HU224137B1 - Kiméra-receptorokat kódoló DNS-molekulák, a DNS-molekulákat hordozó vektorok és a DNS-molekulákat expresszáló sejtek - Google Patents

Abstract

A találmány tárgyát funkcionális protein-tirozin kináz kimérákatexpresszáló sejtek képezik, melyek képesek specifikus célsejtekhez ésfertőző ágensekhez kötődni és azokat elpusztítani. A találmány tárgyátképezik a találmány szerinti sejtek által expresszáltkimérareceptorokat kódoló DNS-molekulák és az azokat hordozó vektorokis. A találmány szerinti sejtek olyan kimérareceptorokatexpresszálnak, melyek a következő részleteket tartalmazzák: (a) egyprotein-tirozin kináz intracelluláris részét, amely képes a sejtszámára olyan jelzést közvetíteni, amely azt egy receptorhoz kötődöttcélsejt vagy receptorhoz kötődött, célzott fertőző ágenselpusztítására készteti, valamint (b) egy extracelluláris részt, amelyképes a célsejtet vagy a célzott fertőző ágenst specifikusanfelismerni és ahhoz kötődni.

Description

A találmány tárgyát funkcionális protein-tirozin kináz kimérákat expresszáló sejtek képezik, melyek képesek specifikus célsejtekhez és fertőző ágensekhez kötődni és azokat elpusztítani. A találmány tárgyát képezik a találmány szerinti sejtek által expresszált kimérareceptorokat kódoló DNS-molekulák és az azokat hordozó vektorok is.

A találmány szerinti megoldás alkalmas különböző betegségek, például az AIDS (.Acquired Immunodeficiency Syndrome”, szerzett immunhiányos szindróma) kezelésére, melyet a HIV-vírus okoz.

A találmány tárgyát tehát funkcionális protein-tirozin kináz kimérákat expresszáló sejtek képezik, mely kimérák képesek immunrendszeri funkciók irányának módosítására. Közelebbről, a találmány tárgyát limfociták, makrofágok, természetes ölősejtek (,,killer”-sejtek) vagy granulociták szabályozása képezi az említett sejtekben kimérák expresszálásán keresztül, melyek a sejtekben a kimérák által felismert célsejttel szemben válaszreakciót váltanak ki. A találmány tárgyát képezik továbbá funkcionális protein-tirozin kináz kimérák, melyek képesek terápiás sejteket úgy irányítani, hogy azok specifikus módon felismerjenek és elpusztítsanak adott fertőző ágenssel fertőzött sejteket, magát a fertőző ágenst, tumorsejteket vagy olyan sejteket, melyekben autoimmun folyamatok indultak meg.

Közelebbről, a találmány tárgyát olyan protein-tirozin kináz kimérák előállítása képezi, amelyek képesek citotoxikus T-limfocitákat HIV-burokproteineket expresszáló sejtek specifikus felismerésére és lizálására késztetni.

Antigének T-sejtek által történő felismerése T-sejtreceptoron keresztül immunológiai jelenségek széles skálájának alapját képezi. A T-sejtek irányítják az úgynevezett sejt által közvetített immunitást. Ez magában foglalja idegen szöveteknek vagy fertőzött sejteknek az immunrendszer sejtjei által történő elpusztítását. Különböző T-sejtek ismertek, ezen belül „helper”- és „szuppresszor”-sejtek, amelyek az immunválasz szabályozásában játszanak szerepet, valamint citotoxikus („killer”-) sejtek, amelyek közvetlenül képesek rendellenes sejtek elpusztítására.

Egy T-sejt, amelyik képes egy másik sejt felszínén bemutatott egyedi antigén felismerésére és ahhoz történő kötődésre, aktiválódik, majd osztódik, és amennyiben az citotoxikus sejt, képes a kötődött sejt elpusztítására.

Autoimmun betegségek létrejöttét gazdaszövettel reagálni képes ellenanyagok termelődése vagy autoreaktív immuneffektor T-sejtek jelenléte jellemzi. Egyes esetekben autoellenanyagok keletkezhetnek olyan idegen anyagok vagy organizmusok által aktivált, normális T-sejtes, valamint B-sejtes válaszon keresztül, amelyek a gazdaszervezet szövetében található, hasonló vegyületekkel keresztreagáló antigéneket tartalmaznak. Klinikai szempontból jelentős autoellenanyagok például myasthenia gravis esetében az acetil-kolin-receptorokkal szemben termelődő ellenanyagok; valamint a szisztémás lupus erythematosus esetében kimutatható anti-DNS-, antieritrocita- és antivérlemezke-eltenanyagok.

A HÍV és immunpatogenezise

1984-ben kimutatták, hogy az AIDS kórokozója HIV-vírus. Azóta az AIDS definíciója többször változott, arra vonatkozólag, hogy a diagnózisnak milyen ismérveken kell alapulnia. A diagnosztikai paraméterek változékonyságának ellenére azonban az AIDS egyszerű általános jellemzője a HIV-vírussal történő fertőződés és azt követően állandó szervi tünetek és az AIDS-tünetegyüttest meghatározó betegségek kifejlődése, úgymint másodlagos fertőzések, neoplazmák és idegrendszeri betegségek jelentkezése [„Harrison’s Principles of Internál Medicine”, 12. kiadás, „McGraw Hill” (1991)].

A HÍV a lentivírusok csoportjába tartozó humán retrovírus. Az eddig felismert négy humán retrovírus két, egymástól elkülöníthető csoportba osztható: a humán T-limfotróp (vagy leukémia-) retrovírusok közé tartoznak a HTLV-1 és a HTLV-2, a humán immundeficiencia-vírusok közé tartoznak a HIV-1- és a HIV-2-vírusok. Az előbbiek transzformációt előidéző vírusok, míg az utóbbiak citopatogén vírusok.

A HIV-1-vírust a világon az AIDS leggyakoribb okozójaként azonosították. A HIV-2 és HIV-1 között kimutatható szekvenciaazonosság körülbelül 40%, és a HIV-2 közelebbi rokonságban áll a majom immundeficiencia-vírusok (SIV) csoportjának egyes tagjaival [lásd Curran J. és munkatársai: Science 329, 1357 (1985); Weiss R. és munkatársai: Natúré 324, 572 (1986)].

A HÍV tartalmazza a szokásos retrovírusgéneket (env, gag és pol), ezenkívül hat olyan gént, amelyek a vírus replikációjában és egyéb biológiai aktivitásaiban játszanak szerepet. Amint azt a fentiekben megállapítottuk, az AIDS szokásos ismérve súlyos immunszuppresszió, elsősorban a sejt által közvetített immunitás szuppressziója. Ez az immunszuppresszió különböző opportunista betegségekhez vezet, közelebbről, bizonyos fertőzések és neoplazmák kialakulásához vezet.

Megállapították, hogy az immunhiány fő oka AIDSben a tímuszeredetű (T) limfociták alcsoportjának, a T4-populációnak mennyiségi és minőségi elégtelensége. Ezt a sejtalcsoportot fenotípusosan a sejtfelszínen CD4-molekulák jelenléte jellemzi, melyről kimutatták, hogy a HÍV sejtreceptora [Dalgleish és munkatársai: Natúré 312, 763 (1984)]. Bár a T4-sejtek képviselik a HÍV által elsősorban fertőzött sejttípust, lényegében bármely, a felszínén CD4-molekulát expresszáló humán sejt képes HIV-hez történő kötődésre és azzal történő fertőződésre.

Hagyományosan, CD4-T-sejteknek segítő/indukáló („helper/inducer”) szerepet tulajdonítanak, utalva arra, hogy funkciójuk a B-sejtek számára aktiválószignál közvetítése, vagy a reciprok, CD8-markerrel rendelkező T-limfociták indukálása citotoxikus/szuppresszor sejtekké történő átalakulásra [Reinherz és Schlossman: Cell. 19, 821 (1980); Goldstein és munkatársai: Immunoi. Rév. 68, 5 (1982)].

A HÍV a vírusburokban található aminosavszakaszon keresztül (gp120) specifikusan és nagy affinitással kötődik a CD4-molekula N-terminális végének közelében található V1-régió részletéhez. A kötődést kö2

HU 224 137 Β1 vetően a vírus a célsejt membránjával fuzionálódik és a sejtbe jut. Miután a sejtbe került, a vírus genomi RNS-e reverz transzkriptáz enzim segítségével DNS-sé íródik át, amely beépül a sejt DNS-ébe, ahol az a sejt további élete során „provírusként” van jelen.

A provírus maradhat látens állapotban, vagy aktiválódhat, ezáltal mRNS-sé és genomi RNS-sé íródhat át, ez pedig proteinszintézishez, összeépüléshez, új virionok keletkezéséhez és a sejtfelszínen át vírusok kiszabadulásához vezethet. Bár annak a mechanizmusnak a részletei még nem ismertek, amelyen keresztül a vírus a sejt pusztulását okozza, feltehető, hogy a fő mechanizmus a sejtfelszínen át történő tömeges vírusfelszabadulás, amely a plazmamembrán károsodásához és az ozmotikus egyensúly felborulásához vezet.

A fertőzés folyamán a gazdaszervezetben ellenanyagok termelődnek a vírusproteinekkel szemben, például a gp120 és gp41 elnevezésű, fő burokglikoproteinekkel szemben. A humorális immunitás ellenére a betegség előrehalad, halálos kimenetelű immunszuppressziót eredményezve, melyet opportunista fertőzések sokasága, parazitémia, dementia és halál jellemeznek. Az a tény, hogy a gazdaszervezet vírusellenes ellenanyagai nem képesek megakadályozni a betegség előrehaladását, jelenti a betegség legnyugtalanítóbb és legriasztóbb sajátságainak egyikét, és nem sok sikert jósol a szokásos eljárásokon alapuló vakcinázási próbálkozásoknak.

Az immundeficiencia-vírusokkal szemben létrejövő humorális válasz hatékonyságának meghatározásában két faktor játszhat szerepet. Először, más RNS-vírusokhoz hasonlóan (és különösen retrovírusokhoz hasonlóan), az immundeficiencia-vírusok magas mutációs aránnyal válaszolnak a gazdaszervezet immunrendszerének ellenőrzésére. Másodszor, a burokglikoproteinek nagymértékben glikozilezett molekulák, amelyek nagy affinitású ellenanyag-kötődés számára kevés alkalmas epitópot mutatnak fel. A vírusburok által képviselt gyenge antigénhatású célpont a gazdaszervezet számára kevés lehetőséget teremt a vírusfertőzés specifikus ellenanyagok termelődésével történő visszaszorítására.

A HIV-vírussal fertőzött sejtek felszínükön expresszálják a gp120-glikoproteint. A gp120-burokprotein, hasonló reakción keresztül, mely révén a vírus a nem fertőzött sejtekbe bejut, fúzió létrejöttét közvetíti a CD4⁺-sejtek közt, rövid életű, többmagvú óriássejtek keletkezéséhez vezetve. A szincíciumképződés a gp120 elnevezésű burokglikoproteinnek a CD4-proteinnel történő közvetlen kölcsönhatásán alapul [Dalgleish és munkatársai: lásd fent; Klatzman D. és munkatársai: Natúré 312, 763 (1984); McDougal J. S. és munkatársai: Science 231, 382 (1986); Sodorski J. és munkatársai: Natúré 322, 470 (1986); Lifson J. D. és munkatársai: Natúré 323, 725 (1986); Sodorski J. és munkatársai: Natúré 321, 412 (1986)].

A bizonyítékok között, melyek szerint a CD4-gp120 kötődés felelős a CD4-antigént hordozó sejtek vírussal történő fertőződéséért, megemlítendő az a tény, hogy a gp120 és CD4 specifikus komplexet képez [McDougal és munkatársai: lásd fent]. Más kutatók kimutatták, hogy HIV-vírussal nem fertőzhető sejtvonalak fertőzhető sejtvonalakká váltak azt követően, hogy azokat humán CD4-cDNS-génnel transzfektálták, és azokban a gén expresszálódott [Maddon és munkatársai: Cell. 46, 333(1986)].

Számos kutatócsoport olyan terápiás programok kidolgozását javasolta, és azok alkalmazását in vitro sikeresen szemléltette, amelyek passzív ágensként, oldható CD4 alkalmazásán alapulnak a vírusadszorpció gátlására és a szincícium által közvetített, sejtről sejtre történő vírusátvitel megakadályozására [Deen és munkatársai: Natúré 331, 82 (1988); Fisherés munkatársai: Natúré 331, 76 (1988); Hussey és munkatársai: Natúré 331, 78 (1988); Smith és munkatársai: Science 238, 1074 (1997); Traunecker és munkatársai: Natúré 331, 84 (1988)], ezt követően elnyújtott felezési idővel és mérsékelt biológiai aktivitással rendelkező CD4-immunglobulin fúziós proteinek kifejlesztésére is sor került [Capon és munkatársai: Natúré 337, 525 (1989); Traunecker és munkatársai: Natúré 339, 68 (1989); Byrn és munkatársai: Natúré 344, 667 (1990); Zettlmeissl és munkatársai: DNA Cell. Bioi. 9, 347 (1990)]. Bár a CD4-immunotoxin-konjugátumok vagy fúziós proteinek in vitro jelentős citotoxikus hatást mutatnak a fertőzött sejtekkel szemben [Chaudhary és munkatársai: Natúré 335, 369 (1988); Till és munkatársai: Science 242, 1166 (1988)], az immundeficiencia-szindróma kialakulásának látenciaideje valószerűtlenné teszi, hogy bármely egyszeri kezelésből álló terápia hatékony lenne a vírusterhelés megszüntetésére, ezenkívül az idegen fúziós proteinek antigenitása valószínűleg korlátozza azok alkalmazhatóságát olyan kezelésekben, melyek ismételt adagolást tesznek szükségessé. SIV-vírussal fertőzött majmokon végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy oldható CD4, olyan állatoknak beadva, melyek nem szenvednek jelentős CD4-citopéniában, képes a SIV-titer csökkentésére és a mieloid funkciók in vitro fokmérőiként használt eredmények javítására [Watanabe és munkatársai: Natúré 337, 267 (1989)]. A kezelés megszakítását követően azonban megfigyelhető volt a vírus azonnali újbóli megjelenése, ami azt jelenti, hogy az immunrendszer előrehaladó legyöngülésének megelőzése érdekében a kezelésre az egész élet során szükség lehet.

Sejtfelszíni receptorral kapcsolódó protein-tirozin kinázok

Az immunrendszerben sejtek közreműködését igénylő effektorprogramok megindítására az első lökést gyakran csoportosult ligandumok sejtek által történő felismerése jelenti. Az ismereteink szerint aggregáció révén, aktivációt kiváltó szignálokat közvetítő receptorok közé tartoznak a B-sejt és T-sejt antigénreceptorok [DeFranco: Eur. J. Biochem. 210, 381 (1992); Weiss: Annu. Rév. Génét. 25, 487 (1991)], az IgG és IgE Fc-receptorcsaládok tagjai [Fanger és munkatársai: Immunoi. Today 10, 92 (1989)], ezenkívül számos járulékos receptor, például a T-sejteken található CD2-, CD4-, CD8- és CD28-receptorok [Yokoyama és Shevach: Year Immunoi. 4, 110 (1989)] és a B-sejten talál3

HU 224 137 Β1 ható CD19-, CD20-, CD21- és CD40-receptorok [Clark és Ledbetter: Adv. Cancer Rés. 52, 81 (1989)], valamint monocitákon található CD44-, CD45- és CD58-receptorok [Webb és munkatársai: Science 249, 1295 (1990)]. Ezenkívül, számos foszfolipiddel kapcsolódó protein antigénreceptor-függő módon elősegíti a sejtaktiválást, amennyiben T-sejtek felszínén keresztkötésekkel kapcsolódnak [Balk és Terhorst: Immunoi. Ser. 45, 411 (1989); Kroczek és munkatársai: Natúré 322, 181 (1986); Yeh és munkatársai: J. Immunoi. 138, 91 (1987); Yokoyama és Shevach: Year Immunoi. 4, 110 (1989)].

Ma még nem világos, miként tud egy egyszerű fizikai esemény, nevezetesen az aggregáció, nyilvánvalóan megkülönböztethető fiziológiai jelet létrehozni. A T-sejt és B-sejt antigénreceptorok és különböző Fc-receptorformák által közvetített sejteffektorprogramok beindításának folyamatát utánozhatjuk az egyes receptorkomplexláncok intracelluláris doménjaival rendelkező kiméraproteinek közti keresztkötések létrehozásával [Irving és Weiss: Cell. 64, 891 (1991); Kolanus és munkatársai: EMBO J. 11, 4861 (1992); Letoumer és Klausner: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8905 (1991); Letoumer és Klausner: Science 255, 79 (1992); Romeo és Seed: Cell. 64, 1037 (1991); Wegener és munkatársai: Cell. 68, 83 (1992)]. A legkisebb, még hatékony, aktivációt kiváltó elem úgy tűnik, 10-11 aminosavval elválasztott és hidrofil, tipikusan savas környezetbe ágyazott két tirozint tartalmazó, filogenetikailag konzervált peptidszekvencia [Reth: Natúré 338, 383 (1989)] [Romeo és munkatársai: Cell. 68, 889 (1992); Irving és munkatársai: J. Exp. Med. 177, 1093 (1993)]. A fenti elemet tartalmazó receptorok csoportosulása aktivációs láncreakciót indít meg, melyben a tirozinkináz-protein (PTK) aktivitása alapvető fontosságúnak tűnik; a PTK-inhibitorok mind a B-sejt- és T-sejt-aktiválásban szerepet játszó korai eseményeket, például a kalciummobilizációt, mind a citokinfelszabadulással és sejtproliferációval járó késői következményeket megakadályozzák [June és munkatársai: J. Immunoi. 144, 1591 (1990); Lane és munkatársai: J. Immunoi. 146, 715 (1991); Mustelin és munkatársai: Science 247, 1584 (1990); Stanley és munkatársai: J. Immunoi. 145, 2189 (1990)]. Bár a receptoraktiválás távolabbi következményei sejttípustól függően változnak, a korai események meglepően hasonlóak a különböző hematopoetikus (vérképző rendszeri) sejtvonalakhoz tartozó sejtek esetében. Például a B-sejt antigénreceptorok [Gold és munkatársai: Natúré 345, 810 (1990); Campbell és Sefton: EMBO J: 9, 2125 (1990)], a T-sejt antigénreceptorok [June C. H. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 7722 (1990); June C. H. és munkatársai; J. Immunoi. 144, 1591 (1990)] és a nagy affinitású IgE-receptorok [Eisman és Bólén: Natúré 355, 78 (1992); Li és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 12, 3176 (1992)] közti keresztkötések kialakulását követően megfigyelhető gyors PTK-aktivitás-növekedésben, valamennyi esetben a korai foszforilezési célpontok között szerepel a foszfotidilinozitolspecifikus foszfolipáz-C gizoformja [Carter és munkatársai; Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 88, 2745 (1991); Li és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 12, 3176 (1992); Park és munkatársai: J. Bioi. Chem. 266, 24 237 (1991); Park és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5453 (1991); Secrist és munkatársai: J. Bioi. Chem. 266, 12 135 (1991); Weiss és munkatársai: Annu. Rév. Génét. 25, 487 (1991)], amely közvetlenül tirozin-foszforilezés révén aktiválódik [Nishibe és munkatársai: Science 250, 1253 (1990)].

Ismereteink szerint a sejtfelszíni receptorokkal kapcsolatos, PTK-aktivitású molekulák két csoportba oszthatók: a protoonkogénnel rokonságot mutató Src-kinázok családjába és a nemrégiben leírt Syk-kinázzal rokonságot mutató csoportba. Az előbbiek közül a Fyn-kinázról kimutatták, hogy a T-sejt-receptorral kapcsolódik [Gassmann és munkatársai: Eur. J. Immunoi. 22, 283 (1992); Samelson és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4358 (1990)], a Lyn-, Fyn-, Blk- és Lck-kinázokról leírták, hogy a B-sejt IgM-receptorral kapcsolódnak [Burkhardt és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7410 (1991); Campbell és Sefton: Mól. Cell. Bioi. 12, 2315 (1992); Yamanashi és munkatársai: Science 251, 192 (1991)], és a Lyn-, valamint Yes-kinázokról kimutatták, hogy nagy affinitású IgE-receptorral kapcsolódnak [Eiseman és Bólén: Natúré 355, 78 (1992); Hutchcroft és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9107 (1992); Hutchcroft és munkatársai: J. Bioi. Chem. 267, 8613 (1992)]. A megfigyelt kapcsolódás mechanizmusának részletei még nem tisztázottak, de előzetes adatok arra utalnak, hogy a receptorkomplexláncok intracelluláris doménja és az Src-családba tartozó kinázok között fizikai kapcsolat jön létre [Clark és munkatársai: Science 258, 123 (1992); Timson Gauen és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 12, 5438 (1992)]. Még nem világos, hogy ez a kapcsolat közvetlen vagy közvetett.

Az Src-családba tartozó kinázok sejtaktiválásban betöltött fontos szerepére vonatkozólag, eddig a legmeggyőzőbb bizonyítékot a T-sejtekben található Fynés Lck-kinázok vizsgálata szolgáltatta. A Fyn-kináz nagy mennyiségben történő expresszálása transzgenikus egerekben antigénhiperszenzitív fenotípust eredményez a keletkező T-sejtekben, míg a katalitikusán inaktív forma nagy mennyiségben történő expresszálódása gátolja a T-sejt-receptor által közvetített proliferációt [Cooke és munkatársai: Cell. 65, 281 (1991)]. Fyn-kináz-aktivitással nem rendelkező mutáns egerekből izolált, tímuszeredetű T-sejtek azon képessége súlyosan károsodott, hogy forbolészter, valamint anti-CD3-ellenanyag vagy konkavalin-A kombinációjával történő kezelés hatására proliferációval válaszoljanak [Appleby és munkatársai: Cell. 70, 751 (1992); Stein és munkatársai: Cell. 70, 741 (1992)]. Ilyen egerekből izolált, léperedetű T-sejtek kevésbé súlyos, de jelentős mértékben gyengült sejtaktivációs választ mutatnak [Appleby és munkatársai: Cell. 70, 751 (1992); Stein és munkatársai: Cell. 70, 741 (1992)].

T-sejtekben az Lck-kináz a CD4- és CD8-koreceptorokon keresztül, közvetett módon kapcsolódik a T-sejt-receptorral (TCR-rel) [Rudd és munkatársai:

HU 224 137 Β1

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5190 (1988); Shaw és munkatársai: Cell. 59, 627 (1989); Turner és munkatársai; Cell. 60, 755 (1990); Veillette és munkatársai: Cell. 55, 301 (1988)]. Az Lck-kináz nagy mennyiségben történő expresszálása antigén-válaszreakcióra képes sejtvonalban, a Fyn-kináz esetében megfigyeltekhez hasonló módon, fokozza a receptorérzékenységet [Abraham és Viliette: Mól. Cell. Bioi. 10, 5197 (1990); Davidson és munkatársai: J. Exp. Med. 175, 1483 (1992); Luo és Sefton: Mól. Cell. Bioi. 12, 4724 (1992)]. Egy CD4-dependens, egér T-sejtes hibridómamodellben az antigénspecifikus „helper”-funkció helyreállítása csak CD4-molekulákkal volt elérhető, melyek képesek voltak Lck-kinázzal kölcsönhatásba lépni [Glaichenhaus és munkatársai: Cell. 64, 511 (1991)].

A legmeggyőzőbb bizonyíték arra vonatkozólag, hogy az Lck-kináz közvetlenül részt vesz az antigénreceptor által közvetített szignál átadásában, Lck-kinázt nem tartalmazó, mutáns sejtvonalak vizsgálatából származik. Két ilyen sejtvonalat tanulmányoztak, az egyik a Jurkat-féle humán T-sejtes leukémia-sejtvonalból [Goldsmith és Weiss: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6879 (1987); Straus és Weiss: Cell. 70, 585 (1992)], a másik a CTLL2 jelzésű, egér citotoxikus T-sejt-klónból származott [Kamitz és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 12, 4521 (1992)]. Mindkét Lck-negatív, mutáns sejtvonalban károsodott a TCR által közvetített jelátadás, és mindkét mutáns sejtvonalban Lck-expresszáló plazmiddal végzett transzfekcióval történő komplementációval helyreállítható a TCR-keresztkötések által jelentett stimulusra létrejövő válaszkészség [Kamitz és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 12, 4521 (1992); Straus és Weiss: Cell. 70, 585 (1992)].

Nemrégiben, a tirozinkinázok új családjának tagjairól mutatták ki, mely család első képviselői az egymással közeli rokonságban álló vagy egymással azonos Syk-kináz [Taniguchi és munkatársai: J. Bioi. Chem. 266, 15 790 (1991)] és ΡΤΚ-72-kináz [Zionochek és munkatársai: J. Bioi. Chem. 261, 15 637 (1986); Zionochek és munkatársai: J. Bioi. Chem. 263, 19 195 (1988)] voltak, hogy sejtfelszíni receptorokkal kapcsolódnak. Bár a PTK-72- és Syk-kináz azonosságát nem bizonyitották egyértelműen, azok szöveti megoszlása (tímusz, lép), molekulatömege és proteolízissel szemben mutatott labilitása megegyezik. A ΡΤΚ-72-kinázról kimutatták, hogy a B-sejt IgM-receptorral kapcsolódik [Hutchroft és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9107 (1992); Hutchroft J. E. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 267, 8613 (1992)], valamint azt, hogy a receptor és anti-lgM között történő keresztkötések kialakulása révén foszforileződik [Hutchroft és munkatársai: J. Bioi. Chem. 266, 14 846 (1991)]. Felszíni IgM-ek közti keresztkötések kialakulását követően kimutatták az enzim ezzel együtt járó aktiválódását, amely mind autofoszforileződés, mind exogén proteinfragmensek foszforilezése alapján mérhető volt [Hutchroft és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9107 (1992); Hutchroft J. E. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 267, 8613 (1992)]. A ΡΤΚ-72-kináz szintén a nagy affinitású IgE-receptorokhoz kapcsolódik patkány bazofil leukémia-sejtvonalban [Hutchroft és munkatársai: Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 89, 9107 (1992); Hutchroft J. E. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 267, 8613 (1992)].

A Syk-kinázok családjának második tagja a ΖΑΡ-70-kináz, melyről kimutatták, hogy receptor-keresztkötések kialakulását követően a T-sejt-receptor zéta-láncával kapcsolódó PTK [Chan és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9166 (1991)]. Bár a ZAP-70-, Fyn- vagy Lck-kinázok expresszálódása COS-sejtekben a tirozin-foszfát-összmennyiséget csak mérsékelten növeli, a ZAP-70, valamint az Lek- vagy a Fyn-kináz együttes expresszálódása a tirozin-foszforileződés drasztikus emelkedéséhez vezet [Chan és munkatársai: Cell. 71, 649 (1992)]. Amennyiben CD8-zéta-lánc kimérák is jelen vannak, a kiméra foszforileződik, és a ΖΑΡ-70-kináz ahhoz kapcsolódva található [Chan és munkatársai: Cell. 71, 649 (1992)]. Jelenleg nem világos, hogy vajon a ZAP-70 aktiválja-e az Src-családba tartozó kinázokat és/vagy fordítva, valamint az sem, hogy kinázok együttes expresszálódása COS-sejtekben miért vezet látszólag folyamatosan aktivált állapothoz. Mindazonáltal, a ΖΑΡ-70-kináz aktív kapcsolódása a keresztkötésekkel összekapcsolódott TCR-receptorokkal arra utal, hogy ez a PTK szerepet játszik a receptoron keresztül végbemenő jelátvitelben.

Az Scr-családba tartozó kinázoktól eltérően, a Sykés a ΖΑΡ-70-kinázok két SH2-doménnal rendelkeznek, és nem rendelkeznek N-terminális mirisztilezési hellyel [Taniguchi és munkatársai: J. Bioi. Chem. 266, 15 790 (1991); Chan és munkatársai: Cell. 71, 649 (1992)]. A kinázreceptor-kapcsolódás mechanizmusának természetes módja az lenne, ha a két SH2-domén az antigénreceptor aktiválóelemének két tirozinjához kötődne, miután azok foszforileződtek. Jelenleg azonban ez csupán feltevés.

Az alábbiakban összefoglaljuk a találmány szerinti megoldást.

A találmány szerinti megoldás olyan kimérák alkalmazhatóságát szemlélteti, amelyekben protein-tirozin kinéz molekulák intracelluláris doménjai, valamint olyan extracelluláris dómén közt jön létre kiméra, amely képes a célfelismerés feladatának végrehajtására. Közelebbről, Syk- vagy ΖΑΡ-70-kináz-szekvenciákat hordozó kimérák csoportosulása kalciummobilizációt vált ki. Csupán Syk-kimérák aggregációja, vagy Fyn- vagy Lek-, valamint ΖΑΡ-70-kinázok együttes aggregációja elegendő citolitikus effektorfunkciók beindításához. Ilyen effektorfunkciók elősegítik nemkívánatos célsejtek, például kórokozók, kórokozóval fertőzött sejtek, tumorsejtek vagy autoimmun sejtek felismerését és elpusztítását.

Számtalan, a találmány szerinti megoldásban alkalmazható kiméramolekula előállítható. Például olyan kimérák előállítása, melyekben protein-tirozin kinéz intracelluláris része egy géntechnológiai úton, megfelelőképp módosított ellenanyag-molekula extracelluláris részével kapcsolódik, lehetővé teszi, hogy az immunrendszer sejtjének célfelismerési képessége ezután specifikusan az extracelluláris ellenanyagrészlet által felismert antigénre irányuljon. Az immunrendszer kimé5

HU 224 137 Β1 rával felfegyverzett sejtjei a kórokozó felszínén valamely determináns felismerésére képes ellenanyagrészlet révén a kórokozó jelenlétére eredetüknek megfelelő effektorprogrammal válaszolnak, például „helper” T-limfociták a célzott sejttel szemben létrejövő citotoxikus aktivitással válaszolnak, B-limfociták aktiválódnak, majd ellenanyagokat termelnek. Makrofágok és granulociták saját effektorprogramjukat hajtják végre, amely citokinkibocsátást, fagocitózist és reaktív oxigén képzését foglalja magában. Hasonlóképp, tumorsejtek felismerésére képes ellenanyagrészlet esetében az immunrendszer válasza a tumorra előnyösen fokozódik. Saját determinánsokkal szembeni rendellenes reaktivitással rendelkező immunsejtek felismerésére képes ellenanyag esetében az autoreaktiv sejtek szelektív módon kiválaszthatók és elpusztíthatok.

Bár a fentiekben a találmány szerinti megoldást az egyszerűség kedvéért ellenanyag-kimérák alkalmazásán keresztül szemléltettük, a találmány nem korlátozódik ellenanyag-kimérák alkalmazására, és valójában specifikus, nem ellenanyag természetű doménok alkalmazása jelentős előnyökkel járhat. Például olyan extracelluláris részlet esetében, amely egy vírus, baktérium vagy parazita receptorát képezi, a kimérákkal felfegyverzett sejtek specifikusan a vírus-, baktérium- vagy parazitadeterminánsokat expresszáló sejteket fogják megcélozni. Ennek a megoldásnak az ellenanyagok alkalmazásához képest az az előnye, hogy egy kórokozó natív receptora egyedülállóan magas szelektivitással vagy affinitással rendelkezhet, ami a létrejövő immunválasz sokkal pontosabb irányítását teszi lehetővé. Hasonlóképp, rendellenes módon saját antigénekkel reagáló immunrendszeri sejtek eltávolítására elegendő lehet az antigén (B-sejtek eltávolítását célzó terápia esetében intakt proteinként, vagy T-sejtek eltávolítását célzó terápia esetében MHC-komplexként történő) összekapcsolása intracelluláris protein-tirozin kinéz láncokkal, ezáltal elérhetjük a saját determinánsokra rendellenesen válaszoló sejtek specifikus, célzott elpusztítását.

A kimérák alkalmazásának másik területe sejtpopulációk in vivő szabályozása egyéb géntechnológiai módosítások létrehozását követően. Például javasolták tumort elárasztó limfociták vagy természetes ölősejtek alkalmazását abból a célból, hogy azok a tumor helyére citotoxikus anyagokat juttassanak. A találmány tárgyát képezi ilyen limfociták és sejtek számának és aktivitásának szabályozására könnyen alkalmazható eljárás, anélkül, hogy azokat in vitro amplifikálás céljából eltávolítanánk a beteg szervezetéből. Mivel tehát a sejtek proliferatív válaszreakcióját a kimérareceptorok intracelluláris doménjai közvetítik, az extracelluláris doménok elrendeződése különböző, az extracelluláris doménokra specifikus, aggregációt kiváltó stimulusok hatására (például az extracelluláris doménra specifikus ellenanyag hatására) a kimérákat hordozó sejtek proliferációját eredményezi.

Bár a találmány egy megvalósítási módja szerint a Syk-, vagy Syk- és Src-családba tartozó protein-tirozin kinázokkal létesített kimérákat alkalmaztunk, a találmány szerinti célra bármely, a fenti molekulákhoz hasonló funkcióval rendelkező tirozinkináz alkalmazható. Előnyös immunsejt-indukáló molekuláknak az alábbi megkülönböztető tulajdonságokkal kell rendelkezniük: legyen képes autonóm expresszálódásra, legyen egy extracelluláris doménnal fuzionáltatható (közvetlenül vagy közvetett módon, egy transzmembrándoménon keresztül) úgy, hogy a kiméra jelen legyen a terápiás sejt felszínén, valamint célzott ligandummal történő találkozást követően létrejövő aggregáció révén képes legyen sejteffektorprogramok beindítására. Jelenleg kiméráknak az immunrendszer sejtjeibe való juttatására leginkább alkalmazható eljárások a génterápia valamilyen formáján alapulnak. Az immunrendszer sejtjeinek kimérareceptorokkal történő ellátása oly módon, hogy a sejteket megfelelőképp szolubilizált, tisztított kiméraproteinnel elegyítjük, szintén módosított sejtpopulációt eredményez, amely képes reagálni a kimérák extracelluláris doménja által felismert célsejtekre. Hasonló eljárást alkalmaztak például az intakt CD4 HIV-receptomak terápiás célból, eritrocitákba történő bejuttatására. Ebben az esetben a módosított sejtpopuláció nem képes önmaga megújítására.

A találmány tárgyát képezik funkcionális, egyszerűsített protein-tirozin kináz kimérák, melyek képesek célzottan módosított irányú immunrendszeri funkciók kiváltására. Közelebbről, a találmány tárgyát limfociták, makrofágok, természetes ölősejtek vagy granulociták működésének szabályozása képezi az említett sejtekben kimérák expresszálásán keresztül, melyek a sejtekben a kimérák által felismert céllal szemben válaszreakciót váltanak ki. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás célzott sejtszintű válaszreakciók kiváltására fertőző kórokozóval, tumorsejtekkel vagy rákos sejtekkel, vagy olyan sejtekkel szemben, melyekben autoimmun folyamatok indultak meg. Emlősben a célzott sejtszintű válaszreakciók kiváltására szolgáló eljárás szerint az emlősnek olyan terápiás sejtek hatékony mennyiségét adjuk be, amely sejtek képesek felismerni és elpusztítani a fent említett fertőző kórokozót, tumorsejtet, rákos sejtet vagy autoimmun sejtet.

A találmány egy másik megvalósítási módja szerint egy fertőző kórokozóval szemben létrejövő célzott sejtszintű válaszreakció kiváltására szolgáló eljárásban terápiás sejteknek az említett kórokozó felismerésére és elpusztítására képes hatékony mennyiségét adjuk be, ahol a kórokozó meghatározott vírus, baktérium, protozoon vagy gomba. Még közelebbről, az eljárás olyan kórokozókkal szemben irányul, mint a HIV-vírus és Pneumocystis carínii.

HlV-fertőzés kezelése céljából, betegeknek kimérareceptort expresszáló citotoxikus T-limfociták hatékony mennyiségét adjuk be; a limfociták képesek specifikus módon felismerni és lizálni a HIV-vírussal fertőzött sejteket, valamint a keringő vírust.

A találmány egy megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezi eljárás HIV-vírussal fertőzött sejtekkel szemben célzott sejtszintű válaszreakciók kiváltására, mely eljárás szerint betegnek citotoxikus T-limfociták hatékony mennyiségét adjuk be, amelyek képesek specifikus módon felismerni és lizálni a HIV-vírussal fertőzött sejteket.

HU 224 137 Β1

A találmány tárgyát képezik továbbá a kimérareceptor-proteinek, melyek a citotoxikus T-limfocitákat HIVfertőzött sejtek felismerésére és lizálására késztetik. A találmány tárgyát képezik ezenkívül a kimérareceptorokat tartalmazó vektorral transzformált gazdasejtek.

Ezek és a találmány további bemutatott, nem korlátozó jellegű megvalósítási módjai szakember számára világosak lesznek a találmány alábbi, részletes leírása alapján.

Az alábbi részletes leírás során utalunk molekuláris biológiában és immunológiában jártas szakember számára jól ismert eljárásokra. Az említett ismert eljárásokat ismertető közlemények és egyéb szakirodalmi helyek, melyekre utalás történt, teljes terjedelmükben a kitanítás részét képezik, mintha azokat teljes egészükben közöltük volna.

Rekombináns DNS-technológia általános elveit ismertetik például a felsorolt ismert szakirodalmi helyek: Watson J. D. és munkatársai: „Molecular Biology of the Gene”, 1. és 2. kötet, „Benjamin/Cummings Publishing Company” Inc., Menlo Park, CA (1987); Darnell J. E. és munkatársai: „Molecular Cell. Biology”, „Scientific American Books”, Inc., New York, N. Y. (1986); Lewin B. M.: „Genes II”, „John Wiley & Sons” New York, N. Y. (1985); Old R. W. és munkatársai: „Principles of Gene Manipulation”: An Introduction to Genetic Engineering”, 2. kiadás, „University of California Press”, Berkeley, CA (1981); Maniatis T. és munkatársai: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. kiadás, „Cold Spring Harbor Laboratory”, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989); valamint Ausubel és munkatársai: „Current Protocols in Molecular Biology” „Wiley Press”, New York, NY (1989).

Annak érdekében, hogy a leírás és az igénypontok egyértelműen értelmezhetőek legyenek, az alábbi definíciókat adjuk meg.

„Klónozás” alatt in vitro rekombinációs technikák alkalmazását értjük adott génnek vagy egyéb DNS-szekvenciának egy vektormolekulába történő inszertálására. Egy meghatározott gén sikeres klónozásához szükség van DNS-fragmensek előállítására, a fragmensek vektormolekulákhoz történő kapcsolására, az összeállított DNS-molekulának olyan gazdasejtbe történő bejuttatására, amelyben az képes replikálódni, valamint a recipiens gazdasejtek közül a célzott gént tartalmazó kiónok szelektálására szolgáló eljárások alkalmazására.

A leírásban „cDNS” alatt olyan komplementer vagy másolat-DNS-t értünk, mely RNS-templát alapján készült RNS-függő DNS-polimeráz- (reverz transzkriptáz) enzim közreműködésével. „cDNS-klón” alatt tehát klónozóvektor által hordozott, egy adott RNS-molekulával komplementer, kettős szálú DNS-szekvenciát értünk.

A „cDNS-génkönyvtár” kifejezés cDNS-inszerteket tartalmazó rekombináns DNS-molekulák gyűjteményére vonatkozik, mely DNS-molekulák olyan mRNS-ről készült DNS-másolatokat tartalmaznak, amelyek a sejtekben a cDNS-génkönyvtár előállításának idejében expresszálódtak. Ilyen cDNS-génkönyvtárat előállíthatunk szakember számára ismert eljárásokkal, ilyen eljárásokat ismertetnek például Maniatis és munkatársai [„Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, lásd fent). Általánosságban, először RNS-t izolálunk az organizmus sejtjeiből, amelynek genomjából egy meghatározott gént klónozni kívánunk. A találmány céljára előnyös emlős-, és különösen humán limfocita-sejtvonalak alkalmazása. A találmány szerinti célra előnyös vektor a vacciniavírus WR-törzs.

„Vektor” kifejezés alatt például plazmid, bakteriofág, vagy emlős- vagy rovarvírus-eredetü DNS-molekulát értünk, melybe DNS-fragmens inszertálható vagy klónozható. Egy vektor egy vagy több egyedi restrikciós hasítási helyet tartalmaz, és meghatározott gazdaszervezetben vagy hordozószervezetben autonóm replikációra képes úgy, hogy a klónozott szekvencia reprodukálható legyen. „DNS-expressziós vektor-nak tehát bármely olyan autonóm elemet nevezünk, amely egy rekombináns peptid szintézisét irányítani képes. Ilyen DNS-expressziós vektorok lehetnek bakteriális eredetű plazmidok és fágok, valamint emlős- és rovareredetű plazmidok és vírusok.

„Lényegében tiszta” kifejezés alatt olyan vegyületet, például proteint, polipeptidet vagy ellenanyagot értünk, amelyik a természetben azzal együtt előforduló összetevőktől lényegében mentes. Általánosságban, egy vegyületről akkor mondjuk, hogy az lényegében tiszta, ha a mintában az adott vegyület aránya legalább 60%, előnyösen 75%, és legelőnyösebben 90%. A tisztasági fok bármely alkalmas eljárással meghatározható, például oszlopkromatográfiával, poliakrilamid-gélelektroforézissel vagy HPLC analízissel. Nukleinsavak vonatkozásában a „lényegében tiszta” kifejezés olyan nukleinsavszekvenciát, -szegmenst vagy -fragmenst jelöl, amelyik nem csatlakozik közvetlenül (azaz nem kapcsolódik kovalensen) azokhoz a kódolószekvenciákhoz (azaz az 5’-végen-, valamint a 3’-végen található szekvenciákhoz), melyekhez közvetlenül kapcsolódik az organizmus természetben előforduló genomjában, amelyből a találmány szerinti DNS származik.

„Funkcionális származékának nevezzük egy molekula „fragmenseit”, „variánsait”, „analógjait” vagy „kémiai származékait”. Egy molekula „fragmense” kifejezés, például a találmány szerinti cDNS-szekvenciák bármelyike, a molekula valamely nukleotid-alcsoportjára vonatkozik. Egy ilyen molekula „variánsa” természetben előforduló molekulát jelent, amely lényegében hasonló a teljes molekulához vagy annak fragmenséhez. Egy molekula „analógjáénak természetben elő nem forduló molekulát nevezünk, amely lényegében hasonló a teljes molekulához vagy annak fragmenséhez. Egy molekuláról akkor mondjuk, hogy az „lényegében hasonló” egy másik molekulához, ha a két molekula aminosavszekvenciája lényegében megegyezik. Lényegében hasonló aminosavakból álló molekulák lényegében hasonló biológiai aktivitással rendelkeznek. Feltéve tehát, hogy két molekula hasonló aktivitással rendelkezik, azokat a leírásban használt definíció szerint variánsoknak tekintjük, még abban az esetben is, ha a molekulák egyike a másikban nem található, további aminosavakat tartalmaz, vagy annál kevesebb aminosavat tartalmaz, vagy a két aminosavszekvencia

HU 224 137 Β1 nem azonos. A leírásban egy molekula „kémiai származékán” olyan molekulát értünk, amelyik a molekula részét a normálisan nem képező, további kémiai csoportokat tartalmaz. Ilyen csoportok javíthatják a molekula oldhatóságát, felszívódását, biológiai felezési idejét stb. A csoportok csökkenthetik továbbá a molekula toxícitását, megszüntethetik vagy csökkenthetik a molekula valamely nem kívánt mellékhatását stb. Ilyen hatások közvetítésére képes csoportokat írnak le például az alábbi szakirodalmi helyen: „Remington Pharmaceutical Science, 16. kiadás, „Mack Publishing Co.’’, Easton, Penn. (1980).

Hasonlóképp, a találmány szerinti receptor-kiméragén „funkcionális származéka” kifejezés vonatkozik a gén „fragmenseire”, „variánsaira” vagy „analógjaira”, melyek nukleinsavszekvenciája „lényegében hasonló” lehet, és amelyek protein-tirozin kináz kimérához hasonló aktivitással rendelkező molekulát kódolnak.

Protein-tirozin kináz kiméraproteinnek nevezünk minden olyan funkcionális származékot, fragmenst, variánst, analógot vagy kémiai származékot, amely lényegében hasonló a „vad típusú” kimérához, és amely ahhoz hasonló aktivitással rendelkezik (azaz a vad típusú receptorkimérák aktivitásának legelőnyösebben 90%-ával, előnyösebben 70%-ával, előnyösen 40%-ával és legalább 10%-ával rendelkezik). Egy funkcionális kimérareceptor-származék aktivitása vonatkozik (annak extracelluláris részén keresztül) egy célzott ágenshez vagy sejthez történő specifikus kötődésre, és a kötődés következményeképp (a kimérareceptor intracelluláris része által) az adott ágens vagy sejt elpusztítására; úgy, hogy az aktivitás tesztelhető például bármely, a leírásban ismertetett vizsgálati módszerrel.

A találmány szerinti kimérát vagy annak funkcionális származékát kódoló DNS-szekvenciát rekombináns úton vektor-DNS-sel kapcsolhatjuk össze szokásos technikák alkalmazásával, például ligálás céljából tompa végek vagy lépcsőzetes végek létrehozásával, megfelelő végek kialakítása céljából restrikciós enzimekkel végzett emésztésekkel, szükség esetén a ragadós végek feltöltésével, a nem kívánt összekapcsolódás megelőzése céljából alkalikus foszfatázzal végzett kezeléssel, valamint megfelelő ligázokkal történő ligálással. Ilyen technikákat írnak le például Maniatis T. és munkatársai (lásd fent), és azok a technika állása szerint jól ismertek.

Egy nukleinsavmolekuláról, például DNS-ről akkor mondjuk, hogy „képes egy polipeptid expresszálására”, ha transzkripciós és transzlációs szabályozó információkat hordozó nukleotidszekvenciákat tartalmaz, és az említett szekvenciák a polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciákkal „funkcionálisan kapcsoltak”. Funkcionális kapcsolódásnak olyan kapcsolódást nevezünk, amelyben a szabályozó DNS-szekvenciák és az expresszálandó DNS-szekvenciák oly módon kapcsolódnak, hogy génexpresszió jöhessen létre. A gén expresszálódásához szükséges szabályozórégiók közelebbi természete organizmusról organizmusra változhat, de általánosságban tartalmazniuk kell egy promoterrégiót, amely prokarióták esetében tartalmazza a promotert, valamint olyan DNS-szekvenciákat, melyek RNS-sé átíródva jelzést szolgáltatnak a proteinszintézis megindulása számára. Ezek a régiók általában tartalmazzák azokat az 5’-végi nem kódoló szekvenciákat, amelyek a traszkripció és a transzláció megindításában játszanak szerepet, például a „TATA-box” régiót, a „capping’-szekvenciát, CAAT-szekvenciát és hasonlókat.

Kívánt esetben, a proteint kódoló génszekvenciától 3’-irányban található nem kódoló régiót megkaphatjuk a fent leírt módszerek alkalmazásával. Ezt a régiót megtarthatjuk az abban található, transzkripciós terminációszabályozó szekvenciák, ezen belül a terminációt és poliadenilezést szabályozó szekvenciák kedvéért. Megtartva tehát a proteint kódoló DNS-szekvenciával természetben kapcsolódó 3’-régiót, rendelkezésre állnak a transzkripció végét jelző szignálok. Amennyiben a transzkripció végét jelző szignálok nem működnek kielégítően az expresszálásra felhasznált gazdasejtben, azt a gazdasejtben működőképes 3’-régióval helyettesíthetjük.

Két DNS-szekvenciáról (például promoterrégió-szekvenciáról és protein-tirozin kináz kimérát kódoló szekvenciáról) akkor mondjuk, hogy azok „funkcionálisan kapcsoltak”, ha a két DNS-szekvencia közti kötődés természete (1) nem eredményez fáziseltolódással járó („frame shift”) mutációt, (2) nem gátolja a promoterrégiót alkotó szekvencia azon képességét, hogy irányítsa a receptorkiméra-génszekvencia transzkripcióját, vagy (3) nem gátolja a receptorkiméra-génszekvencia azon képességét, hogy az a promoterrégió-szekvencia által átíródjon. Egy promoterrégió funkcionálisan kapcsolt egy DNS-szekvenciával, ha a promoter képes létrehozni az adott DNS-szekvencia transzkripcióját. A protein expresszálódásához tehát szükség van megfelelő gazdasejt által felismert transzkripciós és transzlációs szignálokra.

A találmány tárgyát képezi protein-tirozin kináz kiméraprotein (vagy funkcionális származéka) expresszálása prokarióta vagy eukarióta sejtekben, bár eukarióta sejtekben (különösen humán limfocitákban) történő expresszálás előnyösebb.

A találmány szerinti ellenanyagok számos különböző eljárással előállíthatok. Például egy állatnak a receptorkiméra proteineket vagy azok funkcionális származékát expresszáló sejteket adhatunk be, abból a célból, hogy a kimérához kötődni képes poliklonális ellenanyagokat tartalmazó szérum termelődését váltsuk ki.

Egy előnyös eljárás szerint a találmány szerinti ellenanyagok monoklonális ellenanyagok. Ilyen monoklonális ellenanyagokat előállíthatunk hibridómatechnológiával [Kohler és munkatársai: Natúré 256, 495 (1975); Kohler és munkatársai: Eur. J. Immunoi. 6, 511 (1976); Kohler és munkatársai: Eur. J. Immunoi. 6, 292 (1976); Hanierling és munkatársai: „Monoclonal Antibodies and T-Cell. Hybridomas”, „Elsevier” Ν. Y„ 563-684. oldal (1981)]. Általánosságban, a fenti eljárásokban állatot immunizálunk a kiméraantigénnel. Az ilyen állat lépsejtjeit extraháljuk és megfelelő mieloma-sejtvonallal fuzionáltatjuk. A találmány szerinti megvalósítási módokban

HU 224 137 Β1 bármely alkalmas mieloma-sejtvonal alkalmazható. A fúziót követően az így kapott hibridómasejteket szelektív módon, HAT-tápfolyadékban tartjuk fönn, majd Wands J. R. és munkatársai módszere szerint [Gastroenterology 80, 225 (1981 )j, határhígításos eljárással klónozzuk. A fenti szelekcióval kapott hibridómasejteket ezután vizsgáljuk, hogy a kimérához kötődni képes ellenanyagokat szekretáló kiónokat azonosítsuk.

A találmány szerinti ellenanyagok lehetnek poliklonális ellenanyagok is, vagy előnyösebben régióspecifikus poliklonális ellenanyagok.

A találmány szerinti kiméraellenes ellenanyagok alkalmazhatók betegben a kimérareceptor (vagy kimérareceptort hordozó sejtek) mennyiségének meghatározására. Ilyen ellenanyagok alkalmasak a technika állása szerint ismert, standard immundiagnosztikai vizsgálati eljárásokban történő alkalmazásra, például immunometriás vagy „szendvics” vizsgálati eljárásokban, mint például „forward szendvics”, „reverz szendvics” és „szimultán szendvics” vizsgálati eljárásokban. Amint azt további kísérletezés nélkül szakember képes megállapítani, az ellenanyagokat alkalmazhatjuk bármilyen kombinációban, hogy megfelelő specifitással, érzékenységgel és pontossággal rendelkező immunvizsgálati eljáráshoz (,,immunoassay”-hez) jussunk.

Az immunológia általános elveit ismertető szokásos szakirodalmi helyek például az alábbiak: Roitt I.: „Essential Immunology”, 6. kiadás, „Blackwell Scientific Publications”, Oxford (1988); Kimball J. W.: „Introduction to Immunology”, 2. kiadás, „Macmillan Publishing Co.” New York (1986); Roitt I. és munkatársai: „Immunology”, „Gower Medical Publishing Ltd. London (1985); szerk.: Burdon R. és munkatársai: „Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology”, 13. kötet, Campbell A.: „Monoclonal Antibody Technology”, „Elsevier”, Amszterdam (1984); Klein J.: „Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination”, „John Wiley & Sons”, New York, (1982); valamint szerk.: Kennett R. és munkatársai: „Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses”, „Plenum Press” New York (1980).

„Kimutatás” kifejezésen egy anyag jelenlétének vagy hiányának kimutatását, vagy egy anyag mennyiségének meghatározását értjük. A kifejezés vonatkozik tehát a találmány szerinti anyagok, készítmények és eljárások alkalmazásával történő kvalitatív vagy kvantitatív meghatározásokra.

A leírásban feltártakkal megegyező specifitással rendelkező monoklonális ellenanyagokat szekretáló egyéb hibridómák izolálhatok antiidiotípusszűréses technika alkalmazásával [Potocmjak és munkatársai: Science 215, 1637 (1982)]. Röviden, antiidiotípus-ellenanyagnak olyan ellenanyagot nevezünk, amelyik a kérdéses klón által termelt ellenanyagon jelen levő egyedi determinánsokat ismer fel. Antiidiotípus-ellenanyagot úgy állíthatunk elő, hogy a monoklonális ellenanyag forrásául szolgáló fajhoz tartozó állatot a kérdéses monoklonális ellenanyaggal immunizáljuk. Az immunizált állat az immunizálásra felhasznált ellenanyag idiotípusdeterminánsait felismeri, és azokra a fenti idiotípusdeterminánsokkal szembeni ellenanyagok (antiidiotípus-ellenanyagok) termelődésével válaszol.

Replikáció céljából a hibrid sejtek in vitro vagy in vivő tenyészthetők. A magas in vivő termelődés miatt ez utóbbi eljárás az előnyös tenyésztési módszer. Röviden, az egyes hibrid törzsekből származó sejteket intraperitoneálisan (hasüregbe), lökésszerűen pristane-nal kezelt Balb/c-egerekbe injektáltuk, hogy a kívánt monoklonális ellenanyagot magas koncentrációban tartalmazó aszciteszfolyadékot nyerjünk. IgM- vagy IgG-izotípusba tartozó monoklonális ellenanyagokat a tenyészet felülúszójából szakember számára jól ismert oszlopkromatográfiás eljárásokkal tisztíthatunk.

A találmány szerinti ellenanyagok különösen megfelelnek immunvizsgálati eljárásokban történő alkalmazás céljára, amelyekben azokat folyékony fázisban használjuk, vagy szilárd fázisú hordozóhoz kötjük. Az említett immunvizsgálatl eljárásokban használt ellenanyagokat ezenkívül különböző módon jelölhetjük, hogy azok kimutathatóak legyenek.

A technika állása szerint számos különböző jelölőanyag és eljárás alkalmazható jelölésre. A találmány szerinti megvalósítási módokban alkalmazható jelölőanyag-típusok, anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk, például a felsoroltak: enzimek, radioizotópok, fluoreszcens vegyületek, kemilumineszcens vegyületek, biolumineszcens vegyületek és fém-kelátok. Szakember számára ellenanyaghoz köthető más alkalmas jelölőanyagok is ismertek, vagy rutinszerű kísérletekkel képes ilyent kifejleszteni. Továbbá, ezeknek a jelölőanyagoknak ellenanyagokhoz történő kötését szakember számára jól ismert standard technikák alkalmazásával végezhetjük.

A találmány szerinti ellenanyagok kimutatható módon jelölhetők például oly módon, hogy az ellenanyagokat enzimhez kötjük. Ez az enzim viszont, amikor azt később szubsztrátjával érintkeztetjük, reagálni fog a szubsztráttal úgy, hogy olyan kémiai csoport keletkezzen, amelyik például spektrofotometriás vagy fluorometriás eljárással kimutatható. Ellenanyagok kimutatható módon történő jelölésére alkalmazható enzimek például a felsoroltak: malát-dehidrogenáz, staphylococcus-nukleáz, delta-V-szteroid-izomeráz, élesztő-alkohol-dehidrogenáz, alfa-glicerofoszfát-dehidrogenáz, trióz-foszfát-izomeráz, biotin-avidin-peroxidáz, tormaperoxidáz, alkalikus foszfatáz, aszparagináz, glükóz-oxidáz, β-galaktozidáz, ribonukleáz, ureáz, kataláz, glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz, glükoamiláz, valamint acetil-kolin-észteráz.

Kimutatható módon jelölt ellenanyagok jelenlétét kimutathatjuk úgy is, hogy az ellenanyagokat radioaktív izotóppal jelöljük, melyet azután gamma-számláló vagy szcintillációs számláló alkalmazásával határozunk meg. A találmány szerinti célra különösen alkalmas izotópok a felsoroltak: ³H, ¹²⁵l, ³²P, ³⁵S, ¹⁴C, ⁵¹Cr, ³⁶CI, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe és ⁷⁵Se.

Kimutatható módon jelölt ellenanyagok jelenlétét kimutathatjuk továbbá úgy is, hogy az ellenanyagokat fluoreszcens vegyülettel jelöljük. Amikor a fluoreszcens anyaggal jelölt ellenanyagot megfelelő hullámhosszú

HU 224 137 Β1 fénynek tesszük ki, az ellenanyag jelenlétét a festék fluoreszcenciája alapján mutathatjuk ki. A leggyakrabban használt fluoreszcens jelölőanyagok a felsoroltak: fluoreszcein-izotiocianát, rodamid, fikoeritrin, fikocianin, allofikocianin, o-ftaldehid és fluoreszkamin.

A találmány szerinti ellenanyagokat kimutatható módon jelölhetjük továbbá fluoreszcenciát kibocsátó fémekkel, mint például ¹⁵²Eu-val vagy a lantánsorozat egyéb tagjaival. Ezek a fémek az ellenanyag-molekulához olyan fém-kelátor-csoportok alkalmazásával kapcsolhatók hozzá, mint például dietil-enteriamin-pentaecetsav (DTPA) vagy etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA).

A találmány szerinti ellenanyagokat kimutatható módon jelölhetjük továbbá úgy, hogy azokat kemilumineszcens vegyülethez kapcsoljuk. A kemilumineszcens vegyülettel ellátott ellenanyag jelenlétét ezután lumineszcencia kimutatásával határozhatjuk meg, amely a kémiai reakció során keletkezik. A találmány szerinti célra különösen alkalmas kemilumineszcens jelölőanyagok a felsoroltak: luminal, izoluminol, theromatik akridinium-észter, imidazol, akridiniumsók, oxalát-észter és dioxetán.

Hasonlóképp, a találmány szerinti ellenanyagokat jelölhetjük biolumineszcens vegyülettel. A biolumineszcencia a kemilumineszcenciának biológiai rendszerekben található típusa, melyben egy katalitikus protein fokozza a kemilumineszcens reakció hatékonyságát. A biolumineszcens ellenanyag jelenlétét lumineszcencia kimutatásával határozzuk meg. Jelölésre felhasználható jelentősebb biolumineszcens vegyületek az alábbiak: luciferin és luciferáz-aequorin.

A találmány szerinti ellenanyagok és lényegében tisztított antigének ideálisan megfelelnek vizsgálati reagenskészlet előállítására. Ilyen vizsgálati reagenskészlet tartalmazhat rekeszekre osztott hordozóeszközt, hogy azokba szorosan egy vagy több tartályt, például üvegcséket, csöveket és hasonlókat lehessen helyezni, és az említett tartályok mindegyike a vizsgálati eljárásban alkalmazandó egyes elemeket tartalmazza.

Vizsgálati reagenskészlet formájában számos típusú vizsgálati eljárás kivitelezhető, azok lehetnek például kompetitív és nem kompetitív vizsgálati eljárások. A találmány szerinti ellenanyagok alkalmazhatók például az alábbi tipikus vizsgálati eljárásokban: radioimmunvizsgálati eljárások (RIA), enzim-immunvizsgálati eljárások (EIA), enzimhez kötött immunszorbens vizsgálati eljárások (ELISA), valamint immunometriás vagy szendvics immunvizsgálati eljárások.

Az „immunometriás vizsgálati eljárás” vagy „szendvics immunvizsgálatí eljárás” kifejezés vonatkozik szimultán szendvics, „forward szendvics és reverz szendvics immunvizsgálati eljárásokra. Ezek a kifejezések szakember számára jól ismertek. Szakember számára nyilvánvaló az is, hogy a találmány szerinti ellenanyagok alkalmazhatók jelenleg ismert vagy a jövőben kifejlesztendő vizsgálati eljárások egyéb variációiban és formáiban is. Az utóbbiak szintén a találmány tárgyát képezik.

A találmány szerinti vizsgálati eljárások kivitelezésének egy előnyös módja szerint lényeges, hogy az inkubációs közegben bizonyos „blokkolóanyagok legyenek jelen (melyeket rendszerint a jelölt, oldható ellenanyaggal együtt adunk a vizsgálati mintához). A „blokkolóanyagokat” abból a célból adjuk a mintához, hogy a nemspecifikus proteinek, proteázok vagy a kísérleti mintában található, egér-immunglobulinellenes humán ellenanyagok ne létesítsenek keresztkötéseket a szilárd fázisú hordozón található ellenanyagokkal, és azokat ne károsítsák, vagy ne létesítsenek keresztkötéseket a radioaktívan jelölt indikátor-ellenanyagokkal, és azokat ne károsítsák, amelyek révén tévesen pozitív vagy tévesen negatív eredményeket kaphatnánk. „Blokkolóanyagok’’ választása tehát jelentősen hozzájárul a találmány szerinti vizsgálati eljárások specifitásához.

Azt találtuk, hogy számos, a vizsgálati eljárásokban felhasználtakkal megegyező osztályba vagy alosztályba (izotípusba) tartozó, oda nem tartozó (azaz más specifitással rendelkező) ellenanyag (azaz lgG₃, lgG_2a, IgM stb.) alkalmazható „blokkolóanyagként”. Lényeges a „blokkolóanyagok” koncentrációja (általában 1-100 pg/ml), hogy a megfelelő érzékenység fenntartása mellett megakadályozzunk minden nem kívánt gátlást, melyet a humán szérumban egyidejűleg előforduló, keresztreagáló proteinek okozhatnak. Továbbá a „blokkolóanyagokat” tartalmazó pufferrendszert optimalizálnunk kell. Előnyös pufferek gyenge szerves savak, például imidazol, HEPPS, MOPS, TES, ADA, ACES, HEPES, PIPES, TRIS és hasonlók fiziológiás tartományban történő alkalmazásán alapulnak. Végül, a „blokkolóanyagokat” tartalmazó pufferhez ismert proteázinhibitorokat kell adnunk (általában 0,01-10 pg/ml koncentrációban).

Számos szilárd fázisú immunadszorbens létezik, melyet alkalmaztak, és amely a találmány szerinti megvalósítási módokban alkalmazható. Jól ismert immunadszorbensek például a felsoroltak: üveg, polisztirén, polipropilén, dextrán, nejlon és egyéb anyagok, melyek alkalmazhatók ilyen anyagból álló vagy ilyen anyagokkal bevont csövek, gyöngyök, mikrotitrálólemezek és hasonlók formájában. Az immobilizált ellenanyagokat kovalensen vagy fizikai módon a szilárd fázisú immunadszorbenshez köthetjük, például egy amid- vagy észterkötésen keresztül létrejövő kovalens kötés létrehozásával vagy abszorbcióval. Szakember számára számos egyéb alkalmas szilárd fázisú immunadszorbens és ellenanyagoknak azokon történő immobilizálására szolgáló eljárás ismert, vagy csupán rutinkísérletek során képes ilyenek kifejlesztésére.

In vitro, in vivő vagy in situ diagnózis céljára jelölőanyagokat, például radionuklidokat közvetlenül vagy egy közti funkcionális csoporton keresztül köthetünk a találmány szerinti ellenanyagokhoz. Fémkationokként létező radioizotópok ellenanyagokhoz történő kötésére gyakran használt közticsoport például a dietilén-triamin-pentaecetsav (DTPA). Ily módon kötést létesítő tipikus fémkationok például a felsoroltak: ^99mTc, ¹²³l, ^1HIN, ¹³¹l, ⁹⁷Ru, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga, valamint ⁶⁸Ga. A találmány szerinti ellenanyagokat diagnosztikai célból jelölhetjük nem radioaktív izotópokkal is. Ily módon különösen előnyösen alkalmazható elemek a felsoroltak: ¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn, ¹⁶²Dy, ⁵²Cr és ⁵⁶Fe.

HU 224 137 Β1

A találmány szerinti antigének lényegében tiszta formában izolálhatok a találmány szerinti ellenanyagok alkalmazásával. A találmány tárgyát képezi tehát lényegében tiszta protein-tirozin kináz kiméra, az említett antigént az jellemzi, hogy azt a találmány szerinti ellenanyagok felismerik, és azokhoz kötődik. A találmány tárgyát képezi továbbá a kimérareceptor-antigén izolálására vagy tisztítására szolgáló eljárás, mely eljárás szerint az említett antigén egy vagy több, a receptorkiméra ellen termelődött ellenanyaggal komplexet képez.

A találmány szerinti, lényegében tiszta kiméraantigének viszont alkalmazhatók mintában, például szérumban vagy vizeletben a kiméra ellen irányuló ellenanyagok kimutatására vagy azok mennyiségének meghatározására. A találmány tárgyát képezi tehát mintában protein-tirozin kináz kiméraantigénnel szemben irányuló ellenanyagok jelenlétének kimutatására vagy azok mennyiségének meghatározására szolgáló eljárás, mely eljárás szerint a kiméraantigénnel szemben ellenanyagot tartalmazó mintát kimutatható módon jelölt receptorkimérával érintkeztetjük, és a jelölőanyagot kimutatjuk. Világos, hogy alkalmazhatók a kiméra immunreaktív frakciói vagy immunreaktív analógjai is. „Immunreaktív frakció-nak nevezzük a kiméraantigén minden olyan részét, amely a receptorkiméra ellen irányuló ellenanyaggal a receptorkimérával megegyező mértékű immunválaszt ad. „Immunreaktív analógénak olyan proteint nevezünk, amely a receptorkiméra-proteintől egy vagy több aminosav vonatkozásában eltér, de amelyik a találmány szerinti ellenanyagokkal a receptorkimérával megegyező mértékű immunválaszt ad.

„Specifikus módon felismer és kötődik” kifejezés alatt azt értjük, hogy az ellenanyag felismeri a kimérareceptor-polipeptidet, és ahhoz kötődik, de lényegében nem ismer fel a mintában, például biológiai mintában található egyéb, az adott ellenanyagokkal kapcsolatban nem levő molekulákat, és azokhoz nem kötődik.

„Autoimmun sejt”-nek olyan sejteket nevezünk, amelyek a gazdaszervezet szöveteivel szemben ellenanyagokat termelnek, vagy autoreaktív immuneffektor T-sejteket termelnek; ilyen sejtek termelhetnek például acetil-kolin-receptorral szembeni ellenanyagokat (amely például myasthenia gravis kialakulásához vezet), vagy anti-DNS-, antieritrocita-, antivérlemezke-ellenanyagokat (amely például lupus erythematosus kialakulásához vezet).

„Terápiás sejt”-nek olyan sejteket nevezünk, amelyeket a találmány szerinti kimérával transzformáltunk úgy, hogy azok képesek meghatározott fertőző ágens, meghatározott fertőző ágenssel fertőzött sejt, tumorvagy rákos sejt, vagy autoimmun sejt felismerésére és elpusztítására; a fenti terápiás sejtek előnyösen vérképző rendszeri sejtek.

„Célzott fertőző ágensének nevezünk minden olyan fertőző ágenst (például vírust, baktériumot, protozoont vagy gombát), amelyet kimérareceptor-hordozó terápiás sejtek képesek felismerni. „Célzott sejt”-nek nevezünk minden olyan gazdasejtet, amelyet kimérareceptort hordozó terápiás sejtek képesek felismerni; célzott sejtek lehetnek, anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk, vírussal, baktériummal, protozoonnal vagy gombával fertőzött gazdasejtek, valamint tumorvagy rákos sejtek és autoimmun sejtek.

„Extracelluláris” kifejezésen azt értjük, hogy a molekula legalább egy része a sejtfelszínen található. „Intracelluláris” kifejezésen azt értjük, hogy a molekula legalább egy része a terápiás sejt citoplazmájával érintkezik. A „transzmembrán” kifejezés arra vonatkozik, hogy a molekula legalább egy része átszeli a plazmamembránt. A leírás szerint egy „extracelluláris rész”, „intracelluláris rész” vagy „transzmembránrész” tartalmazhat olyan határoló aminosavszekvenciákat, melyek szomszédos sejtterekbe nyúlnak át.

„Oligomerképzés” kifejezés alatt más proteinekkel történő komplexképzést értünk úgy, hogy dimerek, trimerek, tetramerek keletkezzenek, vagy egyéb, több elemből álló oligomer jöjjön létre. Ilyen oligomerek lehetnek homooligomerek vagy heterooligomerek. „Oligomerképző rész”-nek nevezzük egy molekula azon részét, amely a komplexképződést (azaz az oligomerképződést) irányítja.

„Citolitikus”-nak nevezünk valamit, ha az képes sejtek (például kórokozóval fertőzött sejt, tumor- vagy rákos sejt vagy autoimmun sejt) elpusztítására, vagy képes egy fertőző ágens (például vírus) elpusztítására.

„Immundeficiencia-vírus”-nak olyan retrovírust nevezünk, amely vad típusú formában képes főemlős-gazdaszervezet T4-sejtjeinek fertőzésére, és amelyet a lentivírusok alcsaládjának vírusmorfogenezise jellemez, és annak morfológiai sajátságaival rendelkezik. A kifejezés - anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - vonatkozik a HÍV- és SIV-vírusok valamennyi variánsára, ezen belül a HIV-1, HIV-2, SIVmac, SIVagm, SlVmnd, SlVsmm, SlVman, SlVmand és SlVcpz vírusokra.

„MHC-independens” kifejezésen azt értjük, hogy a celluláris citolitikus válasz létrejöttéhez nincs szükség a célzott sejt felszínén II. osztályba tartozó MHC-antigén jelenlétére.

„Funkcionális citolitikus szignáltranszdukciós származékának olyan (fentiekben definiált) funkcionális származékokat nevezünk, amelyek a vad típusú molekula biológiai aktivitásának legalább 10%-ával, előnyösen 40%-ával, még előnyösebben 70%-ával, és legelőnyösebben legalább 90%-ával rendelkeznek. Egy „funkcionális citolitikus szignáltranszdukciós származék a leírásban használt értelemben kifejtheti hatását közvetlenül, jelezve a terápiás sejtnek, hogy a receptorhoz kötődött ágenst vagy sejtet el kell pusztítania (például egy intracelluláris kimérareceptor-részlet esetében), vagy kifejtheti hatását közvetve, oly módon, hogy elősegíti a terápiás sejt citolitikus szignáltranszdukciós proteinjeivel történő oligomerizálódást (például egy transzmembrándomén esetében). Ilyen származékok hatékonyságát például a leírásban ismertetett in vitro vizsgálati eljárásokkal tesztelhetjük.

„HIV-burokhoz kötődő funkcionális származék”-nak nevezünk minden olyan (fentiekben definiált) funkcionális származékot, amelyik képes valamely HlV-burokproteinhez kötődni. Funkcionális származékokat pél11

HU 224 137 Β1 dául a leírásban ismertetett in vitro vizsgálati eljárásokkal azonosíthatunk.

Az alábbiakban ismertetjük a találmány szerinti transzformált sejtek terápiás alkalmazásának lehetőségét.

A találmány szerinti transzformált sejtek számos betegség terápiájában alkalmazhatók. Ilyen transzformáit sejtek beadására jelenleg ismert eljárások például az adoptív immunterápiás eljárás vagy a sejttranszfer-terápia. Ezek az eljárások lehetővé teszik transzformált immunrendszeri sejtek visszajuttatását a vérkeringésbe [Rosenberg S. A.: Scientific American 62, (1990. május); Rosenberg és munkatársai; The New England Journal of Medicine 323(9), 570 (1990)].

A találmány szerinti gyógyászati készítmények bármely olyan állatnak beadhatók, amelyekben a találmány szerinti vegyületek előnyös hatást fejtenek ki. Az említettek közül - anélkül, hogy igényünket az alábbira korlátoznánk - azok elsősorban embernek adhatók be.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti megoldást.

Először a csatolt ábrákat ismertetjük.

Az 1A. ábra a találmány szerinti receptorkináz fúziós proteinek szerveződésének vázlatos ábrázolása. Az 1B. ábra Jurkat-féle sejtekben, vacciniarekombinánsok által expresszált CD16/7/zéta, CD16/7/Lck, CD16/7/Fyn(T), CD16/7/Syk és CD16/7/ZAP-70 fúziós proteinek vizsgálatával kapott „flow-citometriás” eredményeket ábrázol. Az 1C. ábra immunprecipitált CD16/7/zéta(negatív kontroll), CD16/7/Lck, CD16/7/Fyn(T), CD16/7/Syk és CD16/7/ZAP-70 kimérák aktivitásának in vitro vizsgálatával kapott eredményeket mutat; az immunprecipitált Fyn-kiméra esetében látható alacsony molekulatömegű csík még azonosításra vár.

A 2. ábra TCR-negatív Jurkat-sejtekben kinázkimérák közti keresztkötések kialakulása által a citoszolban kiváltott kalciumválaszt mutatja. A pozitív populáció relatív intracelluláris kalciumkoncentrációját ábrázoltuk (melyet Indo-1-fluoreszcencia violából kékké történő átalakulásának aránya alapján határoztunk meg). A különböző fúziós proteineket expresszáló vacciniarekombinánsokkal fertőzött Jurkat-sejteket anti-CD16-3G8 monoklonális ellenanyaggal érintkeztettük, majd 0 időpontban, egér IgG-vel szemben kecskében termelt, fikoeritrinnel konjugált F(ab’)-ellenanyagokkal érintkeztettük. Pozitív és negatív kontrolokként TCR-zéta-lánc és FcRIIB2-alapú kimérákat alkalmaztunk.

A 3. ábra Syk-kináz-kimérát expresszáló TCR-pozitív sejtekben létrejövő korai kalciumválaszt mutat. A fertőzést és az analízist a 2. ábránál, fent ismertetettek szerint végeztük. Syk-kináz-kimérát expresszáló sejtek jelentős részénél a violafloureszcencia nagy része alakult át kékké az első ellenanyag-hozzáadást megelőzően.

A 4A. és 4B. ábrák hibridómaölő vizsgálati eljárás eredményeit szemléltetik.

A 4A. ábra hibridómacélsejtekből felszabaduló ⁵¹Crkromát arányát ábrázolja százalékban megadva, az effektorsejtek (kinázkimérát expresszáló CTL-sejtek) és célsejtek arányának függvényében; pozitív és negatív kontroliokként a TCR-zéta-lánc és FcRIIB2 intracelluláris doménjait hordozó receptorkimérákat expresszáló sejteket alkalmaztunk.

A 4B. ábra a sejtpusztítás specifitását mutatja (látható, hogy a környező sejtek nem pusztultak el). BW5147-sejteket (amelyek nem rendelkeznek felszíni anti-CD16-ellenanyagokkal) ⁵¹Cr-kromáttal telítettünk, és kromáttal telített 3G8-sejteket tartalmazó párhuzamos mintával megegyező feltételek mellett, kinázkimérákat expresszáló CTL-sejtekkel érintkeztettünk. A BW5147-sejtekből nem volt kimutatható mértékű kromátfelszabadulás megfigyelhető.

Az 5A., 5B. és 5C. ábrák azt szemléltetik, hogy ZAP-70 és Fyn vagy Lek együttes expresszálódása lehetővé teszi a citolízis kiváltását, és csökkenti a kalciumválasz látenciaidejét. CTL-sejteket a fenti kimérákat expresszáló vacciniarekombinánsokkal fertőztünk, és azokat citolitikus képességre vagy kalciummobilizációra nézve analizáltuk. A fenti analízissel a kimérák hatékonyságát alábecsültük, mivel nem határoztuk meg függetlenül a mindkét kimérát expresszáló sejtek frakcióját (a legalább egy kimérát expresszáló sejtek frakcióját alkalmaztuk az aktivitás normalizálására). Az 5A. ábra CD16/7/kináz kimérapárokat expresszáló CTL-sejtekkel végzett citolitikus vizsgálat eredményeit mutatja. Az 5B. ábra CD16/7/kináz kimérapárokat expresszáló TCR-negatív sejtek kalciumválaszát ábrázolja. Az 5C. ábra CD4/CD7/Fyn kimérát és CD16/CD7/ZAP-70 kimérát együttesen expresszáló CTL-sejtek alkalmazásával végzett citolitikus vizsgálat eredményeit mutatja. Pozitív kontrollként CD16/7/zéta kiméra szolgált, negatív kontrollként pedig CD16/7/FcRIIB2 kimérát alkalmaztunk.

A 6A. és 6B. ábrák azt szemléltetik, hogy deléciókat vagy pontmutációkat tartalmazó kinázkimérák hatástalanok a kalciummobilizáció és a célzott citolízis vonatkozásában. Kinázaktivítással nem rendelkező fúziósprotein-variánsokat állítottunk elő delécióval (a Syk-kináz esetében) vagy pontmutációval (a ZAP-70 esetében), és azokat kalciummobilizációra és citolitikus képességre nézve teszteltük.

A 6A. ábra TCR-negatív sejtekben létrejött kalciumválaszt ábrázol.

HU 224 137 Β1

A 6B. ábra célzott citolitikus vizsgálat eredményeit mutatja.

A 7A., 7B. és 7C. ábrák azt mutatják, hogy humán Syk-kiméra-alapú kimérák lényegében megegyező hatásúak a sertés Syk-kiméra-alapú kimérákkal. A 7A. ábra a humán Syk-kiméra szekvenciáját ábrázolja összehasonlítva a sertés Syk-kiméra szekvenciájával; az első 11 és az utolsó 7 aminosavat a láncindító oligonukleotidszekvenciák határozzák meg. A 7B. ábra humán Syk-kimérát expresszáló TCR-negatív sejtekben végzett kalciummobilizációs vizsgálat eredményeit mutatja. A 7C. ábra humán Syk-kimérát expresszáló CTL-sejtek alkalmazásával végzett célzott citolitikus vizsgálat eredményeit ábrázolja.

A 8. ábra kimérakinázok keresztkötését követően a tirozin-foszforilezési minta megváltozását mutatja. A fenti kimérákat vagy kimérapárokat expresszáló, T-sejt antigénreceptorra nézve negatív Jurkat-sejteket anti-CD16-ellenanyaggal és kecskében termelt antiegér-IgG második ellenanyaggal kezeltünk, majd lizáltunk, poliakrilamidgélen frakcionáltunk, nitro-cellulózra vittünk át, és antifoszfotirozin-ellenanyaggal érintkeztettünk. A (+) jellel jelölt csíkok olyan sejtekből készített extraktumoknak felelnek meg, melyekben keresztkötéseket hoztunk létre, a (-) jellel jelzett csíkoknak megfelelő sejteket a másodlagos ellenanyag-hozzáadást megelőzően, közvetlenül lizáltuk. Kontrollcsíkokat intracelluláris domént nem tartalmazó CD16/7 fúziós proteineket expresszáló TCR-negatív sejtek hasonló kezelésével kaptunk. Összehasonlításképp, a jobb oldalon anti-CD3-ellenanyaggal történő kezelés hatását ábrázoltuk TCR-pozitív Jurkat-sejtekben (vad típusú vacciniavírussal történt fertőzés mellett vagy anélkül). Az ábra bal oldalán, 100 kD közelében látható feltűnő csíkok megfelelnek a kinázkimérák várható molekulatömegének.

A 9. ábra foszfolipáz-C-g1 tirozin-foszforileződését mutatja kimérák aggregációját követően. PLC-g1-et olyan sejtekből állítottunk elő immunprecipitációval, amelyekben ellenanyag-keresztkötések jöttek létre, az immunprecipitátumokat géleken frakcionáltuk, nitro-cellulózra vittük át, és antifoszfotirozin-ellenanyaggal érintkeztettük. Syk-kimérák aggregációját követően a foszforilezett PLC-g1 mennyiségének jelentős emelkedése volt megfigyelhető, míg Fyn- és ΖΑΡ-70-kimérák koaggregációját követően sokkal korlátozottabb, de könnyen kimutatható növekedést észleltünk.

A 10A. ábra és 10B. ábra in vitro kinázmeghatározási eljárásokat mutat. Kimérakinázokat expresszáló sejteket ellenanyag által közvetített kiméra-keresztkötések létrehozásának vetettünk alá, melyet követően a kinázokat immunprecipitáltuk, és az immunprecipitátumokban meghatároztuk az endogén szubsztrát foszforileződését. A 10A. ábra immunprecipitált kinázkimérák aktivitásának összehasonlítását ábrázolja tízperces inkubációs időszak során, keresztkötéseket tartalmazó (+) és keresztkötéseket nem tartalmazó (-) sejtekből izolált immunprecipitátumok alkalmazásával. A 10B. ábra Syk-kináz-kiméra által foszfátjelölés endogén szubsztrátokba történő beépülését mutatja az idő függvényében, keresztkötések létrehozása mellett (+) vagy anélkül (-).

T-sejtek aktiválása csoportosult („cluster-t képző) tirozinkinázok által

Az alábbiakban a találmány különböző megvalósítási módjainak részletes leírása következik. A leírásban bemutattuk, hogy nem receptor kinázok egyszerű, csoportosulással járó események révén aktiválódnak. Mesterséges receptorkinázokat állítottunk elő, melyek intracelluláris doménjai tartalmazták a teljes Src- vagy Syk-családba tartozó kinázszekvenciákat, és vizsgáltuk külső, keresztkötéseket létrehozó stimulusok hatására létrejövő aggregációjuk következményeit. Nyilvánvaló eltérést tapasztaltunk a Syk- és Src-családba tartozó kinázok aktivitása között: az utóbbiak között létrejött keresztkötések nem vezettek szignifikáns sejtaktivációhoz, míg az előbbiek között létrejött keresztkötések szabad intracelluláris kalciumionok megjelenéséhez, és a Syk-kináz esetében citolitikus képességhez vezettek. Az a nehézség, hogy ΖΑΡ-70-kimérák esetében nem sikerült disztális receptor közvetítette programot kiváltani, áthidalható oly módon, hogy a ZAP-70kimérákat Fyn- vagy Lck-kináz-kimérákkal csoportosíttatjuk. A találmány szerinti megoldást a pontosabb értelmezhetőség céljából a továbbiakban konkrét megvalósítási példákon keresztül kívánjuk szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.

Protein-tirozin kináz kimérák előállítása és hatékonyságuk kimutatása

Sejtfelszíni receptorkinázokra emlékeztető proteineket kódoló génfúziókat állítottunk elő oly módon, hogy a CD16-molekula extracelluláris doménját kódoló DNS-fragmenst a CD7 membránközeli és transzmembrándoménjait kódoló rövid betét- („spacer”-) szegmenshez kapcsoltuk, mely utóbbit viszont a humán Lek [Koga és munkatársai: Eur. J. Immunoi. 16, 1643 (1986)], az egér Fyn(T) [Cooke és Perimutter: New Bioi. 1, 66 (1989)], a sertés Syk [Taniguchi és munkatársai: J. Bioi. Chem. 266, 15 790 (1991)], valamint a humán ZAP-70 [Chan és munkatársai: Cell. 71, 649 (1992)] tirozinkinázok teljes kódolószekvenciájához kötöttük (1A. ábra). Az így kapott, három részből álló génfúziókat homológ rekombinációs technikával és az E. coli gpt-géntermék koexpressziójára történő szelekcióval rekombináns vacciniavírusokba juttattuk. Sej13

HU 224 137 Β1 tek fertőzése a rekombinánsokkal mind a négy kinázkiméra hatékony sejtfelszíni expresszálódását eredményezte (1B. ábra). A kapott proteinkimérák anti-CD16ellenanyagokkal történő immunprecipitációjával a vártnak megfelelő molekulatömeggel rendelkező molekulák jelenlétét sikerült kimutatni, melyek in vitro foszforilezési vizsgálati eljárás szerint aktívnak bizonyultak (1C. ábra).

Ezt követően azt vizsgáltuk, hogy a fúziós proteinek közti keresztkötések kialakulása lehetővé teszi-e szabad intracelluláris kalcium felhalmozódását, hasonló módon ahhoz, ami T-sejt antigénreceptor intracelluláris doménjain alapuló fúziós proteinek esetében megfigyelhető. Ebből a célból különböző sejteket vacciniarekombinánsokkal fertőztünk, és az extracelluláris doménok ellenanyagokkal történő keresztkötését követően mértük a citoplazmában a relatív kalciumkoncentrációt. Mind spektrofluorometriás (nagyobb sejtpopulációra vonatkozó), mind áramlási citometriás (különálló sejtekre vonatkozó) méréseket végeztünk, lndo-1-festékkel telített sejtek alkalmazásával [Grynkiewicz és munkatársai: J. Bioi. Chem. 260, 3440 (1985); Rabinovitch és munkatársai: J. Immunoi. 137, 952 (1986)]. Áramlási citometriás analíziseket olyan sejtekből származó adatok alapján végeztünk, melyeknek a fikoeritrin-fluoreszcencia-intenzitás alapján meghatározott sejtfelszíni CD16-expressziója egy viszonylag keskeny, előre meghatározott tartományba esett. Bár a fenti tartományban az átlagos fluoreszcencia intenzitásának vonatkozásában kismértékű variációkat észleltünk (a sejtek által expresszált kimérák felszín alatti eloszlásában lévő eltérések következtében), ez a megközelítési mód lehetővé tette számunkra körülbelül azonos számú receptort hordozó sejtekben létrejött válasz összehasonlítását. A 2. ábra Jurkat-féle, humán T-sejtes leukémia-sejtvonal mutációs variánsához tartozó sejtekből származó adatok analízisét mutatja, mely sejtvonalból hiányzik a T-sejt antigénreceptor [Weiss és Stobo: J. Exp. Med. 160, 1284 (1984)]. Ezekben a sejtekben sem az Lek-, sem a Fyn-kimérák nem rendelkeztek azzal a képességgel, hogy keresztkötések létrejöttét követően kalciummobilizációt idézzenek elő. Néhány kísérletben az Lek fúziós proteinek csoportosulása a nyugalmi kalciumkoncentráció enyhe csökkenéséhez vezetett a negatív kontrolihoz képest, mely az FcRIIB2 alacsony affinitású IgG-receptor intracelluláris doménján alapuló fúziós protein volt [Kolanus és munkatársai: EMBO J. 11, 4861 (1992)]. Mind a ZAP-70-, mind a Syk-kinázokon alapuló fúziós proteinek aggregációja nagy hatékonysággal elősegítette az intracelluláris szabad kalciumion megjelenését, nagyjából olyan hatékonysággal, mint a T-sejt-receptor-zéta-lánc intracelluláris doménját hordozó, hasonló kiméra aggregációja. A kalciumválasz létrejöttének kezdete vonatkozásában mind a ZAP-70-, mind a Syk-kináz-kimérák esetében kismértékű késleltetést észleltünk a zéta-kíméra által történő kalciummobilizálódás kezdetéhez viszonyítva. T-sejt-receptor-pozitív sejtekben (3. ábra) a Syk-kimérák által létrehozott változások értékelését némileg zavarta a magas nyugalmi szabad kalciumion-koncentráció, ami a kalciumszabályozó rendszer folyamatos működésére utal.

A kimérák citolitikus T-sejtvonalba történő juttatása lehetővé tette a fúziós proteinek effektorfunkciót kiváltó képességének vizsgálatát. Ebben a vizsgálati eljárásban anti-CD16-hibridómasejteket alkalmaztunk célsejtekként, melyek CD16-receptorral szemben sejtfelszíni IgG-ellenanyagokat expresszálnak [Fleit és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 3275 (1982); Shen és munkatársai: Mól. Immunoi. 26, 959 (1989)]. A hibridómasejteket ⁵¹Cr-kromát-beépüléssel jelöltük, és azokat olyan effektorsejtekkel együtt ülepítettük, amelyeket humán allospecifikus citotoxikus T-limfocita (CTL) sejtvonalnak CD16/CD7/kináz fúziós proteineket expresszáló vacciniarekombinánsokkal történő fertőzésével állítottunk elő. A kimérareceptor-kinázok expresszálódása a fertőzött CTL-sejteket képessé teszi a célsejtekhez történő kötődésre és - amennyiben kompetensek - azok lizálására, mely folyamatot a beépült ⁵¹Cr-kromát felszabadulásán keresztül mértünk. A „felfegyverzett” („armed”) T-sejtek relatív lizálóképességét oly módon határoztuk meg, hogy összehasonlítottuk a meghatározott mértékű ⁵¹Cr-felszabaduláshoz szükséges effektorsejt-célsejt arányokat. A 4A. ábra azt mutatja, hogy az Src-családba tartozó Lek- vagy Fyn(T)-kinázokat, vagy a Syk-családba tartozó ΖΑΡ-70-kinázt tartalmazó kimérareceptorokat expresszáló CTL-ek nem képesek citolízis közvetítésére anti-CD16-hibridómacélsejtekkel szemben. A Syk-protein-terméken alapuló kinázkimérát expresszáló CTL hatékonysága azonban lényegében megegyezett egy olyan kimérát expresszáló CTL hatékonyságával, amely a CD16-ot az előzőhöz hasonló módon, T-sejt-receptor zéta-láncának intracelluláris doménjával fuzionáltatva tartalmazza. A CD16/CD7/kináz kimérák által kiváltott citolitikus aktivitás nem magyarázható citotoxikus granulumok nemspecifikus felszabadulásával, mivel krómmal telített semleges célsejtek együttes szedimentációja a kinázokkal felfegyverzett CTL-limfocitákkal nem eredményezte jelölt króm kimutatható mértékű felszabadulását (4B. ábra).

A citolitikus vizsgálati eljárásban a Syk- és ZAP-70kinázok aktivitása közt tapasztalt eltérés nem felelt meg a várakozásnak, tekintve, hogy a két kiméra a kalciumválasz vizsgálatára szolgáló eljárásban hasonló aktivitást mutatott. Figyelembe véve, hogy nem kiméra ΖΑΡ-70-kináz és Src-családba tartozó kinázok koexpressziója COS-sejtekben aktivációt hoz létre [Chan és munkatársai: Cell. 71,649 (1992)], megvizsgáltuk kinázkimérapárok citolízist létrehozó relatív képességét. CTL-effektorsejteket egyszerre, ZAP-70- és Lck-kimérákat, ZAP-70- és Fyn(T)-kimérákat, vagy Lek- és Fyn(T)-kimérákat expresszáló rekombináns vacciniavírusokkal fertőztünk. Az 5A. ábra azt mutatja, hogy ZAP-70- és Fyn(T)-kimérák, vagy ZAP-70- és Lck-kimérák együttes expresszálódása CTL-limfocitákban a csak CD16/CD7/Syk-kináz kimérákat expresszáló CTL-limfociták aktivitásával lényegében megegyező aktivitást hozott létre, mely aktivitás viszont megegyezett a CD16/CD7/zéta kimérák által kiváltott aktivitással. Az

HU 224 137 Β1

Lek- és Fyn(T)-kimérák együttes expresszálódása nem hozott létre jelentős célzott citolitikus hatást anti-CD16 célsejtekkel szemben (5A. ábra). A kalciummobilizálódási képesség vizsgálata kináz fúziós protein-párokkal fertőzött sejtekben azt mutatta, hogy a ZAP-70 és az Src-családba tartozó kinázkimérák együttes expresszálódása növelte a receptor-keresztkötések hatására létrejövő kalciummobilizálódás sebességét, valamint az Lek- és Fyn(T)-kimérák együttes expresszálódása nem eredményezte intracelluláris szabad kalcium jelentős mértékű felhalmozódását (5B. ábra). A Fyn-kiméra koaggregáció által kiváltott aktivációs válaszreakcióban betöltött szerepének további vizsgálata céljából olyan Fyn-kimérákat állítottunk elő, melyek a CD16-kimérákhoz hasonló módon Fyn-kinázhoz fuzionáltatva tartalmazták a CD4 extracelluláris és transzmembrándoménját. Az 5C. ábra azt mutatja, hogy ennek a kimérának a hatékonysága célzott citolitikus vizsgálati eljárásban tízszer-hússzor alacsonyabb volt, mint a hasonló CD16-kiméráé, ami ama utal, hogy a kimérakinázok között létrejövő fizikai kapcsolat lényeges az aktiváció szempontjából. A két kimérát expresszáló sejtek citolitikus aktivitása azonban lényegesen nagyobb, mint a csupán ΖΑΡ-70-kimérát expresszáló sejtek esetében tapasztalható aktivitás. A fenti rendszerben a viszonylag magas szintű kinázexpresszálódás következtében nem lehet kizárni azt, hogy a maradék aktivitás a CD4/Fyn kimérának CD16/ZAP-70 kimérával történő spontán, véletlenszerű kapcsolódását tükrözi.

Annak bizonyítása céljából, hogy a kalcium-válaszreakciós, valamint citolitikus vizsgálati eljárásokban megfigyelhető aktiválódás a megfelelő kinázaktivitás közvetlen következménye volt, és nem a kinázok meglevő szignáltranszdukciós elemekkel történő passzív asszociációjának tudható be, amelyek közvetett aggregációja azután kiváltotta az aktivációs válaszreakciót, mind a sertés-Syk-, mind a humán ΖΑΡ-70-receptor-kimérák esetében kináznegatív variánsokat állítottunk elő. A 6. ábra azt mutatja, hogy a lényegében a teljes kinázdoméntól mentes receptorkimérák (a Syk-kináz esetében) vagy a foszfotranszferázaktivitást megszüntető pontmutációt hordozó receptorkimérák (a ZAP-70 esetében) nem rendelkeztek in vitro kinázaktivitással, és keresztkötések létrejöttét követően nem voltak képesek kalciummobilizálás közvetítésére vagy receptor közvetítette célzott citolízis kiváltására.

Mivel a sertés-Syk-kináznak a humán sejtapparátussal történő kölcsönhatása nem biztos, hogy megegyezik a humán Syk-kinázéval, humán Syk-szekvenciák PCR-eljárással, a sertés-proteinszekvencia aminoterminális és karboxiterminális végének megfelelő láncindító oligonukleotidok alkalmazásával történő izolálását követően humán Syk-kinázon alapuló, a fentiekhez hasonló proteinkimérákat állítottunk elő. A 7A. ábra azt mutatja, hogy a sertés- és humán Syk rendkívül hasonló proteinek, amint azt a kináz és a második SH2-doménrészeknek megfelelő PCR-termékek analízise bizonyítja [Chan és munkatársai: Cell. 71, 649 (1992)]. Ezzel összhangban, a humán Syk-kiméra-receptor-proteinek a kalciumfelszabadulási és citolitikus vizsgálati eljárásokban lényegében a sertéskonstrukciókkal megegyező módon viselkedtek (7B. és

7C. ábrák).

Annak megállapítása céljából, hogy a protein-tirozin kináz kimérák aggregációja jelentős mértékű változást hoz-e létre a foszfotirozin-proteinek mennyiségében, T-sejt-receptor-negatív sejteket a kimérakinázokat kódoló vacciniarekombinánsokkal fertőztünk. A kimérák extracelluláris doménjai között ellenanyagokkal keresztkötéseket hoztunk létre, és az aktivált sejtek teljes lizátumát elektroforézissel frakcionáltuk, membránra vittük át, és foszfotirozint felismerő ellenanyagok alkalmazásával analizáltuk. Lizátumokat a sejtek nemionos detergenssel, vanadát jelenlétében, EDTA-val vagy anélkül történő roncsolásával, vagy nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében történő lizálással, majd a felszabadult DNS ultrahanggal történő darabolásával állítottunk elő. A foszfotirozin-proteinek mintája mindegyik esetben eltérő volt, és vanadát jelenlétében, de EDTA nélkül készült lizátumokban olyan további proteinek voltak megfigyelhetők, melyek a csupán SDS-sel előállított mintákban nem voltak jelen, ami azt jelenti, hogy az EDTA a lízist követően gátolhatja a tirozin kinázok, valamint foszfatázok hatását. SDS-ben történő közvetlen lizálás a protein-tirozin-foszforileződés sokkal reprodukálhatóbb mintáit hozta létre, mint nemionos detergensben, EDTA és vanadát jelenlétében végzett lizálás. A 8. ábra azt mutatja, hogy Syk-, ZAP-70-, vagy Fyn- és ΖΑΡ-70-kinázokat hordozó kimérák aggregációja több olyan proteintípus fokozott foszforileződését eredményezi, melyek együtt vándorolnak antigénreceptor-keresztkötések létrejöttét követően fokozott foszforileződést mutató proteinekkel. Közelebbről, a Syk-kimérák csoportosulása által létrehozott csíkminta nagyon hasonló ahhoz, amelyet T-sejt-receptor-pozitív sejtekben anti-CD3-ellenanyagok váltanak ki (8. ábra). Ezek között található egy Syk-kiméra-aggregáció által kiváltott, körülbelül 150 kD protein, amelynek megjelenése Fyn- és ΖΑΡ-70-kimérák koaggregációjával szintén kiváltható. Előzetes kísérletek szerint ez a foszfoprotein együtt vándorol foszfolipáz-C-g-vel (az adatokat nem tüntettük fel).

Abból a célból, hogy a kinázkimérák csoportosulásának PCL-g-re kifejtett közvetlen hatását megvizsgáljuk, kimérák között keresztkötéseket hoztunk létre, a PCL-g-t monoklonális ellenanyagok elegyével precipitáltuk, és a kapott immunprecipitátumokban analizáltuk a foszfotirozil-proteinek jelenlétét. A 9. ábra azt mutatja, hogy a Syk-kináz csoportosulása a PCL-g tirozin-foszfát-tartaimának jelentős emelkedéséhez vezetett, míg Fyn- és ΖΑΡ-70-kimérák közti keresztkötések létrehozása a tirozin-foszfát-tartalom kevésbé drámai, de könnyen kimutatható emelkedését eredményezte. A csupán Fyn-kimérát expresszáló sejtekben a PCL-g mérsékelt, alapszintű foszforilációja volt kimutatható, amely receptoraggregációt követően nem növekedett (9. ábra). Jelenleg még nem ismert, hogy ugyanazok a tirozin aminosavak foszforileződnek-e a Syk-, Fyn-, valamint ZAP-70- és Fyn-kimérák által. Mivel Fyn-kimérát expresszáló sejtekben nem volt kimutatható sem

HU 224 137 Β1 alapszintű, sem indukált kalciummobilizáció, az ezen sejtek esetében megfigyelhető foszfotírozinszignál valószínűleg más PCL-g-helyek részvételét tükrözi, mint a foszfolipázaktivációt közvetítő helyek.

Hogy a foszfotirozinmintában megfigyelhető változásokra magyarázatot kapjunk, előzetes kísérleteket végeztünk, melyekben a különböző kinázok csoportosulásának kiváltását követően, egy in vitro autofoszforilezési vizsgálati eljárásban meghatároztuk azok aktivitását. A kimérákat aggregáltattuk, immunprecipitáltuk, és meghatároztuk azon képességüket, hogy az immunprecipitátumban található proteinfajtákba foszfátjelölés beépülését idézzék elő. A 10A. ábra azt mutatja, hogy ezen feltételek mellett keresztkötések létrehozását követően nem volt megfigyelhető a kinázaktivitás növekedése, amennyiben a kinázaktivitási vizsgálatot tíz percig végeztük. Bár a jelölt foszfát beépülése a fenti vizsgálati eljárásban 30 percig folyamatosan növekszik, nem világos, milyen faktorok korlátozzák az aktivitást; az adott esetben, a megfigyelt kinetika vonatkozásában döntő lehet az immunkomplexek disszociációjának aránya, amely lehetővé teheti a kináz fel nem használt szubsztrátokhoz történő diffúzióját. Az előbbi hatás kiküszöbölése, valamint a vizsgálati eljárás érzékenységének maximalizálása céljából meghatároztuk a Syk-kináz-aktivitást keresztkötések létrehozását követően, valamint azt megelőzően, egy igen rövid, 5-30 másodperces időtartam során; ebben az esetben sem volt azonban jelentős kinázaktivitás-növekedés megfigyelhető (10B, ábra). Jelenleg nem zárható ki az a lehetőség, hogy megfelelő szubsztrát alkalmazásával aktivitásnövekedést tudnánk kimutatni; aggregáció által kiváltott fokozott Syk-kiméra-aktivitás akkor sem volt megfigyelhető, amikor a kinázaktivitás kimutatására exogén peptidszubsztrátot (a cdc-2 aminosavszekvencia 6-20. aminosavai, a 19. pozícióban Y-K szubsztitúcióval) alkalmaztunk.

Az alábbiakban részletezzük a fenti jelenség lehetséges mechanizmusait.

Az a mechanizmus, amely révén egy egyszerű fizikai stimulus, nevezetesen receptoraggregáció, az immunrendszer sejtjei számára elkülöníthető kémiai szignál átvitelét eredményezi, nem ismert. Korábbi vizsgálatok során megállapították, hogy az Src-családba tartozó kinázok számos fontos, az immunrendszer aggregáció révén aktiválódó receptorával kapcsoltan megtalálhatók, és az ilyen receptorok közti keresztkötések létrehozása gyakran fokozott kinázaktivitáshoz vezet. Nemrégiben az egymással rokonságban álló Syk- és ΖΑΡ-70-kinázokról mutatták ki, hogy vagy stabilan (a Syk esetében), vagy átmenetileg (a ZAP-70 esetében) B- és T-sejt antigénreceptorokkal kapcsolódnak, és legalább a Syk-kináz esetében a receptor-keresztkötés fokozott kinázaktivitást eredményez.

Vizsgálataink során kimutattuk, hogy a Syk-kinázok családjába tartozó kinázok aggregációja, de nem az Src-családba tartozó Lek- és Fyn-kinázok aggregációja, T-sejt-receptort nem hordozó sejtekben kalcium-válaszreakciót hoz létre. A válaszreakció, úgy tűnik, nem más T-sejt-receptorokkal vagy szignáltranszdukciós összetevőkkel történő közvetett kapcsolódás révén jön létre, mivel kináznegatív mutánsok nem képesek a kalcium-válaszreakció kiváltására. A Syk-kinázt tartalmazó kimérák aggregációja elegendő specifikus citolízis kiváltásához, míg a ΖΑΡ-70-kimérával létrehozott hasonló citolízishez szükség van egy Src-családba tartozó kináz további közreműködésére. Jelenleg nem világos, hogy melyik, Syk-családba tartozó kináz játszik fontosabb szerepet a T-sejt-aktiválásban: mind a ZAP-70-, mind a Syk-kináz expresszálódik T-sejtekben, például a saját vizsgálatainkban alkalmazott sejtvonalakban, és legalább egy válaszreakcióra képes humán T-sejtvonal tartalmaz Syk-kinázt, de nem tartalmaz ΖΑΡ-70-kinázt, amint azt specifikus PCR-amplifikációs termékek alapján megállapítottuk. A Syk-kimérák csoportosulását követően megfigyelhető fokozott protein-tirozin foszforileződésre utaló minta igen hasonló ahhoz a mintához, amelyet T-sejt antigénreceptorok keresztkötését követően láthatunk.

Immunrendszeri sejtek nem receptor tirozin kinázok által történő aktiválása, egy egyszerű modell szerint, receptorral kapcsolt kinázok közreműködésével történik, amelyek aggregációja fizikai kapcsolat létrejötte révén (például aktív kinázdimerek képződése révén) vagy egyidejű enzimatikus hatás révén (például keresztfoszforileződés révén) vezet aktiváláshoz; az aktivált enzim ezután a kalciummobilizációhoz és inozitol-foszfát-szintézishez szükséges, kulcsfontosságú intracelluláris szubsztrátokra fejti ki hatását. Ennek az eseménysornak a valószínűségét támasztják alá azok a vizsgálatok, melyek receptorok közti keresztkötések létrejöttét követően fokozott, receptorral kapcsolatos kinázaktivitásról adnak hírt [lásd például Bólén és munkatársai: Adv. Cancer Rés. 57, 103 (1991); Burkhardt és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7410 (1991); Eisman és Bólén: Natúré 355, 78 (1992); Hutchroft és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9107 (1992)/J. Bioi. Chem. 267, 8613; Tsyganov és munkatársai: J. Bioi. Chem. 267,18 259 (1992); Wong és munkatársai: Oncogene 7, 2407 (1992)]. A legtöbb esetben azonban a kinázaktivitásban csak mérsékelt változásokat tudtak kimutatni, és azok ellentétben álltak a foszfotirozil-protein-mintában in vivő megfigyelhető drámai változásokkal. Mivel in vitro kinázaktivitási vizsgálati eljárások alkalmazása mellett nehéz egyértelműen kizárni gyenge alloszterikus kölcsönhatások szerepét az aktiválásban, jelenleg nem lehet határozott álláspontot elfoglalni a kinázaktiválásnak a szignáltranszdukció kiváltásában betöltött viszonylagos fontosságára vonatkozólag. Az itt feltárt adatok azonban arra utalnak, hogy enzim és szubsztrát aggregáció által kiváltott újraeloszlása lényeges faktor lehet egy meglevő aktivitásnak megfelelő fiziológiai célponttal szemben történő irányításában.

Syk-családba tartozó kinázokon alapuló kimérák aggregációja kalcium-válaszreakcióhoz vezetett, amely kismértékben késleltetett volt, de amplitúdója megfelelt az endogén T-sejt-receptort nem tartalmazó sejtekben zéta-receptorkimérák aggregációját követően megfigyelhető válaszreakciónak. A ΖΑΡ-70-kimérák közti ke16

HU 224 137 Β1 resztkötések kialakulását követően a szabad kalciumion megjelenésében sokkal nagyobb késleltetés volt megfigyelhető, és ez a késleltetés ZAP-70- és Fyn-kimérák közti keresztkötések létrehozásával lényegében megszüntethető volt. A megfigyelt késleltetés magyarázata jelenleg nem ismert. Mivel a keresztkötések létrejötte felgyorsította a kalciummobilizációt, a késleltetés magyarázatául szolgálhat a ZAP-70 viszonylag kisebb hatékonyságú aggregáció által közvetített autoaktivációja. De egyéb faktorok éppily fontosak lehetnek, és a ZAP-, valamint Syk-kinázok sejtfelszínhez történő „kipányvázása” az események rendes menetével összehasonlítva, valójában gátolhatja az aktivációt; például ha az események rendes menete során a Syk-családba tartozó kinázok átmenetileg a csoportosult receptorok köré gyűlnek, aktiválódnak, majd felszabadulnak és szubsztrátjaikhoz diffundálnak, a kinázdomén állandó kapcsolódása a plazmamembránnal korlátozó hatást fejthet ki, gátolva a szubsztráthoz történő eljutást és/vagy korlátozva a szignálamplifikációt, mivel a kimérareceptor nem képes a kinázaktiválás számára egyfajta katalitikus centrumként funkcionálni.

A kalcium-válaszreakció másik különleges sajátossága az volt, hogy humán vagy sertés Syk-kinázokon alapuló kimérákat expresszáló T-sejt-receptor-pozitív sejtekben magas alapszintű, szabad kalciumion-koncentráció volt megfigyelhető, ami azt jelenti, hogy a kalcium-válaszreakció spontán módon kiváltódik. Receptornegatív sejtekben nem sikerült hasonló jelenséget kimutatni. Ez az eredmény ellentétes az általunk megfigyelt általános tendenciával, mely szerint T-sejt-receptor-negatív mutáns, humán T-sejtes tumorsejtvonalak tipikusan hiperszenzitív válasszal reagálnak kívülről bejuttatott kiváltómolekulákra. A spontán aktivációs folyamatban T-sejt-receptorok részvételére való nyilvánvaló igényre két lehetséges, egymáshoz közel álló magyarázatot dolgoztunk ki. Az egyik szerint a kiméra Syk-kináz kifejtheti hatását folyamatosan a T-sejt-receptor intracelluláris doménjaira úgy, hogy a receptorkiméra SH2-doménjai számára foszfotirozin-célcsoportokat hoz létre, ily módon multivalens T-sejt-receptor-hídon keresztül intracelluláris aggregációhoz vezet, ami viszont kinázaktivációt eredményez. Egy másik lehetőség szerint T-sejt-receptor-negatív sejtvonalakban alacsonyabb a Syk-kináz-aktiváláshoz szükséges, membránnal kapcsolatos kinázszint; vagy azért, mivel a teljes szabályozókör a feltételezett kinéz csökkent de novo szintéziséhez vezet, vagy azért, mivel az antigénreceptor hiánya szabályozatlan intracelluláris megoszlást eredményez.

B-sejtekben a Syk-kinázról leírták hogy az állandó kapcsolatban van az IgM-antigénreceptor intracelluláris elemeivel [Hutchroft és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9107 (1992); Hutchroft és munkatársai: J. Bioi. Chem. 267, 8613 (1992)]. Ennek a kapcsolódásnak a pontos mechanizmusa nem ismert, de lehetséges, hogy nincs szükség foszfotirozinra a Syk-kináz SH2-doménjai, valamint az mb-1 citoplazmatikus doménján és Β-29-receptorláncokon jelen levő tirozin kiváltóelemek közti kölcsönhatáshoz. Ezt a magyarázatot támasztja alá részben az a megfigyelés, hogy a Philadelphia-kromoszóma töréspont csoportosulási régió („breakpoint cluster” régió) BCR-génterméke foszfotirozinindependens módon különböző SH2-doménokhoz kötődik [Pendergast és munkatársai: Cell. 66, 161 (1991); Muller és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 12, 5087 (1992)]. Ebben az esetben azonban valószínűnek látszik, hogy a kölcsönhatásban foszfoszerin és/vagy foszfotreonin aminosavak játszanak kulcsfontosságú szerepet. Más magyarázat szerint a Syk-kináz az IgM-receptor intracelluláris elemeivel kapcsolódhat a Syk-kináz SH2-elemei és a katalitikus dómén között található egyedi régión keresztül. Egy harmadik lehetőség szerint igen kis mennyiségű tirozin-foszforilezett peptidre van szükség funkcionálisan számottevő mennyiségű Syk-kináznak a plazmamembrán intracelluláris felszínéhez történő gyűjtéséhez, és ezt a kis mennyiségű tirozin-foszfátot eddig nem sikerült kimutatni.

Bár B-sejtekben az Src-családba tartozó kinázok aktivációs folyamatban betöltött szerepét nem mutatták ki határozottan, T-sejtekben található két kinázról, az Lckés Fyn(T)-kinázokról szomatikus vagy teljes szervezeti genetikával kimutatták, hogy lényeges szerepet töltenek be [Appleby és munkatársai: Cell. 70, 751 (1992); Karnitz és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 12, 4521 (1992); Stein és munkatársai: Cell. 70, 585 (1992)]. Jelenleg nem tudjuk határozottan megmondani, hogy a fenti kinázok működése normális körülmények között megelőzi vagy követi a Syk-családba tartozó kinázokét. Egy, a ZAP-70 T-sejt-aktivációban betöltött szerepét magyarázó feltevés szerint az aktiváció egy receptorral kapcsolódó, Src-családba tartozó kináz közreműködésével megy végbe, oly módon, hogy az előbbi aggregációja lehetővé teszi receptorláncok átmeneti foszforileződését, ami viszont ΖΑΡ-70-kináz kapcsolódásához, majd sejtaktivációhoz vezet. A fenti modellben a receptorláncok kezdeti fázisban történő foszforileződését meg kell különböztetnünk a zéta-láncok stabil foszforileződésétől, ami hosszabb távon, receptor-keresztkötések létrejöttét követően megy végbe.

Egér-T-sejtekben a T-sejt-receptor-komplexek kis része zétával rokonságot mutató éta-molekulát tartalmaz [Baniyash és munkatársai: J. Bioi. Chem. 263, 9874 (1988)], amely egy alternatív hasítási formát képvisel [Clayton és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5202 (1991)]. Az éta- a zéta-molekulától annak karboxiterminális végén különbözik, az előbbiben az egér-zéta-molekulában található hat tirozinból a legszélső hiányzik [Jin és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3319 (1990)]. Bár egér-TCR zéta-zéta izoformok zéta-láncának foszforileződése ellenanyag által közvetített receptor-keresztkötések létrehozását követően könnyen kimutatható, hasonló feltételek mellett a TCR éta-láncának foszforileződése nem mutatható ki [Bauer és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3842 (1991)]. A zéta-lánc stabil foszforileződéséhez, úgy tűnik, két egymáshoz közel elhelyezkedő zéta-láncra van szükség, mivel zéta-éta heterodimereket tartalmazó TCR-izoformok receptor-kereszt17

HU 224 137 Β1 kötések létrehozását követően nem foszforileződnek [Bauer és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3842 (1991)]. A foszforileződésben megfigyelhető eltérés ellenére, a csupán éta-homodimereket hordozó TCR-receptorokat tartalmazó sejtvonalak funkcionálisan nem különíthetők el a csak zéta-homodimereket hordozó sejtvonalaktól [Bauer és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3842 (1991)]. A zéta-lánc foszforileződése tehát, amely 30 perccel az ellenanyag által közvetített receptor-keresztkötések létrehozását követően megfigyelhető, nincs összefüggésben az aktivációval. Egy másik tanulmányban, amelyben foszfotirozin-foszfoproteinek felhalmozódásának időbeni lefolyását vizsgálták TCR-aggregációt követően, azt találták, hogy legkorábban két, 135 és 100 kD molekulatömegű protein figyelhető meg, melyek foszforileződése a keresztkötések létrejöttét követően először egyenként 5 és 15 másodperc elteltével mutatható ki, és amelyeknél a maximális foszforileződés felének eléréséhez szükséges idő, ami mindkét esetben körülbelül 30 másodperc, megelőzi a maximális kalciummobilizációhoz és inozitol-foszfát-képződéshez szükséges időt [June és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 7722 (1990); June és munkatársai: J. Immunoi. 144, 1591 (1990)]. Ezzel szemben a zéta-lánc foszforileződésének sebessége lényegesen kisebb, ez a maximális szubsztitúció felét a stimulációt követően körülbelül 3-5 perccel, jóval a kalciumfelhalmozódást és az inozitol-foszfátok felszabadulását követően éri el [June és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 7722 (1990); June és munkatársai: J. Immunoi. 144, 1591 (1990)].

Amennyiben tehát a két lépésből álló modell megfelel a valóságnak, a ΖΑΡ-70-kináz plazmamembrán belső felszínéhez történő „toborzásához szükséges tirozin-foszforileződésnek a fenti vizsgálatokban megfigyelhetőnél sokkal gyorsabb, feltehetően átmeneti eseménynek kell lennie. Nemrégiben leírták, hogy receptor-keresztkötések létrehozását követően, mind zéta-, mind CD3-epszilon-láncokon elég gyorsan (körülbelül tizenöt másodperc elteltével kezdődően) meginduló tirozin-foszforileződést lehet kimutatni [Wange és munkatársai: J. Bioi. Chem. 267, 11 685 (1992)], és mind zéta-, mind epszilon-láncokkal kapcsolódva egy 70 kD molekulatömegű, tirozin-foszfát-tartalmú protein mutatható ki. Egyelőre nem világos, hogy a foszforilezett receptorláncokkal történő stabil kapcsolódás létrejötte előfeltétele-e a sikeres T-sejt-aktiválásnak.

Általánosságban azonban kijelenthetjük, hogy az általunk feltárt eredmények szerint a Syk-családba tartozó kinázok sokkal közvetlenebb módon fejtik ki hatásukat a T-sejtek effektorapparátusára, mint az Src-családba tartozó kinázok. Egyre több bizonyíték támasztja alá azt, hogy az Src-családba tartozó kinázok számos olyan sejtfelszíni molekulával kapcsolódhatnak, amelyek nem tagjai az antigén/Fc-receptor családnak, például CD2- [Bell és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 12, 5548 (1992)], CD23- [Sugie és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9132 (1991)], CD36-molekulákkal [Huang és munkatársai: J. Bioi. Chem. 267, 5467 (1992)], IL-2-receptor béta-lánccal [Hatakeyama és munkatársai: Science 252, 1523 (1991)], valamint különböző, foszfatidil-inozitol által lehorgonyzott proteinekkel [Stefanova és munkatársai: Science 254, 1016 (1991); Thomas és Samelson J. Bioi. Chem. 267, 12 317 (1992)], melyek közül egyesekről ismert, hogy T-sejtekben az akti váció előmozdításához az antigénreceptor jelenlétét igénylik. Az utóbbi igény magyarázata egyszerűen az lehet, hogy az antigénreceptoron található kiváltóelemek az Src-családba tartozó kinázok szubsztrátját képezik, ezáltal lehetővé teszik a Syk-családba tartozó kinázokkal történő összekapcsolódást, majd esetleg valamilyen módosító folyamatot követően, elősegítik azok aktiválását. Figyelembe véve a foszforileződés és aktiválás közti ok-okozati lánc felállításának nehézségeit, lehetséges az is, hogy a kiváltóelemek csak átmeneti szereppel rendelkeznek, egyfajta katalitikus centrumként működve a „toborzáshoz”, aktiváláshoz és effektorkinázok felszabadításához.

Az Src-családba tartozó kinázok széles körben elterjedtek a nem hematopoetikus sejtvonalak között, Fyn-negatív egereken végzett újabb vizsgálatok azt mutatták, hogy a Fyn-kináz szerepet játszik a hosszú távú aktivált állapot fenntartásában, azaz a facilitált szinaptikus átvitel jelenségében, amiről feltételezik, hogy az asszociatív memória kezdeti rögzülésének alapját képezi [Grant és munkatársai: Science 258, 1903 (1992)]. Amennyiben más sejttípusokban hasonló aktivációs folyamatokat Src-családba tartozó kinázok közvetítenek, a Syk-családba tartozó kinázokról is kiderülhet, hogy sokkal elterjedtebbek a vérképző rendszeren kívüli terekben.

Az alábbiakban ismertetjük a kísérleti eljárásokat.

Kimérák előállítása: A humán Lek- [Koga és munkatársai: Eur. J. Immunoi. 16, 1643 (1986)], az egér Fyn(T)- [Cooke és Perimutter: New Bioi. 1, 66 (1989)], a sertés Syk- [Taniguchi és munkatársai: J. Bioi. Chem. 266, 15 790 (1991)], valamint a humán ZAP-70- [Chan és munkatársai: Cell. 71, 649 (1992)] kinázok teljes kódolórégióját egy olyan kiméra transzmembránprotein intracelluláris doménjához kapcsoltuk, amely a CD 16 extracelluláris doménját egy rövid „nyél”-szegmenshez és a CD7 transzmembrándoménhoz kötve tartalmazta. A CD7 intracelluláris domént a stop-transzferszekvenciánál egy Miül hasítási hely hozzáadásával csonkítottuk. Az egyes kinázokat a megfelelő olvasási fázisban Mlu hasítási hellyel láttuk el, hogy a három részből álló fúziós protein expresszálódását lehetővé tegyük. A sertés-Syk-kinázt teljes, sertés-limfocita-RNS alapján végzett reverz transzkripcióval és PCR-reakcióval kaptuk, megfelelő restrikciós helyeket tartalmazó láncindító oligonukleotidok alkalmazásával. Hasonló módon nyertünk ΖΑΡ-70-szekvenciákat humán T-sejt cDNS-génkönyvtár alapján végzett PCR-reakcióval. Több izolátumot szekvenáltunk párhuzamosan, és mindegyik kináz esetében restrikciós fragmens cserével mutációtól mentes kódolószekvenciát állítottunk elő. Az így kapott kódolószekvenciákat a CD16/CD7 szekvenciáktól 3’-irányban vacciniavírus expressziós vektorba inszertáltuk. Humán Syk-kinázt természetes ölő18

HU 224 137 Β1 sejt (,,killer”-sejt) cDNS-génkönyvtárból és Daudi-féle sejtkönyvtárból izoláltunk a sertésszekvencia végeinek megfelelő láncindító oligonukleotidok alkalmazásával. Az előreirányuló („forward”) láncindító oligonukleotid az alábbi szekvenciával rendelkezett: ATG GCA GAC AGT GCC AAC CAC TTG CCC TTC TTC T, a reverz láncindító oligonukleotid pedig a következő szekvenciát tartalmazta: CGC GGG GCG GCC GCT TTA ATT CAC CAC GTC GTA GTA GTA. Miután az első amplifikációt követően a vártnak megfelelő méretű csíkok jelenlétét mutattuk ki, egy második (10 ciklusból álló) amplifikációt végeztünk, az 5’-végen olyan lánchosszabbító láncindító oligonukleotid alkalmazásával, mely az alábbi szekvenciával rendelkezett: CGC GGG ACG CGT ACC ATG GCA GAC AGT GCC AAC, lehetővé téve a fragmens Mlul-enzimmel emésztett vektorba történő ligálását.

Kalciummobilizációs vizsgálati eljárás Áramlási citometriás, valamint a sejtek szétválasztása nélküli spektrofotometriás vizsgálatokat végeztünk rekombináns kinázokat expresszáló sejteken kalciumszenzitív fluorofór lndo-1-festék alkalmazásával, a korábbiakban leírtak szerint [Romeo és Seed: Cell. 64, 1037 (1991); Romeo és munkatársai: Cell. 68, 889 (1992)]. Röviden, Jurkat-féle sejtektől származó, JRT-3.T-3.5 jelzésű mutáns sejtvonalhoz tartozó sejteket [Weiss és Stobo: J. Exp. Med. 160, 1284 (1984)] egy órán át, szérummentes IMDM-tápfolyadékban rekombináns vacciniavírusokkal fertőztünk, melynek során a fertőzés multiplicitása (MOI) 10 volt, majd a sejteket 3-9 órán át, 10% FBS-t (fötális szarvasmarhaszérumot) tartalmazó IMDM-tápfolyadékban inkubáltuk. A sejteket centrifugálással összegyűjtöttük, és milliliterenként 3*10⁶ sejt sűrűségben, 1 mmol/l lndo-1-aceto-metoxi-észtert tartalmazó teljes tápfolyadékban szuszpendáltuk [Grynkiewicz és munkatársai: J. Bioi. Chem. 260, 3440 (1985)] (Molecular Probes, Eugene OR), majd 45 percig, 37 °C-on inkubáltuk. Az lndo-1-festékkel feltöltött sejteket ülepítettük, milliliterenként 1*10⁶ sejt sűrűségben szérummentes IMDM-tápfolyadékban szuszpendáltuk, és szobahőmérsékleten, sötétben tároltuk. A sejteket a szabad kalciumion-tartalomra nézve analizáltuk oly módon, hogy áramlási citometriás eljárással, egymással párhuzamosan mértük a kék és viola fluoreszcenciakibocsátást [Rabinovitch és munkatársai: J. Immunoi. 137, 952 (1986)]. A kalciumáramlás megindítása céljából a sejtszuszpenzióhoz vagy nem konjugált, 3G8 jelzésű monoklonális ellenanyagot (anti-CD16-ellenanyagot) adtunk (1 pg/ml koncentrációban), és ezt követően 0 időpontban 10 pg/ml fikoeritrinnel (PE) konjugált, kecskében termelt, antiegér-IgG Fab-02-fragmenst adtunk, vagy a sejtszuszpenzióhoz PE-konjugált anti-CD4-ellenanyagot (Leu-3a, Becton Dickinson), majd nem konjugált második ellenanyagot adtunk. A viola/kék kibocsátás arányát ábrázoló hisztogramokat gyűjtöttük a PE-pozitív (fertőzött) sejtpopulációból, amely tipikusan a sejtek 40-80%-át képviselte. Az ellenanyag hozzáadását megelőzően mérhető viola/kék kibocsátási arányt - egységnek tekintve - használtuk a kiindulási arány normalizálásához.

Limfocitacitolízis vizsgálati eljárás

Egy CD8⁺-, CD4^--, HLA-B44-antigénekre korlátozódó citolitikus sejtvonalat (WH3) 10% humán szérumot tartalmazó, 100 egység/ml IL-2-vel kiegészített IMDM-tápfolyadékban tartottunk fenn, és szabályos időszakonként besugárzott (3000 rád), HLA-B44 haplotípussal rendelkező mononukleáris sejtekkel stimuláltunk. A sejteket a stimulációt követően legalább 10 napig tenyésztettük a citotoxikus vizsgálati eljárásokban történő alkalmazásukat megelőzően. A sejteket egy órán át, szérummentes tápfolyadékban, legalább 10-es fertőzési multiplicitási érték (MOI) mellett rekombináns vacciniavírusokkal fertőztük, majd három óráig teljes tápfolyadékban inkubáltuk. A sejteket centrifugálással összegyűjtöttük, és milliliterenként 1 *10⁷ sejt sűrűségben szuszpendáltuk. U alakú fenékkel rendelkező mikrotitrálólemezek egyes mélyületeihez, amelyek 100 pl teljes tápfolyadékot tartalmaztak, 100 pl sejtszuszpenziót adtunk. A sejteket felező hígítási sorral hígítottuk. Mindegyik minta vizsgálata esetében két mélyület nem tartalmazott limfocitákat, hogy a spontán krómfelszabadulás és az összkrómfelvétel meghatározható legyen. 10⁶ 3G8-10-2-célsejtet tartalmazó mintát [Shen és munkatársai: Mól. Immunoi. 26, 959 (1988)] centrifugáltunk, és 1 órán át, 37 °C-on, időközönként megkeverve, 50 pl steril ⁵¹Cr-nátrium-kromát-oldatban szuszpendáltunk (1 mCi/ml, DuPont), majd háromszor PBSben mostunk. Valamennyi mélyülethez 100 pl térfogatú, tápfolyadékban 10⁵/ml sűrűségben szuszpendált jelölt sejtet adtunk. A mikrotitrálólemezeket 1 percig, 750 g mellett centrifugáltuk, és 4 órán át, 37 °C-on inkubáltuk. Az inkubációs idő végén a sejteket valamennyi mélyületben óvatos pipettázással felszuszpendáltuk, a beépült összbeütésszám meghatározása céljából azokból mintát vettünk, és a mikrotitrálólemezeket 1 percig, 750 g mellett centrifugáltuk. A felülúszóból 100 pl térfogatú mintát eltávolítottunk, és gamma-szcintillációs számlálóban a beütésszámot meghatároztuk. Az effektorsejt/célsejt arányt a fertőzött effektorsejtek százalékos aránya (általában 70%) alapján korrigáltuk.

Mutáns kinázkimérák előállítása Sertés-Syk-kináz-negatív fúziós protein-variánst állítottunk elő oly módon, hogy a kimérát Stul- és Ntol-enzimekkel emésztettük (az utóbbi hasítási hely a karboxiterminális véghez közel, attól 3’-irányban található), a Notl hasítási helyet feltöltöttük, és a végeket egymással ligáltuk. A kapott szekvenciában a sertésSyk-kinázban található első 298 aminosav a terminációt megelőzően 4, az eredeti szekvenciához nem tartozó aminosavval (GPRL) kapcsolódik. A ΖΑΡ-70-kináz ATP-kötőhelyében pontmutációt [a 369. pozícióban K (lizín) helyett G-t (glicint) tartalmazó mutánst] úgy hoztunk létre, hogy a Chan által leírt szekvencia szerint [Cell. 71, 649 (1992)] a felső szálban az 1319. és 1345. pozíciók között található nukleotidok közt található Ball és Earl hasítási helyek közé egy kettős szálú oligonukleotidfragmenst inszertáltunk. A kapott szekvencia a 369. pozícióban lizin helyett glicint kódolt.

HU 224 137 Β1

Immunprecipitáció és kinázaktivitási vizsgálati eljárás

Körülbelül 2*10® HeLa-S3-sejtet egy órán át, szérummentes DME-tápfolyadékban, legalább 10-es fertőzési multiplicitási érték mellett rekombináns vacciniavírussal fertőztünk. A fertőzést követően öt (5) órával a sejteket összegyűjtöttük, foszfátpufferes fiziológiás sóoldattal kétszer mostuk, és az alábbi összetételű pufferben lizáltuk: 1% Triton-X-100, 0,15 mol/l NaCl, 0,02 mol/l HEPES (pH=7,3), 5 mmol/l EDTA, 5 mmol/l NaF, 0,2 mmol/l NaVO₃,10 pg/ml Leu-peptin, 10 pg/ml aprotinin és 1 mmol/l PMSF. Tíz- (10) perces, jégen történő inkubációt követően a sejtmagokat centrifugálással eltávolítottuk, és a CD16 fúziós proteineket BMA209/2-ellenanyaggal és protein-A-Sepharose-zal immunprecipitáltuk. A fúziós proteinnel feltöltött kromatográfiás töltetet háromszor lízispufferrel, végül 20 mmol/l HEPES-pufferrel (pH=7,3) mostuk. Mindegyik mintához 10 pl térfogatú, 10 pCi [g-³²P]ATP-t (>3000 Ci/mmol) tartalmazó kinázpuffert adtunk [20 mmol/l HEPES (pH=7,3), 10 mmol/l MgCI₂ és 10 mmol/l MnCI₂j. A reakciókat 10 percig szobahőmérsékleten hagytuk inkubálódni, és azokat 20 pl, 2-szeres töménységű mintafelvivő puffer [4% SDS, 100 mmol/l Tris (pH=6,8), 20% glicerin, valamint 10% b-merkapto-etanol] hozzáadásával állítottuk le. Miután az elegyeket 3 percig forraltuk, azokból mintát vettünk, és azokat 4-15%-os gradiensgélen futtattuk. A cdc-2 6-20. pozícióinak megfelelő oldható peptidszubsztráttal - melyben a 20. pozícióban található tirozin lizinnel volt helyettesítve - végzett kinázaktivitási vizsgálati eljárásokat a gyártó (UBI) utasításai szerint végeztük.

Protein-tirozin-foszforileződés analízise immunbloteljárással

TCR-negatív 3.5 jelzésű sejteket egy órán át (legalább 10-es MOl-érték mellett) rekombináns vírustörzstenyészettel fertőztünk. A sejteket ezt követően 8-12 órán át, 37 °C-on inkubáltuk, centrifugáltuk, mostuk, és 10⁷ sejt/ml sűrűségben szérummentes Iscove-féle tápfolyadékban szuszpendáltuk. Sejtmintákat anti-CD16 monoklonális ellenanyaggal (3G8, Medarex vagy BMA209/2, Behringwerke) inkubáltunk; 2-3*10® sejthez 1 pg ellenanyagot adtunk. A stimulált mintákat 5 percig, 3-5-szörös feleslegben alkalmazott, affinitásos eljárással tisztított antiegér-lgG1-ellenanyaggal (Southern Biotechnology) inkubáltuk tovább. A sejteket ezután Secrist J. P., Burns L. A., Kamitz L., Koretzky G. A. és Abraham R. T. kismértékben módosított eljárása szerint kezeltük [J. Bioi. Chem. 268, 5886 (1993)]. Az inkubálást 1 % végkoncentrációig SDS hozzáadásával fejeztük be, és a mintákat három percig forraltuk. A DNS-t „Heat Systems Ultrasonics” (Inc.) készülék alkalmazásával, 1 percig végzett ultrahangos kezeléssel daraboltuk, az elegyhez 2*mintapuffert adtunk, 10®-2,5*10® sejtet tartalmazó mintákat poliakrilamid-géleken szétválasztottunk, és a proteineket félszáraz elektrobloteljárással (Hoefer) nitro-cellulózra („Schleicher and Schuell”, BA45) vittük át. A filtereket egy órán át, 1,5% csirkealbumint (Sigma) tartalmazó, 0,05% Tween-20 detergenssel kiegészített Tris-pufferes fiziológiás sóoldatban (TBST) blokkoltuk, TBST-pufferben mostuk, és 1:10 000 hígításban 4G10 jelzésű antifoszfotirozin-ellenanyagot (UBI) tartalmazó oldatba vittük át, majd 1-2 óráig, 22 °C-on inkubáltuk. A TBST-pufferrel végzett mosást követően a filtereket 1 órán át, 1:5000 hígításban, torma-peroxidázzal konjugált, antiegér-ellenanyagot tartalmazó TBST-pufferben inkubáltuk. A foszforilezett proteincsíkokat kemilumineszcenciás eljárással (ECL, Amersham) mutattuk ki. A megvilágítási idő 2-5 perc közé esett.

Humán lgG1 :protein-tirozin kináz kimérák előállítása

Előállíthatok olyan kiméramolekulák, melyek egy ellenanyag-molekula célsejtre specifikus extracelluláris doménját, valamint egy protein-tirozin kináz (például a leírásban ismertetett kinázok) intracelluláris doménját tartalmazzák. Ilyen molekulák előállítása céljából humán lgG1 nehézlánc-szekvenciákat állítottunk elő oly módon, hogy a C_H3-doménban található szekvenciákat az ellenanyag-mRNS transzmembrán formájának 3’-végéből származó cDNS-fragmenshez kapcsoltuk. A 3’-végi fragmenst polimeráz-láncreakciós eljárással kaptuk, szubsztrátként tonsilla (mandula) cDNS-génkönyvtár és az alábbi láncindító oligonukleotidok alkalmazásával: CGC GGG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC, valamint CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT GGG CCT CA, melyek a kívánt DNS-fragmens 5’-, valamint 3’-végeinek feleltek meg. Az 5’-végi láncindító oligonukleotid komplementer a humán lgG1 CH1-doménjában található szekvenciával, a 3’-végi láncindító oligonukleotid pedig komplementer a membránt átszelő domént kódoló szekvenciától közvetlenül 5’-irányban található hellyel. A PCR-terméket BstXl- és BamHI-enzimekkel emésztettük, majd variábilis, valamint konstans régiókat hordozó, félszintetikus lgG1-ellenanyaggén BstXl és BamHl hasítási helyei közé ligáltuk. A BstXI-BamHI-fragmens inszertálását követően a konstrukció amplifíkált részeit restrikciós fragmens cserével a C_H3-ban található Smal hasítási helyig terjedően helyettesítettük úgy, hogy csak a Smal hasítási hely és a 3’-végi oligonukleotid közt található rész származott a PCR-reakcióból.

Humán lgG1 kimérareceptor előállítása úgy történt, hogy egy BamHI-végben végződő nehézláncgént szokásos technikákkal az adott kináz intracelluláris doménjához kapcsoltunk. A kimérareceptor expresszálódásának szintje áramlási citometriás eljárással határozható meg. Az expresszió szintje egy ellenanyagkönnyűlánc cDNS-t kódoló plazmid koexpressziójával fokozható.

Olyan transzkripciós egység előállítása céljából, amely egyetlen promoterről kiindulva mind nehéz-, mind könnyűláncok expresszálódását lehetővé teszi, nehézláncot és könnyűláncot kódoló szekvenciákból, valamint a grp78-proteinként vagy BIP-proteinként is ismert, 78 kD molekulatömegű, glükóz által szabályozott proteint kódoló mRNS 5’-végi nem transzlálódó részéből egy bicisztronos mRNS-t kódoló plazmidot állítottunk elő. A grp78-szekvenciákat humán genomi DNS

HU 224 137 Β1 alapján végzett PCR-eljárással kaptuk az 5’- és 3’-végeken az alábbi szekvenciákkal rendelkező láncindító oligonukleotidok alkalmazásával: CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC, valamint CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG. A fenti láncindító oligonukleotidok alkalmazásával végzett polimeráz-láncreakció 10% dimetil-szulfoxid jelenlétében történt. A PCR-eljárással kapott fragmenst Notl- és Hincll-enzimekkel emésztettük, és humán lgG1 kódolószekvenciáktól 3'-irányban található Notl és Hpal hasítási helyek közé inszertáltuk. Ezután a Hindi hasítási hely és egy, a vektorban található másik hasítási hely felhasználásával a grp78 vezetőszekvenciájától 3’-irányban humán IgG kappa-könnyűláncot kódoló cDNS-szekvenciákat inszertáltunk. A fenti eljárással nyert expressziós plazmid a következő részeket tartalmazta: a félszintetikus nehézláncgént, ezt követően a grp78 szignálszekvenciát, a kappa-könnyűlánc cDNS-szekvenciát, valamint SV40 DNS-fragmensből származó poliadenilezési szignálokat. A korábbiakban kimutattuk, hogy COS-sejtek transzfekciója a fenti expressziós plazmiddal jelentősen megnövelte a nehézlánc-determinánsok expresszálódását, összehasonlítva a csak nehézlánc-determinánsokat kódoló plazmiddal történő traszfekcióval.

Olyan bicisztronos gén előállítása céljából, amely nehézlánc/receptor kimérát és könnyűláncot is tartalmaz, az 5’-irányban található nehézlánc-szekvenciákat a fent ismertetett bármely kiméra nehézlánc/receptorgén szekvenciával helyettesíthetjük.

Előállításukat követően az IgG-tirozin kináz kimérákat expressziós vektorba klónozhatjuk, gazdasejtbe juttathatjuk, és bármely, a fentiekben ismertetett vizsgálati eljárással tesztelhetjük (például kalciummobilizációs vagy citolitikus vizsgálati eljárásokkal).

CD4-tirozin kináz kimérák előállítása

Előállíthatunk olyan kiméramolekulákat, melyek a CD4-molekula extracelluláris doménját és egy protein-tirozin kináz (például a fent leírt kinázok egyikének) intracelluláris doménját tartalmazzák. Ilyen molekula előállítása céljából a tirozinkinázt kódoló szekvenciát (például cDNS-t) izoláltuk (például a fent ismertetett eljárással). Ezt a szekvenciát ezután standard technikák alkalmazásával a CD4 egy géntechnológiai eljárással módosított formájának extracelluláris doménjával kapcsoltuk össze, amelyik a membránt átszelő doméntól közvetlenül 5’-irányban egy BamHI hasítási helyet tartalmazott [Aruffo és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 8573 (1987b); Zettlmeissl és munkatársai: DNA Cell. Bioi. 9, 347 (1990)]. A fenti fúziós protein előállítása céljából a szekvencián belül megfelelő pozícióban géntechnológiai eljárással BamHI hasítási helyet hozhatunk létre (ismét szokásos eljárások alkalmazásával). A génfúziókat (a fent leírtak szerint) vacciniavírus expressziós plazmidba juttattuk, majd homológ rekombinációs technikával és mikofenolsav jelenlétében történő szaporodás alapján végzett szelekcióval WR jelzésű vacciniatörzs genomjába inszertáltuk [Falkner és munkatársai: J. Virol. 62, 1849 (1988); Boyle és munkatársai: Gene 65, 123 (1988)]. A vacciniarekombinánsokban a CD4-tirozin kináz fúziós proteinek sejtfelszínen történő expresszálódását áramlási citometriás eljárással vizsgáltuk. Az eredményeket vacciniarekombinánsokkal fertőzött sejtek immunprecipitációjával igazoltuk (a fent leírtak szerint).

A CD4-kimérák hatékonyságát a fent ismertetett kalciummobilizációs vagy citolitikus vizsgálati eljárásokkal tesztelhetjük. A találmány egy megvalósítási módja szerint olyan célsejt:effektorsejt modellrendszert dolgoztunk ki, amelyik a gp120/gp41 HlV-burokprotein-komplex CD4 által történő felismerésén alapul. HeLa-sejteket gp120/gp41 proteineket expresszáló rekombináns vacciniavírusokkal fertőztünk [Chakrabarti és munkatársai: Natúré 320, 535 (1986); Earl és munkatársai: J. Virol. 64, 2448 (1990)], és ⁵¹Cr-mal jelöltünk. Ajelölt sejteket olyan humán allospecifikus (CD8⁺, CD4^-), citotoxikus T-limfocita-sejtvonalhoz tartozó sejtekkel inkubáltuk együtt, amelyet előzőleg a CD4-tirozin kináz kimérát expresszáló vacciniarekombinánsokkal fertőztünk, és a sejteket specifikus lizálódásra nézve vizsgáltuk.

Annak a lehetőségnek a kizárására, hogy a vacciniafertőzés műtermékként idézi elő a CTL-limfociták által történő felismerést, hasonló citolitikus kísérleteket végeztünk a CD16 foszfatidil-inozitolhoz kötött formáját (CD16_P|) expresszáló vacciniarekombinánsokkal fertőzött és ⁵¹Cr-mal jelölt célsejtek, valamint CD16-kimérákat expresszáló kontrollrekombinánsokkal fertőzött CTL-limfociták alkalmazásával.

A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a keringésben igen rövid (körülbelül 4 óra) élettartamú és erősen citotoxikus neutrofil granulocitákat alkalmazhatunk CD4-tirozin kináz kimérák expresszálására. Neutrofil sejtek HIV-vírussal történő fertőzése nem valószínű, hogy vírusfelszabaduláshoz vezetne, és a fenti sejtek nagy tömege (a leukociták között a legelterjedtebb típus), előmozdíthatja a gazdaszervezet védekezését. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint gazdasejtekként érett T-sejteket alkalmazhatunk, amely populáció napjainkban vált hozzáférhetővé retrovírussal történő géntechnológiai módosítás számára [Rosenberg S.A.: Sci. Am. 262, 62 (1990)]. Rekombináns IL—2 alkalmazásával T-sejt-populációk viszonylag könnyen szaporíthatok tenyészetben, és a felszaporított populációk a keringésbe visszainfundálva általában korlátozott élettartammal rendelkeznek [Rosenberg és munkatársai: Eng. J. Med. 323, 570 (1990)].

Megfelelő feltételek mellett CD4-kimérákat expresszáló sejtek által történő HIV-felismerés mitogén stimulust is képezhet, lehetővé téve, hogy a „felfegyverzett” (armed) sejtpopuláció dinamikus módon reagáljon a vírusterhelésre. Bár a leírás során a fúziós proteinek citotoxikus T-limfocitákban megfigyelhető viselkedésére összpontosítottunk, a kimérák expresszálása „helper”-limfocitákban lehetővé teheti citokinek HÍV által kiváltott mobilizálását, ami AIDS-betegségben a „helper-sejtek által képzett szubpopuláció csökkenésével szemben fejthet ki hatást. Napjainkban több olyan eljárást írtak le, melyek alkalmazásával géntechnológiai úton, a vírus behatolásának megakadályozásától eltérő fázisban történő beavatkozással fertőzés21

HU 224 137 Β1 sel szembeni rezisztenciát hoztak létre [Friedman és munkatársai: Natúré 335, 452 (1988); Green és munkatársai: Cell. 58, 215 (1989); Malim és munkatársai:

Cell. 58, 205 (1989); Trono és munkatársai: Cell. 59,

113 (1989); Buonocore és munkatársai: Natúré 345, 5

625 (1990)], melyek arra utalnak, hogy megtervezhetők olyan CD4-kimérákat hordozó sejtek, amelyek a vírustermelődést megfelelő, hatásukat intracellulárisan kifejtő doménokkal rendelkező molekulák expresszálásán keresztül akadályozzák meg. 10

Az, hogy T-limfociták számára autonóm kimérák alkalmazásával jelzéseket tudunk közvetíteni, retrovírus alkalmazásával géntechnológiai úton módosított limfociták in vivő szabályozását is lehetővé teszi. Keresztkötéseket létrehozó stimulusok, például komplementkötő 15 doménok eltávolítása céljából géntechnológiai eljárással módosított, specifikus IgM-ellenanyagok által közvetített stimulusok lehetővé tehetik az említett limfociták számának in situ növekedését, míg hasonló specifikus IgG-ellenanyagokkal (például a kiméraláncban génse- 20 bészeti úton létrehozott aminosaveltérést felismerő ellenanyagokkal) történő kezelés szelektív módon képes lehet a géntechnológiai eljárással módosított populációhoz tartozó sejtek számának csökkentésére. A korábbiakban kimutattuk, hogy anti-CD4 IgM-ellenanya- 25 gok alkalmazása esetében CD4^-kimérákat expresszáló Jurkat-féle sejtekben nem szükséges keresztkötések további létrehozása a kalciummobilizációhoz.

Ha a szervezeten kívül végzett ismételt felszaporítás nélkül képesek lennénk sejtpopulációk szabályozására, 30 az jelentősen kiterjeszthetné a géntechnológiai eljárással módosított T-sejtek jelenlegi alkalmazási körét és hatékonyságát.

A találmány egyéb lehetséges megvalósítási módjai 35

Proteinkináz intracelluláris szekvenciákat tartalmazó egyéb kimérákat előállíthatunk úgy, hogy egy receptor extracelluláris doménját kódoló cDNS- vagy genomi szekvenciát az adott extracelluláris domént közvetlenül megelőzően restrikciós hasítási hellyel látunk el. A restrikciós hasítási helyben végződő extracelluláris doménfragmenst ezután a protein kináz szekvenciákhoz kapcsolhatjuk. Tipikus extracelluláris doménokat nyerhetünk komplementet, szénhidrátokat, vírusproteineket, baktériumokat, protozoon- vagy metazoonparazitákat, vagy azok által indukált proteineket felismerő receptorokból. Hasonlóképp, kórokozók vagy tumorsejtek által expresszált ligandumokat vagy receptorokat is proteinkináz-szekvenciákhoz kapcsolhatunk, hogy az immunválaszt célzottan a fenti ligandumokat felismerő receptorokat hordozó sejtekkel szemben irányítsuk.

A citolízishez szükséges minimális proteinkinázszekvenciának a meghatározása céljából szokásos technikák alkalmazásával olyan deléciós mutánsokból álló sorozat állítható elő, melyekben a kináz intracelluláris doménjából egyre többet távolítunk el. Az ilyen deléciós mutánsok hatékonyságát a fent ismertetett vizsgálati eljárások valamelyikével tesztelhetjük. A Sykprotein kináz esetében alkalmazható intracelluláris doménok például a sertés-Syk-kináz 336-628. pozíciójában található aminosavakat tartalmazó szekvencia és a humán Syk-kináz 338-630. pozíciójában található aminosavakat tartalmazó szekvencia.

Bár a találmány szerinti megoldást a fentiekben specifikus megvalósítási módokon keresztül szemléltettük, nyilvánvaló, hogy létrehozhatók a megoldás egyéb módosításai is. Oltalmi igényünk kiterjed a találmány szerinti megoldás különböző variációira, alkalmazási módjaira, adaptációira és minden lehetséges módosítására, amennyiben azok nem többek, mint a találmány szerinti megoldás technika állása alapján létrehozható változatai, és magukon viselik a találmány szerinti megoldás előzőekben felsorolt lényeges jellemzőit, ahogyan azokat a csatolt igénypontokban pontosan megfogalmaztuk.

SZEKVENCIALISTA

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGGTGA CCGTGCCCTC CAGCAGCTTG GGC 33

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 50

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGGATC CGTCGTCCAG AGCCCGTCCA GCTCCCCGTC CTGGGCCTCA 50

HU 224 137 Β1

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGCGGC CGCGACGCCG GCCAAGACAG CAC 33

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGTTGACG AGCAGCCAGT TGGGCAGCAG CAG 33

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 630

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: nem jellemző

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

AZ 5. Met 1

AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA

LEÍRÁSA:

Phe 10

Phe

Phe

Gly

His

Ile 15

Thr

Alá

Asp

Ser Alá Asn 5

His

Leu

Pro

Arg

Glu

Glu

Alá

Glu

Asp

Tyr

Leu

Val

Gin

Gly

Gly

Met

Ser

Asp

Gly

20

25

30

Leu

Tyr

Leu

Leu

Arg

Gin

Ser

Arg

Asn

Tyr

Leu

Gly

Gly

Phe

Alá

Leu

35

40

45

Ser

Val

Alá

His

Gly

Arg

Lys

Alá

His

Asn

Tyr

Thr

Ile

Glu

Arg

Glu

50

55

60

Leu

Asn

Gly

Thr

Tyr

Alá

Ile

Alá

Gly

Gly

Arg

Thr

His

Alá

Ser

Pro

65

70

75

80

Alá

Asp

Leu

Cys

Asn

Tyr

His

Ser

Gin

Glu

Ser

Asp

Gly

Leu

Val

Cys

85

90

95

Leu

Leu

Lys

Lys

Pro

Phe

Asn

Arg

Pro

Gin

Gly

Val

Gin

Pro

Lys

Thr

100

105

110

Gly

Pro

Phe

Glu

Asp

Leu

Lys

Glu

Asn

Leu

Ile

Arg

Glu

Tyr

Val

Lys

115

120

125

Gin

Thr

Met

Asn

Leu

Gin

Gly

Gin

Alá

Leu

Glu

Gin

Alá

Ile

Ile

Ser

130

135

140

Gin

Lys

Pro

Gin

Leu

Glu

Lys

Leu

Ile

Alá

Thr

Thr

Alá

His

Glu

Lys

145

150

155

160

Met

Pro

Trp

Phe

His

Gly

Lys

Ile

Ser

Arg

Glu

Ile

Ser

Thr

Gin

Ile

165

170

175

Val

Leu

Ile

Gly

Ser

Lys

Thr

Asn

Gly

Lys

Phe

Leu

Ile

Arg

Alá

Arg

180

185

190

HU 224 137 Β1

Asp Asn Asn Gly 195

Leu His Tyr Arg 210

Glu Gly Lys Lys 225

Tyr Lys Alá Asp

Ile Gly Thr Gin 260

Gly Ser His Pro 275

Lys Ser Tyr Ser 290

Gin Gly Asn Arg 305

Glu Leu Alá Pro

Pro Met Asp Thr 340

Ile Arg Pro Lys 355

Asp Lys Glu Leu 370

Tyr Gin Met Lys 385

Asn Glu Alá Asn

Asn Val Met Gin 420

Ile Cys Glu Alá 435

Gly Pro Leu Asn 450

Asn Ile Ile Glu 465

Glu Glu Ser Asn

Leu Val Thr Gin 500

Ser Tyr Alá Leu Cys 200

Ile Asp Lys Asp Lys 215

Phe Asp Thr Leu Trp 230

Gly Leu Leu Arg Val 245

Gly Asn Val Asn Phe 265

Alá Thr His Ser Alá 280

Phe Pro Lys Pro Gly 295

Gin Glu Ser Thr Val 310

His Alá Alá Asp Lys 325

Glu Val Tyr Glu Ser 345

Glu Val Tyr Leu Asp 360

Gly Ser Gly Asn Phe 375

Lys Val Val Lys Thr 390

Asp Pro Alá Leu Lys 405

Gin Leu Asp Asn Pro 425

Glu Ser Trp Met Leu 440

Lys Tyr Leu Gin Gin 455

Leu Val His Gin Val 470

Phe Val His Arg Asp 485

His Tyr Alá Lys Ile 505

Leu

Thr

Gin

Leu

250

Gly

Gly

His

Ser

Gly

330

Pro

Arg

Gly

Val

Asp

410

Tyr

Val

Asn

Ser

Leu

490

Ser

Leu His Ile Gly Lys 205

Gly Lys Leu Ser Ile 220

Leu Val Glu His Tyr 235

Thr Val Pro Cys Gin 255

Gly Arg Pro Gin Leu 270

Gly Ile Ile Ser Arg 285

Arg Lys Ser Ser Pro 300

Phe Asn Phe Tyr Glu 315

Pro Gin Arg Ile Alá 335

Tyr Alá Asp Pro Glu 350

Lys Leu Leu Thr Leu 365

Thr Val Lys Lys Gly 380

Alá Val Lys Ile Leu 395

Glu Leu Leu Alá Glu 415

Ile Val Arg Met Ile 430

Met Glu Met Alá Glu 445

Arg His Val Lys Leu 460

Met Gly Met Lys Tyr 475

Alá Alá Arg Asn Val 495

Asp Phe Gly Leu Ser 510

Val

Pro

Ser

240

Lys

Phe

Ile

Alá

Pro

320

Leu

Glu

Glu

Tyr

Lys

400

Alá

Gly

Leu

Lys

Leu

480

Leu

Lys

HU 224 137 Β1

Alá

Leu Arg Alá Asp 515

Glu

Asn

Tyr 520

Tyr

Lys Alá Gin

Thr 525

His

Gly

Lys

Trp

Pro

Val

Lys

Trp

Tyr

Alá

Pro

Glu

Cys

Ile

Asn

Tyr

Tyr

Lys

Phe

530

535

540

Ser

Ser

Lys

Ser

Asp

Val

His

Ser

Phe

Gly

Val

Leu

Met

Asn

Glu

Alá

545

550

555

560

Phe

Ser

Tyr

Gly

Gin

Lys

Phe

Tyr

Arg

Gly

Met

Lys

Gly

Ser

Glu

Val

565

570

575

Ile

Alá

Met

Leu

Glu

Lys

Gly

Glu

Arg

Met

Gly

Cys

Pro

Alá

Gin

Cys

580

585

590

Pro

Arg

Glu

Met

Tyr

Asp

Leu

Met

Asn

Leu

Cys

Trp

Thr

Tyr

Asp

Val

595

600

605

Glu

Asn

Arg

Pro

Gly

Phe

Alá

Alá

Val

Glu

Leu

Arg

Leu

Arg

Asn

Tyr

610

615

620

Tyr

Tyr

Asp

Val

Val

Asn

625 630

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 628

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: nem jellemző

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met 1

Alá

Asp

Ser

Alá 5

Asn

His

Leu

Pro

Phe 10

Phe

Phe

Gly

Gin

Ile 15

Thr

Arg

Glu

Glu

Alá

Glu

Asp

Tyr

Leu

Val

Gin

Gly

Gly

Met

Ser

Asp

Gly

20

25

30

Leu

Tyr

Leu

Leu

Arg

Gin

Ser

Arg

Asn

Tyr

Leu

Gly

Gly

Phe

Alá

Leu

35

40

45

Ser

Val

Alá

Tyr

Asp

Arg

Lys

Alá

His

His

Tyr

Thr

Ile

Glu

Arg

Glu

50

55

60

Leu

Asn

Gly

Thr

Tyr

Alá

Ile

Ser

Gly

Gly

Arg

Thr

His

Gly

Ser

Pro

65

70

75

80

Alá

Glu

Leu

Cys

His

Tyr

His

Ser

Gin

Glu

Leu

Asp

Gly

Leu

Val

Cys

85

90

95

Leu

Leu

Lys

Asn

Pro

Phe

Asn

Arg

Pro

Pro

Gly

Val

Gin

Pro

Lys

Thr

100

105

110

Gly

Pro

Phe

Glu

Asp

Leu

Lys

Glu

Asn

Leu

Ile

Arg

Glu

Tyr

Val

Lys

115

120

125

Gin

Thr

His

Asn

Leu

Gin

Gly

Gin

Alá

Leu

Glu

Gin

Alá

Ile

Ile

Ser

130

135

140

Gin

Lys

Pro

Gin

Leu

Glu

Lys

Leu

Ile

Alá

Thr

Thr

Alá

His

Glu

Lys

145

150

155

160

HU 224 137 Β1

Met Pro Trp Phe His 165

Val Leu Ile Gly Ser 180

Asp Met Gly Ser Tyr 195

Met Tyr Arg Ile Asp 210

Gly Lys Asn Phe Asp 225

Lys Ser Asp Gly Leu 245

Gly Gly Gin Thr Gly 260

His Ser Ala Thr Trp 275

Tyr Ser Phe Pro Lys 290

Asn Arg Pro Glu Ser 305

Gly Phe Trp Ala Asn 325

Asp Thr Glu Val Val 340

Pro Lys Glu Val Tyr 355

Glu Leu Gly Ser Gly 370

Met Lys Lys Val Val 385

Ala Asn Asp Pro Ala 405

Met Gin Gin Leu Asp 420

Glu Ala Ser Ser Trp 435

Leu Asn Lys Tyr Leu 450

Ile Glu Leu Val His 465

Gly Lys Ile Ser Arg Asp 170

Lys Ile Asn Gly Lys Phe 185

Ala Leu Gly Leu Leu His 200

Lys Asp Lys Thr Gly Lys 215

Thr Leu Trp Gin Leu Val 230 235

Leu Arg Val Leu Thr Val 250

Asn Asp Ser Phe Arg Pro 265

Ser Ala Gly Gly Ile Ile 280

Pro Gly His Arg Lys Ala 295

Leu Val Ser Tyr Asn Phe 310 315

Glu Arg Glu Ala Gin Arg 330

Glu Ser Pro Tyr Ala Asp 345

Leu Asp Arg Lys Leu Leu 360

Asn Phe Gly Thr Val Lys 375

Lys Thr Val Ala Val Lys 390 395

Leu Lys Asp Glu Leu Leu 410

Asn Pro Tyr Ile Val Arg 425

Met Leu Val Met Glu Met 440

Gin Gin Asn Arg His Val 455

Gin Val Ser Met Gly Met 470 475

Glu Ser Glu Gin Ile 175

Leu Ile Arg Ala Arg 190

Ile Gly Lys Val Leu 205

Leu Ser Ile Pro Gly 220

Glu Lys Tyr Ser Tyr 240

Pro Cys Gin Lys Ile 255

Gin Leu Phe Ser Ala 270

Ser Arg Ile Lys Ser 285

Ser Ser Pro Gin Gly 300

Tyr Glu Ser Asp Arg 320

Glu Ala Leu Pro Met 335

Pro Glu Glu Ile Arg 350

Thr Leu Glu Asp Lys 365

Lys Gly Tyr Tyr Gin 380

Ile Leu Lys Asn Glu 400

Ala Glu Ala Asn Val 415

Met Ile Gly Ile Cys 430

Ala Glu Leu Gly Pro 445

Lys Asp Lys Asn Ile 460

Lys Tyr Leu Glu Glu 480

HU 224 137 Β1

Cys Asn

Pro Val

His Arg 485

Asp Leu Alá Alá Arg Asn Val 490

Leu

Leu 495

Val

Thr

Gin

His

Tyr

Alá

Lys

Ile

Ser

Asp

Phe

Gly

Leu

Ser

Lys

Alá

Leu

500

505

510

Arg

Alá

Asp

Glu

Asn

Tyr

Tyr

Lys

Alá

Gin

Thr

His

Gly

Lys

Trp

Pro

515

520

525

Val

Lys

Trp

Tyr

Alá

Pro

Glu

Cys

Ile

Asn

Tyr

Tyr

Lys

Phe

Ser

Ser

530

535

540

Lys

Ser

Asp

Val

Asn

Ser

Phe

Gly

Val

Leu

Met

Trp

Glu

Alá

Phe

Ser

545

550

555

560

Tyr

Gly

Gin

Lys

Phe

Tyr

Arg

Gly

Met

Lys

Gly

Ser

Glu

Val

Ser

Alá

565

570

575

Met

Leu

Glu

Lys

Gly

Glu

Arg

Met

Gly

Cys

Phe

Phe

Gly

Cys

Phe

Arg

580

585

590

Glu

Met

Tyr

Glu

Leu

Asn

Thr

Leu

Cys

Asn

Thr

Tyr

Asp

Val

Glu

Asn

595

600

605

Arg

Pro

Gly

Phe

Val

Alá

Val

Glu

Leu

Arg

Leu

Arg

Asn

Tyr

Tyr

Tyr

610

615

620

Asp Val Val Asn

625

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 34

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATGGCAGACA GTGCCAACCA CTTGCCCTTC TTCT 34

A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 39

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGGCGG CCGCTTTAAT TCACCACGTC GTAGTAGTA 39

Claims (15)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Terápiás célt szolgáló sejt (terápiás sejt), amely membránhoz kötött, proteintermészetű kimérareceptort expresszál, azzal jellemezve, hogy az expresszált kimérareceptor az alábbi részeket tartalmazza: (a) egy intracelluláris domént, amely magában foglalja egy protein-tirozin kináz szignáltranszdukciós részét, amely képes a terápiás sejt számára olyan jelzést közvetíteni, amely azt egy receptorhoz kötődött célsejt vagy recep55 torhoz kötődött, célzott fertőző ágens elpusztítására készteti, valamint (b) egy extracelluláris részt, amely képes a célsejtet vagy a célzott fertőző ágenst specifikusan felismerni és ahhoz kötődni, miáltal a terápiás sejt képes a célsejt vagy a célzott fertőző ágens speci60 fikus felismerésére és elpusztítására.

   HU 224 137 Β1
2. 2. Az 1. igénypont szerinti terápiás sejt, azzal jellemezve, hogy szignáltranszdukciös részként egy Syk-kinázok családjába tartozó protein-tirozin kináz egy részét expresszálja.
3. 3. A 2. igénypont szerinti terápiás sejt, azzal jellemezve, hogy szignáltranszdukciös részként a Syk-kináz egy részét expresszálja.
4. 4. A 3. igénypont szerinti terápiás sejt, azzal jellemezve, hogy szignáltranszdukciös részként a sertés-Syk-kináz 336-628. pozícióinak vagy a humán Syk-kináz 338-630. pozícióinak megfelelő aminosavszekvenciát expresszál.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti terápiás sejt, azzal jellemezve, hogy egy második, membránhoz kötött, proteintermészetű kimérareceptort is expresszál, amely második kimérareceptor az alábbi részeket tartalmazza: (a) egy intracelluláris domént, amely magában foglalja egy második protein-tirozin kináz szignáltranszdukciös részét, amely képes a terápiás sejt számára olyan jelzést közvetíteni, amely azt egy receptorhoz kötődött célsejt vagy receptorhoz kötődött, célzott fertőző ágens elpusztítására készteti, valamint (b) egy extracelluláris részt, amely képes az említett célsejtet vagy célzott fertőző ágenst specifikusan felismerni és ahhoz kötődni, miáltal a terápiás sejt képes az említett célsejt vagy célzott fertőző ágens specifikus felismerésére és elpusztítására.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti terápiás sejt, azzal jellemezve, hogy szignáltranszdukciös részként egyrészt egy Syk-kinázok családjába, másrészt pedig egy Src-kinázok családjába tartozó protein-tirozin kináz egy-egy részét expresszálja.
7. 7. A 6. igénypont szerinti terápiás sejt, azzal jellemezve, hogy szignáltranszdukciös részként egyrészt a

   ΖΑΡ-70-kináz, másrészt pedig a Fyn-kináz egy-egy részét expresszálja.
8. 8. A 6. igénypont szerinti terápiás sejt, azzal jellemezve, hogy szignáltranszdukciös részként egyrészt a ΖΑΡ-70-kináz, másrészt pedig az Lck-kináz egy-egy részét expresszálja.
9. 9. Az 1. vagy 5. igénypont szerinti terápiás sejt, azzal jellemezve, hogy a felsoroltak bármelyike: (a) T-limfocita; (b) citotoxikus T-limfocita; (c) természetes ölősejt (,,killer”-sejt); (d) neutrofil sejt; (e) granulocita; (f) makrofág; (g) hízósejt; (h) HeLa-sejt.
10. 10. Az 1. igénypont szerinti terápiás sejt, azzal jellemezve, hogy célzott fertőző ágensként immundeficiencia-vírust képes specifikusan felismerni.
11. 11. A 10. igénypont szerinti terápiás sejt, azzal jellemezve, hogy extracelluláris részként a CD4-antigén HIV-burokhoz kötődni képes részét expresszálja.
12. 12. Az 1. vagy 5. igénypont szerinti terápiás sejt, azzal jellemezve, hogy MHC-independens módon képes kötődni a célsejthez vagy célzott fertőző ágenshez.
13. 13. Az 1. vagy 5. igénypont szerinti terápiás sejt, azzal jellemezve, hogy extracelluláris részként egy receptor ligandumhoz kötődni képes részét, egy ligandum receptorhoz kötődni képes részét, egy ellenanyag antigénhez kötődni képes részét, vagy az előzőek funkcionális származékát expresszálja.
14. 14. DNS, azzal jellemezve, hogy az 1. vagy 5. igénypont szerinti sejt által expresszált kimérareceptort kódol.
15. 15. Vektor, azzal jellemezve, hogy az 1. vagy 5. igénypont szerinti sejtek által expresszált kimérareceptort kódoló DNS-t tartalmaz.