ES2197166T3 - Redireccion de la inmunidad celular por receptores quimericos. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTA UN METODO PARA DIRIGIR UNA RESPUESTA CELULAR EN UN MAMIFERO MEDIANTE LA EXPRESION EN UNA CELULAS DEL MAMIFERO DE UN RECEPTOR QUIMERICO QUE HACE QUE LAS CELULAS RECONOZCAN ESPECIFICAMENTE Y DESTRUYAN UN AGENTE INEFICAZ, UNA CELULA INFECTADA CON UN AGENTE INEFICAZ, UNA CELULA TUMORAL O CANCEROSA, O UNA CELULA GENERADA DE FORMA AUTOINMUNE. EL RECEPTOR QUIMERICO INCLUYE UNA PORCION EXTRACELULAR CAPAZ DE RECONOCER ESPECIFICAMENTE Y ENLAZARSE A LA CELULA SELECCIONADA O AL AGENTE INEFICAZ SELECCIONADO Y (B) UNA PORCION INTRACELULAR DE UNA CINASA DE TIROSINA DE UNA PROTEINA CAPAZ DE SEÑALIZAR LA CELULA TERAPEUTICA PARA DESTRUIR UNA CELULA SELECCIONADA ENLAZADA AL RECEPTOR O UN AGENTE INEFICAZ SELECCIONADO ENLAZADO AL RECEPTOR. TAMBIEN SE PRESENTAN CELULAS QUE EXPRESAN LOS RECEPTORES QUIMERICOS Y UN ADN QUE CODIFICA LOS RECEPTORES QUIMERICOS.

Description

Redirección de la inmunidad celular por receptores quiméricos.

Campo del invento

El invento se refiere a quimeras de proteína-tirosina quinasa funcionales que son capaces de redirigir la función del sistema inmune. Más particularmente, se refiere a la regulación de linfocitos, macrófagos, células asesinas naturales o granulocitos mediante la expresión, en dichas células, de quimeras que causan que las células respondan a dianas reconocidas por las quimeras. El invento también se refiere a quimeras de proteína-tirosina quinasa funcionales que son capaces de dirigir células terapéuticas para que reconozcan y destruyan específicamente células infectadas con un agente infectivo específico, o el propio agente infectivo, o una célula tumoral o una célula generada de forma autoinmune. Más particularmente, el invento se refiere a la producción de quimeras de proteína-tirosina quinasa capaces de dirigir linfocitos T citotóxicos para que reconozcan y lisen específicamente células que expresan proteínas de la envoltura del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV; del inglés, human immunodeficiency virus). Por lo tanto, el invento proporciona una terapia para enfermedades, tales como el sida (síndrome de inmunodeficiencia adquirida), que son causadas por el virus HIV.

Antecedentes del invento

El reconocimiento de antígenos por parte de células T a través del receptor de las células T es la base de una variedad de fenómenos inmunológicos. Las células T dirigen lo que se llama ``inmunidad mediada por células''. Esto implica la destrucción de tejidos extraños o células infectadas, por células del sistema inmune. Existen una diversidad de células T, incluyendo células ``cooperadoras'' y ``supresoras'', que modulan la respuesta inmune, y células citotóxicas (o ``asesinas''), que pueden matar directamente células anormales.

Una célula T que reconoce, y se une a, un antígeno único presentado en la superficie de otra célula se vuelve activa; luego puede multiplicarse y, si es una célula citotóxica, puede matar a la célula unida.

La enfermedad autoinmune se caracteriza por la producción o bien de anticuerpos que reaccionan con tejido del huésped o bien de células T efectoras inmunes que son autorreactivas. En algunos casos, pueden surgir autoanticuerpos mediante una respuesta normal de células T y B activada por sustancias u organismos extraños que contienen antígenos que reaccionan cruzadamente con compuestos similares de tejidos corporales. Son ejemplos de autoanticuerpos clínicamente relevantes los anticuerpos contra receptores de la acetilcolina en la miastenia gravis; y anticuerpos anti- DNA, antieritrocitos y antiplaquetas en el lupus sistémico eritematoso.

HIV e inmunopatogénesis

En 1.984 se mostró que el HIV era el agente etiológico del sida. Desde ese momento, la definición del sida ha sido revisada varias veces con respecto a qué criterios deberían incluirse en el diagnóstico. Sin embargo, a pesar de la fluctuación de los parámetros diagnósticos, el denominador común simple del sida es la infección con HIV y el subsiguiente desarrollo de síntomas constitucionales persistentes y enfermedades definitorias del sida tales como infecciones secundarias, neoplasias y enfermedad neurológica [Harrison's Principles of Internal Medicine, 12ª edición, McGraw Hill (1.991)].

El HIV es un retrovirus humano del grupo lentivirus. Los cuatro retrovirus humanos reconocidos pertenecen a dos grupos distintos: los retrovirus linfotrópicos T (o de leucemia) humanos, HTLV-1 y HTLV-2 (del inglés, human T lymphotropic virus), y los virus de la inmunodeficiencia humana, HIV-1 y HIV-2. Los primeros son virus transformantes, mientras que los segundos son virus citopáticos.

El HIV-1 ha sido identificado como la causa más común del sida por todo el mundo. La homología de secuencias entre el HIV-2 y el HIV-1 es aproximadamente 40%, estando el HIV-2 más estrechamente relacionado con algunos miembros de un grupo de virus de la inmunodeficiencia en simios (SIV; del inglés, simian immunodeficiency virus); véanse J. Curran et al., Science, 329: 1.357-1.359 (1.985), y R. Weiss et al., Nature, 324: 572-575 (1.986).

El HIV tiene los genes retrovíricos habituales (env, gag y pol) así como seis genes extras implicados en la replicación y otras actividades biológicas del virus. Como se afirmó previamente, el denominador común del sida es una profunda inmunosupresión, predominantemente de la inmunidad mediada por células. Esta supresión inmune conduce a una diversidad de enfermedades oportunistas, particularmente de ciertas infecciones y neoplasias.

La causa principal del defecto inmune en el sida ha sido identificada como una deficiencia cuantitativa y cualitativa en la población T4, un subconjunto de linfocitos procedentes del timo (T). Este subconjunto de células está fenotípicamente definido por la presencia de la molécula superficial CD4, de la que se ha demostrado que es el receptor celular para el HIV [Dalgleish et al., Nature, 312: 763 (1.984)]. Aunque la célula T4 es el principal tipo celular infectado por el HIV, esencialmente cualquier célula humana que exprese la molécula CD4 en su superficie es capaz de unirse a, y ser infectada por, el HIV.

Tradicionalmente, a las células T CD4^{+} se les ha asignado el papel de cooperadoras/inductoras, lo que indica su función en cuanto a proporcionar una señal activadora a las células B, o a provocar que linfocitos T que llevan el marcador CD8 recíproco se conviertan en células citotóxicas/supresoras [Reinherz y Schlossman, Cell, 19: 821-827 (1.980); Goldstein et al., Immunol. Rev., 68: 5-42 (1.982)].

El HIV se une específicamente y con elevada afinidad, a través de un tramo de aminoácidos de la envoltura vírica (gp120), a una porción de la región V1 de la molécula CD4, situada cerca de su extremo N. Después de la unión, el virus se fusiona con la membrana de la célula diana y es internalizado. Una vez internalizado, usa la enzima transcriptasa inversa para transcribir su RNA genómico a DNA, el cual se integra en el DNA celular, donde existe durante la vida de la célula como un ``provirus''.

El provirus puede permanecer latente o resultar activado para transcribir mRNA y RNA genómico, lo que conduce a síntesis de proteínas, montaje, formación de nuevos viriones y brotadura de virus de la superficie celular. Aunque no se ha establecido el mecanismo exacto mediante el cual el virus provoca la muerte celular, se tiene la impresión de que el mecanismo principal es la brotadura vírica masiva de la superficie celular, lo que conduce a una rotura de la membrana plasmática y al desequilibrio osmótico resultante.

Durante el curso de la infección, el organismo huésped desarrolla anticuerpos contra proteínas víricas, incluyendo gp120 y gp41, las principales glicoproteínas de la envoltura. A pesar de esta inmunidad humoral, la enfermedad progresa, lo que da lugar a una inmunosupresión letal caracterizada por múltiples infecciones oportunistas, parasitemia, demencia y muerte. El fracaso de los anticuerpos antivíricos del huésped para detener el progreso de la enfermedad representa uno de los aspectos más fastidiosos y alarmantes de la infección, y es de mal agüero en cuanto a los esfuerzos de vacunación basados en planteamientos convencionales.

Dos factores pueden desempeñar un papel en la eficacia de la respuesta humoral a los virus de la inmunodeficiencia. En primer lugar, como otros virus de RNA (y como los retrovirus en particular), los virus de la inmunodeficiencia presentan una elevada tasa de mutación en respuesta a la vigilancia inmune del huésped. En segundo lugar, las propias glicoproteínas de la envoltura son moléculas muy glicosiladas que presentan pocos epítopos adecuados para una unión de alta afinidad con anticuerpos. La diana escasamente antigénica que presenta la envoltura vírica concede al huésped pocas oportunidades de restringir la infección vírica mediante la producción de anticuerpos específicos.

Las células infectadas por el virus HIV expresan la glicoproteína gp120 en su superficie. La gp120 media en procesos de fusión entre células CD4^{+} a través de una reacción similar a la reacción mediante la cual el virus entra en las células no infectadas, lo que conduce a la formación de células gigantes multinucleadas de corta vida. La formación de un sincitio depende de una interacción directa de la glicoproteína gp120 de la envoltura con la proteína CD4 [Dalgleish et al., supra; D. Klatzman et al., Nature, 312:763 (1.984); J. S. McDougal et al., Science, 231: 382 (1.986); J. Sodroski et al., Nature, 322: 470 (1.986); J. D. Lifson et al., Nature, 323: 725 (1.986); J. Sodroski et al., Nature, 321: 412 (1.986)].

La evidencia de que la unión CD4-gp120 es responsable de la infección vírica de las células que llevan el antígeno CD4 incluye el hallazgo de que se forma un complejo específico entre gp120 y CD4 (McDougal et al., supra). Otros investigadores han mostrado que las líneas celulares que no resultaban infectadas por el HIV se convertían en líneas celulares infectables después de la transfección y expresión del gen de cDNA de CD4 humano [Maddon et al., Cell, 46: 333- 348 (1.986)].

Se han propuesto programas terapéuticos basados en CD4 soluble como un agente pasivo para interferir en la adsorción vírica y en la transmisión celular mediada por sincitios, programas cuyo éxito ha sido demostrado in vitro por diversos grupos [Deen et al., Nature, 3.321: 82-84 (1.988); Fisher et al., Nature, 331: 76-78 (1.988); Hussey et al., Nature, 331: 78-81 (1.988); Smith et al., Science, 238: 1.704-07 (1.987); Traunecker et al., Nature, 331: 84-86 (1.988)], y posteriormente se han desarrollado proteínas de fusión de CD4 e inmunoglobulina con semividas prolongadas y una moderada actividad biológica [Capon et al., Nature, 337} 525-531 (1.989); Traunecker et al., Nature, 339: 68-70 (1.989); Byrn et al., Nature, 344: 667-670 (1.990); Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol., 9: 347-353 (1.990)]. Aunque las proteínas de fusión o productos de conjugación de CD4 e inmunotoxina presentan una potente citotoxicidad in vitro para las células infectadas [Chaudhary et al., Nature, 335: 369-372 (1.988); Till et al., Science, 242: 1.166-1.168 (1.988), la latencia del síndrome de inmunodeficiencia hace improbable que cualquier terapia de un solo tratamiento sea eficaz a la hora de eliminar la carga vírica, y es probable que la antigenicidad de las proteínas de fusión extrañas limite su aceptabilidad en los tratamientos que requieren una administración de dosis reiterativa. Experimentos con monos afectados por SIV han mostrado que el CD4 soluble, si se administra a animales sin una citopenia de CD4 acusada, puede reducir el título de SIV y mejorar las medidas in vitro de potencial mieloide [Watanabe et al., Nature, 337: 267-270 (1.989)]. Sin embargo, se observó un rápido resurgimiento vírico una vez que se hubo interrumpido el tratamiento, lo que sugiere que podría ser necesaria una administración durante toda la vida para evitar la debilitación progresiva del sistema inmune.

Proteína-tirosina quinasas asociadas con receptores de la superficie celular

El impulso inicial para la constitución de programas efectores celulares en el sistema inmune es a menudo el reconocimiento celular de ligandos agrupados. Entre los receptores de los que se sabe que transmiten señales de activación tras la agregación están los receptores antigénicos de las células B y las células T (DeFranco, 1.992, Eur. J. Biochem. 210: 381-388; Weiss, 1.991, Annu. Rev. Genet. 25: 487- 510), miembros de las familias de receptores de Fc de IgG e IgE (Fanger et al., 1.989, Immunol. Today 10: 92-99; Ravetch y Kinet, 1.991, Annu. Rev. Immunol. 9: 457- 492) y diversos receptores accesorios, incluyendo CD2, CD4, CD8 y CD28 en células T (Yokoyama y Shevach, 1.989, Year Immunol. 4: 110-146); CD19, CD20, CD21 y CD40 en células B (Clark y Ledbetter, 1.989, Adv. Cancer Res. 52: 81-149), y CD44, CD45 y CD58 en monocitos (Webb et al., 1.990, Science 249: 1.295-1.297). Además, un gran número de proteínas ligadas a fosfolípidos provocan la activación celular, de un modo dependiente del receptor antigénico, cuando se reticulan en la superficie de células T (Balk y Terhorst, 1.989, Immunol. Ser. 45: 411-416; Kroczek et al., 1.986, Nature 322: 181-184; Yeh et al., 1.987, J.Immunol. 138: 91-97; Yokoyama y Shevach, 1.989, Year Immunol. 4: 110-146).

En la actualidad, no está claro cómo un proceso físico sencillo, la agregación, da lugar a una señal fisiológica claramente distinguida. La constitución de programas efectores celulares mediados por los receptores antigénicos de células T y células B, y diversas formas del receptor de Fc, puede ser remedada mediante la reticulación de proteínas quiméricas que poseen los dominios intracelulares de cadenas individuales de los complejos receptores (Irving y Weiss, 1.991, Cell 64: 891- 901; Kolanus et al., 1.992, EMBO J. 11: 4.861-4.868; Letourneur y Klausner, 1.991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8.905-8.909; Letourneur y Klausner, 1.992, Science 255: 79-82; Romeo y Seed, 1.991, Cell 64: 1.037-1.046; Wegener et al., Cell 68: 83-95; Documento WO 92/15322). En el Documento WO 92/15322 se describe un método para dirigir una respuesta celular en un mamífero al hacer que se exprese, en una célula del mamífero, un receptor quimérico que causa que las células reconozcan y destruyan específicamente un agente infectivo, una célula infectada con un agente infectivo, una célula tumoral o cancerosa, o una célula generada de forma autoinmune. También se describen células que expresan los receptores quiméricos y DNA que codifica los receptores quiméricos. Parece que el elemento desencadenante eficaz mínimo requiere una secuencia peptídica filogenéticamente conservada (Reth, 1.989, Nature 338: 383-384) que contiene dos restos de tirosina separados por 10 u 11 restos y encajados en un contexto hidrófilo, típicamente ácido (Romeo et al., 1.992, Cell 68: 889-897; Irving et al., 1.993, J. Exp. Med. 177: 1.093-1.103). La agrupación de receptores que llevan este elemento inicia una cascada de activación para la que parece ser esencial una actividad proteína- tirosina quinasa (PTK; del inglés, protein tyrosine kinase); los inhibidores de PTK bloquean tanto los primeros procesos de la activación de las células B y T, tal como la movilización de calcio, como las secuelas finales de liberación de citoquinas y proliferación celular (June et al., 1.990, J. Immunol. 144: 1.591-1.599; Lane et al., 1.991, J. Immunol. 146: 715-722; Mustelin et al., 1.990, Science 247: 1.584- 1.587; Stanley et al., 1.990, J. Immunol. 145: 2.189-2.198). Aunque las consecuencias más remotas de la activación de receptores difieren de acuerdo con el tipo celular, los primeros procesos son notablemente similares entre células procedentes de linajes hematopoyéticos dispares. Por ejemplo, todos los rápidos aumentos de actividad PTK observados después de la reticulación del receptor antigénico de las células B (Gold et al., 1.990, Nature 345: 810-813; Campbell y Sefton, 1.990, EMBO J. 9: 2.125- 2.131), el receptor antigénico de las células T (C. H. June et al., 1.990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7.722-7.726; C. H. June et al., 1.990, J. Immunol. 144: 1.591-1.599) y el receptor de IgE de alta afinidad (Eiseman y Bolen, 1.992, Nature 355: 78-80; Li et al., 1.992, Mol. Cell. Biol. 12: 3.176-3.182) tienen, entre sus dianas de fosforilación precoces, la isoforma \gamma de la fosfolipasa C específica de fosfatidilinositol (Carter et al., 1.991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2.745-49; Li et al., 1.992, Mol. Cell Biol. 12: 3.176-3.182; Park et al., 1.991, J. Biol. Chem. 266: 24.237- 24.240; Park et al., 1.991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5.453-5-456; Secrist et al., 1.991, J. Biol. Chem. 266: 12.135-12.139; Weiss et al., 1.991, Annu. Rev. Genet. 25: 487- 510), que es directamente activada por fosforilación de tirosina (Nishibe et al., 1.990, Science 250: 1.253-1.256).

Las actividades PTK de las que hasta ahora se sabe que están asociadas con receptores de la superficie celular se dividen en dos clases: las que pertenecen a la familia de las quinasas relacionadas con el protooncogén Src, y las relacionadas con la quinasa Syk recién caracterizada. Entre las primeras, se ha mostrado que la quinasa Fyn se asocia con el receptor de la célula T (Gassmann et al., 1.992, Eur. J. Immunol. 22: 283-286; Samelson et al., 1.990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 4.358- 4.362), se ha comunicado que las quinasas Lyn, Fyn, Blk y Lck se asocian con el receptor IgM de la célula B (Burkhardt et al., 1.991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7.410-7.414; Campbell y Sefton, 1.992, Mol. Cell. Biol. 12: 2.315-2.321; Yamanashi et al., 1.991, Science 251: 192-194), y se ha mostrado que las quinasas Lyn y Yes se asocian con el receptor de IgE de alta afinidad (Eiseman y Bolen, 1.992, Nature 355: 78-80; Hutchcroft et al., 1.992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9.107-9.111; J. E. Hutchcroft et al., 1.992, J. Biol. Chem. 267: 8.613-8.619). El mecanismo de la asociación observada no ha sido establecido con detalle, pero datos preliminares sugieren que los dominios intracelulares de cadenas de los complejos receptores pueden asociarse físicamente con quinasas de la familia Src (Clark et al., 1.992, Science 258: 123-126; Timson Gauen et al., 1.992, Mol. Cell. Biol. 12: 5.438-5.446). En la actualidad, no está claro si estas asociaciones son directas o indirectas.

Hasta la fecha, la evidencia más irresistible en cuanto a la importancia de quinasas de la familia Src en la activación celular ha sido desarrollada a partir del estudio de las quinasas Fyn y Lck en células T. La sobreexpresión de Fyn en ratones transgénicos conduce a un fenotipo hipersensible a antígenos en las células T resultantes, mientras que la sobreexpresión de una forma catalíticamente inactiva bloquea la proliferación mediada por el receptor de la célula T (Cooke et al., 1.991, Cell 65: 281-291). Células T tímicas aisladas de ratones mutantes que carecen de actividad quinasa Fyn presentan un profundo defecto en la capacidad para generar una respuesta proliferativa en respuesta a un tratamiento con una combinación de éster de forbol más anticuerpo anti-CD3 o Concanavalina A (Appleby et al., 1.992, Cell 70: 751-763; Stein et al., 1.992, Cell 70: 741-750). Células T esplénicas aisladas de dichos ratones presentan una atenuación menos grave, aunque sustancial, de la respuesta de activación celular (Appleby et al., 1.992, Cell 70: 751-763; Stein et al., 1.992, Cell 70: 741-750).

En células T, la quinasa Lck se asocia indirectamente con el receptor de la célula T (TCR; del inglés, T cell receptor) a través de los correceptores CD4 y CD8 (Rudd et al., 1.988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5.190-5.194; Shaw et al., 1.989, Cell 59: 627-636; Turner et al., 1.990, Cell 60: 755-765; Veillette et al., 1.988, Cell 55: 301-308). La sobreexpresión de Lck en una línea celular sensible a antígenos potencia la sensibilidad del receptor de un modo similar al visto con Fyn (Abraham y Veillette, 1.990, Mol. Cell. Biol. 10: 5.197-5.206; Davidson et al., 1.992, J. Exp. Med. 175: 1.483-1.492; Luo y Sefton, 1.992, Mol. Cell. Biol. 12: 4.724-4.732). En un modelo de hibridoma de célula T murino dependiente de CD4, la reconstitución de la función cooperadora específica de antígeno sólo podría alcanzarse con moléculas de CD4 que fueran capaces de interaccionar con Lck (Glaichenhaus et al., 1.991, Cell 64: 511-20).

Sin embargo, la evidencia más convincente en cuanto a la participación directa de la quinasa Lck en la generación de señales mediada por el receptor antigénico procede de estudios de líneas celulares mutantes que carecen de Lck. Se han estudiado dos de dichas líneas, una procedente de la línea Jurkat de leucemia de células T humanas (Goldsmith y Weiss, 1.987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6.879-6.883; Straus y Weiss, 1.992, Cell 70: 585-593) y la otra del clon CTLL-2 de células T citotóxicas murinas (Karnitz et al., 1.992, Mol. Cell. Biol. 12: 4.521-4.530). Ambas líneas mutantes negativas en cuanto a Lck son defectuosas en la generación de señales mediada por el TCR, y la complementación de cualquier línea mutante por transfección con un plásmido de expresión de Lck restablece la sensibilidad a los estímulos de reticulación de TCR (Karnitz et al., 1.992, Mol. Cell. Biol. 12: 4.521-4.530; Straus y Weiss, 1.992, Cell 70: 585-593).

Se ha mostrado recientemente que miembros de una nueva familia de tirosina quinasas, inicialmente representada por las quinasas Syk (Taniguchi et al., 1.991, J. Biol. Chem. 266: 15.790-15.796) y PTK 72 (Zioncheck et al., 1.986, J. Biol. Chem. 261: 15.637-15.643; Zioncheck et al., 1.988, J. Biol. Chem. 263: 19.195-19.202) estrechamente relacionadas o idénticas, se asocian con receptores de la superficie celular. Aunque no se ha demostrado definitivamente que PTK 72 y Syk sean idénticas, comparten una distribución tisular (timo y bazo), una masa molecular y una labilidad frente a la proteolisis comunes. Se ha mostrado que PTK 72 se asocia con el receptor IgM de la célula B (Hutchcroft et al., 1.992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9.107- 9.111; J. E. Hutchcroft et al., 1.992, J. Biol. Chem. 267: 8.613-8.619) y que resulta fosforilada tras la reticulación del receptor con anti-IgM (Hutchcroft et al., 1.991, J. Biol. Chem. 266: 14.846-14.849). Se demostró una activación concomitante de la enzima, según se mide tanto por autofosforilación como por fosforilación de un fragmento proteico exógeno, después de la reticulación de la IgM superficial (Hutchcroft et al., 1.992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9.107-9.111; J. E. Hutchcroft et al., 1.992, J. Biol. Chem. 267: 8.613- 8.619). También se halla PTK 72 asociada con el receptor de IgE de alta afinidad en una línea de células leucémicas basófilas de rata (Hutchcroft et al., 1.992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9.107-9.111; J. E. Hutchcroft et al., 1.992, J. Biol. Chem. 267: 8.613- 8.619).

Se ha mostrado que un segundo miembro de la familia Syk, ZAP-70, es una PTK que se asocia con la cadena zeta del receptor de la célula T tras la reticulación del receptor (Chan et al., 1.991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9.166-9.170). Aunque la expresión de ZAP-70, Fyn o Lck en células COS conduce a aumentos moderados de la tirosina-fosfato celular total, la coexpresión de ZAP- 70 y Lck o Fyn conduce a un drástico aumento de la fosforilación neta de tirosina (Chan et al., 1.992, Cell 71: 649-662). Si también está presente una quimera de CD8-cadena zeta, la quimera resulta fosforilada y ZAP-70 se halla asociada con ella (Chan et al., 1.992, Cell 71: 649-662). En la actualidad, no está claro si ZAP-70 activa las quinasas de la familia Src y/o viceversa, ni por qué la coexpresión de quinasas en células COS debería conducir a una aparente activación constitutiva. No obstante, la asociación activa de ZAP-70 con TCR reticulado sugiere un papel de esta PTK en la propagación de la respuesta del receptor.

A diferencia de las quinasas de la familia Src, Syk y ZAP-70 poseen dos dominios SH2 y ningún sitio de miristoilación N-terminal (Taniguchi et al., 1.991, J. Biol. Chem. 266: 15.790-15.796; Chan et al., 1.992, Cell 71: 649-662). Una sugerencia natural para el mecanismo de la asociación quinasa-receptor es que los dos dominios SH2 se unen a las dos tirosinas de los motivos desencadenantes del receptor antigénico una vez que son fosforilados. Sin embargo, esto sigue siendo meramente una hipótesis en la actualidad.

Sumario del invento

El presente invento demuestra la viabilidad de crear quimeras entre el dominio intracelular de una molécula de proteína-tirosina quinasa y un dominio extracelular que es capaz de cumplir la tarea de reconocimiento de dianas. En particular, la agrupación de quimeras que poseen secuencias de la quinasa Syk o ZAP-70 desencadena la movilización de calcio. Basta la agregación de la quimera de Syk sola, o la coagregación de quimeras que poseen las quinasas Fyn o LcK y ZAP-70, para que se inicie la función efectora citolítica. Dicha función efectora facilita el reconocimiento y la destrucción específicos de células diana indeseables, tales como, por ejemplo, agentes patógenos, células infectadas con agentes patógenos, células tumorales y células autoinmunes.

Puede construirse cualquier número de moléculas quiméricas útiles de acuerdo con el invento. Por ejemplo, la formación de quimeras que consistan en la porción intracelular de una proteína-tirosina quinasa, unida a la porción extracelular de una molécula de anticuerpo adecuadamente construida, permite que el potencial de reconocimiento de dianas de una célula del sistema inmune sea específicamente redirigido al antígeno reconocido por la porción extracelular del anticuerpo. De este modo, con una porción de anticuerpo capaz de reconocer algún determinante de la superficie de un agente patógeno, las células del sistema inmune armadas con la quimera responderían a la presencia del agente patógeno con el programa efector apropiado para su linaje; por ejemplo, linfocitos T cooperadores responderían mediante actividad citotóxica contra la diana, y linfocitos B resultarían activados para sintetizar anticuerpo. Macrófagos y granulocitos llevarían sus programas efectores a cabo, incluyendo liberación de citoquinas, fagocitosis y generación de oxígeno reactivo. Similarmente, con una porción de anticuerpo capaz de reconocer células tumorales, la respuesta del sistema inmune al tumor resultaría beneficiosamente elevada. Con un anticuerpo capaz de reconocer células inmunes que tuvieran una reactividad inapropiada con determinantes propios, las células autorreactivas podrían ser selectivamente reconocidas para su destrucción.

Aunque estos ejemplos recurren al uso de quimeras de anticuerpos como una herramienta descriptiva conveniente, el alcance del invento no se limita a quimeras de anticuerpos y, en realidad, el uso de dominios extracelulares específicos no pertenecientes a anticuerpos puede tener importantes ventajas. Por ejemplo, con una porción extracelular que fuera el receptor para un virus, bacteria o parásito, células armadas con las quimeras reconocerían específicamente las células que expresan los determinantes víricos, bacterianos o parasitarios. La ventaja de este planteamiento con respecto al uso de anticuerpos es que el receptor nativo para el agente patógeno puede tener una selectividad o afinidad extraordinariamente elevada para el agente patógeno, lo que permite un mayor grado de precisión en la respuesta inmune resultante. Similarmente, para suprimir células del sistema inmune que reaccionan inapropiadamente con un antígeno propio, puede bastar unir el antígeno [sea como una proteína intacta en el caso de terapias de supresión de células B, o sea como complejo principal de histocompatibilidad (MHC; del inglés, major histocompatibility complex) en el caso de terapias de supresión de células T] a cadenas intracelulares de proteína-tirosina quinasa y, de este modo, influir en el reconocimiento específico de las células que responden inapropiadamente a determinantes propios.

Otro uso de las quimeras es el control in vivo} de poblaciones celulares después de otras formas de ingeniería genética. Por ejemplo, se ha propuesto el uso de linfocitos o células asesinas naturales que se infiltran en tumores para llevar principios citotóxicos al sitio de los tumores. El presente invento proporciona un medio conveniente para regular los números y la actividad de tales linfocitos y células sin extraerlos del cuerpo del paciente para su multiplicación in vitro. De este modo, puesto que los dominios intracelulares de los receptores quiméricos median en las respuestas proliferativas de las células, la coordinación de los dominios extracelulares mediante una diversidad de estímulos agregativos específicos para los dominios extracelulares (por ejemplo, un anticuerpo específico para el dominio extracelular) dará lugar a la proliferación de las células que contienen las quimeras.

Aunque las realizaciones específicas del presente invento comprenden quimeras entre las familias Syk o Syk y Src de proteína-tirosina quinasas, cualquier tirosina quinasa que tuviera una función similar a la de estas moléculas podría ser usada para los fines aquí descritos. Las características distintivas de las deseables moléculas desencadenantes de células inmunes comprenden la capacidad para expresarse autónomamente, la capacidad para fusionarse con un dominio extracelular (directa o indirectamente a través de un dominio transmembranal) de modo que la quimera resultante esté presente en la superficie de una célula terapéutica, y la capacidad para iniciar programas efectores celulares tras la agregación que sigue al encuentro con un ligando diana.

En la actualidad, el método más conveniente para la distribución de las quimeras en células del sistema inmune es a través de alguna forma de terapia génica. Sin embargo, la reconstitución de células del sistema inmune con receptores quiméricos mediante la mezcla de las células con proteína quimérica adecuadamente purificada y solubilizada también daría lugar a la formación de una población celular creada capaz de responder a las dianas reconocidas por el dominio extracelular de las quimeras. Se han usado planteamientos similares para, por ejemplo, introducir el receptor de HIV intacto, CD4, en eritrocitos con fines terapéuticos. En este caso, la población celular creada no sería capaz de autorenovación.

El presente invento se refiere a quimeras de proteína-tirosina quinasa simplificadas y funcionales que son capaces de redirigir la función del sistema inmune. Más particularmente, se refiere a la regulación de linfocitos, macrófagos, células asesinas naturales o granulocitos mediante la expresión, en dichas células, de quimeras que causan que las células respondan a dianas reconocidas por las quimeras. El invento también se refiere a un método para dirigir una respuesta celular a un agente infectivo, una célula tumoral o cancerosa, o una célula generada de forma autoinmune. El método para dirigir la respuesta celular en un mamífero comprende administrar una cantidad eficaz de células terapéuticas a dicho mamífero, células que son capaces de reconocer y destruir dicho agente infectivo, tumor, célula cancerosa o célula generada de forma autoinmune.

En otra realización, el método para dirigir una respuesta celular a un agente infectivo comprende administrar células terapéuticas capaces de reconocer y destruir dicho agente, siendo dicho agente un virus específico, bacterias, protozoos u hongos. Aún más específicamente, el método se dirige contra agentes tales como HIV y Pneumocystis carinii.

Para tratar una infección por HIV, se administra a un paciente una cantidad eficaz de linfocitos T citotóxicos que expresan el receptor quimérico. Los linfocitos son capaces de reconocer y lisar específicamente las células infectadas con HIV así como el virus circulante.

De este modo, en una realización, se proporciona, de acuerdo con el invento, un método para dirigir una respuesta celular a células infectadas con HIV, que comprende administrar a un paciente una cantidad eficaz de linfocitos T citotóxicos que son capaces de reconocer y lisar específicamente células infectadas con HIV.

En aún otra realización, se proporciona las proteínas receptoras quiméricas que dirigen los linfocitos T citotóxicos para que reconozcan y lisen la célula infectada con HIV. Aún otra realización del invento comprende células huésped transformadas con un vector que comprende los receptores quiméricos.

Éstas y otras realizaciones no restrictivas del presente invento serán evidentes para quienes tienen experiencia, a partir de la siguiente descripción detallada del invento.

En la siguiente descripción detallada, se hará referencia a diversas metodologías conocidas por quienes tienen experiencia en el campo de la biología molecular y la inmunología.

Los trabajos de referencia estándares que exponen los principios generales de la tecnología del DNA recombinante incluyen J. D. Watson et al., Molecular Biology of the Gene, volúmenes I y II, editado por The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Menlo Park, California, EE.UU. (1.987); J. E. Darnell et al., Molecular Cell Biology, editado por Scientific American Books, Inc., New York, New York, EE.UU. (1.986); B. M. Lewin, Genes II, editado por John Wiley & Sons, New York, New York, EE.UU. (1.985); R. W. Old et al., Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2ª edición, editado por University of California Press, Berkeley, California, EE.UU. (1.981); T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, editado por Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, EE.UU. (1.989); y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Press, New York, New York, EE.UU. (1.989).

Definiciones

Por ``clonación'' se quiere significar el uso de técnicas de recombinación in vitro para insertar un gen concreto u otra secuencia de DNA en una molécula vector. Con objeto de clonar exitosamente un gen deseado, es necesario emplear métodos para generar fragmentos de DNA para unir los fragmentos a moléculas vector, para introducir la molécula de DNA compuesta en una célula huésped en que pueda replicarse, y para seleccionar el clon que tiene el gen diana de entre las células huésped receptoras.

Por ``cDNA'' se quiere significar DNA complementario o copia producido a partir de un RNA molde por la acción de una DNA polimerasa dependiente de RNA (transcriptasa inversa). De este modo, un ``clon de cDNA'' significa una secuencia de DNA dúplex complementaria de una molécula de RNA de interés, conducida en un vector de clonación.

Por ``banco de cDNA'' se quiere significar una colección de moléculas de DNA recombinantes que contienen insertos de cDNA que comprenden copias DNA de mRNA que fue expresado por la célula en el momento en que se construyó el banco de cDNA. Dicho banco de cDNA puede ser preparado mediante métodos conocidos por quienes tienen experiencia y descritos, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Maniatis et al., supra. Generalmente, se aísla primero RNA de las células de un organismo de cuyo genoma se desea clonar un gen concreto. Para el fin del presente invento se prefieren líneas celulares linfocíticas de mamífero, y particularmente de ser humano. Un vector actualmente preferido para este fin es la cepa WR de virus vaccinia.

Por ``vector'' se quiere significar una molécula de DNA, procedente de, por ejemplo, un plásmido, bacteriófago, o virus de mamífero o insecto, en que pueden insertarse o clonarse fragmentos de DNA. Un vector contendrá uno o más sitios de restricción únicos y puede ser capaz de replicación autónoma en un organismo huésped o vehículo definido, de modo que la secuencia clonada sea reproducible. De este modo, por ``vector de expresión de DNA'' se quiere significar cualquier elemento autónomo capaz de dirigir la síntesis de un péptido recombinante. Dichos vectores de expresión de DNA incluyen plásmidos y fagos bacterianos y plásmidos y virus de mamíferos e insectos.

Por ``sustancialmente puro'' se quiere significar un compuesto, por ejemplo, una proteína, un polipéptido o un anticuerpo, que carece sustancialmente de los componentes que lo acompañan naturalmente. Generalmente, un compuesto es sustancialmente puro cuando al menos el 60%, más preferiblemente al menos el 75% y muy preferiblemente al menos el 90%, del material total de una muestra es el compuesto de interés. La pureza puede ser medida mediante cualquier método apropiado, tal como, por ejemplo, cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida o análisis por cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC; del inglés, high performance liquid chromatography). En el contexto de un ácido nucleico, ``sustancialmente puro'' significa una secuencia, segmento o fragmento de ácido nucleico que no es inmediatamente contiguo (es decir, no está covalentemente unido) a ninguna de las dos secuencias de codificación a la que es inmediatamente contiguo (es decir, una en el extremo 5' y una en el extremo 3') en el genoma, presente en la naturaleza, del organismo del que procede el DNA del invento.

Por ``derivado funcional'' se quiere significar los ``fragmentos'', ``variantes'', ``compuestos análogos'' o ``derivados químicos'' de una molécula. Por un ``fragmento'' de una molécula, tal como cualquiera de las secuencias de cDNA del presente invento, se quiere hacer referencia a cualquier subconjunto nucleotídico de la molécula. Por una ``variante'' de dicha molécula se quiere hacer referencia a una molécula presente en la naturaleza que es sustancialmente similar a la molécula entera o a un fragmento de la misma. Por un ``compuesto análogo'' de una molécula se quiere hacer referencia a una molécula no natural que es sustancialmente similar a la molécula entera o a un fragmento de la misma. Se dice que una molécula es ``sustancialmente similar'' a otra molécula si la secuencia de aminoácidos es sustancialmente la misma en ambas moléculas. Las moléculas aminoácidas sustancialmente similares poseerán una actividad biológica similar. De este modo, con tal que dos moléculas posean una actividad similar, son consideradas variantes en cuanto al término aquí usado incluso si una de las moléculas contiene menos o adicionales restos de aminoácido no hallados en la otra, o si la secuencia de restos de aminoácido no es idéntica. Como se usa aquí, se dice que una molécula es un ``derivado químico'' de otra molécula cuando contiene grupos químicos adicionales que no forman normalmente una parte de la molécula. Dichos grupos pueden mejorar la solubilidad, absorción, semivida biológica, etc. de la molécula. Alternativamente, los grupos pueden disminuir la toxicidad de la molécula, eliminar o atenuar cualquier efecto secundario indeseable de la molécula, etc. En, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, EE.UU. (1.980), se describen grupos capaces de mediar en tales efectos.

Similarmente, por un ``derivado funcional'' de un gen de quimera de receptor del presente invento se quiere incluir ``fragmentos'', ``variantes'' o ``compuestos análogos'' del gen, que pueden ser ``sustancialmente similares'' en cuanto a la secuencia de nucleótidos y que codifican una molécula que posee una actividad similar a la de una quimera de proteína-tirosina quinasa.

De este modo, como se usa aquí, por una proteína quimérica de proteína- tirosina quinasa se quiere incluir también cualquier derivado funcional, fragmentos, variantes, compuestos análogos o derivados químicos que pueden ser sustancialmente similares a la quimera de ``tipo silvestre'' y que poseen una actividad similar (es decir, muy preferiblemente el 90%, más preferiblemente el 70%, preferiblemente el 40% o al menos el 10%, de la actividad de la quimera de receptor de tipo silvestre). La actividad de un derivado funcional de receptor quimérico incluye la unión específica (con su porción extracelular) a un agente o célula diana y la resultante destrucción (dirigida por su porción intracelular) de ese agente o célula; dicha actividad puede ser analizada, por ejemplo, usando cualquiera de los ensayos aquí descritos.

Una secuencia de DNA que codifica la quimera del presente invento, o sus derivados funcionales, puede recombinarse con DNA vector de acuerdo con técnicas convencionales, incluyendo extremos de final romo o final escalonado para ligación, digestión con enzimas de restricción para proporcionar extremos apropiados, compleción de extremos cohesivos según sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar una unión indeseable, y ligación con ligasas apropiadas. Las técnicas para dichas manipulaciones son descritas por T. Maniatis et al., supra, y son bien conocidas en este campo técnico.

Se dice que una molécula de ácido nucleico, tal como DNA, es ``capaz de expresar'' un polipéptido si contiene secuencias de nucleótidos que contienen información reguladora de transcripción y traducción y dichas secuencias están ``operativamente unidas'' a secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido. Una unión operativa es una unión en que las secuencias de DNA reguladoras y la secuencia de DNA buscada para que se exprese están conectadas de tal modo que permiten la expresión génica. La naturaleza exacta de las regiones reguladoras necesarias para la expresión génica puede variar de organismo a organismo pero, en general, debe incluir una región promotora que, en procariontes, contiene tanto el promotor (que dirige la iniciación de la transcripción de RNA) como las secuencias de DNA que, cuando se transcriban en RNA, señalarán la iniciación de la síntesis proteica. Tales regiones incluirán normalmente aquellas secuencias no codificadoras 5' implicadas en la iniciación de la transcripción y traducción, tales como la caja TATA, la secuencia de remate (``capping''), la secuencia CAAT y similares.

Si se desea, la región no codificadora 3' con respecto a la secuencia génica que codifica la proteína puede ser obtenida mediante los métodos anteriormente descritos. Este región puede conservarse por sus secuencias reguladoras de la terminación de la transcripción, tales como terminación y poliadenilación. De este modo, al conservarse la región 3' naturalmente contigua a la secuencia de DNA que codifica la proteína, pueden proporcionarse las señales de terminación de la transcripción. Cuando las señales de terminación de la transcripción no son satisfactoriamente funcionales en la célula huésped de expresión, puede sustituirse una región 3' funcional en la célula huésped.

Se dice que dos secuencias de DNA (tales como una secuencia de región promotora y una secuencia que codifica una quimera de proteína-tirosina quinasa) están operativamente unidas si la naturaleza de la unión entre las dos secuencias de DNA (1) no da lugar a la introducción de una mutación por desplazamiento del marco de lectura, (2) ni interfiere con la capacidad de la secuencia de región promotora para dirigir la transcripción de la secuencia génica de la quimera de receptor, (3) ni interfiere con la capacidad de la secuencia génica de la quimera de receptor para ser transcrita por la secuencia de región promotora. Una región promotora estaría operativamente unida a una secuencia de DNA si el promotor fuera capaz de efectuar la transcripción de esa secuencia de DNA. De este modo, para que se exprese la proteína son necesarias señales de transcripción y traducción reconocidas por un huésped apropiado.

El presente invento abarca la expresión de una proteína quimérica de proteína-tirosina quinasa (o un derivado funcional de la misma) en células procarióticas o eucarióticas, aunque se prefiere la expresión eucariótica (y, particularmente, en linfocitos humanos).

Los anticuerpos de acuerdo con el presente invento pueden ser preparados mediante cualquiera de una diversidad de métodos. Por ejemplo, pueden administrarse células que expresan la proteína quimérica receptora, o un derivado funcional de la misma, a un animal con objeto de provocar la producción de sueros que contengan anticuerpos policlonales que sean capaces de unirse a la quimera.

En un método preferido, los anticuerpos de acuerdo con el presente invento son anticuerpos monoclonales. Dichos anticuerpos monoclonales pueden ser preparados usando la tecnología de hibridomas [Kohler et al., Nature, 256: 495 (1.975); Kohler et al., Eur. J. Immunol., 6: 511 (1.976); Kohler et al., Eur. J. Immunol., 6: 292 (1.976); Hammerling et al. en Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, New York, EE.UU., páginas 563-684 (1.981)]. En general, dichos procedimientos implican inmunizar un animal con el antígeno quimérico. Los esplenocitos de dichos animales son extraídos y son fusionados con una adecuada línea celular de mieloma. Cualquier línea celular de mieloma adecuada puede ser empleada de acuerdo con el presente invento. Después de la fusión, las células de hibridoma resultantes son selectivamente mantenidas en medio HAT y son luego clonadas por dilución limitante del modo descrito por J. R. Wands et al. [Gastroenterology 80: 225-232 (1.981)]. Las células de hibridoma obtenidas por medio de dicha selección son luego analizadas para identificar los clones que secretan anticuerpos capaces de unirse a la quimera.

Los anticuerpos de acuerdo con el presente invento pueden ser también policlonales o, preferiblemente, anticuerpos policlonales específicos de región.

Los anticuerpos contra la quimera de acuerdo con el presente invento pueden ser usados para determinar la cantidad de receptor quimérico (o de células que contienen el receptor quimérico) en un paciente. Dichos anticuerpos son bien adecuados para uso en ensayos inmunodiagnósticos estándares conocidos en la técnica, incluyendo ensayos inmunométricos o ``sándwich'' tales como los ensayos sándwich directo, sándwich inverso y sándwich simultáneo. Los anticuerpos pueden ser usados en cualquier número de combinaciones, como puede ser determinado sin una experimentación excesiva por quienes tienen experiencia, para efectuar inmunoensayos de especificidad, sensibilidad y precisión aceptables.

Los trabajos de referencia estándares que exponen principios generales de inmunología incluyen I. Roitt, Essential Immunology, sexta edición, editado por Blackwell Scientific Publications, Oxford, Gran Bretaña (1.988); J. W. Kimball, Introduction to Immunology, segunda edición, editado por Macmillan Publishing Co., New York, EE.UU. (1.986); I. Roitt et al., Immunology, editado por Gower Medical Publishing Ltd., Londres (1.985); A. Campbell, ``Monoclonal Antibody Technology'' en Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, compilado por R. Burdon et al., volumen 13, editado por Elsevier, Amsterdam, Holanda (1.984); J. Klein, Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, editado por John Wiley & Sons, New York, EE.UU. (1.982); y Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses, compilado por R. Kennett et al., editado por Plenum Press, New York, EE.UU. (1.980).

Por ``detectar'' se quiere incluir determinar la presencia o ausencia de una sustancia o cuantificar la cantidad de una sustancia. El término se refiere así al uso de los materiales, composiciones y métodos del presente invento para determinaciones cualitativas y cuantitativas.

El aislamiento de otros hibridomas que secreten anticuerpos monoclonales de la misma especificidad que la de los aquí descritos puede ser llevado a cabo mediante la técnica de exploración antiidiotípica [Potocmjak et al., Science 215: 1.637 (1.982)]. En resumen, un anticuerpo antiidiotípico es un anticuerpo que reconoce determinantes únicos presentes en el anticuerpo producido por el clon de interés. El anticuerpo antiidiotípico es preparado al inmunizar un animal de la misma raza usada como fuente del anticuerpo monoclonal, con el anticuerpo monoclonal de interés. El animal inmunizado reconocerá, y responderá a, los determinantes idiotípicos del anticuerpo inmunizante produciendo anticuerpo hacia esos determinantes idiotípicos (anticuerpo antiidiotípico).

En cuanto a la replicación, las células híbridas pueden ser cultivadas tanto in vitro como in vivo. La elevada producción in vivo hace que éste sea el método de cultivo actualmente preferido. En resumen, células de las razas híbridas individuales son inyectadas intraperitonealmente en ratones BALB/c estimulados con pristano, para producir fluido ascítico que contiene elevadas concentraciones de los anticuerpos monoclonales deseados. Pueden purificarse anticuerpos monoclonales de isotipo IgM o IgG de los sobrenadantes del cultivo usando métodos de cromatografía en columna bien conocidos por quienes tienen experiencia en la técnica.

Los anticuerpos de acuerdo con el presente invento son particularmente adecuados para uso en inmunoensayos, en los que pueden ser utilizados en fase líquida o unidos a un soporte en fase sólida. Además, en estos inmunoensayos, los anticuerpos pueden ser detectablemente marcados de distintas formas.

Hay muchos diferentes marcadores y métodos de marcación conocidos en la técnica. Los ejemplos de los tipos de marcadores que pueden ser usados en el presente invento incluyen, pero no se limitan a, enzimas, radioisótopos, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes, compuestos bioluminiscentes y quelatos metálicos. Quienes tienen una experiencia normal en la técnica tendrán conocimiento de otros marcadores adecuados para unir a anticuerpos o podrán determinar los mismos mediante el uso de una experimentación rutinaria. Además, la unión de estos marcadores a anticuerpos puede ser llevada a cabo usando técnicas estándares comúnmente conocidas por quienes tienen una experiencia normal en este campo técnico.

Una de las formas en que los anticuerpos de acuerdo con el presente invento pueden ser detectablemente marcados es por enlace del anticuerpo a una enzima. A su vez, esta enzima, cuando sea expuesta más tarde a su sustrato, reaccionará con el sustrato de un modo tal que producirá un grupo químico que podrá ser detectado, por ejemplo, por medios espectrofotométricos o fluorométricos. Los ejemplos de enzimas que pueden ser usadas para marcar detectablemente anticuerpos incluyen malato deshidrogenasa, nucleasa estafilocócica, delta-V-esteroide isomerasa, alcohol deshidrogenasa de levadura, alfa-glicerofosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, biotina-avidina peroxidasa, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, \beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-VI-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolina esterasa.

La presencia de anticuerpos detectablemente marcados puede ser también detectada al marcar los anticuerpos con un isótopo radiactivo que puede ser luego determinado por medios tales como el uso de un contador gamma o un contador de centelleo. Los isótopos que son particularmente útiles para el fin del presente invento son ^{3}H, ^{125}I, ^{32}P, ^{35}S, ^{14}C, ^{51}Cr, ^{36}Cl, ^{57}Co, ^{58}Co, ^{59}Fe y ^{75}Se.

También es posible detectar la unión de anticuerpos detectablemente marcados, al marcar los anticuerpos con un compuesto fluorescente. Cuando un anticuerpo fluorescentemente marcado es expuesto a luz de longitud de onda apropiada, su presencia puede ser luego detectada a causa de la fluorescencia del colorante. Entre los compuestos marcadores fluorescentes más comúnmente usados están: isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o- ftaldehído y fluorescamina.

Los anticuerpos del invento pueden ser también detectablemente marcados al usar metales emisivos fluorescentes tales como ^{152}Eu, u otros de la serie lantánida. Estos metales pueden ser fijados a la molécula de anticuerpo usando grupos quelantes de metales tales como el ácido dietilentriaminapentaacético (DTPA) y el ácido etilendiaminatetraacético (EDTA).

Los anticuerpos pueden ser también detectablemente marcados al hacer copular con ellos un compuesto quimioluminiscente. La presencia del anticuerpo quimioluminiscentemente marcado es luego determinada al detectar la presencia de la luminiscencia que surge durante el curso de la reacción química. Son ejemplos de compuestos marcadores quimioluminiscentes particularmente útiles: luminal, isoluminol, éster de acridinio teromático, imidazol, sales de acridinio, éster de oxalato, y dioxetano.

Asimismo, puede usarse un compuesto bioluminiscente para marcar los anticuerpos de acuerdo con el presente invento. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia hallado en sistemas biológicos, en que una proteína catalítica aumenta la eficacia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de un anticuerpo bioluminiscente es determinada al detectar la presencia de luminiscencia. Los compuestos bioluminiscentes importantes con fines de marcación incluyen luciferina y luciferasa aequorina.

Los anticuerpos y el antígeno sustancialmente purificado del presente invento van idealmente bien para la preparación de un sistema. Dicho sistema puede comprender un medio de soporte que está subdividido para recibir, en estrecho confinamiento con él, uno o más medios recipientes tales como viales, tubos y similares, comprendiendo cada uno de dichos medios recipientes los diferentes elementos del ensayo que se va a usar.

Los tipos de ensayo que pueden ser incorporados en forma de sistema son muchos e incluyen, por ejemplo, ensayos competitivos y no competitivos. Los ejemplos típicos de ensayos en que pueden utilizarse los anticuerpos del invento son radioinmunoensayos (RIA), inmunoensayos enzimáticos (EIA; del inglés, enzyme immunoassays), ensayos con inmunosorbentes ligados a enzimas (ELISA; del inglés; enzyme-linked immunosorbent assays) e inmunoensayos inmunométricos o sándwich.

Por la expresión ``ensayo inmunométrico'' o ``inmunoensayo sándwich'' se pretende incluir los inmunoensayos sándwich simultáneo, sándwich directo y sándwich inverso. Estas expresiones son bien comprendidas por los expertos en la técnica. Quienes tienen experiencia también apreciarán que los anticuerpos de acuerdo con el presente invento serán útiles en otras variaciones y formas de ensayo que son actualmente conocidas o que pueden desarrollarse en el futuro. Se pretende que queden incluidas dentro del alcance del presente invento.

En el modo preferido para llevar los ensayos a cabo, es importante que ciertos ``bloqueadores'' estén presentes en el medio de incubación (normalmente añadidos con el anticuerpo soluble marcado). Los ``bloqueadores'' se añaden para asegurar que proteínas inespecíficas, proteasa, o anticuerpos humanos hacia inmunoglobulinas de ratón presentes en la muestra experimental no reticulan ni destruyen los anticuerpos dispuestos en el soporte en fase sólida, ni el anticuerpo indicador radiomarcado, para producir falsos resultados positivos o negativos. Por lo tanto, la selección de ``bloqueadores'' se suma sustancialmente a la especificidad de los ensayos descritos en el presente invento.

Se ha hallado que como ``bloqueadores'' puede usarse un número de anticuerpos no relevantes (es decir, inespecíficos) de la misma clase o subclase (isotipo) que la usada en los ensayos (por ejemplo, IgG_{1}, IgG_{2a}, IgM, etc.). La concentración de los ``bloqueadores'' (normalmente 1-100 \mug/\mul) es importante con objeto de mantener la sensibilidad apropiada pero inhibir cualquier interferencia indeseada por proteínas del suero humano que presentan mutuamente reactividad cruzada. Además, el sistema tampón que contiene los ``bloqueadores'' ha de ser optimizado. Los tampones preferidos son aquellos basados en ácidos orgánicos débiles, tales como imidazol, HEPPS, MOPS, TES, ADA, ACES, HEPES, PIPES, TRIS y similares, en intervalos de pH fisiológicos. Son tampones algo menos preferidos los tampones inorgánicos, tales como fosfato, borato y carbonato. Finalmente, deberían añadirse inhibidores de proteasas conocidos (normalmente en una concentración de 0,01-10 \mug/ml) al tampón que contiene los ``bloqueadores''.

Hay muchos inmunoadsorbentes en fase sólida que han sido empleados y que pueden usarse en el presente invento. Inmunoadsorbentes bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, dextrano, nailon y otros materiales, en forma de tubos, glóbulos, y placas de microtitulación hechas de, o revestidas con, dichos materiales, y similares. Los anticuerpos inmovilizados pueden ser covalente o físicamente unidos al inmunoadsorbente en fase sólida mediante técnicas tales como unión covalente a través de un enlace amida o éster, o mediante absorción. Los expertos en la técnica conocerán muchos otros adecuados inmunoadsorbentes en fase sólida y métodos para inmovilizar anticuerpos sobre ellos, o podrán determinar los mismos usando nada más que una experimentación rutinaria.

Para el diagnóstico in vivo, in vitro o in situ, pueden unirse marcadores tales como radionucleidos a anticuerpos de acuerdo con el presente invento, ya sea directamente o ya sea usando un grupo funcional intermedio. Un grupo intermedio que es usado a menudo para unir radioisótopos, que existen como cationes metálicos, a anticuerpos es el ácido dietilentriaminapentaacético (DTPA). Los ejemplos típicos de cationes metálicos que se unen de esta manera son: ^{99m}Tc, ^{123}I, ^{111}In, ^{131}I, ^{97}Ru, ^{67}Cu, ^{67}Ga y ^{68}Ga. Los anticuerpos del invento pueden ser también marcados con isótopos no radiactivos con fines de diagnóstico. Los elementos que son particularmente útiles de este modo son: ^{157}Gd, ^{55}Mn, ^{162}Dy, ^{52}Cr y ^{56}Fe.

El antígeno del invento puede aislarse en forma sustancialmente pura al emplear anticuerpos de acuerdo con el presente invento. De este modo, una realización del presente invento proporciona una quimera de proteína-tirosina quinasa sustancialmente pura, antígeno que se caracteriza porque es reconocido por, y se une a, anticuerpos de acuerdo con el presente invento. En otra realización, el presente invento proporciona un método para aislar o purificar el antígeno de receptor quimérico al formar un complejo de dicho antígeno con uno o más anticuerpos dirigidos contra la quimera de receptor.

A su vez, los antígenos quiméricos sustancialmente puros del presente invento pueden ser usados para detectar o medir anticuerpo hacia la quimera en una muestra, tal como suero u orina. De este modo, una realización del presente invento comprende un método para detectar la presencia o cantidad de anticuerpo hacia antígeno de proteína-tirosina quinasa en una muestra, que comprende poner una muestra que contiene un anticuerpo hacia el antígeno quimérico en contacto con quimera de receptor detectablemente marcada y detectar dicho marcador. Se apreciará que pueden utilizarse también fracciones inmunorreactivas y compuestos análogos inmunorreactivos de la quimera. Por la expresión ``fracción inmunorreactiva'' se quiere significar cualquier porción del antígeno quimérico que pone de manifiesto una respuesta inmune equivalente hacia un anticuerpo dirigido contra la quimera de receptor. Por la expresión ``compuesto análogo inmunorreactivo'' se quiere significar una proteína que difiere de la proteína quimérica de receptor en uno o más aminoácidos pero que pone de manifiesto una respuesta inmune equivalente hacia un anticuerpo del invento.

Por ``específicamente reconoce y se une a'' se quiere significar que el anticuerpo reconoce, y se une a, el polipéptido receptor quimérico pero sustancialmente no reconoce, ni se une a, otras moléculas no relacionadas de una muestra, tal como, por ejemplo, una muestra biológica.

Por ``célula generada de forma autoinmune'' se quiere significar células que producen anticuerpos que reaccionan con tejido del huésped o células T efectoras inmunes que son autorreactivas; dichas células incluyen anticuerpos contra receptores de acetilcolina (lo que conduce, por ejemplo, a la miastenia gravis) o anticuerpos anti-DNA, antieritrocitos y antiplaquetas (lo que conduce, por ejemplo, al lupus eritematoso).

Por ``célula terapéutica'' se quiere significar una célula que ha sido transformada por una quimera del invento de modo que sea capaz de reconocer y destruir un agente infectivo específico, una célula infectada por un agente específico, una célula tumoral o cancerosa, o una célula generada de forma autoinmune; dichas células terapéuticas son preferiblemente células del sistema hematopoyético.

Por un ``agente infectivo diana'' se quiere significar cualquier agente infectivo (por ejemplo, un virus, bacteria, protozoo u hongo) que puede ser reconocido por una célula terapéutica que lleva el receptor quimérico. Por una ``célula diana'' se quiere significar cualquier célula huésped que puede ser reconocida por una célula terapéutica que lleva el receptor quimérico; las células diana incluyen, sin limitación, células huésped que están infectadas con un virus, bacteria, protozoo u hongo, así como células tumorales o cancerosas y células generadas de forma autoinmune.

Por ``extracelular'' se quiere significar que tiene al menos una porción de la molécula expuesta en la superficie celular. Por ``intracelular'' se quiere significar que tiene al menos una porción de la molécula expuesta al citoplasma de la célula terapéutica. Por ``transmembranal'' se quiere significar que tiene al menos una porción de la molécula atravesando la membrana plasmática. Como se usan aquí, una ``porción extracelular'', una ``porción intracelular'' y una ``porción transmembranal'' pueden incluir secuencias de aminoácidos flanqueadoras que se extienden en compartimentos celulares contiguos.

Por ``oligomerizar'' se quiere significar complejar con otras proteínas para formar dímeros, trímeros, tetrámeros u otros oligómeros de mayor orden. Dichos oligómeros pueden ser homooligómeros o heterooligómeros. Una ``porción oligomerizante'' es la región de una molécula que dirige la formación del complejo (es decir, el oligómero).

Por ``citolítico'' se quiere significar que es capaz de destruir una célula (por ejemplo, una célula infectada con un agente patógeno, una célula tumoral o cancerosa, o una célula generada de forma autoinmune) o es capaz de destruir un agente infectivo (por ejemplo, un virus).

Por ``virus de inmunodeficiencia'' se quiere significar un retrovirus que, en su forma de tipo silvestre, es capaz de infectar células T4 de un huésped primate y posee una morfogénesis y una morfología víricas características de la subfamilia de lentivirus. La expresión incluye, sin limitación, todas las variantes de HIV y SIV, incluyendo HIV- 1, HIV-2, SIVmac, SIVagm, SIVmnd, SIVsmm, SIVman, SIVmand y SIVcpz.

Por ``independiente del MHC'' se quiere significar que la respuesta citolítica celular no requiere la presencia de un antígeno de clase II del MHC en la superficie de la célula diana.

Por un ``derivado funcional transductor de señales citolíticas'' se quiere significar un derivado funcional (como se definió anteriormente) que es capaz de dirigir al menos el 10%, preferiblemente el 40%, más preferiblemente el 70% o muy preferiblemente al menos el 90%, de la actividad biológica de la molécula de tipo silvestre. Como se usa aquí, un ``derivado funcional transductor de señales citolíticas'' puede actuar generando directamente señales para que la célula terapéutica destruya un agente o célula unido al receptor (por ejemplo, en el caso de una porción intracelular de receptor quimérico) o puede actuar indirectamente al promover la oligomerización con proteínas transductoras de señales citolíticas de la célula terapéutica (por ejemplo, en el caso de un dominio transmembranal). Dichos derivados pueden ser analizados en cuanto a su eficacia usando, por ejemplo, los ensayos in vitro aquí descritos.

Por un ``derivado funcional ligante de la envoltura del HIV'' se quiere significar un derivado funcional (como se definió anteriormente) que es capaz de unirse a cualquier proteína de la envoltura del HIV. Los derivados funcionales pueden ser identificados usando, por ejemplo, los ensayos in vitro aquí descritos.

Administración terapéutica

Las células transformadas del presente invento pueden ser usadas para la terapia de diversas enfermedades. Los métodos actuales para administrar dichas células transformadas implican inmunoterapia adoptiva o terapia de transferencia celular. Estos métodos permiten la vuelta de las células del sistema inmune transformadas a la corriente sanguínea [S. A. Rosenberg, Scientific American, 62 (Mayo de 1.990); Rosenberg et al., The New England Journal of Medicine, 323(9): 570 (1.990)].

Las composiciones farmacéuticas del invento pueden ser administradas a cualquier animal que pueda experimentar los efectos beneficiosos de los compuestos del invento. Entre tales animales, los primeros son los seres humanos, aunque no se pretende que el invento quede así limitado.

Descripción detallada

En primer lugar se describirán los dibujos.

Descripción de los dibujos

La Figura 1A es un diagrama esquemático que muestra la organización de proteínas de fusión de receptor-quinasa del invento. La Figura 1B muestra resultados de citometría de flujo para CD16/7/zeta, CD16/7/Lck, CD16/7/Fyn(T), CD16/7/Syk y CD16/7/ZAP-70 expresados por recombinantes de virus vaccinia en células Jurkat. La Figura 1C muestra un ensayo de actividad quinasa in vitro de CD16/7/zeta (testigo negativo), CD16/7/Lck, CD16/7/Fyn(T), CD16/7/Syk y CD16/7/ZAP-70 inmunoprecipitados; la especie de menor masa molecular que aparece en el inmunoprecipitado de la quimera Fyn ha de ser aún identificado.

La Figura 2 muestra la respuesta de calcio citosólico desencadenada por reticulación de quimeras de quinasa en células Jurkat negativas en cuanto a TCR. Se muestra la concentración relativa de calcio intracelular de la población positiva (medida por la relación de fluorescencia violeta a azul del Indo-1). Células Jurkat infectadas con recombinantes de virus vaccinia que expresaban las diferentes proteínas de fusión fueron expuestas al anticuerpo monoclonal 3G8 anti-CD16 seguido de anticuerpos F(ab')_{2} de cabra, conjugados con ficoeritrina, hacia IgG de ratón a tiempo 0. Las quimeras basadas en la cadena zeta de TCR y en FcRIIB2 sirven como testigos positivo y negativo, respectivamente.

La Figura 3 muestra el brote prematuro de la respuesta de calcio en células positivas en cuanto a TCR que expresan la quimera de quinasa Syk. La infección y el análisis se llevaron a cabo del modo anteriormente descrito para la Figura 2. Una proporción sustancial de células que expresaban la quimera de Syk mostraron una elevada relación de fluorescencia violeta a azul antes de la adición del anticuerpo primario.

Las Figuras 4A y 4B muestran un ensayo de muerte antihibridoma. La Figura 4A muestra el porcentaje de ^{51}Cr-cromato liberado por células diana de hibridoma, mostrado en función de la relación de células efectoras [linfocitos T citotóxicos (CTL; del inglés, cytotoxic T lymphocytes) que expresan quimera de quinasa] a células diana; las células que expresan quimeras de receptor que contienen los dominios intracelulares de la cadena zeta de TCR y de FcRIIB2 sirven como testigos positivo y negativo, respectivamente. La Figura 4B muestra la especificidad de la muerte (ausencia de muerte colateral (``bystander'')]. Células BW5147 (que carecen de anticuerpo anti-CD16 superficial) fueron cargadas con ^{51}Cr-cromato y expuestas a CTL que expresaban quimeras de quinasa bajo las mismas condiciones que para una muestra paralela de células 3G8 cargadas con cromato (que expresan anticuerpo anti-CD16). No se observó liberación detectable alguna de cromato por las células BW5147.

Las Figuras 5A, 5B y 5C muestran que la coexpresión de ZAP-70 y Fyn o Lck permite la inducción de citolisis y reduce la latencia de la respuesta de calcio. Se coinfectaron CTL con recombinantes de virus vaccinia que expresaban las quimeras indicadas y se analizó su potencial citolítico o su movilización de calcio. La eficacia de las quimeras resulta subestimada por este análisis ya que la fracción de células que expresan ambas quimeras no fue medida independientemente (la fracción de células que expresan al menos una quimera fue usada para normalizar la actividad). La Figura 5A muestra un ensayo de citolisis utilizando CTL que expresan pares de quimeras de CD16/7/quinasa. La Figura 5B muestra la respuesta de calcio de células negativas en cuanto a TCR que expresan pares de quimeras de CD16/7/quinasa. La Figura 5C muestra un ensayo de citolisis de CTL que coexpresan una quimera de CD4/CD7/Fyn y una quimera de CD16/CD7/ZAP-70. La quimera de CD16/7/zeta sirve como testigo positivo, mientras que la quimera de CD16/7/FcRIIB2 sirve como testigo negativo.

Las Figuras 6A y 6B muestran que quimeras que contienen supresiones de quinasa o mutaciones puntuales son ineficaces en cuanto a movilización de calcio y citolisis redirigida. Se construyeron variantes de proteínas de fusión, negativas en cuanto a quinasa, por supresión (en el caso de Syk) o mutación puntual (en el caso de ZAP-70) y se analizaron en cuanto a respuesta de calcio y citolisis. La Figura 6A muestra la respuesta de calcio en células negativas en cuanto a TCR. La Figura 6B muestra un ensayo de citolisis redirigida.

Las Figuras 7A, 7B y 7C muestran que quimeras basadas en Syk humana son esencialmente equipotentes con respecto a quimeras basadas en Syk porcina. La Figura 7A es la secuencia de Syk humana y su comparación con la de Syk porcina; los 11 primeros y 7 últimos restos se determinan por las secuencias de cebador. La Figura 7B muestra un análisis de movilización de calcio de células negativas en cuanto a TCR que expresan quimera de Syk humana. La Figura 7C muestra un ensayo de citolisis redirigida de CTL que expresan quimera de Syk humana.

La Figura 8 muestra cambios en el patrón de fosforilación de tirosina después de la reticulación de quinasas quiméricas. Células Jurkat negativas en cuanto al receptor antigénico de células T, que expresan las quimeras indicadas o pares de quimeras fueron tratadas con anti-CD16 y un segundo anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón y fueron luego lisadas, fraccionadas en un gel de poliacrilamida, transferidas a nitrocelulosa y sondadas con anticuerpo antifosfotirosina. Los carriles marcados ``+'' representan extractos de células sometidas a reticulación, mientras los marcados ``n'' fueron células lisadas directamente sin exposición previa al anticuerpo secundario. Se crearon carriles testigo mediante un tratamiento similar de células negativas en cuanto a TCR que expresaban una proteína de fusión de CD16/7 que no contenía un dominio intracelular. Por comparación, se muestran a la derecha los efectos del tratamiento anti-CD3 de células Jurkat positivas en cuanto a TCR (con o sin infección con virus vaccinia de tipo silvestre). Las bandas prominentes en las proximidades de 100 kDa de la parte izquierda de este conjunto corresponden a las masas moleculares esperadas de las quimeras de quinasa.

La Figura 9 muestra la fosforilación de tirosina de la fosfolipasa C-\gamma1 (PLC-\gamma1; del inglés, phospholipase C-\underline{\smash{\gamma1}}) después de la agregación de quimeras. La PLC-\gamma1 fue inmunoprecipitada de células sometidas a reticulación por anticuerpo y los inmunoprecipitados fueron fraccionados en geles, transferidos a nitrocelulosa y sondados con anticuerpo antifosfotirosina. Se vio un aumento sustancial de PLC-\gamma1 fosforilada después de la agregación de quimeras de Syk, mientras que se ve un aumento más limitado aunque fácilmente detectable después de la coagregación de quimeras de Fyn y ZAP-70.

Las Figuras 10A y 10B muestran ensayos de quinasa in vitro. Células que expresaban quinasas quiméricas fueron sometidas a reticulación de quimeras mediada por anticuerpo, después de lo cual las quinasas fueron inmunoprecipitadas y los inmunoprecipitados fueron evaluados en cuanto a la fosforilación de sustrato endógeno. La Figura 10A muestra una comparación de la actividad de quimeras de quinasa inmunoprecipitadas, a lo largo de un periodo de incubación de diez minutos, usando inmunoprecipitados aislados de células reticuladas (+) o no reticuladas (n). La Figura 10B muestra el curso temporal de la asimilación de marcador de fosfato en sustratos endógenos por la quimera de quinasa Syk, con (+) o sin (n) reticulación.

Activación de células T por tirosina quinasas agrupadas

A continuación viene una descripción de realizaciones particulares del invento. En esta descripción, se demuestra que quinasas no asociadas a receptor son activadas por procesos de agrupación sencillos. Se crearon quinasas asociadas a receptor artificiales cuyos dominios intracelulares consistían en las secuencias completas de quinasas de la familia Src o Syk y se examinaron en cuanto a las consecuencias de la agregación por estímulos reticulantes externos. Surgió una clara distinción entre las actividades quinasa de las familias Syk y Src: la reticulación de la segunda no condujo a una activación celular significativa, mientras que la reticulación de la primera condujo a la aparición de ion calcio intracelular libre y, en el caso de Syk, de potencial citolítico. El fallo de las quimeras de ZAP-70 para inducir programas mediados por el receptor distal podría superarse al coagrupar la quimera de ZAP-70 con quimeras de quinasa Fyn o Lck. Los ejemplos ahora descritos se proporcionan con el fin de ilustrar, no limitar, el invento.

Construcción de quimeras de proteína-tirosina quinasa y demostración de su eficacia

Se construyeron fusiones génicas que codificaban proteínas que se asemejaban a quinasas asociadas a receptores de la superficie celular, al adjuntar un fragmento de DNA que codificaba el dominio extracelular de la molécula de CD16 a un segmento espaciador corto que codificaba los dominios yuxtamembranal y transmembranal de CD7 unido, a su vez, a las secuencias de codificación completas de las tirosina quinasas Lck humana (Koga et al., 1.986, Eur. J. Immunol. 16: 1.643-1.646), Fyn (T) murina (Cooke y Perlmutter, 1.989, New. Biol. 1: 66-74), Syk porcina (Taniguchi et al., 1.991, J. Biol. Chem. 266: 15.790-15.796) y ZAP-70 humana (Chan et al., 1.992, Cell 71: 649-662) (Figura 1A). Las fusiones génicas tripartitas resultantes fueron introducidas en virus vaccinia recombinantes mediante recombinación homóloga y selección en cuanto a la coexpresión del producto del gen gpt de E. coli. La infección de células con los recombinantes dio lugar a la expresión eficaz de las cuatro quimeras de quinasa en la superficie celular (Figura 1B). La inmunoprecipitación de las quimeras proteicas resultantes con anticuerpos anti- CD16 reveló la presencia de especies moleculares que tenían las masas esperadas y eran activas en un ensayo de fosforilación in vitro (Figura 1C).

Se examinó a continuación si la reticulación de las proteínas de fusión permitiría la acumulación de calcio intracelular libre de un modo similar al hallado con proteínas de fusión basadas en dominios intracelulares del receptor antigénico de la célula T. Para hacer esto, se infectaron diversas células con recombinantes de virus vaccinia y se midió la concentración relativa de calcio citoplásmico después de la reticulación de los dominios extracelulares con anticuerpos. Tanto la medición espectrofluorométrica (población global) como la medición citométrica de flujo (célula individual) se llevaron a cabo con células cargadas con el colorante Indo-1 (Grynkievitch et al., 1.985, J. Biol. Chem. 260: 3.440-3.450; Rabinovitch et al., 1.986, J. Immunol. 137: 952-961). Los análisis citométricos de flujo se llevaron a cabo sobre datos obtenidos de células cuya expresión de CD16 en la superficie celular, según se determinó por la intensidad de la fluorescencia de ficoeritrina, caía dentro de un intervalo predefinido relativamente estrecho. Aunque aún se observaron variaciones menores de la intensidad media de fluorescencia dentro de este intervalo (debidas a diferencias en la distribución subyacente de quimeras expresadas por las células), este planteamiento permitió contrastar las respuestas de células que poseían aproximadamente el mismo número de receptores. La Figura 2 muestra un análisis de datos recogidos de células de una variante mutacional de la línea leucémica Jurkat de células T humanas que carece del receptor antigénico de la célula T (Weiss y Stobo, 1.984, J. Exp. Med. 160: 1.284-99). En estas células, ni quimeras de Lck ni de Fyn tenían la capacidad para movilizar calcio después de la reticulación. En varios experimentos, la agrupación de la proteína de fusión de Lck dio lugar a una ligera disminución de la concentración de calcio en reposo con respecto a la del testigo negativo, una proteína de fusión basada en el dominio intracelular del receptor FcRIIB2 de IgG de baja afinidad (Kolanus et al., 1.992, EMBO J. 11: 4.861-4.868). La agregación de proteínas de fusión basadas tanto en ZAP-70 como en Syk fue muy eficaz a la hora de provocar la aparición de ion calcio citoplásmico libre, más o menos tan eficaz como la agregación de una quimera similar que poseía el dominio intracelular de la cadena zeta del receptor de la célula T. Se vio un ligero retraso en el inicio de la respuesta de calcio, tanto con la quimera de quinasa ZAP-70 como con la de Syk, con respecto al momento del inicio de la movilización de calcio por la quimera de zeta. En células positivas en cuanto al receptor de la célula T (Figura 3), la evaluación de flujo de quimeras de Syk resultó parcialmente frustrada por una elevada concentración de ion calcio libre en reposo, lo que sugiere una implicación constitutiva del aparato regulador del calcio.

La introducción de las quimeras en una línea de células T citolíticas permitió luego valorar el potencial de las proteínas de fusión para desempeñar una función efectora. En este ensayo, como células diana se utilizan células de hibridoma anti-CD16 que expresan anticuerpo IgG contra CD16 en la superficie celular (Fleit et al., 1.982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 3.275-3.279; Shen et al., 1.989, Mol. Immunol. 26: 959-969). Las células de hibridoma son marcadas mediante la incorporación de ^{51}Cr-cromato y son hechas cosedimentar con células efectoras, preparadas por infección de una línea de linfocitos T citotóxicos (CTL) aloespecíficos humanos con recombinantes de virus vaccinia que expresan las proteínas de fusión de CD16/CD7/quinasa. La expresión de las quinasas quiméricas asociadas a receptor permite que las células CTL infectadas se unan a las células diana y, si son competentes, las lisen, un proceso que es medido por la liberación del ^{51}Cr-cromato incorporado. La potencia relativa de los CTL armados es determinada por comparación de la relación de células efectoras a células diana necesaria para alcanzar una proporción dada de liberación de ^{51}Cr. La Figura 4A muestra que CTL que expresan receptores quiméricos que comprenden las quinasas Lck o Fyn (T) de la familia Src, o la quinasa ZAP-70 de la familia Syk, son incapaces de mediar en la citolisis contra dianas de hibridoma anti-CD16. Sin embargo, CTL que expresaban una quimera de quinasa basada en el producto proteico de Syk eran esencialmente tan eficaces como los CTL que expresaban una quimera compuesta de CD16 fusionado del mismo modo con el dominio intracelular de la cadena zeta del receptor de la célula T. La actividad citolítica dirigida por las quimeras de CD16/CD7/quinasa no podía ser atribuida a una liberación inespecífica de gránulos citotóxicos porque la cosedimentación de una diana irrelevante, cargada de cromo, con los CTL armados con quinasa no dio lugar a una liberación detectable de cromo marcado (Figura 4B).

La disparidad entre actividades Syk y ZAP-70 en el ensayo de citolisis resultó inesperada a la luz de las actividades similares de las dos quimeras en el ensayo de respuesta de calcio. A la luz de la demostración de que la coexpresión de quinasas no quiméricas de las familias ZAP-70 y Src conducía a activación en células COS (Chan et al., 1.992, Cell 71: 649-662), se emprendió una evaluación del potencial relativo de pares de quimeras de quinasa para efectuar citolisis. Efectores CTL fueron coinfectados con virus vaccinia recombinantes que codificaban quimeras de ZAP-70 y Lck, quimeras de ZAP-70 y Fyn (T), o quimeras de Lck y Fyn (T). La Figura 5A muestra que la coexpresión de quimeras de ZAP-70 y Fyn (T), o quimeras de ZAP-70 y Lck, dotaba a CTL de una actividad esencialmente equipotente a la de CTL que expresaban quimeras de CD16/CD7/quinasa Syk solas, una actividad a su vez tan potente como la presentada por quimeras de CD16/CD7/zeta. La coexpresión de quimeras de Lck y Fyn(T) no permitía que un potencial citolítico significativo fuera redirigido contra células diana anti-CD16 (Figura 5A). La evaluación del potencial de movilización de calcio de células coinfectadas con pares de proteínas de fusión de quinasa mostró que la coexpresión de quimeras de quinasas de las familias ZAP-70 y Src aumentaba la rapidez con que se movilizaba calcio en respuesta a la reticulación de receptores y que la coexpresión de quimeras de Lck y Fyn(T) no daba lugar a una acumulación significativa de calcio intracelular libre (Figura 5B). Para explorar adicionalmente el papel de la quimera de Fyn en la respuesta de activación inducida por coagregación, se preparó una quimera de Fyn que consistía en los dominios extracelular y transmembranal de CD4 fusionados con Fyn de un modo similar al de las quimeras de CD16. La Figura 5C muestra que la eficacia de esta quimera en el ensayo de citolisis dirigida es de diez a veinte veces menor que el de la quimera comparable de CD16, lo que sugiere que la asociación física de las quinasas quiméricas es importante para la activación. Sin embargo, la actividad citolítica de las células que expresan las dos quimeras es significativamente mayor que la que se observaría con células que expresaran la quimera de ZAP-70 sola. A causa del nivel relativamente elevado de expresión de quinasa en este sistema, no puede excluirse que la actividad residual refleje una asociación aleatoria espontánea de la quimera de CD4/Fyn con CD16/ZAP-70.

Para establecer que la activación vista tanto en el ensayo de respuesta de calcio como en el de citolisis era directamente atribuible a la relevante actividad quinasa y no a una asociación pasiva de las quinasas con elementos existentes de transducción de señales cuya agregación indirecta iniciaba luego la respuesta de activación, se crearon variantes, negativas en cuanto a quinasa, tanto de la quimera de receptor asociado a Syk porcina como de la quimera de receptor asociado a ZAP-70 humana. La Figura 6 muestra que las quimeras de receptor que carecían de sustancialmente todo el dominio quinasa (en el caso de Syk) o que contenían una mutación puntual que suprimía la actividad fosfotransferasa (en el caso de ZAP-70) carecían de actividad quinasa in vitro y eran incapaces de mediar en la movilización de calcio después de la reticulación, o de mediar en la citolisis redirigida por el receptor.

Puesto que la interacción de Syk porcina con el aparato celular humano podría no ser idéntica a la interacción de Syk humana, se construyeron también quimeras proteicas similares basadas en Syk humana, después de aislar secuencias de Syk humana por reacción en cadena de la polimerasa (PCR; del inglés, polymerase chain reaction) con cebadores correspondientes a los extremos amínino y carboxílico de la secuencia proteica porcina. La Figura 7A muestra que las Syk porcina y humana son proteínas sorprendentemente similares, como sugiere el análisis de productos de PCR correspondientes a porciones de la quinasa y segundos dominios SH2 (Chan et al., 1.992, Cell 71: 649-662). De acuerdo con esto, proteínas receptoras quiméricas asociadas a Syk humana actuaban de forma esencialmente idéntica a las construcciones porcinas en los ensayos de liberación de calcio y de citolisis (Figuras 7B y 7C).

Para establecer si la agregación de las tirosina quinasas quiméricas da lugar a un cambio significativo en la abundancia de proteínas de fosfotirosina, células negativas en cuanto al receptor de la célula T fueron infectadas con recombinantes de virus vaccinia que codificaban las quinasas quiméricas. Los dominios extracelulares de las quimeras fueron reticulados con anticuerpos, y los lisados celulares totales de las células activadas fueron fraccionados por electroforesis, transferidos a membranas y analizados con un anticuerpo que reconocía fosfotirosina. Los lisados fueron preparados por rotura de las células en detergentes no iónicos en presencia de vanadato con o sin EDTA, o por lisis en presencia de dodecilsulfato sódico (SDS; del inglés, sodium dodecyl sulfate), seguido de sonicación para cortar por cizallamiento el DNA liberado. El patrón de proteínas de fosfotirosina era diferente en cada caso y los lisados preparados con vanadato pero sin EDTA mostraban especies adicionales no presentes en los lisados preparados en SDS solo, lo que sugiere que el EDTA puede inhibir la acción poslítica de tirosina quinasas así como de fosfatasas. Se halló que el uso de lisis directa en SDS conducía a patrones más reproducibles de fosforilación de tirosinas proteicas que la lisis con detergentes no iónicos en presencia de EDTA y vanadato. La Figura 8 muestra que la agregación de quimeras que contienen Syk, ZAP-70, o Fyn más ZAP-70 da lugar a la aparición o la fosforilación aumentada de diversas especies proteicas que comigran con proteínas que muestran una fosforilación aumentada después de la reticulación del receptor antigénico. En particular, el patrón de bandas inducido por la agrupación de quimeras de Syk es muy similar al patrón inducido por anticuerpo anti-CD3 en células positivas en cuanto al receptor de la célula T (Figura 8). Entre estas, hay una proteína de aproximadamente 150 kDa inducida por la agregación de la quimera de Syk, pero también inducida por la coagregación de quimeras de Fyn y ZAP-70. En experimentos preliminares, se observó que esta fosfoproteína comigraba con la fosfolipasa C-\gamma (datos no mostrados).

Para establecer directamente los efectos de la agrupación de quimeras de quinasa sobre la PLC- \gamma, se reticularon quimeras, se precipitó la PLC-\gamma con una mezcla de anticuerpos monoclonales y se analizaron los inmunoprecipitados resultantes en cuanto a la presencia de fosfotirosil-proteínas. La Figura 9 muestra que la agrupación de Syk da lugar a un aumento sustancial del contenido de tirosina- fosfato de la PLC-\gamma, mientras que la reticulación de quimeras de Fyn más ZAP-70 da lugar a un aumento menos drástico aunque fácilmente detectable de tirosina-fosfato. Las células que expresaban la quimera de Fyn sola mostraron una moderada fosforilación basal de PLC- \gamma que no aumentaba después de la agregación de receptores (Figura 9). Se desconoce actualmente si los mismos restos de tirosina son fosforilados por Syk, Fyn, o ZAP-70 más Fyn. Puesto que las células que expresaban la quimera de Fyn no mostraban movilización de calcio en reposo ni inducida, la señal de fosfotirosina vista en esas células puede representar la utilización de sitios de la PLC-\gamma distintos de los que median en la activación de la fosfolipasa.

En un intento preliminar para explicar los cambios en el patrón de fosfotirosina, se evaluó la actividad de las diferentes quinasas después de la agrupación en un ensayo de autofosforilación in vitro. Las quimeras fueron agregadas, inmunoprecipitadas, y evaluadas en cuanto a su capacidad para incorporar marcador de fosfato a las especies proteicas presentes en el inmunoprecipitado. La Figura 10A muestra que, bajo estas condiciones, no se detectó aumento alguno de actividad quinasa después de la reticulación cuando el ensayo de quinasa fue llevado a cabo durante diez minutos. Aunque la incorporación de fosfato marcado continúa aumentando durante hasta 30 minutos en este ensayo, no está claro qué factores limitan la actividad; en particular, la cinética observada puede venir dominada por la velocidad de disociación de los complejos inmunes, permitiendo la difusión de quinasa al sustrato no utilizado. En un intento por controlar este efecto, así como por maximizar la sensibilidad del ensayo, se evaluó también la actividad quinasa Syk, con o sin reticulación previa, a lo largo de un brevísimo espacio de tiempo de 5 a 30 segundos; sin embargo, aquí tampoco hubo un aumento significativo de actividad quinasa (Figura 10 B). Aunque no se puede excluir actualmente la posibilidad de que fuera demostrable un aumento de actividad con un sustrato apropiado, tampoco se observó un aumento de actividad de la quimera de Syk, inducido por agregación, cuando se usó un sustrato peptídico exógeno (una sustitución Y 19 K de restos 6-20 de cdc 2) para medir la actividad quinasa.

Mecanismos posibles

El mecanismo mediante el cual un estímulo físico simple, la agregación de receptores, da lugar a la transmisión de una señal química distintiva a células del sistema inmune sigue siendo desconocido. Estudios previos han establecido que quinasas de la familia Src pueden hallarse asociadas con muchos de los importantes receptores del sistema inmune activados por agregación y que la reticulación de dichos receptores conduce frecuentemente a una actividad quinasa aumentada. Más recientemente, se ha hallado que las quinasas Syk y ZAP-70 relacionadas se asocian establemente (en el caso de Syk) o transitoriamente (en el caso de ZAP-70) con los receptores antigénicos de las células B y T, respectivamente, y, al menos en el caso de Syk, se ha comunicado que la reticulación de receptores da lugar a una actividad quinasa aumentada.

En este trabajo, se ha mostrado que la agregación de quinasas de la familia Syk, pero no de las quinasas Lck o Fyn de la familia Src, conduce a una respuesta de calcio en células que carecen del receptor de la célula T. Parece que la respuesta no se debe a una asociación indirecta con otros componentes de receptor o de transducción de señales de la célula T porque mutantes negativos en cuanto a quinasa no pueden inducir la respuesta de calcio. La agregación de quimeras que contienen la quinasa Syk es suficiente para permitir la inducción de citolisis específica, mientras que la inducción de una citolisis similar por la quimera de ZAP-70 requiere la participación adicional de una quinasa de la familia Src. En la actualidad, no está claro cuál de las quinasas de la familia Syk es probable que desempeñe un papel más importante en la activación de células T: tanto ZAP-70 como Syk se expresan en células T, incluyendo las líneas celulares usadas en este estudio, y al menos una línea de células T humanas sensibles contiene Syk pero no ZAP-70, según se estimó mediante productos de multiplicación por PCR específicos. El patrón de fosforilación aumentada de tirosinas proteicas visto después de la agrupación de quimeras de Syk es muy similar al patrón visto después de la reticulación del receptor antigénico de la célula T.

Un modelo sencillo para la activación de células del sistema inmune por tirosina quinasas no asociadas a receptor recurre a una quinasa asociada a receptor cuya agregación conduce a activación ya sea por asociación física (por ejemplo, al formarse dímeros de quinasa activos) o ya sea por acción enzimática mutua (por ejemplo, por fosforilación cruzada); la enzima activada actúa entonces sobre sustratos intracelulares clave requeridos para la movilización de calcio y la síntesis de inositol fosfato. El respaldo a esta secuencia de sucesos puede hallarse en estudios que presentan aumentos de actividad quinasa asociada a receptor después de la reticulación de receptores (por ejemplo, Bolen et al., 1.991, Adv. Cancer Res. 57: 103-149; Burkhardt et al., 1.991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88; 7.410-7.414; Eiseman y Bolen, 1.992, Nature 355: 78-80; Hutchcroft et al., 1.992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9.107-9.111/J. Biol. Chem. 267: 8.613-8.619; Tsygankov et al., 1.992, J. Biol. Chem. 267: 18.259-18.262; Wong et al., 1.992, Oncogene 7: 2.407-2.415). Sin embargo, los cambios presentados de actividad quinasa son moderados en la mayoría de los casos y contrastan con los cambios drásticos en el patrón de fosfotirosil-proteína visto in vivo. Puesto que es difícil excluir inequívocamente la activación por interacciones alostéricas débiles al usar ensayos sobre quinasa in vitro como herramienta, en este punto no se puede hacer una afirmación definitiva acerca de la importancia relativa de la activación de quinasas en el inicio de la transducción de señales. Pero los datos aquí presentados sugieren que la redistribución, inducida por agregación, de enzima y sustrato puede ser un factor importante a la hora de dirigir una actividad existente hacia la apropiada diana fisiológica.

La agregación de quimeras basadas en quinasas de la familia Syk condujo a una respuesta de calcio que estaba ligeramente retrasada pero era similar, en cuanto a amplitud, a la respuesta vista después de la agregación de quimeras de receptor zeta en células que carecían de receptor endógeno de células T. Después de la reticulación de quimeras de ZAP-70 se observó un retraso más profundo en la aparición de ion calcio libre, y este retraso podía ser sustancialmente suprimido al hacer correticular quimeras de ZAP-70 y Fyn. En la actualidad no está clara la explicación de la latencia observada. Puesto que la reticulación aceleraba la movilización de calcio, es tentador atribuir el retraso a la ineficacia relativa de ZAP-70 para la autoactivación mediada por agregación. Pero otros factores pueden ser igualmente importantes, y la fijación de quinasas ZAP y Syk a la superficie celular puede ser realmente un impedimento para la activación cuando se compara con el proceso normal; por ejemplo, si, en el curso normal de sucesos, quinasas de la familia Syk son transitoriamente llevadas a receptores agrupados, activadas y luego liberadas para que se difundan hacia sus sustratos, la unión permanente del dominio quinasa a la membrana plasmática podría ser restrictiva al entorpecer el acceso al sustrato y/o limitar la amplificación de señales a causa de la incapacidad de los receptores quiméricos para actuar como una clase de centro catalítico para la activación de quinasas.

Una segunda peculiaridad de la respuesta de calcio fue el hallazgo de que células positivas en cuanto al receptor de la célula T que expresaban quimeras basadas en Syk humana o porcina mostraban una elevada concentración de línea de base del ion calcio libre, lo que sugería que la liberación de calcio había sido espontáneamente desencadenada. No se observó un hallazgo similar en células negativas en cuanto al receptor. Este resultado va en contra de una tendencia general que se ha observado: mutantes de líneas tumorales de células T humanas, negativos en cuanto al receptor de la célula T, son típicamente hipersensibles a moléculas desencadenantes exógenamente introducidas. Para explicar la aparente necesidad del receptor de la célula T en el proceso de activación espontánea, se proponen dos explicaciones posibles y relacionadas. Una es que la quinasa Syk quimérica puede actuar constitutivamente sobre dominios intracelulares del receptor de la célula T para crear dianas de fosfotirosina para los dominios SH2 de la quimera de receptor, lo que conduciría a una agregación intracelular a través de un puente multivalente de receptores de la célula T y, a su vez, provocaría la activación de la quinasa. Otra posibilidad es que la línea celular negativa en cuanto al receptor de la célula T pueda tener menores niveles de una quinasa, asociada a la membrana, necesaria para la activación de Syk, sea porque un circuito regulador global da lugar a una síntesis de novo disminuida de la quinasa hipotética, o sea porque la ausencia de receptor antigénico da lugar a un tráfico intracelular mal regulado.

Se ha comunicado que, en células B, la quinasa Syk está constitutivamente asociada con los elementos intracelulares del receptor antigénico IgM (Hutchcroft et al., 1.992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9.107-9.111; Hutchcroft et al., 1.992, J. Biol. Chem. 267: 8.613-8.619). El mecanismo exacto de esta asociación no está claro, pero una posibilidad es que no se requiera fosfotirosina para la interacción de dominios SH2 de Syk con el motivo desencadenante de tirosina presente en el dominio citoplásmico de las cadenas de receptor mb-1 y B29. Un precedente parcial de esta sugerencia es la comunicación de que el producto génico BCR de la región de agrupación de puntos de rotura (BCR; del inglés, breakpoint cluster region) del cromosoma Philadelphia se une a una variedad de dominios SH2 de un modo independiente de fosfotirosina (Pendergast et al., 1.991, Cell 66: 161-171; Muller et al., 1.992, Mol. Cell. Biol. 12: 5.087-5.093). Sin embargo, en este caso, parece probable que restos de fosfoserina y/o fosfotreonina desempeñen un papel crítico en la interacción. Alternativamente, Syk puede asociarse con motivos intracelulares del receptor IgM a través de la región única situada entre los elementos SH2 de Syk y el dominio catalítico. Una tercera posibilidad es que sólo una pequeñísima cantidad de péptido fosforilado en cuanto a tirosina sea necesaria para reunir niveles funcionalmente importantes de Syk en la cara interna de la membrana plasmática, y que este bajo nivel de tisosina-fosfato haya escapado hasta ahora a la detección.

Aunque, en las células B, la necesidad de una quinasa de la familia Src para la activación no ha sido definitivamente establecida, en las células T se ha mostrado por genética somática o de organismos que dos quinasas, Lck y Fyn (T), desempeñan papeles importantes (Appleby et al., 1.992, Cell 70: 751-763; Karnitz et al., 1.992, Mol. Cell. Biol. 12: 4.521-4.530; Stein et al., 1.992, Cell 70: 741- 750; Straus y Weiss, 1.992, Cell 70: 585-593). En la actualidad, no se puede establecer concluyentemente si la acción de estas quinasas normalmente precede o subsigue a la acción de las quinasas de la familia Syk. Una hipótesis que explica la acción de ZAP-70 en la activación de células T recurre a una quinasa de la familia Src, asociada a receptor, cuya agregación permite una fosforilación transitoria de cadenas de receptor, lo cual, a su vez, conduce a la asociación de ZAP-70 y la subsiguiente activación celular. La fosforilación inicial de cadenas de receptor propuesta en este modelo debe distinguirse de la fosforilación estable de zeta vista durante más tiempo después de la reticulación de receptores.

En células T murinas, una pequeña proporción de complejos receptores de la célula T contiene una molécula relacionada con zeta, llamada eta (Baniyash et al., 1.988, J. Biol. Chem. 263: 9.874-9.878), que representa una forma alternativamente remodelada (Clayton et al., 1.991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5.202-06). Eta difiere de zeta en el extremo carboxílico y carece de la más distal de las seis tirosinas halladas en zeta murina (Jin et al., 1.990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3.319-3.323). Aunque la fosforilación de la cadena zeta de isoformas zeta-zeta murinas de TCR puede ser fácilmente detectada después de la reticulación de receptores mediada por anticuerpos, la cadena eta de TCR no resulta detectablemente fosforilada bajo circunstancias similares (Bauer et al., 1.991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3.842-3.846). Parece que la fosforilación estable de la cadena zeta requiere dos cadenas zeta estrechamente yuxtapuestas puesto que isoformas de TCR que contienen heterodímeros zeta-eta no resultan fosforilados después de la reticulación de receptores (Bauer et al., 1.991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3.842-3.846). A pesar de las diferencias en la fosforilación, líneas celulares que comprenden isoformas de TCR que consisten únicamente en homodímeros de eta son funcionalmente indistinguibles de líneas celulares que sólo contienen homodímeros de zeta (Bauer et al., 1.991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3.842-3.846). De este modo, la fosforilación de zeta, como se observa 30 minutos después de la agregación de receptores mediada por anticuerpos, no se correlaciona con la activación. En un estudio separado, el examen del curso temporal de la acumulación de fosfoproteínas de fosfotirosina después de la agregación de TCR ha mostrado que las especies observables más precoces son dos proteínas, de masas 135 y 100 kDa, cuya fosforilación es detectable por vez primera cinco y quince segundos, respectivamente, después de la reticulación y cuya fosforilación semimáxima, en ambos casos a aproximadamente 30 segundos, precede a los momentos de movilización de calcio y formación de inositol-fosfato semimáximas (June et al., 1.990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7.722-7.726; June et al., 1.990, J. Immunol. 144: 1.591-99). Por contraste, la velocidad de fosforilación de zeta es sustancialmente más pequeña, lo que conduce a una sustitución semimáxima aproximadamente de tres a cinco minutos después de la estimulación, bien después de que se hayan observado la acumulación de calcio y la liberación de inositol-fosfatos (June et al., 1.990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7.722-7.726; June et al., 1.990, J. Immunol. 144: 1.591-1.599).

De este modo, si el modelo de dos fases es correcto, la fosforilación de tirosinas necesaria para reunir ZAP-70 en la cara interna de la membrana plasmática debe ser un suceso más rápido, probablemente transitorio, que el observado en los estudios anteriores. Se ha sugerido recientemente que puede detectarse una fosforilación de tirosina con un inicio apropiadamente rápido (aproximadamente quince segundos) tanto en la cadena zeta como en la cadena épsilon de CD3 después de la reticulación de receptores (Wange et al., 1.992, J. Biol. Chem. 267: 11.685- 11.688), y que una proteína de 70kDa que contiene tirosina-fosfato puede hallarse asociada tanto con la cadena zeta como con la cadena épsilon. No está actualmente claro si una asociación estable con cadenas de receptor fosforiladas es un requisito previo para una activación exitosa de las células T.

Sin embargo, como una afirmación general, los resultados aquí presentados sugieren que quinasas de la familia Syk actúan más directamente sobre el aparato efector de las células T que quinasas de la familia Src. Un conjunto creciente de evidencia sugiere que quinasas de la familia Src pueden asociarse con diversas moléculas de la superficie celular que no son miembros de la familia del receptor de antígeno/Fc, incluyendo CD2 (Bell et al., 1.992, Mol. Cell. Biol. 12: 5.548- 5.554), CD23 (Sugie et al., 1.991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9.132-9.135), CD36 (Huang et al., 1.992, J. Biol. Chem. 267: 5.467-5.473), la cadena beta del receptor de la interleuquina 2 (IL-2) (Hatakeyama et al., 1.991, Science 252: 1.523-1.528) y diversas proteínas ancladas a fosfatidilinositol (Stefanova et al., 1.991, Science 254: 1.016-1.019; Thomas y Samelson, 1.992, J. Biol. Chem. 267: 12.317-12.322), algunas de las cuales son conocidas por requerir la presencia adicional del receptor antigénico para promover la activación en las células T. Una explicación sencilla del último requisito puede ser que los motivos desencadenantes del receptor antigénico actúan como sustratos para quinasas de la familia Src, permitiendo el subsiguiente acoplamiento de quinasas de la familia Syk, seguido quizás de algún proceso modificador que promueve su activación. Dada la dificultad para establecer una cadena causal de fosforilación y activación, puede ser también que los motivos desencadenantes ejerzan sólo una función transitoria, para actuar como una clase de centro catalítico para la reunión, activación y liberación de quinasas efectoras.

Las quinasas de la familia Src están ampliamente distribuidas por todos los linajes no hematopoyéticos, y estudios recientes en que se usaban ratones negativos en cuanto a Fyn han mostrado un papel de Fyn en el sustento de la potenciación de larga duración, el fenómeno de transmisión sináptica facilitada del que se piensa que sirve de base para la consolidación inicial de la memoria asociativa (Grant et al., 1.992, Science 258: 1.903-1.910). Si rutas de activación similares son mediadas por quinasas de la familia Src en otros tipos celulares, puede demostrarse también que quinasas de la familia Syk están más ampliamente distribuidas por todos los compartimentos extrahematopoyéticos.

Métodos experimentales Construcción de quimeras

Se fijaron las regiones de codificación completas de las quinasas Lck humana (Koga et al., 1.986, Eur. J. Immunol. 16: 1.643-1.646), Fyn (T) murina (Cooke y Perlmutter, 1.989, New. Biol. 1: 66-74), Syk porcina (Taniguchi et al., 1.991, J. Biol. Chem. 266: 15.790-15.796) y ZAP-70 humana (Chan et al., 1.992, Cell 71: 649-662) al dominio intracelular de una proteína transmembranal quimérica que consistía en el dominio extracelular de CD16 unido a un segmento ``pedúnculo'' (``stalk'') corto y el dominio transmembranal de CD7. El dominio intracelular de CD7 fue truncado en la secuencia de transferencia de terminación mediante la adición de un sitio Mlu. Las diferentes quinasas fueron adaptadas con un sitio Mlu en el apropiado marco de lectura para permitir que se expresara una proteína de fusión tripartita. La secuencia de Syk porcina fue obtenida por transcripción inversa y PCR de RNA total de linfocitos porcinos usando cebadores que contenían sitios de restricción apropiados. Las secuencias de ZAP-70 se obtuvieron similarmente por PCR a partir de un banco de cDNA de células T humanas. Se secuenciaron en paralelo varios productos de aislamiento y, de cada quinasa, se obtuvo una secuencia de codificación exenta de mutación mediante intercambio de fragmentos de restricción. Las secuencias de codificación resultantes fueron insertadas en un vector de expresión de virus vaccinia, aguas abajo de las secuencias de CD16/CD7. Se aisló Syk humana de un banco de cDNA de células asesinas naturales y de un banco de células Daudi usando cebadores correspondientes a los extremos de la secuencia porcina. El cebador directo contenía la secuencia atg gca gac agt gcc aac cac ttg ccc ttc ttc t, y el cebador inverso contenía la secuencia cgc ggg gcg gcc gct tta att cac cac gtc gta gta gta. Una vez que la multiplicación inicial reveló la presencia de bandas del tamaño esperado, se llevó a cabo una remultiplicación (10 ciclos) usando un cebador de extensión en el extremo 5' que tenía la secuencia cgc ggg acg cgt acc atg gca gac agt gcc aac, lo que permitió que el fragmento se ligara a un vector cortado con Mlu I.

Análisis de movilización de calcio

Se llevaron a cabo análisis espectrofotométricos globales y citométricos de flujo sobre células que expresaban quinasas recombinantes, usando el fluoróforo Indo-1 sensible al calcio del modo previamente descrito (Romeo y Seed, 1.991, Cell 64: 1.037-1.046; Romeo et al., 1.992, Cell 68: 889-897). En resumen, células de la sublínea mutante Jurkat JRT 3.T 3.5 (Weiss y Stobo, 1.984, J. Exp. Med. 160: 1.284-1.299) fueron infectadas con virus vaccinia recombinantes durante una hora en medio IMDM exento de suero con una multiplicidad de infección de 10 y fueron incubadas durante de tres a nueve horas en IMDM, suero bovino fetal al 10%. Las células fueron recogidas por centrifugación, resuspendidas en una concentración de 3 x 10^{6}/ml en medio completo que contenía éster acetometoxílico de Indo-1 1mM (Grynkiewicz et al., 1.985, J. Biol. Chem. 260: 3.440-3.450) (Molecular Probes, Eugene, Oregon, EE.UU.) e incubadas a 37ºC durante 45 minutos. Las células cargadas de Indo-1 fueron recogidas como sedimento de centrifugación, resuspendidas en una concentración de 1 x 10^{6}/ml en IMDM exento de suero y guardadas a temperatura ambiental en la oscuridad. Las células fueron analizadas en cuanto a ion calcio libre mediante la medición simultánea de la emisión de fluorescencia violeta y azul por citometría de flujo (Rabinovitch et al., 1.986, J. Immunol. 137: 952-961). Para iniciar el flujo de calcio, o se añadió el anticuerpo monoclonal 3G8 (anti-CD16) no conjugado (en una concentración de 1 \mug/ml) a la suspensión de células seguido de 10 \mug/ml de anti-IgG de ratón, de cabra, Fab 02 conjugado con ficoeritrina (PE; del inglés, phycoerythrin) en el momento 0, o se añadió un anticuerpo anti-CD4 conjugado con PE (Leu-3a, Becton Dickinson), seguido de un segundo anticuerpo no conjugado. De la población celular positiva en cuanto a PE (infectada), que representaba típicamente el 40-80% de las células, se recogieron histogramas de la relación de emisiones violetas/azules. La relación de emisiones violetas/azules antes de la adición de anticuerpo fue usada para establecer la relación inicial normalizada, ajustada igual a la unidad.

Ensayo de citolisis de linfocitos

Una línea citolítica (WH3) CD8^{+} CD4^{-} restringida a HLA B44 fue mantenida en IMDM, suero humano al 10% con 100 U/ml de IL-2, y fue periódicamente estimulada con células mononucleares irradiadas (30 Gy) que tenían el haplotipo HLA B44. Antes de su uso en ensayos de citotoxicidad, las células fueron cultivadas durante al menos 10 días tras la estimulación. Las células fueron infectadas con virus vaccinia recombinantes con una multiplicidad de infección de al menos 10 durante una hora en medio exento de suero, lo que fue seguido de incubación en medio completo durante tres horas. Las células fueron recolectadas por centrifugación y fueron resuspendidas con una densidad de 1 x 10^{7}/ml. Se añadieron 100 \mul a cada pocillo de una placa de microtitulación con fondo en U que contenía 100 \mul de medio completo/pocillo. Las células fueron diluidas al doble en etapas sucesivas. Para cada muestra, dos pocillos no contenían linfocitos para permitir que se midiera la liberación espontánea de cromo y la absorción total de cromo. Una parte alícuota de 10^{6} células diana 3G8 10-2 (Shen et al., 1.989, Mol. Immunol. 26: 959-969) fue centrifugada, resuspendida en 50 \mul de ^{51}Cr-cromato sódico estéril (3,7 x 10^{7} Bq/ml, DuPont) durante una hora a 37ºC con mezclamiento intermitente y luego lavada tres veces con disolución salina tamponada con fosfato. A cada pocillo se añadieron 100 \mul de células marcadas resuspendidas en medio en una concentración de 10^{5}/ml. La placa de microtitulación fue centrifugada a 750 x g durante 1 minuto e incubada durante 4 horas a 37ºC. Al final del periodo de incubación, se resuspendieron las células de cada pocillo mediante una aspiración suave con pipeta, se extrajo una muestra para determinar las cuentas totales incorporadas y se centrifugó la placa de microtitulación a 750 x g durante 1 minuto. Se extrajeron partes alícuotas de 100 \mul del sobrenadante y se contaron en un contador de centelleo de rayos gamma. La relación de efector a diana fue corregida en cuanto al porcentaje de células efectoras infectadas (normalmente > 70%).

Creación de quimeras de quinasa mutantes

Se creó una variante de proteína de fusión negativa en cuanto a quinasa Syk porcina por escisión de la quimera con Stu I y Not I (extendiéndose la última justo 3' con respecto al extremo carboxílico), completando el sitio Not I y ligando los extremos entre sí. La secuencia resultante unía los primeros 298 restos de Syk porcina a 4 restos extraños (GPRL) antes de la terminación. Se creó una mutación puntual (K369G) en el sitio ligante de ATP de ZAP-70 por inserción de un fragmento oligonucleotídico dúplex entre los sitios BalI y EarI situados entre los restos nucleotídicos 1.319 y 1.345 de la cadena superior de la secuencia presentada por Chan et al. (1.992, Cell 71: 649-662). La secuencia resultante codificaba glicocola en vez de lisina en el resto 369.

Ensayo de inmunoprecipitación y quinasa

Se infectaron aproximadamente 2 x 10^{6} células Hela S3 con virus vaccinia recombinante, con una multiplicidad de infección de al menos diez, durante una hora en medio DME exento de suero. 5 horas después de la infección, las células fueron recolectadas, lavadas dos veces con disolución salina tamponada con fosfato y lisadas en Triton X-100 al 1%, NaCl 0,15 M, HEPES 0,02 M, pH de 7,3, EDTA 5 mM, NaF 5 mM, NaVO_{3} 0,2 mM, 10 \mug/ml de leupeptina, 10 \mug/ml de aprotinina y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM. Después de una incubación de 10 minutos sobre hielo, se separaron los núcleos por centrifugación y se inmunoprecipitaron las proteínas de fusión de CD16 con anticuerpo BMA209/2 y proteína A-Sepharose. La resina cargada con proteína de fusión fue lavada tres veces con tampón de lisis, lo que fue seguido de un lavado final con Hepes 20 mM, pH de 7,3. A cada muestra se añadieron 10 \mul de tampón de quinasas (Hepes 20 mM, pH de 7,3, MgCl_{2} 10 mM, MnCl_{2} 10 mM) que contenía 3,7 x 10^{5} Bq de [(-^{32}P]ATP (> 1,11 x 10^{14} Bq/milimol). Se dejaron las mezclas de reacción en incubación a temperatura ambiental durante 10 minutos y se terminaron las reacciones mediante la adición de 20 \mul de tampón 2X para carga de muestras (SDS al 4%, Tris 100 mM, pH de 6,8, glicerol al 20% y \beta-mercaptoetanol al 10%). Una vez que las muestras hubieron sido sometidas a ebullición durante 3 minutos, se desarrollaron partes alícuotas en un gel en gradiente al 4-15%. Se llevaron a cabo ensayos de quinasa, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (UBI), con un sustrato peptídico soluble que correspondía a las posiciones 6-20 de cdc 2, en que tyr 20 estaba sustituida por lys.

Análisis de fosforilación de tirosina proteica, por inmunotransferencia

Células 3.5 negativas en cuanto a TCR fueron infectadas con reservas de virus recombinantes (multiplicidad de infección de al menos 10) durante una hora. Las células fueron posteriormente incubadas a 37ºC durante 8-12 h, centrifugadas, lavadas y resuspendidas en medio de Iscove sin suero en una concentración de 10^{7} células por ml. Partes alícuotas de células fueron incubadas con anticuerpo monoclonal anti-CD16 (3G8, Medarex, o BMA209/2, Behringwerke) en una cantidad de 1 \mug de anticuerpo por 2-3 x 10^{6} células. Las muestras estimuladas fueron luego incubadas con un exceso de 3-5 veces de un anticuerpo anti-IgG 1 de ratón (Southern Biotechnology), purificado por afinidad, durante 5 minutos. Las células fueron posteriormente procesadas de acuerdo con J. P. Secrist, L. A. Burns, L. Karnitz, G. A. Koretzky y R. T. Abraham, (J. Biol. Chem. 268: 5.886-5.893, 1.993), con ligeras modificaciones. Se terminaron las incubaciones al añadir SDS a una concentración final de 1%, y se sometieron muestras a ebullición durante tres minutos. Se sometió el DNA a cizallamiento por sonicación durante 1 minuto usando un Heat Systems Ultrasonics, Inc., se añadió tampón 2X de muestras, se sometieron partes alícuotas, correspondientes a una cantidad de 10^{5} a 2,5 x 10^{5} células, a separación en geles de poliacrilamida y se transfirieron las proteínas a nitrocelulosa (Schleicher and Schuell BA45) por electrotransferencia en estado semiseco (Hoefer). Los filtros fueron bloqueados durante una hora en disolución salina con Tween-20 al 0,05% tamponada con Tris (TBST; del inglés, Tris buffered saline with Tween-20), que contenía ovoalbúmina de gallina (Sigma) al 1,5%, lavados en TBST, transferidos a una disolución que contenía el anticuerpo 4G10 antifosfotirosina (UBI) en una dilución 1:10.000 e incubados a 22ºC durante 1-2 h. Tras lavados en TBST, los filtros fueron incubados en TBST y una dilución 1:5.000 del producto de conjugación de peroxidasa de rábano picante y anti-ratón durante 1 hora. Las bandas de proteína fosforilada fueron detectadas por quimioluminiscencia (ECL, Amersham). Los tiempos de exposición variaron entre 2 segundos y 5 minutos.

Construcción de quimeras de IgG1 humana:proteína-tirosina quinasa

Pueden producirse moléculas quiméricas que incluyan el dominio extracelular de una molécula de anticuerpo específica para una célula diana, y el dominio intracelular de una proteína-tirosina quinasa (por ejemplo, las quinasas aquí descritas). Para producir dicha molécula, se preparan secuencias de cadena pesada de IgG1 humana uniendo secuencias del dominio C_{H}3 a un fragmento de cDNA procedente del extremo 3' de la forma transmembranal del mRNA del anticuerpo. El fragmento del extremo 3' se obtiene por reacción en cadena de la polimerasa usando un banco de cDNA de tonsila como sustrato, y oligonucleotidos que tienen las secuencias:

CGC GGG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC y

CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT GGG CCT CA,

que corresponden a los extremos 5' y 3', respectivamente, de los fragmentos de DNA deseados. El oligonucleótido 5' es complementario de un sitio del dominio C_{H}1 de IgG1 humana, y el oligonucleótido 3' es complementario de un sitio justo 5' de las secuencias que codifican el dominio que traviesa la membrana. El producto de PCR es sometido a digestión con BstXI y BamHI y es ligado entre sitios BstXI y BamHI de un gen de anticuerpo IgG1 semisintético que posee regiones variables y constantes. Después de la inserción del fragmento BstXI a BamHI, las porciones multiplicadas de la construcción son sustituidas hasta el sitio SmaI de C_{H}3 por intercambio de fragmentos de restricción, de modo que sólo la porción entre el sitio SmaI y el oligonucleótido 3' proceda de la reacción PCR.

Para crear un receptor quimérico de IgG1 humana, el gen de cadena pesada que termina en un sitio BamHI es unido al dominio intracelular de interés de quinasa mediante técnicas estándares. Los niveles de expresión del receptor quimérico pueden ser determinados por citometría de flujo. Pueden alcanzarse aumentos de expresión por coexpresión de un plásmido que codifica un cDNA de cadena ligera de anticuerpo,

Para crear una sola unidad de transcripción que permita que ambas cadenas pesada y ligera se expresen a partir de un solo promotor, se crea un plásmido que codifica un mRNA bicistrónico a partir de secuencias de codificación de las cadenas pesada y ligera, y la porción no traducida 5' del mRNA que codifica la proteína de 78kDa regulada por glucosa, también conocida como grp78 o BiP. Se obtienen secuencias de grp78 por PCR de DNA genómico humano usando cebadores que tienen las secuencias:

CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC y

CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG

en los extremos 5' y 3', respectivamente. Se llevan a cabo reacciones en cadena de la polimerasa con estos oligonucleotidos en presencia de dimetilsulfóxido al 10%. El fragmento obtenido por PCR es sometido a digestión con NotI e HincII y es insertado entre sitios NotI y HpaI aguas abajo de secuencias de codificación de IgG1 humana. Secuencias que codifican un cDNA de cadena ligera kappa de IgG humana son luego insertadas aguas abajo de la secuencia líder de grp78, usando el sitio HincII y otro sitio del vector. El plásmido de expresión que resulta de estas manipulaciones consiste en el gen de cadena pesada semisintético seguido de las secuencias líder de grp78, seguido de las secuencias de cDNA de cadena ligera kappa, seguido de señales de poliadenilación procedentes de un fragmento de DNA del virus 40 de simios (SV40; del inglés, simian virus 40). Se ha demostrado previamente que la transfección de células COS con este plásmido de expresión proporciona una expresión notablemente mejorada de determinantes de cadena pesada, en comparación con la transfección con plásmido que sólo codifica determinantes de cadena pesada.

Para crear un gen bicistrónico que comprenda una quimera de cadena pesada/receptor y una cadena ligera, las secuencias de cadena pesada aguas arriba pueden ser sustituidas por cualquier gen quimérico de cadena pesada/receptor aquí descrito.

Una vez construidas, las quimeras de IgG-tirosina quinasa pueden ser clonadas en un vector de expresión, introducidas en una célula huésped y analizadas mediante cualquiera de los ensayos aquí descritos (por ejemplo, mediante ensayos de movilización de calcio o de citolisis).

Construcción de quimeras de CD4-tirosina quinasa

Pueden producirse moléculas quiméricas que incluyan el dominio extracelular de la molécula de CD4 y el dominio intracelular de una proteína- tirosina quinasa (por ejemplo, las quinasas aquí descritas). Para producir dicha molécula, se aísla (por ejemplo, del modo anteriormente descrito) la secuencia que codifica la tirosina quinasa (por ejemplo, cDNA). Esta secuencia es luego unida al dominio extracelular de una forma creada de CD4 que posee un sitio BamHI justo aguas arriba del dominio que atraviesa la membrana [Aruffo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 8.573-8.577 (1.987b); Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol., 9: 347-353 (1.990)] mediante técnicas estándares. Para formar esta proteína de fusión, puede construirse un sitio BamHI en la secuencia, en la posición apropiada (de nuevo mediante técnicas estándares). Las fusiones génicas son introducidas en un plásmido de expresión de virus vaccinia (como aquí se describe) e insertadas en el genoma de la cepa WR de virus vaccinia mediante recombinación homóloga y selección por crecimiento en ácido micofenólico [Falkner et al., J. Virol., 62: 1.849- 1.854 (1.988); Boyle et al., Gene, 65: 123-128 (1.988)]. Se usa el análisis citométrico de flujo para examinar la expresión, por los recombinantes de virus vaccinia, de las proteínas de fusión de CD4-tirosina quinasa en la superficie celular. La inmunoprecipitación de las células infectadas con los recombinantes de virus vaccinia es usada para confirmar los resultados (como se describió anteriormente).

La eficacia de las quimeras de CD4 puede ser analizada mediante cualquiera de los ensayos de movilización de calcio o de citolisis aquí descritos. En un ejemplo particular, se crea un sistema modelo de diana:efector basado en el reconocimiento del complejo gp120/gp41 de la envoltura del HIV por CD4. Células Hela son infectadas con virus vaccinia recombinantes que expresan gp120/gp41 [Chakrabarti et al., Nature, 320: 535-537 (1.986); Earl et al., J. Virol., 64: 2.448-2.451 (1.990)] y son marcadas con ^{51}Cr. Las células marcadas son incubadas con células de una línea de linfocitos T citotóxicos aloespecíficos (CD8^{+}, CD4^{-}) humanos que ha sido infectada con recombinantes de virus vaccinia que expresan la quimera de CD4-tirosina quinasa, y son examinadas en cuanto a lisis específica.

Para controlar la posibilidad de que la infección por virus vaccinia pueda provocar un reconocimiento de tipo artefacto por CTL, se llevan a cabo experimentos de citolisis similares con células diana infectadas con recombinantes de virus vaccinia que expresan la forma de CD16 ligada a fosfatidilinositol (CD16_{PI}) y marcadas con ^{51}Cr, y con CTL infectados con recombinantes testigo que expresan quimeras de CD16.

En otro ejemplo, los granulocitos neutrófilos, que tienen un tiempo de vida en circulación muy corto (4 h) y son intensamente citolíticos, son células atractivas para la expresión de quimeras de CD4-tirosina quinasa. No es probable que la infección de neutrófilos con HIV dé lugar a una liberación de virus, y la abundancia de estas células (las más extendidas de los leucocitos) debería facilitar la defensa del huésped. Otra atractiva posibilidad para células huésped son las células T maduras, una población actualmente accesible a la ingeniería retrovírica [S. A. Rosenberg, Sci. Am., 262; 62-69 (1.990)]. Con la ayuda de IL-2 recombinante, pueden desarrollarse poblaciones de células T en cultivo con relativa facilidad, y las poblaciones desarrolladas tienen típicamente un tiempo de vida limitado cuando se vuelven a infundir [Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 323: 570-578 (1.990)].

Bajo las condiciones apropiadas, el reconocimiento de HIV por células que expresan quimeras de CD4 debería proporcionar también estímulos mitogénicos, permitiendo la posibilidad de que la población de células armadas pudiera responder dinámicamente a la carga vírica. Aunque aquí se ha hecho hincapié en la actuación de las proteínas de fusión en linfocitos T citolíticos, la expresión de las quimeras en linfocitos cooperadores podría proporcionar una fuente de citoquinas, movilizada por HIV, que podrían contrarrestar el colapso del subgrupo de células cooperadoras en el sida. Una reciente descripción de diversos esquemas para crear resistencia a la infección en fases distintas a la penetración del virus [Friedman et al., Nature, 335: 452-454 (1.988); Green et al., Cell, 58: 215-223 (1.989); Malim et al., Cell, 58: 205-214 (1.989); Trono et al., Cell, 59: 113-120 (1.989); Buonocore et al., Nature, 345: 625-628 (1.990)] sugiere que podrían diseñarse células que contuvieran quimeras de CD4 para frustrar la producción de virus mediante la expresión de agentes apropiados que tuvieran un sitio intracelular de acción.

La capacidad para transmitir señales a linfocitos T a través de quimeras autónomas proporciona además la capacidad para la regulación in vivo de linfocitos retrovíricamente construidos. Estímulos de reticulación, mediados, por ejemplo, por anticuerpos IgM específicos creados para eliminar dominios ligantes de complemento, pueden permitir que aumente in situ el número de tales linfocitos, mientras que el tratamiento con anticuerpos IgG específicos similares (que reconocieran, por ejemplo, una variación de aminoácidos creada en la cadena quimérica) podría agotar selectivamente la población creada. Se ha determinado previamente que anticuerpos IgM anti-CD4 no requieren una reticulación adicional para movilizar calcio en células Jurkat que expresan quimeras de CD4:\zeta. La capacidad para regular poblaciones de células sin recurrir a una multiplicación extracorpórea repetida puede ampliar sustancialmente el alcance y la eficacia de los actuales usos propuestos para células T genéticamente creadas.

Otras realizaciones

Para crear otras quimeras que consistan en secuencias intracelulares de proteína quinasa, secuencias de cDNA o genómicas que codifican un dominio extracelular del receptor pueden ser dotadas de un sitio de restricción introducido en una posición que preceda exactamente al dominio extracelular de elección. El fragmento de dominio extracelular que termina en el sitio de restricción puede ser luego unido a las secuencias de proteína quinasa. Los dominios extracelulares típicos pueden proceder de receptores que reconocen complemento, carbohidratos, proteínas víricas, bacterias, parásitos protozoarios o metazoarios, o proteínas inducidas por ellos. Similarmente, ligandos o receptores expresados por agentes patógenos o células tumorales pueden ser fijados a secuencias de proteína quinasa para dirigir respuestas inmunes contra células que contengan receptores que reconozcan esos ligandos.

Para identificar las mínimas secuencias de proteína quinasa necesarias para la citolisis, puede prepararse una serie de mutantes por deleción mediante técnicas estándares en que se va eliminando sucesivamente cada vez más dominio intracelular de quinasa. Dichos mutantes por deleción son analizados en cuanto a su eficacia en cualquiera de los ensayos aquí descritos. Los dominios intracelulares útiles para la proteína quinasa Syk incluyen, por ejemplo, los aminoácidos 336- 628 de la secuencia de Syk porcina y los aminoácidos 338-630 de la secuencia de Syk humana.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

(i)

SOLICITANTE:

(A)

NOMBRE: The General Hospital Corporation

(B)

CALLE: 13th Street Bldg. 149, Suite 1101

(C)

CIUDAD: Charlestown

(D)

ESTADO: Massachusetts

(E)

PAÍS: EE.UU.

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): MA 02129

(G)

TELÉFONO: 001-617-726/5474

(H)

TELEFAX: 001-617726/1668

(I)

TÉLEX: -

(ii)

TÍTULO DEL INVENTO: Redirection of cellular immunity by receptor chimeras

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 8

(iv)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

(A)

TIPO DE MEDIO: disquete

(B)

ORDENADOR: Compatible con ordenador personal IBM

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

(D)

PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Licencia nº 1.0, Versión nº 1.25 (EPO)

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº 1:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CLASE DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(ix)

RASGO:

(A):

NOMBRE/CLAVE: exón

(B):

SITUACIÓN: 1..33

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 1:

CGCGGGGTGA CCGTGCCCTC CAGCAGCTTG GGC 33

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº 2:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 50 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CLASE DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(ix)

RASGO:

(A):

NOMBRE/CLAVE: exón

(B):

SITUACIÓN: 1..50

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 2:

CGCGGGGATC CGTCGTCCAG AGCCCGTCCA GCTCCCCGTC CTGGGCCTCA 50

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº 3:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CLASE DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(ix)

RASGO:

(A):

NOMBRE/CLAVE: exón

(B):

SITUACIÓN: 1..33

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 3:

CGCGGGCGGC CGCGACGCCG GCCAAGACAG CAC 33

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº 4:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CLASE DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(ix)

RASGO:

(A):

NOMBRE/CLAVE: exón

(B):

SITUACIÓN: 1..33

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 4:

CGCGTTGACG AGCAGCCAGT TGGGCAGCAG CAG 33

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº 5:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 630 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(C)

CLASE DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(ix)

RASGO:

(A):

NOMBRE/CLAVE: péptido

(B):

SITUACIÓN: 1..630

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 5:

1

2

3

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº 6:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 628 aminoácidos

(E)

TIPO: aminoácido

(F)

CLASE DE CADENA: sencilla

(G)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(ix)

RASGO:

(A):

NOMBRE/CLAVE: péptido

(B):

SITUACIÓN: 1..628

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 6:

4

5

6

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº 7:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 34 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CLASE DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(ix)

RASGO:

(A):

NOMBRE/CLAVE: exón

(B):

SITUACIÓN: 1..34

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 7:

ATGGCAGACA GTGCCAACCA CTTGCCCTTC TTCT 34

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID Nº 8:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

(H)

TIPO: ácido nucleico

(I)

CLASE DE CADENA: sencilla

(J)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(ix)

RASGO:

(A):

NOMBRE/CLAVE: exón

(B):

SITUACIÓN: 1..39

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 8:

CGCGGGGCGG CCGCTTTAAT TCACCACGTC GTAGTAGGTA 39

Claims (15)

1. Una célula terapéutica que expresa un receptor quimérico proteico unido a la membrana, receptor que comprende (a) una porción intracelular de una proteína-tirosina quinasa que es capaz de generar señales para que dicha célula terapéutica destruya una célula diana unida al receptor o un agente infectivo diana unido al receptor, y (b) una porción extracelular que es capaz de específicamente reconocer, y unirse a, dicha célula diana o dicho agente infectivo diana, por lo cual una de dichas células terapéuticas es capaz de reconocer y destruir específicamente dicha célula diana o dicho agente infectivo diana.

2. Una célula de acuerdo con la Reivindicación 1, en la que dicha proteína- tirosina quinasa es un miembro de la familia Syk de quinasas.

3. Una célula de acuerdo con la Reivindicación 2, en la que dicha proteína- tirosina quinasa es Syk.

4. Una célula de acuerdo con la Reivindicación 3, en la que dicha porción intracelular incluye los aminoácidos 336-628 de Syk porcina o los aminoácidos 338-630 de Syk humana.

5. Una célula de acuerdo con la Reivindicación 1, en la que cada una de dichas células terapéuticas expresa un segundo receptor quimérico proteico unido a la membrana, segundo receptor quimérico que comprende (a) una porción intracelular de una segunda proteína-tirosina quinasa que es capaz de generar señales para que dicha célula terapéutica destruya una célula diana unida al receptor o un agente infectivo diana unido al receptor, y (b) una porción extracelular que es capaz de específicamente reconocer, y unirse a, dicha célula diana o dicho agente infectivo diana, por lo cual cada una de dichas células terapéuticas es capaz de reconocer y destruir específicamente una célula diana o un agente infectivo diana.

6. Una célula de acuerdo con la Reivindicación 5, en la que una de dichas proteína-tirosina quinasas es un miembro de la familia Syk de quinasas y la otra de dichas proteína-tirosina quinasas es un miembro de la familia Src de quinasas.

7. Una célula de acuerdo con la Reivindicación 6, en la que una de dichas proteína-tirosina quinasas es ZAP-70 y la otra de dichas proteína-tirosina quinasas es Fyn.

8. Una célula de acuerdo con la Reivindicación 6, en la que una de dichas proteína-tirosina quinasas es ZAP-70 y la otra de dichas proteína-tirosina quinasas es Lck.

9. Una célula de acuerdo con la Reivindicación 1 ó 5, en la que dichas células terapéuticas son seleccionadas del grupo que consiste en: (a) linfocitos T, (b) linfocitos T citotóxicos, (c) células asesinas naturales, (d) neutrófilos, (e) granulocitos, (f) macrófagos, (g) células cebadas y (h) células HeLa.

10. Una célula de acuerdo con la Reivindicación 1, en la que dicho agente infectivo diana es un virus de inmunodeficiencia.

11. Una célula de acuerdo con la Reivindicación 10, en la que dicha porción extracelular comprende una porción de CD4 ligante de la envoltura del HIV.

12. Una célula de acuerdo con la Reivindicación 1 ó 5, en la que dicha unión es independiente del MHC.

13. Una célula de acuerdo con la Reivindicación 1 ó 5, en la que dicha porción extracelular comprende la porción de un receptor ligante de ligandos, la porción de un ligando ligante de receptores, la porción de un anticuerpo ligante de antígenos, o un derivado funcional de las mismas.

14. DNA que codifica un receptor quimérico de acuerdo con la Reivindicación 1 ó 5.

15. Un vector que comprende el DNA de receptor quimérico de acuerdo con la Reivindicación 1 ó 5.