NO316942B1

NO316942B1 - Celle uttrykkende kimert reseptorprotein, samt DNA og vektor

Info

Publication number: NO316942B1
Application number: NO19960175A
Authority: NO
Inventors: Brian Seed; Charles Romeo; Waldemar Kolanus
Original assignee: Gen Hospital Corp
Priority date: 1993-07-16
Filing date: 1996-01-15
Publication date: 2004-07-05
Also published as: NO960175D0; EP0804552A1; AU712245B2; DE69432487T2; NZ269312A; RU2158305C2; CA2166102C; PT804552E; JPH09500020A; CZ291754B6; EP0804552A4; DE69432487D1; FI960178A0; HU9600084D0; NO960175L; FI960178A; JP3738024B2; AU712245C; JP2004222735A; KR100278352B1

Description

Oppfinnelsens område

Oppfinnelsen angår celle uttrykkende kimert reseptorprotein, samt DNA og vektor.

Oppfinnelsens bakgrunn

T-celle-gjenkjenhing av antigen via T-celle-reseptoren er basis for en rekke immunologiske fenomener. T-cellene styrer den såkalte celle-medierte immuniteten.

Denne involverer destruksjon av fremmed vev eller infiserte celler av celler i immun-

ystemet. Det eksisterer en rekke T-celler, omfattende "hjelpe"- og "suppressor"-celler, som modulerer immun-responsen, og cytotoksiske (eller dreper-) celler, som kan drepe unormale celler direkte.

En T-celle som gjenkjenner og binder et unikt antigen vist på overflaten av en

annen celle blir aktivert; den kan så multipliseres, og hvis den er en cytotoksisk celle kan den drepe den bundne cellen.

Autoimmune sykdommer karakteriseres ved produksjon av hvilke som helst

antistoffer som reagerer med verts-vev eller immun-effektor-T-celler som er autoreaktive.

I noen tilfeller kan auto-antistoffer oppstå fra en normal T- og B-celle-respons aktivert av fremmede substanser eller organismer som inneholder antigener som kryss-reagerer med lignende forbindelser i kroppsvev. Eksempler på klinisk, relevante autoantistoffer er antistoffer mot acetylcholin-reseptorer i myasthenia gravis; og anti-DNA-, anti-erytrocytt-

og anti-blodplate-antistoffer i systemisk lupus erythematosus.

HIV og immunopatogenese

1 1984 ble HIV vist å være det etiologiske agenset for AIDS. Siden den tid har definisjonen på AIDS vært revidert flere ganger med hensyn til hvilke kriterier som skal bli inkludert i diagnosen. Til tross for svigningene i diagnostiske parametere er imidlertid den enkle fellesnevnelsen for AIDS, infeksjon med HIV, og påfølgende utvikling av vedvaren-

de helse-symptomer og AIDS-definerte sykdommer så som sekundære infeksjoner, neoplasmer og nevrologiske sykdommer. Harrison's Principles of Internal Medicine, 12.

utg, red. McGraw Hill (1991).

HIV er et humant retrovirus av lentivirus-gruppen. De fire kjente humane retrovirusene tilhører to distinkte grupper: humane T-lymfotrofe (eller leukemi) retrovirus, HTLV-1 og HTLV-2, og humane immunodefekt-virus, HIV-1 og HIV-2. De første er transformerende virus, mens de siste er cytopatiske virus.

HIV-1 er identifisert som den mest vanlige årsaken for AIDS i hele verden. Sekvens-homologi mellom HIV-2 og HIV-1 er omtrent 40%, der HIV-2 er nærmere

beslektet med noen medlemmer av en gruppe ape immunodefekte virus (SIV). Se Curran,

J. et al., Science, 329:1357-1359 (1985); Weiss, R et al., Nature 324:572-575 (1986).

HIV har de vanlige retrovirale genene (env, gag og pol), så vel som seks ekstra gener som er involvert i replikasjonen og andre biologiske aktiviteter til viruset. Som tidligere fremsatt er fellesnevnelsen for AIDS en sterk immunosuppresjon, hovedsakelig av cellemediert immunitet. Denne immunosupresjonen fører til en rekke opportunistiske sykdommer, spesielt visse infeksjoner og neoplasmer.

Den viktigste årsaken for immundefekten ved AIDS er identifisert som en kvantitativ og kvalitativ defekt i en undergruppe tymus-avledete (T) lymfocytter, T4-populasjonen. Denne undergruppen av celler er definert fenotypisk ved tilstedeværelsen av CD4-overflatemolekylet, som er demonstrert å være den cellulære reseptoren for HIV. Dalgleish et al., Nature, 312:763 (1984). Selv om T4-cellen er den viktigste celletypen som infiseres av HIV har hovedsakelig alle humane celler som uttrykker CD4-molekylet på overflaten evne til å binde og infiseres av HIV.

Tradisjonelt er CD4+ T-celler blitt utpekt i rollen som hjelper/inducer, noe som indikerer deres funksjon ved tilveiebringelse av et aktiverende signal til B-celler, eller induksjon av T-lymfocytter som bærer den resiproke CD8-markøren til å bli cytotoksiske/ uppressor-celler. Reinherz og Schlossman, Cell, 19:821-827 (1980); Goldstein et al., Immunol. Rev., 68:5-42, (1982)..

HIV binder spesifikt og med høy affinitet via et strekk med aminosyrer i den virale envelopen (gpl20), til en del av VI-regionen av CD4-molekylet lokalisert nær den N-terminale ende. Etter binding smelter viruset sammen med mål-cellemembranen, og blir internalisert. Når det er internalisert anvender det enzymet revers transkriptase for å transkribere dets genomiske RNA til DNA, som blir integrert i cellulært DNA hvor det eksisterer hele cellens liv som et provirus.

Proviruset kan forbli latent eller bli aktivert til å transkribere mRNA og genomisk RNA, noe som fører til protein-syntese, sammensetning, dannelse av nye virioner og knoppskyting av virus fra celle-overflaten. Selv om den presise mekanismen som viruset induserer celledød ved ikke er bekreftet, antas det at den viktigste mekanismen er massiv virus-knoppskyting fra celleoverflaten, noe som fører til at plasmamembranen brytes opp og resulterende osmotisk ulikevekt.

Under infeksjonsløpet utvikler vertsorganismen antistoffer mot virale proteiner, inklusive de store envelop glykoproteinene gpl20 og gp41. Til tross for denne humorale immuniteten utvikles sykdommen, hvilket resulterer i en letal immunosuppresjon karakterisert av mange opportunistiske infeksjoner, parasitema, demens og død. Svikten av vertens antivirale antistoffer når det gjelder å stoppe progresjonen av sykdommen representerer en av de mest besværlige og alarmerende aspekter av infeksjonen, og lover ikke godt for vaksinasjons-innsats basert på konvensjonelle fremgangsmåter.

To faktorer kan spille en rolle for effektiviteten av den humorale responsen mot immunosvikt-virus. Først, som for andre RNA-virus (og som for retrovirus spesielt) viser immunosvikt-virus en høy mutasjonsrate som respons på vertens immun-overvåkning. For det andre er envelop glykoproteiner tungt glykosylerte molekyler som presenterer få epitoper egnet for høy-affinitets-antistoff-bmding. Det svake antigene målet som den virale envelopen presenterer gir verten liten mulighet til å begrense viral infeksjon ved spesifikk antistoff-produksjon.

Celler som er infisert med HIV-virus uttrykker gpl20-glykoproteinet på sin overflate. gpl20 medierer fusjonsbegivenheter blant CD4+-celler via en reaksjon lignende den der virus kommer inn i uinfiserte celler, noe som fører til dannelse av kortlivede multi-nukleære kjempe-celler. Syncytium-dannelse er avhengig av en direkte interaksjon av gpl20 envelop-glykoproteinet med CD4-proteinet. Dalgleish et al., supra; Klatzman, D. et al., Nature, 312:763 (1984); McDougal, J.S. et al., Science, 231:382 (1986); Sodroski, J. et al., Nature, 322:470 (1986); Lifson, J. D. et al., Nature, 323:725 (1986); Sodroski, J. et al., Nature, 321:412(1986).

Bevis for at CD4-gpl20-binding er ansvarlig for viral infeksjon av celler som bærer CD4-antigenet omfatter funn av et spesifikt kompleks blir dannet mellom gpl20 og CD4. McDougal et al., supra. Andre undersøkelser har vist at cellelinjene, som er ikke-infektive for HIV, ble omdannet til infekterbare cellelinjer etter transformasjon og ekspresjon av det menneskelige CD4 cDNA-genet. Maddon et al., Cell, 46:333-348 (1986).

Terapeutiske programmer basert på løselig CD4 som en passiv agens for å interferere med viral absorpsjon og syncytium-mediert cellulær, overføring er foreslått, og suksessfullt demonstrert in vitro av en rekke grupper (Deen et al., Nature, 3321:82-84

(1988) ; Fisher et al., Nature, 331:76-78 (1988); Hussey et al., Nature 331:78-81, (1988); Smith et al., Science, 238:1704-1707 (1987); Traunecker et al., Nature, 331:84-86 (1988)); og CD4-immunoglobulin fusjonsproteiner med forlenget halveringstid og moderat biologisk aktivitet er deretter blitt utviklet (Capon et al., Nature 337:525-531 (1989); Traunecker et al., Nature 339:68-70 (1989); Bym et al., Nature, 344:667-670 (1990); Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol. 9:347-353 (1990). Selv om CD4-immunotoksin-konjugater eller fusjonsproteiner viser en kraftig cytotoksitet mot infiserte celler in vitro

(Chaudhary et al., Nature, 335:369-372 (1988); Till et al., Science, 242:1166-1168 (1988)), gjør latentheten i det immunodefekte syndromet at det er usannsynlig at hvilken som helst enkel-behandlingsterapi vil være effektiv for å eliminere virus-byrden, og antigenisiteten til fremmede fusjonsproteiner vil sannsynligvis begrense aksepterbarheten deres ved behandlinger som krever gjentatt dosering. Forsøk med aper rammet av SIV har vist at løselig CD4, hvis administrert til dyr uten markert CD4-cytopenia, kan redusere SIV-titer og forbedre in vitro-målinger av myeloid potensial (Watanabe et al., Nature, 337:267-270

(1989) . En rask tilbakekomst av virus ble imidlertid observert etter at behandlingen ble avbrutt, noe som antyder at administrering hele livet kan være nødvendig for å hindre progressiv immunsystem-svekkelse.

Celleoverflate-reseptor-assosierteprotein-tyrosinkinaser

De første fremstøt for å engasjere cellulære effektor-programmer i immunsystemet er ofte celle-gjenkjenhing av samlede ligander. Blant reseptorene som er kjent for å over-føre aktiverende signaler ved aggregering er B-celle- og T-celle-antigen-reseptorer (DeFranco, 1992, Eur. J. Biochem. 210:381-388; Weiss, 1991, Annu. Rev. Genet. 25:487-510), medlemmer av IgG og IgE Fc-reseptor-familiene (Fanger et al., 1989, Immunol. Today 10:92-99; Ravetch og Kinet, 1991, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492) og en rekke tilleggs-reseptorer, omfattende CD2, CD4, CD8 og CD28 i T-celler (Yokoyama og Shevach, 1989, Year Immunol. 4:110-146), CD19, CD20, CD21 og CD40 i B-celler (Clark og Ledbetter, 1989, Adv. Cancer Res. 52:81-149) og CD44, CD45 og CD58 i monocytter (Webb et al., 1990, Science 249:1295-1297). I tillegg aktiverer et stort antall fosfolipid-bundne proteiner cellulær aktivering på en antigen-reseptor-avhengig måte når de er krysskoblet på overflaten av T-celler (Balk og Terhorst, 1989, Immunol. Ser. 45:411-416; Kroczek et al., 1986, Nature 322:181-184; Yeh et al., 1987, J. Immunol. 138:91-97; Yokoyama og Shevach, 1989, Year Immunol. 4:110-146).

Det er idag ikke klart hvordan en enkel fysisk hendelse, aggregering, resulterer i et klart adskilt fysiologisk signal. Engasjement av cellulære effektor-programmer mediert av T-celle- og B-celle-antigen reseptorer, og ulike former for Fc-reseptor, kan bli etterlignet ved kryssbinding av kimere proteiner som bærer de intracellulære domenene av individuelle kjeder av reseptor-kompleksene (Irving og Weiss, 1991, Cell 64:891-901; Kolanus et al., 1992, EMBO. J. 11:4861-4868; Letourneur og Klausner, 1991, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:8905-8909; Letourneur og Klausner, 1992, Science 255:79-82; Romeo og Seed, 1991, Cell 64:1037-1046; Wegener et al., 1992, Cell 68:83-95). Det minste effektive utløserelementet ser ut til å kreve en fylogenetisk konservert (Reth, 1989, Nature 338:383-384) peptid-sekvens omfattende to tyrosin-enheter separert av 10 eller 11 enheter, og er innstøpt i en hydrofil, typisk sur, omgivelse (Romeo et al., 1992, Cell 68:889-897; Irving et al., 1993, J. Exp. Med. 177:1093-1103). Samling av reseptorer som bærer dette elementet initierer en aktiveringskaskade hvor protein-tyrosinkinase (PTK) aktivitet ser ut til å være essensiell; PTK-hemmere blokkerer både tidlige hendelser i B- og T-celle-aktivering, så som kalsium-mobilisering og den senere følge-tilstanden med cytokinfrigjøring og cellulær proliferasjon (June et al., 1990, J. Immunol. 144:1591-1599; Lane et al., 1991, J. Immunol. 146:715-722; Mustelin et al., 1990, Science 247:1584-1587; Stanley et al., 1990, J. Immunol. 145:2189-2198). Til tross for at de mer distale konsekvensene av reseptor-aktivering varierer i samsvar med celletype er de tidlige hendelsene slående like blant celler fra uensartede hematopoietiske linjer. De raske økningene observert i PTK-aktivitet etter kryssbinding av B-celle antigen-reseptor (Gold et al., 1990, Nature 345:810-813; Campbell og Sefton, 1990, EMBO J. 9:2125-2131), T-celle antigen-reseptor (June, C. H. et al., 1990, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:7722-7726; June, C. H. et al., 1990, J. Immunol. 144:1591-1599) og høy-affinitets IgE-reseptoren (Eiseman og Bolen, 1992, Nature 355:78-80; Li et al., 1992, Mol. Cell. Biol. 12:3176-3182) har alle r-isoformen av fosfatidylinositol-spesifikk fosfolipase C blant de tidlige fosforyleringsmålene (Carter et al., 1991, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:2745-2749; Li et al., 1992, Mol. Cell Biol. 12:3176-3182; Park et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:24237-24240; Park et al., 1991, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:5453-5456; Secrist et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:12135-12139; Weiss et al., 1991, Annu. Rev. Genet. 25:487-510), som blir direkte aktivert av tyrosin-fosforylering (Nishibe et al., 1990, Science 250:1253-1256).

PTK-aktivitetene som til nå er kjent for å assosiere med celleoverflate-reseptorer faller i to klasser: de som tilhører familien med Src proto-onkogen-relaterte kinaser og de som er relatert til den nylige karakteriserte Syk-kinase. Blant de første er Fyn-kinase blitt vist å assosiere med T-celle-reseptoren (Gassmann et al., 1992, Eur. J. Immunol. 22:283-286; Samelson et al., 1990, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:4358-4362), Lyn-, Fyn-, Blk- og Lck-kinasene er rapportert å assosiere med B-celle IgM-reseptoren (Burkhardt et al., 1991, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:7410-7414; Campbell og Sefton, 1992, Mol. Cell. Biol. 12:2315-2321; Yamanashi et al., 1991, Science 251:192-194) og Lyn- og Yes-kinaser er vist å assosiere med høy-affinitets IgE-reseptoren (Eiseman og Bolen, 1992, Nature 355:78-80; Hutchcroft et al., 1992, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:9107-9111; Hutchcroft, J. E. et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:8613-8619). Mekanismen for de observerte assosieringene er ikke etablert i detalj, men foreløpige data antyder at de intracellulære domenene av reseptor-kompleks-kjeder fysisk kan assosiere med Src-familie-kinaser (Clark et al., 1992, Science 258:123-126; Timson Gauen et al., 1992, Mol. Cell. Biol. 12:5438-5446). Det er idag ikke klart om disse assosiasjonene er direkte eller indirekte.

I dag er det mest overbevisende beviset for betydningen av Src-familie-kinaser i celleaktivering utviklet fra studiet av Fyn- og Lck-kinaser i T-celler. Overekspresjon av Fyn i transgene mus fører til en antigen-hyperresponsiv fenotype i de resulterende T-cellene, mens overekspresjon av en katalytisk inaktiv form blokkerer T-celle-reseptor-mediert proliferasjon (Cooke et al., 1991, Cell 65:281-291). Thymus T-celler isolert fra mutante mus som mangler Fyn-kinaseaktivitet viser en sterk defekt i evnen til å gi en proliferativ respons som respons på behandling med en kombinasjon av phorbol-ester pluss enten anti-CD3 antistoff eller Concanavalin A (Appleby et al., 1992, Cell 70:751-763; Stein et al., 1992, Cell 70:741-750). Milt T-celler isolert fra slike mus viser en mindre alvorlig, men betydellig, svekking av celle-aktiveringsresponsen (Appleby et al., 1992, Cell 70:751-763; Stein et al., 1992, Cell 70:741-750).

I T-celler assosierer Lck-kinasen indirekte med TCR via CD4 og CD8 ko reseptorene (Rudd et al., 1988, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85:5190-5194; Shaw et al., 1989, Cell 59:627-636; Turner et al., 1990, Cell 60:755-765; Veillette et al., 1988, Cell 55:301-308). Overekspresjon av Lek i en antigen-responsiv cellelinje muliggjør reseptor-sensitivitet på en lignende måte som den observert for Fyn (Abraham og Veillette, 1990, Mol. Cell. Biol. 10:5197-5206; Davidson et al., 1992, J. Exp. Med. 175:1483-1492; Luo og Sefton, 1992, Mol. Cell. Biol. 12:4724-4732). I en CD4-avhengig murin T-celle hybridoma-modell kan rekonstitusjon av antigen-spesifikk hjelpe-funksjon bare bli oppnådd med CD4-molekyler som kan interagere med Lek (Glaichenhaus et al., 1991, Cell 64:511-520).

Det sterkeste beviset for den direkte deltagelsen av Lck-kinase i antigen-reseptor-mediert signalisering kommer imidlertid fra studier av mutante cellelinjer som mangler Lek. To slike linjer er undersøkt, én avledet fra Jurkat humane T-celle leukemi-hnjen (Goldsmith og Weiss, 1987, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84:6879-6883; Straus og Weiss, 1992, Cell 70:585-593) og den andre fra den murine cytotokiske T-celleklonen CTLL-2 (Karnitz et al., 1992, Mol. Cell. Biol. 12:4521-4530). Begge de Lck-negative mutante cellelinjene er defekte ved TCR-mediert signalisering, og komplementasjon av hvilken som helst av de mutante linjene ved transfeksjon med et Lck-uttrykkende plasmid gjenoppretter responsivitet for TCR-krysskoblings-stimuli (Karnitz et al., 1992, Mol. Cell. Biol. 12:4521-4530; Straus og Weiss, 1992, Cell 70:585-593).

Nylig er medlemmer av en ny familie tyrosin-kinaser, først representert av de nært beslektede eller identiske kinasene Syk (Taniguchi et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:15790-15796) og PTK 72 (Zioncheck et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:15637-15643; Zioncheck et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:19195-19202) vist å assosiere med celle-overflate-reseptorer. Til tross for at PTK 72 og Syk ikke er definitivt bevist å være identiske, har de en felles vevs-fordeling (tymus og milt), molekylmasse og labilitet for protelyse. PTK 72 er vist å assosiere med B-celle IgM-reseptor (Hutchcroft et al., 1992, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:9107-9111; Hutchcroft, J. E. et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:8613-8619), og å være fosforylert etter krysskobling av reseptoren med anti-IgM (Hutchcroft et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:14846-14849). En samtidig aktivering av enzymet, som målt ved både autofosforylering og fosforylering av et eksogent proteinfragment, ble demonstrert etter overflate IgM-kryssbinding (Hutchcroft et al., 1992, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:9107-9111; Hutchcroft, J. E. et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:8613-8619). PTK 72 er også funnet assosiert med høy-affinitets-IgE-reseptoren i en rotte basofil-leukemi-cellelinje (Hutchcroft et al., 1992, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:9107-9111; Hutchcroft, J. E. et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:8613-8619).

Et andre medlem av Syk-familien, ZAP-70, er vist å være en PTK som assosierer med zeta-kjeden av T-celle-reseptoren etter reseptor-kryssbinding (Chan et al., 1991, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:9166-9170). Til tross for at ekspresjon av ZAP-70, Fyn eller Lek i COS-celler fører til moderat økning i total celle-tyrosinfosfat, fører sam-ekspresjon av ZAP-70 og enten Lek eller Fyn til en dramatisk økning i netto tyrosin-fosforylering (Chan et al., 1992, Cell, 71:649-662). Hvis en CD8-zeta-kjede-kimer også er tilstede blir kimeren fosforylert og ZAP-70 er funnet assosiert med den (Chan et al., 1992, Cell, 71:649-662). Det er idag ikke klart hvorvidt ZAP-70 aktiverer Src-familie kinasene og/eller vice versa, og heller ikke hvorfor sam-ekspresjon av kinaser i COS-celler skulle medføre en åpenbar konstitutiv aktivering. Uansett antyder den aktive assosieringen av ZAP-70 med kryss-koblet TCR en rolle for denne PTK i overføringen av reseptorresponsen.

I motsetning til Src-familie kinasene bærer Syk og ZAP-70 to SH2-domener, og intet N-terminal myristolasjons-sete (Taniguchi et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:15790-15796; Chan et al., 1992, Cell, 71:649-662). En naturlig antagelse for mekanismen til kinasereseptor-assosiering er at to SH2-domener binder de to tyrosinene fra antigen-reseptor utløser-motivene når de er fosforylert. Dette fremstår imidlertid bare som en hypotese idag.

W092/15322 beskriver kimere reseptorer som innbefatter spesielle signaliserings-deler av T-cell, B-celle eller Fc-reseptorproteiner. Denne publikasjonen verken beskriver eller foreslår kimeriske reseptorer som innbefatter en protem-tyrosinkinase intracellulær signaliseringsdel.

Sammendrag av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig celle som uttrykker et membran-bundet kimert reseptorprotein, kjennetegnet ved at den omfatter (a) en intracellulær del av en protein-tyrosinkinase som kan signalisere til nevnte celle at den skal ødelegge en reseptorbundet målcelle, eller et reseptorbundet mål-infektivt agens og (b) en ekstracellulær del som spesifikt kan gjenkjenne og binde nevnte målcelle eller nevnte målinfektive agens, hvorved hver av de nevnte cellene spesifikt kan gjenkjenne og ødelegge nevnte målcelle eller målinfektive agens.

Det er videre beskrevet DNA, kjennetegnet ved at det koder for en kimer reseptor ifølge krav 1 eller 5.

Det er også beskrevet vektor, kjennetegnet ved at den omfatter det kimere reseptor-DNAet ifølge kravene 1 eller 5.

Det demonstreres heri muligheten av å danne kimeras mellom det intracellulære domenet av et protein-tyrosinkinase-molekyl og et ekstracellulært domene som kan utføre oppgaven med mål-gjenkjenning. Spesielt vil samling av kimeras som bærer Syk eller ZAP-70 kinase-sekvenser utløse kalsium-mobilisering. Aggregering av Syk-kimeras alene, eller ko-aggregering av kimeras som bærer Fyn eller Lek og ZAP-70-kinaser, er tilstrekkelig til å initiere cytolytisk effektorfunksjon. Slik effektorfunksjon forenkler den spesifikke gjenkjenningen og ødeleggelsen av uønskede målceller, f. eks. patogener, patogeninfiserte celler, tumorceller eller autoimmune celler.

Hvilket som helst antall nyttige kimere molekyler kan bli konstruert. F. eks. tillater dannelsen av kimeras som består av den intracellulære delen av en proteintyrosinkinase spleiset til den ekstracellulære delen av et passende sammensatt antistoffmolekyl at måj-gjenkjenningspotensialet til en immunsystemcelle blir spesifikt omdirigert til antigenet som er gjenkjent av den ekstracellulære antistoff-delen. Med en antistoffdel som kan gjenkjenne noen determinanter på overflaten av et patogen, vil således immunsystemceller utrustet med kimeren kunne respondere på tilstedeværelsen av patogenet med effektorprogrammet egnet for deres linje, f.eks vil hjelpe-T-lymfocytter respondere med cytotoksisk aktivitet mot målet, og B-lymfocytter vil bli aktivert til å syntetisere antistoff. Makrofager og granulocytter vil utføre deres effektor-programmer, omfattende cytokinfrigj øring, fago-cytose og reaktiv oksygengenerering. På lignende vis, med en antistoffdel som kan gjenkjenne tumorceller, vil immunsystem-responsen mot tumoren bli fordelaktig forhøyet. Med et antistoff som kan gjenkjenne immunceller med en uegnet reaktivitet med selv-determinanter kan autoreaktive celler bli selektivt målrettet for destruksjon.

Disse eksemplene angir anvendelsen av antistoff-kimeras som en hensiktsmessig illustrasjon, men spesifikke ikke-antistoff ekstracellulære domener kan også ha viktige fordeler. Med en ekstracellulær del som er reseptoren for et virus, en bakterie eller parasitt vil f.eks celler som er utrustet med kimeren spesifikt ha som mål celler som uttrykker virale, bakterielle eller parasittiske determinanter. Fordelen med denne fremgangsmåten fremfor anvendelse av antistoffer er at den native reseptoren for patogenet kan ha en unikt høy selektivitet eller affinitet for patogenet, noe som tillater en større grad av presisjon i den resulterende immunresponsen. På lignende vis kan det, for å fjerne immunsystem-celler som uhensiktsmessig reagerer med et selv-antigen, være tilstrekkelig å sammenføye antigener (enten som et intakt protein, som for B-celle-tappings-terapier, eller som MHC-kompleks, som for T-celle-tappings-terapier) for intracellulære pro tein-tyrosinkinasekj eder, og derved påvirke den spesifikke målrettingen av cellene som uhensiktsmessig responderer på selv-determinanter.

En annen anvendelse av kimerene er kontroll av cellepopulasjoner in vivo etter andre former for genetisk sammensetning. F. eks. er anvendelse av tumor-infUtrerende lymfocytter eller naturlige dreperceller, for å føre cytotoksisitet til setet med tumor foreslått. Det konvensjonelle midlet regulerer antallet og aktiviteten av slike lymfocytter og celler uten å fjerne dem fra pasientens kropp for amplifisering in vitro. Fordi de intracellulære domenene i de kimerte reseptorene medierer de proliferative responsene i cellene, vil således koordineringen av de ekstracellulære domenene med en rekke aggregerings-stimuli spesifikke for de ekstracellulære domenene (f. eks et antistoff som er spesifikt for det ekstracellulære domenet) resultere i proliferasjon av cellene som bærer kimerene.

, Selv om de spesifikke utførelsesformene av foreliggende oppfinnelse omfatter kimeras mellom Syk eller Syk og Src-familiene av protem-tyrosinkinaser, kan alle tyrosin-kinaser som bar en lignende funksjon som disse molekylene bli anvendt for formålene . beskrevet her. De fremtredende trekkene ved ønskelige immuncelle-utløser-molekyler omfatter evnen til å bli uttrykt autonomt, evnen til å bli fusert til et ekstracellulært domene (direkte eller indirekte gjennom et transmembrant domene) slik at den resulterende kimeren er tilstede på overflaten av en terapeutisk celle, og evnen til å initiere cellulære effektor-programmer etter aggregering, etter møte med en mål-ligand.

I dag er den mest egnede metoden for å avlevere kimerene til immunsystem-celler, gjennom en form for genetisk terapi. Rekonstruksjon av immunsystem-celler med kimerte reseptorer ved å blande cellene med passende oppløste renset kimertt protein vil imidlertid også resultere i dannelse av en sammensatt celle-populasjon som kan respondere på målene som er gjenkjent av det ekstracellulære domenet av kimerene. Lignende fremgangsmåter er anvendt f. eks. for å innføre intakt HIV-reseptor, CD4, i erytrocytter for terapeutiske formål. I dette tilfellet vil ikke den sammensatte cellepopulasjonen ha evnen til å fornye seg.

Foreliggende oppfinnelse angår funksjonelle enkle protein-tyrosinkinase-kimeras som kan redirigere immunsystem-funksjoner. Mer spesifikt angår den regulering av

lymfocytter, makrofager, naturlige dreperceller eller granulocytter ved ekspresjon i nevnte celler av kimeras som forårsaker at cellene responderer på mål gjenkjent av kimerene. Det er mulig å dirigere cellulær respons til en infektiv agens, en tumor eller kreft-celle eller en autoimmun-generert celle. Dette kan gjøres ved administrering av en effektiv mengde terapeutiske celler til nevnte pattedyr, hvor nevnte celler kan gjenkjenne og ødelegge nevnte infektive agens, tumor, kreft-celle eller autoimmun-genererte celle.

Administrering av terapeutiske celler som kan gjenkjenne og ødelegge nevnte agens, hvor agenset er et spesifikt virus, bakterie, protozo eller sopper er også mulig. Agenser så som HIV og Pneumocystis carinii kan anvendes.

For å behandle en HIV-infeksjon blir en effektiv mengde kimer-reseptor-uttrykkende cytotoksiske T-lymfocytter administrert til en pasient; lymfocyttene kan spesifikt gjenkjenne og lysere celler som er infisert med HIV, så vel som sirkulerende virus.

Det er mulig å dirigere cellulær respons mot HIV-infiserte celler ved å administrere til en pasient en effektiv mengde cytotoksiske T-lymfocytter som spesifikt kan gjenkjenne og lysere celler som er infisert med HIV.

Disse og andre utførelsesformer ifølge foreliggende oppfinnelse vil være klare for fagfolk ut fra den følgende detaljerte beskrivelsen av oppfinnelsen.

I den følgende detaljerte beskrivelsen vil det bli henvist til ulike metodikker som er kjent for fagfolk innen feltet molekylær-biologi og immunologi.

Standard referansearbeid som fremsetter generelle prinsipper ved rekombinant DNA-teknologi omfatter Watson J.D. et al., Molecular Biology of the Gene, Volum I og II, the Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., utgiver, Menlo Park, CA (1987); Darnell, J.E. et al., Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Inc., utgiver, New York, N.Y. (1986); Lewin, B.M. Genes II, John Wiley & Sons, utgiver, New York, N.Y

(1985); Old, R. W. et al., Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2. utg, University of California Press, utgiver, Berkeley, CA, (1981); Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utg, Cold Spring Harbor Laboratory, utgiver, Cold Spring Harbor, NY (1989) og Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Wiley Press, New York, NY (1989).

Definisjoner

Med "kloning" menes anvendelse av in vitro rekombinasjonsteknikker for å sette inn et spesielt gen eller en annen DNA-sekvens i et vektor-molekyl. For vellykket å klone et ønsket gen er det nødvendig å ta i bruk metoder for å generere DNA-fragmenter for å sette sammen fragmentene med vektormolekyler, for å innføre det sammensatte DNA-molekylet i en vertscelle hvor den kan replikere, og å selektere for klonen som har mål-genet fra de mottagende vertscellene.

Med "cDNA" menes komplementært eller kopi-DNA, produsert fra et RNA-templat ved RNA-avhengig DNA-polymerase- (revers transkriptase) aktivitet. Med en "cDNA-klon" menes således en dupleks DNA-sekvens som er komplementær med det interessante RNA-molekylet, båret i en kloningsvektor.

Med "cDNA-bibliotek" menes en samling rekombinante DNA-molekyler som inneholder cDNA-innskudd som omfatter DNA-kopier av mRNA som uttrykkes av cellen på den tiden cDNA-biblioteket ble laget. Et slikt cDNA-bibliotek kan bli produsert ved metoder som er kjent for fagfolk innen feltet, og f.eks beskrevet i Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra. Generelt blir RNA først isolert fra cellene til en organisme fra hvis genom det er ønsket å klone et spesielt gen. Foretrukket for formålet med foreliggende oppfinnelse er lymfocyttiske cellelinjer fra pattedyr, spesielt menneske. En foretrukket vektor idag for dette formål er vaccinia-virus WR-stamme.

Med "vektor" menes et DNA-molekyl, avledet f.eks fra et plasmid, en bakteriofag, et pattedyr eller insektsvirus, hvor fragmenter av DNA kan bli satt inn, eller klonet. En vektor vil omfatte ett eller flere unike restriksjonsseter, og kan ha evnen til autonom replikasjon i en definert vert eller hjelpeorganisme slik at den klonede sekvensen er reproduserbar. Med "DNA-ekspresjonsvektor" menes således hvilke som helst autonome elementer som kan dirigere syntesen av et rekombinant peptid. Slike DNA-ekspresjons-vektorer omfatter bakterielle plasmider, fag og pattedyr- og insekts-plasmider og virus.

Med "hovedsakelig rent" menes en forbindelse, f.eks et protein, et polypeptid eller

et antistoff som er i all hovedsak fri for komponentene som naturlig følger det. Generelt er en forbindelse hovedsakelig ren når minst 60%, fortrinnsvis minst 75% og mer foretrukket minst 90% av det totale materialet i en prøve er den interessante forbindelsen. Renhet kan måles ved hvilken som helst egnet metode, f.eks kolonne-kromatografi, polyakrylamidgel-elektroforese eller HPLC-analyser. I forbindelse med en nukleinsyre betyr "hovedsakelig ren" en nukleinsyre-sekvens, segment eller fragment som ikke er umiddelbart tilstøtende med (dvs. kovalent bundet til) begge de kodende sekvensene som den er umiddelbart tilstøtende med (dvs. en ved 5'-enden'og en ved 3'-enden) i det naturlige forekommende genomet til organismen fra hvilken DNAet ifølge oppfinnelsen, er avledet.

Med "funksjonelle derivater" menes "fragmenter", "varianter", "analoger" eller "kjemiske derivater" av et molekyl. Et "fragment" av et molekyl, så som hvilke som helst av cDNA-sekvensene ifølge foreliggende oppfinnelse skal referere til hvilken som helst nukleotid-undergruppe av molekylet. En "variant" av et slikt molekyl refererer til et naturlig forekommende molekyl som hovedsakelig ligner enten hele molekylet, eller et fragment derav. En "analog" til et molekyl refererer til et ikke-naturlig molekyl som hovedsakelig ligner enten hele molekylet, eller et fragment derav. Et molekyl sies å være "hovedsakelig lignende" med et annet molekyl dersom sekvensen av aminosyrene i begge molekyler er hovedsakelig den samme. Hovedsakelig lignende aminosyremolekyler vil ha en lignende biologisk aktivitet. Når to molekyler har lignende aktivitet er de således ansett som varianter slik begrepet er anvendt her, selv om ett av molekylene omfatter flere eller færre aminosyre-enheter som ikke finnes i det andre, eller hvis sekvensen av aminosyre-enhetene ikke er identisk. Et molekyl blir her betraktet som et "kjemisk derivat" av et annet molekyl når det inneholder ytterligere kjemiske rester som normalt ikke er en del av molekylet. Slike grupper kan forbedre molekylenes oppløselighet, absorpsjon, biologiske halveringstid osv. Gruppene kan alternativt redusere toksisiteten av molekylet, eliminere eller svekke hvilke som helst uønskede bieffekter av molekylet, osv. Grupper som kan mediere slike effekter er f.eks beskrevet i Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. utg. Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1980).

Tilsvarende skal et "funksjonelt derivat" av et reseptor-kimer-gen ifølge foreliggende oppfinnelse omfatte "fragmenter", "varianter" eller "analoger" av genet som kan være "hovedsakelig lignende" i nukleotid-sekvens og som kan kode for et molekyl som har lignende aktivitet som en protein tyrosin-kinase-kimer.

Som anvendt her skal således et protein-tyrosinkinase-kimer-protein også omfatte hvilket som helst funksjonelt derivat, fragmenter, varianter, analoger eller kjemiske derivater som hovedsakelig kan være lignende "villtype" kimeras og som utviser lignende aktivitet (dvs. minst 10%, fortrinnsvis 40%, mer foretrukket 70% eller mest foretrukket 90% av villtype-reseptor-kimeras-aktivitet). Aktiviteten av et funksjonelt kimertt reseptor-derivat omfatter spesifikk binding (med den ekstracellulære delen) til et målrettet agens eller celle, og resulterende destruksjon (dirigert av dens intracellulære del) av agenset eller cellen; slik aktivitet kan bli testet, f.eks ved å anvende hvilken som helst av testene beskrevet her.

En DNA-sekvens som koder for kimeren eller dens funksjonelle derivater, kan rekombineres med vektor-DNA i samsvar med konvensjonelle teknikker, omfattende rett-endet eller overhengende-endet ender for ligering, restriksjonsenzym-kutting for å fremskaffe egnede ender, hensiktsmessig fylling av kohesive ender, alkalisk fosfatase-behandling for å unngå uønsket kobling og ligering med passende ligaser. Teknikker for slike manipuleringer er beskrevet av Maniatis T., et al., supra, og er godt kjent innen feltet.

Et nukleinsyre-molekyl, så som DNA, er angitt å ha "evnen til å uttrykke" et polypeptid hvis det omfatter nukleotidsekvenser som inneholder transkripsjonen og translasjonen regulatorisk informasjon, og slike sekvenser er "operabelt koblet" til nukleoud-sekvenser som koder for polypeptidet. En operabel kobling er en kobling hvor de regulatoriske DNA-sekvensene og DNA-sekvensen som skal uttrykkes er forbundet på en slik måte at gen-ekspresjon tillates. Den presise naturen til de regulatoriske regionene som trengs for gen-ekspresjon kan variere fra organisme til organisme, men vil generelt omfatte en promoter-region som, i prokaryoter, omfatter både promoteren (som styrer initieringen av RNA-transkripsjon) så vel som DNA-sekvenser som, når de blir transkribert til RNA, vil signalisere initieringen av protein-syntese. Slike regioner vil normalt omfatte de 5'-ikke-kodende sekvensene som er involvert i initieringen av transkripsjon og translasjon, så som TATA-boks, capp'ing-sekvens, CAAT-sekvens og lignende.

Hvis ønsket kan den ikke-kodende regionen 3' for gen-sekvensen som koder for proteinet bli oppnådd ved de ovenfor beskrevne metodene. Denne regionen kan bli opprettholdt for dens transkripsjonene terminerings-regulatoriske sekvenser, så som terminering og polyadenylering. Ved å beholde 3'-regionen som naturlig tilstøter DNA-sekvensen som koder for proteinet kan således transkripsjons-terminerings-signaler bli fremskaffet. Når transkripsjonstermineringssignalene ikke er tilfredsstillende funksjonelle i ekspresjons-vertscellen, kan så en 3'-region som er funksjonell i vertscellen bli satt inn i stedet.

To DNA-sekvenser (så som en promoterregion-sekvens og en protein-tyrosinkinase kimera-kodende sekvens) sies å være operabelt koblet hvis naturen av koblingen mellom de to DNA-sekvensene ikke (1) resulterer i innføringen av en leseramme-forskyvnings-mutasjon, (2) interfererer med promoterregion-sekvensens evne til å styre transkripsjonen av reseptor-kimer-gensekvensen eller (3) interfererer med reseptor-kimer-gensekvensens evne til å bli transkribert av promoter-region-sekvensen. En promoter-region vil være operabelt koblet til en DNA-sekvens hvis promoteren kan effektuere transkripsjon av den DNA-sekvensen. For å uttrykke proteinet er det således nødvendig med transkripsjonene og translasjonelle signaler som gjenkjennes av en egnet vert.

Ekspresjonen av protein-tyrosin-kinase kimera-proteinet (eller et funksjonelt derivat derav) kan foregå i enten prokaryote eller eukaryote celler, selv om eukaryote (og spesielt humane lymfocytter) uttrykk er foretrukket.

Antistoffer kan bli preparert ved hvilken som helst av en rekke metoder. F.eks kan celler som uttrykker reseptor-kimera-proteinet, eller et funksjonelt derivat derav, bli administrert til et dyr for å indusere produksjonen av sera som inneholder polyklonale antistoffer som kan binde kimeren.

Ved en foretrukket fremgangsmåte er antistoffene monoklonale antistoffer. Slike monoklonale antistoffer kan bli preparert ved å anvende hybridoma-teknologi (Kohler et al., Nature 256:495 (1975); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:292 (1976); Hammerling et al., I: Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., s. 563-684 (1981)). Generelt involverer slike prosedyrer immunisering av et dyr med kimera-antigenet. Splenocyttene fra slike dyr blir ekstrahert og fusert med en egnet myeloma-cellelinje. Hvilken som helst egnet myeloma-cellelinje kan bli anvendt i samsvar med foreliggende oppfinnelse. Etter fusjon blir de resulterende hybridoma-cellene selektivt holdt i HAT-medium, og deretter klonet ved begrensende fortynning som beskrevet av Wands, J. R. et al., (Gastroenterology 80:225-232 (1981). Hybridoma-cellene oppnådd gjennom en slik seleksjon blir så testet for å identifisere kloner som sekreterer antistoffer som kan binde kimeren.

Antistoffene kan også være polyklonale, eller fortrinnsvis regionspesifikke polyklonale antistoffer.

Antistoffer mot kimera kan bli anvendt for å overvåke mengden av kimere reseptorer (eller kimere reseptor-bærende ceUer) hos en pasient. Slike antistoffer er godt egnet for anvendelse i standard immunodiagnostiske tester kjent innen feltet, omfattende slike immunometriske eller "sandwich"-tester som fremover-sandwich, revers-sandwich og samtidig-sandwich-tester. Antistoffene kan bli anvendt i et antall kombinasjoner som kan bestemmes av fagfolk uten unødig eksperimentering for å utføre immunotester med aksepterbar spesifisitet, sensitivitet og nøyaktighet.

Standard referansearbeid som fremsetter generelle prinsipper innen immunologi omfatter Roitt, I., Essential Immunology, 6.utg., Blackwell Scientific Publications, utgiver, Oxford (1988); Kimball, J. W., Introduction to Immunology, 2.utg. Macmillan Publishing Co., utgiver, New York (1986); Roitt, I., et al., Immunology, Gower Medical Publishing Ltd., utgiver, London, (1985); Campbell, A., "Monoclonal Antibody Technology", I Burdon, R., et al., red. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volum 13, Elsevier, utgiver, Amsterdam (1984); Klein, J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, utgiver, New York (1982) og Kennett, R., et al., red., Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Press, utgiver, New York (1980).

Med "detektering" er det ment å inkludere bestemmelsen av tilstedeværelsen eller fraværet av en substans, eller kvantifisere mengden av en substans. Begrepet refererer således til anvendelsen åv materialene, blandingene og fremgangsmåtene for kvalitative og kvantitative bestemmelser.

Isoleringen av andre hybridomer som sekreterer monoklonale antistoffer med samme spesifisitet som de beskrevet her kan bli utført ved teknikken med anti-idiotyping undersøkelse (Potocmjak et al., Science 215:1637 (1982)). Et anti-idiotypisk antistoff er et antistoff som gjenkjenner unike determinanter som er tilstede på antistoffet produsert av den interessante klonen.' Det anti-idiotypiske antistoffet blir preparert ved å immunisere et dyr, av den samme stammen som ble anvendt som kilden for det monoklonale antistoffet, med det interessante monoklonale antistoffet. Det immuniserte dyret vil gjenkjenne og respondere på de idiotypiske determinantene til det immuniserende antistoffet ved å produsere antistoffer mot disse idiotypiske determinantene (anti-idiotypisk antistoff).

For replikasjon kan hybride celler bli kultivert både in vitro og in vivo. Høy in

vivo produksjon gjør denne til den foretrukne fremgangsmåten for dyrking idag. Celler fra de individuelle hybride stammene blir injisert intraperitonalt i pristane-primet BALB/c-

mus for å produsere ascites-fluidum inneholdende høye konsentrasjoner av de ønskede monoklonale antistoffene. Monoklonale antistoffer av isotype IgM eller IgG kan bli renset fra dyrkede supernatanter ved å anvende kolonne-kromatografi-metoder som er godt kjent for fagfolk innen feltet.

Nevnte antistoffer er spesielt velegnet for anvendelse i immunotester hvor de kan

bli anvendt i flytende fase, eller bundet til en fast fase-bærer. I tillegg kan antistoffene i disse immunotestene bli detekterbart merket på ulike måter.

Det er kjent mange ulike merker og metoder for merking innen feltet. Eksempler

på typene merker som kan bli anvendt ved foreliggende oppfinnelse omfatter, men er ikke begrenset til, enzymer, radioisotoper, flourescerende forbindelser, kjemiluminiscerende forbindelser, bioluminiscerende forbindelser og metall-chelater. Fagfolk innen feltet vil kjenne andre egnede merker for binding til antistoffer, eller vil kunne skaffe seg kjennskap til dette ved anvendelse av rutine-ekspeirmentering. Videre kan binding av disse merkene til antistoffer bli utført ved å anvende standard teknikker som er vanlig kjent for fagfolk innen feltet.

En av måtene som antistoffene kan bli detekterbart merket på, er ved å koble antistoffet til et enzym. Dette enzymet vil deretter, når det senere blir eksponert for sitt substrat, reagere med substratet på en slik måte at det produseres en kjemisk enhet som kan bli detektert f.eks ved spektrofotometriske eller flourometriske midler. Eksempler på enzymer som kan bli anvendt for detekterbart å merke antistoffer, omfatter malatdehydro-genase, stafylokokkisk nuklease, delta-V-steroid-isomerase, gjær alkohol-dehydrogenase, alfa-glycerofosfat-dehydrogenase, triosefosfat-isomerase, biotinavidin-peroksidase, pepperrot-peroksidase, alkalisk fosfatase, asparaginase, glukose-oksidase, fi-galaktosidase, ribonuklease, urease, katalase, glukose-VI-fosfat-dehydrogenase, glukoamylase og acetylcholin-esterase.

Tilstedeværelsen av detekterbart merkede antistoffer kan også bli detektert ved å merke antistoffene med en radioaktiv isotop som så kan bli determinert ved slike midler som anvendelse av en gamma-teller eller en scintillasjonsteller. Isotoper som er spesielt nyttige for foreliggende oppfinnelse er 3H, 1251,32P, 35S, 14C, 51 Cr, 36C1, 57Co, 58Co, 59Fe og 75Se.

Det er også mulig å detektere bindingen av detekterbart merkede antistoffer ved merking av antistoffene med en flourescerende forbindelse. Når et flourescerende merket antistoff eksponeres for lys av den riktige bølgelengden kan dens nærvær så bli detektert på grunn av fluoresceringen til fargestoffet. Blant de mest vanlig brukte flourescerende merkede forbindelser er flourescein, isotiocyanat, rhodamin, phycoerythrin, phycocyanin, allophycocyanin, o-fthaldehyd og flourescamin.

Antistoffene kan også bli detekterbart merket ved å anvende flourescerens-utstrålende metaller så som 152Eu eller andre i lantanid-serien. Disse metallene kan bli festet til antistoff-molekylet ved å anvende slike metall-chelaterende-grupper som dietylentriaminpentaeddikksyre (DTP A) eller etylendiamintetraeddikksyre (EDTA).

Antistoffer kan også bli detekterbart merket ved å koble dem til en kjemi-luminescent forbindelse. Tilstedeværelse av det kjemiluminecent-merkede antistoffet blir så bestemt ved å detektere tilstedeværelsen av luminescens som oppstår under forløpet av den kjemiske reaksjonen. Eksempler på spesielt nyttige kjemiluminescerende merkings-forbindelser er luminal, isoluminol, theromatisk akridinium-ester, imidazol, akridinium-salter, oksalatester og dioksetan.

Likeledes kan en bioluminescent forbindelse bli anvendt for å merke antistoffene. Bioluminescens er en type kjemiluminescense funnet i biologiske systemer hvor et katalytisk protein øker effektiviteten av den kjemiluminescerende reaksjonen. Tilstedeværelsen av et bioluminecent antistoff blir bestemt ved å detektere tilstedeværelsen av luminescens. Viktige bioluminescerende forbindelser for merking omfatter luciferin, luciferase aequorin.

Antistoffene og hovedsakelig renset antigen er ideelt egnet for dannelsen av et sett. Et slikt sett kan omfatte en bære-anordning som er oppdelt i seksjoner som kan inneholde én eller flere bokser så som krukker, rør og lignende, idet hver av de nevnte boksene inneholder de separate elementene for anvendelse i testen.

Typene tester som kan bli innført i et sett er mange, og omfatter f.eks. kompetitive og ikke-kompetitive tester. Typiske eksempler på tester som kan anvende antistoffene ifølge oppfinnelsen er radioimmunotester (RIA), enzym-immunotester (EIA), enzym-koblede irornunosorbente tester (ELISA) og immunometrisk, eller sandwich, immunotester.

Begrepet "immunometrisk test" eller "sandwich immunotest" er ment å omfatte samtidig sandwich-, fremover sandwich- og revers sandwich-immunotester. Disse begrepene er velkjente for fagfolk innen feltet. Fagfolk vil også være klar over at antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse vil være nyttige i andre variasjoner og former for tester som er kjent idag, eller som kan bli utviklet i fremtiden. Disse skal være innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse.

Ved den foretrukne fremgangsmåten for å utføre testene er det viktig at visse "blokkere" er tilstede i inkuberingsmediet (vanligvis tilsatt sammen det merkede oppløslige antistoffet). "Blokker" er tilsatt for å sikre at ikke-spesifikke proteiner, proteaser eller humane antistoffer mot muse-immunoglobuliner som er tilstede i den eksperimentelle prøven ikke krysskobler eller ødelegger antistoffene på fast-fase-bæreren, eller det radio-merkede indikator-antistoffet, og gi falske positive eller falske negative resultater. Valget av "blokker" øker derfor betydelig spesifisiteten til testen beskrevet i foreliggende oppfinnelse..

Det er funnet at en rekke ikke-relevante (dvs. ikke-spesifikke) antistoffer fra samme klassen eller subklassen (isotype) som de anvendt i testene (f.eks IgGl, IgG2a, IgM, osv) kan bli anvendt som "blokker". Konsentrasjonen av blokker (normalt 1-100 ug/ul) er viktig for å opprettholde den ønskede sensitiviteten og fremdeles hemme alle uønskede på-virkninger ved gjensidig forekommende kryss-reaktive proteiner i humant serum. I tillegg må buffersystemet som omfatter "blokker" optimaliseres. Foretrukne buffere er de basert på svake organiske syrer, så som imidazol, HEPPS, MOPS, TES, ADA, ACES, HEPES, PIPES, TRIS og lignende, ved fysiologiske pH-områder. Noe mindre foretrukne buffere er uorganiske buffere så som fosfat, borat eller karbonat. Til slutt bør det tilsettes kjente protease-hemmere (normalt 0,01-10 ug/ml) til bufferen som omfatter "blokker".

Det er mange fast-fase immunoadsorbenter som er benyttet, og som kan bli anvendt i foreliggende oppfinnelse. Velkjente immunoadsorbenter omfatter glass, polystyren, polypropylen, dekstran, nylon og andre materialer, i form av rør, kuler og mikrotiterplater dannet av eller bekledd med slike materialer, og lignende. Immobiliserte antistoffer kan være enten kovalent eller fysisk bundet til fast-fase immunoadsorbenten, ved teknikker som kovalent binding via en amid- eller ester-binding, eller ved absorpsjon. Fagfolk innen feltet vil kjenne mange andre egnede fast-fase immunoadsorbenter, og fremgangsmåter for å immobilisere antistoffer på disse, eller vil kunne finne slike uten å anvende annet en rutine-ekspeirmentering.

For in vivo, in vitro eller in situ diagnostikk kan merker så som radionuklider bli bundet til antistoffene, enten direkte eller ved å anvende en mellomledd-funksjonell-gruppe. En mellomledd-gruppe som ofte anvendes for å binde radioisotoper som eksisterer som metalliske kationer til antistoffer, er dietylentriaminpentaeddikksyre (DTPA). Typiske eksempler på metalliske kationer som er bundet på denne måten er : 99mTc, L23I, 11 lin, 1311,97Ru, 67Cu, 67Ga og 68Ga. Antistoffene kan også bli merket med ikke-radioaktive isotoper for diagnostiske formål. Elementer som er spesielt nyttige slik en er 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr og 56Fe.

Antigenene kan bli isolert i hovedsakelig ren form ved å benytte antistoffene angityt ovenfor. Det tilveiebringes derfor hovedsakelig rene protein-tyrosinlrinase-kimerer, hvor nevnte antigen er karakterisert ved at det blir gjenkjent av og binder til antistoffene. Det er mulig å isolere eller rense det kimerte reseptor-antigenet, ved å danne et kompleks av nevnte antigen med ett eller flere antistoffer dirigert mot reseptor-kimeren.

De hovedsakelig rene kimera-antigenene kan så bli anvendt for å detektere eller måle antistoff mot kimeren i en prøve, så som serum eller urin. Det er således mulig å detektere tilstedeværelsen eller mengden av antistoff mot protein-tyrosinkinase-antigen i en prøve omfattende å bringe en prøve inneholdende et antistoff mot det kimere antigenet i kontakte med detekterbart merket reseptor-kimer, og detektere nevnte merke. Det vil være klart at irnmunoreaktive fraksjoner og immunoreaktive analoger av kimeren også kan bli anvendt. Med begrepet "immunoreaktiv fraksjon" menes hvilken som helst del av det kimere antigenet som demonstrerer en ekvivalent immunrespons mot et antistoff styrt mot reseptor-kimeren. Med begrepet "immunoreaktiv analog" menes et protein som skiller seg fra reseptor-kimer-proteinet med én eller flere aminosyrer, men som demonstrerer en lik immunrespons med et antistoff ifølge oppfinnelsen.

Med "spesifikt gjenkjenner og binder" menes at antistoffet gjenkjenner og binder det kimerte reseptor-polypeptidet, men hovedsakelig ikke gjenkjenner og binder andre, urelaterte molekyler i en prøve, f.eks en biologisk prøve.

Med "autoimmun-generert celler" menes celler som produserer antistoffer som reagerer med verts-vev eller immune effektor T-celler som er autoreaktive; slike celler inkluderer antistoffer mot acetylcholin reseptorer (fører f.eks til myasthenia gravis), eller anti-DNA, anti-erytrocytt og anti-blodplate auto-antistoffer (fører f.eks til lupus erythematosus).

Med "terapeutisk celle" menes en celle som er transformert med en kimer slik at den kan gjenkjenne og ødelegge et spesifikt infektivt agens, en celle infisert med et spesifikt agens, en tumor eller kreft-celle, eller en autoimmun-generert celle; og slike terapeutiske celler er fortrinnsvis celler i det hematopoietiske systemet.

Med "mål-infektivt agens" menes hvilket som helst infektivt agens (f.eks et virus, en bakterie, protozo eller sopp) som kan bli gjenkjent av en kimera-reseptor-bærende terapeutisk celle. Med en "mål-celle" menes hvilken som helst verts-celle som kan bli gjenkjent av en kimert reseptor-bærende celle; idet målcellene omfatter, men er ikke begrenset til, vertsceller som er infisert med et vims, en bakterie, protozo eller sopp, så vel som tumor eller kreft-celler og autoimmun-genererte celler.

Med "ekstracellulær" menes at minst en del av molekylet er eksponert på celleoverflaten. Med "intracellulær" menes at minst en del av molekylet er eksponert for den terapeutiske cellens cytoplasma. Med "transmembran" menes at minst en del av molekylet er utstrakt gjennom plasmamembranen. En "ekstracellulær del", en "intracellulær del" og en "transmembran del", som anvendt her, kan inkludere flankerende aminosyre-sekvenser som strekker seg inn i tilgrensende cellulære avdelinger.

Med "oligomerisere" menes å sette sammen med andre proteiner for å danne dimere, trimere, tetramere eller andre høyere ordens oligomere. Slike oligomere kan være homo-oligomere eller hetero-oligomere. En "oligomeriseringsdel" er den regionen av et molekyl som styrer kompleks- (dvs. oligomer-) dannelse.

Med "cytolytisk" menes å kunne ødelegge en celle (f.eks en celle infisert med et patogen, en tumor eller kreftcelle, eller en autoimmun-regenerert celle), eller å kunne ødelegge et infektivt agens (f.eks et virus).

Med "immunodefekt virus" menes et retrovirus som i villtype-form kan infisere T4-celler i en primat vert, og som utviser viral morfogenese og morfologi som er karakteristisk for lentivirus-underfamilien. Begrepet omfatter, uten å begrense, alle varianter av HIV og SIV, inklusive HIV-1, HIV-2, SIVmac, SlVagm, SIVmnd, SIVsmm, SlVman, SIVmand og SIVcpz.

Med "MHC-uavhengig", menes at den cellulære cytolytiske responsen ikke trenger tilstedeværelse av et MHC klasse II-antigen på overflaten av mål-cellen.

Med et "funksjonelt cytolytisk signal-overføirngs-derivat" menes et funksjonelt derivat (som definert ovenfor) som kan styre minst 10%, fortrinnsvis 40%, mer foretrukket 70% og mest foretrukket minst 90% av den biologiske aktiviteten til villtype-molekylet. Som anvendt her kan et "funksjonelt cytolytisk signal-overføirngs-derivat" virke ved direkte å signalisere til den terapeutiske cellen å ødelegge et reseptorbundet agens eller celle (f.eks ved tilfellet med en intracellulær kimert reseptordel) eller kan virke indirekte ved å fremme oligomerisering med cytolytiske signal-overføirngsproteiner i den terapeutiske cellen (f.eks i tilfellet med et transmembrant domene). Slike derivater kan bli testet for effektivitet, f.eks ved å anvende in vitro-testene beskrevet her.

Med et "funksjonelt HIV-envelop-bindings-derivat" menes et funksjonelt derivat (som definert ovenfor) som kan binde hvilket som helst HIV-envelope-protein. Funksjonelle derivater kan bli identifisert ved å anvende f.eks in vitro-testene beskrevet her.

Terapeutisk Administrering

De transformerte cellene kan bli anvendt for terapi mot en rekke sykdommer. Gjeldende metoder for administrering av slike transformerte celler involverer adoptiv-. immunoterapi eller celle-overførings-terapi. Disse metodene tillater tilbakeleveringen av de transformerte immurisystem-cellene til blodstrømmen. Rosenberg, S.A., Scientific American 62 (Mai, 1990); Rosenberg et al., The New England Journal of Medicine 323(9):570, (1990).

Detaljert beskrivelse

Først blir tegningene beskrevet

Beskrivelse av tegningene

Fig. IA er et skjematisk diagram som viser organiseringen av reseptor-kinase-fusjonsproteiner ifølge oppfinnelsen. Fig. IB viser flow-cytometri-resultater for CD16/7/zeta, CD16/7/Lck, CD16/7/Fyn(T), CD16/7/Syk og CD16/7/ZAP-70, uttrykt av vaccinia-rekombinanter i Jurkat-celler. Fig. 1C viser in vitro-kinase-aktivitets-tester av immunopresipitert CD16/7/zeta (negativ kontroll), CD16/7/Lck, CD16/7/Fyn(T), CD16/7/Syk og CD16/7/ZAP-70; de lavere molekylmasse-typene som fremkommer ved Fyn-kimer- immunopresipitat er ennå ikke identifisert. Fig. 2 viser cytosolisk kalsium-respons utløst ved kryss-kobling av kinase-kimeras i TCR-negative Jurkat-celler. Den relative intracellulære kalsium-konsentrasjon i den positive populasjonen (målt ved forholdet Indo-I fiolett til blå fluorescens) er vist. Jurkat-celler infisert med vaccinia-rekombinanter som uttrykker de ulike fusjonsproteinene ble eksponert for anti-CD16 mAb 3G8 fulgt av phycoerythirn-konjugert geit F(ab')2-antistoffer mot muse-IgG ved tid 0. Kimeras basert på TCR zeta-kjede og FcRIIB2 fungerer som hhv. positive og negative kontroller. Fig. 3 viser det for tidlige engasjementet av kalsiumrespons i TCR-positive celler som uttrykker Syk-kinase-kimer. Infeksjon og analyse ble utført som beskrevet ovenfor for fig. 2. En vesentlig andel av celler som uttrykker Syk-kimer viste et høyt forhold av fiolett til blå fluorescens før tilsetning av primært antistoff.

Fig. 4A og 4B viser en anti-hybridoma dreper-test.

Fig. 4A viser prosent 51Cr-kromat frigjort fra hybridoma-mål-celler vist som en funksjon av forholdet effektor-celler (CTL-uttrykkende kinase-kimer) til mål-celler; celler som uttrykker reseptor-kimeras som bærer de intracellulære domenene av TCR zeta-kjede og FcRIIB2 fungerer som hhv. positive og negative kontroller. Fig 4B viser spesifisitet av drepingen (fravær av dreping av "tilskuere"). BW5147-celler (som mangler overflate anti-CD16-antistoff) ble lastet med 5 lCr-kromat og eksponert for CTL-uttrykkende kinase-kimeras under de samme betingelsene som for en parallell prøve av kromat-lastede 3G8-celler (som uttrykker anti-CD16-antistoff). Ingen detekterbar frigjøring av kromat ble observert fra BW5147-cellene. Fig. 5 A, 5B og 5C viser at ko-ekspresjon av ZAP-70 og Fyn eller Lek tillater induksjon av cytolyse, og reduserer latensen for kalsium-respons. CTL ble saminfisert med vaccinia-rekombinanter som uttrykker de indikerte kimerene og analysert for cytolytisk potensiale eller kalsium-mobilisering. Effektiviteten til kimerene er underestimert ved denne analysen siden fraksjonen av celler som uttrykker begge kimerene ikke ble målt uavhengig (fraksjonen med celler som uttrykker minst én kimer ble anvendt for å normalisere aktiviteten). Fig. 5A viser at cytolyse-tester som anvender CTL-uttrykkende par av CD 16/7/kinase-kimeras. Fig. 5B viser kalsium-respons fra TCR-negative celler som uttrykker par av CD 16/7/kinase-kimeras. Fig. 5C viser en cytolyse-test av CTL som sam-uttrykker en CD4/CD7/Fyn-kimer og en CD16/CD7/ZAP-70-kimer. CD16/7/zeta-kimer fungerer som den positive kontrollen, mens CD16/7/FcRIIB2-kimer fungerer som den negative kontrollen. Fig. 6 A og 6B viser at kimeras som bærer kinase-delesjoner eller punktmutasjoner er ineffektiv for kalsium-mobilisering og redirigering av cytolyse. Kinase-negativ fusjonsprotein-varianter ble konstruert ved delesjon (ved tilfellet med Syk) eller punktmutasjon (ved tilfellet med ZAP-70), og testet for kalsium-respons og cytolyse.

Fig 6A viser kalsium-respons i TCR-negative celler.

Fig 6B viser en redirigert cytolyse-test.

Fig. 7A, 7B og 7C viser at kimeras basert på humant Syk er essensielt ekvipotent med kimeras basert på porcint Syk. Fig 7A er sekvensen av humant Syk, og er sammenlignet med porcint Syk; de første 11 og siste 7 enhetene er bestemt av primer-sekvensene. Fig. 7B viser kalsium-mobiliseringsanalyse av TCR-negative celler som uttrykker human Syk-kimer. Fig. 7C viser en redirigert cytolyse-test av CTL-uttrykkende human Syk-kimer. Fig. 8 viser endringer i tyrosin-fosfoiylerings-mønster etter kryss-kobling av kimere kinaser. T-celle-antigen-reseptor-negative Jurkat-celler som uttrykker de indikerte kimeras, eller par av kimeras, ble behandlet med anti-CD16 og geit-anti-mus IgG sekundært antistoff, og så lysert, fraksjonert på en polyakrylamidgel, overført til nitrocellulose og probet med anti-fosfotyrosin-antistoff. Spor merketrepresenterer ekstrakter fra celler som har gjennomgått kryss-kobling, mens de markert'-' ble lysert direkte uten forutgående eksponering for sekundært antistoff. Kontroll-spor ble dannet ved lignende behandling av TCR-negative celler som uttrykker et CD16/7-fusjonsprotein som ikke omfattet et intracellulært domene. For sammenligning er effektene av anti-CD3-behandling av TCR-positive Jurkat-celler (med eller uten villtype-vaccinia-virus infeksjon) vist til høyre. Det fremtredende båndet i nærheten av 100 kD på venstre side av dette bildet korresponderer med de forventede molekylvektene til kinase-kimeras. Fig. 9 viser tyrosin-fosforylering av fosfolipase C-n etter aggregering av kimerene. PLC-ri ble immunopresipitert fra celler som var utsatt for antistoff-krysskobling, og immunopresipitatene ble fraksjonert på geler, overført til nitrocellulose og probet med anti-fosfotyrosin-antistoff. En sterk økning i fosforylert PLC-H ble observert etter aggregering av Syk-kimeras, mens en mer begrenset, men lett detekterbar, økning ble observert etter ko-aggregering av Fyn og ZAP-70 kimeras. Fig 10A og 10B viser in vitro kinase-tester. Celler som uttrykker kimere kinaser ble utsatt for antistoff-mediert kimer-krysskobling, etter hvilken kinasene ble immunopresipitert, og immunopresipitatene vurdert for fosforylering av endogent substrat. Fig 10A viser en sammenligning av aktiviteten til immunopresipitert kinase-kimeras over en inkuberingsperiode på 10 minutter, ved å anvende immunopresipitater isolert fra krysskoblede (+) eller ikke-krysskoblede (-) celler. Fig 10B viser tidsforløp for opptak av fosfat-merke i endogene substrater av Syk-kinase-kimerer, med (+) eller uten (-) krysskobling.

T-celle-aktivering av samlede tyrosin-kinaser

Det følger nå en beskrivelse av spesielle utførelsesformer ifølge oppfinnelsen. I denne beskrivelsen er det demonstrert at ikke-reseptor-kinaser er aktivert ved enkle samlings-hendelser. Kunstige reseptor-kinaser ble dannet, hvis intracellulære domener besto av de fullstendige Src- eller Syk-familie-kinase-sekvensene, og undersøkt for konsekvensene av aggregering ved eksterne krysskoblings-signaler. En klar forskjell kom frem mellom Syk- og Src-familie-kinase-aktivitetene: Krysskobling mellom de siste førte ikke til noen signifikant cellulær aktivering, mens krysskobling av den første førte til tilsynekomsten av frie intracellulære kalsiumioner og, for Syk, cytolytisk potensiale. Mangelen ZAP-70-kimeras har til å indusere distale reseptor-medierte programmer kan overkommes ved ko-samling av ZAP-70-kimerer med enten Fyn- eller Lck-kinase-kimeras. Eksemplene som nå beskrives er kun gitt som illustrasjon.

Konstruksjon av protein-tyrosin-kinase-kimeras og demonstrasjon av effektivitet

Gen-fusjoner som koder for proteiner som ligner celle-overflate-reseptor-kinaser ble konstruert ved henge et DNA-fragment som koder for det ekstracellulære domenet til CD 16-molekylet på et kort "spacer"-segment som koder for de juxtamembrane og transmembrane domenene i CD7, som igjen er festet til den fullstendige kodende sekvensen for human Lek (Koga et al., 1986, Eur. J. Immunol. 16:1643-1646), murin Fyn (T) (Cooke og Perlmutter, 1989, New. Biol. 1:66-74) porcin Syk (Taniguchi et al., 199J, J. Biol. Chem. 266:15790-15796) og human ZAP-70 (Chan et al., 1992, Cell 71:649-662) tyrosin-kinaser (Fig IA). De resulterende tredelte genfusjonene ble innført i rekombinante vaccinia-virus ved homolog rekombinasjon og seleksjon for ko-ekspresjon av E. coli gpt-genproduktet. Infeksjon av celler med rekombinantene resulterte i effektivt celle-overflate-uttrykk av alle fire kinase-kimeras (Fig IB). Immunopresipitering av de resulterende protein-kimeras med anti-CD16 antistoffer røpet tilstedeværelsen av molekyl-typer med den forventede massen, som var aktive ved en in vitro-fosforyleringstest (fig 1C).

Deretter undersøkte vi hvorvidt krysskobling av fusjonsproteinene ville tillate akkumulering av fri intracellulær kalsium på en lignende måte som den funnet med fusjonsproteiner basert på T-celle-antigen-reseptor intracellulære domener. For å gjøre dette infiserte vi ulike celler med vaccinia rekombinanter og målte den relative cytoplasmiske kalsium-konsentrasjonen etter krysskobling av de ekstracellulære domenene med antistoffer. Både spektrofluorimetriske (store populasjoner) og fiow-cytometriske (enkel celle) målinger ble utført, med celler lastet med fargen Indo-I (Grynkiewicz et al.,

1985, J. Biol. Chem. 260:3440-3450; Rabinovitch et al., 1986, J, Immunol. 137:952-961). Flow-cytometri-anlyser ble utført på data anskaffet fra celler hvis celleoverflate-ekspresjon av CD 16, som bestemt ved phycoeiythrin-fluorescerens intensitet, og falt innenfor et relativt smalt forhånds-definert område. Selv om små variasjoner i gjennomsnittlig fluorescens intensitet fremdeles ble observert innenfor dette området (på grunn av forskjeller i den underliggende fordelingen av kimeras som er uttrykt av cellene) tillot denne fremgangsmåten oss å motvirke responsene til celler som bærer omtrent samme antall reseptorer. Figur 2 viser en analyse av data innsamlet fra celler med en mutasjonsvariant av den Jurkat humane T-celle-leukemi-cellelinjen som mangler T-celle-antigen-reseptoren (Weiss og Stobo, 1984, J. Exp. Med. 160:1284-1299). I disse cellene

har hverken Lek- eller Fyn-kimerer kapasitet til å mobilisere kalsium etter krysskobling. I flere eksperimenter resulterte samling av Lck-fusjonsproteinet i en liten nedgang i hvilende kalsium-konsentrasjon, relativt til den negative kontrollen, et fusjonsprotein basert på lav-affinitets IgG-reseptoren FcRIIB2-imtracellulært domene (Kolanus et al., 1992, EMBO J. 11:4861-4868). Aggregering av fusjonsproteiner basert på både ZAP-70 og Syk var meget effektivt for å fremme tilsynekomsten av frie kalsium-ioner i cytoplasma, omtrent så effektivt som aggregering av en lignende kimer som bærer det intracellulære domenet til T-celle-reseptor zeta-kjeden. En svak forsinkelse for inntreden av kalsium-responsen ble observert for både ZAP-70 og Syk kinase-kimerene, relativt til inntredningstiden for kalsium-mobilisering av zeta-kimer. I T-celle-reseptor positive celler (Fig. 3) ble fluks-

evaluering av Syk-kimerer delvis ødelagt av en høy hvile-konsentrasjon av frie kalsium-ioner, noe som antyder et konstitutivt engasjement av det kalsium-regulatoriske apparatet.

Innføring av kimeras i en cytolytisk T-cellelinje tillater oss så å måle fusjons- . proteinets potensiale for å engasjere effektor-funksjoner. I denne testen er anti-CD16 hybridoma-celler som uttrykker celleoverflate-IgG-antistoff mot CD 16 (Fleit et al., 1982, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79:3275-3279; Shen et al., 1989, Mol. Immunol. 26:959-969) anvendt som mål-celler. Hybridoma-cellene er merket ved inkorporering av 51 Cr-kromat og ko-sedimentert med effektor-celler, preparert ved infeksjon av en human allospesifikk cytotoksisk T-lymfocytt- (CTL) linje med vaccinia rekombinanter som uttrykker CD16/CD7/kinase-fusjonsproteiner. Ekspresjon av de kimerte reseptor-kinasene tillater de infiserte CTL-cellene å binde til målcellene og, hvis kompetente, å lysere dem, en prosess som ble målt ved frigjøring av det inkorporerte 51 Cr-kromat. Det relative potensialet til det utrustede CTL ble bestemt ved sammenligning av forholdet av effektor til mål-celler som trengs for å oppnå en gitt andel av 51Cr-frigjøring. Figur 4A viser at CTL-uttrykkende kimerte reseptorer omfattende Src-familie-kinasene Lek eller Fyn (T), eller Syk-familie-kinasen ZAP-70, ikke kan mediere cytolyse mot anti-CD16 hybridoma-mål. CTL som uttrykker en kinase-kimer basert på Syk-protein-produktet var imidlertid like effektivt som CTL som uttrykker en kimer sammensatt av CD 16 fusert på samme måten til det intracellulære domenet av T-celle-reseptor zeta-kjeden. Den cytolytiske aktiviteten dirigert av CD16/CD7/kinase-kimeras kan ikke tilskrives en uspesifikk frigjøring av cytotoksiske granuler, fordi kosedimentering av et irrelevant krom-lastet mål med kinase-utrustet CTL ikke resulterte i detekterbar frigjøring av merket krom (Fig 4B).

Forskjellene mellom Syk- og ZAP-70-akitviteter i cytolyse-testen var uventet på bakgrunn av de lignende aktivitetene for de to kimerene i kalsium-respons-testen. I lys av demonstrasjonen av at koekspresjon av ikke-kimert ZAP-70- og Src-familie-kinaser fører til aktivering i COS-celler (Chan et al., 1992, Cell 71:649-662) foretok vi en evaluering av det relative potensialet av par med kinase-kimerer for å utføre cytolyse. CTL-effektorer ble koinfisert med rekombinante vaccinia-virus som koder for ZAP-70 og Lck-kimeras, ZAP-70 og Fyn (T) kimeras eller Lek og Fyn (T)-kimeras. Fig 5A viser at koekspresjonen av ZAP-70- og Fyn (T)-kimeras eller ZAP-70- og Lck-kimeras, utruster CTL med en aktivitet som hovedsakelig er ekvipotent med den for CTL-uttrykkende CD16/CD7/Syk-kinase-kimeras alene, en aktivitet som igjen er like kraftig som den utvist av CD16/CD7/zeta-kimeras. Koekspresjon av Lek- og Fyn (T)-kimeras tillot ikke signifikant cytolytisk potensial å bli redirigert mot anti-CD16-målceller (Fig. 5A). Evaluering av kalsium-mobiliseirngspotensialet til celler koinfisert med par av kinase-fusjonsproteiner viste at koekspresjon av ZAP-70 og Src-familie kinase-kimeras økte hastigheten med hvilken kalsium ble mobilisert som respons på reseptor-krysskobling, og at koekspresjon av Lek og Fyn (T)-kimeras ikke resulterte i en signifikant akkumulering av fri intracellulær kalsium (Fig 5B). For videre å undersøke rollen Fyn-kimeras spiller ved aktiveringsresponsen indusert ved koaggregering, preparerte vi en Fyn-kimer bestående av de ekstracellulære og transmembrane domenene av CD4 fusert med Fyn på tilsvarendeL måte som den for CD16-kimeras. Fig. 5C viser at effektiviteten av denne kimeren i den redirigerte cytolyse-testén er ti til tyve ganger la<y>ere enn den til den sammenlignbare CDlé-kimeren, noe som antyder at fysisk assosiering av kimer-kinasene er viktig for aktivering. Cytolytisk aktivitet for celler som uttrykker de to kimerene er imidlertid betydelig større enn hva som observeres for celler som uttrykker Z AP-70-kimeren alene. På grunn av det relativt høye nivået av kinase-ekspresjon i dette systemet kan det ikke utelukkes at rest-aktivitet reflekterer spontan tilfeldig assosiering av CD4/Fyn-kimeren medCD16/ZAP-70.

For å fastslå at aktiveringen som sees i både kalsiumrespons og cytolyse-tester direkte kan tilskrives den relevante kinase-aktiviteten, og ikke passiv assosiering av kinasene med eksisterende signal-transduksjonselementer hvis indirekte aggregering så initierer aktiveringsresponsen, skapte vi kinase-negative varianter av både porcin Syk og human ZAP-70 reseptor-kimeras. Fig. 6 viser at reseptor-kimeras som mangler enten hovedsakelig hele kinase-doménet (i tilfellet med Syk) eller bærer en punktmutasjon som opphever fosfotransferase-aktivitet (i tilfellet med ZAP-70), mangler in vitro kinase-aktivitet, og kunne ikke mediere kalsium-mobilisering etter krysskobling, eller mediere reseptor redirigert cytolyse.

Fordi interaksjonen av procin Syk med det humane cellulære apparatet ikke nødendigvis er identisk med interaksjonen av human Syk konstruerte vi også lignende protein-kimeras basert på human Syk, etter isolering av human Syk-sekvenser ved PCR med primere som korresponderer med amino- og karboksyterminale ender av porcin-proteinsekvens. Fig. 7A viser at gris og menneske Syk er slående like proteiner, som antydet ved analyse av PCR-produkter som tilsvarer med deler av kinase- og det andre SH2-domenene (Chan et al., 1992, Cell, 71:649-662). I tråd med dette oppførte human Syk kimer-reseptorproteiner seg hovedsakelig identisk med porcin-konstruksjonene ved kalsium-firgjøring og cytolyse-tester (Fig. 7B og 7C).

For å fastslå hvorvidt aggregering av de kimerte tyrosinkinasene resulterer i en betydelig endring i tallrikheten av fosfotyrosin-proteiner, ble T-celle-reseptor-negative celler infisert med vaccinia rekombinanter som koder for kimerte kinaser. De ekstracellulære domenene fra kimerene ble kryss-koblet med antistoffer, og totale cellulære lysater fra de aktiverte cellene ble fraksjonert ved elektroforese, overført til membraner og analysert med et antistoff som gjenkjenner fosfotyrosin. Lysater ble preparert ved å sprenge celler med ikke-ioniske detergenter i nærvær av vanadat, med eller uten EDTA, eller ved lysis i nærvær av natrium-dodecyl-sulfat, etterfulgt av sonikering for å skjære det frigjorte DNAet. Mønsteret av fosfotyrosin-proteiner ble forskjellig i hvert tilfelle, og lysatehe preparert med vanadat, og uten EDTA, viste ytterligere typer som ikke var tilstede i lysater preparert med SDS alene, noe som foreslår at EDTA kan hemme etter-lysis-aktivitet av tyrosin-kinaser, så vel som fosfataser. Anvendelse av direkte lysering i SDS ble funnet å føre til mer reproduserbare mønstre av protein-tyrosin fosforylering enn lysis med ikke-ioniske detergeneter ved tilstedeværelse av EDTA og vanadat. Figur 8 viser at aggregering av kimeras som bærer Syk, ZAP-70 eller Fyn pluss ZAP-70 resulterer i tilsynekomsten av eller øket fosforylering av flere protein-typer som komigrerer med proteiner, som viser øket fosforylering etter antigen-reseptor krysskobling. Spesielt er mønsteret av bånd indusert av Syk-kimer-samling veldig likt mønsteret indusert av anti-CD3 antistoff i T-celle-reseptor-positive celler (Fig 8). Blant diise er et omtrent 150 kD protein som er indusert ved aggregering av Syk-kimer, men også indusert ved koaggregering av Fyn og ZAP-70-kimeras. I foreløpige eksperimenter blir dette fosfoproteinet observert å komigrere med fosfolipase C-r (data ikke vist).

For å fastslå effektene av kinase-kimer-samling på PLC-r direkte krysskoblet vi kimeras, presipiterte PLC-r med en blanding av monoklonale antistoffer og analyserte de resulterende immunopresipitatatene for tilstedeværels av fosfotyrosyl-proteiner. Fig. 9 viser at samling av Syk resulterer i en betydelig økning i tyrosin-fosfat-innholdet i PLC-r, mens ko-krysskobling av Fyn pluss ZAP-70-kimeras resulterer i en mindre dramatisk, men lett detekterbar, økning i tyrosin-fosfat. Celler som uttrykker Fyn-kimeras alene viser en moderat basal fosforylering av PLC-r, som ikke økte etter reseptor-aggregering (Fig. 9). Hvorvidt de samme tyrosin-enhetene er fosforylert av Syk, Fyn eller ZAP-70 pluss Fyn er idag ukjent. Fordi celler som uttrykker Fyn-kimer viste hverken hvilende eller indusert kalsium-mobilisering, kan fosfotyrosin-signalet observert i disse cellene, representere bruken av andre seter på PLC-r enn de som medierer fosfolipase-aktivering.

For et foreløpig forsøk på å forklare endringene i fosfotyrosin-mønsteret undersøkte vi aktiviteten til de ulike kinasene etter samling i en in vitro autofosforyleringstest. Kimeras ble aggregert, immunopresipitert og undersøkt for evnen til å inkorporere fosfat-merke i protein-typene som er tilstede i immunopresipitatet. Fig 10A viser at det under disse betingelsene ikke ble detektert noen økning i kinase-aktivitet etter krysskobling når kinase-testen ble utført i 10 minutter. Til tross for at inkorporering av merket fosfat fortsatte å øke i opp til 30 minutter i denne testen er det uklart hvilke faktorer som begrenser aktivitet; spesielt kan den observerte kinetikken være dominert av dissosierings-raten av immunkompleksene, noe som tillater kinase-diffusjon til ubrukt substrat. I et forsøk på å kontrollere denne effekten, så vel som å maksimalisere sensitiviteten til testen, undersøkte vi Syk-kinase-aktivitet med eller uten forutgående krysskobling over et veldig kort tidsløp, fra 5 til 30 sekunder; det var imidlertid ingen signifikant økning i kinase-aktivitet her heller (fig. 10B). Selv om vi idag ikke kan utelukke muligheten at en økning i aktivitet vil være demonstrerbar med et egnet substrat, ble heller ikke aggregeringsindusert økning i Syk-kimer-aktivitet observert når et eksogent peptid-substrat (en Y 19 K-erstatning av cdc 2-restene 6-20) ble anvendt for å måle kinase-aktivitet.

Mulige mekanismer

Mekanismene hvorved et enkelt fysisk stimulus, reseptor-aggregering, resulterer i overføring av et distinkt kjemisk signal til immunsystem-celler er fremdeles ukjent. Tidligere studier har fastslått at Src-familie-kinasene kan finnes assosiert med mange av de viktige aggregerings-aktiverte reseptorene i immunsystemet, og at krysskobling av slike reseptorer ofte fører til øket kinase-aktivitet. Nylig er de relaterte Syk- og ZAP-70-kinasene funnet å assosiere enten stabilt (i tilfellet med Syk) eller transient (i tilfellet med ZAP-70) med hhv. B- og T-celle-antigen-reseptorene, og i det minste for Syk er reseptor-krysskobling rapportert å resultere i en øket kinase-aktivitet.

I dette arbeidet har vi vist at aggregering av Syk-familie kinaser, men ikke Src-familie kinasene Lek eller Fyn, fører til en kalsium-respons i celler som mangler T-celle-reseptor. Responsen ser ikke ut til å skyldes en indirekte assosiasjon med andre T-celle-reseptor- eller signal-overførings-komponenter fordi kinase-negative mutanter ikke kan indusere kalsium-responsen. Aggregering av kimeras som omfatter Syk-kinasen er tilstrekkelig for å tillate induksjon av spesifikk cytolyse, mens induksjon av lignende cytolyse av ZAP-70-kimer krever ytterligere deltagelse av en Src-familie kinase. Det er idag uklart hvilke av Syk-familie-kinasene som er sannsynlige å spille den viktigere rollen i T-celle-aktivering: både ZAP-70 og Syk er uttrykt i T-celler, omfattende cellelinjene anvendt i denne undersøkelsen», og minst én responsiv human T-cellelinje inneholder Syk og ikke ZAP-70, som bedømt ved spesifikk PCR-amplifiseirngsprodukter. Mønsteret av øket protein tyrosin-fosforylering observert etter Syk-kimer-samling er veldig lik mønsteret observert etter krysskobling av T-celle-antigen-reseptor.

En enkel modell for aktivering av immunsystem-celler av ikke-reseptor tyrosin-kinaser involverer en reseptor-assosiert kinase, hvis aggregering fører til aktivering enten ved fysisk assosiering (f.eks ved å danne aktive kinase-dimere) eller ved gjensidig enzymatisk virkning (f.eks kryssfosforylering); det aktiverte enzymet virker så på nøkkel-intracellulære substrater som er nødvendige for kalsium-mobilisering og inositolfosfat-syntese. Støtte for dette hendelsesforløpet kan finnes i studier som rapporterer økning i reseptor-assosiert-kinase-aktivitet etter reseptor-krysskobling (f.eks Bolen et al., 1991, Adv. Cancer Res. 57:103-149; Burkhardt et al., 1991, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:7410-7414; Eiseman og Bolen, 1992, Nature 355:78-80; Hutchcroft et al., 1992, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:9107-9111 l/J. Biol. Chem. 267:8613-8619; Tsygankov et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:18259-18262; Wong et al., 1992, Oncogene 7:2407-2415). De rapporterte endringene i kinase-aktivitet er imidlertid i de fleste tilfeller beskjeden, og i kontrast med de dramatiske endringene i fosfotyrosyl-protein-mønsteret observert in vivo. Fordi det er vanskelig entydig å utelukke aktivering ved svake allosteriske interaksjoner ved å anvende in vitro kinase-tester som et verktøy, kan vi ikke på dette tidspunkt gi et definitivt utsagn angående den relative betydningen kinase-aktivering har for initieringen av signal-overføring. Men data presentert her antyder at aggregeringsindusert fordeling av enzym og substrat kan være en viktig faktor ved dirigering av en eksisterende aktivitet mot det aktuelle fysiologiske målet

Aggregering av kimeras basert på Syk-familie kinaser førte til en kalsium-respons som var lett forsinket, men lignende i amplitude med responsen observert etter aggregering av zeta-reseptor-kimeras i celler som mangler endogen T-celle-reseptor. En større forsinkelse før tilsynekomsten av frie kalsium-ioner ble observert etter ZAP-70-kimer krysskobling, og denne forsinkelsen kan hovedsakelig fjernes ved å ko-krysskoble ZAP-70 og Fyn-kimeras. Forklaringen på denne observerte forsinkelsen er idag uklar. Fordi ko-krysskobling akslererte kalsium-mobilisering er det fristende å tilskrive forsinkelsen til den relative ineffektiviteten til ZAP-70 for aggregerings-mediert autoaktivering. Men andre faktorer kan være like viktige, og bindingen av ZAP og Syk-kinaser på celleoverflaten kan faktisk være en hindring for aktivering sammenlignet med den normale prosessen; f.eks hvis under det normale hendelsesforløpet Syk-familie kinaser blir transient rekruttert til samlede reseptorer, aktivert og så frigjort for å diffundere til substratene, kan den permanente bindingen av kinase-domenet til plasmamembranen være begrensende ved å hindre adgang til substratet og/eller begrense signal-amplifisering på grunn av kimere reseptorers manglende evne til å fungere som et slags katalytisk senter for kinase-aktivering.

Et annet påfallende trekk ved kalsium-responsen var funnet at T-celle-reseptor-positive celler som uttrykker kimeras basert på human eller porcin Syk, viste en høy basal-linje-konsentrasjon av frie kalsiumioner, noe som foreslår at kalsium-frigjøring var spon-tant blitt utløst. Et lignende funn ble ikke observert for reseptor-negative celler. Dette resultatet går mot en generell trend vi har observert, hvor T-celle-reseptor-negative mutanter av human T-celle-tumorlinjer typisk er hyperresponsive for eksogent innførte utløser-molekyler. For å forklare det klare behovet for T-celle-reseptor i den spontane aktiveringsprosesseh foreslår vi to mulige og beslektede forklaringer. Én er at kimert Syk-kinase kan virke konstitutivt på T-celle-reseptor intracellulære domener for å skape fosfotyrosin-mål for SH2-domenene til reseptor-kimeren, noe som fører til intracellulær aggregering gjennom en multivalent T-celle-reseptor-bro, som igjen fremmer kinasae-aktivering. En annen mulighet er at den T-celle-reseptor-negative cellelinjen kan ha lavere nivåer av en membran-assosiert kinase som er nødvendig for aktivering av Syk, enten fordi en global regulatorisk runde resulterte i nedsatt de novo-syntese av den hypotetiske kinasen, eller fordi fraværet av antigen-reseptor resulterte i en desregulert intracellulær trafikering.

I B-celler er Syk-kinasen rapportert å være konstitutivt assosiert med de intracellulære elementene til IgM-antigen-reseptoren (Hutchcroft et al., 1992, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:9107-91111; Hutchcroft, et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:8613-8619). Den eksakte mekanismen for denne assosieringen er uklar, men én mulighet er at fosfotyrosin ikke er nødvendig for interaksjon av Syk SH2-domener med det tyrosin-utløsende-motivet som er til stede i det cytoplasmiske domenet til mb-1 og B-29 reseptor-kjedene. En delvis presedens for dette forslaget er rapporten om at Philadelphia kromosom-bruddpunkt-kluster-region-genproduktet BCR binder til en rekke SH2-domener på en fosfotyrosin-uavhengig måte (Pendergast et al., 1991, Cell 66:161-171; Muller et al., 1992, Mol. Cell. Biol. 12:5087-5093). I dette tilfellet ser det allikevel sannsynlig ut at fosfoserin- og/eller fosfothreonin-enheter spiller en kritisk rolle i interaksjonen. Alternativt kan Syk assosiere med IgM-reseptor intracellulære motiver gjennom den unike regionen lokalisert mellom Syk SH2-elementer og det katalytiske domenet. En tredje mulighet er at bare en veldig liten mengde tyrosin-fosforylert peptid er nødvendig for å rekruttere funksjonelt viktige nivåer av Syk til den indre delen av plasmamembranen, og at dette lave nivået av tyrosin-fosfat har så langt unnsluppet deteksjon.

Selv om behovet for en Src-familie kinase i aktiveringen ikke er definitivt fastslått for B-celler, er det i T-celler vist ved somatisk eller organisme-genetikk at to kinaser, Lek og Fyn (T), spiller en viktig rolle (Appleby et al., 1992, Cell 70:751 -763; Karnitz et al., 1992, Mol. Cell. Biol. 12:4521-4530; Stein et al., 1992, Cell 70:741-750; Straus og Weiss, 1992, Cell 70:585-593). Idag kan vi ikke endelig fastslå hvorvidt aktiviteten av disse kinasene normalt går foran eller etter aktiviteten av Syk-familie kinasene. En hypotese som forklarer aktiviteten av ZAP-70 i T-celle-aktivering involverer en reseptor-assosiert Src-familie kinase hvis aggregering tillater en kortvarig fosforylering av reseptor-kjeder, som igjen fører til assosiering av ZAP-70 og deretter cellulær aktivering. Den første fosforyleringen av reseptor-kjedene foreslått i denne modellen må skilles fra den stabile fosforyleringen av zeta observert i lengre tid etter reseptor-krysskobling.

I murine T-celler omfatter en liten del av T-celle-reseptor-komplekser et zeta-relatert molekyl kalt eta (Baniyashet al., 1988, J. Biol. Chem. 263:9874-9878) som representerer en alternativt spleiset form (Clayton et al., 1991, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:5202-5206). Eta skiller seg fra zeta i den karboksy-terminale enden, og mangler den mest distale av de seks tyrosinene funnet i murin zeta (Jin et al., 1990, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:3319-3323). Selv om fosforyleringen av zeta-kjeden fra murin TCR zeta-zeta isoformer enkelt kan detekteres etter antistoff-mediert reseptor-krysskobling, under lignende omstendigheter er ikke TCR eta-kjeden detekterbart fosforylert (Bauer et al., 1991, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:3842-3846). Stabil fosforylering av zeta-kjeden ser ut til å trenge to tett apposisjonerte zeta-kjeder siden TCR-isofbmer som bærer zeta-eta heterodimerer ikke blir fosforylert etter reseptor-krysskobling (Bauer et al., 1991, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:3842-3846). Til tross for forskjellene i fosforylering er cellelinjer som inneholder TCR-isoformer som utelukkene består av eat-homodimere funksjonelt ikke-skillbare fra cellelinjer som utelukende bærer zeta-homodimere (Bauer et al., 1991, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:3842-3846). Fosforylering av zeta, som observert 30 minutter etter antistoff-mediert reseptor-aggregering, korrelerer derfor ikke med aktivering. I en separat studie har undersøkelser av tidsforløpet for akkumulering av fosfotyrosin fosfoproteiner etter TCR-aggregering vist at den tidligste observerbare typene er to proteiner med massene 135 og 100 kD, hvis fosforylering først er detekterbar hhv. fem og femten sekunder etter krysskobling, og hvis halve maksimale fosforylering, i begge tilfeller etter omtrent 30 sekunder, går foran tidene for halv maksimal kalsium-mobilisering og inositol fosfat-dannelse (June et al., 1990, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:7722-7726; June et al., 1990, J. Immunol. 144:1591-1599). I motsetning er raten av fosforylering av zeta betydelig langsommere, noe som fører til halve maksimal erstaning ca. tre til fem minutter etter stimulering, godt etter at kalsium-akkumulering og frigjøring av inositol-fosfater er observert (June et al., 1990, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:7722-7726; June et al., 1990, J. Immunol. 144:1591-1599). . Hvis to-trinnsmodellen er riktig må således tyrosin-fosforylering nødvendig for å rekruttere ZAP-70 til den indre delen av plasmamembranen være en raskere, trolig transient, begivenhet enn den observert i studiene ovenfor. Det er nylig foreslått at tyrosin-fosforylering med en hensiktsmessig rask (ca. 15 sekunder) start kan bli detektert på både zeta og CD3-epsilon kjeder etter reseptorkrysskobling (Wange et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:11685-11688),og at et 70 kD protein som bærer tyrosin-fosfat kan bli funnet assosiert med både zeta og epsilon-kjeder. Det ikke idag klart hvorvidt en stabil assosiasjon med fosforylerte reseptor-kjeder er en forutsetning for vellykket T-celle-aktivering.

Som en generell påstand antyder resultatene rapportert her at Syk-familie-kinaser virker mer direkte på effektor-apparatet på T-celler enn Src-familie kinaser. En økende mengde bevis foreslår at Src-familie kinaser kan assosiere med et antall celleoverflate-molekyler som ikke er medlemmer av antigen/Fc-reseptor-familien, omfattende CD2 (Bell et al., 1992, Mol. Cell. Biol. 12:5548-5554), CD23 (Sugie et al., 1991, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:9132-9135), CD36 (Huang et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:5467-5473), IL-2 reseptor-beta-kjede (Hatakeyama et al., 1991, Science 252:1523-1528) og ulike fosfatidylinositol-festede proteiner (Stefanova et al., 1991, Science 254:1016-1019; Thomas og Samelson, 1992, J. Biol. Chem. 267:12317-12322), hvorav noen er kjent for å trenge ytterligere tilstedeværelse av antigen-reseptor for å fremme aktivering i T-celler. En enkel forklaring for dette siste behovet kan være at utløser-motivene på antigen-reseptoren virker som substrater for Src-familie kinaser, noe som tillater påfølgende beskjæring av Syk-familie kinaser, muligens etterfulgt av noen modifiserende hendelser som fremmer deres aktivering. Gitt problemene ved å etablere en årsakskjede for fosforylering og aktivering, kan det også være at utløser-motiver bare har en transient rolle, å virke som et slags katalytisk senter for rekrutteringen, aktiveringen og frigjøringen av effektor-kinaser.

Src-familie kinaser er bredt distribuert gjennom ikke-hématopoietiske linjer, og. nyere studier som anvender Fyn-negative mus har vist en rolle for Fyn i opprettholdelsen av langtids-potensiering, idet fenomenet forenklet synaptisk overføring er antatt å ligge under den initielle stadfestingen av assosierende minne (Grant et al., 1992, Science 258:1903-1910). Hvis lignende aktiveringsveier blir mediert av Src-familie kinaser i andre celletyper kan også Syk-familie kinaser vise seg å være mer utbredt gjennom ekstra-hematpoietiske avdelinger.

Eksperimentelle metoder

Konstruksjon av kimeras. Hele de kodende regionene fra human Lek (Koga et al., 1986, Eur. J. Immunol. 16:1643-1646), murin Fyn (T) (Cooke og Perlmutter, 1989, New Biol. 1:66-74), porcin Syk (Taniguchi et al., 1991, J. Biol. Chem., 266:15790-15796) og human ZAP-70 (Chan et al., 1992, Cell 71:649-662) kinaser ble festet til det intracellulære domenet av et kimertt transmembran-protein bestående av det CD 16 ekstracellulære domenet bundet med et kort "stilk"-segment og det transmembrane domenet til CD7. Det CD7 intracellulære domenet ble avkortet ved stopp-overføirngs-sekvensen ved å sette inn et Mlu-sete. De ulike kinasene ble tilpasset et Mlu-sete i en passende leseramme for å tillate et tredelt fusjonsprotein å bli uttrykt. Grise Syk-sekvensen ble oppnådd ved revers transkripsjon og PCR på total grise-lymfocytt RNA ved å anvende primere med egnede restriksjonsseter. ZAP-70-sekvenser ble likeledes oppnådd ved P.CR fra et menneske T-celle cDNA-bibliotek. Flere isolater ble sekvensert parallelt, og en mutasjonsfri kodende sekvens ble avledet for hver kinase ved restriksjonsfragment-utbytting. De resulterende kodende sekvensene ble satt inn i en vaccinia virus ekspresjonsvektor nedstrøms for CD16/CD7-sekvensene. Human Syk ble isolert fra et naturlig drepercelle cDNA-bibliotek, og fra et Daudi-celle bibliotek ved å anvende primere som korresponderer med endene fra porcin-sekvensen.

Fremover-primeren hadde sekvensen:

atg gca gac agt gcc aac cac ttg ccc ttc ttc t og

den reverse primeren hadde sekvensen:

ege ggg gcg gcc get tta att cac cac gtc gta gta gta.

Etter at initiell amplifisering røpet tilstedeværelsen av bånd med den forventede størrelsen ble en reamplifisering (10 sykler) utført ved å anvende en ekstensjonsprimer som i 5'-enden har sekvensen:

ege ggg acg egt acc atg gca gac agt gcc aac,

noe som tillater fragmentet å bli ligert i en Mlul-kuttet vektor.

Kalsium-mobiliseringsanalyser

Flow-cytometri og masse-spektrofotometriske analyser ble utført på celler som uttrykker rekombinante kinaser ved å anvende kalsium-sensitive fluorofor Indo-1 som - tidligere beskrevet (Romeo og Seed, 1991, Cell 64:1037-1046; Romeo et al., 1992, Cell 68:889-897). Celler fra Jurkat mutant underlinjen JRT 3.T 3,5 (Weiss og Stobo, 1984, J. Exp. Med. 160:1284-1299) ble infisert med rekombinante vaccinia-virus i en time i serumfri IMDM ved en moi på 10, og inkubert i tre til ni timer i IMDM, 10% FBS. Celler ble oppsamlet ved sentrifugering og resuspendert ved 3 x 106/ml i komplett medium omfattende 1 mM Indo-1 acetometoksyester (Grynkiewicz et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:3440-3450) (Molecular Probes, Eugene, OR) og inkubert ved 37°C i 45 minutter. Indo-1-lastede celler ble pelletert og resuspendert til 1 x 106/ml i serumfri IMDM og lagret ved romtemperatur i mørket. Celler ble analysert for frie kalsiumioner ved samtidige målinger av fiolett og blå fluorescerende utstråling ved flow-cytometri (Rabinovitch et al.,. 1986, J. Immunol. 137:952-961). For å initiere kalsium-fluks, ble enten ukonjugert 3G8 (anti-CD16) monoklonalt antistoff (ved 1 ug/ml) satt til cellesuspensjonen, fulgt av 10 Hg/ml phycoerythrin (PE)-konjugert Fab 02 geite anti-mus IgG ved tid 0, eller PE-konjugert anti-CD4 antistoff (Leu-3a, Becton Dickinson) ble tilsatt, fulgt av ukonjugert sekundært antistoff. Histogrammer over fiolett/blå-utstråkngsforhold ble innsamlet fra den PE-positive (infiserte) cellepopulasjonen, som typisk utgjør 40-80% av cellene. Det fiolett/blå-utstrålings-forholdet før tilsetning av antistoffet ble anvendt for å etablere det normaliserte initielle forholdet, satt lik enhet.

Lymfocytt-cytolyse-test

En CD8+ CD4- HLA B44-begrenset cytolytisk linje (WH3) ble holdt i IMDM, 10% humant serum med 100 U/ml IL-2, og ble periodisk stimulert med bestrålte (3000 rad) mononukleære celler som har HLA B44 haplotypen. Celler ble dyrket i minst ti dager etter stimulering, før de anvendes i cytotoksiske tester. Cellene ble infisert med rekombinant vaccinia med en multiplisitet av infeksjon på minst 10, i en time i serum-fritt-medium, etterfulgt av inkubering i komplett medium i tre timer. Celler ble høstet ved sentrifugering og resuspendert til en tetthet på 1 x 107/ml. 100 ul ble tilsatt hver brønn i en U-bunn mikrotiterplate inneholdende 100 ul/brønn med komplett medium. Celler ble fortynnet i en to-gangers-fortynning. To brønner for hver prøve inneholdt ikke lymfocytter, for å tillate spontan krom-frigjøring, og totalt krom-opptak å bli målt. En alikvot på 106 3G8 10-2 mål-celler (Shen et al., 1989, Mol. Immunol. 26:959-969) ble sentrifugert og resuspendert i 50 ul sterilt 51Cr-natirum-kromat (1 m Ci/ml, DuPont) i en time ved 37°C med periodisk blanding, deretter vasket tre ganger med PBS. 100 (il merkede celler resuspendert i medium ved 105/ml ble tilsatt hver brønn. Mikrotiterplatene ble spunnet ved 750 x g i 1 minutt, og inkubert i 4 timer ved 37°C. Ved slutten av inkuberings-perioden ble cellene i hver brønn resuspendert ved forsiktig pipettering, en prøve ble fjernet for å bestemme det totale tallet inkorporert, og mikrotiterplaten ble så spunnet ved 750 x g i 1 minutt. 100 ul alikvoter av supernatanten ble fjernet og talt i en gamma-stråle scintillasjonsteller. Effektor til mål-forholdet ble korrigert for prosenten av effektorceller som var infisert (normalt >70%).

Dannelse av mutante kinase-kimeras

En porcin Syk-kinase-negaitivt fusjonsprotein-variant ble skapt ved å spalte kimeren med Stu I og Not I (den siste ligger rett 3' for karboksyl-enden), fylle i Not I-setet og ligerer endene sammen. Den resulterende sekvensen koblet sammen de første 298-enhetene fra gris Syk med fire fremmende enheter (GPRL) før terminering. En punktmutasjon (K369G) i ATP-bindingssetet til ZAP-70 ble dannet ved å sette inn et dupleks oligonukleotid-fragment mellom Bal I og Ear I-setene lokalisert mellom nukleotid-enhetene 1319 og 1345 i den øvre tråden av sekvensen rapportert av Chan et al., (1992, Cell 71:649-662). Den resulterende sekvensen koder for glycin ved enhet 369 istedenfor lysin.

Immunopresipitering- og kinase-test

Omtrent 2 x 106 Hela S3-celler ble infisert i en time i serum-fritt DME-medium med rekombinant vaccinia ved en multiplisitet av infeksjonen på minst 10. 5 timer etter infeksjonen ble cellene høstet, vasket to ganger med fosfat-bufret saltoppløsning, og lysert i 1% Triton X-100,0,15 M NaCl, 0,02 M HEPES pH 7,3, 5 mM EDTA, 5 mM NaF, 0,2 m MNaV03,10 ug/ml leu-peptin, 10 ug/ml a protinin og 1 mM PMSF. Etter 10 minutters inkubering på is ble kjernene fjernet ved sentrifugering, og CD16 fusjonsproteinene immunpresipitert med antistoff BMA209/2 og protein-A sepharose. Fusjonsprotein-lastet resin ble vasket tre ganger med lyserings-buffer etterfulgt av en siste vask med 20 mM Hepes pH 7,3. Til hver prøve ble det tilsatt 10 (il kinasebuffer (20 mM Hepes pH 7,3,10 mM MgC12,10 mM MnC12) inneholdende 10 uCi [r-32P]ATP (>3000 Ci/mmol). Reaksjonene ble inkubert ved romtemperatur i 10 minutter, og terminert ved tilsetning av 20 ul 2X prøve-appliseringsbuffer (4% SDS, 100 mM Tris pH 6,8, 20% glycerol og 10% 13-merkaptoetanol). Etter at prøvene ble kokt i 3 minutter var alikvoter kjørt på en 4-15% gradient-gel. Kinase-tester med et løselig peptid-substrat korresponderende med posisjonene 6-20 fra cdc 2, hvor tyr 20 var erstattet med lys, ble utført i samsvar med leve-randørens anbefaliger (UBI).

Immunoblott-analyser av protein-tyrosin-fosforylering

TCR-negative 3,5 celler ble infisert med rekombinant virus-lageroppløsning (moi på minst 10) i en time. Celler ble deretter inkubert ved 37°C i 8-12 timer, sentrifugert, vasket og resuspendert i Iscove ^-medium uten serum til 107 celler per ml. Alikvoter av celler ble inkubert med anti-CD 16 mAb (3G8, Medarex eller BMA209/2, Behringwerke) ved 1 (ig antistoff per 2-3 x 106 celler. Stimulerte prøver ble videre inkubert med et 3-5 gangers overskudd av et affinitets-renset anti-mus IgG 1 antistoff (Southern Biotechnology) i 5 min. Cellene ble deretter behandlet i henhold til Secrist, J.P., Burns, L.A., Karnitz, L., Koretzky, G.A. og Abraham, R.T. (J. Biol. Chem. 268:5886-5893, 1993), med små modifikasjoner. Inkuberinger ble terminert ved å tilsette SDS til en endelig konsentrasjon på 1%, og prøvene ble kokt i tre min. DNA ble skåret ved sonikering i 1 min., ved å anvende en Heat Systems Ultrasonics, Inc., 2X prøvebuffer ble så tilsatt, og alikvoter tilsvarende 105 til 2,5 x 105 celler ble separert på polyakrylamidgeler og protei-nene overført ved semitørr elektroblotting (Hoefer) til nitrocellulose (Schleicher og Schuell BA45). Filterene ble blokkert i en time i Tris-bufret saltoppløsning med 0,05% Tween-20 (TBST) inneholdende 1,5% kylling-ovalbumin (Sigma), vasket i TBST og overført til en løsning inneholdende anti-fosfotyrosin antistoff 4G10 (UBI) ved en 1:10000 fortynnng og inkubert ved 22°C i 1-2 timer. Etter TBST-vask ble filterene inkubert i TBST, og en 1:5000 fortynning av anti-mus pepperrot-peroksidase-konjugat i 1 time. Fosforylerte proteinbånd ble detektert ved kjemiluminescens (ECL, Amersham). Eksponeringstider varierte mellom 2 sekunder og 5 minutter.

Konstruksjon av human IgGl: Protein-tyrosinkinase-kimeras

Kimere molekyler som omfatter det ekstracellulære domenet fra et antistoffmolekyl som er spesifikt for en målcelle, og det intracellulære domenet fra en protein-tyrosinkinase kan bli produsert (f.eks de kinaser beskrevet her). For å produsere et slikt molekyl blir human IgGl tungkjede-sekvenser preparert ved å feste sekvensene i CH3-domenet til et cDNA-fragment avledet fra 3'-enden av den transmembrane formen av antistoff mRNA. 3'-ende-rfagmentet blir oppnådd ved polymerasekjedereaksjon ved å anvende tonsill cDNA-bibliotek som substrat, og oligonukleotider som har sekvensene:

korresponderende med hhv. 5'- og 3'-endene til de ønskede DNA-fragmentene. 5'-oligoen er komplementær med et sete i CH1-domenet fra human IgGl, og 3'-oligoen er komplementær med et sete rett 5' for sekvensene som koder for det membran-spennede-domenet. PCR-produktet blir kuttet med BstX I og BamH I, og ligert mellom BstX I- og BamH I-setene i et semisyntetisk IgGl-antistoff-gen som bærer variable og konstante regioner. Etter innsettingen av BstX I til BamH I-fragmentet blir amplifiserte delene av konstruksjonen erstattet opp til Sma I-setet i CH3 ved restriksjonsfragment-utbytting, slik at bare den delen mellom Sma I-setet og 3'-oligoen er avledet fra PCR-reaksjonen.

For å skape en human IgGl kimert reseptor blir tungkjede-genet som ender i et BamHI-sete festet til det interessante kinase-intracellulære-domenet ved standard teknikker. Nivåer av kimert reseptor-ekspresjon kan bli bestemt ved flow-cytometri.. Økning i ekspresjon kan bli oppnådd ved koekspresjon av et plasmid som koder for et antistoff lettkjede-cDNA.

For å oppnå en enkel transkripsj onsenhet som vil tillate både tung- og lettkjeder å bli uttrykt fra en enkelt promoter blir det skapt et plasmid som koder for et bicistronisk mRNA fra tung- og lettkjede kodende sekvenser og den S'-utranslaterte delen av mRNA som koder for det 78 kD glukose-regulerte proteinet, også kjent som grp78, eller BiP. grp78-sekvenser blir oppnådd ved PCR på humant genomisk DNA ved å anvende primere med sekvensene:

på hhv. 5'- og 3'-endene. Polymerasekjedereaksjonen med disse oligoene blir utført i nærvær av 10% dimetyl-sulfoksid. Fragmentet oppnådd ved PCR blir fordøyd med Not I og Hine II og satt inn mellom Not I- og Hpa I-seter nedstrøms for human IgGl-kodende sekvenser. Sekvenser som koder for et humant IgG kappa lettkjede cDNA blir så satt inn nedstrøms for grp78-leaderen, ved å anvende Hine II-setet og et annet sete i vektoren. Ekspresjonsplasmidet som resulterte fra disse manipuleringene besto av det semisyntetiske tungkjede-genet, fulgt av grp78 leadersekvenser, fulgt av kappa lettkjede cDNA-sekvenser, fulgt av polyadenyleringssignaler avledet fra et SV40 DNA-fragment. Vi har tidligere demonstrert at transfeksjon av COS-celler med dette ekspresjonsplasmidet ga markert forbedret ekspresjon av tungkjede-determinanter, sammenlignet med transfeksjon av plasmid som koder for tungkjede-deteminanter alene.

For å skape et bicistronisk gen omfattende en tungkjede/reseptor-kimer og en lettkjede kan den oppstrøms tungkjede-sekvensen bli erstattet av hvilket som helst kimertt tungkjede/reseptor-gen beskrevet her.

Når den er konstruert kan IgG-tyrosinkinase-kimeren bli klonet i en ekspresjonsvektor, innført i en vertscelle og testet ved hvilke som helst av testene beskrevet her (f.eks ved kalsium-mobilisering- eller cytolyse-tester).

Konstruksjon av CD4-tyrosin-kinase-kimeras

Kimere molekyler kan bli produsert som omfatter det ekstracellulære domenet fra CD4-molekylet, og det intracellulære domenet fra en protein-tyrosin kinase (f.eks de kinaser som er beskrevet her). For å produsere et slikt molekyl blir den tyrosin kinase-kodende sekvensen (f.eks cDNA) isolert (f.eks som beskrevet ovenfor). Denne sekvensen blir så festet til det ekstracellulære domenet av en sammensatt form av CD4 som har et BamHI-sete rett oppstrøms for det membran-spennende domenet (Aruffo et al., Proe. Nati.

Acad. Sei. USA 84:8573-8577 (1987b); Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol. 9:347-353

(1990) ved standard teknikker. For å danne dette fusjonsproteinet kan et BamHI-sete bli konstruert i sekvensen ved en egnet lokasjon (igjen ved standard teknikker). Genfusjonene blir innført i et vaccinia-virus ekspresjonsplasmid (som beskrevet her), og satt inn i genomet til vaccinia WR-stammen ved homolog rekombinasjon og seleksjon for vekst i mycofenolsyre (Falkner et al., J. Viriol., 62:1849-1854 (1988); Boyle et al., Gene 65:123-128 (1988)). Flow-cytometri-analyse blir anvendt for å undersøke ekspresjon av vaccinia-rekombinantene med CD4-ryrosin-kinase-fusjonsproteinene på celleoverflaten. Immunopresipitering av celler infisert med vaccinia-rekombinanter blir anvendt for å bekrefte resultatene (som beskrevet ovenfor).

Effektiviteten av CD4-kimeras kan bli testet ved hvilke som helst av kalsium-mobilisering eller cytolyse-testene beskrevet her. Ved et spesielt eksempel er det skapt et mål:effektor-system basert på CD4-gjenkjenning av HIV-envelope gpl20/gp41-komplekset. HeLa-celler blir infisert med rekombinant vaccinia-virus som uttrykker gpl20/gp41 (Chakrabarti et al., Nature 320:535-537 (1986); Earl et al., J. Viriol. 64:2448-2451 (1990) og merket med 51 Cr. Merkede celler blir inkubert med celler fra en human allospesifikk (CD8+, CD4-) cytotoksisk T-lymfocytt-linje som var infisert med vaccinia rekombinanter som uttrykker CD4-tyrosin-kinase-kimeren og undersøkt for spesifikk lysis.

For å kontrollere muligheten for at vacciniå-infeksjon kan fremme kunstig gjenkjenning ved CTL ble lignende cytolyse-ekperimenter utført med målceller infisert med vaccinia-rekombinanter som uttrykker den fosfatidylinositol-koblede formen av CD 16 (CD16PI) og merket med 51 Cr, og med CTL infisert med kontroll-rekombinanter som uttrykker CD16-kimeras.

Ved et annet eksempel er neutrofile granulocytter, som har veldig kort livslengde (ca. 4 timer) i sirkulasjon og er meget cytolytiske, attraktive celler for ekspresjon av CD4-tyrosin-kianse-kimeras. Infeksjon av neutrofiler med HIV vil sannsynligvis ikke resultere i vinis-firgjøring, og tallrikheten av disse cellene (de mest vanlige av leukocyttene) bør fprenkle verts-forsvaret. En annen attraktiv mulighet for vertsceller er modne T-celler, en populasjon som idag er tilgjengelig for retroviral konstruksjon (Rosenberg, S.A., Sei. Am., 262:62-69 (1990). Ved hjelp av rekombinant IL-2 kan T-celle-populasjoner relativt enkelt bli ekspandert i kultur, og de ekspanderte populasjonene har typisk et begrenset livsløp når de blir reinfusert (Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 323:570-578 (1990).

Under de passende betingelsene vil HTV-gjenkjennmg av celler som uttrykker CD4-kimeras også fremskaffe mitogent stimuli, noe som gir muligheten for at den utrustede cellepopulasjonen kan respondere dynamisk på den virale byrden. Selv om vi her har fokusert på adferden til fusjonsproteinene i cytolytiske T-lymfocytter kan ekspresjon av kimeras i hjelpe-lymfocytter tilveiebringe en HIV-mobilisert kilde for cytokiner som kan motvirke nedbrytningen av hjelpecelle-undergruppen i AIDS. Nyere beskrivelse av flere metoder for konstruksjon av resistens mot infeksjon ved andre trinn enn virus-penetrering (Friedman et al., Nature 335:452-454 (1988); Green et al., Cell, 58:215-223, (1989); Malim et al., Cell 58:205-214 (1989); Trono et al., Cell 59:113-120 (1989); Buonocor&et al., Nature 345:625-628 (1990)) foreslår at celler som bærer CD4-kimeras kan bli designet for å komme i veien for virus-produksjon ved ekspresjon av passende agens som har et intracellulært sete for aktivitet.

Muligheten for å overføre signaler til T-lymfocytter gjennom autonome kimeras kan også tilveiebringe evnen til å regulere retrovirale sammensatte lymfocytter in vivo. Krysskoblings-stimulering, mediert f.eks ved spesifikke IgM-antistoffer som er sammensatt for å fjerne komplement-bindende domener, kan tillate slike lymfocytter å øke i antall in situ, mens behandling med lignende spesifikke IgG-antistoffer (f.eks som gjenkjenner en aminosyre-variant som er konstruert i den kimere-kjeden) selektivt kan redusere den konstruerte populasjonen. Vi har tidligere bestemt at anti-CD4 IgM-antistoffer ikke trenger ytterligere krysskobling for å mobilisere kalsium i Jurkat-celler som uttrykker CD4:^-kimeras. Evnen til å regulere cellepopulasjoner uten å ty til repetert ekstra-korporal amplifisering kan virkelig utvide rekkevidden og effektiviteten til foreliggende anvendelser foreslått for genetisk sammensatte T-celler.

Andre utførelsesformer

For å skape andre kimeras bestående av protein-kinase intracellulære sekvenser kan cDNA- eller genomiske-sekvenser som koder for et ekstracellulært domene av reseptoren bli utstyrt med et restriksjonssete innført ved en lokasjon rett foran det valgte ekstracellulære domenet. Det ekstracellulære domene-fragmentet som terminerer i restriksjons-setet kan så bli festet til protein-kinase-sekvensene. Typiske ekstracellulære domener kan bli avledet fra reseptorer som gjenkjenner komplement, karbohydrater, virale proteiner, bakterier, protozo- eller metazo-parasitter eller proteiner indusert av disse. Likeledes kan ligander eller reseptorer uttrykt av patogener eller tumor-celler bli festet til protein-kinase-sekvenser for å dirigere immunresponser mot celler som bæreer reseptorer som gjenkjenner disse ligandene.

For å identifisere de minimale protein-kinase-sekvensene som er nødvendig for cytolyse kan en serie med delesjonsmutanter bli preparert ved standard teknikker, hvor suksessivt mer av det kinase-intracellulære domenet blir fjernet. Slike delesjonsmutanter blir testet for effektivitet med hvilke som helst av testene beskrevet her. Nyttige intracellulære domener for Syk-protein-kinasen omfatter f.eks aminosyrene 336-628 fra porcin Syk-sekvenser og aminosyrene 338-630 fra human Syk-sekvensen.

Claims

1. Celle som uttrykker et membran-bundet kimert reseptorprotein, karakterisert ved at den omfatter (a) en intracellulær del av en protein-tyrosin-kinase som kan signalisere til nevnte celle at den skal ødelegge en reseptor-bundet mål-celle, eller et reseptor-bundet mål-infektivt agens og (b) en ekstracellulær del som spesifikt kan gjenkjenne og binde nevnte målcelle eller nevnte mål-infektive agens, hvorved hver av de nevnte cellene spesifikt kan gjenkjenne og ødelegge nevnte målcelle eller mål-infektive agens.

2. Celle ifølge krav 1,karakterisert ved at nevnte protein-tyrosin-kinase er et medlem av Syk-kinase familien.

3. Celle ifølge krav 2, karakterisert ved at nevnte protein-tyrosin-kinase er Syk.

4. Celle ifølge krav 3, karakterisert ved at nevnte intracellulære del omfatter human Syk aminosyrene 338-630, eller porcin Syk aminosyrene 336-628.

5. Celle ifølge krav 1,karakterisert ved at hver av de nevnte cellene uttrykker en andre membranbundet kimert reseptorprotein, hvor nevnte andre kimere reseptor omfatter (a) en intracellulær del av en andre protein-tyrosinkinase som kan signalisere til nevnte celle at den skal ødelegge en reseptor-bundet målcelle eller et reseptor-bundet mål-infektivt agens og (b) en ekstracellulær del som spesifikt kan gjenkjenne og binde nevnte målcelle eller nevnte mål-infektive agens, hvorved hver av de nevnte cellene spesifikt kan gjenkjenne og ødelegge en målcelle eller et mål-infektivt agens.

6. Celle ifølge krav 5, karakterisert ved at en av de nevnte protein-tyrosinkinasene er et medlem av Syk-kinase-familien, og den andre nevnte protein-tyrosinkinasen er et medlem av Src-kinase-familien.

7. Celle ifølge krav 6, karakterisert ved at en av de nevnte protein-tyrosinkinasene er ZAP-70, og den andre nevnte protein-tyrosinkinasen er Fyn.

8. Celle ifølge krav 6, karakterisert ved at en av de nevnte protein-tyrosinkinasene er ZAP-70, og den andre nevnte protein-tyrosinkinasen er Lek.

9. Celle ifølge krav 7 eller 8, karakterisert ved at nevnte ZAP-70-del omfatter human ZAP-70 Tyr 369.

10. Celle ifølge krav 1 eller 5, karakterisert ved at nevnte celler er valgt fra gruppen bestående av (a) T-lymfocytter; (b) cytotoksiske T-lymfocytter; (c) naturlige dreperceller; (d) neutrofiler; (e) granulocytter; (f) makrofager; (g) mast-celler;og (h) HeLa-celler.

11. Celle ifølge krav 1,karakterisert ved at nevnte mål-infektive agens er et immunodefekt virus.

12. Celle ifølge krav 11,karakterisert ved at nevnte ekstracellulære del omfatter en HIV-kapsel-bindende del av CD4.

13. Celle ifølge kravene 1 eller 5, karakterisert ved at nevnte binding er MHC-uavhengig.

14. Celle ifølge krav 1 eller 5, karakterisert ved at nevnte ekstracellulære del omfatter den ligand-bindende delen av en reseptor, den reseptor-bindende delen av en ligand, den antigen-bindende delen av et antistoff eller et funksjonelt derivat derav.

15. DNA, karakterisert ved at det koder for en kimer reseptor ifølge krav 1 eller 5.

16. Vektor, karakterisert ved at den omfatter det kimere reseptor-DNAet ifølge kravene 1 eller 5.