck- ja :ZÄP«70~kinaäsien aggregoi tuulinen keskenään on riittävä käynnistämään syto-lyyttisen efektorivaikutuksen, Tällainen efektorivaikutus; edistää haitallisten kohdesplujen, esimerkiksi patogeenien, 10 patogeenillä infektoituneiden solujen, tuumorisolujen tai autoimmuunisolujen, tunnistusta ja niiden tuhoamista.

On mahdollista konstruoida mikä tahansa määrä tämän keksinnön mukaisesti valmistettavia käyttökelpoisia kimee-risiä molekyylejä. Sellaisten kimeeroiden muodostaminen, 15 jotka sisältävät proteiini-tyrosiinikinaasin intraselluiaa-risen osan liitettynä sopivalla tavalla muokatun vasta-ainemolekyylin ekstrasellulaariseen osaan, mahdollistaa esimerkiksi sen, että immuun i j ä r j e st e Irnän solun mahdollisuudet tunnistaa kohteensa voidaan spesifisesti suunnata 20 uudelleen vasta-aineen ekstrasellulaarisen osan tunnistamaa antigeeniä vastaan. Käyttämällä sellaista vasta-aineen osaa, joka kykenee tunnistamaan patogeenin pinnnassa olevan jonkin determinantin, voivat tällä kimeeralla varustetut immuunijärjestelmän solut siis reagoisivat patogeeniä vas-25 taan kehityslinjansa mukaisella efektoriohjelma, esimerkiksi auttaja-T-lymfosyytit reagoisivat kohdetta vastaan sy-totoksisella aktiivisuudella ja B-lymfosyytit aktivoituisivat syntetoimaan vasta-ainetta. Mäkrofagit ja granulo-syytit toimisivat efektoriohjelmansa mukaisesti, kuten 30 vapauttamalla sytokiinejä, fagosytoimallä j a muodostamalla reaktiivista happea. Käyttämällä: vastaavalla tavalla tuumorisolujen tunnistukseen kykenevää vasta-aineen osaa saataisiin edullisesti voimistettua iimnuurri järjestelmän vastetta tuumoria vastaan. Elimistöä itseään västäan reagoi- 14 vat solut voitaisiin valikoida tuhottaviksi käyttämällä vasta-ainetta, joka kykenee tunnistamaan yksilön omia de-tetminanttej a vastaan epätarkoituksenmukaisesti reagoivat immuunisolut.

5 Vaikka näissä esimerkeissä on turvauduttu vasta- ainekimeeroiden käyttöön tarkoituksenmukaisena välineenä antigeenien esittämiseksi immuunijärjestelmälle, niin tämän keksinnön suojapiiri ei rajoitu kimeeristen vasta-aineiden käyttöön ja spesifisten ekstrasellulaaristen vasta-10 aineisiin kuulumattomien domeenien käytöllä saattaa itse asiassa olla merkittäviä etuja. Esimerkiksi jos käytetään viruksen, bakteerin tai loisen reseptorista peräsin olevaa ekstrasellulaarista osaa, niin tällaisilla kimeeroilla varustettujen solujen spesifisenä kohteena ovat näitä vi-15 rusten, bakteerien tai loisten determinantteja ilmentävät solut. Tällaisen lähestymistavan etuna vasta-aineiden käyttöön verrattuna on se, että patogeenin natiivi reseptori saattaa olla ainutlaatuisen voimakkaasti selektiivinen tai affiini patogeeniä kohtaan, minkä avulla tuioksek-20 si syntyvän immuunivasteen taso on mahdollista saada aikaisempaa tarkemmaksi. Yksilön oman antigeenin kanssa epätarkoituksenmukaisesti reagoivien immuunijärjestelmän solujen tuhoamiseksi saattaa vastaavasti riittää se, että antigeeni liitetään (joko ehjänä proteiinina B-soluja tu-25 haavan hoidon yhteydessä tai MHC-komplekseina T-soluja tuhoavan hoidon yhteydessä) intrasellulaarisiin proteiini-tyrosiinikinaasiketjuihin, ja tällä tavalla epätarkoituksenmukaisesti yksilön omia determinantteja vastaan reagoivat solut saadaan soluja tuhoavien toimenpiteiden kohteik-30 si.

Toinen kimeerojen käyttö on in vivo -olosuhteissa tapahtuva solupopulaatioiden säätely muun tyyppisten geneettisten muokkaustoimenpiteiden jälkeen. On esimerkiksi ehdotettu, että tuumoreihln infiltroituvia lymfosyytteja 35 tai luonnollisia tappajasoluja voitaisiin käyttää sytotok- 15 s is ten ainesosien kul jettainiseen t uuma r i k oh ti i n. Tämän keksinnön mukaisella menetelmäilä saadaan käyttöön sopiva keino tällaisten lymfosyyttien ja luonnollisten tappajasolujen lukumäärän ja aktiivisuuden säätelemiseksi tuomatta näitä 5 pois potilaan elimistöstä niiden monistamiseksi in vitro -olosuhteissa. Koska kimeeristen reseptorien intraseilulaa-riset dömeenit toimivat solujen proliferaatiivisia vasteita välittävinä komponentteina, niin ekstrasellulaarisille do-meeneille spesifiset aggregoitumista aikaansaavat ärsykkeet 10 (esimerkiksi ekstfaselluläarista domeenia vastaan suunnatut väsfca-aineet) aikaansaavat useiden erilaisten ekstrasellu-laaristen domeenien yhteistoimintaa, mikä johtaa kimeeroita sisältävien solujen lisääntymiseen.

Vaikka tämän keksinnön spesifisiin sovellatusmuo-15 töihin kuuluvat Syk- tai Syk- ja Src-pro tei ini-tyros i ini-kinaasiryhmien väliset kimeerat, niin tässä keksinnössä kuvattuihin: tarkoituksiin voidaan käyttää mitä tahansa tyro-siinikinaasia, jonka toiminta vastaa näiden molekyylien toimintaa. Haluttujen immuun is olojen toiminnan laukaisevien 20 molekyylien merkittäviä piirteitä ovat kyky ilmentyä au tonomisesti, kyky fuusioitua ekstrasellulaariseen domeeniin (Suoraan tai epäsuorasti transmembraanisen domeenin välityksen lä) siten, että tästä syntyvä kimeera esiintyy terapeuttisen solun pinnalla, ja kyky käynnistää solujen efek-25 toritoimintoja aggregaation vaikutuksesta, joka tapahtuu kyseisten solujen kohdattua kohde1igandinsa.

Sopivin menetelmä kimeeröjen viemiseksi immuunijärjestelmän soluihin on nykyään jonkinlainen geeniterapeut-tinen menetelmä. Immuimijärjestelmän solujen varustaminen 30 uudelleen kimeerisillä reseptoreilla siten, että solut yhdistetään sopivasti solubilisoituun puhdistettuun kimee-riseen proteiiniin, johtaa myös kuitenkin sellaisen muokatun solupopulaation syntymiseen, joka pystyy reagoimaan kimeeroiden ekstrasellulaarisen domeenin tunnistamia koh-35 teitä vastaan. Samanlaisia lähestymistapoja on käytetty esimerkiksi ehjän HIV-reseptorin, CD4:n, lisäämiseen eryt- 16 rosyytteihin terapeuttisessa tarkoituksessa. Tässä tapauksessa geeniteknisesti muokattu solupopulaatio ei pystyisi uudistumaan itsenäisesti.

Tämän keksinnön mukainen menetelmä liittyy funktio·· 5 naalisiin yksinkertaistettuihin pröteiini-tyiOsiinikinaasi-· kimeerbihin, jotka, kykenevät suuntaamaan uudelleen immuunijärjestelmän toimintaa. Tarkemmin sanottuna se liittyy lymfosyyttien, makrofagien, luonnollisten tappajasolujen tai granulosyyttien toiminnan säätelyyn ilmentämällä maini-10 tuissa soluissa kimeeroita, joiden vaikutuksesta solut reagoivat kimeeroiden tunnistamia kohteita vastaan. Tämä keksintö on käyttökelpoinen myös menetelmässä soluvälitteisen vasteen suuntaamiseksi uudelleen infektoiyaa agenssia, tuumori- tai syöpäsolua tai autoimmunologisesti muodostunutta 15 solua vastaan.: Menetelmä soluvälitteisen vasteen suuntaami seksi nisäkkäässä käsittää sen, että annetaan mainitulle nisäkkäälle tehokkaasti vaikuttava määrä terapeuttisia soluja, mainittujen solujen kyetessä tunnistamaan mainitun infektoivan agenssin, tuumorin, syöpäsolun tai autoiiranuno-20 logisesti syntyneen solun ja tuhoamaanne.

Toisessa sövellutusmuodossa menetelmä soluvälitteisen vasteen suuntaamiseksi infektoivaa agenssia vastaan käsittää sen, että annetaan mainitun agenssin tunnistamiseen ja tuhoamiseen kykeneviä terapeuttisia soluja, jossa mene-25 telmässä agenssi on jokin spesifinen virus, bakteeri, al kueläin tai sieni. Vielä tarkemmin sanottuna tämä menetelmä on suunnattu agensseja, kuten HIV:ta ja Pneumocystis aarini. i'ta, vastaan.

hiv-infektion hoitamiseksi potilaalle annetaan te-30 hokkäasti Vaikuttava määrä kimeeristä reseptoria ilmentäviä sytotoksisia T-lymfosyyttejä; lymfosyytit kykenevät tunnistamaan spesifisesti HlV:llä infektoituneet solut sekä verenkierrossa esiintyvän viruksen ja hajottamaan ne.

17

Yhdessä soyeilutusmuodossa saadaan siis tässä keksinnössä valmistettavien solujen avulla käyttöön menetelmä soluvälitteisen vasteen suuntaamiseksi HIV:llä infektoituneita soluja vastaan, joka menetelmä käsittää sen, että an-5 netaan potilaalle tehokkaasti vaikuttava määrä sytotoksisia T-lymfosyyttejä, jotka kykenevät tunnistamaan spesifisesti HIV:llä infektoituneet solut ja hajottamaan ne.

Vielä yhdestä sovellutvsmuodosta saadaan käyttöön sellaisia kimeerisiä reseptoripröteiineja, jotka ohjaavat 10 T-lymfosyyttejä toimimaan: siten, että ne tunnistavat HIV:llä infektoituneen solun ja hajottavat sen, vielä: yksi tämän keksinnön sovellutusmuoto käsittää kimeerisiä reseptoreja sisältävällä vektorilla transformoidut isäntä-solut.

Nämä ja muut: tätä keksintöä rajoittamattomat sovel-15 lutusmuodot ovat alan ammattikokemuksen perusteella ilmeisiä seuraavan tämän keksinnön yksityiskohtaisen kuvauksen perusteella.

Seuraavassa yksityiskohtaisessa kuvauksessa viitataan moniin erilaisiin menetelmiin, jotka ovat molekyyli-20 biologian ja immunologian alan ammattikokemuksen perusteella tunnettuja. Julkaisut ja muu. aineisto, joissa tällaisia tunnettuja menetelmiä on esitetty, on liitetty tähän patenttihakemus julkaisuun siihen oikeuttavien säädösten nojalla aivan kuten ne olisi esitetty siinä kokonaisuudes-25 saan.

Tavanomaisia lähdeteoksia, joissa on esitetty yh-distelmä-DNA-tekniikan yleisiä periaatteita, ovat Watson, J.D. at ai,, Molecular Biology of the Gene, osat I ja IT, kustantaja Benj amin/Cummings Publishing Company, Inc., 30 Menlo Park, CA (1987) ,* Darnell, J.E., et al., Molecular Cell Biology, kustantaja Scientific American Books, Inc., New York, N.Y. (1986); Lewin, B.M., Genes II, kustantaja John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1985) ; Old, R.W. , et al., Principles of Gene Manipulation: An Introduction to 35 Genetic Engineering, 2d edition, kustantaja University of 18

California Press, Berkeley, CA (1981); Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., kustantaja Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989); ja Ausubel, et al.. Current Protocols in Mol-5 ecular Biology, Wiley Press, New York, NY (1989).

Määritelmät "Kloonaus" tarkoittaa in vitro -olosuhteissa suoritettavien yhdistelmä-DNA-tekniikoiden käyttöä tietyn geenin tai jonkin muun DNA-sekvenssin liittämiseksi vektori-10 molekyyliin. Suotuisten tulosten saavuttamiseksi jonkin halutun geenin kloonaamisessa on tarpeen käyttää menetelmiä, joiden avulla saadaan muodostettua DNA-fragmentteja näiden fragmenttien liittämiseksi vektörimolekyyleihin, joiden avulla koostettu DNA-molekyyli saadaan vietyä isän-15 täsoluun, jossa se pystyy replikoitumaan, ja joiden avulla saadaan valikoitua vastaanottajina toimineista isäntäso-luista tutkittavan geenin sisältävä klooni.

"cDNA" tarkoittaa komplementaarista DNA:ta tai DNA:sta tehtyä kopiota, joka on muodostunut RNA-templaa-20 tista RNA:sta riippuvaisen DNA-polymeraasin (käänteisko-piointientsyymin) vaikutuksesta. "cDNA-klooni" tarkoittaa siis kloonausvektorin sisältämää kaksinauhaista DNA-sekvenssiä, joka on komplementaarinen kyseessä olevalle RNA-molekyylille, 25 "cDNA-kirjastö" tarkoittaa sellaisten DNA-molekyy-

Xien joukkoa, jotka sisältävät cDNA-liitossekvenssejä, jotka sisältävät cDNA-kirjaston valmistushetkellä solun ilmentämästä mRNAjstä tehtyjä DNA-kopioita. Tällainen CDNA-kirjasto voidaan valmistaa alan ammattikokemuksen 30 perusteella tunnetuilla menetelmillä ja niitä on kuvattu esimerkiksi teoksessa Maniatis, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, edellä. Yksityiskohtiin puuttumatta eristetään ensin RNA:ta sen organismin soluista, jonka genomista tietty geeni halutaan kloonata. Tämän keksinnön 35 yhteydessä nisäkkäiden, ja erityisesti ihmisen, lymfosyyt- 19 tisolulinjat ovat edullisia. Tällä hetkellä tähän tarkoitukseen käytettävä edullinen vektori on vaceiniaviruksen WR~kanta.

"Vektori" tarkoittaa DNA-molekyyliä, joka on peräi-5 sin esimerkiksi plasmidista, bakteriofagista tai nisäkkään tai hyönteisen viruksesta, ja johon DNA-fragmentit voidaan liittää tai kloonata. Vektori sisältää yhden tai usempia ainutlaatuisia restriktiokohtia ja se saattaa kyetä repli-koitumaan itsenäisesti määrätyssä isännässä tai vehikkeli-10 organismissa siten, että kloonattu sekvenssi kykenee lisääntymään. "DNA:n ilmentämisvektori" tarkoittaa siis mitä tahansa yhdistelmä-peptidin synteesin ohjaamiseen kykenevää itsenäisesti toimivaa elementtiä. Tällaisia DNA:n il-mentämisvektoreita ovat bakteerien plasmidit ja faagit 15 sekä nisäkkäiden ja hyönteisten plasmidit ja virukset.

"Olennaisesti puhdas" tarkoittaa yhdistettä, esimerkiksi proteiinia, polypeptidiä tai vasta-ainetta, joka ei sisällä olennaisesti lainkaan siihen luonnossa liittyneitä komponentteja. Yhdiste on yleensä olennaisesti puh-20 dasta, kun kyseessä olevaa yhdistettä on materiaalin kokonaismäärästä vähintään 60 %, edullisemmin vähintään 75 % ja edullisimmin vähintään 90 %. Puhtaus voidaan määrittää millä tahansa tarkoituksenmukaisella menetelmällä, esimerkiksi kolonnikrömatografiällä, polyakryyliamidigeelielekt-25 roforeesilla tai HPLC-analyysillä. Nukleiinihappojen kyseessä ollessa "olennaisesti puhdas" tarkoittaa nukleiini-happosekvenssia, segmenttiä tai fragmenttia, joka ei ole suoraan liittyneenä {toisin sanottuna ole kovalenttisesti sitoutuneena) kumpaankaan sellaiseen koodaavaan sekvens-30 siin, joihin se on liittyneenä (toisin sanottuna toiseen 5'-päässä olevaan sekvenssiin ja toiseen 3’-päässä olevaan sekvenssiin) sen organismin luonnossa esiintyvässä geno-missa, josta tämän keksinnön mukainen DNA on peräisin.

"Toiminnallinen johdannainen" tarkoittaa molekyylin 35 "fragmentteja", "variantteja", "analogeja" tai "kemialli- 20 siä johdannaisia”. Molekyylin "fragmentti", kuten mikä tahansa tämän keksinnön mukainen cDNA-sekvenssi, tarkoittaa tämän molekyylin mitä tahansa osanukleotidia. Tällaisen molekyylin "variantti" tarkoittaa luonnossa esiintyvää mole-5 kyyllä, joka on olennaisesti samanlainen kuin joko koko molekyyli tai sen fragmentti. Molekyylin "analogi" tarkoittaa luonnossa esiintymätöntä molekyyliä, joka on olennaisesti samanlainen kuin joko koko molekyyli tai sen fragmentti. Molekyyliä pidetään "olennaisesti samanlaisena" toisen mold lekyylin kanssa, jos kummankin molekyylin aminohapposekvenssit ovat olennaisesti samanlaiset. Olennaisesti samanlaisilla aminohappomölekyyleillä on samanlainen biologinen aktiivisuus. Kahta molekyyliä pidetään toistensa variantteina tässä keksinnössä käytetyssä merkityksessä vaikka 15 toisessa molekyylissä olisi enemmän tai vähemmän sellaisia aminohappQryhmiä, joita ei ole toisessa molekyylissä tai vaikka aminöhäpporyhmien sekvenssi ei olisi identtinen edellyttäen, että nämä kaksi molekyyliä ovat aktiivisuudeltaan samanlaiset. Tässä patenttihakemusjulkaisussa molekyy-20 liä pidetään toisen molekyylin "kemiallisena johdannaise na" , jos se sisältää muita kemiallisia ryhmiä, jotka tavallisesti eivät kuulu tähän molekyyliin. Tällaiset ryhmät saattavat parantaa molekyylin liukoisuutta, absorptiota, biologista puoliintumisaikaa ja niin edelleen. Nämä ryhmät 25 saattavat vaihtoehtoisesti heikentää molekyylin toksisuut ta, poistaa tai heikentää mitä tahansa molekyylin sivuvaikutusta ja niin edelleen. Tällaisia vaikutuksia välittäviä ryhmiä on kuvattu esimerkiksi teoksessa Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th et., Mack Publishing Co., Easton, 30 Penn. (1980).

Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä kimeerisen reseptorigeenin "funktionaalinen johdannainen" tarkoittaa vastaavasti geenin "fragmentteja", "variantteja" tai "analogeja", joiden nukleo t i dis ekvens s i voi olla "olennaisesti 35 samanlainen" ja jotka koodaavat molekyyliä, jonka aktiivi- 21 suus on samanlainen kuin kimeerisen proteiini-tyrosiini-kinaasin akt i ivisuus.

Tässä keksinnössä kimeerinen proteiini-tyrosiini-kinaasiproteiini tarkoittaa siis myös mitä tahansa funktio-5 naalista johdannaista, fragmenttia, varianttia, analogia tai kemiallista johdannaista, joka voi olla olennaisesti samanlainen kuin "villityypin" kimeera ja jonka aktiivisuus on. samanlainen -.(toisin sanottuna edullisimmin 90 %, edullisemmin 70 %, edullisesti 40 % tai vähintään 10 % villityy-10 pin kiineerisen reseptorin aktiivisuudesta) . Funktionaalisen kimeerisen reseptorijohdannaisen aktiivisuus tarkoittaa spesifistä sitoutumista (molekyylin: ekstrasellulaarisen

Osan välityksellä) kohteena olevaan, agenssiin tai soluun ja sen seurauksena tämän agenssin tai solun, tuhoutumista (mo-15 lekyylin intrasellulaarisen osan välityksellä); tällaista aktiivisuutta voidaan tutkia käyttäen esimerkiksi: mitä tahansa tässä keksinnössä kuvattua määritystä.

Tämän keksinnön mukaista kimeeraa tai sen funktionaalisia johdannaisia koodaava DNA-sekvenssi voidaan rekom-20 binoida vektorin DNA:hän tavanomaisina menetelmillä, joita j ovat tasoitettujen päiden tai ylijäävään osaan päättyvien Ϊ päiden käyttö ligaatioon, pilkkominen restriktioentsyymeil-lä tarkoituksenmnkalsten terminaalisten päiden muodostamiseksi, kohesiivisten päiden täyttäminen mikäli tätä on tar-25 peeh käyttää, käsittely alkalisella fosfataasilla molekyy lien haitallisen liittymisen estämiseksi sekä liittäminen tarkoituksenmukaisilla ligäaSeilla. Tällaisia manipulaatio-menetelmiä on kuvattu teoksessa Maniatis, T., et ai., edellä, ja ne ovat alan ammattikokemuksen perusteella tunnettu-3 0 ja.

Nuk1ei inihappomo1ekyy 1in, kuten DNA:n, sanotaan "kykenevän ilmentämään1' polypeptidiä, jos se sisältää transkriptiota ja translaatiota koskevaa säätelyinfor-maatiota sisältäviä nukleotldisekvenssejä ja jos nämä sek- 22 venssit on "liitetty toiminnallisesti" polypeptidiä kop-daaviin nukleotidisekvensseihin. Toiminnallinen liitos on liitos, jossa säätely-DNA-sekvenssit ja ilmennettäväksi tarkoitettu DNA-sekvenssi ovat liittyneet toisiinsa siten, 5 että geenin ilmentyminen on mahdollista. Geenin ilmentymiseen tarvittavien säätelyalueiden tarkka luonne vaihtelee organismista toiseen, mutta yleensä siinä tulisi olla promoottorialue, joka prokaryooteissa sisältää sekä promoottorin (joka ohjaa RNA: n transkription käynnistymistä) että 10 DNA-sekvenssit, jotka RNA:ksl transkriboituna käynnistävät proteiinisynteesin. Tavallisesti tällaiset alueet sisältävät sellaisia transkription ja translaation käynnistymiseen osallistuvia 5'-pään ei-koodaavia sekvenssejä, kuten TATA-alueen, pääteossa (cap) määrävän sekvenssin, CAAT-15 sekvenssin, ja muita näitä vastaavia sekvenssejä.

Proteiinia koödaavan geenisekvenssin 3'-pään puoleinen ei-koodaaVa alue voidaan haluttaessa saada aikaan edellä kuvatuilla menetelmillä. Tämä alue voidaan säilyttää sen sisältämien transkription lopetusta säätelevien 1 20 sekvenssien, kuten lopetus- ja polYaäenylaatiosekvenssien, takia. Transkription lopetussignaalit voidaan siis saada käyttöön jättämällä proteiinia koodaavaan DNA-sekvenssiin luonnossa liittyneenä oleva 3'-pään alue ennalleen. Silloin, kun transkription lopetussignaalit eivät toimi riit-25 tävän hyvin ilmentävässä isäntäsolussa, ne voidaan korvata isäntäsolussa toimivalla 3'-pään alueella.

Kahden DNA-sekvenssin (kuten promoottorialueen sekvenssin ja proteiini-tyrosiinikinaasikimeeraa koodaavan sekvenssin) sanotaan olevan toiminnallisesti liittyneenä, j 30 jos näiden kahden DNA-sekvenssin välinen liitos ei (1) saa j aikaan lukukehyksen siirtymistä aiheuttavaa mutaatiota, j (2) häiritse promoottorialueen sekvenssin kykyä ohjata | reseptorikimeeran geenisekvenssin transkriptiota eikä (3) 1 häiritse promoottorialueen sekvenssin aikaansaamaa resep- | 35 torikimeeran geenisekvenssin transkriptiota. Promoottori- | ί j 23 alue on liitetty toiminnallisesti DN&- sekvenssi in, jos promoottori kykenee saamaan aikaan kyseisen dna~s elevens s in transkription. Proteiinin ilmentämiseen tarvitaan siis sopivan isännän tunnistamat transkriptio- ja translaatiosig-5 naalit.

Tämän keksinnön mukainen menetelmä käsittää kimee-risen proteiini-tyrosiinikinaasiproteiinin (tai sen funktionaalisen johdannaisen) ilmentämisen joko prokaryootti-sissa tai eukaryoottisissa soluissa vaikka ilmentäminen eu- 10 karyottisissa soluissa (erityisesti ihmisen lymfosyyteissä) on edullista.

Tämän keksinnön mukaisia vasta-aineita voidaan valmistaa millä tahansa monista erilaisista, menetelmistä. Ki-meeristä reseptoripröteiinia tai sen funktionaalista joh-15 dannaista ilmentäviä soluja voidaan esimerkiksi antaa eläi melle, minkä tarkoituksena on saada aikaan sellaisten seerumien muodostuminen, jotka sisältävät polyklonaalisia vasta-aineita, jotka kykenevät sitoutumaan kimeeraan.

Edullisessa menetelmässä tämän keksinnön mukaiset 20 västa-aineet ovat monoklonaalisiä vasta-aineita. Tällaisia monoklonaalisia vasta-aineita voidaan valmistaa hybridooma-menetelmillä. [Kohler, et ai., Nature 256 {1975) 495; Kohler, et ai., Eur. J, Immunol. 6 (1976) 511; Kohler, et ai,,

Eur. J. Immunol, 6 (1976) 292; Hammerling, et ai., teok-25 sessa Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybrids, Elsevier, N.Y., (1981) 563 - 684] . Yksityiskohtiin puuttumatta täl laisissa menetelmissä jokin eläin immunisoidaan anti-geenikimeeralla. Tällaisten eläinten pernasolut poistetaan ja ne fuusioidaan sopivaan myeloomasolulinjaan. Tämän kek-3D sinnon mukaisesti voidaan käyttää mitä tahansa sopivaa mye loomasolul in jaa. Fuusioimisen jälkeen saatuja hybridoo-masöluja kasvatetaan selektiivisesti HAT-liuoksessa, minkä jälkeen ne kloonataan rajalaimennusmenetelmällä, jonka on kuvannut Wands, J.R., et ai. [Gastroent.erology 80 (1981) 35 225 - 232]. Tämän jälkeen tällaisen valikoinnin tuloksena \ aikaansaaduille hybridoomasoluille suoritetaan määritys i j 24 niiden kloonien tunnistamiseksi, jotka erittävät kimeeraan sitoutumaan kykeneviä vasta-aineita» Tämän keksinnön mukaiset vasta-aineet voivat ola myös polyklonaalisia tai edullisesti aluespesifisiä poly-5 kionaalisia vasta-aineita.

Tämän keksinnön mukaista kimeeraa vastaan suunnattuja vasta-aineita voidaan käyttää potilaassa kimeerisen reseptorin (tai kimeeristä reseptoria sisältävien solujen) määrän seuraamiseen. Tällaiset vasta-aineet soveltuvat 10 hyvin käytettäväksi tällä alalla tunnetuissa immunologisissa diagnostisissa määrityksissä, kuten immunometrisissä määrityksissä eli "kerros"-määrityksissä, kuten suorissa kerrosmäärityksissä, käänteisissä kerrosmäärityksissä ja simultaänikerrosmäärityksissä. Alan ammattikokemuksen pe-15 rusteella turhiin kokeiluihin turvautumatta näitä vasta- aineita voidaan käyttää millaisena yhdistelmänä tahansa sellaisten immunologiSten määritysten aikaansaamiseen, jotka ovat spesifisyydeltään, herrkkydeltään ja tarkkuudeltaan hyväksyttävää luokkaa- 20 Immunologian yleisiä peruskäsitteitä on esitetty alan yleisesti tunnetuissa lähdeteoksissa, kuten JRoitt, I., Essential immunology, Sixth Ed», kustantaja Blackwell Scientific Publications, Oxford (1988); Kimball, J. W., Introduction to Immunology, Second Ed., kustantaja 25 Macmillan Publishing Co., New York (1986); Roitt, I., et ai», Immunology, kustantaja Gower Medical Publishing Ltd.,

Lontoo (1985); Campbell, A., "Monoclonal Antibody Technology," teoksessa Burdon, H., et ai., toi-πι,, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 30 13, kustantaja Elsevier> Amsterdam (1984); Klein, J.,

Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, kustantaja John Wiley & Sons, New York (1982); ja Kennett, R., et al., toim,, Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension In Biological Analysis, kustantaja Plenum Press, 35 New York (1980).

§ j 25 "Havaitsemiseen" on tarkoitettu sisältyväksi jonkin aineen esiintymisen tai sen puuttumisen määrittäminen tai jonkin aineen määrän määrittäminen. Tällä termillä tarkoitetaan siis tämän keksinnön mukaisten materiaalien, koos-5 tumusten ja menetelmien käyttöä kvalitatiivisissa ja kvantitatiivisissa määrityksissä.

Sellaisia monoklonaalisia vasta-aineita erittäviä muita hybridoomia, jotka vastaavat spesifisyydeltään tässä keksinnössä kuvattuja vasta-aineita, voidaan eristää anti-10 idiotyyppiseulonnalla [Potocmjak, et ai.. Science 215 (1982 ) 16373 . Yksityiskohtiin puuttumatta anti-idiotyyppi-nen vasta-aine on sellainen vasta-aine, joka tunnistaa kyseessä olevan kloonin tuottaman vasta-aineen ainutlaatuisia determinantteja. Anti-idiotyyppinen vasta-aine val-15 niistetään immunisoimalla kyseessä olevalla monoklonaali-sella vasta-aineella eläin, joka kuuluu samaan kantaan kuin monokionaalisen vasta-aineen tuottamisessa käytetty eläin. Immunisoitu eläin tunnistaa immunisointiin käytetyn vasta-aineen idiotyyppiset determinantit ja se muodostaa 20 vasteen niitä vastaan tuottamalla näitä idiotyyppisiä vasta-aineita vastaan suunnattua vasta-ainetta (anti-idio-tyyppistä vasta-ainetta).

Replikaatiota varten hybridisoluja voidaan viljellä sekä in vitro että in vivo -olosuhteissa. In vivo -olosuh-25 teissä tapahtuvasta tuotannosta saadaan suuri saantomin kä ansiosta se on tällä hetkellä edullinen viljelymenetelmä. Yksityiskohtiin puuttumatta yksittäisistä hybridikan-noista peräisin olevia soluja injektoidaan intraperito-neaalisesti pristaanilla esikäsiteltyihin BALB/c-hiiriin, 30 minkä tarkoituksena on saada aikaan askitesnestettä, jossa haluttujen monoklonaalisten vasta-aineiden pitoisuus on suuri. Viljelmäsupernatäntista voidaan puhdistaa IcfM- ja IgG-isötyyppeihin kuuluvia monoklonaalisia vasta-aineita alan ammattikokemuksen perusteella tunnetuilla koXonnikro-35 matografisillä menetelmillä.

26 Tämän keksinnön mukaiset; vasta-aineet sopivat erityisen hyvin käytettäväksi immunologisissa määrityksissä, joissa niitä voidaan käyttää nestefaasissa tai kiinteän faasin kantaja-aineeseen sitoutuneena. Näissä immunologi-5 sissa määrityksissä käytettävät vasta-aineet voidaan lisäksi varustaa helposti havaittavalla leimalla.

Tällä alalla tunnetaan monia erilaisia merkkiaineita ja menetelmiä halutun aineen varustamiseksi leimalla.

Tässä keksinnössä käytettäviä merkkiainetyyppejä ovat esi-10 merkiksi, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, entsyymit, radioisotoopit, fluoresoivat yhdisteet, kemilurainoi-vat yhdisteet, bioluminoivat yhdisteet ja metällikelaatit.

Alan ammattikokemuksen perusteella tunnetaan muitakin sopivia merkkiaineita, joilla vasta-aineita voidaan varus-15 taa, tai sen perusteella on mahdollista jokapäiväisin kokein varmistaa merkkiaineiden sopivuus. Tällaiset merkkiaineet voidaan lisäksi liittää vasta-aineisiin tavanomaisilla alan ammattikokemuksen perusteella tunnetuilla menetelmillä, 20 Yksi sellainen tapa, jolla tämän keksinnön mukaiset västa^aineet voidaan varustaa helposti havaittavalla leimalla, on vasta-aineen kytkeminen johonkin entsyymiin. Kun entsyymiä käsitellään myöhemmin substraatillaan, niin tämä vuorostaan reagoi substraatin kanssa muodostaen kemiallis-· 25 ta yhdistettä, joka voidaan havaita esimerkiksi spektrofo-tometrisesti tai fluorometrisesti. Entsyymejä, joita voidaan käyttää vasta-aineiden varustamiseen helposti havaittavalla leimalla, ovat esimerkiksi raalaattidehydrqgenaasi, stafylokokista saatu nukleaasi, delta-V-steroidi-isomefaa-30 si, hiivan alkoholidehydrogenaasi, alfa-glyserolifosfaat-tidehydfogenaasi, trioosifosfaatti-isomeraasi, biotiini-avidiiniperoksidaasi, piparj uuriperoksidaasi, alkalinen fosfataasi, asparaginaasi, glukoosioksidaasi, (ä^galaktosi-daasi, ribonukleaasi, ureaasi, katalaasi, glukoosi-VI-fos- j 27 faattidehydrogenaasi, glukoamylaasi ja asetyylikolilnies-teraasi.

Helposti havaittavalla leimalla varustetut vasta-aineet voidaan havaita myös varustamalla vasta-aineet jol-5 lakin radioaktiivisella isotooppileimalla, jonka esiinty-minen voidaan sitten määrittää gammalaskij alla tai tuike-laskijalla. Tässä keksinnössä erityisen käyttökelpoisia isotooppeja ovat %, 1251, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 36C1, 57Co, 58Co, 59Fe ja 75Se.

10 Helposti havaittavalla leimalla varustettujen vas ta-aineiden sitoutuminen on mahdollista havaita myös varustamalla vasta-aineet jollakin fluoresoivalla yhdisteellä. KUn fluoresoivalla yhdisteellä varustettuun vasta-aineeseen kohdistetaan tietyn aallonpituista valoa, voidaan 15 sen esiintyminen havaita väriaineen fluoresenssin ansiosta. Tavallisimmin käytettyjä fluoresoivia merkkiaineita ovat fluoreskeiini, isotiosyanaatti, rodamiini, fykoeryt-riini, fykosyaniini, allofykosyaniini, o-ftaalialdehydi ja fluoreskamiini.

20 Tämän keksinnön mukaiset yasta-aineet voidaan va rustaa helposti havaittavalla leimalla käyttämällä fluoresenssi säteilyä lähettäviä metalleja, kuten 125Eu:ta tai muita lantanidiryhmän metalleja. Nämä metallit voidaan kiinnittää vasta—ainemolekyyliin käyttämällä kelatoivia 25 metalliryhmiä, kuten dietyleenitriamiinipentaetikkahappoa (DTPA) tai etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA).

Vasta-aineet voidaan varustaa helposti havaittavalla leimalla myös kytkemällä ne johonkin kemiluminesoivaan yhdisteeseen. Kemiluminesoivaan yhdisteeseen kytketty vas-30 ta-aine voidaan määrittää havaitsemalla kemiallisen reaktion aikana esiintyvä luminesenssi. Erityisen -käyttökelpoisia kemiluminesoivia merkkiyhdisteitä ovat luminaali, isoluminoli, teroma a11 i nen akridiniumesteri, imidatsoli, akridiniumsuolat, oksalaattiesteri ja diöksetaarii.

28

Bioluminesoivaa yhdistettä voidaan niinikään käyttää tämän keksinnön mukaisten vasta-aineiden varustamiseen leimalla. Bioluminesenssi on biologisissa systeemeissä esiintyvä kemiluminesenssin muoto, jossa katalyyttinen 5 proteiini lisää kemiluminesenssireaktion tehokkuutta. Bio-luminesoiva vasta-aine määritetään havaitsemalla lumine-senssin esiintyminen. Merkittäviä merkkiaineena käytettäviä bioluminesoivia yhdisteitä ovat lusiferiini, ekvorii-nilusiferaasi.

10 Tämän keksinnön mukaiset vasta-aineet ja olennai sesti puhdistettu antigeeni sopivat ihanteellisesti testi pakkauksen valmistukseen. Tällainen testipakkaus voi sisältää sillä tavoin osastoihin jaetun kuljetuskeinon, että yksi tai useampi säiliökeino, kuten pullo, koeputki tai 15 jokin näitä vastaava keino, joista mainituista säiliökei-nostä kukin sisältää käytettävän määrityksen erillisen elementin, asettuu toisiinsa nähden tiiviisti paikoilleen.

Testipakkausffluotoon yhdistettäviä määritystyyppejä on useita ja näitä ovat esimerkiksi kilpailevat ja ei-kil-20 päHevat määritykset. Tyypillisiä esimerkkejä määrityksis- f tä, joissa voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisia vasta- j aineita, ovat radioimmunologiset määritykset, entsyymi-immunologiset määritykset (EIA), ELISA-määritykset (enzyme-linked immunosorbent assay) ja immunometriset eli 25 immunologiset kerrösmääritykset.

"Immunometrinen määritys" tai " immunologinen ker-rpsmäärityS" tarkoittaa immunologisia simultaanikerrosmää-rityksiä, suoria kerrosmäärityksiä ja käänteisiä kerros-määrityksiä. Nämä termit ovat selviä alan ämmattikokemuk- 30 sen perusteella. Alan ammattikokemuksen perusteella on myös selvää, että tämän keksinnön mukaiset vasta-aineet ovat käyttökelpoisia myös muissa nykyään tunnettujen tai tulevaisuudessa mahdollisesti kehitettävien määritysten muunnelmissa ja muodoissa. Tällaiset määritykset kuuluvat 35 tämän keksinnön suojapiiriin.

; ; 29 Määritysten edullisessa suoritustavassa on tärkeää, että inkubaatioliuoksessa on mukana tiettyjä "reagoinnin estoaineita” (jotka tavallisesti lisätään yhdessä leimalla varustetun liukoisen vasta-aineen kanssa). Näitä "reagoin-5 nin estoaineita” lisätään sen varmistamiseksi, etteivät tutkittavassa näytteessä olevat epäspesifiset proteiinit, proteaasi tai ihmisen hiiren immunoglobuliineja vastaan suunnatut vasta-aineet silloitu kiinteän faasin pinnalla oleviin vasta-aineisiin tai radioaktiivisella leimalla 10 varustettuun indikaattorivasta-aineeseen tai tuhoa näitä, minkä seurauksena voisi syntyä vääriä positiivisia tai vääriä negatiivisia tuloksia. Kun "reagoinnin estoaineet” Valitaan oikealla tavalla, niin ne lisäävät merkittävästi tässä keksinnössä kuvattujen määritysten spesifisyyttä.

15 On havaittu, että "reagoinnin estoaineina" voidaan käyttää monia erilaisia ei-relevantteja (eli epäspesifisiä) vasta-aineita, jotka kuuluvat samaan luokkaan tai alaluokkaan (isotyyppiin) kuin määrityksissä käytetyt vasta-aineet (esimerkiksi igGj, IgG2a, igM ja niin edelleen). 20 "Reagoinnin estoaineiden" konsentraatiolla (joka on tavallisesti 1 - 100 pg/μΐ) on merkitystä, koska on tarkoituksena säilyttää asianmukainen herkkyys mutta silti samalla estää kaikki ihmisen seerumissa samanaikaisesti esiintyvien ristiinreagöivien proteiinien aikaansaamat haitalli-25 set häiriöt. Tällaisia "reagoinnin estoaineita" sisältävä puskurijärjestelmä täytyy myös optimoida. Puskureita ovat edullisesti heikkoihin happohin perustuvat puskurit, kuten imidatsoli, HEPPS, MOPS, TES, ADA, ACES, HEPES, PIPES, TRIS ja muut näitä vastaavat puskurit, joiden pH-arvo on 30 fysiologisella alueella. Jonkin verran vähemmän edullisia puskureita ovat epäorgaaniset puskurit, kuten fosfaatti, höraatti tai karbonaatti. Lopuksi voidaan mainita, että "reagoinnin estoaineita" sisältävään puskuriliuokseen tulisi lisätä tunnettuja proteaasi-inhibiittoreita (tavalli-35 sesti 0,01 - 10 pg/ml).

30

On olemassa monia kiinteän faasin immunoadsorbens— seja, joita on käytetty ja joita voidaan käyttää tässä keksinnössä. Tunnettuja immunoadsorbensseja ovat lasi, polystyreeni, polypropeeni, öekstraani, nailon sekä muut 5 materiaalit, putkina, helminä ja mikrotiitterilevyinä, jotka on tehty tällaisista materiaaleista tai päällystetty niillä, sekä muut näitä vastaavat materiaalit. Xmmobili-soidut vasta-aineet voidaan kiinnittää kiinteän faasin immunoadsorbens siin joko kovalenttisesti tai fysikaalisesti 10 sellaisilla menetelmillä, kuten amidi- tai esterisidoksen välityksellä tapahtuvalla kovalenttisella liittämisellä tai absorptiolla. Alan ammattikokemuksen perusteella tunnetaan monia muita sopivia kiinteän faasin inununoadsorbensseja sekä menetelmiä vasta-aineiden immobilisoimiseksi 15 niiden pinnalle tai sen perusteella tällaiset seikat on mahdollista varmistaa pelkillä jokapäiväisillä kokeilla.

In vivo, in vitro tai in situ -olosuhteissa tapahtuvaa diagnosointia varten tämän keksinnön mukaisiin vasta-aineisiin voidaan kiinnittää merkkiaineita, kuten ra~ 20 dionuklideja, joko suoraan tai funktionaalista välittävää 1 ryhmää käyttäen. Metallikationeina esiintyvien radioaktii- j visten isotooppien liittämisessä vastä^aineisiin on usein j käytetty välittävänä ryhmänä dietyieenitriamiinipentaetik- j kahappoa (ΟΎΡΑ), Tällä tavalla liitettäviä tyypillisiä 25 metallikationeja ovat esimerkiksi: "“Te, 123I, 111IN, l3lX, 97Ru, 67Cu, 67Ga ja 6?Ga. Tämän keksinnön mukaiset vasta-aineet voidaan diagnostisia tarkoituksia varten varustaa myös ei-radioaktiivisilla isotoopeilla. Tällaisessa käy- j töSSä erityisen käyttökelpoisia alkuaineita ovat 157Gd, j 3 0 55Mn, lfi2Dy, 52Gr ja 56Fe. |

Tämän keksinnön mukainen antigeeni voidaan eristää I

olennaisesti puhtaassa muodossa käyttämällä tämän keksin- j nön mukaisia vasta-aineita. Tämän keksinnön yhdestä sovel- j lutusmuodosta saadaan siis käyttöön olennaisesti puhdas j

35 proteilni-tyrosiinikinaasikimeera, ja mainitulle antigee- I

i | 31 nil le on luonteenomaista, että tämän keksinnön mukaiset vasta-aineet tunnistavat sen ja sitoutuvat siihen· Toisessa sovellutusmuodossa tästä keksinnöstä saadaan käyttöön menetelmä kimeerisen reseptoriantigeenin eristämiseksi ja 5 puhdistamiseksi siten, että muodostetaan kompleksi, jossa on mainittu antigeeni sekä yksi tai useampi reseptoriki-meeraa vastaan suunnattu vasta-aine.

Tämän keksinnön mukaisia olennaisesti puhtaita ki-meerisiä antigeenejä voidaan vuorostaan käyttää kimeeraa 10 vastaan suunnatun vasta-aineen havaitsemiseen tai määrittämiseen näytteestä, kuten seerumista tai virtsasta, yksi tämän keksinnön mukainen sovellutusmuoto käsittää siis menetelmän näytteessä olevan proteiini-tyrosiinikinaasian-tigeenin esiihtymisen tai sen määrän havaitsemiseksi, joka 15 menetelmä käsittää sen, että saatetaan kimeeristä antigeeniä vastaan suunnattua vasta-ainetta sisältävä näyte kosketukseen helposti havaittavalla leimalla varustetun re-septörikimeeran kanssa ja havaitaan mainittu merkkiaine.

On selvää, että voidaan käyttää myös kimeeran immunplogi-20 sesti reagoivia osia ja immunologisesti reagoivia analoge- j ja. Termi '"immunologisesti reagoiva osa" tarkoittaa mitä tahansa kimeerisen antigeenin osaa, joka saa aikaan yhtä voimakkaan immuunivasteen xeseptorikimeeraa vastaan suunnatun vasta-aineen kanssa. Termi "immunologisesti reagoiva 25 analogi" tarkoittaa proteiinia, joka poikkeaa kimeerisestä reseptoriproteiinista yhden tai useamman aminohapon verran, mutta joka saa aikaan yhtä voimakkaan immuunivasteen tämän keksinnön mukaisen vasta-aineen kanssa.

Sanonta "tunnistaa spesifisesti ja sitoutuu" tar-30 koittaa sitä, että vasta-aine tunnistaa kimeerisen resep- I

toripolypeptidin ja sitoutuu siihen mutta ei olennaisesti ]

tunnista muita näytteessä, esimerkiksi biologisessa näytteessä, olevia asiaankuulumattomia molekyylejä eikä sitou- I

du niihin. \

S

| 32 "Autoimmunologisesti muodostunut solu" tarkoittaa isännän kudoksien kanssa reagoivia vasta-aineita tuottavia soluja tai tämän omia kudoksia vastaan reagoivia immuuni-efektori-T-soluja; tällaisiin soluihin kuuluvat asetyyli-5 koliinireseptoreja vastaan suunnatut vasta-aineet (jotka aiheuttavat esimerkiksi myasthenia graviksen) tai anti-DNA-, anti-erytrosyYtti- tai anti-verihiutale-vasta-aineita (jotka aiheuttavat esimerkiksi lupus erythematosus -tautia.).* 10 "Terapeuttinen solu" tarkoittaa solua, joka on transformoitu tämän keksinnön mukaisella kimeerisellä molekyylillä siten, että se kykenee tunnistamaan spesifisen infektoiyan agenssin, spesifisen Infektoivan agenssin infektoiman solun, tuumori- tai syöpäsolun tai autoimmuno-15 logisesti muodostuneen solun ja tuhoamaan ne; tällaiset terapeuttiset solut ovat edullisesti hematopoeettisen järjestelmän soluja.

"Kohteena oleva infektoiva agenssi" tarkoittaa mitä tahansa infektoivaa agenssia (esimerkiksi virusta, baktee-20 ria, prototsoiittia tai sientä), jonka kimeerisen reseptorin sisältävä terapeuttinen solu pystyy tunnistamaan. "Kohdesolu" tarkoitaa mitä tahansa isännän solua, jonka kimeerisen reseptorin sisältävä terapeuttinen solu pystyy tunnistamaan; kohdesoluja ovat, mainittuihin rajoittumat-25 ta, viruksen, bakteerin, alkueläimen tai sienen infektoimat isäntäsolut sekä tuumori- tai syöpäsolut tai autoimmu-nologisesti muodostuneet solut.

"Ekstrasellulaarinen" tarkoittaa sitä, että ainakin osa molekyylistä ulottuu solun pinnan ulkopuolelle. "Xnt-30 rasellularinen" tarkoittaa sitä, että ainakin osa molekyylistä on terapeuttisen solun sytoplasmassa, "Transmembraa-ninen" tarkoittaa sitä, että ainakin osa molekyylistä on plasmamembraanin sisällä. Tässä keksinnössä "ekstrasellulaarinen osa", "intrasellularinen osa" ja "transmembraani-35 nen osa" voivat sisältää toistensa vieressä olevia amino- 33 happosekvenssejä, jotka ulottuvat toistensa vieressä sijaitseviin solun osiin.

Termi "aligomeroitua" tarkoittaa sitä, että proteiini muodostaa kompleksin toisten proteiinien kanssa, 5 mistä muodostuu dimeerejä, trimeerejä, tetrameerejä tai muita suuremman kertaluvun oligomeerejä. Tällaiset oligo-meerit voivat olla homo-oligomeerejä tai hetero-oligomee-rejä. "Oligomerisoituva osa" on molekyylin kompleksinmuo-dostusta (esimerkiksi oligomeerin muodostusta) ohjaava 10 osa.

"Sytolyyttinen" tarkoittaa kykyä tuhota solu (esimerkiksi patogeenin infektoima solu, tuumori- tai syöpäsolu tai autoiffimunöXogisesti muodostunut solu) tai kykyä tuhota infektoiva agenssi (esimerkiksi virus).

15 "Immuunikatovirus" tarkoittaa retrovirusta, joka villityyppisessä muodossaan pystyy infektoimaan kädellisen isännän T4-soluja ja jonka luonteenomaiset virusmorfoge-neettiset ja virusmorfologiset piirteet ovat tyypillisiä lentiviruksille. Termillä tarkoitetaan, mainittuihin ra-20 joittumafta, kaikkia HIV:n ja SIV:n variantteja, mukaan luettuna HIV-2, HlV-2, SIVmac, SlVägm, SIVmnd, SIVSmm, SIVraan, SIVmand ja SIVcpz.

"MHC:stä riippumaton" tarkoittaa sitä, että solun sytolyyttiseen vasteeseen ei tarvita kohdesolun pinnalla 25 esiintyvää luokan II MHC-antigeeniä.

"Funktionaalinen sytolyyttinen signaalia välittävä johdannainen" tarkoittaa (edellä määriteltyä) funktionaalista johdannaista, joka kykenee suuntaamaan vähintään 10 %:, edullisesti 40 %:, edullisemmin 70 %: tai edulli-30 simmin vähintään 90 %: villi tyypin molekyylin biologisesta aktiivisuudesta. Tässä keksinnössä "funktionaalinen sytolyyttinen signaalia välittävä johdannainen" voi toimia antamalla suoraan terapeuttiselle solulle reseptoriin sitoutuneen agenssin tai solun tuhoamissignaalin (kun ky-35 seessä on esimerkiksi intrasellulaarinen kimeerinen resep- 34 torin osa'), tai se voi toimia epäsuorasti edistämällä terapeuttisen solun oligomerisaatiota sytolyyttisten signaalia välittävien proteiinien kanssa (kun kyseessä on esimerkiksi transmembraaninen domeeni). Tällaisten johdannaisten tehok-5 kuutta voidaan tutkia käyttämällä esimerkiksi tässä keksinnössä kuvattuja in vitro -olosuhteissa tehtäviä määrityksiä .

"Funktionaalinen HIV:n vaippaan sitoutuva johdannainen" tarkoittaa (edellä määriteltyä) funktionaalista 10 johdannaista, joka: kykenee sitoutumaan mihin tahansa HIV:n vaippaproteiiniin. Funktionaaliset johdannaiset voidaan tunnistaa käyttämällä esimerkiksi tässä patenttihakemusjulkaisussa kuvattuja in vitro -olosuhteissa tehtäviä määrityksiä .

15 Terapeuttinen antaminen Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistet tuja transformoituja soluja voidaan käyttää monien sairauksien hoidossa. Tällaisten transformoitujen solujen tämänhetkisiä antamismenetelmiä ovat adoptiivinen immunoterapia 20 tai solunsiirtoterapia. Näiden menetelmien avulla transformoidut immuuni järj estelmän solut voidaan palauttaa verenkiertoon. Rosenberg, S.A., Scientific American, 62 (toukokuu 1990); Rosenberg, et ai., The New England Journal of Medicine, 323(9) (1990) 570.

25 Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistet tavia farmaseuttisia formulaatioita voidaan antaa mille tahansa eläimelle, jolle tämän keksinnön mukaisilla yhdisteillä voi olla hyödyllisiä vaikutuksia. Ensisijaisesti tällaiset eläimet ovat ihmisiä, vaikkei tämä keksintö ra-30 joitu pelkästään heihin.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Ensin on kuvattu piirrokset.

Piirustusten kuvaus

Kuvio IA on kaavio, jossa on esitetty tämän keksin-35 non mukaisten reseptori-kinaasi-fuusioproteiinien organisaatio. Kuviossa IB on esitetty Jurkat-soluissa yhdistel- 35 mä-vacciniavirusten avulla ilmennetyistä fuusioproteii-neista CDl6/7/zeta, CDl6/7/Lck, CD16/7/Fyn(T), CDl6/7/Syk ja CP16/7/ZÄP-70 saadut virtaussytometriset koetulokset.

Kuviossa le on esitetty immunologisesti seostetuille mole-5 kyyleille CD16/7/zeta (negatiivinen kontrolli), CD16/7/

Lok, CD16/7/Fyn(T), CD16/7/Syk ja CD16/7/ZAP-70 in vitro -olosuhteissa tehty kinaasin aktiivisuusmääritys; immuno-logisesti seostetun, kimeerisen Fyn-molekyylin kohdalla havaittua pienimoolimassaista molekyyliä ei ole torstai-10 seksi tunnistettu.

Kuviossa 2 on esitetty sytosolin kalsiumvaste, jonka on käynnistänyt kinaasikimeerojen silloittuminen TCR-nega t i i vi s is s a Jurkat •“soluissa. Kuviossa on esitetty positiivisen populaation suhteellinen intrasellulaarinen kal-15 siumkonsentraatio (joka on määritetty Indo-l:n violetin ja sinisen fluoresenssin suhteena). Erilaisia fuusioproteii-neja ilmentävillä yhdistelmä-vacciniaviruksilla infektoi-tuja Jurkat-soluja käsiteltiin hetkellä 0 anti-CD-I6 mAb 3G8:lla ja sen jälkeen fykoerytriiniin konjugoiduilla vuo-20 hessa tehdyillä hiiren IgG:tä vastaan suunnatuilla F( ab’ )2- -j vasta-aineilla. Positiivisina kontrolleina käytettiin TCR- j zeeta-ketjuun perustuvia kimeeroja ja negatiivisina kontrolleina FcRIIB2;een perustuvia kimeeroja.

Kuviossa 3 on esitetty ennenaikaisesti käynnistyvä 25 kalsiumvaste Syk-kinaasikimeeraa ilmentävissä TGR-positii-visissa soluissa. Infektio ja analyysi tehtiin edellä kuvion 2 yhteydessä kuvatulla tavalla. Violetin fluoresenssin suhde siniseen fluoresenssiin oli suuri huomattavassa osassa Syk-kimeeraa ilmentävistä soluista ennen primaari-30 sen vasta-aineen lisäämistä.

Kuvioissa 4A ja 4B on esitetty hybridoomasolujen tuhoutumista mittaava määritys.

Kuviossa 4A on esitetty kohteena olleista hybridoo-masoluista vapautuneen 51Cr-kromaatlh osuus efektorisolujen 35 (kinaasikimeeraa ilmentävien CTL-solujen) ja kohdesolujen 36 välisen suhteen funktiona; positiivisina kontrolleina käytettiin soluja, jotka ilmensivät TCR-zeetaketjun intrasel-lulaarisen osan sisältäviä reseptorikimeeroja ja negatiivisina kontrolleina käytettiin soluja, jotka ilmensivät 5 FcRIIB2:n intrasellulaarisen osan sisältäviä reseptoriki-meeroja. Kuviossa 4B on esitetty soluja tuhoavan vaikutuksen spesifisyys (sivullisten solujen tuhoutumisen puuttuminen). BW5147“SOluihin (joilta puuttuu solun pinnan anti-CD16-vasta-aine) lisättiin 51Cr~kromaattia ja ne käsiiel-10 tiin kinaasikimeeroja ilmentävillä CTL-solullla samoissa Olosuhteissa kuin rinnakkaista näytettä, joka sisälsi kro-mäattia sisäänsä ottaneita 3G8-soluja (nämä ilmensivät anti-CD16-vasta-ainetta). BW5147-soluista ei vapautunut ainakaan havaittavia määriä kromaattia.

15 Kuvioissa ÖA, 5B ja 5C on osoitettu, että ZAP-7Q:rt ja Fyn;in tai Lokin ilmentäminen samanaikaisesti mahdollistaa sytolyysin käynnistymisen ja lyhentää kalsiumvas-teen latenssiaikaa. CTL-soluja infektoitiin rinnakkain mainittuja kimeeroja ilmentävillä yhdistelmä-vacciniavi-20 ruksilla ja niistä määritettiin sytolyyttinen potentiaali ja kalsiumin mobilisaatio. Tämän määrityksen perusteella kimeerojen teho on todellista huonompi, koska kumpaakin kimeeraa ilmentävien solujen fraktiota ei määritetty erikseen (aktiivisuuden normalisointiin käytettiin solufrak-25 tiota, joka ilmensi ainakin toista kimeeraa). Kuviossa 5A on esitetty sytolyyttinen määritys, jossa käytettiin CD16/ 7/kinaasikimeeroja ilmentäviä CTL-soluja. Kuviossa 5B on esitetty CDl6/7/kinaasikimeeroja ilmentävien TCR-negatii-visten solujen kalsiumvaste. Kuviossa 5C on esitetty syto-30 lyyttinen määritys CTL-soluista, jotka ilmensivät yhtä aikaa CD4/CD7/Fyn-kimeeraa ja CDl6/CD7/ZAP-70~kimeeraa, Positiivisena kontrollina on käytetty CD16/7/zeeta-kimee-raa ja negatiivisena kontrollina CDl6/7/FcRIlB2-kimeeraa.

Kuvioissa 6A ja 6B on osoitettu, että kinaasissa | 35 olevia deleetioita tai pistemutaatiota sisältävät kimeerat 37 eivät saa aikaan kalsiumin mobilisaatiota eivätkä uudelleen suunnattua sytolyysiä. Konstruoitiin kinaasinegatiivisia fuusioproteiinivariantteja tekemällä deleetio {Sykin tapauksessa) tai pistemutaatio (ZAP-70;n tapauksessa) ja 5 kalsiumvasteen ja sytolyysin esiintyminen tutkittiin. Kuviossa 6A on esitetty TCR-negatiivisista soluista saatu kalsiumvaste. Kuviossa 6B on esitetty uudelleen suunnatun sytolyysin määritys.

Kuvioissa 7A, 7B ja 7G on osoitettu, että humaani-10 Sykihon perustuvat kimeerat ovat olennaisesti yhtä tehokkaita kuin sian Sykihon perustuvat kimeerat. Kuviossa 7A on esitetty humaani-Sykin sekvenssi sian Sykihon verrattu na; ensimmäiset 11 ja viimeiset 7 ryhmää määräytyvät alu-kesekvenssien mukaan. Kuviossa 7B on esitetty kalsiumin 15 mobilisaatiomääritys humaani-Syk-kimeeraa ilmentävistä TCR-negatiivisista soluista. Kuviossa 7C on esitetty uudelleen suunnatun sytolyysin määritys humaani-Syk-kimeeraa ilmentävistä CTL-soluista.

Kuviossa 8 on esitetty tyrosiinin fosforylaatio-20 tuotteiden jakaumassa tapahtuneet muutokset kimeeristen kinaasien silloittumisen jälkeen. Jurkat-soluja, joissa ei ollut T-soluantigeenireseptoria ja jotka ilmensivät mainittuja kimeeroja tai kimeeraparej a, käsiteltiin anti-CBlSilla ja vuohessa tehdyllä hiiren igGitä vastaan suun-25 natulla sekundaarisella vasta-aineella ja sen jälkeen hajotettiin, fraktioitiin polyakryyliamidigeelissä, siirrettiin: nitroselluloösalle ja käsiteltiin koettimella, jona käytettiin anti-fosfotyrosiinivasta-ainetta. Merkillä * +' merkityt kanavat edustavat silloitetuista soluista tehtyjä 30 uutteita kun taas merkillä ’ -" merkityt kanavat oli hajotettu suoraan käsittelemättä sekundaarisella vasta-aineella. Kontrollikanavat tehtiin käsittelemällä samalla tavalla TCR>-negatiivisia soluja, jotka ilmensivät CD16/7-fuu-sipproteiinia, jossa ei ollut intrasellulaarista domeenia.

35 Kuviossa oikealla on esitetty vertailun vuoksi anti-CD3- 1 | $ | 38 käsittelyn vaikutus TCR-positiivisiin Jurkat-soluihin (jotka joko oli infektoitu villityypin vacciniaviruksella tai joita ei ollut infektoitu), 10Q kD:n läheisyydessä havaitut selvästi erottuvat vyöhykkeet tämän paneelin va-5 seramanpuoleisessa osassa vastaavat kinaasikimeerojen odotettuja suhteellisia molekyylipainoja.

Kuviossa 9 on esitetty fosfolipaasi-Ö-yl:n tyrosii-nifosforylaatio kimeerojen aggregaation jälkeen. PLC-yl immimosaostettiin soluista, joille oli tehty vasta-ainei-10 den silloittaminen, ja immunosaostumat fraktioitiin geeleissä, siirrettiin nitroselluioosalle ja käsiteltiin koettimellä, jona käytettiin ahti-fosfotyrosiinivasta-ai-netta. Syk-kimeerojen aggregaation seurauksena havaittiin, että fosforyloituneen PLC-γΙ: n määrä lisääntyi merkittä-· 15 västi, kun taas Fyn- ja ZAP-70-kimeerojen samanaikaisesti tapahtuneen aggregaation seurauksena määrän lisääntyminen oli edellistä vähäisempää mutta silti helposti havaittavissa.

Kuvioissa 10A ja 1QB on esitetty in vitro -olosuh-20 teissä tehdyt kinaasimääritykset. Klmeerlsiä klnaaseja ilmentävissä soluissa olevat kimeeratsilloitettiin vasta-aineilla, minkä jälkeen kinaasit immunosaostettiin ja im-munosaostumista määritettiin endogeenisen substraatin fos-foryloituminen. Kuviossa 10A on verrattu immunosäostettu-25 jen kinaasikimeerojen aktiivisuutta kymmenen minuutin in-kubaation aikana käyttäen silloitetuista (+) tai silloit-tamattomista ( - ) soluista eristettyjä immunosaostettuja molekyylejä. Kuviossa 10B on esitetty ajan suhteen joko silloitetun (+) tai sillolttamattoman (-) kimeerisen Syk-30 kinaasin aikaansaama fosfaattimerkkiaineen liittyminen 1 endogeeniseen substraattiin.

Yhteen kerääntyneiden tyrosiinikinaasien aikaansaama T-soluaktivaatio |

Seuraavaksi on kuvattu tämän keksinnön tiettyjä j 35 sovellutusmuotpja. Tässä selityksessä on osoitettu, että | 39 reseptoreina toimimattomat kinaasit aktivoituvat yksinkertaisten yhteenkerääntymistapahtumien vaikutuksesta. Muodostettiin keinotekoisia reseptorikinaaseja, joiden int-raseliulaariset domeenit sisälsivät täydellisiä Src- tai 5 Syk-ryhmän sekvenssejä, ja tutkittiin minkälaisia seurauk sia Syntyy, kun aggregaatio tapahtuu ulkoisten silloittavien ärsykkeiden vaikutuksesta. Syk- ja Src-ryhmiin kuulu vien kinaasien toiminnassa havaittiin selviä eroja: viimeksi mainittujen silloittaminen ei aktivoinut solua merit) kittävässä määrin kun taas ensiksi mainittujen silloittu-minen sai aikaan vapaan intrasellulaarisen kalsiumionin syntymisen ja Syk:n tapauksessa sai aikaan sytolyyttisen potentiaalin. Se, ettei ZAP-70-kimeeroilla saatu aikaan distaalisten reseptorien välityksellä syntyvää vastetta, 15 pystyttiin voittamaan sillä, että ZAF-70-kimeerä saatettiin muodostamaan yhteenkertyrniä joko Fyn- tai Lck-kinaa-sikimeerojen kanssa. Seuraavaksi kuvatut esimerkit on tarkoitettu tätä keksintöä valaiseviksi eivätkä sitä rajoittaviksi .

20 Proteiini-tyrosiinikinaasikimeerojeri konstruointi ja niiden tehokkuuden osoittaminen

Solun pinnan reseptorikinaaseja muistuttavia proteiineja koodaavat fuusiogeenit konstruoitiin liittämällä CDlö-molekyylin eksträselluläarista domeenia koodaava DNA-25 fragmentti lyhyeen loitontajasekvenssiin, joka koodaa CD7:n jukstamemhraanisia ja transmembraanisia dömeeneja ja joka on vuorostaan liitetty humaani-Lck- [Koga, et ai.,

Eur. J. Immunol. 16 (1986) 1643 - 1646), hiiren Fyn (T)-[Cooke ja Perlmutter, New. Biol. 1 (1989) 66 - 74], sian 30 Syk- [Taniguchi, et ai., J. BioI, Chem. 266 (1991) 15790 -15796) ja humaani-ZAP-70- [Chan, et ai.. Cell 71 (1992) 649 - 662) tyrosiinikinaaseja (kuvio IA) koodaaviin täydellisiin sekvensseihin. Tästä saadut kolmen osapuolen muodostamat fuusiogeenit liitettiin yhdistelmä-vaccinia-35 viruksiin menetelmällä, jossa käytettiin homologista re- j $ \ •5 40 kombinaatiota ja valikointia E. colin gpt~geenituotteen samanaikaisen ilmentymisen suhteen. Kun soluja infektoituu näillä yhdistelmä-viruksilla, niin kaikki neljä ki-naasikimeeraa saatiin ilmentymään tehokkaasti solun pin-S nalla (kuvio IB). Kun saadut proteiinikimeerat immunosaos-tettiin käyttäen anti-CDlö-vasta-aineita, niin havaittiin molekyylejä, joiden molekyylipainot olivat odotusten mukaisia ja jotka olivat aktiivisia in vitro -olosuhteissa tehdyssä fosforylaatiomäärityksessä (kuvio 1C).

10 Seuraavaksi tutkittiin mahdollistaako fuusiopro- teiinien silloittaminen vapaan intrasellulaatisen kalsiumin kertymisen samalla tavoin kuin on havaittu tapahtuvan T-soluantigeenireseptorieh intrasellulaarisiin domeeneihin perustuvien fuusiopröteiinien yhteydessä. Tämän selvittä-15 miseksi monia erilaisia soluja infektoituu yhdistelmä-vacciniaviruksilla ja sytoplasman suhteellinen kalsiumpitoisuus määritettiin sen jälkeen kun ekstrasellulaariset domeenit oli silloitettu vasta-aineilla. Tehtiin sekä spektrofluorometrisiä (erottelemattomalle solupopulaatiol-20 le) ja virtaussytometrisiä (yksittäisille soluille) määrityksiä käyttäen Indo-1-väriainetta sisältäviä soluja [Grynkiewicz, et ai., J. Biol. Chem. 260 (1985) 3440 -3450; Rabinovxtch, et ai., J. Immunol. 137 (1986) 952 -961]. Sellaisista soluista saadulle koeaineistolle tehtiin 25 virtausytometrisiä määrityksiä, joiden pinnalla ilmentyvän CDl6;n määrä fykoerytriinin fluoresenssin voimakkuuden perusteella määritettynä osui tietylle ennalta määrätylle kapealle alueelle. Vaikka fluoresenssin keskimääräisessä intensiteetissä havaittiin pieniä vaihteluita (jotka joh-30 tulvat siitä, että solujen ilmentämien kimeerojen jakaantumisessa oli eroavuuksia) vielä tälläkin alueella, niin tällä lähestymistavalla oli mahdollista verrata toisiinsa sellaisten solujen vasteita, joissa oli suunnilleen yhtä suuri määrä reseptoreita. Kuviossa 2 on esitetty sellai-35 sista koetuloksista tehty analyysi, jotka on saatu käyttä- 41 mällä soluja, jotka ovat peräisin Jurkatin humaani-leuke-mia-T-solulinjan mutatoituneesta varianttisolulinj asta, josta puuttuu T-soluantigeenireseptori [Weiss ja Stobo, J. Exp. Med. 160 (1984) 1284 - 1299]. Lck- ja Fyn-kimeerat 5 eivät pystyneet näissä soluissa mobilisoimaan kalsiumia silloittamisen jälkeen. Useissa kokeissa Lck-fuusiopro-teilnih yhteenkertyminen pienensi jonkin verran kalsiumin lepokonsentraatiota verrattuna negatiiviseen kontrolliin, joka oli pieniaffiniteettisen IgG-reseptorin, FcRIIB2:n, 10 intrasellulaariseen domeeniin perustuva fuusioproteiini [Koianus, et ai., EMBQ J. 11 (1992) 4861 - 4868] . Sekä ZÄP~7Q:een että Sykrhon perustuvien fuusioproteiinien agg-regaatio edisti erittäin tehokkaasti vapaan sytoplasmisen kalsiumionin vapautumista, mikä tapahtui likimäärin yhtä 15 tehokkaasti kuin T-solureseptorin zeetaketjun intrasellu-laarisen domeenin sisältävän samanlaisen kimeeran aggre-goitumisen aikaansaama vapautuminen. Sekä ZAP-70- että Syk-kinaasikimeeran yhteydessä havaittiin pieni viive kal-siumvasteen käynnistymisessä verrattuna zeeta-kimeeralla 20 aikaansaatuun kalsiumin mobilisaation käynnistymishetkeen.

T-solureseptorin suhteen positiivisissa soluissa (kuvio 3) Syk-kimeeran aikaansaaman ionien virtauksen arviointia haittasi osittain vapaiden kalsiumionien suuri lepokon-sentraatio, mikä viittaa siihen, että kalsiumia säätelevä 25 mekanismi oli jatkuvasti päälle kytkeyneenä.

Tämän jälkeen kiraeeroja lisättiin sytolyyttisen T-solulinjan soluihin, mikä ansiosta tuli mahdolliseksi arvioida fuusioproteiinien kykyä saada aikaan efektori-funktiön käynnistyminen. Tässä määrityksessä kohdesoluina 30 käytettiin anti-CD16~hybridoomasoluj a, joiden pinnalla ilmentyy CDlörtta vastaan suunnattua JgG-vasta-ainetta [Fleit, et ai-, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79 (1982) 3275 - 3279; Shen, et ai., Mol. Immunol. 28 (1989) 959 -969]. Hybridoomasolut varustetaan merkkiaineella lisäämäl-35 lä niihin 51Cr-kromaattia ja ne sedimentoidaan yhdessä sei- 42 laisten efektorisolujen kanssa, jotka on valmistettu infektoimalla allospesifinen sytotoksinen humaani-T-lymfosyytti soluiinja (CTL) CD16/CD7/kinaasi-fuusioproteiinej a ilmentävillä yhdistelmä-vacciniaviruksilla. Kimeeristen 5 feseptorikinaasien ilmentäminen mahdollistaa sen, että infektoidut CTL-soiut pystyvät sitoutumaan köhdesoluihin ja siinä tapauksessa, että ne ovat kompetentteja, hajottamaan ne, ja jälkimmäinen tapahtuma määritetään soluihin lisätyn 51Gr-kromaatin vapautumisen perusteella. Soluja 10 tuhoamaan kykenevien CTL-solujen suhteellinen tehokkuus määritetään määrittämällä tiettyyn 51Cr;n vapautumistasoon tarvittava efektorisolujen ja kohdesolujen määrän välinen suhde. Kuviossa 4A on osoitettu, että Src-ryhmään kuuluvia Lck- tai Fyn (T) -kinaaseja tai Syk-ryhmään kuuluvaa ZAP-15 70~kinaasia sisältäviä kimeerisiä reseptoreja ilmentävät CTL-soiut eivät kykene toimimaan välittäjinä kohteena olevia anti-GDI5-soluja vastaan suunnatussa sytolyysissä. Syk-proteiinituotteeseen perustuvaa kinaasikimeeraa ilmentävät CTL-soiut olivat kuitenkin olennaisesti yhtä tehok-20 kaita kuin ne CTL-soiut, jotka ilmensivät kimeeraa, joka j koostui samalla tavalla T-solureseptörin zeetaketjun j intrasellulaariseen domeeniin fuusioidusta CD16:sta. j CPl6/GP7/kinaasikimeeroiden aikaansaamaa sytolyyttistä | aktiivisuutta ei voitu lukea sytotoksisten granuloiden | 25 epäspesifisen vapautumisen ansioksi, koska asiaankuulumattoman kromia sisäänsä ottaneen kohdesolun sedimentoiminen yhdessä fcinaasilla varustettujen CTL-solujen kanssa ei saanut aikaan leimauksessa käytetyn kromin vapautumista j havaittavissa määrin (kuvio 4B). f 30 Sykin ja ZAP-7Q:n aktiivisuuksien suuruusero syto- \ lyysimäärityksessö oli yllättävää, koska näiden kahden \ kimeerisen molekyylin aktiivisuus kalsiumvastemääritykses- j sä oli samaa luokkaa. Koska on osoitettu, että ei-kimee- ! $ ristien ZAP-70:n ja Scr-ryhmän kinaasien ilmentäminen yh- j 35 dessä sai aikaan aktivoitumisen GÖS-soluissa [Chan, et j | 43 al., Cell 71 (1992) 649 — 662], ryhdyttiin arvioimaan ki-naasikimeeraparien suhteellista kykyä saada aikaan syto-lyysiä. CTL-efektorisoluj a infektöitiin samanaikaisesti yhdistelmä-vacciniaviruksilla, jotka koodasivat ZAP-70- ja 5 Lck-kimeeroja, ZAP-70- ja Fyn (T) -kimeeroja tai Lck- ja

Fyn (T) -kimeeroja. Kuviossa 5Ä on osoitettu, että ZÄP-70-ja Pyn (T) -kimeerojen tai ZAP-70- ja Lck-kimeerojen ilmentäminen samanaikaisesti teki CTL-soluista olennaisesti yhtä aktiivisia kuin sellaiset CTL-solut, joissa ilmentyy 10 pelkästään CDl6/CD7/Syk-kinaasia, mikä aktiivisuus vuorostaan on yhtä voimakasta kuin CD16/CD7/zeeta-kimeeroj en aikaansaama aktiivisuus. Lck- ja Fyn (T) -kimeerojen ilmentäminen yhdessä ei mahdollistanut sytolyyttisen potentiaalin merkittävää uudelleensuuntautumista kohteena ole-15 via anti-CDl6~soiuja vastaan (kuvio 5A). Arvioitaessa samanaikaisesti kahdella kinaasifuusioproteiinilla infektoi-tujen solujen kalsiumin mobilisaatiopotentiaalia havaittiin, että ZAP-70:n ja Src-ryhmän kinaasikimeerojen samanaikainen ilmentäminen nopeutti kalsiumin vapautumista re-20 septorien silloittumisesta saatavana vasteena ja että Lck-ja Fyn (T) -kimeerojen samanaikainen ilmentäminen ei saanut aikaan vapaan intrasellulaarisen kalsiumin kertymistä merkittävässä määrin (kuvio 5B). Jotta saataisiin tutkittua tarkemmin kimeerisen Fyn:in osuutta samanaikaisen agg-25 regaation aikaansaamassa aktivaatiovasteessa muodostettiin Fyn-kimeera, joka sisälsi GD4:n ektrasellulaariset ja transmembraaniset domeenit fuusioituna Fyn:iin samalla tavalla kuin CDl6-kimeeroissa, Kuviossa 5C on osoitettu, että tämän kimeeran tehokkuus uudelleen suunnatussa syto-30 lyyttisessä määrityksessä on 10 - 20 kertaa pienempi kuin vastaavän CDl6-kimeeran tehokkuus, mikä viittaa siihen, että kiraeeristen kinaasien fyysinen assosioituminen on aktivoitumiselle tärkeää. Näitä kahta kimeeraa ilmentävien solujen sytolyyttinen aktiivisuus on kuitenkin huomatta- j 35 vasti voimakkaainpi kuin mitä havaitaan pelkästään ZAP-70- | | j 44 kimeeraa ilmentävien solujen yhteydessä. Koska tässä järjestelmässä kinaasia ilmentyy suhteellisen runsaasti, ei voida sulkea pois sitä mahdollisuutta, että jäljellä oleva aktiivisuus johtuu CD4/Fyn-kimeeran spontaanista satunnai-5 sesta assosiaatiosta CD16/ZAP-70:een.

Sen seikan toteen näyttämiseksi, että sekä kal-siumvaste- että sytolyysimäärityksissä havaitun aktivaation saivat aikaan asianomaiset kinaasit eikä näiden ki-naasien passiivinen assosiaatio sellaisiin olemassaoleviin 10 signaalia välittäviin elementteihin, joiden epäsuora agg-regoituminen käynnisti aktivaatlavasteen, muodostettiin sekä sian Syk-reseptörikimeerasta että ihmisen ZAP-70-re-septorikimeerasta kinaasinegatlivisia variantteja. Kuviossa 6 on osoitettu, että sellaisilla reseptorikimeeroilla, 15 joista joko puuttui kinaasidomeeni olennaisesti kokonaan (Syk*n tapauksessa) tai joissa oli fosfotransferaaslaktii-visuuden estävä pisterautaatio (ZAP-70:n tapauksessa), ei ollut in vitro -olosuhteissa lainkaan kinaasiaktiivisuutta eivätkä ne kyenneet toimimaan välittäjinä silloittumisesta 20 johtuvassa kalsiumin mobilisaatiossa eivätkä välittäjinä reseptorien uudelleen suuntaamassa sytolyysissä.

Koska oli mahdollista, että sian Syk saattaisi reagoida ihmissolun toimintamekanismien kanssa eri tavalla kuin humaani-Syk, konstruoitiin myös samanlaisia huntaani-25 Syk:hon perustuvia proteiinikimeeroja sen jälkeen kun hu~ maani-Syk-sekvenssit oli eristetty PCRillä käyttäen aluk-keita, jotka vastaavat sian proteilnisekvenssin amino- ja karboksyyliterminaalisia päitä. Kuviossa 7A on osoitettu, että sian ja ihmisen Syk-mölekyylit muistuttavat silmiin 30 pistävästi toisiaan, mihin viittäavat tulokset, jotka saatiin analysoimalla PCR-tuotteita, jotka vastasivat kinaa-sin domeenin ja toisen SH2-domeenin tiettyjä osia [Chan, et ai. , Cell 71 (1992) 649 - 662]. Edellisen havainnon kanssa yhdenmukaista on sd, että sekä kalsiumin vapautu-35 mismäärityksessä että sytolyysimäärityksessä ihmisen ki- j | 45 meeriset Syk-reseptoriproteiinit käyttäytyivät olennaisesti samalla tavalla kuin siasta peräisin olevat konstruktiot (kuviot 7B ja 7C),

Sen seikan toteen näyttämiseksi muuttaako kimeeris-5 ten tyrosiinikinaasien aggregaatio merkittävästi fosfoty-rosiiniproteiinien määrää, T-solureseptorinegatiivisia soluja infektoltiin kimeerisiä kinaaseja koodaavilla yhdistelmä-vaccinlavi ruksi 11a . Näiden kimeerojen ekstrasel-lulaariset dömeenit silloitettiin vasta-aineisiin ja akti-10 voituneiden solujen kokosolulysaatit fraktioitiin elektroforeesilla, siirrettiin membraaneiile ja analysoitiin fos-fotyrosiinin tunnistavalla vasta-aineella, lysaatit valmistettiin hajottamalla solut ionittomissa detergenteissä vanadaatin läsnäollessa EDTA;n kanssa tai ilman sitä, tai 15 hajottamalla solut natriumdodekyylisulfsStin läsnä ollessa ja sen jälkeen käsittelemällä ultraäänellä leifckausvoimien kohdistamiseksi vapautuneeseen DNA:hän. Fosfotyrosiinipro-teiinien koostumus oli kussakin tapauksessa erilainen ja lysaateissa, jotka oli valmistettu vanadaatin kanssa mutta 20 ilman EDTA:ta, havaittiin lisäksi molekyylejä, joita ei esiintynyt pelkällä SDS:llä valmistetuissa lysaateissa, mikä viittaa siihen, että EDTA saattaa inhiboida tyrosiinikinaasien sekä fosfataasien toimintaa solujen hajotuksen järkeen. Havaittiin, että solujen suoralla hajottamisella 25 SDS:llä saatiin proteiinien tyrosiinin fosforylaatio tapahtumaan helpommin toistettavasti kuin hajottamalla solut ionittoinissa detergenteissä EDTA: n ja vanadaatin läsnä ollessa. Kuviossa 8 on osoitettu, että Syk:ta, ZAP~7Q:ää tai Fyn:iä ja ZAP-70:ää sisältävien kimeerojen aggregaation 30 seurauksena ilmaantuu useita proteiineja, jotka liikkuvat yhdessä sellaisten proteiinien kanssa, joiden fosforylaatio lisääntyy antigeenireseptorien silloittumisen seurauksena, tai näiden proteiinien fosforylaatiö lisääntyy. Varsinkin Syk-kimeeran yhteenkertyrnisen aiheuttamat vyöhyk-35 keet muistuttavat suuresti T-solureseptorin suhteen posi- 46 tiivissa soluissa olevalla anti-CD3-vasta-aineella aikaan-saatuja vyöhykkeitä (kuvio 8). Näiden vyöhykkeiden, joukossa on Syk-kimeeran aggregaation aikaansaama sekä myös Fyn-ja ZAP-70-kimeerojen samanaikaisen aggregoation aikaansaa-5 ma noin 150 kD:n proteiini. Alustavissa tutkimuksissa havaittiin, että tämä proteiini liikkuu yhdessä iosfolipaa-si-C-γ:n kanssa (koetuloksia ei ole esitetty).

Sen seikan toteen näyttämiseksi mitä suoria vaikutuksia kinaasikimeerojen yhteen keräytymisellä on PLC-10 γ:aan, silloitettiin kimeeroja, seostettiin PLC-γ monoklo-naallsten vasta-aineiden seoksella ja tästä saaduista im-munosaostumista määritettiin fosfotyrosyyliproteiinit. Kuviossa 9 on osoitettu, että Syk:n yhteen keräytyminen lisää merkittävästi PLC-γ :n tyrosiinlfosfaattipitoisuutta, 15 kun taas Fyn- ja ZÄP-70-kimeerojen samanaikainen silloittaminen johtaa vähemmän silmiinpistävään, mutta helposti havaittavaan tyrosiinifosfaatin määrän lisääntymiseen. Pelkkää Fyn-klmeeraa ilmentävissä soluissa PLC-γ:n fosfo-rylaatio oli kohtuullisella perustasolla eikä sen määrä 20 kohonnut reseptorien aggregoitumisen seurauksena (kuvio 9). Nykyään ei tiedetä fosforyloivatko Syk, Fyn tai ZAP-7Q ja Fyn samoja tyrosiiniryhmiä. Koska Fyn-kimeeraa ilmentävissä soluissa ei havaittu kalsiumin mobilisaatiota lepotilassa eikä sen indusoitumista, saattaa näissä soluissa 25 havaittu fqsfotyrosilnisignaali edustaa muiden PLC-γ:ssa olevien fosfolipaasin aktivaatioon osallistumattomien kohtien toimintaa.

Fosfotyrosiinia koskevissa tuloksissa esiintyvien muutosten syiden selvittämiseksi tehdyssä alustavassa ka-30 keessa arvioitiin in vitro -olosuhteissa tehdyllä autofos-forylaatlomäärityksellä useiden erilaisten kinaasien aktiivisuutta yhteen keräytymisen jälkeen. Kimeeroja aggre-goitiin, immunosaostettiin ja niistä määritettiin, kuinka ne kykenivät liittämään fosfaattimerkkiainetta immunosaos-35 tumassa olevaan proteiiniin. Kuviossa 10A on osoitettu, 47 että näissä olosuhteissa kinaasin aktitvisuuden ei havaittu lisääntyvän silloittamisen jälkeen kinaasimäärityksen kestettyä kynunenen minuutin ajan. Vaikka tässä määrityksessä leimalla varustetun fosfaatin liittyminen proteii-5 niin kasvaa yhtäjaksoisesti jopa 30 minuutin ajan, niin on epäselvää, mitkä tekijät rajoittavat aktiivisuutta; hallitsevana tekijänä havaitussa kinetiikassa saattaa olla varsinkin immuunikomplekslen dissosiaationopeus, mikä mahdollistaa kinaasin di f f usoi tunti sen hyväksikäyttämättömään 10 substraattiin. Toimenpiteissä, joihin ryhdyttiin tämän ilmiön poistamiseksi sekä määrityksen herkkyyden maksimoimiseksi, arvioitiin myös joko etukäteen silloitetun tai Silloittamattoman Syk-kinaasin aktiivisuus erittäin lyhyellä 5 - 30 sekunnin aikavälillä; tässäkään tapauksessa 15 kinaasin aktiivisuus ei kuitenkaan lisääntynyt merkittävästi (kuvio 10B). Vaikkei tällä hetkellä voida sulkea pois sitä mahdollisuutta, että aktiivisuuden lisääntyminen voitaisiin osoittaa sopivalla substraatilla, niin Syk-ki-meeran aktiivisuuden ei myöskään havaittu kohoavan aggre-20 goitumisen seurauksena, kun kinaasiaktiivisuuden määrittämiseen käytettiin eksogeenistä peptidisubtraattia (jossa edo 2 m ryhmät 6 - 20 on substituoitu Y 19 Kiila).

Mahdolliset mekanismit

Toistaiseksi ei tiedetä sitä, millaisella mekanis-25 millä yksinkertainen fysikaalinen ärsyke, reseptorien agg-regaatio, saa aikaan selvästi erottuvan kemiallisen signaalin siirtymisen immuuni järjestelmän soluihin. Aikaisemmissa tutkimuksissa on saatu selville, että immuunijärjestelmän moniin merkittäviin aggregoitumalla aktivoituviin 30 reseptoreihin on liittyneenä Src-ryhmän kinaaseja ja että tällaisten reseptorien silloittuminen usein lisää kinaasi--aktiivisuutta. Aivan viime aikoina on havaittu, että toisiaan muistuttavat Syk- ja ZAP-70-kinaasit ovat assosioituneena joko pysyvästi (Sykin tapauksessa) tai lyhytaikai-35 sesti (ZAP-70:n tapauksessa), samassa järjestyksessä mai- 48 nittuna, B- ja T^solujen antigeenireseptoreihin ja ainakin Sykin tapauksessa reseptorien silloittumisen on raportoitu lisäävän kinaasiaktiivisuutta.

Tässä keksinnössä on osoitettu, että Syk-ryhmän 5 kinaasit saavat aikaan kalsiumvasteen soluissa, joista puuttuu T-solureseptori, mikä ei pidä paikkaansa Src-ryh-män kinaasien, lokin tai Fymin, kyseessä ollessa. Vaikuttaa siltä, että vaste ei johdu epäsuorasta assosiaatiosta muihin T-solureseptorin tai signaalin transduktion kompo-10 nentteihin, koska kinaasinegatiiviset mutatoidut molekyylit eivät saa aikaan kalsiumvastetta. Spesifisen sytolyy-sin käynnistymiseen riittää Syk-kinaasin sisältävien ki~ meerojen aggregoituminen, kun taas samanlaiseen sytolyysin käynnistymiseen kimeerisen ZAP-70-molekyylin vaikutuksesta 15 tarvitaan myös Src-ryhmän kinaasin mukanaoloa. Tällä hetkellä on epäselvää, millä Syk-ryhmän kinaasilla on todennäköisesti muita merkittävämpi osuus T-solujen aktivoitumisessa: sekä ZAP-70 että Syk ilmentyvät T-söluissa, tässä tutkimuksessa käytetyt solulinjät mukaan luettuna, ja spe-20 sifisten PCR-amplifikaatiatuotteiden perusteella ainakin §; yhdessä reagoivassa humaani^T-solulinjassa on Sykitä mutta ei ZAP-70:ää. Kimeerisen Syk-mölekyylin yhteen kertymisen seurauksena syntyvä proteiinityrosiinifosforylaation lisääntyminen muistuttaa suuresti T-soluantigeenireseptorin 25 silloittumisen jälkeen havaittavaa lisääntymistä.

Yhdessä yksinkertaisessa mallissa, joka koskee reseptorina toimimattomien tyrosiinikinaasien aikaansaamaa immuunijärjestelmän solujen aktivoitumista, on käytetty hyväksi reseptoriin assosioituvaä kinaasia, jonka aggre-30 goituminen saa aikaan aktivoitumisen joko fysikaalisen assosiaation (esimerkiksi aktiivisten diffieeristen kinaasien muodostumisen) välityksellä tai vastavuoroisen entsy-maattisen toiminnan (esimerkiksi ristiinfosforyloitumisen) välityksellä; tämän jälkeen aktivoituneen entsyymin vaiku- j 35 tus kohdistuu avainasemassa oleviin intrasellulaarisiin | j j 49 substraatteihln, joita tarvitaan kalsiumin mobilisaatioon ja inositolifosfaatin synteesiin. Tällaista tapahtumaketjua tukevia todisteita on esitetty tutkimuksissa, joissa on raportoitu, että kinaasien aktiviisuus kohoaa resepto-5 reihin liittyneiden reseptorien silloittumisen seurauksena [esimerkiksi Bolen, et ai., Adv. Cancer Res. 57 (1991) 103 ~ 149; Burkhardt, et ai., Proc, Natl. Acad. Sei. USA 88 (1991) 74X0 - 7414; Eiseman ja Bolen, Nature 355 ¢1992) 78 - 80; Hutchcroft, et ai., Proc. Natl, Acad. Sei, USA 89 10 (1992) 9107 - 91111/3. Biol, Chern. 257 8613 - 8619; Tsy- gankov, et ai., J. Biol. Chem, 267 (1992) 18259 - 18262;

Wong, et ai., Oncogene 7 (1992) 2407 - 2415j. Kxnaasiak-tlivlsuuden raportoidut muutokset ovat kuitenkin olleet useimmassa tapauksissa vaatimattomia ja ristiriidassa nii-15 den silmiinpistävien muutosten kanssa, joita fosfotyrösyy-iiproteiinikoostumuksessa havaitaan in vivo -olosuhteissa.

Koska in vitro -olosuhteissa tehtävillä kinaasimäärityk-sillä heikkojen allosteeristen vuorovaikutusten aikaansaamaa aktivoitumista ei voida yksiselitteisesti sulkea pois, 20 on tällä hetkellä mahdotonta sanoa lopullisesti, kuinka i suuri suhteellinen merkitys kinaasiaktivaatiolla on signaalin transduktion käynnistymisessä. Tässä keksinnössä esitetyt koetulokset viittavat kuitenkin siihen, että agg-regaation indusoima entsyymin ja substraatin uudelleen 25 partitiotuminen saattaa olla merkittävä tekijä olemassa olevan aktiivisuuden suuntaamisessa asiaankuuluvaa fysiologista kohdetta vastaan,

Syk-ryhmän kinaaseihin perustuvien kimeerojen agg-regoituminen sai aikaan kalsiumvasteen, joka viivästyi 30 jonkin verran mutta jonka amplitudi oli samanlainen kuin vasteella, joka saatiin zeeta-reseptorikimeerojen aggre-gaation seurauksena soluissa, joista puuttui endogeeninen T-soluröseptpri. ZAP-70-kimeeran silloittumisen seurauksena vapaan kalsiumionin ilmaantumisessa havaittiin edellis-35 tä pidempi viive, joka saatiin olennaisesti täysin pois- 50 tettua, kun ZAP-70-kimeera silloitettiin yhdessä Fyn-ki-meeran kanssa. Tällä hetkellä tälle latenssiaj alle ei ole selvää selitystä. Koska kahden molekyylin samanaikainen silloittuminen kiihdytti kalsiumin vapautumista, on hou-5 kuttelevaa ajatella, että viive johtuisi ZAP-70:n suhteellisesta tehottomuudesta aggregaation välityksellä tapahtuvassa autoaktivaatiossa. Muilla tekijöillä saattaa silti olla yhtä paljon merkitystä ja ZAP— ja Syk-kinaasien liittyminen toisiinsa solun pinnalla saattaa itse asiassa hi-10 dastaa aktivaatiota tapahtumien normaaliin kulkuun verrattuna; esimerkiksi jos tapahtumien normaalissa kulussa Syk-ryhmän kinaasit liittyvät lyhytaikaisesti yhteen kertyneiksi reseptoreiksi, aktivoituvat ja sitten vapautuvat diffusoituakseen substraatteihinsa, niin kinaasidomeenin 15 kytkeminen pysyvästi plasmamembraaniin saattaa rajoittaa tapahtumia siten, että molekyyli ei pääse kiinnittymään substraattiinsa ja/tai siten, että se rajoittaa signaalin vahvistumista, mikä johtuu siitä, etteivät kimeeriset reseptorit kykene toimimaan eräänlaisena kinaasien aktivoi-20 tumiseen tarvittavana katalyyttisenä keskuksena, s

Toinen kai s iumvas teessä havaittu omalaatuinen piirre oli havainto, että ihmisen tai sian Syk:hon perustuvia kimeeroja ilmentävissä T-solureseptorin suhteen positiivisissa soluissa vapaan kalsiumionin peruskonsentraatio oli 25 suuri, mikä viittaa siihen, että kalsiumin vapautuminen oli lähtenyt käyntiin spontaanisti. Reseptorin suhteen negatiivisissa soluissa ei havaittu vastaavaa ilmiötä.

Tämä tulos on päinvastainen verrattuna havaittuun yleiseen tendenssiin, jonka mukaan humaani-T-salutuumorisoluIinjo-30 jen T-solureseptorin suhteen negatiiviset mutantit reagoivat tyypillisesti yliherkästi ulkopuolelta annetuille laukaiseville molekyyleille. Tässä keksinnössä on esitetty kaksi mahdollista ja toisiinsa liittyvää selitystä sille, että T-solureseptoreja ilmeisesti tarvitaan spontaaniin 35 aktivaatiotapahtumaah. Toinen selitys on, että kimeerinen 51

Syk-kinaasi saattaa vaikuttaa konstitutiivisesti T-solu-reseptorien intrasellulaarisiin domeeneihin, minkä tarkoituksena on muodostaa fosfotyrosiinikohteita reseptoriki-meeran SH2~dameeneilie, mikä saa aikaan intrasellulaarisen 5 aggregaation muitivalentin T-solureseptorlsillan välityk-sellä, mikä vuorostaan edistää kinaasiaktivaatiota. Toinen mahdollisuus on, että T-solureseptorinegatiivisessa solu-linjassa Syk: n aktivoitumiseen tarvittavan membraaniin liittyneen kinaasin pitoisuus on pieni joko siksi, että 10 globaali säätelypiirirt toiminta johtaa hypoteettisen kinaasin de novo “Synteesin vähentymiseen, tai siksi, että antigeenireseptorin puuttuminen johtaa molekyylien intrasellulaarisen liikkumisen säätelyn häiriintymiseen.

On raportoitu, että B-soluissä Syk-kinaasi on kons-15 titutiivisesti assosiotuneena IgM-antigeenireseptorin int rasellulaarisiin elementteihin [Hutchcroft, et ai., Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992) 9107 - 91111; Hutchcroft et ai., J. Biol. Chem. 267 (1992) 8613 - 8619]. Tämän assosiaation tarkka mekanismi on selvittämättä, mutta yhtenä 20 mahdollisuutena on, että Syk:n SH2-domeenien ja mb-1- ja is B-29-reseptoriketjujen sytoplasmisessa domeenissa olevan tYrosiini-laukäisuryhmittymän välisessä vuorovaikutuksessa ei tarvita fosfotyrosiinia. Tälle ehdotukselle on osittaisena ennakkotapauksena raportti, jonka mukaan Phi-25 ladelphia-kromosomin kätkeamiskohtaryhmittymän alueen gee ni tuote BCR (breakpoint cluster region) sitoutuu moniin erilaisiin SH2-domeeneihin fosfotyrosiinista riippumattomalla tavalla [Pendergast, et ai., Cell 66 (1991) 161 -171; Muller, et ai., Mol. Cell. Biol. 12 (1992) 5087 -30 5093]. Toisaalta tässä tapauksessa vaikuttaa todennäköi seltä, että tässä vuorovaikutuksessa fosfoseriini- ja/tai fosfotreoniinlryhmillä on ratkaisevan tärkeä osuus, Syk voi vaihtoehtoisesti assosioitua reseptorin intrasellulaarisiin ryhmittymiin sellaisen ainutlaatuisen alueen väli-35 tyksellä, joka sijaitsee Syk:n SH2-elementtien ja kata- 52 lyyttisen domeenin välissä. Kolmantena mahdollisuutena on, että Sykin siirtämiseen plasmamembraanin sisäpuolelle funktionaalisesti merkittävässä määrin tarvitaan vain erittäin pieni määrä peptidiä, jonka tyrosiinit on fosfo-5 ryloitu, ja että tätä pientä tyrosiinifosfaattipitoisuutta ei toistaiseksi ole havaittu.

Vaikka ei olla täysin varmoja siitä, että B-soluis-sa aktivaatioon tarvitaan Src-ryhmän kinaaseja, niin T-so-luissa on somaattisten solujen tai organismitasoisen gene-10 tilkan avulla osoitettu, että kahdella kinaasllla, Lck:11a ja Fyn (T)rllä, on merkittävä osuus [Appleby, et ai., Cell 70 (1992) 751 - 763; Karnitz, et ai., Mol. Cell. Biol. 12 (1992) 4521 - 4530; Stein, et ai., Cell 70 (1992) 741 -750; Straus ja Weiss, Cell 70 (1992) 585 - 593]. Tällä 15 hetkellä ei ole lopullisella varmuudella selvää, toimivatko nämä kihaasit normaalisti ennen Syk-ryhmän kinaaseja vai vasta niiden jälkeen. Yhdessä hypoteesissa, joka selittäisi ZAP-7Ö;n toiminnan T-soluaktivääiiossa, käytetään hyväksi reseptoriin assosioituvaa Src-ryhmän kinaasia, 20 jonka aggregoituminen mahdollistaa reseptoriketjujen ly- * hytaikaisen fosforylaation, mikä vuorostaan saa aikaan ZAF-70:n liittymisen ja sen seurauksena syntyvän solujen aktivoitumisen. Tässä mallissa ehdotettu reseptoriketjujen ensiksi tapahtuva fosforylaatio on pidettävä erillään zee-25 tamolekyylin stabiilista fosforyläatiösta, jota havaitaan edellistä pidempien aikojen kuluttua reseptorien silloit-tumisesta.

Hiiren T-soluissa pieni osa T-solureseptorikomplek-seista sisältää zeeta-molekyyliä muistuttavaa molekyyliä, 30 jota kutsutaan eeta-molekyyliksi [Banlyash et ai., J.

Biol. Chem. 263 (1988) 9874 - 9878] ja joka edustaa molekyylin vaihtoehtoisesti pilkkoutunutta muotoa [Clayton, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88 (1991) 5202 - 5206].

Eeta poikkeaa zeetasta karhoksyyliterminaalisen pään osal-35 ta ja siitä puuttuu hiiren zeeta-molekyylissä esiintyvät 53 kuusi distaalisinta tyrosiinia [ Jin, et ai., Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 87 (1990) 3319 - 3323]. Vaikka hiiren TCR-zeeta-zeeta-isomuotojen zeeta-ketjun fosforylaatio voidaan havaita vaivatta yasta-ainevälitteisen reseptorien sil-5 löittamisen jälkeen, niin samanlaisissa olosuhteissa TCR-eeta-ketju ei fosforyloidu havaittavissa määrin [Bauer, et ai,, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88 (1991) 3842 - 3846],

Vaikuttaa siltä, että zeeta-ketjun stabiiliin fosforylaä-tioon tarvitaan kaksi läheisesti rinnakkain olevaa zeeta-10 ketjua, koska zeeta-eeta-heterodirneerejä sisältävät TCR-isomuodot eivät fosforyloidy reseptorien silloittumisen seurauksena [Bauer, et ai,, Proc. Natl. Acad. Sei, USA 88 (1991) 3842 - 3846], Fosforylaatiossa vallitsevista eroavuuksista huolimatta pelkästään eeta-kejuja sisältävistä 15 homodimeereistö koostuvia TCR-isomuotoj a sisältäviä solu-linjoja ei voida toiminnallisesti erottaa solulinjöistä, joissa on pelkästään zeeta-homodimeerejä [Bauer, et ai.,

Proc. Natl. Acad. Soi, USA 88 (1991) 3842 - 3846]. Zeeta-molekyylin fosforylaatio ei siis korreloi aktivoitumisen 20 karissa, koska tämän havaittiin tapahtuvan 30 minuutin ku- I

luttua Västa-ainevälitteisen reseptoriaggregaation jälkeen. Erillisessä tutkimuksessa, jossa on tutkittu fosfo-tyrosiinifosfoproteiinien kertymistä ajan suhteen, on osoitettu että varhaisimmat havaittavissa olevat molekyy-25 lit ovat kaksi massaltaan 135 ja 100 kD:n suuruista proteiinia, joiden fosforyloituminen voidaan ensimmäisen kerran havaita 5 ja 15 sekunnin kuluttua sillolttumisesta, samassa järjestyksessä ilmoitettuna, ja joiden fosforylaatio saavuttaa puolet maksimiarvostaan kuminassakin tapauk-30 sessa on noin 30 sekunnin kuluttua, mikä tapahtuu aikaisemmin kuin kalsiumin mobilisaatio ja inositolifosfaatin muodostuminen saavuttavat puolet maksimaalisista aivoistaan [June, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 (1990) 7722 - 7726; June, et ai,, J. Immunol, 144 {1990) 1591 -35 1599]. Zeeta-molekyylin fosforylaationopeus on sitä vas- 54 toin merkittävästi pienempi ja substituutio saavuttaa puolet maksimiarvostaan noin 3 - 5 minuutin kuluttua stimulaatiosta, mikä tapahtuu selvästi kalsiumin kertymisen ja inositolifosfaattien vapautumisen havaitsemisen jälkeen 5 [June, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 (1990) 7722 -7726; June, et ai., j. Immunol. 144 (1990) 1591 - 1599],

Jos siis kaksivaiheinen malli On oikea, niin tyrosiinifos-forylaatiön, joka tarvitaan ZAP-70:n siirtämiseksi plas-mamembraanin sisäpuolelle, täytyy olla nopeampi, oletetta-10 vasti lyhytkestoinen, tapahtuma kuin edellisissä tutkimuksissa havaittu tapahtuma. Viime aikoina on .ehdotettu, että reseptorien sillOittumisen jälkeen sekä zeeta- että CD3-epsilonketjuissa voidaan havaita tyrosiinifosforylaatio, joka käynnistyy riittävän nopeasti (noin 15 sekunnissa) 15 [Wange, et ai., J. Biol, Chem, 267 (1992) 11685 - 11688], ja että tyrosiinifosfaatin sisältävä 70 kD:n suuruinen proteiini voidaan havaita sekä zeeta- että epsilonketjui-hin assosiotuneena. Tällä hetkellä on epäselvää, onko stabiili assosiaatio fosforyloituneiden reseptöriketjujen 20 kanssa edellytyksenä onnistuneelle T-soluaktivaatiolle. I; Tässä keksinnössä esitettyjen tulosten perusteella voidaan toisaalta yleisesti ottaen esittää väite, että Syk-ryhmän kinaasit vaikuttavat välittömämmin T~solujen efektorimekanismiin kuin Src-ryhmän kinaasit. On saatu yhä 25 enemmän todisteita siitä, että Src-ryhmän kinaasit pystyvät liittymään moniin solun pinnan molekyyleihin, jotka eivät kuulu antigeeni/Fc-reseptoreihin ja joita ovat CD2 [Bell, et ai., Mol. Cell. Biol. 12 (1992) 5548 - 5554], CD23 [Sugie, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88 (1991) 30 9132 - 9135], CD36 [Huang, et ai., J. Biol. Chem. 267 \ (1992) 5467 - 5473], IL-2-reseptorin beetaketju [Hatakeya-raa, et ai., Science 252 (1991) 1523 - 1528] ja monet erilaiset fosfatidyyli-inositoliin kiinnittyneet proteiinit [Stefanova, et ai., Science 254 (1991) 1016 - 1019; Thomas 35 ja Samelson, J. Biol. Chem. 267 (1992) 12317 - 12322], 55 joista joidenkin tiedetään vaativan myös antigeeniresepto-rin mukanaoloa T-soluissa tapahtuvan aktivaation edistämiseksi. Viimeksi mainitulle vaatimukselle saattaa selityksenä olla yksinkertaisesti se, että antigeenireseptorin 5 laakasija-ryhmittymät toimivat Src-ryhmän kinaasien subst raatteina ja tällä tavoin seuraavaksi mahdollistavat Syk-ryhmän kinaasien kiinnittymisen paikoilleen, minkä jälkeen niiden aktivoitumista edistää kenties jokin toinen muok-käava tapahtuma. Koska fosforylaation ja aktivaation väli-10 sen syy-seuraussuhteen selvittäminen on vaikeaa, niin on mahdollista, että laukaisija-ryhmittymien osuus tapahtumissa on vain väliaikainen siten, että ne toimivat jonkinlaisena katalyyttisenä keskuksena efektorikinaasien käyttöönotossa/ aktivaatiossa ja vapautumisessa, 15 Src-ryhmän kinaasejä esiintyy laajalti ei-hemato- poeettisissa solutinjoissa ja viimeaikaisissa Fyn-negatii-visilla hiirillä tehdyissä tutkimuksissa on osoitettu, että Fyn:illä on osuutta osaltaan pitkäkestoisen poten-tioitumisen säilymisessä, joka on synaptisen transmission 20 edistyrnisilmiö, johon assosiatiivisen muistin alkuvaiheen #f lujittumisen arvellaan perustuvan [Grant, et ai., Science 258 (1992) 1903 - 1910). Jos Src-ryhmän kinaasi! toimivat välittäjäaineina samanlaisissa aktivaatioreaktioteissä myös muissa solutyypeissä, niin saattaa osoittautua, että 25 Syk-ryhmän kinaaseja esiintyy nykyisin tunnettua enemmän hematopoeettiseen järjestelmään kuulumattomissa soluissa.

Kokeelliset menetelmät

Kimeerojen konstruointi, Humaani-Lck- [koga, et ai., Eur. J. Immunol. 16 (1986) 1643 - 1646], hiiren Fyn 30 (T)— [Cooke ja Perlmutter, New. Biol. 1 (1989) 66 - 74],

Sian Syk- [Taniguchi, et ai., J. Biol. Chem. 266 (1991) 15790 - 15796] ja humaani-ZAP-70-kinaasien [Chan, et ai.,

Cell 71 (1992) 649 - 662] täydelliset koodaavat alueet

liitettiin sellaisen klmeerisen transmemhraanisen proteii-35 hin intrasellulaariseen doraeeniin, joka sisälsi GD16;n J

56 ekstrasellulaarisen domeenin yhdistettynä lyhyeen "varsi segmenttiin ja CD7:n transmembraaniseen dameeniin. CD7:n intrasellulaarinen domeeni katkaistiin "stop transfer" -sekvenssin kohdalta liittämällä siihen Mlu-kohta. Useat 5 erilaiset kinaasit tehtiin sellaisiksi, että Miu-kohta oli sopivassa lukukehyksessä, minkä ansiosta kolmesta osapuolesta muodostuva fuUsioproteiini saatiin ilmentymään. Sian Syk-sekvenssi saatiin sian lymfosyytti-kokonais-RNA:sta käänteiskopioinnilla ja PCR:llä käyttäen tarkoituksenmu-10 kaiset restriktiököhdat sisältäviä alukkeita. ZAP-70-sek-venssit saatiin samalla tavalla PCR:llä ihmisen T-solu-cDNA-kirjestosta. Useita sekvenssejä sekvenssoitiin rinnakkain ja restriktiofragmentteja keskenään vaihtamalla saatiin mutatoitumaton kutakin kinaasia koodaava sekvens-15 si. Tästä saadut kooöavat sekvenssit liitettiin ilmentä-misvektorina käytettyyn vaccinia-virukseen CDl6/CD7-sek-venssien myötäsuunnan puolelle. Humaani-Syk eristettiin luonnollisista tappajasoluista tehdystä oDMA-kirjestosta ja Daudi-solukirjastosta käyttäen sian sekvenssin päitä 20 vastaavia alukkeita. Eteenpäin suuntautuvan alukkeen sek-venssi oli atg gca gac agt gec aac cac ttg ccc ttc ttc t ja käänteisen alukkeen sekvenssi oli cgc ggg gcg gcc got tta att cac cac gtc gta gta gta. Sen jälkeen kun alustavasta monistuksesta oli saatu selville, että vyöhykkeet 25 olivat odotetun kokoisia, tehtiin monistus uudelleen (10 kierrosta) käyttäen 5'-päässä pidennysaluketta, jonka oli sekvenssi cgc ggg acg cgt acc atg gca gac agt gcc aac, minkä ansiosta fragmentti pystyttiin liittämään ligaasilla Mlu-I:llä pilkottuun vektoriin.

30 Kalsiumin mobilisaatiomääritys. Yhdistelraä-kinaase- ja ilmentäville soluille suoritettiin virtaussytometrinen analyysi ja erottelernattomista soluista tehtiin spektro-fotometrinen analyysi aikaisemmin kuvatulla tavalla [Romeo ja Seed, Cell 64 (1991) 1037 - 1046; Romeo, et ai., Cell 35 68 (1992) 889 - 897] käyttäen kalsiumherkkää Indo-l~fluo- i 57 roforia. Yksityiskohtiin puuttumatta iurkatin mutanttiala-1 in jän JRT 3.T 3.5 soluja [Weiss ja Stoho, J. Exp. Med.

160 (1984) 1284 - 1299] infektoitiin yhdistelmä-vaOcinia-viruksilla yhden tunnin ajan seerumittomassa IMDM:ssä 5 käyttäen infektion multiplisiteettinä 10 ja soluja inku-.böitiin 3 - 9 tunnin ajan IMDMissä,, joka sisälsi 10 % FBS:ää. Solut kerättiin sentrifugoimalla ja suspendoitiin uudelleen täydelliseen kasvatuslluokseen, joka sisälsi 1 mM Indo-l-asetoraetoksiesteriä [Grynkiewics, et ai., 3.

10 Biol. Ghent. 260 ¢1985) 3440 - 3450] {Molecular Probes,

Eugene, OR), solutiheyteen 3 x 106/ml, jonka jälkeen solujat inkuboitiin 37 °C:ssa 45 minuutin ajan. Indo-l:tä sisältävistä soluista tehtiin nappi ja ne suspendoitiin uudelleen seerumittomaan lMDM:ääh solutiheyteen 1 x 106/ml ja niitä 15 varastoitiin huoneenlämmössä pimeässä. Soluista määritettiin vapaan kalsiumionin määrä määrittämällä virtaussytö-metrisesti samanaikaisesti violetin ja sinisen fluoresenssin emissio [Rabinovitch, et ai., J. Immunol. 137 (1986) 952 - 961]. Kalsiumin virtauksen käynnistämiseksi solusus-20 pensioon lisättiin hetkellä 0 joko konjugoimatonta mono- i klonaalista (anti-GDI6) 3G8-vasta-ainetta (pitoisuutena 1 pg/ml) ja sen jälkeen 10 pg/ml fykoerytriinixn (PE-) konjugoitua vuohessa valmistettua hiiren IgG:ta vastaan suunnattua Fab 02 -vasta-ainetta, tai lisättiin FE-konju-25 goitua anti-GD4-vasta-ainetta (Leu-3a, Becton Dickinson) ja sen jälkeen konjugoimatönta sekundaarista vasta-ainetta. PE-positiivisesta (infektoidusta) solupopulaatiosta, jonka osuus kaikista soluista oli tyypillisesti 40 - 80 %, koottiin talteen violetin ja sinisen emission suhdetta 30 kuvaavia histogrammeja. Ennen vasta-aineen lisäämistä vallinnutta violetin ja sinisen emission suhdetta käytettiin normalisoidun alkusuhteen määrittämiseen, jolle annettiin arvoksi 1.

Lymfosyyttien sytolyysimääritys. CD8+ CD4" HLA 35 B44:ään rajoittunutta sytolyyttistä soiulinjaa (WH3) kas- 58 vaiettiin IMDMrssä, joka sisälsi 10 % ihmisen seerumia ja 100 U/ml IL~2:ta, ja soluja stimuloitiin ajoittain säiei-Xytetyillä (3000 rad) mononukleaarisilla soluilla, joilla oli HL& B44 -haplotyyppi. Soluja kasvatettiin vähintään 10 5 päivän ajan stimulaation jälkeen, minkä jälkeen niitä käytettiin sytotoksisuusmäärityksissä. Soluja infektoitiin yhdistelmä-vacciniaviruksella infektion multiplisiteetillä 10 vähintään yhden tunnin ajan seerumittomassa kasvatus-liuoksessa ja tämän jälkeen niitä inkuboitiin täydellises- 10 sä kasvatusliuoksessa kolmen tunnin ajan. Solut kerättiin talteen sentrifugoimalla ja ne suspendoitiin uudelleen solutiheyteen 1 x 107. Kuhunkin ϋ-pohjäisen mikrotiitteri levyn kuoppaan, joissa oli täydellistä kasvatusliuosta 100 μΐ/kuoppa, lisättiin 100 μΐ solususpensiota. Solut laimen-15 nettiin sarjalaimennoksena kaksinkertaisin laimennoksin.

Kahdessa kutakin näytettä sisältävässä kuopassa ei ollut lainkaan lymfosyyttejä, minkä ansiosta saatiin määritettyä kromin spontaani vapautuminen ja kromin kokonaissisäänotto soluihin. 106 kohteena olevaa 3G8 10-2 -solua [Shen, et 20 ai., Mol. Immunol. 26 (1989) 959 - 969] sisältävä näyte- H

erä tai sentrifugoitiin ja suspendoitiin uudelleen 50 i pl:aan steriiliä 5lCr-natriumkromaattia (1 rnCi/ml, DuPont) yhden tunnin ajaksi 37 °C:ssa ajoittain sekoittaen, minkä jälkeen solut pestiin kolme kertaa PBS:llä. Kuhunkin kuop-25 paan lisättiin 100 μΐ leimalla varustettuja soluja, jotka 011 suspendoitu kasvatusliuökseen solutiheyteen 105/ml. Mikrotiitterilevyä sehtrlfugoitiin 750 x g:n voimalla minuutin ajan ja inkuboitiin 4 tunnin ajan 37 °C:ssa. Inku-baatiojakson lopussa kussakin kuopassa olevat solut sus- 30 pendoitiin uudelleen varovasti pipetoimalla, kuopista otettiin näyte soluihin kerääntyneiden kokonaisiskumäärien määrittämiseksi ja tämän jälkeen mikrotiitterilevyä sentrifugoitiin 750 x g:n voimalla minuutin ajan. Supernatan-tista otettiin 100 μΐ:n näytteitä ja ne laskettiin gamma- i 35 tuikelaskijalla. Efektorisolujen ja kohdesolujen suhde 59 korjattiin infektoituneiden efektorlsolujen osuuden (joka tavallisesti oli >70 %) suhteen.

Mutatoituj en kinaasikiiiieeröjen muodostaminen. Sian Syk-kinaasi-negatiivinen fuusioproteiinivariantti muodos-5 tettiin pilkkomalla kimeera Stu Iillä ja Not Iillä (joista viimeksi mainittu sijaitsee aivan karboksyylipään 3’—puolella), täyttämällä Not I -kohta ja liittämällä päät li-gaasilla yhteen· Tulokseksi saadussa sekvenssissä Sian Sykin 298 ensimmäistä ryhmää on liittyneenä 4 ulkopuoli-10 seen ryhmään (GPNL) ennen terminaatiokohtaa. ZAP-70:n ATP:n sitoutumiskohdassa oleva pistemutaatio (K369G) muodostettiin liittämällä sekvenssin ylemmän juosteen ryhmien 1319 ja 1345 välissä sijaitsevien Bali- ja Earl-kohtien väliin kaksinauhainen aligonukleotidifragmentti, mikä on 15 raportoitu Changin, et ai., julkaisussa [Cell 71 (1992) 649 - 662]. Tästä saatu sekvenssi koodasi iysiinin sijasta glysiiniä ryhmässä 369.

iBununosaostus ja kinaasimääritys. Noin 2 x 106 Hela S3 -solua infektgitiin yhden tunnin ajan seerumittomassä 20 DME-kasvatusliuoksessa yhdistelmä-vacciniaviruksella in- s fekiion multiplisiteetilla kymmenen. Viiden tunnin kuluttua infektiosta solut kerättiin talteen, pestiin kaksi kertaa fosfaatilla puskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella ja hajotettiin liuoksessa, jonka koostumus oli 25 1 % Triton X-lOOiaa, 0,15 M NaCl, 0,02 M HEPES, pH 7,3, 5 mM EDTÄ, 5 mM NaF, 0,2 mM NaV03, 10 pg/ml leu-peptiinia, 10 pg/ml protiniinia ja 1 mM PMSF. Sen jälkeen kun seosta 011 inkuboitu jäissä 10 minuutin ajan, tumat poistettiin sentrifugoimalia ja CDl6-fuusioproteiinit immunosaostet- 30 tiin BMA209/2-vasta-aineella ja proteiini-A-Sepharosella.

Fuusioproteiinia sisältävä hartsi pestiin 3 kertaa hajo-tuspuskurilla ja sen jälkeen viimeisen kerran 20 mM Hepesiillä, pH 7,3. Kuhunkin näytteeseen lisättiin 10 μΐ kinaasi puskuri a {20 mM Hepes, pH 7,3, ID mM MgCl2, 10 mM 35 MnClz) , joka sisälsi 10 pCi [γ~32Ρ] ATP: ta ( > 3000 Ci/mooli ).

60

Reaktioseoksia inkuboitiin huoneenlämmössä 10 minuutin ajan ja reaktio pysäytettiin lisäämällä 20 μΐ 2 x -näyte-puskuria (4 % SDS, 100 mM Iris, pH 6,8, 20 % glyserolia ja 10 % fj-merkaptoetanqlia). Sen jälkeen kun näytteitä oli 5 keitetty 3 minuutin, ajan, niistä otettuja näytteitä ajettiin 4 - 15-%:isessa gradienttigeelissä. Sellaiset kinaasi määritykset, joissa käytettiin liukoista peptidisubstraattia, joka vastaa edo 2:n asemia 6 - 20, jossa tyr on korvattu lysiillä, suoritettiin valmistajan (UBI) ohjeiden 10 mukaisesti.

Proteiinityrosiinifosforyiaation immunoblottausmää xitys. TRC-negatiivisia 3.5-soluja infektoitiin yhdistelmä-viruskannalla (jonka infektion multiplisiteetti oli vähintään 10) yhden tunnin ajan. Tämän jälkeen soluja in-15 kuboitiin 37 °C:ssa 8 - 12 tunnin ajan, sentrifugoitiin, pestiin ja suspendoitiin uudelleen seerumittomäan Iscoven kasvatusliuokseen sölUtiheyteen 107 solua millilitrassa.

Soluista otettuja näytteitä inkuboitiin anti-CD16-mAb:n (3G8, Medarex tai BMA209/2, Behringwerke) kanssa pitoisuu-20 ten® 1 pg vasta-ainetta 2 - 3 x lQs:ttä solua kohti* Stimu- i; loituja näytteitä inkuboitiin vielä 5 minuutin ajan käyt- f tien 3 - 5 kertaista ylimäärää affiniteettipuhdistettua hiiren IgG-l:tä vastaan suunnattua vasta-aihetta (Southern Biotechnology). Tämän jälkeen solut käsiteltiin julkaisus-25 sa Secrist, J.P., Burns, L. A., Karnitz, L·., Koretzky, G.A,, ja Abraham, R.T. [J, Biol. Chern. 268 (1993) 5886 -5893] kuvatulla menetelmällä,, johon oli tehty pieniä muutoksia. Inkuhaatiot pysäytettiin lisäämällä SDS:ää siten, että konsentraatioksi tuli 1 %, ja näytteitä keitettiin 30 kolmen minuutin ajan. DNA: hän kohdistettiin laikkausvoimia käsittelemällä ultraäänellä 1 minuutin ajan Heat Systems Ultrasonics, Inc. -yhtiön valmistamalla laitteella, seokseen lisättiin 2 X -näytepuskuria ja 1Ö5 - 2 x 10s solua sisältäneet näytteet eroteltiin polyakryyliamldigeeleissä 35 ja proteiinit siirrettiin puolikuivan elektroblottauksen i 61 (Hoefer) avulla nitroselluloosalle (Schleicher ja Schuell BA45). Suodattimien reagoivat kohdat tehtiin reagoimattomiksi inkufooimalla niitä yhden tunnin ajan Tris:illä puskuroidussa fysiologisessa suolaliuoksessa käyttäen 5 0,05-%:ista Tween 20:ä (TBST), jossa oli 1,5 % kanan oval- bumiinia (Sigma), pestiin TBST:ssä ja siirrettiin liuokseen, joka sisälsi anti-fosfotyrosiini-vasta-ainetta 4G10 (UBI) laimennettuna suhteessa 1:10. 000, minkä jälkeen seosta inkuboitiin 22 °C:ssa 1 - 2 h ajan. TBST-pesujen 10 jälkeen suodattimia inkuboitiin TBST:ssä ja suhteessa 1:5 000 laimennetun hiirtä vastaan suunnatun piparjuuri-peroksidaaslkonjugaatin kanssa 1 h ajan. Fosforyloituneet proteiiniyyöhykkeet havaittiin kemiluminesenssin perusteella (ECL, Amer Sham). Valotusaj at vaihtelivat 2 sektin™ 15 nista 5 minuuttiin.

Humaani-IgGl: prot ei ini - tyros iinikinaasikimeeroj en konstruointi

Voidaan valmistaa sellaisia kimeerlsiä molekyylejä, jotka sisältävät kohdesolulle spesifisen Västa-äinemole-20 kyylin ekstrasellulaarisen domeenin ja (esimerkiksi tässä i keksinnössä kuvatun) proteiini-tyrasiinikinaasln intrasel- s lulaarisen domeenin. Tällaisen molekyylin valmistamiseksi valmistetaan humaani-IgGl:n raskaan ketjun sekvenssejä liittämällä CH3-domeenissa olevat sekvenssit vasta-aineen 25 mRNA:n transmembraanisen muodon 3'-päästä saatuun cDNA-fragmenttiin. 3'-pään fragmentti saadaan polyffleraasiketju reaktiolla käyttäen substraattina nielurisä-cDNA-kirjastöa sekä oligonukleotidejä, joilla on sekvenssit: CCC GGG GTG ACC GTG CGC TCC AGC AGC TTG GGC ja 30 CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT GGG CCT CÄ, jotka vastaavat haluttujen DNA-fragmenttien 5!~ ja 3'-päitä, vastaavassa järjestyksessä ilmoitettuna. 5'-pään oli-gonukleotidi on komplementaarinen humaani-IgGl:n CHl-domee-35 nissa olevan kohdan suhteen ja 3’-pään oligonukleotidi on 62 komplementaarinen sellaisen kohdan suhteen, joka sijaitsee 5’-puolella heti membraanin läpäisevää dorneenia koodaavien sekvenssien jälkeen. PCR-tuote pilkotaan BstXIrllä ja BamHI:llä ja liitetään ligaasilla vaihtelevat ja muuttu-5 mattomat alueet sisältävän puolisynteettisen IgGl-vasta-ainegeenin BstXI- ja BamHI-kohtien väliin. Sen jälkeen kun BstXI-BamHI-fragmentti on liitetty, konstruktion monistetut osat korvataan C„3:n Smal-kohtaan saakka restriktio-fragmentteja keskenään vaihtamalla niin, että pelkästään 10 Smal-kohdan ja 3'-pään oligonukleotldin välissä oleva osa on peräisin PCR-reaktiosta.

Kimeerisen humaani-IgGl-reseptorin muodostamiseksi BamHI-kohtaan päättyvä raskaan ketjun geeni liitetään kyseessä olevan kinaasin intrasellulaariseen domeeniin ta-15 vanomaisilla menetelmillä. Kimeerisen reseptorin ilmenty-mistasot voidaan määrittää virtaussytometrisesti. Ilmentymistä voidaan lisätä ilmentämällä samanaikaisesti vasta-aineen kevyen ketjun cDNA:ta sisältävää plasmidia.

Sellaisen yhden tränskriptioyksikön muodostamisek-20 si, jonka ansiosta sekä raskaat että kevyet ketjut pystyi- #, sivät ilmentymään yhden promoottorin avuila> muodostetaan # bikistronista mRNA:ta koodaava plasmidi raskasta ja kevyttä ketjua koodaavista sekvensseistä sekä 78 kD:n glukoosin säätelemää proteiinia koodavan mRNA:n 5'-pään transioitu- 2,5 mattomasta osasta, josta käytetään myös nimitystä grp78 tai BiP. grp78:n sekvenssit saadaan PCR:llä ihmisen geno-misesta DNA:sta käyttäen alukkeita, joilla on seuraavat sekvenssit: CGC GGG CGG CCG CCA CGC CGG CCA AGA CAG CAC 5’-päässä ja 30 CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG 3 ’ -päässä .

Näillä oligonukleotideiiiä tehdyt polymeraasiketjureaktiot tehtiin 10—prosenttisen dimetyylisulfoksidin läsnä ollessa, PCR:llä saatu fragmentti pilkotaan Nötlillä ja Hindi:11a ja liitetään humaani-IgGl:tä koodaavien aluei-35 den myötäsuunnan puolella olevien Noil- ja Hpal-kohtien 63 väliin. Humaani-Igö:n kevyen kappa-ketjun cDNA:ta koodaa-vat sekvenssit liitetään sitten myötääuuntaän grp78-johtö“ sekvenssiin nähden käyttäen Hinctl-kohtaa ja toista vektorissa olevaa kohtaa. Näistä manipulaatioista saatava 11-5 mentämisplasmidi koostuu puolisynteettisestä raskaan ketjun geenistä, tämän jälkeen tulevasta grp78-johtosekvens-sistä ja sitä seuraavista kevyen kappa-ketjun cDNA-sek-vensseistä ja näitä seuraavista SV40:n DNA-fragmentista peräsin olevista polyadenylaatiosignaalisekvensseistä.

10 Tämän keksinnön tekij ät ovat aikaisemmin osoittaneet, että kun COS-soluja transfektoidaan tällä ilmentämisplasmidll-la, niin raskaan ketjun determinattien ilmentyminen oli selvästi tehokkaampaa kuin transfektiossa pelkkiä raskaan ketjun determinantteja koodaavalla plasmidilla.

15 Raskaasta ketjusta ja reseptorista koostuvan fcimee- ran sekä kevyen ketjun sisältävän bikistronisen geenin konstruoimiseksi vastasuuntaan sijaitsevat raskaan ketjun sekvenssit voidaan korvata millä tahansa tässä keksinnössä kuvatulla kimeerisellä raskaan ketjun ja reseptorin sisäl-20 tävällä geenillä. Il

Konstruoinnin jälkeen IgG-tyrosiinikinaasi-kimeerat * voidaan kloonata ilmentämisvektoriin, liittää isäntäsaluun ja niitä voidaan tutkia millä tahansa tässä keksinnössä kuvatulla määrityksellä (esimerkiksi kalsiumin mphilisaa-25 tiomäärityksellä tai sytolyysimäärityksellä).

CD4-tyrosiinikinaasikimeerojen konstruointi Voidaan valmistaa sellaisia kimeerisiä molekyylejä, jotka sisältävät CD4-molekyylin ekstrasellulaarisen domee-nin ja proteiini-tyrosiinikinaasin (esimerkiksi jonkin 30 tässä keksinnössä kuvatun kinaasin) intrasellulaarisen domeenin. Tällaisen molekyylin valmistamiseksi eristetään (esimerkiksi edellä kuvatulla tavalla) kyseinen tyrosiini-kinaasia koodaava sekvenssi (esimerkiksi cDNA). Tämän jälkeen tämä sekvenssi liitetään tavanomaisilla menetelmillä 35 CD4:n muokatun muodon ekstrasellulaariseen domeeniin, jos 64 sa myötäsuuntaan heti membraanin läpäisevän domeenin jälkeen on BamHI-kohta [Aruffo, et ai., Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 84 (1987b) 8573 - 8577; Zettlmeissl, et ai., DNA Cell Biol. 9 (1990) 347- 353]. Tämän fuusioproteiinin 5 muodostamiseksi sopivaan sekvenssin kohtaan voidaan muokata BamHI-kohta (edelleen tavanomaisilla menetelmillä), Geenifuusiot liitetään vaccinxa-vxrusilmentämisplasmidiln (tässä keksinnössä kuvatulla tavalla) ja liitetään vacci-nia-WR-kannan genömiin homologisella rekombinaatiolla ja 1Ö suorittamalla valikointi sillä perusteella, että solut kasvavat mykofenolihapossa [Falkner, et ai., J. Virol. 62 (1988) 1849 - 1854; Boyle, et ai., Gene 65 (1988) 123 -128]. yhdistelmä-vacGiniavirusten solun pinnalla aikaansaaman CD4-tyrösiinikinaasifuusioproteiinien ilmentymisen 15 tutkimiseen käytetään virtaussytometristä määritystä. Tu- f lokset varmistetaan immunosaostamalla yhdistelmä-vaccinia-viruksilla infektoidut solut (edellä kuvatulla tavalla), CD4-kxmeerojen tehokkuutta voidaan tutkia millä tahansa tässä keksinnössä kuvatulla kalsiumin mobilisaa- # 20 tiomäärityksellä tai sytolyysimäärityksellä. yhdessä eri- i tyisessä esimerkissä muodostetaan kohde- ja efektorisoluja ® sisältävä mallijärjestelmä, joka perustuu siihen, että CD4 tunnistaa HIV:n vaipan gpl20/gp41-kompleksin. HeLa-soluja Infektoidaan yhdistelmä-vacciniaviruksilla, jotka 25 ilmentävät gpl20/gp41:ta [Chakrabarti, et ai,. Nature 320 (1986) 535 - 537; Earl, et ai., J. Virol. 64 (1990) 2448 -2451], ja ne varustetaan 5ICr-leimalla. Leimalla varustettuja soluja inkuboxdaan sellaisten solujen kanssa, jotka ovat peräsin ihmisen allospesifxsestä (CD8+, CD 4') sytotok-30 sisesta T-lymfosyyttisoluIinjasta, joka on infektoitu CD4-tyrosiinikinaasikimeeraa ilmentävillä yhdistelmä-vaccinia-viruksilla, minkä jälkeen tutkitaan ilmeneekö solujen spe-s x fIstä haj oami sta.

Sen mahdollisuuden kontrolloimiseksi, että vacci-35 nia-xnfektio voisi edistää sitä, että CTL-solujem tunnis- 65 tustapahtuma on artefakta, tehtiin samanlaisia sytolyysi-kokeita käyttäen sellaisilla yhdistelmä-vacciniaviruksilla infektoituja 51Cr-leimalla varastettuja kohdesoluja, jotka ilmensivät GDl6:n fpsfatidyyli-inositoliin kytkettyä muo-5 toa (CD16P1), ja CD16~k±meeroja ilmentävillä kontrolli-yhdistelmä-viruksilla infektoituja CTL-soluja.

Toisessa esimerkissä GD4-tyrosiinikinaasikimeero jen ilmentämiseen käytettävinä soluina on houkuttelevaa käyttää neutrofiilisia granulosyyttejä, joiden elinkaari ve-10 renkierrossa on erittäin lyhyt (= 4 h). Neutrofiilien in-fektoiminen HIV:lläei todennäköisesti saa aikaan viruksen vapautumista ja näiden solujen suuren määrän (suurin osa leukosyyteistä on näitä soluja) pitäisi edistää isännän puolustusreaktioita. Toisina houkuttelevana mahdollisuute-15 na on käyttää isäntäsoluina kypsiä T-soluja, joka on sellainen solupopulaatio, jota on nykyään mahdollista muokata retrovirusilla [Rosenberg, S,A., Soi. Am. 262 (1990) 62 —

69] . Yhdistelmä-IL-2:n avulla T-solupopulaatioiden solujen lukumäärää voidaan kasvataa suhteellisen helposti ja solu- I

20 lukumäärältään kasvatettujen populaatioiden elinikä on f rajallinen uudelleen verenkiertoon vietynä [Rosenberg, et s ai., N. Engl. J. Med. 323 (1990) 570 - 578].

Sopivissa olosuhteissa CD4-kimeeroja ilmentävien solujen tunnistaessa HIV:n tulisi syntyä myös mitogeenisia 25 ärsykkeitä, minkä ansiosta on mahdollista, että tarkoituk-sehmukaisesti varustettu solupopulaatio reagoisi dynaamisesti Viruksia vastaan. Vaikka tässä keksinnössä on keskitytty fuusioproteiinien käyttäytymiseen sytolyyttlsissä T-lymfosyyteissä, niin kimeerojen ilmentäminen auttajalym-30 fosyyteissä saattaisi antaa käyttöön sellaisen HIV:n mobilisoiman sytokiinilähteen, joka voisi vastustaa AIDSrissa ilmenevää auttajasolujen alajoukon supistumista. Monet viime aikoina kuvatut suunnitelmat infektioresistenssin aikaansaamiseksi muissa infektion vaiheissa kuin viruksen 35 penetraatiovaiheessa [Friedman, et ai., Nature 335 (1988) 66 452 - 454; Green, et al,. Cell 58 (1989) 215 - 223; Malim, et ai., Cell 59 (1989) 205 - 214; Trono, et ai-. Cell 59 (1989) 113 - 120; Buonöcöre, et ai.. Nature 345 (1990) 625 - 628] viittaavat sillien, että voitaisiin suunnitella 5 viruksen muodostumista estäviä CD4-kimeeroj a sisältäviä soluja ilmentämällä sopivia agensseja, joiden vaikutuskoh-ta on solun sisällä.

Kyvystä välittää signaaleja T-lymfosyyteihin autonomisten kimeerojen välityksellä saadaan myös käyttöön 10 mahdollisuudet säädellä retrpvlruksilla muokattujen lymfosyyttien määrää in vivo -olosuhteissa. Sellaisten silloitus ärsykkeiden avulla, jotka tapahtuvat esimerkiksi sellaisten IgM-vasta-aineiden välityksellä, joista on muokkaamalla poistettu niiden komplementtia sitovat domee-15 nit, voi olla mahdollista saada tällaisten lymfosyyttien lukumäärä kasvamaan in situ -olosuhteissa, kun taas käsittely samanlaisilla spesifisillä IgG-vasta-aineilla (jotka esimerkiksi tunnistavat kimeeriseen ketjuun muokkaamalla tehdyn aminohappovariaation) voisi valikoivasti poistaa * 20 muokkamisen tuloksena saadun populaation. Tämän keksinnön §; tekijät ovat aikaisemmin määrittäneet, että CD4:ζ-kimeero- f ja ilmentävissä Jurkat-soluissa anti-Cp4-lgM-vasta-aineet eivät tarvitse ylimääräistä silloittamista kalsiumin mobilisaation aikaansaamiseksi. Kyky solupopulaatioiden sääte-25 lyyn turvautumatta toistuvaan elimistön ulkopuolella tapahtuvaan monistukseen saattaa merkittävästi laajentaa nykyisin geeniteknisesti muokatuille T~soluille esitettyjen käyttötapojen toiminta-aluetta ja tehokkuutta,

Muut soyellutusmuodot 30 Muiden sellaisten kimeerojen muodostamiseksi, jotka sisältävät proteiinikinaasin intrasellulaarisla sekvenssejä, voidaan kyseisen reseptorin ekstrasellulaarista domee-nia koodaviin genomisiin sekvensseihin tai cDNA-sekvens-seihin liittää restriktiokohta kohtaan, joka ön heti halu-35 tun ekstrasellulaarisen domeenin edellä. Tämän jälkeen 67 restriktiokohtaan päättyvä ekstrasellulaarisen domeenln sisältävä fragmentti voidaan liittää proteiinikinaaslsek-vensseihin, Tyypillisesti ekstrasellulaarisia domeenej a voidaan saada reseptoreista, jotka tunnistavat komplement-5 tia, hiilihydraatteja, virusproteiineja, bakteereja, alku-eläinioisia tai manisoluisia loisia, tai näiden indusoimia proteiineja- Proteiinikinaasisekvensseihin voidaan samalla tavoin liittää patogeenien tai tuumorisolujen ilmentämiä ligandeja tai reseptoreita, minkä tarkoituksena on suunna-10 ta immuunivaste niitä soluja vastaan, joissa on näitä ligandeja tunnistavia reseptoreita,

Sytolyysiin tarvittavien proteiinikinaasisekvens-sien vähimmäiskoon tunnistamiseksi voidaan tavanomaisilla menetelmillä tehdä sarja deleetioita sisältäviä mutatoitu 15 ja sekvenssejä, joista jokaisesta on poistettu edellistä f suurempi osa kinaasin inttäsellulaarisesta alueesta. Tällaisten deleetioita sisältävien mutatoitujen sekvenssien tehokkuus tutkitaan millä tahansa tässä keksinnössä kuvatulla määrityksellä- Käyttökelpoisia Syk-proteiinikinaasin t 20 intrasellulaarisia domeeneja ovat esimerkiksi sian Syk- f sekvenssin aminohapot 336 - 628 ja ihmisen Syk-sekvenssin f aminohapot 338 - 630.

Vaikka tätä keksintöä on kuvattu sen spesifisten sovellUtusmuotojen yhteydessä, niin on selvää, että siihen 25 voidaan tehdä muitakin muutoksia ja tämän patenttihakemus-julkaisun tarkoituksena on kattaa tämän keksinnön variaatiot, käyttömuodot, tai muunnelmat ja joihin kuuluvat sellaiset tästä keksinnöstä poikkeavat käyttömuodot, jotka ovat siihen alaan kuuluvia, jota tämä keksintö koskee, ja 30 joita voidaan soveltaa edellä esitettyihin olennaisiin tunnusmerkkeihin, jotka kuuluvat seuraavassa esitettyjen keksintöön liitettyjen patenttivaatimusten suojapiiriin.

f [

E

68

Sekvenssiluettelo <i) general informations (i) APPLICANTS Brian Seed

Charlaa Romeo Waldemar Koianus

fiij TITLE OF INVENTION» REDIRECTION OP CELL ULAA IMMUNITY

BY RECEPTOR CHIMERAS

(Ui) NUMBER OF SEQUENCES* 8 (lv) COERESFÖtnsEMCE ADDRESS! (A) ADDRESSEE: Fish & Richardson (S) streets 225 Franklin Street <C) CITY» Boston (O) STATSi Massachusetts (E) COUNTRY» U.5.A.

(F) SIPs 02110-2804 (V) COMPUTER READABLE FORM»

<ä) medium type» 3.5* Diskette, 1.44 Mb I

(B) COMPUTER» IBM PS/2 Model 502 or 55SX

(C) opbr&tino system» ks-dos (Version s.0) (p) SOFTWARES WordPerfect (Version 5.1) (<ri) current application data» (A) APPLICATION NUMBER» 08/093,210 1 (B) FILING DATEs July 16, 1993 % (C) CLASSIFICATION* '

(Uii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION I

(A) NAMES Paul T. Clark (B) REGISTRATION NUMBERS 30,162 (C) REFERBNCB/DOCKST NUMBER» 00786/195001

(lx) TSLSCÖMKöMICaSIO» INFORMATIONS

(A) TSL&PSORS* (617) 542-5070 (B) TELEFAX! (617) 542-8906 (C) TELSSi 200154 69

(2) INFORMATION FOR SEQUENCE IDENTIFICATION NUMBERS Is < i) SEQUENCE CHARACTERISTICS I

(A) LENGTH: 33 (B) TYPEI nucleic acid (C) BTRÄNDEBMESSI single (D) TOPOLOGYs linear (si) SEQUENCE DESCRIPTIONS SEQ ID NOs Is CGCGGGGTGÄ CCGTGCCCTC CAGCAGCTTG CGC 33 (3:.). INFORMATION FOR SEQUENCE I DENT 2 El CAT I OH NUMBERS 2i (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS! (A) LENGTHS 50 <B) TYPES nucleic acid (C) STRAHUEDNESSt singl® (D) TOPOLOGY s linear <*i) SEQUENCE DESCRIPTIONS SEQ ID NO: 2: CGCGGGGATC CGTCGTCCAG AGCCCGTCCA GCTCCCCGTC CTOGGCCTCA 50 (..3) INFORMATION FOR SEQUENCE IDENTIFICATION NUMBER: 3: (1) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LEHOTHt 33 (B) TYPE» nucleic acid $ (C> STRANDEDHESSi Bingl® (D) TOPOLOGY: linear (si) SEQUENCE DESCRIPTIONS SEQ ID NOt 3 s CGCGGGCGGC CGCGACGCCG GCCAAGACAG CAC 33 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE IDENTIFICATION NUMBERS 4i

(i) SSQUEHCB CHARACTERISTICSS

(A) LENGTHS 33 (8) TYPES nucleic acid (C> STRANDEDMSSSs single (D) TOPOLOGYs linear (si) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 4..:: CGCGTTGACG ÄOCÄGCCAGT TGGGCAGCAG GAG 33 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE IDENTIFICATION HUMBER: Ss 70 (i) SBQtJEKCS CHARACTERISTICS! (A) LENGTH} 630 (B) USB· amino acid

(C) STHAHDEDNESSI N/A

CD) TOPOLOOYs linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 5t

Met Ala Asp Ser Ala Aen His Leu Pro Phe Phe Phe Gly Hie lie Thr 1 5 10 15

Arg Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Leu Val Gin Gly Gly Met Ser Asp Gly 20 25 30

Leu Tyr Leu Leu Arg Gin Ser Arg Asn Tyr Leu Gly Gly Phe Ala Leu 35 40 45

Ser Val Ala Hie Gly Arg Lye Ala His Aen Tyr Thr lie Glu Arg Glu 50 55 60

Leu Aan Gly Thr Tyr Ala lie Ala Gly Gly Arg Thr Hie Ala Ser Pro 65 70 75 80

Ala Rep Leu Cys Aan Tyr Hie Ser Gin Glu Ser Aep Gly Leu Val Cy® 85 90 95

Leu Leu Lye Lye Pro Phe Asn Arg Pro Gin Gly Val Gin Pro Lye Thr 100 105 110

Gly Pro Phe Glu Asp Leu Lye Glu Asn Leu lie Arg Glu Tyr Val Lya 115 120 125

Gin Thr Met Asn Leu Gin Gly Gin Ala Leu Glu Gin Ala lie He Ser 130 135 140 ;i

Gin Lye Pro Gin Leu Glu Ly® Leu He Ala Thr Thr Ala Hi® Glu Lye 145 150 155 160

Het Pro Trp Phe Hie Gly Lye He Ser Arg Glu lie Ser Thr Gin lie

165 170 17S

Val Leu He Gly Ser Lye Thr Aen Gly Lya Phe Leu He Arg Ala Arg ISO 185 190

Asp Ae« Aan Gly Ser Tyr Ala Leu eye Leu Leu Hie He Gly Lye Val 195 200 205 *

Leu His Tyr Arg He Asp Lys Asp Lya Thr Sly Ly® Leu Ser Π® Pro 210 215 220

Glu Gly Ly® Lys Phe Asp Thr Leu Trp Gin Leu val Glu Hie Tyr Ser # 225 230 235 240

Tyr Ly® Ala Asp Gly Leu Leu Arg Val Leu Thr Val Pro Cys Gin Lya 245 250 255

He Gly Thr Gin Gly Asn Val Asn Phe Gly Gly Arg Pro Gin Leu Phe 260 265 270

Gly Ser Hie Pro Ala Thr Hi® Ser Ala Gly Gly lie He Ser Arg H® 275 280 285

Ly® Ser Tyr Ser ?h® Pro Lys Pro Gly Hi® Arg Lya Ser Ser Pro Ala 290 295 300

Gin Gly Aan Arg Gin Glu Ser Thr Val Ser Ph® Asn Phe Tyr Glu Pro 305 310 315 320

Glu Leu Ale Pro Hia Ala Ala Asp Lys Gly Pro Gin Arg lie Ala Leu 325 330 335

Pro Het Aep'Thr Glu Val Tyr Glu Ser Pro Tyr Ala Asp Pro Glu Glu 340 345 350 Π® Arg Pro Lye Glu Val Tyr Leu Asp Arg Lys Leu Leu Thr Leu Glu 355 360 365

Asp Ly® Glu Leu Gly Ser Gly Aen Phe Gly Thr Val Lye Ly® Gly Tyr 370 375 380

Tyr Gin Met Lye Ly® Val Val Lye Thr val Ala Val Lya He Leu Ly® 385 390 395 400

Asn Glu Ala Aen Aep Pro Ala Leu Ly® Asp Glu Leu Leu Ala Glu Ala 405 410 415

Asn Val Mat Gin Gin Leu Asp Asn Pro Tyr Ile Vai Arg Het II® Gly 420 425 430 71 tie Cye Glu Ala Glu Ser Trp Met Leu Val Met Glu Met Ala Glu Leu 435 440 445

Gly Pro Leu Αβά Lye Tyr Leu Gin Gin Aen Arg His Val Lys Leu Lys 450 455 460

Aen lie tie Glu Leu Val His Gin Val Ser Met Gly Met Lys Tyr Leu 465 470 475 4B0

Glu Glu Ser Aen Phe Val Hie Arg Aep Leu Ala Ala Arg Aen Val Leu 485 490 495

Leu Val Thr Gin His Tyr Ala Lys lie Ser Asp Phe Gly Leu ser Lye 500 505 510

Ala Leu Arg Ala Aep Glu Asn Tyr Tyr Lys Ala Gin Thr His Gly Lys 515 520 525

Trp Pro Val Lys Trp Tyr Ala Pro Glu Cys 11® Aen Tyr Tyr Lye Fh® 530 S3 5 540

Ser Ser Lys Set Asp Val Hie Ser Phe Gly Val Leu Met Asn Glu Ala 545 $50 555 560

Phe Ser Tyr Gly Gin Lye Phe Tyr Arg Gly Met Lys Gly Ser Glu Val 56S 570 575 lie Ala Met Leu Glu Lye Gly Glu Arg Met Gly Cye Pro Ala Gin Cye 580 585 590

Pro ATg Glu Met Tyr Aep Leu Met Aen Leu Cye Trp Thr Tyr Asp val 595 600 605

Glu Asn Arg Pro Gly Phe Ala Ala Val Glu Leu Arg Leu Arg Aen Tyr 610 615 620

Tyr Tyr Aep Val Val Asn 625 630 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE IDENTIFICATION NUMBERJ 6: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTHS .626 (B) TYPES amino acid (0) STSUUTOBSHESSi N/A , <P) TOPOLOGY! linear % (Si) SEQUENCE DESCRIPTION! SEQ ID Νθϊ 6.4 ^

Met Ala Asp Ser Ala Asn His Leu Pro Phe Phe Phe Gly Gin II® Thr 1 5 10 15

Arg Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Leu Val Gin Gly Gly Met Ser Asp Gly 20 25 30

Leu Tyr Leu Leu Arg Gin Ser Arg Asn Tyr Leu Gly Gly Phe Ala Leu 35 40 45 ser Val Ala Tyr Asp Arg Lys Ala His Hie Tyr Thr lie Glu Arg Glu 50 55 60

Leu Asn Gly Thr Tyr Ala lie Ser Gly Gly Arg Thr His Gly Ser Pro 65 70 75 80

Ala Glu Leu Cys His Tyr Hie Ser Gin Glu Leu Asp Gly Leu Val Cye 85 90 95

Leu Leu Lys Aan Pro PhS Aan Arg Pro Pro Gly Val Gin Pro Lys Thr 100 10$ no

Gly Pro Phe Glu Asp Leu Lys Glu Asn Leu XI® Arg Glu Tyr Val Lys US 120 125

Gin Thr His Asn Leu Gin Gly Gin Ala Leu Glu Gin Ala II® lie Ser 130 135 140

Gin Lys Pro Gin Leu Glu Lys Leu lie Ala Thr Thr Ala His Glu Lys 145 150 155 160

Met Pro Trp Ph® His Gly Lys II® Ser Arg Asp Glu Ser Glu Gin lie 16S 170 ITS

val Leu lie Gly ser Lys lie Asn Gly Lys Phe Leu He Arg Ala Arg 180 185 190 72

Asp Het Gly Ser Tyr Ala Leu Gly Leu Leu Hi® Ile Gly ly® Vai Leu

ItS 200 2OS

Hat Tyr Arg Ile Asp Lye Aap Ly® Thr Gly Ly® Leu Ser Ile Pro Gly 210 2IS 220

Gly Ly® Aan Ph® Asp Thr Leu Trp Gin L®u vai Glu Lys Tyr Ser Tyr 225 230 235 240

Lys Ser Aap Gly Leu Lau Arg Vai Leu Thr Vai Pro Cys Gin Ly® 11a 245 250 255

Gly Gly Gin Thr Gly Aan Asp Ser Phe Arg Pro Gin Leu Phe Ser Ala 260 265 270

His Ser Ala Thr Trp Ser Ala Gly Gly Ile Ile Ser Arg II® Lys ser 275 280 285

Tyr Ser Phe Pro Lys Pro Gly Hi® Arg Lys Ala Ser Ser Pro Gin Gly 2tO . 295 300

Aan Arg Pro Glu Ser Leu Vai Ser Tyr Asn Phe Tyr Glu Ser Asp Arg 305 310 315 320

Gly Ph® Trp Ala Asn Glu Arg Glu Ala Gin Arg Glu Ala Lau Pro Ket 325 330 335

Asp Thr Glu Vai Vai Glu Ser Pro Tyr Ala Aflp Pro Glu Glu Ile Arg 340 345 350

Pro Lys Glu Vai Tyr Leu Asp Arg Lys Leu Leu Thr Leu Glu Asp Lys 355 360 365

Glu Leu Gly Ser Gly Asn Phe Gly Thr Vai Lye Lys Gly Tyr Tyr Gin 370 375 380

Met Lys Lye Vai Vai Lys Thr Vai Ala Vai Lys Ile Leu Lye Asn Glu 385 390 3tS 400

Ala Asn Asp Pro Ala Leu Lys Asp Glu Leu Leu Ala Glu Ala Asti Vai ; 405 410 415

Ket Gin Gin Leu Asp Aan Pro Tyr Ile vai Arg Met II® Gly il® cys 420 425 430

Glu Ala Ser Ser Trp Ket Lau Vai Het Glu Met Ala Glu Leu Gly Pro 435 440 445

Leu Asn Lys Tyr Leu Gin Gin Asn Arg Hls Vai Lya Asp Lys Asn II® 450 455 460 * II® Glu Leu Vai His Gin Vai Ser Met Gly Het Ly® Tyr Leu Clu Glu 465 470 475 480 |

Cys Asn Pro Vai Hl® Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Vai Leu Leu Vai 485 480 495 *

Thr Gin His Tyr Ala Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ser Lye Ala Leu 500 505 510

Arg Ala Asp Glu Asn Tyr Tyr Lye Ala Gin Thr His Gly Lya Trp Pro 515 520 525

Vai Lys Trp Tyr Ala Pro Glu Cys Ile Asn Tyr Tyr Lys Phe ser s®r 530 535 540

Lv® Ser Asp Vai Asn Ser Phe Gly Vai Leu Ket Trp Glu Ala Ph® Ser 545 550 555 560

Tyr Gly Gin Lys Ph® Tyr Arg Gly Het Lys Gly Ser Glu Vai Ser Ala 565 570 575

Het Leu Glu Lys Gly Glu Arg Het Giy cys Phe Ph® Gly Cys Ph® Arg 580 585 590

Glu Het Tyr Glu Leu Aan Thr Leu Cys Asn Thr Tyr Asp Vai Glu Aan 595 · 600 605

Arg Pro Gly Phe Vai Ala Vai Glu Leu Arg Leu Arg Asn Tyr Tyr Tyr 610 615 620

Asp Vai Vai Aen 625 73 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE IDENTIFICATION NUMBERS 7i <i) sequence csumcrmisTxcst (A) LENGTH* 34 (B) TYPE! nucleic acid (C) STRANDEDHE3S! single <D) TOPOLOGY! linear (si) SEQUENCE DESCRIPTIONS SEQ ID NO: 7: ATGGCAGACÄ GTGCCAACCA CTTGCCCTTC TTCT 34 (2) INFORMATION FOR SEQUENCE IDENTIFICATION NUMBER! 8» (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS! (A) LENGTH! 39 (B) TYPES nucleic acid (C) STRANDEDNESSi single (D) TOPOLOGY! linear (si) SEQUENCE DESCRIPTION! SEQ ID NO! i:’ CGCGGGGCGG CCGCTTTAÄT TCACCACGTC GTAGTAGTA 39 :-¾ ! ; : t

Claims (16)

1. 74
2. 1. Menetelmä solun valmistamiseksi, joka solu ilmentää rnembraaniin sitoutunutta proteiinipitoista kimeeris- 5 tä reseptoria, tunnettu siitä, että se transformoidaan dna:1la, joka koodaa (a) proteiini-tyrosiinikinaasin intra-sellulaarista osaa, ja joka kykenee antamaan mainitulle solulle signaalin reseptoriin sitoutuneen kohdesolun tai reseptoriin sitoutuneen iufektoivan agenssin tuhoamiseksi ja 10 (b) ektrasellulaärista osaa, joka kykenee spesifisesti tun nistamaan mainitun kohdesolun tai mainitun infektoivan agenssin ja sitoutumaan näihin, minkä seurauksena kukin mainituista soluista kykenee spesifisesti tunnistamaan mainitun kohdesolun tai kohteena olevan infektoivan agenssin 15 ja tuhoamaan sen.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu proteiini-tyrosiinikinaasi kuuluu Syk-kinaäsien ryhmään.
4. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tun- * 'Si 2. nettu siitä, että mainittu proteiini-tyrosiinikinaasi on Svk. *' 4. .Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tun-n e t t u siitä, että mainittu intrasellulaarinen osa sisältää sian Syk: n aminohapot 33 6 - 628 tai humaani - Syk: n ami- 25 nohapot 338 - 630.
5. 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kukin mainituista soluista ilmentää toista membraaniin sitoutunutta proteiinipitoista kimeeris-tä reseptoria ja mainittu toinen kimeerinen reseptori si- 30 sältää (a) proteiini-1yro s i inikinaas in intrasellulaarisen osan, joka kykenee ätitamaah mainitulle solulle signaalin reseptoriin sitoutuneen kohdesolun tai reseptoriin sitoutuneen infektoivan agenssin tuhoamiseksi ja <b) ektrasellu-1 aari sen', osan, joka kykenee spesifisesti tunnistamaan mai-35 nitun kohdesolun tai mainitun infektoivan agenssin ja sitoutumaan näihin, minkä seurauksena kukin mainituista so- 75 luista kykenee spesifisesti tunnistamaan mainitun kohde-solun tai kohteena olevan infektoivan agenssin ja tuhoamaan sen., 6., Patenttivaatimuksen 5 mukainen .menetelmä, tun-5 nettu siitä, että toinen mainituista proteiini-tyrosiini- kinaaseista kuuluu Syk-kinaasien ryhmään, ja toinen mainituista proteiini-tyrosiinikinaaseista kuuluu Src-kinaasien ryhmään..
6. 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä,, t u n - 10 nettu siitä, että toinen mainituista proteiini-tyrosiinikinaaseista on ZAP-70 ja toinen mainituista proteiini-tyro-siinikinaaseista on Fyn.
7. 8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toinen, mainituista proteiini-tyrosiini-
8. 15 Mnaaseista on ZAP-70 ja toinen mainituista proteiini-tyro- i siinikinaaseista on Lck.
9. 9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen; menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu ZftP-70 sisältää humaani-SÄP“70:n Tyr 369in.
10. 10. Patenttivaatimuksen 1 tai 5 mukainen menetelmä, # tunnettu siitä, että mainitut solut ovat (a) T-lymfo- * syyttejä,; (b) sytotoksisia T-lymfosyyttejä; (c) luonnollisia tappajasoluja? (dj neutroMilejä, (e) granulosyyttejä? (f) makrofageja? (g) syöttösoluja; (h) HeLa-soluja. 25 11, Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että mainittu kohteena oleva infektoiva agenssi on irranuunikatovirus.
11. 12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu ekstrasellulaarinen osa käsit- 30 tää GD4:n HIV:n vaippaan sitoutuvan osan. 13., Patenttivaatimuksen 1 tai patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu sitoutuminen tapahtuu MHC:stä riippumattomasti. 76
12. 14. Patenttivaatimuksen 1 tai patenttivaatimuksen 5 mukainen irienetelmä, tunnettu siitä, että mainittu ekst-rasellulaarinen osa sisältää reseptorin ligandiin sitoutuvan osan, ligandin reseptoriin sitoutuvan osan, vasta- 5 aineen antigeeniin sitoutuvan osan tai näiden jonkin funktionaalisen johdannaisen,
13. 15, DNA, tunnettu siitä, että se koodaa patenttivaatimuksessa 1 tai patenttivaatimuksessa 5 määriteltyä kimeeristä reseptoria.
14. 16. Vektori, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 1 tai patenttivaatimuksen 5 mukaisessa menetelmässä määritellyn kimeerisen reseptorin, Ϊ; 77